JP2024518125A

JP2024518125A - 組織再生の促進に有用なｈｍｇｂ１関連ポリペプチド、それを含む組成物及びその使用

Info

Publication number: JP2024518125A
Application number: JP2023571634A
Authority: JP
Inventors: ナンチャハル、ジャグディープ; ビナルス・ギタルト、アルバロ; ユエ、ワイアット; バージェス－ブラウン、ニコラ; リ、ツォン・ユエン; エスピリト・サント、アナ・イザベル
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2021-05-19
Filing date: 2022-05-19
Publication date: 2024-04-24
Also published as: EP4341280A1; CA3219138A1; AU2022276188A1; WO2022243932A1

Abstract

本発明は、以下の式：Ｈ２Ｎ－Ａ－Ｘ－Ｂ－Ａ－Ｘ－Ｂ－ＨＯＯＣで表されるＨＭＢＧ１に基づくポリペプチド、当該ポリペプチドを含む組成物、当該ポリペプチドを使用する治療方法に関する。

Description

この出願は、米国仮出願第63/190,429号（出願日：2021年5月19日）の利益を主張し、その内容は参照によりこの明細書に組み込まれる。

この出願全体で、さまざまな刊行物を参照しており、各参考文献はその全体が参照により本出願に組み込まれる。

配列表の参照
この出願は、本出願の一部として提出した、ファイル名「220519_91203-B-PCT_Sequence_Listing_AWG.txt」で、サイズが78KBで、ＩＢＭ－ＰＣ機形式で2022年5月18日に作成され、MS-Windows（登録商標）とのオペレーティングシステム適合性を有するテキストファイル中の各ヌクレオチド配列も、参照により組み込む。

技術分野
この発明は、有害な炎症を誘発することなく組織再生を促進するＨＭＧＢ１関連ポリペプチド、及び、組織損傷を伴う急性又は慢性の状態の治療を必要とする対象に前記ポリペプチドを投与することによって、前記状態を治療する方法に関する。

常在性幹細胞及び前駆細胞は、恒常性の維持及び損傷後の多くの組織の修復において、重要な役割を果たす［1］。しかし、成体のほとんどの組織は、瘢痕化によって治癒する。骨髄移植の成功［2］に続き、固形臓器（solid organ）の再生を促進するための外因性の幹細胞療法に多くの関心が向けられた。しかし、成功は眼［3］及び皮膚［4］などの一部の臓器に限定された。組織が損傷した後の炎症は、幹細胞の生着にはつながらず、その後の瘢痕化は、幹細胞ニッチを破壊する［5］。したがって、内因性の修復機序を刺激することによる組織再生の促進に焦点がシフトした［6］。治療薬開発の成功は、これらの経路を促進する可溶性の媒介因子の特定に依存する［7］。我々は、骨、血液及び骨格筋を含む複数の組織における修復の重要な媒介因子として、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）を、以前に特定した［8］。

ＨＭＧＢ１は、アラーミンのプロトタイプで［9, 10］、生理学的条件において、転写で重要な役割を果たす［11, 12］。それは、細胞損傷時に、損傷を受けて壊死した細胞から、細胞外及び血液中に受動的に放出され、内因性の幹細胞と前駆細胞を、Ｇ_０とＧ_１との間の中間状態［13］であるＧ_{Ａｌｅｒｔ}に移行させる［8］。適切な活性化因子にさらされると、細胞はＧ_{Ａｌｅｒｔ}からＧ_１に急速に移行でき、組織を修復する。必要とされない場合、Ｇ_{Ａｌｅｒｔ}にある幹細胞は、およそ３週間後にＧ_０に戻り［13］、その結果、それらが疲弊しないことを確実にし、ニッチは枯渇されない。

ＨＭＢＧ１は、２つのＬ字型ボックスドメインＡ及びＢを有し、それぞれが、可動性の領域によって接続された３つのα－ヘリックス（Ｉ～ＩＩＩ）を含む（図１Ａ）。タンパク質のＣ末端は、本質的に秩序がなく、酸性テールを構成するカルボン酸残基（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）を高い比率で含む。ＨＭＧＢ１システイン残基（ボックスＡではＣｙｓ２２、Ｃｙｓ４４、ボックスＢではＣｙｓ１０５）の酸化状態は、ＨＭＧＢ１の細胞外での活性の重要な決定因子で、放出の機序に依存する。in vivoでは、３つの異なる酸化還元形態が報告されている［14］。損傷又は細胞壊死の後に核から受動的に放出されるＨＭＧＢ１は、完全還元型（ＦＲ－ＨＭＧＢ１）である。それはＣＸＣＬ１２に結合し、ヘテロ複合体が細胞表面受容体ＣＸＣＲ４を介してシグナル伝達して、幹細胞及び前駆細胞をＧ_{Ａｌｅｒｔ}に移行させる［8］。局所的な炎症における部分的酸化により、Ｃｙｓ２２とＣｙｓ４４が結合したジスルフィドＨＭＧＢ１（ＤＳ－ＨＭＧＢ１）が形成される［15, 16］。これは、アセチル化及びN-グリコシル化の後に免疫細胞によって能動的に分泌される形態でもある［17, 18］。ＤＳ－ＨＭＧＢ１によるＴＬＲ－４シグナル伝達は、ＴＮＦを含むいくつかの炎症促進性サイトカインを産生する［19］が、ＴＬＲ－２シグナル伝達は、血栓症や再灌流傷害、自己免疫疾患を含む複数のプロセスにおいて有害であることが示されている［20, 21］。ＲＡＧＥを介したＤＳ－ＨＭＧＢ１シグナル伝達は、血小板の活性化と好中球によるＮＥＴ形成において重要な役割を果たし、血栓形成を促進する［20, 22 - 24］。３つ全ての受容体を介する細胞内シグナル伝達が収束して、ＭｙＤ８８に依存する様式で［26, 27］ＮＦ－κβ活性［25］を誘導する。細胞外の活性酸素種の作用による３つのシステイン残基全ての酸化により、生物学的に不活性なスルホニル－ＨＭＧＢ１（ＳＯ_３）が得られる［14, 19］。

ＤＳ－ＨＭＧＢ１のボックスＡにおけるジスルフィド架橋（Ｃｙｓ２２－Ｃｙｓ４４）は、ＴＬＲ４シグナル伝達に必須であり（図１Ｂ及び図１Ｃ）、ＴＬＲ４との結合を開始させるが、解離速度も比較的早い。次いで、ＭＤ－２は、親和性は低いものの非常に遅い解離速度でボックスＢに結合し、相互作用を安定化させる［28］；ボックスＢにおけるＰｈｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ（ＦＣＳＥ、１０４－１０７）ペプチドは、この相互作用に必須である［29］。ＤＳ－ＨＭＧＢ１がＴＬＲ４を介してシグナル伝達する能力は、２２位、４４位及び１０５位のシステインをセリンに置換し、３Ｓ－ＨＭＧＢ１として記載の操作された形態とすることで抑制された［14］。Tirone Mらは、３Ｓ－ＨＭＧＢ１が、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と比較して、再生特性が増強されていると主張していた［30］が、我々は、骨、血液及び骨格筋の損傷では、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と同等であることを見いだした。興味深いことに、心筋梗塞後に局所的に投与した場合、３Ｓ－ＨＭＧＢ１は有害であると報告されていたが、ＦＲ－ＨＭＧＢ１は梗塞を小さくし、４週間の評価で、心機能を増強した［31］。ＴＬＲ２又はＲＡＧＥシグナル伝達に対する３Ｓ置換の作用について、公開されているデータは存在しない。

ＴＬＲ２と相互作用する部位は明確ではないが、グリチルリチンがこの相互作用を阻害することは知られている［21］。少なくとも一方、又は可能性としては両方のＨＭＧボックスドメインと、酸性テールが関与していることが示唆されている［11］。酸性テールは結合を負に調整し、ＨＭＧＢ１の酸性テールをボックスドメインから転置してＴＬＲ２を介したシグナル伝達を可能にするためには、共リガンドが必要であることが報告されている［32, 33］。しかし、いくつかの刊行物は、ＨＭＧＢ１単独でのＴＬＲ２に依存する炎症促進性シグナル伝達を報告している［34, 35］。ＴＬＲ２シグナル伝達におけるＨＭＧＢ１の酸化還元状態の役割は、ジスルフィド形態［36］及び完全還元型［32］の両者が、ＴＬＲ２によってシグナル伝達することが提示されているため、不明瞭なままである。ＲＡＧＥ相互作用は、主として、ＨＭＧボックスＢ（残基１４９－１８２）内のペプチドにマッピングされており［37］（図１Ｂ及び図１Ｃ）、この配列に由来するペプチドは、ＨＭＧＢ１－ＲＡＧＥシグナル伝達を効果的に阻害できる［38］。より最近では、第２のＲＡＧＥ結合部位がＨＭＧボックスＡで特定されており［39］、カスパーゼ１１によるタンパク質分解後にのみ活性があることが示されている［39］。しかし、ＲＡＧＥシグナル伝達に対するそれぞれの部位の相対的な寄与は、不明である。結合部位は現在不明であるにもかかわらず、ＲＡＧＥが媒介する血栓形成促進性シグナル伝達が、ＨＭＧＢ１のジスルフィド形態を必要とすることも認識されており、ボックスＡが関与していることが示される［36］。ＨＭＧＢ１の酸性テールは、ＲＡＧＥ結合ペプチド内の残基と結合するため、ＴＬＲ２と類似の様式でＲＡＧＥシグナル伝達を負に調節する可能性がある［11, 40, 41］。

ＦＲ－ＨＭＧＢ１の再生活性を医療に移行することの成功は、ＣＸＣＬ１２結合及びＣＸＣＲ４を介したシグナル伝達を維持しながら、全ての有害な炎症促進性シグナル伝達の可能性を排除することに依存する。この明細書では、ＣＸＣＬ１２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ２及びＲＡＧＥとの結合に重要なＨＭＧＢ１の残基を特定し、再生活性を維持しながら、ＲＡＧＥ結合並びにＴＬＲ２及びＴＬＲ４シグナル伝達を排除する、ＨＭＧＢ１バリアントについて説明する。この度のデータに基づいて、これらの特性を有する他のＨＭＧＢ１コンストラクトを説明する。

本発明は、以下の式：
Ｈ_２Ｎ－Ａ－Ｘ－Ｂ－Ａ－Ｘ－Ｂ－ＨＯＯＣ
（式中、
Ａは連続するアミノ酸であり、その配列は、
(1) ４アミノ酸の配列であり、
(a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１（配列番号１）のアミノ酸９０～９３の配列と同一である、又は、
(b) 前記(a)の配列とは１以上のアミノ酸で異なる；
かつ、
(2) １～６の連続するアミノ酸をそのアミノ末端側に有し、その配列は、
(a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸９０より前の対応する１～６アミノ酸の配列と同一である、又は、
(b) 前記(a)の配列とは１以上のアミノ酸で異なる；
かつ、
(3) 場合によっては、アミノ末端はメチオニンである、
各Ａは、同一であっても、異なっていてもよい；
Ｘは連続するアミノ酸であり、その配列は、野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸９４～１６２の配列と同一である；
Ｂは連続するアミノ酸であり、その配列は、
(1) ５若しくは６アミノ酸の配列であり、
(a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６８の配列と同一である；
(b) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６７の配列と同一である；
(c) 前記(a)の配列において、アミノ酸１６３、１６７若しくは１６８のいずれか１つが他のアミノ酸に変更されている；
(d) 前記(b)の配列において、アミノ酸１６３若しくは１６７のいずれか１つが他のアミノ酸に変更されている；
(e) 前記(a)若しくは(b)の配列において、アミノ酸１６４がリシンからアルギニンに変更されている；
(f) 前記(a)若しくは(b)の配列において、アミノ酸１６５がグリシンから、アラニン、セリン若しくはスレオニンに変更されている；
(g) 前記(a)若しくは(b)の配列において、アミノ酸１６６がリシンからアルギニンに変更されている；
(h) 前記(a)若しくは(b)の配列が、(e)及び(f)、(e)及び(g)、(f)及び(g)若しくは(e)、(f)及び(g)の組合せである；
(i) 前記(a)、(b)若しくは(c)の配列が、(e)、(f)及び(g)の１以上の変更の組合せである；又は、
(j) 前記(d)の配列が、(e)、(f)及び(g)の１以上の変更の組合せである；
かつ、
(2) １～６の連続するアミノ酸をそのカルボキシ末端側に有し、その配列は、
(a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８より後の対応する１～６アミノ酸の配列と同一である、
(b) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６７より後の対応する１～６アミノ酸の配列と同一である、
(c) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８より後の対応する１～６アミノ酸の配列とは１以上の位置で異なる、又は、
(d) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６７より後の対応する１～６アミノ酸の配列とは１以上の位置で異なる、
各Ｂは、同一であっても、異なっていてもよい；
－は、ＡとＸ、ＸとＢ、ＢとＡ、ＡとＸ及びＸとＢの間のペプチド結合を表す；
ここで、２つのＸの間のＢ－Ａのアミノ酸の数は少なくとも１２でなければならず；かつ、ポリペプチドのカルボキシ末端のＢでは、(2)の１～６の連続するアミノ酸は存在しなくてもよい）
で表されるポリペプチドを提供する。

本発明は、この発明のポリペプチドと担体を含む組成物、及び、修復をＣＸＣＲ４＋細胞に依存する組織又は細胞の再生を促進することで緩和される状態に苦しむ対象又は前記状態を発症する危険性がある対象を処置する方法であって、前記組織又は細胞の再生を促進し、治療効果又は予防効果を得るのに有効な量のこの発明のポリペプチド又は組成物を対象に投与することを含む方法も提供する。

図１Ａ～１Ｃは、ＨＭＧＢ１の構造と免疫原性活性の判明している位置の概略を示す。図１Ａは、各ボックスドメインのαヘリックスを示したＨＭＧＢ１（ＰＤＢ２ＹＲＱ、立体構造異性体１）の構造である。図１Ｂは、ＬＰＳ、ＴＬＲ－４又はＲＡＧＥとの公知の相互作用に応じてＰｙＭｏｌで着色した図１Ａの構造を示す。ＴＬＲ－２との結合に関与する領域は現在不明である。転写調節及び殺細菌活性に関与する酸性テールは示していない。各ボックスドメインのαヘリックスを示したＨＭＧＢ１の構造を明示し、元の色を以下に示す－ピンク：グリチルリチン結合に関与する残基、赤：ボックスＡ又はボックスＢに隣接するＮ末端側の可動性領域、オレンジ：システイン残基、白色：ＨＭＧボックス間のリンカー領域、明るい緑と黄：ＲＡＧＥ結合領域（黄色の酸性テール内に延在するため、図１Ａでは不完全）。図１Ｃは、文献に記載されている、ＨＭＧＢ１のＤＡＭＰシグナル伝達を調節することが知られている領域の概略図である。ジスルフィド結合も記載。図２Ａ～２Ｆは、ＣＸＣＬ１２との結合に重要な、各ＨＭＧボックスドメインに保存された残基を示す。図２Ａは、１μＭのＣＸＣＬ１２－Ｈｉｓ６と共にインキュベートし、抗Ｈｉｓ５－ＨＲＰ抗体で検出した、ＨＭＧＢ１の１５量体のペプチドアレイ（１１×１０）である。スポットの強度は、ペプチドと結合したＣＸＣＬ１２の量に対応し、最初と最後の２つのスポットは、１０－Ｈｉｓ陽性対照である。図２Ｂは、１０－Ｈｉｓ対照に対して正規化した図２Ａのスポット強度の定量（２回の実験）を示す。図２Ｃのアラニンスキャニング実験に使用したペプチドを図に示した。酸性テール内のペプチドは、その高い負電荷のために、ＣＸＣＬ１２などのカチオン性分子に非特異的に結合することから、含めなかった。図中のペプチドは、左から右へ、配列番号８～１０４で表される。図２Ｃは、図２Ａ及び図２Ｂで特定したドメインのアラニン点変異誘発のペプチドアレイを示す。それぞれの列における最初のスポットは陽性対照に対応し、２番目のスポットは未改変のペプチドに対応する。示したペプチドは、上から下へ、配列番号１０５～１１１で表される。図２Ｄは、未改変のペプチドに対して正規化した図２Ｃのペプチド（配列番号１０５～１１１）のアレイの強度の定量化を示す。アラニン残基と比較してＣＸＣＬ１２結合が増加した残基（Ａｌａ－＞Ａｌａ、同義変異、灰色）は、元の図において赤で示し、バーの上に星印を付した。図２Ｅは、ＣＸＣＬ１２に結合するビオチン化ＨＭＧＢ１コンストラクト［全長ＦＲ１～２１４（丸）、３Ｓ１～２１４（四角）、最小ボックスＡ８～７８（上向き三角）及びボックスＢ９４～１６２（下向き三角）、拡張型ボックスＡ１～８８（菱形）及びボックスＢ８９～１７４（星）］のミカエリス・メンテン飽和フィッティングを示す。図２Ｆは、図２Ｅから得た動態パラメーターの概要を示す。両者のフィッティングで得た親和性定数（Ｋｄ）は、同じ関係性に従い、ＨＭＧＢ１９４～１６２では大幅に減少した；フィッティングしたデータから一元配置ブラウン－フォーサイスＡＮＯＶＡで分析。ＡＩＣが複数の定数を有するモデルを支持する場合、Ｋｄ値を事後二元配置ＡＮＯＶＡで比較し、一対比較（カラム因子）で有意差が見られなかったことから、両者の値を平均化した。加工前のインターフェログラムを図１２に示す。Ｒ_ｅｑ：平衡状態での応答、ｋ_Ｏｆｆ：解離定数（ｓ^－１）、ｋ_Ｏｎ：結合定数（（μＭ×ｓ）^－１）、ＡＩＣ：Aikaikeの情報基準による統計的比較（補正済み）。図３は、ペプチドアレイで分析したＨＭＧＢ１とＤＡＭＰ受容体の結合を示す。ＴＬＲ－２（「Ａ」、元の色はオレンジ）、ＴＬＲ－４（「Ｂ」、元の色は赤）又はＲＡＧＥ（「Ｃ」、元の色は緑）をベイトしたＨＭＧＢ１の１５量体ペプチドを用いるCelluSpot（登録商標）アレイの強度デンシトグラムである。強度を０（空スポット）～１００（対照の最高値）で正規化し、各標的について２つの膜全体で平均した。ＨＭＧＢ１の概略図をペプチド配列の左側に示す。ＨＭＧＢ１内のＴＬＲ－２（Ａ）結合ペプチドは、ボックスＡとボックスＢで同様の位置を占め、酸性テールの直前に別の結合領域がある。ＣＸＣＬ１２とは異なり、ＴＬＲ－４（Ｂ）及びＲＡＧＥ（Ｃ）の結合パターンは２つのボックス間で異なっており、ＴＬＲ－４結合ペプチドは、主にボックスＡとリンカーに集中し、ＲＡＧＥ結合ペプチド配列は、ボックスＢのＣ末端と酸性テールのＮ末端よりも前にある可動性領域に集中する。図４は、ボックスＡのＤＡＭＰ受容体結合ペプチドと、そのＣｙｓ２２－Ｃｙｓ４４の酸化状態に依存する立体配置の変化を示す。公開されているＨＭＧＢ１（ＰＤＢ２ＹＲＱ）のＰｙｍｏｌＮＭＲ構造に重ね合わせた、図３の結合ペプチドの表面を示す。Ａ上の列：ＴＬＲ－２、Ｂ中央の列：ＴＬＲ－４、Ｃ下の列：ＲＡＧＥ。元の色は以下のとおり、シアン：システイン残基；ピンク（Ａのみ）：ＴＬＲ－２結合部位に含まれるグリシルリジン結合残基；黒（Ｃのみ）：ＨＭＧＢ１が誘導するＲＡＧＥ媒介性免疫寛容が報告されているカスパーゼ－１部位。ＨＭＧＢ１の残基１６４よりもＣ末端側に結合するペプチドは、利用できるタンパク質構造には存在しないので、いずれの図にも示していない。３つ全ての場合において、ボックスＡ内のペプチドの位置は、酸化の影響を受ける。図５Ａ～５Ｂは、ＣＸＣＬ１２結合に関与する残基のＮＭＲ検証を示す。図５Ａは、ＣＸＣＬ１２（０．４２、０．８４及び１．４２モル当量）で滴定した後の、最終濃度点の後に測定したＣＸＣＬ１２を含まない並列対照（ＣＳＰドリフト対照）を含む複数のＨＳＱＣスペクトルにわたって計算した、ヘリックスのみのビオチン化ボックスＢ（９４～１６２、ＨＭＧＢ１Ａ－ｃ０２８）又は完全なボックスＢ（８９～１７４、ＨＭＧＢ１Ａ－ｃ０３８）の累積ＣＳＰを示す。バーの網掛けによる暗さの強度は相対的なＣＳＰを示す。各ＨＭＧＢ１コンストラクトの配列には残基番号を重ね、空の（番号のない）カラムは、並列３Ｄ ^１Ｈ－^１５ＮＨＳＱＣ／ＮＯＥ／ＴＯＣＳＹ実験でマッピングできなかった残基を表す。各ＨＭＧボックスに対応する残基の配列は、元の色で以下のように示す：水色はＣＸＣＬ１２結合に関与することが文献に報告されている残基（具体的には、Ｋ９５、Ａ１００、Ｉ１１２、Ｇ１１４、Ｌ１１９、Ａ１３６及びＹ１５４）；赤はペプチドアレイで弱く関与する残基（具体的には、Ｄ９０、Ｐ９１、Ｎ９２、Ｒ９６、Ｓ９９、Ｆ１０１、Ｆ１０４、Ｃ１０５、Ｓ１０６、Ｅ１０７、Ｙ１０８、Ｒ１０９、Ｋ１１３、Ｇ１１８、Ｓ１２０、Ｋ１５１、Ｅ１５２、Ｋ１５３、Ｅ１５５、Ｙ１６１、Ｒ１６２、Ｇ１６５、Ｋ１６６、Ｐ１６７及びＤ１６８）；紫は公開されている文献及びペプチドアレイの両者で関与する残基（具体的には、Ｆ１０２、Ｌ１０３、Ｅ１１５及びＤ１５７）；灰色はペプチドアレイで評価できなかったＣＸＣＬ１２結合ペプチド（下線）内のアラニン残基（Ａ９３、Ａ１５９及びＡ１６０）。図に示した配列は、配列番号５として表される。図５Ｂは、図５Ａの累積ピーク高さの変化；ＮＭＲ変化のヒートマップを示す。元の色で赤は、全ての残基の１標準誤差を上回るＩ／Ｉ０変化を示し、元の色で青は、－１標準誤差を上回る減少を示す。これらのバーもラベル付けされている。図に示した配列は、配列番号５として表される。図６Ａ～６Ｃは、ＲＡＧＥ、ＴＬＲ－２及びＴＬＲ－４シグナル伝達を除去するｄＢＢ１２Ｌコンストラクトの設計を示す。図６Ａは、ボックスＡ＋リンカー（１～８８）（配列番号３）とボックスＢ＋リンカー（８９～１７４）（配列番号４）の配列のアライメントで、番号はＮＭＲ構造による残基のナンバリングに対応する（Ｎ末端メチオニンを除く）。垂直方向の線は、厳密に保存されている位置を示し、二重の点は、類似のアミノ酸を示す。下線：第１のペプチドアレイから得たＣＸＣＬ１２に結合するペプチド領域。元の色で赤：ＮＭＲで検証できず、アラニンスキャンでＣＸＣＬ１２結合に関与するとしてフラグ付けされた残基（具体的には、ボックスＡで、Ｄ４、Ｐ８、Ｍ１２、Ｃ２２、Ｒ６９、Ｙ７０、Ｔ７６及びＰ８０；ボックスＢで、Ｐ９１、Ｇ１１８及びＰ１６７）。元の色でオレンジ：アラニンスキャンでフラグ付けされ、ＣＳＰ又はＮＭＲによるピーク体積変化のいずれかを示す残基（具体的には、ボックスＡで、Ｋ６、Ｒ９、Ｇ１０、Ｋ１１、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｈ２６、Ｋ２８、Ｋ２９、Ｈ３０、Ｋ６４、Ｄ６６、Ｅ７３、Ｋ７５、Ｙ７７及びＩ７８；ボックスＢで、Ｄ９０、Ｒ９６、Ｓ９９、Ｆ１０１、Ｆ１０２、Ｌ１０３、Ｆ１０４、Ｓ１０６、Ｒ１０９、Ｋ１１３、Ｋ１５１、Ｅ１５２、Ｉ１５８、Ｙ１６１、Ｒ１６２、Ｇ１６５、Ｋ１６６及びＤ１６８）。元の色でシアン：ＮＭＲにおいてもペプチドアレイ実験においてもフラグ付けされなかったが、ＮＭＲ文献［46］でＣＸＣＬ１２結合に寄与するとされている残基（具体的には、ボックスＡで、Ｆ３７、Ｓ３８、Ｋ４９、Ｋ５６；ボックスＢで、Ａ１００、Ｇ１１４、Ｌ１１９、Ａ１３６、Ｙ１５４）。元の色で紫：ペプチドアレイ実験でフラグ付けされ、公開されたデータ又は我々のＮＭＲデータによって確認された残基（具体的には、ボックスＡで、Ｖ１９及びＲ２３；ボックスＢでＥ１１５及びＤ１５７）。緑：ＣＸＣＬ１２に直接的に結合する可能性があるか、近傍の残基への結合によって影響を受ける可能性があるか、ＮＭＲ実験でのみフラグ付けされた残基（具体的には、ボックスＡで、Ａ３３、Ｋ４２、Ｋ４３、Ｓ４５、Ｔ５０、Ｓ５２、Ｋ５８、Ｄ６１及びＡ６８；ボックスＢで、Ｈ１１６、Ｇ１２２、Ｄ１２３、Ｖ１２４、Ｋ１２６、Ｋ１２７、Ａ１４７、Ａ１４８、Ａ１５９、Ａ１６３及びＫ１６４）。元の色でピンク：ＮＭＲ実験及び公開されているデータの両者でフラグ付けされた残基（具体的には、ボックスＡでＡ１６、ボックスＢでＫ９５及びＩ１１２）。図６Ｂは、図６Ａに示したように残基を着色したＦＲ－ＨＭＧＢ１１～１６６（２ＹＲＱ）の構造を示す。着色した残基全ての側鎖を示す。破線の円は、各ＨＭＧボックスにおけるグリチルリチン結合領域を示す。右図は、ＣＸＣＬ１２結合残基のＰｙｍｏｌによる表示；ボックスＡが還元されると、ＮＭＲ及びペプチドアレイでフラグが付された残基は、各ＨＭＧＢボックスの凹面に同様の結合ポケットを形成する。図６Ｃは、ｄＢＢ１２Ｌコンストラクト設計の概要を示す。開始コドンＭｅｔ１は、切断されたペプチドでは部分的に失われているため、この明細書ではＭｅｔ０とナンバリングする。したがって、ＨＭＧＢ１Ｍｅｔ１－Ｇｌｙ２・・・Ｇｌｕ２１５は、Ｍｅｔ０－Ｇｌｙ１・・・Ｇｌｕ２１４となる。ＦＲ－ＨＭＧＢ１（上部、配列番号１）及びｄＢＢ１２Ｌコンストラクト（下部、配列番号２）のドメインの構成と配列を示す。ｄＢＢ１２Ｌコンストラクトは、以下のように設計した：１．酸性テール及びＲＡＧＥ結合ドメインの一部（１７５～２１４）が欠失する；２．残基１～８８（ボックスＡ）を、残基９０～１７５で置換し、２つのＨＭＧボックスＢドメインが生じる；かつ、３．ボックスＢのＣ末端側の残基１６３～１７４を、天然のＨＭＧＢ１におけるボックスＡに対してＣ末端側にある天然の可動性リンカー（７９～８８）と置換する。ＣＸＣＬ１２結合ペプチドを、元の色で赤の文字で示し、上にアスタリスクも付ける。ボックスＢの繰り返し単位は、図では黒色の縦破線で区切っている。ボックスＡのＤＡＭＰ受容体結合ペプチドを破線で示し、ボックスＢのものは実線で示す。ＤＢＢ１２ＬではＴＬＲ－２及びＲＡＧＥペプチドが短縮されており、置換のために、全てのボックスＡペプチドはコンストラクト中にはない。図７Ａ～７Ｄは、ｄＢＢ１２Ｌが、ＦＲ－ＨＭＧＢ１１～２１４／１～１６４と類似の安定性及び表面電荷を有することを示す。図７Ａは、さまざまな緩衝液中の、全長ＦＲ－ＨＭＧＢ１、１～１６４ＦＲ－ＨＭＧＢ１及びｄＢＢ１２Ｌについて計算したＴｍ_５０（℃単位）を、全てのコンストラクトのグローバルデータセット内の最高値（元の色で緑）及び最低値（元の色で赤）のヒートマップとして示す。Ｎ／Ａ：曲線がフィッティングできない。ｐＨ及びＮａＣｌ濃度の効果を下の表にまとめた（ＦＲ－ＨＭＧＢ１：丸、ｄＢＢ１２Ｌ：四角、１～１６４ＦＲ－ＨＭＧＢ１：三角）。図７Ｂは、５０ｍＭ又は０．２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）のＨＭＧＢ１コンストラクトのネイティブＥＳＩ／ＭＳを示す。３つ全てのＨＭＧＢ１コンストラクトのネイティブＭ／Ｚプロファイルは類似しており、ｄＢＢ１２Ｌでは、２つのＨＭＧボックスが互いに離れて、還元型ＨＭＧＢ１コンストラクトに酷似している。実線：コンパクト型モノマー。破線：拡張型モノマー（ＨＭＧボックスが互いに遠位にある）。酸性テールの除去（青の曲線のＦＲ－ＨＭＧＢ１１～１６４と赤の曲線のＦＲ－ＨＭＧＢ１とを比較）とイオン強度の上昇（５０ｍＭ又は２００ｍＭの酢酸アンモニウムでの同じコンストラクトのスペクトルの比較）は、高いＭ／Ｚ状態（部分的なアンフォールディング）を増加させる。図７Ｃは、図７Ｄで得た、フォールディングされたＨＭＧＢ１モノマー、拡張型及びコンパクト型モノマー状態、並びにフォールディングされていないモノマーの溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）の平均の計算値を示す。図７Ｄは、０．２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）中、室温で１８０日間（Ｄ０～Ｄ１８０）保管した後の、ＨＭＧＢ１コンストラクトの変性ＥＳＩ／ＭＳデコンボリューション、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣプロファイルを示す。図８Ａ～８Ｆは、ｄＢＢ１２ＬがＲＡＧＥに対する結合を減少させ、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４を介してシグナル伝達しないことを示す。図８Ａは、ｄＢＢ１２Ｌコンストラクトが酸化状態に関係なくＲＡＧＥと結合しないことを示す、ハイブリッドＥＬＩＳＡ（１濃度につきｎ＝４、グローバルなフィッティング）でのミカエリス・メンテン飽和フィッティングである。ＤＳ－ＨＭＧＢ１は、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と比較してＲＡＧＥと強力に結合する。データは、ＤＳ－ＨＭＧＢ１対照に対して正規化。図８Ｂは、バイオレイヤー干渉法（０～２５μＭのＨＭＧＢ１、図１４に示した６回の実験）でのミカエリス・メンテン飽和フィッティングである。結合速度及び解離速度は、加工前のインターフェログラムのデータのみから計算。図８Ｃは、図８Ａ及び図８Ｂにおける動態パラメーターと色の凡例（ジスルフィド形態は破線）の要約である。無効なフィッティングは、Ｒ^２＜０．６（結合不良）を表す。ＥＬＩＳＡは定常状態の条件である。各動態パラメーターについて、元の色で緑は、最も高い親和性、最も速い結合（ｋ_ｏｎ）又は最も遅い解離（ｋ_Ｏｆｆ）のコンストラクトを示す；中間点を黄で、最低を赤色で示す。図８Ｄは、ＤＳ－ＨＭＧＢ１が、ヒトＴＬＲ２及びＣＤ１４を発現するレポーターＨＥＫ－Ｄｕａｌ細胞で、ＮＦ－κβ活性を促進したことを示す。ｄＢＢ１２Ｌ及びＦＲ－ＨＭＧＢ１は、ＮＦ－κβシグナル伝達を促進しなかった。データを、対照（培地単独）と比較した平均±標準誤差の倍率変化として示す。図８Ｅは、ＤＳ－ＨＭＧＢ１が、マウスＴＬＲ４、ＭＤ－２及びＣＤ１４を発現するレポーターＨＥＫ－Ｄｕａｌ細胞で、ＮＦ－κβ活性を促進したことを示す。ｄＢＢ１２Ｌ及びＦＲ－ＨＭＧＢ１は、ＮＦ－κβシグナル伝達を促進しなかった。データを、対照（培地単独）と比較した平均±標準誤差の倍率変化として示す。図８Ｆは、ジスルフィドＨＭＧＢ１（ＤＳ－ＨＭＧＢ１）が単球においてＴＮＦ産生を増加させたことを示し、準最適量のＬＴＡの存在で更に増強されたが、ＬＰＳでは増強されなかった。ＦＲ－ＨＭＧＢ１及びｄＢＢ１２Ｌは、ＬＰＳ又はＬＴＡと共に事前に２４時間インキュベートした場合であっても、ＴＮＦの発現を促進しなかった。これらのコンストラクトと共に事前にインキュベートしたＬＰＳに対する応答も有意に減少した。ドナー３人、それぞれ３回の実験。図９は、ＦＲ－ＨＭＧＢ１の再生活性に対するリンカーの修飾の効果を示す。アライメントにおけるｄＢＢ１２Ｌ配列は、配列番号２で示す配列の残基７５～９１である。アライメントにおけるＦＲ－ＨＭＧＢ１配列（「ＦＲ」）は、配列番号１で示す配列の残基７９～９３である。アライメントにおける「Ｓｕｂ（７９－８３）」、「Ｓｕｂ（８４－８８）」及び「Ｓｕｂ（８９－９３）」の配列は、配列番号１７５で示す配列である。図１０Ａ～１０Ｊは、最適用量でのｄＢＢ－ＨＭＧＢ１及びＦＲ－ＨＭＧＢ１の再生作用が、活性化損傷のものと同一であることを示す。図１０Ａは、損傷後又はＨＭＧＢ１がＧ_{Ａｌｅｒｔ}を誘導した後の、筋肉幹細胞において差次的に発現する遺伝子を倍率変化で示すボルケーノプロットである。積分は、反対側の下肢の損傷又は静脈内（ｉｖ）ＨＭＧＢ１によって誘導されるＧ_{Ａｌｅｒｔ}にあるコア遺伝子の上方制御（示した括弧内の元の色で褐色の点）及び下方制御（示した括弧内の元の色で青色の点）の保存を示す。図１０Ｂは、筋肉幹細胞におけるＧ_{Ａｌｅｒｔ}誘導中の差次的に発現する遺伝子の遺伝子オントロジータームのネットワークマップを示す。図１０Ｃは、再生を線維の断面積によって定量した、ＢａＣｌ_２骨格筋損傷モデルにおけるＦＲ－ＨＭＧＢ１の用量応答を示す。最適用量は０．７５ｍｇ／ｋｇ（２８．７５ｎｍｏｌ／ｋｇ）で、これを後続のアッセイで使用した。値は、ホルム－シダック補正を用いたネステッドＡＮＯＶＡにおける平均±標準誤差として示す。図１０Ｄは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１（最適用量）を、ＢａＣｌ_２の注入後のさまざまな時点で動物に投薬して、損傷後のＦＲ－ＨＭＧＢ１での処置が有効である間隔を評価した結果を示す。値は、ホルム－シダック補正を用いたネステッドＡＮＯＶＡにおける平均±標準誤差として示す。図１０Ｅは、二相指数関数的減衰曲線に対して非線形最小二乗法でフィッティングした、０．７５ｍｇ／ｍｌのＦＲ－ＨＭＧＢ１を投与した後の血液中のＨＭＧＢ１の薬物動態を示す。図１０Ｆは、カプラン－マイヤーの生存率プロットを示す。ＭＩ後５週目で、ＦＲ－ＨＭＧＢ１は８３％、ＰＢＳは５２％であった。図１０Ｇは、連続ＭＲＩスキャンから計算した経時的な駆出率を示す。破線は、正常／偽手術マウスにおける駆出率である。四角：ＦＲ－ＨＭＧＢ１；丸：ＰＢＳ対照。図１０Ｈは、連続ＭＲＩスキャンから計算した経時的な梗塞サイズを示す。四角：ＦＲ－ＨＭＧＢ１；丸：ＰＢＳ対照。図１０Ｉは、ＭＩの１週間後及び５週間後における心臓周期の拡張終期及び収縮終期の代表的な心房中央の短軸シネＭＲＩ画像を示す。心室内の血液は明るく見える。ＦＲ－ＨＭＧＢ１群は、心機能の保存及び心臓壁厚さの維持（ラベルのない短い矢印）を示し、収縮期に右左心室の分離（ＲＶ、ＬＶとラベルした矢印）が確認できる。対照的に、ＰＢＳ群では、左室の大幅な拡張（ＬＶとラベルした矢印）があり、拡張期と収縮期との間の収縮は非常に限定されている。１群当たり１０匹。全てのＭＲＩスキャンは、盲検観測者が評価。図１０Ｊは、ＢａＣｌ_２により筋肉が損傷を受けた動物を、ＰＢＳ（元の色で黒、左のバー）、２８．７５ｎＭ／ｋｇのＦＲ－ＨＭＧＢ１Ａ－ｃ００１（元の色で赤、中央のバー）、又はｄＢＢ１２Ｌ（元の色で緑、右のバー）で処置した後の、それぞれの日数の時点での平均筋肉断面積を示す。１群、各日数につき５匹、ネステッドＡＮＯＶＡ（ホルム－シダック事後補正）。それぞれの時点における代表的な画像を図１５に示す。図１１Ａ～１１Ｂは、ＨＭＧＢ１と相互作用するＣＸＣＬ１２ペプチドのペプチドアレイの結果を示す。図１１Ａは、全長ＣＸＣＬ１２のペプチドアレイを示す。「＋」の位置は、陽性対照１０－Ｈｉｓペプチドに対応し、残りのペプチドは、２つの連続する残基をＣ末端の方にシフトさせたＣＸＣＬ１２の１５量体を含む。膜を、１μＭのＨＭＧＢ１（ＦＲ又は３Ｓ）－Ｈｉｓ６（１～２１４）、ボックスＡ－Ｈｉｓ６（８～７８）及びボックスＢ－Ｈｉｓ６（９４～１６２）に、２４時間曝露した。結合したタンパク質を、抗Ｈｉｓ－ＨＲＰコンジュゲートの化学発光で検出した。全長ＨＭＧＢ１と相互作用するＣＸＣＬ１２のペプチドは、ボックスＡ又はボックスＢのいずれか単独とは相互作用できず、各ボックスドメインのＮ末端側のセグメント（特に、ボックスＡではＤ４／ボックスＢではＤ９０）の必要性を確認し；ＣＸＣＬ１２ペプチドに関与するスポットの強度も、ボックスドメイン単独への結合の場合にはＦＬ－ＨＭＧＢ１と比較して著しく減少する。３Ｓへの結合は、ＦＲに対する結合よりも強いと考えられ；これは、アッセイ中のタンパク質の酸化に起因する可能性が高いが、使用したタンパク質の低い濃度がＥＳＩ／ＴＯＦＭＳに不適切であることに起因して、定量しなかった。しかし、ＢＬＩデータは、３ＳからのＣＸＣＬ１２の解離速度がＦＲ－ＨＭＧＢ１よりも低いことを示唆している。図１１Ｂは、ＨＭＧＢ１に結合する領域を強調表示したＣＸＣＬ１２二量体（ＰＤＢ２Ｊ７Ｚ）を示す。元の色で赤：共通した結合領域。元の色で青：共通しない結合領域。図１２は、固定化したＨＭＧＢ１コンストラクトに結合するＣＸＣＬ１２のＢＬＩのインターフェログラムを示す。ビオチン化ＨＭＧＢ１コンストラクトを、ストレプトアビジンをコーティングしたOctetバイオセンサーに固定し、漸増濃度のＣＸＣＬ１２に浸漬した。各インターフェログラム内のそれぞれの線は、特に説明しない限り、上から下にキーと同じ順序である。インターフェログラムは、ＣＸＣＬ１２の濃度に応じて色付けしている（凡例は右上）。３つの複製物の各セット（サイクル）は、コンストラクトに応じて色付けしたオーバーレイによって囲まれている。１行目：ＦＲＦＬ－ＨＭＧＢ１（図では「センサー情報：ｃ０１１」と表示）、２行目：３Ｓ－ＦＬＨＭＧＢ１（図では「センサー情報：ｃ０２２」と表示）、３行目：ＦＲ－ＨＭＧＢ１ボックスＡ８～７８（図では「センサー情報：ｃ０２７」と表示）、４行目：ＦＲ－ＨＭＧＢ１ボックスＢ９４～１６２（図では「センサー情報：ｃ０２８」と表示）、５行目：ＦＲ－ＨＭＧＢ１ボックスＡ１～８８（図では「センサー情報：ｃ０３７」と表示）、６行目：ＦＲ－ＨＭＧＢ１ボックスＢ９０～１６２（図では「センサー情報：ｃ０３８」と表示）。図１３Ａ～１３Ｄは、ＣＸＣＬ１２結合に関与する残基のＮＭＲによる検証を示す。図１３Ａは、１：２モル当量のＣＸＣＬ１２を一工程で添加した際のＨＭＧＢ１３Ｓ１～１８４（ＨＭＧＢ１Ａ－ｃ００７）の累積ＣＳＰ（ＨＭＧボックス対ＣＸＣＬ１２が１：１）を示す。ボックスＡ及びボックスＢの残基は、中央値ＣＳＰを計算する目的で、別の分子と考えている。棒グラフ中のバーの暗さは、高い相対ＣＳＰを示す。各ＨＭＧＢ１コンストラクトの配列に、残基番号を重ね合わせてあり、空のカラム（番号なし）は、並列した３Ｄ ^１Ｈ－^１５ＮＨＳＱＣ／ＮＯＥ／ＴＯＣＳＹ実験でマッピングできなかった残基を示す。各ボックスに対応する残基の配列は、各条件の中央にあり、元々次のように色付けされている。水色は文献でＣＸＣＬ１２結合に関与することが報告されている残基（具体的には、ボックスＢでは、Ｋ９５、Ａ１００、Ｉ１１２、Ｇ１１４、Ｌ１１９、Ａ１３６及びＹ１５４；ボックスＡでは、Ａ１６、Ｆ４０、Ｓ４１、Ｋ４９及びＫ５６）；赤はペプチドアレイで弱く関与する残基（具体的には、ボックスＢでは、Ｄ９０、Ｐ９１、Ｎ９２、Ｒ９６、Ｓ９９、Ｆ１０１、Ｆ１０４、Ｃ１０５、Ｓ１０６、Ｅ１０７、Ｙ１０８、Ｒ１０９、Ｋ１１３、Ｇ１１８、Ｓ１２０、Ｋ１５１、Ｅ１５２、Ｋ１５３、Ｅ１５５、Ｙ１６１、Ｒ１６２、Ｇ１６５、Ｋ１６６、Ｐ１６７及びＤ１６８；ボックスＡでは、Ｄ４、Ｋ６、Ｋ７、Ｐ８、Ｒ９、Ｇ１０、Ｋ１１、Ｍ１２、Ｓ１４、Ｆ１７、Ｆ１８、Ｔ２１、Ｅ２４、Ｅ２５、Ｈ２６、Ｋ２７、Ｋ２８、Ｋ２９、Ｈ３０、Ｄ３２、Ｓ３４、Ｖ３５、Ｎ３６、Ｋ６４、Ｄ６６、Ｒ６９、Ｙ７０、Ｅ７１、Ｒ７２、Ｅ７３、Ｍ７４、Ｋ７５、Ｔ７６、Ｙ７７、Ｈ７８及びＰ８０）；紫は公開されている文献及びペプチドアレイの両者で関与する残基（具体的には、ボックスＢでは、Ｆ１０２、Ｌ１０３、Ｅ１１５及びＤ１５７；ボックスＡでは、Ｓ１３、Ｙ１５、Ｖ１９及びＲ２３）。示した配列は、配列番号６及び７として表される。図１３Ｂは、図１３Ａに示した、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中の^１５ＮＨＳＱＣ－ＨＱＭＣピークスペクトルを示す。タンパク質濃度をスペクトルオーバーレイで示す。図１３Ｃは、ＨＭＧＢ１Ａ９４～１６２（２日間の実験）の、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中の^１５ＮＨＳＱＣ－ＨＱＭＣピークスペクトルを示す。タンパク質濃度をスペクトルオーバーレイで示す。図１３Ｄは、ＨＭＧＢ１Ａ８９～１７４（６日間の実験、４日目以降に軽微な分解が生じた）の、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中の^１５ＮＨＳＱＣ－ＨＱＭＣピークスペクトルを示す。タンパク質濃度をスペクトルオーバーレイで示す。図１４は、固定化したＦｃ－ＲＡＧＥに結合するＨＭＧＢ１コンストラクトのＢＬＩにおけるインターフェログラムを示す。ＲＡＧＥ－ＦｃをＡＨＣセンサーの表面に固定化し、漸増濃度でさまざまなＨＭＧＢ１コンストラクトに浸漬した。２回の実験を、さまざまな濃度で行った；左側の３つのグラフの列は、０～２２．２２μＭの１０段階のＨＭＧＢ１で、右側は、０～２５μＭの９段階のもの。いずれも、濃度（上部に示す）で色分けしている。色はコンストラクト濃度を示す。グラフ中の上部から下部への線は、ほとんどの場合、最高濃度から最低濃度に対応する。それぞれのグラフは、単一のセンサー（複製物）に対応する。黒の長方形で囲んだインターフェログラムは、品質不良（例．ドリフト）に起因して排除したデータを有していた。図１５は、図１０に示した、ＰＢＳ対照（黒）と比較した、ＦＲ－ＨＭＧＢ１（赤）又はｄＢＢ１２Ｌ（緑）に応答して再生する筋肉の組織学的画像を示す。図１６は、プラスミドベクターマップを示す。特徴及び制限部位を有するベクターマップ。ＴＥＶ：タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ認識部位。６－Ｈｉｓ：１０／６－ヒスチジン残基親和性エピトープ。ＦＬＡＧ：ＦＬＡＧ親和性エピトープ。ＳｔｒｅｐＴａｇ：ストレプトアクチンＸＴ親和性エピトープ。ＳａｃＢ：レバンスクラーゼ前駆体（スクロースの存在下での陰性選択）。ｐＬＩＣ：コロニースクリーニングで使用するシーケンシングプライマーのアニーリング部位。全てのプラスミドは、カナマイシン耐性を含む（５０μｇ／ｍＬ）。図１７は、３Ｓ－ＨＭＧＢ１を生成する方法を示す。

発明の詳細な説明
本発明は、以下の式：
Ｈ_２Ｎ－Ａ－Ｘ－Ｂ－Ａ－Ｘ－Ｂ－ＨＯＯＣ
（式中、
Ａは連続するアミノ酸であり、その配列は、
(1) ４アミノ酸の配列であり、
(a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１（配列番号１）のアミノ酸９０～９３の配列と同一である、又は、
(b) 前記(a)の配列とは１以上のアミノ酸で異なる；
かつ、
(2) １～６の連続するアミノ酸をそのアミノ末端側に有し、その配列は、
(a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸９０より前の対応する１～６アミノ酸の配列と同一である、又は、
(b) 前記(a)の配列とは１以上のアミノ酸で異なる；
かつ、
(3) 場合によっては、アミノ末端はメチオニンである、
各Ａは、同一であっても、異なっていてもよい；
Ｘは連続するアミノ酸であり、その配列は、野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸９４～１６２の配列と同一である；
Ｂは連続するアミノ酸であり、その配列は、
(1) ５若しくは６アミノ酸の配列であり、
(a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６８の配列と同一である；
(b) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６７の配列と同一である；
(c) 前記(a)の配列において、アミノ酸１６３、１６７若しくは１６８のいずれか１つが他のアミノ酸に変更されている；
(d) 前記(b)の配列において、アミノ酸１６３若しくは１６７のいずれか１つが他のアミノ酸に変更されている；
(e) 前記(a)若しくは(b)の配列において、アミノ酸１６４がリシンからアルギニンに変更されている；
(f) 前記(a)若しくは(b)の配列において、アミノ酸１６５がグリシンから、アラニン、セリン若しくはスレオニンに変更されている；
(g) 前記(a)若しくは(b)の配列において、アミノ酸１６６がリシンからアルギニンに変更されている；
(h) 前記(a)若しくは(b)の配列が、(e)及び(f)、(e)及び(g)、(f)及び(g)若しくは(e)、(f)及び(g)の組合せである；
(i) 前記(a)、(b)若しくは(c)の配列が、(e)、(f)及び(g)の１以上の変更の組合せである；又は、
(j) 前記(d)の配列が、(e)、(f)及び(g)の１以上の変更の組合せである；
かつ、
(2) １～６の連続するアミノ酸をそのカルボキシ末端側に有し、その配列は、
(a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８より後の対応する１～６アミノ酸の配列と同一である、
(b) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６７より後の対応する１～６アミノ酸の配列と同一である、
(c) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８より後の対応する１～６アミノ酸の配列とは１以上の位置で異なる、又は、
(d) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６７より後の対応する１～６アミノ酸の配列とは１以上の位置で異なる、
各Ｂは、同一であっても、異なっていてもよい；
－は、ＡとＸ、ＸとＢ、ＢとＡ、ＡとＸ及びＸとＢの間のペプチド結合を表す；
ここで、２つのＸの間のＢ－Ａのアミノ酸の数は少なくとも１２でなければならず；かつ、ポリペプチドのカルボキシ末端のＢでは、(2)の１～６の連続するアミノ酸は存在しなくてもよい）
で表されるポリペプチドを提供する。

いくつかの態様では、ポリペプチドのアミノ末端にはメチオニンが存在する。

別の態様では、Ａは、野生型ＨＭＧＢ１（配列番号１）のアミノ酸８９に対応するアミノ酸をそのアミノ末端側に有する。

いくつかの態様では、Ｂの(2)では、Ｂは、そのカルボキシ末端側に野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６９～１７４に対応する６アミノ酸を有する。

いくつかの態様では、２つのＸの間のＢ－Ａのアミノ酸の数は少なくとも１３である。そのような態様では、２つのＸの間のＢ－Ａのアミノ酸の数は、最大で２２、より好ましくは、最大で２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５又は１４である。

別の態様では、２つのＸの間のＢ－Ａのアミノ酸の数は１２～２２である。

更に別の態様では、２つのＸの間のＢ－Ａのアミノ酸の数は１３～２２である。いくつかの態様では、２つのＸの間のＢ－Ａのアミノ酸の数は、１３～２１、より好ましくは１３～２０、より好ましくは１３～１９、より好ましくは１３～１８、より好ましくは１３～１７、より好ましくは１３～１６、より好ましくは１３～１５、より好ましくは１３～１４である。

いくつかの態様では、Ｂのいずれか一方又は両方の(2)(c)又は(2)(d)の配列は、１以上の位置が、天然のＨＭＧ１の当該位置に存在するアミノ酸残基に換えて、グリシン、セリン、プロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンが存在する。

いくつかの態様では、Ｂのいずれか一方又は両方の(2)(c)又は(2)(d)の配列は、ＧＳＧＳＧ（配列番号１７５）であるか、ＧＳＧＳＧ（配列番号１７５）を含む。

別の態様では、ＧＳＧＳＧ（配列番号１７５）は、２つのＸの間の配列Ｂと配列Ａとの間に存在する。

更に別の態様では、グリシン残基とセリン残基の順序又は数は、配列番号１７５で示すペプチド配列内で変更されている。限定するものではない例として、(2)(c)又は(2)(d)の配列は、ＧＳＳＳＧ（配列番号１７６）、ＧＳＳＧＳ（配列番号１７７）又はＧＧＳＧＧ（配列番号１７８）のいずれかであるか、これらを含んでいてもよい。

いくつかの態様では、Ｂのいずれか一方又は両方の(2)(c)又は(2)(d)のアミノ酸配列は、はっきりとした二次構造を欠くか、又は、ターン若しくはランダムコイルの二次構造を有する。

いくつかの態様では、Ａのいずれか一方又は両方は、５の連続するアミノ酸である。

いくつかの態様では、５の連続するアミノ酸は、野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸８９～９３の配列と同一の配列である。

いくつかの態様では、
a) Ｘの間のＡが５の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＢが少なくとも７の連続するアミノ酸である；
b) Ｘの間のＡが６の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＢが少なくとも６の連続するアミノ酸である；
c) Ｘの間のＡが７の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＢが少なくとも６の連続するアミノ酸である；
d) Ｘの間のＡが８の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＢが少なくとも６の連続するアミノ酸である；
e) Ｘの間のＡが９の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＢが少なくとも６の連続するアミノ酸である；又は
f) Ｘの間のＡが１０の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＢが少なくとも６の連続するアミノ酸である。

いくつかの態様では、
a) Ｘの間のＢが６の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡが少なくとも６の連続するアミノ酸である；
b) Ｘの間のＢが７の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡが少なくとも５の連続するアミノ酸である；
c) Ｘの間のＢが８の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡが少なくとも５の連続するアミノ酸である；
d) Ｘの間のＢが９の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡが少なくとも５の連続するアミノ酸である；
e) Ｘの間のＢは１０の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡは少なくとも５の連続するアミノ酸である；
f) Ｘの間のＢが１１の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡが少なくとも５の連続するアミノ酸である；又は
g) Ｘの間のＢが１２の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡが少なくとも５の連続するアミノ酸である。

本発明は、この発明のポリペプチド及び担体を含む組成物も提供する。

いくつかの態様では、ポリペプチドは治療上又は予防上有効な量で存在し、担体は薬学的に許容される担体である。

本発明は、修復をＣＸＣＲ４＋細胞に依存する組織又は細胞の再生を促進することで緩和される状態に苦しむ対象又は前記状態を発症する危険性がある対象を処置する方法であって、前記組織又は細胞の再生を促進する量のこの発明のポリペプチド又は組成物を対象に投与することを含み、すなわち、必要とする対象におけるこの発明の医薬組成物の治療又は予防有効用量を達成する方法も提供する。

いくつかの態様では、状態は急性損傷である。

現在の好ましい態様では、急性損傷から５時間以内、好ましくは４時間以内、より好ましくは３時間以内、更により好ましくは２時間以内、最も好ましくは１時間以内にポリペプチドを投与する。

いくつかの態様では、状態は慢性の状態である。

いくつかの態様では、ポリペプチドを、毎日、毎週、毎月又は毎年、繰り返して投与する。

いくつかの態様では、急性損傷は心筋梗塞である。いくつかの態様では、組織は、心臓の組織又は心筋である。

いくつかの態様では、急性損傷は、脳卒中、脊髄の損傷又は末梢神経の損傷である。

現在の好ましい態様では、ポリペプチドを心筋梗塞後５時間以内に投与する。いくつかの態様では、心筋梗塞から５時間以内、好ましくは４時間以内、より好ましくは３時間以内、更により好ましくは２時間以内、最も好ましくは１時間以内にポリペプチドを投与する。

現在の好ましい態様では、ポリペプチドを、脳卒中、脊髄の損傷又は末梢神経の損傷後５時間以内に投与する。いくつかの態様では、脳卒中、脊髄の損傷又は末梢神経の損傷から５時間以内、好ましくは４時間以内、より好ましくは３時間以内、更により好ましくは２時間以内、最も好ましくは１時間以内にポリペプチドを投与する。

いくつかの態様では、急性損傷は、骨折、関節置換又は骨癒合である。いくつかの態様では、組織は骨である。

いくつかの態様では、急性損傷は、骨格筋損傷、関節損傷又は靭帯損傷である。

いくつかの態様では、状態は肝臓の損傷に関係する。いくつかの態様では、組織は肝組織である。

いくつかの態様では、慢性の状態は、非アルコール性脂肪性肝疾患、肝硬変又は感染性肝炎である。

いくつかの態様では、慢性の状態は、脳又は中枢神経系の他の部分の損傷に関係する。

いくつかの態様では、慢性の状態は、パーキンソン病、認知症、多発性硬化症、運動ニューロン疾患又は末梢神経損傷である。

いくつかの態様では、慢性の状態は慢性の関節損傷に関係する。

いくつかの態様では、慢性の関節損傷は、炎症性関節炎又は変形性関節症である。

いくつかの態様では、状態は肺の損傷に関係する。

いくつかの態様では、急性損傷は、肺のウイルス感染、肺の細菌感染、肺の真菌感染又は肺の機械的損傷である。

いくつかの態様では、肺のウイルス感染は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS-CoV-2）感染である。

いくつかの態様では、機械的損傷は人工呼吸器による損傷である。

いくつかの態様では、慢性の状態は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患又は気腫である。

いくつかの態様では、状態は腸に関係する。

いくつかの態様では、急性損傷は腸の術中損傷である。

いくつかの態様では、慢性損傷は、炎症性腸疾患、クローン病又は潰瘍性大腸炎である。

いくつかの態様では、状態は皮膚の損傷に関係する。

いくつかの態様では、急性損傷は、熱傷又は皮膚の術中損傷である。

いくつかの態様では、慢性の状態は、皮膚潰瘍、糖尿病性潰瘍、静脈潰瘍、動脈潰瘍又は褥瘡性潰瘍である。

いくつかの態様では、状態は膵臓に関係し、細胞は膵島細胞である。

いくつかの態様では、状態は糖尿病である。

いくつかの態様では、状態は化学療法後の好中球減少症で、組織は骨髄である。

いくつかの態様では、急性損傷は化学療法で、必要に応じて、化学療法を実施する前又は実施後５時間以内にポリペプチドを投与する。

いくつかの態様では、ポリペプチドを急性損傷の前に投与する。

いくつかの態様では、ポリペプチドを急性損傷の後に投与する。

いくつかの態様では、状態は腎不全で、組織は腎臓組織である。

いくつかの態様では、慢性の状態は慢性腎不全を引き起こす疾患である。

いくつかの態様では、急性損傷は待機手術で、手術の前、手術中又は手術後５時間以内に、ポリペプチドを投与する。

いくつかの態様では、急性損傷はスポーツ又は戦闘による損傷である。

いくつかの態様では、慢性の状態は慢性的な骨格筋の状態である。

いくつかの態様では、慢性的な骨格筋の状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋肉減少症又は廃用症候群などの筋ジストロフィーである。

用語
本発明の理解を促進するために、別途明細書で明示的に説明する場合を除き、以下の各用語は、以下に説明する意味を有する。

この明細書では、「操作された」とは、天然に存在する化合物を変更に基づいて製造した非天然の化合物を意味する。操作されたポリペプチドには、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸に対応するアミノ酸、及び天然に存在するポリペプチドのアミノ酸とは同一性又は位置が異なるアミノ酸が含まれてもよい。そのような操作されたポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドの「アナログ」又は「誘導体」ともいう。

この明細書では、「幹細胞」は、造血幹細胞を含むがこれには限定されない、体内で多数の異なる細胞型に発達する可能性がある、未分化の細胞を意味する。

この明細書では、「有効量」という用語は、所望の結果を達成できる、例えば状態又はそれに関連する１以上の症状（例．急性又は慢性の組織の損傷）を緩和できる、本発明のポリペプチドの量を意味する。本発明に従って投与される化合物の具体的な量は、当然ながら、状態を治療又は予防する特定の方法、例えば、投与経路、対象の生理学的状態及び治療する状態の重症度、によって決まる。例えば、対象に投与される操作されたＨＭＧＢ１ポリペプチドは、好ましくは、治療又は予防有効量の操作されたＨＭＧＢ１ポリペプチドを含む組成物の形態である。

「薬学的に許容される」という語句は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、又は他の問題若しくは合併症を伴わず、妥当なリスク／ベネフィット比に見合った、ヒト及び動物に使用するのに好適な化合物、材料、組成物又は剤形を指す。この明細書では、「薬学的に許容される担体」という語句は、薬学的に許容される材料、組成物又はビヒクル、例えば、液体若しくは固体のフィラー、希釈剤、賦形剤又は溶媒封入材料を意味する。特定の薬学的に許容される担体の選択は、十分に当業者の知識の範囲内である。したがって、利用できるさまざまな好適な担体があり、医薬組成物において日常的に使用されている。

この明細書では、「１つの」という用語は、列挙した成分の「１つ以上」を指すことを理解されたい。

この明細書では、提示する全ての数値範囲は、両端の点と、文脈と一致して、範囲の両端の点の間に含まれる全ての数字を明示的に含めることを意図している。

更に限定するものではない詳細を、以下の「実験の詳細」の項に記載しているが、これは本発明の理解を助けるために記載するもので、開示する本発明の範囲を限定することを決して意図するものではなく、またそのように解釈されるべきではない。

実験の詳細
結果
ＣＸＣＬ１２結合に関与するＨＭＧＢ１内のアミノ酸及びモチーフの特定
炎症促進性シグナル伝達を排除するために、変異又は欠失可能なＦＲ－ＨＭＧＢ１の残基を検討する前に、ＣＸＣＬ１２との結合に関与するアミノ酸及びモチーフをマッピングすることが不可欠である。ペプチドＳＰＯＴアレイを使用し［42］、標的タンパク質（ＨＭＧＢ１）のうちの１つの配列をカバーする重複ペプチドのＣＸＣＬ１２に結合する能力について、免疫ブロッティングで評価した。２つの主要な結合部位を特定した（図２Ａ及び図２Ｂ）。第１のものは、各ＨＭＧボックスの、α－ヘリックスＩとヘリックスＩＩの一部を包含し（ボックスＡのペプチド１～３、ボックスＢのペプチド５～６）、グリチルリチン結合部位と重複していた［43］。第２の領域（ボックスＡのペプチド４及びボックスＢのペプチド７）は、α－ヘリックスＩＩＩのＣ末端側の半分に位置していた。それぞれのＨＭＧボックスにおいて、第１のＣＸＣＬ１２結合ペプチド（ヘリックスＩ及びＩＩ）は、スポットの強度がはるかに大きく、ＣＸＣＬ１２に対する高い親和性の可能性を示した。

次に、ＣＸＣＬ１２相互作用に直接的に寄与するアミノ酸を特定するために、ＣＸＣＬ１２結合ペプチド内のそれぞれのアミノ酸をアラニンに置換した第２のペプチドアレイを作り出した。これにより、いくつかの残基の重要な役割が確認された（図２Ｃ及び図２Ｄ）。ＣＸＣＬ１２は、ＨＭＧボックスのヘリックスセグメントと相互作用することのみを示す公開されているデータ［44 - 46］とは対照的に、それぞれのボックスの可動性Ｎ末端の隣接領域の一部（Ｄ_－４－Ｐ－Ｘ－Ｘ_－１、下付きの数字は、各ＨＭＧボックス中の最初の残基に対する相対的な位置（ボックスＡではＰｒｏ９、ボックスＢではＰｒｏ９４）を示す）及びＣ末端の残基（ボックスＡではＩｌｅ７８～Ｐｒｏ８０、ボックスＢではＡｌａ１６３～Ａｓｐ１６８）も、関与することが判明した（図２Ｅ）。これは、ＣＸＣＬ１２ペプチドをＨＭＧＢ１への結合についてプローブした逆ペプチドアレイ（図１１）で確認された。全長ＦＲ及び３Ｓ－ＨＭＧＢ１は、ＣＸＣＬ１２のβシート全体をカバーする配列を含むペプチドに結合し、一方、隣接する可動性領域を含まないＨＭＧＢ１ボックスコンストラクト単独（（８～７８ボックスＡ）又は（９４～１６２ボックスＢ））［47］が、βシートのＮ末端鎖をカバーするペプチドとのみ相互作用した。

これらの可動性領域の役割を更に確認するために、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して、ＣＸＣＬ１２と異なる境界を有するＨＭＧＢ１コンストラクトの結合を評価した。隣接領域を有するＨＭＧボックス全体を含む完全なＨＭＧボックスコンストラクト（ボックスＡではＨＭＧＢ１の１～８８、ボックスＢではＨＭＧＢ１の８９～１７４）［48］、及び、コアＨＭＧボックスのみを有し、可動性の隣接残基を有さないヘリックスのみのＨＭＧボックスコンストラクト（ＨＭＧＢ１の９－７８、ＨＭＧＢ１の９４－１６２）のいずれかを作り出した。これらを、完全長ＨＭＧＢ１コンストラクト（１－２１４）である、ＦＲ－ＨＭＧＢ１及び非酸化（３Ｓ）－ＨＭＧＢ１と比較した。なお、後者は野生型タンパク質のＣＸＣＬ１２結合特性を有する［14］。予測したように、ヘリックスのみのコンストラクトは、その大きな解離速度に起因して、インタクトな隣接領域を有する完全なＨＭＧボックスコンストラクトと比較して、ＣＸＣＬ１２との親和性及び結合能が低かった。これとは対照的に、ＣＸＣＬ１２の、完全長のＦＲ－ＨＭＧＢ１、完全長の３Ｓ－ＨＭＧＢ１及び完全ＨＭＧボックスコンストラクトに対する親和性は互いに同等で、ヘリックスのみのコンストラクトに対する親和性よりも高かった（図２Ｅ及び図２Ｆ）。

ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４及びＲＡＧＥ結合に関与するＨＭＧＢ１中のアミノ酸及びモチーフの特定
次に、炎症促進性受容体（ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４及びＲＡＧＥ）に対してＨＭＧＢ１ペプチドアレイをプローブした。非特異的結合を説明するために、ベイトしていないアレイの正規化したシグナルをベイトしたアレイから減算した。ＴＬＲ－２は、ＨＭＧＢ１のボックスＡ及びボックスＢ中のペプチド（ＨＭＧボックス（図１Ｂ）中のグリチルリチン結合部位と一致［49］）に結合することが判明した（図３、セクションＡ）。さらに、ＴＬＲ－２は、２つのボックスの間のリンカー領域、ＨＭＧＢ１の酸性テールに直接隣接するペプチド、及び各ＨＭＧボックスのＣ末端領域にも結合し、ＣＸＣＬ１２に結合する残基を超えて拡がった。興味深いことに、ボックスＡ内のＴＬＲ－２に対する結合界面は、酸化の際にねじれて［50］異なる３Ｄ立体配置をとるαヘリックス（図４、セクションＡ）内にある。

ＴＬＲ－４に結合するペプチド（図３、セクションＢ）は、ボックスＡが酸化された場合にのみ連続する結合ポケット（図４、セクションＡ）をボックスＡ内に形成する。これには、脱脂されたＬＰＳ結合セグメントとボックスＡ内の脂質Ａ結合領域に隣接する領域を含む［51］。

ＲＡＧＥについてのスポットアレイデータ（図３、セクションＣ）は、ＲＡＧＥ活性を調節することが以前に示されたペプチドの役割［39, 52］（図４、セクションＣ）、すなわち、１４９－１８２位の間のＲａｇｅ拮抗ペプチド（ＲＡＰ）、及びボックスＡのヘリックス２におけるカスパーゼ－１活性化部位の役割を確認した。しかし、活性がＨＭＧＢ１のカスパーゼ－１切断後にのみ見られた以前の研究［39］とは対照的に、全長のボックスＡでは、ボックスＡ部位が溶媒にアクセス可能であることと、その位置が酸化によるボックスＡ中のヘリックス２の屈曲の影響を受けることを観察した。

まとめると、これらのデータは、３つの炎症促進性受容体とＨＭＧＢ１の結合では、各ＨＭＧボックス中の異なる領域が関与し、ボックスＡの空間配置は酸化に依存していることを示す。加えて、ボックス間のリンカーの配列及び酸性テールのＮ末端側の配列の親和性は、３つ全ての炎症促進性受容体で高い。したがって、これらの配列の置換又は欠失は、これら全ての炎症促進性受容体との結合を効果的に減少させる。

ＣＸＣＬ１２は、ペプチドアレイ及びＮＭＲが示すように、各ＨＭＧボックスの下側の凹部ポケットに結合する（578）
次に、ＮＭＲを使用して、構造上の観点から、ＣＸＣＬ１２の結合に関与するＨＭＧＢ１内のアミノ酸残基を確認した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１９４～１６２及び８９～１７４、並びに３ＳＨＭＧＢ１１～１８４を使用して、隣接領域がある又はないＨＭＧボックスを表した。７５０ＭＨｚにおいて３Ｄスペクトルの完全なセット（^１５ＮＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ／ＮＯＥＳＹ及び関連する^１５ＮＨＳＱＣスペクトル）を取得するのに必要とされる時間は、後者の酸化をもたらすので、天然の全長ＦＲ－ＨＭＧＢ１の代わり非酸化性３Ｓ－ＨＭＧＢ１を使用した。

ＨＭＧＢ１ボックスＢ９４～１６２のＣＸＣＬ１２滴定（図５Ａ）は、ペプチドアレイにおいて特定されたＣ末端及びＮ末端の結合領域において、複数の残基の、累積化学シフト摂動（ＣＳＰ）又はピーク高さ（Ｉ／Ｉ_０）の変化をもたらした。隣接領域を含むボックスＢのコンストラクトについては、中央値ＣＳＰ及び平均体積変化の両者が有意に高く、これらの隣接領域におけるいくつかの残基（Ｄ９０、Ｇ１６５、Ｋ１６６）は、ＣＸＣＬ１２結合に関与することが確認された。ヘリックスのみ（９４～１６２）のコンストラクトにおいてＣＸＣＬ１２結合の影響を受けず、ペプチドアレイにおいてＣＸＣＬ１２結合に関与しているとして特定された、例えば、Ｙ１５４、Ｄ１５７及びＩ１５８といった残基は、完全ＨＭＧボックスコンストラクト（８９－１７４）で有意なＣＳＰを示し、隣接領域が存在する場合に、結合が改善されたことを示した。加えて、隣接領域を有するコンストラクトにおいて、ペプチドアレイでは特定されていなかった残基（Ａ１４７、Ｍ１３１、Ａ１６９、Ｋ１７２、Ｇ１７３）でＣＳＰ変化を観察した。これまでに特定されていなかったが、ペプチドアレイにおいて可能性として重要であるとしてフラグが付された他の残基は、ＣＸＣＬ１２の添加時にＣＳＰ変化又は体積変化を示さなかった（Ｃ１０５、Ｅ１０７、Ｙ１０８）。したがって、これらの群の残基は、ＣＸＣＬ１２にとって重要ではないとして再分類された。驚くべきことに、公開されているデータ［53］とは対照的に、ボックスＢコンストラクトの残基Ａ１００、Ｉ１１２、Ｌ１１９及びＡ１３６は、有意なＣＳＰ変化をもたらすことができなかったが、これらのうちのいくつかに非常に近い残基（Ｓ９９、Ｋ１１３）は、影響を受けた。

３Ｓ－ＨＭＧＢ１１～１８４でＮＭＲ実験を繰り返した場合、ＣＸＣＬ１２添加時のＣＳＰの変化は、低いシグナル対ノイズ比のために、ほとんどの残基で検出の閾値を下回った。しかし、いくつかの残基に対し、ＣＳＰ変化の中央値を超える結合を依然として観察できた。ＨＭＧボックスＢに対応する残基は、ボックスＡにおけるものと比較して、ＣＳＰ変化が全体的に弱かった。これは、ボックスＢの大きな結合速度及び解離速度と一致する流動性の高い平衡を表す可能性がある（図２Ｆ）。これにより、ペプチドアレイで特定されたボックスＡの残基Ｈ３０、Ｄ３２又はＳ３４等を、偽陽性として示すことも可能となった（図１１）。ボックスＢ８９～１７４のＫ８９は、ＣＳＰが高かったが、これは、Ｎ末端から３番目の残基（ＴＥＶ切断後の残りのＮ末端残基、Ｓｅｒ－Ｍｅｔ）である。３ＳＨＭＧＢ１１～１８４を用いた実験では、可動性リンカーの中央部にある場合、ＣＳＰは増加しなかった。したがって、ボックスＢ単独におけるこの残基に関連する変化は、Ｎ末端の位置に関連する可能性があり、高い立体構造的可動性を許容する可能性がある。

ＣＸＣＬ１２結合を保持し、同時に炎症促進性シグナル伝達を排除する、二重のボックスＢＨＭＧＢ１コンストラクトの設計
ペプチドアレイ、アラニン置換及びＮＭＲのデータを組み合わせて、ＨＭＧＢ１のＮＭＲ構造にマッピングし（図６Ａ及び図６Ｂ、ＰＤＢ２ＹＲＱ）、ＣＸＣＬ１２との結合に関与する残基を特定した。それらは、各ＨＭＧボックスの下側に凹状のポケットを形成することが判明した。これらの２つのポケットには、ＨＭＧＢ１－ＣＸＣＬ１２結合を阻害するグリチルリチンの結合部位も含まれる［43］。驚くべきことに、各ＨＭＧボックス内のＣＸＣＬ１２と相互作用するペプチドの分布が、２つのＨＭＧボックスで類似しており、ほぼ同じ結合ポケットを形成する（図６Ｂ）。さらに、ＨＭＧボックスＡとボックスＢは、１つのＣＸＣＬ１２モノマーと同等の親和性で結合でき、ＣＸＣＬ１２モノマーの結合は２つのボックスのドメイン間の協力を必要としない。これとは対照的に、炎症促進性受容体との結合には、２つのボックスのドメイン間の協力を必要とする。そこで、我々は、ボックスＡを別のボックスＢに置換した（すなわち、１～８８を８９～１７４で置き換えた）操作されたＨＭＧＢ１コンストラクトは、２つのＣＸＣＬ１２モノマーに効果的に結合してＣＸＣＲ４膜二量体を提示するが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４又はＲＡＧＥを介してシグナル伝達できないという仮説を立てた。ボックスＢ（１７５－１８４）におけるＲＡＧＥ結合配列を欠失させることで、ＲＡＧＥに結合する傾向を更に減少させた。ボックスＡの配列をボックスＢと置きかえることは、ＬＰＳグリカン結合ペプチドを、ＬＰＳ脂質Ａ結合ペプチドと置きかえることでもある［51］。したがって、この操作されたコンストラクトｄＢＢ１２Ｌ（図６Ｃ）は、天然のＨＭＧＢ１タンパク質の以下のセグメントから構成されていた：可動性Ｎ末端側領域（ＨＭＧＢ１８９～９３に由来）、第１のボックスＢ（ＨＭＧＢ１９４～１６２に由来）、天然のボックスＢのＣ末端側の１２個の残基のリンカー（ＨＭＧＢ１１６３～１７４に由来）、及び第２のボックスＢ（ＨＭＧＢ１９４～１６２に由来）。このｄＢＢ１２Ｌにおける１２残基のリンカーは、天然のＨＭＧＢ１のリンカーにおける１０個のアミノ酸と類似し、ＣＸＣＬ１２との結合でＣＳＰが変化した残基１７２及び１７３を含む。

示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）及び溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）測定を行い、ネイティブ質量分析法（ネイティブＥＳＩ／ＭＳ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、さまざまな緩衝液の条件で、ｄＢＢ１２Ｌ及び野生型ＨＭＧＢ１の熱安定性を比較した。ｄＢＢ１２Ｌは、２つのＨＭＧボックスドメインを含み、Ｃ末端側酸性テールを含まない、ＦＲ－ＨＭＧＢ１１～１６４との安定性及び表面荷電プロファイルが同様であった。さまざまな緩衝液中での熱安定性の傾向は、全てのコンストラクトで同様で（図７Ａ）、等電点（ｄＢＢ１２Ｌ又は１－１６４のテールなしコンストラクトについては９．９、ＦＬ－ＨＭＧＢ１については６）付近のｐＨの緩衝液ではＴｍ_５０が低下した。全てのコンストラクトは、ＰＢＳ、精製緩衝液及び生理食塩水溶液において、同等に安定で、Ｔｍ_５０は約５０℃であった。しかし、ＦＲ－ＨＭＧＢ１／ＦＲ－ＨＭＧＢ１１～１６４では、ｄＢＢ１２Ｌと比較して、最適なイオン強度とｐＨが異なることが観察された。ネイティブＥＳＩ／ＭＳにおいて、３つ全てのＨＭＧＢ１コンストラクトは、同様の荷電状態分布を有し、主要な種としてのコンパクト型モノマー、及びより高いＳＡＳＡの拡張型モノマーの立体構造を有していた（図７Ｂ及び図７Ｃ）。拡張型モノマーは、テールのないコンストラクトにおいて、又はより高いイオン強度で一般的であった。ネイティブＥＳＩ／ＭＳで観察された平均モノマーＳＡＳＡ値（図７Ｃ）は、ＳＥＣ又は公開されているＮＭＲ構造（ＰＤＢ２ＹＲＱ、ＨＭＧＢ１１～１６４）に由来するものと一致した。コンパクト型ＦＬ－ＨＭＧＢ１モノマーのＳＡＳＡは、水中でのＦＬ－ＨＭＧＢ１の計算モデルと一致した［46］。最大１８０日間の保管は、ＳＥＣプロファイル（常に等しいＲＶで単分散）、分解又は凝集に影響を及ぼさなかった（図７Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ｄＢＢ１２Ｌが臨床的に関連する溶液中で天然のＦＲ－ＨＭＧＢ１と折り畳み及び安定性が同様であることを示す。

ｄＢＢ１２Ｌコンストラクトは、ＲＡＧＥに対する親和性が大幅に低減し、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４を介してシグナル伝達できない
次いで、ｄＢＢ１２Ｌが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４シグナル伝達、及びＲＡＧＥ結合を減少させ、ＨＭＧＢ１が媒介する再生を維持するかどうかを評価した。ＲＡＧＥのシグナル伝達アッセイが確立していないため、リアルタイム動態（ＢＬＩ）及びエンドポイントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＨＭＧＢ１とＲＡＧＥの結合を評価した。ＥＬＩＳＡによる親和性の測定（図８Ａ）では、平衡状態で、３Ｓ－、ＦＲ－及びＤＳ－ＨＭＧＢ１は同じ量のＲＡＧＥに結合し、ＤＳ－ＨＭＧＢ１及び３Ｓ－ＨＭＧＢ１の親和性は、ＦＲ－ＨＭＧＢ１よりも有意に高いことが示された。対照的に、ｄＢＢ１２ＬはＲＡＧＥに結合しなかった。別の３つのＨＭＧＢ１コンストラクト：インタクトなＲＡＧＥ結合ペプチド及び酸化型ボックスＡを有するが、酸性テールを有さず、したがって、ＲＡＧＥ結合の全ての必要条件を有する、ＤＳ－ＨＭＧＢ１１～１８４；ＲＡＧＥ結合ペプチドの大半を欠失しているが、酸化型ボックスＡを保持する、ＤＳ－ＨＭＧＢ１１～１６４；及びＤＳ－ボックスＡ単独、を試験した。ＤＳ－ＨＭＧＢ１１～１８４はＲＡＧＥに結合したが、全長ＤＳ－ＨＭＧＢ１と比較して能力及び親和性が低減していたことが判明した。ＤＳ－ＨＭＧＢ１１～１６４のＲＡＧＥ結合能は、全長ＤＳ－ＨＭＧＢ１と比較して、大幅に減少したが、依然としてｄＢＢ１２Ｌより高く、一方でＤＳボックスＡ１～８８（隣接領域を有する完全ＨＭＧボックスコンストラクト）は、ＲＡＧＥと結合できなかった。

ＢＬＩを使用した動態分析は、２つの例外を除き、ＥＬＩＳＡの結果と一致した（図８Ｂ）。ＢＬＩ（図８Ｃ）では、ＤＳ－ＨＭＧＢ１１～１８４は、ＤＳ－ＨＭＧＢ１よりも親和性が低かったＥＬＩＳＡと比較して、解離速度がわずかに速かったにもかかわらず、他の全てのコンストラクトよりもＲＡＧＥ結合親和性がはるかに高かった。３Ｓ－ＨＭＧＢ１は、ＤＳ－又はＦＲ－ＨＭＧＢ１と同等の量のＲＡＧＥに結合し、親和性はＦＲ－ＨＭＧＢ１に類似したが、全体的な動態速度ははるかに遅く、一方でＥＬＩＳＡでは、親和性及び結合能力はＤＳ－ＨＭＧＢ１と同等であった。両者のアッセイにおける、ＦＲと比較したＲＡＧＥに対するＤＳ－ＨＭＧＢ１の高い親和性は、より速い結合速度（ｋ_ｏｎ）に起因し、一方で解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、これらの２つの酸化還元形態でほぼ同一であった。対照的に、結合速度がＤＳ－ＨＭＧＢ１に近いｄＢＢ１２Ｌは、非常に速い解離速度のため、結合が非常に不安定であった。ＤＳ－ＨＭＧＢ１１～１６４も、ｄＢＢ１２Ｌ－ＨＭＧＢ１よりも結合親和性が高いにもかかわらず、全長ＤＳ－ＨＭＧＢ１よりも親和性が全体的に低く、ＲＡＧＥ結合平衡が速かった。ｄＢＢ１２Ｌでは、ボックスＢで置換することによる、ボックスＢの最後の１０個の残基（１７５～１８４）とボックスＡにおけるジスルフィド架橋の欠失により、ＲＡＧＥとの結合が不安定となった。

ＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＲＡＧＥに結合し、全ての受容体からのシグナル伝達は、ＮＦ－κβ経路に収束する［25］。その結果、下流の炎症促進性サイトカイン産生がそれぞれの受容体によるとすることは困難である。したがって、最初に、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４のいずれか、及び両者の共受容体が発現するように操作したＮＦ－κβレポーター細胞系を使用して、ＴＬＲ特異的シグナル伝達を評価した。ジスルフィドＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ２（図８Ｄ）及びＴＬＲ４（図８Ｅ）を介してＮＦ－ｋＢシグナル伝達を促進した。対照的に、ｄＢＢ１２Ｌは、いずれの細胞型においてもシグナル伝達できなかった。次に、初代ヒト単球に対するさまざまなＨＭＧＢ１コンストラクトの作用を確認した。ＤＳ－ＨＭＧＢ１は、リポテイコ酸（ＬＴＡ）などのＴＬＲ２リガンドと相乗作用して炎症促進性シグナル伝達を促進することが報告されている［32］。我々は、ＤＳ－ＨＭＧＢ１が、ＬＴＡと相乗作用して、ＬＴＡ又はＤＳ－ＨＭＧＢ１単独よりも高いＴＮＦ産生を促進したことを確認した。対照的に、ｄＢＢ１２Ｌ又はＦＲ－ＨＭＧＢ１は、この相乗作用を示さず、培地のみの場合よりも高いＴＮＦ分泌を誘起できなかった（図８Ｆ）。ＤＳ－ＨＭＧＢ１とＴＬＲ４リガンドであるＬＰＳを用いた相乗応答については、説明されていない。ＬＰＳを組み合わせた場合、ＤＳ－ＨＭＧＢ１は、初代ヒト単球によるＴＮＦの発現を、ＬＰＳ単独の場合と同程度に促進した。対照的に、ＦＲ－ＨＭＧＢ１又はｄＢＢ１２Ｌは、単独で、ＴＮＦ産生を促進しなかった。しかし、ＬＰＳと組み合わせた場合、ＦＲ－ＨＭＧＢ１又はｄＢＢ１２Ｌは、ＬＰＳ単独と比較して、ＴＮＦの発現を低減させた。

まとめると、これらのデータは、ｄＢＢ１２Ｌが、同種リガンドの存在下であっても、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４を介してシグナル伝達せず、ＲＡＧＥに対する親和性を大幅に低下させ、ＬＰＳを介した炎症促進性シグナル伝達を減少させることを示す。

ｄＢＢ１２Ｌコンストラクトは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１に匹敵する再生促進活性を示す
遠位損傷は、幹細胞をＧ_{Ａｌｅｒｔ}に移行させることが、以前に示されている［13］。したがって、最初に、骨格筋幹細胞の、ＦＲ－ＨＭＧＢ１又は対側肢の損傷に対するトランスクリプトーム応答を比較した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１又は遠位損傷によって上方制御及び下方制御される遺伝子は、非常に類似しており（図１０Ａ）、上方制御される主要な経路は、ミトコンドリア代謝、酸化的リン酸化及び細胞周期を含む、Ｇ_{Ａｌｅｒｔ}と関連するものであった（図１０Ｂ）［8, 13］。興味深いことに、ＣＸＣＲ４は最も高度に上方制御された遺伝子の１つであった。

次に、骨格筋損傷の検証済みのモデルマウス［8, 13］を使用して、ＦＲ－ＨＭＧＢ１のin vivoでの最適な治療用量を求めた。最大の応答が０．７５ｍｇ／ｋｇ（２９ｎｍｏｌ／ｋｇ）で得られ、これより高い用量では再生活性が更に改善しなかったことが判明した（図７Ｃ）。損傷後にin vivo投与する最適な時期も評価した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１は、損傷の最大で５時間後までに注入した場合、修復を促進するのに有効であることが判明した（図１０Ｄ）。次に、静脈投与後の血液中のＦＲ－ＨＭＧＢ１の半減期を調べた。初期の急速なクリアランス（ｔ_１／２約１１分）、続く緩徐なクリアランス（ｔ_１／２約１２０分）が判明した（図１０Ｅ）。これは、ヒトにおける２５分という半減期と一致し［54］、このタンパク質は、ハプトグロビンに結合することによってクリアランスされる［55, 56］。

ＦＲ－ＨＭＧＢ１は、損傷後に幹細胞及び前駆細胞のＧ_{Ａｌｅｒｔ}への移行を促進することで、骨格筋、骨及び血液の再生を加速させることを、我々は以前に示している［8］。哺乳動物の心臓の前駆細胞集団は少数で［57］、損傷後の新しい心筋細胞の大半は既存の心筋細胞に由来する［58］。再生を常在性幹細胞及び前駆細胞に依存しない組織に対するＦＲ－ＨＭＧＢ１の有効性を確認するために、ＦＲ－ＨＭＧＢ１の投与が、心臓再生に効果があるかどうかを評価した。心筋梗塞時における静脈内注入により、生存率が向上し（ＰＢＳ対照の５２％と比較して、ＦＲ－ＨＭＧＢ１で治療したマウスでは８３％）（図１０Ｆ）、５週間の連続的ＭＲＩスキャンによる評価で、梗塞サイズが約６０％低減し（図７Ｈ）、全体的な左室駆出率が１６％改善した（図７Ｇ）ことが判明した。

次に、in vivoでの骨格筋再生の促進におけるｄＢＢ１２Ｌの有効性を、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と比較して評価した。最適用量（２９ｎＭ／ｋｇ）のＦＲ－ＨＭＧＢ１又はｄＢＢ１２Ｌを注入したマウスは、中心核を有する再生筋線維の平均断面積の増加で判定した場合に、損傷後に同様に再生の加速を示した（図１０Ｊ）［8, 13］。これは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１について以前に述べられた［8］ように、１４日目に最も顕著であった。

最後に、再生プロセスにおけるＨＭＧボックス間の可動性領域の役割を評価した。第一に、野生型ヒトＦＲ－ＨＭＧＢ１のこのリンカー領域における変化がタンパク質の安定性に影響を及ぼすか否かを試験した。リンカーのアミノ酸残基数を１３以下に減少させることによって、Ｔｍ_５０が減少することが判明し、このことは、リンカーの長さがタンパク質の折り畳みと安定性において重要な役割を果たすことを示す。さらに、リンカー領域の最初の２つのプロリンの欠失により、発現が完全に抑止された。このことは、リンカーの長さがタンパク質の折り畳みと安定性も支配する可能性が高いことを示す。次いで、さまざまなリンカーを有するコンストラクトのin vivo再生活性を試験した（図）。リンカー全体の欠失（Δ７９～８８）により再生活性が喪失し、最初の４つのリンカー残基（Δ７９～８２）の欠失では、再生活性がいくらか喪失することが判明した。中央領域の欠失（Δ８４～８８）により組織再生は完全に喪失したが、驚くべきことに、残基８４～８８を一般的な可動性アミノ酸残基の配列で置換すると、再生活性が完全に回復した。第２のボックスＢドメインの前のＤＰＮＡペプチドの置換も、再生活性に悪影響を及ぼした。

考察
ＨＭＧＢ１を組織修復治療薬として使用するためには、改変が必要である
固体臓器の修復を促進するための外因性幹細胞を投与する治療法は、当初の見込みを達成できておらず［6, 59］、死滅した細胞も、免疫応答を引き起こす効果がある［60］。別の、可能性としてより効果的なアプローチは、常在性幹細胞及び前駆細胞を含む内因性の再生修復プロセスを標的とすることである［61, 62］。プロスタグランジンデヒドロゲナーゼの阻害は有望なアプローチである［7］が、臨床に移行するまでには時間がかかった［63］。成長因子の投与も行われたが［64, 65］、in vivoでのタンパク質分解によって制限される［66］。現時点では、複数の組織の再生を促進し、修復を加速させる治療薬は承認されていない。

我々は、常在性幹細胞及び前駆細胞が、組織損傷時に放出される適切な活性化因子に容易に反応して修復できる場合、ＦＲ－ＨＭＧＢ１の外因性投与が、これらの細胞をＧ_{Ａｌｅｒｔ}に移行させることで、骨、骨格筋及び血液の再生を加速させるのに有効であることを以前に示している［8］。一方、損傷部位における局所的なＦＲ－ＨＭＧＢ１からＤＳ－ＨＭＧＢ１への変換を裏付けるin vivoの証拠が蓄積されている［18, 19］。したがって、有害な炎症促進性シグナル伝達の可能性により、天然のＦＲ－ＨＭＧＢ１を治療薬として使用することはできない。ＤＳ－ＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ４［29, 35］、ＴＬＲ２［32, 33, 35］又はＲＡＧＥ［37, 67］を介してシグナル伝達することでＮＦ－κβに集中し［25, 68］、炎症促進性サイトカインの相乗的発現をもたらす［69, 70］。したがって、治療薬としてのＨＭＧＢ１の開発は、３つ全ての受容体を介したシグナル伝達を排除するように分子を操作することに大きく依存する。

ボックスＡ及びボックスＢは独立してＣＸＣＬ１２に結合する
ＦＲ－ＨＭＧＢ１の再生活性は、ＣＸＣＬ１２とのヘテロ複合体の形成及びＣＸＣＲ４を介したシグナル伝達に大きく依存する。ＣＸＣＬ１２がＨＭＧボックスに結合することは知られているが［44, 71］、関与する構造モチーフは不明である［53, 72］。このシグナル伝達が、走化性を促進するＣＸＣＬ１２モノマーのホモ二量体に関与するかについても不明である［73 - 75］。フォワードペプチドアレイ（図２Ａ及び図２Ｂ）及びリバースペプチドアレイ（図１１）、アラニン置換アレイ（図２Ｃ及び図２Ｄ）、並びにＮＭＲ実験（図５Ａ及び図５Ｂ）のデータを組み合わせることで、ＨＭＧＢ１－ＣＸＣＬ１２相互作用に関与する残基が特定できた［76］。我々は、ボックスＡ及びボックスＢの下側の凹状ポケットを占める、ＣＸＣＬ１２に結合するＨＭＧＢ１ペプチドの共通パターンを特定した。ＢＬＩを使用して（図２Ｅ及び図２Ｆ）、ＣＸＣＬ１２結合におけるＢＬＩによる隣接する可動性領域の役割を同定した。さらに、ＣＸＣＬ１２二量体化を防止するために［77］、ＢＬＩ及びＮＭＲ実験でＨＥＰＥＳ緩衝液を使用したので、各ボックスが、ボックスドメイン間の連携を必要とせずにＣＸＣＬ１２モノマーに結合でき、ＣＸＣＬ１２の二量体化が複合体形成の必要条件ではないと、我々は結論付けた。

再生促進特性を完全に保持しながら、ＴＬＲ－２若しくはＴＬＲ－４を介してシグナル伝達せず、又はＲＡＧＥと結合しない、操作されたｄＢＢ１２Ｌコンストラクトの設計
我々は、ＴＬＲ－２結合に関与するＨＭＧＢ１中の領域のＨＭＧボックスにおいて同様の反映が認められた（図３セクションＡ及び図４セクションＡ）が、ＨＭＧＢ１のジスルフィド形態は、ＴＬＲ－２を介してシグナル伝達する能力が高いことを見いだした（図８Ｄ及び図８Ｆ）。このことは、ＣＸＣＬ１２（還元された分子中の２つの同じＨＭＧボックス）とは異なり、ＴＬＲ－２シグナル伝達には、２つの異なるＨＭＧボックス（還元型立体構造と酸化型立体構造）が必要であることを示す。ＴＬＲ－４は、酸化型ＨＭＧＢ１ボックスＡに優先的に結合することが長い間知られていた。我々は、ＬＰＳ結合セグメント（１～１５、８０～９６）と重複し、ボックスＡが酸化された場合にのみ連続するＨＭＧＢ１上のＴＬＲ－４に対する明確な結合ポケットを特定した。酸性テール及びボックスＡの酸化がＲＡＧＥ結合を増強する前に、ＲＡＧＥとの結合は、ボックスＡ及びＢに加え、インタクトな配列を必要とする。興味深いことに、全ての場合において、ＨＭＧＢ１のリンカー領域は、炎症促進性受容体との結合に関与しているようである。

この詳細な理解により、ＣＸＣＬ１２結合を維持しながら、ＴＬＲ４、ＴＬＲ２及びＲＡＧＥを介した炎症促進性シグナル伝達を排除するコンストラクトの設計が可能となった。このコンストラクトは、野生型ＨＭＧＢ１（ｄＢＢ１２Ｌ）と同様の長さのリンカーによって分離されたタンデムの２つのＨＭＧボックスＢドメインからなった。ｄＢＢ１２Ｌ中にボックスＡが存在しないことで、酸化が妨げられ、したがって、ＴＬＲ－２（ヘリックス３の回転）、ＲＡＧＥ（ヘリックス２の屈曲）及びＴＬＲ－４（連続結合表面）で観察される結合界面の再配列が妨げられ、一方で、２つのボックスＢドメインを介した２つのＣＸＣＬ１２モノマーとの結合を可能となる。我々は、ｄＢＢ１２Ｌは、１～１６４ＦＲ－ＨＭＧＢ１又は全長ＦＲ－ＨＭＧＢ１と同様に安定で、長期間の保管時に凝集も分解もないことを見いだした。

ＤＳ－ＨＭＧＢ１は、単独で結合でき、ＴＬＲ４／ＭＤ－２を介してシグナル伝達できる［28］が、ＬＰＳに結合し、ＴＬＲ４／ＭＤ－２への伝達及び認識を促進するＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）と置換することによって、ＬＰＳを介したシグナル伝達を促進できる［51］。本発明のｄＢＢ１２ＬコンストラクトにおけるボックスＡの欠失は、ＴＬＲ４を介したシグナル伝達を効果的に排除した。興味深いことに、我々は、ＦＲ－ＨＭＧＢ１及びｄＢＢ１２ＬがＬＰＳに応答して、単球でＴＮＦ発現を減少させることを観察した。培地の血清に存在する［78］残留ＬＰＳを効果的に置換できるＤＳ－ＨＭＧＢ１［51］とは異なり、これは、これらのタンパク質がＬＰＳに結合するが、酸化型ボックスＡの欠如に起因して、ＬＰＳをＴＬＲ４／ＭＤ２に伝達できないことに起因する可能性がある。

ＨＭＧＢ１がそれ自体でＴＬＲ２シグナル伝達を誘導できるのか［34, 35］、それとも、活性を誘導するために共リガンドを必要とするか、また、この応答がタンパク質の酸化還元状態に依存するかどうかについて［32, 33］、論議がある。入手できるデータ［32, 33］は、ＨＭＧＢ１は単独でＴＬＲ－２を介してシグナル伝達できるが、高い応答を誘導するためには共リガンドが必要であることを示唆する。我々は、ＤＳ－ＨＭＧＢ１が、単独でＴＬＲ２を介してシグナル伝達でき、その作用が血清含有培地中のＬＴＡの存在で増強されることを見いだした。しかし、ＬＴＡと相乗作用しないＦＲ－ＨＭＧＢ１又はｄＢＢ１２Ｌに対する応答はなかった。これは、ＴＬＲ４と同様に、ＴＬＲ２が媒介する応答にはジスルフィド架橋を有する酸化型ボックスＡが必要であること、及びＴＬＲ２共リガンドが、可能性として酸性テールを転置させてＴＬＲ２相互作用を促進することにより、ＤＳ－ＨＭＧＢ１と相乗作用することを示唆する。

ＨＭＧＢ１内のＲＡＧＥ結合ペプチド（残基１４９～１８２）は、以前に説明されている［37］。同様のモチーフはＳ１００タンパク質のような他のＲＡＧＥリガンドにも存在し、これらの配列と相同なペプチドは、ＨＭＧＢ１が媒介するＲＡＧＥシグナル伝達の有効なアンタゴニストである［38, 52］。ＨＭＧＢ１の酸性テールは、ＲＡＧＥ結合ペプチドと残基が共通しており［40］、ＴＬＲ２結合におけるその役割と類似して、ＲＡＧＥ相互作用の調節因子として提案されている。しかし、ＨＭＧＢ１のジスルフィド形態のみが、ＲＡＧＥを介した血栓形成促進活性に関連付けられている［36］。我々は、活性化にカスパーゼ－１プロセシングが必要と考えられていたボックスＡのＲＡＧＥ結合ペプチド［39］が、溶液中では、インタクトなＨＭＧＢ１内で露出され、ジスルフィドが酸化されてその立体構造を変化させることを観察した。我々は、ｄＢＢ１２Ｌを含め、完全なＲＡＧＥ結合ペプチド１４９－１８２が欠如しているコンストラクトは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＲＡＧＥに結合できないことを見いだした。ＤＳ－ＨＭＧＢ１とは対照的に、また興味深いことには、３Ｓ－ＨＭＧＢ１も、ＦＲ－ＨＭＧＢ１よりも良好にＲＡＧＥに結合できた。我々のＢＬＩのデータは、ＲＡＧＥに対する親和性は、ＦＲ－ＨＭＧＢ１及びＤＳ－ＨＭＧＢ１と比較してｄＢＢ１２Ｌでは低いことを示した。ｄＢＢ１２Ｌは、おそらく、このコンストラクトにおける２つの部分的なＲＡＧＥ結合ドメインの存在のために、結合速度がＦＲ－ＨＭＧＢ１の３倍で、解離速度は５倍であった。ＥＬＩＳＡのデータは、平衡時の結合状態を表し、会合速度と解離速度のバランスを反映する。例えば、ＢＬＩではＦＲ－ＨＭＧＢ１と同様のＲＡＧＥに対する親和性を有する３Ｓ－ＨＭＧＢ１は、その解離速度がＦＲ－ＨＭＧＢ１又はＤＳ－ＨＭＧＢ１よりもはるかに遅いことに起因して、ＥＬＩＳＡでは、ＤＳ－ＨＭＧＢ１と同様に、はるかに高い見かけの親和性を示す。このＲＡＧＥ結合の増加は、心筋梗塞のモデルマウスで見られる対照と比較した線維症の増加を部分的に説明できるが、一方で、ＦＲ－ＨＭＧＢ１は、再生を促進させ、機能を向上させた［31］。ＨＭＧＢ１とＲＡＧＥの結合には２つの異なる結合部位が必要である可能性が高く、そのうちの１つは酸化状態に応じて変化することを、他の研究者もＳＰＲを使用して示している［20］。我々は、ＢＬＩを使用したＤＳ－ＨＭＧＢ１のＲＡＧＥに対する親和性（Ｋ_ｄ＝０．２～１．３μＭ）が、３Ｓ－ＨＭＧＢ１に対する高い親和性も報告する、ＳＰＲを使用して以前に報告されたもの（０．１［79］～０．６５μＭ［36］）に類似することを見いだした。ＢＬＩデータは、酸性テールの消失が、結合速度の大幅な増加により、ＨＭＧＢ１のＲＡＧＥに対する親和性を増加させ、一方で、ＲＡＧＥ結合ペプチドの短縮又はボックスＡの還元は、解離速度を大幅に増加させたことを示す。興味深いことに、酸化型ボックスＡ単独ではＲＡＧＥに結合できず、このことは、相互作用が、ＲＡＧＥ結合ペプチドによって完全に安定化されていることを示唆し、酸性テールは、ＲＡＧＥ結合ペプチド内の残基との競合により、この結合を負に制御する［40］。ｄＢＢ１２ＬにおけるボックスＡの不在とＲＡＧＥ結合ペプチドの短縮は、ＲＡＧＥ親和性を大幅に低減させる。

骨格筋幹細胞においてＦＲ－ＨＭＧＢ１によって誘導されるトランスクリプトームの変化は、遠位損傷によって誘導されるものに非常に類似しており、ＨＭＢＧ１によるＣＸＣＲ４発現の上方制御は、その作用を増強させる可能性がある。損傷から５時間以内にＦＲ－ＨＭＧＢ１を投与した場合にのみ有効であることを示す我々のデータは、それが幹細胞をＧ_{Ａｌｅｒｔ}に移行させることによって作用することと一致する。これよりも後の時点で、幹細胞は、完全に活性化されている［80］。我々は、ｄＢＢ１２Ｌが、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と同等にin vivoにおける再生活性を保持していることを確認した。重要なことに、我々は、心筋梗塞の際に静脈に投与したＦＲ－ＨＭＧＢ１が、生存率を改善し、梗塞サイズを減らし、左室駆出率を改善したことを見いだした。これらのデータに基づいて、我々は、ｄＢＢ１２Ｌの投与が、修復を幹細胞に依存する組織（例．骨、骨格筋、血液）、及び、再生を心筋細胞のような成熟細胞集団に主に依存する組織の再生も促進すると予測する。我々は、ｄＢＢ１２Ｌは、損傷後５時間以内に投与した場合に有効である可能性が高いと予測する。米国では、ＭＩ後に入院するまでの中央値が３時間である［81］ことから、この点は重要である。米国では、毎年約８０万人が心筋梗塞を患い［81］、約２０％が心不全となる。米国における心不全の医療費は、2012年には３００億ドルを超え、2030年までに７００億ドルに増加する見込みであるにもかかわらず、５年生存率は約６０％にすぎず、ほとんどのがんよりも悪い［81］。我々のデータに基づき、発症から５時間以内のｄＢＢ１２Ｌの投与が、心筋梗塞の患者の生存率を高め、梗塞サイズの低減と駆出率の維持により、心不全の発生率及び重症度を低減させると予測する。梗塞の４時間後に梗塞周囲領域の心筋にＦＲ－ＨＭＧＢ１を直接注入することが、心臓修復を促進するのに有効であることを、マウス［31, 82, 83］及びヒツジ［84］モデルで示す研究がある。静脈内投与は、臨床用途に容易に適用可能であるため、その有効性を示す我々のデータは重要である。

さまざまなリンカーの長さとリンカーの置換を有するコンストラクトを使用する我々のデータに基づいて、類似の活性プロファイルを有するｄＢＢ１２Ｌに対する別のコンストラクトも設計できる。これらは、以下の変形が含まれる可能性がある。

1) 本発明の二重のボックスＢコンストラクト中の第２のＢボックスのＣ末端の１６９～１７４位に相当する残基（すなわち、配列番号２で示す配列の残基１６７～１７２である「ＡＡＫＫＧＶ」）は、以下の3) で説明するように、完全に欠失されるか、置換される。我々は、二重のボックスＢコンストラクト中の第１のＢボックスドメインのＣ末端の等価な残基を置換することが、ＴＬＲ－２への結合の可能性の排除に更に役立つと想定している。

2) 本発明の現在のｄＢＢ１２Ｌコンストラクトは、第１のボックスＢドメインのＣ末端における天然のＨＭＧＢ１配列の１６３～１７４位に対応する１２アミノ酸残基を有する。ＣＸＣＬ１２結合に重要であることが見いだされた第２のＢボックスのＮ末端における追加の５アミノ酸により、ボックス間の全リンカー長は１７アミノ酸となる。リンカー長が１３アミノ酸残基未満のコンストラクトは、再生活性と熱安定性が低く、分子の折り畳みが不安定である。したがって、最適なリンカー長は１３～２０アミノ酸であると予測される。リンカーが短いコンストラクトの再生活性の喪失は、２つのＣＸＣＬ１２モノマーをＣＸＣＲ４二量体に提示する適切な立体構造となることができないことに関連する可能性がある。

3) リンカーの欠失は、欠失の位置に応じて再生効果が変化する：残基７９～８２（ボックスＢの最初を含む１１残基）の欠失で、分子の再生効果が減少し、残基８４～８８の欠失で、再生活性は完全に失われた。ボックスＡのＣ末端に続くボックス間リンカーにおけるアミノ酸８４～８８の一般的な可動性アミノ酸の配列（ＧＳＧＳＧ（配列番号１７５））による置換が、in vivoにおける再生活性に悪い影響を及ぼさないことも見いだした。我々のペプチドアレイ又はＮＭＲでは、この領域はＣＸＣＬ１２結合に関与していなかった。したがって、本発明の次世代分子では、この領域は、以下の改変を有する１３～１７残基のリンカーで置換できる。

a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１の１６８～１７４位に相当する残基（リンカー中の最後の７残基）のいずれか又は全ての、以下のいずれかによる置換。この領域が、非特異的な二次構造、コイル－ターン構造又はαヘリックスコンフォメーションのいずれか（最初の２つが好ましい）を採用できるようなアミノ酸のランダムな配列。アミノ酸の置換（例．Ｌｙｓ＜－＞Ａｒｇ、脂肪族から脂肪族への置換）。Ｇｌｙ－Ｓｅｒのような可動性のアミノ酸配列［85］、又はＰｒｏのようなターン誘導残基。溶解性を改善する荷電残基。

b) １６３～１６７位に相当するいずれか、若しくは全ての残基の、a)の選択肢のいずれかによる置換、又は個々の残基の点欠失。しかし、野生型ＨＭＧＢ１のこの領域に相当する残基の置換又は欠失により再生活性が低下したので、Ｋ１６４、Ｇ１６５又はＫ１６６の置換はＣＸＣＬ１２結合能に影響を及ぼす可能性があると予測される。したがって、これらは、化学的により類似する残基で置換する必要があると考えられる。

c) Ｄ－Ｐ－Ｘ－Ｘモチーフを含む、ボックスＢの直前の５アミノ酸中のいずれか、又は全ての残基の置換。これにより、いくらかの再生活性が失われたが、この領域は、第３のαヘリックスに対して平行に位置するので、ＨＭＧボックスの可動性の延長としてのみ必要とされる可能性がある。

上記のアミノ酸配列は、ＣＸＣＬ１２の、リンカーの変更を含む改変したＨＭＧボックスドメインへの結合能を保存することを最優先の目的として、炎症促進性活性を（例えば、ＲＡＧＥ、ＬＰＳ、及び他のＤＡＭＰ／ＰＡＭＰに対する親和性を更に低下させるために、特定のエピトープを除去することによって）低下させること、タンパク質の安定性と折り畳みを改善すること、又は化学的官能化（例．クリックケミストリー又は非天然アミノ酸）を導入することを意図して設計される。ＨＭＧボックスのコアドメインの大幅な改変も可能であるが、ＨＭＧボックスドメイン、したがってＣＸＣＬ１２結合のポケットの構造を破壊する可能性が高い。

我々のデータは、ＣＸＣＬ１２との結合に関与するペプチドはボックスＡ及びボックスＢに反映されているが、各ボックス及び隣接ドメインは、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４又はＲＡＧＥとの結合に関与することから、これは炎症促進性受容体には当てはまらないことを示している。ｄＢＢ１２ＬにおけるボックスＡ及びそのＣ末端リンカーの欠失は、３つ全ての炎症促進性受容体を介するシグナル伝達が存在しないことを説明する。ＴＬＲ－２及びＲＡＧＥの結合とシグナル伝達は、Ｃ末端の酸性テールの前の結合配列の切断、及び酸化型ボックスＡ中の結合領域がボックスＢ中の等価物に置換されるという事実によって更に損なわれる。ボックスＢの表面の配置は、酸化されるとボックスＡとは異なるので、ＴＬＲ４、ＴＬＲ－２又はＲＡＧＥに効果的に結合できない。重要なことに、二重のボックスＢコンストラクトは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と同等の再生活性を維持する。まとめると、これらのデータは、これまでに説明した二重のボックスＢコンストラクトが臨床治療剤として開発できることを示す。

結論として、ＣＸＣＬ１２結合に重要なＨＭＧＢ１の部位をマッピングし、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４を介してシグナル伝達せず、ＲＡＧＥと効果的に結合できないコンストラクト（ｄＢＢ１２Ｌ）を設計した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１は、その半減期が短いにもかかわらず、遠位損傷と類似する様式で、幹細胞をＧ_{Ａｌｅｒｔ}に移行させ、損傷後５時間以内に投与した場合に有効である。さらに、ｄＢＢ１２Ｌは、in vivoにおいて、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と同程度の有効性で組織再生を促進する。したがって、ｄＢＢ１２Ｌは、臨床移行が可能である。

要約
還元型高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）タンパク質は、ＣＸＣリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）に結合し、ＣＸＣ受容体４（ＣＸＣＲ４）を介してシグナル伝達し、幹細胞及び前駆細胞をＧ_{Ａｌｅｒｔ}に移行させることにより、組織再生を促進し、修復を加速させる。しかし、ＦＲ－ＨＭＧＢ１のジスルフィド形態（ＤＳ－ＨＭＧＢ１）への局所的な変換は、Ｔｏｌｌ様受容体２及び４並びに終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）を介したシグナル伝達により、有害な炎症をもたらす可能性がある。したがって、ＨＭＧＢ１の臨床適用を検討する場合、分子を操作して、これらの有害となる可能性のある炎症促進性作用を排除することが重要である。

我々は、ペプチドアレイ、バイオレイヤー干渉法及び核磁気共鳴の組合せを使用して、ＨＭＧＢ１－ＣＸＣＬ１２ヘテロ複合体の形成に関与する残基を特定した。さらに、我々は、ペプチドアレイを使用して、ＴＬＲ－２、ＲＡＧＥ、ＴＬＲ－４の結合に必要なペプチド配列を明示した。これらのデータに基づいて、我々は、２つのＨＭＧＢボックスをタンデムで含むコンストラクト（ｄＢＢ１２Ｌ）を設計した。これは、再生能力、安定性及び立体構造が野生型の完全還元型ＨＭＧＢ１と同様で、それらの共リガンドの存在下であっても、ＴＬＲ－２又はＴＬＲ－４を介してシグナル伝達せず、ＲＡＧＥ結合が大幅に減少している。我々は、同様の属性を有する他の一連の二重のボックスＢ構造についても説明する。

特許及び文献の包括的な考察により、ＴＬＲ４のシグナル伝達を防止するためのシステインのセリンによる置換を記載する米国特許出願公開第2015/0203551号が特定された；しかし、このコンストラクトは、ＭＩ後に心臓線維症を過剰に引き起こすことが示されている［14］。さらに、このコンストラクトは、ＲＡＧＥの解離がＦＲ－ＨＭＧＢ１と比較して遅く、図８Ｂに示すように、平衡後にＲＡＧＥが長く結合したままとなり、したがって、これらの置換は、本発明のコンストラクトでは回避した。米国特許出願公開第2009/0069227号（A9）は、幹細胞の遊走と増殖を促進するＨＭＧＢ１コンストラクトは、アミノ酸１～１８７（本願では０～１８６、０位はＮ末端のＭｅｔ）を含む必要があることを明記しており、米国特許第9,623,078号は、心臓再生のためのアミノ酸１～４４（本願では０～４３）に限定するペプチドを言及している。米国特許出願公開第2009/0202500号は、組織修復方法を開示しているが、全長（１～２１５）野生型ＨＭＧＢ１（本願では０～２１４）にしか言及していない。この明細書で提示するｄＢＢ１２Ｌコンストラクトは、ＲＡＧＥ結合もＴＬＲ４／２シグナル伝達もなく、アミノ酸長が１１７で、これまでに記載されていないアミノ酸置換を含む。したがって、この明細書で提示するコンストラクトは、先行技術の範囲に含まれない。

臨床応用
本発明は、内因性の再生プロセスを利用して組織修復を増強させるポリペプチド及び方法を提供する。このポリペプチドは、２つのＣＸＣＬ１２分子とヘテロ複合体を形成し、それが、ＣＸＣＲ４、おそらくは細胞表面上の２つの隣接するＣＸＣＲ４受容体を介してシグナル伝達することによって組織再生を促進する、完全還元型の野生型ＨＭＧＢ１と同様に機能する。

我々のデータは、本発明のポリペプチド（ｄＢＢ１２Ｌ）が、類似の様式で作用することを示す。したがって、ｄＢＢ１２Ｌが、修復に関してＣＸＣＲ４＋細胞に依存する組織の再生を促進することが期待される。そのような組織としては、修復が主として幹細胞及び前駆細胞に依存する組織、例えば、骨格筋及び造血系、並びに修復が大部分を既存の成熟細胞、例えば、成体哺乳動物の心臓における心筋細胞に依存する組織が挙げられる。

臨床適応の可能性：
心筋梗塞後の心臓
この適応症は臨床試験に適している。世界的に見て、虚血性心疾患は、１億５３００万人が罹患しており［101］、2017年には１億５００万を上回る障害調整年齢が失われている［102］。毎年、英国では２０．５万人［103］及び米国では８０．５万人が、心筋梗塞（ＭＩ）に罹患し、そのうち３８％が、ＳＴ上昇型ＭＩ（ＳＴＥＭＩ）を経験している［101］。ＭＩ後に、個体のうちのおよそ３０～４０％が、心不全を発症し、世界中で３８００万人が罹患している。2012年の米国における心不全の医療費が３００億ドルを上回り、２０３０年までに７００億ドルに増加する見込みであるにもかかわらず、５年生存率は約６０％にすぎず、これは、ほとんどのがんよりも悪い［101］。主要な標的集団は、ＭＩ後の患者、特に、心不全を発症する危険性にある患者である［104］。心臓損傷を制限し、ＭＩ後の再生を促進し、心不全の発症を予防する新規な治療薬は、罹患率及び死亡率を劇的に低減させ、医療費の負担を著しく低減させる。確実に心筋細胞壊死をもたらす確立されている［105 - 108］恒久的な結紮マウスＭＩモデル［109］を使用した決定的なデータは、損傷時のＦＲ－ＨＭＧＢ１の単回静脈内投薬が、生存率を増強（ＰＢＳプラセボで治療した群における５２％と比較して、ＦＲ－ＨＭＧＢ１で治療した動物では８３％）させ、対照と比較して絶対心臓駆出率を約１６％改善し、５週間のＰＢＳ対照との比較において梗塞サイズが約６０％低減することを示す（図１０Ｆ）。

骨格損傷モデルにおけるＦＲ－ＨＭＧＢ１の最適な用量は、０．７５ｍｇ／ｋｇ（図１０Ｃ）であり、非常に短い半減期にも関わらず（図１０Ｅ）、損傷の最大５時間後に静脈内投与された場合であっても有効である［109］（図１０Ｄ）。心筋梗塞後、虚血心筋の再灌流は、可能な限り早く達成されるべきである。例えば、ＳＴＥＭＩ後の患者は、経皮的介入を受けるべきである。データは、可能な限り早く、かつ最大で損傷後５時間以内でのＨＭＧＢ１の投与が、損傷した心筋を保存し、再生を促進することを示す。

天然のＦＲ－ＨＭＧＢ１は、ＭＩ後に機能的回復を促進するが（図１０Ｆ～１０Ｉ）、ジスルフィド形態への局所的な変換により、血栓形成、並びにＲＡＧＥ、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４を介した伝達が促進される［110］。他者により報告されているコンストラクト、例えば、ＲＡＧＥ結合を保持する３Ｓ－ＨＭＧＢ１（図８Ｂ）は、ＭＩ後の過剰な線維症及び機能障害をもたらす［111］。ＦＲ－ＨＭＧＢ１もまた、ＤＳ－ＨＭＧＢ１よりも程度は低いがＲＡＧＥに結合し、したがって、臨床使用に好適ではない。ＴＬＲ２を介したＨＭＧＢ１のシグナル伝達は、心筋梗塞後の虚血再灌流傷害［112］及び血栓症［110］において重要な役割を果たす。ヒトのアテローム性動脈硬化症におけるＴＬＲ２の重要な役割を、我々は示した［113］。ＴＬＲ４シグナル伝達もまた、心筋再灌流傷害において重要である［114］。心筋梗塞後の損傷した心臓の虚血性及び炎症した微小循環における酸化還元条件は、ＦＲ－ＨＭＧＢ１のジスルフィド形態（ＤＳ－ＨＭＧＢ１）への変換を促進させ、この形態は、血栓症の中心的な媒介因子である［110］。ＭＩ後に心臓再生を促進するための承認された治療法は存在しない。造血幹細胞の再生作用を示すと主張している報告は否定されており［115］、死滅した細胞も、免疫応答を引き起こす効果がある［116］。多能性幹細胞を含む他の細胞型を用いたとしても、不整脈、免疫抑制、拡張可能性、バッチ変動性、送達、長期実現性、及び有効性を含む相当な課題が残っている［115, 117］。細胞に基づく治療法の大規模な臨床研究は、機能の有意な改善を示さず、不整脈が患者において報告されている［118 - 120］。

成体の心臓には多くの幹細胞集団が存在しないこと［121］と、心外膜前駆細胞の数が少ないこと［122］は、損傷後の新しい心筋細胞の大半が既存の心筋細胞に由来すると理解でき、内因性経路の操作による再生の促進に焦点をシフトさせた［121］。これには、複数の転写因子のアデノウイルス形質導入［105,108］、発生経路、例えば、Hippo［106］若しくはMeis1［123］の操作、成長因子、例えば、ニューレグリン［124］、ＩＧＦ／ＨＧＦ［125］、若しくはＦＳＴＬ１［126］の付加、又はｍｉＲＮＡによる操作［127］が含まれる。これらのアプローチは、重大な欠点を有する：アデノウイルス形質導入及び成長因子（ＩＦＧＦ１／ＨＧＦ）は、心臓内注入又は局所パッチによる適用を必要とし（ＦＳＴＬ１）、発生経路の操作は、発癌の危険性があり［128］、ブタにおけるｍｉＲＮＡ１９９－ａのウイルス形質導入は、致命的な不整脈をもたらした［127］。免疫細胞のクリアランスを促進することによる心臓再生の刺激という代わりの戦略は、ＶＥＧＦ－Ｃの反復注入を必要とする［129］。ＭＡＰ４Ｋ４の阻害は、心筋の生存を促進し、梗塞サイズを制限するが、再生作用はなかった［130］。現時点では、これらの戦略はいずれも、臨床試験には進んでいない。

本発明は、心筋細胞の生存及び複数の組織の再生を促進するために内因性プロセスを標的とする固有の解決策を提供する。それは、抗線維性ＣＡＲ－Ｔ細胞［131］を含む細胞療法に関連する多数の障害、例えば、法外な費用［132, 133］を打開する。ＦＲ－ＨＭＧＢ１は細胞表面受容体ＣＸＣＲ４を介して作用するため、例えば、転写因子又はｍｉＲＮＡのアデノウイルス形質導入による、細胞内プロセスを標的とすることに関連するオフターゲット効果を有するとは予測されない。ＨＭＧＢ１阻害は、虚血再灌流傷害後の梗塞サイズを増加させ［134］、一方でＦＲ－ＨＭＧＢ１の局所的な上方調節［135, 136）又は心筋内注入は、マウス［111, 137, 138］及びヒツジ［139］の両者で有効であることが示されているが、我々のデータは、静脈内投与が有効で、全ての標的細胞に到達する可能性がより高いことを示している。有害な炎症促進性シグナル伝達を回避する本発明の操作された二重のボックスＢコンストラクトは安全である。

ミラノのグループは、ＴＬＲ４シグナル伝達を無効にするために３つのシステインがセリンと置きかえられたＨＭＧＢ１アナログ（３Ｓ－ＨＭＧＢ１）を記載している［140］。彼らは、３Ｓ－ＨＭＧＢ１が、組織再生の促進においてＦＲ－ＨＭＧＢ１よりも優れていると主張しているが［141］、我々は、これが当てはまることを見いだしていない［142］。重要なことに、３Ｓ－ＨＭＧＢ１は、マウスＭＩモデルにおいて線維症を促進させ、心機能の悪化を伴い、一方で、ＦＲ－ＨＭＧＢ１は、組織再生を促進させ、左室駆出率を改善した［111］。我々は、３Ｓ－ＨＭＧＢ１が、ＤＳ－ＨＭＧＢ１又はＦＲ－ＨＭＧＢ１よりも長くＲＡＧＥに結合したままとなることを見いだした（図７Ａ）。したがって、ＦＲ－ＨＭＧＢ１、３Ｓ－ＨＭＧＢ１及びＤＳ－ＨＭＧＢ１は、平衡時に同等の量のＲＡＧＥに結合するが、時間の経過により、３Ｓ－ＨＭＧＢ１が結合するＲＡＧＥのレベルは、炎症促進性ジスルフィドＨＭＧＢ１（ＤＳ－ＨＭＧＢ１）に匹敵し、ＦＲ－ＨＭＧＢ１よりも高くなる。本発明の二重のボックスＢコンストラクトは、望ましくない炎症促進性シグナル伝達を排除しながら、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と同等の再生活性を保持する。

他の応用：
骨折
骨折は、損傷後に生じる。しかし、最も一般的な骨格の「損傷」の１つは、関節置換術又は関節形成術である。我々は、ｄＢＢ１２を使用して、骨折又は関節形成術後の治癒を促進し、それによって、合併症の可能性、例えば、コンポーネントの緩みの危険性を低減できることを提案する。

脳及び神経系
ｄＢＢ１２Ｌは、卒中後の患者の予後を改善するために使用してもよい。他の適応症としては、パーキンソン病及び認知症が挙げられる。

肺
ｄＢＢ１２Ｌは、肺の損傷後、例えば、新型コロナウイルス感染後又は特発性肺線維症を有する患者において、予後を改善することが企図される。

肝臓
米国の人口のうちの３０％が、非アルコール性肝疾患に罹患していると推定される。これらのうちの６０％は、非アルコール性脂肪性肝炎を発症し、それらのうちの２０％は、肝硬変を発症する。これらの状態による肝臓損傷を制限し、予防する方法が開発されている。我々は、ｄＢＢ１２Ｌを、これらの方法と組み合わせて使用して、肝臓再生を促進することを提案する。

腸
ｄＢＢ１２Ｌは、炎症を制御するための治療と組み合わせて、例えば、外科手術後又は炎症性腸疾患（例．潰瘍性大腸炎）の患者の、腸の治癒を促進するために使用してもよい。

腎臓
ｄＢＢ１２Ｌは、腎臓の再生を促進し、それによって、可能性としては透析又は腎臓移植の必要性を回避するために使用してもよい。

皮膚
ｄＢＢ１２Ｌは、例えば、外科手術後、熱傷、又は潰瘍（例．糖尿病性潰瘍）の患者の創傷治癒の促進に使用してもよい。

膵臓
ｄＢＢ１２Ｌは、１型糖尿病を有する患者において、膵島細胞の再生を促進することによって、予後を改善するために使用してもよい。

骨髄
ｄＢＢ１２Ｌは、例えば、化学療法後に、造血系の再生を促進し、それによって、重度の生命を脅かす危険性にある好中球減少症を予防してもよい。

我々は、これまでに、ＦＲ－ＨＭＧＢ１が、損傷の最大２週間前に投与された場合でさえも有効であることを示している［142］。ｄＢＢ１２Ｌは、ＦＲ－ＨＭＧＢ１と同等に有効であるため（図１０Ｊ）、このポリペプチドを、予防的に、例えば、戦闘によって、若しくはスポーツによる損傷のために、又は待機的手術若しくは化学療法の前に、使用してもよい。

材料及び方法
大腸菌株
Ｍａｃｈ－１Ｔ１Ｒ細胞（Invitrogen、抗生物質耐性も誘導もなし）、ＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｒ３－ｐＲＡＲＥ２（社内ＢＬ２１誘導体、クロラムフェニコール耐性３６μｇ／ｍＬ、Ｔ７－ポリメラーゼｌａｃ誘導［86］）、及びＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｒ３－ｐＲＡＲＥ２－ＢｉｒＡ（上記ＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｒ３－ｐＲＡＲＥ２のin vivoビオチン化誘導体、スペクチノマイシン耐性を更に有する、５０μｇ／ｍＬ）を、社内で調製した化学的に適合性のあるストックから得た。

細菌培養培地
ＳＯＣ：２０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１８６２ｇ／ＬのＫＣｌをオートクレーブし、４．１３２ｇ／ＬのＭｇＣｌ_２及び２０ｍＭのグルコースを補充。
ＬＢ（Luria Bertani）：１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ７．２、オートクレーブ滅菌。２w/v％の寒天粉末を添加して、ＬＢ寒天プレートを調製した。
ＴＢ（Terrific Broth）：１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４ｇ／Ｌのグリセリン、１２．５ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、２．３５ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、オートクレーブ滅菌。
ＴＢ補充物質：１．６w/v％のグリセリン、１％のグルコース、２５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、１０×微量金属、０．２２μＭで滅菌ろ過。
微量金属溶液：５０ｍＭのＦｅＣｌ_３（１３．５ｇ／Ｌ）、２０ｍＭのＣａＣｌ_２（２．９４ｇ／Ｌ）、１０ｍＭのＭｎＣｌ_２（１．９６ｇ／Ｌ）、１０ｍＭのＺｎＳＯ_４（２．８８ｇ／Ｌ）、２ｍＭのＣｏＣｌ_２（０．４８ｇ／Ｌ）、２ｍＭのＣｕＣｌ_２（０．３４ｇ／Ｌ）、及び２ｍＭのＮｉＣｌ_２（０．４８ｇ／Ｌ）、０．１ＭＨＣｌ中、０．２２μＭで滅菌ろ過。
Ｍ９最少培地：１６ｇ／ＬのＮａ_２ＨＰＯ_４、４ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、１ｇ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ７．２～７．３、及び２．５ｇ／ＬのＦｅＳＯ_４、０．２５ｍｇ／ＬのＺｎＣｌ_２、０．０５ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ_４、０．２５ｇ／ＬのＥＤＴＡ、１ｍＭのＭｇＳＯ_４をオートクレーブし、４ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＵ－９９％ ^１５ＮＨ_４Ｃｌ（Cambridge Isotopes）、０．３ｍＭのＣａＣｌ_２、１．５ｍｇ／ＬのＤ－ビオチン、及び１．５ｍｇ／Ｌのチアミン－ＨＣＬを、滅菌ろ過したストックから補充。

プラスミド
プラスミドは、ＳＧＣライブラリーから得た［86］。全てのプラスミドは、ＴＥＶ－切断部位を有する６×Ｈｉｓタグを含み、ｐＮＩＣ－Ｂｉｏ３及びｐＤｓｂＣ－ＨＴ－ＣＢｉｏは、Ｃ末端ビオチン化エピトープ（終止コドンで除去できる）も有する。プラスミドＤＮＡを、制限酵素消化：ｐＮＩＣ－ＣＴＨＦについてはＢｆｕＡ１（３時間、６０℃）、又はＢｓａＩ（２時間、３７℃）によって線形化した。切断したベクターＤＮＡを、PureLink ＰＣＲキットで精製し、製造業者のプロトコールに従って０．２５ｍＭのｄＧＴＰ（ｐＮＩＣ－ＣＴＨＦ）又はｄＣＴＰの存在下において、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（NEB M0203）で処理した。

クローニング
哺乳動物遺伝子コレクションから入手したＨＭＧＢ１コンストラクト（Ｍａｃｈ１細胞）を、ＰＣＲで増幅した：９５℃／１０分、［９５℃／３０秒、５２℃／１分、６８℃／０．５～１．５分］を２５回、６８℃／１０分のプログラムを使用。反応は、２５μＬの最終体積で、５μＬのヘラクレスＩＩ緩衝液、１μＭのそれぞれのプライマー、６μｇ／ｍＬのプラスミド鋳型、１μＭのｄＮＴＰ混合物、及び１単位のヘラクレスＩＩポリメラーゼ（Agilent 600679、緩衝液及び１００μＭのｄＮＴＰストックと供給）からなっていた。ＰＣＲ産物を、更に使用する前に精製した（PureLinkキット、ThermoFisher K310001）。

増幅させたコーディング配列（アレル）を、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）によって目的のベクターにクローニングした。インサートを、ベクターに使用したものと同種のヌクレオチド（１０μＬの反応体積）の存在下において、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、２μＬを、１μＬの処理済みベクターと混合し、３０分間アニーリングした。４０μＬの氷冷Ｍａｃｈ－１細胞（保管のため）又は２０μＬのＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｒ３－ｐＲＡＲＥ２／ＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｒ３－ｐＲＡＲＥ２－ＢｉｒＡ細胞（発現のため）を添加し、４２℃で４５秒間、熱ショックを与えた後、氷中で冷却した。５％スクロース及び抗生物質を有する選択培地に播種する前に、３７℃で２時間、ＳＯＣ培地において回収を行った。２４時間後に陽性クローンを採取し、製造業者のプロトコールに従って正しい分子量のバンドに特異的なシーケンシングプライマー対を用いて、ＭｙＴａｑポリメラーゼでスクリーニングした。陽性形質転換体を、抗生物質を有する１ｍＬの２× ＬＢ（２倍濃度のＬＢ）において一晩増殖させ、－８０℃において１２v/v％グリセリン中でストックした。

３Ｓ－ＨＭＧＢ１変異体配列を類似の方法で生成した。ＰＣＲを別個に行って、Ｓ２３－Ｓ４５及びＳ１０６フラグメントを生成し、これらを、ＰＣＲによってアニーリングし、５μＬのそれぞれの精製されたＰＣＲ産物を、この反応におけるプライマー及び鋳型の代替物として用いた。この方法を図１７にまとめる。

ＣＸＣＬ１２コンストラクトを、成熟タンパク質のＮ末端側のインフレームＳＵＭＯプロテアーゼ部位を用いてクローニングして、ｐＤｓｂＣ－ＨＴ－ＣＢｉｏベクター（DsbC-SUMO-CXCL12）におけるＮ末端融合タンパク質の周辺質分泌を可能にし、その活性に影響を及ぼし得るタンパク質へのＮ末端残基の付加を回避しながら［87, 88］、ＤｓｂＣ融合タンパク質系を介してフォールディングされた酸化型ＣＸＣＬ１２を得た［89］。各コンストラクション、境界、発現株及び塩基対／アミノ酸配列に使用するプライマー及びベクターの詳細な表は、Supplemental Methodsの項に示した。全ての変異体を、シーケンシングによって検証した（SourceBioscience）。ＨＭＧＢ１－ｄＢＢの配列は、大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３ゲノム（アセンブリASM956v1）に従って、ボックスＢ８９～１７４の配列をコドン最適化し、天然のＨＭＧＢ１ボックスＢ配列の後に配置することによってin silicoで設計し、Twist Bioscience（San Francisco, USA）でin vitroで合成し、ｐＮＩＣ－ＣＴＨＦにクローニングした

組換えタンパク質の発現
新しい寒天プレートストリークから増殖させたＨＭＧＢ１発現株の形質転換体の一晩培養物２０ｍＬを、補充物質を有する１ＬのＴＢ（又はＭ９）培地に播種し、０．４５ＲＣＦ回転振盪で３７℃において最大ＯＤ２．０（Ｍ９培地についてはＯＤ０．６）まで増殖させた。^１５Ｎ標識したＨＭＧＢ１の産生に使用した予備培養物は、まず、１０００ＲＣＦで５分間回転沈降させ、Ｍ９培地で洗浄した。これを、標的ＯＤに達するまで増殖させ、１８℃に冷却した後、０．５ｍＭ又は０．２５ｍＭのＩＰＴＧ（それぞれ、ＨＭＧＢ１及びＣＸＣＬ１２タンパク質について）を添加し、１６時間増殖させた後、４０００ＲＣＦで採取した。ビオチン化タンパク質については、ＰＢＳ中の１０ｍＭのＤ－ビオチンを添加した後、誘導し、更に１時間後に細胞採取した。

組換えＨＭＧＢ１の精製
誘導したＨＭＧＢ１発現細胞のペレットを、１：１０００のプロテアーゼ阻害剤（Calbiochem Set III, Merck 539134）、３μｇ／ｍＬのベンゾナーゼ－ＭＢＰ、１ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．５ｍｇ／Ｌのリゾチーム（Sigma L6876）及び０．５v/v％のTriton（登録商標）X100を補充した１ＭのＮａＣｌ、５％のグリセリン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１０ｍＭのイミダゾール（緩衝液Ａ）中に、１４ｇ／Ｌで再懸濁させた後、－８０℃で凍結し、この時点以降、全ての工程は４℃で行った。解凍したペレットを、６７８０ＲＣＦで４５分間回転沈降させ、上清を、事前平衡処理したニッケル－Ｈｉｓ GraviTrap（GE Healthcare）の１ｍＬのカラムにロードした。滴下後に、カラムを、１０ＣＶの１ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、並びに１．５ＣＶの０．４ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＳＯ_４、及び３μｇ／ｍＬベンゾナーゼ－ＭＢＰ溶液で洗浄して、残りのＤＮＡを３０分間消化させた。混入物を、３０ｍＭのイミダゾールを補充した１５ＣＶの０．５ＭＮａＣｌ、５％グリセリン、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５（緩衝液Ｂ）で洗浄した後、２．５ｍＬの緩衝液Ｂ＋５００ｍＭイミダゾールを用いてＰＤ－１０カラム（GE Healthcare、緩衝液Ｂ＋２０ｍＭイミダゾールにおいて平衡処理）に直接溶出した。タンパク質を、３．５ｍＬの緩衝液Ｂ＋２０ｍＭイミダゾールを用いてカラムから溶出させた後、１：２０ＯＤのＴＥＶ－ＧＳＴプロテアーゼを用い、１６時間かけてタグを除去した。

カラム（緩衝液Ｂ＋２０ｍＭイミダゾールにおいて平衡処理）にタンパク質溶液を再循環させることによって、除去した。ビオチン化タンパク質については、ストレプトアビジン－ＸＴ樹脂を代わりに使用してビオチン化分子のみを選択し、樹脂と３０分間インキュベーションした後、試料を滴下させ、３０ＣＶの緩衝液Ａ及び１ＣＶの緩衝液Ｂ＋１００ｍＭＤ－ビオチンで洗浄し、３ＣＶの同じ緩衝液における２時間インキュベーションによって、溶出させた。タンパク質を、生物物理学的研究用には１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５＋１５０ｍＭＮａＣｌ、細胞及び動物の研究用には細胞培養グレードのＰＢＳで、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Superdex S75 10/300－流速０．３５ｍＬ／分、16/600－流速１．２ｍＬ／分）によって更に精製した。組換えタンパク質は、還元型ＨＭＧＢ１タンパク質の場合には１ｍＭのＴＣＥＰを添加して、保管のために瞬間凍結させた。

組換えＣＸＣＬ１２の精製
ＤｓｂＣ－ＳＵＭＯ－ＣＸＣＬ１２を発現する細胞の外膜を、浸透圧ショックによって溶解させた［90］。ペレットを、１Ｍスクロース、０．２ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、２×cOmpleteプロテアーゼ阻害剤セット（COEDTAF-RO, Roche）、５０ｍＭイミダゾール、及び３μｇ／ｍＬベンゾナーゼ中に、４０ｇ／Ｌで再懸濁させた。これを、室温で４５分間撹拌した後、４体積の氷冷１８．２ｍΩ水を添加し、更に１０分間混合した後、１ｍＭＭｇＳＯ_４を添加した。これを、１６０００ＲＣＦ、４℃で１時間遠心分離し、上清を、１０ｍＬ／分で、Aekta Xpress ＦＰＬＣシステムのＮｉ－ＮＴＡ Superflowカラム（Qiagen, 30761）にロードし、細胞６Ｌごとに１つのカラムを使用した。タンパク質を、緩衝液Ｂにおいてイミダゾール勾配（１０ＣＶにわたって１０～２５ｍＭ、及び８ＣＶにわたって２５～５００ｍＭ）によって溶出させ、１：１０のＯＤのＵｌｐ－１プロテアーゼを添加した後、１００体積の０．２ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８．０（緩衝液Ａｃ）中で一晩透析した。翌日、タンパク質を、CaptoSカラム（CaptoS ImpAct, GE 17-3717-47）に２．３ｍＬ／分でロードし、２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８．０中０．２～１．５ＭＮａＣｌ勾配で溶出して、切断されたＣＸＣＬ１２をＤｓｂＣ及びＵｌｐ－１から分離した。タンパク質を、ＨＭＧＢ１と同じ様式でＳＥＣによって更に精製し、保管のために瞬間凍結させた。

内毒素の除去
内毒素は、全ての事例において、Triton（登録商標）Tx-114を用いた相分離によって、サイズ排除クロマトグラフィーの前に除去した［91］。２v/v％のTX-114を組換えタンパク質溶液に添加し、４℃で２０００ＲＣＦにおいて回転振盪させながら２０分間ホモジナイズし、３７℃で５分間分離した後、界面活性剤相を２５℃で８０００ＲＣＦにおいて１０分間ペレット化した。上清を、５w/v％のＳＭ－２バイオビーズ（BioRad, 152-8920）と混合し、２％のTX-114で２時間清浄し、３０ＣＶのメタノール、３０ＣＶの内毒素を含まない１８．２ｍΩ水、及び３０ＣＶの内毒素を含まないＰＢＳで再生させた。これを、室温で４時間インキュベートして、残りのTriton（登録商標）及びＰＥＧを吸着させた後［92］、滅菌したＳＥＣ系に注入し（１２時間かけて０．５ＭＮａＯＨと接触させ、続いて６時間かけて０．２Ｍ酢酸／２０％エタノールと接触させ、細胞培養グレードのＰＢＳ中で平衡処理）、ポリマー混入物を完全に除去しながら、サイズ排除を行った。Triton（登録商標）及びＰＥＧが存在しないことを、ＥＳＩ／ＱＴＯＦ－ＭＳ質量分析法において、これらの荷電状態種が存在しないことで検証した［93］。組換えタンパク質のＬＰＳ含量を、ＬＡＬ法（GenScript ToxinSensor L000350）によって評価した。試料は、含有するＬＰＳがタンパク質１ｍｇ当たり４ＥＵ未満である場合に、細胞及び動物への使用が承認された。

酵素産生
ＴＥＶ－ＧＳＴプロテアーゼ（ＧＳＴ融合タンパク質）、ベンゾナーゼ－ＭＢＰ及びＵｌｐ－１プロテアーゼを、ＳＧＣコレクションに保管中の形質転換体から産生させた［86］；全ては、２００μｇ／ｍＬのアンピシリン耐性を有していた。ＴＥＶ及びＵｌｐ－１を、ＨＭＧＢ１で説明したプロトコールに従い、ＩＭＡＣ工程で１回だけ精製し、ベンゾナーゼ－ＭＢＰは、ＣＸＣＬ１２と同様に取得した外膜の溶解物から精製し、製造業者のプロトコールに従ってアミロース樹脂（NEB, E0821）を使用して単離した。いずれの事例においても、得られたタンパク質を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．３ＭのＮａＣｌ、１０％グリセリン中で１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。ＧＳＴ－ＴＥＶプロテアーゼ及びＵｌｐ－１を、液体窒素で瞬間凍結させ、精製中に０．５ｍＭＴＣＥＰを補充し、ベンゾナーゼ－ＭＢＰには、５０％グリセリン及び２ｍＭＭｇＣｌ_２を補充し、－２０℃で保管した。

ペプチドアレイ
アラニンスキャン並びに最初のＨＭＧＢ１及びＣＸＣＬ１２アレイでは、元の膜で特定されたペプチドの膜、完全なＨＭＧＢ１配列の膜、又はＣＸＣＬ１２（Uniprot P48061、分泌シグナルを除く）を有する膜を、公開されたプロトコールに従い、必要に応じて、ＳＧＣのSarah Picaud博士が印刷した。膜を、２０～２５℃で、９５％及び７０％エタノールにより再水和し、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ１×、０．０５％ Tween（登録商標）20 ３×）で平衡処理し、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで８時間ブロッキングした。１μＭのパートナーＨｉｓタグ付きタンパク質コンストラクトを添加し（ＰＢＳ中）、４℃で２４時間結合させた。過剰なＢＳＡ及びタンパク質を、ＰＢＳＴで３回の洗浄によって除去し、全ての洗浄は、別途説明しない限り１分間行った。結合したタンパク質を検出するために、膜を、１：３０００希釈のQiagen抗ペンタＨｉｓＨＲＰコンジュゲート（Qiagen 34460）で処理し、過剰な抗体を、ＰＢＳＴ中で２０分間３回洗浄することによって除去した。

ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４及びＲＡＧＥペプチドアレイでは、CelluSpotアレイを代わりに使用した（IntaVis［94］）。膜を、上記のように、ＣＸＣＬ１２又はＩｇＧのＣＨドメイン（530-TR、9149-TR又は1145-RG、BioTechne）と融合した３つのレセプターのいずれかでベイトし、次いで、抗ＣＸＣＬ１２抗体（PA5-17238、Invitrogen）でプローブした。次いで、Ｆｃ融合タンパク質又は抗ＣＸＣＬ１２による結合ＩｇＧを、０．２５μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧのＣＨ２ドメイン抗体（NBP2-68464、ＨＲＰにカスタム結合）で検出した。ヒトＩｇＧのＣＨ２ドメインをカバーする一連のペプチド（Uniprot P01857、１１１～２２３）を対照として使用した：最高強度スポットを１００％シグナル閾値として使用。

全ての場合で、結合した抗体は化学発光（Pierce ECL substrate - 32109）により行った：基質溶液で膜を覆い、２枚の透明なプラスチックシートの間に置いた後、LAS-4000カメラを用い２分間隔で増分画像化した。各膜のペプチドの強度（１００％～０％）をImageJで測定し、対照及びブランクスポットに対して正規化した。アラニンへの変異が、配列中のアラニン位置について観察されたものよりも強度が大きく変化した残基を、ＣＸＣＬ１２結合への重要な寄与因子とみなした。

バイオレイヤーインターフェロメトリー（ＢＬＩ）
事前水和させたストレプトアビジンOctetバイオセンサー（ForteBio 18-5019）を、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ（基礎緩衝液－ＢＢ）に０．５ｍＭＴＣＥＰを加えたものにおけるビオチン化ＨＭＧＢ１タンパク質の４μＭ溶液でコーティングした（６０秒のベースライン、６０秒の結合）。非特異的結合を、動態アッセイの前に、ＢＢ＋１％ＢＳＡ＋０．０５％Tween（登録商標）20（動態緩衝液、ＫＢ）中で３分間インキュベートすることによって最小化させた。ＣＸＣＬ１２との相互作用を、ＫＢ中の漸増ＣＸＣＬ１２濃度（１：２希釈で０～１５０μＭ）の溶液において、センサーの段階浸漬を行うことによって測定した（６０秒のベースライン、５００秒の結合、４２０秒の解離、ＢＢ＋０．５ｍＭＴＣＥＰにおいて１８０秒の還元）。OctetRed 384機器をこれらの実験に使用した。動態データは、DataAnalysis 9.0（ForteBio）を使用して抽出した。平衡時の応答Ｒ_Ｅｑを、ミカエリス・メンテン飽和プロットにおいて濃度に対してプロットして、ｋＤ／Ｂ_ｍａｘ（ｒＥｑに対する濃度の飽和プロット）を計算した。動態速度（結合速度ｋ_ｏｎ及び解離速度ｋ_ｏｆｆ）を、インターフェログラムにおける全ての結合及び解離工程から得られるそれぞれのパラメーターの直接測定から導出し、全ての測定で水平線（平均）にフィッティングした。それぞれの複数回のデータを同じ様式でプールして、全体の平均を計算した。ＨＭＧＢ１へのＲＡＧＥ結合動態を測定するために、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０２％Tween（登録商標）20中の１５μｇ／ｍＬのＲＡＧＥ－Ｆｃを、抗ＩｇＧバイオセンサー（AHC, 18-5060）の表面に３０秒間固定化し、連続濃度のそれぞれのＨＭＧＢ１コンストラクト中に浸漬し（６０秒のベースライン、２００秒の結合／解離）、同じ様式でフィッティングして動態パラメーターを導出した。

核磁気共鳴（ＮＭＲ）
１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．５）（ＢＬＩ実験と同一の緩衝液及びイオン強度）中の^１５Ｎ標識した組換えＨＭＧＢ１コンストラクトに、５v/v％のＤ_２Ｏを補充し、ガラス製パスツールピペットで５ｍｍ Shigeimiチューブにピペッティングし、パラフィンで封止した。最終体積は、３３０μＬを上回った。ＣＸＣＬ１２を、同じ緩衝液に添加し、参照物の改変を回避するように最終体積を調整した。シグナルのロッキング、チューブのシミング、及び核の調整を、Bruker TopSpinソフトウェアによって手動で行った。水のシグナルは、^１Ｈスペクトルをパワーレベル１（Ｐ１）＝推定パルスキャリブレーション（pulsecal）で取得することによって抑制した。単一のピークが観察された場合、初期の４倍のＰ１値をベースラインとして使用し、^１Ｈスペクトルに対称ピークが観察できるまで調整した。ＮＭＲ実験を、これらのキャリブレーション工程の後に行い、^１Ｈ－ＮＭＲ、^１５Ｎ－ＨＳＱＣ、^１５Ｎ－ＮＯＥＳＹ－ＨＳＱＣ、^１５Ｎ－ＴＯＣＳＹ－ＨＳＱＣピークを、^１５Ｎ－ＨＳＱＣスペクトルにおいて、ＨＭＧＢ１１～１８４（BMRB 15418）の公開されているＮＭＲ表に基づいて割り当て、それぞれのコンストラクトについての我々独自のＮＯＥＳＹ／ＴＯＣＳＹデータを分析した。ＣＸＣＬ１２結合を測定するために、特定されたピークの化学シフト位置及び体積を、CCPNMR 3.0 Analyzeの化学シフト追跡モジュールによって、異なるモル当量のＣＸＣＬ１２（これらは、関連する画像に列挙されている）で追跡した。ピーク強度の変化については、それぞれのセットにおける中央値強度変化をベースラインと考えた。完全な化学シフトの表及び実験のパラメーターは、この節の最後に示す。

質量分析法
ＭＳ／ＭＳ及びトリプシン消化によるタンパク質の特定のために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから得られたバンドを切り取り、ＳＧＣオープンアクセスのＭＳプラットフォームに提出し、Rod Chalk博士、Tiago Moreira博士及びOktawia Borkowskaが公開しているように分析した［93, 95］。タンパク質の同一性に注釈を付けるためのデータ分析（ペプチドマッピング）を、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジンを用いて、Ｕｎｉｐｒｏｔ（参照タンパク質配列）及びＳＧＣ（コンストラクト配列）データベースに対して行った。ネイティブＥＳＩ／ＭＳ実験を、３６０μＬ／時で揮発性緩衝液（５０又は２００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５）においてＥＳＩ／ＱＴＯＦ（Agilent Q-TOF 6545）に手作業で注入することによって行った。全イオンクロマトグラムにおいて安定なイオン流が観察された後に、シグナルを、少なくとも１０カウント（３０秒）取得した。変性実験については、説明しているように、０．２％ギ酸中に、試料を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＨＰＬＣ（Agilent 1100 HPLC）によって注入し、ギ酸／メタノールの移動相中に溶出させた［93］。荷電状態のそれぞれの連続的な分布を異なる立体構造と考え、荷電状態（Ｚ）を、
式ｍＷ＝（ｍＷ／Ｚ－プロトン質量）×Ｚ
に割り当てた。表面積を、文献中に提案されている式から導出し［96, 97］、これにより、ネイティブＭＳについては、
式ｌｎ（ＳＡＳＡ）＝ｌｎ（Ｍ／Ｚ）×０．６８９７－４．０６３
及び変性試料については、
式ｌｎ（ＳＡＳＡ）＝ｌｎ（Ｍ／Ｚ）×０．９０２４－５．９０１３
を得た。少なくとも３回の独立した注入を、全てのＭＳ試料で行った。これらの実験における全ての溶液は、ＨＰＬＣ水（電気化学グレード）及び溶媒を用いて調製した。

ＳＥＣ表面積定量
ＳＥＣクロマトグラムを表面積と相関させるために、公知の構造を有する標準セット（BioRad 1511901）を、この実験で使用したSuperdex 75pg、１０／３００カラムに流した。これらに含まれるタンパク質のＳＡＳＡ及びＧＥにより供給されたキャリブレーション曲線標準物は、公開されているＰＤＢ構造（ＢＳＡ、３Ｖ０３；卵白アルブミン、１ＪＴＩ；ミオグロビン、２Ｖ１Ｉ；ＲＮＡｓｅＡ、１Ａ５Ｐ；アプロチニン、１ＮＡＧ；ビタミンＢ１２、３ＢＵＬ）から導出し、非線形最小二乗フィッティングによって保持体積と相関させた（ＳＡＳＡ＝３３１．２×ＲＶ^２－１．１９ｅ４×ＲＶ＋１．０８ｅ５）。ＨＭＧＢ１試料間で比較した全ての実験は、ネイティブＭＳと同じ緩衝液（２００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５）において行い、注入は、シグナルの飽和を回避するために１ｍｇ／ｍＬで行い、全ての試料は、０．４ｍＬ／分で溶出させた。

ＲＡＧＥ結合ＥＬＩＳＡアッセイ
３８４ウェルのタンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート（Santa Cruz Biotechnology, sc-206072）を、それぞれ４つの複製物で、４℃において２４時間、ＦＬ／ＤＳＨＭＧＢ１全長対照及びブランクを含め、ＰＢＳ中４０ｎＭのＨＭＧＢ１コンストラクトの溶液５０μＬ（ＦＲ－ＨＭＧＢ１コンストラクトについては＋０．５ｍＭＴＣＥＰ）でコーティングした。非特異的結合を、２０～２５℃で２時間、ＰＢＳ中１０％のＢＳＡと共にインキュベートすることによって、遮断した。各濃度のＲＡＧＥ－Ｆｃキメラタンパク質（BioTechne, 1145-RG、１：４希釈で０～６４０ｎＭ）を、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に添加し、４℃で２時間結合させた。結合したＦＣキメラを、２０～２５℃で２時間、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：１００００で希釈した抗ヒトＩｇＧＨＲＰ（Agilent Dako P021402-2）と共にインキュベートすることによって検出した。これら３つの工程それぞれの間に、プレートを１００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。

結合した抗体を検出するために、２５μＬのＴＭＢ基質（ThermoFisher N301）をそれぞれのウェルに添加し、ＦＬ－ＤＳ－ＨＭＧＢ１対照が明確な濃度依存性色勾配を発生するまで暗所で顕色させた後、２５μＬの０．５ＭＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。ＯＤ４５０を、読み取り値（FluoStar OMEGA, BMG Labtech）としてorgan測定し、２× ＲＡＧＥ－Ｆｃ濃度（キメラは、ＲＡＧＥ二量体であるため）に対する飽和フィッティングとしてプロットした。

ＴＬＲ４及びＴＬＲ２に媒介されるＮＦ－κＢシグナル伝達レポーターアッセイ
ヒトＴＬＲ２及びＣＤ１４、又はマウスＴＬＲ４、ＭＤ－２及びＣＤ１４を発現するＨＥＫ－Ｄｕａｌ細胞（Invivogen）を、標準的な組織培養条件（３７℃、５％ＣＯ_２）において、１０％ＦＢＳ（Gibco）、１％ L-グルタミン（Gibco）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）を補充したＤＭＥＭ（Gibco）中で維持した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１、ＤＳ－ＨＭＧＢ１及びｄＢＢ１２Ｌが、ＴＬＲ４及びＴＬＲ２シグナル伝達の活性化を誘導するかどうかを判定するために、１０４のＴＬＲ４及びＴＬＲ２ＨＥＫ二重細胞を、９６ウェルプレートのウェルに播種（３回の実験）し、ＴＬＲ２については１０μｇ／ｍＬのｌＨＭＧＢ１及び（Ｘ濃度）ＦＳＬ－１、ＴＬＲ４については１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激した。刺激から２４時間後に、誘導された分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のレベルを測定して、ＮＦ－κβ活性を判定した。

単球総ＮＦ－κＢ分泌アッセイ
ヒト単球（StemCell Technologies）を、標準的な組織培養条件（３７℃、５％ＣＯ_２）において、１０％ＦＢＳ（Gibco）を補充したＤＭＥＭ（Gibco）中で維持した。ＦＲ－ＨＭＧＢ１、ＤＳ－ＨＭＧＢ１及びｄＢＢ１２Ｌが、炎症促進性サイトカイン産生を誘導するかどうかを判定するために、１０^５個のヒト単球を９６ウェルプレートのウェルに播種し（３回の実験）、１０μｇ／ｍＬのＨＭＧＢ１と、５０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ又は１０ｎｇ／ｍＬのＬＴＡで刺激した。刺激から２４時間後に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Abcam）によって、ＴＮＦのレベルを判定した。

トランスクリプトーム分析
マウスを、５０μＬのＰＢＳビヒクル中の３０μｇのＦＲ－ＨＭＧＢ１、又はＰＢＳのみの対照の静脈内注入で、全身処理した。損傷細胞は、以下に説明するように、ＢａＣｌ_２損傷マウスに由来する。Ａｌｅｒｔ細胞は、ＢａＣｌ_２損傷マウスの損傷を受けていない反対側に由来する。マウス筋肉幹細胞（ｍＭｕＳＣ）を、これまでに報告されているプロトコールに従って特定し、新たに単離した。大腿部の筋肉を切り刻み、コラゲナーゼ８００Ｕ／ｍｌ（Worthington-Biochem）及びジスパーゼ１Ｕ／ｍＬ（Gibco）で酵素消化することで、筋肉細胞懸濁液を調製した。その後、全ての懸濁液を、７０μｍ及び４０μｍのフィルタ（Greiner Bio-One）を通過させて、それぞれの抗体で染色した。ｍＭｕＳＣ、ＣＤ３１^－ＣＤ４５^－Ｓｃａ－１^－ＶＣＡＭ１^＋を、BD FACSAria IIIを使用して蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって単離した。新しくＦＡＣＳにより単離したｍＭｕＳＣから抽出したＲＮＡを、Lexogen 3'キットライブラリープレップを使用してＲＮＡ－ｓｅｑ分析に送り、HiSeq400（Illumina）を使用してシーケンシングした。ＦＡＳＴＱファイルを、ＦＡＳＴＱＣを使用して評価し、続いて、kallisto v0.42.4を用いてＴＰＭ値を生成した。ＴＰＭ値を合計して、tximportを使用して遺伝子レベルの発現値を取得し、差次的発現分析を、ＤｅＳＥＱ２で行った。Ｒパッケージ「clusterProfiler」［98］を使用して、ベンジャミニ－ホッホベルグ多重検定調整及び偽発見率のカットオフ０．１を用い、差次的に発現される遺伝子のＧＯ濃縮を行った。Ｒパッケージの「ggplot2」及び「igraph」を使用して視覚化した。

in vivoマウス筋肉損傷モデル
１１～１２週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６近交系マウスをCharles River UKから購入し、Kennedy InstituteのBiological Safety Unit（ＢＳＵ）に収容した。順化期間は１～２週間であった。生きている動物に対して実施する全てのプロトコールは、英国内務省（PPL 30/3330及びPPL P12F5C2AF）と地元の動物施設が指名した者によって承認され、ＡＳＰＡ規制下の適切なプロジェクト及び個人のライセンスの下で登録されている。全ての消耗品は外科用に認定されており、組換えタンパク質はエンドドキシンを含まなかった。手術は、殺処分施設とは別の清潔な環境で行った。全ての動物を、術後６時間、そして、その後３日間毎日モニタリングした；次いで、モニタリングをＮＶＳ／ＮＡＣＷＯに移管した。

以前に記載した［8, 13］ように手術を行った。動物を、エアロゾル化した２％イソフルランで麻酔して鎮痛し、加温パッドに移し、右後肢をポビドンヨードで消毒し、静脈注射を行う場合には尾を７０％エタノールで消毒した。５０μＬの１．２％ＢａＣｌ_２（Sigma）を、前脛骨（ＴＡ）筋の長さ方向に沿って注射し、細胞死を誘導した。マウスを安楽死させ、特定の時間に下肢を切除し、４％パラホルムアルデヒド（Santa Cruz Biotechnology）中で２４時間固定した。ＴＡ筋を切開し、更に２４時間固定した後、パラフィンに包埋し、切片化した。切片（５μｍ）をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、中心核を有する線維を特定し、１０倍の接眼レンズ／４０倍の対物レンズを使用してOlympus BX51で画像化した。１マウスにつき少なくとも４枚の画像から得た繊維の断面積（ＣＳＡ）を、ImageJ2ソフトウェア（ＮＩＨ）のＦＩＪＩディストリビューションを使用して手動で測定した。データをマウスごとにグループ分けした。マウスにＨＭＧＢ１コンストラクト（４６ｎＭ／ｋｇ、ＰＢＳに懸濁）又はＰＢＳビヒクル対照を、損傷時、又は損傷後のＨＭＧＢ１コンストラクトの最適な時点に、筋肉内又は静脈内に注射した。

in vivoマウス心臓損傷モデル
体重２５～３０ｇで１０～１４週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを手術した。全てのマウスに、手術直前にＦＲ－ＨＭＧＢ１（４６ｎＭ／ｋｇ、ＰＢＳに懸濁）又はビヒクル対照のいずれかを静脈内注射した。ブプレノルフィン（塩酸ブプレノルフィン；Vetergesic）を、手術の２０分前に腹腔内注射によって０．０１５ｍｇ／ｍｌ溶液として送達して、鎮痛した。マウスを２．５％イソフルランで麻酔し、気管内チューブにより外部と換気した。心臓損傷は、開胸術による左前下行冠動脈（ＬＡＤ）の恒久的な結紮により誘発した。実験者は、その後の心臓シネＭＲＩ及び分析のために処理群に対して盲検とした。マウスを制御された環境に収容し、維持した。全ての外科手技及び薬理学的手順は、英国のAnimals (Scientific Procedures) Act 1986に従って行った。

心臓シネＭＲＩ及び分析
心臓シネ（cine）ＭＲＩを、ＬＡＤ結紮後にVarian DDRシステムを使用して７Ｔで行った。簡単に説明すると、マウスをＯ_２中の２％イソフルランで麻酔し、恒温制御を備えた特注の動物取り扱いシステムに仰向けに置いた。前向きにゲーティングしたプロトン心臓画像を、機能的定量化のための２つ及び４つの心房の長軸図及び短軸スタックを得るために（１２８×１２８の行列、２５．６ｍｍ^２ＦＯＶ、０．２ｍｍの平面分解脳）パーシャルフーリエ加速スポイルド勾配エコーシネ手順（ＴＲ５．９ミリ秒、ＴＥ２．２ミリ秒、３０ｋＨｚバンド幅、３０°ＦＡ、約２０～３０フレームを４ミリ秒の標識後遅延でＲ波にゲーティング；２０％の部分的取得；４つの平均）によって、７２ｍｍのボリューム送信／４チャネル表面受信コイル（Rapid Biomedical GmbH）で取得した。未取得のパーシャルフーリエデータは、単純なデカルト座標のＤＦＴの前に、凸集合への投影方法によって再構築した。ImageJ（ＮＩＨ）を用いて盲検画像解析を行った。左室質量、体積及び駆出率を以前に記載された［1］ように計算した。拡張期に測定した、全てのスライスの薄くなった無動領域の心内膜と心外膜の周囲長の平均から、相対梗塞サイズを計算し、全心筋表面の割合として表した［99］。

統計学的分析
全ての計算は、GraphPad Prism（v. 8.41）を用いて行った。動態実験（ＢＬＩ／ＲＡＧＥＥＬＩＳＡ）では、非線形最小二乗により全てのフィッティングを行った。ＲＡＧＥＥＬＩＳＡについては、ＲＡＧＥの各濃度が残りのウェルから独立していたので、全てのデータを１つの動態適合とみなした；しかし、ＢＬＩでは、各センサーは、計算の目的のために独立した適合と見なした。パラメーター間の比較は、ＡＵＣ法で行った。マウス筋肉損傷モデルのデータを、ネステッドＡＮＯＶＡとして分析し、ここで、各カラムは、所与の動物についての全ての筋肉ＣＳＡ値を含み、各群は、生物学的変動を治療効果から分離するために、全ての動物を含む。等分散仮定がいずれの場合にも満たされなかった場合、クラスカル－ワリス検定でデータを分析した；ネステッドＡＮＯＶＡについては、各動物からの同数のデータをランダムに選択して、ゆがみを回避する。不等分散プロット及びＱ／Ｑプロットが等しい分散仮定を裏付けた場合［100］、他のデータを一元配置ＡＮＯＶＡで分析した；これらは、スピアマンの検定によっても検証した。多変量実験（例．心臓実験）のために、二元配置ＡＮＯＶＡを同じ仮定で使用した（この事例では、不等分散性を乱すデータセットはなかった）。ホルム－シダック補正（ＡＮＯＶＡファミリー検定）又はダンズ法（クラスカル・ワリス）によって、事後検定での比較を重み付けした。各事例で選択した試験は、それぞれの図の凡例の下に記載している。有意性の凡例：ｎ．ｓ；有意差なし、^＊；ｐ＜０．０３３、^＊＊；ｐ＜０．００２、^＊＊＊；ｐ＜０．０００２、^＊＊＊＊；ｐ＜０．０００１。

ＮＭＲ化学シフトの表
０、０．４２、０．８２及び１．４２モル当量のＣＸＣＬ１２Ａ－ｃ０２１で滴定したＨＭＧＢ１－ｃ０２８（９４～１６２、ビオチン化）、図５Ａ及び５Ｂ

タンパク質の量の制限のため、順次、ＨＭＧＢ１試料にＣＸＣＬ１２を添加して滴定を行い、試料を希釈した。ＣＣＰＮＭＲの化学シフト追跡モジュールでの計算はピークに依存しないので、これによって結果は変化しない。中央値の変化は容積の比較で示される。

３Ｄ実験（第１日）
３Ｄ特性のためこれらのスペクトルは示していないが、必要であれば、データは利用できる。試料はベースライン１のものである。

０、０．４２、０．８２及び１．４２モル当量のＣＸＣＬ１２Ａ－ｃ０２１で滴定したＨＭＧＢ１－ｃ０３８（８９～１７４、ビオチン化）、図５Ａ及び５Ｂ

３Ｄ実験（第１日～第５日）
３Ｄ特性のためこれらのスペクトルは示していないが、必要であれば、データは利用できる。試料はベースライン１のものである。

１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ中の、モル比１：２のＨＭＧＢ１Ａ－ｃ００７（３Ｓ、１～１８４）とＣＸＣＬ１２（１：１モル比ＣＸＣＬ１２／ＨＭＧボックス）、図１３Ａ～１３Ｄ

参考文献
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Claims

以下の式：
Ｈ_２Ｎ－Ａ－Ｘ－Ｂ－Ａ－Ｘ－Ｂ－ＨＯＯＣ
（式中、
Ａは連続するアミノ酸であり、その配列は、
(1) ４アミノ酸の配列であり、
(a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１（配列番号１）のアミノ酸９０～９３の配列と同一である、又は、
(b) 前記(a)の配列とは１以上のアミノ酸で異なる；
かつ、
(2) １～６の連続するアミノ酸をそのアミノ末端側に有し、その配列は、
(a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸９０より前の対応する１～６アミノ酸の配列と同一である、又は、
(b) 前記(a)の配列とは１以上のアミノ酸で異なる；
かつ、
(3) 場合によっては、アミノ末端はメチオニンである、
各Ａは、同一であっても、異なっていてもよい；
Ｘは連続するアミノ酸であり、その配列は、野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸９４～１６２の配列と同一である；
Ｂは連続するアミノ酸であり、その配列は、
(1) ５若しくは６アミノ酸の配列であり、
(a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６８の配列と同一である；
(b) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６３～１６７の配列と同一である；
(c) 前記(a)の配列において、アミノ酸１６３、１６７若しくは１６８のいずれか１つが他のアミノ酸に変更されている；
(d) 前記(b)の配列において、アミノ酸１６３若しくは１６７のいずれか１つが他のアミノ酸に変更されている；
(e) 前記(a)若しくは(b)の配列において、アミノ酸１６４がリシンからアルギニンに変更されている；
(f) 前記(a)若しくは(b)の配列において、アミノ酸１６５がグリシンから、アラニン、セリン若しくはスレオニンに変更されている；
(g) 前記(a)若しくは(b)の配列において、アミノ酸１６６がリシンからアルギニンに変更されている；
(h) 前記(a)若しくは(b)の配列が、(e)及び(f)、(e)及び(g)、(f)及び(g)若しくは(e)、(f)及び(g)の組合せである；
(i) 前記(a)、(b)若しくは(c)の配列が、(e)、(f)及び(g)の１以上の変更の組合せである；又は、
(j) 前記(d)の配列が、(e)、(f)及び(g)の１以上の変更の組合せである；
かつ、
(2) １～６の連続するアミノ酸をそのカルボキシ末端側に有し、その配列は、
(a) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８より後の対応する１～６アミノ酸の配列と同一である、
(b) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６７より後の対応する１～６アミノ酸の配列と同一である、
(c) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６８より後の対応する１～６アミノ酸の配列とは１以上の位置で異なる、又は、
(d) 野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６７より後の対応する１～６アミノ酸の配列とは１以上の位置で異なる、
各Ｂは、同一であっても、異なっていてもよい；
－は、ＡとＸ、ＸとＢ、ＢとＡ、ＡとＸ及びＸとＢの間のペプチド結合を表す；
ここで、２つのＸの間のＢ－Ａのアミノ酸の数は少なくとも１２でなければならず；かつ、ポリペプチドのカルボキシ末端のＢでは、(2)の１～６の連続するアミノ酸は存在しなくてもよい）
で表されるポリペプチド。
アミノ末端がメチオニンである、請求項１に記載のポリペプチド。
前記Ａの(2)(a)は、野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸８９に対応する１アミノ酸である、請求項２に記載のポリペプチド。
前記Ｂの(2)では、Ｂは、そのカルボキシ末端側に野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸１６９～１７４に対応する６アミノ酸を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記２つのＸの間のＢ－Ａのアミノ酸の数は少なくとも１３である、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記２つのＸの間のＢ－Ａのアミノ酸の数は１２～２２である、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記２つのＸの間のＢ－Ａのアミノ酸の数は１３～２２である、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
Ｂのいずれか一方又は両方の(2)(c)又は(2)(d)の配列は、グリシン、セリン、プロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンの存在によって１以上の位置で異なる、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
Ｂのいずれか一方又は両方の(2)(c)又は(2)(d)の配列は、ＧＳＧＳＧ（配列番号１７５）であるか、ＧＳＧＳＧ（配列番号１７５）を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記GSGSG（配列番号１７５）は、２つのＸの間のＢとＡとの間に存在する、請求項９に記載のポリペプチド。
グリシン残基とセリン残基の順序又は数は、配列番号１７５で示すペプチド配列内で変更されている、請求項９に記載のポリペプチド。
Ｂのいずれか一方又は両方の(2)(c)又は(2)(d)のアミノ酸配列は、はっきりとした二次構造を欠くか、ターン又はランダムコイルの二次構造を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
Ａのいずれか一方又は両方は、５の連続するアミノ酸である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記５の連続するアミノ酸は、野生型ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸８９～９３の配列と同一の配列である、請求項１３に記載のポリペプチド。
(a) Ｘの間のＡが５の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＢが少なくとも７の連続するアミノ酸である；
(b) Ｘの間のＡが６の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＢが少なくとも６の連続するアミノ酸である；
(c) Ｘの間のＡが７の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＢが少なくとも６の連続するアミノ酸である；
(d) Ｘの間のＡが８の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＢが少なくとも６の連続するアミノ酸である；
(e) Ｘの間のＡが９の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＢが少なくとも６の連続するアミノ酸である；又は
(f) Ｘの間のＡが１０の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＢが少なくとも６の連続するアミノ酸である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(a) Ｘの間のＢが６の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡが少なくとも６の連続するアミノ酸である；
(b) Ｘの間のＢが７の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡが少なくとも５の連続するアミノ酸である；
(c) Ｘの間のＢが８の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡが少なくとも５の連続するアミノ酸である；
(d) Ｘの間のＢが９の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡが少なくとも５の連続するアミノ酸である；
(e) Ｘの間のＢは１０の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡは少なくとも５の連続するアミノ酸である；
(f) Ｘの間のＢが１１の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡが少なくとも５の連続するアミノ酸である；又は
(g) Ｘの間のＢが１２の連続するアミノ酸であり、Ｘの間のＡが少なくとも５の連続するアミノ酸である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
請求項１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド及び担体を含む組成物。
前記ポリペプチドは治療上又は予防上有効な量で存在し、前記担体は薬学的に許容される担体である、請求項１７に記載の医薬組成物。
修復をＣＸＣＲ４＋細胞に依存する組織又は細胞の再生を促進することで緩和される状態に苦しむ対象又は前記状態を発症する危険性がある対象を処置する方法であって、前記組織若しくは細胞の再生を促進するのに有効な量の請求項１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド又は治療用量若しくは予防用量の請求項１８に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む方法。
前記状態が急性損傷である、請求項１９に記載の方法。
前記ポリペプチドを前記急性損傷後５時間以内に投与する、請求項２０に記載の方法。
前記状態が慢性の状態である、請求項１９に記載の方法。
前記ポリペプチドを、毎日、毎週、毎月又は毎年、繰り返して投与する、請求項２２に記載の方法。
前記急性損傷が心筋梗塞である、請求項２０に記載の方法。
前記急性損傷が、脳卒中、脊髄の損傷又は末梢神経の損傷である、請求項２０に記載の方法。
前記ポリペプチドを前記心筋梗塞後５時間以内に投与する、請求項２４に記載の方法。
前記ポリペプチドを、前記脳卒中、脊髄の損傷又は末梢神経の損傷後５時間以内に投与する、請求項２５に記載の方法。
前記急性損傷が、骨折、関節置換又は骨癒合である、請求項２０に記載の方法。
前記急性損傷が、骨格筋損傷、関節損傷又は靭帯損傷である、請求項２０に記載の方法。
前記状態が肝臓の損傷に関係する、請求項１９に記載の方法。
前記慢性の状態が、非アルコール性脂肪性肝疾患、肝硬変又は感染性肝炎である、請求項２２に記載の方法。
前記慢性の状態が、脳又は中枢神経系の他の部分の損傷に関係する、請求項２２に記載の方法。
前記慢性の状態が、パーキンソン病、認知症、多発性硬化症、運動ニューロン疾患又は末梢神経損傷である、請求項２２に記載の方法。
前記慢性の状態が慢性の関節損傷に関係する、請求項２２に記載の方法。
前記慢性の関節損傷が、炎症性関節炎又は変形性関節症である、請求項３４に記載の方法。
前記状態が肺の損傷に関係する、請求項１９に記載の方法。
前記急性損傷が、肺のウイルス感染、肺の細菌感染、肺の真菌感染又は肺の機械的損傷である、請求項２０に記載の方法。
前記肺のウイルス感染が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（SARS-CoV-2）感染である、請求項３７に記載の方法。
前記機械的損傷が人工呼吸器による損傷である、請求項３７に記載の方法。
前記慢性の状態が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患又は気腫である、請求項２２に記載の方法。
前記状態が腸に関係する、請求項１９に記載の方法。
前記急性損傷が腸の術中損傷である、請求項２０に記載の方法。
前記慢性損傷は、炎症性腸疾患、クローン病又は潰瘍性大腸炎である、請求項２２に記載の方法。
前記状態が皮膚の損傷に関係する、請求項１９に記載の方法。
前記急性損傷が、熱傷又は皮膚の術中損傷である、請求項２０に記載の方法。
前記慢性の状態が、皮膚潰瘍、糖尿病性潰瘍、静脈潰瘍、動脈潰瘍又は褥瘡性潰瘍である、請求項２２に記載の方法。
前記状態が膵臓に関係し、前記細胞が膵島細胞である、請求項１９に記載の方法。
前記状態が糖尿病である、請求項４７に記載の方法。
前記状態が化学療法後の好中球減少症で、前記組織が骨髄である、請求項１９に記載の方法。
前記急性損傷が化学療法で、必要に応じて、前記化学療法を実施する前又は実施後５時間以内に前記ポリペプチドを投与する、請求項２０に記載の方法。
前記ポリペプチドを前記急性損傷の前に投与する、請求項５０に記載の方法。
前記ポリペプチドを前記急性損傷の後に投与する、請求項５０に記載の方法。
前記状態が腎不全で、前記組織が腎臓組織である、請求項１９に記載の方法。
前記慢性の状態が慢性腎不全を引き起こす疾患である、請求項２２に記載の方法。
前記急性損傷が待機手術で、前記手術の前、前記手術中又は前記手術後５時間以内に、前記ポリペプチドを投与する、請求項２０に記載の方法。
前記急性損傷が、スポーツ又は戦闘による損傷である、請求項２０に記載の方法。
前記慢性の状態が慢性的な骨格筋の状態である、請求項２２に記載の方法。
前記慢性的な骨格筋の状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋肉減少症又は廃用症候群などの筋ジストロフィーである、請求項５７に記載の方法。