JP7055637B2 - ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用 - Google Patents

ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP7055637B2
JP7055637B2 JP2017552156A JP2017552156A JP7055637B2 JP 7055637 B2 JP7055637 B2 JP 7055637B2 JP 2017552156 A JP2017552156 A JP 2017552156A JP 2017552156 A JP2017552156 A JP 2017552156A JP 7055637 B2 JP7055637 B2 JP 7055637B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
actriib
alk4
heteromultimer
polypeptide
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2017552156A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018516240A5 (ja
JP2018516240A (ja
Inventor
ラビンドラ クマール，
アシャ グリンバーグ，
ダイアン エス． サコ，
ロバート スコット ピアーソル，
ロズリーヌ カストンギー，
Original Assignee
アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド filed Critical アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド
Publication of JP2018516240A publication Critical patent/JP2018516240A/ja
Publication of JP2018516240A5 publication Critical patent/JP2018516240A5/ja
Priority to JP2021069064A priority Critical patent/JP2021104058A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7055637B2 publication Critical patent/JP7055637B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/06—Anabolic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年４月６日に出願された米国仮出願第６２／１４３，５７９号および２０１５年９月１８日に出願された同第６２／２２０，８３６号に対する優先権の利益を主張する。上記出願のそれぞれの開示は、それらの全体が本明細書に援用される。
トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび構造モチーフを共有する種々の増殖因子を含有する。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における多種多様な細胞型において生物学的効果を発揮することが公知である。このスーパーファミリーのメンバーは、胚発生の際にパターン形成および組織特異化において重要な機能を果たし、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、心臓発生、造血発生、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化過程に影響を与えることができる。このファミリーは、２つの一般的な系統発生クレード：スーパーファミリーのうちのより最近進化したメンバーであって、ＴＧＦ－β、アクチビン、およびＮｏｄａｌを含むメンバーと、スーパーファミリーのうちのより遠縁のタンパク質のクレードであって、多数のＢＭＰおよびＧＤＦを含むクレードとに分けられる［Ｈｉｎｃｋ（２０１２年）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０～１８７０頁］。ＴＧＦβファミリーメンバーは、多様な、多くの場合補完的な効果を有する。ＴＧＦβファミリーのメンバーの活性を操作することにより、生物に有意な生理的変化を引き起こすことが可能になることが多い。例えば、畜牛のピエモンテ種およびベルジャンブルー種は、ＧＤＦ８（また、ミオスタチンとも呼ばれる）遺伝子における機能喪失変異であって、筋量の顕著な増大を引き起こす変異を保有する［Ｇｒｏｂｅｔら（１９９７年）、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、１７巻（１号）：７１～４頁］。さらに、ヒトでも、ＧＤＦ８の不活性の対立遺伝子は、筋量の増大と関連し、報告では、例外的な筋力と関連する［Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２～８頁］。
線維症、筋肉、骨、脂肪、赤血球、および他の組織の変化は、ＴＧＦ－βファミリーのリガンドにより媒介される細胞内シグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤ１、２、３、５、および／または８）を増強または阻害することにより達成することができる。したがって、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの多様なリガンドの活性を調節する作用因子が必要とされている。
Ｈｉｎｃｋ（２０１２年）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０～１８７０頁 Ｇｒｏｂｅｔら（１９９７年）、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、１７巻（１号）：７１～４頁 Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２～８頁
本明細書において記載されるように、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体タンパク質複合体は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーのリガンドの固有のアンタゴニストであり、対応するＡｃｔＲＩＩＢおよびＡＬＫ４ホモ二量体と比較して異なるリガンド結合プロファイル／選択性を呈することが見出された。特に、例示的なＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、いずれのホモ二量体と比較してもアクチビンＢに対する結合の増強を提示し、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体で観察されるようなアクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対する強い結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３に対する実質的に低減された結合を呈示する。実際、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＢＭＰ９に対して低度～観察できないアフィニティを提示するが、このリガンドはＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体に強く結合する。図６を参照のこと。したがって、これらの結果は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較してＴＧＦ－βスーパーファミリーのある特定のリガンドのより選択的なアンタゴニスト（インヒビター）であることを実証する。したがって、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、そのような選択的アンタゴニズムが有利であるある特定の適用において、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体より有用である。例として、１つまたは複数のアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１をアンタゴナイズし、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３の１つまたは複数のアンタゴニズムは減少されることが所望される治療適用が挙げられる。
さらに、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、２つの複合体の示差的なリガンド選択性にもかかわらず、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体の生物学的効果と酷似する、ある特定の生物学的効果をもたらした。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、骨格筋および骨に対する有益な同化効果、ならびに脂肪組織に対する異化効果であって、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体の効果と酷似する効果を及ぼす。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と異なり、ＡｃｔＲＩＩＢ：ＡＬＫ４ヘテロ二量体は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０には、低アフィニティまたは一過性の結合を呈示するに過ぎないので、血管新生など、これらのリガンドにより媒介される過程に対しては、ほとんど～全く、共時的な阻害を及ぼさないはずである。この新規の選択性は、例えば、筋肉および骨に対する刺激性効果、ならびに／または脂肪に対する阻害性効果は必要とするが、血管新生の変更は必要としない患者の処置において有用であり得る。加えて、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、腎疾患のマウスモデルにおいて、特に、腎損傷、炎症、および線維症の処置または予防に対して、多様で有益な効果を及ぼした。したがって、特定の作用機構に束縛されることを望まないが、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＣ）、ＧＤＦ８、および／またはＧＤＦ１１のうちの、少なくとも１つまたは複数に結合する／これを阻害するＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体ならびにそれらの改変体は、骨格筋および骨に対する有益な同化効果、脂肪組織に対する異化効果、ならびに腎疾患に対する有益な効果を促進するのに有用な作用因子であることが予測される。さらに、本明細書で記載されるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の結合／阻害特性を模倣する、他のアンタゴニスト（阻害剤）またはアンタゴニストの組合せのほか、ＡＬＫ４受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体を直接的もしくは間接的にアンタゴナイズする作用因子、ＡＬＫ４結合性リガンドおよび／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ結合性リガンドを直接的もしくは間接的にアンタゴナイズする作用因子、下流のシグナル伝達メディエーター（例えば、Ｓｍａｄ）を直接的もしくは間接的にアンタゴナイズする作用因子、ならびに／またはＴＧＦ－βスーパーファミリー共受容体を直接的もしくは間接的にアンタゴナイズする作用因子も、インビボにおいて、同様の生物学的効果であって、例えば、筋肉および骨に対する刺激性効果、ならびに脂肪に対する阻害性効果を含む効果を及ぼすことが予測される。本明細書では、これらのアンタゴニスト性模倣剤を、「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト」または「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ阻害剤」と総称する。
したがって、本開示は、部分的に、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドおよび少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）を含むヘテロ多量体複合体（ヘテロ多量体）を提供する。好ましくは、ＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡＬＫ４受容体のリガンド結合ドメイン、例えば、ＡＬＫ４細胞外ドメインの部分を含む。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、一般的に、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド結合ドメイン、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの部分を含む。好ましくは、そのようなＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ならびに結果的に生じるそのヘテロ多量体は、可溶性である。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号９のアミノ酸２４～３４のいずれか１つ（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４）で始まり、配列番号９のアミノ酸１０１～１２６のいずれか１つ（例えば、アミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）で終わるポリペプチドと少なくとも７０％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号９のアミノ酸３４～１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号９のアミノ酸２４～１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。別の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含み得る。なお別の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号２０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含み得る。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２０～２９（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９）のいずれか１つで始まり、配列番号１のアミノ酸１０９～１３４（１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、および１３４）のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２５～１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。別の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含み得る。なお別の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含み得る。なお別の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含み得る。なおさらに別の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含み得る。ある特定の好ましい実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸（例えば、天然に生じるアミノ酸ＥまたはＤあるいは人工酸性アミノ酸）を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含まない。
本明細書に記載のＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの種々の組み合わせもまた、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関して企図される。例えば、ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号９のアミノ酸３４～１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号１のアミノ酸２９～１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号９のアミノ酸２４～１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号１のアミノ酸２５～１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。別の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。別の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号２０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。なお別の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。なお別の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号２０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。さらに別の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。さらに別の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号２０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。なおさらに別の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。なおさらに別の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号２０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。
本明細書において記載される場合、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体構造として、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、ヘテロ五量体およびより高次のヘテロ多量体複合体が挙げられる。例えば、図１、２、および８～１０を参照。ある特定の好ましい実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは融合タンパク質であり得る。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡＬＫ４ポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非ＡＬＫ４）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であり得る。同様に、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非ＡｃｔＲＩＩＢ）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であり得る。
任意選択で、ＡＬＫ４ポリペプチドは、１つまたは複数の異種ドメインまたはリンカーなどの介在配列（ＡＬＫ４ポリペプチドのアミノ酸配列と、１つまたは複数の異種ドメインとの間に位置付けられ得る）に直接連結（融合）される。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数の異種ドメインまたはリンカーなどの介在配列（ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列と、１つまたは複数の異種ドメインとの間に位置付けられ得る）に直接連結（融合）され得る。リンカーは、ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡＬＫ４の細胞外ドメインのＣ末端終端のおよそ１５アミノ酸の非構造化領域（「テール」）に対応するか、またはこれは、比較的二次構造が自由な５～１５、２０、３０、５０、１００またはそれより多くのアミノ酸の人工配列であり得る。Ａリンカーは、グリシンおよびプロリン残基が豊富であってもよく、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列を含んでもよい。リンカーの例として、これらに限定されないが、配列ＴＧＧＧ（配列番号１７）、ＳＧＧＧ（配列番号１８）、ＴＧＧＧＧ（配列番号１５）、ＳＧＧＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＧＧＧ（配列番号１４）、およびＧＧＧ（配列番号１３）が挙げられる。一部の実施形態では、１つまたは複数の異種ドメインは、例えば、薬物動態の改善、より容易な精製、特定の組織へのターゲティングなどを含む所望の特性をＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質に与える。例えば、融合タンパク質の異種ドメインは、インビボ安定性、インビボ半減期、摂取／投与、組織局在化または分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および／または精製の１つまたは複数を増強し得る。ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメイン（野生型または変異体）を含んでもよいし、血清アルブミンを含んでもよい。一部の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、精製用サブ配列、例えば、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＳＴ融合体を含み得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に会合したＡＬＫ４ポリペプチドを含み、ここで、ＡＬＫ４ポリペプチドはＡＬＫ４ドメインおよび相互作用ペアの第１のメンバー（または第２のメンバー）のアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび相互作用ペアの第２のメンバー（または第１のメンバー）のアミノ酸配列を含む。本明細書で記載される相互作用ペアは、二量体化を促進するか、または高次の多量体を形成するように設計されている。例えば、図１、２および８～１０を参照。一部の実施形態では、相互作用ペアは、相互作用して複合体、特に、ヘテロ二量体の複合体を形成する任意の２つのポリペプチド配列の場合もあるが、実効性のある実施形態は、ホモ二量体の配列を形成する相互作用ペアを用いることもできる。相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、非対称ペアとなることができ、これは、ペアのメンバーが、自己会合する（すなわち、誘導型相互作用ペア）よりもむしろ、互いと優先的に会合することを意味する。したがって、非対称相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、会合して、ヘテロ二量体の複合体を形成することができる。代替的に、相互作用ペアは、非誘導型であってもよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先度なしで、互いと会合しても自己会合してもよく、よって、同じまたは異なるアミノ酸配列を有することができることを意味する。したがって、非誘導型相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、会合して、ホモ二量体の複合体またはヘテロ二量体の複合体を形成することができる。任意選択で、相互作用的作用ペア（例えば、非対称ペアまたは非誘導型相互作用ペア）の第１のメンバーは、相互作用ペアの第２のメンバーと共有結合により会合する。任意選択で、相互作用的作用ペア（例えば、非対称ペアまたは非誘導型相互作用ペア）の第１のメンバーは、相互作用ペアの第２のメンバーと非共有結合により会合する。任意選択で、相互作用作用ペア（例えば、非対称ペアまたは非誘導相互作用ペア）の第１のメンバーは、と共有結合的および非共有結合的両方の機を介して相互作用ペアの第２のメンバーに会合する。
一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む融合タンパク質である。同様に、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む融合タンパク質である。伝統的なＦｃ融合タンパク質および抗体は、非誘導型相互作用ペアの例である一方で、種々の操作されたＦｃドメインが、非対称相互作用ペアとして設計された［Ｓｐｉｅｓｓら（２０１５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２Ａ）：９５－１０６］。したがって、本明細書で記載される相互作用ペアの第１のメンバーおよび／または第２のメンバーは、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの定常ドメインを含み得る。例えば、相互作用ペアの第１のメンバーは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥまたはＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含み得る。そのような免疫グロブリンドメインは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、欠失、付加および／または置換）を含み得る。例えば、相互作用ペアの第１のメンバーは、配列番号２３～３７のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。同様に、相互作用ペアの第２のメンバーは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含み得る。そのような免疫グロブリンドメインは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含み得る。例えば、相互作用ペアの第２のメンバーは、配列番号２３～３７のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。一部の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーおよび第２のメンバーは、免疫グロブリンクラスおよびサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。別の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーおよび第２のメンバーは、異なる免疫グロブリンクラスまたはサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ｉ）配列番号４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるＡＬＫ４ポリペプチド、およびｉｉ）配列番号４１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。別の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ｉ）配列番号４８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるＡＬＫ４ポリペプチド、およびｉｉ）配列番号４６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。
任意選択で、相互作用ペア（例えば、非対称ペアまたは非誘導型相互作用ペア）の第１のメンバーおよび／または第２のメンバーは、例えば、免疫グロブリンの修飾されたＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの修飾された定常ドメインを含む。例えば、本開示のタンパク質複合体は、群：配列番号２３～３７から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなる、ＩｇＧの第１の修飾されたＦｃ部分と、群：配列番号２３～３７から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなる、ＩｇＧの第１の修飾されたＦｃ部分のアミノ酸配列と同じであっても異なっていてもよいＩｇＧの第２の修飾されたＦｃ部分とを含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号２３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる免疫グロブリンドメインを含むＡＬＫ４（またはＡｃｔＲＩＩＢ）融合タンパク質であって、任意選択で、免疫グロブリンドメインが配列番号２３の残基１３４および１７７に対応する位置に正に帯電したアミノ酸（例えば、Ｋ、Ｒ、またはＨ）を含み、さらに任意選択で、免疫グロブリンドメインは配列番号２３の残基２２５に対応する位置に正に帯電したアミノ酸（例えば、Ｋ、Ｒ、またはＨ）を含まない融合タンパク質、ならびにｂ）配列番号２４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる免疫グロブリンドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（またはＡＬＫ４）融合タンパク質であって、任意選択で、免疫グロブリンドメインは配列番号２４の残基１７０および１８７に対応する位置に負に帯電した（例えば、ＤまたはＥ）アミノ酸を含み、さらに任意選択で、免疫グロブリンドメインは配列番号２４の残基２２５に対応する位置に正に帯電したアミノ酸（例えば、Ｋ、Ｒ、またはＨ）を含むタンパク質、を含む。別の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる免疫グロブリンドメインを含むＡＬＫ４（またはＡｃｔＲＩＩＢ）融合タンパク質であって、任意選択で免疫グロブリンドメインは配列番号２７の残基１３２に対応する位置にＣを、配列番号２７の残基１４４に対応する位置にＷを含み、さらに任意選択で、免疫グロブリンドメインは配列番号２７の残基２２５に対応する位置に正に帯電したアミノ酸（例えば、Ｋ、Ｒ、またはＨ）を含まない融合タンパク質、ならびにｂ）配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる免疫グロブリンドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（またはＡＬＫ４）融合タンパク質であって、任意選択で、免疫グロブリンドメインは配列番号２８の残基１４４に対応する位置にＳを含み、配列番号２８の残基１４６に対応する位置にＡを、および配列番号２８の残基１８５に対応する位置にＶを含み、さらに任意選択で、免疫グロブリンドメインは配列番号２８の残基２２５に対応する位置に正に帯電したアミノ酸（例えば、Ｋ、Ｒ、またはＨ）を含まない融合タンパク質、を含む。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号３９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号４１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号４２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。本明細書に記載のＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの種々の組み合わせが、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関して企図される。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号４１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号４８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号４６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。
任意選択で、ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、および有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択される、１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む。ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つのＮ結合型糖を含むことが可能であり、２つ、３つ、またはこれを超えるＮ結合型糖を含み得る。このようなポリペプチドはまた、Ｏ結合型糖を含み得る。ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、タンパク質を、患者使用に適する形でグリコシル化する様々な細胞系であって、操作された昆虫細胞または酵母細胞、ならびにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、およびＮＳＯ細胞などの哺乳動物細胞を含む細胞系内で作製することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、グリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣細胞系から得ることができるグリコシル化パターンを有する。好ましくは、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において少なくとも４、６、１２、２４、３６、４８、または７２時間の血清半減期を呈示する。任意選択で、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において少なくとも６、８、１０、１２、１４、２０、２５、または３０日の血清半減期を呈示し得る。
ある特定の態様では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドに結合する。任意選択で、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、１０－８、１０－９、１０－１０、１０－１１、または１０－１２Ｍ未満またはこれと等しいＫＤでこれらのリガンドの１つまたは複数に結合する。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡＢに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＣに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡＣに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢＣに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢＣに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢＥに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＧＤＦ１１に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＧＤＦ８に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＢＭＰ６に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＧＤＦ３に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＢＭＰ１０に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＢＭＰ９に結合しないか、または実質的に結合しない。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより強いアフィニティでアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより弱いアフィニティでＧＤＦ３に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより弱いアフィニティでＢＭＰ１０に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより弱いアフィニティでＢＭＰ９に結合する。
概して、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、少なくとも１つのＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドの１つまたは複数の活性をアンタゴナイズ（阻害）し、そのような活性の変更は、例えば、本明細書に記載されるものなどの当技術分野で公知の種々のアッセイ細胞ベースのアッセイを含むを使用して測定することができる。ある特定の態様では、例えば、細胞ベースのアッセイにおいて、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を使用して、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによって媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達）を阻害することができる。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンシグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンシグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＡシグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＢシグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＡＢシグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＣシグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＡＣシグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＢＣシグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＥシグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＡＥシグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＣＥシグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＧＤＦ１１シグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＧＤＦ８シグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ６シグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＧＤＦ３シグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ１０シグナル伝達の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ９シグナル伝達を阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＢシグナル伝達のより強いインヒビターである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＧＤＦ３シグナル伝達のより弱いインヒビターである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ１０シグナル伝達のより弱いインヒビターである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ９シグナル伝達のより弱いインヒビターである。
本明細書で記載される任意のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ならびにＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、医薬調製物（医薬組成物）として製剤化することができる。一部の実施形態では、医薬調製物は、薬学的に許容される担体を含む。医薬調製物は、発熱物質非含有（治療的使用のための製品の品質を統制する規制により要請される程度に発熱物質非含有であることを意味する）であることが好ましい。医薬調製物はまた、本明細書で記載される障害／状態を処置するのに使用される化合物など、１つまたは複数の追加の化合物を含み得る。概して、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の医薬調製物は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を実質的に含まない。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む。
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載されるようなＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸を提供する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ核酸は、配列番号７の７３～３９６の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸、あるいは配列番号７のヌクレオチド７３～３９６の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイスするものを含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。そのような核酸は、配列番号８または４０の配列を含むものであり得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ核酸は、配列番号７、８、および４０のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。同様に、ＡＬＫ４核酸は、配列番号１１の７０～３７８の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸、あるいは配列番号１１のヌクレオチド７０～３７８の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイスするものを含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。そのようなＡＬＫ４核酸は、配列番号１２、２２、または４３の配列を含むものであり得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４核酸は、配列番号１１、１２、２１、２２、および４３のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドのコード配列およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列を含む核酸配列を提供する。例えば、一部の実施形態では、本開示の核酸は、ａ）配列番号１１、１２、２１、２２、および４３のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなり、ｂ）配列番号７、８、および４０のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。好ましくは、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ核酸は、単離および／または組み換えの核酸である。本明細書に開示の核酸は、発現のためにプロモーターに動作可能に連結されていてもよい。本開示は、そのようなＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含むベクターならびに、そのようなＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドおよびそのようなＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、好ましくはヒトまたは他の脊椎動物種から単離された細胞をさらに提供する。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、患者における望ましくない免疫応答の可能性（獣医学的患者の可能性を含む）を低減するために、哺乳動物細胞株、任意選択で、ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡＬＫ４タンパク質の天然のグリコシル化を適切に媒介する細胞系内で発現させられ得る。ヒト細胞株およびＣＨＯ細胞株は、首尾よく使用されており、そして、他の一般的な哺乳動物発現ベクターが有用であることが予想される。したがって、本開示は、本明細書で開示される任意の核酸を含む培養細胞を提供する。このような細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨＥＫ細胞、およびＣＯＳ細胞を含む哺乳動物細胞であり得る。他の細胞を、意図される患者の種に応じて選択することができる。本明細書では、他の細胞が開示されている。培養細胞とは、実験室または他の人工的状態（例えば、凍結状態、または培地中の状態）において維持されており、生物の一部ではない細胞を意味すると理解される。
ある特定の態様では、本開示は、任意の本明細書に記載のＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにそのようなポリペプチドを含むＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体を作製するための方法を提供する。そのような方法は、適当な細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞）において任意の本明細書に開示の核酸を発現させる工程を含み得る。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を作製するための方法は、：ａ）ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養する工程であって、ここで細胞がＡＬＫ４ポリヌクレオチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含む工程；およびｂ）そうして発現されたヘテロ多量体を回収する工程を含む。代替的に、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を作製するための方法は、：ａ）ＡＬＫ４ポリペプチドの発現に適した条件下で第１の細胞を培養する工程であって、ここで第１の細胞がＡＬＫ４ポリヌクレオチドを含む工程；ｂ）そうして発現されたＡＬＫ４ポリペプチドを回収する工程；ｃ）ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で第２の細胞を培養する工程であって、ここで第２の細胞がＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含む工程；ｄ）そうして発現されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを回収する工程；ｅ）ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体形成に適した条件下で、回収されたＡＬＫ４ポリペプチドと、前記回収されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとを合わせる工程；およびｆ）ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を回収する工程を含み得る。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＴＰＡリーダー配列（例えば、配列番号３８）を使用して発現される。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＣＨＯ細胞内で発現される。本明細書に記載のＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ならびにそのタンパク質複合体は、タンパク質を細胞培養物から取得する周知の技法のいずれかを使用して粗精製、部分精製または高度精製された分画として回収することができる。概して、そのような方法は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体が実質的にないＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体をもたらす。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を作製する方法は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体をもたらす。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を作製する方法は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体をもたらす。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を作製する方法は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体および約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体をもたらす。
本開示はさらに、例えば、筋肉、骨、脂肪、赤血球、および他の組織と関連する、多様なＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連の疾患および状態の処置または予防における使用のための、方法およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）も提供する。このような疾患および障害として、筋力低下または筋成長不全と関連する障害（例えば、筋委縮症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、および顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィー；筋委縮性側索硬化症；ならびに悪液質）、および所望されない体重増加と関連する障害（例えば、肥満症、２型糖尿病または非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、心血管疾患、高血圧症、骨関節炎、脳卒中、呼吸器問題、および胆嚢疾患）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ヘテロ多量体）を使用して、それを必要とする対象において体脂肪含量を低下または体脂肪の増加速度を減少させることができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ヘテロ多量体）を使用して患者におけるコレステロールおよび／またはトリグリセリドレベルを減少させることができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ヘテロ多量体）を使用して線維症または線維症関連障害または状態（例えば、腎不全、慢性腎疾患、嚢胞性線維症、および骨髄線維症）を処置または予防することができる。
本開示は、例えば腎臓に関連する、種々のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連疾患および状態の処置または予防における使用のための方法およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストをさらに提供する。そのような疾患または状態として、例えば、以下のものが挙げられる；慢性腎疾患または不全、急性腎疾患または不全、病期１の腎疾患を有する患者、病期２の腎疾患を有する患者、病期３の腎疾患を有する患者、病期４の腎疾患を有する患者、病期５の腎疾患を有する患者、非糖尿病性腎疾患、糸球体腎炎、間質性腎炎、糖尿病性腎疾患、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、急速進行性糸球体腎炎、腎線維症、アルポート症候群、ＩＤＤＭ腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎、腎間質性線維症、巣状分節状糸球体硬化症、膜性腎症、微小変化型疾患、微量免疫型急速進行性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、多発性嚢胞腎、デント病、腎シスチン蓄積症（ｎｅｐｈｒｏｃｙｔｉｎｏｓｉｓ）、ヘイマン腎炎、常染色体優性（成人型）多発性嚢胞腎、常染色体劣性（小児型）多発性嚢胞腎、急性腎傷害、ネフローゼ症候群、腎虚血症、有足細胞疾患または有足細胞障害、タンパク尿症、糸球体疾患、膜性糸球体腎炎、巣状分節状糸球体腎炎、子癇前症、子癇、腎病変、膠原血管病、良性起立性（体位性）タンパク尿症、ＩｇＭ腎症、膜性腎症、サルコイドーシス、糖尿病、薬物に起因する腎損傷、ファブリー病、アミノ酸尿症、ファンコーニ症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球病、ヘモグロビン尿症、ミオグロビン尿症、ウェゲナー肉芽腫症、１型糖原病、慢性腎疾患、慢性腎不全、糸球体濾過量（ＧＦＲ）低下症、腎血管硬化症、ループス腎炎、ＡＮＣＡ陽性微量免疫型半月体形成性糸球体腎炎、慢性移植腎症、腎臓毒性、腎毒性、腎壊死、腎損傷、糸球体尿細管傷害、腎機能不全、腎炎症候群、急性腎不全、慢性腎不全、近位尿細管機能不全、急性腎移植拒絶、慢性腎移植拒絶、非ＩｇＡメサンギウム増殖性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、任意の種類の腎関与を伴う血管炎、任意の遺伝性腎疾患、任意の間質性腎炎、腎移植不全、腎臓がん、他の状態（例えば、高血圧症、糖尿病、および自己免疫疾患）と関連する腎疾患、デント病、腎シスチン蓄積症、ヘイマン腎炎、原発性腎疾患、虚脱性糸球体症、デンスデポジット病、寒冷グロブリン血症関連糸球体腎炎、ヘノッホ－シェーンライン病、感染後糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ－ストラウス症候群、抗ＧＢＭ抗体介在型糸球体腎炎、アミロイドーシス、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、線維性糸球体腎炎、イムノタクトイド糸球体症、虚血性尿細管傷害、薬物誘導性尿細管間質性腎炎、毒性尿細管間質性腎炎、感染性尿細管間質性腎炎、細菌性腎盂腎炎、ポリオーマウイルス感染またはＨＩＶ感染から生じるウイルス感染性尿細管間質性腎炎、代謝誘導性尿細管間質性疾患、混合性結合組織疾患、円柱腎症、尿酸結晶もしくはシュウ酸結晶または薬物誘導性結晶の沈着から生じ得る結晶腎症、急性細胞性尿細管間質性同種移植片拒絶、リンパ腫または移植後リンパ増殖性疾患から生じる腫瘍性浸潤性疾患、腎臓の閉塞性疾患、血管疾患、血栓性微小血管症、腎血管硬化症、アテローム塞栓性疾患、混合性結合組織疾患、結節性多発動脈炎、カルシニューリン阻害剤誘導性血管疾患、急性細胞性血管性同種移植片拒絶、急性体液性同種移植片拒絶、早期腎機能低下症（ＥＲＦＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、腎静脈血栓症、急性尿細管壊死、腎閉塞、急性間質性腎炎、確立された慢性腎疾患、腎動脈狭窄症、虚血性腎症、血尿症、薬物毒素誘導性慢性尿細管間質性腎炎、逆流腎症、腎臓結石、グッドパスチャー症候群、正球性正色素性貧血、腎性貧血、糖尿病性慢性腎疾患、ＩｇＧ４関連疾患、フォンヒッペル－リンダウ症候群、結節性硬化症、ネフロン癆、髄質性嚢胞腎疾患、腎細胞癌、腺癌、腎芽細胞腫、リンパ腫、白血病、低シアリル化障害、慢性シクロスポリン腎症、腎再灌流傷害、腎形成異常、高窒素血症、両側性動脈閉塞、急性尿酸性腎症、血液量減少、急性両側性閉塞性尿路疾患、高カルシウム血性腎症、溶血性尿毒症症候群、急性尿貯留、悪性腎硬化症、分娩後糸球体硬化症、強皮症、非グッドパスチャー抗ＧＢＭ病、顕微鏡的結節性多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫症、急性放射線腎炎、溶連菌感染後糸球体腎炎、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、鎮痛薬性腎症、動静脈フィステル、動静脈移植、透析、異所性腎、海綿腎、腎性骨形成異常症、単腎症、水腎、微量アルブミン尿症、尿毒症、血尿、高脂血症、低アルブミン血症、脂肪尿、アシドーシス、および高カリウム血症。一部の実施形態では、本開示 は、病期１から病期２への腎疾患の進行、病期２から病期３への腎疾患の進行、病期３から病期４への腎疾患の進行、または病期４から病期５への腎疾患の進行を遅延させるかまたは予防するのに使用するための方法およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストをさらに提供する。一部の実施形態では、本開示は、腎臓炎症を予防するかまたは低減するのに使用するための方法およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストをさらに提供する。一部の実施形態では、本開示は、腎臓損傷を予防するかまたは低減するのに使用するための方法およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストをさらに提供する。一部の実施形態では、本開示は、腎臓線維症を予防するかまたは低減するのに使用するための方法およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストをさらに提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む組み換えヘテロ多量体。
（項目２）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、
ａ）配列番号９のアミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれか１つで始まり、
ｂ）配列番号９のアミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６のいずれか１つで終わる、
ポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のヘテロ多量体。
（項目３）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸３４～１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のヘテロ多量体。
（項目４）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸３４～１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列からなる、またはから本質的になる、項目１に記載のヘテロ多量体。
（項目５）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のヘテロ多量体。
（項目６）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号２０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のヘテロ多量体。
（項目７）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、
ａ）配列番号１のアミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のいずれか１つで始まり、および
ｂ）配列番号１のアミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終わる、
ポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目８）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸２９～１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目９）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸２５～１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１０）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸を含まない、項目１～９のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１１）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～１０のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１２）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～１０のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１３）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～１０のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１４）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～１０のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１５）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、異種ドメインをさらに含む融合タンパク質である、項目１～１４のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１６）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、異種ドメインをさらに含む融合タンパク質である、項目１～１５のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１７）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、相互作用ペアの第１または第２のメンバーを含む、項目１５に記載のヘテロ多量体。
（項目１８）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、相互作用ペアの第１または第２のメンバーを含む、項目１６に記載のヘテロ多量体。
（項目１９）
前記異種ドメインが、Ｆｃ免疫グロブリンドメインを含む、項目１５～１８のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目２０）
前記Ｆｃ免疫グロブリンドメインが、ヘテロ二量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目１９に記載のヘテロ多量体。
（項目２１）
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、ホモ二量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目１９または２０に記載のヘテロ多量体。
（項目２２）
前記異種ドメインが、ＩｇＧ免疫グロブリン由来のＦｃ免疫グロブリンドメインを含む、項目１９～２１のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目２３）
前記ＩｇＧ免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３、またはＩｇＧ４からなる群から選択される、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目２４）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目２５）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２３の残基１３４および１７７に対応する位置に正に帯電したアミノ酸を含む、項目２４に記載のヘテロ多量体。
（項目２６）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２３の１３４位および１７７位にＫを含む、項目２５に記載のヘテロ多量体。
（項目２７）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２３の残基２２５に対応する位置に正に帯電したアミノ酸を含まない、項目２４～２６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目２８）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２３の２２５位にＫを含まない、項目２７に記載のヘテロ多量体。
（項目２９）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目３０）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２４の残基１７０および１８７に対応する位置に負に帯電したアミノ酸を含む、項目２９に記載のヘテロ多量体。
（項目３１）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２４の１７０位および１８７位にＤを含む、項目３０に記載のヘテロ多量体。
（項目３２）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２４の残基２２５に対応する位置に正に帯電したアミノ酸を含む、項目２９～３１のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目３３）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２４の２２５位にＫを含む、項目３２に記載のヘテロ多量体。
（項目３４）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目３５）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目３６）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目３７）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２７の残基１３２に対応する位置にＣを含み、ここで、前記Ｆｃ免疫グロブリンが配列番号２７の残基１４４に対応する位置にＷをさらに含む、項目３６に記載のヘテロ多量体。
（項目３８）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２７の残基２２５に対応する位置に正に帯電したアミノ酸を含まない、項目３６または３７に記載のヘテロ多量体。
（項目３９）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２７の２２５位にＫを含まない、項目３８に記載のヘテロ多量体。
（項目４０）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目４１）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが配列番号２８の残基１２７に対応する位置にＣを含み、前記Ｆｃ免疫グロブリンが配列番号２８の残基１４４に対応する位置にＳをさらに含み、前記Ｆｃ免疫グロブリンが配列番号２８の残基１４６に対応する位置にＡをさらに含み、前記Ｆｃ免疫グロブリンが配列番号２８の残基１８５に対応する位置にＶをさらに含む、項目４０に記載のヘテロ多量体。
（項目４２）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２８の残基２２５に対応する位置に正に帯電したアミノ酸を含まない、項目４０または４１に記載のヘテロ多量体。
（項目４３）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２８の２２５位にＫを含まない、項目４２に記載のヘテロ多量体。
（項目４４）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号２９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目４５）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号３０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目４６）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目４７）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目４８）
前記Ｆｃ免疫グロブリン鎖が、配列番号３３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目４９）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号３４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目５０）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号３５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目５１）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号３６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目５２）
前記Ｆｃ免疫グロブリンが、配列番号３７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のヘテロ多量体。
（項目５３）
ａ）前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号２３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの定常領域をさらに含む融合タンパク質であり；
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの定常領域をさらに含む融合タンパク質である、項目１～２２のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目５４）
ａ）前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号２４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの定常領域をさらに含む融合タンパク質であり；
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの定常領域をさらに含む融合タンパク質である、項目１～２２のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目５５）
前記定常領域が、配列番号２３の残基１３４および１７７に対応する位置に正に帯電したアミノ酸を含む、項目５３または５４に記載のヘテロ多量体。
（項目５６）
前記定常領域が、配列番号２３の１３４位および１７７位にＫを含む、項目５５に記載のヘテロ多量体。
（項目５７）
前記定常領域が、配列番号２３の残基２２５に対応する位置に正に帯電したアミノ酸を含まない、項目５３～５６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目５８）
前記定常領域が、配列番号２３の２２５位にＫを含まない、項目５７に記載のヘテロ多量体。
（項目５９）
前記定常領域が、配列番号２４の残基１７０および１８７に対応する位置に負に帯電したアミノ酸を含む、項目５３～５８のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目６０）
前記定常領域が、配列番号２４の１７０位および１８７位にＤを含む、項目５９に記載のヘテロ多量体。
（項目６１）
前記定常領域が、配列番号２４の残基２２５に対応する位置に正に帯電したアミノ酸を含む、項目５３～６０のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目６２）
前記定常領域が、配列番号２４の２２５位にＫを含む、項目６１に記載のヘテロ多量体。
（項目６３）
ａ）前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの定常領域をさらに含む融合タンパク質であり；
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの定常領域をさらに含む融合タンパク質である、項目１～２２のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目６４）
ａ）前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの定常領域をさらに含む融合タンパク質であり；
ｂ）前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの定常領域をさらに含む融合タンパク質である、項目１～２２のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目６５）
前記定常領域が、配列番号２７の残基１３２に対応する位置にＣを含み、前記定常領域が配列番号２７の残基１４４に対応する位置にＷをさらに含む、項目６３または６４に記載のヘテロ多量体。
（項目６６）
前記定常領域が、配列番号２７の残基２２５に対応する位置に正に帯電したアミノ酸を含まない、項目６３～６５のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目６７）
前記定常領域が、配列番号２７の２２５位にＫを含まない、項目６６に記載のヘテロ多量体。
（項目６８）
前記定常領域が配列番号２８の残基１２７に対応する位置にＣを含み、前記定常領域が配列番号２８の残基１４４に対応する位置にＳをさらに含み、前記定常領域が配列番号２８の残基１４６に対応する位置にＡをさらに含み、前記定常領域が配列番号２８の残基１８５に対応する位置にＶをさらに含む、項目６３～６７のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目６９）
前記定常領域が、配列番号２８の残基２２５に対応する位置に正に帯電したアミノ酸を含まない、項目６３～６８のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目７０）
前記定常領域が、配列番号２８の２２５位にＫを含まない、項目６９に記載のヘテロ多量体。
（項目７１）
前記融合タンパク質が、前記ＡＬＫ４ドメインと前記異種ドメインとの間に位置付けられるリンカードメインをさらに含む、項目１５～７０のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目７２）
前記融合タンパク質が、前記ＡｃｔＲＩＩＢドメインと前記異種ドメインとの間に位置付けられるリンカードメインをさらに含む、項目１５～７１のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目７３）
前記リンカードメインが、ＴＧＧＧ（配列番号１７）、ＴＧＧＧＧ（配列番号１５）、ＳＧＧＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＧＧ（配列番号１３）、ＧＧＧＧ（配列番号１４）、およびＳＧＧＧ（配列番号１８）からなる群から選択される、項目７１または７２に記載のヘテロ多量体。
（項目７４）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号４２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～１６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目７５）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～１６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目７６）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号３９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～１６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目７７）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号４１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～１６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目７８）
前記ヘテロ多量体が、
ａ）配列番号４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ポリペプチド、および
ｂ）配列番号４１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、
を含む、項目１～１６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目７９）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号４７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～１６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目８０）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号４８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～１６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目８１）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～１６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目８２）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号４６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～１６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目８３）
前記ヘテロ多量体が、
ｃ）配列番号４８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ポリペプチド、および
ｄ）配列番号４６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む、項目１～１６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目８４）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸からなる群から選択される、１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む、項目１から８３のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
（項目８５）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸からなる群から選択される、１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む、項目１から８４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
（項目８６）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＤＴ融合体からなる群から選択される、１つまたは複数の精製用配列をさらに含む、項目１から８５のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
（項目８７）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＤＴ融合体からなる群から選択される、１つまたは複数の精製用配列をさらに含む、項目１から８６のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
（項目８８）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、グリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣細胞系から得ることができるグリコシル化パターンを有する、項目１から８７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
（項目８９）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、グリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣細胞系から得ることができるグリコシル化パターンを有する、項目１から８８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
（項目９０）
前記ヘテロ多量体が、アクチビンに結合する、項目１～８９のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目９１）
前記ヘテロ多量体が、アクチビンＡに結合する、項目１～９０のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目９２）
前記ヘテロ多量体が、アクチビンＢに結合する、項目１～９１のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目９３）
前記ヘテロ多量体が、ＧＤＦ８に結合する、項目１～９２のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目９４）
前記ヘテロ多量体が、ＧＤＦ１１に結合する、項目１～９３のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目９５）
前記ヘテロ多量体が、ＢＭＰ６に結合する、項目１～９４のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目９６）
前記ヘテロ多量体が、ＢＭＰ１０に結合する、項目１～９５のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目９７）
前記ヘテロ多量体が、ＧＤＦ３に結合する、項目１～９６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目９８）
前記ヘテロ多量体が、ＢＭＰ９に実質的に結合しない、項目１～９７のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目９９）
前記ヘテロ多量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより弱いアフィニティでＢＭＰ１０に結合する、項目１～９８のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１００）
前記ヘテロ多量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより弱いアフィニティでＢＭＰ９に結合する、項目１～９９のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１０１）
前記ヘテロ多量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより弱いアフィニティでＧＤＦ３に結合する、項目１～１００のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１０２）
前記ヘテロ多量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより強いアフィニティでアクチビンＢに結合する、項目１～１０１のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１０３）
前記ヘテロ多量体が、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンシグナル伝達を阻害する、項目１～１０２のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１０４）
前記ヘテロ多量体が、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＡシグナル伝達を阻害する、項目１～１０３のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１０５）
前記ヘテロ多量体が、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＢシグナル伝達を阻害する、項目１～１０４のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１０６）
前記ヘテロ多量体が、細胞ベースのアッセイにおいてＧＤＦ８シグナル伝達を阻害する、項目１～１０５のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１０７）
前記ヘテロ多量体が、細胞ベースのアッセイにおいてＧＤＦ１１シグナル伝達を阻害する、項目１～１０６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１０８）
前記ヘテロ多量体が、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ６シグナル伝達を阻害する、項目１～１０７のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１０９）
前記ヘテロ多量体が、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ９の細胞内シグナル伝達を実質的に阻害しない、項目１～１０８のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１１０）
前記ヘテロ多量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して細胞ベースのアッセイにおけるＢＭＰ１０シグナル伝達のより弱いインヒビターである、項目１～１０９のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１１１）
前記ヘテロ多量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して細胞ベースのアッセイにおけるＢＭＰ９シグナル伝達のより弱いインヒビターである、項目１～１１０のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１１２）
前記ヘテロ多量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して細胞ベースのアッセイにおけるＧＤＦ３シグナル伝達のより弱いインヒビターである、項目１～１１１のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１１３）
前記ヘテロ多量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して細胞ベースのアッセイにおけるアクチビンＢシグナル伝達のより強いインヒビターである、項目１～１１１のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１１４）
前記ヘテロ多量体が、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である、項目１～１１３のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
（項目１１５）
項目１～１１４のいずれか１項に記載のヘテロ多量体および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬調製物。
（項目１１６）
前記医薬調製物が実質的に発熱物質非含有である、項目１１５に記載の医薬調製物。
（項目１１７）
前記医薬調製物が、追加の活性剤をさらに含む、項目１１５または１１６に記載の医薬調製物。
（項目１１８）
前記医薬調製物が、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体を含む、項目１１５～１１７のいずれか１項に記載の医薬調製物。
（項目１１９）
前記医薬調製物が、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む、項目１１５～１１８に記載の医薬調製物。
（項目１２０）
項目１～１１４のいずれか１項に記載のＡＬＫ４ポリペプチドのコード配列を含む単離核酸配列。
（項目１２１）
前記核酸が、配列番号４３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる、項目１２０に記載の単離核酸配列。
（項目１２２）
項目１～１１４のいずれか１項に記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列を含む単離核酸配列。
（項目１２３）
前記核酸が、配列番号４０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる、項目１２２に記載の単離核酸配列。
（項目１２４）
項目１～１１４のいずれか１項に記載のＡＬＫ４ポリペプチドのコード配列と、項目１～１１４のいずれか１項に記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列とを含む単離核酸配列。
（項目１２５）
前記核酸が、
ａ）配列番号４３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなり、
ｂ）配列番号４０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる、
項目１２４に記載の単離核酸配列。
（項目１２６）
項目１２０または１２１に記載のＡＬＫ４ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む組み換えポリヌクレオチド。
（項目１２７）
項目１２２または１２３に記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む組み換えポリヌクレオチド。
（項目１２８）
項目１２４または１２５に記載ののＡＬＫ４ポリペプチドコード配列およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む組み換えポリヌクレオチド。
（項目１２９）
項目１２６～１２８のいずれか１項に記載の組み換えポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目１３０）
項目１２６～１２８のいずれか１項に記載の組み換えポリヌクレオチドまたは項目１２９に記載のベクターで形質転換された細胞。
（項目１３１）
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、項目１３０に記載の細胞。
（項目１３２）
ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を作製する方法であって、
ａ）ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養する工程であって、ここで前記細胞は項目１２６および１２７に記載の組み換えポリヌクレオチドを含む、工程；ならびに
ｂ）そうして発現させた前記ヘテロ多量体を回収する工程
を含む方法。
（項目１３３）
ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を作製する方法であって、
ａ）ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養する工程であって、ここで前記細胞は項目１２８に記載の組み換えポリヌクレオチドを含む、工程；ならびに
ｂ）そうして発現させた前記ヘテロ多量体を回収する工程
を含む方法。
（項目１３４）
ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を作製する方法であって、
ａ）ＡＬＫ４ポリペプチドの発現に適した条件下で第１の細胞を培養する工程であって、ここで前記第１の細胞は項目１２６に記載の組み換えポリヌクレオチドを含む、工程；ｂ）そうして発現させた前記ＡＬＫ４ポリペプチドを回収する工程；
ｃ）ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で第２の細胞を培養する工程であって、ここで前記第２の細胞は項目１２７に記載の組み換えポリヌクレオチドを含む、工程；
ｄ）そうして発現させた前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを回収する工程；
ｅ）ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体形成に適した条件下で、前記回収されたＡＬＫ４ポリペプチドと、前記回収されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとを合わせる工程；ならびに
ｆ）前記ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を回収する工程
を含む方法。
（項目１３５）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、ＴＰＡリーダー配列を使用して発現させられる、項目１３２～１３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３６）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ＴＰＡリーダー配列を使用して発現させられる、項目１３２～１３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３７）
前記ＴＰＡリーダーが、配列番号３８を含むか、から本質的になるか、またはからなる、項目１３５または１３６に記載の方法。
（項目１３８）
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、項目１３２～１３７に記載の方法。
（項目１３９）
前記ヘテロ多量体が、ヘテロ二量体である、項目１３２～１３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４０）
筋力低下または筋成長不全と関連する障害を有する患者を処置するための方法であって、処置を必要とする患者に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組合せの有効量を投与する工程を含む方法。
（項目１４１）
前記患者が、筋委縮症を有する、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
前記患者が、筋ジストロフィーを有する、項目１４０に記載の方法。
（項目１４３）
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
前記患者が、若年者であり、処置が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有すると診断された日から１～５年以内に始まる、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
前記筋ジストロフィーが、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーである、項目１４３に記載の方法。
（項目１４６）
前記患者が、筋委縮性側索硬化症を有する、項目１４０に記載の方法。
（項目１４７）
前記患者が、筋委縮性側索硬化症を有すると診断された後で、処置を施される、項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
前記障害が、がんまたはがん治療と関連する悪液質である、項目１４０に記載の方法。
（項目１４９）
神経変性と関連する障害を有する患者を処置するための方法であって、処置を必要とする患者に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組合せの有効量を投与する工程を含む方法。
（項目１５０）
前記障害が、筋萎縮性側索硬化症である、項目１４９に記載の方法。
（項目１５１）
線維症または線維症と関連する障害または状態を処置するための方法であって、処置を必要とする患者に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組合せの有効量を投与する工程を含む方法。
（項目１５２）
前記線維症と関連する障害または状態が、肺線維症、過敏性肺炎、特発性線維症、結核、肺炎、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、腎（腎臓）線維症、腎（腎臓）不全、慢性腎（腎臓）疾患、骨線維症、骨髄線維症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、サルコイドーシス、多発血管炎性肉芽腫症、ペロニー病、肝臓線維症、ウィルソン病、糖原病（特に、ＩＩＩ、ＩＶ、ＩＸおよびＸ型）、鉄過剰、ゴーシェ病、ツェルウェーガー症候群、非アルコール性およびアルコール性脂肪性肝炎、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、外科手術関連線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮（Ｄｕｐｕｔｒｅｎ’ｓ ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ）、縦隔線維症、腎性線維症（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｅｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、後腹膜線維症、心房性線維症、心内膜心筋線維症、膵臓線維症から選択される、項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
対象において体重を減少させるための方法であって、体重の減少を必要とする対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組み合わせの有効量を投与する工程を含む、方法。
（項目１５４）
対象において体重増加を減少させるための方法であって、体重増加の減少を必要とする対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組み合わせの有効量を投与する工程を含む、方法。
（項目１５５）
糖尿病を処置または予防するための方法であって、処置または予防を必要とする対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組み合わせの有効量を投与する工程を含む、方法。
（項目１５６）
前記対象が、ＩＩ型糖尿病を有する、項目１５５に記載の方法。
（項目１５７）
肥満症を処置または予防するための方法であって、処置または予防を必要とする対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組み合わせの有効量を投与する工程を含む、方法。
（項目１５８）
脂肪肝疾患を処置または予防するための方法であって、処置または予防を必要とする対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組み合わせの有効量を投与する工程を含む、方法。
（項目１５９）
前記対象が、非アルコール性脂肪肝疾患を有する、項目１５８に記載の方法。
（項目１６０）
対象においてコレステロールおよび／またはトリグリセリドを減少させるための方法であって、コレステロールおよび／またはトリグリセリドの減少を必要とする対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組み合わせの有効量を投与する工程を含む、方法。
（項目１６１）
前記対象が、２５ｋｇ／ｍ ２ またはそれより大きいボディー・マス・インデックス（ＢＭＩ）を有する、項目１５３～１６０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６２）
前記対象が肥満である、項目１５３～１６１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６３）
前記対象が、３０ｋｇ／ｍ ２ またはそれより大きいボディー・マス・インデックス（ＢＭＩ）を有する、項目１６２に記載の方法。
（項目１６４）
前記対象が、インスリン抵抗性を有する、項目１５３～１６３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６５）
前記対象が、２型糖尿病を有する、項目１５３～１６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６６）
前記対象が、脂質異常症、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬ血清レベル、高ＬＤＬ血清レベル、および高トリグリセリド血症からなる群から選択される疾患または状態を有する、項目１５３から１６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６７）
前記対象が、高血圧症（高血圧）、心筋梗塞、末梢動脈疾患、血圧調節機能不全、動脈硬化症、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化、冠動脈性心疾患、または細小血管疾患からなる群から選択される疾患または状態を有する、項目１５３から１６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６８）
前記対象が、脂肪肝疾患を有する、項目１５３から１６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６９）
前記対象が、非アルコール性脂肪肝疾患を有する、項目１６８に記載の方法。
（項目１７０）
所望されない体重増加および／または代謝性障害と関連する障害または状態を処置または予防するための方法であって、処置を必要とする対象に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組合せの有効量を投与する工程を含む方法。
（項目１７１）
前記障害または状態が、高血糖症、脂質代謝疾患（障害）、脂質異常症（ｄｉｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、低ＨＤＬレベル、高ＬＤＬレベル、高トリグリセリドレベル、高脂血症、リポタンパク質異常、グルコース代謝疾患、グルコース不耐症、インスリン抵抗性、グルコース耐性障害（ＩＧＴ）、空腹時血糖障害（ＩＦＧ）、高尿酸レベル、ＮＡＦＬＤ、脂肪肝、ＮＡＳＨ、多嚢胞性卵巣症候群、高インスリン血症、肥満症、ＩＩ型糖尿病、心疾患、高血圧、アテローム性動脈硬化、症候群Ｘ、メタボリック症候群、および高血圧症からなる群から選択される、項目１７０に記載の方法。
（項目１７２）
対象における線維症または線維症と関連する障害もしくは状態を処置するための方法であって、処置を必要とする対象に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組合せの有効量を投与する工程を含む方法。
（項目１７３）
前記線維症と関連する障害または状態が、肺線維症、過敏性肺炎、特発性線維症、結核、肺炎、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、腎（腎臓）線維症、腎（腎臓）不全、慢性腎（腎臓）疾患、骨線維症、骨髄線維症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、サルコイドーシス、多発血管炎性肉芽腫症、ペロニー病、肝臓線維症、ウィルソン病、糖原病（特に、ＩＩＩ、ＩＶ、ＩＸおよびＸ型）、鉄過剰、ゴーシェ病、ツェルウェーガー症候群、非アルコール性およびアルコール性脂肪性肝炎、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、外科手術関連線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮（Ｄｕｐｕｔｒｅｎ’ｓ ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ）、縦隔線維症、腎性線維症（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｅｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、後腹膜線維症、心房性線維症、心内膜心筋線維症および膵臓線維症から選択される、項目１７２に記載の方法。
（項目１７４）
前記ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、項目１～１１４のいずれか１項に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体または項目１１５～１１９のいずれか１項に記載の医薬調製物である、項目１４０～１７３および２０６～２１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７５）
前記ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、ＡＬＫ４に結合する抗体または抗体の組み合わせである、項目１４０～１７３および２０６～２１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７６）
前記抗体または抗体の組み合わせが、ＡＬＫ４に結合し、ＡＬＫ４活性を阻害する、項目１７５に記載の方法。
（項目１７７）
前記抗体または抗体の組み合わせが、細胞ベースのアッセイにおいてＡＬＫ４活性を阻害する、項目１７６に記載の方法。
（項目１７８）
前記ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体または抗体の組み合わせである、項目１４０～１７３および２０６～２１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７９）
前記抗体または抗体の組み合わせが、ＡｃｔＲＩＩＢに結合し、ＡｃｔＲＩＩＢ活性を阻害する、項目１７８に記載の方法。
（項目１８０）
前記抗体または抗体の組み合わせが、細胞ベースのアッセイにおいてＡｃｔＲＩＩＢ活性を阻害する、項目１７９に記載の方法。
（項目１８１）
前記ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、アクチビンＢ、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する抗体または抗体の組み合わせである、項目１４０～１７３および２０６～２１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８２）
前記抗体または抗体の組み合わせが、前記１つまたは複数のリガンドがＡＬＫ４に結合するのを阻害する、項目１８１に記載の方法。
（項目１８３）
前記抗体または抗体の組み合わせが、前記１つまたは複数のリガンドが１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢに結合するのを阻害する、項目１８１または１８２に記載の方法。
（項目１８４）
前記抗体または抗体の組み合わせが、ＡＬＫ４活性を阻害する、項目１８１～１８３に記載の方法。
（項目１８５）
前記抗体または抗体の組み合わせが、細胞ベースのアッセイにおいてＡＬＫ４活性を阻害する、項目１８４に記載の方法。
（項目１８６）
前記抗体または抗体の組み合わせが、ＡｃｔＲＩＩＢ活性を阻害する、項目１８１～１８３に記載の方法。
（項目１８７）
前記抗体または抗体の組み合わせが、細胞ベースのアッセイにおいてＡｃｔＲＩＩＢ活性を阻害する、項目１８６に記載の方法。
（項目１８８）
前記抗体または抗体の組み合わせが、多重特異性抗体である、項目１７５～１８７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８９）
前記抗体または抗体の組み合わせが、二重特異性抗体である、項目１８９に記載の方法。
（項目１９０）
前記抗体または抗体の組み合わせが、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、項目１７５～１９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９１）
前記抗体または抗体の組み合わせが、単鎖抗体、Ｆ（ａｂ’） ２ フラグメント、単鎖ダイアボディー、タンデム単鎖Ｆｖフラグメント、タンデム単鎖ダイアボディー、または単鎖ダイアボディーと免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも一部とを含む融合タンパク質である、項目１７５から１９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９２）
前記ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、低分子またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト低分子の組み合わせである、項目１４０～１７３および２０６～２１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９３）
前記低分子または低分子の組み合わせが、ＡＬＫ４活性を阻害する、項目１９２に記載の方法。
（項目１９４）
前記低分子または低分子の組み合わせが、細胞ベースのアッセイにおいてＡＬＫ４活性を阻害する、項目１９３に記載の方法。
（項目１９５）
前記低分子または低分子の組み合わせが、ＡｃｔＲＩＩＢ活性を阻害する、項目１９２に記載の方法。
（項目１９６）
前記低分子または低分子の組み合わせが、細胞ベースのアッセイにおいてＡｃｔＲＩＩＢ活性を阻害する、項目１９５に記載の方法。
（項目１９７）
前記低分子または低分子の組み合わせが、アクチビンＢ、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドを阻害する、項目１９２に記載の方法。
（項目１９８）
前記ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド組み合わせである、項目１４０～１７３および２０６～２１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９９）
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド組み合わせが、ＡＬＫ４活性を阻害する、項目１９８に記載の方法。
（項目２００）
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド組み合わせが、細胞ベースのアッセイにおいてＡＬＫ４活性を阻害する、項目１９９に記載の方法。
（項目２０１）
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド組み合わせが、ＡｃｔＲＩＩＢ活性を阻害する、項目１９８に記載の方法。
（項目２０２）
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド組み合わせが、細胞ベースのアッセイにおいてＡｃｔＲＩＩＢ活性を阻害する、項目２０１に記載の方法。
（項目２０３）
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド組み合わせが、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ、およびＮｏｄａｌからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドを阻害する、項目１９８に記載の方法。
（項目２０４）
前記ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、フォリスタチンポリペプチドである、項目１４０～１７３および２０６～２１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０５）
前記ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、ＦＬＲＧポリペプチドである、項目１４０～１７３および２０６～２１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０６）
腎疾患または腎疾患の合併症を処置するための方法であって、処置を必要とする患者に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組合せの有効量を投与する工程を含む方法。
（項目２０７）
前記患者が、慢性の腎疾患または腎不全を有する、項目２０６に記載の方法。
（項目２０８）
前記患者が、急性の腎疾患または腎不全を有する、項目２０６に記載の方法。
（項目２０９）
前記患者が、病期１、病期２、病期３、病期４、または病期５の腎疾患を有する、項目２０７に記載の方法。
（項目２１０）
病期１から病期２への腎疾患の進行、病期２から病期３への腎疾患の進行、病期３から病期４への腎疾患の進行、または病期４から病期５への腎疾患の進行を遅延させるかまたは予防する、項目２０７に記載の方法。
（項目２１１）
腎炎症を予防または軽減する、項目２０６から２１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１２）
腎組織損傷を予防または軽減する、項目２０６から２１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１３）
腎線維症を予防または軽減する、項目２０６から２１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１４）
前記患者が、非糖尿病性腎疾患、糸球体腎炎、間質性腎炎、糖尿病性腎疾患、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、急速進行性糸球体腎炎、腎線維症、アルポート症候群、ＩＤＤＭ腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎、腎間質性線維症、巣状分節状糸球体硬化症、膜性腎症、微小変化型疾患、微量免疫型急速進行性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、多発性嚢胞腎、デント病、腎シスチン蓄積症（ｎｅｐｈｒｏｃｙｔｉｎｏｓｉｓ）、ヘイマン腎炎、常染色体優性（成人型）多発性嚢胞腎、常染色体劣性（小児型）多発性嚢胞腎、急性腎傷害、ネフローゼ症候群、腎虚血症、有足細胞疾患または有足細胞障害、タンパク尿症、糸球体疾患、膜性糸球体腎炎、巣状分節状糸球体腎炎、子癇前症、子癇、腎病変、膠原血管病、良性起立性（体位性）タンパク尿症、ＩｇＭ腎症、膜性腎症、サルコイドーシス、糖尿病、薬物に起因する腎損傷、ファブリー病、アミノ酸尿症、ファンコーニ症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球病、ヘモグロビン尿症、ミオグロビン尿症、ウェゲナー肉芽腫症、１型糖原病、慢性腎疾患、慢性腎不全、糸球体濾過量（ＧＦＲ）低下症、腎血管硬化症、ループス腎炎、ＡＮＣＡ陽性微量免疫型半月体形成性糸球体腎炎、慢性移植腎症、腎臓毒性、腎毒性、腎壊死、腎損傷、糸球体尿細管傷害、腎機能不全、腎炎症候群、急性腎不全（急性腎傷害）、慢性腎不全、近位尿細管機能不全、急性腎移植拒絶、慢性腎移植拒絶、非ＩｇＡメサンギウム増殖性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、任意の種類の腎関与を伴う血管炎、任意の遺伝性腎疾患、任意の間質性腎炎、腎移植不全、腎臓がん、他の状態（例えば、高血圧症、糖尿病、および自己免疫疾患）と関連する腎疾患、デント病、腎シスチン蓄積症、ヘイマン腎炎、原発性腎疾患、虚脱性糸球体症、デンスデポジット病、寒冷グロブリン血症関連糸球体腎炎、ヘノッホ－シェーンライン病、感染後糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ－ストラウス症候群、抗ＧＢＭ抗体介在型糸球体腎炎、アミロイドーシス、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、線維性糸球体腎炎、イムノタクトイド糸球体症、虚血性尿細管傷害、薬物誘導性尿細管間質性腎炎、毒性尿細管間質性腎炎、感染性尿細管間質性腎炎、細菌性腎盂腎炎、ポリオーマウイルス感染またはＨＩＶ感染から生じるウイルス感染性尿細管間質性腎炎、代謝誘導性尿細管間質性疾患、混合性結合組織疾患、円柱腎症、尿酸結晶もしくはシュウ酸結晶または薬物誘導性結晶の沈着から生じ得る結晶腎症、急性細胞性尿細管間質性同種移植片拒絶、リンパ腫または移植後リンパ増殖性疾患から生じる腫瘍性浸潤性疾患、腎臓の閉塞性疾患、血管疾患、血栓性微小血管症、腎血管硬化症、アテローム塞栓性疾患、混合性結合組織疾患、結節性多発動脈炎、カルシニューリン阻害剤誘導性血管疾患、急性細胞性血管性同種移植片拒絶、急性体液性同種移植片拒絶、早期腎機能低下症（ＥＲＦＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、腎静脈血栓症、急性尿細管壊死、腎閉塞、急性間質性腎炎、確立された慢性腎疾患、腎動脈狭窄症、虚血性腎症、血尿症、薬物毒素誘導性慢性尿細管間質性腎炎、逆流腎症、腎臓結石、グッドパスチャー症候群、正球性正色素性貧血、腎性貧血、糖尿病性慢性腎疾患、ＩｇＧ４関連疾患、フォンヒッペル－リンダウ症候群、結節性硬化症、ネフロン癆、髄質性嚢胞腎疾患、腎細胞癌、腺癌、腎芽細胞腫、リンパ腫、白血病、低シアリル化障害、慢性シクロスポリン腎症、腎再灌流傷害、腎形成異常、高窒素血症、両側性動脈閉塞、急性尿酸性腎症、血液量減少、急性両側性閉塞性尿路疾患、高カルシウム血性腎症、溶血性尿毒症症候群、急性尿貯留、悪性腎硬化症、分娩後糸球体硬化症、強皮症、非グッドパスチャー抗ＧＢＭ病、顕微鏡的結節性多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫症、急性放射線腎炎、溶連菌感染後糸球体腎炎、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、鎮痛薬性腎症、動静脈フィステル、動静脈移植、透析、異所性腎、海綿腎、腎性骨形成異常症、単腎症、水腎、微量アルブミン尿症、尿毒症、血尿、高脂血症、低アルブミン血症、脂肪尿、アシドーシス、および高カリウム血症のうちの１つまたは複数を有する、項目２０６から２１３のいずれか一項に記載の方法。
図１Ａおよび１Ｂは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体ポリペプチドを含む異種タンパク質複合体の２つの概略例を示す。図１Ａは、１つのＩ型受容体融合ポリペプチドおよび１つのＩＩ型受容体融合ポリペプチドを含むヘテロ二量体のタンパク質複合体を示し、これは、各ポリペプチド鎖内に含まれる多量体化ドメインを介して共有結合的または非共有結合的にアセンブリすることができる。２つのアセンブリされた多量体化ドメインが相互作用ペアを構成し、これは誘導型であっても非誘導型であってもよい。図１Ｂは、図１Ａで描示した通りの２つのヘテロ二量体複合体を含むヘテロ四量体タンパク質複合体について描示する。より高次の複合体も、想定することができる。
図２は、Ｉ型受容体ポリペプチド（「Ｉ」と示す）（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡＬＫ４タンパク質、例えば、配列番号９、１０、１９、２０、４２、４４、４７、および４８、の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）およびＩＩ型受容体ポリペプチド（「ＩＩ」と表示される）（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、３９、４１、４５、および４６、の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）を含む異種タンパク質複合体の概略例を示す。例示された実施形態では、Ｉ型受容体ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの部分であり、ＩＩ型受容体ポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの部分である。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、Ｉ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドと、相互作用ペアの対応するメンバーとの間に位置付けられ得る。相互作用ペアの第１および第２のメンバーは誘導型（非対称）であってよく、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりむしろ、優先的に互いと会合することを意味し、あるいは相互作用ペアは非誘導型であってよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先性なしで互いと会合する、または自己会合することができ、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味する。伝統的なＦｃ融合タンパク質および抗体は非誘導型相互作用ペアの例であり、他方、操作されたＦｃドメインの種類は誘導型（非対称）相互作用ペアとしてデザインされている［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２Ａ）： ９５－１０６］。
図３は、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡの結晶構造の合成解析に基づき、ボックスで指し示されるリガンドに直接接触することが本明細書で推定される残基を伴う、ヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン（配列番号４９）およびヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（配列番号２）のアラインメントを示す。
図４は、種々の脊椎動物の細胞内ドメインのないＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質（それぞれ、配列番号５０～５５）、細胞内ドメインのないヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質（配列番号５６）、およびコンセンサスＡｃｔＲＩＩ前駆体タンパク質（配列番号５７）の多重配列アライメントを示す。
図５は、Ｃｌｕｓｔａｌ ２．１を使用した、ヒトＩｇＧアイソタイプに由来するＦｃドメインの多重配列アラインメントを示す。ヒンジ領域は、点線の下線によって指し示されている。二重の下線は、非対称鎖ペア形成を促進するようにＩｇＧ１ Ｆｃにおいて操作された位置と、他のアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に関する対応する位置の例を指し示す。
図６は、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体についての、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体と比較した、比較リガンド結合データを示す。各タンパク質複合体について、リガンドを、リガンドによるシグナル伝達の阻害と良好に相関する反応速度定数であるｋｏｆｆによりランク付けし、結合アフィニティの降順に列挙する（最も緊密に結合したリガンドを、一番上に列挙する）。左側において、黄線、赤線、緑線、および青線は、オフ速度定数の大きさを指し示す。黒実線は、ヘテロ二量体への結合がホモ二量体と比較して増強されるかまたは不変であるリガンドを指し示すのに対し、赤破線は、ホモ二量体と比較して実質的に低減した結合を指し示す。示される通り、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、ホモ二量体と比較してアクチビンＢへの結合の増強を提示し、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体について観察されるようなアクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１への強い結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３への結合の実質的な低減を呈示する。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と同様に、ヘテロ二量体は、ＢＭＰ６への中レベルの結合を保持する。
図７は、種々の脊椎動物種に由来するＡＬＫ４細胞外ドメイン（配列番号５９～６５）の多重配列アライメントを示す。
図８Ａ～８Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡＬＫ４タンパク質、例えば、配列番号９、１０、１９、２０、４２、４４、４７、および４８、の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）と、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、３９、４１、４５、および４６、の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）とを含むンパク質複合体の概略例を示す。 例示された実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチド（左から右）は、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの部分であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの部分である。適当な相互作用ペアは、例えば、本明細書に記載されるものなどの重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用ペア、その短縮体および改変体を含んだ［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２Ａ）： ９５－１０６］。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用ペアの対応するメンバーとの間に位置付けられ得る。相互作用ペアの第１および第２のメンバーは非誘導型であり得、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先性なしで互いと会合する、または自己会合することができることを意味し、これらは、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得る。図８Ａを参照のこと。代替的に、相互作用ペアは誘導型（非対称）ペアであり得、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりむしろ、優先的に互いと会合することを意味する。図８Ｂを参照のこと。より高次の複合体が構想され得る。図８Ｃおよび８Ｄを参照のこと。 同上 同上 同上
図９Ａ～９Ｇは、２つのＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種に由来するＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、配列番号９、１０、１９、２０、４２、４４、４７、および４８、と独立に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド）と、２つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種に由来するＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメイン、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、３９、４１、４５、および４６、と独立に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である２つのポリペプチド）とを含む異種タンパク質複合体の概略例を示す。例示される実施形態９Ａでは、第１のＡＬＫ４ポリペプチド（左から右）は、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含み、追加の相互作用ペアの第１のメンバー（「Ａ１」）をさらに含む融合ポリペプチドの部分であり；第２のＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含み、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ａ２」）をさらに含む融合ポリペプチドの部分である。第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（左から右）は、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｂ１」）を含む融合ポリペプチドの部分であり；第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｂ２」）を含む融合ポリペプチドの部分である。Ａ１およびＡ２は同じであってもよいし異なってもよく、Ｂ１およびＢ２は同じであってもよいし異なってもよく、Ｃ１およびＣ２は同じであってもよいし異なってもよい。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用ペアの対応するメンバーとの間、ならびに相互作用ペア間に位置付けられ得る。図９Ａは非誘導型相互作用ペアの会合の例であり、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先性なしで互いと会合する、または自己会合することができ、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味する。例示される実施形態９Ｂでは、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（左から右）は、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含み、追加の相互作用ペアの第１のメンバー（「Ａ１」）をさらに含む融合ポリペプチドの部分である。；第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｂ２」）を含む融合ポリペプチドの部分である。第１のＡＬＫ４ポリペプチド（左から右）は、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｂ１」）を含む融合ポリペプチドの部分であり；第２のＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含み、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ａ２」）をさらに含む融合ポリペプチドの部分である。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用ペアの対応するメンバーとの間、ならびに相互作用ペア間に位置付けられ得る。図９Ｂは誘導型（非対称）相互作用ペアの会合の例であり、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりむしろ、優先的に互いと会合することを意味する。適当な相互作用ペアは、例えば、本明細書に記載されるものなどの重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用ペア、その短縮体および改変体を含んだ［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２Ａ）： ９５－１０６］。より高次の複合体が構想され得る。図９Ｃ～９Ｆを参照のこと。類似の方法（特に、軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン、その短縮体、または改変体を利用するもの）を使用して、相互作用ペアを使用して抗体ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２複合体に似たＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体を作製することができる［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２Ａ）： ９５－１０６］。図９Ｇを参照のこと。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図１０Ａおよび１０Ｂは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるようなヒトまたは他の種由来のＡＬＫ４タンパク質、例えば、配列番号９、１０、１９、２０、４２、４４、４７、および４８、の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、３９、４１、４５、および４６、の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）、ならびに抗体のリガンド結合ドメイン（例えば、１つまたは複数のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンドに結合する抗体に由来するリガンド結合ドメイン）を含む異種タンパク質複合体の概略例を示す。例示された実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含み、追加の相互作用ペアの第１のメンバー（「Ａ１」）をさらに含む融合ポリペプチドの部分である。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｂ１」）を含む融合ポリペプチドの部分である。可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含み、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ａ２」）をさらに含む融合ポリペプチドの部分である。可変重鎖（ＶＬ）ポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｂ２」）を含む融合ポリペプチドの部分である。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用ペアの対応するメンバーとの間、相互作用ペア間、ならびにＶＨおよびＶＬポリペプチドと、相互作用ペアのメンバーがとの間に位置付けられ得る。Ａ１およびＡ２は同じであってもよいし異なってもよく；Ｂ１およびＢ２は同じであってもよいし異なってもよく、Ｃ１およびＣ２は同じであってもよいし異なってもよい。適当な相互作用ペアは、例えば、本明細書に記載されるものなどの定常および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用ペア、その短縮体および改変体を含んだ［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２Ａ）： ９５－１０６］。図１０Ａは、誘導型（非対称）相互作用ペアの会合の例であり、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりむしろ、優先的に互いと会合することを意味する。図１０Ｂは非誘導型相互作用ペアの会合の例であり、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先性なしで互いと会合する、または自己会合することができ、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味する。そのような抗体－ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ複合体は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢリガンドではない作用因子にさらに結合／アンタゴナイズすることが所望される状況で有用であり得る。代替的に、そのような抗体－ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ複合体は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合／アンタゴニズムをさらに増強することが所望される状況で有用であり得る。例えば、本明細書の実施例によって実証されるように、アクチビンＢ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８は全て、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体に強いアフィニティで結合する。加えて、ＢＭＰ６はＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体に結合するが、より弱いアフィニティである。高アフィニティ結合リガンドの１つまたは複数（例えば、アクチビンＢ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８）に加えてＢＭＰ６活性をアンタゴナイズすることが所望されるある特定の状況では、ＢＭＰ６はＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体に対する結合について打ち勝ち得る。そのような状況では、抗体のＢＭＰ６結合ドメインのＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体への付加は、そのようなタンパク質複合体がアクチビンＢ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８の１つまたは複数に加えてＢＭＰ６をアンタゴナイズする能力を改良する。 同上

図１１は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢシングルトラップポリペプチドの概略例を示す。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢシングルトラップポリペプチドは、同じまたは異なる配列を有する複数のＡＬＫ４ドメイン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、９、１０またはそれより多くのドメイン）および同じまたは異なる配列を有する複数のＡｃｔＲＩＩＢドメイン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、９、１０またはそれより多くのドメイン）を含み得る。これらのＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢドメインは任意の順序で配列されてよく、１つまたは複数のＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢドメインの間に１つまたは複数のリンカードメイン位置を含み得る。そのようなリガンドトラップは、本明細書に記載の疾患または状態を処置または予防するための治療剤として使用することができる。
図１２Ａ～１２Ｄは、少なくとも１つのＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖トラップポリペプチドを含むマルチマータンパク質複合体の概略例を示す。例示された実施形態では、１２Ａおよび１２Ｂ、第１のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖トラップポリペプチド（左から右）は、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの部分であり；第２のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖トラップポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの部分である。Ｃ１およびＣ２は同じであってもよいし異なってもよい。第１および第２のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖トラップポリペプチドは同じであってもよいし異なってもよい。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖トラップポリペプチドと、相互作用ペアの対応するメンバーとの間に位置付けられ得る。適当な相互作用ペアは、例えば、本明細書に記載されるような重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用ペア、その短縮体および改変体を含んだ［例えば、 Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２Ａ）： ９５－１０６］。図１２Ａは非誘導型相互作用ペアの会合の例であり、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先性なしで互いと会合する、または自己会合することができ、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味する。図１２Ｂは誘導型（非対称）相互作用ペアの会合の例であり、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりむしろ、優先的に互いと会合することを意味する。加えて、そのようなＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖トラップポリペプチドは、同様に、１つまたは複数のＡＬＫ４ポリペプチドおよび／または１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に会合し得る。図１２Ｃを参照のこと。また、そのようなＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖トラップポリペプチドは、同様に、１つまたは複数の抗体のリガンド結合ドメイン（例えば、１つまたは複数のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンドに結合する抗体のリガンド結合ドメイン）に共有結合的または非共有結合的に会合し得る。図１２Ｄを参照のこと。 同上 同上 同上
図１３は、本明細書に記載されるようにＡ－２０４ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙによって決定した場合の比較ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体／ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体ＩＣ５０データを示す。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と同様にアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害する。しかし、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０シグナル伝達経路のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体による阻害は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較して著明に低減した。これらのデータは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が対応するＡｃｔＲＩＩＢ：ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較してアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを実証する。
図１４Ａ～１４Ｃは、片側尿管閉塞（ＵＵＯ）に供したマウス腎臓に由来する、線維化遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、ＰＡＩ－１、ＣＴＧＦ、およびａ－ＳＭＡ）、炎症遺伝子（ＴＮＦ－アルファおよびＭＣＰ１）、サイトカイン遺伝子（ＴＧＦ－β１、ＧＦ－ベータ２、ＴＧＦ－β３、およびアクチビンＡ）、腎傷害遺伝子（ＮＧＡＬ）、低酸素誘導因子－１アルファ（ＨＩＦ１ａ）、およびアクチビンＡ受容体（Ａｃｖｒ２Ａ）についての遺伝子発現プロファイルを示す。対側の非施術腎に由来する試料を、対照（Ｃｔｒｌ）として使用した。遺伝子発現プロファイルは、手術後１７日目に得た。手術後３、７、１０、および１４日目において、マウスに、ＰＢＳまたはＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体のいずれかを投与した。（＄）は、ＰＢＳだけを投与されたマウスの１７日目におけるＵＵＯ腎と、比較したＡＬＫ７－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体を投与されたマウスの１７日目におけるＵＵＯ腎との間の統計学的差違を表す。（＠）は、転写物が検出されなかったことを表す。 同上 同上
１．概観
部分的に、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドおよびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドを含むヘテロ多量体、その使用、およびそのようなヘテロ多量体を作製する方法に関連する。例えば、図１および２を参照のこと。ある特定の好ましい実施形態では、ヘテロ多量体は、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインおよびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含む。特に、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体を提供する。好ましくは、そのようなＡＬＫ４ポリペプチドはＡＬＫ４受容体のリガンド結合ドメインを含み、そのようなＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドはＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド結合ドメインを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するホモ多量体の試料と比較して変更されたＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合プロファイル／特異性を有する（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ：ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体またはＡＬＫ４：ＡＬＫ４ホモ二量体と比較したＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）。
ＴＧＦ－βスーパーファミリーは、ＴＧＦ－β、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、骨形成遺伝子タンパク質（ＢＭＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、および抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を含む、３０を超える分泌因子から構成される［Ｗｅｉｓｓら（２０１３年）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（１号）：４７～６３頁］。スーパーファミリーのメンバーであって、脊椎動物および非脊椎動物のいずれにおいても見出されるメンバーは、多様な組織内で遍在的に発現し、動物の寿命を通して発生の最早期に機能する。実際、ＴＧＦ－βスーパーファミリータンパク質は、幹細胞の自己再生、原腸形成、分化、器官の形態形成、および成体組織のホメオスタシスの鍵となるメディエーターである。ＴＧＦ－βスーパーファミリーによるシグナル伝達の異常が、例えば、自己免疫疾患、心血管疾患、線維性疾患、およびがんを含む広範にわたるヒト病態と関連することは、この活性の遍在性と符合する。
ＴＧＦ－βスーパーファミリーのリガンドは、１つの単量体の中央３－１／２ターンヘリックスが、他の単量体のベータ－ストランドにより形成される凹部表面に対してパッキングされる、同じ二量体構造を共有する。ＴＧＦ－βファミリーメンバーの大半は、分子間ジスルフィド結合によりさらに安定化される。このジスルフィド結合は、「システインノット」モチーフと称されるモチーフを生成する他の２つのジスルフィド結合により形成されるリングを横切る［Ｌｉｎら（２００６年）、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、１３２巻：１７９～１９０頁；およびＨｉｎｃｋら（２０１２年）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０～１８７０頁］。
ＴＧＦ－βスーパーファミリーのシグナル伝達は、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼ受容体の異種複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）によって媒介され、これらは、リガンド刺激の際に、下流のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤタンパク質１、２、３、５、および８）をリン酸化および活性化する［Ｍａｓｓａｇｕｅ、２０００年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１巻：１６９～１７８頁］。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、システインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および、予測セリン／スレオニンキナーゼ特異性を持つ細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。概して、Ｉ型受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介する一方、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドの結合に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型の受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。
ＴＧＦ－βファミリーは、結合するＩ型受容体と、活性化させるＳｍａｄタンパク質とに基づき、系統発生上の２つの分枝に分けることができる。１つは、近年進化した分枝であり、例えば、ＴＧＦ－β、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ３およびＮｏｄａｌを含み、これは、Ｓｍａｄ２および３を活性化するＩ型受容体を介してシグナル伝達する［Ｈｉｎｃｋ （２０１２） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８６：１８６０－１８７０］。他の分枝は、スーパーファミリーのより遠い関連タンパク質を含み、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７を含み、これは、Ｓｍａｄ１、５、および８を介してシグナル伝達する。
ＴＧＦ－βアイソフォームは、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの基礎となるメンバーであり、そのうち、哺乳動物では、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３と表示される３つのアイソフォームが公知である。生物活性な成熟ＴＧＦ－βリガンドは、ホモ二量体として機能し、主に、Ｉ型受容体であるＡＬＫ５を介してシグナル伝達するが、加えてまた、内皮細胞内のＡＬＫ１を介してもシグナル伝達することが見出されている［Ｇｏｕｍａｎｓら（２００３年）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、１２巻（４号）：８１７～８２８頁］。ＴＧＦ－β１は、最も夥多であり、かつ、遍在的に発現するアイソフォームである。ＴＧＦ－β１は、創傷治癒において重要な役割を果たすことが公知であり、恒常的に活性なＴＧＦ－β１トランス遺伝子を発現するマウスは、線維症を発症する［Ｃｌｏｕｔｈｉｅｒら（１９９７年）、Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１００巻（１１号）：２６９７～２７１３頁］。ＴＧＦ－β１はまた、Ｔ細胞の活性化および調節性Ｔ細胞の維持にも関与する［Ｌｉら（２００６年）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２５巻（３号）：４５５～４７１頁］。ＴＧＦ－β２の発現は、ヒト神経膠芽腫細胞において最初に説明されたが、胚神経系のニューロン内および星状膠細胞内で生じる。ＴＧＦ－β２は、Ｔリンパ球のインターロイキン２依存性増殖を抑制することが公知である。ＴＧＦ－β３は当初、ヒト横紋筋肉腫細胞系から単離され、以来、肺腺癌および腎癌細胞系において見出されている。ＴＧＦ－β３は、口蓋および肺の形態形成に重要であることが公知である［Ｋｕｂｉｃｚｋｏｖａら（２０１２年）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０巻：１８３頁］。
アクチビンは、ＴＧＦ－βスーパーファミリーのメンバーであり、当初、濾胞刺激ホルモンの分泌の調節因子として発見されたが、その後、多様な生殖的および非生殖的役割が特徴付けられている。２つの近縁のβサブユニットのホモ／ヘテロ二量体（それぞれ、βＡβＡ、βＢβＢ、およびβＡβＢ）である、３つの主要なアクチビン形態（Ａ、Ｂ、およびＡＢ）が存在する。ヒトゲノムはまた、主に肝臓内で発現する、アクチビンＣおよびアクチビンＥもコードし、βＣまたはβＥを含有するヘテロ二量体形態もまた公知である。ＴＧＦ－βスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤の細胞におけるホルモン生成を刺激し得、神経細胞の生存を支援し得、細胞周期の進行に対して細胞型に依存して正もしくは負に影響を及ぼし得、そして、少なくとも両生類の胚において中胚葉分化を誘導し得る、独特かつ多機能の作用因子である［ＤｅＰａｏｌｏら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１９８巻：５００～５１２頁；Ｄｙｓｏｎら（１９９７年）、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．７巻：８１～８４頁；およびＷｏｏｄｒｕｆｆ（１９９８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５巻：９５３～９６３頁］。いくつかの組織では、アクチビンのシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体であるインヒビンによってアンタゴナイズされる。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌の制御において、アクチビンは、ＦＳＨの合成および分泌を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨの合成および分泌を低減する。アクチビンの生活性を調節し得、そして／または、アクチビンに結合し得る他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ、ＦＬＲＧまたはＦＳＴＬ３としても公知）およびα２－マクログロブリンが挙げられる。
本明細書で記載される通り、「アクチビンＡ」に結合する作用因子は、単離βＡサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてであれ、βＡサブユニットに特異的に結合する作用因子である。ヘテロ二量体の複合体（例えば、βＡβＢヘテロ二量体）の場合、「アクチビンＡ」に結合する作用因子は、βＡサブユニット内に存在するエピトープには特異的であるが、複合体のβＡ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンＡ」にアンタゴナイズする（これを阻害する）本明細書で開示される作用因子は、単離βＡサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてあれ、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性を阻害する作用因子である。βＡβＢヘテロ二量体の場合、「アクチビンＡ」を阻害する作用因子は、βＡサブユニットの１つまたは複数の活性を特異的に阻害するが、複合体のβＡ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）の活性は阻害しない作用因子である。この原則はまた、「アクチビンＢ」、「アクチビンＣ」、および「アクチビンＥ」に結合し、かつ／またはこれらを阻害する作用因子にも当てはまる。「アクチビンＡＢ」にアンタゴナイズする本明細書で開示される作用因子は、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性と、βＢサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性とを阻害する作用因子である。同じ原則が、「アクチビンＡＣ」、「アクチビンＢＣ」、「アクチビンＡＥ」および「アクチビンＢＥ」に結合し、かつ／またはこれらを阻害する作用因子にも当てはまる。
Ｎｏｄａｌタンパク質は、中胚葉および内胚葉の誘導および形成における機能のほか、初期胚発生における心臓および胃など、体軸構造（ａｘｉａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の後続の組織化における機能も有する。発生しつつある脊椎動物の胚内の背側組織は主に、脊索および前索板の体軸構造に寄与する一方で、体軸構造以外の胚構造を形成するように、周囲の細胞を動員することが実証されている。Ｎｏｄａｌは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体の両方ならびにＳＭＡＤタンパク質として公知の細胞内エフェクターを介して、シグナル伝達すると考えられている。研究は、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢは、ＮｏｄａｌのＩＩ型受容体として機能するという考えを裏付ける［Ｓａｋｕｍａら（２００２年）、Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．、２００２年、７巻：４０１～１２頁］。Ｎｏｄａｌリガンドは、それらの補因子（例えば、ＣｒｉｐｔｏまたはＣｒｉｐｔｉｃ）と相互作用して、アクチビンＩ型受容体およびアクチビンＩＩ型受容体を活性化させ、これにより、ＳＭＡＤ２をリン酸化することが示唆される。Ｎｏｄａｌタンパク質は、初期脊椎動物胚に極めて重要な多くのイベントであって、中胚葉形成、前部パターン形成、および左右体軸の指定を含むイベントに関与している。実験的証拠により、Ｎｏｄａｌシグナル伝達は、アクチビンおよびＴＧＦβに特異的に応答することが既に示されているルシフェラーゼレポーターである、ｐＡＲ３－Ｌｕｘを活性化させることが実証されている。しかし、Ｎｏｄａｌは、骨形成性タンパク質に対して特異的に応答するレポーターである、ｐＴｌｘ２－Ｌｕｘを誘導することは不可能である。近年の結果は、Ｎｏｄａｌシグナル伝達は、ＴＧＦβおよびアクチビンによるシグナル伝達も媒介するＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３に媒介されるという直接的な生化学的証拠を提示する。さらなる証拠により、Ｎｏｄａｌシグナル伝達には、細胞外タンパク質ＣｒｉｐｔｏまたはＣｒｉｐｔｉｃを要することが示されており、これにより、Ｎｏｄａｌシグナル伝達は、アクチビンシグナル伝達またはＴＧＦβシグナル伝達と顕著に異なっている。
ＢＭＰおよびＧＤＦは、併せて、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの特徴的折り畳みを共有するシステインノットサイトカインのファミリーを形成する［Ｒｉｄｅｒら（２０１０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、４２９巻（１号）：１～１２頁］。このファミリーは、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２ａ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ１０としても公知）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２としても公知）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１としても公知）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７としても公知）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６）、ＢＭＰ１４（ＧＤＦ５としても公知）、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３（ＶＧＲ２としても公知）、ＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１５およびｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃを含む。骨形成を誘導する能力であって、ＢＭＰにそれらの名称を与えた能力のほか、ＢＭＰ／ＧＤＦは、広範にわたる組織の発達における形態形成活性も提示する。ＢＭＰ／ＧＤＦホモおよびヘテロ二量体は、Ｉ型およびＩＩ型受容体の二量体の組合せと相互作用して、複数の可能なシグナル伝達複合体をもたらし、ＳＭＡＤ転写因子の２つの競合するセットのうちの１つを活性化させる。ＢＭＰ／ＧＤＦは、高度に特異的で、局在化された機能を有する。これらは、ＢＭＰ／ＧＤＦ発現の発達上の制限を含む多数の形で調節されており、高アフィニティでサイトカインに結合するいくつかの特異的ＢＭＰアンタゴニストタンパク質の分泌を介して調節されている。興味深いことに、これらの多数のアンタゴニストは、ＴＧＦ－βスーパーファミリーのリガンドに相似している。
増殖および分化因子８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知であり、骨格筋量の負の調節因子である。ＧＤＦ８は、発生中および成体中の骨格筋において高度に発現する。遺伝子導入マウスにおけるＧＤＦ８欠失変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成を特徴とする［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７年）、３８７巻：８３～９０頁］。骨格筋量の同様の増加は、ウシおよび、驚くべきことに、ヒト［Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４年）、Ｇｒｏｗｔｈ、３８巻：５０１～５０７頁；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ、Ｊ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ．、（１９９４年）３８巻：７５２～７５７頁；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、（１９９７年）９４巻：１２４５７～１２４６１頁；Ｋａｍｂａｄｕｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、（１９９７年）７巻：９１０～９１５頁；およびＳｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２～８頁］におけるＧＤＦ８の天然に存在する変異において明らかである。研究は、ヒトにおけるＨＩＶ感染に関連する筋肉消耗には、ＧＤＦ８タンパク質の発現の増加が随伴することも示している［Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃａｄａｖｉｄら、ＰＮＡＳ、（１９９８年）９５巻：１４９３８～４３頁］。加えて、ＧＤＦ８は、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成を調節することが可能であり、筋芽細胞の増殖を調節し得る［国際特許出願公開第ＷＯ００／４３７８１号］。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合的に結合し、その生物活性を不活性化することができる［Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３巻：６４０７～６４１５頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３巻：７６４６～７６５４頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９０年）、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻：３５～４３頁］。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、それらの生物活性を阻害する他のタンパク質として、フォリスタチン、および、潜在的に、フォリスタチン関連タンパク質が挙げられる［Ｇａｍｅｒら（１９９９年）、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２～２３２頁］。
ＢＭＰ１１としても公知のＧＤＦ１１は、マウス発生時に尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓、ならびに後根神経節において発現する分泌タンパク質である［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９９年）、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、２２巻：２６０～２６４頁；およびＮａｋａｓｈｉｍａら（１９９９年）、Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ．、８０巻：１８５～１８９頁］。ＧＤＦ１１は、中胚葉組織および神経組織の両方のパターン形成において、固有の役割を果たす［Ｇａｍｅｒら（１９９９年）、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２～３２頁］。ＧＤＦ１１は、発生中のニワトリの肢における軟骨形成および筋発生の負の調節因子であることが示された［Ｇａｍｅｒら（２００１年）、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．、２２９巻：４０７～２０頁］。筋内のＧＤＦ１１の発現はまた、ＧＤＦ８と同様の方式での筋肉の増殖の調節におけるその役割も示唆する。加えて、脳内のＧＤＦ１１の発現は、ＧＤＦ１１はまた、神経系の機能に関連する活性を有し得ることを示唆する。興味深いことに、ＧＤＦ１１は、嗅上皮における神経発生を阻害することも見出された［Ｗｕら（２００３年）、Ｎｅｕｒｏｎ、３７巻：１９７～２０７頁を参照］。よって、阻害剤であるＧＤＦ１１は、筋疾患および神経変性疾患（例えば、筋委縮性側索硬化症）などの疾患を処置するのに、インビトロおよびインビボにおいて適用することができる。
骨形成性タンパク質１（ＯＰ－１）とも呼ばれるＢＭＰ７は、軟骨および骨の形成を誘導することが周知である。加えて、ＢＭＰ７は、広範にわたる生理プロセスも調節する。例えば、ＢＭＰ７は、上皮骨形成現象の一因となる、骨誘導因子であり得る。また、ＢＭＰ７がカルシウムの調節および骨のホメオスタシスにおいても役割を果たすことも見出されている。アクチビンと同様に、ＢＭＰ７も、ＩＩ型受容体であるＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する。しかし、ＢＭＰ７とアクチビンとは、異なるＩ型受容体を動員して、ヘテロマーの受容体複合体となる。観察されるＢＭＰ７の主要なＩ型受容体が、ＡＬＫ２であったのに対し、アクチビンはもっぱらＡＬＫ４（ＡｃｔＲＩＩＢ）に結合した。ＢＭＰ７とアクチビンとは、顕著に異なる生体応答を誘発し、異なるＳＭＡＤ経路を活性化させた［Ｍａｃｉａｓ－Ｓｉｌｖａら（１９９８年）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７３巻：２５６２８～３６頁］。
本明細書で記載される通り、比較結合データは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、結合プロファイル（リガンド選択性）が対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体またはＡＬＫ４ホモ二量体と比較して変更されることを実証した。特に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ホモ二量体と比較してアクチビンＢへの結合の増強を提示し、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体について観察されるようなアクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１への強い結合を保持する。しかし、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較してＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３への結合の実質的な低減を呈示する。特に、ＢＭＰ９は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体に対して低度のアフィニティを提示するか、または観察可能なアフィニティを提示しないが、このリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体には強く結合する。
したがって、これらの結果は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較してアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニスト（インヒビター）であることを実証する。したがって、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、そのような選択的アンタゴニズムが有利であるある特定の適用において、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体より有用である。例として、１つまたは複数のアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のアンタゴニズムを保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ６の１つまたは複数のアンタゴニズムは最小化することが所望される治療適用が挙げられる。
さらに、本明細書で記載されるように、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、骨格筋および骨に対する有益な同化効果、ならびに脂肪組織に対する異化効果であって、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体の効果と非常に類似する効果を及ぼす。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と異なり、ＡｃｔＲＩＩＢ：ＡＬＫ４ヘテロ二量体は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０には、低アフィニティまたは一過性の結合を呈示するに過ぎないので、血管新生など、これらのリガンドにより媒介されるプロセスに対しては、ほとんど～全く共時的な阻害を示さない。この新規の選択性は、例えば、筋肉および骨に対する刺激性効果、ならびに脂肪に対する阻害性効果は必要とするが、血管新生の変更は必要としない患者の処置において有用となる。
本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の組成物および方法、ならびに、これらの作製方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲および意味は、それが使用される特定の文脈から明らかである。
「へテロマー」または「ヘテロ多量体」という用語は、少なくとも第１のポリペプチド鎖と、第２のポリペプチド鎖とを含む複合体であって、第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、第１のポリペプチド鎖と、少なくとも１つのアミノ酸残基だけ異なる複合体を指す。へテロマーは、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖により形成される「ヘテロ二量体」を含む場合もあり、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖に加えて、１つまたは複数のポリペプチド鎖が存在するより高次の構造を形成する場合もある。ヘテロ多量体の例示的な構造として、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、およびさらなるオリゴマー構造が挙げられる。本明細書では、ヘテロ二量体を、Ｘ：Ｙまたは、これと同義に、Ｘ－Ｙと表示する［表示中、Ｘは第１のポリペプチド鎖を表し、Ｙは第２のポリペプチド鎖を表す］。本明細書では、より高次のへテロマーおよびオリゴマー構造を対応する形式で表示する。ある特定の実施形態では、ヘテロ多量体は、組換え（例えば、１つまたは複数のポリペプチド構成要素が、組換えタンパク質であり得る）であり、単離されており、かつ／または精製されている。
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて「共通する進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、同じ生物種のスーパーファミリーからのタンパク質ならびに異なる生物種からの相同タンパク質を含む。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。しかし、一般的な用法およびこの出願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連していてもしていなくてもよい。
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共有している場合も共有していない場合もある、核酸もしくはアミノ酸配列間の同一性もしくは対応性の程度をいう。
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に照らした「配列同一性パーセント（％）」とは、配列を決定し、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後における、保存的置換は配列同一性の一部と考えない場合の、候補配列内のアミノ酸残基（または核酸）の百分率であって、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列内のアミノ酸残基（または核酸）と同一であるアミノ酸残基（または核酸）の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的とするアラインメントは、当該分野の技術の範囲内にある種々の方式で、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア、ＢＬＡＳＴ－２ソフトウェア、ＡＬＩＧＮソフトウェア、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、配列を決定するのに適切なパラメータであって、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含むパラメータを決定することができる。しかし、本明細書の目的では、アミノ酸（核酸）配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムである、ＡＬＩＧＮ－２を使用して生成する。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードは、使用説明書と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここで、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から一般に利用可能であるが、ソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上の使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムにより設定され、変化しない。
本明細書で使用される場合、そうでないと記述しない限り、「Ｘに実質的に結合しない」とは、「Ｘ」に対する作用因子のＫＤが、約１０－７より大きい、１０－６より大きい、１０－５より大きい、１０－４より大きい、またはそれより大きい（例えば、ＫＤを決定するのに使用されるアッセイにより検出可能でない結合）を意味することが意図され、ここで「Ｘ」はタンパク質または核酸などの特定された作用因子である。
その全ての文法的形態において、「アゴナイズ」とは、タンパク質および／もしくは遺伝子を活性化させる（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を活性化させるか、もしくは増幅することにより、または不活性タンパク質を活性状態に入るように誘導することにより）か、またはタンパク質および／もしくは遺伝子の活性を増大させる過程を指す。
その全ての文法的形態において、「アンタゴナイズ」とは、タンパク質および／もしくは遺伝子を阻害する（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を阻害するか、もしくは減少させることにより、または活性タンパク質を不活性状態に入るように誘導することにより）か、またはタンパク質および／もしくは遺伝子の活性を減少させる過程を指す。
本明細書および特許請求の範囲を通して数値と関連して使用される場合の「約」および「およそ」という用語は、当業者にとって馴染みがあり、許容可能な、正確さの区間を表す。一般に、このような正確さの区間は、±１０％である。代替的に、特に、生物学的系では、「約」および「およそ」という用語は、ある大きさの程度内、好ましくは、所与の値の≦５倍であり、より好ましくは、≦２倍以内である値を意味し得る。
本明細書で開示される数値範囲は、範囲を規定する数について包含的である。
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、その用語が使用される文脈によりそうでないことが明らかに指示されるのでない限り、複数の言及を含む。本明細書では、「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）という用語、ならびに「１つまたは複数の」および「少なくとも１つの」という用語を、互換的に使用することができる。さらに、本明細書で使用される場合の「および／または」とは、２つまたはこれを超える指定された特色または構成要素であって、他の特色または構成要素を伴うかまたは伴わない特色または構成要素の各々を具体的に開示するものとして理解されるものとする。したがって、本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、以下の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）の各々を包摂することを意図する。
本明細書を通して、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、言明された整数または整数の群の包含を含意するものであり、他のいずれの整数または整数の群の除外も含意するものではないと理解される。
２．ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト
本明細書において記載されるように、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーのリガンドの固有のアンタゴニストであり、対応するＡｃｔＲＩＩＢおよびＡＬＫ４ホモ二量体と比較して異なるリガンド結合プロファイル／選択性を呈することが見出された。特に、例示的なＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、いずれのホモ二量体と比較してもアクチビンＢに対する結合の増強を提示し、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体で観察されるようなアクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対する強い結合を保持したが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３に対する実質的に低減された結合を呈示する。実際、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＢＭＰ９に対して低度～観察できないアフィニティを提示するが、このリガンドはＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体に強く結合する。図６を参照のこと。したがって、これらの結果は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較してＴＧＦ－βスーパーファミリーのある特定のリガンドのより選択的なアンタゴニスト（インヒビター）であることを実証する。したがって、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、そのような選択的アンタゴニズムが有利であるある特定の適用において、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体より有用である。例として、１つまたは複数のアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１をアンタゴナイズし、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３の１つまたは複数のアンタゴニズムは減少されることが所望される治療適用が挙げられる。
さらに、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、その２つの複合体の差示的なリガンド選択性にもかかわらず、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と酷似したある特定の生物学的影響をもたらした。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体に酷似した有益な骨格筋および骨に対する同化効果、ならびに脂肪組織に対する異化効果を示す。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と異なり、ＡｃｔＲＩＩＢ：ＡＬＫ４ヘテロ二量体は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に対して低アフィニティまたは一過性の結合のみを示すので、それらのリガンドによって媒介される血管新生などのプロセスに対してほとんど～全く共時的な阻害を有しないはずである。この新規の選択性は、例えば、筋肉および骨に対する刺激効果、および／または脂肪に対する阻害効果を必要とするが、血管新生の変更は必要ない患者の処置に有用であり得る。したがって、特定の作用機構に束縛されることを望むものではないが、少なくとも１つのまたは複数のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンドに結合し／阻害するＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ならびにその改変体は、有益な骨格筋および骨に対する同化効果および脂肪組織に対する異化効果を促進するための有用な作用因子であることが予測される。さらに、本明細書に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の結合／阻害特性を模倣する他のアンタゴニスト（インヒビター）またはアンタゴニストの組み合わせ、ならびにＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体を直接的または間接的にアンタゴナイズする作用因子、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンドを直接的または間接的にアンタゴナイズする作用因子、下流のシグナル伝達メディエーター（例えば、Ｓｍａｄ）を直接的または間接的にアンタゴナイズする作用因子、および／またはＴＧＦβスーパーファミリー共受容体を直接的または間接的にアンタゴナイズする作用因子は、例えば、および骨に対する刺激効果ならびに脂肪に対する阻害効果を含む同様の生物学的効果を有することが予測される。これらのアンタゴニスト性模倣物は、本明細書において「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト」または「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢインヒビター」と総称される。
Ａ．ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体
ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数のＡＬＫ４受容体ポリペプチド（例えば、配列番号９、１０、１９、２０、４２、４４、４７および４８）および１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢ受容体ポリペプチド（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、３９、４１、４５、および４６）を含むヘテロ多量体に関連し、これは、本明細書において、一般に、「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体」または「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体」と称される。好ましくは、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は可溶性であり、例えば、ヘテロ多量体は、ＡＬＫ４受容体の可溶性部分（ドメイン）およびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の可溶性部分（ドメイン）を含み得る。概して、ＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインは、これらの受容体の可溶性部分に対応する。したがって、一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、ＡＬＫ４受容体の細胞外ドメインおよびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の細胞外ドメインを含む。例の細胞外ドメインＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢ受容体は、本明細書に開示されており、そのような配列、ならびにそのフラグメント、機能的改変体、および改変形態が、本開示の発明に従って使用され得る（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体組成物およびその使用）。本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体として、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびより高次のオリゴマー構造が挙げられる。例えば、図１、２、および８～１０を参照のこと。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体はＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である。
好ましくは、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数に結合することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＣに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＥに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡＢに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡＣに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＡＥに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢＣに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、アクチビンＢＥに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体はＧＤＦ１１に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体はＧＤＦ８に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体はＢＭＰ６に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体はＧＤＦ３に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体はＢＭＰ１０に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＢＭＰ９に結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、ＢＭＰ９およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の間の一過性の性質に起因して確定できないＫａまたはＫｄを有する）。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより強いアフィニティでアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより弱いアフィニティでＧＤＦ３に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより弱いアフィニティでＢＭＰ９に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより弱いアフィニティでＢＭＰ１０に結合する。任意選択で、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、Ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙの１つまたは複数にさらに結合することができる。
一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を使用して１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによって媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達）を阻害（アンタゴナイズ）することができる。特に、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を使用して、例えば、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによって細胞内シグナル伝達を阻害することができる。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいて１つまたは複数のアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０によって媒介されるシグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＡシグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＢシグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＣシグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＤシグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＥシグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＡＢシグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＡＣシグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＢＣシグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＡＥシグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＢＥシグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＧＤＦ１１シグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＧＤＦ８シグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ６シグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＧＤＦ３シグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ９シグナル伝達の活性を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ９シグナル伝達を阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して細胞ベースのアッセイにおけるアクチビンＢシグナル伝達のより強いインヒビターである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して細胞ベースのアッセイにおけるＢＭＰ１０シグナル伝達のより弱いインヒビターである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して細胞ベースのアッセイにおけるＧＤＦ３シグナル伝達のより強いインヒビターである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較して細胞ベースのアッセイにおけるＢＭＰ９シグナル伝達のより強いインヒビターである。任意選択で、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、Ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙの活性の１つまたは複数による細胞内シグナル伝達をさらに阻害し得る。
本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡｃｔＲＩＩＢタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＢに対する言及は、現在同定されている形態のうちの任意の１つに対する言及であるものと理解される。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび予測セリン／スレオニンキナーゼ活性を持つ細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。
用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合体およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを包含する。このような改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例は、本開示を通して提供されるほか、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０１２６２７号、同第ＷＯ２００８／０９７５４１号および同第ＷＯ２０１０／１５１４２６号においても提供されている。本明細書で記載される、全てのＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記で提供される、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のタンパク質配列（配列番号１）の番号付けに基づく。
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のタンパク質配列は、以下の通りである。
Figure 0007055637000001
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し、潜在的な、内因性Ｎ－連結グリコシル化部位は、二重下線で指し示す。
プロセシング後の（成熟）細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである。
Figure 0007055637000002
一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端における「ＳＧＲ・・・」配列により生成することができる。細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。
Figure 0007055637000003
配列番号１の６４位においてアラニン（Ａ６４）を有するＡｃｔＲＩＩＢの形態についてはまた、文献、例えば、Ｈｉｌｄｅｎら（１９９４年）、Ｂｌｏｏｄ、８３巻（８号）：２１６３～２１７０頁を参照されたい、においても報告されている。本出願人らは、Ａ６４置換を有するＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティが比較的低いことを確認した。これに対し、６４位においてアルギニン（Ｒ６４）を有する、同じＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティが、低ｎＭ～高ｐＭの範囲である。したがって、Ｒ６４を有する配列を、本開示におけるヒトＡｃｔＲＩＩＢのための「野生型」参照配列として使用する。
６４位においてアラニンを有するＡｃｔＲＩＩＢの形態は、以下の通りである。
Figure 0007055637000004
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
代替的なＡ６４形態の、プロセシング後の（成熟）細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである。
Figure 0007055637000005
一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端における「ＳＧＲ・・・」配列により生成することができる。細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。
Figure 0007055637000006
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列であって、ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のアミノ酸１～５１３をコードする、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０６．３のヌクレオチド２５～１５６０を表す核酸配列を、下記（配列番号７）に示す。示される配列は、６４位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。シグナル配列に下線を付す。
Figure 0007055637000007
プロセシング後のヒト細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸配列は、以下（配列番号８）の通りである。示される配列は、６４位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。
Figure 0007055637000008
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを、図３に例示する。このアラインメントは、両方の受容体内のアミノ酸残基であって、ＡｃｔＲＩＩリガンドに直接接触すると考えられるアミノ酸残基を指し示す。例えば、複合ＡｃｔＲＩＩ構造は、ＡｃｔＲＩＩＢ－リガンドの結合ポケットが、部分的に、残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８～Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３～Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８～Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４～Ｆ１０１により規定されることを指し示した。これらの位置では、保存的変異が許容されることが予測される。
加えて、ＡｃｔＲＩＩＢは、完全に保存された細胞外ドメインの大きな連なりを伴って、脊椎動物間で良好に保存されている。例えば、図４は、多様なＡｃｔＲＩＩＢオーソログと比較してヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの多重配列アラインメントを描示する。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くもまた、高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントから、リガンド結合ドメイン内の鍵となるアミノ酸位置であって、正常なＡｃｔＲＩＩＢ－リガンド結合活性に重要なアミノ酸位置を予測するほか、正常なＡｃｔＲＩＩＢ－リガンド結合活性を著明に変更せずに、置換を許容する可能性が高いアミノ酸位置も予測することが可能である。したがって、本開示の方法に従い有用な活性ヒトＡｃｔＲＩＩＢ改変体ポリペプチドは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢの配列に由来する、対応する位置における１つまたは複数のアミノ酸を含んでもよいし、ヒトまたは他の脊椎動物配列内の残基と類似する残基を含んでもよい。以下の例は、限定的であると意図せずに、活性ＡｃｔＲＩＩＢ改変体を規定するこの手法を例示する。ヒト細胞外ドメイン（配列番号５３）内のＬ４６は、ＸｅｎｏｐｕｓのＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号５５）ではバリンであるので、この位置は変更することができ、任意選択で、Ｖ、Ｉ、もしくはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基に変更することができる。ヒト細胞外ドメイン内のＥ５２はＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、この部位がＥ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、ＹおよびおそらくＡなどの極性残基を含む、広範な変化を許容し得ることを示す。．ヒト細胞外ドメイン内のＴ９３はＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、広範な構造バリエーションがこの位置で許容され、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの極性残基が好まれることを示す。ヒト細胞外ドメイン内のＦ１０８はＸｅｎｏｐｕｓではＹであり、したがってＹまたは他の疎水性基、例えばＩ、ＶまたはＬが許容されるはずである。ヒト細胞外ドメイン内のＥ１１１はＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨ，ならびにＱおよびＮを含む荷電残基がこの位置で許容されることを示す。ヒト細胞外ドメイン内のＲ１１２はＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、ＲおよびＨを含む塩基性残基がこの位置で許容されることを示す。ヒト細胞外ドメイン内の１１９位のＡは、比較的保存が不良であり、齧歯動物ではＰとして現れ、ＸｅｎｏｐｕｓではＶとして現れるので、この位置では、本質的に任意のアミノ酸が許容されるはずである。
さらに、当該分野では、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、特にリガンド結合に関する、構造機能的特徴との関係で特徴付けられている［Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、６８巻（１号）：９７～１０８頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻（１号）：１８～２２頁；Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら（２００６年）、ＰＮＡＳ、１０３巻（２０号）：７６４３～７６４８頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００３年）、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、２２巻（７号）：１５５５～１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号、および同第７，８４２，６６３号］。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献も、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＢ改変体をどのようにして生成するのかについての指針を十分に提供している。
例えば、３フィンガーの毒素フォールドとして公知の構造モチーフを規定することは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体の受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に配置された保存されたシステイン残基により形成される［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ、６巻：１８～２２頁；およびＨｉｎｃｋ（２０１２年）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５８６巻：１８６０～１８７０頁］。したがって、これらの保存されたシステインの最外殻により画されるようなヒトＡｃｔＲＩＩＢのコアとなるリガンド結合性ドメインは、配列番号１（ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体）の２９～１０９位に対応する。したがって、これらのシステインによって画されるコア配列に隣接する構造的に秩序のより乏しいアミノ酸は、必ずしもリガンド結合性を変更することなく、Ｎ末端で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８残基だけ、かつ／またはＣ末端で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５残基だけ短縮することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端短縮型についての例示的なＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインとして、配列番号２、３、５、および６が挙げられる。
Ａｔｔｉｓａｎｏらは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失が、受容体のアクチビンに対するアフィニティを低減することを示した。本明細書の配列番号１のアミノ酸２０～１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質である「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１１９）－Ｆｃ」は、ＧＤＦ１１およびアクチビンへの結合が、プロリンノット領域と、完全膜近傍ドメインとを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）－Ｆｃと比べて低減されている（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１２９）－Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されていてもなお、野生型と比べてある程度低減されているが、同様の活性を保持する。
したがって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、および１２９（配列番号１に照らして）で終止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て、活性であることが予測されるが、１３４または１３３で終止する構築物が最も活性であり得る。同様に、残基１２９～１３４（配列番号１に照らして）のいずれにおける変異も、リガンド結合アフィニティを大幅に変更することはないと予測される。この裏付けとして、当該分野では、Ｐ１２９およびＰ１３０（配列番号１に照らして）の変異は、リガンド結合を実質的に減殺しないことが公知である。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アミノ酸１０９（最後のシステイン）という前方の位置で終結し得るが、１０９および１１９またはその間（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、または１１９）で終結する形態は、リガンド結合が低減されることが予測される。アミノ酸１１９（本明細書の配列番号１に照らして）は保存が良好でないので、たやすく変更または短縮される。１２８（配列番号１に照らして）またはこの後方で終結するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、リガンド結合活性を保持するはずである。配列番号１に照らして、１１９および１２７またはその間（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、または１２７）で終結するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、中程度の結合能を有する。これらの形態のいずれも、臨床状況または実験状況に応じて、使用が所望され得る。
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端では、アミノ酸２９またはこの前方（配列番号１に照らして）で始まるタンパク質は、リガンド結合活性を保持することが予測される。アミノ酸２９は、最初のシステインを表す。２４位（配列番号１に照らして）における、アラニンからアスパラギンへの変異は、リガンド結合に実質的に影響を及ぼさずに、Ｎ結合型グリコシル化配列を導入する［米国特許第７，８４２，６６３号］。これは、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域との間の領域であって、アミノ酸２０～２９に対応する領域内の変異が、良好に許容されることを確認する。特に、２０、２１、２２、２３、および２４位（配列番号１に照らして）で始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、一般的なリガンド結合活性を保持するはずであり、２５、２６、２７、２８、および２９位（配列番号１に照らして）で始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドもまた、リガンド結合活性を保持すると予測される。例えば、米国特許第７，８４２，６６３号では、驚くべきことに、２２、２３、２４または２５で始まるＡｃｔＲＩＩＢ構築物が最も大きな活性を有することが実証されている。
まとめると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分（例えば、リガンド結合部分）の一般式は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９を含む。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸２０～２９のいずれか１つ（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のいずれか１つで始まる）に対応する残基で始まり、配列番号１のいずれか１つのアミノ酸１０９～１３４（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終わる）に対応する位置で終わるＡｃｔＲＩＩＢの部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなり得る。他の例として、配列番号１の２０～２９（例えば、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、または２９位のいずれか１つ）または２１～２９（例えば、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、または２９位のいずれか１つ）の位置で始まり、配列番号１の１１９～１３４（例えば、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、または１３４位のいずれか１つ）、１１９～１３３（例えば、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、または１３３位のいずれか１つ）、１２９～１３４（例えば、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、または１３４位のいずれか１つ）、または１２９～１３３（例えば、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、または１３３位のいずれか１つ）の位置で終わるポリペプチドが挙げられる。他の例として、配列番号１の２０～２４（例えば、２０位、２１位、２２位、２３位、または２４位のいずれか１つ）、２１～２４（例えば、２１位、２２位、２３位、または２４位のいずれか１つ）、または２２～２５（例えば、２２位、２２位、２３位、または２５位のいずれか１つ）の位置で始まり、配列番号１の１０９～１３４（例えば、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、または１３４位のいずれか１つ）、１１９～１３４（例えば、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、または１３４位のいずれか１つ）または１２９～１３４（例えば、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、または１３４位のいずれか１つ）の位置で終わる構築物が挙げられる。これらの範囲内の改変体、特に配列番号１の対応する部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するもの、もまた企図される。
本明細書で記載される改変は、多様な形で組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ改変体は、リガンド結合ポケット内における１、２、５、６、７、８、９、１０または１５以下の保存的アミノ酸変化と、リガンド結合ポケット内の４０、５３、５５、７４、７９、および／または８２位における０、１、またはこれを超える非保存的変更とを含む。ばらつきが特に良好に許容され得る結合ポケットの外部の部位として、細胞外ドメイン（上記で言及した）のアミノ末端およびカルボキシ末端と、４２～４６および６５～７３位（配列番号１に照らして）とが挙げられる。実際、６５位におけるアスパラギンからアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、バックグラウンドをＡ６４とするときのリガンド結合を改善するので、バックグラウンドをＲ６４とするときのリガンド結合に有害作用を及ぼさないことが予測されている［米国特許第７，８４２，６６３号］。この変化はおそらく、バックグラウンドをＡ６４とするときのＮ６５におけるグリコシル化を消失させることから、この領域内の著明な変化は、許容される可能性が高いことが実証される。Ｒ６４Ａ変化は許容が不良であるが、Ｒ６４Ｋは許容が良好であるので、６４位では、Ｈなどの別の塩基性残基が許容され得る［米国特許第７，８４２，６６３号］。追加的に、当技術分野で記載された変異生成プログラムの結果は、保存することが多くの場合有益なＡｃｔＲＩＩＢにおけるアミノ酸位置があることを指し示す。配列番号１に照らして、これらには、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、特にトリプトファン）、３７位（酸性、特にアスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特にフェニルアラニンまたはチロシン）が含まれる。したがって、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおいて保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存することが所望され得る他の位置は、以下の通りである：５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８（極性または帯電、特にＥ、Ｄ、ＲまたはＫ）（全て配列番号１に照らして）。
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むヘテロ多量体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは可溶性である（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示に従う使用のためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドに結合する。したがって、一部の実施形態では、本開示に従う使用のためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２０～２９（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のいずれか１つで始まる）に対応する残基で始まり、配列番号１のアミノ酸１０９～１３４（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終わる）に対応する位置で終わるＡｃｔＲＩＩＢの部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。別の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号１のアミノ酸２５～１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１、２、３、４、５、６、３９、４１、４５、または４６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１のＬ７９に対応する位置が酸性アミノ酸である（すなわち、天然に生じるＤまたはＥアミノ酸残基あるいは人工酸性アミノ酸でない）ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むか含まない。
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡＬＫ４」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体様キナーゼ－４タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡＬＫ４タンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡＬＫ４への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡＬＫ４ファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
用語「ＡＬＫ４ポリペプチド」は、ＡＬＫ４ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合体、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＡＬＫ４関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記のヒトＡＬＫ４前駆体のタンパク質配列（配列番号９）の番号付けに基づく。
標準的なヒトＡＬＫ４前駆体のタンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４２９３）は、以下の通りである。
Figure 0007055637000009
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
プロセシング後の（成熟）細胞外ヒトＡＬＫ４ポリペプチド配列は、以下の通りである。
Figure 0007055637000010
ＡＬＫ４前駆体タンパク質をコードする核酸配列を、下記（配列番号１１）に示し、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４３０２．４のヌクレオチド７８～１５９２に対応する。シグナル配列に下線を付し、細胞外ドメインを太字のフォントで指し示す。
Figure 0007055637000011
 細胞外ＡＬＫ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の通りである。
Figure 0007055637000012
 ヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列の代替的アイソフォーム、アイソフォームＣ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６４７３３．３）は以下の通りである。
Figure 0007055637000013
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
プロセシング後の（成熟）細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド配列（アイソフォームＣ）は、以下の通りである。
Figure 0007055637000014
ＡＬＫ４前駆体タンパク質（アイソフォームＣ）をコードする核酸配列を、下記（配列番号２１）に示し、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿０２０３２８．３のヌクレオチド７８～１７１５に対応する。シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
Figure 0007055637000015
 細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド（アイソフォームＣ）をコードする核酸配列は、以下の通りである。
Figure 0007055637000016
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むヘテロ多量体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびその使用）は可溶性である（例えば、ＡＬＫ４の細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＡＬＫ４ポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドに結合する、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号９、１０、１９、２０、４２、４４、４７、または４８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号９、１０、１９、２０、４２、４４、４７、または４８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドから本質的になるか、またはからなる。
ＡＬＫ４は、脊椎動物間で、完全に保存された細胞外ドメインの大きな連なりを伴って、良好に保存されている。例えば、図７は、多様なＡＬＫ４オーソログと比較してヒトＡＬＫ４細胞外ドメインの多重配列アラインメントを描示する。ＡＬＫ４に結合するリガンドの多くもまた、高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントからは、リガンド結合性ドメイン内の鍵となるアミノ酸位置であって、通常のＡＬＫ４－リガンドの結合活性に重要なアミノ酸位置を予測することが可能であるほか、通常のＡＬＫ４－リガンドの結合活性を顕著に変更させずに、置換に対して許容性を有する可能性が高いアミノ酸位置を予測することも可能である。したがって、本開示の方法に従い有用な活性ヒトＡＬＫ４改変体ポリペプチドは、別の脊椎動物ＡＬＫ４の配列に由来する、対応する位置における１つまたは複数のアミノ酸を含んでもよいし、ヒトまたは他の脊椎動物配列内の残基と類似する残基を含んでもよい。以下の例は、限定的であると意図せずに、活性ＡＬＫ４改変体を規定するこの手法を例示する。ヒトＡＬＫ４細胞外ドメイン（配列番号５９）内のＶ６は、Ｍｕｓ ｍｕｃｕｌｕｓのＡＬＫ４（配列番号６３）ではイソロイシンであるので、この位置は変更することができ、任意選択で、Ｌ、Ｉ、もしくはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基に（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓのＡＬＫ４（配列番号６２）で観察される通り）変更することができる。ヒト細胞外ドメイン内のＥ４０はＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４ではＫであり、この部位が、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙなどの極性 残基およびおそらくＡなどの非極性残基を含む広範な変化を許容することができることを指し示す。ヒト細胞外ドメイン内のＳ１５はＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４ではＤであり、この位置では、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの極性残基が好まれる広範な構造バリエーションが許容されることを指し示す。ヒト細胞外ドメイン内のＥ４０はＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４ではＫであり、この位置では、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ならびにＱおよびＮを含む帯電残基が許容されることを指し示す。ヒト細胞外ドメイン内のＲ８０は、Ｃｏｎｄｙｌｕｒａ ｃｒｉｓｔａｔａのＡＬＫ４（配列番号６０）ではＫであり、この位置では、Ｒ、Ｋ、およびＨを含む塩基性残基が許容されることを示す。ヒト細胞外ドメイン内のＹ７７は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａのＡＬＫ４（配列番号６４）ではＦであり、この位置では、Ｆ、Ｗ、およびＹを含む芳香族残基が許容されることを示す。ヒト細胞外ドメイン内のＰ９３は、比較的保存が不良であり、Ｅｒｉｎａｃｅｕｓ ｅｕｒｏｐａｅｕｓのＡＬＫ４（配列番号６１）ではＳとして現れ、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓのＡＬＫ４ではＮとして現れるので、この位置では、本質的に任意のアミノ酸が許容されるはずである。
さらに、当該分野では、ＡＬＫ４タンパク質は、特にリガンド結合に関する、構造機能的特徴との関係で特徴付けられている［例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎら（２００３年）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７８巻（２３号）：２１１２９～２１１３５頁；Ｒｏｍａｎｏら（２０１２年）、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｏｄｅｌ、１８巻（８号）：３６１７～３６２５頁；およびＣａｌｖａｎｅｓｅら（２００９年）、１５巻（３号）：１７５～１８３頁］。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献も、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡＬＫ４改変体をどのようにして生成するのかについての指針を十分に提供している。
例えば、３フィンガーの毒素フォールドとして公知の構造モチーフを規定することは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体の受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に配置された、保存されたシステイン残基により形成される［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ、６巻：１８～２２頁；およびＨｉｎｃｋ（２０１２年）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５８６巻：１８６０～１８７０頁］。したがって、これらの保存されたシステインの最外殻により画されるような、ヒトＡＬＫ４のコアとなるリガンド結合ドメインは、配列番号９（ＡＬＫ４前駆体）の３４～１０１位に対応する。したがって、これらのシステインによって画されるコア配列に隣接する構造的に秩序のより乏しいアミノ酸は、必ずしもリガンド結合性を変更することなく、Ｎ末端で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基だけ、またはＣ末端で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６残基だけ短縮することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端短縮型についての例示的なＡＬＫ４細胞外ドメインとして、配列番号１０および２０が挙げられる。
したがって、ＡＬＫ４の活性部分（例えば、リガンド結合部分）の一般式は、アミノ酸３４～１０１を含む。したがって、ＡＬＫ４ポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸２４～３４のいずれか１つ（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれか１つで始まる）に対応する残基で始まり、配列番号９の任意の１つのアミノ酸１０１～１２６（例えば、アミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６のいずれか１つで終わる）に対応する位置で終わるＡＬＫ４の部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。他の例として、配列番号９の２４～３４（例えば、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、または３４位のいずれか１つ）、２５～３４（例えば、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、または３４位のいずれか１つ）、または２６～３４（例えば、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、または３４位のいずれか１つ）の位置で始まり、配列番号９の１０１～１２６（例えば、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、または１２６位のいずれか１つ）、１０２～１２６（例えば、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、または１２６位のいずれか１つ）、１０１～１２５（例えば、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、または１２５位のいずれか１つ）、１０１～１２４（例えば、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、または１２４位のいずれか１つ）、１０１～１２１（例えば、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、または１２１位のいずれか１つ）、１１１～１２６（例えば、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、または１２６位のいずれか１つ）、１１１～１２５（例えば、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、または１２５位のいずれか１つ）、１１１～１２４（例えば、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、または１２４位のいずれか１つ）、１２１～１２６（例えば、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、または１２６位のいずれか１つ）、１２１～１２５（例えば、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、または１２５位のいずれか１つ）、１２１～１２４（例えば、１２１位、１２２位、１２３位、または１２４位のいずれか１つ）、または１２４～１２６（例えば、１２４位、１２５位、または１２６位のいずれか１つ）の位置で終わる構築物が挙げられる。これらの範囲内の改変体、特に配列番号９の対応する部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するもの、もまた企図される。
本明細書に記載のバリエーションは、様々な形で組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４改変体は、１、２、５、６、７、８、９、１０または１５以下の保存的アミノ酸変化をリガンド結合ポケットに含む。結合ポケット外の部位（変動が特によく許容され得る）は細胞外ドメインのアミノおよびカルボキシ末端を含む（上記）。ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数のＡＬＫ４受容体ポリペプチド（例えば、配列番号９、１０、１９、２０、４２、４４、４７および４８）および１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢ受容体ポリペプチド（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、３９、４１、４５、および４６）を含むヘテロ多量体に関連し、これは、本明細書において一般に「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体」または「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体」と称される。好ましくは、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は可溶性であり、例えば、ヘテロ多量体は、ＡＬＫ４受容体の可溶性部分（ドメイン）およびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の可溶性部分（ドメイン）を含む。概して、ＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインは、これらの受容体の可溶性部分に対応する。したがって、一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、ＡＬＫ４受容体の細胞外ドメインおよびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の細胞外ドメインを含む。例示的な細胞外ドメインＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢ受容体は本明細書に開示されており、そのような配列、ならびにフラグメント、機能的改変体、およびその改変形態は、本開示の発明に従って使用することができる（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体組成物およびその使用）。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号９、１０、１９、２０、４２、４４、４７、および４８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号９のアミノ酸２４～３４、２５～３４、または２６～３４のいずれか１つに対応する残基で始まり、１０１～１２６、１０２～１２６、１０１～１２５、１０１～１２４、１０１～１２１、１１１～１２６、１１１～１２５、１１１～１２４、１２１～１２６、１２１～１２５、１２１～１２４、または１２４～１２６の位置で終わるＡＬＫ４の部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４～ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１、２、３、４、５、６、３９、４１、４５、および４６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２０～２９、２０～２４、２１～２４、２２～２５、または２１～２９のいずれか１つに対応する残基で始まり、１０９～１３４、１１９～１３４、１１９～１３３、１２９～１３４、または１２９～１３３の位置で終わるＡｃｔＲＩＩＢの部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体配列番号１のＬ７９に対応する位置が酸性アミノ酸ではない（すなわち、天然に生じるＤまたはＥアミノ酸残基あるいは人工の酸性アミノ酸でない）少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体として、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびより高次のオリゴマー構造が挙げられる。例えば、図１、２、および８～１０を参照。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体はＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である。
一部の実施形態では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの構造を改変することにより機能的改変体を作製することを企図する。改変体は、アミノ酸の置換、欠失、付加またはそれらの組み合わせによっても生成することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの単発的な置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での単発的な置換、スレオニンのセリンでの単発的な置換、または、あるアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的変異）は、結果として生じる分子の生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないと予想するのは理にかなっている。保存的置換は、その側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化の結果として、機能的相同体がもたらされるのかどうかは、非改変もしくは野生型ポリペプチドと比較した場合に、野生型ポリペプチドと同様の様式で細胞内の応答を生成するか、または、１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙを含む）に結合する、改変体ポリペプチドの能力を評価することにより、たやすく決定することができる。
一部の実施形態では、本開示は、治療効力または安定性（例えば、保管寿命の延長および／またはタンパク質分解に対する抵抗性）を増強することなどを目的として、ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの構造を修飾することにより、機能的な改変体を作製することを企図する。
一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更させるようなＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特異的変異を企図する。このような変異は、１または複数のグリコシル化部位（例えば、Ｏ－連結もしくはＮ－連結のグリコシル化部位）を導入もしくは排除するように選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般に、トリペプチド配列、アスパラギン－Ｘ－スレオニンまたはアスパラギン－Ｘ－セリン（ここで、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含み、この配列は、適切な細胞のグリコシル化酵素によって特異的に認識される。変化はまた、（Ｏ－連結グリコシル化部位については）ポリペプチドの配列への、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によってなされ得る。グリコシル化認識部位の第１位もしくは第３位のアミノ酸の一方もしくは両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失（および／または、第２位におけるアミノ酸の欠失）は、改変されたトリペプチド配列において非グリコシル化をもたらす。ポリペプチドにおける糖質部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的もしくは酵素的なカップリングによるものである。使用されるカップリング様式に依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）フリーのカルボキシル基；（ｃ）フリーのスルフヒドリル基（例えば、システインのもの）；（ｄ）フリーのヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの）；（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの）；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。ポリペプチド上に存在する１または複数の糖質部分の除去は、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのポリペプチドの曝露を含み得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつつ、連結糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんどもしくは全ての糖の切断を生じる。ポリペプチドにおける、炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら［Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７年）、１３８巻：３５０頁］により記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。ポリペプチドの配列は、適切なように、使用される発現系のタイプに応じて調節され得る。というのも、哺乳動物、酵母、昆虫および植物の細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得る。一般に、ヒトにおいて使用するための本開示のヘテロマー複合体は、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株）において発現され得るが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であることと期待される。
本開示はさらに、変異体、特に、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコンビナトリアル変異体のセットを生成する方法のほか、短縮型変異体も生成する方法も企図する。コンビナトリアル変異体のプールは、機能的に活性な（例えば、ＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド結合）ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ配列を同定するためにとりわけ有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、薬物動態の変更またはリガンドへの結合の変更など、特性を変更させたポリペプチド改変体を生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、そして、このようなアッセイは、改変体を評価するために使用され得る。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ複合体改変体は、１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドに結合して、ＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドのＴＧＦ－βスーパーファミリー受容体への結合を妨害する能力、および／または、ＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドにより引き起こされるシグナル伝達に干渉する能力についてスクリーニングされ得る。
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の活性は、例えば、細胞ベースのアッセイまたはインビボアッセイで調べることができる。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の、マウス細胞における筋生成に関与する遺伝子の発現またはタンパク質の活性に対する効果を評価することができる。これは、必要に応じて、１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドの存在下で実施することができ、細胞に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と、任意選択で、ＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドとを生成するように、トランスフェクトすることができる。同様に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を、マウスまたは他の動物に投与することができ、当技術分野で認識されている方法を使用して筋形成または筋強度など、１つまたは複数の計測値を評価することができる。同様に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体またはそのバリアントの活性を、例えば、本明細書に記載されるようなアッセイおよび当技術分野において通常の知識のものによって、例えば、骨芽細胞、脂肪細胞および／またはニューロン細胞において、これらの細胞の成長に対するいずれかの効果について試験することができる。ＳＭＡＤ応答性のレポーター遺伝子を、このような細胞株内で使用して、下流のシグナル伝達に対する効果をモニタリングすることができる。
コンビナトリアル由来の改変体を、参照ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と比べて増大した選択性を有するか、または一般に効力を増大させて生成することができる。このような改変体は、組換えＤＮＡ構築物から発現されたとき、遺伝子治療のプロトコルにおいて使用され得る。同様に、変異誘発は、対応する非改変ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体とは劇的に異なる細胞内半減期を有する改変体を生じ得る。例えば、変更されたタンパク質は、タンパク質分解、または、非改変ポリペプチドの崩壊もしくは他の方法で不活性化をもたらす他の細胞プロセスに対してより安定性であるかもしくは安定性が低いかのいずれかにされ得る。このような改変体およびこれをコードする遺伝子は、そのポリペプチドの半減期を調節することによってポリペプチド複合体レベルを変更するのに利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的作用を生じ得、そして、誘導性の発現系の一部である場合、細胞内での組換えポリペプチド複合体レベルのより厳しい制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパク質では、変異は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の１つまたは複数の活性、例えば、免疫原性、半減期および溶解性を変更するために、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分において作製され得る。
コンビナトリアルライブラリーは、各々が潜在的なＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ配列の少なくとも一部を含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって生成することができる。例えば、潜在的なＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢをコードするヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、または代替的に、大型の融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイのための）として発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的にライゲーションすることができる。
潜在的な相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成し得る、多くの方式が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動式ＤＮＡ合成器で実行することができ、次いで、合成遺伝子は、発現に適切なベクターにライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である［Ｎａｒａｎｇ， ＳＡ（１９８３年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９巻：３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１年）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ． ３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２７３～２８９頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３巻：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８巻：１０５６頁；Ｉｋｅら（１９８３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１１巻：４７７頁］。このような技法は、他のタンパク質の指向進化で利用されている［Ｓｃｏｔｔら、（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：３８６～３９０頁；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２年）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８９巻：２４２９～２４３３頁；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：４０４～４０６頁；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０年）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８７巻：６３７８～６３８２頁のほか、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、および同第５，０９６，８１５号］。
代替的に、変異誘発の他の形態も、コンビナトリアルライブラリーを生成するのに活用することができる。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、例えば、アラニン走査変異誘発［Ｒｕｆら（１９９４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３巻：１５６５～１５７２頁；Ｗａｎｇら（１９９４年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３０９５～３０９９頁；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３年）、Ｇｅｎｅ、１３７巻：１０９～１１８頁；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３年）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１８巻：５９７～６０１頁；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６８巻：２８８８～２８９２頁；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：１０８３２～１０８３８頁；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１～１０８５頁］を使用して、リンカー走査変異誘発［Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９３巻：６５３～６６０頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９２年）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２巻：２６４４～２６５２頁；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻：３１６頁］によって、飽和変異誘発［Ｍｅｙｅｒｓら、（１９８６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻：６１３頁］によって、ＰＣＲ変異誘発［Ｌｅｕｎｇら（１９８９年）、Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１巻：１１～１９頁］によって、または化学的変異誘発［Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２年）、Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４年）、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、７巻：３２～３４頁］を含むランダム変異誘発によって、スクリーニングすることにより、ライブラリーから生成および単離することができる。特に、コンビナトリアルの状況におけるリンカー走査変異誘発は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの短縮型（生体活性）形態を同定するための魅力的な方法である。
当該分野では、広範にわたる技法であって、点変異および短縮により作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技法、および、このために、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技法が公知である。このような技法は一般に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体のコンビナトリアル変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用される技法は典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングする工程と、適切な細胞を結果として得られるベクターのライブラリーで形質転換する工程と、所望の活性の検出により、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させる工程とを含む。好ましいアッセイは、ＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）についての結合アッセイならびに／またはＴＧＦ－βリガンドに媒介される細胞シグナル伝達についてのアッセイを含む。
ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体はさらに、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド内に天然に存在する任意の翻訳後修飾に加えて翻訳後修飾を含み得る。このような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類もしくは単糖類およびホスフェイトのような非アミノ酸成分を含み得る。このような非アミノ酸成分の、ヘテロ多量体複合体の機能に対する影響は、他のヘテロ多量体改変体について本明細書中に記載されるようにして試験され得る。本開示のポリペプチドの新生形態を切断することによってポリペプチドが細胞内で生成される場合、翻訳後プロセシングもまた、このタンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能にとって重要となり得る。様々な細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ－３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）が、このような翻訳後の活性のための特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、そして、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにこれを含むヘテロ多量体の正確な修飾およびプロセシングを保証するように選択され得る。
ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載のヘテロ多量体は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に会合した少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。好ましくは、本明細書に開示のポリペプチドはヘテロ二量体の複合体を形成するが、より高次のヘテロ多量体の複合体もまた含まれ、これらに限定されないが、例えば、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびさらなるオリゴマー構造である（例えば、図１、２、および８～１０を参照のこと）。一部の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つの多量体化ドメインを含む。本明細書に開示される場合、用語「多量体化ドメイン」は、少なくとも第１のポリペプチドと少なくとも第２のポリペプチドとの間の共有結合的または非共有結合的な相互作用を促進するアミノ酸またはアミノ酸の配列を指す。本明細書に開示のポリペプチドは、多量体化ドメインに共有結合的または非共有結合的に連結し得る。好ましくは、多量体化ドメインは、第１のポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチド）と、第２のポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）との間の相互作用を促進して、ヘテロ多量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進し、任意選択でホモ多量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を妨げるかまたはそれ以外の様式で不利にさせ、それによって所望のヘテロ多量体の収率を上昇させる（例えば、図２を参照のこと）。
当該分野で公知の多くの方法を使用して、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を生成することができる。例えば、天然には生じないジスルフィド結合は、フリーのチオールが第２のポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）上の別のフリーのチオール含有残基と相互作用して、ジスルフィド結合が第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドとの間で形成されるように、第１のポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチド）上で、天然に生じるアミノ酸をシステインなどのフリーのチオール含有残基で置きかえることにより構築することができる。ヘテロ多量体の形成を促進する相互作用の追加の例は、Ｋｊａｅｒｇａａｒｄら、ＷＯ２００７１４７９０１などに記載されているイオン性相互作用；Ｋａｎｎａｎら、Ｕ．Ｓ．８，５９２，５６２などに記載されている静電ステアリング効果；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｕ．Ｓ．２０１２０３０２７３７などに記載されているコイルドコイル相互作用；ＰａｃｋおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、（１９９２年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻：１５７９～１５８４頁などに記載されているロイシンジッパー；およびＰａｃｋら、（１９９３年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１巻：１２７１～１２７７頁などに記載されているヘリックスターンヘリックスモチーフを含むが、これらに限定されない。多様なセグメントの連結は、例えば、化学的架橋、ペプチドリンカー、ジスルフィド架橋などによる共有結合、またはアビジン－ビオチンなどによるアフィニティ相互作用、またはロイシンジッパー技術を介して得ることができる。
ある特定の態様では、多量体化ドメインは、相互作用ペアの１つの構成成分を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示のポリペプチドは、第２のポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に会合した第１のポリペプチドを含むタンパク質複合体を形成することができ、ここで、第１のポリペプチドは、ＡＬＫ４ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第２のメンバーのアミノ酸配列を含む。相互作用ペアは、相互作用して、複合体、特にヘテロ二量体の複合体を形成する任意の２つのポリペプチド配列であり得るが、実効的な実施形態はホモ二量体の複合体を形成することができる相互作用ペアもまた利用し得る。相互作用ペアの１つのメンバーは、例えば、配列番号２、３、５、６、１０、および２０のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド配列を含む本明細書に記載されるようなＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに融合されてもよい。血清半減期の延長などの特性／活性の改善を付与するように相互作用ペアを選択することもでき、特性／活性の改善をもたらすように別の部分をその上に結合させるアダプターとして作用するように相互作用ペアを選択することもできる。例えば、ポリエチレングリコール部分を、相互作用ペアの構成要素の一方または両方へと結合させて、血清半減期の改善などの特性／活性の改善をもたらすことができる。
相互作用ペアの第１および第２のメンバーは非対称ペアであってもよく、これは、ペアのメンバーが、自己会合よりも優先的に互いに会合することを意味する。したがって、非対称相互作用ペアの第１および第２のメンバーは会合して、ヘテロ二量体の複合体を形成することができる（例えば、図２を参照）。代替的に、相互作用ペア非誘導型であってもよく、これは、アのメンバーが、実質的な優先性なく互いに会合することも自己会合することもでき、そのため、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味する。したがって、非誘導相互作用ペアの第１および第２のメンバーは会合して、ホモ二量体複合体またはヘテロ二量体の複合体を形成してもよい。任意選択で、相互作用ペアの第１のメンバー（例えば、非対称ペアまたは非誘導相互作用ペア）は、共有結合的に相互作用ペアの第２のメンバーに会合する。任意選択で、相互作用ペアの第１のメンバー（例えば、非対称ペアまたは非誘導相互作用ペア）は、非有結合的に相互作用ペアの第２のメンバーに会合する。
具体例としては、本開示は、免疫グロブリンのＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、もしくはＣＨ３ドメインなど、免疫グロブリンの定常ドメインまたは、Ｆｃドメインを含むポリペプチドに融合させたＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢを含む融合タンパク質を提供する。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に由来するＦｃドメインを本明細書に提示する。ＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性を減殺する、他の変異も公知であり、本開示には、集合的に、これらの改変体のいずれかが含まれ、本開示のヘテロ多量体複合体の有利な構成要素として使用することができる。任意選択で、配列番号３１のＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ａｓｐ－２６５、Ｌｙｓ－３２２およびＡｓｎ－４３４（対応する全長ＩｇＧ１に従った番号付け）などの残基に１つまたは複数の変異を有する。ある場合において、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ－２６５変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比べてＦｃγ受容体に結合する能力が低減する。他の場合において、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ－４３４変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比べてＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）に結合する能力が増加する。
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）に使用することができる天然のアミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号３１）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、天然に存在する改変体を有する位置を指し示す。部分的に、本開示は、配列番号３１に対し７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおける天然に存在する改変体は、配列番号３１において使用される番号付け方式に従ったＥ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌを含むであろう（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７を参照）。
Figure 0007055637000017
ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）に使用することができる天然のアミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号３２）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、二重の下線は、配列データの矛盾が存在する位置を指し示す（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８５９に従う）。部分的に、本開示は、配列番号３２に対し７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなるポリペプチドを提供する。
Figure 0007055637000018
ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）に使用することができるアミノ酸配列の２つの例を下記に示す。Ｇ３Ｆｃにおけるヒンジ領域は、他のＦｃ鎖におけるものの最大４倍の長さとなることができ、同様の１７残基セグメントに先行される３つの同一１５残基セグメントを含有する。下記に示される第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号３３）は、単一１５残基セグメントからなる短いヒンジ領域を含有する一方、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号３４）は、全長ヒンジ領域を含有する。いずれの場合でも、点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８５９に従った天然に存在する改変体を有する位置を指し示す。部分的に、本開示は、配列番号３３および３４に対し７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなるポリペプチドを提供する。
Figure 0007055637000019
Ｇ３Ｆｃにおける天然に存在する改変体（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６０を参照）は、配列番号３３において使用される番号付け方式に変換された場合、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本開示は、これらの変種のうち１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。加えて、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジ長を特徴とする構造的多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５９を参照］。特に、改変体ＷＩＳは、Ｖ領域の大部分およびＣＨ１領域の全てを欠いている。これは、ヒンジ領域に通常存在する１１個に加えて、７位に余分な鎖間ジスルフィド結合を有する。改変体ＺＵＣは、Ｖ領域の大部分、ＣＨ１領域の全ておよびヒンジの一部を欠く。改変体ＯＭＭは、対立遺伝子型または別のガンマ鎖サブクラスを表すことができる。本開示は、これらの改変体のうち１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む追加的な融合タンパク質を提供する。
ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）に使用することができる天然のアミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号３５）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示す。部分的に、本開示は、配列番号３５に対し７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなるポリペプチドを提供する。
Figure 0007055637000020
Ｆｃドメインにおける種々の操作された変異が、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号３１）に関して本明細書に提示されており、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃにおける類似の変異は、図５におけるＧ１Ｆｃとそれらのアラインメントに由来することができる。不等なヒンジ長のため、アイソタイプアラインメント（図５）に基づく類似のＦｃ位置は、配列番号３１、３２、３３、３４および３５において異なるアミノ酸番号を保持する。また、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおける通り、番号付けが、全ＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域からなる）を包摂する場合、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域（例えば、配列番号３１、３２、３３、３４、および３５）からなる免疫グロブリン配列内の所与のアミノ酸位置は、同じ位置とは異なる番号により特定されることも理解することができる。例えば、ヒトＧ１Ｆｃ配列（配列番号３１）、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７）、およびヒトＩｇＧ１重鎖内で選択されるＣＨ３位置の間の対応関係は、以下の通りである。
Figure 0007055637000021
単一細胞株からの非対称の免疫グロブリンに基づくタンパク質の大規模産生において生じる問題は、「鎖会合課題」として公知である。二重特異性抗体の産生において顕著に直面するように、鎖会合課題は、単一細胞株において異なる重鎖および／または軽鎖が産生される場合に、固有に生じる複数の組合せの中から所望の多重鎖タンパク質を効率的に産生するという難題に関係する［Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ ４巻：６５３～６６３頁］。この問題は、同じ細胞内で２種の異なる重鎖および２種の異なる軽鎖が産生される場合に最も喫緊となり、この場合、１種のみが典型的に望まれるときに、総計１６通りの可能な鎖組合せ（これらのいくつかは同一であるが）が存在する。にもかかわらず、同じ原理が、２種の異なる（非対称）重鎖のみを取り込む所望の多重鎖融合タンパク質の収量縮小の原因である。
単一細胞株においてＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望のペア形成を増加させて、許容される収量で好ましい非対称融合タンパク質を産生する様々な方法が、当該分野で公知である［Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ ４巻：６５３～６６３頁；およびＳｐｉｅｓｓら（２０１５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２Ａ）：９５－１０６］。Ｆｃ含有鎖の所望のペア形成を得るための方法として、電荷に基づくペア形成（静電ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ））、「ノブ・ホール型（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）」立体ペア形成およびＳＥＥＤｂｏｄｙペア形成およびロイシンジッパーベースのペア形成が挙げられるがこれらに限定されない［Ｒｉｄｇｗａｙら（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９巻：６１７～６２１頁；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（１９９８年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６巻：６７７～６８１頁；Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２３巻：１９５～２０２頁；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら（２０１０）；２８５：１９６３７－１９６４６；Ｗｒａｎｉｋら（２０１２） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７：４３３３１－４３３３９；ＵＳ５９３２４４８；ＷＯ１９９３／０１１１６２；ＷＯ２００９／０８９００４およびＷＯ２０１１／０３４６０５］。本明細書において記載されるように、これらの方法を使用して、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ多量体複合体を生成することができる。図８～１０を参照のこと。
例えば、特異的ポリペプチドの間の相互作用を促進し得る１つの手段は、Ａｒａｔｈｏｏｎら、Ｕ．Ｓ．７，１８３，０７６およびＣａｒｔｅｒら、Ｕ．Ｓ．５，７３１，１６８などにおいて記載されている、凸部対凹部（ノブ・ホール）（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ－ｉｎｔｏ－ｃａｖｉｔｙ（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ））相補領域を操作することによる手段である。「凸部」は、第１のポリペプチド（例えば、第１の相互作用ペア）の界面に由来する小型のアミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることにより構築する。任意選択で、大型のアミノ酸側鎖をより小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチド（例えば、第２の相互作用ペア）の界面上に、凸部と同一または同様なサイズの相補的「凹部」を創出する。第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの界面に位置および寸法が適切な凸部または凹部が存在する場合は、隣接する界面において、それぞれ、対応する凹部または凸部を操作することが必要とされるだけである。
中性のｐＨ（７．０）では、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、負に帯電し、リシン、アルギニン、およびヒスチジンは、正に帯電している。これらの帯電残基を使用して、ヘテロ二量体の形成を促進し、同時に、ホモ二量体の形成を妨げることができる。反対の電荷の間では、誘引性の相互作用が生じ、同じ電荷の間では、排斥性の相互作用が生じる。部分的に、本明細書で開示されるタンパク質複合体は、帯電界面残基の部位指向変異誘発を実行することにより、ヘテロ多量体の形成（例えば、ヘテロ二量体の形成）を促進するための誘引性の相互作用、および任意選択で、ホモ二量体の形成（例えば、ホモ二量体の形成）を妨げるための排斥性の相互作用を使用する。
例えば、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインの界面は、ドメイン間相互作用に関与する４つの固有の電荷残基ペア：Ａｓｐ３５６－Ｌｙｓ４３９’、Ｇｌｕ３５７－Ｌｙｓ３７０’、Ｌｙｓ３９２－Ａｓｐ３９９’、およびＡｓｐ３９９－Ｌｙｓ４０９’［第２の鎖内の残基の番号付けは（’）で指し示している］を含む。ここで、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン内の残基を表示するのに使用される番号付けスキームは、ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けスキームに準拠することに留意されたい。ＣＨ３ドメイン間相互作用に存在する２回転対称に起因して、構造内では、各固有の相互作用が２回現れる（例えば、Ａｓｐ３９９－Ｌｙｓ４０９’およびＬｙｓ４０９－Ａｓｐ３９９’）。野生型配列では、Ｋ４０９－Ｄ３９９’は、ヘテロ二量体の形成およびホモ二量体の形成のいずれにも好都合である。第１の鎖内の電荷極性を切り換える単一の変異（例えば、Ｋ４０９Ｅ；陽性電荷から、陰性電荷への切換え）は、第１の鎖のホモ二量体の形成に不都合な相互作用をもたらす。この不都合な相互作用は、同じ電荷間（陰性間；Ｋ４０９Ｅ－Ｄ３９９’およびＤ３９９－Ｋ４０９Ｅ’）で生じる排斥性の相互作用のために発生する。第２の鎖内の電荷極性を切り換える同様の変異（Ｄ３９９Ｋ’；陰性電荷から、陽性電荷への切換え）は、第２の鎖のホモ二量体の形成に不都合な相互作用（Ｋ４０９’－Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９Ｋ－Ｋ４０９’）をもたらす。しかし、同時に、これらの２つの変異（Ｋ４０９ＥおよびＤ３９９Ｋ’）は、ヘテロ二量体の形成には好都合な相互作用（Ｋ４０９Ｅ－Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９－Ｋ４０９’）をもたらす。
ヘテロ二量体の形成およびホモ二量体の阻止における静電ステアリング効果は、追加の帯電残基の変異によりさらに増強することができ、これは、第２の鎖内の反対に帯電した残基とペア形成する場合もしない場合もあり、例えばＡｒｇ３５５およびＬｙｓ３６０が挙げられる。下記の表は、電荷を変化させる可能な変異であって、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の形成を増強するのに単独または組合せで使用し得る変異を列挙する。
Figure 0007055637000022
一部の実施形態では、相互作用が静電的に不都合となるように、本出願の融合タンパク質内のＣＨ３間の界面を構成する１つまたは複数の残基を、帯電アミノ酸で置き換える。例えば、界面内の正に帯電したアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）を、負に帯電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置き換える。代替的に、または前出の置換と組み合わせて、界面内の負に帯電したアミノ酸を、正に帯電したアミノ酸で置き換える。ある特定の実施形態では、アミノ酸を、所望の電荷特徴を有する天然に生じないアミノ酸で置き換える。負に帯電した残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）をＨｉｓへと変異させることは、立体的問題を引き起こし得る側鎖体積の増大をもたらすことに留意されたい。さらに、Ｈｉｓのプロトンドナー形態およびプロトンアクセプター形態は、局在化環境に依存する。デザイン戦略とともにこれらの問題を考慮に入れるべきである。ヒトＩｇＧサブクラスおよびマウスＩｇＧサブクラスでは、界面残基が高度に保存されるため、本明細書で開示される静電ステアリング効果は、ヒトおよびマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に適用することができる。この戦略はまた、ＣＨ３ドメインの界面における非帯電残基の帯電残基への改変にも拡張することができる。
部分的に、本開示は、電荷ペア形成（静電ステアリング）に基づいて相補的となるように操作されたＦｃ配列を使用した、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。静電相補性を有するＦｃ配列のペアの一方は、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに任意に融合して、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を生成することができる。この単鎖は、第１のＦｃと相補的なＦｃ配列と共に最適な細胞において共発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ）させて、所望の多重鎖構築物（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）の生成に有利に働くことができる。静電ステアリングに基づくこの例において、配列番号２３［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｅ１３４Ｋ／Ｄ１７７Ｋ）］および配列番号２４［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｋ１７０Ｄ／Ｋ１８７Ｄ）］は、操作されたアミノ酸置換に二重の下線が引かれた相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物のＴＧＦ－βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、配列番号２３または配列番号２４のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図５を参照）が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号２３および２４）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
Figure 0007055637000023
部分的に、本開示は、立体相補性のために操作されたＦｃ配列を使用した、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。部分的に、本開示は、立体相補性の例としてノブ・ホール型ペア形成を提供する。立体相補性を有するＦｃ配列のペアの一方は、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに任意に融合して、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を生成することができる。この単鎖は、第１のＦｃと相補的なＦｃ配列と共に最適な細胞において共発現されて、所望の多重鎖構築物の生成に有利に働くことができる。ノブ・ホール型ペア形成に基づくこの例において、配列番号２５［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｔ１４４Ｙ）］および配列番号２６［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｙ１８５Ｔ）］は、操作されたアミノ酸置換に二重の下線が引かれた相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２５または配列番号２６のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図５を参照）が、下の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号２５および２６）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
Figure 0007055637000024
操作されたジスルフィド結合と組み合わせたノブ・ホール型ペア形成に基づくＦｃ相補性の例は、配列番号２７［ｈＧ１Ｆｃ（Ｓ１３２Ｃ／Ｔ１４４Ｗ）］および配列番号２８［ｈＧ１Ｆｃ（Ｙ１２７Ｃ／Ｔ１４４Ｓ／Ｌ１４６Ａ／Ｙ１８５Ｖ）］に開示されている。これらの配列における操作されたアミノ酸置換には二重の下線が引かれ、構築物ＴＧＦ－βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドは、配列番号２７または配列番号２８のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図５を参照）が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号２７および２８）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
Figure 0007055637000025
部分的に、本開示は、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ ＣＨ３ドメインの指状嵌合型（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ）β－ストランドセグメントを生成するように操作されたＦｃ配列を使用した、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。このような方法は、ＳＥＥＤｂｏｄｙ融合タンパク質の形成を可能にするストランド交換操作ドメイン（ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ）（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体の使用を含む［Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｅｌ ２３巻：１９５～２０２頁］。ＳＥＥＤｂｏｄｙ相補性を有するＦｃ配列のペアの一方は、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢに任意に融合して、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖は、第１のＦｃと相補的なＦｃ配列と共に最適な細胞において共発現されて、所望の多重鎖構築物の生成に有利に働くことができる。ＳＥＥＤｂｏｄｙ（Ｓｂ）ペア形成に基づくこの例において、配列番号２９［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＡＧ）］および配列番号３０［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＧＡ）］は、ＩｇＡ Ｆｃに由来する操作されたアミノ酸置換に二重の下線が引かれた相補的ＩｇＧ Ｆｃ配列の例であり、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２９または配列番号３０のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃの対応する位置におけるアミノ酸置換（図５を参照）が、下記の相補的ＩｇＧ－ＩｇＡペア（配列番号２９および３０）において使用することができるＦｃ単量体を生成するであろうと認めることができる。
Figure 0007055637000026
部分的に、本開示は、切断可能なロイシンジッパードメインであって、Ｆｃ ＣＨ３ドメインのＣ末端に結合させたロイシンジッパードメインを伴う非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。ロイシンジッパーの結合は、ヘテロ二量体の抗体重鎖の優先的なアセンブリーを引き起こすのに十分である［Ｗｒａｎｉｋら（２０１２年）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８７巻：４３３３１～４３３３９頁］。本明細書で開示される通り、ロイシンジッパー形成鎖に結合させたＦｃ配列のペアの一方を、任意選択のリンカーを伴うかまたは伴わずに、構築物のＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドへと任意に融合させて、ＡＬＫ４融合ポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖を、選択した細胞内で相補的なロイシンジッパー形成鎖に結合させたＦｃ配列と共に共発現させて、所望の多重鎖構築物の生成を優先することができる。精製後における、構築物の、細菌性エンドプロテイナーゼであるＬｙｓ－Ｃによるタンパク質分解性消化により、ロイシンジッパードメインを放出することができ、構造が天然Ｆｃと同一のＦｃ構築物をもたらす。ロイシンジッパーのペア形成に基づくこの例では、配列番号３６［ｈＧ１Ｆｃ－Ａｐ１（酸性）］および配列番号３７［ｈＧ１Ｆｃ－Ｂｐ１（塩基性）］が、相補的なＩｇＧ Ｆｃ配列［配列中、操作された相補的ロイシンジッパー配列に下線を付す］の例であり、構築物のＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３６または配列番号３７のいずれかに融合させてよいが、これらの両方には融合させない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃ、および天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を踏まえると、任意選択のリンカーを伴うかまたは伴わずに、ｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３Ｆｃ、またはｈＧ４Ｆｃ（図５を参照されたい）に結合させたロイシンジッパー形成配列により、下記（配列番号３６および３７）の相補的なロイシンジッパー形成ペアにおいて使用され得るＦｃ単量体が生成されることが理解され得る。
Figure 0007055637000027
上記で記載した通り、当該分野では、Ｆｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望のペア形成を単一の細胞系内で増大させて、好ましい非対称融合タンパク質を許容可能な収率で作製する多様な方法が公知である［Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）、ｍＡｂｓ、４巻：６５３～６６３頁；およびＳｐｉｅｓｓら（２０１５年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６７巻（２Ａ号）：９５～１０６頁］。加えて、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む重鎖および軽鎖融合タンパク質の組み合わせを使用して作製することができる。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、リンカードメインを伴うか、または伴わずに、少なくともＣＨ１ドメインの部分を含む免疫グロブリン重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２）に融合されていてもよい。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、リンカードメインを伴うか、または伴わずに、少なくとも軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の部分を含む免疫グロブリン軽鎖（κまたはλ）に融合されていてもよい。代替的な実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、リンカードメインを伴うか、または伴わずに、少なくともＣＨ１ドメインの部分を含む免疫グロブリン重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２）に融合されていてもよく、ＡＬＫ４ポリペプチドは、リンカードメインを伴うか、または伴わずに、少なくとも軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の部分を含む免疫グロブリン軽鎖（κまたはλ）に融合されていてもよい。このデザインは、重鎖が軽鎖とともにヘテロ二量体化する天然の能力を利用している。特に、重鎖および軽鎖のヘテロ二量体化は、ジスルフィド結合を介した２つのドメインの共有結合的連結によって一般的に安定化されているＣＨ１とＣＬとの間で生じる。完全長重鎖または少なくともヒンジ領域を含む重鎖の部分を利用した構築物により、２つの「軽鎖」および２つの「重鎖」を含む抗体様分子を得ることができる。図９を参照のこと。このデザインの潜在的な利点は、天然に生じるＡＬＫ４－リガンド－ＡｃｔＲＩＩＢ複合体をより緊密に模倣することができ、リガンドに対して比較のシングルヘテロ二量体より高度なアフィニティを提示することができることである。一部の実施形態では、例えば、ＣＨ１ドメインと、ヒンジドメインの一部または全部とを含む短縮型（Ｆ（ａｂ’）２様分子をもたらす）、ならびにＣＨ１ドメインまたはそのフラグメントだけを含む短縮型（Ｆａｂ様分子をもたらす）を含む、多様な重鎖短縮型を組み込むことにより、このデザインを改変することができる。図９Ｇを参照されたい。このようなヘテロ多量体構築物をデザインするための多様な方法については、その内容全体が本明細書に援用されるＵＳ２００９／００１０８７９、Ｋｌｅｉｎら［（２０１２年）、ｍＡｂｓ、４巻：６５３～６６３頁］、およびＳｐｉｅｓｓら［（２０１５年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６７巻（２Ａ号）：９５～１０６頁］に記載されている。
一部の実施形態では、ＡＬＫ４－ＣＬ：ＡｃｔＲＩＩＢ－ＣＨ１ヘテロ二量体ペアを含む複合体の少なくとも１つの分枝およびＡｃｔＲＩＩＢ－ＣＬ：ＡＬＫ４－ＣＨ１ヘテロ二量体ペアを含む少なくとも第２の分枝を含む抗体様ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体を生成することが所望される。例えば、図９Ｂを参照のこと。そのようなヘテロ二量体複合体は、例えば、重鎖および軽鎖の非対称なペア形成技術の組み合わせを使用して生成することができる［Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２Ａ）： ９５－１０６］。例えば、ＣｒｏｓｓＭａｂ技術［Ｓｃｈａｅｆｅｒら（２０１１年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０８巻：１１１８７～１１１９２頁］では、ドメインクロスオーバーを使用して軽鎖の誤ったペア形成を克服し、ノブ・ホールを使用して重鎖をヘテロ二量体化する［Ｍｅｒｃｈａｎｔら（１９９８年）、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻：６７７～６８１頁］。ドメインクロスオーバーのためには、可変ドメインまたは定常ドメインを、軽鎖と重鎖との間で交換して、可変ドメインの構造機能的な完全性を保存しながらコグネイト軽鎖のペア形成を駆動する２つの非対称Ｆａｂアームを創出する［Ｆｅｎｎら（２０１３年）、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、８巻：ｅ６１９５３頁］。軽鎖の誤ったペア形成を克服するための代替的手法は、Ｆａｂ界面が直交する重鎖および軽鎖をデザインすることである［Ｌｅｗｉｓ（２０１４年）、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３２巻：１９１～１９８頁］。これは、ＶＨ／ＶＬ界面およびＣＨ１／ＣＬ界面における変異を特定するＸ線結晶構造解析と組み合わせた計算モデル化［Ｄａｓら（２００８年）、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７７巻：３６３～３８２頁］により達せられている。この方法を使用して生成されるヘテロ二量体には、ＶＨ／ＶＬ界面およびＣＨ１／ＣＬ界面の両方への変異を操作して、重鎖／軽鎖の誤ったペア形成を最小化することが必要であり得る。デザインした直交性のＦａｂ界面を、重鎖のヘテロ二量体化戦略と共に使用して、単一の宿主細胞における効率的なＩｇＧ産生を促進することができる。直交性のＦａｂ界面を生成して、このようなヘテロ二量体の構築を促進するために、静電ステアリングも使用することができる。ペプチドリンカーを使用して、「ＬＵＺ－Ｙ」として公知のフォーマット［Ｗｒａｎｉｋら（２０１２年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２８７巻：４３３３１～４３３３９頁］において軽鎖および重鎖のコグネイトペア形成を確実にしてもよく、ここでは、重鎖のヘテロ二量体化は、インビトロにおけるタンパク質分解により後で除去され得るロイシンジッパーを使用して達せられる。
代替的に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、本明細書に記載されるような１つまたは複数の単鎖リガンドトラップを含むことができ、任意選択で、これは、１つまたは複数のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびに追加のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖リガンドトラップに共有結合的または非共有結合的に会合していてもよい［ＵＳ２０１１／０２３６３０９およびＵＳ２００９／００１０８７９］。図１２を参照のこと。本明細書において記載されるように、単鎖リガンドトラップは、多価になるのにコイルドコイルなどＦｃドメインのいずれの多量体化ドメインとの融合も必要としない。概して、本開示の単鎖リガンドトラップは、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドドメインおよび１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインを含む。本明細書において一般に結合ドメイン（ＢＤ）と称されるＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインは、任意選択で、リンカー領域によって結合されていてもよい。
例えば、一態様では、本開示は、以下の構造：
（＜ＢＤ１＞－リンカー１）ｋ－［＜ＢＤ２＞－リンカー２－｛＜ＢＤ３＞－リンカー３｝ｆ］ｎ－（＜ＢＤ４＞）ｍ－（リンカー４－ＢＤ５＞ｄ）ｈ
を有するポリペプチドを含むヘテロ多量体を提供する。
ここで、ｎおよびｈは、独立に、１より大きいか、またはこれと等しく；ｄ、ｆ、ｍ、およびｋは、独立に、０より大きいか、またはこれと等しく；ＢＤ１、ＢＤ２、ＢＤ３、ＢＤ４、およびＢＤ５は、独立に、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインであり、ここで、ＢＤ１、ＢＤ２、ＢＤ３、およびＢＤ４の少なくとも１つはＡＬＫ４ポリペプチドドメインであり、ＢＤ１、ＢＤ２、ＢＤ３、およびＢＤ４の少なくとも１つはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインであり、リンカー１、リンカー２、リンカー３、およびリンカー４は、独立に、０より大きいか、またはこれと等しい。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖トラップは、少なくとも２つの異なるＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖トラップは、少なくとも２つの異なるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖トラップは、少なくとも２つの異なるリンカーを含む。ｄ、ｆ、ｈ、ｋ、ｍ、およびｎについて選択される値に応じて、ヘテロ多量体構造は、種々の組み合わせのより大きな数の反復単位を含んでもよいし、比較的に単純な構造でもよい。
別の態様では、本開示は、以下の構造：
＜ＢＤ１＞－リンカー１－＜ＢＤ２＞
を有するポリペプチドを含むヘテロ多量体を提供する。
なお別の態様では、本開示は、以下の構造：
＜ＢＤ１＞－（リンカー２－＜ＢＤ２＞）ｎ
を有するポリペプチドを含むヘテロ多量体を提供し、
ここで、ｎは、１より大きいか、またはこれと等しい。
本発明の別の態様は、以下の構造：
（＜ＢＤ１＞－リンカー１－＜ＢＤ１＞）ｆ－リンカー２－（＜ＢＤ２＞－リンカー３－＜ＢＤ３＞）ｇ
を有するポリペプチドを含むヘテロ多量体を提供し、
ここで、ｆおよびｇは、１より大きいか、またはこれと等しい。
ＢＤ２とＢＤ３とが同じであり、ｆとｇとが同じ数である実施形態では、この結果として、リンカー２の近傍において実質的に鏡面対称構造であって、リンカーの差違に従う構造をもたらすことができる。ＢＤ２がＢＤ３と異なり、かつ／またはｆとｇとが異なる数である場合、異なる構造がもたらされる。適切な結合ドメイン、リンカー、および反復頻度を、本明細書における開示および当該分野における知見に照らして選択することは当業者の能力の範囲内にある。本開示に従うこのような単鎖リガンドトラップの具体的で非限定的な例を、図１１に概略的に表す。
リンカー（１、２、３、および４）は、同じであってもよく、異なっていてもよい。リンカー領域は、ＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢの構造化されたリガンド結合ドメインとは異なるセグメントをもたらし、したがって、結合ドメインを化学修飾する必要なしにアクセサリー分子（例えば、ＰＥＧ化部分などの安定性を増大させるのに有用な分子）とのコンジュゲーションのために使用することができる。リンカーは、ＴＧＦ－βスーパーファミリーにおける目的のリガンドの受容体または別の受容体の細胞外部分内の天然の非構造化領域の配列と同じ場合もあり、これに対する保存的修飾に由来する場合もある、非構造化アミノ酸配列を含み得る。他の場合には、このようなリンカーは組成および起源において完全に人工的であり得るが、構造化されていない可撓性のリンカーであって、目的のリガンドに近接した場合に、静電的または立体障害上の難題に遭遇する可能性が小さいリンカーをもたらすように選択されたアミノ酸を含有する。リンカーの長さは、リンカーのＮ末端およびＣ末端の各々に配置された結合ドメインが、その天然のリガンド上のその天然の結合部位に結合することを可能とし、両方の結合ドメインがそのように結合することにより、リガンドが、結合ドメインのうちの１つだけの結合により結合する場合より高アフィニティで結合する場合に、許容可能であると考えられる。場合によっては、天然起源または人工起源のリンカー内のアミノ酸残基の数は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンド上の２つの結合部位への同時的な（架橋された）結合に要請される最小の距離と同等であるか、またはこれを超えるように選択する。例えばであり、いかなる形でも限定的であることを望まないが、リンカーの長さは、１～１０アミノ酸、１０～２０アミノ酸、約１８～８０アミノ酸、２５～６０アミノ酸、３５～４５アミノ酸の間、または他の任意の適切な長さであり得る。
リンカーは、ポリペプチドの精製を促進するようにデザインすることができる。選択される精製スキームにより、どのような修飾が必要とされるのかが決定され、例えばであり、限定的であることを望まないが、Ｈｉｓタグなどの精製「タグ」の付加が企図され、他の例では、リンカーは、カーゴ分子またはアクセサリー分子の付加を促進する領域を含み得る。このような付加が、リンカーの非構造化性質に影響を及ぼすか、または潜在的な静電的もしくは立体的懸念をもたらす場合、２つの結合ドメインがリガンド上のそのそれぞれの部位に結合することが可能であることを確実にするように、リンカーの長さを適切に増大させる。本明細書の方法および教示に照らし、当業者は、このような決定を慣習的に行うことができる。
加えて、このデザインは、他のカーゴ分子（例えば、蛍光分子などのイメージング剤）、毒素などの連結も可能とする。例えばであり、いかなる形でも限定的であることを望まないが、単鎖ポリペプチドは、１つまたは複数のカーゴ分子および／またはアクセサリー分子（本明細書では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４などと総称する）：
Figure 0007055637000028
 を付加するように修飾することができる。
利用可能なＲ置換基の一般性を限定するものではないが、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は存在してもよく、存在しなくてもよいが、存在する場合、それらは、同じであってもよく、異なってもよく、独立に、１つまたは複数のターゲティングのための融合タンパク質、これらに限定されないが、例えば、抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ）および／もしくは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）；例えば、放射性核種（例えば、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１８Ｆ、６４Ｃ、６８Ｙ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、５７Ｃｕ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ）、蛍光色素（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、Ｃｙ色素）、および／もしくは蛍光タンパク質タグ（例えば、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ）などのこれらに限定されない、放射線療法および／もしくはイメージング剤；例えば、ドキソルビシン、カリケアミシン、マイタンシノイドの誘導体（例えば、ＤＭ１、ＤＭ４）、毒素（例えば、短縮型Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素）などのこれらに限定されない、化学療法のための細胞傷害剤；例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、薬物、ナノ担体、もしくはイメージング剤にコンジュゲートしたポリマー（例えば、ポリマーであるＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、グルタミン酸、ＰＥＧ、デキストランによるもの）などのこれらに限定されない、ナノ粒子ベースの担体；薬物（例えば、ドキソルビシン、カンプトテシン、パクリタキセル、白金酸塩（ｐａｌａｔｉｎａｔｅ）であるがこれらに限定されない）；例えば、ナノシェルもしくはリポソームなどのこれらに限定されない、ナノ担体；例えば、Ｓｕｐｅｒｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ（ＳＰＩＯ）などのこれに限定されない、イメージング剤；デンドリマー；ならびに／またはリガンドの精製、濃縮、もしくは隔離に使用するための固体支持体（例えば、ナノ粒子、不活性樹脂、適するシリカ支持体）であり得る。
概して、全ての可能な位置にカーゴ分子またはアクセサリー分子を有することは、立体的または静電的難題を引き起こし得るので、好ましくない。しかし、カーゴ分子またはアクセサリー分子を構造上の１つまたは複数の任意の所与の位置に付加することの効果は、本明細書の開示に照らして、結合ドメイン間のリンカーをモデル化し、分子動力学シミュレーションを実行して、分子力学エネルギーを実質的に最小化し、リンカーと、本明細書で教示されるようなＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとの間の立体的および静電的不適合性を低減することにより、慣習的に決定することができる。
結合機能への干渉の可能性を低減するために、カーゴ分子またはアクセサリー分子を、結合ドメインではなく、作用因子のリンカー部分に付加することが好ましい場合もある。しかし、一部の場合には、結合ドメインへの付加が可能であり、所望されることもあり、このような付加の効果は、提起される付加を伴う結合作用因子およびリンカーを、本明細書で記載されるようにモデル化することにより慣習的にあらかじめ決定することができる。
コンジュゲーション方法は、一級アミン反応基、スクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル反応基、およびスルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒａｌ）反応基などの一般的な反応基を介するコンンジュゲーションを可能とする市販のキットを使用して実施することができる。一部の非限定的な例は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８タンパク質標識化キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＰＥＧ化キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）である。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖トラップを、１つまたは複数のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ならびに追加のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖リガンドトラップと共有結合的にまたは非共有結合的に会合させて、本明細書で記載される方法に従い使用し得るより高次のヘテロ多量体を形成することができる。例えば、図１２を参照されたい。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖リガンドトラップは、本明細書で記載されるような多量体化ドメインをさらに含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖リガンドトラップは、Ｉｇ免疫グロブリンの定常ドメインを含む。このような免疫グロブリン定常ドメインは、少なくとも１つの単鎖ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢトラップを含む対称または非対称複合体を促進するように選択することができる。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖トラップまたはそのようなトラップの組み合わせを、本明細書に記載されるようなＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ障害または疾患を処置または予防するためのＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストとして使用することができる。
融合タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質）の異なるエレメントは、所望の機能性と符合する任意の様式で配列し得ることが理解される。例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインを、異種ドメインに対してＣ末端に配置することもでき、代替的に、異種ドメインを、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインに対してＣ末端に配置することもできる。ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインと、異種ドメインとは、融合タンパク質内で隣接する必要はなく、追加のドメインまたはアミノ酸配列を、いずれかのドメインに対してＣ末端またはＮ末端に含めることもでき、ドメインの間に含めることもできる。
例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃで示されるようなアミノ酸配列を含み得る。Ｂ部分はＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインに対応する。ＡおよびＣ部分は、独立に、０、１または１より多くのアミノ酸であり得、ＡおよびＣ部分の両方は、存在する場合、Ｂに対して異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に結合されていてもよい。リンカーは、グリシン（例えば、２～１０、２～５、２～４、２～３グリシン残基）またはグリシンおよびプロリン残基が豊富であってもよいし、スレオニン／セリンおよびグリシンの単一配列またはスレオニン／セリンおよび／またはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号１３）、ＧＧＧＧ（配列番号１４）、ＴＧＧＧＧ（配列番号１５）、ＳＧＧＧＧ（配列番号１６）、ＴＧＧＧ（配列番号１７）、ＳＧＧＧ（配列番号１８）、またはＧＧＧＧＳ（配列番号５８）の単回または反復、を含んでもよい。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃで示されるようなアミノ酸配列を含み、ここで、Ａはリーダー（シグナル）配列、ＢはＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインからなり、Ｃは、インビボ安定性、インビボ半減期、摂取／投与、組織局在化または分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製の１つまたは複数を増強するポリペプチド部分である。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃで示されるようなアミノ酸配列を含み、ここで、ＡはＴＰＡリーダー配列であり、ＢはＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体ポリペプチドドメインからなり、Ｃは免疫グロブリンＦｃドメインである。好ましい融合タンパク質は、配列番号３９、４１、４２、４４、４５、４６、４７、および４８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、所望の特性を付与するために１つまたは複数の異種部分（ドメイン）をさらに含む。例えば、いくつかの融合ドメインが、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。このような融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。アフィニティ精製の目的では、グルタチオン－、アミラーゼ－、およびニッケル－もしくはコバルト－結合化樹脂のような、アフィニティクロマトグラフィーのための適切なマトリクスが使用される。このようなマトリクスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムおよび（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓＴＭシステム（Ｑｉａｇｅｎ）のような「キット」の形態で利用可能である。別の例としては、融合ドメインは、リガンドトラップポリペプチドの検出を容易にするように選択され得る。このような検出ドメインの例としては、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに、「エピトープタグ」（これは、特定の抗体に利用可能な、通常は短いペプチド配列である）が挙げられる。特定のモノクローナル抗体に容易に利用可能な周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ－ｍｙｃタグが挙げられる。いくつかの場合、融合ドメインは、関連のプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、そこから組換えタンパク質を解放することを可能にする、第Ｘａ因子またはトロンビンのようなプロテアーゼ切断部位を有する。解放されたタンパク質は、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって、融合ドメインから単離され得る。
ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ポリペプチドを安定化させ得る１または複数の修飾を含み得る。例えば、このような修飾は、ポリペプチドのインビトロ半減期を増強させるか、ポリペプチドの循環半減期を増強させる、かつ／または、ポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。このような安定化修飾としては、融合タンパク質（例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインと安定化ドメインとを含む融合タンパク質が挙げられる）、グリコシル化部位の修飾（例えば、本開示のポリペプチドへのグリコシル化部位の付加が挙げられる）、および糖質部分の修飾（例えば、本開示のポリペプチドからの炭水化物部分の除去が挙げられる）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「安定化ドメイン」は、融合タンパク質の場合のように融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を指すだけでなく、炭水化物部分のような非タンパク質性修飾、または、ポリエチレングリコールのような非タンパク質性部分も含む。
好ましい実施形態では、本明細書で記載される方法に従い使用されるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、単離複合体である。本明細書で使用する場合、単離タンパク質（またはタンパク質複合体）または単離ポリペプチド（またはポリペプチド複合体）とは、その天然環境の成分から分離されたタンパク質またはポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体を、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰＬＣ）により決定した場合に、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より高い純度まで精製する。当該分野では、抗体純度を評価するための方法が周知である［Ｆｌａｔｍａｎら、（２００７年）、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、Ｂ８４８巻：７９～８７頁］。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体調製物は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を実質的に含まない。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体および約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにそれを含むヘテロ多量体は、当該分野で公知の様々な技法により生成することができる。例えば、ポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ， Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３年）；およびＧｒａｎｔ Ｇ． Ａ．（編）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２年）において記載されているものなどの標準的なタンパク質化学技術を使用して合成することができる。加えて、自動式ペプチド合成器も、市販されている（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ ３９６型；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ９６００）。代替的に、それらのフラグメントまたは改変体を含む、ポリペプチドは、当該分野で周知の、種々の発現系［Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス］を使用して、組換えにより生成することもできる。さらなる実施形態では、改変ポリペプチドまたは非改変ポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、またはＰＡＣＥ（ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）の使用を介する、組換えにより生成された全長ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの消化により生成することができる。（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）コンピュータ解析を使用して、タンパク質分解性切断部位を同定することができる。
Ｂ．ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体（そのフラグメント、機能的改変体、および融合タンパク質を含む）をコードする、単離核酸および／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号１１は、天然に存在するヒトＡＬＫ４前駆体のポリペプチドをコードするが、配列番号１２は、ＡＬＫ４の成熟細胞外ドメインをコードする。対象核酸は、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。このような核酸は、ＤＮＡ分子でもよく、ＲＮＡ分子でもよい。これらの核酸は、例えば、本明細書に記載のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を作製するための方法において使用することができる。
本明細書で使用する場合、単離核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、その核酸分子を通常含有するが、その核酸分子が染色体外またはその天然の染色体位置と異なる染色体位置に存在する細胞内に含有される核酸分子を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸は、配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０または４３、ならびにその改変体の任意の１つを含むことが理解される。改変体ヌクレオチド配列は、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失により異なる配列であって、対立遺伝子改変体を含む配列を含み、したがって、配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０、４３の任意の１つに表示されるヌクレオチド配列と異なるコード配列を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦβスーパーファミリーＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０、または４３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる単離または組み換えの核酸配列にコードされる。当業者は、配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０、または４３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列に相補的な配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる核酸配列も本開示の範囲内であることを理解する。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離されていてもよく、組み換えであってもよく、かつ／または異種ヌクレオチド配列と融合されていてもよく、ＤＮＡライブラリにおけるものでもよい。
他の実施形態では、本開示の核酸はまた、配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０または４３に指定されるヌクレオチド配列、配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０または４３の相補配列、またはこれらのフラグメントに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。例えば、約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションの後に、５０℃における２．０×ＳＳＣの洗浄を行い得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃における約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度と塩の両方が変更されても、温度または塩濃度が一定に保たれ、他の変数が変更されてもよい。一実施形態では、本開示は、室温における６×ＳＳＣとその後の室温で２×ＳＳＣでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
遺伝子コードにおける縮重に対して配列番号７、８、１１、１２、２１、２２、４０、または４３に示される核酸と異なる単離された核酸もまた、本開示の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が１より多いトリプレットによって示される。同じアミノ酸を特定するコドンまたは同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンに対する同義語である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じ得る。しかしながら、哺乳動物細胞の中には、本主題のタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が存在することが予想される。当業者は、天然の対立遺伝子改変に起因して、所与の種の個体間に、特定のタンパク質をコードする核酸の１または複数のヌクレオチド（約３～５％までのヌクレオチド）におけるこれらの改変が存在し得ることを理解する。任意およびあらゆるこのようなヌクレオチドの改変と、結果として生じるアミノ酸の多型とは、本開示の範囲内である。
特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物において１または複数の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に対して適切なものである。種々の宿主細胞について、多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知である。代表的には、上記１または複数の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列もしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくはアクチベーター配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性のプロモーターが、本開示によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または、１つより多くのプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在し得るか、または、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用される宿主細胞により変化する。
特定の態様では、本主題の核酸は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードし、そして、少なくとも１つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語、調節性配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣもしくはＴＲＣシステム、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が誘導されるＴ７プロモーター、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α－接合因子（ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに、原核生物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた考慮されるべきである。
本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか、または両方において発現させるために適切なベクター中に連結することによって生成され得る。組換えＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適切なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられる：原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための、ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞において発現される１または複数の真核生物の転写単位との両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ－ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列を用いて改変される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）またはエプスタイン－バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体が、真核生物細胞におけるタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一般的な組換え手順、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年］。いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系を用いて組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷｌ）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β－ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）が挙げられる。
好ましい実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞における本主題のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの生成のために設計される（例えば、Ｐｃｍｖ－Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ－ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ））。明らかであるように、本主題の遺伝子構築物は、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を生成するため、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本主題のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
本開示はまた、１または複数の本主題のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢトラップポリペプチドのコード配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢトラップポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株］において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
したがって、本開示はさらに、本主題のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを生成する方法に関する。例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を起こすことが可能な適切な条件下で培養され得る。ポリペプチドは、ポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、細胞質または膜画分から単離されてもよいし、回収し、溶解された細胞から得られてもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本主題のポリペプチドは、タンパク質を精製するための当該分野で公知の技法であって、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫アフィニティ精製、およびＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに融合させたドメインに結合する作用因子によるアフィニティ精製（例えば、プロテインＡカラムを使用して、ＡＬＫ４－Ｆｃおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を精製することができる）を含む技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはこれらの両方から単離することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、その精製を容易とするドメインを含有する融合タンパク質である。
一部の実施形態では、精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多く、任意の順序で含む工程により達成する。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了し得る。ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにその融合タンパク質は、サイズ除外クロマトグラフィーにより決定した場合に、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、または＞９９％の純度まで精製することができ、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより決定した場合に、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、または＞９９％の純度まで精製することができる。純度の標的レベルは、哺乳動物系、特に、非ヒト霊長動物、齧歯動物（マウス）、およびヒトにおいて、望ましい結果を達成するのに十分なレベルであるべきである。
別の実施形態では、精製用リーダー配列（例えば、組換えＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの所望の部分のＮ末端に位置するポリ－（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列）をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その後、精製用リーダー配列は、引き続いて、エンテロキナーゼでの処理によって除去され、精製ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにそのヘテロ多量体を提供し得る［Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、（１９９１年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８巻：８９７２頁］。
融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もしくは突出（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端のフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ－ｉｎ）、所望されない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用いる従来の技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照のこと。
Ｃ．抗体アンタゴニスト
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、抗体（ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体）または抗体の組み合わせである。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、例えば、１つまたは複数のＡＬＫ４リガンド、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ－結合リガンド、ＡＬＫ４受容体、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体、および／または１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリー共受容体に結合することができる。本明細書において記載されるように、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体を、単独、または、１つまたは複数の支持療法または活性剤と組み合わせて使用して、それを必要とする者（例えば、骨関連疾患または障害、筋肉関連疾患または障害、あるいは過剰もしくは望まない脂肪と関連した疾患または障害を有する対象）を処置することができる。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、およびＧＤＦ３などのＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体によって結合されるかまたは結合される可能性の高い１つまたは複数のリガンドを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともそのようなリガンドの１つに結合する。例として、本明細書で使用する場合、アクチビンＢ抗体（または抗アクチビンＢ抗体）は、一般に、十分なアフィニティでアクチビンＢに結合することができる抗体を指し、そのため、この抗体は、アクチビンＢをターゲッティングするのに診断剤および／または治療剤として有用である。ある特定の実施形態では、アクチビンＢ抗体が無関係な非アクチビンＢタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定した場合に、この抗体のアクチビンＢへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満である。ある特定の実施形態では、アクチビンＢ抗体は、異なる種由来のアクチビンＢの間で保存されているアクチビンＢのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗アクチビンＢ抗体は、ヒトアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、アクチビンＢ抗体は、アクチビンＢがＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、そうすることで、アクチビンＢ媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、アクチビンＢ抗体は、アクチビンＢが共受容体に結合するのを阻害し、そうすることで、アクチビンＢ媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。アクチビンＢはアクチビンＡ、ＣおよびＥといくらかの配列ホモロジーを共有し、したがって、アクチビンＢに結合する抗体は、一部の場合には、別のアクチビンにも結合し、かつ／またはこれを阻害し得ることに留意されたい。一部の実施形態では、本開示は、例えばアクチビンＢに結合し、かつ、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡＢおよびアクチビンＢ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６およびＧＤＦ３］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体にさらに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、アクチビンＢに結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１ｘ１０－７Ｍより大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的穏和な結合、例えば、約１ｘ１０－８Ｍまたは約１ｘ１０－９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関連し、ここで、抗体の組み合わせは、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６およびＧＤＦ］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体に結合する２つまたはそれより多くの抗体の組み合わせを含む。一部の実施形態では、抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＧＤＦ８を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＧＤＦ８に結合する。本明細書で使用する場合、ＧＤＦ８抗体（または抗ＧＤＦ８抗体）は、一般に、十分なアフィニティでＧＤＦ８に結合する抗体を指し、そのため、この抗体は、ＧＤＦ８をターゲッティングするのに診断剤および／または治療剤として有用である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ８抗体が無関係な非ＧＤＦ８タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定した場合に、この抗体のＧＤＦ８への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ８抗体は、異なる種由来のＧＤＦ８の間で保存されているＧＤＦ８のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、ヒトＧＤＦ８に結合する。一部の実施形態では、ＧＤＦ８抗体は、ＧＤＦ８がＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、そうすることで、ＧＤＦ８媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＧＤＦ８抗体は、ＧＤＦ８が共受容体に結合するのを阻害し、そうすることで、ＧＤＦ８媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。ＧＤＦ８はＧＤＦ１１と高い配列ホモロジーを有し、したがって、ＧＤＦ８に結合する抗体は、一部の場合には、ＧＤＦ１１にも結合し、かつ／またはこれを阻害し得ることに留意されたい。一部の実施形態では、本開示は、ＧＤＦ８に結合し、かつ、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６およびＧＤＦ３］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体にさらに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＧＤＦ８に結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１ｘ１０－７Ｍより大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的穏和な結合、例えば、約１ｘ１０－８Ｍまたは約１ｘ１０－９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関連し、ここで、抗体の組み合わせは、ＧＤＦ８抗体と、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ８抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１に結合する。本明細書で使用する場合、ＧＤＦ１１抗体（または抗ＧＤＦ１１抗体）は、一般に、十分なアフィニティでＧＤＦ１１に結合する抗体を指し、そのため、この抗体は、ＧＤＦ１１をターゲッティングするのに診断剤および／または治療剤として有用である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体が無関係な非ＧＤＦ１１タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定した場合に、この抗体のＧＤＦ１１への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体は、異なる種由来のＧＤＦ１１の間で保存されているＧＤＦ１１のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、ヒトＧＤＦ１１に結合する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体は、ＧＤＦ１１がＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、そうすることで、ＧＤＦ１１媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体は、ＧＤＦ１１が共受容体に結合するのを阻害し、そうすることで、ＧＤＦ１１媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。ＧＤＦ１１はＧＤＦ８と高い配列ホモロジーを有し、したがって、ＧＤＦ１１に結合する抗体は、一部の場合には、ＧＤＦ８にも結合し、かつ／またはこれを阻害し得ることに留意されたい。一部の実施形態では、本開示は、ＧＤＦ１１に結合し、かつ、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６およびＧＤＦ３］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体にさらに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１に結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１ｘ１０－７Ｍより大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的穏和な結合、例えば、約１ｘ１０－８Ｍまたは約１ｘ１０－９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関連し、ここで、抗体の組み合わせは、ＧＤＦ１１抗体と、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＧＤＦ３を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＧＤＦ３に結合する。本明細書で使用する場合、ＧＤＦ３抗体（または抗ＧＤＦ３抗体）は、一般に、十分なアフィニティでＧＤＦ３に結合する抗体を指し、そのため、この抗体は、ＧＤＦ３をターゲッティングするのに診断剤および／または治療剤として有用である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ３抗体が無関係な非ＧＤＦ３タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定した場合に、この抗体のＧＤＦ３への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ３抗体は、異なる種由来のＧＤＦ３の間で保存されているＧＤＦ３のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体は、ヒトＧＤＦ３に結合する。一部の実施形態では、ＧＤＦ３抗体は、ＧＤＦ３がＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、そうすることで、ＧＤＦ３媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＧＤＦ３抗体は、ＧＤＦ３が共受容体に結合するのを阻害し、そうすることで、ＧＤＦ３媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、本開示は、ＧＤＦ３に結合し、かつ、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６およびＧＤＦ１１］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体にさらに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＧＤＦ３に結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１ｘ１０－７Ｍより大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的穏和な結合、例えば、約１ｘ１０－８Ｍまたは約１ｘ１０－９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関連し、ここで、抗体の組み合わせは、ＧＤＦ３抗体と、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ３抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＢＭＰ６を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＢＭＰ６に結合する。本明細書で使用する場合、ＢＭＰ６抗体（または抗ＢＭＰ６抗体）は、一般に、十分なアフィニティでＢＭＰ６に結合する抗体を指し、そのため、この抗体は、ＢＭＰ６をターゲッティングするのに診断剤および／または治療剤として有用である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６抗体が無関係な非ＢＭＰ６タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定した場合に、この抗体のＢＭＰ６への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６抗体は、異なる種由来のＢＭＰ６の間で保存されているＢＭＰ６のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、ヒトＢＭＰ６に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ６抗体は、ＢＭＰ６がＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、そうすることで、ＢＭＰ６媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＢＭＰ６抗体は、ＢＭＰ６が共受容体に結合するのを阻害し、そうすることで、ＢＭＰ６媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、本開示は、ＢＭＰ６に結合し、かつ、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３およびＧＤＦ１１］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体にさらに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＢＭＰ６に結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１ｘ１０－７Ｍより大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的穏和な結合、例えば、約１ｘ１０－８Ｍまたは約１ｘ１０－９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関連し、ここで、抗体の組み合わせは、ＢＭＰ６抗体と、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３およびＢＭＰ１０］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ６抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＢＭＰ１０に結合する。本明細書で使用する場合、ＢＭＰ１０抗体（または抗ＢＭＰ１０抗体）は、一般に、十分なアフィニティでＢＭＰ１０に結合する抗体を指し、そのため、この抗体は、ＢＭＰ１０をターゲッティングするのに診断剤および／または治療剤として有用である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体が無関係な非ＢＭＰ１０タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定した場合に、この抗体のＢＭＰ１０への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体は、異なる種由来のＢＭＰ１０の間で保存されているＢＭＰ１０のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、ヒトＢＭＰ１０に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ１０がＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、そうすることで、ＢＭＰ１０媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ１０が共受容体に結合するのを阻害し、そうすることで、ＢＭＰ１０媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、本開示は、ＢＭＰ１０に結合し、かつ、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３およびＧＤＦ１１］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体にさらに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０に結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１ｘ１０－７Ｍより大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的穏和な結合、例えば、約１ｘ１０－８Ｍまたは約１ｘ１０－９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関連し、ここで、抗体の組み合わせは、ＢＭＰ１０抗体と、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３およびＢＭＰ６］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともアクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣおよび／またはアクチビンＢＥ）を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともアクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣおよび／またはアクチビンＢＥ）に結合する。本明細書で使用する場合、アクチビン抗体（または抗アクチビン抗体）は、一般に、十分なアフィニティでアクチビンの形態に結合することができる抗体を指し、そのため、この抗体は、アクチビンのその形態をターゲッティングするのに診断剤および／または治療剤として有用である。ある特定の実施形態では、アクチビン抗体が無関係な非アクチビンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定した場合に、この抗体のアクチビンへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満である。ある特定の実施形態では、アクチビン抗体は、異なる種由来のアクチビンの間で保存されているアクチビンのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗アクチビン抗体は、ヒトアクチビンに結合する。別の好ましい実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンがＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、そうすることで、アクチビン媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＡおよびアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＡＢに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＣに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＥに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＡおよびアクチビンＣに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＡＣに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＡおよびアクチビンＥに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＡＥに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＢおよびアクチビンＣに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＢＣに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＢおよびアクチビンＥに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＢＥに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＣに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＥに結合する。任意選択で、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＣの１つまたは複数に結合するアクチビン抗体は、アクチビンＥにさらに結合することができる。一部の実施形態では、本開示は、アクチビンに結合し、かつ、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６およびＧＤＦ３］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体にさらに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、アクチビンに結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１ｘ１０－７Ｍより大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的穏和な結合、例えば、約１ｘ１０－８Ｍまたは約１ｘ１０－９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関連し、ここで、抗体の組み合わせは、アクチビン抗体と、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数の追加のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、１つまたは複数のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）、および／または１つまたは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、アクチビン抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ１０］に結合し、アンタゴナイズする抗体に関して、抗体は、そのようなリガンドのエピトープに結合する第１の部分を含み、そうすることで抗体の第１の部分はＩ型受容体と結合について競合し、かつそのようなリガンドのエピトープに結合する第２の部分を含み、そうすることで抗体の第２の部分はＩＩ型受容体と結合について競合する、二重特異性抗体としてデザインされ得ることが企図される。この様式において、単一のリガンドをターゲティングする二重特異性抗体は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体によって付与され得る二重Ｉ型－ＩＩ型受容体結合遮断を模倣するように設計され得る。同様に、同じ効果を、２つまたはそれより多くの抗体の組み合わせを使用して達成することができることが企図され、ここでは、少なくとも第１の抗体はそのようなリガンドのエピトープに結合し、そうすることで第１の抗体はＩ型受容体と結合について競合し、かつ少なくとも第２の抗体はそのようなリガンドのエピトープに結合し、そうすることで第２の抗体はＩＩ型受容体と結合について競合する。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＡＣＴＲＩＩＢを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＡＣＴＲＩＩＢに結合する。本明細書で使用する場合、ＡＣＴＲＩＩＢ抗体（または抗ＡＣＴＲＩＩＢ抗体）は、一般に、十分なアフィニティでＡＣＴＲＩＩＢに結合する抗体を指し、そのため、この抗体は、ＡＣＴＲＩＩＢをターゲッティングするのに診断剤および／または治療剤として有用である。ある特定の実施形態では、抗ＡＣＴＲＩＩＢ抗体が無関係な非ＡＣＴＲＩＩＢタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定した場合に、この抗体のＡＣＴＲＩＩＢへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＣＴＲＩＩＢ抗体は、異なる種由来のＡＣＴＲＩＩＢの間で保存されているＡＣＴＲＩＩＢのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＣＴＲＩＩＢ抗体は、ヒトＡＣＴＲＩＩＢに結合する。一部の実施形態では、ＡＣＴＲＩＩＢ抗体は、ＡＣＴＲＩＩＢがＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、そうすることで、ＡＣＴＲＩＩＢ媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］がＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡＬＫ４に結合するのを阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢと、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、および、アクチビンＡＢ）ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４）、共受容体および／または追加のＩＩ型受容体とに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体およびその使用に関連し、ここで、抗体の組み合わせは、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体と、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、Ｎｏｄａｌ、およびＢＭＰ９］、共受容体、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４）および／または追加のＩＩ型受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。ＡｃｔＲＩＩＢはＡｃｔＲＩＩＡに対する配列類似性を有し、したがってＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体は、一部の場合には、ＡｃｔＲＩＩＡにも結合し、かつ／または阻害することができることに留意されたい。
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＡＬＫ４を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＡＬＫ４に結合する。本明細書で使用する場合、ＡＬＫ４抗体（抗ＡＬＫ４抗体）は、一般に、十分なアフィニティでＡＬＫ４に結合する抗体を指し、そのため、この抗体は、ＡＬＫ４をターゲッティングするのに診断剤および／または治療剤として有用である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体が無関係な非ＡＬＫ４タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定した場合に、この抗体のＡＬＫ４への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、異なる種由来のＡＬＫ４の間で保存されているＡＬＫ４のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、ヒトＡＬＫ４に結合する。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］がＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ４）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）または共受容体に結合するのを阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、ＡＬＫ４と、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、およびＧＤＦ３］、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、共受容体および／または追加のＩ型受容体とに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体およびその使用に関連し、ここで、抗体の組み合わせは、抗ＡＬＫ４抗体と、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、およびＧＤＦ３］、共受容体、追加のＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。
本明細書において記載されるように、ヘテロ多量体を生成するための種々の方法がある。そのような方法を使用して、抗体結合ドメイン（例えば、ＶＬおよびＶＨ鎖の複合体）と、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロマーまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢシングルトラップポリペプチドから選択される１つまたは複数のポリペプチドとを含むヘテロ多量体を生成することができる。図１０および１２Ｄを参照のこと。例えば、一部の実施形態では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に会合している、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、およびＧＤＦ３］に結合する抗体のリガンド結合ドメインを含むタンパク質複合体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に会合している、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、およびＧＤＦ３］に結合する抗体のリガンド結合ドメインを含むタンパク質複合体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖リガンドトラップに共有結合合的または非共有結合的に会合している、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、およびＧＤＦ３］に結合する抗体のリガンド結合ドメインを含むタンパク質複合体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に共有結合的または非共有結合的に会合した、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンドに結合する抗体のリガンド結合ドメインを含むタンパク質複合体を提供する。
抗体という用語は、本明細書では、最も広い意味で使用され、それらが、所望の抗原結合活性を呈示する限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、および抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない、種々の抗体構造を包摂する。抗体フラグメントとは、インタクトな抗体以外の分子であって、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む分子を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を含むがこれらに限定されない［例えば、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、９巻：１２９～１３４頁；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、２６９～３１５頁（１９９４年）；ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号；同第５，５８７，４５８号；および同第５，８６９，０４６号を参照されたい］。ダイアボディーは、二価または二特異性であり得る、２つの抗原結合性部位を有する抗体フラグメントである［例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、９巻：１２９～１３４頁；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６４４４～６４４８頁を参照されたい］。トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｙ）およびテトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）もまた、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、９巻：１２９～１３４頁において記載されている。単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である［例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい］。本明細書で開示される抗体は、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよい。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、それらに付加させた、検出可能な標識を含む（例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。ある特定の好ましい実施形態では、本開示の抗体は、単離された抗体である。ある特定の好ましい実施形態では、本開示の抗体は、組み換え抗体である。
本明細書の抗体は、任意のクラスの抗体であり得る。抗体のクラスとは、その重鎖により保有される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。
一般に、本明細書で開示される方法における使用のための抗体は、その標的抗原に、好ましくは、大きな結合アフィニティで特異的に結合する。アフィニティは、ＫＤ値として表すことができ、内因性結合アフィニティ（例えば、アビディティー効果を最小化して）を反映する。典型的に、結合アフィニティは、無細胞状況の場合であれ、細胞会合状況の場合であれ、インビトロにおいて測定する。本明細書で開示されるアッセイを含む、当該分野で公知の多数のアッセイであって、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）、およびＥＬＩＳＡを含むアッセイのいずれかを使用して、結合アフィニティの測定値を得ることができる。。一部の実施形態では、本開示の抗体は、それらの標的抗原（例えば、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６およびＧＤＦ３）に、少なくとも１×１０－７もしくはこれよりも強力に、１×１０－８もしくはこれよりも強力に、１×１０－９もしくはこれよりも強力に、１×１０－１０もしくはこれよりも強力に、１×１０－１１もしくはこれよりも強力に、１×１０－１２もしくはこれよりも強力に、１×１０－１３もしくはこれよりも強力に、または１×１０－１４もしくはこれよりも強力なＫＤで結合する。
ある特定の実施形態では、ＫＤは、以下のアッセイにより記載されるように、関心のある抗体のＦａｂバージョンおよびその標的抗原で実施されるＲＩＡにより測定される。Ｆａｂの抗原に対する溶液結合アフィニティは、Ｆａｂを、滴定系列の非標識抗原の存在下において、最低濃度の放射性標識された抗原（例えば、１２５Ｉで標識された）と平衡化し、次いで、結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートで捕捉することにより測定する［例えば、Ｃｈｅｎら（１９９９年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９３巻：８６５～８８１頁を参照されたい］。アッセイ条件を確立するために、マルチウェルプレート（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標））を、捕捉用抗Ｆａｂ抗体（例えば、Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ製）でコーティングし（例えば、一晩にわたり）、その後、好ましくは、室温（およそ２３℃）において、ウシ血清アルブミンでブロッキングする。非吸着型プレートでは、放射性標識された抗原を、関心のあるＦａｂの系列希釈液と混合する［例えば、Ｐｒｅｓｔａら、（１９９７年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７巻：４５９３～４５９９頁における抗ＶＥＧＦ抗体である、Ｆａｂ－１２の評価と符合する］。次いで、関心のあるＦａｂを、好ましくは、一晩にわたりインキュベートするが、平衡に到達することを確保するように、インキュベーションは、長時間（例えば、約６５時間）にわたり継続することもできる。その後、混合物を、好ましくは、室温で約１時間にわたるインキュベーションのために、捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、好ましくは、ポリソルベート２０とＰＢＳとの混合物で、複数回洗浄する。プレートを乾燥させたら、シンチレーション剤（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ製のＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（登録商標））を添加し、ガンマカウンター（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ製のＴＯＰＣＯＵＮＴ（登録商標））上で、プレートをカウントする。
別の実施形態によれば、ＫＤは、例えば、抗原ＣＭ５チップを約１０応答単位（ＲＵ）で固定化させた、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定する。略述すると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。例えば、抗原は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）まで希釈してから、５μｌ／分の流量で注入して、およそ１０応答単位（ＲＵ）のタンパク質のカップリングを達成することができる。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。反応速度の測定のため、Ｆａｂの２倍系列希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に、およそ２５μｌ／分の流量で注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、例えば、単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサーグラムおよび解離センサーグラムのフィッティングを同時に行うことにより計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算する［例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９９年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９３巻：８６５～８８１頁を参照されたい］。オン速度が、例えば、上記の表面プラズモン共鳴アッセイで１０６Ｍ－１ｓ－１を超える場合、オン速度は、徐々に増大する濃度の抗原の存在下におけるＰＢＳ中、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度（例えば、励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）であって、攪拌型キュベットを有するストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または８０００シリーズのＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（登録商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計により測定した場合の、蛍光発光強度の増加または減少を測定する蛍光消光法を使用することにより決定することができる。
抗体フラグメントは、本明細書で記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化のほか、組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による生成を含むがこれらに限定されない種々の技法により作製することができる。当該分野では、ヒトのＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＧＤＦ３およびＢＭＰ９の核酸配列およびアミノ酸配列が周知である。加えて、当該分野では、抗体を生成するための多数の方法が周知であり、それらの一部については、本明細書でも記載する。したがって、本開示に従う使用のための抗体アンタゴニストは、当該分野における知見および本明細書で提供される教示に基づき、当業者が日常的に作製することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来する一方、重鎖および／または軽鎖の残余は異なる供給源または種に由来する抗体を指す。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻：６８５１～６８５５頁に記載されている。一部の実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長動物に由来する可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。一部の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスを、親抗体のクラスまたはサブクラスから変化させた「クラススイッチ」抗体である。一般に、キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）に由来するアミノ酸残基と、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つの可変ドメインであり、典型的には２つの可変ドメインであって、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）に対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を経た抗体を指す。ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）、Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ．、１３巻：１６１９～１６３３頁において総説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３～３２９頁；Ｑｕｅｅｎら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６巻：１００２９～１００３３頁；米国特許第５，８２１，３３７号；同第７，５２７，７９１号；同第６，９８２，３２１号；および同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：２５～３４頁［ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフティングについて記載する］；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９１年）、２８巻：４８９～４９８頁（「リサーフェシング」について記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：４３～６０頁（「ＦＲシャフリング」について記載する）；Ｏｓｂｏｕｒｎら（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：６１～６８頁；ならびにＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ（２０００年）、８３巻：２５２～２６０頁（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチについて記載する）においてさらに記載されている。ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域は、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域［例えば、Ｓｉｍｓら（１９９３年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁を参照されたい］；軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定の亜集団による、ヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域［例えば、Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁；およびＰｒｅｓｔａら（１９９３年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁を参照されたい］；ヒト成熟（体細胞変異させた）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域［例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）、Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ．、１３巻：１６１９～１６３３頁を参照されたい］；およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域［例えば、Ｂａｃａら、（１９９７年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７２巻：１０６７８～１０６８４頁；およびＲｏｓｏｋら、（１９９６年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７１巻：２２６１１～２２６１８頁を参照されたい］を含むがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該分野で公知の種々の技法を使用して生成することができる。ヒト抗体は一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋおよびｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ（２００８年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５巻：３６８～７４頁（２００１年）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０巻：４５０～４５９頁において記載されている。例えば、ヒト抗体は、免疫原（例えば、ＧＤＦ１１ポリペプチド、アクチビンＢポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を、抗原性攻撃に応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物に投与することにより調製することができる。このような動物は典型的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置きかえるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。このようなトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ（２００５年）、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３巻：１１１７～１１２５頁；米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について記載）；米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術について記載）；米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載）；ならびに米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術について記載）を参照されたい。このような動物により生成されるインタクトな抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによりさらに改変することができる。
本明細書で提供されるヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は記載されている［例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９８４年）、１３３巻：３００１頁；Ｂｒｏｄｅｕｒら（１９８７年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１～６３頁、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＢｏｅｒｎｅｒら（１９９１年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６頁を参照されたい］。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉら、（２００６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０３巻：３５５７～３５６２頁において記載されている。追加の方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の生成について記載）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ（２００６年）、２６巻（４号）：２６５～２６８頁（２００６年）（ヒト－ヒトハイブリドーマについて記載）において記載されている方法を含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ（２００５年）、Ｈｉｓｔｏｌ． Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、２０巻（３号）：９２７～９３７頁；ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｉｎｄ Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２７巻（３号）：１８５～９１頁において記載されている。本明細書で提供されるヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーより選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成することができる。次いで、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。ヒト抗体を抗体ライブラリーより選択するための技法については、当該技術分野で公知であり、本明細書で記載される。
例えば、本開示の抗体は、１つまたは複数の所望の活性を有する抗体のためのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。当該分野では、ファージディスプレイライブラリーを生成し、このようなライブラリーを、所望の結合特徴を保有する抗体についてスクリーニングするための、様々な方法が公知である。このような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７８巻：１～３７頁、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．において総説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２～５５４頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４～６２８頁；Ｍａｒｋｓら（１９９２年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１～５９７頁；ＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ（２００３年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻：１６１～１７５頁、Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．；Ｓｉｄｈｕら（２００４年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３３８巻（２号）：２９９～３１０頁；Ｌｅｅら（２００４年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３４０巻（５号）：１０７３～１０９３頁；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ（２００４年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０１巻（３４号）：１２４６７～１２４７２頁；ならびにＬｅｅら（２００４年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８４巻（１～２号）：１１９～１３２頁においてさらに記載されている。
ある特定のファージディスプレイ法では、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４年）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３～４５５頁において記載されているように、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに組み換え、次いで、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的に、抗体フラグメントを、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントとして呈示する。免疫化された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、ＡＬＫ４、またはＡｃｔＲＩＩＢ）に対する高アフィニティ抗体をもたらす。代替的に、ナイーブレパートリーは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）、ＥＭＢＯ Ｊ、１２巻：７２５～７３４頁により記載されているように、いかなる免疫化もなく、広範にわたる非自己抗原に対する抗体の単一の供給源をもたらし、また、広範にわたる自己抗原を指向する抗体の単一の供給源ももたらすように、クローニングすることができる（例えば、ヒトから）。最後に、ナイーブライブラリーはまた、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１～３８８頁により記載されているように、再配列されていないＶ遺伝子セグメントを、幹細胞からクローニングし、高度に可変的なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロにおける再配列を達成する、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することを介して、合成により作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載する特許公開は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号；ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、および同第２００９／０００２３６０号を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多特異性抗体、例えば、二特異性抗体である。多特異性抗体（典型的に、モノクローナル抗体）は、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれを超える）抗原上の、少なくとも２つの（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれを超える）異なるエピトープに対する結合特異性を有する。
多重特異性抗体を作製するための技法として、これらに限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖軽鎖ペアの組み換え共発現［例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ、（１９８３） Ｎａｔｕｒｅ ３０５： ５３７；国際特許公開ＷＯ９３／０８８２９；およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０： ３６５５、および米国特許第５，７３１，１６８号（「ノブ・ホール」操作）を参照のこと］が挙げられる。多重特異性抗体は、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体の分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（例えば、ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１を参照のこと）；２つまたはそれより多くの抗体またはフラグメントを架橋すること［例えば、米国特許第４，６７６，９８０号；およびＢｒｅｎｎａｎら、（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９： ８１を参照のこと］；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を生成すること［例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、（１９９２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７－１５５３を参照のこと］；二重特異性抗体 フラグメントを作製するために「ダイアボディ」技法を使用すること［例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、（１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４－６４４８を参照のこと］；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること ［例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、（１９９４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８を参照のこと］；および三重特異性抗体を調製すること（例えば、Ｔｕｔｔら、（１９９１）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７： ６０を参照のこと）によって作製することもできる。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントとして調製され得る。本明細書にはまた、３つまたはこれを超える、機能的な抗原結合性部位を有する操作抗体であって、「オクトパス抗体」を含む操作抗体も含まれる［例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい］。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能な改変体抗体、例えば、天然に存在する変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の生成時に発生する改変体抗体（このような改変体は、一般に少量で存在する）を除き同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。典型的に、異なるエピトープを指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープを指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の性質を指し示し、任意の特定の方法により抗体の生成を必要とするとはみなさないものとする。例えば、本方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を活用する方法、本明細書で記載されるモノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法を含むがこれらに限定されない様々な技法により作製することができる。
例えば、標準的なプロトコルを介して、ＧＤＦ１１に由来する免疫原を使用することにより、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清または抗タンパク質／抗ペプチドモノクローナル抗体を作製することができる［例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８年）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８を参照されたい］。マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳動物は、ＧＤＦ１１ポリペプチドの免疫原性形態、抗体応答を誘発することが可能である抗原性フラグメント、または融合タンパク質で免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法は、キャリアへのコンジュゲーションまたは当該分野で周知の他の技法を含む。ＧＤＦ１１ポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血漿中または血清中の抗体力価の検出によりモニタリングすることができる。免疫原を抗原とする標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを使用して、抗体生成レベルおよび／または結合アフィニティレベルを評価することができる。
ＧＤＦ１１の抗原性調製物で動物を免疫化した後、抗血清を得ることができ、所望の場合、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を生成するために、抗体生成細胞（リンパ球）を、免疫化動物から採取し、標準的な体細胞融合手順により、骨髄腫細胞など、不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞をもたらすことができる。このような技法は、当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技法［例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５～４９７頁を参照されたい］、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法［例えば、Ｋｏｚｂａｒら（１９８３年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁を参照されたい］、およびヒトモノクローナル抗体を生成するＥＢＶハイブリドーマ技法［Ｃｏｌｅら（１９８５年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、７７～９６頁］が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、ＧＤＦ１１ポリペプチドと特異的に反応性である抗体、およびこのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離されたモノクローナル抗体の生成について、免疫化学的にスクリーニングすることができる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、これにより、Ｆｃ領域改変体を生成することができる。Ｆｃ領域改変体は、１つまたは複数のアミノ酸位置において、アミノ酸改変（例えば、置換、欠失、および／または付加）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、またはヒトＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
例えば、本開示は、一部のエフェクター機能を保有するが、全てのエフェクター機能は保有しない抗体の改変体であって、これにより、インビボにおける抗体の半減期は重要であるが、ある特定のエフェクター機能［例えば、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）］は、不要または有害である適用に望ましい候補となる抗体の改変体を企図する。インビトロおよび／またはインビボにおける細胞傷害作用アッセイを実行して、ＣＤＣ活性および／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体が、ＦｃγＲ結合を欠く（よって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎへの結合能は保持することを確保することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、例えば、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ（１９９１年）、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻：４５７～４９２頁にまとめられている。関心のある分子のＡＤＣＣ活性を評価するインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ， Ｉ．ら（１９８６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８３巻：７０５９～７０６３頁］；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ， Ｉら（１９８５年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２巻：１４９９～１５０２頁；米国特許第５，８２１，３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ， Ｍ．ら（１９８７年）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１６６巻：１３５１～１３６１頁において記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法を利用することができる（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害作用アッセイ；ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害作用アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に、または加えて、関心のある分子のＡＤＣＣ活性は、インビボにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら（１９９８年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５巻：６５２～６５６頁において開示されている動物モデルなどの動物モデルにおいて評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合できず、よって、ＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる［例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２における、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい］。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる［例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９６年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２巻：１６３頁；Ｃｒａｇｇ， Ｍ． Ｓ．ら（２００３年）、Ｂｌｏｏｄ、１０１巻：１０４５～１０５２頁；ならびにＣｒａｇｇ， Ｍ． Ｓ．およびＭ． Ｊ． Ｇｌｅｎｎｉｅ（２００４年）、Ｂｌｏｏｄ、１０３巻：２７３８～２７４３頁を参照されたい］。当該分野で公知の方法を使用して、ＦｃＲｎへの結合およびインビボにおけるクリアランス／半減期の決定もまた、実施することができる［例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ， Ｓ． Ｂ．ら（２００６年）、Ｉｎｔｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８巻（１２号）：１７５９～１７６９頁を参照されたい］。エフェクター機能を低減した本開示の抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つまたは複数を置換した抗体を含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体は、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、および３２７位のうちの２つまたはこれより多くにおいて置換を有するＦｃ変異体であって、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含むＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ある特定の実施形態では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１つまたは複数の残基をシステイン残基で置換した「チオＭＡｂ」を創出することが望ましいと考えられる。特定の実施形態では、残基の置換を、抗体の接近可能な部位に施す。システインでこれらの残基を置換することにより、反応性のチオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、抗体を、薬物部分またはリンカー－薬物部分など、他の部分にコンジュゲートして、本明細書でさらに記載されるような、免疫コンジュゲートを創出するのに使用することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちの任意の１つまたは複数を、システインで置換することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号において記載されているように生成することができる。
加えて、望ましい抗体を同定するための抗体をスクリーニングするのに使用される技法は、得られる抗体の特性に影響を及ぼし得る。例えば、抗体を、溶液中の抗原の結合に使用する場合、溶液中での結合について試験することが望ましいと考えられる。抗体と抗原との相互作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために、様々な異なる技法が利用可能である。このような技法として、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織化学が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列改変体が企図される。例えば、抗体および／または結合ポリペプチドの結合アフィニティおよび／または他の生体特性を改善することが望ましい場合がある。抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、抗体および／または結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより調製することもでき、ペプチド合成により調製することもできる。このような改変は、例えば、抗体および／または結合性ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはこれらへの挿入、および／またはこれらの置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終的な構築物が、所望の特徴、例えば、標的への結合（ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢへの結合）を保有するという条件で、最終的な構築物に到達するように施すことができる。
変更（例えば、置換）をＨＶＲ内に施して、例えば、抗体のアフィニティを改善することができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスにおいて高頻度で変異を経るコドンによりコードされる残基［例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ（２００８年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２０７巻：１７９～１９６頁（２００８年）を参照されたい］、および／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）に施すことができ、結果として得られる改変体ＶＨまたは改変体ＶＬを結合アフィニティについて調べる。当該分野では、二次ライブラリーを構築し、ここから再選択することによるアフィニティ成熟が記載されている［例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７８巻：１～３７頁、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（２００１年）を参照されたい］。アフィニティ成熟の一部の実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指向変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを創出する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望のアフィニティを有する任意の抗体改変体を同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６残基）をランダム化する、ＨＶＲ指向アプローチを伴う。抗原の結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニン走査変異誘発またはモデル化を使用して、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３は、しばしば標的化される。
ある特定の実施形態では、このような変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限りにおいて、１つまたは複数のＨＶＲ内に置換、挿入、または欠失を施すことができる。例えば、結合アフィニティを実質的に低減しない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）を、ＨＶＲ内に施すことができる。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外部であり得る。上記で提供した改変体ＶＨ配列およびＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、不変であるか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
変異誘発のために標的化され得る抗体および／または結合性ポリペプチドの残基または領域の同定に有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１～１０８５頁により記載されているように、「アラニン走査変異誘発」と呼ばれている。この方法では、残基または標的残基の群（例えば、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性であるかまたは負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置きかえて、抗体の、抗原との相互作用が影響を受けるのかどうかを決定する。初期の置換に対して機能的な感受性を顕示するアミノ酸位置に、さらなる置換を導入することもできる。代替的に、または加えて、抗原－抗体複合体の結晶構造を決定して、抗体と抗原との間の接点を同定する。このような接触残基および近傍の残基は、置換の標的化してもよく、置換の候補として消失させてもよい。改変体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定することができる。
アミノ酸配列の挿入は、１残基～１００またはこれより多くの残基を含有するポリペプチドの範囲の長さのアミノ末端融合体および／またはカルボキシル末端融合体のほか、単一または複数のアミノ酸残基の内部配列挿入も含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入改変体として、抗体のＮ末端もしくはＣ末端の、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）、または抗体の血清中半減期を延長するポリペプチドへの融合体が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合性ポリペプチドを、当該分野で公知であり、たやすく利用可能である、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾することができる。抗体および／または結合性ポリペプチドの誘導体化に適する部分は、水溶性ポリマーを含むがこれらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、およびデキストラン、またはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中のその安定性のために、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であることが可能であり、分枝状でもよく、非分枝状でもよい。抗体および／または結合ポリペプチドに付加させるポリマーの数は、変化させることができ、１つより多くのポリマーを付加させる場合、それらは、同じ分子でもよく、異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、抗体の誘導体および／または結合ポリペプチドの誘導体が規定の条件下での治療に使用されようと、改善する抗体および／または結合ポリペプチドの特定の特性または機能を含むがこれらに限定されない検討事項に基づき決定することができる。
Ｄ．低分子アンタゴニスト
別の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、低分子（ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニスト）または低分子アンタゴニストの組み合わせである。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、例えば、１つまたは複数のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンド、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、および／または共受容体を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、例えば、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて決定した場合に１つまたは複数のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンドによって媒介されるシグナル伝達を阻害する。本明細書において記載されるように、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストは単独で、あるいは１つまたは複数の支持療法または活性剤と組み合わせて使用してそれを必要とする患者（例えば、骨関連疾患または障害、筋肉関連疾患または障害、あるいは過剰もしくは望まない脂肪に関連した疾患または障害を有する対象）を処置することができる。
一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ８を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともアクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、およびアクチビンを阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ４を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ６を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ３を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるようなＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、ＢＭＰ９を阻害しないか、または実質的に阻害しない。
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストは、直接的または間接的インヒビターであり得る。例えば、間接的分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する少なくとも１つのまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、およびＧＤＦ３］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、および／または１つまたは複数の下流のシグナル伝達構成成分（例えば、Ｓｍａｄ）の発現（例えば、転写、翻訳、細胞分泌またはその組み合わせ）を阻害し得る。代替的に、直接的な低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する１つまたは複数のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、およびＧＤＦ３］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、共受容体（例えば、ＣｒｉｐｔｏまたはＣｒｙｐｔｉｃ）、および／または下流のシグナル伝達構成成分（例えば、Ｓｍａｄ）に直接結合し、阻害することができる。１つまたは複数の間接的および１つまたは複数の直接的ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ低分子アンタゴニストの組み合わせは、本明細書に開示の方法に従って使用することができる。
本開示の結合低分子アンタゴニストは、公知の方法を使用して、同定し、化学合成することができる（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。一般に、本開示の低分子アンタゴニストは、通常約２０００ダルトン未満のサイズであり、代替的に、約１５００、７５０、５００、２５０、または２００ダルトン未満のサイズであり、ここで、このような有機低分子は、本明細書で記載されるポリペプチドに、好ましくは、特異的に結合することが可能である。これらの低分子アンタゴニストは、不要な実験を行わず、周知の技法を使用して同定することができる。これに関して、当該分野では、ポリペプチド標的に特異的に結合することが可能な分子について、有機低分子ライブラリーをスクリーニングするための技法が周知であることに留意されたい（例えば、国際特許公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。
本開示の結合有機低分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニル塩化物、ジアゾ化合物、および酸塩化物であり得る。
Ｅ．ポリヌクレオチドアンタゴニスト
別の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、ポリヌクレオチド（ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニスト）またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせである。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、例えば、１つまたは複数のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６およびＧＤＦ３］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、共受容体および／または下流のシグナル伝達構成成分（例えば、Ｓｍａｄ）を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、例えば、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて決定した場合に１つまたは複数のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンドによって媒介されるシグナル伝達を阻害する。本明細書において記載されるように、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストは単独で、あるいは１つまたは複数の支持療法または活性剤と組み合わせて使用してそれを必要とする患者（例えば、骨関連疾患または障害、筋肉関連疾患または障害、あるいは過剰もしくは望まない脂肪に関連した疾患または障害を有する対象）を処置することができる。
一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ８を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともアクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣおよび／またはアクチビンＢＥ）を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、およびアクチビンを阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ４を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ６を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ３を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるようなＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、ＢＭＰ９を阻害しないか、または実質的に阻害しない。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子［例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）］、アプタマーおよび／またはリボザイムであり得る。当該分野では、ヒトＧＤＦ１１、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＢＭＰ１０の核酸配列およびアミノ酸配列が公知である。加えて、ポリヌクレオチドアンタゴニストを作製する多くの異なる方法は、当技術分野で周知である。したがって、当業者は、当該分野における知識および本明細書で提供される教示に基づき、本開示に従う使用のためのポリヌクレオチドアンタゴニストを、慣習的に作製することができる。
アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡ、または三重螺旋形成を介して、遺伝子発現を制御するのに使用することができる。アンチセンス法は、例えば、Ｏｋａｎｏ（１９９１年）、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６巻：５６０頁；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８８年）において論じられている。三重螺旋形成は、例えば、Ｃｏｏｎｅｙら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：４５６頁；およびＤｅｒｖａｎら、（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻：１３００頁において論じられている。方法は、ポリヌクレオチドの、相補性ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。一部の実施形態では、アンチセンス核酸は、本明細書で開示される遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な一本鎖ＲＮＡ配列または一本鎖ＤＮＡ配列を含む。しかし、絶対的な相補性は、好ましいが、必要ではない。
本明細書で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズし、安定的な二重鎖を形成することが可能であるのに十分な相補性を有する配列を意味し、したがって、本明細書で開示される遺伝子の二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験してもよく、三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズさせる核酸が大型であるほど、それが含有し得るＲＮＡとの塩基のミスマッチも多くなるが、なおも安定的な二重鎖（または、場合に応じて、三重鎖）を形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な手順の使用により、ミスマッチの許容可能な程度を確認することができる。
メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの５’側非翻訳配列であって、ＡＵＧ開始コドンを含む５’側非翻訳配列に相補的なポリヌクレオチドは、翻訳を阻害するのに最も効率的に働くはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’側非翻訳配列に対する配列相補性もまた、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに効果的であることが示されている［例えば、Ｗａｇｎｅｒ， Ｒ．、（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３７２巻：３３３～３３５頁を参照されたい］。したがって、本開示の遺伝子の非コード領域である、５’側または３’側の非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチにおいて使用し得る。ｍＲＮＡの５’側非翻訳領域に相補的なポリヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳のそれほど効率的な阻害剤ではないが、本開示の方法に従い使用し得る。本開示のｍＲＮＡの５’領域、３’領域、またはコード領域のいずれにハイブリダイズするようにデザインされている場合でも、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドの長さであるべきであり、好ましくは、６～約５０ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴヌクレオチドである。具体的な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
一実施形態では、本開示のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写により、細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部は、転写され、本開示の遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成する。このようなベクターは、所望のアンチセンス核酸をコードする配列を含有する。このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを生成するように転写され得る限りにおいて、エピソームにとどまってもよく、染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ法により構築することができる。ベクターは、プラスミドベクターでもよく、ウイルスベクターでもよく、または当該分野で公知の他のベクターであって、脊椎動物細胞内の複製および発現のために使用されるベクターでもよい。本開示の所望の遺伝子またはこれらのフラグメントをコードする配列の発現は、脊椎動物細胞内、好ましくは、ヒト細胞内で作用することが当該分野で公知の任意のプロモーターによるものであり得る。このようなプロモーターは、誘導性であっても、恒常的であってもよい。このようなプロモーターとして、ＳＶ４０初期プロモーター領域［例えば、ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ（１９８１年）、Ｎａｔｕｒｅ、２９０巻：３０４～３１０頁を参照されたい］、ラウス肉腫ウイルスの３’側長末端リピート内に含有されるプロモーター［例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８０年）、Ｃｅｌｌ、２２巻：７８７～７９７頁を参照されたい］、ヘルペスチミジンプロモーター［例えば、Ｗａｇｎｅｒら（１９８１年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８巻：１４４１～１４４５頁を参照されたい］、およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列［例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２年）、Ｎａｔｕｒｅ、２９６巻：３９～４２頁を参照されたい］が挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアンタゴニストは、ＧＤＦ１１， アクチビン Ｂ， ＧＤＦ８， アクチビン Ａ， ＢＭＰ６， ＧＤＦ３， ＢＭＰ１０， ＡＬＫ４， および ＡｃｔＲＩＩＢのうちの１つまたは複数の発現を標的化する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。ＲＮＡｉとは、標的化されるｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現を指す。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）を介する特異的ｍＲＮＡとの相互作用により、標的化される遺伝子をサイレンシングする。次いで、ｄｓＲＮＡ複合体が、細胞による分解の標的化される。ｓｉＲＮＡ分子は、１０～５０ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ二重鎖であり、十分に相補的な標的遺伝子（例えば、遺伝子に少なくとも８０％の同一性）の発現に干渉する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
追加のＲＮＡｉ分子として、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられ、また、短鎖干渉ヘアピンおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループにより接続された、標的遺伝子に由来するセンス配列とアンチセンス配列とを含有する。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、ｍＲＮＡと共に分解される。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはＵ６プロモーターを使用して、ＲＮＡｉのためのＲＮＡを発現させることができる。Ｐａｄｄｉｓｏｎら［Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．（２００２年）、１６巻：９４８～９５８頁、２００２年］は、ＲＮＡｉを実行する手段としてヘアピンに折り畳まれた低分子ＲＮＡ分子を使用している。したがって、このような短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子はまた、本明細書で記載される方法においても有利に使用される。機能的なｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは、サイレンシング活性に影響を及ぼさずに変化し、ステム長は、約２５～約３０ｎｔのいずれかの範囲であることが可能であり、ループサイズは、４～約２５ｎｔの間の範囲であり得る。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、これらのｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ ＲＮａｓｅの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物に相似し、いずれにせよ、特異的遺伝子の発現を阻害するための同じ能力を有すると考えられる。ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクターから発現させることができる。ｍｉＲＮＡは、約１０～７０ヌクレオチドの長さの一本鎖ＲＮＡであり、「ステムループ」構造を特徴とするｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとして最初に転写され、その後、ＲＩＳＣを介するさらなるプロセシングの後で、成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。
ｓｉＲＮＡを含むがこれに限定せず、ＲＮＡｉを媒介する分子は、インビトロで、化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５２１巻：１９５～１９９頁、２００２年）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９巻：９９４２～９９４７頁、２００２年）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３０巻：ｅ４６頁、２００２年；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９巻：６０４７～６０５２頁、２００２年）、およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＩＩＩなどのヌクレアーゼを使用する二本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９巻：９９４２～９９４７頁、２００２年）によって生成することができる。
別の態様に従うと、本開示は、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、封入型ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、封入型ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉をもたらすことが可能な分子、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドアンタゴニストを提供する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、二本鎖ＤＮＡ分子および一本鎖ＲＮＡ分子を含む核酸分子であって、標的分子に特異的に結合する三次構造に結合し、これを形成する核酸分子である。当該分野では、アプタマーの生成および治療的使用が、十分に確立されている（例えば、米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい）。アプタマーについての追加の情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号において見出すことができる。核酸アプタマーは、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）プロセスを介して選択される。ＳＥＬＥＸは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，５８０，７３７号、同第５，５６７，５８８号、同第５，７０７，７９６号、同第５，７６３，１７７号、同第６，０１１，５７７号、および同第６，６９９，８４３号において記載されているように、標的分子に高度に特異的に結合する核酸分子のインビトロ進化法である。アプタマーを同定する別のスクリーニング法は、米国特許第５，２７０，１６３号において記載されている。ＳＥＬＥＸプロセスは、単量体であれ、多量体であれ、他の核酸分子およびポリペプチドを含め、事実上任意の化合物に対してリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）ヌクレオチド単量体内で利用可能な二次元構造および三次元構造ならびに化学的多様性を形成する核酸の能力に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が、標的として機能し得る。ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに結合、区分、および増幅の段階的反復を伴い、同じ一般的な選択スキームを使用して、所望の結合アフィニティおよび選択性を達成する。ランダム化された配列のセグメントを含み得る核酸の混合物から始めて、ＳＥＬＥＸ法は、混合物を結合に好適な条件下で標的と接触させる工程と；非結合核酸を標的分子に特異的に結合した核酸から区分する工程と；核酸－標的複合体を解離させる工程と；核酸－標的複合体から解離させた核酸を増幅して、リガンド濃縮された核酸混合物をもたらす工程とを含む。結合させる工程と、区分する工程と、解離させる工程と、増幅する工程を、所望の回数のサイクルにわたり繰り返して、標的分子に対して高アフィニティかつ高特異性で結合する核酸リガンドをもたらす。
典型的に、このような結合分子は、動物に別個に投与される［例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ（１９９１年）、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６巻：５６０頁を参照されたい］が、このような結合分子はまた、宿主細胞により取り込まれたポリヌクレオチドからインビボで発現させることもでき、インビボで発現させることができる［例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８８年）を参照されたい］。
Ｆ．フォリスタチンおよびＦＬＲＧアンタゴニスト
タンパク質のフォリスタチンおよびＦＬＲＧ群のメンバーは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ経路を介してシグナル伝達するリガンドをアンタゴナイズすることが公知である。したがって、他の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストはフォリスタチンまたはＦＬＲＧポリペプチドであり、これは、所望の効果を達成する（例えば、腎疾患および／または代謝性障害を有する患者を処置する）ために、単独で使用することもでき、本明細書で開示されるような１つまたは複数の追加の支持療法および／または活性作用因子と組み合わせて使用することもできる。
用語「フォリスタチンポリペプチド」は、フォリスタチンの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合体、およびペプチド模倣物形態を含む）も含むポリペプチドを含み、フォリスタチンの任意の機能的な単量体または多量体もさらに含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のフォリスタチンポリペプチドは、アクチビンおよび／またはＧＤＦ８に結合し、かつ／またはこれらの活性を阻害する。アクチビンへの結合特性を保持する、フォリスタチンポリペプチドの改変体は、フォリスタチンとアクチビンとの相互作用に関するかつての研究に基づき同定することができる。例えば、ＷＯ２００８／０３０３６７は、アクチビンへの結合に重要であることが示されている、特異的なフォリスタチンドメイン（「ＦＳＤ」）について開示している。下記の配列番号９０～９４に示される通り、フォリスタチンのＮ末端ドメイン（「ＦＳＮＤ」；配列番号９２）、ＦＳＤ２（配列番号９４）は、フォリスタチン内の例示的なドメインであって、アクチビンへの結合に重要なドメインを表し、程度は劣るが、ＦＳＤ１（配列番号９３）も、フォリスタチン内の例示的なドメインであって、アクチビンへの結合に重要なドメインを表す。加えて、上記では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの文脈において、ポリペプチドのライブラリーを作製し、これについて調べるための方法についても記載したが、このような方法はまた、フォリスタチンの改変体を作製し、これらについて調べることにも関する。フォリスタチンポリペプチドは、任意の公知のフォリスタチン配列に由来するポリペプチドであって、フォリスタチンポリペプチドの配列に少なくとも約８０％同一である配列を有し、任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれを超える同一性を有するポリペプチドを含む。フォリスタチンポリペプチドの例は、成熟フォリスタチンポリペプチド、または、例えば、ＷＯ２００５／０２５６０１において記載されている、ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチド（配列番号９０）の短いアイソフォームもしくは他の改変体を含む。
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのアイソフォームであるＦＳＴ３４４は、以下の通りである。
Figure 0007055637000029
シグナルペプチドに下線を付す；上記ではまた、このフォリスタチンアイソフォームを、下記に示される短いフォリスタチンアイソフォームであるＦＳＴ３１７から弁別する、Ｃ末端伸長部分を表す最後の２７残基にも下線を付している。
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのアイソフォームであるＦＳＴ３１７は、以下の通りである。
Figure 0007055637000030
シグナルペプチドに下線を付す。
フォリスタチンのＮ末端ドメイン（ＦＳＮＤ）配列は、以下の通りである。
Figure 0007055637000031
他の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、フォリスタチン関連タンパク質３（ＦＳＴＬ３）としてもまた公知の、フォリスタチン様関連遺伝子（ＦＬＲＧ）である。用語「ＦＬＲＧポリペプチド」は、ＦＬＲＧの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合体、およびペプチド模倣物形態を含む）も含むポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示のＦＬＲＧポリペプチドは、アクチビン、特に、アクチビンＡに結合し、かつ／またはこれらの活性を阻害する。アクチビンへの結合特性を保持するＦＬＲＧポリペプチドの改変体は、ＦＬＲＧとアクチビンとの相互作用についてアッセイする日常的方法を使用して同定することができる（例えば、ＵＳ６，５３７，９６６を参照されたい）。加えて、上記では、ＡｃｔＲＩＩおよびＡＬＫ４ポリペプチドの文脈において、ポリペプチドのライブラリーを作製し、これについて調べるための方法についても記載したが、このような方法はまた、ＦＬＲＧの改変体を作製し、これらについて調べることにも関する。ＦＬＲＧポリペプチドは、任意の公知のＦＬＲＧ配列に由来するポリペプチドであって、ＦＬＲＧポリペプチドの配列に少なくとも約８０％同一である配列を有し、任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはこれを超える同一性を有するポリペプチドを含む。
ヒトＦＬＲＧ前駆体（フォリスタチン関連タンパク質３前駆体）ポリペプチドは、以下の通りである。
Figure 0007055637000032
シグナルペプチドに下線を付す。
ある特定の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドおよびＦＬＲＧポリペプチドの機能的な改変体または改変形態は、フォリスタチンポリペプチドまたはＦＬＲＧポリペプチドの少なくとも一部を有する融合タンパク質と、例えば、ポリペプチドの単離、検出、安定化、または多量体化を容易とするドメインなど、１つまたは複数の融合ドメインとを含む。適切な融合ドメインについては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに関して、上記で詳細に論じられている。一部の実施形態では、本開示のアンタゴニスト作用因子は、Ｆｃドメインに融合させたフォリスタチンポリペプチドのアクチビン結合性部分を含む融合タンパク質である。別の実施形態では、本開示のアンタゴニスト作用因子は、Ｆｃドメインに融合させたＦＬＲＧポリペプチドのアクチビン結合性部分を含む融合タンパク質である。
（５．スクリーニングアッセイ）
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の使用であって、ＴＧＦ－βスーパーファミリー受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（作用因子）を同定するための使用に関する。このスクリーニングを介して同定される化合物を、インビボまたはインビトロにおける組織成長を調節する能力を評価するために、試験して、骨、軟骨、筋肉、脂肪および／またはニューロンなどの組織を調節するそれらの能力を評価することができる。これらの化合物は、例えば、動物モデルにおいて試験することができる。
ＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達）を標的化することによって組織成長を調節するための治療剤についてスクリーニングするための多数のアプローチが存在する。特定の実施形態では、選択された細胞株においてＴＧＦ－βスーパーファミリー受容体媒介性の作用を混乱させる作用因子を同定するために、化合物のハイスループットスクリーニングが行われ得る。特定の実施形態では、アッセイは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の、その結合パートナー、例えばＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドなど（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）への結合を特異的に阻害または減少させる化合物をスクリーニングおよび同定するために行われ得る。あるいは、アッセイは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の、その結合パートナー、例えばＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドなどへの結合を増強しない化合物を同定するために使用され得る。さらなる実施形態では、化合物は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と相互作用するその能力によって同定され得る。
種々のアッセイ形式が十分であり、そして、本開示を考慮すれば、本明細書中に明示的に記載されない形式は、本明細書中に記載されていないにもかかわらず、当業者によって理解される。本明細書中に記載されるように、本発明の試験化合物（作用因子）は、任意の組み合わせ化学の方法によって作製され得る。あるいは、本主題の化合物は、インビボまたはインビトロで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織増殖の調節因子として作用するその能力について試験される化合物（作用因子）は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物によって生成されても（例えば、天然の生成物）、化学的に生成されても（例えば、ペプチド模倣物を含む低分子）、組換えにより生成されてもよい。本発明によって企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子が挙げられる。ある特定の実施形態では、試験作用因子は、約２０００ダルトン未満の分子量を持つ小さな有機分子である。
本開示の試験化合物は、単一の別個の実体として提供され得るか、または、組み合わせ化学によって作製されたような、より複雑度の高いライブラリーにおいて提供され得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび有機化合物の他の分類を含み得る。試験システムに対する試験化合物の提示は、特に、最初のスクリーニング段階において、単離された形態または化合物の混合物としてのいずれかであり得る。任意選択で、化合物は、任意選択で他の化合物で誘導体化され得、そして、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有し得る。誘導体化基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化クロスリンカー、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所与の期間に調査される化合物の数を最大にするためには、ハイスループットアッセイが望ましい。精製もしくは半精製（ｓｅｍｉ－ｐｕｒｉｆｉｅｄ）されたタンパク質で誘導され得るような、無細胞のシステムにおいて行われるアッセイは、試験化合物によって媒介される分子標的における変更の迅速な発生と比較的容易な検出とを可能にするように作られ得るという点で、しばしば、「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティの作用は、一般に、インビトロのシステムでは無視され得るが、その代わりに、このアッセイは主として、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体とその結合パートナー（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）との間の結合親和性の変更において明らかになり得るような、分子標的に対する薬物の作用に焦点を当てている。
単なる例示として、本開示の例示的なスクリーニングアッセイでは、関心のある化合物は、アッセイの意図に応じて適宜、通常ＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドに結合し得る単離および精製されたＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と接触させられる。その後、化合物とＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体との混合物は、適当なＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）を含む組成物に加えられる。ヘテロ多量体－スーパーファミリーリガンド複合体の検出および定量は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体とその結合タンパク質との間の複合体の形成の阻害（または助長）における化合物の効力を決定するための手段を提供する。化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量応答曲線を生成することによって評価され得る。さらに、比較のためのベースラインを提供するためのコントロールアッセイもまた行われ得る。例えば、コントロールアッセイでは、単離および精製されたＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を含む組成物に加えられ、そして、ヘテロ多量体リガンド複合体の形成は、試験化合物の非存在下で定量される。一般に、反応物が混合され得る順序は変化し得、そして、同時に混合され得ることが理解される。さらに、適切な無細胞アッセイ系を与えるように、精製したタンパク質の代わりに、細胞の抽出物および溶解物が使用され得る。
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の他のタンパク質への結合は、種々の技術によって検出され得る。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、検出可能に標識されたタンパク質、例えば、放射標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ）、または、酵素標識されたＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロマーおよび／またはその結合タンパク質を用いて、イムノアッセイによって、あるいは、クロマトグラフィーによる検出によって定量され得る。
特定の実施形態では、本開示は、直接的または間接的のいずれかで、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体とその結合タンパク質との間の相互作用の程度を測定する、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー遷移（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、光導波管（ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサ、および表面力センサに基づくもののような、他の検出様式が、本開示の多くの実施形態と適合性がある。
さらに、本開示は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体とその結合パートナーとの間の相互作用を妨害または助長する作用因子を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知である相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７２巻：２２３～２３２頁；Ｍａｄｕｒａら（１９９３年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８巻：１２０４６～１２０５４頁；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４巻：９２０～９２４頁；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８巻：１６９３～１６９６頁を参照のこと。特定の実施形態では、本開示は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体とその結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物（例えば、低分子またはペプチド）を同定するための、逆ツーハイブリッドシステムの使用を企図する［ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７巻：９１９～２９頁；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７巻：３７４～８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号］。
特定の実施形態では、本主題の化合物は、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と相互作用するその能力によって同定される。化合物と、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体との間の相互作用は、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。例えば、このような相互作用は、光架橋、放射性標識リガンド結合、およびアフィニティクロマトグラフィーを含むインビトロの生化学的な方法を用いて、タンパク質レベルで同定され得る［Ｊａｋｏｂｙ ＷＢら（１９７４年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４６巻：１頁］。特定の場合には、化合物は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する化合物を検出するためのアッセイのような、機構ベースのアッセイにおいてスクリーニングされ得る。これは、固相もしくは流体相の結合事象を含み得る。あるいは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体をコードする遺伝子は、レポーターシステム（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）と共に細胞中にトランスフェクトされ、そして、好ましくは、ハイスループットスクリーニングによって、ライブラリーに対して、または、ライブラリーの個々のメンバーを用いてスクリーニングされ得る。他の機構ベースの結合アッセイ（例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイ）が使用され得る。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定されているか、または、固定された抗体によって捕捉されている標的を用いて行われ得るか、あるいは、キャピラリー電気泳動によって分離され得る。結合した化合物は通常、比色エンドポイントあるいは蛍光または表面プラズモン共鳴を用いて検出され得る。
６．例示的な治療的使用
ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの組合せを使用して、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンドの異常活性と関連する疾患または状態を処置または予防することができる。本明細書では一般に、これらの疾患、障害、または状態を、「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態」または「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連障害」と称する。ある特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする個体に、本明細書で記載されるようなＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体などのＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せの治療有効量を投与することにより、個体におけるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態を処置または予防する方法を提供する。「対象」、「個体」、または「患者」という用語は、本明細書を通して互換的である。本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストのいずれも潜在的に、本明細書で開示される治療的使用のために、個別にまたは組合せで利用することができる。これらの方法は特に、例えば、齧歯動物、霊長動物、およびヒトを含む哺乳動物の治療的処置および予防的処置を目的とする。
本明細書中で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計的試料において、無処置の対照試料に対して、処置試料における障害もしくは状態の出現を低下させるか、あるいは、無処置の対照試料に対して、障害もしくは状態の１または複数の症状の発症を遅延させるか、または、重篤度を低下させるような化合物を指す。用語「処置する」は、本明細書中で使用される場合、一度確立された状態の改善もしくは除去を含む。いずれの場合にも、予防または処置は、医師または他の医療提供者によって提供される診断、および、治療剤の投与の意図される結果において認識され得る。
一般に、本開示で記載されている疾患または状態の処置または予防は、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはそのようなアンタゴニストの組み合わせを、「有効量」で投与することにより達成する。作用因子の有効量とは、必要な投与量で、かつ、必要な期間にわたり、所望の治療結果または予防結果を達成するのに効果的な量を指す。本開示の作用因子の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する作用因子の能力などの要因に従い変化し得る。「予防有効量」とは、必要な投与量で、かつ、必要な期間にわたり、所望の予防結果を達成するのに効果的な量を指す。
天然に存在するＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢ受容体－リガンド複合体は、組織成長のほか、種々の構造の適正な形成などの早期発生プロセスにおいて、または、性的発育、下垂体ホルモンの生成、ならびに骨および軟骨の創出を含む、１つもしくは複数の発生後能において不可欠の役割を果たす。したがって、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態は、組織成長の異常および発生の欠損を含むが、これらに限定されない。加えて、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態は、炎症、アレルギー、自己免疫疾患、および腫瘍など、細胞の増殖および分化の障害を含むがこれらに限定されない。
例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態は、神経筋障害（例えば、筋ジストロフィーおよび筋萎縮）、うっ血性閉塞性肺疾患（およびＣＯＰＤに関連する筋消耗）、筋消耗症候群、サルコペニアおよび悪液質、脂肪組織障害（例えば、肥満）、２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ、成人発症型糖尿病）ならびに骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）を含む。他の例示的なＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態は、筋肉変性障害（ｍｕｓｃｕｌｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）および神経筋障害、組織修復（例えば、創傷治癒）、神経変性疾患（例えば、筋委縮性側索硬化症）ならびに免疫学的障害（例えば、リンパ球の異常な増殖または機能に関連する障害）を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを、筋ジストロフィーのための処置の一部として使用され得る。用語「筋ジストロフィー」とは、骨格筋、ならびに、ある場合には、心臓および呼吸筋の段階的な筋力低下および劣化を特徴とする、変性性筋疾患の群を指す。筋ジストロフィーは、筋肉の微視的変化と共に始まる、進行性の筋消耗および筋力低下を特徴とする遺伝性障害である。筋肉が経時的に変性するにつれて、個人の筋強度は減衰する。本主題のＴＧＦ－βスーパーファミリーヘテロ多量体複合体を含むレジメンで処置され得る、例示的な筋ジストロフィーとして、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー－ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（ランドゥジー－デジェリン型としてもまた公知である）、筋強直性ジストロフィー（ＭＭＤ；スタイナート病としてもまた公知である）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）が挙げられる。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、フランスの神経学者である、Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ａｍａｎｄ Ｄｕｃｈｅｎｎｅにより、１８６０年代において、最初に記載された。ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、ＤＭＤのこの変化形について１９５０年代に最初に記載したドイツの医師であるＰｅｔｅｒ Ｅｍｉｌ Ｂｅｃｋｅｒに因んで名付けられた。ＤＭＤは、男性において最も高頻度の遺伝性疾患の１つであり、３，５００人中１人の少年に影響を及ぼす。ＤＭＤは、Ｘ染色体の短腕部に位置するジストロフィン遺伝子が欠失すると生じる。男性が保有するＸ染色体のコピーは、１つだけであるので、男性が有するジストロフィン遺伝子のコピーも１つだけである。ジストロフィンタンパク質を伴わないと、筋肉は、収縮および弛緩の周期において容易に損傷する。疾患の早期では、筋肉は、再生により代償されるが、後に、筋前駆細胞は、進行する損傷に追いつけなくなり、健常筋肉は、非機能的な線維脂肪性組織で置きかえられる。
ＢＭＤは、ジストロフィン遺伝子における異なる変異から生じる。ＢＭＤ患者は、いくらかのジストロフィンを有するが、量が不十分であるか、または質が不良である。いくらかのジストロフィンの存在で、ＢＭＤを有する患者の筋肉は、ＤＭＤを有する患者の筋肉と同等の重篤または迅速な変性からは保護される。
動物における研究は、ＧＤＦ８シグナル伝達経路の阻害が、ＤＭＤおよびＢＭＤ患者において疾患の種々の側面を有効に処置することができることを指し示す（Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈら、２００２， Ｎａｔｕｒｅ ４２０：４１８－４２１； Ｐｉｓｔｉｌｌｉら、２０１１， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７８：１２８７－１２９７）。したがって、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストはＧＤＦ８阻害剤（アンタゴニスト）として作用することができ、ＤＭＤおよびＢＭＤ患者において、インビボで、ＧＤＦ８および／または関連するＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによるシグナル伝達を遮断する代替的な手段を構成する。
同様に、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、筋成長を必要とする他の疾患状態において、筋量を増大させる有効な手段をもたらし得る。例えば、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（ルーゲーリック病または運動ニューロン疾患ともまた呼ばれる）は、慢性で、進行性で、治癒不能なＣＮＳ障害であって、骨格筋収縮の開始に要求される中枢神経性の構成要素である運動ニューロンを攻撃するＣＮＳ障害である。ＡＬＳでは、運動ニューロンは、劣化し、最終的に死滅し、個人の脳は、完全な機能および呼びかけ（ａｌｅｒｔ）を正常に保つが、筋肉収縮の開始は脊髄レベルで遮断される。ＡＬＳを発症した個体は、典型的には、４０～７０歳の間であり、変性する最初の運動ニューロンは、腕部または脚部を支配する運動ニューロンである。ＡＬＳを有する患者は、歩行が困難な場合があり、物を落とし、倒れ、呂律が回らなくなり、制御不能に笑ったり泣いたりする場合がある。疾患が進行すると、四肢における筋肉は、不使用のために萎縮し始める。筋力低下は、消耗性となり、患者は最終的に車椅子を必要とするか、またはベットに伏したままになる。大半のＡＬＳ患者は、疾患発病から３～５年で、呼吸不全、または肺炎のような換気装置支援による合併症で死ぬ。
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる筋量増加の促進は、筋消耗疾患を患う患者の利益になることもできる。Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃａｄａｖｉｄら（上記）は、ＧＤＦ８発現は、ヒトにおける除脂肪体重と逆相関し、このようなＧＤＦ８遺伝子の発現増加は、ＡＩＤＳ消耗性症候群の男性における体重減少と関連すると報告する。ＡＩＤＳ患者におけるＧＤＦ８の機能を阻害することにより、ＡＩＤＳの少なくともある特定の症状を、完全に消失させないにせよ、緩和することができ、こうして、ＡＩＤＳ患者における生活の質を著明に改善することができる。
ＧＤＦ８機能の喪失はまた、栄養摂取の減退を伴わない脂肪の減少とも関連する（Ｚｉｍｍｅｒｓら、前出；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、前出）ので、対象のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストはさらに、肥満症および２型糖尿病の発症を緩徐化または予防するための治療剤としても使用することができる。
がん食欲不振－悪液質症候群は、がんの最も衰弱性かつ生命にかかわる側面にある。この症候群は、死亡時にがん患者のおよそ８０％に存在する、多くの種類のがんに共通の特色であり、不十分な生活の質および化学療法に対する不十分な応答のみならず、匹敵する腫瘍を有するが体重減少していない患者よりも短い生存時間の原因にもなる。発病前体重の５パーセントを超える不随意性の体重減少が、６ヶ月間の期間内に起こる場合、悪液質が典型的にがん患者において疑われる。食欲不振、脂肪および筋肉組織の消耗ならびに心理的窮迫に伴い、悪液質が、がんおよび宿主の間の複雑な相互作用から生じる。がん悪液質は、サイトカイン産生、脂質動員およびタンパク質分解誘導因子の放出、ならびに中間代謝の変更に影響を与える。食欲不振が一般的であるが、食物摂取減少単独では、がん患者に観察される体組成の変化を説明することができず、栄養摂取の増加は、消耗性症候群を反転することができない。現在、悪液質過程（ｃａｃｈｅｘｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ）を制御または反転するための処置は存在しない。成体マウスにおけるＧＤＦ８の全身性過剰発現は、ヒト悪液質症候群に観察されるものと類似の著明な筋肉および脂肪損失を誘導することが判明したため（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上記参照）、対象のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、筋肉成長が望まれる悪液質症候群の症状の予防、処置または軽減に有益に使用することができる。上記で記載したような筋力低下を予防、処置、または軽減するのに有用なへテロマー複合体の例は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である。
ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔｒＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せを、骨形成および／もしくは軟骨形成を誘導する、骨量の減少を予防する、骨の石灰化を増大させる、骨の脱灰を予防する、ならびに／または骨密度を増大させる方法において使用することができる。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、無症状性の低骨密度を有すると診断された患者において、骨粗鬆症の発症に対する保護的措置として有用であり得る。
一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せは、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨欠損の治癒において医療的に有用であり得る。対象の方法および組成物はまた、閉鎖骨折ならびに開放骨折の低減において予防的に使用することができ、また、人工関節の固定を改善するのにも使用することができる。骨形成作用因子により誘導されるデノボの骨形成は、先天性であるか、外傷誘導性であるか、またはがん治療における切除により引き起こされる頭蓋顔面欠損の修復に有用であり、また、美容整形手術においても有用である。さらに、本発明の方法および組成物は、歯周病の処置、および他の歯牙修復プロセスにおいても使用することができる。ある特定の場合には、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔｒＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せは、骨形成細胞を誘引する環境をもたらす、骨形成細胞の増殖を刺激する、または骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導することが可能である。本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せはまた、骨粗鬆症の処置においても有用であり得る。さらに、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、軟骨欠損の修復および骨関節炎の予防／転導においても使用することができる。本明細書で記載されるような骨形成を誘導し、骨量の減少を予防し、骨の石灰化を増大させ、骨の脱灰を予防し、かつ／または骨密度を増大させるために有用なへテロマー複合体の例は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である。
Ｒｏｓｅｎら（編）、Ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂｏｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、７版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．（参照により本明細書に援用される）は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト、またはこのようなアンタゴニストの組合せによる処置に供され得る骨障害についての広範な考察を提供する。本明細書では、部分的な列挙を提供する。本発明の方法および組成物は、骨粗鬆症（続発性骨粗鬆症を含む）、副甲状腺機能亢進症、慢性腎疾患／骨ミネラル障害、性ホルモン（例えば、アンドロゲンおよび／またはエストロゲン）の枯渇もしくは除去、グルココルチコイド処置、関節リウマチ、重度の火傷、副甲状腺機能亢進症、高カルシウム血症、低カルシウム血症、低リン血症、骨軟化症（腫瘍誘導性骨軟化症を含む）、高リン血症、ビタミンＤ欠損症、副甲状腺機能亢進症（家族性副甲状腺機能亢進症を含む）および偽性副甲状腺機能低下症、腫瘍の骨転移、腫瘍もしくは化学療法の帰結としての骨量の減少、骨および骨髄の腫瘍（例えば、多発性骨髄腫）、虚血性骨障害、歯周病および口腔内骨量の減少、クッシング病、ページェット病、甲状腺中毒症、慢性下痢状態もしくは吸収不良、腎臓尿細管アシドーシス、または神経性無食欲症などの、骨量の減少を特徴とするか、またはこれを引き起こす状態に適用することができる。本発明の方法および組成物はまた、骨形成または骨治癒の不全を特徴とする状態であって、非癒合骨折、そうでなければ治癒が遅い骨折、胎児および新生児の骨異形成（例えば、低カルシウム血症、高カルシウム血症、カルシウム受容体欠損、およびビタミンＤ欠損症）、骨壊死（顎部の骨壊死を含む）、ならびに骨形成不全症を含む状態にも適用することができる。加えて、同化効果によって、このようなアンタゴニストは、骨損傷または骨糜爛と関連する骨疼痛を減殺させる。抗骨吸収効果の帰結として、このようなアンタゴニストは、造骨性腫瘍転移（例えば、原発性前立腺がんまたは乳がんと関連する）、造骨性骨肉腫、大理石骨病、進行性骨幹異形成、骨内膜性骨化過剰症、骨斑紋症、および流蝋骨症などの、骨形成異常障害を処置するのに有用であり得る。処置され得る他の障害として、線維性異形成および軟骨異形成が挙げられる。
別の具体的実施形態では、本開示は、軟骨および／もしくは骨の欠損または歯周病と関連する、骨折および他の状態を修復するための治療方法および組成物を提供する。本発明はさらに、創傷治癒および組織修復のための治療方法および組成物も提供する。創傷の種類として、火傷、切創、および潰瘍が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０１１０６号を参照されたい。このような組成物は、薬学的に許容されるビヒクル、担体、またはマトリックスと混合した、本開示の少なくとも１つのＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの治療有効量を含む。
一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せは、骨粗鬆症、副甲状腺機能亢進症、クッシング病、甲状腺中毒症、慢性下痢状態もしくは吸収不良、腎臓尿細管アシドーシス、または神経性無食欲症などの、骨量の減少を引き起こす状態に適用することができる。女性であること、体重が小さいこと、および座りがちな生活様式をとることは、骨粗鬆症（骨折リスクをもたらす、骨ミネラル密度の喪失）のリスク要因であることが一般に理解されている。しかし、骨粗鬆症はまた、ある特定の医薬の長期にわたる使用からも生じ得る。薬物または別の医学的状態から生じる骨粗鬆症は、続発性骨粗鬆症として公知である。クッシング病では、体内で産生されたコルチゾールの過剰量が、骨粗鬆症および骨折を結果としてもたらす。続発性骨粗鬆症と関連する最も一般的な医薬は、天然で副腎により産生されるホルモンであるコルチゾール様に作用する薬物のクラスであるコルチコステロイドである。骨格の発達には、甲状腺ホルモンの適切なレベルが必要とされるが、過剰な甲状腺ホルモンは、時間経過と共に骨量を減少させ得る。アルミニウムを含有する制酸剤は、腎の問題を有する人、特に、透析を受けている人が高用量を服用する場合、骨量の減少をもたらし得る。続発性骨粗鬆症を引き起こし得る他の医薬として、発作を予防するのに使用されるフェニトイン（Ｄｉｌａｎｔｉｎ）およびバルビツール酸；関節炎、がん、および免疫障害の一部の形態のための薬物であるメトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｆｏｌｅｘ ＰＦＳ）；一部の自己免疫疾患を処置し、臓器移植患者における免疫系を抑制するのに使用される薬物であるシクロスポリン（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ、Ｎｅｏｒａｌ）；前立腺がんおよび子宮内膜症を処置するのに使用される黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト（Ｌｕｐｒｏｎ、Ｚｏｌａｄｅｘ）；抗凝固薬であるヘパリン（Ｃａｌｃｉｐａｒｉｎｅ、Ｌｉｑｕａｅｍｉｎ）；ならびに高コレステロールを処置するのに使用されるコレスチラミン（Ｑｕｅｓｔｒａｎ）およびコレスチポール（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ）が挙げられる。がん治療から生じる骨量の減少は、広く認識されており、がん治療誘導性骨量減少（ＣＴＩＢＬ）と称されている。骨転移は、骨中の空隙を創出し得るが、これは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）で処置することにより是正することができる。骨量の減少はまた、歯肉の陥凹部に棲息する細菌が毒素および有害な酵素を産生する慢性感染症である歯肉疾患によっても引き起こされ得る。
さらなる実施形態では、本開示は、異常なまたは望ましくない骨成長と関連する疾患または障害を処置するための方法および治療剤を提供する。例えば、先天性障害である進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を有する患者は、自発的なまたは組織外傷に応答した軟組織内の進行性異所性骨成長に苦しみ、生活の質に多大な影響が及ぶ。加えて、異常な骨成長が、股関節置換術の後で生じる場合もあり、そのため、手術転帰が損なわれ得る。これは、対象の方法および組成物が治療的に有用であり得る病理学的な骨成長および状況のより一般的な例である。この方法および組成物はまた、異常な骨成長の他の形態（例えば、外傷、火傷、または脊髄傷害後の骨の病理学的成長）を処置し、転移性前立腺がんまたは骨肉腫と関連して見られる異常な骨成長と関連する所望されない状態を処置または予防するためにも有用であり得る。
ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せを使用して、がんを有する患者における骨形成を促進することができる。ある特定の腫瘍（例えば、前立腺がん、乳がん、多発性骨髄腫、または副甲状腺機能亢進症を引き起こす任意の腫瘍）を有する患者は、腫瘍誘導性の骨量の減少、骨転移、および治療剤に起因して骨量の減少のリスクが高い。このような患者は、骨量の減少または骨転移の証拠の非存在下であっても、ＴＧＦ－βスーパーファミリーのヘテロ多量体複合体、または複合体の組合せで処置することができる。患者はまた、骨量の減少または骨転移の証拠についてモニタリングされてもよく、指標がリスクの増大を示す場合は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストで処置することができる。一般に、ＤＥＸＡスキャンを利用して骨密度の変化を評価する一方で、骨リモデリングの指標を使用して骨転移の可能性を評価することができる。血清マーカーをモニタリングすることができる。骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＳＡＰ）は、骨芽細胞内に存在する酵素である。ＢＳＡＰの血中レベルは、骨リモデリングの増大を結果としてもたらす骨転移および他の状態を有する患者において上昇する。オステオカルシンおよびプロコラーゲンペプチドもまた、骨形成および骨転移と関連する。ＢＳＡＰの増大は、前立腺がんにより引き起こされた骨転移を有する患者において検出されており、より低度で、乳がんに由来する骨転移においても検出されている。ＢＭＰ７レベルは、骨へと転移した前立腺がんでは高度であるが、膀胱がん、皮膚がん、肝臓がん、または肺がんに起因する骨転移では高度でない。Ｉ型カルボキシ末端テロペプチド（ＩＣＴＰ）とは、骨吸収時に形成されるコラーゲン内で見出される架橋である。骨は恒常的に分解および再形成されているので、ＩＣＴＰは全身で見出される。しかし、骨転移の部位では、このレベルは正常な骨の領域より著明に高くなる。ＩＣＴＰは、前立腺がん、肺がん、および乳がんに起因する骨転移において高レベルで見出されている。別のコラーゲン架橋である、Ｉ型Ｎ末端のテロペプチド（ＮＴｘ）は、骨代謝回転時にＩＣＴＰと共に産生される。ＮＴｘの量は、多くの異なる種類のがんであって、肺がん、前立腺がん、および乳がんを含むがんにより引き起こされる骨転移において増大する。ＮＴｘのレベルはまた、骨転移の進行に伴っても上昇する。したがって、このマーカーを使用して、転移を検出し、かつ、疾患の程度を測定することができる。吸収の他のマーカーは、ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンを含む。吸収マーカーまたは骨転移のマーカーの任意の増大は、患者におけるＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる治療の必要を指し示す。
別の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せは、腎疾患から発生する、相互に関連した骨格、心血管、およびミネラル代謝障害の広範にわたる症候群である、慢性腎疾患／骨ミネラル障害（ＣＫＤ－ＭＢＤ）を有する患者において使用することができる。ＣＫＤ－ＭＢＤは、腎性骨形成異常症（ＲＯＤ）としばしば称される多様な骨格病態を包摂し、これは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔｒＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せによる処置のための好ましい実施形態である。異なる病原性要因の相対的な寄与に応じて、ＲＯＤは、骨リモデリングの多様な病理学的パターンとして顕在化される（Ｈｒｕｓｋａら、２００８年、Ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｂｏｎｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ （ＣＫＤ－ＭＢＤ）、Ｒｏｓｅｎら（編）、Ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂｏｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、７版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、３４３～３４９頁）。スペクトルの一終端では、ＲＯＤは、尿毒症性骨ジストロフィーおよび低骨代謝回転を伴い、活性リモデリング部位の数の減少、骨形成の深刻な抑制、および低骨吸収を特徴とする。他の極では、ＲＯＤは、副甲状腺機能亢進症、高骨代謝回転、および線維性骨炎を伴う。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔｒＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せが、同化効果および抗骨吸収効果の両方を及ぼし得ることを踏まえると、これらの作用因子は、ＲＯＤの病態スペクトルにわたる患者において有用であり得る。
本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せは、他の骨活性医薬剤と共に併用投与することができる。併用投与は、単一の共製剤の投与により達することもでき、同時的な投与により達することもでき、別個の時点における投与により達することもできる。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、他の骨活性作用因子と共に投与する場合に、特に有利であり得る。患者は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト複合体を施されると共に、カルシウムサプリメント、ビタミンＤを服用し、適切な身体運動を行い、かつ／または、場合によって、他の医薬を服用することから利益を得ることができる。他の医薬の例は、ビスホスホネート（アレンドロネート、イバンドロネート、およびリセドロネート）、カルシトニン、エストロゲン、副甲状腺ホルモン、およびラロキシフェンを含む。ビスホスホネート（アレンドロネート、イバンドロネート、およびリセドロネート）、カルシトニン、エストロゲン、およびラロキシフェンは、骨リモデリングサイクルに影響を及ぼし、抗骨吸収医薬として分類される。骨リモデリングは、２つの異なる段階：骨吸収および骨形成からなる。抗骨吸収医薬は、骨リモデリングサイクルのうちの骨吸収部分は、緩徐化するか、または停止させるが、サイクルのうちの骨形成部分は、緩徐化しない。結果として、新たな形成は、骨吸収より大きな速度で持続し、骨密度は、時間経過と共に増大し得る。副甲状腺ホルモンの形態であるテリパラチドは、骨リモデリングサイクルにおける骨形成速度を増大させる。アレンドロネートは、閉経後骨粗鬆症の予防（毎日５ｍｇまたは毎週１回３５ｍｇ）および処置（毎日１０ｍｇまたは毎週１回７０ｍｇ）の両方について承認されている。アレンドロネートは、骨量の減少を軽減し、骨密度を増大させ、脊椎、手首、および股関節の骨折のリスクを低減する。アレンドロネートはまた、男性および女性におけるグルココルチコイド誘導性骨粗鬆症であって、これらの医薬（すなわち、プレドニゾンおよびコルチゾン）の長期にわたる使用の結果としての骨粗鬆症の処置と、男性における骨粗鬆症の処置とについて承認されている。ビタミンＤを加えたアレンドロネートは、閉経後女性における骨粗鬆症の処置（ビタミンＤを加えた、毎週１回７０ｍｇ）と、骨粗鬆症を有する男性における骨量を改善する処置とについて承認されている。イバンドロネートは、閉経後骨粗鬆症の予防および処置について承認されている。毎月１回の丸剤（１５０ｍｇ）として服用されるイバンドロネートは、各月同じ日に服用するべきである。イバンドロネートは、骨量の減少を軽減し、骨密度を増大させ、脊椎骨折のリスクを低減する。リセドロネートは、閉経後骨粗鬆症の予防および処置について承認されている。毎日（５ｍｇの用量）または毎週（３５ｍｇの用量、またはカルシウムを伴う３５ｍｇの用量）服用されるリセドロネートは、骨量の減少を緩徐化し、骨密度を増大させ、脊椎骨折および非脊椎骨折のリスクを低減する。リセドロネートはまた、男性および女性による使用であって、これらの医薬（すなわち、プレドニゾンおよびコルチゾン）の長期にわたる使用から生じるグルココルチコイド誘導性骨粗鬆症を予防および／または処置する使用が承認されている。カルシトニンとは、カルシウム調節および骨代謝に関与する天然に生じるホルモンである。閉経後５年を超える女性において、カルシトニンは、骨量の減少を緩徐化し、脊椎の骨密度を増大させ、骨折と関連する疼痛を緩和し得る。カルシトニンは、脊椎骨折のリスクを低減する。カルシトニンは、注射（毎日５０～１００ＩＵ）または経鼻スプレー（毎日２００ＩＵ）として利用可能である。
患者はまた、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト、またはこのようなアンタゴニストの組合せと、追加の骨活性医薬とを、共に施されることからも利益を得ることができる。エストロゲン療法（ＥＴ）／ホルモン療法（ＨＴ）は、骨粗鬆症の予防について承認されている。ＥＴは、閉経後女性において、骨量の減少を軽減し、脊椎および股関節のいずれでも骨密度を増大させ、股関節および脊椎の骨折のリスクを低減することが示されている。ＥＴは、最も一般には、毎日およそ０．３ｍｇの低用量または毎日およそ０．６２５ｍｇの標準用量を送達する丸剤または皮膚パッチの形態で投与され、７０歳を過ぎて開始しても有効である。単独で服用する場合、エストロゲンは、女性が子宮内膜のがん（子宮内膜がん）を発症するリスクを増大させ得る。このリスクを消失させるために、医療ケア提供者は、無傷の子宮を有する女性のために、ホルモンであるプロゲスチンをエストロゲンと組み合わせて（ホルモン補充療法またはＨＴ）処方する。ＥＴ／ＨＴは、閉経症状を緩和し、骨健康に対して有益な効果を及ぼすことが示されている。副作用として、膣出血、乳房圧痛、気分障害、および胆嚢疾患が挙げれる得る。毎日６０ｍｇのラロキシフェンは、閉経後骨粗鬆症の予防および処置について承認されている。ラロキシフェンは、選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）と呼ばれる薬物であって、エストロゲンの有益な効果を、それらの潜在的な欠点を伴わずにもたらすように開発された薬物のクラスに由来する。ラロキシフェンは、骨量を増大させ、脊椎骨折のリスクを低減する。ラロキシフェンが、股関節の骨折および他の非脊椎骨折のリスクを低減し得ることを実証するデータは、まだ利用可能ではない。副甲状腺ホルモンの形態であるテリパラチドは、閉経後女性および骨折のリスクが高い男性における骨粗鬆症の処置について承認されている。この医薬は、新たな骨形成を刺激し、骨ミネラル密度を著明に増大させる。閉経後女性では、脊椎、股関節、脚部、肋骨、および手首における骨折の低減が見られた。男性では、脊椎における骨折の低減が見られたが、他の部位における骨折の低減を評価するには、データが不十分であった。テリパラチドは、最長で２４カ月間にわたり、毎日の注射として、自己投与される。
他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはそのようなアンタゴニストの組み合わせは、動物における体脂肪含量の調節に、およびそれに関係する状態、特に、それに関係する健康を損なう状態の処置または予防に使用することができる。本発明にしたがって、体重を調節（制御）するということは、体重の低減もしくは増加、体重増加の速度の低減もしくは増加、または体重減少の速度の増加もしくは低減を指すことができ、体重を能動的に維持すること、または有意に変化させないこと（例えば、何もしなければ体重を増加または減少させ得る、外部または内部の影響に対して）も含む。本開示の一実施形態は、本開示のＴＧＦ－βスーパーファミリーヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ－βスーパーファミリーヘテロ多量体複合体の組合せを、それを必要とする動物（例えば、ヒト）に投与することによる、体重の調節に関する。
一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはこのようなアンタゴニストの組合せは、動物における体重の低減および／または体重増加の低減に、より具体的には、肥満のリスクがあるまたはこれを患う患者における肥満の処置または好転に使用することができる。別の特異的な実施形態では、本発明は、体重を増加または保持することができない動物（例えば、消耗性症候群の動物）を処置するための方法および化合物を対象にする。このような方法は、体重および／または質量の増加に、または体重および／または質量減少の低減に、または望ましくなく低い（例えば、不健康な）体重および／または質量に関連するもしくはこれに起因する状態の改善に有効である。加えて、高コレステロールの障害（例えば、高コレステロール血症または脂質異常症（ｄｉｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ））は、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはこのようなアンタゴニストの組合せにより処置することができる。
他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せを、動物における体脂肪含量を調節し、これと関連する状態を処置または予防し、特に、これと関連する健康毀損状態を処置または予防するために使用することができる。本発明によれば、体重を調節（制御）することとは、体重を低減するかまたは増大させることを指す場合もあり、体重増加の速度を低減するかまたは増大させることを指す場合もあり、体重減少の速度を増大させるかまたは低減することを指す場合もあり、また、体重を能動的に維持するか、またはこれを著明には変化させないこと（例えば、これがなければ体重を増大または減少させ得る外的または内的な影響に対して）も含む。本開示の一実施形態は、それを必要とする動物（例えば、ヒト）に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せを投与することにより体重を調節することに関する。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せを使用して、肥満症（例えば、腹部肥満症）；過剰体重；インスリン抵抗性；メタボリック症候群および他の代謝性疾患もしくは代謝性状態；低ＨＤＬレベル、高ＬＤＬレベル、高脂血症、高トリグリセリド血症、もしくは脂質異常症などの脂質障害；リポタンパク質異常；トリグリセリドの減少；炎症（例えば、肝臓の炎症および／または脂肪組織の炎症）、脂肪肝疾患；非アルコール性脂肪肝疾患；高血糖症；グルコース耐性障害（ＩＧＴ）；高インスリン血症；高コレステロール（例えば、高ＬＤＬレベルおよび高コレステロール血症）；冠動脈性心疾患、うっ血性心不全、脳卒中、末梢血管疾患、アテローム性動脈硬化を含む心疾患などの心血管疾患；動脈硬化症、および高血圧症；症候群Ｘ；血管再狭窄；神経障害；網膜症；神経変性疾患；内皮機能不全、呼吸器機能不全；膵炎；多嚢胞性卵巣症候群；尿酸レベルの上昇；ヘモクロマトーシス（鉄過剰負荷）；黒色表皮症（皮膚上の暗色の斑点）；またはがん（例えば、卵巣がん、乳がん、子宮内膜がん、および結腸がん）；あるいは上記の疾患または状態のうちの１つまたは複数と関連する別の障害／状態から選択される障害または状態を処置または予防することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せを使用して処置される疾患または状態は、過剰体重（例えば、≧２５ｋｇ／ｍ２のＢＭＩ）または体脂肪過多と関連する。
一実施形態では、本開示は、体重を減少させることを望む、またはそれを必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む、体重を減少させる方法を提供する。一部の実施形態では、対象は体重超過である（例えば、前肥満（ｐｒｅ－ｏｂｅｓｅ））。一部の実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ２またはそれより大きなボディー・マス・インデックス（ＢＭＩ）を有する。さらなる実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２、３０ｋｇ／ｍ２～３９．９ｋｇ／ｍ２、２５ｋｇ／ｍ２～３９．９ｋｇ／ｍ２、または２５ｋｇ／ｍ２～５０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は肥満である。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ２またはそれより大きな（例えば、３０～３９．９ｋｇ／ｍ２または３０ｋｇ／ｍ２～５０ｋｇ／ｍ２）ＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は病的な肥満である。一部の実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ２またはそれより大きなＢＭＩを有する。さらなる実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ２～４５ｋｇ／ｍ２、または４０ｋｇ／ｍ２～５０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、中心性肥満（例えば、腹部脂肪および／または内臓脂肪を含む腹部領域の過剰な脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、対象は、０．８５またはそれより大きなウエスト／ヒップ周長比（ＷＨＲ）を有する。一部の実施形態では、対象は、末梢性肥満（例えば、臀部の過剰脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、対象は、２型糖尿病を有する。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、単独または組み合わせ療法、別の種類の支持療法として投与され得る。例えば、一部の実施形態では、支持療法は食餌および／または運動である。
一実施形態では、本開示は、体重増加を減少させることを望む、またはそれを必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む、体重増加を減少させる方法を提供する。一部の実施形態では、対象は体重超過である（例えば、前肥満）。一部の実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ２またはそれより大きなＢＭＩを有する。さらなる実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２、３０ｋｇ／ｍ２～３９．９ｋｇ／ｍ２、２５ｋｇ／ｍ２～３９．９ｋｇ／ｍ２、または２５ｋｇ／ｍ２～５０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は肥満である。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ２またはそれより大きな（例えば、３０～３９．９ｋｇ／ｍ２または３０ｋｇ／ｍ２～５０ｋｇ／ｍ２）ＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は病的な肥満である。一部の実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ２またはそれより大きなＢＭＩを有する。さらなる実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ２～４５ｋｇ／ｍ２、または４０ｋｇ／ｍ２～５０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、２型糖尿病を有する。
処置または予防を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む、対象における過剰な体重に関連した疾患または障害を処置または予防する方法もまた提供される。一実施形態では、処置または予防される疾患または障害は、肥満症である。一実施形態では、処置または予防される疾患または障害はインスリン抵抗性である。一実施形態では、処置または予防される疾患または障害は、脂質異常症、高脂質血症（総コレステロールレベル＞２４０ｍｇ／ｄＬ）、高コレステロール血症（例えば、＞２００ｍｇ／ｄＬ、＞２２０ｍｇ／ｄＬ、＞２４０ｍｇ／ｄＬ、＞２５０ｍｇ／ｄＬ、または＞２７５ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベル）、低ＨＤＬ血清レベル（例えば、＜４０ｍｇ／ｄＬ、＜４５ｍｇ／ｄＬ、または＜５０ｍｇ／ｄＬ）、高ＬＤＬ血清レベル（例えば、≧１００ｍｇ／ｄＬ、≧１３０ｍｇ／ｄＬ、≧１６０ｍｇ／ｄＬ、または≧１９０ｍｇ／ｄＬ）、および高トリグリセリド血症（例えば、≧１５０ｍｇ／ｄＬ、≧１７５ｍｇ／ｄＬ、≧２００ｍｇ／ｄＬ、≧３００ｍｇ／ｄＬ、≧４００ｍｇ／ｄＬ、または≧４９９ｍｇ／ｄＬの空腹時ＴＧレベル）からなる群から選択されるメンバーである。ある特定の場合には、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト処置は、食餌および／または運動の補助である。
別の実施形態では、本開示は、体重超過である対象において体重を減少させる方法を提供する。その方法は、体重超過の対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む。一部の実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ２またはそれより大きなボディー・マス・インデックス（ＢＭＩ）を有する。さらなる実施形態では、対象は、２５ｋｇ／ｍ２～２９．９ｋｇ／ｍ２、３０ｋｇ／ｍ２～３９．９ｋｇ／ｍ２、２５ｋｇ／ｍ２～３９．９ｋｇ／ｍ２、または２５ｋｇ／ｍ２～５０ｋｇ／ｍ２、または２７～４０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は肥満である。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ２またはそれより大きな（例えば、３０～３９．９ｋｇ／ｍ２または３０ｋｇ／ｍ２～５０ｋｇ／ｍ２）ＢＭＩを有する。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、単独または組み合わせ療法として投与される。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト処置は、食餌および／または運動の補助である。
一実施形態では、本開示は、肥満の対象において体重を減少させる方法を提供する。その方法は、対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ２またはそれより大きな（例えば、３０～３９．９ｋｇ／ｍ２または３０ｋｇ／ｍ２～５０ｋｇ／ｍ２）ＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ２またはそれより大きなＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、中心性肥満（例えば、腹部脂肪および／または内臓脂肪を含む腹部領域の過剰な脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、対象は、０．８５またはそれより大きなウエスト／ヒップ周長比（ＷＨＲ）を有する。一部の実施形態では、対象は、末梢性肥満（例えば、臀部の過剰な脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト処置は、食餌および／または運動の補助である。
別の実施形態では、本開示は、肥満の対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む、肥満または肥満に関連した疾患または障害を処置および／または軽減する方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ２またはそれより大きなＢＭＩを有する。さらなる実施形態では、対象は、３０～３９．９ｋｇ／ｍ２または３０ｋｇ／ｍ２～５０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は病的な肥満である。一部の実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ２またはそれより大きなＢＭＩを有する。さらなる実施形態では、対象は、４０ｋｇ／ｍ２～４５ｋｇ／ｍ２、または４０ｋｇ／ｍ２～５０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、２型糖尿病を有する。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ２またはそれより大きな（例えば、３０～３９．９ｋｇ／ｍ２）ＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、少なくとも４０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、中心性肥満（例えば、腹部脂肪および／または内臓脂肪を含む腹部領域の過剰な脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、対象は、０．８５またはそれより大きなウエスト／ヒップ周長比（ＷＨＲ）を有する。一部の実施形態では、対象は、末梢性肥満（例えば、臀部の過剰な脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト処置は、食餌および／または運動の補助である。
処置または予防を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む、対象における肥満症に関連した疾患または障害を処置または予防する方法もまた提供される。一実施形態では、処置または予防される疾患または障害は、脂質異常症、高脂質血症（総コレステロールレベル＞２４０ｍｇ／ｄＬ）、高コレステロール血症（例えば、＞２００ｍｇ／ｄＬ、＞２２０ｍｇ／ｄＬ、＞２４０ｍｇ／ｄＬ、＞２５０ｍｇ／ｄＬ、または＞２７５ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベル）、低ＨＤＬ血清レベル（例えば、＜４０ｍｇ／ｄＬ、＜４５ｍｇ／ｄＬ、または＜５０ｍｇ／ｄＬ）、高ＬＤＬ血清レベル（例えば、≧１００ｍｇ／ｄＬ、≧１３０ｍｇ／ｄＬ、≧１６０ｍｇ／ｄＬ、または≧１９０ｍｇ／ｄＬ）、および高トリグリセリド血症（例えば、≧１５０ｍｇ／ｄＬ、≧１７５ｍｇ／ｄＬ、≧２００ｍｇ／ｄＬ、≧３００ｍｇ／ｄＬ、≧４００ｍｇ／ｄＬ、または≧４９９ｍｇ／ｄＬの空腹時ＴＧレベル）からなる群から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置または予防される疾患または障害は、心血管疾患である。追加の実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、高血圧症（高血圧）、心筋梗塞、末梢動脈疾患、血圧調節（ｖａｓｏｒｅｇｕｌａｔｏｉｎ）機能不全、動脈硬化症、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化、冠動脈性心疾患、または細小血管疾患である。一実施形態では、処置または予防される疾患または障害は、肝疾患である。一実施形態では、処置または予防される肝疾患または障害は、ＮＡＦＬＤである。一実施形態では、肝疾患は、脂肪肝である。一実施形態では、肝疾患は、ＮＡＳＨである。別の実施形態では、処置または予防される疾患または障害は、脂肪性肝炎、脂肪症、線維症、および／または肝硬変からなる群から選択されるメンバーである。ある特定の場合には、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト処置は、食餌および／または運動の補助である。
別の実施形態では、本開示は、２型糖尿病を有するか、または２型糖尿病を発症するリスクのある対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む、２型糖尿病または糖尿病に関連する疾患または障害を処置、軽減および／または予防する方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、３０ｋｇ／ｍ２またはそれより大きな（例えば、３０～３９．９ｋｇ／ｍ２）ボディー・マス・インデックスＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、少なくとも４０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、中心性肥満（例えば、腹部脂肪および／または内臓脂肪を含む腹部領域の過剰な脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、対象は、０．８５またはそれより大きなＷＨＲを有する。一部の実施形態では、対象は、末梢性肥満（例えば、臀部の過剰な脂肪蓄積）を有する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト処置は、食餌および／または運動の補助である。
糖尿病を有する対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む、糖尿病に関連した疾患または障害を処置、予防または軽減する方法もまた提供される。一実施形態では、処置または予防される疾患または障害は、脂質異常症、高脂質血症（総コレステロールレベル＞２４０ｍｇ／ｄＬ）、高コレステロール血症（例えば、＞２００ｍｇ／ｄＬ、＞２２０ｍｇ／ｄＬ、＞２４０ｍｇ／ｄＬ、＞２５０ｍｇ／ｄＬ、または＞２７５ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベル）、低ＨＤＬ血清レベル（例えば、＜４０ｍｇ／ｄＬ、＜４５ｍｇ／ｄＬ、または＜５０ｍｇ／ｄＬ）、高ＬＤＬ血清レベル（例えば、≧１００ｍｇ／ｄＬ、≧１３０ｍｇ／ｄＬ、≧１６０ｍｇ／ｄＬ、または≧１９０ｍｇ／ｄＬ）、および高トリグリセリド血症（例えば、≧１５０ｍｇ／ｄＬ、≧１７５ｍｇ／ｄＬ、≧２００ｍｇ／ｄＬ、≧３００ｍｇ／ｄＬ、≧４００ｍｇ／ｄＬ、または≧４９９ｍｇ／ｄＬの空腹時ＴＧレベル）からなる群から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置または予防される疾患または障害は、心血管疾患である。追加の実施形態では、処置または予防される疾患または障害は、高血圧症（高血圧）、心筋梗塞、末梢動脈疾患、血管制御の機能不全（ｖａｓｏｒｅｇｕｌａｔｏｉｎ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）、または動脈硬化症である。一実施形態では、処置または予防される疾患または障害は肝疾患である。別の実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、群：脂肪肝疾患、脂肪性肝炎、脂肪症、および／または肝硬変から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置または予防される疾患または状態は、白内障、閉塞性睡眠時無呼吸、静脈炎、痛風、骨関節炎、胆嚢疾患、および高コレステロールからなる群から選択されるメンバーである。ある特定の場合、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置は、食餌および／または運動に対する補助処置である。
本開示は、そのような処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む、対象における血液脂質プロファイルを改善するための方法もまた提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＬＤＬコレステロールのレベルを減少またはＨＤＬ－コレステロールのレベルを上昇させるための方法を提供する。一実施形態では、対象は、脂質異常症を有する。別の実施形態では、対象は、血清脂質の上昇（例えば、コレステロール（高コレステロール血症）および／またはトリグリセリド（例えば、高トリグリセリド血症）を有する。対象は、ＬＤＬ－Ｃ≧１００ｍｇ／ｄＬ、≧１３０ｍｇ／ｄＬ、または≧１６０ｍｇ／ｄＬ）を有する。一実施形態では、対象は、ＴＧ≧１５０ｍｇ／ｄＬ、≧１６０ｍｇ／ｄＬ、≧１７０ｍｇ／ｄＬ）を有する。一実施形態では、対象は、血漿インスリンレベルの上昇（高インスリン血症；例えば、＞２０ｕｇ／ｍｌの空腹時インスリンレベル、１００を超え得る）を有する。一部の実施形態では、対象は、ＩＩ型糖尿病を有する。
一実施形態に従うと、本開示は、それを必要とする対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む、代謝性疾患または障害あるいは代謝性疾患または障害に関連した状態を処置または予防するための方法を提供する。一実施形態では、処置される代謝性疾患、障害または状態は高血糖症（例えば、経口グルコース耐性試験の間の空腹状態におけるまたはグルコース投与後の＞１３０ｍｇ／ｄＬ）である。一実施形態では、処置される代謝性疾患、障害または状態は、脂質代謝疾患、障害または状態である。一実施形態では、処置される代謝性疾患、障害または状態は脂質異常症である。さらなる実施形態では、脂質代謝疾患、障害または状態は、低ＨＤＬレベル、高ＬＤＬレベル、高トリグリセリドレベル、高脂質血症、およびリポタンパク質異常から選択されるメンバーである。一実施形態では、対象は、＞２００ｍｇ／ｄＬ、＞２２０ｍｇ／ｄＬ、＞２４０ｍｇ／ｄＬ、＞２５０ｍｇ／ｄＬ、または＞２７５ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベルを有する。一実施形態では、対象は、＜４０ｍｇ／ｄＬ、＜４５ｍｇ／ｄＬ、または＜５０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ血清レベルを有する。一実施形態では、対象は、ＬＤＬ血清レベル≧１００ｍｇ／ｄＬ、≧１３０ｍｇ／ｄＬ、≧１６０ｍｇ／ｄＬ、または≧１９０ｍｇ／ｄＬを有する。一実施形態では、対象は、≧１５０ｍｇ／ｄＬ、≧１７５ｍｇ／ｄＬ、≧２００ｍｇ／ｄＬ、≧３００ｍｇ／ｄＬ、≧４００ｍｇ／ｄＬ、または≧４９９ｍｇ／ｄＬの空腹時ＴＧレベルを有する。一実施形態では、処置される代謝性疾患、障害または状態は、グルコース代謝疾患、障害または状態である。さらなる実施形態では、グルコース代謝疾患、障害、または状態は、グルコース不耐症、インスリン抵抗性、グルコース耐性障害（ＩＧＴ）、空腹時血糖障害（ＩＦＧ）から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置される代謝性疾患、障害、または状態は、高尿酸レベル、ＮＡＦＬＤ、脂肪肝、ＮＡＳＨ、および多嚢胞性卵巣症候群からなる群から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置される対象は、高インスリン血症を有する。一実施形態では、処置される対象は肥満である（例えば、対象は腹部肥満を有する）。別の実施形態では、処置される対象は、ＩＩ型糖尿病を有する。
メタボリック症候群とは、心疾患のリスクを増進する障害のセットが関与する状態である。メタボリック症候群の主要な構成要素は、過剰な体重、心血管パラメータ（高血圧、脂質異常症、血中のトリグリセリドの高レベルおよび／またはＨＤＬの低レベル）、アテローム性動脈硬化、糖尿病、および／またはインスリン抵抗性である。これらの構成要素のいくつか、すなわち、メタボリック症候群を有する対象は、心疾患に非常に罹患しやすいが、各構成要素はリスク要因である。本開示はまた、上記のメタボリック症候群の構成要素のうちの１つ、２つ、３つ、またはこれ超を処置または予防するための方法であって、処置を必要とする対象に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、またはこのようなアンタゴニストの組合せの有効量を投与する工程を含む方法も提供する。
それを必要とする対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む、心血管疾患または障害を処置、予防または軽減する方法が追加的に提供される。一実施形態では、処置、予防または軽減される心血管疾患または障害は、アテローム性動脈硬化である。一実施形態では、処置、予防、または軽減される心血管疾患または状態は、高血圧症（例えば、静止状態における血圧＞１３０／８０ｍｍＨｇまたは＞１４０／９０ｍｍＨｇ）である。一実施形態では、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化（冠動脈性心疾患）である。
一実施形態では、本開示は、それを必要とする対象にＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む、炎症性肝疾患または障害を処置および／または軽減するための方法を提供する。一実施形態では、疾患または障害は、ＮＡＦＬＤである。さらなる実施形態では、疾患または障害は、脂肪肝である。さらなる実施形態では、疾患または障害は、脂肪症（例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ））である。さらなる実施形態では、疾患または障害は、アルコール性脂肪肝疾患である。それを必要とする対象
本開示は、処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）を投与する工程を含む、血糖コントロールを改善する方法もまた提供する。一実施形態では、投与される対象は、＞１３０、＞１３５、＞１４０、＞１４５、または＞１５０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベルを有する。一実施形態では、投与される対象は、食事２時間後に＞１８０、＞１８５、＞１９０、＞１９５、または＞２００ｍｇ／ｄＬの食後血糖レベルを有する。ある特定の場合には、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト処置は、食餌および／または運動の補助である。その投与は、また体重を減少させることも、肥満症を処置することもできる。ある特定の場合には、対象は、２型糖尿病を有する。ある特定の場合には、対象は、２７～４０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。ある特定の場合には、対象は、３０～３９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する。ある特定の場合には、対象は、少なくとも４０のＢＭＩを有する。ある特定の場合には、対象は体重超過である。ある特定の場合には、対象は肥満である。血糖コントロールの改善は、混合食負荷試験などの当該分野で公知の技法を使用して評価することができる。
本開示は、そのような処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）を投与する工程を含む、対象における高血糖症または高血糖症に関連した状態を処置、予防または軽減するための組成物および方法もまた提供する。一実施形態では、投与される対象は、＞１３０、＞１３５、＞１４０、＞１４５、または＞１５０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベルを有する。一実施形態では、投与される対象は、食事２時間後に＞１８０、＞１８５、＞１９０、＞１９５、または＞２００ｍｇ／ｄＬの食後血糖レベルを有する。一実施形態では、処置、予防または軽減の結果は、処置前の対象の血清レベルと比較した場合の、グルコースの血清レベルの減少、トリグリセリドの血清レベルの減少、インスリンの血清レベルの減少、および／または非エステル化脂肪酸の血清レベルの減少からなる群から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置、予防または軽減の結果は、処置前の対象の体温と比較した場合の約０．４℃～１℃の体温の上昇である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ処置は、また対象の体重を減少させる。
別の実施形態では、本開示は、そのような処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）を投与する工程を含む、対象における血漿インスリンレベルを減少させる方法を提供する。一実施形態では、対象は、＞１３０、＞１３５、＞１４０、＞１４５、または＞１５０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベルを有する。一実施形態では、対象は、食事２時間後に＞１８０、＞１８５、＞１９０、＞１９５、または＞２００ｍｇ／ｄＬの食後血糖レベルを有する。一実施形態では、対象は体重超過である。一実施形態では、対象は肥満である。別の実施形態では、対象は、２型糖尿病を有する。
本開示は、そのような処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）を投与する工程を含む、対象における高血糖症または高血糖症に関連した状態を処置、予防または軽減するための組成物および方法もまた提供する。一実施形態では、対象は、＞１３０、＞１３５、＞１４０、＞１４５、または＞１５０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベルを有する。一実施形態では、対象は、食事２時間後に＞１８０、＞１８５、＞１９０、＞１９５、または＞２００ｍｇ／ｄＬの食後血糖レベルを有する。一実施形態では、処置、予防または軽減の結果は、処置前の対象の血清レベルと比較した場合の、グルコースの血清レベルの減少、トリグリセリドの血清レベルの減少、インスリンの血清レベルの減少、および／または非エステル化脂肪酸の血清レベルの減少からなる群から選択されるメンバーである。一実施形態では、処置、予防または軽減の結果は、処置前の対象の体温と比較した場合の約０．４℃～１℃の体温の上昇である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト処置は、また対象の体重を減少させる。
別の実施形態では、本開示は、そのような処置を必要とする対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む、対象における血漿インスリンレベルを低下させる方法を提供する。一実施形態では、対象は、＞１３０、＞１３５、＞１４０、＞１４５、または＞１５０ｍｇ／ｄＬのを有する。一実施形態では、は食事２時間後に＞１８０、＞１８５、＞１９０、＞１９５、または＞２００ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベル食後血糖レベルを有する。一実施形態では、対象は体重超過である。一実施形態では、対象は肥満である。別の実施形態では、対象は、２型糖尿病を有する。
別の実施形態では、本開示は、肝疾患を有する対象に有効量のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせを投与する工程を含む対象における肝疾患を処置、予防または軽減する方法を提供する。一実施形態では、対象は、肝臓の炎症を有する。一実施形態では、対象は、ＮＡＦＬＤを有する。一実施形態では、対象は、脂肪肝を有する。別の実施形態では、対象は、ＮＡＳＨを有する。一実施形態では、対象は、脂肪肝を有する。別の実施形態では、対象は、アルコール性脂肪肝疾患を有する。一実施形態では、処置、予防または軽減される肝疾患は、線維症、瘢痕、肝硬変または肝不全である。別の実施形態では、処置、予防または軽減される肝疾患は肝がんである。一実施形態では、対象は体重超過である。別の実施形態では、対象は肥満である。別の実施形態では、対象は、２型糖尿病を有する。
線維症は一般に、器官または組織における細胞数の相対的減少と組み合わせた、コラーゲン線維および細胞外マトリクスの両方の過剰な沈着を指す。この過程は、傷害後の自然な創傷治癒の重要な特色であるが、線維症は、例えば、肺、腎臓、肝臓、骨、筋肉および皮膚を含む様々な組織および器官に病理的損傷をもたらし得る。線維症におけるＴＧＦ－βの役割は、広範に研究されてきた。しかし、例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡおよびアクチビンＢ）およびＧＤＦ８を含む、他のＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドもまた、線維症に関係づけられてきた［Ｈｅｄｇｅｒら（２０１３年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４巻：２８５～２９５頁；Ｈａｒｄｙら（２０１５年）９３巻：５６７～５７４頁；およびＣａｎｔｉｎｉら（２００８年）Ｊ Ｓｅｘ Ｍｅｄ ５巻：１６０７～１６２２頁］。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせは、線維症、特に、線維症関連障害および状態の処置に使用することができる。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせは、肺線維症、過敏性肺炎、特発性線維症、結核、肺炎、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、腎（腎臓）線維症、腎（腎臓）不全、慢性腎（腎臓）疾患、骨線維症、骨髄線維症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、サルコイドーシス、多発血管炎性肉芽腫症、ペロニー病、肝臓線維症、ウィルソン病、糖原病（特に、ＩＩＩ、ＩＶ、ＩＸおよびＸ型）、鉄過剰、ゴーシェ病、ツェルウェーガー症候群、非アルコール性およびアルコール性脂肪性肝炎、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、外科手術関連線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮（Ｄｕｐｕｔｒｅｎ’ｓ ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ）、縦隔線維症、腎性線維症（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｅｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、後腹膜線維症、心房性線維症、心内膜心筋線維症、膵臓線維症のうち１つまたは複数の処置または予防に使用することができる。
腎臓は、体積、ｐＨの平衡、電解質濃度、および血圧を含む、血液の多くの特色を維持するほか、毒素および老廃物の濾過を担っている。これらの機能は、腎ネフロンの複雑な構造、腎臓の多様な毛細血管を通る一定の血流量、および体内の残余の部分からのシグナルであって、内分泌ホルモンを含むシグナルによる腎臓の調節に依存する。腎機能に関する問題は、直接的機構（例えば、遺伝子欠損、感染、または毒素曝露）と、肥大および過剰濾過（これら自体、しばしば、腎機能に対するより直接的な攻撃の結果である）などの長期にわたるストレス因子から次第に進行する間接的機構とにより顕在化する。血液の維持および老廃物の排出における腎臓の中心的役割に起因して、腎関連疾患の症状は、多く、様々であり、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１８版、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎ．Ｙ．、１３部、２７７～２８９章において総説され得る。
本明細書で記載される通り、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、腎疾患モデルにおいて多様で有益な効果を及ぼした。特に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体による処置は、片側尿管閉塞を有する対象において腎組織の損傷、炎症、および線維症を軽減した。これらのデータは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、腎疾患を処置または予防する、特に、腎疾患の多様な合併症（症状）であって、例えば、腎組織の損傷、炎症、および／または線維症を含む合併症（症状）を処置または予防し得ることを指し示す。
したがって、本発明の方法は、多様な腎関連疾患または状態に適用することができる。本明細書で使用される場合、「腎関連疾患または状態」とは、腎臓または腎臓系が罹患する任意の疾患、障害、または状態を指し得る。腎関連疾患または状態として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない；慢性腎疾患（または不全）、急性腎疾患（または不全）、原発性腎疾患、非糖尿病性腎疾患、糸球体腎炎、間質性腎炎、糖尿病性腎疾患、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、急速進行性糸球体腎炎、腎線維症、アルポート症候群、ＩＤＤＭ腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎、腎間質性線維症、巣状分節状糸球体硬化症、膜性腎症、微小変化型疾患、微量免疫型急速進行性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、多発性嚢胞腎、デント病、腎シスチン蓄積症（ｎｅｐｈｒｏｃｙｔｉｎｏｓｉｓ）、ヘイマン腎炎、常染色体優性（成人型）多発性嚢胞腎、常染色体劣性（小児型）多発性嚢胞腎、急性腎傷害、ネフローゼ症候群、腎虚血症、有足細胞疾患または有足細胞障害、タンパク尿症、糸球体疾患、膜性糸球体腎炎、巣状分節状糸球体腎炎、子癇前症、子癇、腎病変、膠原血管病、良性起立性（体位性）タンパク尿症、ＩｇＭ腎症、膜性腎症、サルコイドーシス、糖尿病、薬物に起因する腎損傷、ファブリー病、アミノ酸尿症、ファンコーニ症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球病、ヘモグロビン尿症、ミオグロビン尿症、ウェゲナー肉芽腫症、１型糖原病、慢性腎疾患、慢性腎不全、糸球体濾過量（ＧＦＲ）低下症、腎血管硬化症、ループス腎炎、ＡＮＣＡ陽性微量免疫型半月体形成性糸球体腎炎、慢性移植腎症、腎臓毒性、腎毒性、腎壊死、腎損傷、糸球体尿細管傷害、腎機能不全、腎炎症候群、急性腎不全、慢性腎不全、近位尿細管機能不全、急性腎移植拒絶、慢性腎移植拒絶、非ＩｇＡメサンギウム増殖性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、任意の種類の腎関与を伴う血管炎、任意の遺伝性腎疾患、任意の間質性腎炎、腎移植不全、腎臓がん、他の状態（例えば、高血圧症、糖尿病、および自己免疫疾患）と関連する腎疾患、デント病、腎シスチン蓄積症、ヘイマン腎炎、原発性腎疾患、虚脱性糸球体症、デンスデポジット病、寒冷グロブリン血症関連糸球体腎炎、ヘノッホ－シェーンライン病、感染後糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ－ストラウス症候群、抗ＧＢＭ抗体介在型糸球体腎炎、アミロイドーシス、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、線維性糸球体腎炎、イムノタクトイド糸球体症、虚血性尿細管傷害、薬物誘導性尿細管間質性腎炎、毒性尿細管間質性腎炎、感染性尿細管間質性腎炎、細菌性腎盂腎炎、ポリオーマウイルス感染またはＨＩＶ感染から生じるウイルス感染性尿細管間質性腎炎、代謝誘導性尿細管間質性疾患、混合性結合組織疾患、円柱腎症、尿酸結晶もしくはシュウ酸結晶または薬物誘導性結晶の沈着から生じ得る結晶腎症、急性細胞性尿細管間質性同種移植片拒絶、リンパ腫または移植後リンパ増殖性疾患から生じる腫瘍性浸潤性疾患、腎臓の閉塞性疾患、血管疾患、血栓性微小血管症、腎血管硬化症、アテローム塞栓性疾患、混合性結合組織疾患、結節性多発動脈炎、カルシニューリン阻害剤誘導性血管疾患、急性細胞性血管性同種移植片拒絶、急性体液性同種移植片拒絶、早期腎機能低下症（ＥＲＦＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、腎静脈血栓症、急性尿細管壊死、急性間質性腎炎、確立された慢性腎疾患、腎動脈狭窄症、虚血性腎症、血尿症、薬物毒素誘導性慢性尿細管間質性腎炎、逆流腎症、腎臓結石、グッドパスチャー症候群、正球性正色素性貧血、腎性貧血、糖尿病性慢性腎疾患、ＩｇＧ４関連疾患、フォンヒッペル－リンダウ症候群、結節性硬化症、ネフロン癆、髄質性嚢胞腎疾患、腎細胞癌、腺癌、腎芽細胞腫、リンパ腫、白血病、低シアリル化障害、慢性シクロスポリン腎症、腎再灌流傷害、腎形成異常、高窒素血症、両側性動脈閉塞、急性尿酸性腎症、血液量減少、急性両側性閉塞性尿路疾患、高カルシウム血性腎症、溶血性尿毒症症候群、急性尿貯留、悪性腎硬化症、分娩後糸球体硬化症、強皮症、非グッドパスチャー抗ＧＢＭ病、顕微鏡的結節性多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫症、急性放射線腎炎、溶連菌感染後糸球体腎炎、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、鎮痛薬性腎症、動静脈フィステル、動静脈移植、透析、異所性腎、海綿腎、腎性骨形成異常症、単腎症、水腎、微量アルブミン尿症、尿毒症、血尿、高脂血症、低アルブミン血症、脂肪尿、アシドーシス、高カリウム血症、および浮腫。
一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはそのようなアンタゴニストの組み合わせ（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体などのＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）は、慢性腎臓疾患を処置するための１つまたは複数の支持療法と任意選択で組み合わせて、慢性腎臓疾患の処置または予防に使用することができる。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはそのようなアンタゴニストの組み合わせ（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体などのＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）は、慢性腎臓疾患を処置するための１つまたは複数の支持療法と任意選択で組み合わせて、慢性腎臓疾患の１つまたは複数の合併症（症状または症状発現）の処置または予防に使用することができる。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはそのようなアンタゴニストの組み合わせ（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体などのＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）は、末期腎臓疾患を処置するための１つまたは複数の支持療法と任意選択で組み合わせて、末期腎臓不全の処置または予防に使用することができる。慢性腎疾患としても公知の慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）は、数ヶ月間または数年間の期間にわたる腎機能の進行性損失である。腎臓機能の悪化の症状は、全体的な体調不良を感じることおよび食欲低減を経験することを含み得る。多くの場合、慢性腎臓疾患は、高血圧または糖尿病を有する者およびＣＫＤの血縁者がいる者など、腎臓問題のリスクがあることが公知の人のスクリーニングの結果として診断される。この疾患は、心血管疾患、貧血または心膜炎など、その認識される合併症の１つをもたらす場合に同定することもできる。近年の専門ガイドラインは、５つのステージにＣＫＤの重症度を分類し、ステージ１が最も軽度であり、通常、ほとんど症状を引き起こさず、ステージ５が重度疾病であり、処置しなければ不十分な平均余命となる。ステージ５のＣＫＤは多くの場合、末期腎臓疾患、末期腎疾患または末期腎臓不全と呼ばれ、これは、現在は旧式の用語である慢性腎不全または慢性腎臓不全とほぼ同義であり；通常、患者が、ある形態の透析が関与し得るが、理想的には腎臓移植を構成する腎代替療法を必要とすることを意味する。ＣＫＤは、初期に特異的な症状がなく、一般に、血清クレアチニンまたは尿中タンパク質の増加としてのみ検出される。腎臓機能が減少するにつれて、後述する通り様々な症状が顕在化し得る。水分過負荷およびレニン・アンジオテンシン系により腎臓によって生成される血管作動性ホルモンの産生により、血圧が増加することがあり、高血圧症を発症するおよび／またはうっ血性心不全を患うリスクを増加させる。尿素が蓄積することがあり、高窒素血症および最終的に尿毒症（嗜眠から心膜炎および脳症に及ぶ症状）をもたらす。その高い全身性循環のため、尿素は、エクリン汗において高濃度で排泄され、汗が蒸発する際に皮膚上で結晶化する（「尿素霜」）。血液中にカリウムが蓄積することがある（倦怠感および潜在的に致死的な心不整脈を含むある範囲の症状を有する高カリウム血症）。高カリウム血症は通常、糸球体濾過率が、２０～２５ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２未満に降下するまで発症せず、このポイントで、腎臓は、カリウムを排泄する能力が減少している。ＣＫＤにおける高カリウム血症は、酸血症（カリウムの細胞外シフトをもたらす）によって、また、インスリンの欠如から増悪され得る。エリスロポエチン合成が減少されることがあり、貧血の原因となる。軽度浮腫から生命にかかわる肺浮腫に及ぶ、液量過負荷症状（ｆｌｕｉｄ ｖｏｌｕｍｅ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｓｙｍｐｔｏｍ）が起こることがある。一般に、糸球体濾過の減少後に、リン酸塩排泄の低減による高リン酸血症が起こることがある。高リン酸血症は、心血管リスクの増加に関連し、血管石灰化に対する直接的な刺激である。一般に、線維芽細胞増殖因子－２３の刺激に起因する、低カルシウム血症が症状発現することがある。骨細胞は、酵素１－アルファ－ヒドロキシラーゼ（２５－ヒドロキシコレカルシフェロールから１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３への変換の原因となる）の強力な阻害剤であるＦＧＦ２３の産生増加の原因となる。後に、これは、二次性副甲状腺機能亢進症、腎性骨形成異常症および血管石灰化へと進行し、これは、心機能をさらに損なう。代謝性アシドーシス（硫酸塩、リン酸塩、尿酸などの蓄積による）が起こり、酵素に作用する過剰な酸による酵素活性の変更を引き起こすことがある；過剰な酸（酸血症）による高カリウム血症の促進により心臓およびニューロン膜の興奮性の増加を引き起こすこともある。アシドーシスは、近位尿細管の細胞から十分なアンモニアを生成する能力の減少によっても起こる。腎臓機能が減少するにつれて有病率が増加する鉄欠乏貧血は、血液透析を必要としている者において特に蔓延している。これは、原因が多因子性（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒａｌ）であるが、骨髄抑制をもたらす炎症増加、エリスロポエチンの低減および高尿酸血症を含む。ＣＫＤを有する者は、急速進行型アテローム性動脈硬化を患い、母集団よりも心血管疾患を発症する可能性が高い。ＣＫＤおよび心血管疾患を患う患者は、後者のみを患う患者よりも有意に悪い予後を有する傾向がある。
本明細書で使用する場合、「～と組み合わせて」または「併用投与」とは、追加的治療（例えば、第２、第３、第４など）が、体内でなおも効果的である（例えば、複数の化合物は、患者において同時に効果的であり、これは、これらの化合物の相乗効果を含み得る）ような、任意の投与形態を指す。有効性は、血中、血清中、または血漿中の作用因子の測定可能な濃度と相関しない場合もある。例えば、異なる治療用化合物は、同じ製剤において投与することもでき、別個の製剤において、共時的または逐次的に投与することもでき、異なるスケジュールで投与することもできる。したがって、このような処置を施される個体は、異なる治療の組み合わせ効果から利益を得ることができる。本開示の１つまたは複数のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、１つまたは複数の他の追加の作用因子または支持療法と共時的に、これらの前に、またはこれらの後に投与され得る。一般に、各治療剤は、その特定の作用因子について決定された用量および／または時間スケジュールで投与される。レジメンにおいて利用する特定の組み合わせは、本開示のアンタゴニストの、治療および／または達成される所望の治療効果に対する適合性を考慮に入れる。
（７．薬学的組成物）
ある特定の態様では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）またはそのようなアンタゴニストの組み合わせは、単独で投与することもでき、医薬製剤（治療用組成物または薬学的組成物とも称される）の成分として投与することもできる。医薬製剤とは、その中に含有される活性成分（例えば、本開示の作用因子）の生物活性が効果的であることを可能とするような形態にあり、製剤が投与される対象に対して許容不可能に毒性である、さらなる成分を含有しない調製物を指す。本主題の化合物は、ヒト医療または獣医療における使用のために好都合な任意の方式における投与のために製剤化され得る。例えば、本開示の１つまたは複数の作用因子は、薬学的に許容されるキャリアと共に製剤化することができる。薬学的に許容されるキャリアとは、医薬製剤中の、活性成分以外の成分であって、対象に対して一般に非毒性である成分を指す。薬学的に許容されるキャリアは、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、および／または保存剤を含むがこれらに限定されない。一般に、本開示における使用のための医薬製剤は、対象に投与されるとき、発熱物質非含有であり、生理学的に許容される形態にある。本明細書に記載のもの以外の治療的に有用な作用因子であって、任意選択で、上記の製剤中に含まれ得る作用因子を、本開示の方法における主題の作用因子と組み合わせて投与することができる。
ある特定の実施形態では、組成物は、非経口投与される［例えば、静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射、動脈内注射、骨内注射、筋内注射、髄腔内注射、皮下注射、または皮内注射により］。非経口投与に適する薬学的組成物は、本開示の１つまたは複数の作用因子を、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌かつ等張の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液、もしくはエマルジョン、または使用直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散液へと再構成され得る無菌粉末と組み合わせて含み得る。注射可能な溶液または分散液は、抗酸化物質、緩衝剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、または製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。本開示の医薬製剤において利用され得る、適切な水性および非水性のキャリアの例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、植物油（例えば、オリーブ油）、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、およびこれらの適切な混合物を含む。適正な流動性は、例えば、コーティング材料（例えば、レシチン）の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒子径の維持によって、および、界面活性剤の使用によって維持することができる。
一部の実施形態では、本開示の治療法は、インプラントもしくはデバイスから薬学的組成物を全身投与または局所投与する工程を包含する。さらに、薬学的組成物は、カプセル化され得、または、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）へと送達するための形態で注射され得る。特定の実施形態では、本開示の組成物は、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）に本開示の１つまたは複数の作用因子を送達し得、成長中の組織のための構造を提供し得、そして、最適には身体内へと再吸収され得るマトリクスを含み得る。例えば、マトリクスは、本開示の１つまたは複数の作用因子の遅速放出を提供し得る。このようなマトリクスは、他の移植医療用途に現在使用される材料から形成され得る。
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、見かけ上の様相および界面の特性のうちの１つまたは複数に基づいてもよい。本主題の組成物の特定の用途が、適切な製剤を画定する。組成物のための可能性のあるマトリクスは、生分解性でかつ化学的に画定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の可能性のある材料は、生分解性でかつ生物学的に十分に画定されたもの（例えば、骨または皮膚のコラーゲンが挙げられる）である。さらなるマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリクスの成分から構成される。他の可能性のあるマトリクスは、非生分解性でかつ化学的に規定されたもの（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩、または他のセラミクスが挙げられる）である。マトリクスは、上述のタイプの材料のいずれかの組み合わせ（例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、または、コラーゲンおよびリン酸三カルシウム）を含み得る。バイオセラミクスは、組成物（例えば、カルシウム－アルミン酸－リン酸）中で変化され得、孔径、粒子径、粒子の形状および生分解性のうちの１つまたは複数を変更するように加工され得る。
ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、局所投与することができる。「局所適用」または「局所」とは、医薬組成物の体表面（例えば、皮膚、創傷部位、および粘膜）との接触を意味する。局所用医薬組成物は、多様な適用形態を有することが可能であり、典型的には、組成物の局所投与時に組織に近接または直接接触して配置されるように適応される薬物含有層を含む。局所投与に適する医薬組成物は、本開示の、液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、フォーム、ペースト、パテ、半固形、または固形として組み合わせて製剤化された１つまたは複数のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを含み得る。液体形態、ゲル形態、クリーム形態、ローション形態、軟膏形態、フォーム形態、ペースト形態、またはパテ形態の組成物は、組成物を、標的組織上に塗り伸ばすか、スプレーするか、スミアリングするか、ダビングするか、またはローリングすることにより適用することができる。組成物はまた、滅菌包帯、経皮パッチ、プラスター、およびバンデージへと含浸させることもできる。パテ形態、半固形形態または固形形態の組成物は、可塑性であり得る。それらは、伸縮性または非伸縮性（例えば、可撓性または剛性）であり得る。ある特定の態様では、組成物は、複合物の一部を形成し、組成が同じであるか、または異なる繊維、微粒子、または多重層を含み得る。
液体形態の局所用組成物は、薬学的に許容される溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、および懸濁液を含み得る。有効成分に加えて、液体剤形は、当該分野において一般に使用される不活性の希釈剤であって、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および／もしくは乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、または１，３－ブチレングリコール、油（例えば、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含む希釈剤を含有し得る。
局所用のゲル、クリーム、ローション、軟膏、半固形または固形組成物は、多糖、合成ポリマーまたはタンパク質ベースのポリマーなどの１つまたは複数の増粘剤を含み得る。本発明の一実施形態では、本明細書のゲル化剤は、適切に非毒性であり、所望の粘性をもたらすゲル化剤である。増粘剤として、ビニルピロリドン、メタクリルアミド、アクリルアミドＮ－ビニルイミダゾール、カルボキシビニル、ビニルエステル、ビニルエーテル、シリコーン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ビニルアルコール、アクリル酸ナトリウム、アクリレート、マレイン酸、ＮＮ－ジメチルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、アクリルアミド、アクリロイルモルホリン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、コラーゲン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニレン、ポリビニルシリケート、糖（例えば、スクロース、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、トレハロース、マンノース、またはラクトース）で置換されたポリアクリレート、アシルアミドプロパンスルホン酸、テトラメトキシオルトシリケート、メチルトリメトキシオルトシリケート、テトラアルコキシオルトシリケート、トリアルコキシオルトシリケート、グリコール、プロピレングリコール、グリセリン、多糖、アルギネート、デキストラン、シクロデキストリン、セルロース、修飾セルロース、酸化セルロース、キトサン、キチン、グアーガム、カラギーナン、ヒアルロン酸、イヌリン、デンプン、修飾デンプン、アガロース、メチルセルロース、植物ガム、ヒアルロナン（ｈｙｌａｒｏｎａｎｓ）、ハイドロゲル、ゼラチン、グリコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ペクチン、低メトキシペクチン、架橋デキストラン、デンプン－アクリロニトリルグラフトコポリマー、ポリアクリル酸ナトリウムデンプン、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニレン、ポリエチルビニルエーテル、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリアルカノエート、ポリ乳酸、ポリラクテート、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、スルホン化ハイドロゲル、ＡＭＰＳ（２－アクリルアミド－２－メチル－１－プロパンスルホン酸）、ＳＥＭ（スルホエチルメタクリレート）、ＳＰＭ（スルホプロピルメタクリレート）、ＳＰＡ（スルホプロピルアクリレート）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－メタクリロキシエチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）アンモニウムベタイン、メタクリル酸アミドプロピル－ジメチルアンモニウムスルホベタイン、ＳＰＩ（イタコン酸－ビス（１－プロピルスルホン酸（ｓｕｌｆｏｎｉｚａｃｉｄ）－３）エステル二カリウム塩）、イタコン酸、ＡＭＢＣ（３－アクリルアミド－３－メチルブタン酸）、ベータ－カルボキシエチルアクリレート（アクリル酸二量体）、およびマレイン酸無水物－メチルビニルエーテルポリマー、これらの誘導体、これらの塩、これらの酸、ならびにこれらの組合せによる、ポリマー、コポリマー、および単量体が挙げられ得る。ある特定の実施形態では、本開示の薬学的組成物は、例えば、カプセル、カシェ、丸剤、錠剤、ロゼンジ（スクロースおよびアカシアまたはトラガントなどの矯味矯臭基材を使用する）、散剤、顆粒剤、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油もしくは油中水の液体エマルジョン、またはエリキシルもしくはシロップ、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基材を使用する）、かつ／またはマウスウォッシュの形態で経口投与することもでき、各々が、所定量の、本開示の化合物と、任意選択で、１つまたは複数の他の活性成分とを含有する。本開示の化合物と、任意選択で、１つまたは複数の他の活性成分とはまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとしても投与することができる。
経口投与のための固体投薬形態（例えば、カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤および顆粒剤）において、本開示の１または複数の化合物は、１または複数の薬学的に受容可能なキャリア（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア）、湿潤剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、アガー－アガー、炭酸カルシウム、ポテトもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶液抑制因子（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、パラフィン）、吸収加速剤（例えば、四級アンモニウム化合物）、加湿剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ）、潤滑剤（例えば、滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤およびこれらの混合物を含む）と共に混合され得る。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、医薬製剤（組成物）はまた、緩衝剤も含み得る。また、同様の種類の固形組成物も、例えば、ラクトースまたは乳糖のほか、高分子量ポリエチレングリコールを含む、１つまたは複数の賦形剤を使用して、軟充填ゼラチンカプセル中および硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として利用することができる。
薬学的組成物の経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分に加え、液体投薬形態は、当該分野で一般に用いられる不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒が挙げられる）、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（例えば、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含み得る。不活性な希釈剤に加え、経口用組成物はまた、例えば、加湿剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤、保存剤およびこれらの組み合わせを含む佐剤を含み得る。
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー－アガー、トラガント、およびこれらの組み合わせを含む懸濁剤を含有し得る。
微生物の作用および／または増殖の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびソルビン酸フェノールを含む、種々の抗細菌剤および抗真菌剤を組み入れることにより確保することができる。
ある特定の実施形態では、例えば、糖、または塩化ナトリウムを含む等張化剤を組成物中に組み入れることも望ましいと考えられる。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の遅延も、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含む、吸収を遅延させる作用因子を組み入れることにより、もたらすことができる。
投薬レジメンは、本開示の１つまたは複数の作用因子の作用を修飾する種々の要因を考慮して主治医によって決定されることが理解される。赤血球の形成を促進するＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの場合では、種々の要因として、患者の赤血球数、ヘモグロビンレベル、所望の標的赤血球数、患者の年齢、患者の性別、および患者の食餌、赤血球レベルの低下に寄与し得る任意の疾患の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的要因が挙げられ得るがこれらに限定されない。他の公知の活性の作用因子の、最終組成物への添加もまた、投与量に影響を及ぼし得る。進行は、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、網状赤血球レベル、および造血プロセスの他の指標のうちの１つまたは複数の定期的な評価によりモニタリングすることができる。
特定の実施形態では、本開示はまた、本開示の１つまたは複数の作用因子のインビボ産生のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、上に列挙したような障害のうち１つまたは複数を有する細胞または組織中に作用因子配列を導入することによってその治療作用を達成する。作用因子配列の送達は、例えば、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いることによって達成され得る。本開示の１つまたは複数の作用因子配列の好ましい治療的送達は、標的化されたリポソームの使用である。
本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、ＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）が挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスもしくはトリのレトロウイルスの誘導体であり得る。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多数のさらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択マーカーについての遺伝子を移送または組み込み得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって、標的特異的とされ得る。好ましい標的化は、抗体を用いて達成される。当業者は、本開示の１つまたは複数の作用因子を含むレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノム中に挿入され得るか、または、ウイルスエンベロープに付着され得ることを認識する。
あるいは、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、レトロウイルスの構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をコードするプラスミドを用いて直接トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、次いで、関心のある遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
本開示の１つまたは複数の作用因子のための別の標的化送達システムは、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む）が挙げられる。特定の実施形態において、本開示の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして有用な人工の膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンが、水性の内部に封入され得、そして、生物学的に活性な形態で細胞へと送達され得る［Ｆｒａｌｅｙら（１９８１年）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．、６巻：７７頁］。リポソームビヒクルを用いた効率的な遺伝子移入のための方法は当該分野で公知である［Ｍａｎｎｉｎｏら（１９８８年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８］。
リポソームの組成は通常、リン脂質の組み合わせであり、ステロイド（例えば、コレステロール）を含み得る。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。また、他のリン脂質または他の脂質であって、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシド）、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含むリン脂質または脂質も使用することができる。例えば、器官特異性、細胞特異性および細胞小器官特異性に基づいたリポソームの標的化もまた可能であり、当該分野で公知である。
参照による組込み
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、具体的かつ個別に参考として援用されると示されるかのように、その全体が本明細書に参考として援用される。
本主題の特定の実施形態が考察されてきたが、上記明細書は、例示的であり、限定的なものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を精査すれば、多くの変更が当業者に明らかとなる。本発明の完全な範囲は、その等価物の完全な範囲と共に特許請求の範囲を、そして、このような変更と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。
本発明は、ここで、一般的に記載されるが、単に特定の実施形態および本発明の実施形態を例示する目的のために含められ、本発明を限定することは意図されない以下の実施例を参照するとより容易に理解される。
実施例１．ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の生成
出願人は、それぞれ、リンカーが細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に位置付けられたＦｃドメインに融合されたヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡＬＫ４の細胞外ドメインを含む可溶性ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ異種複合体を構築した。個々の構築物を、それぞれＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。
ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ異種複合体の形成を促進するための方法は、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃまたはＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体の複合体とは反対に非対称異種複合体の形成を誘導するためにＦｃドメインのアミノ酸配列に変更を導入する。Ｆｃドメインを使用して非対称相互作用ペアを作製するための多くの異なるアプローチが、本開示において記載される。
１つのアプローチでは、それぞれ配列番号３９～４１および４２－４４のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドは、それぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー：
Figure 0007055637000033
 を利用する。
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃポリペプチド配列（配列番号３９）は以下に示される：
Figure 0007055637000034
リーダー（シグナル）配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリジンで置き換える）が、上の二重下線で示されるようにＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のＦｃドメインに導入され得る。配列番号３９のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
このＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は以下の核酸配列（配列番号４０）にコードされる：
Figure 0007055637000035
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
Figure 0007055637000036
 ＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４２）の相補的形態は、以下の通りである：
Figure 0007055637000037
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。上記配列番号３９および４１のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドでヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアスパラギン酸で置き換える）が、上の二重下線で示されるようにＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４２のアミノ酸配列は、任意選択で、リジン（Ｋ）がＣ末端に付加されて提供されてもよい。
このＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質は以下の核酸（配列番号４３）にコードされる：
Figure 0007055637000038
成熟ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号４４）は、以下の通りであり、任意選択で、リジン（Ｋ）がＣ末端に付加されて提供されてもよい。
Figure 0007055637000039
それぞれ、配列番号４１および配列番号４４のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞系、から共発現させ、精製して、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを含む異種複合体が得られ得る。
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進する別のアプローチでは、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４５～４６および４７～４８のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドは、それぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号３８）
を利用する。
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃポリペプチド配列（配列番号４５）は以下に示される：
Figure 0007055637000040
リーダー（シグナル）配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合タンパク質のＦｃドメインに導入され得る。配列番号４５のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の通りである：
Figure 0007055637000041
ＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４７）の相補的形態は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
Figure 0007055637000042
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。上記配列番号４５および４６のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドでヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換が、上の二重下線で示されるようにＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４７のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
成熟ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質配列は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
Figure 0007055637000043
それぞれ、配列番号４６および配列番号４８のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを含む異種複合体が得られ得る。
種々のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーの３つまたはこれ超を、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了させることができた。
実施例２．ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体と比較したＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ベースの結合アッセイを使用して、上記で記載したＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体複合体およびＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用するシステムに独立に捕捉させた。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上を流動させた。結果を、下記の表にまとめ、この表では、有効なリガンドトラップを最もよく示すリガンドのオフ速度（ｋｄ）を、グレーの影で表示する。
Figure 0007055637000044
これらの比較結合データは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体またはＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体と比べて結合プロファイル／結合選択性の変更を有することを実証する。、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、ホモ二量体と比較してアクチビンＢへの結合の増強を提示し、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体について観察されるようなアクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１への強い結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３への結合の実質的な低減を呈示する。特に、ＢＭＰ９は、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体に対して低度のアフィニティを提示するか、または観察可能なアフィニティを提示しないが、このリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体には強く結合する。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と同様に、ヘテロ二量体は、ＢＭＰ６への中レベルの結合を保持する。図６を参照。
加えて、Ａ－２０４レポーター遺伝子アッセイを使用して、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体の、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９によるシグナル伝達に対する効果を評価した。細胞系：ヒト横紋筋肉腫（筋肉に由来する）である。レポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２である（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８年、ＥＭＢＯ、１７巻：３０９１～３１００頁において記載されている通り）。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦ－β応答性遺伝子（ＰＡＩ－１遺伝子）内に存在するので、このベクターは、Ｓｍａｄ２および３を介してシグナル伝達する因子のために一般に使用される。例示的なＡ－２０４レポーター遺伝子アッセイを、下記に概括する。
１日目：Ａ－２０４細胞を、４８ウェルプレートに分注する。
２日目：Ａ－２０４細胞に、１０ｕｇのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２またはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０ｕｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１ｕｇ）およびＦｕｇｅｎｅをトランスフェクトする。
３日目：因子（培地＋０．１％のＢＳＡに希釈した）を添加する。阻害剤は、細胞に添加する前に約１時間にわたり因子と共にプレインキュベートする必要がある。約６時間後、細胞をＰＢＳですすぎ、次いで、溶解させる。
上記の工程の後、出願人は、ルシフェラーゼアッセイを実施した。
このアッセイでは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体のいずれも、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８の強力な阻害剤であることが決定された。特に、図１３に例示される比較ホモ二量体／ヘテロ二量体ＩＣ５０データにおいて見ることができるように、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と同様にアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害する。しかし、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０シグナル伝達経路のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体による阻害は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較して著明に低減した。このデータは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対しては、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体のいずれもが、強い結合を提示するが、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較してＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体に対して著明に低減されたアフィニティを有することを観察した上記で論じた結合データと符合する。
したがって、まとめると、これらのデータは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較してアクチビンＢ、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを実証する。したがって、このような選択的アンタゴニズムが有利なある特定の適用では、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体より有用である。例として、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のうちの１つまたは複数に対するアンタゴニズムは保持するが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ６のうちの１つまたは複数に対するアンタゴニズムは最小化することが所望される治療適用が挙げられる。
（実施例３）
マウスにおける、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較したＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の活性プロファイル
ホモ二量体複合体およびヘテロ二量体複合体を、インビボにおけるそれらの活性プロファイルの差違について調査するためにマウスにおいて調べた。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体（３または１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（リン酸緩衝生理食塩液、ＰＢＳ）を、およそ１０週齢で始めて、毎週２回、４週間にわたり皮下投与した（群１つ当たりのマウスのｎ＝９）。ＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体については、表面プラズモン共鳴により決定したときに、無細胞条件下ではリガンドに高アフィニティで結合できなかったため、インビボでは試験しなかった。研究評価項目は、体重；ベースラインおよび研究完了時（４週間後）において核磁気共鳴（ＮＭＲ）により決定した場合の総除脂肪量および総脂肪量；ベースラインおよび４週間後において二重エネルギーｘ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）により決定した場合の総骨ミネラル密度；ならびに４週間後において決定される腓腹筋、大腿直筋、および胸筋の重量を含んだ。
Figure 0007055637000045
研究結果を、上記の表にまとめる。予測された通り、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体は、身体組成の顕著な変化であって、多くがＧＤＦ８およびアクチビン阻害の公知の効果と符合する変化を引き起こした。野生型マウスの、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体による処置は、研究の経過によって体重増加をビヒクル処置対照と比較して２倍を超えて倍加させた。この正味の体重増加には、ビヒクルと比較して、総除脂肪量および総骨ミネラル密度の著明な増大、ならびに総脂肪量の著明な低減が随伴した。除脂肪量（典型的には、マウスの体重の約７０％）は、脂肪量（典型的には、体重の約１０％）よりはるかに大きいため、除脂肪組織および脂肪組織の正規化（パーセンテージベースの）変化は、絶対変化のそれらの対応関係とは異なることを認識されたい。腓腹筋、大腿筋、および胸筋を含む試験した個々の骨格筋は全て、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体による処置の経過により重量がビヒクル対照と比較して著明に増大した。
ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、２つの複合体の差示的なリガンド選択性にもかかわらず、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体の効果と酷似するある特定の効果をもたらした。上記の表に示した通り、１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルのＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体によるマウスの処置は、列挙した全ての評価項目について、同じ用量レベルのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体の効果に匹敵するか、これにほぼ匹敵するか、またはこれを超えた。３ｍｇ／ｋｇのＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の効果は、いくつかの評価項目について、１０ｍｇ／ｋｇと比較してわずかに減弱されたので、用量－効果関係についての証拠がもたらされる。
したがって、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、骨格筋および骨に対する有益な同化効果、ならびに脂肪組織に対する異化効果であって、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体の効果と酷似する効果を及ぼす。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と異なり、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０には低アフィニティまたは一過性の結合を呈示するに過ぎないので、血管新生などのこれらのリガンドにより媒介されるプロセスに対しては、ほとんど～全く共時的な阻害を及ぼさないはずである。この新規の選択性は、例えば、筋肉および骨に対する刺激性効果、ならびに脂肪に対する阻害性効果は必要とするが、血管新生の変更は必要としない患者の処置において有用である。
（実施例４）
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体による処置は、腎線維症および炎症を抑制し、腎傷害を軽減する
実施例２で記載した、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の、腎疾患に対する効果を、マウス片側尿管閉塞モデルにおいて評価した。例えば、ＫｌａｈｒおよびＭｏｒｒｉｓｓｅｙ（２００２年）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２８３巻：Ｆ８６１～Ｆ８７５頁を参照されたい。
１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス２４匹の、腎下極の水準に左片側尿管結紮を２回施した。３日後、８匹のマウスを安楽死させ、腎臓を個々の動物から採取して、腎傷害について評価した。残りのマウスを、以下の２つの群に無作為化した：ｉ）８匹のマウスは、手術３日後、７日後、１０日後、および１４日後に、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注入した、ｉｉ）８匹のマウスは、手術３日後、７日後、１０日後、および１４日後に、ビヒクル対照であるリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を皮下注入した。１７日目に、関連のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓに従い、両群ともに屠殺した。組織学解析（Ｈ＆Ｅ、およびマッソントリクローム染色）のために、ＵＵＯ腎および対側腎の両方から、個々の動物の腎臓の半分を回収し、腎臓の４分の１を、ＲＮＡ抽出（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、ＩＬ）のために使用した。
ＵＵＯ腎試料に対する遺伝子発現解析を実施して、多様な遺伝子のレベルについて評価した。ＱＲＴ－ＰＣＲを、ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ（商標）Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＣＡ）上で実施して、多様な線維化遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、ＰＡＩ－１、ＣＴＧＦ、およびａ－ＳＭＡ）、炎症遺伝子（ＴＮＦａおよびＭＣＰ１）、サイトカイン（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびアクチビンＡ）、および腎傷害遺伝子（ＮＧＡＬ）の発現について評価した。図１４を参照されたい。マウスの、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体による処置は、線維化遺伝子および炎症遺伝子の発現を著明に抑制し、ＴＧＦβ１／２／３の上方調節を阻害し、腎傷害を軽減した。組織学データは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体による処置が、ＵＵＯモデルにおいて、腎線維症を著明に阻害し、腎傷害を軽減することを確認した。
まとめると、これらのデータは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体による処置が、腎線維症および腎炎症を抑制し、腎傷害を軽減することを実証する。さらに、例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンドのアンタゴニスト、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体のアンタゴニスト、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ下流のシグナル伝達メディエーター（例えば、Ｓｍａｄ）のアンタゴニスト、およびＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢに関連したＴＧＦβスーパーファミリー共受容体のアンタゴニストを含む他のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが腎臓疾患の処置または予防に有用であり得ることを指し示す。

Claims (21)

  1. ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む組み換えヘテロ多量体であって、
    前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、
    ａ）配列番号９のアミノ酸２４で始まり、かつ
    ｂ）配列番号９のアミノ酸１２６で終わる、
    ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
    前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、
    ａ）配列番号１のアミノ酸２０で始まり、かつ
    ｂ）配列番号１のアミノ酸１３４で終わる、
    ポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
    前記ＡＬＫ４ポリペプチドが異種ドメインをさらに含む融合タンパク質であり、前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが異種ドメインをさらに含む融合タンパク質であり、前記異種ドメインが各々Ｆｃ免疫グロブリンドメインを含み、
    前記ヘテロ多量体がアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１に結合できる、組換えヘテロ多量体。
  2. 前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、
    ａ）配列番号９のアミノ酸２４で始まり、かつ
    ｂ）配列番号９のアミノ酸１２６で終わる、
    ポリペプチドと少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヘテロ多量体。
  3. 前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、
    ａ）配列番号１のアミノ酸２０で始まり、かつ
    ｂ）配列番号１のアミノ酸１３４で終わる、
    ポリペプチドと少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のヘテロ多量体。
  4. 前記ＡＬＫ４ポリペプチドに融合したＦｃ免疫グロブリンドメインおよび／または前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに融合したＦｃ免疫グロブリンドメインが、ヘテロ二量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾、ならびに／または、ホモ二量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載のヘテロ多量体。
  5. 前記異種ドメインが、ＩｇＧ免疫グロブリン由来のＦｃ免疫グロブリンドメインを含む、請求項１または４に記載のヘテロ多量体。
  6. 前記融合タンパク質が、前記ＡＬＫ４ドメインと前記異種ドメインとの間に位置付けられるリンカードメインおよび／または前記ＡｃｔＲＩＩＢドメインと前記異種ドメインとの間に位置付けられるリンカードメインをさらに含む、請求項１または４に記載のヘテロ多量体。
  7. 前記ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸からなる群から選択される、１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
  8. 前記ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、グリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣細胞系から得ることができるグリコシル化パターンを有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
  9. 前記ヘテロ多量体が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０およびＧＤＦ３からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する、請求項１～８のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
  10. 前記ヘテロ多量体が、細胞ベースのアッセイにおいてリガンドシグナル伝達を阻害し、ここで、前記リガンドはアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０およびＧＤＦ３からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
  11. 前記ヘテロ多量体が、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
  12. 前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
  13. 前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
  14. 請求項１～１３のいずれか１項に記載のヘテロ多量体および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬調製物。
  15. 前記医薬調製物が実質的に発熱物質非含有である、請求項１４に記載の医薬調製物。
  16. 前記医薬調製物が、追加の活性剤をさらに含む、請求項１４または１５に記載の医薬調製物。
  17. 前記医薬調製物が、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体を含む、かつ／または前記医薬調製物が、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の医薬調製物。
  18. 筋力低下または筋成長不全と関連する障害を有する患者を処置するのに使用するための組成物であって、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体、または、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の医薬調製物の有効量を含む、組成物。
  19. 前記患者が、筋委縮症、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋委縮性側索硬化症、がんまたはがん治療と関連する悪液質からなる群から選択される障害を有する、請求項１８に記載の組成物。
  20. 神経変性と関連する障害を有する患者を処置するのに使用するための組成物であって、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体、または、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の医薬調製物の有効量を含む、組成物。
  21. 前記障害が、筋萎縮性側索硬化症である、請求項２０に記載の組成物。
JP2017552156A 2015-04-06 2016-04-06 ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用 Active JP7055637B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021069064A JP2021104058A (ja) 2015-04-06 2021-04-15 ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562143579P 2015-04-06 2015-04-06
US62/143,579 2015-04-06
US201562220836P 2015-09-18 2015-09-18
US62/220,836 2015-09-18
PCT/US2016/026269 WO2016164497A1 (en) 2015-04-06 2016-04-06 Alk4:actriib heteromultimers and uses thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021069064A Division JP2021104058A (ja) 2015-04-06 2021-04-15 ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2018516240A JP2018516240A (ja) 2018-06-21
JP2018516240A5 JP2018516240A5 (ja) 2019-05-16
JP7055637B2 true JP7055637B2 (ja) 2022-04-18

Family

ID=57015141

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017552156A Active JP7055637B2 (ja) 2015-04-06 2016-04-06 ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用
JP2021069064A Ceased JP2021104058A (ja) 2015-04-06 2021-04-15 ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021069064A Ceased JP2021104058A (ja) 2015-04-06 2021-04-15 ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用

Country Status (15)

Country Link
US (5) US10196434B2 (ja)
EP (2) EP3929211A1 (ja)
JP (2) JP7055637B2 (ja)
KR (1) KR20180002660A (ja)
CN (1) CN107709357B (ja)
AU (2) AU2016246703B2 (ja)
BR (1) BR112017021525A2 (ja)
CA (1) CA2981831A1 (ja)
EA (1) EA201792217A1 (ja)
ES (1) ES2882105T3 (ja)
HK (2) HK1248734A1 (ja)
MA (2) MA41919A (ja)
MX (2) MX2017012845A (ja)
SG (1) SG11201708176UA (ja)
WO (1) WO2016164497A1 (ja)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
KR20170141215A (ko) 2015-04-06 2017-12-22 악셀레론 파마 인코포레이티드 싱글-암 유형 i과 유형 ii 수용체 융합 단백질들 및 이들의 용도
MA54328A (fr) 2015-04-06 2021-10-06 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères de récepteur de type i et de type ii de la superfamille de tgf-bêta et leurs utilisations
RU2733492C2 (ru) 2015-04-22 2020-10-02 Байоджен Ма Инк. Новые гибридные ActRIIB белки-ловушки лигандов для лечения заболеваний, связанных с мышечной атрофией
US20170240639A1 (en) * 2016-02-22 2017-08-24 Acceleron Pharma Inc. Actrii antagonists for use in increasing immune activity
US20170306027A1 (en) 2016-04-06 2017-10-26 Acceleron Pharma Inc. Alk7 antagonists and uses thereof
SI3496739T1 (sl) 2016-07-15 2021-06-30 Acceleron Pharma Inc. Sestave, ki zajemajo polipeptide actriia, za uporabo pri zdravljenju pljučne hipertenzije
US11440949B2 (en) 2016-10-05 2022-09-13 Acceleron Pharma Inc. TGF-beta superfamily type I and type II receptor heteromultimers and uses thereof
CA3039074A1 (en) * 2016-10-05 2018-04-12 Acceleron Pharma Inc. Compositions and method for treating kidney disease
WO2018067874A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 Acceleron Pharma Inc. Variant actriib proteins and uses thereof
JP7219705B2 (ja) 2016-10-05 2023-02-08 アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用
JOP20190085A1 (ar) * 2016-10-20 2019-04-17 Biogen Ma Inc طرق علاج الضمور العضلي ومرض العظام باستخدام بروتينات احتجاز مركب ترابطي actriib هجين حديثة
EP3606562A4 (en) * 2017-04-03 2020-11-11 Acceleron Pharma Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF SPINAL MUSCLE ATROPHY
KR20230002391A (ko) * 2020-03-13 2023-01-05 악셀레론 파마 인코포레이티드 신장 질환 또는 병태를 치료하기 위한 단일-가지 actriia 및 actriib 이종다량체 및 치료 방법
MX2022016243A (es) * 2020-06-17 2023-03-08 Acceleron Pharma Inc Antagonistas de actrii-alk4 y métodos para el tratamiento contra insuficiencia cardíaca.
WO2022104071A2 (en) * 2020-11-13 2022-05-19 The Jackson Laboratory Therapeutics targeting transforming growth factor beta family signaling
US20240197902A1 (en) * 2021-03-10 2024-06-20 Acceleron Pharma Inc. Actrii-alk4 antagonists and methods of treating heart failure
EP4305052A1 (en) * 2021-03-10 2024-01-17 Acceleron Pharma Inc. Actrii-alk4 antagonists and methods of treating heart failure

Family Cites Families (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3382562D1 (de) 1982-09-24 1992-06-25 Us Health Wiederherstellung von gewebe bei tieren.
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5707796A (en) 1990-06-11 1998-01-13 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5763177A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
EP1493825A3 (en) 1990-06-11 2005-02-09 Gilead Sciences, Inc. Method for producing nucleic acid ligands
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US7592428B1 (en) 1992-11-17 2009-09-22 Ludwig Institute For Cancer Research Antibodies which bind specifically to activin receptor like kinases
DE69332779T2 (de) * 1992-11-17 2003-10-23 Ludwig Institut For Cancer Research, Padington Aktivin-rezeptor-ähnliche kinasen, proteine mit serin/threonin kinase domänen und deren anwendungen
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
AU716893B2 (en) 1995-04-11 2000-03-09 General Hospital Corporation, The Reverse two-hybrid systems
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6699843B2 (en) 1995-06-07 2004-03-02 Gilead Sciences, Inc. Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6011577A (en) 1997-06-30 2000-01-04 Polaroid Corporation Modular optical print head assembly
JP2001513982A (ja) 1997-08-29 2001-09-11 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド フォリスタチン−３
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
US6335155B1 (en) 1998-06-26 2002-01-01 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapidly identifying small organic molecule ligands for binding to biological target molecules
US6927044B2 (en) 1998-09-25 2005-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-1 receptor based cytokine traps
WO2000039585A1 (en) 1998-12-28 2000-07-06 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Identifying small organic molecule ligands for binding
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
BR0008188A (pt) 1999-01-21 2002-02-13 Metamorphix Inc Inibidores de fator de diferenciação de crescimento e usos para os mesmos
DE60042021D1 (de) 1999-07-29 2009-05-28 Gilead Sciences Inc Nukleinsäureliganden für den hepatozytischen wachstumsfaktor/dispersionsfaktor (hgf/sf) und seines c-met rezeptors
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
PT1354034E (pt) 2000-11-30 2008-02-28 Medarex Inc Roedores transgénicos transcromossómicos para produção de anticorpos humanos
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2005025601A1 (en) 2003-09-15 2005-03-24 Monash University Follistatin isoforms and uses thereof
DK1670511T3 (da) 2003-09-15 2009-11-23 Res Dev Foundation Cripto-antagonisme af activin- og TGF-B-signalering
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2360186B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
ES2426005T3 (es) 2004-07-23 2013-10-18 Acceleron Pharma Inc. Polipéptidos del receptor ACTRII, procedimientos y composiciones
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
CN105001320A (zh) 2005-11-23 2015-10-28 阿塞勒隆制药公司 Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
JP2009536527A (ja) 2006-05-09 2009-10-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 最適化されたスキャフォールドを備えた結合ポリペプチド
EP2035456A1 (en) 2006-06-22 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
WO2008030367A2 (en) 2006-09-01 2008-03-13 The General Hospital Corporation Selective myostatin inhibitors
AU2007332819A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Acceleron Pharma Inc. Uses of cerberus, coco and derivatives thereof
US20100035918A1 (en) 2007-01-30 2010-02-11 Biogen Idec Ma Inc Imidazolone Compounds and Methods of Making and Using the Same
TW202021980A (zh) 2007-02-02 2020-06-16 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ActRIIB的變體與其用途
TWI454479B (zh) 2007-03-06 2014-10-01 Amgen Inc 變異之活動素受體多肽及其用途
EP2574671B1 (en) 2007-03-19 2016-02-03 National Research Council Of Canada Antagonists of ligands and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
TWI748373B (zh) 2008-08-14 2021-12-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 使用gdf阱以增加紅血球水平
CA2737271C (en) 2008-09-17 2020-06-23 National Research Council Of Canada Hetero-multivalent binding agents for members of the tgf.beta. superfamily
LT2370463T (lt) 2008-11-26 2016-12-12 Amgen Inc. Stabilizuotas aktivino iib receptoriaus variantas
EP2387412A4 (en) * 2009-01-13 2013-04-03 Acceleron Pharma Inc METHODS FOR INCREASING ADIPONECTIN
EP3805259A1 (en) 2009-06-12 2021-04-14 Acceleron Pharma Inc. Truncated actriib-fc fusion proteins
CA2781519A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
FR2951408B1 (fr) 2009-10-15 2012-01-13 Renault Sa Cadre moteur pour moteur electrique de vehicule automobile
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
AR080794A1 (es) * 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
WO2012024242A1 (en) * 2010-08-16 2012-02-23 Amgen Inc. Antibodies that bind myostatin, compositions and methods
UY33827A (es) * 2010-12-22 2012-07-31 Abbott Lab Proteínas de unión a media-inmunoglobulina y sus usos
CN102850458B (zh) 2011-06-28 2014-10-01 华博生物医药技术（上海）有限公司 新型重组双功能融合蛋白及其制法和用途
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
EP2831105B1 (en) 2012-03-28 2017-08-09 The Board of Regents of The University of Texas System Tgf type ii-type iii receptor fusions
JP6631865B2 (ja) 2014-08-11 2020-01-15 日本化薬株式会社 ＴＧＦβ阻害機能を持つキメラタンパク質
WO2016090035A2 (en) 2014-12-02 2016-06-09 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Modulators of activin and methods for modulating immune responses and t follicular helper cells
WO2016154601A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Acceleron Pharma Inc. Follistatin-related fusion proteins and uses thereof
MA54328A (fr) 2015-04-06 2021-10-06 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères de récepteur de type i et de type ii de la superfamille de tgf-bêta et leurs utilisations
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
KR20170141215A (ko) 2015-04-06 2017-12-22 악셀레론 파마 인코포레이티드 싱글-암 유형 i과 유형 ii 수용체 융합 단백질들 및 이들의 용도
RU2733492C2 (ru) 2015-04-22 2020-10-02 Байоджен Ма Инк. Новые гибридные ActRIIB белки-ловушки лигандов для лечения заболеваний, связанных с мышечной атрофией
WO2016205370A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Methods of using activin receptor iib-based proteins
US20200231652A1 (en) 2015-08-31 2020-07-23 National Research Council Of Canada Tgf-b-receptor ectodomain fusion molecules and uses thereof
US20170240639A1 (en) 2016-02-22 2017-08-24 Acceleron Pharma Inc. Actrii antagonists for use in increasing immune activity
US20170306027A1 (en) 2016-04-06 2017-10-26 Acceleron Pharma Inc. Alk7 antagonists and uses thereof
WO2018009624A1 (en) 2016-07-07 2018-01-11 Acceleron Pharma Inc. Tgf-beta superfamily heteromultimers and uses thereof
WO2018009732A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-activin a antibodies and methods of use thereof for treating pulmonary arterial hypertension
JP7219705B2 (ja) 2016-10-05 2023-02-08 アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用
JOP20190085A1 (ar) 2016-10-20 2019-04-17 Biogen Ma Inc طرق علاج الضمور العضلي ومرض العظام باستخدام بروتينات احتجاز مركب ترابطي actriib هجين حديثة

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊ．，２００８年，Ｖｏｌ．５５，Ｎｏ．１，ｐ．１１－２１
Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ａ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２０１３年，Ｖｏｌ．６８，Ｎｏ．１０，ｐ．１１８１－１１９２

Also Published As

Publication number Publication date
CA2981831A1 (en) 2016-10-13
US20190100570A1 (en) 2019-04-04
CN107709357A (zh) 2018-02-16
WO2016164497A1 (en) 2016-10-13
EP3280726A4 (en) 2018-10-31
KR20180002660A (ko) 2018-01-08
MX2017012845A (es) 2018-07-06
US20190218272A1 (en) 2019-07-18
EP3280726B1 (en) 2021-06-02
SG11201708176UA (en) 2017-11-29
JP2021104058A (ja) 2021-07-26
EP3280726A1 (en) 2018-02-14
AU2016246703A8 (en) 2017-11-23
MA41919A (fr) 2018-02-13
CN107709357B (zh) 2022-12-06
US10196434B2 (en) 2019-02-05
US11279746B2 (en) 2022-03-22
HK1250374A1 (zh) 2018-12-14
MX2022010732A (es) 2022-09-23
EP3929211A1 (en) 2021-12-29
US10738098B2 (en) 2020-08-11
US20210163569A1 (en) 2021-06-03
AU2021200071A1 (en) 2021-03-18
MA55044A (fr) 2021-12-29
US20160289292A1 (en) 2016-10-06
US20220242927A1 (en) 2022-08-04
AU2016246703B2 (en) 2021-02-04
AU2016246703A1 (en) 2017-10-26
EA201792217A1 (ru) 2018-04-30
BR112017021525A2 (pt) 2018-07-03
ES2882105T3 (es) 2021-12-01
JP2018516240A (ja) 2018-06-21
HK1248734A1 (zh) 2018-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7055636B2 (ja) ＡＬＫ７：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用
JP7055637B2 (ja) ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用
JP7220141B2 (ja) 肺高血圧症を処置するための組成物および方法
JP6810702B2 (ja) シングルアームｉ型およびｉｉ型受容体融合タンパク質およびその使用
US12024563B2 (en) ALK7 antagonists and uses thereof
JP7058606B2 (ja) 増加した免疫活性において使用するためのａｃｔｒｉｉアンタゴニスト
JP2022084709A (ja) 腎臓疾患を治療するための組成物および方法
JP2021526835A (ja) 二機能性および三機能性融合タンパク質およびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190405

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190405

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20200131

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200213

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200420

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200813

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20201215

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210415

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20210415

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20210422

C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21

Effective date: 20210423

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20210611

C211 Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211

Effective date: 20210615

C22 Notice of designation (change) of administrative judge

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22

Effective date: 20220105

C23 Notice of termination of proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23

Effective date: 20220216

C03 Trial/appeal decision taken

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03

Effective date: 20220317

C30A Notification sent

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012

Effective date: 20220317

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220406

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7055637

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D04