MX2007001180A - Enlazantes. - Google Patents

Abstract

Se exponen polipeptidos terapeuticos que comprenden por lo menos dos dominios capaces de unirse a un receptor de citocina, en donde los dominios estan conectados por un enlazador de peptido, en donde el enlazador comprende opcionalmente una region helicoidal alfa rigida.

Description

ENLAZANTES MEMORIA DESCRIPTIVA La invención se relaciona con polipéptidos que comprenden al menos dos dominios capaces de unirse a un receptor de citocina, en donde los dominios están conectados por una molécula enlazante peptídica. Un grupo de factores de crecimiento, referidos como citocinas, está involucrado en varias funciones celulares diversas. Estas incluyen, por ejemplo, y no a manera de limitación, la modulación del sistema inmune, la regulación del metabolismo de la energía y el control del crecimiento y el desarrollo. Las citocinas median sus efectos vía receptores expresados en la superficie celular en las células objetivo. Los receptores de la citocína pueden dividirse en tres subgrupos separados. Los receptores del Tipo 1 (familia de la hormona del crecimiento (GH)), están caracterizados por cuatro residuos de cisteína conservados en la parte amino terminal de ese dominio extracelular en la presencia de un motivo Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser conservado en la parte C terminal. El motivo Cys repetido también está presente en el Tipo 2 (familia del ¡nterferón) y el Tipo lll (familia de la necrosis del tumor). Se sabe que muchos dominios de citocina interactúan con su receptor análogo vía sitios específicos. Algunos receptores de citocina tienen tanto sitios de unión del dominio de alta afinidad como sitios de unión de baja afinidad.

Por ejemplo, se sabe que una sola molécula de GH se asocia con dos moléculas receptoras (GHR) (Cunningham et al, 1991 ; de Vos et al, 1992; Sundstrom et al, 1996; Clackson et al, 1998). Esto ocurre a través de dos sitios de unión al receptor únicos en la GH y un receptáculo de unión común en el dominio extracelular de dos receptores. El sitio 1 en la molécula de GH, tiene una afinidad más alta que el sitio 2, y se piensa que la dimerización del receptor ocurre secuencíalmente con un receptor que se une al sitio 1 en la GH, seguido por el reclutamiento de un segundo receptor en el sitio 2. El dominio extracelular de la GHR existe como dos dominios enlazados, cada uno de aproximadamente 100 aminoácidos. Es un cambio conformacional en estos dos dominios que ocurre en la hormona que se una con la formación del complejo trimérico GHR-GH-GHR. La internalización del complejo GHR-GH-GHR es seguida por un paso de reciclado, por lo que la molécula receptora se regenera para uso adicional dentro de la célula. Las citocinas y otros dominios con frecuencia forman complejos receptor-dominio tras la unión. Los receptores involucrados en la formación del complejo pueden ser homogéneos o heterogéneos. Por ejemplo, la eritropoyetina y la GH, forman un complejo trimérico receptor-hormona-receptor. La ¡nterleucina 4 forma un complejo trimérico receptor-hormona-receptor diferente. El factor de necrosis del tumor señaliza vía la formación de trímeros homotípicos de los receptores del factor de necrosis del tumor transmembranales de la célula; TNF-1/p55 o TNF-2/p75. Otras citocinas, por ejemplo la leptina y GCSF, forman complejos tetraméricos receptor-hormona- hormona-receptor y otros (por ejemplo, interleucina 6), forman probablemente complejos hexaméricos que consisten de dos moléculas receptoras solubles, dos moléculas receptoras transmembranales y dos moléculas de citocina. En cada caso, hay un sitio de unión de alta afinidad primario, que localiza la citocina en el complejo receptor, y sitios adicionales que juegan papeles secundarios al alterar la conformación o reclutamiento de otras moléculas, iniciando por lo tanto la señalización. La superfamilia TNF de citocinas, activa las trayectorias de señalización para la supervivencia, muerte y diferenciación de la célula que regulan el desarrollo, organización y homeostasis de los tejidos linfoide, mamario, neuronal y ectodérmico. El TNF tiene un papel demostrado en la defensa del hospedero, tales papeles incluyen, por ejemplo, diferenciación de las células esplénicas, respuesta IgG completa y conmutación del isotipo, activación de macrófagos, generación de óxido nítrico y radicales de oxígeno reactivo. Sin embargo, el TNF también está involucrado en la patogénesis cuando está sobreexpresado. La evidencia de tal implicación se ha encontrado en las siguientes patologías; sepsis bacteriana; enfermedad de injerto versus hospedero; malaria cerebral; artritis reumatoide; alopecia areata/general; asma; cáncer; enfermedad de Crohn; diabetes; obesidad; soriasis y artritis soriática; sarcoidosis; escleroderma y síndrome de choque tóxico. Estas patologías están reconocidas como patologías establecidas y/o potenciales para aplicaciones de agentes anti-TNF.

La sobreexpresión de las citocinas es la causa de una gama de enfermedades humanas, por ejemplo, acromegalia; gigantismo; deficiencia de GH; Síndrome de Turner; falla renal; osteoporosis; osteoartritis; diabetes mellitus; cáncer; obesidad; resistencia a la insulina; hiperlipidemia; hipertensión; anemia; enfermedad autoinmune e infecciosa; trastornos inflamatorios incluyendo artritis reumatoide. Un procedimiento para inhibir la acción de las citocinas, por ejemplo, GH, prolactina o TNF, es la administración de antagonistas. Un ejemplo de un antagonista de GH es Pegvisomant, que es una molécula de GH modificada, recubierta en polietilenglicol (PEG). El pegvisomant tiene varios efectos benéficos, incluyendo, por ejemplo, velocidad de filtración glomerular disminuida debido a un peso molecular efectivo incrementado, reduciendo por lo tanto la dosis requerida para producir el efecto deseado [véase, Abuchowski et al J Biol Chem., 252, 3578-3581 , (1977)]. Sin embargo, una consecuencia de la pegílación es una reducción en la afinidad de la molécula de GH modificada para GHR. Un ejemplo de un antagonista de prolactina se describe en la WO03/057729 (que se incorpora como referencia en su totalidad y más específicamente, las secuencias nucleotídicas y de proteína que codifican el antagonista de prolactina). El antagonista de prolactina comprende una modificación a la secuencia de aminoácidos de la prolactina humana, que reemplaza un residuo de glicina en la posición 129 con un residuo de arginina.

La proteína de prolactína modificada actúa como un inhibidor de la activación del receptor de prolactina. Varias estrategias terapéuticas para inhibir el TNF se han desarrollado basándose en ser capaces de i) inhibir la síntesis de TNF (por ejemplo, utilizando citocinas inhibidoras, IL-10; talidomida, corticosteroides, ciclosporina A; oligonucleótidos antisentido); ¡i) inhibición del procesamiento de TNF (por ejemplo, inhibidores de la metaloproteasa (TACE)); iii) neutralización del TNF (por ejemplo, utilizando receptores de TNF solubles o anticuerpos al TNF). Describimos polipéptidos que comprenden múltiples dominios de unión al ligando de los receptores de la citocinas y su uso en la modulación de la activación de la citocina mediada por el receptor. De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido que comprende al menos dos dominios de unión a la citocina, capaces de unirse a un receptor de la citocina, en donde los dominios están enlazados por una molécula enlazante peptídica que comprende una región helicoidal inflexible. En una modalidad preferida de la invención, el polipéptido actúa como un antagonista del receptor de la citocina. De manera alterna, el polípéptido actúa como un agonista. De manera preferida, el polipéptido comprende los dominios en un arreglo en cascada. En las modalidades preferidas de la invención, el polipéptido comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 dominios en un arreglo en cascada. En una modalidad aún más preferida de la invención, el polipéptido comprende más de 10 dominios en un arreglo en cascada. De manera preferida, la región helicoidal inflexible comprende al menos una copia del motivo A(EAAAK)XA, o una variante funcional del mismo. De manera preferida, la molécula enlazante peptídica comprende dos copias del motivo EAAAK, con la longitud de la molécula enlazante peptídica siendo extensible por la adición en incrementos de al menos un aminoácido. Una "variante funcional", es una molécula enlazante que puede diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, supresiones, pero que retiene sustancialmente una conformación helicoidal o no helicoidal. Entre las variantes preferidas están aquéllas que pueden formar una secuencia de aminoácidos de referencia mediante sustituciones conservadoras de aminoácidos. Tales sustituciones son aquéllas que sustituyen un aminoácido dado por otro aminoácido de características similares. La siguiente lista no limitante de aminoácidos se consideran reemplazos conservadores (similares): a) alanina, serina y treonina; b) ácido glutámico y ácido aspártico; c) asparagina y glutamina d) argínina, lisina e histidina; e) ¡soleucina, leucina, metionina y valina y f) fenilalanina, tirosina y triptófano. Más altamente preferidas son las sustituciones de aminoácidos que mantienen sustancialmente una región enlazante helicoidal flexible o inflexible.

En una modalidad preferida adicional de la invención, la molécula enlazante comprende al menos una región no helicoidal flexible. Aunque la provisión de la región helicoidal inflexible mantiene la separación espacial de los dominios, como se describió anteriormente, la provisión de una región no helicoidal flexible permite que los dominios se orienten en los sitios de unión de los receptores de la citocina. En una modalidad de la invención, una región no helicoidal flexible se localiza en o cerca del extremo amino terminal de la molécula enlazante peptídica, permitiendo por lo tanto la orientación del dominio de unión localizado en el extremo amino terminal de la molécula enlazante peptídica con relación a su receptor análogo. En una modalidad adicional de la invención, la región no helicoidal flexible está localizada en, o cerca del extremo carboxilo terminal de la molécula enlazante peptídica, permitiendo por lo tanto la orientación del dominio de unión localizado en el extremo carboxilo terminal de la molécula enlazante peptídica con relación a su receptor análogo. En aún una modalidad adicional de la invención, la región no helicoidal flexible se localiza en, o cerca del extremo amino y carboxilo terminal de la molécula enlazante peptídica, permitiendo por lo tanto la orientación de los dominios de unión colocados en el extremo amino y carboxilo terminal respectivamente, de la molécula enlazante peptídíca, con relación a sus receptores análogos.

De manera preferida, la región no helicoidal flexible se localiza adyacente a al menos uno de los dominios de unión. Aún de manera más preferida, la región no helicoidal flexible forma una junta entre el dominio de unión y la región helicoidal inflexible. Aún de manera más preferida, la región helicoidal inflexible comprende al menos una copia del motivo A(EAAAK)XA. La longitud de la región no helicoidal inflexible es extensible incrementando el número de repeticiones de este motivo A(EAAAK)XA. En una modalidad preferida de la invención, x en el motivo A(EAAAK)XA, es menor que 10 copias. Aún de manera más preferida, x es menor que 5 copias. Incluso aún de manera más preferida, x se selecciona de 1 , 2, 3, 4 ó 5 copias. En una modalidad preferida de la invención, no hay conexiones flexibles entre los enlazantes helicoidales alfa rígidos y los dominios de unión, pero los dominios de unión están enlazados directamente al enlazante helicoidal alfa inflexible. En una modalidad preferida de la invención, los dominios de unión están enlazados por una molécula enlazante que consiste de una hélice alfa inflexible. En una modalidad preferida de la invención, la molécula enlazante helicoidal enlaza el término carboxilo de un dominio de unión con el término amino de un segundo dominio de unión. En esta modalidad de la invención, el enlazante helicoidal es continuo entre la hélice C terminal y la iniciadora molécula de citocina y la hélice N terminal de la segunda molécula de citocina, enlazando así de manera rígida los dos dominios de unión a la citocina en una orientación sustancialmente fija. Por ejemplo, esto puede involucrar la supresión de una corta región N terminal y C terminal posthelicoidal de un iniciador dominio de citocina y una corta región N terminal prehelicoidal de una segunda citocina (es decir, residuos 182-190 de una iniciadora citocina, y residuos 1-5 de una segunda citocina, puesto que estas son regiones cortas de conformación de espiral aleatoria después de la hélice C terminal (por ejemplo, la hélice 4 en la Figura 1B) en la iniciadora citocina, y antes de la N terminal (hélice 1' en la Figura 1 B) de una segunda citocina. En diferentes constructos, esta orientación fija (tanto traslacional como rotacional), puede alterarse mediante la inserción de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos adicionales, o por la supresión de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos para producir moléculas con propiedades novedosas, por ejemplo, propiedades antagonistas. La adición de un aminoácido extra, producirá una traslación relativa adicional de los dos dominios por aproximadamente 1.5 A y una rotación relativa de los dos dominios alrededor del eje de la hélice de aproximadamente +100°. Típicamente, los enlazantes pueden empezar con dos unidades EAAAK, y se alargarán por la adición de las secuencias A, AA, AAA, AAAA, EAAAA y EAAAK. En una modalidad preferida adicional de la ¡nvención, los dominios de unión del polipéptido son los mismos o similares unos a otros.

En modalidades aún adicionales de la invención, el polipéptído comprende dominios de unión de las citocinas seleccionados del grupo que consiste de; hormona de crecimiento; leptina; eritropoyetina; prolactina; interleucinas (IL) IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11 , la subunidad p35 de la IL-12, IL-13, IL-15; factor que estimula la colonia del granulocito (G-CSF); factor que estimula la colonia del macrófago del granulocito (GM-CSF); factor neurotrófico ciliar (CNTF); cardiotrofina (CT-1 ); factor inhibidor del leucocito (LIF); oncostatina M (OSM); interferón, IFNa e IFN?; factor de necrosis del tumor (TNF)a, TNFß, y ligando RANK. En una modalidad preferida adicional de la ¡nvención, al menos uno de los dominios comprende un dominio de unión a la hormona de crecimiento. En una modalidad preferida adicional de la ¡nvención, el polipéptido comprende al menos dos dominios de unión de la hormona de crecimiento, o una variante de la hormona de crecimiento. Las variantes de GH modificadas se describen en la US 5,849,535, que se incorpora como referencia. La modificación a GH es en el sitio 1 y el sitio 2 de los sitios de unión. Las modificaciones al sitio 1 producen una molécula de GH que tiene una afinidad más alta por GHR, en comparación con la GH de tipo silvestre. Estas moléculas de GH modificadas actúan como agonistas. Hay también una descripción de las modificaciones del sitio 2 que resultan en la creación de antagonistas de GH. Los ejemplos adicionales de modificaciones a GH que alteran la afinidad de unión de GH por el sitio 1 , se describen en la US 5,854,026; US 6,004,931 ; US 6,022,711 ; US 6,057,292; y la US 6136563, cada una de las cuales se incorpora como referencia. Las modificaciones al sitio 2 también se describen, en particular el residuo de aminoácido G 120 en GH, que cuando se modifica a arginina, lisina, triptófano, tirosina, fenilalanina o ácido glutámico, crea una molécula de GH con propiedades antagonistas. En nuestra solicitud copendiente WO03/070765, que se incorpora como referencia, describimos la fusión de una variante GH con actividad antagonista con respecto a la activación del receptor de GH. La variante GH se fusiona vía un enlazante flexible al dominio extracelular del receptor de la hormona de crecimiento. Este polipéptido quimérico muestra una eliminación retrasada de actividad antagonista. La provisión de un polipéptido quimérico similar, pero con un enlazante inflexible o parcialmente flexible, también está dentro del alcance de la invención descrita en la presente. En una modalidad preferida alterna de la invención, el polipéptido comprende al menos dos dominios de unión de prolactina, o una variante de prolactina. En una modalidad preferida de la invención, el polípéptido de la variante de prolactina comprende una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos se modifica en la posición 129 de la prolactina humana.

En una modalidad preferida de la invención, la modificación es una sustitución de aminoácido. De manera preferida, la sustitución reemplaza un residuo de aminoácido de glicina con un residuo de aminoácido de arginina. De manera preferida, la modificación comprende además la supresión de al menos 9, 10, 11 , 12, 13 ó 14 residuos de aminoácidos amino terminales. En una modalidad alterna de la invención, los dominios de unión del polipéptido no son iguales unos con otros. En una modalidad preferida de la invención, el polipéptido comprende un iniciador dominio de unión que es un dominio de unión a la hormona de crecimiento, y un segundo dominio de unión que es un dominio de unión a la prolactina. De manera preferida, el polipéptido consiste de un dominio de unión a la hormona de crecimiento y un dominio de unión a la prolactina. En una modalidad preferida alterna de la invención, el polipéptido comprende un iniciador dominio de unión que es un dominio de unión a la hormona de crecimiento modificado, y un segundo dominio de unión que es un dominio de unión a la prolactina modificado. De manera preferida, el polipéptido consiste de un dominio de unión a la hormona de crecimiento modificado, y un dominio de unión a la prolactina modificado. En una modalidad preferida de la invención, el dominio de unión a la hormona de crecimiento modificado comprende una sustitución de aminoácido en la posición del aminoácido de glicina 120. De manera preferida, la modificación es una sustitución de la glicina 120 por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de arginina, lisina, triptófano, tirosina, fenilalanina o ácido glutámico. En una modalidad preferida de la ¡nvención, la modificación es la sustitución de la glicina 120 con un residuo de aminoácido de arginina. En una modalidad preferida adicional de la invención, el dominio de unión a la prolactina modificado, comprende una modificación de la glicina 129. De manera preferida, la modificación es la sustitución de la glicina 129 con un residuo de aminoácido de arginina. De manera preferida, la modificación comprende además la supresión de al menos 9, 10, 11 , 12, 13 ó 14 residuos de aminoácidos amino terminales. En una modalidad preferida adicional de la invención, el polipéptido comprende además un dominio de unión al ligando de un receptor de la citocina. De manera preferida, el receptor es un receptor de la hormona de crecimiento. En una modalidad preferida alterna de la ¡nvención, el receptor es un receptor de prolactina. En una modalidad preferida de la ¡nvención, el dominio de unión al ligando puede enlazarse dominio de unión de citocina por un enlazante que comprende o consiste de una región helicoidal inflexible. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con la invención.

En una modalidad preferida de la invención, la molécula de ácido nucleico es un vector adaptado para la expresión del polipéptido. Típicamente, la adaptación incluye la provisión de secuencias de control de la transcripción (secuencias del promotor), que median la expresión específica de la célula/tejido. Estas secuencias promotoras pueden ser específicas de la célula/tejido, inducibles o constitutivas. Promotor es un término reconocido en la técnica y, por claridad, incluye las siguientes características que se proporcionan como ejemplo únicamente. Los elementos mejoradores son secuencias de ácido nucleico que actúan en cis, encontradas con frecuencia en la dirección 5' al sitio de inicio de la transcripción de un gen (los mejoradores también pueden encontrarse en la dirección 3' de una secuencia génica o localizarse incluso en secuencias intrónicas y son por lo tanto independientes de la posición). Los mejoradores funcionan para incrementar la velocidad de transcripción del gen al cual está enlazado el mejorador. La actividad del mejorador es sensible a los factores de transcripción que actúan en trans (polipéptidos) que han mostrado unirse de manera específica a los elementos del mejorador. La unión/actividad de los factores de transcripción (véase, por favor, Eukaryotic Transcription Factors, de David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diego), es sensible a varias indicaciones que incluyen, por ejemplo, metabolitos intermediarios (por ejemplo, glucosa), efectores ambientales (por ejemplo, calor).

Los elementos del promotor también incluyen el llamado recuadro TATA y las secuencias de selección de inicio del ARN polimerasa (RIS), que funcionan para seleccionar un sitio de inicio de la transcripción.

Estas secuencias también se unen a polipéptidos que funcionan, inter alia, para facilitar la selección del inicio de la transcripción por la ARN polimerasa. Las adaptaciones también incluyen la provisión de marcadores seleccionables y secuencias de replicación autónomas, que facilitan el mantenimiento del vector en la célula eucariótica o procariótica. Los vectores que se mantienen de manera autónoma, se refieren como vectores episomales. Las adaptaciones que facilitan la expresión de los genes codificados por el vector, incluyen la provisión de secuencias de terminación de la transcripción/poliadenilación. Esto también incluye la provisión de sitios de entrada del ribosoma interno (IRES) que funcionan para maximizar la expresión de los genes codificados por el vector colocados en casetes de expresión bicistrónicos o multicistrónicos. Estas adaptaciones son bien conocidas en la técnica. Hay una cantidad significativa de literatura publicada con respecto a la construcción del vector de expresión y a las técnicas de ADN recombinante en general. Favor de ver, Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY, y las referencias en el mismo; Marston, F (1987) ADN Cloning Techniques: A Practical Approach Vol lll IRL Press, Oxford RU; ADN Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols ¡n Molecular Bíology, John Wiley & Sons, Inc. (1994). Será evidente para alguien con experiencia en la técnica que los vectores de acuerdo con la invención pueden ser vectores para terapia génica. Los vectores para terapia génica son típicamente basados en virus. Varios virus se utilizan comúnmente para el suministro de genes exógenos. Los vectores empleados comúnmente incluyen virus de ADN y ARN modificados de manera recombinante, envueltos o no envueltos, seleccionados de manera preferida de baculoviruses, parvoviruses, picornoviruses, herpesviruses, poxviruses, adenoviruses o picornaviruses. También pueden emplearse vectores quiméricos, que explotan los elementos ventajosos de cada una de las propiedades del vector original (véase, por ejemplo, Feng, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870). Tales vectores virales pueden ser del tipo silvestre o pueden modificarse mediante técnicas de ADN recombinante para que sean deficientes para la replicación, se repliquen condicionalmente o sean competentes para la replicación. Los vectores preferidos se derivan de genomas adenoviral, viral adenoasociado y retroviral. En la práctica más preferida de la invención, los vectores se derivan del genoma del adenovirus humano. Los vectores particularmente preferidos se derivan de los serotipos 2 ó 5 del adenovirus humano. La capacidad de replicación de tales vectores puede estar atenuada (al punto de ser considerados "deficientes para la replicación"), mediante modificaciones o supresiones en las regiones codificantes E1a y/o E1b. Se prefieren otras modificaciones al genoma viral para lograr características de expresión particulares o para permitir la administración repetida o una respuesta inmune más baja. De manera alterna, los vectores virales pueden replicarse condicionalmente o ser competentes para la replicación. Los vectores virales que se replican condicionalmente, se utilizan para lograr la expresión selectiva en tipos celulares particulares, mientras se evita la infección por amplio espectro indeseada. Los ejemplos de vectores que se replican condicionalmente se describen en Pennisi, E. (1996) Science 274:342-343; Russell, y SJ. (1994) Eur. J. of Cáncer 30A(8):1 65-1171. Los ejemplos adicionales de vectores que se replican selectivamente incluyen aquellos vectores en donde un gen esencial para la replicación del virus está bajo el control del promotor, que es activo únicamente en un tipo celular o estado celular particular, de manera que en la ausencia de la expresión del tal gen, el virus no se replicará. Los ejemplos de tales vectores se describen en Henderson, et al., Patente de Estados Unidos No. 5,698,443 expedida en Diciembre 16, de 1997, y en Henderson, et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,871 ,726, expedida en Febrero 16, de 1999, las enseñanzas completas de las cuales se incorporan aquí como referencia. Además, el genoma viral puede modificarse para incluir los promotores inducibles que logran la replicación o expresión sólo bajo ciertas condiciones. Los ejemplos de promotores inducibles son conocidos en la literatura científica (véase, por ejemplo, Yoshida y Hamada (1997) Biochem.

Biophys. Res. Comm. 230:426-430; lida, et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059; Hwang, et al. (1997) J. Virol 71(9):7128-7131 ; Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105; y Dreher, et al. (1997) J. Biol. Chem 272(46); 29364-29371. Los vectores también pueden ser no virales y están disponibles de varias fuentes comerciales fácilmente disponibles para la persona con experiencia en la técnica. Por ejemplo, los vectores pueden ser plásmidos que pueden ser episomales o integrantes. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una célula transformada o transfectada con un ácido nucleico o un vector de acuerdo con la invención. En una modalidad preferida de la invención, la célula es una célula eucariótica. De manera preferida, la célula eucariótica se selecciona del grupo que consiste de: una célula de hongo, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia spp; moho de limo (por ejemplo, Dictyostelium spp); células de insecto (por ejemplo, Spodoptera frugiperda); una célula de planta; o una célula de mamífero (por ejemplo, célula CHO). En una modalidad preferida alterna de la invención, la célula es una célula procariótica. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para preparar un polipéptido de acuerdo con la invención, el método comprende los pasos de; i) cultivar una célula de acuerdo con la invención en condiciones que conduzcan a la producción de un polipéptido de acuerdo con la invención; y ii) aislar el polipéptido de la célula, o su medio de cultivo. En un método preferido de la invención, el polipéptido se proporciona con una marca de afinidad. Las marcas de afinidad se conocen en la técnica e incluyen, proteína que se une a la maltosa, glutatíon S transferasa, proteína que se une a la calmodulina y el diseño de pistas de polihistidina en proteínas que se purifican a continuación mediante purificación por afinidad en matrices que contienen níquel. En muchos casos, los vectores y/o equipos comercialmente disponibles pueden utilizarse para fusionar una proteína de interés a una marca de afinidad adecuada, que se transfecta posteriormente en una célula hospedera para la expresión y la extracción y purificación subsiguiente en una matriz de afinidad. En nuestra solicitud copendiente, la WO 03/034275, el contenido de la cual se incorpora como referencia, describimos una marca de afinidad novedosa para polipéptidos, que utiliza un dominio que utiliza una secuencia de la señal que dirige la adición de glicosilfosfatidilinositol al polipéptido. Los polipéptidos que incluyen una marca de glicosilfosfatidilinositol se insertan de manera preferida en membranas lipídicas y pueden tener efectos antagonistas en la activación del receptor de la citocina. Por lo tanto, la invención descrita en la presente, abarca polipéptidos con una molécula glicosilfosfatidilinositol unida. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un polipéptido que comprende un iniciador dominio de unión a la citocina enlazado a un segundo dominio de unión a la citocina, en donde el polipéptido comprende además un dominio extracelular de un receptor de la citocina. En una modalidad preferida de la invención, el iniciador y segundo dominios de unión se enlazan por una molécula enlazante flexible. En una modalidad preferida alterna de la invención, el iniciador y segundo dominios de unión están enlazados por una molécula enlazante peptídica que comprende una región helicoidal inflexible. En una modalidad preferida de la invención, el iniciador y segundo dominios de unión están enlazados por una molécula enlazante peptídica, que comprende una región helicoidal inflexible y una región no helicoidal flexible. Los enlazantes peptídicos que comprenden las regiones helicoidales inflexibles y combinaciones de regiones helicoidales inflexibles y regiones no helicoidales flexibles, se han descrito previamente en lo anterior, y son aplicables a esta modalidad de la invención, puesto que son citocinas y receptores de la citocina previamente especificados. En una modalidad preferida de la invención, el dominio extracelular del receptor de la citocina está enlazado al iniciador o al segundo dominios de unión a la citocina vía una molécula enlazante. De manera preferida, la molécula enlazante comprende una región helicoidal inflexible. En una modalidad preferida alterna de la ¡nvención, la molécula enlazante es flexible. De manera preferida, la molécula enlazante comprende una región helicoidal inflexible y una región no helicoidal flexible. En una modalidad preferida de la invención, el dominio de unión a la citocina, es la hormona de crecimiento, o una variante de la hormona de crecimiento, y el dominio extracelular es un dominio extracelular de la hormona de crecimiento. De manera preferida, los dominios son humanos. El polipéptido de la invención puede demostrar funcionalidad doble. Iniciadoro, el iniciador y segundo dominios que comprenden citocinas, o partes de las mismas, que están enlazados de manera preferida por una molécula enlazante peptídica que comprende una región helicoidal inflexible, son capaces de unirse a los receptores de la citocina de la superficie celular e impedir estéricamente la asociación de estos receptores en los complejos del receptor, evitando así la señalización de la célula corriente abajo. En segundo lugar, la provisión de un tercer dominio que comprende receptores de citocinas, o partes de los mismos, son capaces de funcionar como un receptor soluble, ligando así cualquier citocina, antes de su unión al receptor de la superficie celular. Este tercer dominio está enlazado de manera preferida al iniciador y segundo dominio mediante una molécula enlazante peptídica que comprende una región helicoidal inflexible. En una modalidad alterna de la invención, el tercer dominio está enlazado de manera preferida al iniciador o segundo dominio por una molécula enlazante peptídica que comprende una región no helicoidal flexible. En una modalidad preferida de la invención, las moléculas enlazantes peptídicas comprenden además una secuencia de aminoácidos que es sensible a la escisión proteolítica. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un polipéptldo o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención como un producto farmacéutico. De manera preferida, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido o la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. De manera preferida, la composición farmacéutica comprende un portador, excipiente y/o diluyente. Cuando se administran, las composiciones terapéuticas de la presente invención se administran en preparaciones farmacéuticamente aceptables. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos. Tales preparaciones pueden contener de manera rutinaria sales, agentes amortiguantes, portadores compatibles, conservadores y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Cuando se utilizan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero pueden utilizarse de manera conveniente sales no farmacéuticamente aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas, y no están excluidas del alcance de la invención. Tales sales farmacológica y farmacéuticamente aceptables incluyen, de manera no exclusiva, aquéllas preparadas de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y lo similar. También, las sales farmacéuticamente aceptables pueden prepararse como sales de metal alcalino o alcalinotérreo, tales como sales de sodio, potasio o calcio. Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes amortiguantes adecuados, incluyendo: ácido acético en una sal; ácido cítrico en una sal; ácido bórico en una sal; y ácido fosfórico en una sal. Las composiciones pueden combinarse, si se desea, con un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador farmacéuticamente aceptable", como se utiliza en la presente, significa uno o más rellenos, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidas o líquidas compatibles, que son adecuadas para la administración a un humano. El término "portador" denota un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, que con el ingrediente activo se combina para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de comezclarse con las moléculas de la presente invención, y unos con otros, de una manera tal que no hay interacción sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse de manera conveniente en una forma de dosificación unitaria, y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Todos los métodos incluyen el paso de llevar el agente activo en asociación con un portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan llevando de manera uniforme e íntima el compuesto activo en asociación con un portador líquido, un portador sólido finamente dividido o ambos, y a continuación, si es necesario, dar forma al producto. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener, opcionalmente, conservadores adecuados, tales como: cloruro de benzalconio; clorobutanol', parabenos y timerosal. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse mediante cualquier ruta convencional, incluyendo inyección o mediante infusión gradual con el tiempo. La administración puede, por ejemplo, ser oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, ¡ntracavidad, subcutánea o transdérmica. Las composiciones adecuadas para la administración oral pueden presentarse como unidades discretas, tales como cápsulas, tabletas, grageas, cada una que contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo. Otras composiciones incluyen suspensiones en líquidos acuosos o líquidos no acuosos, tales como un jarabe, elixir o una emulsión. Las composiciones de la invención se administran en cantidades efectivas. Una "cantidad efectiva" es aquella cantidad de una composición que sola, o junto con dosis adicionales, produce la respuesta deseada. En el caso de tratar una enfermedad particular, tal como cáncer, la respuesta deseada es inhibir la progresión de la enfermedad. Esto puede involucrar únicamente disminuir la progresión de la enfermedad temporalmente, aunque de manera más preferida, involucra detener la progresión de la enfermedad de manera permanente. Esto puede verificarse mediante métodos de rutina. Tales cantidades dependerán, por supuesto, de la condición particular siendo tratada, la severidad de la condición, los parámetros del paciente individual incluyendo edad, condición física, talla y peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), la ruta específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y experiencia del practicante de la salud. Estos factores son bien conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica y pueden tratarse con no más que la experimentación de rutina. Se prefiere generalmente que se utilice una dosis máxima de los componentes individuales o combinaciones de los mismos, esto es, la dosis segura más alta de acuerdo con el juicio médico sólido. Se entenderá por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica, sin embargo, que un paciente puede insistir en una dosis menor o una dosis tolerable por razones médicas, razones sicológicas o por virtualmente cualquier otras razones. En un aspecto adicional de la ¡nvención, se proporciona el uso de un polipéptido o molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de; acromegalia; gigantismo; deficiencia de la GH; Síndrome de Turner; falla renal; osteoporosis; osteoartritis; diabetes mellitus; cáncer (por ejemplo, cáncer de próstata, un cáncer cervical, un cáncer de mama, melanoma, hepatoma, cáncer renal, glioma, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer neural, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer pancreático, cáncer gastrointestinal, linfoma); obesidad; resistencia a la insulina; hiperlipidemia; hipertensión; anemia; enfermedad autoinmune e infecciosa; trastornos inflamatorios, incluyendo artritis reumatoide. La invención también proporciona un método para tratar a un humano o sujeto animal, que comprende administrar una cantidad efectiva de un polipéptido, molécula de ácido nucleico, composición farmacéutica o medicamento al sujeto. A través de la descripción y las reivindicaciones de esta especificación, las palabras "comprende" y "contiene" y variaciones de tales palabras, por ejemplo "que comprende" y "comprenden", significan "incluyendo de manera no exclusiva", y no pretenden (y no lo hacen), excluir otras porciones, aditivos, componentes, enteros o pasos. A través de la descripción y las reivindicaciones de esta especificación, el singular abarca el plural a menos que el contexto lo requiera de otra manera. En particular, en donde se utiliza el artículo indefinido, la especificación se entenderá como que contempla la pluralidad así como la singularidad, a menos que el contexto lo requiera de otra manera. Los rasgos, enteros, características, compuestos, porciones químicas o grupos descritos en conjunto con un aspecto particular, modalidad o ejemplo de la invención, se entenderán como aplicables a cualquier otro aspecto, modalidad o ejemplo descrito en la presente, a menos que sea incompatible con el mismo. Las modalidades de la ¡nvención se describirán ahora a manera de ejemplo únicamente y con referencia a las siguientes figuras, en donde: Figura 1A. Los dominios de la citocina (óvalos), se conectan por una hélice alfa (rectángulo sombreado). Los enlazantes flexibles (flechas curvas), conectan el iniciador dominio de la citocina a la hélice y la hélice al segundo dominio de la citocina; Figura 1 B. Los dominios de la citocina están conectados por una hélice alfa. Los enlazantes flexibles conectan el iniciador dominio de la citocina al enlazante helicoidal y el enlazante helicoidal al segundo dominio de la citocina; Figura 2. El enlazante helicoidal no tiene conectores flexibles, en su lugar, continúa la hélice C terminal (4) de la citocina 1 y la une a la hélice N terminal (T) de la citocina 2 para formar una cascada rígida enlazada por una sola hélice 4 iarga-hélice enlazante-1 '. La orientación relativa de los dos dominios de la citocina es fija por lo tanto. Sin embargo, haciendo diferentes constructos agregando o retirando aminoácidos del enlazante, es posible generar una serie de cascadas rígidas en las cuales los dominios están orientados de manera diferente; La Figura 3 ¡lustra un mapa y la secuencia nucleotídica/de aminoácidos para el constructo ?lC1b; La Figura 4 ¡lustra una generalidad del diseño del enlazante y los cebadores utilizados para generar las cascadas con los enlazantes helicoidales con extremos flexibles; Las Figuras 5A-5B ¡lustran El diseño de las regiones límite entre los dominios GH y el enlazante para permitir el ligado de los dúplex del cebador para producir enlazantes helicoidales ininterrumpidos entre los dominios como se observa en la figura 5A. Los cebadores utilizados para modificar ?lC1 b para generar ?lC5 como se observa en la figura 5B; La Figura 6 ilustra un mapa del constructo ?lC5 y la secuencia de la región del enlazante; La Figura 7 ¡lustra una generalidad del diseño del enlazante y los cebadores utilizados para generar las cascadas con enlazantes helicoidales rígidos; La Figura 8 ilustra un diagrama esquemático que muestra la estrategia para la construcción de ?lL1 ; La Figura 9 ¡lustra la secuencia nucleotídica de ?lL Los dominios de GH se muestran en gris, el dominio GHR en negrillas y los enlazantes subrayados; La Figura 10 ¡lustra la secuencia de aminoácidos de ?lL1. Los dominios de GH se muestran en gris, el dominio GHR en negrillas y los enlazantes subrayados; La Figura 11 ilustra un diagrama esquemático que muestra la estrategia de clonación para la construcción de ?lL1 ; La Figura 12 ilustra la expresión de ?lL1 ; La Figura 13 ¡lustra una purificación preliminar de ?lL1-His. ?lL1-His se purificó utilizando una columna de CO2+; La Figura 14 ilustra que ?lL1 muestra actividad agonista; La Figura 15 resume la nomenclatura utilizada con respecto a los constructos de GH rígidos o semirrígidos; Las Figuras 16A-16E muestran la secuencia de ácido nucleico de una cascada GH que comprende una secuencia enlazante semirrígida como se observa en la figura 16A; la secuencia de aminoácidos de una cascada GH que comprende una secuencia enlazante semirrígida como se observa en la figura 16B; los ejemplos de enlazantes semirrígidos utilizados en la construcción de cascadas GH como se observa en la figura 16C; la expresión bacteriana de las cascadas GH que comprende enlazantes semirrígidos como se observa en la figura 16D; y la bioactividad de las cascadas GH que comprenden enlazantes semirrígidos como se observa en la figura 16E; y Las Figuras 17A-17E muestran la secuencia de ácidos nucleicos de una cascada GH que comprende una secuencia enlazante rígida como se observa en la figura 17A; la secuencia de aminoácidos de una cascada GH que comprende una secuencia enlazante rígida como se observa en la figura 17B; los ejemplos de enlazantes rígidos utilizados en la construcción de cascadas GH como se observa en la figura 17C; la expresión bacteriana de cascadas GH que comprenden enlazantes rígidos como se observa en la figura 17D; y la bioactividad de las cascadas GH que comprenden los enlazantes rígidos como se observa en la figura 17E. La Figura 18A ilustra la purificación de T1cEAK2+3his y un análisis mediante tinción con coomassie y western blot; las Figuras 18B y 18C ¡lustran la bioactividad de T1cEAK2+3his; la Figura 18D ilustra la purificación de T1cEAK2+4his y el análisis mediante tinción con coomassie y western blot; y la Figura 18E y 18F ilustran la bioactividad de T1cEAK2+4his; La Figura 19 es una ilustración esquemática de las cascadas de la hormona de crecimiento enlazadas mediante enlazantes flexibles, semirrígidos y rígidos; Las Figuras 20A y 20B ilustran las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de prolactina y una de sus formas antagonistas, el mutante G129R truncado en los aminoácidos 1-14 (subrayado); Las Figuras 21 A y 21 B ¡lustran las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de la hormona de crecimiento y su forma antagonista, el mutante G120R (subrayado); La Figura 22 es una ilustración esquemática de una cascada de prolactina; y La Figura 23A es un esquema de los constructos en cascada rígidos de GH con los sitios de restricción diseñados, Noti y ?/ft/I, que permiten la conexión del enlazante directamente a las hélices terminales de los dominios cercanos y también facilita la variación del enlazante. La figura 23B es un esquema del constructo rígido PRL-enlazante-GH con los sitios de restricción diseñados, Not\ y Nru\, que tienen funciones similares a la figura 23A, el sitio Not\ está en la región del enlazante y, por lo tanto, sólo puede anexarse al gen PRL trunco en el dominio A. La figura 23C es un diagrama esquemático de la cascada rígida de PRL, un sitio de restricción único que necesita diseñarse, utilizando el código de aminoácidos degenerados, en el límite entre el enlazante y el PRL en el dominio B para permitir la síntesis y modificación fácil del gen en cascada.

Materiales y métodos La modificación del enlazante en la cascada GH se inició del gen para la molécula GH-(G4S)-GH (?lC1 ), que se ha modificado para eliminar una saliente de 30 aminoácidos del término N de la proteína expresada, el gen también se subclonó en un vector pET21(+) modificado, para proporcionar pET21 :?lC1 b (Figura 3). Para los constructos con los enlazantes helicoidales con extremos flexibles, el enlazante se construyó ligando oligonucleótidos complementarios; estos oligonucleótidos se diseñaron para codificar el enlazante deseado y para tener extremos que se ligarían en el vector, pET21 :?lC1 b, que se ha digerido con Noti y EcoRI. Una generalidad de estos enlazantes se muestra en la Figura 4. Para el enlazante rígido entre los dominios GH, los dominios GH tuvieron que modificarse para truncar sus términos C (GH1 ) y términos N (GH2), de manera que los dominios terminaran en el extremo de las hélices.

A continuación se diseñaron los sitios de restricción, utilizando el tratamiento del codón degenerado, que permitiría que los nuevos enlazantes se introdujeran sin ninguna interrupción a la hélice que se formaría entre los dos dominios (Figura 5A). Se diseñaron los cebadores para llevar a cabo estas modificaciones a los dominios GH de la cascada GH (Figura 5B). El constructo resultante se designó ?lC5 (Figura 6). Los oligonucleótidos complementarios se utilizaron para generar la región del enlazante flanqueada por sitios Noti y Nru\, estos se ligaron a continuación en pET21 :?lC5, que se había digerido con Non y Nru\. Una generalidad de estos enlazantes se muestra en la Figura 7. La expresión de los constructos se llevará a cabo transformando iniciadoro el vector de expresión pET en la cepa de expresión, de E. coli BL21(DE3) CodonPlus RIPL. La expresión puede llevarse a cabo bajo varias condiciones diferentes, que incluyen diferentes temperaturas de incubación (por ejemplo, temperatura ambiente, 37°C), diferente medio (por ejemplo, LB, 2YT, 5YT, etc.), diferentes puntos de inducción (es decir, OD6oo en la cual el cultivo se induce), diferentes concentraciones de IPTG (u otro inductor), utilizadas para inducir el cultivo, y el tiempo al cual las células se recolectan postinducción. Una marca His puede agregarse al término C del constructo, lo cual facilitaría su purificación utilizando cromatografía por afinidad con ¡on metálico inmovilizado (con columnas de Ni2+ o Co2+). Los constructos que no tienen esta marca His pueden purificarse utilizando una variedad de medios tales como cromatografía de intercambio de iones, columnas hidrofóbicas y cromatografía por exclusión de tamaño. Una o más de estas técnicas de purificación pueden requerirse para producir una proteína de una pureza adecuada.

Construcción de ylC5 Los dominios GH modificados se generaron utilizando PCR y los cebadores relevantes. GH1 se modificó utilizando DiGHNcoGF y GH[AEA3]NotR y GH2 se modificó con Ecol-(Nru)GH-F y GH?*-HR. Las reacciones de PCR consistieron de; 1 µl de 100 pmoles/µl del cebador hacia adelante, 1 µl de 100 pmoles/µl del cebador inverso, 1 µl de pTrcHisGHstop (diluido), 1 µl de dNTPs 10 mM, 5 µl 10x de amortiguador de amplificación, 1 µl de MgSO4 50 mM, 0.5 µl de Pfx polimerasa, 39.5 µl de agua estéril. La PCR se realizó en estas mezclas de reacción utilizando el siguiente perfil térmico; 95°C durante 5 minutos; 15 x (95°C durante 45 segundos, 55°C durante 45 segundos, 72°C durante 45 segundos); 72°C durante 5 minutos. Los productos de la PCR se verificaron utilizando un gel de agarosa y el producto deseado de la PCR se purificó. El GH1 modificado se ligó en pET21 :?lC1b, entre los sitios ?/col y Non, para proporcionar pET21 :?lC4. El GH2 modificado se ligó en pET21 :?lC4, entre los sitios EcoRI y HindWl, para proporcionar pET21 :?lC5. Una generalidad de este procedimiento se muestra en la Figura 8.

Variación del enlazante Fosforilación de los cebadores Cuando 2 o más dúplex de cebadores se requieren para generar el enlazante, los cebadores que contienen el extremo 5' se fosforilaron iniciadora. La siguiente mezcla de reacción se hizo para cada cebador a ser fosforilado: 2 µl de 100 pmoles/µl de oligonucleótídos, 2 µl 10x de Amortiguador de Cinasa, 2 µl de ATP 10 mM, 13 µl se agua estéril, 1 µl de la cinasa del polinucleótido T4 (10U/µl). Estos se incubaron durante 30 minutos a 37°C y a continuación a 70°C durante 10 minutos. Las muestras se diluyeron a continuación a 1 :10, utilizando Amortiguador de Recocido (TRIS 10 mM, NaCI 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7.5-8.0), para obtener una solución de 0.1 pmoles/µl. Esto puede utilizarse a continuación en la reacción de recocido, siguiente.

Recocido de los dúplex de cebador Los cebadores se diluyeron a 0.1 pmoles/µl utilizando Amortiguador de Recocido (TRIS 10 mM TRIS, NaCI 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7.5-8.0). 10 µl de los cebadores complementarios se mezclaron en un tubo nuevo. El tubo se incubó a continuación a 95°C durante 2 minutos, y la temperatura se dejó caer a 30°C durante un periodo de 40-60 minutos. En los casos en donde se requieren más de un dúplex del cebador, volúmenes iguales de los dúplex del cebador se mezclaron para proporcionar una solución que contiene todos los dúplex del cebador necesarios para formar el enlazante deseado. Las soluciones se mantuvieron a continuación en hielo.

Ligación y transformación Aproximadamente 200 ng del vector digerido con las enzimas de restricción relevantes (por ejemplo, pET21 :?lC1b digerido con Noti y EcoRI o pET21 :?lC5 digerido con Noti y Nru\), se incubaron con 4 µl de los cebadores recocidos, 1 µl de amortiguador de ligasa, 2 µl de ADN ligasa T4 y la reacción se aforó a 10 µ! con agua estéril. Estos se incubaron durante la noche en un vaso de precipitados con hielo, que se dejó congelar durante este tiempo. 5 µl de la ligación durante la noche se agregaron a continuación a 50 µl de células SURE de E. coli químicamente competentes. Estas se incubaron en hielo durante 1 hora, a continuación se sometieron a choque con calor a 42°C durante 30 segundos. Se agregaron 450 µl de medio LB a las células, y a continuación la muestra se incubó durante 30 minutos a 37°C. El minicultivo se centrifugó a continuación durante 5 minutos a 4000 rpm, la pelotilla resultante se resuspendió en 50 µl de medio LB, y a continuación se emplacó en placas LB que contienen carbenicilina (100 µg/ml), tetraciclina (10 µg/ml) y glucosa (0.3% peso/volumen). Esto se incubó durante la noche a 37°C. Las colonias resultantes se seleccionaron a continuación para verificar si la variación del enlazante fue exitosa.

Modificaciones a la estrategia general La generación de los constructos con enlazantes rígidos utilizando las enzimas de restricción Noti y Nru\ para digerir pET21 :?lC5, generaron un gran número de colonias en las placas de control negativo (sin dúplex del cebador en la reacción de ligación) después de la transformación, por lo tanto, fue difícil seleccionar las clonas positivas. Esto se rectificó desfosforilando el vector digerido; 15µl de pET21:?lC5 digeridos con Noti y Nru\, se mezclaron con 2 µl de amortiguador CIAP 10x, 1 µl de CIAP (Fosfatasa Alcalina Intestinal de Becerro) (10 U/µl) y 2 µl de agua estéril. Esto se incubó a 37°C durante 1 hora, y a continuación a 80°C durante 30 minutos. El ADN se limpio a continuación de la solución utilizando un equipo de purificación (por ejemplo, Equipo de Purificación con PCR de Qiagen PCR). Todos los cebadores utilizados para hacer los dúplex del cebador se fosforilaron utilizando el método descrito anteriormente. Los dúplex del cebador fosforilado se ligaron a continuación en el vector desfosforilado como se describió anteriormente.

Clonación y expresión de ylL1 ?lL1 consiste de dos dominios de la hormona de crecimiento GH seguidos por un solo dominio extracelular de la hormona de crecimiento, cada uno de estos dominios están enlazados realmente con un enlazante (Gly4Ser)4 (Figura 8). La secuencia nucleotídica de ?lL1 se muestra en la Figura 9 y la secuencia de aminoácidos se proporciona en la Figura 10. ?lL1 se construyó ligando el gen hGH flanqueado por los sitios Nhel y Xhol en ?lE2 (GHRa-GH-GHRb); esto proporcionó ?lK1. El dominio GHR se ligó a continuación en ?lK1 entre los sitios EcoRI y HindWl para proporcionar ?lL1. Un diagrama esquemático de este procedimiento se muestra en la Figura 11. El gen ?lL1 se verificó mediante el secuenciamiento y se demostró que es correcto. La expresión se llevó a cabo utilizando un vector pET21 (+) modificado en células de E. coli BL21(DE3) CodonPlus RIPL. La proteína expresada en el medio LB 4 horas después de la inducción con IPTG 1 mM (concentración final) a una OD6oo de 0.5-0.6, fue parcialmente soluble y se observaron múltiples bandas Mw en el western blot sondeado contra GH (Figura 12). Una versión marcada con His C terminal de ?lL1 , se purificó utilizando una columna de Co2+ (Figura 13). Varias de las proteínas contaminantes que permanecieron en la preparación de la proteína y múltiples bandas Mw se observaron todavía en el western blot. Los bioensayos preliminares de esta preparación de la proteína mostraron que tenía una actividad agonista significativa (Figura 14).

Construcción de las cascadas de prolactina y cascadas de prolactina:hormona de crecimiento Los constructos de las cascadas de PRL y GH se generaron utilizando técnicas de PCR estándar, seguidas por la ligación y transformación del vector preparado. El enlazante puede variarse ligando y transformando los pares oligonucleotídicos recosidos en vectores preparados. Tres estrategias ejemplares se muestran a continuación para el constructo de la cascada de PRL y GH.

Estrategia 1 Generación de PRL-(G4S)4-PRL 1. PCR PRL entre los sitios Ncol y Noti (cebador hacia adelante = atatccatqggcTTGCCCATCTGTCC; cebador inverso = atatatatatatgggcggccgccGCAGTTGTTGTTGTGG). 2. Digerir el producto de la PCR con Ncol y Nofí. 3. Digerir el vector receptor con Ncol y Noti ? pET21(m)?lC1 b (es decir, GH-(G4S)4-GH). 4. Ligar el producto de la PCR en el vector; para proporcionar pET21 (m)PRL-(G4S)4-GH. 5. PCR PRL entre los sitios EcoRI y HindWW (cebador hacia adelante = atatqaattcTTGCCCATCTGTCC; cebador inverso atataagcttGCAGTTGTTGTTGTGG). 6. Digerir el producto de la PCR con EcoRI y HindlW. 7. Digerir el vector receptor con EcoRI y HindWl ? pET21 (m)PRL-(G4S)4-GH. 8. Ligar el producto de la PCR en el vector; para proporcionar pET21 (m)PRL-(G4S)4-PRL.

Estrategia 2 Generación de PRL-A(EA3K)2A -GH 1. PCR PRL entre los sitios Ncol y Notl (cebador hacia adelante = atatccatgggcTTGCCCATCTGTCC; cebador inverso = atatatatatatgggcggccgccGCAGTTGTTGTTGTGG). 2. Digerir el producto de la PCR con Ncol y Notl. 3. Digerir el vector receptor con Ncol y Notl -» pET21(m)TlaEAK2 (es decir, GH-A(EA3K)2A-GH). 4. Ligar el producto de la PCR en el vector; para proporcionar PRL-A(EA3K)2A-GH.

Estrategia 3 Generación de PRL-A(EA3K)4A-PRL 1. Recocer los cebadores para la generación del enlazante A(EA3K)4A. 2. Digerir el vector receptor con Noti y EcoRI ? pET21(m)PRL-(G4S)4-PRL (del ejemplo 1 anterior). 3. Ligar el dímero oligonucleotídico en el vector; para proporcionar PRL-A(EA3K)4A-PRL. La estrategia anterior se ilustra en la Figura 22.

EJEMPLO 1 Cascadas semirrígidas Las células de E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL, se cultivaron en 10 ml de medio LB suplementado con carbenicilina, tetraciclina y cloranfenicol. Las células se cultivaron agitando a 37°C. Los cultivos se indujeron a una OD60o de 0.4-0.7, utilizando IPTG a una concentración final de 1 mM. Los cultivos se cultivaron durante 4 horas adicionales antes de la recolección. Las células se usaron utilizando una combinación de lisozima, desoxicolato de sodio y sonicación. La fracción soluble se aisló a continuación mediante centrifugación. Los geles de PAGE teñidos con coomassie no mostraron bandas obvias para la expresión en cascada. La fracción soluble se determinó mediante ELISA, y 40 ng/pozo de la cascada se cargaron en un gel de PAGE al 12%. La proteína se transfirió a una membrana PVDF y se sometió a western blot utilizando Ab anti-GH de conejo (primario) y Ab anti-HRP de conejo (secundario); véase la Figura 16D. La bioactividad de una cascada GH que comprende un enlazante semirrígido se muestra en la Figura 16E.

EJEMPLO 2 Cascadas rígidas Las células de E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL, se cultivaron en 10 ml de medio LB suplementado con carbenicllina, tetraciclina y cloranfenicol. Las células se cultivaron agitando a 37°C. Los cultivos se indujeron a una OD6oo de 0.4-0.7, utilizando IPTG a una concentración final de 1 mM. Los cultivos se cultivaron durante 4 horas adicionales antes de la recolección. Las células se usaron utilizando una combinación de lisozima, desoxicolato de sodio y sonicación. La fracción soluble se aisló a continuación mediante centrifugación. Los geles de PAGE teñidos con coomassie no mostraron bandas obvias para la expresión en cascada. La fracción soluble se determinó mediante ELISA, y 40 ng/pozo de la cascada se cargaron en un gel de PAGE al 12%. La proteína se transfirió a una membrana PVDF y se sometió a western blot utilizando Ab anti-GH de conejo (primario) y Ab anti-HRP de conejo (secundario); véase la Figura 17D. La bioactividad de una cascada GH que comprende un enlazante semirrígido se muestra en la Figura 17E.

EJEMPLO 3 Purificación de las cascadas Los constructos T1cEAK2+3Hls y T1cEAK2+4His se listaron de manera corta para un estudio adicional basándose en sus actividades supramáximas iniciales en el bioensayo. El plásmido de expresión se transformó en células de E. coli BL21(DE3) Codonplus RJPL, y la expresión se llevó a cabo en cultivos de lotes de 1 L. La purificación se realizó en la fracción de la proteína soluble utilizando una combinación de cromatografía por afinidad del ¡on metálico inmovilizado con quelato de Ni (IMAC) y cromatografía por intercambio de iones. La IMAC fue el iniciador paso de purificación, ¡nicialmente la elusión se logró utilizando un gradiente de pH (pH 8 a pH 3); sin embargo, se encontró que un lote de proteína se perdía en los lavados de la columna. Por lo tanto, se volvió a utilizar una elusión de imidazol (imidazol de 0 a 0.5 M), con modificaciones en la estrategia de la purificación, alcanzamos >70% de pureza. A continuación, se utilizó una columna de intercambio de iones (Resource Q), para purificar además la proteína a >90% de pureza. Esto se ilustra en las Figuras 18A-18F. La cuantificación basada en el ELISA resulta: T1cEAK2+3His (RQ 13/4) = 215 µg/ml; T1 cEAK2+3His (RQ14/4) = 177 µg/ml Se obtuvo 1 ml de cada uno, por lo tanto, el rendimiento total fue de 392 µg. Esto se obtuvo de 2 litros de cultivo ? rendimiento por litro = -200 µg La actividad de T1cEAK2+3-His alcanza un aumento en la inducción más alta que rhGH en las concentraciones de proteína más altas. Un resultado similar se obtiene cuando la cascada se prueba en una base molar, véase la Figura 18B y la Figura 18C. Un análisis similar se realizó con respecto a T1cEAK2+4His. La purificación y la bioactividad se ¡lustran en la Figura 18D, 18E y 18F. La cuantificación basada en ELISA resulta de T1 cEAK2+4His (RQ13/4) = 550 µg/ml. Se obtuvo 1 ml de cada uno, por lo tanto, el rendimiento total fue de 550 µg. Esto se obtuvo de 2 litros de cultivo ? rendimiento por litro = -275 µg. La actividad de T1cEAK2+4-His alcanza un aumento de la inducción mayor que rhGH a las concentraciones de proteína más altas. Un resultado similar se obtiene cuando la cascada se prueba en una base molar.

EJEMPLO 4 La concentración de ?lC3 se midió utilizando un Ensayo de Bradford. rhGH (@ 1 mg/ml) se midió en paralelo para verificar la veracidad de los datos obtenidos del Ensayo de Bradford. A continuación se utilizó ?lC3 para reemplazar directamente los estándares de GH en el bioensayo de GH para proporcionar una curva estándar de la cascada. Las muestras puras e impuras de la cascada y de rhGH se midieron contra la curva estándar de GH y la curva estándar de la cascada, la concentración de la proteína se midió a continuación de cada placa de ELISA. El ELISA GH proporciona aproximadamente dos tercios del valor real de las cascadas como se mide mediante estos ELISA. Esto se ilustra en el cuadro 1.

CUADRO 1 EJEMPLO 5 Cascadas de prolactina/GH Las cascadas de prolactina y/o GH, con o sin su mutación antagonista respectiva, pueden sintetizarse utilizando PCR para introducir los sitios de restricción apropiados en cualquier extremo del gen para permitir la ligación en el gen en cascada.

Cascadas flexibles El gen en cascada se construye enlazando dos dominios de proteína con un enlazante flexible, basado en la secuencia (G4S)n; hay sitios de restricción únicos en cada extremo de los dominios de la proteína y el enlazante (Figura 19). Por lo tanto, los dos dominios de la proteína en la cascada pueden variarse ligando en diferentes dominios. Por ejemplo, la prolactina (PRL), el mutante G129R de prolactina con los aminoácidos 1-14 suprimidos (?1-14PRL.G129R), la hormona de crecimiento (GH) y el mutante antagonista G120R de la hormona de crecimiento (GH.G120R), pueden combinarse en el gen en cascada en una variedad de formas (Figura B). Las Figuras 20 y 21 muestran las secuencias nucleotídicas y las secuencias de proteína para estos dominios. La PCR estándar puede utilizarse para generar los genes para el dominio de la proteína deseado a ser flanqueado por los sitios de endohucleasa de restricción apropiados. La digestión del producto de la PCR y el vector receptor con estas endonucleasas de restricción, seguido por la ligación y transformación, generará una cascada con los dominios de la proteína deseados. Este procedimiento puede llevarse a cabo en cualquier dominio de la proteína o en el enlazante (Figura 22), que sería reemplazado utilizando un dímero oligonucleotídico como ya se describió.

Cascadas semirrígidas El gen en cascada se construye enlazando dos dominios de proteína con un enlazante helicoidal basándose en la secuencia A(EA3K)nA; hay sitios de restricción únicos en cada extremo de los dominios de la proteína y el enlazante (Figura 19). Por lo tanto, los dos dominios de la proteína en las cascadas pueden variarse ligando en diferentes dominios. Por ejemplo, la prolactina (PRL), el mutante G129R de prolactina con los aminoácidos 1-14 suprimidos (?1-14PRL.G129R), la hormona de crecimiento (GH) y el mutante antagonista G120R de la hormona de crecimiento (GH.G120R), pueden combinarse en el gen en cascada en una variedad de formas (cuadro 2). Las Figuras 20 y 21 muestran las secuencias nucleotídicas y las secuencias de proteína para estos dominios.

CUADRO 2 La PCR estándar puede utilizarse para generar los genes para el dominio de la proteína deseado a ser flanqueado por los sitios de endonucleasa de restricción apropiados. La digestión del producto de la PCR y el vector receptor con estas endonucleasas de restricción, seguido por la ligación y transformación, generará una cascada con los dominios de la proteína deseados. Este procedimiento puede llevarse a cabo en cualquier dominio de la proteína o en el enlazante (Figura 22), que sería reemplazado utilizando un dímero oligonucleotídico como ya se describió.

Cascadas rígidas Los dos dominios de la cascada no necesitan enlazarse directamente a través de la hélice a del término C del dominio A y la hélice N terminal del dominio B. Por lo tanto, los genes para las proteínas (Figuras 20 y 21 ) en el dominio A y B, necesitan truncarse de manera que el enlazante helicoidal [A[EA3K)nA], se une directamente a estas hélices. Por lo tanto: El gen en cascada se construye enlazando dos dominios de proteína con un enlazante helicoidal basándose en la secuencia A(EA3K)nA; hay sitios de restricción únicos en cada extremo de los dominios de la proteína y el enlazante (Figura 19). Un sitio Notl único se ha diseñado en el extremo N terminal de la región del enlazante y un sitio Nrul único se ha diseñado en el extremo C terminal de GH (Figuras 5A-5B y 6); esto permite la modificación de la región del enlazante en las cascadas GH. La secuencia del enlazante N terminal que incluye el sitio Noti puede unirse directamente a un gen PRL en la posición del dominio A, permitiendo que el constructo basado en la plantilla de PRL-enlazante-GH se construya (Figuras 23A-23C). Sin embargo, un sitio de restricción único tiene que introducirse en el límite entre el enlazante y el dominio B en los casos en donde el dominio B es PRL (Figuras 23A-23C). Por lo tanto, los dos dominios de la proteína en las cascadas pueden variarse ligando en diferentes dominios truncados. Por ejemplo, la prolactina (PRL), el mutante G129R de prolactina con los aminoácidos 1-14 suprimidos (?1-14PRL.G129R), la hormona de crecimiento (GH) y el mutante antagonista G120R de la hormona de crecimiento (GH.G120R), pueden combinarse en el gen en cascada en una variedad de formas (cuadro 2).

Dependiendo de su posición en el dominio A o el dominio B, los dominios de proteína tendrán que truncarse como se describió anteriormente. La PCR estándar puede utilizarse para generar los genes para que el dominio de la proteína deseado esté flanqueado por los sitios de endonucleasa de restricción apropiados. La digestión del producto de la PCR y el vector receptor con estas endonucleasas de restricción, seguido por la ligación y transformación, generará una cascada con los dominios de la proteína deseados. Este procedimiento puede llevarse a cabo en el dominio de la proteína o en el enlazante, y es similar a la metodología utilizada para los enlazantes flexibles y semirrígidos (Figura 22).

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un polipéptido que comprende al menos dos dominios de unión a la citocina capaces de unirse a un receptor de la citocina, en donde los dominios están enlazados por una molécula enlazante peptídica que comprende una región helicoidal inflexible. 2.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los dominios comprenden 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 dominios de unión en un arreglo en cascada. 3.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polipéptido comprende más de 10 dominios en un arreglo en cascada. 4.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque la región helicoidal inflexible comprende al menos una copia del motivo A(EAAAK)XA, o una variante funcional del mismo. 5.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado además porque la molécula enlazante comprende al menos una región no helicoidal flexible. 6.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la región no helicoidal flexible se localiza en, o cerca del extremo amino terminal de la molécula enlazante peptídica. 7 '.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la región no helicoidal flexible se localiza en, o cerca del extremo carboxilo terminal de la molécula enlazante peptídica. 8.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la región no helicoidal flexible se localiza en, o cerca del extremo amino y carboxilo terminal de la molécula enlazante peptídica. 9.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-8, caracterizado además porque la región no helicoidal flexible se localiza adyacente a al menos uno de los dominios de unión. 10.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-9, caracterizado además porque el polipéptido comprende menos que 10 copias del motivo EAAAK. 11.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-9, caracterizado además porque el polipéptido comprende menos que 5 copias del motivo EAAAK. 12.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-11 , caracterizado además porque los dominios de unión están enlazados por una molécula enlazante que consiste de un enlazante helicoidal inflexible. 13.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el enlazante helicoidal enlaza el término carboxilo de un dominio de unión con el término amino de un segundo dominio de unión. 14.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el enlazante helicoidal es continuo entre la hélice C terminal del iniciador dominio de unión y la hélice N terminal del segundo dominio de unión, enlazando así de manera rígida los dos dominios de unión en una orientación sustancialmente fija. 15.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado además porque los dominios de unión del polipéptido son los mismos o similares unos con otros. 16.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el polipéptido comprende dominios de unión de citocinas seleccionadas del grupo que consiste de: hormona de crecimiento; leptina; eritropoyetina; prolactina; interleucínas (IL) IL-2, IL-3, IL-4, lL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11 , la subunidad p35 de la IL-12, IL-13, IL-15; factor que estimula la colonia del granulocito (G-CSF); factor que estimula la colonia del macrófago del granulocito (GM-CSF); factor neurotrófico ciliar (CNTF); cardiotrofina (CT-1 ); factor inhibidor del leucocito (LIF); oncostatina M (OSM); interferón, IFNa e IFN?; factor de necrosis del tumor (TNF)a y TNFß y ligando RANK. 17.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque al menos uno de los dominios comprende un dominio de unión a la hormona de crecimiento, o una variante de la hormona de crecimiento. 18.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizado además porque el polipéptido comprende al menos dos dominios de unión de la hormona de crecimiento, o un polipéptido variante de la hormona de crecimiento. 19.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el polipéptido comprende al menos dos dominios de unión de prolactina o una variante de prolactina. 20.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el polipéptido variante de prolactina comprende una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos está modificada en la posición 129 de la prolactina. 21.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la modificación es una sustitución de aminoácido. 22.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la sustitución reemplaza un residuo de aminoácido de glicina con un residuo de aminoácido de arginina. 23.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-22, caracterizado además porque el polipéptido comprende la supresión de entre 9 y 14 residuos de aminoácidos amino terminales de prolactina. 24.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado además porque los dominios de unión del polipéptido son diferentes unos de otros. 25.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el polipéptido comprende un iniciador dominio de unión que es un dominio de unión a la hormona de crecimiento y un segundo dominio de unión que es un dominio de unión a la prolactina. 26.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el polipéptido consiste de un dominio de unión a la hormona de crecimiento y un dominio de unión a la prolactina. 27.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el polipéptido comprende un iniciador dominio de unión que es un dominio de unión a la hormona de crecimiento modificado, y un segundo dominio de unión que es un dominio de unión a la prolactina modificado. 28.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el polipéptido consiste de un dominio de unión a la hormona de crecimiento modificado y un dominio de unión a la prolactina modificado. 29.- El polipéptldo de conformidad con la reivindicación 27 ó 28, caracterizado además porque el dominio de unión a la hormona de crecimiento modificado comprende una sustitución de aminoácido en la posición del aminoácido de la glicina 120. 30.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la modificación es una sustitución de la glicina 120 para el aminoácido seleccionado del grupo que consiste de arginina, lisina, triptófano, tirosina, fenilalanina o ácido glutámico. 31.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la modificación es la sustitución de la glicina 120 con un residuo de aminoácido de arginina. 32.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-31 , caracterizado además porque el dominio de unión a la prolactina modificado comprende una modificación de la glicina 129. 33.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la modificación es la sustitución de la glicina 129 con un residuo de aminoácido de arginina. 34.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28-32, caracterizado además porque el polipéptido comprende además la supresión de entre 9 y 14 residuos de aminoácidos amino terminales de prolactina. 35.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34, caracterizado además porque el polipéptido comprende un dominio de unión al ligando de un receptor de citocina. 36.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el receptor es un receptor de la hormona de crecimiento. 37.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el receptor es un receptor de prolactina. 38.- Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-37. 39.- El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque el ácido nucleico es un vector adaptado para la expresión del polipéptido. 40.- Una célula aislada transformada o transfectada con el ácido nucleico o el vector de conformidad con la reivindicación 38 ó 39. 41.- La célula aislada de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada además porque la célula es una célula eucariótica. 42.- La célula aislada de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada además porque la célula es una célula procariótica. 43.- Un método para preparar un polipéptido de acuerdo con la ¡nvención, el método comprende los pasos de: i) cultivar una célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-42 en condiciones que conduzcan a la producción de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-37; y ii) aislar el polipéptido de la célula, o de su medio de cultivo. 44.- Un polipéptido que comprende un iniciador dominio de unión a la citocina enlazado a un segundo dominio de unión a la citocina, en donde el polipéptido comprende además un dominio extracelular de un receptor de citocina. 45.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque el iniciador y segundo dominios de unión están enlazados por una molécula enlazante flexible. 46.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque el iniciador y segundo dominios de unión están enlazados por una molécula enlazante peptídica que comprende una región helicoidal inflexible. 47.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque el iniciador y segundo dominios de unión están enlazados por una molécula enlazante peptídica que comprende una región helicoidal inflexible y una región no helicoidal flexible. 48.- El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-47, caracterizado además porque el dominio de unión de citocina es hormona de crecimiento, o una variante de la hormona de crecimiento, y el dominio extracelular es un dominio extracelular de la hormona de crecimiento. 49.- Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-48. 50.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada además porque el ácido nucleico es un vector adaptado para la expresión del polipéptido. 51.- Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 49. 52.- Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido o la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39 ó 44-51. 53.- Una célula aislada transformada o transfectada con una molécula de ácido nucleico o un vector de conformidad con la reivindicación 49 ó 51. 54.- La célula aislada de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque la célula es una célula eucariótica. 55.- La célula aislada de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque la célula es procariótica.