KR20220137876A

KR20220137876A - 조직 재생의 촉진에 유용한 hmgb1과 관련된 폴리펩티드, 이를 포함하는 조성물, 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR20220137876A
Application number: KR1020227019798A
Authority: KR
Inventors: 자그딥 난차할; 귀탈트 알바로 비날스; 와이어트 유에; 니콜라 버제스-브라운; 쯩 유안 리; 산토 아나 이사벨 에스피리토
Original assignee: 옥스포드 유니버시티 이노베이션 리미티드
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2020-11-12
Publication date: 2022-10-12
Also published as: WO2021094983A1; AU2020385059A1; JP2023512392A; EP4058033A1; CA3157785A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식으로 나타내어지는 폴리펩티드를 제공한다:
H2N-A-X-B-A-X-B-HOOC
상기 화학식에서,
A는 연속 아미노산을 나타내고, 이 서열은 (1) 야생형 HMGB1의 아미노산 90 내지 93의 서열과 동일한 서열을 포함하고, (2) 아미노 말단에 1 내지 6개의 연속 아미노산, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산을 갖고, 이 서열은 야생형 HMGB1의 아미노산 90에 선행하는 대응하는 1 내지 6개의 아미노산 서열과 동일하고, 임의로, (3) 아미노 말단에 메티오닌을 갖고;
X는 연속 아미노산을 나타내고, 이 서열은 야생형 HMGB1의 아미노산 94 내지 162의 서열과 동일하고;
B는 연속 아미노산을 나타내고, 이 서열은 (1) 야생형 HMGB1의 아미노산 163 내지 168의 서열과 동일한 서열을 포함하고, (2) 이의 카복시 말단에 1 내지 6개의 연속 아미노산, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산을 갖고, 이 서열은 야생형 HMGB1의 아미노산 168 이후에 대응하는 1 내지 6개 아미노산의 서열과 동일하고; 각각의 -는 각각 A와 X, X와 B, B와 A, A와 X, 및 X와 B 사이의 펩티드 결합을 나타낸다.

Description

조직 재생의 촉진에 유용한 HMGB1과 관련된 폴리펩티드, 이를 포함하는 조성물, 및 이들의 용도

본 출원은 2019년 11월 12일에 출원된 미국 가출원 제62/934,299호의 이익을 주장하고, 그 내용은 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.

본 출원 전반에 걸쳐, 괄호 안의 참조를 포함한 다양한 출판물이 참조된다. 본 출원에서 언급된 모든 간행물의 개시는, 본 발명이 관련된 기술 및 본 발명에서 사용될 수 있는 기술의 특징에 대한 추가 설명을 제공하기 위해 참조에 의해 본 출원에 도입된다.

서열 목록에 대한 참조

본 출원에는 "201112_91203-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.txt"라는 명칭의 파일에 존재하는 참조에 의한 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있고, 이 파일의 크기는 78KB이고, 2020년 11월 12일에 IBM-PC 머쉰 형식으로 작성되었고, 본 출원의 일부로서 2020년 11월 12일에 제출된 텍스트 파일에 포함된 MS-Windows와 운영 체제 호환성이 있다.

기술 분야

본 발명은, 유해한 염증의 가능성 없이 조직 재생을 촉진하는 HMGB1과 관련하는 조작된 폴리펩티드, 및 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 조작된 폴리펩티드를 투여함으로써 급성 조직 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

지속적 줄기 세포와 전구 세포는, 항상성을 유지하고 손상 후의 다수 조직을 수복(repair)하는 데 중요한 역할을 한다[1]. 그러나, 성인의 대부분의 조직은 반흔화로 치유된다. 골수(bone marrow) 이식의 성공 후[2], 고형 장기의 재생을 촉진하는 외인성 줄기 세포 요법에 상당한 관심이 있어 왔고, 눈[3]이나 피부[4] 등의 일부 장기에서의 성공은 제한적이다. 조직 손상 후의 염증 환경은 줄기 세포의 이식을 촉진하지 않고, 그 후의 반흔화는 줄기 세포 니치(niche)를 파괴한다[5]. 따라서, 초점은 내인성 수복 메커니즘을 자극함으로써 조직 재생의 촉진으로 이동하고 있다[6]. 성공적 치료법의 개발은 이러한 경로를 촉진하기 위한 가용성 매개인자의 동정에 의존한다. 골, 혈액, 골격근 등의 다수의 조직에서 수복의 주요 매개인자로서, 고이동성 그룹 박스 1(High Mobility Group Box 1; HMGB1)을 이전에 동정했다[7].

HMGB1은 전형적 알라민(alarmin)이고[8,9], 생리학적 조건하에서 전사에 중요한 역할을 한다[10,11]. 세포가 손상되면, 세포외 공간의 손상된 괴사 세포 및 순환으로부터 수동적으로 방출되고, 줄기 세포와 전구 세포에 작용하여, 이들을 G0과 G1 사이의 중간 상태인 G_Alert[7]로 전이시킨다[12]. 적절한 활성화 인자에 노출되면, GAlert의 세포는 급속하게 G1에 진입하여 조직의 복구를 수행할 수 있다. 불필요한 경우, GAlert 줄기 세포는 약 3주 후에 G0으로 돌아오고[12], 이에 의해 이들이 고갈되지 않고 니치가 고갈되지 않도록 한다.

HMBG1은 2개의 L-자형 박스 도메인 A와 B로 구성되어 있고, 각각은 LPS(박스 A의 N-말단 및 인접한 C-말단 링커 영역)[13] 또는 RAGE(박스 B의 C 말단) 결합[14]에 관여하는 유연한 영역에 의해 연결된 3개의 α-헬릭스(I-III)을 함유한다. 단백질의 C-말단은 본질적으로 무질서하고, 산성 테일을 구성하는 카복실산 잔기(Glu/Asp)를 높은 비율로 함유한다. 이것은 HMG 박스에 결합하여, TLR-2[10,15,16] 또는 경우에 따라 RAGE[15]와의 상호작용을 포함하는 활성을 조정한다(도 1A-1B). HMGB1 시스테인 잔기(박스 A의 Cys 22, Cys 44, 박스 B의 Cys 105)의 산화 상태는 HMGB1의 세포외 활성의 중요한 결정기이고, 방출의 메커니즘에 의존한다. 3개의 상이한 레독스 형태가 생체내에서 기재되어 있다[17]. 손상 또는 세포 괴사 후에 핵으로부터 수동적으로 방출되는 HMGB1은 완전히 환원된 형태(FR-HMGB1)이다. 세포 표면 수용체 CXCR4를 통해 CXCL12 및 헤테로 복합체 신호에 결합하여, 줄기 세포 및 전구 세포를 G_Alert로 전이시킨다[7]. 국소 염증 환경에서 부분적 산화는, 디설파이드 HMGB1 (DS-HMGB1)의 형성을 초래하고[18,19], 이는 Cys22와 Cys44 사이에 디설파이드 결합을 갖는다. 이는 또한 아세틸화[20] 및 N-글리코실화[21] 후에 면역 세포에 의해 활발하게 분비되는 형태이다. 고도의 글루코스 최종 산물의 수용체(RAGE)를 통한 DS-HMGB1 신호전달은 혈소판을 활성화시키고, 혈전증의 중요한 매개인자이다[22,23]. DS-HMGB1은 TLR-4 및 TLR-2를 통해 작용하여, TNF 및 IL-6을 포함하는 염증성 사이토카인의 방출을 유도한다[24]. 세포내 신호전달은 3개의 수용체 모두를 통해 수렴하여, MyD88-의존적 방식[26,27]으로 NF-κβ 활성을 유도한다[25]. 세포외 활성 산소 종의 작용에 의한 3개의 시스테인 잔기의 모든 산화는 생물학적으로 불활성인 설포닐-HMGB1(SO3)을 초래한다[17,28].

DS-HMGB1의 박스 A의 디설파이드 가교(Cys22-Cys44)는 TLR-4 신호전달에 필수적이고(도 1A-1B), TLR-4에 대한 결합을 개시하지만, 해리 속도도 비교적 높다. 된다. 이어서, MD-2는 낮은 친화성으로 박스 B에 결합하지만, 해리 속도는 매우 낮고, 상호작용을 안정화시키고[29]; 박스 B의 Phe-Cys-Ser-Glu(FCSE, 104-107) 펩티드는 이러한 상호작용에 필수적이다[30]. TLR-4를 통해 신호를 보내는 DS-HMGB1의 능력은 22, 44, 105 위치의 시스테인을 세린으로 치환하여, 3S-HMGB1로 기재된 조작된 형태를 생성함으로써 극복되었다[17]. 저자들은 3S-HMGB1이 FR-HMGB1와 비교하여 재생 특성이 증강되었다고 주장했지만[31], 골, 혈액, 골격근 손상에서는 FR-HMGB1과 동등하다는 것을 밝혀냈다. 흥미롭게도, 3S-HMGB1은 심근 경색 후에 국소 투여하면 유해한 것으로 보고되었지만, FR-HMGB1은 4주에 걸쳐 평가된 보다 작은 경색 및 증강된 심장 기능을 초래했다[32]. TLR-2 또는 RAGE 신호전달에 대한 3S 치환의 영향에 대한 공개 데이터는 없다.

TLR-2 상호작용 부위는 명확하게 정의되지 않았지만, 글리시르히진(glycyrrhizin)은 이 상호작용을 억제하는 것으로 공지되어 있다[33]. 이는 적어도 하나, 경우에 따라서는 양쪽 HMGBox 도메인과 산성 테일[10]이 관여한다는 것을 시사한다. 산성 테일은 HMGB1을 음으로 조절하고, TLR-2[35]를 통한 신호전달을 가능하게 하기 위해, 박스 도메인으로부터 HMGB1의 산성 테일을 치환하기 위해 공-리간드[34]가 필요하다고 보고되었다. 그러나, 일부 출판물은 HMGB1 단독에 의한 TLR-2 의존성 염증 유발성 신호전달을 보고하였고[24,36], 공-리간드의 요건은 세포 유형 및 상황에 의존성일 수 있다. TLR-2 신호전달에 대한 HMGB1의 레독스 상태의 역할은 디설파이드 형태[22]과 완전-환원 형태[34] 양쪽 모두가 TLR-2를 통해 신호전달하는 것이 제안되어 있기 때문에, 불명확한 상태이다. RAGE 상호작용은 주로 HMG 박스 B(잔기 149-182)의 펩티드에 맵핑되고[14](도 1A-1B), 이 서열로부터 유래하는 펩티드는 HMGB1-RAGE 신호전달을 효과적으로 억제할 수 있다[37]. 또한, 박스 A 내에 제2 카스파제-의존 부위가 있다. 최근, 제2 RAGE 결합 부위는 HMG 박스 A[38]에서 동정되었고, 카스파제 11에 의한 단백질분해 후에만 접근 가능하다[38]. 그러나, RAGE 신호전달에 대한 각 부위 상대적 기여는 불분명하다. RAGE에 의해 매개된 혈전형성 촉진성 신호전달에는 HMGB1의 디설파이드 유형이 필요하다는 것이 인식되어 있고, 이는 박스 A가 관여한다는 것을 의미한다[22]. HMGB1의 산성 테일은 RAGE 결합 펩티드 내의 잔기에 결합하기 때문에, TLR-2와 유사한 방식으로 RAGE 신호전달을 음으로 조절할 수 있다[10, 15, 39].

FR-HMGB1의 재생 활성의 클리닉에 대한 성공적 번역은, CXCL12 결합과 CXCR4를 통한 신호전달을 유지하면서, RAGE, TLR-2, TLR-4를 통한 모든 잠재적 유해 신호전달의 제거에 의존한다. 여기서는, CXCL12에 대한 결합에 중요한 HMGB1의 잔기가 동정되고, RAGE 결합과 TLR-2 및 TLR-4 신호전달을 제거하면서 재생 활성을 유지하는 HMGB1 변이체가 설명되어 있다.

본 발명은 하기 화학식으로 나타내어지는 폴리펩티드를 제공한다:

H2N-A-X-B-A-X-B-HOOC

상기 화학식에서,

A는 연속 아미노산을 나타내고, 이 서열은 (1) 야생형 HMGB1의 아미노산 90 내지 93의 서열과 동일한 서열을 포함하고, (2) 아미노 말단(amino terminal end)에 1 내지 6개의 연속 아미노산, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산을 갖고, 이 서열은 야생형 HMGB1의 아미노산 90에 선행하는 대응하는 1 내지 6개의 아미노산 서열과 동일하며, 임의로, (3) 아미노 말단(amino terminus)에 메티오닌을 갖고;

X는 연속 아미노산을 나타내고, 이 서열은 야생형 HMGB1의 아미노산 94 내지 162의 서열과 동일하고;

B는 연속 아미노산을 나타내고, 이 서열은 (1) 야생형 HMGB1의 아미노산 163 내지 168의 서열과 동일한 서열을 포함하고, (2) 이의 카복시 말단에 1 내지 6개의 연속 아미노산, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산을 갖고, 이 서열은 야생형 HMGB1의 아미노산 168 이후에 대응하는 1 내지 6개 아미노산의 서열과 동일하고;

각각의 -는 각각 A와 X, X와 B, B와 A, A와 X, 및 X와 B 사이의 펩티드 결합을 나타낸다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 조성물, 및 조직 또는 세포의 재생 촉진에 효과적인 양의 본 발명의 폴리펩티드 및 치료적 예방적 용량의 본 발명의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 수복을 위해 CXCR4⁺ 세포에 의존하는 조직 또는 세포의 재생을 촉진함으로써 완화될 병태(condition)를 앓거나, 또는 이러한 병태가 진행될 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

도 1A-1B는 HMGB1의 구조와 공지된 면역원성 활성의 위치의 개략도를 나타낸다. 도 1A: HMGB1의 구조(PDB 2YRQ, 컨포머 1, LPS, TLR-4 또는 RAGE와의 공지된 상호작용에 따라 PyMol로 착색. 전사 조절 및 살균 활성에 관여하는 산성 테일은 구조에 도시되지 않는다. 도 1B: 결합 부위의 개략도. 원래 도면의 색상은 박스 A-청색; 박스 B-녹색; 핑크색: 글리시르히진 결합에 결합에 관여하는 잔기; 적색: 박스 A 또는 박스 B에 인접하는 유연한 N-말단 영역; 오렌지색: 시스테인 잔기; 백색: HMG 박스 사이의 링커 영역; 밝은 녹색 및 황색: RAGE 결합 영역(산성 테일로 신장하기 대문에 불완전, 황색).
도 2A-2F는 각 HMG 박스 도메인의 보존된 잔기가 CXCL12 결합에 중요하고, N-말단의 D-P-X-X 테트라머를 포함한다는 것을 나타낸다. 도 2A: 1μM CXCL12-His6과 함께 인큐베이팅하고 항-His5-HRP 항체로 검출된 HMGB1 15-mer의 펩티드 어레이(11x10). 스폿의 강도는 펩티드에 결합된 CXCL12의 양에 대응하고; 어레이의 최초 2개 및 최후 2개의 스폿은 10-His 양성 대조군으로 구성되었다. 도 2B: 10-his 대조군에 대해 정규화된 (도 2A)(중복 실행)에서 스폿 강도의 강도 정량화. 알라닌 스캐닝 실험에 사용된 펩티드가 강조 표시되었다. 산성 테일의 펩티드는, 이의 높은 음전하로 인해, CXCL12 등의 양이온 분자에 비특이적으로 결합하기 때문에, 포함되지 않았다. 그래프의 펩티드는 좌측으로부터 우측으로 서열번호 8 내지 104로 표시된다. 도 2C: (도 2A-2B)에서 동정된 펩티드 내의 단일 위치에서 알라닌 돌연변이유발의 펩티드 어레이. 각 행의 제1 스폿은 양성 대조군에 대응하고, 비변형 펩티드에 대한 제2 스폿. 제시된 펩티드는 서열번호 105 내지 111에 제시되어 있다. 도 2D: 비변형 펩티드에 대해 정규화된 (도 2C, 서열번호 105-111) 내의 어레이의 강도 정량화. 알라닌 잔기에서 관찰된 변동보다 더 큰 CXCL12 신호의 변동을 나타낸 잔기(Ala → Ala; 동의 돌연변이, 회색)는 원래 도면 착색에서 적색으로 표시된다. 도 2E: 원래 도면 착색에서 CXCL12에 결합하는 비오티닐화된 HMGB1 작제물의 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 포화 적합[전장 FR 적색/3S 흑색; 최소 박스 A 8-78(자색) 및 박스 B 94-162(갈색), 확장 박스 A 1-88(핑크색) 및 박스 B 89-174(회색)]. 도 2F: (도 2E)로부터 도출된 동력학 파라미터의 요약. 양쪽 적합으로부터의 친화성(Kd) 상수는 동일한 관계를 따르고, HMGB1 94-162에 대해 대폭 감소하고; 적합된 데이터로부터 1원 배치 브라운-포르시트(1-way Brown-Forsythe) ANOVA로 분석했다. Kd 값은 사후 2원 배치(post-hoc 2-way) ANOVA를 통해 비교되었고, 페어링 비교(열 계수)에서 유의한 차이가 발견되지 않았기 때문에, 양쪽 값을 평균했다. 생 간섭도는 도 9에서 발견할 수 있다.
도 3A-3B는 CXCL12 결합에 관여하는 잔기의 NMR 검증을 나타낸다. 도 3A: CXCL12 부재하의 병렬 대조군을 포함하는 몇몇 HSQC 스펙트럼에 대해 계산된, CXCL12(0.42, 0.84 및 1.42 몰 당량)으로 적정한 후의 헬릭스-단독 비오티닐화 박스 B(94-162, HMGB1A-c028) 또는 완전한 박스 B(89-174, HMGB1A-c038)의 누적 CSP는 최후 농도 점 후에 측정했다(CSP 드리프트 제어). 그래프에서 녹색의 강도는 상대적 CSP를 나타낸다. 각 HMGB1 작제물의 서열은 잔기 번호와 중첩되었고; 공 열(숫자 없음)은 병렬 3D ¹H-¹⁵N HSQC/NOE/TOCSY 실험에서 맵핑할 수 없는 잔기를 나타낸다. 각 HMG 박스에 대응하는 잔기의 서열은 원래 도면 착색으로 다음과 같이 도시된다. 연청색, CXCL12 결합에 관여하는 것으로서 이전에 문헌에 보고된 잔기; 적색, 펩티드 어레이에 약하게 관여하는 잔기; 자색, 공개된 문헌 및 펩티드 어레이 둘 다에 따른 것에 관여하는 잔기. 회색, 펩티드 어레이에서 평가할 수 없는, CXCL12 결합 펩티드 내의 알라닌 잔기(밑줄). 도시된 서열은 서열번호 5에 표시되어 있다. 도 3B: (도 3A)의 누적 피크 높이 변화; NMR 변화의 히트맵. 원래 도면 착색에서, 적색은 모든 잔류물의 1 SEM에 대한 I/I0 변화를 나타내고, 청색은 -1 SEM 초과의 감소를 나타낸다. 제시된 서열은 서열번호 5에 표시되어 있다.
도 4A-4C는 dBB12L 작제물의 설계를 나타낸다. 도 4A: 박스 A + 링커(1-88)(서열번호 3)와 박스 B + 링커(89-174)(서열번호 4)의 정렬; 값은 NMR 명명법에 대응한다(N-말단 메티오닌 제외). 수직선은 엄격하게 보존된 위치를 나타내고, 이중 도트는 유사한 치환을 나타낸다. 밑줄: 제1 펩티드 어레이로부터의 CXCL12에 결합하는 펩티드 영역. 원래 도면 착색, 적색: NMR에 의해 검증할 수 없는 CXCL12 결합에 관여하는 것으로서 알라닌 스캔에서 플래그된 잔기; 오렌지색: 알라닌 스캔에서 플래그되고 NMR에 의해 CSP 또는 피크 용적 변화를 나타내는 잔기; 시안색: NMR 또는 펩티드 어레이 실험에서는 플래그되지 않았지만, NMR 문헌에서는 CXCL12 결합에 기여하는 것으로 기재된 잔기[44]; 자색: 펩티드 어레이 실험에 플래그되고 공개된 또는 당사의 NMR 데이터에 의해 확인된 잔기; 녹색: CXCL12에 직접 결합하거나 근처 잔기에 대한 결합에 의해 영향을 받을 수 있는, NMR 실험에서만 플래그된 잔기; 핑크색: NMR 실험과 공개된 데이터 둘 다에 의해 플래그된 잔기. 도 4B: FR-HMGB1 1-166(2YRQ)의 구조, 잔기는 (도 4A)와 동일한 색상 코드에 따라 착색된다. 모든 유색 잔기의 측쇄가 도시되었다. 점선 원은 각 HMG 박스의 글리시르히진(glycyrrhizin) 결합 영역을 나타낸다. 도 4C: dBB12L 작제물 설계의 개략도. 개시 코돈 Met 1은, 절단된 펩티드에서 부분적으로 소실되기 때문에, 본 명세서에서는 Met 0으로 넘버링된다. 따라서, HMGB1 Met 1 -Gly 2…Glu 215는 Met 0-Gly 1…Glu 214로 된다. FR-HMGB1(상부 - 서열번호 1) 및 dBB12L 작제물(하부 - 서열번호 2)의 도메인 구성 및 서열. dBB12L 작제물은 다음과 같이 설계되었다: 1. 산성 테일 및 RAGE 결합 도메인(175-214)의 일부를 결실시키고; 2. 잔기 1-88(박스 A)을 잔기 89-174로 치환하여, 2개의 HMG 박스 B 도메인을 생성하고; 3. 박스 B에 대한 잔기 163-174 C-말단은 천연 HMGB1에서 박스 A에 대한 천연 유연한 링커(79-88) C-말단을 치환한다. CXCL12 결합 펩티드는 적색 문자로 표시된다. 반복 박스 B 단위는 다이어그램에서 흑색 파선으로 구분된다.
도 5A-5D는 dBB12L이 FR-HMGB1 1-214/1-164와 유사한 안정성 및 표면 전하 형태를 갖는 것을 나타낸다. 도 5A: 전체 길이 및 1-164 FR-HMGB1 및 dBB12L에 대해 계산된 Tm₅₀ 값(℃). 개별 Tm₅₀ 값의 음영은 모든 작제물에 대한 글로벌 데이터세트 내에서 최고(녹색) 및 최저(적색)의 값을 나타낸다. N/A: 곡선은 적합하지 않는다. 도 5B: 50mM 또는 0.2M 암모늄 아세테이트(pH 6.5)에서 HMGB1 작제물의 천연 ESI/MS. 3개의 모든 HMGB1 작제물은 유사한 천연 M/Z 프로필을 갖고 있으며, dBB12L은 2개의 HMG 박스가 서로 이격되어 있는 축소된 HMGB1 작제물과 매우 유사하다. 연속선; 컴팩트 단량체. 점선; 확장된 단량체(서로 원위의 HMG 박스). 산성 테일 제거(FR HMGB1 1-164, FR-HMGB1와 비교하여 청색 곡선, 원래 도면 착색을 갖는 적색 곡선) 및 더 높은 이온 강도(50mM 또는 200mM 암모늄 아세테이트에서 동일한 작제물에 대한 스펙트럼 비교)는 더 높은 M/Z 상태(부분적 비폴딩)의 유병율을 증가시킨다. 도 5C: 평균 폴딩 HMGB1 단량체, 확장 및 압축 단량체 상태 및 비폴딩 단량체에 대한 용매 접촉 표면적(SASA)의 계산(도 5D). 도 5D: 0.2M 암모늄 아세테이트, pH 6.5에서 실온에서 180일(D0-D180)간 보존한 후 HMGB1 작제물의 변성 ESI/MS 디콘볼루션, SDS-PAGE 및 SEC 프로파일.
도　6A-6F는 dBB12L이 RAGE에 대한 결합을 감소시키고, TLR-2 또는 TLR-4를 통해 신호를 전달하지 않음을 나타낸다.　 도　6A:　미카엘리스-멘텐 포화도는 하이브리드 ELISA로부터 적합시키고(농도당 n=4, 글로벌 적합), 산화 상태와 관계없이, dBB12L 작제물에 의한 RAGE 결합의 부재를 나타낸다. DS-HMGB1은 FR-HMGB1과 비교하여 RAGE를 더 강력하게 결합시킨다. DS-HMGB1 조절과 관련하여 정규화된 데이터.　도　6B:　미카엘리스-멘텐 포화는 생물층　간섭계로부터 적합시킨다(0-25μM HMGB1; n = 6 센서 실행).　회합 및 해리 속도는 생 인터페로그램 데이터 단독으로부터 계산되었다. 동역학 파라미터 및 색상 범례(디설파이드 형태는 파선으로 표시됨)는 도 6C에 요약되어 있고:　유효하지 않은 적합은 R²　< 0.6(불충분한 결합)을 나타낸다. ELISA로부터의 데이터는 실험의 특성으로 인해 회합 상수보다도 해리 상수에 의해 비례적으로 더 많은 영향을 받는다.　각 동력학 파라미터에 대해, 녹색은 가장 높은 친화성, 가장 빠른 회합(k _on ) 또는 가장 느린 해리(k _Off )를 갖는 작제물을 나타내고; 중앙점은 황색으로, 최저점은 원래 착색 도면에서 적색으로 나타낸다. 도 6D-6E는 인간 TLR-2 및 CD14(도 6D) 또는 뮤린 TLR-4, MD-2 및 CD14를 발현하는 리포터 HEK-이중 세포에서　DS-HMGB1 촉진된 NF-κβ　활성을　나타낸다(도　6E).　DbB-HMGB1은 NF-κβ　신호전달을　촉진하지 않지만, FR-HMGB1은 양쪽 세포주 모두에서 경미한 NF-κβ 활성화만을 유도했고, 이는 검정 동안의 부분적 산화에 의한 것이다. 값은 대조군((배지 단독)과 비교하여 평균 ± SEM 배수 변화로서 제시된다. 도 6F:　디설파이드 HMGB1(DS-HMGB1)은 단핵구에서 TNF 생산을 증가시켰고, 이는 LPS가 아닌 최적량 이하의 LTA의 존재에 의해 추가로　증강되었다. FR-HMGB1 및 DbB-HMGB1은 둘 다 LPS 또는 LTA와 함께 24시간 동안 예비-인큐베이팅한 경우에도 TNF 분비를 유발하지 않았다. 이들 작제물과 함께 예비-인큐베이팅된 LPS에 대한 반응은 또한 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 n=3 공여체를 유의하게 감소시켰다.
도 7A-7J는 최적 용량의 dBB-HMGB1 및 FR-HMGB1의 재생 효과가 활성화 손상의 재생 효과와 동일한 것을 나타낸다. 도 7A: 손상 또는 HMGB1 유도 G_Alert 후의 배수 변화에 의해 근육 줄기 세포에서 차등적으로 발현된 유전자를 나타내는 화산 플롯. 통합은, 반대측 하지 손상 또는 정맥내(iv) HMGB1에 의해 유도된 G_Alert의 코어 유전자의 보존된 상향(색상을 갖는 도면의 갈색 도트) 및 하향(색상을 갖는 도면의 청색 도트) 조절을 입증한다. 도 7B: 근육 줄기 세포에서 G_Alert 유도 동안 차등적으로 발현하는 세포의 유전자 온톨로지 용어의 네트워크 맵. 도 7C: BaCl₂ 골격근 손상 모델에서 FR-HMGB1의 용량 반응, 재생은 섬유 단면적에 의해 정량화된다. 최적 용량은 0.75mg/kg(28.75nmol/kg)이고, 후속 검정에 사용되었다. 도 7D: 동물에게, BaCl₂ 주사 후의 다양한 시점에서 FR-HMGB1(최적 용량)을 투여하여, FR-HMGB1에 의한 치료가 손상 후에 효과적인 간격을 평가했다. (도 7C)의 값(도 7D)은 홈-시닥(Holm-Sidak) 보정을 사용한 네스트된 ANOVA에서 평균 ± SEM으로 표시된다(사후 시험에 대해 표시된 값). 도 7E: 마우스에서 iv HMGB1의 약물동태, 비선형 최송 제곱법에 의해 2상 지수관수적 감쇠 곡선(최적 용량의 정맥내 주사 후의 HMGB1의 순환)에 적합. 도 7F: 5주간 FR-HMGB1 = 83%, PBS = 52%에서 심근경색증(MI) 후의 생존율. 도 7G: 박출율. 점선은 정상/위 수술 마우스의 박출율을 나타낸다. 도 7H: 시간 경과에 따른 치료 효과에 대한 2원 배치 ANOVA에 의해 비교한 경색 크기. 도 7I: MI 후 1주 및 5주간의 심장 주기의 확장기 말기 및 수축기 말기 단계에서 대표적 중간-심실 단축 시네-MRI 이미지. 챔버의 혈액은 밝게 나타난다. FR-HMGB1 그룹은 수축기의 우심실과 좌심실(색상을 갖는 도면에서 적색 화살표)의 가시적 분리와 함께 심장 기능의 유지 및 벽 두께의 유지(색상을 갖는 도면의 황색 화살표)를 나타낸다. 대조적으로, PBS 처리 그룹에서는, 좌심실의 유의한 확장(백색 화살표)이 있고, 확장기와 수축기 사이의 수축은 매우 한정되어 있다. n = 그룹당 10. 모든 MRI 스캔은 블라인드 관찰자에 의해 수행되고 평가되었다. 도 7J: PBS(흑색), 28.75nM/kg의 FR-HMGB1A-c001(색상을 갖는 도면에서 적색) 또는 dBB12L(색상을 갖는 도면에서 녹색)으로 처리된 BaCl₂ 근육 손상 동물 후의 소정 시점에서 플롯된 평균 근육 단면적. N= 그룹 및 시점당 5, 네스트된 ANOVA(홈-시닥(Holm-Sidak) 사후 보정). 각 시점의 대표적 이미지는 도 12에 도시되어 있다.
도 8A-8B는 HMGB1과 상호작용하는 CXCL12 펩티드의 펩티드 어레이의 결과를 나타낸다. 도 8A: 전체 길이 CXCL12의 펩티드 어레이. "+" 위치는 양성 대조군 10-His 펩티드에 대응하고; 나머지 펩티드는 C-말단을 향해 연속적으로 2개의 잔기로 이동된 CXCL12 15-mer를 포함한다. 막을 1uM HMGB1(FR 또는 3S)-His6(1-214), BoxA-His6(8-78) 및 BoxB-His6(94-162)에 24시간 노출시켰다. 결합된 단백질은 항-His-HRP 접합체 화학발광에 의해 검출되었다. 전장 HMGB1과 상호작용하는 CXCL12의 펩티드는 박스 A 또는 박스 B 단독과 상호작용할 수 없고, 이는 각 박스 도메인의 N-말단 세그먼트의 요건을 확인하고(특히, 박스 A의 D4/박스 B의 D90), 일반적 CXCL12 펩티드와 관련된 스폿의 강도는 또한, FL-HMGB1과 비교한 경우, 박스 도메인 단독에 결합하면 현저히 감소한다. 3S에 대한 결합은 FR에 대한 결합보다 강도가 더 높은 것으로 보이고; 이는 분석 중의 단백질의 산화로 인한 것일 수 있지만, 사용된 단백질의 농도가 낮아 ESI/TOF MS에 적합하지 않기 때문에 이는 정량화되지 않았다. 그러나, BLI 데이터는 FR-HMGB1보다 3S의 쪽이 CXCL12의 더 낮은 오프 속도를 시사한다. 도 8B: HMGB1 결합 영역이 강조 표시된 CXCL12 다이머(PDB 2J7Z). 색상을 갖는 원래 도면에서는, 적색: 공유 결합 영역, 청색: 비공유 결합 영역.
도 9는 고정된 HMGB1 작제물에 결합하는 CXCL12의 BLI에서 인터페로그램을 나타낸다. 비오티닐화 HMGB1 작제물을 스트렙트아비딘으로 코팅된 옥테트(Octet) 바이오센서에 고정하고, CXCL12의 농도를 상승시키면서 침적했다. 인터페로그램은 CXCL12 농도에 따라 착색된다(우측 상부 키). 소정 센서에 대한 3개의 반복(사이클)의 각 세트는 작제물에 따라 착색된 오버레이로 둘러싸여 있다. FR FL-HMGB1(c011), 측색: 3S-FL HMGB1(c022), 자색: FR-HMGB1 박스 A 8-78(c027), 갈색: FR-HMGB1 박스 B 94-162(c028), 핑크색: FR-HMGB1 박스 A 1-88(c037), 회색: FR-HMGB1 박스 B 90-162(c038).
도 10A-10D는 CXCL12 결합에 관여하는 잔기의 NMR 검증을 나타낸다(계속). 도 10A: 1단계에서 1:2 몰 당량의 CXCL12를 첨가한 경우의 HMGB1 3S 1-184(HMGB1A-c007)의 누적 CSP(1:1 HMG 박스 대 CXCL12의 비율). 박스 A와 박스 B 잔기는 중앙값 CSP 계산을 위해 별도의 분자로 간주되었다. 원래 도면 착색의 경우, 막대 그래프에서 녹색의 강도는 더 높은 상대 CSP를 나타낸다. 각 HMGB1 작제물의 서열은 잔기 번호와 오버레이되었고; 공 열(번호 없음)은 병렬 3D 1H-15N HSQC/NOE/TOCSY 실험에서 맵핑할 수 없는 잔기를 나타낸다. 각 박스에 대응하는 잔기의 서열은 각 조건의 중간에 있고, 원래는 다음과 같이 착색되어 있다: 밝은 청색, CXCL12 결합에 관여하는 이전에 문헌에서 보고된 잔기; 적색, 펩티드 어레이에 약하게 관여하는 잔기; 자색, 공개된 문헌 및 펩티드 어레이 둘 다에 따라 관여하는 잔기. 도시된 서열은 서열번호 6 및 7에 표시되어 있다. 도 10B: 10mM HEPES 150mM NaCl pH 7.5 완충액에서 (A)에 대한 15N HSQC-HQMC 피크 스펙트럼. 단백질 농도는 스펙트럼 오버레이에 표시된다. 도 10C - 10D는 10mM HEPES 150mM NaCl pH 7.5 완충액에서 15N HSQC-HQMC 피크 스펙트럼을 나타낸다. 단백질 농도는 스펙트럼 오버레이에 표시된다. 도 10C: HMGB1A 94-162(2일간 실험); 도 10D: HMGB1A 89-174(6일간 실험, 4일 후에 경미한 열화 발생).
도 11은 고정된 Fc-RAGE에 결합하는 HMGB1 작제물의 BLI에서 인터페로그램을 나타낸다. RAGE-Fc는 AHC 센서의 표면에 고정되고, 상승 농도의 상이한 HMGB1 작제물에 침적시켰다. 상이한 농도 범위에서 2개의 실험이 실행되었다: 좌측 3개의 그래프 컬럼, 9단계에 걸쳐 0 내지 22.22μM HMGB1; 우측은 7단계에 걸쳐 0 내지 25μM이다. 둘 다는 원래 농도에 따라 색상-코드화된다(상부). 색상은 특정 작제물 농도를 나타낸다. 각 그래프는 단일 센서(복제)에 대응한다. 적색 직사각형으로 둘러싸인 인터페로그램은, 품질이 불량하기 때문에(예: 드리프트), 데이터 포인트가 제외되었다.
도 12는 FR-HMGB1(적색) 또는 dBB12L(녹색)에 반응하여 재생 근육의 조직학적 이미지를 원래 착색된 도면에서 PBS 대조군(흑색)과 비교하여 나타낸다.
도 13A-13C는 플라스미드 벡터 맵을 나타낸다. 기능 및 제한 부위를 포함하는 벡터 맵. TEV: 타바코 엣치 바이러스 프로테아제 인식 부위. 6-His: 10/6-히스티딘 잔기 친화성 에피토프. FLAG: FLAG 친화성 에피토프. StrepTag: StreptactinXT 친화성 에피토프. SacB: 레반수크라제 전구체(수크로즈의 존재하에 음성 선택). pLIC: 콜로니 스크리닝에 사용되는 서열분석 프라이머의 어닐링 부위. 모든 플라스미드에는 카나마이신 내성(50μg/mL)이 포함되어 있다.
도 14는 3S-HMGB1을 생성하기 위한 FR-HMGB1 서열의 돌연변이유발을 나타낸다.

용어

본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 본 명세서에 명시적으로 제공된 경우를 제외하고, 하기 용어들 각각은 이하에 기재된 의미를 갖는다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "조작된"은 천연 존재 화합물의 변경에 기초하여 생성된 비천연 존재 화합물을 의미한다. 조작된 화합물, 예를 들면, 폴리펩티드는 변형 또는 재배열된 천연 존재 화합물의 일부를 포함할 수 있다. 이러한 조작된 폴리펩티드는 또한 천연 존재 폴리펩티드의 "유사체" 또는 "유도체"로서 지칭될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "줄기 세포"는, 조혈 줄기 세포를 제한 없이 포함하는, 체내에서 다수의 상이한 세포 유형으로 발달할 수 있는 가능성을 갖는 임의의 특수화되지 않은 세포를 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 급성 조직 손상 등, 이와 연관된 병태 또는 증상을 경감시키는 등, 목적하는 결과를 달성할 수 있는 화합물의 양을 의미한다. 본 발명에 따라 투여되는 화합물의 특정 용량은, 물론, 병태와 관련되는 특정 행위, 예를 들면, 투여 경로, 대상체의 생리학적 상태, 및 치료되는 병태의 중증도에 의해 결정될 것이다. 예를 들면, 대상체에게 투여되는 조작된 HMGB1 단백질은 바람직하게는 치료학적 유효량의 조작된 HMGB1 단백질을 포함하는 조성물의 형태이다.

어구 "약학적으로 허용되는"은, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한, 화합물, 재료, 조성물 또는 투여 형태를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 어구 "약학적으로 허용되는 담체"는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매 캡슐화 재료 등의 약학적으로 허용되는 재료, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 임의의 특정 약제학적으로 허용되는 담체의 선택은 당업자의 지식의 범위 내에 있다. 따라서, 약제학적 조성물에 이용가능하고 일상적으로 사용되는 매우 다양한 적합한 담체가 존재한다.

본 명세서에 사용된 용어 "a" 및 "an"은 열거된 구성요소 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 제공된 모든 수치 범위는 종점들을 명시적으로 포함하고, 범위의 종점들 사이에 속하는 모든 수치를 문맥과 일치시키는 것을 의도한다.

본 발명의 실시형태

H2N-A-X-B-A-X-B-HOOC

상기 화학식에서,

A는 연속 아미노산을 나타내고, 이 서열은 (1) 야생형 HMGB1의 아미노산 90 내지 93의 서열과 동일한 서열을 포함하고, (2) 아미노 말단에 1 내지 6개의 연속 아미노산을 갖고, 이 서열은 야생형 HMGB1의 아미노산 90에 선행하는 대응하는 1 내지 6개의 아미노산 서열과 동일하며, 임의로, (3) 아미노 말단에 메티오닌을 갖고;

일부 실시형태에서, 메티오닌은 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재한다.

다른 실시형태에서, A는 이의 아미노 말단에 야생형 HMGB1의 아미노산 89에 대응하는 하나의 아미노산을 갖는다.

일부 실시형태에서, B는 이의 카복시 말단 말단에, 야생형 HMGB1의 아미노산 169 내지 174의 서열에 대응하는 서열을 갖는 6개의 아미노산 서열을 가는다.

본 발명은 또한 제공된 실시형태 중의 어느 하나의 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 치료적 또는 예방적 유효량으로 존재하고, 담체는 약제학적으로 허용되는 담체이다.

본 발명은 또한, 조직 또는 세포의 재생을 촉진하기에 효과적인 양의 제공된 실시형태 중 어느 하나의 폴리펩티드, 즉 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 수복을 위해 CXCR4⁺ 세포에 의존하는 조직 또는 세포의 재생을 촉진함으로써 완화되는 병태을 앓고 있거나 이러한 병태가 진행될 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

특정 실시형태에서, 병태는 심근 경색(myocardial infarction)이고, 조직은 심장 조직, 특히 심근이다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 폴리펩티드는 심근 경색으로부터 5시간 이내, 바람직하게는 4시간 이내, 더욱 바람직하게는 3시간 이내, 더욱더 바람직하게는 2시간 이내 및 가장 바람직하게는 1시간 이내에 투여된다.

일부 실시형태에서, 상기 병태는 골절(fracture)이고, 조직은 골이다.

다른 실시형태에서, 상기 병태는 간 손상을 수반하고, 상기 조직은 간 조직이다.

또 다른 실시형태에서, 상기 병태는 뇌 또는 신경계의 손상을 수반하고, 뇌졸중(stroke), 파킨슨병(Parkinson's disease) 및 치매(dementia)를 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 병태는 폐의 손상을 수반한다.

또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 병태는 장(gut)을 수반하고, 수술 및 염증성 장 질환을 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 병태는 피부의 손상을 수반하고, 외과적 처치(surgical procedure), 화상 및 궤양을 포함한다.

추가의 실시형태에서, 상기 병태는 제1형 당뇨병(type 1 diabetes)을 포함하는 췌장을 수반하고, 상기 세포는 췌도 세포(islet cell)를 포함한다.

추가의 실시형태에서, 병태는 호중구감소증(neutropenia), 예를 들면, 화학요법 후의 호중구감소증이고, 조직은 골수이다.

일부 실시형태에서, 상기 상태는 신부전(kidney failure)이고, 조직은 신장 조직이다.

추가로, 비제한적 상세는 하기의 실험 상세 섹션에 설명되어 있고, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위해 기재되지만, 개시된 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것을 의도하지 않고, 또한 해석되어서는 안 된다.

실험 상세

결과

CXCL12 결합에 관여하는 HMGB1의 아미노산 및 모티프의 동정

FR-HMGB1의 어느 잔기가 돌연변이되어 염증유발성 신호전달을 제거할 수 있는지를 고려하기 전에, CXCL12에 대한 결합에 관여하는 아미노산 및 모티프를 맵핑하는 것이 필수적이다. 펩티드 SPOT 어레이가 사용되었고[40], 여기서 하나의 표적 단백질(HMGB1)의 서열을 커버하는 중첩 펩티드를, 결합에 관여하는 주요 서열을 확인하기 위해 CXCL12에 결합하는 이들의 능력에 대해 면역블롯팅에 의해 평가한다. his-태그된 CXCL12에 결합하는 인간 HMGB1 펩티드를 갖는 조악한 펩티드 어레이는 CXCL12에 결합하는 박스 A와 박스 B 사이의 상동성 서열의 특정 패턴을 강조했다. 2개의 주요 결합 부위는 HMGB1 서열 상에서 CXCL12 결합 펩티드의 클러스터링에 의해 동정되었다(도 2A 및 도 2B). 제1의 것은, 글리시르히진 결합 부위와 중첩되는, HMG 박스의 최초 2.5 α-헬릭스를 포함했다[41]. 제2의 것은 제3 α-헬릭스의 C 말단의 절반에 위치했다. 각각의 HMG 박스에서, 제1 CXCL12 결합 펩티드(헬릭스 I 및 II)는 이 세그먼트로부터의 펩티드에 결합하는 CXCL12의 강도가 훨씬 더 높았기 때문에, CXCL12 결합에 가장 관여하는 것으로 나타났다. CXCL12에 대한 박스 B 펩티드의 결합은 면역블롯의 강도에 기초하여 박스 A와 비교하여 약간 약한 것으로 나타났다.

개별 잔기의 중요성을 추가로 상세히 설명하기 위해, CXCL12 결합 펩티드 내의 각 아미노산이 알라닌으로 치환되고 CXCL12 결합에 대한 이들의 효과가 평가되는 제2 펩티드 어레이가 생성되었다. 목적은 CXCL12 상호작용에 직접적으로 기여하는 펩티드 상의 아미노산을 특정하는 것이었다. 이에 의해, 알라닌에 대한 이들의 치환이 기타 상동성 펩티드에서 결합된 CXCL12의 강도를 변화시켰기 때문에(도 2C 및 도 2D), 몇몇 잔기가 CXCL12 결합에 중요하다는 것이 확인되었다. CXCL12와의 상호작용이 HMG 박스의 헬릭스 세그먼트만을 포함하는 것으로 밝혀진 공개된 데이터와는 달리[42-44], 각 박스에 대한 유연한 N 말단 인접 영역의 일부(D_-4-P-X-X-X_-1)와 C 말단 잔기(박스 A의 경우 Ile 78-Pro 80 및 Box B의 경우 Ala 163-Asp168)가 CXCL12와의 상호작용에 관여한다는 것을 발견했다(도 2E). 이는 CXCL12 펩티드의 역 펩티드 어레이(도 9)로 확인되었다. 전장 FR 및 3S-HMGB1은 CXCL12의 β-시트 전체를 커버하는 서열을 함유하는 펩티드에 결합하지만, HMGB1 박스 작제물 단독(8-78 박스 A) 또는 (94-162 박스 B)는, 인접 유연한 영역[45]이 없이, β-시트의 N 말단 쇄를 커버하는 펩티드와만 상호작용했다.

HMG 박스에 인접하는 이러한 유연한 영역이 CXCL12 결합에 관여하는 경우, 이들이 존재하지 않으면, HMGB1과 CXCL12의 상호작용이 현저히 변화되어야 한다고 가정했다. 생물층 간섭법(BLI)을 사용하여, 유연한 인접 잔기(전장 HMG 박스 작제물: 박스 A의 경우 HMGB1 1-88, 박스 B의 경우 HMGB1 89-174)[46]의 존재 또는 부재(헬릭스-단독 HMG 박스 작제물; HMGB1 9-78, HMGB1 94-162)하의 각각의 HMG 박스, 야생형 단백질[17]의 CXCL12-결합 특성을 공유하는 전장 FR-HMGB1 및 비-산화성 (3S)-HMGB1을 포함하는 HMGB1 작제물에 대한 CXCL12의 결합을 평가한다. 예상한 바와 같이, HMGB1에 대한 CXCL12의 결합은 이러한 유연한 영역의 존재에 의해 크게 영향을 받았다(도 2E 및 도 2F). 헬릭스-단독 작제물은, 인접 영역의 부재하에 헬릭스-단독 작제물의 증가된 해리 속도(k_off)에 의해 입증된 바와 같이, 무손상 인접 영역을 갖는 완전한 HMG 박스 작제물과 비교하여 CXCL12 친화성 및 결합 능력이 감소했다. 대조적으로, 전장 HMGB1(FR 또는 3S) 및 완전한 HMG 박스 작제물에 대한 CXCL12의 친화성은 서로 동등했고, 헬릭스-단독 작제물에 대한 것보다 높았다.

본 발명의 펩티드 어레이는 CXCL12 결합에 관여하는 잔기가 2개의 펩티드로 클러스터링되었다는 것을 나타냈다: 하나는 α-헬릭스 I 및 II의 N 말단 절반에 걸쳐 있고, 두 번째는 α-헬릭스 III의 C-말단에 걸쳐 있다. 양쪽 펩티드 모두에는 각각의 HMG 박스의 N- 및 C-말단에 유연한 인접 영역이 포함되어 있다. 이 패턴은 HMG A 및 B 박스에 걸쳐 미러링되었다(도 2B, 도 2D, 도 2E). BLI 동역학 데이터에 의해, 단일 HMG 박스 도메인에서 인접 영역의 부재가 동원된 CXCL12의 불안정화를 초래하고, 이는 헬릭스 단독 작제물에 결합된 상태로 잔류하지 않는 것이 확인되었다(도 2F).

CXCL12는 펩티드 어레이 및 NMR에 의해 제시된 바와 같이 각 HMG 박스의 하부에 있는 오목형 포켓에 결합한다.

이어서, NMR을 사용하여, CXCL12 결합에 관여하는 HMGB1의 아미노산 잔기를 구조적 관점에서 확인했다. CXCL12 결합에 관여하는 잔기는 복합체의 형성시에 NMR 신호 변화를 초래할 것이다. FR-HMGB1 94-162 및 89-174를 사용하여, 인접 영역의 존재 또는 부재하에 HMG 박스, 및 3S HMGB1 1-184를 나타냈다. 750MHz에서 3D 스펙트럼의 전체 세트(¹⁵N HSQC-TOCSY/NOESY 및 관련 ¹⁵N HSQC 스펙트럼)을 수득하기 위해 필요한 시간은 피크 공명 및 CXCL12와의 상호작용 둘 다를 변경하는 FR-HMGB1의 산화를 초래하기 때문에, 비-산화성 3S-HMGB1을 사용했다.

HMGB1 박스 B 94-162의 CXCL12 적정(도 3A)은, 펩티드 어레이에서 동정된 C 말단 및 N 말단 결합 영역 둘 다에서 몇몇 잔기의 누적 화학적 이동 섭동(CSP) 또는 피크 높이 변화(I/I₀) 중 어느 하나의 NMR 신호의 변화를 초래했다. 그러나, 본 발명의 펩티드 어레이에서 동정되고 또한 문헌[43,44]에 기재된 몇몇 잔기(A100, I112, L119, A136, Y154, D157, I158)는 CSP 또는 용적 변화를 나타내지 않았다. 인접 영역을 포함하는 박스 B 작제물의 경우, 중앙값 CSP와 평균 용적 변화 모두가 현저히 높았다. 이들 인접 영역 내의 몇몇 잔기(D90, G165, K166)는, 본 발명의 펩티드 어레이 데이터에 따르면, CXCL12 결합에 관여하는 것으로 밝혀졌다. Y154, D157 및 I158 등의 헬릭스 단독(94-162) 작제물에서 CXCL12 결합에 의해 영향을 받지 않고 펩티드 어레이에서 CXCL12 결합에 관여하는 것으로 동정된 잔기는 완전 HMG 박스 작제물에서 유의한 CSP를 입증했고, 이는, 인접 영역이 존재하는 경우에 개선된 결합을 나타낸다. 또한, 인접 영역을 갖는 작제물에서 펩티드 어레이(A147, M131, A169, K172, G173)에서 동정되지 않은 잔기에 대한 CSP 변화를 관찰했다. 이전에 동정되지 않았지만 펩티드 어레이에서 잠재적으로 중요한 것으로 플래그된 다른 잔기는 CXCL12(C105, E107, Y108)의 첨가시에 CSP 또는 용적 변화를 나타내지 않았다. 따라서, 이러한 잔기의 그룹은 CXCL12 결합에 중요하지 않은 것으로 재분류되었다.

NMR 실험이 3S-HMGB1 1-184로 반복된 경우, CXCL12 첨가는 신호 대 잡음 비율로 인해 검출을 위한 임계값 이하의 CSP 변화를 초래했다. 놀랍게도, 공개된 데이터[47]와는 대조적으로, 3S-HMGB1 1-184의 박스 B 중의 잔기 A100, I112, L119 및 A136은, 이들 중 일부에 매우 근접한 잔기(S99, K113)가 영향을 받았음에도, 유의한 CSP 또는 용적 변화를 생성하지 못했다. 이 작제물 내에서, HMG 박스 B에 대응하는 잔기는 박스 A의 잔기와 비교하여 CXCL12와의 상호작용에 관여하는 잔기에 대해 더 약한 CSP 변화를 나타냈다. 이것은, 박스 B에 대한 더 높은 회합 및 해리 속도에 의해 시사된 바와 같이, CXCL12 결합의 보다 유동적 평형을 나타낼 수 있다(도 2G). 이에 의해, H30, D32 또는 S34 등의 잔기를 펩티드 어레이로부터의 위 양성으로 나타낼 수 있었다(도 11). 박스 B 89-174의 K89는 높은 CSP를 나타냈지만, 이것은 N 말단으로부터의 제3 잔기이다(TEV 절단 후의 잔류하는 N 말단 잔기 - Ser-Met). 3S HMGB1 1-184를 사용한 실험에서, 유연한 링커의 중간에 있는 경우, CSP 변화의 증가를 입증하지 않았다. 따라서, 박스 B 단독에서 이러한 잔기와 연관된 변화는, N 말단에서의 이의 위치와 관련될 가능성이 높고, 잠재적으로 높은 입체구조적 유연성을 가능하게 한다.

염증유발성 신호전달을 제거하면서 CXCL12 결합을 유지하는 이중 박스 B HMGB1 작제물의 설계

펩티드 어레이, 알라닌 치환, 및 NMR로부터의 데이터를 조합하고, 이를 HMGB1의 NMR 구조(도 3A, PDB 2YRQ)에 맵핑하여, CXCL12 결합에 관여하는 잔기를 동정했다. 본 발명자들은, CXCL12 결합 잔기가 HMG 박스 도메인의 오목면을 점유하여, 각 HMG 박스의 하부에 CXCL12 결합 포켓을 형성하는 것을 발견했다. 이들 2개 포켓(각 HMG 박스 상에 하나씩)에는 또한, 각각의 박스 상의 헬릭스 I 및 II 사이의 HMGB1-CXCL12 결합의 경쟁적 억제제인 글리시르히진에 대해 기재된 결합 부위가 함유되어 있다[41]. HMG 박스 A 및 B는 각각 1개의 CXCL12 단량체를 동등한 친화성으로 결합할 수 있다. 또한, CXCL12와 상호작용하는 각 HMG 박스 내의 펩티드의 분포는 양쪽 HMG 박스 사이에서 유사하고, 거의 동일한 결합 포켓을 형성하는 것을 인식했다(도 4A).

CXCL12에 결합하는 서열 결정인자를 동정한 후, 이어서, 이들 상호작용 표면을 보존하지만, 염증유발성 신호전달을 감쇠시키기 위해 서열을 변경한 HMGB1 작제물을 설계했다. 각각의 HMG 박스가 CXCL12 단량체에 독립적으로 결합할 수 있다는 사실, 및 TLR-4[48] 및 잠재적으로 프로혈전성 RAGE[14,22] 및 TLR-2[22,33] 신호전달 활성에 대한 박스 A(산화된) 및 박스 B 둘 다의 요건에 기초하여, 박스 A가 또 다른 박스 B로 치환되는(즉, 1-88이 89-174로 치환된) HMGB1 구조는 TLR-2, TLR-4 또는 RAGE를 통해 신호전달하지 않는 것으로 가정했다. 또한, 박스 B(175-184)에서 RAGE 결합 서열의 일부를 결실시켜 이 수용체에 대한 친화성을 추가로 감소시켰다. 박스 B에 대한 박스 A 서열을 치환하면, LPS 지질 A 결합 펩티드의 카피에 대한 LPS 글리칸 결합 펩티드도 치환하고[13], 이는 HMGB1의 염증유발성 활성[49] 및 LBP와 유사한 방식으로 TLR-4/MD-2로의 LPS의 전달을 추가로 저해할 것이다. 이 조작된 작제물 dBB12L(도 4B)은 천연 HMGB1 단백질의 하기 세그먼트로 구성되어 있다: 유연한 N 말단 영역(HMGB1 89-93으로부터), 제1 박스 B(HMGB1 94-162로부터), 천연 박스 B의 12-잔기 링커 C 말단(HMGB1 163-174로부터), 및 제2 박스 B(HMGB1 94-162로부터). 이러한 dBB12L 내의 12개 잔기의 링커 길이는 천연 HMGB1의 링커 내의 10개 아미노산과 유사하다. 링커 길이의 이러한 약간의 증가는 CXCL12 결합에 대한 CSP의 변화를 나타낸 잔기 172 및 173의 보존에 의한 것이었다.

동적 산란 형광측정(DSF)를 사용하여 dBB12L 및 야생형 HMGB1의 열안정성, 및 천연 질량 분광(천연 ESI/MS) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 둘 다에 의한 용매 접촉 표면적(SASA)을 비교했다. dBB12L은 FR-HMGB1 1-164와 유사한 안정성 및 표면 전하 프로파일을 갖고 있었고, 이는 또한 2개의 HMG 박스 도메인을 함유하고 C 말단 산 테일을 함유하지 않는다. 열안정성 경향은 모든 작제물에 대해 유사했고(도 5A), 등전점에 근접한 pH에서 Tm₅₀이 낮아졌고(dBB12L 또는 1-164로서 테일-부재 작제물의 경우 9.9, FL-HMGB1의 경우 6), 이들은 모두 임상 진료와 관련된 조건(PBS, 정제 완충액 및 생리식염수)에서 동등하게 안정했고, Tm₅₀은 약 50℃였다. 그러나, dBB12L과 비교하여 FR-HMGB1/FR-HMGB1 1-164에 대해 상이한 최적 이온 강도 범위가 관찰되었다. 천연 ESI/MS에서, 3개 HMGB1 작제물 모두가 유사한 전하 상태 분포를 갖고, 주요 종으로서 콤팩트 단량체가 있고, 더 높은 SASA 확장 단량체가 있다(도 5B 및 도 5C). 확장된 단량체는 테일-부재 작제물 또는 더 높은 이온 강도에서 더 일반적이었다. 천연 ESI/MS에서 관찰된 평균 단량체 SASA 값은 SEC 또는 공개된 NMR 구조(PDB 2YRQ; HMGB1 1-164)로부터 유래하는 것들과 일치했다. 콤팩트 FL-HMGB1 단량체 SASA는 수 중의 FL-HMGB1의 계산 모델과 일치했다[44]. 최대 180일의 보관은 SEC 프로파일(항상 동등한 RV에서 단분산), 열화 또는 응집에 영향을 미치지 않았다(도 5D). 이는 ESI/MS에서 관찰된 형태가 HMGB1 작제물의 대표적 또는 네이티브 폴딩이고, dBB12L이 2개의 HMG 박스만을 갖는 HMGB1 작제물과 현저히 상이하지 않다는 것을 시사한다.

dBB12L 작제물은 RAGE에 대한 친화성을 대폭 감소시켰고, TLR -2 또는 TLR -4를 통해 신호전달할 수 없다.

이어서, HMGB1 매개된 재생을 유지하면서, dBB12L이 TLR-2, TLR-4 신호전달 및 RAGE 결합을 감소시켰는지를 평가했다. RAGE에 대한 확립된 신호전달 검정의 부재로 인해, 실시간 동역학(BLI) 및 종점 검정(ELISA)을 사용하여, HMGB1에 대한 RAGE의 결합을 평가했다. ELISA 기반 친화성 측정(도 6A)은 평형 상태에서 3S-, FR- 및 DS-HMGB1이 유사한 양의 RAGE에 결합하는 것을 나타냈고, DS-HMGB1 및 3S-HMGB1은 FR-HMGB1보다 현저히 높은 외관 친화성을 갖는다. 대조적으로, dBB12L은 이 검정에서 RAGE에 결합하지 않았다. 무손상 RAGE 결합 펩티드 및 산화된 박스 A를 갖지만 산성 테일을 갖지 않고, 따라서 RAGE 결합에 대한 모든 요건을 갖는 DS-HMGB1 1-184; RAGE 결합 펩티드의 상당 부분을 결여하지만 산화된 박스 A를 보유하는 DS-HMGB1 1-164; 및 DS-박스 A 단독을 포함하여 3개의 추가 HMGB1 작제물이 시험되었다. DS-HMGB1 1-184는 RAGE에 결합했지만, 전장 DS-HMGB1와 비교하여 용량과 친화성이 감소한 것으로 밝혀졌다. 비교하면, DS-HMGB1 1-164는 전장 DS-HMGB1와 비교하여 RAGE 결합 능력이 대폭 감소했지만, 여전히 dBB12L보다 높았고, DS 박스 A 1-88(인접 영역을 갖는 완전 HMG 박스 작제물)은 RAGE에 결합할 수 없었다.

BLI를 이용한 동역학 분석에 의해, 2개의 예외를 제외하고 ELISA 결과(도 6B)가 확인되었다. BLI(도 6C)에서, DS-HMGB1 1-184는 DS-HMGB1보다 친화성이 낮은 ELISA와 비교하여 해리 속도가 약간 신속하지만, 다른 모든 작제물보다 훨씬 높은 RAGE 결합 친화성을 가졌다. 3S-HMGB1은, 등량의 RAGE를 DS- 또는 FR-HMGB1에 결합하면서, FR-HMGB1과 유사한 친화성을 가졌지만, 전체 운동 속도는 훨씬 느린 반면, ELISA에서는 DS-HMGB1과 동등한 RAGE에 대한 친화성 및 결합 능력을 가졌다. BLI에서 RAGE에 대한 다른 모든 HMGB1 작제물의 결합은 ELISA로부터의 결과를 재현했다. 양쪽 검정 모두에서 FR와 비교하여 DS-HMGB1의 RAGE 친화성이 더 높은 것은 회합 속도(k_on)이 훨씬 신속하기 때문이지만, 해리 속도(k_off)는 이들 2개 레독스 형태에 대해 거의 동일했다. 대조적으로, DS-HMGB1에 더 근접한 회합 속도를 갖는 dBB12L은 매우 높은 해리 속도로 매우 불안정한 결합을 나타냈다. DS-HMGB1 1-164는 또한, dBB12L-HMGB1보다 더 높은 친화성을 갖지만, 전장 DS-HMGB1보다 전체적으로 낮은 결합 친화성으로 더 신속한 RAGE 결합 평형을 가졌다. dBB12L의 박스 B(175-184)의 최종 10개 잔기 및 박스 A에서의 디설파이드 브릿지(박스 B로 치환함으로써)의 결실은 RAGE의 불안정한 결합을 초래했다.

HMGB1은 TLR-2, TLR-4 및 RAGE에 결합하고, 모든 수용체로부터의 신호전달은 NF-κβ 경로로 수렴한다[25]. 결과적으로, 하류 염증유발성 사이토카인 생산을 소정 수용체로 되돌리는 것은 곤란하다. 따라서, 먼저 TLR-2 또는 TLR-4 및 이들의 공-수용체를 발현하도록 조작된 NF-κβ 리포터 세포주를 사용하여, TLR 특이적 신호전달을 평가했다. 디설파이드 HMGB1은 TLR-2(도 6D) 및 TLR-4(도 6E)를 통해 NF-kB 신호전달을 촉진시켰다. 대조적으로, dBB12L은 어느 세포 유형에서도 신호전달할 수 없었다. 이어서, 1차 인간 단핵구에 대한 다양한 HMGB1 작제물의 효과를 확인했다. DS-HMGB1이 LTA 등의 TLR-2 리간드와 상승작용하여 염증유발성 신호전달을 촉진한다는 것이 보고되었다[34]. DS-HMGB1이 LTA와 상승적으로 작용하여, LTA 또는 DS-HMGB1 단독보다 더 높은 TNF 생산을 촉진하는 것을 확인했다. 대조적으로, dBB12L 또는 FR-HMGB1은 이러한 상승 효과를 나타내지 않았고, 단독으로는 배지 단독보다 많은 TNF 분비를 유발하지 못했다(도 6F). DS-HMGB1 및 TLR-4 리간드 LPS와의 상승적 반응은 기재되지 않았다. LPS와 조합되면, DS-HMGB1은 1차 인간 단핵구에 의한 TNF 발현을 LPS 단독과 동일한 정도로 촉진시켰다. 대조적으로, FR-HMGB1 또는 dBB12L 단독으로는 TNF 생산을 촉진하지 않았다. 그러나, LPS와 조합되면, FR-HMGB1 또는 dBB12L은 LPS 단독과 비교하여 TNF 발현을 감소시켰다.

종합하면, 이들 데이터는, 이들의 동족 리간드의 존재하는 경우에도, dBB12L이 TLR-2 또는 TLR-4를 통해 신호전달하지 않고, RAGE에 대한 친화성이 대폭 감소하는 것을 나타낸다.

dBB12L 작제물은 FR - HMGB1의 것에 필적하는 재생-촉진 활성을 갖는다.

원위 손상은 줄기 세포를 G_Alert로 전이시키는 것으로 이전에 밝혀졌다[12]. 따라서, 먼저, FR-HMGB1의 골격근 줄기 세포의 전사 반응을 대측성 사지의 손상과 비교했다. FR-HMGB1 또는 원위 손상에 의해 상향 및 하향-조절되는 유전자는 현저하게 유사했고(도 7A), 상향조절된 주요 경로는 미토콘드리아 대사, 산화적 포스포릴화 및 세포 사이클을 포함하여 G_Alert와 관련된 것들이다[7,12](도 7B). 흥미롭게도, CXCR4는 가장 고도로 상향조절된 유전자 중 하나였다.

이어서, 골격근 손상의 검증된 뮤린 모델을 사용하여 FR-HMGB1에 대한 최적의 생체내 치료 용량을 결정했다[7,12]. 0.75mg/kg(29nmol/kg)이 최대 반응을 초래했고, 더 높은 용량에서는 재생 활성이 추가로 개선되지 않는 것을 발견했다(도 7C). 또한, 손상 후의 생체내 투여를 위한 최적 시간을 평가했다. FR-HMGB1은, 손상 후 최대 5시간 이내에 주사하면, 수복 촉진에 효과적인 것으로 평가되었다(도 7D). 그 후, 개선은 없었다. 이어서, 정맥내 투여 후의 순환에서 FR-HMGB1의 반감기를 조사했다. 초기 급속한 클리어런스(t_1/ ₂약 11분), 이어서 후속의 더 느린 클리어런스 속도(t_1/2 약 120분)이 있음을 밝혀냈다(도 7E). 이것은 인간에서 25분의 반감기와 일치하고[50], 단백질은 합토글로빈에 결합함으로써 제거된다[51,52].

FR-HMGB1은 줄기 세포 및 전구 세포의 G_Alert로의 전환을 촉진함으로써 손상 후의 골격근, 골 및 혈액의 재생을 촉진하는 것을 이전에 밝혀냈다[7]. 포유동물 심장에는 중요한 줄기 세포가 없고, 손상 후의 새로운 심근세포의 대부분은 기존의 심근세포로부터 유래한다[53]. 따라서, FR-HMGB1의 투여가 심장 재생을 촉진하는지의 여부를 평가했다. 심근 경색시의 정맥내 주사에 의해 생존율이 증강되는 것을 밝혀냈다(FR-HMGB1로 치료된 마우스에서는 83%, PBS 대조군에서는 52%)(도 7F). FR-HMGB1은 5주에 걸친 연속 MRI 스캔에 의해 평가된 경색 크기를 약 60% 감소시키고(도 7H), 전체 좌심실 박출율을 16% 개선시켰다(도 7G).

마지막으로, 생체내에서 골격근 재생의 촉진에서 FR-HMGB1과 비교하여 dBB12L의 효능을 평가했다. FR-HMGB1 또는 dBB12L의 최적 용량(29nM/kg)을 주사한 마우스는 중심 핵을 수반하는 재생 근섬유의 평균 단면적의 증가에 의해 결정된 바와 같이 손상 후에 동등하게 가속된 재생을 나타낸다(도 7J)[7,12]. 이는 FR-HMGB1[7]에 대해 전술한 바와 같이, 14일차에 가장 현저했다.

토론

조직 수복 치료제로서 사용하기 위해서는 HMGB1을 변경할 필요가 있다.

고형 기관의 수복을 촉진하기 위한 외인성 줄기 세포의 투여에 기초한 치료법은 당초의 약속을 이행하지 못하고[6,54], 사멸된 세포는 면역 반응을 유발시킴으로써 동일하게 효과적이다[55]. 대안의 잠재적으로 더 만족시키는 접근법은 상주 줄기 세포 및 전구 세포를 포함하는 내인성 재생 수복 프로세스를 표적으로 하는 것이다[56,57]. 프로스타글란딘 데하이드로게나제의 억제는 유망한 접근법이지만[58], 임상 이행으로의 진전은 느리다[59]. 성장 인자의 투여는 또한 기재되었지만[60,61], 생체내 단백질분해에 의해 제한된다[62]. 현재, 다수 조직의 재생을 촉진하고 수복을 촉진하기 위한 승인된 치료법은 없다.

FR-HMGB1의 외인성 투여는, 조직 손상시에 방출되는 적절한 활성화 인자에 용이하게 반응하여 효과를 발휘하는 경우, 상주 줄기 세포 및 전구 세포를 G_Alert로 이행시킴으로써 골, 골격근 및 혈액의 재생을 촉진하는데 효과적이라는 것을 이전에 밝혀냈다[7]. 외상 후의 환자에서 검출된 전신 DS-HMGB1의 대부분은 제2 방출 이벤트에서 분비되는 반면[50], 손상 부위에서 생체내에서 국소적으로 FR-HMGB1로부터 DS-HMGB1로의 전환을 서포트하는 증거가 축적되어 있다[18,19]. 따라서, 유해한 염증유발성 신호전달에 대한 가능성은 치료제로서 천연 FR-HMGB1의 사용을 배제한다.

디설파이드 HMGB1은 TLR-4[24,30], TLR-2[24,34,35] 또는 RAGE[14,63]를 통해 신호전달하여, 염증유발성 사이토카인의 발현을 유도할 수 있다. DS-HMGB1에 의한 TLR-4 신호전달은 TNF를 포함하는 몇몇 염증유발성 사이토카인의 생성을 초래하는 반면[28], TLR-2 신호전달은 혈전증 및 재관류 손상[64] 및 자가면역 장애[33]를 포함하는 다수의 프로세스에서 유해한 것으로 밝혀졌다. RAGE를 통한 DS-HMGB1 신호전달은 혈소판 활성화 및 호중구에 의한 NET 형성에서 중요한 역할을 하여 혈전 형성을 촉진한다[23,64-66]. 3개 수용체 모두는 궁극적으로 NF-κβ[25,67]에 수렴하여, 3개 수용체 모두를 통해 염증유발성 사이토카인의 상승적 발현을 유도한다[68,69]. 따라서, 치료제로서의 HMGB1의 개발은 3개 수용체 모두를 통한 신호전달을 제거하기 위해 분자를 조작하는 것에 결정적으로 의존한다.

박스 A 및 박스 B는 공유 펩티드 패턴으로 인해 CXCL12에 독립적으로 결합한다.

FR-HMGB1의 재생 활성은 CXCL12와의 헤테로복합체의 형성 및 CXCR4를 통한 신호전달에 결정적으로 의존한다. CXCL12가 HMG 박스[42,70]에 결합한다는 것이 공지되어 있지만, 관여하는 구조적 모티프는 불명인 상태이고, 제안된 잔기는 거의 없다[47,71]. 또한, 이 신호전달이, 주화성을 촉진하는 조혈 줄기 세포 또는 CXCR4 단량체의 정지의 강제를 포함하는, CXCR4 축을 통한 CXCL12의 동종이량체에 관여하는지도 또한 불명이다[72-74].

펩티드 어레이는 HMGB1-CXCL12 상호작용에 관여하는 잔기[75]를 동정할 수 있게 했다. 박스 A와 박스 B 둘 다에 존재하는 CXCL12에 대한 2개 펩티드 결합 영역의 공통 패턴을 동정했다. 제1 펩티드 영역은 N 말단의 유연한 세그먼트로부터 헬릭스 II의 절반으로 신장되고, 글리시르히진 결합 부위와 중첩되고[41], 제2 영역은 각각의 HMG 박스에서 헬릭스 III의 C 말단 부분 상에 있다. 알라닌 돌연변이를 사용하는 이들 잔기의 중요성을 확인하고, BLI에 의한 인접하는 유연한 영역의 중요성을 확인했고, 이들 잔기의 제거는 CXCL12의 해리 속도의 극적 증가를 초래했다. BLI는 또한, 각 박스가 박스들 사이의 협력성 없이, 유사한 친화성으로 독립적으로 CXCL12 단량체에 결합할 수 있는 것을 확인했다. 추가로, HEPES 완충액의 사용에 의해 CXCL12 이량체화가 방지되고[76], 각 박스가 단량체성 CXCL12에 결합할 수 있고, CXCL12의 이량체화는 복합체 형성에 필수 조건이 아니라는 결론을 내릴 수 있게 했다. 이 모델은 CXCR4를 통한 HMGB1-CXCL12 헤테로복합체의 신호전달의 제안된 메커니즘과 일치한다[72].

이어서, NMR을 사용하여, 펩티드 어레이에 의해 확인된 펩티드 영역의 중요한 역할을 확인하였고, 여기에는 완전 또는 헬릭스 단독의 HMG 박스 B 작제물 중 어느 하나에 결합할 때에 CXCL12-유도된 변화의 감소를 초래하는 유연한 인접 영역이 포함된다. 이는 인접 영역을 함유하는 것과 비교하여 헬릭스 단독의 HMG 박스 B 작제물에 대한 BLI에서 관찰된 더 신속한 해리 속도와 일치한다. 또한, 박스 A와 비교하여 박스 B에 대해 더 약한 신호(피크 확장)가 관찰되었고, 이는 박스 A와 비교하여 전장 박스 B에 대한 BLI에서 관찰된 더 신속한 교환 결합 평형을 서포트하고, 또한 펩티드 어레이에서 박스 B CXCL12-결합 서열에 대한 더 약한 신호를 서포트했다. 일부 잔기는 펩티드 어레이에서 플래그되지 않았음에도 불구하고, NMR의 시프트 변화를 입증했다. 이들은 CXCL12에 결합하고, 순차로 근처의 위치에 영향을 미치는 다른 잔기의 주쇄 상호작용 또는 중계 효과 등의 결합에 대한 서열-독립적 기여를 나타낼 수 있다.

NMR 및 펩티드 어레이 둘 다에 의해 결정된 CXCL12 결합에 관여하는 잔기를 HMGB1 1-164(PDB 2YRQ)의 구조에 중첩시킨 경우, 잔기의 측쇄가 모두 포켓의 중심에 정렬되어 있는 각각의 박스 도메인 내의 포켓을 동정했다. 알라닌 스캔 및 NMR로 동정된 잔기는 박스 B에 오목한 표면을 형성하고, 이는 글리시르히진 결합 부위를 또한 포함한다(도 3B, 점선의 원). 반대로, NMR의 변화만을 나타내는 몇몇 잔기는 이 포켓의 외측을 가리키는 측쇄를 갖고, 이는 CXCL12에 대한 서열-독립적 결합(주쇄 매개)을 시사하거나, 이들이 CXCL12 결합시의 HMG 박스의 다른 부분에서 간접적 화학적 환경 변화에 의해 영향을 받는다는 것을 시사한다.

이 CXCL12 결합에 대한 상세한 이해를 통해, TLR-4, TLR-2 및 RAGE를 통해 염증유발성 신호전달을 제거하는 작제물을 설계할 수 있었다. 이 작제물은 야생형 HMGB1(dBB12L)와 유사한 길이의 링커에 의해 분리된 2개의 HMG 박스 B 도메인으로 구성되었고, 이는 박스 A가 박스 B로 치환되었기 때문에 산화할 수 없고, 2개의 HMG 박스가 존재하기 때문에 CXCL12에 결합해야 한다. dBB12L은 1-164 FR-HMGB1 또는 전장 FR-HMGB1만큼 안정적이었고, 임상적으로 관련된 완충 조건(PBS, 식염수)에서 동등하게 열안정성이었고, 장기간의 보관에서 응집 또는 열화가 없다. dBB12L의 표면적 및 전하 프로파일은 또한 HMGB1 1-164와 동일했고, SEC에서는 단분산 프로파일이 있고, 천연 ESI/MS에서는 전하 분포가 있다. 이러한 유사성은, dBB12L과, 2개의 HMG 박스와 링커 영역(FR-HMGB1 1-164)을 갖지만, 산성 테일을 갖지 않는 야생형 HMGB1 작제물 사이의 용액에서 유사한 입체형태를 반영한다.

조작된 dBB12L 작제물은 TLR -2 또는 TLR -4를 통해 신호전달하거나 RAGE에 결합하지 않지만, 완전한 재생촉진 특성을 유지한다.

TLR-4/MD-2에 대한 HMGB1의 결합은 잘 기재되어 있다[29]. 산화된 박스 A는 TLR-4와 상호작용함으로써 DS-HMGB1의 결합을 개시하고, 박스 B는 MD-2 결합에 의해 이러한 상호작용을 안정화시키고; 박스 B 내의 FCSE 모티프는 신호전달에 필수적인 것으로 밝혀졌다[30]. DS-HMGB1은 TLR-4/MD-2를 통해 그 자체적으로 신호전달할 수 있지만, LPS에 결합하고 TLR-4/MD-2로의 전달 및 인식을 촉진하는 LPS-결합 단백질(LBP)을 치환함으로써 LPS를 통한 신호전달을 촉진할 수도 있다[13]. 본 발명의 dBB12L 작제물에서 박스 A의 결실은 TLR-4를 통한 신호전달을 효과적으로 배제했다. 흥미롭게도, FR-HMGB1 및 dBB12L 둘 다가 LPS에 반응하여 단핵구에 의한 TNF 발현을 감소시킨다는 것을 관찰했다. 이는, LPS에 결합하는 이들 단백질에 기인할 수 있지만, 배양 배지[77]의 혈청에 존재하는 LPS 결합 단백질(LBP)[13]을 효과적으로 치환할 수 있는 DS-HMGB1과는 달리, 산화된 박스 A의 부재로 인해 TLR-4/MD2로 이들 전달할 수 없기 때문일 수 있다.

HMGB1과 TLR-2 사이의 상호작용은 보다 덜 기재되어 있고, HMGB1이 그 자체로 TLR-2 신호전달을 유도할 수 있는지[24,36] 또는 활성을 유도하기 위해 공-리간드를 필요로 하는지의 여부, 및 또한 이러한 반응이 단백질의 레독스 상태에 의존하는지의 여부[34,35]에 관한 논란이 있다. HMGB1 단독으로는 TLR-2 반응을 유도할 수 없었던 공개된 데이터는 혈청의 부재[35]하에 또는 낮은 농도의 HMGB1의 존재[34]하에 수행되었고, 이는 HMGB1 단독이 TLR-2를 통해 어느 정도의 신호전달 능력을 보유하지만, 더 높은 수준의 반응을 유도하기 위해서는 공-리간드가 요구된다는 것을 시사한다. 결합에는 적어도 하나의 HMG 박스[33]가 수반되어야 하고, 산성 테일은 TLR-2에 대한 결합을 음으로 조절한다는 것이 공지되어 있다[35]. DS-HMGB1 단독이 TLR-2를 통해 신호전달할 수 있고, 혈청 함유 배지에서 LTA의 존재에 의해 효과가 증강되었음을 발견했다. 그러나, FR-HMGB1 또는 dBB12L에 대한 반응은 없었고, 이는 LTA와 상승작용을 나타내지 않았다. 이는, TLR-4와 마찬가지로, 디설파이드 브릿지를 갖는 산화된 박스 A가 TLR-2 매개된 반응에 필요하고, TLR-2 공-리간드가 DS-HMGB1과 상승작용을 한다는 것을 시사하며, 이는 산성 테일을 치환하여 TLR-2 상호작용을 촉진시킬 가능성이 있다.

HMGB1 내의 RAGE 결합 부위(잔기 150-183)는 이전에 기재되었다[14]. 유사한 모티프는 S100 단백질 등의 기타 RAGE 리간드에도 존재하고, 이들 서열에 대한 상동성 펩티드는 HMGB1 매개된 RAGE 신호전달의 효과적 길항제이다[37,78]. HMGB1의 산성 테일은 RAGE 결합 펩티드와 잔기를 공유하고[15], TLR-2 결합에서의 이의 역할과 유사하게 RAGE 상호작용의 조절자로서 제안되었다. 그러나, HMGB1의 디설파이드 형태만이 RAGE를 통한 혈전형성촉진 활성에 특이적으로 관련되었다[22]. dBB12L을 포함한 RAGE 결합 펩티드를 결여하는 작제물이 ELISA 검정에서 RAGE에 결합할 수 없다는 것을 발견했다. 대조적으로, DS-HMGB1 및 흥미롭게도 3S-HMGB1은 FR-HMGB1보다 RAGE에 더 잘 결합할 수 있었다. BLI를 사용하여 상호작용의 동태를 분석했을 때, ELISA 데이터에 따르면, dBB12L은 FR-HMGB1 및 DS-HMGB1과 비교하여 RAGE에 대한 친화성이 낮다는 것을 발견했다. dBB12L은 FR-HMGB1보다 3배 더 높은 회합 속도를 갖는 반면, 이 작제물에 2개의 부분적 RAGE 결합 도메인이 존재하기 때문에, 해리 속도는 5배 높고, 이는 전체적으로 불안정하고 약한 결합을 나타낸다. ELISA와 연관된 광범위한 세척은 해리 속도의 효과를 확대시키고, 각 검정에서 HMGB1 작제물의 상이한 거동을 유도하고, 평형에서의 결합 상태를 나타낸다. 예를 들면, BLI에서 FR-HMGB1과 유사한 RAGE에 대한 친화성을 갖는 3S-HMGB1은, FR-HMGB1 또는 DS-HMGB1보다 해리 속도가 훨씬 낮기 때문에, ELISA에서 훨씬 더 높은 외관 친화성을 나타내고, RAGE는 이에 결합한 상태로 잔류한다. 이러한 증가된 RAGE 결합은 대조군과 비교하여 심근 경색의 마우스 모델에서 관찰되는 섬유증의 증가를 부분적으로 설명할 수 있지만, FR-HMGB1은 재생을 촉진하고 기능을 개선시켰다[32]. SPR을 사용하면, FR-HMGB1과의 비교는 수행되지 않았지만, 3S-HMGB1이 매우 높은 친화성으로 RAGE에 결합할 가능성이 높음을 나타냈다[64]. BLI(K_d = 0.2-1.3μM)를 사용하는 DS-HMGB1에 대한 RAGE에 대한 친화성은 SPR(0.1[79] - 0.65μM[22])을 사용하여 이전에 보고된 것과 유사하다는 것을 발견했다. 본 발명의 BLI 데이터는 또한, 산성 테일의 상실이 RAGE에 대한 HMGB1의 친화성을 증가시키는 것을 나타내지만, 해리 속도가 높기 때문에 결합의 안정성이 저하되는 반면, RAGE 결합 펩티드의 절단 또는 박스 A의 감소에 의해 해리 속도가 대폭 증가하여, 결합이 불안정해진다. 흥미롭게도, 산화된 박스 A 단독으로는 RAGE에 결합할 수 없고, 이는 상호작용이 RAGE 결합 펩티드에 의해 개시될 가능성이 높음을 시사한다. dBB12L에서 RAGE 결합 펩티드의 절단과 함께 박스 A의 부재는, FR- 또는 DS-HMGB1과 비교하여, 해리 속도가 신속하기 때문에, RAGE 친화성이 대폭 저하되고, 결합 후의 RAGE를 유지하는 능력이 저하된다.

골격근 줄기 세포에서 FR-HMGB1에 의해 유도된 전사체 변화는 원위 손상에 의해 유도되는 것과 매우 유사하고, 미토콘드리아 대사, 산화적 포스포릴화 및 G_Alert[80,81]에 기재된 세포 사이클의 경로의 상향조절과 일치한다는 것을 발견했다. HMBG1에 의한 CXCR4 발현의 상향조절은 이의 효과를 잠재적으로 향상시킬 것이다. FR-HMGB1이 손상 후 최대 5시간까지 투여되는 경우에만 효과적이라는 것을 나타내는 데이터는 줄기 세포를 G_Alert로 이행시킴으로써 작용하는 것과 일치한다. 이후의 시점에서, 줄기 세포는 활성화되어 G_Alert에 진입할 수 없다. 근육 줄기 세포는 손상 후 5-6시간에서 그 부위로 이동하고, 약 12시간에서 활발하게 분열하기 시작하는 것으로 밝혀졌다[82]. dBB12L이 FR-HMGB1과 동등한 생체내에서의 재생 활성을 유지한다는 것을 확인했다. 중요하게도, 심근 경색시에 FR-HMGB1을 정맥 주사로 투여하면, 생존율이 향상되고, 경색 크기가 감소하고, 좌심실 박출율이 개선되는 것을 발견했다. 이러한 데이터를 바탕으로, dBB12L의 투여는 골, 골격근 및 혈액 등의 수복을 위해 줄기 세포에 의존하는 조직 뿐만 아니라, 재생이 주로 심장의 심근 세포 등의 성숙 세포 모집단에 의존하는 조직의 재생을 촉진할 것이라고 예측할 수 있다. 또한, 손상 후 최대 5시간 이내에 투여한 경우, dBB12L이 효과적일 것으로 예측한다. 미국에서 MI 이후 병원에 입원하기 위한 중간 시간이 3시간이기 때문에, 이는 중요하다[83]. 미국에서 약 800,000명이 매년 심근 경색으로 고통받고 있고[83], 약 20 내지 30%가 심부전을 발증하고 있다. 2012년의 심부전에 대한 미국의 의료 지출은 300억 달러를 초과하고, 2030년까지 700억 달러로 증가할 것으로 예상되지만, 5년 생존율은 약 60%에 불과하고, 이는 대부분의 암보다 심하다[83]. 본 발명의 데이터를 바탕으로, 이벤트로부터 5시간 이내에 dBB12L을 투여하면, 심근 경색, 특히 ST 상승 심근 경색을 경험하는 환자의 생존율을 향상시키고 경색 크기의 감소와 박출율의 유지를 통해 심부전의 발생률과 중증도를 감소시킬 것으로 예측된다. 다른 사람들은 마우스[32,84,85] 및 양[86] 모델에서 경색의 4시간 후에 경색 주변 영역의 심근에 FR-HMGB1을 직접 주사하는 것이 심장 수복을 촉진하는 데 효과적이라는 것을 밝혀냈다. 이 경로는 임상 사용에 용이하게 적용할 수 있기 때문에, 정맥내 투여의 효능을 입증하는 데이터는 중요하다.

결론적으로, CXCL12 결합에 중요한 HMGB1의 부위를 맵핑하고, TLR-2 또는 TLR-4를 통해 신호전달하지 않고 RAGE에 효과적으로 결합할 수 없는 작제물(dBB12L)이 설계되었다. FR-HMGB1은, 짧은 반감기에도 불구하고, 원위 손상과 유사한 방식으로 줄기 세포를 G_Alert로 이행시키고, 손상 후 최대 5시간까지 투여하면 효과적이다. 추가로, dBB12L은 FR-HMGB1만큼 효과적으로 생체내 조직 재생을 촉진한다. 따라서, dBB12L은 임상 번역을 위해 개발될 수 있다.

요약

환원형 고이동도 그룹 박스 1(HMGB1) 단백질은 CXC 리간드 12(CXCL12)에 결합하고, CXC 수용체 4(CXCR4)를 통해 신호전달하여 조직 및 재생을 촉진하고, 줄기 세포 및 전구 세포를 G_Alert로 이행시켜 수복을 촉진한다. 그러나, FR-HMGB1의 디설파이드 형태(DS-HMGB1)로의 국소 전환은 Toll-유사 수용체 2(TLR-2) 및 4(TLR-4) 및 종말 당화 생성물에 대한 수용체(RAGE)를 통한 신호전달을 통해 유해한 염증을 초래할 수 있다. 따라서, 임상적 실습에서 조직 재생을 촉진하기 위한 HMGB1의 투여를 고려하기 전에, 이러한 잠재적으로 유해한 염증유발성 효과를 제거하도록 분자를 조작하는 것이 중요하다.

펩티드 어레이, 생물층 간섭법 및 핵 자기 공명의 조합을 사용하여, HMGB1-CXCL12 헤테로복합체의 형성에 관여하는 잔기를 동정했다. 이러한 데이터를 염증유발성 수용체와의 상호작용 부위에 관한 이용가능한 문헌과 조합하여, C-말단 산성 테일의 부재하에 야생형의 완전 환원된 HMGB1 작제물의 것과 유사한 안정성 및 입체형태를 갖는 2개의 HMG B 박스를 탠덤으로 포함하는 작제물(dBB12L)을 설계했다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, dBB12L은 이들의 공-리간드의 존재하에서도 TLR-2 또는 TLR-4를 통해 신호전달하지 않고, RAGE 결합을 대폭 감소시켰다. 추가로, dBB12L 작제물은 생체내에서 FR-HMGB1과 동등한 재생 활성을 유지한다.

특허 상황 및 과학 문헌에 대한 포괄적 검토에 의해, TLR-4 신호전달을 방지하기 위해 시스테인을 세린으로 치환하는 것에 대해 기재하는 미국 특허 출원 공개 US 제2015/0203551 A1호를 확인했지만; 이 작제물은 MI 후의 과다한 심근 섬유화를 유도하는 것으로 밝혀졌다(17). 추가로, 이러한 작제물은 FR-HMGB1과 비교하여 RAGE에 대해 더 느린 해리를 갖고, 도 6B)에 도시된 바와 같이, 평형 후에도 더 장기간 동안 RAGE가 결합된 상태로 잔류하며; 따라서 이러한 치환은 본 발명의 작제물에서 회피되었다. 미국 특허 출원 공개 US 제2009/0069227 A9호는 줄기 세포의 이동 및 증식을 촉진하는 HMGB1 작제물이 아미노산 1-187(본 발명의 데이터에서는 0-186, 0은 N 말단 Met임)을 포함해야 한다고 규정하고, 미국 특허 제9,623,078호는 심장 재생을 위해 아미노산 1-44(본 발명의 데이터에서는 0-43)로 한정된 펩티드를 참조한다. 미국 특허 출원 공개 US 제2009/0202500 A1호는 조직 수복을 위한 방법을 개시하지만, 전장(1-215) 야생형 HMGB1(본 발명의 데이터에서는 0-214)만을 참조한다. 본 명세서에 제시된 dBB12L 작제물은 RAGE 결합 또는 TLR-4/2 신호전달을 갖지 않고, 177개 아미노산 길이이며, 이전에 기재되지 않은 아미노산 치환을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 제시된 작제물은 종래 기술의 범위에 포함되지 않는다.

임상 응용

본 발명은 조직 수복을 증강시키기 위해 내인성 재생 프로세스를 이용하는 폴리펩티드 및 방법을 제공한다. 폴리펩티드는 완전히 환원된 야생형 HMGB1과 유사하게 기능하고, 이는 2개의 CXCL12 분자와 함께 헤테로복합체를 형성함으로써 조직 재생을 촉진하며, 이 분자는 차례로 CXCR4, 아마도 세포 표면 상에 인접한 2개의 CXCR4 수용체를 통해 신호전달한다.

본 발명의 데이터는, 본 발명의 폴리펩티드(dBB12L)가 유사한 방식으로 작용한다는 것을 나타낸다. 따라서, dBB12L은, 수복을 위해 CXCR4+ 세포에 의존하는 조직의 재생을 촉진하는 것으로 고려된다. 이러한 조직에는 수복이 주로 줄기 세포 및 전구 세포, 예컨대, 골격근 및 조혈계에 의존하는 조직 뿐만 아니라, 수복이 기존의 성숙 세포, 예를 들면, 포유동물의 성체 심장의 심근세포에 크게 의존하는 조직이 포함된다.

잠재적 임상 적응증:

심근경색 후의 심장. 이 적응증은 임상 시험에 적합하다. 전 세계적으로, 허혈성 심장 질환은 1억 5300만명에 영향을 미치고(101), 2017년에는 1억 500만명을 초과하는 장애 조정 생존 연도가 소실된다(102). 매년, 영국에서는 205,000명(103), 미국에서는 805,000명이 심근 경색(MI)을 앓고 있고, 그 중 38%가 ST-상승형 MI(STEMI)를 경험한다(101). MI 이후, 개인의 약 30 내지 40%가 심부전을 발증하고, 전 세계적으로 3,800만명에 영향을 미친다. 2012년의 심부전에 대한 미국의 의료 비용은 300억 달러를 초과하고, 2030년까지 700억 달러로 증가할 것으로 예측되지만, 5년 생존율은 약 60%에 불과하고, 이는 대부분의 암보다 심각하다. 주요 표적 모집단은 MI 후의 환자, 특히 심부전을 발증할 위험이 있는 환자이다(104). 심장 손상을 제한하고, MI 후의 재생을 촉진하고, 심부전의 발증을 예방하는 신규한 치료법은 이환률과 사망률을 극적으로 감소시키고, 의료 부담을 대폭 감소시킨다. 심근세포 괴사(109)를 확실하게 유도하는 확립된(105-108) 영구 결찰 뮤린 MI 모델을 사용한 결정적 데이터는 손상시에 FR-HMGB1의 단일 정맥내 용량이 증강된 생존율[PBS(위약)로 치료된 그룹의 52%와 비교하여 FR-HMGB1로 치료된 동물 83%], 대조군과 비교하여, 5주 동안 PBS 대조군과 비교하여 절대 심장 박출율의 약 16% 개선 및 경색 크기의 약 60% 감소를 유도하는 것을 나타낸다(도 7F).

골격 손상 모델에서, FR-HMGB1의 최적 용량은 0.75mg/kg이었고(도 7C), 매우 짧은 반감기에도 불구하고, 손상 후 5시간까지 정맥내 투여하더라도 효과적이다(도 7D). 심근 경색 후, 허혈성 심장 근육의 재관류는 가능한 한 조기에 달성되어야 한다. 예를 들면, 후속 STEMI 환자는 경피 개입을 받아야 한다. 데이터는, HMGB1을 가능한 한 조기에 및 손상 후 최대 5시간까지 투여하면, 손상된 심근이 보존되고, 재생이 촉진되는 것을 나타낸다.

천연 FR-HMGB1은 MI 후의 기능 회복을 촉진하지만(도 7F-7I), 디설파이드 형태로의 국소적 전환은 RAGE, TLR-2 및 TLR-4를 통한 혈전의 형성 및 증식을 촉진한다(110). RAGE 결합을 보유하는 3S-HMGB1 등의 다른 사람들에 의해 보고된 작제물(도 6B)은 MI 후에 과도한 섬유화 및 기능 손상을 초래한다(111). FR-HMGB1은 또한, DS-HMGB1보다 적은 정도임에도 불구하고, RAGE에 결합하고, 따라서 임상 용도에 적합하지 않다. TLR-2를 통한 HMGB1 신호전달은 심근 경색(112) 및 혈전증(110) 후의 허혈 재관류 손상에서 중요한 역할을 하고, 본 발명자들은 인간 아테롬성 동맥경화증에서 TLR-2의 중요한 역할을 밝혀냈다(113). TLR-4 신호전달은 심근 재관류 손상에서도 매우 중요하다(114). 심근 경색 후의 손상된 심장의 허혈성 및 염증성 미세순환에서 레독스 상태는, FR-HMGB1을 혈전증의 중심적 매개인자인 디설파이드 형태(DS-HMGB1)로의 전환을 촉진할 것이다(110). MI 후의 심장 재생을 촉진하기 위한 승인된 치료법은 없다. 조혈 줄기 세포의 재생 효과를 나타낸다고 주장하는 보고는 신용을 상실했고(115), 사멸된 세포는 면역 반응을 유발시킴으로써 유사하게 효과적이다(116). 다능성 줄기 세포를 포함하는 기타 세포 유형에도 불구하고, 부정맥 발생, 면역억제, 확장성, 배치 변동, 전달, 장기 생존율 및 효능을 포함하는 중요한 과제가 남아 있다(115, 117). 세포 기반 치료법에 대한 대규모 시험에서는 기능의 유의한 개선이 나타나지 않았고, 부정맥이 환자에서 보고되었다(118-120).

성인 심장에 유의한 줄기 모집단(121) 및 제한된 심외막 전구 세포(122)의 부재는, 손상 후의 신규한 심근세포의 대부분이 기존의 심근세포로부터 유래한다는 이해와 함께, 내인성 경로(121)를 조작함으로써 재생을 촉진하는 것으로 초점이 이동되었다. 여기에는 다중 전사 인자(105, 108)의 아데노바이러스 형질도입, 히포(Hippo)(106) 또는 Meis1(123) 등의 발생 경로의 조작, 뉴레귤린(neuregulin)(124), IGF/HGF(125) 또는 FSTL1(126) 등의 성장 인자의 부가 또는 miRNA(127)의 조작이 포함된다. 이러한 접근법은 상당한 단점을 갖고 있다: 아데노바이러스 형질도입 및 성장 인자(IFGF1/HGF)는 심장내 주사 또는 국소 패치 적용(FSTL1)을 필요로 하고, 발생 경로의 조작은 종양유발 위험을 수반하고(128), 돼지에서 miRNA199-a의 바이러스 형질도입은 치명적 부정맥을 초래했다(127). 면역 세포의 클리어런스를 촉진함으로써 심장 재생을 자극하기 위한 대체 전략은 VEGF-C의 반복 주사를 필요로 한다(129). MAP4K4의 억제는 심근 생존을 촉진하고 경색 크기를 제한하지만, 재생 효과는 없었다(130). 현재까지, 이러한 전략 중 어느 것도 임상 시험으로 진행되지 않았다.

본 발명은 심근세포 생존 및 다중 조직의 재생을 촉진하기 위해 내인성 프로세스를 표적으로 하는 독특한 해결책을 제공한다. 이는 법외 비용(132, 133) 등의 항-섬유성 CAR T 세포(131)를 포함하는 세포 요법과 관련된 다수의 장애물을 극복한다. FR-HMGB1은 세포 표면 수용체 CXCR4를 통해 작용하기 때문에, 예를 들면, 전사 인자 또는 miRNA의 아데노바이러스 형질도입에 의한 세포내 프로세스의 표적화와 관련된 오프 표적 효과는 기대되지 않는다. HMGB1 억제는 허혈 재관류 손상 후의 경색 크기를 증가시키고(134), FR-HMGB1의 국소 상향조절(135, 136) 또는 심근 주사는 마우스(111, 137, 138) 및 양(139) 둘 다에서 효과적인 것으로 나타난 반면, 본 발명의 데이터는 정맥내 투여가 효능이 있고 모든 표적 세포에 도달할 가능성이 더 높다는 것을 나타낸다. 유해한 염증유발성 신호전달을 회피하는 본 발명의 조작된 이중 박스 B 작제물은 안전해야 한다.

밀라노의 한 그룹은 3개의 시스테인이 세린으로 치환되어 TLR-4 신호전달을 무력화하는 HMGB1 유사체(3S-HMGB1)에 대해 기재했다(140). 이들은 조직 재생을 촉진하는데 있어서 3S-HMGB1이 FR-HMGB1보다 우수하다고 주장했지만(141), 본 발명자들은 이것이 사실)인 것을 발견하지 못했다. 중요하게도, 3S-HMGB1은 심장 기능의 저하를 수반하는 뮤린 MI 모델에서 섬유증을 촉진하지만, FR-HMGB1은 조직 재생을 촉진하고 좌심실 박출율을 개선시켰다(111). 본 발명자들은 3S-HMGB1이 DS-HMGB1 또는 FR-HMGB1보다 더 장기간 RAGE에 결합된 상태로 잔류하는 것을 발견했다(도 5A). 따라서, FR-HMGB1, 3S-HMGB1 및 DS-HMGB1은 평형 상태에서 동등한 양의 RAGE에 결합하지만, 3S-HMGB1에 의해 결합된 RAGE의 경시적 수준은 염증유발성 디설파이드 HMGB1(DS-HMGB1)에 필적하고, FR-HMGB1보다 높다. 본 발명자들은 이중 박스 B 작제물은 FR-HMGB1과 동등한 재생 활성을 보유하면서 바람직하지 않은 염증유발성 신호전달을 제거한다.

추가 적용:

골절. 골절은 손상 후에 발생한다. 그러나, 가장 일반적 골격 '손상' 중 하나는 관절 치환술 또는 관절 성형술이다. 본 발명자들은, dBB12를 사용하여, 골절 또는 관절성형술 후의 치유를 촉진하고, 이에 의해 성분의 이완 등의 잠재적 합병증의 위험을 감소시킬 수 있음을 제안한다.

뇌 및 신경계. dBB12L은 뇌졸중 후의 환자 결과를 개선하는데 사용될 수 있다. 이의 기타 잠재적 징후에는 파킨슨 병과 치매가 있다.

폐. dBB12L은 폐 손상 후, 예를 들면, Covid-19 이후 또는 특발성 폐 섬유증 환자에서 결과를 개선하는 것으로 생각된다.

간. 미국 국민의 30%는 비알콜성 간 질환을 앓고 있는 것으로 추정된다. 이들 중 60%는 비알콜성 지방간염을 발증하고 있고, 20%는 간경변을 발증하고 있다. 이들 상태로 인한 간 손상을 제한 및 예방하기 위한 치료법이 개발되고 있다. 본 발명자들은 dBB12L이 이들 치료법과 조합 사용하여 간 재생을 촉진하는 것을 제안한다.

장. dBB12L은, 염증을 조절하기 위한 치료법과 조합하여, 예를 들면, 수술 후 또는 궤양성 대장염 등의 염증성 장 질환을 갖는 환자에서 장의 치유를 촉진하기 위해 사용될 수 있다.

신장. dBB12L은 신장의 재생을 촉진하기 위해 사용될 수 있고, 이에 의해 투석 또는 신장 이식의 필요성을 잠재적으로 회피할 수 있다.

피부. dBB12L은, 예를 들면, 수술 후, 화상 또는 궤양을 갖는 환자, 예를 들면, 당뇨병성 궤양을 갖는 환자에서 창상 치유를 촉진하기 위해 사용될 수 있다.

췌장. dBB12L은 췌도 세포의 재생을 촉진함으로써 제1형 당뇨병 환자의 결과를 개선하기 위해 사용될 수 있다.

골수. dBB12L은, 예를 들면, 화학요법 후의 조혈계의 재생을 촉진할 수 있고, 이에 의해 중증의 잠재적으로 생명을 위협하는 호중구감소증을 예방할 수 있다.

본 발명자들은 FR-HMGB1이 손상 전 최대 2주까지 투여된 경우에도 효과적이라는 것을 이전에 밝혀냈다(142). dBB12L이 FR-HMGB1에 동등하게 효능이 있기 때문에(도 7J), 이 폴리펩티드는 예방적으로, 예를 들면, 군대에 의해 또는 스포츠 상해에 의해 또는 대기 수술 또는 화학요법 전에 사용될 수 있다는 것이 고려된다.

재료 및 방법

이. 콜라이 균주

Mach-1 T1R 세포(인비트로젠, 항생제 내성 또는 유도 없음, BL21(DE3)-R3-pRARE2(사내 BL21 유도체, 클로람페니콜 내성 36μg/mL, T7-폴리머라제 lac 유도[87]) 및 BL21(DE3)-R3-pRARE2-BirA(상기의 생체내 비오티닐화 유도체, 추가의 스펙티노마이신 내성 50μg/mL)를 사내에서 제조된 화학적으로 유능한 스톡으로부터 공급했다.

세균 배양 배지

SOC: 20g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물, 0.5g/L NaCl, 0.1862g/L KCl을 오토클레이브하고, 4.132g/LMgCl₂ 및 20mM 글루코스로 보충했다.

LB(루리아 베르타니): 10g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L NaCl, pH 7.2, 오토클레이브 살균. 2% w/v 한천 분말을 첨가하여 LB 한천 플레이트를 생성했다.

TB(Terrific Broth): 12g/L 트립톤, 24g/L 효모 추출물, 4g/L 글리세롤, 12.5g/L K₂HPO₄, 2.35g/L KH₂PO₄, 오토클레이브 멸균

TB 보충물: 1.6% w/v 글리세롤, 1% 글루코스, 25mM (NH₄)₂SO₄, 10mM MgSO₄, 10× 미량 금속, 0.22μM 멸균 여과.

미량 금속 용액: 50mM FeCl₃(13.5g/L), 20mM CaCl₂(2.94g/L), 10mM MnCl₂(1.96g/L), 10mM ZnSO₄(2.88g/L), 2mM CoCl₂(0.48g/L), 2mM CuCl₂(0.34g/L), 및 2mM NiCl₂(0.48g/L), 0.1M HCl 중에서, 0.22μM 멸균-여과.

M9 최소 배지: 16g/L Na₂HPO₄, 4g/L K₂HPO₄, 1g/L NaCl, pH 7.2-7.3 및 2.5g/L FeSO₄, 0.25mg/LZnCl₂, 0.05mg/L CuSO₄, 0.25g/L EDTA, 1mM MgSO₄를 오토클레이브하고, 4g/L 글루코스, 1g/L U-99% ¹⁵NH₄Cl(Cambridge 동위원소), 0.3mM CaCl₂, 1.5mg/L D-비오틴 및 멸균 여과된 스톡으로부터 1.5mg/L 티아민-HCL로 보충했다.

플라스미드

플라스미드는 SGC 라이브러리로부터 공급되었다[87]. 모든 플라스미드는 TEV-절단 부위를 갖는 6×His 태그를 함유하고; pNIC-Bio3 및 pDsbC-HT-CBio는 또한 C-말단 비오티닐화 에피토프(이는 정지 코돈으로 제거될 수 있음)를 갖는다. 플라스미드 DNA는 제한 효소 소화에 의해 선형화되었다: pNIC-CTHF의 경우 BsaI(2h, 37℃), 또는 BfuA1(3h, 60℃). 절단된 벡터 DNA를 PureLink PCR 키트로 정제하고, 0.25mM dGTP(pNIC-CTHF) 또는 dCTP의 존재하에 제조자 프로토콜에 따라 T4 DNA 폴리머라제(NEB M0203)로 처리했다.

클로닝

HMGB1 작제물을 포유동물 유전자 수집물으로부터 공급했다(항생제를 포함하는 LB 배지에서 밤새 성장한 Mach1 세포로부터의 플라스미드로서 정제). 작제물은 PCR을 통해 증폭되었다: 95℃/10', 25×(95℃/30", 52℃/1', 68℃에서 0.5-1.5분), 68℃/10'의 프로그램이 사용되었다. 반응은 25μL 최종 용적으로 5μL 헤르쿨라제 II 완충액, 1μM의 각 프라이머, 6μg/mL 플라스미드 주형, 1μM dNTP 혼합물 및 1 유닛의 헤르쿨라제 II 폴리머라제(아길런트 600679; 완충액 및 100μM dNTP 스톡과 함께 공급됨)로 구성되었다. PCR 산물은 추가 사용 전에 정제했다(PureLink 키트, ThermoFisher K310001).

증폭된 코딩 서열(대립유전자)을 결찰 독립적 클로닝(LIC)을 통해 목적 벡터 내로 클로닝했다. 상기 삽입물을 벡터에 사용된 것과 동족의 뉴클레오티드의 존재하에 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고(10μL 반응 용적), 2μL를 1μL의 처리된 벡터와 혼합하고 30분간 어닐링했다. 40μL 빙냉 Mach-1 세포(저장용) 또는 20μL BL21 (DE3)-R3-pRARE2/BL21(DE3)-R3-pRARE2-BirA 세포(발현용)를 첨가하고, 아이스에서 냉각하기 전에 42℃에서 45초 동안 열 충격을 가했다. 5% 수크로오스 및 항생제를 갖는 선택 배지 상에 플레이팅하기 전에 37℃의 SOC 배지에서 2시간 동안 회수를 수행했다. 24시간 후, 양성 콜로니를 선별하고, 정확한 분자량의 밴드를 위한 특정 서열분석 프라이머 쌍을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 MyTaq 폴리머라제로 스크리닝했다. 양성 형질전환체는 항생제를 갖는 2× LB(LB의 2배 농도) 1mL에서 밤새 성장시키고, -80℃에서 12% 글리세롤 v/v로 저장했다.

3S-HMGB1 돌연변이 서열은 유사한 방식으로 생성되었다. PCR을 별도로 수행하여 S23-S45 및 S106 단편을 생성하고, 이들을 PCR로 어닐링하고; 이 반응에서는 5μL의 정제된 각 PCR 산물이 프라이머 및 주형을 치환되었다. 이 프로세스는 도 14에 요약되어 있다.

CXCL12 작제물은 성숙 단백질의 N-말단에서 프레임내 SUMO 프로테아제 부위에서 클로닝되고, pDsbC-HT-CBio 벡터(DsbC-SUMO-CXCL12)의 N-말단 융합 단백질과의 주변세포질 분비를 가능하게 하여, DsbC 융합 단백질 시스템을 통해 폴딩되고 산화된 CXCL12를 수득하면서[90], 이의 활성에 영향을 미칠 수 있는 단백질에 N-말단 잔기의 부가를 회피했다[88,89]. 모든 돌연변이체는 서열분석(SourceBioscience)에 의해 검증되었다. HMGB1-dBB에 대한 서열은 천연 HMGB1 박스 B 서열을 배치한 후에 배치된 이. 콜라이 BL21-DE3 게놈(어셈블리 ASM956v1)에 따라 박스 B 89-174 서열을 코돈-최적화함으로써 인-실리코로 설계되고, pNIC-CTHF에 클로닝된 트위스트 바이오사이언스(Twist Bioscience)(미국 샌프란시스코)에 의해 시험관내에서 합성했다.

재조합 단백질 발현

신선한 한천 플레이트 스트리크로부터 성장한 HMGB1 발현 균주 형질전환체 20mL를, 보충물을 포함하는 TB(또는 M9) 배지 1L에 접종하고, 0.45 RCF 오비탈 진탕(M9 배지의 경우 OD 0.6)으로 37℃에서 OD 2.0까지 성장시켰다. 15N 표지된 HMGB1의 생산에 사용된 예비배양물은 먼저 1000 RCF에서 5분 동안 스핀다운시키고, M9 배지에서 세척했다. 표적 OD에 도달하면, 18℃로 냉각시킨 다음, 0.5mM 또는 0.25mM IPTG(각각 HMGB1 및 CXCL12 단백질의 경우)를 첨가하고, 16시간 동안 성장시킨 다음, 4000 RCF에서 회수했다. 비오티닐화 단백질의 경우, 유도 전과 세포 채취 1시간 전에 PBS 중의 10mM D-비오틴을 첨가했다.

재조합 HMGB1 정제

유도된 HMGB1 발현 세포의 펠렛을, 1M NaCl, 5% 글리세롤, 50mM HEPES pH 7.5, 1:1000 프로테아제 억제제(칼바이오켐 세트 III, Merck 539134)가 보충된 10mM 이미다졸(완충액 A), 3μg/mL 벤조나제-MBP, 1mM MgSO₄, 0.5mg/L 리소자임(Sigma L6876) 및 0.5% v/v 트리톤-X100에서 14g/L로 재현탁시킨 다음, -80℃에서 동결시키고; 이 시점부터 모든 단계는 4℃에서 수행했다. 해동된 펠릿을 6780 RCF에서 45분 동안 스핀다운시키고, 상청액을 사전 평형화된 니켈-His GraviTrap(GE Healthcare) 1mL 컬럼에 로딩했다. 적하 후, 컬럼을 10CV의 10M NaCl, 0.4M NaCl의 50mM HEPES pH 7.5 및 1.5CV의 0.4M NaCl, 20mM HEPES pH 7.5, 1mM MgSO₄, 및 3μg/mL 벤조나제-MBP 용액으로 세척하여 30분 동안 잔류 DNA를 소화시켰다. 오염물을 15CV의 0.5M NaCl, 5% 글리세롤, 30mM 이미다졸로 보충된 50mM HEPES pH 7.5(완충액 B)로 세척한 다음, 2.5mL의 완충액 B + 500mM 이미다졸을 포함하는 PD-10 컬럼(GE Healthcare; 완충액 B + 20mM 이미다졸로 평형화)으로 직접 용출시켰다. 단백질을 3.5mL의 완충액 B + 20mM 이미다졸로 컬럼으로부터 용출시킨 후, 16시간에 걸쳐 1:20 OD TEV-GST 프로테아제로 태그를 제거했다.

초기에 정제하기 위해 사용된 것과 동일한 GraviTrap 컬럼(완충액 B + 20mM 이미다졸에서 평형화됨) 상에서 단백질 용액을 재순환시킴으로써 프로테아제 및 추가의 오염물을 제거했다. 비오티닐화 단백질의 경우, 대신에 스트렙트아비딘-XT 수지를 사용하여 비오티닐화된 분자만을 선택했다: 수지에서 30분 동안 인큐베이팅한 후, 샘플을 적하하고, 30CV의 완충액 A와 1CV의 완충액 B + 100mM D-비오틴으로 세척하고, 3CV의 동일한 완충액에서 2시간 인큐베이팅함으로써 용출시켰다. 단백질은, 생물 물리학의 작업을 위한 10mM HEPES pH 7.5 + 150mM NaCl 또는 세포 및 동물 작업을 위한 세포 배양 등급 PBS에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)(Superdex S75 10/300-0.35mL/min 또는 16/600-1.2mL/min 유속)에 의해 추가로 정제했다. 재조합 단백질은 저장을 위해 플래시-동결되었고, HMGB1 단백질이 감소된 경우에는 1mM TCEP를 첨가했다.

재조합 CXCL12 정제

DsbC-SUMO-CXCL12를 발현하는 세포의 외막은 삼투압 쇼크에 의해 용해되었다[91]. 펠렛을 1M 수크로오스, 0.2M 트리스-HCl pH 8.0, 1mM EDTA, 1mg/mL 리소자임, 2X cOmplete 프로테아제 억제제 세트(COEDTAF-RO, Roche), 50mM 이미다졸 및 3μg/mL 벤조나제 중에 40g/L로 재현탁시켰다. 이것을 실온에서 45분 동안 교반한 후, 4배 용량의 빙냉 18.2mΩ 물을 첨가하고, 추가로 10분 동안 혼합한 다음, 1mM MgSO₄를 첨가했다. 이를 16000 RCF, 4℃에서 1시간 동안 원심분리하고, 상청액을 Akta Xpress FPLC 시스템 상의 Ni-NTA 수퍼플로우 컬럼(Qiagen, 30761)에 10mL/분으로 로딩하고; 1 컬럼을 6L의 세포마다 사용했다. 단백질을 완충액 B에서 이미다졸 구배(10CV에서 10-25mM 및 8CV에서 25-500 mM)를 통해 용출시키고, 1:10 OD의 Ulp-1 프로테아제를 첨가한 다음, 100배 용적의 0.2M NaCl, 20mM HEPES pH 8.0(완충액 Ac)에서 밤새 투석했다. 다음날, 단백질을 CaptoS 컬럼(CaptoS ImpAct, GE 17-3717-47)에 2.3mL/min으로 로딩하고, 20mM HEPES pH 8.0 중의 0.2-1.5M NaCl의 구배로 용출시켜 절단된 CXCL12를 DsbC 및 Ulp-1로부터 분리했다. 단백질은 HMGB1과 동일한 방법으로 SEC를 통해 추가로 정제하고, 저장을 위해 플래시-동결시켰다.

내독소의 제거

내독소는 트리톤 Tx-114에 의한 상 분리를 통해 크기-배제 크로마토그래피 전에 모든 경우에 제거되었다[92]. 2% v/v의 TX-114를 재조합 단백질 용액에 첨가하고, 4℃에서 2000 RCF에서 오비탈 진탕시키면서 20분 동안 균질화하고, 37℃에서 5분 동안 분리한 후, 8000 RCF, 10', 25℃에서 세제 상을 펠릿화했다. 상청액을 5% w/v의 SM-2 바이오비드(BioRad, 152-8920)와 혼합하고, 2% TX-114로 2시간 동안 세척하고, 30CV의 메탄올, 30CV의 내독소 비함유 18.2mΩ 물 및 30CV의 내독소-비함유 PBS로 재생시켰다. 이를 실온에서 4시간 동안 인큐베이팅하여 잔류하는 트리톤 및 PEG를 흡착시킨 후[93], 소독된 SEC 시스템(12시간에 걸쳐 0.5M NaOH 접촉, 이어서 6시간에 걸쳐 0.2M 아세트산/20% 에탄올 접촉 및 세포-배양 등급의 PBS에서의 평형화)에 주사하여, 크기 배제를 수행하면서 잔류하는 중합체 오염물을 완전히 제거했다. 트리톤 및 PEG의 부재는 ESI/QTOF-MS 질량 분광법에서 각각의 전하 상태 종의 부재에 의해 검증되었다[94]. 재조합 단백질의 LPS 함량은 LAL 방법(GenScript ToxinSensor L000350)을 통해 평가했다. 샘플이 < 4 EU LPS/mg 단백질을 함유하는 경우, 샘플은 세포 및 동물용으로 승인되었다.

효소 생산

TEV-GST 프로테아제(GST-융합 단백질), 벤조나제-MBP, 및 Ulp-1 프로테아제는 SGC 수집물에서 보관된 형질전환체로부터 생산되었고[87]; 모두는 200μg/mL 암피실린 내성을 가졌다. TEV 및 Ulp-1은 1개의 IMAC 단계만으로 HMGB1에 대해 기재된 프로토콜에 따라 정제된 반면, 벤조나제-MBP는 CXCL12와 동일하게 수득된 외막 용해물로부터 정제되고, 제조업자 프로토콜에 따라 아밀로오스 수지(NEB, E0821)를 사용하여 단리되었다. 두 경우 모두에서, 생성된 단백질은 50mM HEPES pH 7.5, 0.3M NaCl, 10% 글리세롤에서 10mg/mL로 농축되었다. GST-TEV 프로테아제 및 Ulp-1을 액체 질소로 플래쉬-동결시키고, 정제 동안 0.5mM TCEP로 보충하고; 벤조나제-MBP는 50% 글리세롤 및 2mM MgCl₂를 보충하고, -20℃에서 저장했다.

펩티드 어레이

인간 HMGB1(Uniprot P09429) 또는 CXCL12(Uniprot P48061, 분비 신호 제외)의 FMOC 결합 15-mer 펩티드를 갖는 막은 공개된 프로토콜에 따른 요청에 따라 SGC에서 사라 피카우드(Sarah Picaud) 박사에 의해 인쇄되었다[40]. 막을 95% 및 70% 에탄올로 20-25℃에서 재수화시키고, PBST(PBS 1X + 0.05% 트윈-20, 3x)로 평형화시키고, 8시간 동안 10% BSA/PBST로 차단했다. 1μM의 파트너 His-태그된 단백질 작제물을 (PBS에서) 첨가하고, 4℃에서 24시간 동안 결합시켰다. 과량의 BSA 및 단백질을 PBST에서 3회 세척하여 제거하고; 모든 세척은, 달리 명시되지 않는 한, 1분 동안 지속했다. 결합된 단백질을 검출하기 위해, 막을 1:3000 희석된 Qiagen 항-Penta His HRP 접합체(Qiagen 34460)로 처리하고, 20분 동안 PBST에서 3회 세척으로 과량의 항체를 제거했다. 이어서, 결합된 항체를 화학발광을 통해 정량화하고(Piece ECL 기질 - 32109): 막을 기질 용액으로 커버하고, 2개의 투명한 플라스틱 시트 사이에 배치한 다음, LAS-4000 카메라에서 2분 간격으로 증분 이미징을 수행했다(화학발광 설정). 각 막에서 펩티드의 강도를 ImageJ에서 측정하고, 10-His 대조군에 대해 정규화했다. 알라닌 돌연변이유발 스캔은 동일한 방식으로 수행하고, 인쇄된 펩티드는 초기 펩티드 어레이 중에 동정된 것들로 구성되어 있다. 알라닌으로의 돌연변이가 서열 중의 알라닌 위치에 대해 관찰된 것보다 더 높은 강도 변화를 초래한 잔기는 CXCL12 결합에 유의한 기여자로 간주되었다.

생물층 간섭법( BLI )

사전수화된 스트렙트아비딘 옥테트(Octet) 바이오센서(ForteBio 18-5019)를 10mM HEPES, pH 7.5, 150mM NaCl(염기 완충액-BB) 플러스, 0.5mM TCEP(60초 기준선, 60초 결합) 중의 비오티닐화 HMGB1 단백질의 4μM 용액으로 코팅했다. 비특이적 결합은, 동역학 검정 전에, BB+ 1% BSA + 0.05% 트윈-20(키네틱스 완충액, KB)에서 3분 동안 인큐베이팅함으로써 최소화했다. CXCL12와의 상호작용은 KB(60초 기준선, 500초 회합, 420초 해리, BB + 0.5mM TCEP에서의 180초 감소)에서 CXCL12 농도(0-150μM, 1:2 희석 중)를 증가시키면서 용액에서 센서의 증분 침지를 수행함으로써 측정되었다. 이 실험에는 OctetRed 384 장비를 사용했다. 동역학 데이터는 DataAnalysis 9.0(ForteBio)으로 추출했다. 평형 R_EQ에서의 반응은 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 포화 플롯에서의 농도에 대해 플롯팅하여 kD/B_max(rEq에 대한 농도의 포화 플롯)를 계산했다. 동력학 속도(회합 속도; k_on 및 해리 속도; k_off)는 인터페로그램 내의 모든 회합 및 해리 단계로부터 각 파라미터의 직접 측정을 유도했고, 모든 측정에 걸쳐 수평선(평균)에 적합했다. 각 복제 실행의 데이터는 전체 평균을 계산하기 위해 동일한 방식으로 풀링되었다. HMGB1에 대한 RAGE 결합 동역학을 측정하기 위해, PBS+ 0.1% BSA + 0.02% 트윈-20 중의 15μg/mL RAGE-Fc를 항-IgG 바이오센서(AHC, 18-5060)의 표면에 30초에 걸쳐 고정화시키고, 각 HMGB1 작제물의 연속 농도(60초 기준선, 200초 회합/해리)에 침지시키고, 동일한 방식으로 적합시켜 동력학 파라미터를 도출했다.

핵 자기 공명(NMR)

10mM HEPES 150mM NaCl pH 7.5 중의 ¹⁵N-표지된 재조합 HMGB1 작제물(BLI 실험과 동일한 완충 및 이온 강도)에 5% v/v D₂O를 보충하고, 파라핀으로 밀봉된 5mm 시게이미 튜브에 유리 파스퇴르 피펫으로 피펫팅했다. 최종 용적은 > 330μL이었다. CXCL12를 동일한 완충액에 첨가하고, 참조의 변경을 회피하기 위해 최종 용적을 조정했다. 신호 록킹, 튜브 쉬밍 및 핵 튜닝은 Bruker TopSpin 소프트웨어를 통해 수동으로 수행되었다. 물 신호는 파워 수준 1(P1) = 추정된 펄스 캘리브레이션(펄스)으로 ¹H 스펙트럼을 취득함으로써 억제되었다. 단일 피크가 관찰된 경우, 초기 값의 4배의 P1 값을 기준선으로 사용하고, ¹H 스펙트럼에서 대칭 피크가 관찰될 때까지 조정했다. NMR 실험은 이들 캘리브레이션 단계 후에 수행했다(¹H-NMR, ¹⁵N-HSQC, ¹⁵N-NOESY-HSQC, ¹⁵N-TOCSY-HSQC). ¹⁵N-HSQC 스펙트럼에서의 피크는 HMGB11-184(BMRB 15418)의 공개된 NMR 테이블 및 분석된 각 작제물에 대한 본 발명의 독자의 NOESY/TOCSY 데이터에 기초하여 할당되었다. CXCL12 결합을 측정하기 위해, CCPNMR 3.0 분석의 화학 시프트 추적 모듈을 통해, CXCL12의 상이한 몰 당량에 걸쳐 화학적 이동 위치 및 동정된 피크의 용적을 추적했다(이들은 관련 이미지에 수록됨). 피크 강도 변화에 대해, 각 세트에서의 강도 변화의 중앙값을 기준선으로서 고려되었다. 완전 화학 이동 테이블 및 실험 파라미터는 이 섹션의 끝에 유지된다.

질량 분광법

MS/MS 및 트립신 소화에 의한 단백질 동정을 위해, SDS-PAGE 겔로부터의 밴드를 적출하여, SGC 오픈 액세스 MS 플랫폼에 제출하고, 로드 초크(Rod Chalk) 박사, 티아고 모레이라(Tiago Moreira) 박사 및 옥타위아 보르코프스카(Oktawia Borkowska)에 의해 공개된 바와 같이 분석되었다[94,95]. 단백질 동일성에 주석을 달기 위한 데이터 분석(펩티드 맵핑)은 Uniprot(참조 단백질 서열) 및 SGC(작제물 서열) 데이터베이스에 대하여 MASCOT 검색 엔진을 사용하여 수행되었다. 천연 ESI/MS 실험은 휘발성 완충액(50 또는 200mM 암모늄 아세테이트, pH 6.5)를 ESI/QTOF 기기(아길런트 Q-TOF 6545)에 360μL/h로 수동 주입함으로써 수행되었다. 총 이온 크로마토그램에서 안정한 이온 스트림이 관찰되면, 적어도 10카운트(30초) 신호를 취득했다. 변성 실험을 위해, 샘플을 0.2% 포름산에서 1mg/mL로 희석하고, HPLC(아길런트 1100 HPLC)를 통해 주입하고, [94]에 기재된 바와 같이, 포름산/메탄올의 이동상에서 용출시켰다. 전하 상태의 각각의 연속 분포는 별개의 형태로서 간주되었고; 전하 상태(Z)는 mW = (mW/Z-양성자 질량) * Z의 식에 따라 할당되었다. 표면 영역은 문헌[96,97]에 제안된 식으로부터 도출되고, 천연 MS의 경우 식 ln(SASA) = ln(M/Z) * 0.6897-4.063 및 변성된 샘플의 경우 식 ln(SASA) = ln(M/Z) * 0.9024-5.9013을 초래했다. 모든 MS 샘플에 대해, 적어도 3회의 독립적 주입을 수행했다. 이들 실험에서 모든 용액은 HPLC 물(전기화학적 등급) 및 용매를 사용하여 제조되었다.

SEC 표면적 정량화

SEC 크로마토그램을 표면적과 상관시키기 위해, 공지된 구조를 갖는 표준 세트(BioRad 1511901)를, 이들 실험에 사용된 Superdex 75pg, 10/300 컬럼을 통해 실행했다. 이들에 함유된 단백질의 SASA 및 GE 제공 검량선 표준은 공개된 PDB 구조(BSA, 3V03; 난알부민, 1JTI; 미오글로빈, 2V1I; RNAseA, 1A5P; 아프로티닌, 1NAG; 비타민 B12, 3BUL)로부터 도출되고, 비선형 최소 제곱 적합에 의해 유지 용적(SASA= 331.2*RV²-1.19e4*RV+1.08e5)과 상관에 의한 보유 용적과 상관되었다. HMGB1 샘플 사이에서 비교된 모든 실험은 천연 MS와 동일한 완충액(200mM 암모늄 아세테이트, pH 6.5)에서 수행되었고; 신호의 포화를 회피하기 위해 1mg/mL에서 주입을 수행하고, 모든 샘플을 0.4mL/min으로 용출했다.

RAGE 결합 ELISA 검정

384-웰 단백질-결합 ELISA 플레이트(산타크루즈 바이오테크놀로지, sc-206072)를, FL/DS HMGB1 전장 대조군 및 블랭크를 포함하여, 각각 4개의 복제물을 사용하여, HMGB1 작제물의 PBS(FR-HMGB1 작제물의 경우 + 0.5mM TCEP) 중의 50μL의 40nM 용액으로 4℃에서 24시간 동안 코팅했다. 비특이적 결합은 PBS 중의 10% BSA로 20-25℃에서 2시간 동안 인큐베이팅으로써 차단되었다. RAGE-Fc 키메라 단백질(BioTechne, 1145-RG; 1:4 희석에서 0-640nM)의 농도 범위를 10% BSA/PBS에 첨가하고, 4℃에서 2시간 동안 결합시켰다. 결합된 FC 키메라는 1% BSA/PBS에서 1:10000으로 희석된 항-인간 IgG HRP(아길런트 다코 P021402-2)와 함께 20-25℃에서 2시간 동안 인큐베이팅함으로써 검출되었다. 이들 각각의 3단계 사이에, 플레이트를 100μL PBST로 3회 세척했다.

결합된 항체를 검출하기 위해, 25μL의 TMB 기질(ThermoFisher N301)을 각 웰에 첨가하고; FL-DS-HMGB1 대조군이 명확한 농도 의존적 색 구배를 발현할 때까지 반응을 암소에서 진행시킨 후, 25μL의 0.5M H₂SO₄로 반응을 정지시켰다. OD450은 판독값(FluoStar OMEGA, BMG Labtech)으로서 측정하고, 2x RAGE-Fc 농도에 대해 포화 적합으로서 플롯팅했다(키메라는 RAGE 이량체이기 때문).

TLR -4 및 TLR -2 매개된 NF - κB 신호전달 리포터 검정

인간 TLR-2 및 CD14 또는 뮤린 TLR-4, MD-2 및 CD14를 발현하는 HEK-이중 세포(인비보겐(Invivogen))를, 10% FBS(Gibco), 1% L-글루타민(Gibco), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)으로 보충된 DMEM(Gibco)에서 표준 조직 배양 조건(37℃; 5% CO2)에서 유지했다. FR-HMGB1, DS-HMGB1 및 dBB12L이 TLR-4 및 TLR-2 신호전달의 활성화를 유도하는지의 여부를 판단하기 위해, 104 TLR-4 및 TLR-2 HEK-이중 세포를 96 웰 플레이트의 웰에 삼중으로 플레이팅하고, TLR-2의 경우 10μg/mL l HMGB1 및 (X 농도) FSL-1 및 TLR-4의 경우 10ng/mL LPS로 자극했다. 자극 24시간 후, NF-κβ 활성은 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 유도된 수준을 측정하여 결정했다.

단핵구 총 NF -κ B 분비 검정

인간 단핵구(StemCell Technologies)는 표준 조직 배양 조건(37℃; 5% CO2)에서 10% FBS(Gibco)로 보충된 DMEM(Gibco)에서 유지되었다. FR-HMGB1, DS-HMGB1 및 dBB12L이 염증유발성 사이토카인 생산을 유도하는지의 여부를 판단하기 위해, 10⁵개의 인간 단핵구를 96-웰 플레이트의 웰에 삼중으로 플레이팅하고, 10μg/mL HMGB1 및 50ng/mL LPS 또는 10ng/mL LTA로 자극했다. 자극 24시간 후, TNF 수준은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)(Abcam)에 의해 결정되었다.

전사체 분석

마우스를 50μL의 PBS 비히클 중의 30μg FR-HMGB1 또는 PBS 단독 대조군의 정맥내 주사로 전신적으로 치료했다. 손상 세포는 하기에 기재된 바와 같이 BaCl₂ 손상 마우스로부터의 것이다. 경고 세포는 BaCl₂ 손상된 마우스의 손상되지 않은 반대측으로부터의 것이다. 뮤린 근육 줄기 세포(mMuSCs)는 이전에 보고된 프로토콜에 따라 정의되고, 신선하게 단리되었다. 근육 세포 현탁액은 대퇴부 근육을 다지고 콜라게나제 800U/ml(Worthington-Biochem) 및 디스파제 1U/mL(Gibco)로 효소적으로 소화함으로써 생성되었다. 그 후, 모든 현탁액을 70μm 및 40μm 필터(Greiner Bio-One)를 통해 여과하고, 각각의 항체로 염색했다. mMuSC, CD31-CD45-Sca-1-VCAM1⁺는 BD FACSAria III 머쉰을 사용한 형광 활성화 세포 선별(FACS)에 의해 단리했다. 새롭게 FACS 단리된 mMuSCs로부터 추출된 RNA는 Lexogen 3' 키트 라이브러리 프렙을 사용하여 RNA-seq 분석으로 전송하고, HiSeq400(Illumina)을 사용하여 서열분석했다. FASTQ 파일은 FASTQC를 사용하여 평가하고, 이어서 칼리스토(kallisto) v0.42.4로 TPM 값을 생성했다. TPM 값을 합계하여, tximport를 사용하여 유전자-수준 발현 값을 수득하고, DeSEQ2를 사용하여 차등적 발현 분석을 수행했다. 차등적으로 발현된 유전자의 GO 농후화는, R 팩키지 'clusterProfiler'[98]를 사용하여, 벤자미니-호흐버그(Benjamini-Hochberg) 다중 시험 조정 및 0.1의 허위-발견률 컷오프로 수행되었고, 시각화는 R 팩키지 'ggplot2' 및 'igraph'를 사용하여 수행되었다.

생체내 마우스 근육 손상 모델

C57BL/6 사육 마우스 균주, 11-12주령의 암컷은 영국 찰스 리버로부터 구입하고, 케네디 연구소의 지역 생물 안전 유닛(BSU)에 수용되었다. 순응 기간은 1-2주였다. 살아있는 동물에 대해 수행되는 모든 프로토콜은 영국 내무부(PPL 30/3330 및 PPL P12F5C2AF) 및 지역 동물 시설인 퍼슨(persons)의 승인을 받았고, ASPA 규정에 따라 적절한 프로젝트 및 개인 라이센스에 따라 등록되어 있다. 모든 소모품은 외과적으로 인증되었고; 재조합 단백질은 내독소가 없다. 수술은 컬링 시설로부터 분리된 청결한 환경에서 수행되었다. 모든 동물을 수술 후 6시간 동안 모니터링하고, 그후 3일 동안 매일 모니터링하고; 이어서 모니터링은 NVS/NACWO로 전송되었다.

수술은 상기 기재한 바와 같이 수행되었다([7,12]). 동물들을 에어로졸화된 2% 이소플루란으로 마취시키고, 진통제를 제공하고, 가온 패드로 옮기고, 정맥내 주사를 수행한 경우에는, 우측 뒷다리를 포비돈 요오드로 소독하고, 테일을 70% 에탄올로 소독했다. 50μL의 1.2% BaCl₂(Sigma)를 전경골근(TA)의 길이에 따라 주사하여 세포 사멸을 유도했다. 마우스를 안락사시키고, 지시된 시간에 하지를 제거하고, 4% 파라포름알데히드(Santa Cruz Biotechnology)에 24시간 동안 고정시켰다. TA 근육을 해부하고, 24시간 동안 추가로 고정시킨 다음, 파라핀에 매립하여 절편화했다. 절편(5μm)을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여 중심 핵을 갖는 섬유를 확인하고, 10x 접안 렌즈/40x 대물 렌즈를 사용하여 올림푸스 BX51로 이미지화했다. ImageJ2 소프트웨어(NIH)의 FIJI 분포를 사용하여, 마우스당 적어도 4개의 이미지로부터의 섬유의 단면적(CSA)을 수동으로 측정했다. 데이터는 마우스별로 그룹화되었다. 마우스에 HMGB1 작제물(46nM/kg, PBS에 재현탁) 또는 PBS 비히클 대조군을 손상시 또는 손상후에 근육내 또는 정맥내로 주사하여, 손상후의 HMGB1 작제물의 투여를 최적화했다.

생체내 마우스 심장 손상 모델

C57BL/6 암컷 마우스는 10-14주령 사이에서 수술을 받았고, 체중은 25-30g 사이였다. 모든 마우스는 FR-HMGB1(46nM/kg, PBS에 재현탁) 또는 수술 직전에 비히클 대조군의 정맥내 주사를 가졌다. 부프레노르핀(부프레노르핀 하이드로클로라이드; Vetergesic)는 진통제를 제공하기 위해 시술 20분 전에 복강내 주사를 통해 0.015mg 용액으로서 전달했다. 이들은 2.5% 이소플루란으로 마취시키고, 기관내 튜브를 통해 외부 환기시켜다. 심장 손상은 흉부 절제술을 통해 좌측 전방 하강 관상동맥(LAD)의 영구 결찰에 의해 유도되었다. 실험자들은 후속 심장 시네-MRI 및 분석을 위해 치료 그룹에 대해 블라인딩했다. 마우스는 관리된 환경에서 사육되고, 유지되었다. 모든 수술적 및 약리학적 절차는 1986년 영국 동물법(Scientific Procedures)에 따라 수행되었다.

심장 시네-MRI 및 분석

심장 시네-MRI는 바리안 DDR 시스템을 사용하여 7T에서 LAD 결찰 후에 수행되었다. 간략하게, 마우스를 O₂ 중의 2% 이소플루란으로 마취시키고, 항온 제어를 구비한 커스텀 동물 처리 시스템에 반듯이 위치시켰다. 전향적으로 게이팅된 양성자 심장 이미지는 72mm 용적 전송/4 채널 표면 수신 코일(Rapid Biomedical GmbH)을 사용하여 부분 푸리에 가속 스포일 구배 에코 CINE 서열(TR 5.9ms, TE 2.2ms, 30kHz 대역폭, 30°FA, 4ms 표지후 지연으로 R 파에 게이팅된 약 20-30 프레임; 20% 부분 획득; 평균 4)로 취득하여, 기능 정량화를 위해 2개 및 4개의 챔버 장축 뷰와 단축 스택(128×128 매트릭스, 25.6mm² FOV, 평면내 0.2mm 해상도)을 취득했다. 취득되지 않은 부분 푸리에 데이터는 단순한 데카르 DFT 이전에 볼록한 세트 상에 투영하는 방법을 통해 재구성되었다. 블라이딩된 화상 분석은 ImageJ(NIH)를 사용하여 수행되었다. 좌심실의 질량, 용적 및 박출율은 상기 기재한 바와 같이 계산되었다¹. 상대적 경색 크기는 모든 슬라이스의 얇아진, 운동성 영역의 심내막 및 심외막 원주 길이의 평균으로부터 계산되었고, 확장기에서 측정되고, 심근 표면 전체의 백분율로서 표시되었다[99].

통계 분석

모든 계산은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)(v. 8.41)을 사용하여 수행되었다. 동역학 실험(BLI/RAGE ELISA)의 경우, 모든 적합은 비선형 최소 제곱법을 통해 수행되었다. RAGE ELISA의 경우, RAGE의 각 농도가 나머지 웰로부터 독립적이었기 때문에, 모든 데이터는 하나의 동역학적 적합으로 간주되었고; 그러나, BLI에서는 각 센서는 계산 목적으로 독립적 적합으로 간주되었다. 파라미터 사이의 비교는 AUC 방법을 통해 수행되었다. 마우스 근육 손상 모델 데이터는 네스트된 ANOVA로서 분석되었고, 여기서 각각의 서브-컬럼은 소정 동물에 대한 모든 근육 CSA 값을 포함하고, 각 그룹에는 생물학적 변이를 치료 효과로부터 분리하기 위해 모든 동물이 포함된다. 어느 경우에도 등분산의 가정을 충족할 수 없는 경우, 데이터는 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정에 의해 분석되었다. 네스트된 ANOVA의 경우, 왜곡을 회피하기 위해, 각 동물로부터의 동일한 수의 데이터가 랜덤으로 선택된다. 이질성 플롯 및 Q/Q 플롯이 등분산 가정을 서포트하는 경우, 다른 데이터는 일원배치 ANOVA를 통해 분석되었고[100]; 이들은 또한 스페아르만(Spearman)의 검정에 의해 검증되었다. 다변량 실험(예: 심장 실험)의 경우, 동일한 가정하에서 2개 인자 ANOVA가 사용되었다(이 경우, 데이터 세트는 이질성에 위반하지 않음). 사후 비교는 홈스-시닥(Holms-Sidak) 보정(ANOVA 패밀리 시험) 또는 둔(Dunn)의 방법(Kruskal-Wallis)에 의해 가중치가 부여되었다. 각 경우에 선택된 시험은 각 도면의 범례하에 표시된다. 중요한 범례: n.s; 중요하지 않음, *; p < 0.033, **; p< 0.002, ***; p< 0.0002, ****; p< 0.0001.

NMR 화학 시프트 테이블

0, 0.42, 0.82 및 1.42몰 당량에서 CXCL12A -c021에 의한 HMGB1 -c028(94-162, 비오티닐화) 적정, 도 3A-3B.

단백질 양의 제한으로 인해, HMGB1 샘플에 CXCL12를 순차적으로 첨가하여 적정을 수행하고, 샘플을 희석했다. CCPNMR의 화학적 시프트 추적 모듈의 계산은 피크와 독립적이기 때문에, 결과가 변경되지 않고; 변화의 중앙값은 용적 비교에서 표시되었다.

기준선 (1일차)

3D 실험(1일차)

이들 실험은 이들의 3D 성질에 기인하에 제시되지 않고; 데이터는 요구된 경우에 이용가능하다. 샘플은 기준선 1의 것이다.

0.84 몰 비율 CXCL 12/HMG 박스(2일차)

1.43 몰 비율 CXCL 12/HMG 박스(2일차)

기준선 2(2일차)

0, 0.42, 0.82 및 1.42 몰 당량의 CXCL12A -c021에 의한 HMGB1 -c038(89-174, 비오티닐화) 적정, 도 3A-3B

단백질 양의 제한에 의해, HMGB1 샘플에 CXCL12를 순차 첨가하여 적정을 수행하고, 샘플을 희석했다. CCPNMR의 화학 시프트 추적 모듈에서의 계산은 피크와 독립적이기 때문에, 이에 의해 결과가 변화되지 않고; 변화의 중앙값은 용적 비교에서 표시되어 있다.

기준선 1(1일차)

3D 실험(1-5일차)

이들 스펙트럼은 이들의 3D 성질에 기인하여 제시되지 않고; 데이터는 요구되는 경우에 이용가능하다. 샘플은 기준선 1의 것이다.

0.42 몰 비율 CXCL 12/HMG 박스(5일차)

0.84 몰 비율 CXCL12/HMG 박스(5일차)

1.43 몰 비율 CXCL12/HMG 박스(5일차)

기준선 2(5일차)

10 mM HEPES pH 7.5 150 mM NaCl에서 1:2 몰 비율 CXCL12 (1:1 몰 비율 CXCL12 to HMG Box)를 갖는 HMGB1A-c007 (3S, 1-184), 도 12

기준선 1(1일차)

3D 실험(1일차)

이들 스펙트럼은 이들의 3D 성질에 기인하여 제시되지 않고; 데이터는 요구된 경우에 이용가능하다. 샘플은 기준선 1의 것이다.

기준선 2(3일차)

1:1 몰 비율 CXCL12/HMG 박스(1:2 비율 HMGB1A-c007/CXCL12A-c021, 4일차)

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SEQUENCE LISTING <110> Oxford University Innovation Limited <120> POLYPEPTIDES RELATED TO HMGB1 USEFUL FOR PROMOTING TISSUE REGENERATION, COMPSITIONS COMPRISING SAME, AND USES THEREOF <130> 91203-A-PCT/JPW/AWG <150> 62934299 <151> 2019-11-12 <160> 174 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WT HMGB1 <400> 1 Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala 1 5 10 15 Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp 20 25 30 Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp 35 40 45 Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys 50 55 60 Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro 65 70 75 80 Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg 85 90 95 Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile 100 105 110 Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu 115 120 125 Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp 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caaacttgtc gggaggagca taagaagaag cacccagatg cttcagtcaa cttctcagag 120 ttttctaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagagaa aggaaaattt 180 gaagatatgg caaaagcgga caaggcccgt tatgaaagag aaatgaaaac ctatatccct 240 cccaaagggg agacaaaaaa gaagttcaag gatcccaatg cacccaagag gcctccttcg 300 gccttcttcc tcttctgctc tgagtatcgc ccaaaaatca aaggagaaca tcctggcctg 360 tccattggtg atgttgcgaa gaaactggga gagatgtgga ataacactgc tgcagatgac 420 aagcagcctt atgaaaagaa ggctgcgaag ctgaaggaaa aatacgaaaa ggatattgct 480 gcatatcgag ctaaaggaaa gcctgatgca gcaaaaaagg gagttgtcaa ggctgaaaaa 540 agcaagaaaa agaaggaaga ggaggaagat gaggaagatg aagaggatga ggaggaggag 600 gaagatgaag aagatgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaa 645 <210> 115 <211> 522 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dBB12L pNIC-CTHF DNA sequence cloned into the vector <400> 115 atgaaggacc cgaacgcgcc gaagcgccca ccgtccgctt tttttctgtt ctgtagcgaa 60 taccgtccaa aaattaaagg tgaacaccca ggcctttcta tcggcgatgt tgcgaaaaaa 120 ctgggtgaga tgtggaacaa tactgcagca gatgataaac aaccgtatga aaagaaagcg 180 gcgaagctga aagaaaaata cgaaaaagat atcgctgcgt atcgggccaa ggggaaaccg 240 gatgcggcga aaaaaggcgt caaggatccc aacgcgccga aacgtccacc gagcgcgttc 300 tttctgtttt gttcagaata ccgcccgaaa attaaaggcg aacacccggg cctttcgatt 360 ggtgacgttg cgaaaaaact tggcgaaatg tggaataaca cggcagcgga cgataagcag 420 ccttatgaaa aaaaagccgc caaacttaaa gaaaaatacg agaaagacat tgcagcttac 480 cgcgcgaagg gtaaacctga cgctgcaaaa aaaggtgttt aa 522 <210> 116 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3S-HMGB1 1-214 (HMGB1A-s002) pNIC-CTHF Forward LIC cloning primer <400> 116 ttaagaagga gatatactat gggcaaagga gatcctaaga agccg 45 <210> 117 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3S-HMGB1 1-214 (HMGB1A-s002) pNIC-CTHF Reverse LIC cloning primer <400> 117 ttaagaagga gatatactat gggcaaagga gatcctaaga agccg 45 <210> 118 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3S-HMGB1 1-214 (HMGB1A-s002) pNIC-CTHF DNA sequence cloned into the vector <400> 118 atgggcaaag gagatcctaa gaagccgaga ggcaaaatgt catcatatgc attttttgtg 60 caaactagtc gggaggagca taagaagaag cacccagatg cttcagtcaa cttctcagag 120 ttttctaaga agagctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagagaa aggaaaattt 180 gaagatatgg caaaagcgga caaggcccgt tatgaaagag aaatgaaaac ctatatccct 240 cccaaagggg agacaaaaaa gaagttcaag gatcccaatg cacccaagag gcctccttcg 300 gccttcttcc tcttcagctc tgagtatcgc ccaaaaatca aaggagaaca tcctggcctg 360 tccattggtg atgttgcgaa gaaactggga gagatgtgga ataacactgc tgcagatgac 420 aagcagcctt atgaaaagaa ggctgcgaag ctgaaggaaa aatacgaaaa ggatattgct 480 gcatatcgag ctaaaggaaa gcctgatgca gcaaaaaagg gagttgtcaa ggctgaaaaa 540 agcaagaaaa agaaggaaga ggaggaagat gaggaagatg aagaggatga ggaggaggag 600 gaagatgaag aagatgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaa 645 <210> 119 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wt HMGB1 1-184 pNIC-CTHF Forward LIC cloning primer <400> 119 ttaagaagga gatatactat gggcaaagga gatcctaaga agccg 45 <210> 120 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wt HMGB1 1-184 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Sequence <220> <223> HMGB1 89-174 pNIC-CTHF DNA sequence cloned into the vector <400> 136 atgaaggatc ccaatgcacc caagaggcct ccttcggcct tcttcctctt ctgctctgag 60 tatcgcccaa aaatcaaagg agaacatcct ggcctgtcca ttggtgatgt tgcgaagaaa 120 ctgggagaga tgtggaataa cactgctgca gatgacaagc agccttatga aaagaaggct 180 gcgaagctga aggaaaaata cgaaaaggat attgctgcat atcgagctaa aggaaagcct 240 gatgcagcaa aaaagggagt t 261 <210> 137 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1 8-78, biotinylated pNIC-Bio3 Forward LIC cloning primer <400> 137 tacttccaat ccatgccgag aggcaaaatg tca 33 <210> 138 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1 8-78, biotinylated pNIC-Bio3 Reverse LIC cloning primer <400> 138 tatccacctt tactgctgat ataggttttc atttctcttt cataacggg 49 <210> 139 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1 8-78, biotinylated pNIC-Bio3 DNA sequence cloned into the vector <400> 139 atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt gtagatctgg gtaccgagaa cctgtacttc 60 caatccatgc cgagaggcaa aatgtcatca tatgcatttt ttgtgcaaac ttgtcgggag 120 gagcataaga agaagcaccc agatgcttca gtcaacttct cagagttttc taagaagtgc 180 tcagagaggt ggaagaccat gtctgctaaa gagaaaggaa aatttgaaga tatggcaaaa 240 gcggacaagg cccgttatga aagagaaatg aaaacctata tc 282 <210> 140 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1 94-162, biotinylated pNIC-Bio3 Forward LIC cloning primer <400> 140 tacttccaat ccatgcccaa gaggcctcct tcg 33 <210> 141 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1 94-162, biotinylated pNIC-Bio3 Reverse LIC cloning primer <400> 141 tatccacctt tactgcttcg atatgcagca atatcctttt cg 42 <210> 142 <211> 276 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1 94-162, biotinylated pNIC-Bio3 DNA sequence cloned into the vector <400> 142 atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt gtagatctgg gtaccgagaa cctgtacttc 60 caatccatgc ccaagaggcc tccttcggcc ttcttcctct tctgctctga gtatcgccca 120 aaaatcaaag gagaacatcc tggcctgtcc attggtgatg ttgcgaagaa actgggagag 180 atgtggaata acactgctgc agatgacaag cagccttatg aaaagaaggc tgcgaagctg 240 aaggaaaaat acgaaaagga tattgctgca tatcga 276 <210> 143 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wt CXCL12 with SUMO pDsbC-HT-CBio Forward LIC cloning primer <400> 143 tacttccaat ccatgtctga ccaggaggca aaaccttcaa ctg 43 <210> 144 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wt CXCL12 with SUMO pDsbC-HT-CBio Reverse LIC cloning primer <400> 144 tatccacctt tactgtcatt acttgtttaa agctttctcc aggta 45 <210> 145 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wt CXCL12 with SUMO pDsbC-HT-CBio DNA sequence cloned into the vector <400> 145 atgtctgacc aggaggcaaa accttcaact gaggacttgg gggataagaa ggaaggtgaa 60 tatattaaac tcaaagtcat tggacaggat agcagtgaga ttcacttcaa agtgaaaatg 120 acaacacatc tcaagaaact caaagaatca tactgtcaaa gacagggtgt tccaatgaat 180 tcactcaggt ttctctttga gggtcagaga attgctgata atcatactcc aaaagaactg 240 ggaatggagg aagaagatgt gattgaagtt taccaggagc aaacgggagg taagcccgtc 300 agcctgagct acagatgccc atgccgattc ttcgaaagcc atgttgccag agccaacgtc 360 aagcatctca aaattctcaa cactccaaac tgtgcccttc agattgtagc ccggctgaag 420 aacaacaaca gacaagtgtg cattgacccg aagctaaagt ggattcagga gtacctggag 480 aaagctttaa acaag 495 <210> 146 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1WTLICF <400> 146 atgggcaaag gcgatccgaa aaaaccgc 28 <210> 147 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1C106S <400> 147 gcgatactca gagctgaaga ggaagaaggc 30 <210> 148 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1C45S <400> 148 ttttctaaga agagctcaga gaggtggaa 29 <210> 149 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1WTLICR <400> 149 ttattcatca tcatcatctt cttcttca 28 <210> 150 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1C23S <400> 150 tttttgtgca gaccagccgc gaagaaca 28 <210> 151 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wt HMGB1 1-214 (HMGB1A-s001) pNIC-CTHF <400> 151 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys 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Lys Gly Lys Pro 65 70 75 80 Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val 85 <210> 168 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1 89-174 pNIC-CTHF purified protein sequence <400> 168 Met Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu 1 5 10 15 Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu 20 25 30 Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr 35 40 45 Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys 50 55 60 Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro 65 70 75 80 Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 85 90 <210> 169 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1 8-78, biotinylated pNIC-Bio3 <400> 169 Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg 1 5 10 15 Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu 20 25 30 Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu 35 40 45 Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu 50 55 60 Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile 65 70 <210> 170 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1 8-78, biotinylated pNIC-Bio3 purified protein sequence <400> 170 Ser Met Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr 1 5 10 15 Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe 20 25 30 Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala 35 40 45 Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg 50 55 60 Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Ser Ser Lys Gly Gly Tyr Gly 65 70 75 80 Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 85 90 <210> 171 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1 94-162, biotinylated pNIC-Bio3 <400> 171 Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg 1 5 10 15 Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala 20 25 30 Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln 35 40 45 Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp 50 55 60 Ile Ala Ala Tyr Arg 65 <210> 172 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGB1 94-162, biotinylated pNIC-Bio3 purified protein sequence <400> 172 Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg 1 5 10 15 Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala 20 25 30 Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln 35 40 45 Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp 50 55 60 Ile Ala Ala Tyr Arg Ser Ser Lys Gly Gly Tyr Gly Leu Asn Asp Ile 65 70 75 80 Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 85 90 <210> 173 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wt CXCL12 with SUMO pDsbC-HT-Cbio <400> 173 Met Ser Asp Gln Glu Ala Lys Pro Ser Thr Glu Asp Leu Gly Asp Lys 1 5 10 15 Lys Glu Gly Glu Tyr Ile Lys Leu Lys Val Ile Gly Gln Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Ile His Phe Lys Val Lys Met Thr Thr His Leu Lys Lys Leu Lys 35 40 45 Glu Ser Tyr Cys Gln Arg Gln Gly Val Pro Met Asn Ser Leu Arg Phe 50 55 60 Leu Phe Glu Gly Gln Arg Ile Ala Asp Asn His Thr Pro Lys Glu Leu 65 70 75 80 Gly Met Glu Glu Glu Asp Val Ile Glu Val Tyr Gln Glu Gln Thr Gly 85 90 95 Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu 100 105 110 Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr 115 120 125 Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg 130 135 140 Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu 145 150 155 160 Lys Ala Leu Asn Lys 165 <210> 174 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wt CXCL12 with SUMO pDsbC-HT-CBio purified protein sequence <400> 174 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Lys 65

Claims

하기 화학식으로 나타내어지는 폴리펩티드:
H2N-A-X-B-A-X-B-HOOC
상기 화학식에서,
A는 연속 아미노산을 나타내고, 이 서열은 (1) 야생형 HMGB1의 아미노산 90 내지 93의 서열과 동일한 서열을 포함하고, (2) 이의 아미노 말단(amino terminal end)에 1 내지 6개의 연속 아미노산을 갖고, 이 서열은 야생형 HMGB1의 아미노산 90에 선행하는 대응하는 1 내지 6개의 아미노산의 서열과 동일하고, 임의로, (3) 아미노 말단(amino terminus)에 메티오닌을 갖고;
X는 연속 아미노산을 나타내고, 이 서열은 야생형 HMGB1의 아미노산 94 내지 162의 서열과 동일하고;
B는 연속 아미노산을 나타내고, 이 서열은 (1) 야생형 HMGB1의 아미노산 163 내지 168의 서열과 동일한 서열을 포함하고, (2) 이의 카복시 말단에 1 내지 6개의 연속 아미노산을 갖고, 이 서열은 야생형 HMGB1의 아미노산 168 이후에 대응하는 1 내지 6개 아미노산의 서열과 동일하고;
각각의 -는 각각 A와 X, X와 B, B와 A, A와 X, 및 X와 B 사이의 펩티드 결합을 나타낸다.
제1항에 있어서, 상기 메티오닌이 아미노 말단에 존재하는, 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, A가 이의 아미노 말단에 야생형 HMGB1의 아미노산 89에 대응하는 하나의 아미노산을 갖는, 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, B가 이의 카복시 말단에 야생형 HMGB1의 아미노산 169 내지 174에 대응하는 6개의 아미노산을 갖는, 폴리펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양으로 존재하고, 상기 담체가 약제학적으로 허용되는 담체인, 약제학적 조성물.
조직의 재생을 촉진하기에 효과적인 양의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 치료적 또는 예방적 용량의 제6항의 약제학적 조성물을 대상체(subject)에게 투여하는 것을 포함하여, 수복(repair)을 위해 CXCR4⁺ 세포에 의존하는 조직 또는 세포의 재생을 촉진함으로써 완화되는 병태(condition)를 앓고 있거나 이러한 병태가 진행될 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 병태가 심근 경색(myocardial infarction)이고, 상기 조직이 심장 조직/심근인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 심근 경색으로부터 5시간 이내에 투여되는, 방법.
제7항에 있어서, 상기 병태가 골절이고, 상기 조직이 골인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 병태가 간 손상을 포함하고, 상기 조직이 간 조직인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 병태가 뇌 또는 신경계에 대한 손상을 포함하고, 뇌졸중(stroke), 파킨슨병(Parkinson's disease) 및 치매(dementia)를 포함하는, 방법.
제7항에 있어서, 상기 병태가 폐에 대한 손상을 수반하는, 방법.
제7항에 있어서, 상기 병태가 장(gut)을 포함하고, 수술 및 염증성 장 질환을 포함하는, 방법.
제7항에 있어서, 상기 병태가 피부에 대한 손상을 포함하고, 외과적 처치(surgical procedure), 화상 및 궤양을 포함하는, 방법.
제7항에 있어서, 상기 병태가 제1형 당뇨병(type 1 diabetes)을 포함하는 췌장을 포함하고, 상기 세포가 췌도 세포(islet cell)인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 병태가, 예를 들면, 화학요법 후의 호중구감소증(neutropenia)이고, 상기 조직이 골수(bone marrow)인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 상태가 신부전(kidney failure)이고, 상기 조직이 신장 조직인, 방법.