KR20190109946A

KR20190109946A - 알부민 결합 나노바디가 융합된 wkymvm 펩티드의 수용성 과발현 및 정제 방법

Info

Publication number: KR20190109946A
Application number: KR1020180031682A
Authority: KR
Inventors: 최한석; 이경진; 유지원; 응우엔민딴
Original assignee: 울산대학교 산학협력단; 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2018-03-19
Filing date: 2018-03-19
Publication date: 2019-09-27
Also published as: KR102206762B1

Abstract

본 발명은 알부민 결합 나노바디가 융합된 WKYMVM 펩티드의 수용성 과발현 및 정제 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 수용성 향상 태그(solubility enhancing tag), 알부민 결합 나노바디 및 트립토판(Trp)-리신(Lys)-티로신(Tyr)-메티오닌(Met)-발린(Val)-메티오닌(Met)(WKYMVM) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포, 이를 이용한 재조합 단백질의 생산방법, 상기 방법으로 생산된 재조합 단백질 및 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 재조합 단백질 생산방법에 따르면 Alb1-WKYMVM를 원핵 세포에서 생산할 수 있으며, 알부민 결합 나노바디(Alb1)와 융합된 WKYMVM 펩티드를 단일 융합 단백질 형태로 생산함으로써 생체 내 활성의 변화 없이 펩티드의 안정성을 증가시킬 수 있다. 또한 본 발명에 따른 재조합 단백질은 치료 효과 및 반감기가 향상되어 투여 횟수를 줄일 수 있기 때문에 환자의 편의성이 증대될 것으로 기대된다.

Description

알부민 결합 나노바디가 융합된 WKYMVM 펩티드의 수용성 과발현 및 정제 방법{Method for soluble overexpression and purification of active WKYMVM peptide fused with albumin binding nanobody}

본 발명은 알부민 결합 나노바디가 융합된 WKYMVM 펩티드의 수용성 과발현 및 정제 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 재조합 단백질의 수용성 향상 태그(solubility enhancing tag)를 코딩하는 유전자, 알부민 결합 나노바디(Albumin binding nanobody)를 코딩하는 유전자 및 트립토판(Trp)-리신(Lys)-티로신(Tyr)-메티오닌(Met)-발린(Val)-메티오닌(Met)(WKYMVM)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법, 상기 방법으로 생산된 재조합 단백질 및 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

트립토판(tryptophan; Trp)-리신(lysine; Lys)-티로신(tyrosine; Tyr)-메티오닌(methionine; Met)-발린(valine; Val)-메티오닌(methionine; Met)(WKYMVM)은 펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 동정한 합성 펩티드로, 3개의 포르밀 펩티드 수용체(formyl peptide receptor; FPR)에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 구체적으로, WKYMVM 펩티드는 FPR2 및 FPR3에만 결합하는 반면 여섯 번째 메티오닌이 D-Met으로 치환된 WKYMVm 펩티드는 FPR1, FPR2 및 FPR3에 결합한다. WKYMVM 또는 WKYMVMm은 FPR 군과 결합함으로써 중성구(neutrophil), 단핵구(monocyte), 수지상세포(dendritic cell) 및 자연살상세포(natural killer cell)와 같은 백혈구(leukocyte)의 화학주성이동(chemotactic migration)을 촉진하며, 백혈구의 식세포 활성을 촉진하고, 또한 중성구 및 단핵구를 포함하는 대식세포로부터 초과산화물 음이온(superoxide anion) 생성을 촉진한다. 따라서 WKYMVM/m 펩티드는 패혈증 및 패혈증 쇼크에 대해 치료 효과가 있음이 알려졌다.

최근, WKYMVM에 대한 다양한 연구 결과로부터 상처 치유, 조직 재생과 같은 다른 질병에 대한 치료 효과가 있다는 것이 알려졌다. 그러나 WKYMVM 펩티드는 분자 크기가 작고, 혈장 내 반감기가 짧기 때문에 생체 내에서 목적하는 치료 효과를 얻기 위해서는 많은 양을 사용하여야 하는 문제점이 있다. 이를 극복하기 위해서 자연적인 L-형 아미노산을 D-형으로 치환하여 생체활성을 높이고 단백질 분해를 피하는 방법이 개발되었으나, 펩티드 합성 비용이 높아질 뿐만 아니라 D-형 아미노산의 독성을 해결해야 하는 문제가 있다.

알부민은 혈청 단백질의 50% 이상을 차지하며 혈액 내 순환하는 단백질 중에 가장 많은 단백질이다. 또한 알부민의 반감기는 약 19일 정도로 길기 때문에 저분자 펩티드 약물의 생체 내 안정성 및 약물동력학 특성을 향상시키기 위한 후보 물질로 각광 받고 있다.

낙타과(camalids) 또는 연골어류(cartilaginous fish)의 중쇄 항체로부터 유래된 나노바디는 항체에 결합하는 가장 작은 단편으로서, 분자량이 작고, 안정성 및 수용성이 높으며, 면역성이 낮고, 대부분의 발현 숙주에서 생산이 용이하다는 특징을 갖기 때문에 치료 및 연구 목적으로 매우 유용하다. 또한, 목적 단백질의 융합 형태로 알부민 결합 나노바디(albumin binding Nanobody; Alb1)를 사용하면 생체 내에서 항-EGFR 및 항- TNF-α 나노바디 포맷을 현저히 연장시킬 수 있다는 것이 알려졌다.

본 발명의 발명자들은 WKYMVM 펩티드의 치료적 효과를 높이고자 예의 노력한 결과, Alb1을 WKYMVM 펩티드의 융합 단백질로 사용함으로써 반감기를 증가시킬 수 있다는 점을 확인하였으며, 최적의 수용성 향상 태그를 사용하여 Alb1-WKYMVM를 수용성 과발현시킬 수 있는 생산 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 재조합 단백질의 수용성 향상 태그를 코딩하는 유전자, 알부민 결합 나노바디(Albunin binding nanobody, Alb1)를 코딩하는 유전자 및 서열번호 1로 표시되는 펩티드(WKYMVM)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계, 상기 형질전환체를 배양하여 Alb1-WKYMVM 재조합 단백질을 발현시키는 단계 및 상기 재조합 단백질로부터 수용성 향상 태그를 제거하는 단계를 포함하는 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 생산된 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 대장균 세포질에서 수용성 형태로 단백질을 과발현시킬 수 있는 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)을 다양한 태그-융합 형태로 제작하였다. 이 중에서, 단백질 이황화물 이성질화효소 b'a' 도메인(protein disulfide isomerase b'a' domain; PDIb'a') 또는 말토스 결합 단백질(maltose binding protein; MBP) 태그를 사용하였을 때 높은 수율로 생물학적 활성을 가지는 수용성 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)을 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 또한, TEV 단백질 분해효소(protease)를 태그 제거에 사용하였으며, 관심 표적 단백질은 여러 크로마토그래피를 조합하여 분리하였다.

본 발명은 재조합 단백질의 수용성 향상 태그를 코딩하는 유전자, 알부민 결합 나노바디(Albunin binding nanobody, Alb1)를 코딩하는 유전자 및 서열번호 1로 표시되는 펩티드(WKYMVM)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 일 양상에 따르면, 상기 펩티드(WKYMVM)를 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 일 양상에 따르면, 상기 알부민 결합 나노바디(Alb1)는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일 양상에 따르면, 상기 알부민 결합 나노바디(Alb1)을 코딩하는 유전자는 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 수용성 향상 태그는 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)을 수용성 형태로 발현시킬 수 있는 것이면 어느 것이든 제한 없이 이용 가능하다. 예를 들어, 상기 수용성 향상 태그는 단백질 이황화물 이성질화효소의 b'a' 도메인(b'a' domain of PDI; PDIb'a'), 말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein; MBP), 헥사히스티딘(hexahistidine; His6), 티오레독신(thioredoxin; Trx), 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase; GST), N-이용 기질 단백질 A(N-utilization substance Protein A; NusA) 또는 단백질 이황화물 이성질화효소(protein disulfide isomerase; PDI) 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 양상에 따르면, 상기 수용성 향상 태그는 단백질 이황화물 이성질화효소의 b'a' 도메인(PDIb'a'), 말토스 결합 단백질(MBP) 또는 헥사히스티딘(His6)일 수 있다. 상세하게는, 상기 PDIb'a' 유전자는 서열번호 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 MBP 유전자는 서열번호 6으로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 His6 유전자는 서열번호7로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어 “벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.

본 발명의 용어 “발현벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비(非)형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

본 발명에서 사용한 게이트웨이 벡터 시스템(Gateway Vector system)은 엔트리(entry) 벡터와 목적 벡터로 구성되며, 상기 엔트리 벡터는 목적 유전자의 양 말단에 attL1, attL2를 갖는 벡터이며, 목적 벡터는 attR1, attR2를 포함하는 벡터이다. 상기 엔트리 벡터와 상기 목적 벡터는 목적 벡터의 attR1 및 attR2가 엔트리 벡터의 attL1 및 attL2와 재조합 효소에 의해 LR반응을 일으키며, 이 과정에서 엔트리 벡터에 포함되어 있던 목적 유전자가 목적 벡터로 전달되고, attR1과 attR2 는 attB1과 attB2 서열로 치환된다.

본 발명의 일 양상에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 상기 수용성 향상 태그를 용이하게 제거하기 위하여, 수용성 향상 태그를 코딩하는 유전자와 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)을 코딩하는 유전자 사이에 담배 식각 바이러스 프로테아제 인식 위치(tobacco etch virus protease recognition site, TEVrs)를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 TEVrs는 서열번호 8로 표시되는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 일 양상에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있으며, 바람직하게 상기 대장균은 BL21(DE3) 또는 Origami 2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 재조합 단백질의 수용성 향상 태그를 코딩하는 유전자, 알부민 결합 나노바디(Albunin binding nanobody, Alb1)를 코딩하는 유전자 및 서열번호 1로 표시되는 펩티드(WKYMVM)를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 구조체(gene construct)가 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.

본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자 조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비(非)바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 상기 형질전환체를 배양하여 Alb1-WKYMVM 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 재조합 단백질로부터 수용성 향상 태그를 제거하는 단계를 포함하는 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 일 양상에 있어서, 상기 수용성 향상 태그를 제거하는 단계는 재조합 단백질에 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제를 처리하는 방법을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 실시예에서는 담배 식각 바이러스(Tobacco Etch Virus; TEV) 프로테아제(protease)를 사용했지만, 프로테아제(protease)는 당업계에서 통상적으로 사용될 수 있는 인자(Factor) Xa 프로테아제, 트롬빈(Thrombin), 엔테로키나제(Enterokinase), 유비퀴틴-특이적 단백질 분해효소(Ubiquitin-specific protease), 푸린(Furin), 유전자 분해효소 I(Genease I) 또는 프로테이나제 K(Proteinase K) 등을 적용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양상에 있어서, 상기 생산방법은 수용성 향상 태그가 제거된 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)을 회수하고 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 생산방법에 의해 생산된 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단에 알부민 결합 나노바디(Albunin binding nanobody, Alb1)가 융합된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의　조성물은　약학적　조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른　약학적　조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의　약학적　조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의　약학적　조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글라이콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의　조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의　약학적　조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의　조성물은 1일 0.001 내지 1000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의　약학적　조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러나 경구 투여시,　단백질은 소화가 되기 때문에 경구용　조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 본 발명의　약학적　조성물은 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른　약학적　조성물은 상기 유효성분 외에 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지된 물질을 하나 이상 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른　약학적　조성물은 상기 유효성분 외에 기관지 확장제, 항히스타민제 또는 소염진통제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 단백질 생산방법에 따르면 Alb1-WKYMVM를 원핵 세포에서 생산할 수 있으며, 알부민 결합 나노바디(Alb1)와 융합된 WKYMVM 펩티드를 단일 융합 단백질 형태로 생산함으로써 생체 내 활성의 변화 없이 펩티드의 안정성을 증가시킬 수 있다. 또한 본 발명에 따른 재조합 단백질은 치료 효과 및 반감기가 향상되어 투여 횟수를 줄일 수 있기 때문에 환자의 편의성이 증대될 것으로 기대된다.

도 1은 Alb1-WKYMVM 융합 단백질 구조의 모식도이다. 화살표는 TEV 프로테아제 절단 위치를 나타낸다.
도 2는 BL21(DE3) 및 Origami 2에서 Alb1-WKYMVM 융합 단백질의 발현을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 도 2A는 37℃에서, 도 2B는 18℃에서 배양한 결과이다(M, molecular weight marker; C, total cell protein before IPTG induction as negative control; I, total cell protein after IPTG induction; S, soluble fraction after cell sonication).
도 3은 BL21(DE3) 및 Origami 2에서 펩티드 태그에 따른 Alb1-WKYMVM 단백질의 발현 수준(A) 및 수용성(B)을 나타낸 것이다.
도 4는 Origami 2에서 발현시킨 PDIb'a'-Alb1-WKYMVM로부터 수용성 Alb1-WKYMVM를 정제하는 과정(A) 및 SDS-PAGE로 확인한 결과(B)이다(M, molecular weight marker; lane 1, total cell extract without IPTG induction as negative control; lane 2, total cell extract with IPTG induction; lane 3, soluble fraction after cell sonication; lane 4, MBP tag cleavage with TEV protease (28.6 kDa): PDIb'a'-Alb1-WKYMVM (48.0 kDa), PDIb'a' (34.8 kDa) and Alb1-WKYMVM (13.2 kDa); lane 5, purified Alb1-WKYMVM using ion exchange chromatography. lane 6 and 7, purified Alb1-WKYMVM using SEC column: final Alb1-WKYMVM under reducing and non-reducing conditions, respectively).
도 5 는 MTT 분석으로 확인한 세포 생존도(A) 및 LPS-유도 RAW 264.7 세포주에서 Alb1-WKYMVM의 NO 생성 억제 효과(B)를 나타낸 결과이다.
도 6은 LPS-유도 RAW 264.7 세포주에서 Alb1-WKYMVM의 HMGB1(A) 및 TNF-α(B) 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 7은 LPS-유도 대식세포에서 Alb1-WKYMVM의 NF-κB 활성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 8은 Alb1-WKYMVM와 HSA의 상호작용을 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과 및 SEC에서 용출된 피크의 단백질 조성을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 화살표는 용출된 단백질의 피크를 나타낸다.
도 9는 CLP 마우스 모델에서 Alb1-WKYMVM의 혈청 전염증 사이토카인 생성 효과를 나타낸 결과이다. ELISA 키트를 사용하여 TNF-α(A), IL-1β(B), IL-6(C) 및 IL-12(D)의 농도를 측정하였다.
도 10은 폐 염증에 대한 Alb1-WKYMVM의 효과를 확인한 결과이다. 화살표는 폐 손상 부위를 나타낸다(A, 대조군; B, CLP; C, CLP+Alb1-WKYMVM 40 mg/kg, two times of injection).
도 11은 Alb1-WKYMVM가 CLP-유도 패혈증 마우스에의 생존률에 미치는 영향을 확인한 결과이나.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 재조합 Alb1 - WKYMVM 단백질 발현 플라스미드 제작

본 발명의 알부민 결합 나노바디(Alb1 Nanobody)는 국제특허 제WO 2006/122786호에 개시된 서열 정보를 참조하였다. Alb1 올리고뉴클레오티드와 WKYMVM 펩티드는 가요성 펩티드 링커(flexible peptide linker) Gly4로 연결되었다. Alb1-WKYMVM의 전체 서열은 Gateway 클로닝 방법을 사용하여 발현벡터에 클로닝되기 전에 코돈 최적화되었고 화학적으로 합성되었다.

서로 다른 수용성 향상 태그가 융합된 Alb1-WKYMVM 발현 플라스미드를 제작하기 위하여, 먼저 BP 반응을 수행하여 pENTR-Alb1-WKYMVM로 명명된 엔트리 클론을 얻었다. 다음으로, LR 반응을 사용하여 Alb1-WKYMVM를 3개의 목적 벡터(destination vector; pDEST-HGWA, pDEST-PDIb'a', pDEST-HMGWA)에 옮겨졌고, 각각 헥사히드티딘(hexahistidine; His6), 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein; MBP) 및 PDI의 b'a' 도메인(b'a' domain of human protein disulfide isomerase; PDIb'a')과 융합된 Alb1-WKYMVM를 코딩하는 3개의 발현 클론을 제작하였다. 모든 발현 클론의 서열은 서열분석을 통해 확인하였다(Macrogen, Daejeon, Korea).

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Gateway 방법은 성공적으로 수행되어 서로 다른 융합 태그가 포함된 Alb1-WKYMVM 발현 플라스미드가 제작되었다. 그 결과, N-말단에 His6, PDIb'a' 또는 MBP 태그가 융합된 3개의 구조체를 얻을 수 있었으며, 각각의 플라스미드는 BL21(DE3) 및 Origami 2 세포에 형질전환되었고, T7 프로모터의 조절 하에서 융합 단백질의 발현을 유도하기 위해 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalacopyranoside; Anaspec, Fremont, CA)를 사용하였다. 태그를 쉽게 제거하기 위해 rHSA 서열 바로 앞에 일반적으로 사용되는 TEV 프로테아제의 절단효소 인식자리를 삽입하였다.

실시예 2. 융합 단백질 발현 및 수용성 실험

실시예1에서 제작한 서로 다른 발현 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)와 Origami 2 (Novagen, Madison, WI)에 형질전환하였고, 단일 콜로니들을 항생제가 포함된 LB 배지에 접종시킨 후 37℃에서 밤새(overnight) 배양하였다. BL21(DE3)를 배양할 때는 50 μg/mL 암피실린(ampicillin; Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands)을 첨가하였고, Origami 2를 배양할 때는 12.5 μg/mL 테트라사이클린(tetracycline)을 참가하였다. 세포는 37℃, 200 rpm에서 배양하였고, OD₆₀₀가 0.4 ~ 0.5 정도일 때 0.5 mM IPTG를 배양액에 첨가한 후 37℃에서 5시간 또는 18℃에서 18시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 다음으로 단백질 발현이 유도된 세포를 수확한 후 단백질 분획을 5X 샘플 버퍼(312.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 50% glycerol, 5% SDS, 0.05% bromophenol blue, 100 mM DTT)와 혼합하여 10% 트리신(tricine) SDS-PAGE로 분석하였다. 서로 다른 발현 숙주세포와 융합 플랫폼에서 Alb1-WKYMVM의 발현 효율 및 수용성 정도 및 목적 단백질의 순도의 정량 분석은 ImageJ image software (http://imagej.nih.gov/ij)를 이용하였다.

BL21(DE3) 및 Origami 2에 서로 다른 발현 플라스미드를 형질전환한 후 배양하고, 37℃ 또는 18℃에서 발현을 유도한 후 SDS-PAGE로 단백질 분획을 분석한 결과를 도 2에 나타내었다. 또한 서로 다른 발현 조건에서 단백질의 발현 정도 및 수용성 정도를 비교하기 위하여, 단백질 밴드의 농도 분석(densitometry) 방법으로 분석한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 2 및 도 3A에 나타난 바와 같이, 일반적으로 BL21(DE3)에서는 37℃ 보다 18℃에서 발현이 더 잘 되는 반면, Origami 2에서는 18℃ 보다 37℃에서 발현이 더 잘 되는 경향을 보였다. 또한 His6 태그를 융합한 경우 두 종류의 대장균 숙주 모두 단백질이 불용성 형태로 발현되었으나, PDIb'a' 또는 MBP 태그를 융합한 경우 모두 Alb1-WKYMVM의 수용성 발현이 현저히 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

Alb1-WKYMVM의 생산을 위한 최적의 조건을 찾기 위해 발현 수준 및 수용성을 비교한 결과, 18℃에서 PDIb'a' 및 MBP 수용성 태그 사이에 현저한 차이는 없었지만, Origami 2 숙주가 PDIb'a'-Alb1-WKYMVM의 발현 수준을 최고로 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다(45% 이상). 따라서, 후속 연구를 위하여 단백질 발현 및 수용성에 있어서 가장 좋은 결과를 나타낸 Origami 2에서 발현된 PDIb'a'-Alb1-WKYMVM를 사용하였다.

실시예 3. Alb1 - WKYMVM의 정제

Alb1-WKYMVM를 PDIb'a' 융합 컨스트럭트로부터 수용성 형태로 정제하고, Origami 2에서 발현시켰다. 2 L 진동 플라스크 배양(shake-flask cultivation)으로 배양된 세포를 수확하고 3,800 × g, 4℃에서 30분간 원심분리하였다. 원심분리 후에 세포를 100 mL 용출 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 9.0, 5% glycerol (v/v))에서 재부유시키고, 초음파 세포 파쇄기 JY99-IIDN (Ningbo Scientz Biotechnology, Guangdong, China)를 이용하여 세포를 균질화하였다. 세포 잔여물을 제거하기 위해 세포 용출물을 23,000 × g, 4℃에서 30분간 원심분리하였다. 상등액을 0.4 μm 짜리 멤브레인으로 여과하고, TEV 프로테아제를 처리하였다. 20 mg TEV 프로테아제를 깨끗한 상등액에 첨가한 후 상온에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음으로 시료를 세포 용출에 사용된 것과 동일한 버퍼로 세척한 4 × 5 mL Hi-Trap Q HP 컬럼에 로딩하였다. 태그가 없는 Alb1-WKYMVM를 포함하는 분획물을 수확하고 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography; SEC)로 정제하였다. 단백질 분리를 위한 SEC 컬럼은 450 mL Superdex 75 prep grade 레진과 PBS 버퍼로 채워진 컬럼이 사용된 버퍼는 PBS 1X, pH 7.4와 함께 사용되었다. 정제된 Alb1-WKYMVM 분획을 모은 후 -70℃에서 보관하였다. 단백질 농도를 측정할 때는 BSA를 기준으로 하는 브래드포드 분석(Bradford assay)을 사용하였다.

Alb1-WKYMVM을 얻기 위해 PDIb'a' 융합형을 Origami 2 숙주에서 발현시키고, 세포를 수확하여 정제하였다(도 4A). 수확한 세포를 파쇄하고 상등액(도 4B, lane 3)에 TEV 프로테아제를 처리하여 태그를 제거하였다. TEV 프로테아제 처리 후 태그가 제거된 Alb1-WKYMVM과 상응하는 약 ~13 kDa 단백질 밴드가 관찰되었다(도 4B, lane 4). 단백질 혼합물의 일부를 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 이용하여 정제한 결과, Alb1-WKYMVM가 나타났지만, PDIb'a' 태그와 일부 불순물도 컬럼에 나타났다(도 4B, lane 5). Alb1-WKYMVM와 다른 불순물 사이에 분자량 차이가 있기 때문에, 이어서 단백질 혼합물을 SEC 컬럼에 로딩하여 분리하였다. 목적 단백질(Alb1-WKYMVM)이 포함된 분획을 모아서 겔에서 확인한 결과, 도 4B의 lane 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 정제된 Alb1-WKYMVM 에 해당하는 약 13.2 kDa의 단백질 밴드가 선명하게 나타났다.

정제된 Alb1-WKYMVM의 양과 수율을 하기 표 1에 나타내었다.

정제 단계	총 단백질(mg)	순도(%) ^a	Alb1 - WKYMVM (mg) ^b	수율( % )
세균 배양(2 L)	4650 (pellet)	-	-	-
상등액	755.0	45.4	94.3	100
1차 Q Flow through	106.4	14.9	15.9	16.9
2차 GPC 용출물	3.01	95	2.9	3.1

a. 농도측정계(ImageJ)로 측정한 관심 단백질의 순도

b. 관심 단백질의 순도와 Alb1-WKYMVM 및 융합 단백질 사이의 크기 관계에 기초하여 계산된 Alb1-WKYMVM 의 양

실시예 4. 내독소 제거( endotoxin removal)

내독소를 제거하기 위하여, Triton X-114 방법을 사용하였다(Song, J. A. et al. PLoS One 8, e83781, doi:10.1371/journal.pone.0083781). 내독소 농도를 측정하기 위하여 QCL-1000™ Endpoint Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay kit를 사용하였다. 37℃에서 미리 반응시킨 96 웰-플레이트를 측정에 사용하였다. 50 μL의 단백질과 표준물질을 50 μL의 LAL과 혼합하고, 10분 간 반응시켰다. 다음으로, 100 μL의 발색 용액(chromogenic substrate solution)을 각각의 웰에 투여하고, 플레이트를 37℃에서 6분간 반응시켰다. 다음으로 100 μL의 정지 시약(25% v/v glacial acetic acid)를 첨가하고 405 ~ 410 nm 파장의 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하였다.

최종적으로 정제된 Alb1-WKYMVM의 내독소를 제거한 결과 매우 낮은 농도의 내독소를 포함하며, 단백질 의약품으로서 허용 한계 (<1 EU/μg)를 유지하는 수준인 것으로 확인되었다.

실시예 5. 세포 배양 및 MTT 분석( MTT assay)

RAW 264.7 마우스 마크로파아지 세포주(American Type Culture Collection, Bethesda, MD)를 10% FBS(fetal bovine serum), 2 mM L-글루타민(L-glutamine), 100 U/ml 페니실린(penicillin), 및 100 U/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM 배지, 37℃, 5% 습도, 5% CO₂/95% 대기 조건에서 배양하였다. 10% FBS가 첨가된 DMEM의 RAW 264.7 세포(5 × 10⁵ cell/well)를 24-웰 플레이트에 심고 24시간 동안 배양하였다. 다음으로 다양한 농도의 Alb1-WKYMVM 단백질과 100 ng/mL LPS를 각각의 웰에 첨가한 후 37℃에서 추가적으로 24시간 동안 반응시켰다. 550 nm 흡광도를 측정하여 Alb1-WKYMVM의 상대적인 세포 독성을 확인하였다.

그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이 펩티드 농도가 50 ng/mL이 될 때까지는 세포 생존도가 감소하지 않았다.

실시예 6. NO 분석(NO assay)

Alb1-WKYMVM가 여전히 항염 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 세포를 LPS 존재 하에서 서로 다른 농도의 펩티드와 함깨 배양하였다. 일산화질소(Nitric oxide, NO)는 종래 당업자에게 알려진 방법으로 측정하였다. 상기 실시예 6과 같이 다양한 농도의 Alb1-WKYMVM 단백질과 100 ng/mL LPS를 웰에 첨가하여 배양한 후, 100　μl의 RAW 264.7 세포 배양액을 100 μl 의 Griess solution(0.1% naphthylethylenediamine and 1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid)과 함께 혼합시켰다. 아질산나트륨(sodium nitrite)을 표준으로 하는 눈금 곡선을 사용하여 아질산염(nitrite) 농도를 평가하였고 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 5B에 나타낸 바와 같이, Alb1-WKYMVM는 농도의존적으로 LPS-유도 마크로파아지에서 NO의 생성을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 7. 혈청 TNF -α 및 HMGB1 농도 측정

RAW 264.7 세포 배양액에서 TNF-α와 HMGB1의 수준을 확인하기 위하여 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN; Shino-Test Corp., Tokyo, Japan). 를 사용하였다. 간략하게 다클론 래트 항-마우스 사이토카인 항체를 1차 항체(capturing antibodies)로 사용하였고, 비오틴 표지된 항체를 사이토카인 검출에 사용하였다. 각각의 분석에서 표준 곡선을 만들고 색깔 변화는 450 nm에서 결정하였다.

NO 유도와 함께 TNF-α 및 HMGB1와 같은 전염증 사이토카인은 패혈증에서 현저하게 변화하는 것으로 알려져 있다. 따라서 LPS-유도 RAW 264.7 세포주의 배양 배지를 수확하여 TNF-α와 HMGB1를 측정하였다. 그 결과, 상기 실시예 7의 결과와 유사하게, Alb1-WKYMVM 농도 의존적으로 TNF-α 및 HMGB1의 생성 및 분비가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 6).

실시예8 . 루시퍼라제 분석( luciferase reporter assay)

NF-κB는 대식세포 염증 반응을 촉진하는 데 중요한 역할을 한다. Alb1-WKYMVM가 LPS로 자극된 대식세포주에서 NF-κB를 억제할 수 있는지 확인하기 위하여, 루시퍼라아제 분석(luciferase reporter assay)을 사용하였다. 구체적으로, 3 × 10⁵의 RAW 264.7 세포를 24-웰 플레이트에 각각 심고, 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 세포를 Lipofectamine® 2000 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 Renilla luciferase 발현을 위해 NF-κB-프로모터-루시퍼라아제 컨스트럭트 및 pRL-SV40 플라스미드와 함께 일시적으로 형질도입하였다. 프로모터 활성값은 Renilla reporter를 사용하여 생성되었다.

그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, Alb1-WKYMVM는 LPS로 촉진된 NF-κB 루시퍼라아제 활성을 억제하였다. Alb1-WKYMVM에 의한 억제 효과는 HO-1 효소 억제제인 ZnPP가 있을 때 거의 사라졌다. 이로부터 NF-κB 활성에 대한 억제 효과는 Alb1-WKYMVM에 의한 HO-1 발현의 증가를 통해 가능해진다는 것을 알 수 있었다.

실시예 9. 크기 배제 크로마토그래피 분석

Alb1-WKYMVM이 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합할 수 있는지 확인하기 위하여, 20 μM의 Alb1-WKYMVM을 HSA와 같은 몰랄 농도(molar concentration)에서 혼합하고 PBS 버퍼와 함께 37℃, pH 7.4에서 반응시켰다. 2시간 후, 혼합물을 상기 정제 과정에서 사용한 것과 동일한 450 mL Superdex 75 prep grade resin으로 채운 컬럼에 주입하였다. 비교 실험으로 동일한 몰랄 농도의 HSA와 Alb1-WKYMVM를 각각 다른 컬럼에 주입하였다. 단백질을 포함하는 분획을 수확하고 SDS-PAGE 겔로 분석하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 HSA와 Alb1-WKYMVM를 함께 반응시킨 후 컬럼에 주입하였을 때 Alb1-WKYMVM 피크 높이가 감소하고 HSA 피크보다 빨리 용출되는 것을 확인하였다. 또한, SDS-PAGE에서 빨리 용출된 피크가 HSA와 Alb1-WKYMVM를 모두 포함하고 있다는 것을 확인하였다. 이로부터 Alb1-WKYMVM는 실험 조건에서 HSA와 결합할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 11. 패혈증 마우스 모델에서 치료 효과 확인

11-1. 마우스 모델 제조

8주령의 특정 병원균이 없는 수컷 BALB/C 마우스를 Central Laboratory Animal Inc.(Seoul, Republic of Korea)에서 구입하였다. 쥐는 21 ~ 24℃, 상대습도 40 ~ 60%, 12시간 단위 명암 사이클의 특정 병원균이 없는 조건 하에서 사육하였으며, 음식과 물은 자유롭게 허용하였다.

CLP(cecal ligation and puncture)-유도 패혈증 실험을 위해, 마우스를 먼저 40 mg/kg 졸레틸-럼푼(zoletil-rompun) 혼합물로 마취시키고, 중앙선을 2 cm 절개하여 맹장과 연결된 내장을 노출시켰다. 맹장 말단에서 5.0 mm 부위를 3.0 실크 봉합사로 강하게 묶고 26-gauge 바늘로 한 번 구멍을 내었다. 구멍을 확실히 뚫기 위해 남은 분비물을 짜 내었다. 다음으로 창자를 복부에 다시 넣고 절개 부분을 봉합하였다. 대조군(n = 10)은 맹장을 노출시킨 후 묶거나 구멍을 내지 않고 그대로 복부에 다시 넣었다. CLP 수술 후 2시간 및 14시간이 되었을 때, 마우스에 Alb1-WKYMVM(40 mg/kg, 복강주사, n = 10) 또는 PBS(복강주사, n = 10)를 투여하였고, 24시간마다 11일 동안 생존 여부를 확인하였다.

11-2. 혈청 사이토카인 농도 측정

혈청 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-12 및 IL-6 농도를 측정하기 위해 BALB/c 마우스를 30 mg/kg 케타민(ketamine)과 6 mg/kg 자일라진(xylazine)으로 마취시키고, 상기 11-1과 같이 CLP 수술을 시행하였다.

CLP 수술 후 2시간, 14시간 시점에 마우스에 복강 주사로 Alb1-WKYMVM(40 mg/kg, n = 3)과 WKYMVM(4 mg/kg, n = 3)을 투여하였다. 더 높은 용량의 Alb1-WKYMVM(80 mg/kg, n = 3)도 실험하였으나, CLP 수술 후 2시간 시점에 한 번만 주사하였다. CLP 수술 24시간 후, 모든 동물을 케타민 마취(30 mg/kg, intraperitoneal)하여 희생시켰다. 각각의 혈액 시료를 수확하고, 35°고정각에서 원심분리 하였다(7500 × g, 20분, 4℃). TNF-α, IL-1β, IL-12 및 IL-6 용 ELISA 키트(Shino-Test Corp., Tokyo, Japan)를 사용하여 혈청 사이토카인 농도를 측정하였다.

일반적으로 펩티드의 크기가 작고 혈장 순환 반감기가 짧기 때문에 원하는 치료 효과를 얻기 위해서는 마우스에 4 ~ 6회 주사를 한다. 본 발명에서는 Alb1 나노바디가 펩티드의 반감이 증가에 도움이 되는지 확인하기 위하여, Alb1-WKYMVM과 WKYMVM을 각각 2회만 주사하였고, 고농도 Alb1-WKYMVM는 1회만 주사하였다.

그 결과, WKYMVM을 2회 주사한 경우는 아무런 처리를 하지 않은 대조군(PBS)과 비교했을 때 CLP 마우스의 혈청 사이토카인의 농도가 변하지 않고 매우 높은 상태로 유지되었다. 그러나 Alb1-WKYMVM를 투여한 경우 TNF-α, IL-1β 및 IL-12의 농도가 현저하게 감소하였다(도 9A, B, D). 특히 TNF-α 및 IL-12는 대조군에 비해 절반 이상 감소하였다. 그러나, IL-6 농도는 모든 CLP 그룹에서 변화하지 않았다(도 9C).

한편 Alb1-WKYMVM의 농도가 저농도(40 mg/kg)일 때와 고농도(80 mg/kg)일 때 효과의 차이가 크지 않았기 때문에 이후 실험에서는 40 mg/kg씩 두 번 주사하였다.

11-3. 폐 손상 실험

패혈증은 장기 손상으로 발생하는 것으로 알려져 있으며, 급성 폐 손상이 패혈증으로 인한 사망의 주요한 원인이다. 따라서, 손상에 대한 Alb1-WKYMVM의 보호 효과를 확인하기 위하여, 동물 모델의 폐를 수확하고 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 하였다. 구체적으로, 우측 폐의 상엽(superior lobe)을 절제하고, 조직을 고정시키기 위해 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)가 포함된 PBS 버퍼를 사용하였다. 고정된 조직을 파라핀 왁스에 넣고 4-μm 두께로 절단한 다음, 조직학적 분석을 위해 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 하였다.

폐 손상 정도는 절단 조직에서 호중구 침윤(neutrophil infiltration), 출혈, 괴사, 울혈 및 부종(edema)을 평가하여 계산하였다. 각각의 손상 정도에 따라 다음과 같이 점수를 매겼다(0 = normal; 1 ≤ 25%; 2 = 25-50%; 3 = 50-75%; 4 ≥ 75%).

조직학적 분석 결과, CLP 마우스 모델에서 삼출성 변화, 출혈, 호중구 및 림프구 침윤이 관찰되었다(도 10B). Alb1-WKYMVM 처리 결과 폐 손상이 확실히 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 10C, D).

Alb1-WKYMVM가 CLP-유도 패혈증 마우스에의 생존률에 미치는 영향을 확인하기 위하여, CLP 수술 후 마우스를 두 개의 그룹으로 나누고 각각의 그룹에 40 mg/kg PBS 또는 40 mg/kg Alb1-WKYMVM를 처리하였다(CLP 수술 후 2시간, 14시간). 그 결과 도 11에 나타낸 바와 같이, PBS 처리군의 경우 이틀 만에 생존률이 급감하였으나, Alb1-WKYMVM 처리군의 경우 2일 후까지 한 마리도 죽지 않았고 11일이 지난 후에도 70% 이상이 생존하였다. 이로부터 Alb1-WKYMVM 의 투여로 CLP-유도 패혈증으로 인한 사망을 현저하게 막을 수 있다는 것을 알 수 있었다.

<110> THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Method for soluble overexpression and purification of active WKYMVM peptide fused with albumin binding nanobody <130> 1062717 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WKYMVM peptide <400> 1 Trp Lys Tyr Met Val Met 1 5 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WKYMVM DNA <400> 2 tggaaatata tggtgatg 18 <210> 3 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb1 peptide <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Alb1 DNA <400> 4 gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcaacag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc agctttggca tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcagc attagcggca gcggcagcga taccctgtat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgcgaaaac caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cccggaagat accgcggtgt attattgcac cattggcggc 300 agcctgagcc gcagcagcca gggcaccctg gtgaccgtga gcagc 345 <210> 5 <211> 801 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDIb'a' <400> 5 attgaattta cagaacaaac ggcgccgaaa attttcggcg gtgagattaa aacacatatc 60 ctgctgtttc tgccgaagag cgtttctgat tacgatggta aactgagtaa ttttaaaacc 120 gccgcagaat ctttcaaagg taagattctg ttcattttca ttgatagcga ccacacggac 180 aatcagcgta tcctggagtt ctttggtctg aagaaagagg aatgcccggc tgtgcgtctg 240 attacgctgg aagaggaaat gacaaagtac aagccggaga gcgaggaact gactgcagaa 300 cgtatcaccg aattttgtca tcgtttcctg gaggggaaga ttaagccgca tctgatgagc 360 caggaactgc cggaggattg ggacaaacag ccagtgaaag ttctggtggg gaagaatttt 420 gaagatgtgg ccttcgatga gaagaagaat gtgtttgtgg agttctacgc cccgtggtgt 480 gggcactgta aacagctggc gccgatctgg gacaaactgg gcgaaacgta taaagatcac 540 gaaaatattg tgatcgcgaa aatggattct accgcgaatg aagtagaagc ggtaaaagta 600 cactcttttc cgacgctgaa attctttcca gcgagcgcgg atcgtactgt cattgattat 660 aatggcgaac gtactctgga cggctttaag aaatttctgg aaagcggcgg ccaggatggc 720 gcgggcgatg atgatgacct ggaagacctg gaagaagcgg aggaaccaga catggaggag 780 gatgacgacc agaaagcggt c 801 <210> 6 <211> 1098 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP <400> 6 aaaactgaag aaggtaaact ggtaatctgg attaacggcg ataaaggcta taacggtctc 60 gctgaagtcg gtaagaaatt cgagaaagat accggaatta aagtcaccgt tgagcatccg 120 gataaactgg aagagaaatt cccacaggtt gcggcaactg gcgatggccc tgacattatc 180 ttctgggcac acgaccgctt tggtggctac gctcaatctg gcctgttggc tgaaatcacc 240 ccggacaaag cgttccagga caagctgtat ccgtttacct gggatgccgt acgttacaac 300 ggcaagctga ttgcttaccc gatcgctgtt gaagcgttat cgctgattta taacaaagat 360 ctgctgccga acccgccaaa aacctgggaa gagatcccgg cgctggataa agaactgaaa 420 gcgaaaggta agagcgcgct gatgttcaac ctgcaagaac cgtacttcac ctggccgctg 480 attgctgctg acgggggtta tgcgttcaag tatgaaaacg gcaagtacga cattaaagac 540 gtgggcgtgg ataacgctgg cgcgaaagcg ggtctgacct tcctggttga cctgattaaa 600 aacaaacaca tgaatgcaga caccgattac tccatcgcag aagctgcctt taataaaggc 660 gaaacagcga tgaccatcaa cggcccgtgg gcatggtcca acatcgacac cagcaaagtg 720 aattatggtg taacggtact gccgaccttc aagggtcaac catccaaacc gttcgttggc 780 gtgctgagcg caggtattaa cgccgccagt ccgaacaaag agctggcaaa agagttcctc 840 gaaaactatc tgctgactga tgaaggtctg gaagcggtta ataaagacaa accgctgggt 900 gccgtagcgc tgaagtctta cgaggaagag ttggcgaaag atccacgtat tgccgccacc 960 atggaaaacg cccagaaagg tgaaatcatg ccgaacatcc cgcagatgtc cgctttctgg 1020 tatgccgtgc gtactgcggt gatcaacgcc gccagcggtc gtcagactgt cgatgaagcc 1080 ctgaaagacg cgcagact 1098 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His6 <400> 7 catcatcatc atcatcac 18 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEVrs <400> 8 gaaaacctgt attttcaggg c 21

Claims

재조합 단백질의 수용성 향상 태그를 코딩하는 유전자;
알부민 결합 나노바디(Albunin binding nanobody, Alb1)을 코딩하는 유전자; 및
서열번호 1로 표시되는 펩티드(WKYMVM)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서,
상기 펩티드(WKYMVM)를 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서,
상기 알부민 결합 나노바디(Alb1)는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서,
상기 수용성 향상 태그는 단백질 이황화물 이성질화효소 b'a' 도메인(protein disulfide isomerase b'a' domain; PDIb'a'), 말토스 결합 단백질(maltose binding protein; MBP) 또는 헥사히스티딘(His6)인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제4항에 있어서,
상기 PDIb'a'유전자는 서열번호 5로 표시되는 핵산 서열을 포함하고, 상기 MBP 유전자는 서열번호 6으로 표시되는 핵산 서열을 포함하며, 상기 His6 유전자는 서열번호 7로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서,
상기 수용성 향상 태그를 코딩하는 유전자와 알부민 결합 단백질(Alb1)을 코딩하는 유전자 사이에 담배 식각 바이러스 프로테아제 인식 위치(tobacco etch virus protease recognition site, TEVrs)를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제6항에 있어서,
상기 담배 식각 바이러스 프로테아제 인식 위치는 서열번호 8로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제1항에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
제8항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제9항에 있어서,
상기 대장균은 BL21(DE3) 또는 Origami 2인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제1항에 따른 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
상기 형질전환체를 배양하여 Alb1-WKYMVM 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및
상기 재조합 단백질로부터 수용성 향상 태그를 제거하는 단계를 포함하는 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)의 생산방법.
제11항에 있어서,
상기 수용성 향상 태그를 제거하는 단계는 재조합 단백질에 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제를 처리하는 것을 특징으로 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)의 생산방법.
제11항에 있어서,
상기 수용성 향상 태그가 제거된 재조합 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM)의 생산방법.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 재조합 단백질(Alb1-WKYMVM).
서열번호 1로 표시되는 펩티드의 N-말단에 알부민 결합 나노바디(Albunin binding nanobody, Alb1)가 융합된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.