KR20070096252A - 녹용으로부터 분리된 신규 ｎｋ 세포 강화인자 ｂ의 폴리펩타이드 및 이의 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 NK 세포 강화인자 (NKEF-B; Natural Killer Enhancing Factor B)의 폴리펩타이드 및 이의 유전자에 관한 것으로서, 이는 녹용에서 분리되어진 것이다. 또한 본 발명은 상기 녹용의 NKEF-B 단백질을 암호화하는 유전자 및 이 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 상기 NKEF-B 단백질은 NK 세포 또는 T-세포를 활성화 시켜 항암제 또는 에이즈 치료제로서의 유용성을 보였다.

NKEF-B, NK세포, T-세포, 녹용, 항암제, 에이즈치료제

Description

신규한 ＮＫ 세포 강화인자 Ｂ의 폴리펩타이드 및 이의 유전자{New Gene and Polypeptides of Natural Killer Enhancing Factor B}

도 1은 녹용 NKEF-B 유전자와 인간의 NKEF-B 유전자의 상동성을 비교한 것이다.

도 2는 과량 발현된 녹용 NKEF-B 유전자의 전기영동 사진을 보인다. 레인 1은 NKEF-A, 레인 2은 NKEF-B를 보인다.

도 3은 녹용 NKEF-B 단백질과 퍼옥시레독신 2 단백질의 상동성을 비교한 것이다.

도 4는 녹용 NKEF-B 폴리펩타이드의 전기영동 사진이다. 레인 1은 싸이클로필린 B, 레인 2는 MTAP, 레인 3은 NKEF-B 을 보인다.

도 5는 녹용의 단백질 정제의 전기영동 사진이다. 레인 1은 싸이클로필린 B, 레인 2는 NKEF-B, 레인 3은 UBE2C, 레인 4는 NM23을 보인다.

도 6은 pET 시스템에서 녹용 NKEF-B 단백질의 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 사진이다. 레인 2는 싸이클로필린 B, 레인 6은 NKEF-B, 레인 10은 UBE2C, 레인 11은 NM23을 보인다.

도 7은 녹용 NKEF-B의 농도에 따른 NK 세포의 활성을 분석한 그래프이다.

도 8은 NKEF-B의 농도에 따른 인터페론 감마의 방출량을 분석한 그래프이다.

도 9는 NKEF-B 의 농도에 따른 CD4+T 세포의 증식률을 분석한 그래프이다.

도 10, 도 11은 극성화 된 Th1 세포에서 Th0 세포로 사이토카인의 발현을 분석한 그래프이다. 극성 조건에서 IFN-γ 와 TNF

-α 의 ELISA 분석 결과를 보인다. Con은 대조구로 NKEF-B가 없는 배지에서 배양한 것, NKEF-B LOW는 0.1㎍/ml의 NKEF-B를 함유한 배지에서 배양한 것,NKEF-B HIGH는 1㎍/ml의 NKEF-B를 함유한 배지에서 배양한 것을 나타낸다.

NKEF는 인간의 적혈구 세포에서 최초로 발견되었는데 암세포에 대항한 NK 세포의 세포독성을 강화시키는 능력을 가지고 있다고 알려져 있다. (H. Shau, R. K. Gupta and S. H. Golub, Identification of a natural killer enhancing factor from human erythroid cells. Cell. Immunol. 147 (1993), pp. 1-11.)

또한, NKEF는 과산화수소에 의한 산화에 대한 세포의 저항력을 증가시키고, 알킬 과산화수소와 메틸 수은과 같은 중금속으로부터 세포를 보호하여 항산화제로 작용한다(H. Sauri, L. Butterfield, A. Kim and H. Shau, Antioxidant function of recombinant human natural killer enhancing factor, Biochemical and Biophysical Research Communications 208 (1995), pp. 964969 ; A.T. Kim, T.A. Sarafian and H. Shau, Characterization of antioxidant properties of natural killer-enhancing factor-B and induction of its expression by hydrogen peroxide, Toxicology and Applied Pharmacology 147 (1997), pp. 135142).

또한 NKEF 단백질은 세포증식에 관여하고( M.T. Prosperi, D. Ferbus, I. Karczinski and G. Goubin, A human cDNA corresponding to a gene overexpressed during cell proliferation encodes a product sharing homology with amoebic and bacterial proteins, Journal of Biological Chemistry 268 (1993), pp. 1105011056.), HIV-1의 작용을 억제하는 것으로 알려져 있다(R. Geiben-Lynn, M. Kursar, N.V. Brown, M.M. Addo, H. Shau and J. Lieberman et al., HIV-1 antiviral activity of recombinant natural killer cell enhancing factors, NKEF-A and NKEF-B, members of the peroxiredoxin family, Journal of Biological Chemistry 278 (2003), pp. 15691574.).

NKEF 단백질은 매우 보존된 퍼옥시레독신 유전자 패밀리(PRDXs, Peroxiredoxin gene family)에 속한다. 상기 패밀리는 6종류를 포함하는데, 그 중에는 전에는 NKEF-A와 NKEF-B로 설명되어져왔던 PRDX1, PRDX2가 포함된다.(G. Leyens, I. Donnay and B. Knoops, Cloning of bovine peroxiredoxins gene expression in bovine tissues and amino acid sequence comparison with rat, mouse and primate peroxiredoxins, Comparative Biochemistry and Physiology Part B 136 (2003), pp. 943955).

인간의 성숙한 NKEF 단백질은 두개의 서브유닛을 포함하고 있는데, 이는 각각 NKEF-A와 -B 유전자로 암호화되고, 이황화 결합으로 연결되어 있다. 199개의 아미노산으로 구성되어 있는 두 개의 서브유닛은 상동성이 매우 높다(H. Shau and A. Kim, Identification of natural killer enhancing factor as a major antioxidant in human red blood cells, Biochemical and Biophysical Research Communications 199 (1994), pp. 8388).

인간의 내피세포 ECV304에 과산화수소 처리를 하면 처리 후 약 2시간 후에 NKEF-B 유전자는 전사가 최대수준에 도달한다(A.T. Kim, T.A. Sarafian and H. Shau, Characterization of antioxidant properties of natural killer-enhancing factor-B and induction of its expression by hydrogen peroxide, Toxicology and Applied Pharmacology 147 (1997), pp. 135142).

반면, 상기와 같이 과산화수소 처리를 한 경우 NKEF-A 의 전사는 일정수준을 유지한다고 한다(Robert W. Li, Geoffrey C. Waldbiese , Genomic organisation and expression of the natural killer cell enhancing factor (NKEF)

gene in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque) ,Fish & Shellfish Immunology 20 (2006),pp. 72-82).

시험관내에서 재조합 NKEF-A와 NKEF-B는 항산화작용을 나타낸다(H. Sauri, L. Butterfield, A. Kim and H. Shau, Antioxidant function of recombinant human natural killer enhancing factor, Biochemical and Biophysical Research Communications 208 (1995), pp. 964969.).

그러나, NKEF-A 만이 NK세포독성을 보인다고 알려져 있다(H. Shau, A.T. Kim, C.C. Hedrick, A.J. Lusis, C. Tompkins and R. Finney et al., Endogenous natural killer enhancing factor-B increases cellular resistance to oxidative stresses, Free Radical Biology & Medicine 22 (1997), pp. 497507).

이에 본 발명자들은 녹용의 유전자 분석을 통하여 신규의 NKEF-B 유전자를 찾아내었고, 상기 유전자를 이용하여 유전공학적 방법으로 NKEF-B 단백질을 대량생산하여 정제한 후, 마우스의 비장 세포에서 분리한 NK세포와 T-세포에 처리 했을 때, NK세포와 T-세포를 활성화 시킨다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 NKEF-B 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 NKEF-B 단백질을 포함하는 NK 세포 또는 T-세포의 작용을 활성화제를 제공하고, 상기 단백질을 포함하는 암 또는 에이즈 치료를 위한 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 제 1 태양은 신규한 NK 세포 강화 인자(NKEF) 타입 B 폴리펩타이드에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2 인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 발명의 정의상 NKEF-B 폴리펩타이드의 "기능적 동등물" 이란 천연형 사슴의 NKEF-B 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 " 기능적 동등물" 에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산 (Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 NKEF-B 의 생리 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

" 기능적 유도체" 는 상기 NKEF-B 폴리펩타이드의 단편, 상기 단편을 포함하는 단백질, 또는 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질을 말한다. " 단편"이란 용어는 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말한다. NKEF-B 폴리펩타이드의 안정성, 저장성, 용해도 등을 변경시키기 위한 변형 또는 예를 들어 NKEF-B 와 상호 작용하는 물질과의 관계를 변경시키기 위해 변형을 가한 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다. 상기와 같은 단백질의 기능적 유도체를 만드는 방법은 공지되어 있다.

본 발명의 제 2 태양은 NKEF-B 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 상기 유전자가 서열번호 1을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 및 상기 유전자가 Cervus elaphus 유래인 것을 특징으로 하는 유전자를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 "등가의 핵산서열" 에는 본 명세서에서 제공하는 서열과 알릴(allelic) 변형에 의한 서열, 종 (species)간의 변이에 의한 서열 또는 코돈 축퇴성 서열을 포함한다. "핵산서열 군" 이란 용어는 선택적 발현성이 확인된 천연의 mRNA, 그에 상보적인 cDNA 서열 및 이에 등가의 핵산서열을 포함한다.

"등가의 핵산서열" 에는 본 명세서에서 제공하는 서열과 알릴(allelic) 변형에 의한 서열, 종 (species)간의 변이에 의한 서열 또는 코돈 축퇴성 서열을 포함한다. " 코돈 축퇴성 서열" 이란 상기 자연 발생의 서열과는 상이하나 본 발명에 개시된 자연 발생의 NKEF-B 폴리펩타이드와 동일한 서열의 폴리펩타이드를 코드하는 핵산서열을 의미한다.

" 알릴(allelic) 변형에 의한 서열" 또는 " 종(species)간 변형에 의한 서열" 은 상기 자연 발생의 핵산서열과는 상이하나 본 명세서에 개시된 상기 폴리펩타이드들과 실질적으로 동일한 기능적 성질을 보유하는 폴리펩타이드를 코드하는 핵산서열을 의미한다.

본 발명의 제 3 태양은 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 미생물을 배양하여 NKEF-B 단백질을 대량생산하는 방법을 제공한다.

특히 바람직한 NKEF-B 단백질의 제조방법은 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. NKEF-B를 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 용해물을 만들거나 NKEF-B mRNA를 시험관내 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 NKEF-B 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포 조각 (cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 용해물 또는 시험관내 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그라피의 예이다. 친화성 컬럼은, 예를 들어, 항-NKEF-B 항체를 이용하여 만들 수 있다.

본 발명의 NKEF-B 폴리펩타이드 유래의 단편을 비롯한 NKEF-B 단백질의 기능적 유도체는 펩타이드 합성에 대한 공지의 유기화학적 방법 중 하나를 이용하여 제조할 수 있다. 펩타이드 합성의 유기 화학적 방법은 균질상에서 또는 소위 고체상의 지지체에서 축합 반응에 의해 필요한 아미노산을 커플링시키는 것을 포함한다. 축합 반응에 관한 가장 통상적인 방법으로는 카르보디이미드 방법, 아지드 방법, 혼합 무수물 방법 및 활성 에스테르를 사용한 방법이 있는데, 이들 방법에 대해서는 문헌 (The Peptides Analysis, Synthesis, Biology Vol. 1-3, Gross, E. 및 Meienhofer,J. 편집, 1979-1981, Academic Press Inc.)에 개시되어 있다.

특히 적합한 고체상으로는 문헌(Wang, J. Am. Chem. Soc., 95, 132 (1974))에 기재된 p-알콕시벤질 알코올 수지(4-히드록시-메틸-페녹시-메틸-코폴리스티렌-1% 디비닐벤젠 수지)가 있다. 합성 후 펩타이드는 부드러운 조건하에 상기 고체상으로부터 분리될 수 있다. 목적하는 아미노산 서열의 합성 후, 수지로부터 펩타이드의 탈리는 트리이소프로필 실란, 아니솔 또는 에탄디티올, 티오아니솔과 같은 스캐빈저를 함유하는 트리플루오로아세트산을 사용하여 실시한다. 축합 반응에 관여할 수 없는 반응성기는 산, 염기를 사용하여 가수분해시키거나 또는 환원시키므로써 매우 용이하게 다시 제거될 수 있는 기에 의해 효과적으로 보호된다. 가능한 보호기에 대해서는 문헌(The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1-9 (Gross, Udenfriend and Meienhofer 편집, 1979-1987, Academic Press Inc.)에 보다 상세하게 설명되어 있다.

본 발명의 제 4 태양은 상기 NKEF-B 폴리펩타이드, 활성 단편, 및/또는 기능적 유도체를 포함하는 면역세포 활성화를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 상기 면역활성을 증가시켜서 에이즈 및 암에 대한 치료를 할 수 있다. 상기 약학 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합되거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형되거나 식이 중에 직접 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다.

상기 정제, 트로키, 환제, 캡슐 등은 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 인산 이칼슘과 같은 부형제; 옥수수전분, 감자전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제; 및 슈크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리향과 같은 향미제를 포함할 수 있다. 투여 유닛 형태가 캡슐인 경우 상기 물질외에도 액체 담체를 함유할 수 있다. 코팅제 또는 투여 유닛의 물리적 형태를 변화시키는 기타 다양한 물질이 첨가될 수도 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐은 쉘락 (shellac), 당 또는 이 2가지 모두에 의해 코팅될 수 있다. 엘릭시르 시럽은 활성 화합물과 함께 감미제로서 슈크로스, 보존제로서 메틸파라벤과 프로필파라벤, 염료 및 체리향이나 오렌지향과 같은 향미제를 함유할 수 있다. 임의의 투여 유닛 형태를 제조하는데 사용되는 모든 물질은 약학적으로 순수하고 사용되는 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방형 제제로 제조될 수 있다.

경구 투여용의 경우, 본 발명의 조성물은 부형제와 혼합하여 비섭취형 구강세척제 및 치약 형태로 사용할 수 있다. 구강 세척제는 활성 성분을 적당한 용매, 예컨대 붕산나트륨 용액(Dobell's Solution)에 필요량만큼 첨가하여 제조할 수 있다. 별법으로, 활성 성분을 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산칼륨을 함유하는 방부 세정제에 첨가하거나, 겔, 페이스트, 파우더 및 슬러리 등의 형태인 치약에 분산시키거나 또는 물, 결합제, 연마제, 향미제, 발포제 및 습윤제를 포함할 수 있는 페이스트 치약에 치료적 유효량으로 첨가할 수 있다.

기타 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야에 잘 알려진 서적(예, " Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition)에 기재되어 있거나 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

투여 용량은 치료 환자의 상태에 따라 다양할 수 있으며, 투여를 담당하는 사람이라면 각 환자에게 적합한 적당 용량을 결정할 수 있다. 또한, 인체 투여용의 경우, 제제는 식품의약품안전청의 기준에 부합하는 멸균성, 발열성, 일반 안전 및 순도 기준을 충족하는 것이어야 한다.

이하 본 발명은 하기 실시예를 통하여 설명되어진다. 그러나 하기 실시예로 본 발명이 한정되어지는 것은 아니다.

(실시예 1) 녹용의 mRNA를 분리

(1) 시료의 선정 및 채취

녹용을 생산하는 사슴 중 약리 효과가 가장 우수한 것으로 평가받고 있는 사슴인 세르버스 엘라퍼스의 뿔을 성장점의 활동이 왕성한 2 순기(5월 초순 ~ 중순)에 절단하였다. 절단된 조직은 드라이아이스와 에탄올을 사용하여 급속 동결시킨 후, 생장 조직을 분리하여 -80℃에 보관하면서 실험을 수행하였다.

(2) 생장조직으로부터 총 RNA 분리

50㎖ 짜리 원뿔형 튜브에 3㎖ 트리졸(기브코 BRL)과 분리된 생장 조직 3g을 넣고 균질기로 균질화하였다. 여기에 트리졸 27㎖를 추가하여 넣고, 잘 혼합한 후 5분간 실온에서 정치하고, 이 혼합액을 4개의 튜브에 7.5㎖씩 나누고 각각의 튜브에 1.5㎖ 클로로포름을 첨가하였다. 3분간 실온에서 정치한 후 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 상징액 3㎖을 새로운 튜브에 옮기고 각각의 튜브에 이소프로판올 3.75㎖를 넣은 후 4℃에서 10분간 정치한 다음 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상징액을 제거하였다. 침전물인 총 RNA를 75% 에탄올 7.5㎖로 세척하고, 다시 7,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 상징액을 제거하였다. 총 RNA를 상온에서 건조한 후 225㎕ DEPC 처리된 증류수에 녹여 보관하였다.

(3) 총 RNA로부터 mRNA 분리

상기와 같이 분리된 총 RNA로부터 올리고텍스(Oligotex) mRNA 미디키트(midi kit)(퀴아겐 제품)을 사용하여 mRNA를 분리하였다.

(실시예 2) 녹용의 mRNA로부터 cDNA를 합성, cDNA의 라이브러리 제조

mRNA로부터 cDNA 합성은 기브코 BRL 사의 cDNA 합성 키트를 이용하고, 실험 방법을 일부 변형하여 실시하였다.

제1 가닥 cDNA합성은, mRNA(2㎍) 9㎕에 NotⅠ 프라이머-어댑터(0.5㎍/㎕) 2㎕를 넣고 잘 섞은 후 70℃에서 10분간 반응시켜 RNA 2차 구조를 변성시켰다. 2분간 얼음에서 식힌 다음, 5X 제1 가닥 완충액 4㎕, 0.1M DTT 2㎕ 그리고 10mM dNTP 1㎕의 혼합물을 넣고 잘 섞은 후 37℃에서 2분간 반응시킨 후, 수퍼스크립타제(Superscriptase) Ⅱ 2㎕를 첨가하여 37℃에서 60분간 반응시킨 후 얼음에서 2분간 정치하였다.

제2 가닥 cDNA 합성은 상기 반응액에 DEPC 처리 증류수 91㎕, 제2 가닥 완충액 30㎕, 10mM dNTP 혼합물 3㎕, 대장균 DNA 리가아제(10U/㎕) 1㎕, 대장균 DNA 중합효소(10U/㎕) 1㎕, 대장균 RNA 분해효소 H (2U/㎕) 1㎕를 첨가하여 16℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, T4 DNA 중합효소 2㎕(10U)를 첨가하여 5분간 더 반응시켰다. 반응이 끝난 용액은 0.5M EDTA 10㎕를 첨가한 후, 페놀-클로로포름을 사용하여 cDNA를 추출하여 DEPC 처리된 증류수에 녹여 사용하였다.

합성된 cDNA에 EcoR1-BstX1 어댑터(인비트로겐)를 결찰시키고, Not1로 절단하여 cDNA 가닥 양 끝에 Not1과 EcoR1 서열을 갖는 cDNA를 준비하였다. 원하는 크기의 cDNA를 겔 여과 컬럼을 통해 분리하여 회수하고, 다중클로닝 부위에 Not1과 EcoR1 서열을 갖는 벡터(pDONR222,pSPORT 1, pBluescript, pPICZ, pYES3/CT 등)를 결찰시켰다. 전기침투(일렉트로포레이션) 방법을 이용하여 대장균(ElectroMAX DH5α, 기브코 BRL)을 형질전환시켜 cDNA를 포함하는 플라스미드 벡터를 증폭시켰다.

(실시예 3) 녹용 DNA 염기서열 결정 및 NKEF-B 선별

(1) 제조 및 방법

녹용의 cDNA 라이브러리로부터 위 방법에 따라 EST 클론을 분리한 후 각각의 클론으로부터 DNA를 추출한 후, ABI사의 빅다이 터미네이터 사이클 시퀴엔스 키트(BigDye Terminator Cycle sequence Kit)를 이용하여 단방향으로 DNA 염기서열 분석을 수행하였다. 다음으로 개시코돈이 있는 클론 전체를 서열분석 한 후 종결코돈 을 찾고 NCBI를 통해 다른종과의 염기서열 상동성 비교와 번역되었을 때의 아미노산의 종간 상동성을 찾고 최종적으로 NKEF-B 유전자를 찾았다.

(2) 결과

1) 녹용 NKEF-B cDNA 염기서열

총 695개의 염기(서열목록 번호 1)로 이루어져 있고, 도 1에서 보이듯이 인간의 퍼옥시레독신 2(PRDX2, peroxiredoxin 2)의 유전자와 88%의 상동성을 나타낸다. 다른 종간 핵산의 특이한 부분에 따라 83 %에서 100 % (부분 서열 비교)의 높은 상동성을 보였다.

2) 녹용 NKEF-B cDNA의 번역

녹용의 NKEF-B cDNA를 인터넷상의 번역 프로그램으로 번역한 결과는 서열목록번호2와 같다. 녹용 NKEF-B는 597개의 핵산서열으로 암호화되고 있으며, 메티오닌(M)으로 시작해서 아스파라긴(N)으로 끝나는 198개의 아미노산으로 이루어져있다. 도 2에서는 과량발현된 녹용 NKEF-B 유전자의 전기영동 사진을 보인다.

상기 녹용의 NKEF-B 아미노산 서열은 도 3 에서 보이는 바와 같이 퍼옥시레독신 2 (Peroxiredoxin 2 ;Thioredoxin peroxidase 1 ; Thioredoxin-dependent peroxide reductase 1;Thiol-specific antioxidant protein, ,TSA ,PRP; Natural killer cell enhancing factor B, NKEF-B)와 90% 상동성을 나타낸다.

인간의 NKEF-B 단백질과는 77% 유사하였고, 다른 종간 단백질의 특이한 부분에 따라 44 %에서 100 % (부분 서열 비교)의 상동성을 보였다. 인간과 녹용 NKEF-B를 비교했을 때 31..84 지역 (특히 50..60 헬리컬 지역, 59..66 컨플릭트, SNRAEDFR -> TTVKRTSA) 이 달라 NKEF-B의 효과에 영향을 미쳐 인간 NKEF-B보다 나은 골다공증 치료제로서의 효과가 기대된다.

이들은 주로 알파 헬릭스, 베타 쉬트, 수소결합된 턴(turn)처럼 단백질의 2차 구조에 해당하는 서열로, 녹용에 있어서 이들 서열의 달라 단백질의 다른 구조를 나타내고, 녹용 NKEF-B의 작용에 영향을 주고, NK 세포, T-세포를 활성화에 효과적이게 하는 것으로 보인다.

(실시예 4) 녹용 NKEF-B cDNA 를 포함하는 대장균 균주 제조

녹용 NKEF-B cDNA를 포함하는 플라스미드 벡터를 가지고 전기침투 방법을 이용하여 대장균 균주를 형질전환시켰다. OD₆₀₀에서 1.3 내지 1.5 정도로 증식된 대장균 세포를 전기침투가 가능하도록 컴피턴트(competent) 세포로 만들고, 이 세포 80㎕를 녹용 cDNA가 포함된 벡터 5㎍로 형질전환시켰다(1.5kV, 25μF, 200Ω, 0.2cm 큐벳, Gene-Pulser, BioRad).

(실시예 5) 형질전환된 대장균을 이용하여 NKEF-B 단백질의 대량생산 및 정제

(1) 제조 및 방법

NKEF-B 의 단백질을 발현하기 위해 실시예 4에 따라 제조되어진 벡터로부터 원하는 부분을 용출하였다. 이를 위해 제작된 포워드 프라이머(서열목록 번호 3) 와 리버스 프라이머(서열목록 번호 4) 각각 2 ㎕/10 pmol, dNTP 혼합물, Taq-DNA 중합효소, MgCl₂ 와 반응 완충용액을 넣고 PCR을 하여 특정 밴드를 겔 용출 하였다.

그리고 PCR 생산물의 poly -A 꼬리가 붙도록 만들어진 T-벡터 (50 ng/ μl) 시스템에 T4 DNA 리가아제 (3U/ μl)와 PCR 생산물을 넣고 결찰한 후, 이 결찰물을 화학적 방법으로 만들어진 DH5α에 열충격(42 °C) 형질전환하였다. 여기서 나온 형질전환체를 EcoRI과 Xho I으로 효소 다이제스쳔하여 발현할 인서트(insert)를 준비하였다. 단백질을 발현 할 벡터로는 pET28a(+)를 사용하였고, 이 또한 EcoRI과 Xho I으로 효소 다이제스쳔하여 벡터를 준비하였다. 준비된 발현벡터와 인서트를 결찰하였다. 그 조건은 16 °C에서 16 시간 정도 시행하였다. 여기서 얻은 결찰물을 BL21(DE3)에 형질전환하였고, 완전히 구성 되었는지 살펴보기 위해 각각의 형질전환체를 키운 다음, 미니프렙 키트(QIAGEN)를 통해 얻은 플라스미드 DNA를 EcoRI과 Xho I으로 다이제스쳔하여 벡터(대략 5.3 kb)와 인서트(0.7 kb) 사이즈를 확인하였다. 위와 같이 구성된 것을 확인한 후 단백질 발현을 위해서, 확인된 콜로니를 15ml 튜브에 LB (카나마이신 50 μg/ml) 3ml을 넣고, 하룻밤 키웠다. 이 세포를 250ml 플라스크에 100ml의 LB 배지를 넣고, O.D 600 값이 0.4 ~ 0.5 될 때까지 37 °C 교반 항온배양기에서 키웠다. 이 때에 단백질 발현 유도체인 IPTG (1mM)를 넣어주고, 상온에서 하룻밤 키워준다. 키운 세포를 수확 하여 분해 완충용액(lysis buffer; 50mM NaCl, 5mM MgCl₂, 50mM Tris-HCl / pH 7.9)으로 재현탁하고, 필요에 따라 0.1 mm PMSF, 10 mM BME(Basal Medium Eagle)를 넣어주었다. 이렇게 준비된 생산물에 리소자임 (1g/ 10 ml) 저장용액을 넣고, 37 °C에서 30 분 정도 항온반응한 후, 초음파처리 하였다. 용해성 분획을 얻어내어 20 °C에 보관하였다. 친화성 컬럼 시스템(Affininty column system)을 이용하여, 레진에 Ni²⁺을 붙인 후, 위에서 얻은 단백질을 투석하였다. 먼저 끈끈한 레진을 컬럼에 로딩(2 ml)하고, 다 빠져나가면 멸균된 증류수를 6 ml 정도 로딩하여 흐름 속도를 확인하였다. 다음으로 차징 완충용액(charging buffer; 50 mM NiSO₄)을 10 ml 흘려준 후, 결합 완충용액(binding buffer; 20mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl/ pH 7.9) 을 6 ml 흘려주었고, 결합 완충용액이 다 빠져나가면 위에서 얻은 단백질 시료를 1ml 흘려주었다. 발현된 단백질에는 히스티딘이 발현되어 있을 것임으로, 결합 완충용액으로 인하여 얻고자 하는 단백질이 레진에 결합 될 것이다. 이 단계에서 결합 완충용액을 10ml씩 두 번 로딩하여 흘려보낸 후, 비특이적 결합 단백질을 씻어내기 위해 세척 완충용액 (100 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl/ pH 7.9)을 10ml씩 세 번 로딩하여 주었다. 그리고 용출 완충용액 (1 M 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl/ pH 7.9)을 넣어 주어 원하는 단백질을 용출하였다. 사용했던 레진을 다시 사용하기 위해 스트립 완충용액 (100 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl/ pH 7.9)을 넣어주어 완전히 레진을 깨끗하게 씻어내고, 멸균된 증류수로 세척 후, 20% EtOH 10 ml정도 넣어 레진을 보관하였다 (단백질 정제에 관련된 실험은 시원한 방, 4°C에서 하도록 함). 정제를 마친 시료의 탈염을 하기 위해 투석를 시행하였다. 먼저 분해 완충용액에 20 % 글리세롤을 넣어서 완충용액을 준비하고 새로운 PMSF, BME를 넣어준 후, 투석 튜브에 시료를 넣어서 교반 플레이트 상에서 튜브가 적당히 잠기도록 하여, 시원한 방에서 하룻밤 돌려주었다. 이렇게 준비된 단백질을 브래드포드 방법(Bradford method)을 통해 정량한 후, 사용하기 전까지 20 °C보관해 놓는다.

(2) 결과

SDS-PAGE, 웨스턴 블랏팅 등을 통해 단백질 발현 여부를 확인하였다.

도 4는 녹용 NKEF-B 폴리펩타이드의 전기영동 사진으로 레인 1은 Cyclophilin B, 레인 2는 MTAP, 레인 3은 NKEF-B 으로 21.8 kDa 의 분자량을 보였다. 도 5는 녹용의 정제된 여러 단백질과 NKEF-B를 비교한 전기영동 사진이다. 레인 1은 싸이클로필린 B, 레인 2는 NKEF-B, 레인 3은 UBE2C, 레인 4는 NM23을 보인다. 도 6은 pET 벡터 시스템에서 녹용 NKEF-B 단백질의 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 사진이다.

(실시예 6) 녹용 NKEF-B 처리에 따른 NK 세포의 활성화 효과의 확인

(1) 제조 및 방법

암세포주인 K-562에 마우스의 비장세포에서 분리한 NK 세포와 함께 녹용 재조합 단백질 NKEF-B를 0, 0.1, 1 ㎍/ml을 처리했을 때 K-562 세포에 대한 세포독성을 칼세인-에이엠 방출 분석( Calcein-AM release assay)으로 측정해 보았다.

칼세인-에이엠을 암세포에 넣어주면 살아 있을 때는 이것이 세포 밖으로 방출되지 않지만 세포가 죽으면 많이 방출된다. 즉, 세포가 많이 죽을수록 많이 방출된다. 이것의 양을 형광이나 엘리자(ELISA)로 측정해 세포독성을 산출하였다.

(2) 결과

NKEF-B의 처리농도가 0.1 및 1㎍/ml 일 때 NKEF-B 처리를 하지 않은 대조군에 비하여 세포독성이 각각 155 % 및 195 %의 농도 의존적 증가를 보였다(표 1 및 도 7 참조).

<표 1> NKEF-B 처리농도와 세포독성 관계

NK세포 활성도 분석 (Calcein-AM release assay)
NKEF-B 처리농도(㎍/ml)	0	0.1	1
1회	2.264	4.895	9.668
2회	3.128	11.192	10.230
3회	4.310	8.652	8.742
평균	3.234	8.246	9.553

이러한 결과는 녹용 NKEF-B가 NK 세포 활성도를 높여주어 암세포를 죽이는 효과가 있다는 것을 보이고, 이는 녹용 NKEF-B가 항암제로 개발될 수 있음을 시사한다.

(실시예 7) 녹용 NKEF-B 처리에 따른 T-세포의 활성화 효과의 확인

(1) 제조 및 방법

암세포에 대한 주 면역세포인 T-세포가 비장내에 대부분 존재하며, T-세포가 활성화 되었을 땐 T-세포의 주요 사이토카인인 인터페론 감마가 급격하게 증가한다. 따라서 인터페론 감마의 방출량을 재는 것은 간접적으로 T-세포의 활성도를 측정하는 것이다. 이러한 원리에 의해 마우스의 비장세포에 NKEF-B 처리농도를 0.001 - 1 ㎍/ml로 증가시키면서 인터페론 감마의 방출량을 쟀다.

(2) 결과

상기와 같은 NKEF-B 처리 결과 농도의존적으로 처리하지 않았을 때와 비교해 97배까지 인터페론 감마의 방출량이 늘어났다(표 2 및 도 8 참조).

<표 2> NKEF-B 처리와 인터페론 감마의 방출량 관계

	NKEF-B 처리에 따른 마우스의 비장세포에서 인터페론 감마의 방출량
NKEF-B처리농도(㎍/ml)	0	0.001	0.01	0.1	1
1회	11.9	15.9	11.9	100.9	774.9
2회	6.9	20.9	11.9	103.9	1041.9
평균	9.4	18.4	11.9	102.4	908.4

이러한 결과는 녹용의 NKEF-B가 충분히 T-세포를 활성화 시킨다는 것을 의미하고, 이는 녹용 NKEF-B가 강력한 항암제 혹은 항에이즈 치료제로서의 효과를 보일 것이라 예상된다.

(실시예 8) 녹용 NKEF-B 처리에 따른 CD4+ T-세포의 활성화 효과의 확인

(1) 제조 및 방법

1) 비장 임파구 준비

BALB/c 마우스의 비장을 적출하여 멸균된 주사기로 파쇄 한 후 세포 여과기 (BD Biosciences, USA)로 걸러내었다. 균질화된 비장세포에 적혈구 제거를 위하여 5㎖ 파엠라이제(PharM Lyse, BD Bioscience, USA)를 넣고 5분간 반응시켰다. 세포가 부유 되어있는 튜브에 5㎖의 배지를 첨가한 후 1,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 남은 세포의 잔여물은 1㎖의 현탁액(media)으로 현탁한 후 트리판 블루(trypan blue)로 염색하여 세포수를 측정하였다.

2) CD4+ T 세포 분리

비장임파구 1× 10⁷ 세포/90㎕ 농도당 10㎕의 자기적 세포 분류 CD4(L3T4) 마이크로비즈(magnetic cell sorting CD4(L3T4) microbeads , iltenyi Biotec, U.S.A.)를 첨가하여 15분간 4℃에서 반응시켰다. 300 xg에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하고 5㎖의 배지로 세척하였다. 남은 세포 잔여물에 1× 10⁸/500㎕의 농도가 되도록 현탁액을 넣고 다시 현탁하였다.

엘에스 분리 컬럼(Ls separation column, Miltenyi Biotec, U.S.A.)을 배리오맥스 분리기(varioMACS separator ,Miltenyi Biotec, U.S.A.)에 장치한 후 3㎖의 완충용액(2mM EDTA 와 0.5% BSA를 첨가한 PBS)으로 컬럼을 통과시키고 세포부유액을 컬럼 안으로 주입한다. 세포부유액이 컬럼을 통하여 빠져나가면 다시 2㎖의 완충용액으로 컬럼을 3번 헹구어 낸다. 컬럼을 분리기에서 분리해 낸 후 5㎖의 완충용액을 넣고 플런저(plunger)를 눌러서 CD4+ T 세포를 용출 하였다.

3) 생존률 및 증식능 측정

유사분열촉진물질(Mitogen)로 자극 받지 않은 비장 임파구의 생존율을 측정하기 위해 셀타이터 96 아쿠에우스 원 솔루션 세포 증식 분석(CellTiter 96 Aqueous One solution cell proliferation assay, Promega, U.S.A.)의 프로토콜을 이용하여 CD4+ T 세포을 분리 한 후 4× 10⁵ 세포/㎖의 농도로 100㎕씩 평평한 바닥의 96-웰 플레이트에 분주하였다. CD4+ T 세포가 분주된 플레이트에 NKEF-B를 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 ㎍/㎖ 농도로 첨가하고 1㎍/㎖ 항-CD3e(clone:145-2C11, BD Bioscience, USA)가 코팅된 플레이트에서 2㎍/㎖ 항-CD28 (clone:37.51, BD Bioscience, USA)로 상호 자극하였다. 이상의 혼합물을 48시간동안 37℃, 5% CO₂ 항온배양기 (Nuaire, USA)에서 배양하였다.

4) CD4+ T 세포를 Th1/Th2 세포로 분화

10㎍/㎖ 항-CD3e로 코팅된 12-웰 플레이트에 CD4+ T 세포를 2× 10⁶cells/㎖의 농도로 분주한 후 2㎍/㎖ 항-CD28로 상호 자극하였다. NKEF-B를 0, 1ng/㎖의 농도에서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 항온배양기에서 배양하였다. Th1 세포의 플레이트는 50U rIL-2 (Sigma, U.S.A)와 10 ng/㎖ rIL-12, 10 ㎍/㎖ 항-IL-4 (BD Biosciences, U.S.A)를 첨가하고 3일 후에 1:2로 분할하였다. 48시간 후 세포를 PBS로 세척한 후 10㎍/㎖ 항-CD3e와 2㎍/㎖ 항-CD28로 재자극한 후 24시간동안 배양하였다.

5) ELISA를 이용한 사이토카인 발현량 측정

분화된 Th1 세포의 상층액에서 IFN-γ, TNF-α 발현량을 측정하기 위하여 OptEIA 마우스 IFN-γ 세트(set), OptEIA 마우스 TNF-α 세트 (Pharmingen, BD Biosciences, U.S.A)의 프로토콜을 이용하되, 캡처(capture) 항체(항-mouse IFN-γ또는 TNF-α)를 코팅(coating) 완충용액(0.1M Carbonate, pH 9.5)으로 희석하여 96-웰 플레이트에 100 ㎕ 씩 분주한 후 4℃에 하룻밤 동안 코팅하였다. 코팅한 플레이트를 세척 완충용액(PBS/Tween-20 0.05%)으로 3번 세척한 후 분석 희석액 (Pharmingen, BD Biosciences, U.S.A)을 200 ㎕/웰 씩 분주한 후 실온에서 1시간 동안 어두운 곳에 둔다. 다시 세척 완충용액으로 3번 세척하고 표준(standard)과 시료를 100 ㎕씩 분주한 후 실온에서 2시간 반응시킨다. 세척 완충용액으로 5번 세척 하고 워킹 검출기(Working Detector, Detection antibody＋Avidin-HRP) 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 1시간 반응 후 세척 완충용액으로 10번 세척 한 후 기질 솔루션(Substrate Solution ,TMB Substrate Reagent; Pharmingen, BD Biosciences, U.S.A) 세트를 각 웰마다 100 ㎕씩 첨가하였다. 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 반응 한 후 2N H₂SO₄를 50 ㎕ 첨가 한 후 30분 안에 마이크로플레이트 리더(Micropalte reader, Molecular Devices, U.S.A)로 450nm/570nm에서 읽었다.

(2) 결과

1) NKEF-B가 분리된 CD4+ T 세포의 생존에 미치는 영향

NKEF-B가 주변의 APC (antigen presenting cell)가 없이도 직접적으로 CD4+ T 세포 생존에 영향을 미치는지 확인하여 위해 CD4+ T 세포를 분리한 후 NKEF-B를 농도별로 투여하고 48시간동안 배양한 결과 유사분열촉진물질(mitogen)이 없는 상태에서는 CD4+ T 세포의 생존율에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다. 항-CD3e/항-CD28 항체로 활성화시켰을 때에는 1ug/㎖에서 CD4+ T 세포의 생존율이 20 % 정도 증가되었다(도 9 참조).

세포 증식률은 MTS 분석에 의해 정량되었고, 에러 막대 (Error bars)는 S.E.M을 나타낸다.

2) NKEF-B가 Th1 세포 비대칭(skewed) 조건에서 사이토카인 발현량에 미치는 영향.

순수한 CD4+ T 세포에 NKEF-B 0.1 및 1 ㎍/㎖을 투여하고 50U rIL-2, 10 ㎍/㎖ 항-Il-4, 10 ㎍/㎖ , 10ng/ml rIL-12을 이용하여 7일 동안 Th1 세포와 분화 한 후 상층액에서 사이토카인 발현량을 ELISA 방법을 이용하여 측정한 결과 , Th1 세포 비대칭(skewed) 조건에서 IFN-γ와 TNF-α 모두 농도 의존적으로 사이토카인 발현량을 각각의 농도에서 2배, 5배 증가 시킨 것을 확인하였다(도 10, 11 참조).

도 10, 도 11은 극성화 된 Th1 세포가 Th0 세포로 사이토카인의 발현을 분석한 그래프로 극성 조건에서 IFN-γ 와 TNF

-α 의 ELISA 분석 결과를 나타내었다. Con은 대조구로 NKEF-B가 없는 배지에서 배양한 것, NKEF-B LOW는 0.1㎍/ml의 NKEF-B를 함유한 배지에서 배양한 것,NKEF-B HIGH는 1㎍/ml의 NKEF-B를 함유한 배지에서 배양한 것을 나타낸다.

녹용의 NKEF-B를 처리했을때 K-562 세포에 대한 세포독성을 살펴본 결과 녹용 NKEF-B가 NK 세포의 활성도를 높여주어 암세포를 죽이는 효과를 보였다.

또한 NKEF-B를 쥐의 비장세포에 처리하여 처리농도에 따른 인터페론 감마의 방출량을 살펴본 결과 인터페론 감마의 방출량이 현저하게 늘어났다. 이는 충분히 T-세포를 활성화 시킨다는 의미이다.

따라서, 녹용의 NKEF-B 단백질을 이용하여 강력한 항암제 혹은 항에이즈 치료제로 효과적인 물질인 것을 보인다.

<110> Purimed Co. <120> New gene and polypeptides of natural killer enhancing factor B <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 695 <212> DNA <213> Cervus elaphus <220> <221> CDS <222> (66)..(659) <400> 1 ccacgcgtcc ggtccttgca tccgagagtc ggtgcgtccc gcccttaccc acgcagcttt 60 cagtc atg gcc tgc ggc aag gcg cac ctc gga aag ccc gcc cca gaa 107 Met Ala Cys Gly Lys Ala His Leu Gly Lys Pro Ala Pro Glu 1 5 10 ttc cag gcc acc gcg gtg gtg gat ggc gcc ttc aag gag gtg aag ctt 155 Phe Gln Ala Thr Ala Val Val Asp Gly Ala Phe Lys Glu Val Lys Leu 15 20 25 30 tcc gac tac aaa ggg aag tac gtg gtc ctc ttt ttc tac cct ctg gac 203 Ser Asp Tyr Lys Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp 35 40 45 ttt acc ttt gtg tgc ccc acg gag atc gta gct ttc agc gac cgt gct 251 Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Val Ala Phe Ser Asp Arg Ala 50 55 60 gcg gag ttc cac aag ctg aac tgc gag gtg ctg ggc gtc tcc gtg gac 299 Ala Glu Phe His Lys Leu Asn Cys Glu Val Leu Gly Val Ser Val Asp 65 70 75 tct cag ttc acc cac ctg gct tgg atc aac act ccc cgg aag gag gga 347 Ser Gln Phe Thr His Leu Ala Trp Ile Asn Thr Pro Arg Lys Glu Gly 80 85 90 ggc ctg ggc ccg ctg aac atc ccc ctg ctg gct gat gta acc aga aag 395 Gly Leu Gly Pro Leu Asn Ile Pro Leu Leu Ala Asp Val Thr Arg Lys 95 100 105 110 ttg tcc agt gat tat ggc gtg ctg aag gaa gat gag ggg gtc gcc tac 443 Leu Ser Ser Asp Tyr Gly Val Leu Lys Glu Asp Glu Gly Val Ala Tyr 115 120 125 agg ggc ctc ttt gtc atc gac ggc aag ggt gtc ctt cgc cag gtc acc 491 Arg Gly Leu Phe Val Ile Asp Gly Lys Gly Val Leu Arg Gln Val Thr 130 135 140 gtc aat gat ttg ccc gtg gga cgc tcc gtg gat gag gct ctg agg ctg 539 Val Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Ala Leu Arg Leu 145 150 155 gtc cag gct ttc cag tac aca gat gag cac ggg gaa gtc tgc ccc gcc 587 Val Gln Ala Phe Gln Tyr Thr Asp Glu His Gly Glu Val Cys Pro Ala 160 165 170 ggc tgg aca cca ggc agt gac acg atc aag ccc aac gtg gac gac agc 635 Gly Trp Thr Pro Gly Ser Asp Thr Ile Lys Pro Asn Val Asp Asp Ser 175 180 185 190 aag gaa tat ttc tcc aaa cac aac t aggctggcag atggtgtcac 680 Lys Glu Tyr Phe Ser Lys His Asn 195 gcctgggctc ttggc 695 <210> 2 <211> 198 <212> PRT <213> Cervus elaphus <400> 2 Met Ala Cys Gly Lys Ala His Leu Gly Lys Pro Ala Pro Glu Phe Gln 1 5 10 15 Ala Thr Ala Val Val Asp Gly Ala Phe Lys Glu Val Lys Leu Ser Asp 20 25 30 Tyr Lys Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr 35 40 45 Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Val Ala Phe Ser Asp Arg Ala Ala Glu 50 55 60 Phe His Lys Leu Asn Cys Glu Val Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Gln 65 70 75 80 Phe Thr His Leu Ala Trp Ile Asn Thr Pro Arg Lys Glu Gly Gly Leu 85 90 95 Gly Pro Leu Asn Ile Pro Leu Leu Ala Asp Val Thr Arg Lys Leu Ser 100 105 110 Ser Asp Tyr Gly Val Leu Lys Glu Asp Glu Gly Val Ala Tyr Arg Gly 115 120 125 Leu Phe Val Ile Asp Gly Lys Gly Val Leu Arg Gln Val Thr Val Asn 130 135 140 Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Ala Leu Arg Leu Val Gln 145 150 155 160 Ala Phe Gln Tyr Thr Asp Glu His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp 165 170 175 Thr Pro Gly Ser Asp Thr Ile Lys Pro Asn Val Asp Asp Ser Lys Glu 180 185 190 Tyr Phe Ser Lys His Asn 195 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antler velvet NKEF-B forward primer <400> 3 ttaagagctc atggcctgcg gcaaggcgca cctcggaaag 40 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antler velvet NKEF-B reverse primer <400> 4 ttaactcgag ctagttgtgt ttggagaaat attccttgct gtc 43

Claims (11)

1. 신규한 NK세포 강화 인자 B (NKEF-B ;natural killer enhancing factor B) 폴리펩타이드.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열목록 번호 2를 포함하는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
3. 제 1 항의 NKEF-B 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 NKEF-B 유전자가 서열목록 번호 1의 66에서 662번의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자.
5. 제 3 항에 있어서, 세르버스 엘라퍼스(Cervus elaphus) 유래인 것을 특징으로 하는 유전자.
6. 제 3 항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
7. 제 6 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 숙주세포가 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
9. 제 7 항의 형질전환된 숙주세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 따른 폴리펩타이드의 제조방법.
10. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 NKEF-B 단백질을 포함하는 NK 세포의 활성화 또는 T-세포의 활성화를 위한 조성물.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 암 또는 에이즈의 치료를 위한 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.

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