KR100742313B1 - 신규한 혈소판 유래 성장 인자(ｐｄｇｆ) ｂ 폴리펩타이드및 이의 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) B 폴리펩타이드 및 이의 유전자에 관한 것으로, 인간의 PDGF B 보다 상처 치유효과가 뛰어난 신규의 PDGF 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 또한 상기 신규의 PDGF B 단백질을 포함하는 세포의 증식, 발생, 분화, 창상치유, 퇴행성 신경질환, 허혈성 신경질환 또는 신경손상 질환 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

PDGF, 상처치유

Description

신규한 혈소판 유래 성장 인자(ＰＤＧＦ) Ｂ 폴리펩타이드 및 이의 유전자{New gene and polypeptides of platelet derived growth factor B}

도 1은 신규한 혈소판 유래 성장 인자 폴리펩타이드를 찾기 위한 개략적인 모식도이다.

도 2는 성숙한 사슴의 혈소판 유래 성장 인자 타입 B 유전자의 전기영동 사진을 보인다.

도 3은 표준 폴리펩타이드와 녹용에서 추출한 PDGF B의 전기영동 비교사진이다. 레인M은 바이오 래드(Bio-Rad)의 표준 폴리펩타이드, 레인1은 유도(induction) 전에 pET 28(a)(+)벡터 샘플, 레인2는 유도 후 pET 28(a)(+)벡터 샘플, 레인3-4는 유도 전 PDGF B 샘플, 레인5-6은 유도 후 PDGF B의 샘플이고, 레인7은 정제된 폴리펩타이드(M)이다.

도 4는 녹용으로부터 분리된 PDGF B의 cDNA 전체서열을 보인다. 개시코돈으로 ATG로부터 시작해서 종결코돈인 TAG를 가진다. 이들은 완전히 발현될 수 있는 729개의 전장의 전 형태를 갖는다. 밑줄 친 AGC로 시작해서 ACC로 끝나는 부분이 성숙된 형태로 327 핵산서열로 이루어져 있고 이것을 번역하였을 때 111개의 아미노산 서열로 이루어진다.

도 5는 녹용 PDGF B 아미노산 서열 및 PDGF B 유전자 부분을 나타낸다.

도 6은 녹용 PDGF B유전자의 인간 PDGF B와의 상동성을 비교한 결과이다.

도 7은 녹용 PDGF B 단백질의 인간 PDGF B 단백질의 상동성을 비교한 결과이다.

도 8은 손상된 인간의 섬유아세포에 녹용의 PDGF B와 인간의 PDGF B를 처리 하였을 때 치유효과의 비교사진이다. P는 녹용으로 분리되어진 PDGF 타입 B 1, 10, 100ng/ml씩 처리구이고, s는 인간의 PDGF B(시그마) 1, 10, 100ng/ml씩 처리구이다.

도 9는 손상된 인간의 섬유아세포에 PDGF 타입 B에 의한 회복 효과를 보인다. PDGF 타입 B를 각각 0, 1, 10, 100ng/ml씩 처리 하였다. P는 녹용으로 분리되어진 PDGF 타입 B 폴리펩타이드이고, s는 인간의 PDGF B(시그마) 폴리펩타이드이다.

도 10은 녹용으로부터 분리된 PDGF 타입 B를 손상된 인간의 섬유아세포에 처리하였을 때 회복 효과를 보인다. (A) 녹용 PDGF B를 처리한 후 24시간 후 (B) 녹용 PDGF B를 처리한 후 72시간 후.

도 11은 녹용 및 인간의 PDGF B에 의한 인산화를 보인다. (A) 상처를 안준 정상상태 이며 PDGF B를 처리하지 않은 세포 (B) PDGF B 처리후 24시간 후 (C) PDGF B 처리후 30분 (D) PDGF B 처리후 6시간후; M: 분자표준시료, P0: 녹용 PDGF 0 ng/ml 처리, P1: 녹용 PDGF 1 ng/ml처리, P10: 녹용 PDGF 10 ng/ml 처리, P100: 녹용 PDGF 100 ng/ml 처리,S0: 인간 PDGF 0 ng/ml 처리, S1: 인간 PDGF 1 ng/ml 처리, S10: 인간 PDGF 10 ng/ml 처리, S100: 인간 PDGF 100 ng/ml 처리.

혈소판 유래 성장 인자（Platelet derived growth factor, PDGF)는 세포의 증식이나 발생·분화, 창상치유, 나아가 암 악성화나 동맥 경화 등에 있어서 중요한 역할을 하고 있다. PDGF의 3가지 공지된 이량체 이소형태(isoform)는 각각 A , B 2 가지의 펩티드 쇄의 동종 또는 이종이량체의 조합물이다. PDGF의 3 가지 이량체 이소형태는 PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB이다. 최근에, 리 및 첸 등에 의해 새로운 타입의 PDGF C 및 D에 대한 보고가 있다(Xuri Li and Ulf Eriksson, Cytokine & Growth Factor reviews (2003) Vol. 14, pp91-93; Jingzhou Chen, Yu Han, Yu Ha, Chunxia Lin, Yisong Zhen, Xiaodong Song, Siyong Teng, Chen Chen, Yu Chen, Yinhui Zhang and Rutai Hui, Biochemical and Biophysical Research Communications (2005), Vol. 329, pp 976-983).

성장인자는 특정 수용체와 상호작용을 하는 호르몬 유사분자인 폴리펩타이드이며, 상처 치유 과정은 ⅰ) 세포 증식을 자극하는 분열 촉진 활성을 갖는 성장 인자,

ⅱ) 맥관 형성 활성을 가져서 새로운 혈관의 성장을 자극하는 성장 인자,

ⅲ) 염증 세포 및 섬유아세포를 상처로 유인하는 주화성 활성을 갖는 성장 인자,

ⅳ) 이웃 세포에 의하여 사이토카인 및 성장 인자의 합성에 영향을 미치는 성장 인자,

ⅴ) 세포외 기질의 생성 및 분해를 초래하는 성장 인자에 의하여 제어되고 조절된다.

PDGF는 이 중에서 혈청에는 존재하지만 혈장에는 존재하지 않는 주요한 분열 촉진성 성장 인자이다(Antoniades 등, Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA, vol. 72 (1975), 2635-2639; 및 Ross와 Vogel, Cell, vol. 14 (1978), 203-210). 이것은 섬유아세포의 생체내 증식을 자극하는데 혈청이 혈장보다 우수하다는 관찰에서 밝혀졌다(Balk 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, vol. 70 (1973), 675-679). PDGF는 결합 조직 뿐만 아니라 대부분의 중배엽 유래 세포에 대한 분열 촉진제이며(Pierce 및 Mustoe, Annual Review of Medicine, vol. 46 (1995), 467-481), 또한 호중성 백혈구, 단핵구 및 섬유아세포에 대한 주화성 인자로 작용한다(Lepisto 등, Eur. Surg. Res., vol. 26 (1994), 267-272). 순환하는 단핵구 및 섬유아세포는 PDGF의 주화성 활성에 의하여 상처로 이동하는데, 이들은 조직 대식 세포로 성숙하고 스스로 PDGF를 분비할 수 있다. 주화성 효과 이외에, PDGF-BB는 인간의 말초 혈액 단핵구에서 조직 인자인 응고 캐스케이드 개시자의 발현을 유도한다는 것이 알려져 있다(Ernofsson M., 및 Siegbahn, A., Thromb. Res., vol. 83 (1996), 307-320).

또한, PDGF는 세포외 기질 합성의 유도를 매개하여 히알루론산 및 피브로넥틴의 생성을 유도한다(Robson, M. C. Wound Rep. Reg., vol. 5 (1997), 12-17). 상처 재형성에서 중요한 단백질인 콜라게나제는 또한 PDGF에 대한 반응으로 생성된다(Steed, D. L. Surg. Clin. North Am., vol. 77 (1997), 575-586).

PDGF는 또한 종양 형성(tumorogenesis), 동맥경화증, 류마토이드 관절염, 폐섬유증, 골수섬유화증 또는 비정상적인 상처 치유와 같은 병적인 증상과 관련되고(Bornfeldt 등, Ann. NY Acad. Sci., vol. 766 (1995), 416-430; Heldin, C. H., FEBS Lett., vol. 410 (1997), 17-21) 골형성 세포의 증식을 자극하는 골 세포에 대한 분열촉진제로서 작용한다(Horner 등., Bone, vol. 19 (1996), 353-362).

따라서, PDGF는 세포배양조성물로 이용되고 있으며, PDGF 시그널을 제어하여 암 등의 질환을 치료하는 방법이 연구되고 있다. 실제로는, 치료약으로서 PDGF의 발현 억제제（예를 들면，일본특허공보 특개１０－５９８５０호 공보 참조）, PDGF와 PDGF 수용체 α와의 결합 저해제（예를 들면，일본특허공보 특표 평８－５０００１０호 참조），PDGF 수용체 α의 티로신 키나아제 저해제（예를 들면，일본특허공보 특표 ２００２－５１４２２８호 참조), 암세포에 특이적인 PDGF 시그널만을 선택적으로 억제할 수 있는 발현 억제 방법에 이용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 발현 억제 물질，발현 억제제, 및 암 치료제(한국 출원번호 2005-7008784 참조), 암 세포 전이 억제(한국 출원번호 2005-7014530 참조)방법 등이 개발되고 있다.

또한 PDGF는 IGF-I, IGF-II, VEGF 와 같은 성장인자, 또는 성장인자 수용체와 함께 상처 치료, 조직 공학, 피부 치환 및 피부 재생과 같은 화장용 및 치료적 처리 및 상피 세포 이동이 필요한 화상의 치료에 용도를 가질 수 있는 세포 이동 및/또는 증식을 촉진 또는 유도하기도 한다(한국 출원번호 2005-7014530 참조).

이러한, 신경성장인자 PDGF는 섬유아세포 유사분열 촉진물질(fibroblast mitogen)으로 알려져 왔으나 최근 배아와 성체의 뇌 신경에서 가장 많이 발현되는 것으로 알려졌으며 A와 B 모두 신경세포에서 분비된다

포유동물의 뇌는 신경줄기세포(neuronal stem cell)의 분열과 분화 및 생존과 사멸(apoptosis) 그리고 시냅스 형성 등 일련의 과정을 거쳐 체계적인 신경회로망(neural network)을 발생(development)함으로서 복잡한 기능을 수행할 수 있게 된다. 신경세포는 세포분화하고 시냅스를 형성하는 과정에서 신경성장인자와 같은 표적유래 생존인자(target-derived survival factor)를 받지 못하면 세포사멸하며 스트레스와 세포독성물질(cytotoxic agent)에 의한 세포사멸은 퇴행성뇌질환의 주요원인이 된다.

PDGF 는 신경성장인자(neurotrophic factor)로 신경재생의 기능을 가지고 있어 다양한 종류의 퇴행성 신경질환, 허혈성 신경질환 또는 신경손상 질환의 치료제로 쓰일 수 있다(한국출원번호 2002-044770 참조).

녹용(deer velvet antler)은 사슴에서 매년 재생되는 뼈 조직의 일종으로, 예로부터 자양 강장 및 면역 효과 증강을 목적으로 동양권에서는 널리 사용되어져 왔던 한약재의 일종이다. 국내 한의학계에서는 지금까지 연구 논문을 통해 녹용의 우수한 효과를 검증하여 왔다. 문헌적으로 신농본초경에서 허로, 양기부족, 자궁허냉, 붕루 등을 치료하여 자양 강장, 대보원기 등의 효과가 있다고 하였으며, 현대의 연구에서도 발육 촉진 작용, 조혈 작용, 강심 작용, 손상된 간에 대한 보호 작용, 간 조직 재생 및 촉진 작용, 간내 효소 활성화, 호르몬 대사 기능 개선 작용, 골다공증 치료 효과, 상처치료 효과 등을 보고하고 있다.

본 발명자들은 녹용에서 신규한 PDGF-B 유전자를 발견하고, 이를 발현시켜 상처난 일반 섬유아세포에 투여했을 때 상처가 빠르게 회복되었고, ERK 1/2의 인산화가 인간 PDGF-B를 이용한 경우보다 더 증가하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 녹용으로부터 신규한 PDGF 유전자를 탐색하고, 이를 발현하여 활성 폴리펩타이드를 제조하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 위해 본 발명은 신규한 PDGF B 유전자 및 이의 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 제 1 태양은 신규한 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 타입 B 폴리펩타이드에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 발명의 정의상 혈소판 유래 성장 인자 폴리펩타이드의 "기능적 동등물" 이란 천연형 사슴의 혈소판 유래 성장 인자 B 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 " 기능적 동등물" 에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산 (Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 혈소판 유래 성장 인자의 생리 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

" 기능적 유도체" 는 상기 혈소판 유래 성장 인자 폴리펩타이드의 단편, 상기 단편을 포함하는 단백질, 또는 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질을 말한다. " 단편" 이란 용어는 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말한다. 혈소판 유래 성장 인자 폴리펩타이드의 안정성, 저장성, 용해도 등을 변경시키기 위한 변형 또는 예를 들어 혈소판 유래 성장 인자와 상호 작용하는 물질과의 관계를 변경시키기 위해 변형을 가한 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다. 상기와 같은 단백질의 기능적 유도체를 만드는 방법은 공지되어 있다.

특히 바람직한 혈소판 유래 성장 인자 단백질의 제조방법은 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 혈소판 유래 성장 인자 B을 코드하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 용해물을 만들거나 혈소판 유래 성장 인자 mRNA를 in vitro 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 혈소판 유래 성장 인자 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포 조각 (cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 용해물 또는 in vitro 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그라피의 예이다. 친화성 컬럼은, 예를 들어, 항-PDGF B 항체를 이용하여 만들 수 있다.

본 발명의 혈소판 유래 성장 인자 폴리펩타이드 유래의 단편을 비롯한 혈소판 유래 성장 인자 단백질의 기능적 유도체는 펩타이드 합성에 대한 공지의 유기화학적 방법 중 하나를 이용하여 제조할 수 있다. 펩타이드 합성의 유기 화학적 방법은 균질상에서 또는 소위 고체상의 지지체에서 축합 반응에 의해 필요한 아미노산을 커플링시키는 것을 포함한다. 축합 반응에 관한 가장 통상적인 방법으로는 카르보디이미드 방법, 아지드 방법, 혼합 무수물 방법 및 활성 에스테르를 사용한 방법이 있는데, 이들 방법에 대해서는 문헌 (The Peptides Analysis, Synthesis, Biology Vol. 1-3 (Gross, E. 및 Meienhofer,J. 편집), 1979-1981(Academic Press Inc.))에 개시되어 있다.

특히 적합한 고체상으로는 문헌(Wang, J. Am. Chem. Soc., 95, 132 (1974))에 기재된 p-알콕시벤질 알코올 수지(4-히드록시-메틸-페녹시-메틸-코폴리스티렌-1% 디비닐벤젠 수지)가 있다. 합성 후 펩타이드는 부드러운 조건하에 상기 고체상으로부터 분리될 수 있다. 목적하는 아미노산 서열의 합성 후, 수지로부터 펩타이드의 탈리는 트리이소프로필 실란, 아니솔 또는 에탄디티올, 티오아니솔과 같은 스캐빈저를 함유하는 트리플루오로아세트산을 사용하여 실시한다. 축합 반응에 관여할 수 없는 반응성기는 산, 염기를 사용하여 가수분해시키거나 또는 환원시키므로써 매우 용이하게 다시 제거될 수 있는 기에 의해 효과적으로 보호된다. 가능한 보호기에 대해서는 문헌(The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1-9 (Gross, Udenfriend and Meienhofer 편집) 1979-1987 (Academic Press Inc.))에 보다 상세하게 설명되어 있다.

본 발명의 제 2 태양은 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 타입 B 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 및 이를 암호화하는 등가의 핵산서열에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 상기 유전자는 서열번호 1인 것을 특징으로 하는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 타입 B 유전자에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 "등가의 핵산서열" 에는 본 명세서에서 제공하는 서열과 알릴(allelic) 변형에 의한 서열, 종 (species)간의 변이에 의한 서열 또는 코돈 축퇴성 서열을 포함한다.

상기 "핵산서열 군" 이란 용어는 선택적 발현성이 확인된 천연의 mRNA, 그에 상보적인 cDNA 서열 및 이에 등가의 핵산서열을 포함한다.

"등가의 핵산서열" 에는 본 명세서에서 제공하는 서열과 알릴(allelic) 변형에 의한 서열, 종 (species)간의 변이에 의한 서열 또는 코돈 축퇴성 서열을 포함한다. " 코돈 축퇴성 서열" 이란 상기 자연 발생의 서열과는 상이하나 본 발명에 개시된 자연 발생의 PDGF 폴리펩타이드와 동일한 서열의 폴리펩타이드를 코드하는 핵산서열을 의미한다.

" 알릴(allelic) 변형에 의한 서열" 또는 " 종(species)간 변형에 의한 서열" 은 상기 자연 발생의 핵산서열과는 상이하나 본 명세서에 개시된 상기 폴리펩타이드들과 실질적으로 동일한 기능적 성질을 보유하는 폴리펩타이드를 코드하는 핵산을 의미한다.

본 발명의 제 3 태양은 상기 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 타입 B 폴리펩타이드, 활성 단편, 및/또는 기능적 유도체을 포함하는 세포의 증식, 발생, 분화, 창상치유, 퇴행성 신경질환, 허혈성 신경질환 또는 신경손상 질환 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기 약학 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다.

예를 들어, 경구 투여시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합되거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형되거나 식이 중에 직접 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다.

상기 정제, 트로키, 환제, 캡슐 등은 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 인산 이칼슘과 같은 부형제; 옥수수전분, 감자전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제; 및 슈크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리향과 같은 향미제를 포함할 수 있다. 투여 유닛 형태가 캡슐인 경우 상기 물질외에도 액체 담체를 함유할 수 있다. 코팅제 또는 투여 유닛의 물리적 형태를 변화시키는 기타 다양한 물질이 첨가될 수도 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐은 쉘락 (shellac), 당 또는 이 2가지 모두에 의해 코팅될 수 있다. 엘릭시르 시럽은 활성 화합물과 함께 감미제로서 슈크로스, 보존제로서 메틸파라벤과 프로필파라벤, 염료 및 체리향이나 오렌지향과 같은 향미제를 함유할 수 있다. 임의의 투여 유닛 형태를 제조하는데 사용되는 모든 물질은 약학적으로 순수하고 사용되는 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방형 제제로 제조될 수 있다.

경구 투여용의 경우, 본 발명의 조성물은 부형제와 혼합하여 비섭취형 구강세척제 및 치약 형태로 사용할 수 있다. 구강 세척제는 활성 성분을 적당한 용매, 예컨대 붕산나트륨 용액(Dobell's Solution)에 필요량만큼 첨가하여 제조할 수 있다. 별법으로, 활성 성분을 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산칼륨을 함유하는 방부 세정제에 첨가하거나, 겔, 페이스트, 파우더 및 슬러리 등의 형태인 치약에 분산시키거나 또는 물, 결합제, 연마제, 향미제, 발포제 및 습윤제를 포함할 수 있는 페이스트 치약에 치료적 유효량으로 첨가할 수 있다.

기타 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야에 잘 알려진 서적(예, " Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition)에 기재되어 있거나 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

투여 용량은 치료 환자의 상태에 따라 다양할 수 있으며, 투여를 담당하는 사람이라면 각 환자에게 적합한 적당 용량을 결정할 수 있다. 또한, 인체 투여용의 경우, 제제는 식품의약품안전청의 기준에 부합하는 멸균성, 발열성, 일반 안전 및 순도 기준을 충족하는 것이어야 한다.

이하 본 발명은 하기 실시예를 통하여 설명되어진다. 그러나 하기 실시예로 본 발명이 한정되어지는 것은 아니다.

[실시예 1] 사슴의 녹용에서 PDGF B 유전자 확인

(1)재료 및 방법

녹용은 세르버스 엘라퍼스(Cervus elaphus)로부터 채취하고, 세포 배양물과 RNA 분리 및 cDNA 합성 시약은 기브코 BRL 제품, mRNA 분리 시약은 퀴아겐 제품, 대장균 발현에 관련된 시약은 인비트로겐 제품을 사용하였다. 기타 시약은 모두 분자생물학급 이상을 사용하였다. 전체적인 유전자 분리 개략도는 도 1에 보였다.

(2) 시료 선정 및 채취

녹용을 생산하는 사슴 중 약리 효과가 가장 우수한 것으로 평가받고 있는 사슴인 세르버스 엘라퍼스의 뿔을 성장점의 활동이 왕성한 2 순기(5월 초순 ~ 중순)에 절단하였다. 절단된 조직은 드라이 아이스와 에탄올을 사용하여 급속 동결시킨 후, 생장 조직을 분리하여 -80℃에 보관하면서 실험을 수행하였다.

(3) 생장조직으로부터 총 RNA 분리

50㎖ 짜리 원뿔형 튜브에 3㎖ 트리졸(기브코 BRL)과 분리된 생장 조직 3g을 넣고 균질기로 균질화하였다. 여기에 트리졸 27㎖를 추가하여 넣고, 잘 혼합한 후 5분간 실온에서 정치하였다. 이 혼합액을 4개의 튜브에 7.5㎖씩 나누고 각각의 튜브에 1.5㎖ 클로로포름을 첨가하였다. 3분간 실온에서 정치한 후 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 상징액 3㎖을 새로운 튜브에 옮기고 각각의 튜브에 이소프로판올 3.75㎖를 넣은 후 4℃에서 10분간 정치한 다음 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상징액을 제거하였다. 침전물인 총 RNA를 75% 에탄올 7.5㎖로 세척하고, 다시 7,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 상징액을 제거하였다. 총 RNA를 상온에서 건조한 후 225㎕ DEPC 처리된 증류수에 녹여 보관하였다.

(4) 총 RNA로부터 mRNA 분리

전술한 바와 같이 분리된 총 RNA로부터 올리고텍스(Oligotex) mRNA 미디키트(midi kit)(퀴아겐 제품)을 사용하여 mRNA를 분리하였다.

(5) 분리된 mRNA로부터 cDNA 합성 및 클로닝

mRNA로부터 cDNA 합성은 기브코 BRL 사의 cDNA 합성 키트를 이용하고, 실험 방법을 일부 변형하여 실시하였다.

제1 가닥 cDNA합성은, mRNA(2㎍) 9㎕에 NotⅠ 프라이머-어댑터(0.5㎍/㎕) 2㎕를 넣고 잘 섞은 후 70℃에서 10분간 반응시켜 RNA 2차 구조를 변성시켰다. 2분간 얼음에서 식힌 다음, 5X 제1 가닥 완충액 4㎕, 0.1M DTT 2㎕ 그리고 10 mM dNTP 1㎕의 혼합물을 넣고 잘 섞은 후 37℃에서 2분간 반응시켰다. 그리고 수퍼스크립타제(Superscriptase) Ⅱ 2㎕를 첨가하여 37℃에서 60분간 반응시킨 후 얼음에서 2분간 정치하였다.

제 2 가닥 cDNA 합성은 전술한 반응액에 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리 증류수 91㎕, 제2 가닥 완충액 30㎕, 10mM dNTP 혼합물 3㎕, 대장균(E. coli) DNA 리가아제(10 U/㎕) 1㎕, 대장균(E. coli) DNA 폴리머라제(10U/㎕) 1㎕, 대장균 RNA 분해효소 H (2U/㎕) 1㎕를 첨가하여 16℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 T4 DNA 폴리머라제 2㎕(10U)를 첨가하여 5분간 더 반응시켰다. 반응이 끝난 용액은 0.5M EDTA 10㎕를 첨가한 후, 페놀-클로로포름을 사용하여 cDNA를 추출하여 DEPC 처리된 증류수에 녹여 사용하였다.

합성된 cDNA에 EcoR1-BstX1 어댑터(인비트로겐)를 결찰시키고, Not1로 절단하여 cDNA 가닥 양 끝에 Not1과 EcoR1 을 갖는 cDNA를 준비하였다. 원하는 크기의 cDNA를 겔 여과 컬럼을 통해 분리하여 회수하고, 다중클로닝 부위에 Not1과 EcoR1 을 갖는 벡터(pDONR222, pSPORT 1, pBluescript, pPICZ, pYES3/CT 등)를 결찰시켰다. 전기침투(일렉트로포레이션) 방법을 이용하여 대장균(ElectroMAX DH5α, 기브코 BRL)을 형질전환시켜 cDNA를 포함하는 플라스미드 벡터를 증폭시켰다.

(6) 녹용 DNA 염기 결정 및 PDGF B 선별작업

녹용의 cDNA 라이브러리로부터 위 방법에 따라 EST 클론을 분리한 후 각각의 클론으로부터 DNA를 추출한 후 ABI사의 빅다이 터미네이터 사이클 시퀴엔스 키트(BigDye Terminator Cycle sequence Kit)를 이용하여 단방향으로 DNA 염기 분석을 수행했다. 그리고 나서 개시코돈이 있는 클론을 전체 분석한 후 종결 코돈을 찾고 NCBI를 통해 다른 종과의 염기 상동성 비교와 번역되었을 때의 아미노산의 종간 상동성을 찾고 최종적으로 관심있고 유용한 유전자를 찾았다. 여기서 선택된 유전자가 상처치료로 잘 알려진 PDGF B이다. 서열목록 번호 1의 유전자를 포함하는 벡터를 선정하였다.

(7) 녹용 PDGF B cDNA 를 포함하는 대장균 균주 생산

녹용 PDGFB cDNA를 포함하는 플라스미드 벡터를 가지고 전기침투 방법을 이용하여 대장균 균주를 형질전환시켰다. OD₆₀₀에서 1.3 내지 1.5 정도로 증식된 대장균 세포를 전기침투가 가능하도록 컴피턴트(competent) 세포로 만들고, 이 세포 80㎕를 녹용 cDNA가 포함된 벡터 5㎍로 형질전환시켰다(1.5kV, 25μF, 200Ω, 0.2cm 큐벳, Gene-Pulser, BioRad).

[실시예 2] 녹용 PDGF B 유전자 발현확인

(1) 녹용PDGF B의 대량생산 및 분리정제

PDGF의 단백질을 발현하기 위해 우선 실시예 1에 따라 제조되어진 녹용 PDGF B cDNA를 포함하는 플라스미드 벡터로부터 원하는 부분을 용출하였다. 그러기 위해서, 제작된 포워드 프라이머(서열목록 번호 3)와 리버스 프라이머(서열목록 번호 4) 각각 2 μl/10 pmol, dNTP 혼합물, Taq-DNA 중합효소, MgCl₂, 반응 완충용액을 넣고 PCR 를 하여 특정 밴드를 겔 용출 하였다(도 2 참조). 그리고 PCR 생산물의 poly -A 꼬리가 붙도록 만들어진 T-벡터 (50 ng/ μl) 시스템에 T4 DNA 리가아제 (3U/ μl)와 PCR 생산물을 넣고 결찰한 후, 이 결찰물을 화학적 방법으로 만들어진 DH5α에 열충격(42 °C) 형질전환하였다. 여기서 나온 형질전환체를 EcoRI과 Xho I으로 효소 다이제스쳔하여 발현할 인서트(insert)를 준비하였다. 단백질을 발현 할 벡터로는 pET28a(+)를 사용하였고, 이 또한 EcoRI과 Xho I으로 효소 다이제스쳔하여 벡터를 준비하였다. 준비된 발현벡터와 인서트를 결찰하였다. 그 조건은 16 °C에서 16 hr 정도 시행하였다. 여기서 얻은 결찰물를 BL21(DE3)에 형질전환하였고, 완전히 구성 되었는지 살펴보기 위해 각각의 형질전환체를 키운 다음, 미니프렙 키트(QIAGEN)를 통해 얻은 플라스미드 DNA를 Eco RI과 Xho I으로 다이제스쳔하여 벡터(대략 5.3 kb)와 인서트(0.7 kb) 사이즈를 확인하였다. 위와 같이 구성된 것을 확인한 후 단백질 발현을 위해서, 확인된 콜로니를 15ml 튜브에 LB (카나마이신 50 μg/ml) 3ml을 넣고, 하룻밤 키웠다. 이 세포를 250ml 플라스크에 100ml의 LB 배지를 넣고, O.D 600 값이 0.4 ~ 0.5 될 때까지 37 °C 교반 항온배양기에서 키웠다. 이 때에 단백질 발현 유도체인 IPTG (1mM)를 넣어주고, 상온에서 하룻밤 키워준다. 키운 세포를 수확 하여 분해 완충용액(lysis buffer; 50mM NaCl, 5mM MgCl₂, 50mM Tris-HCl / pH 7.9)로 재현탁하고, 필요에 따라 0.1 mm PMSF, 10 mM BME(Basal Medium Eagle)를 넣어준다. 이렇게 준비된 생산물에 리소자임 (1g/ 10 ml) 저장용액을 넣고, 37 °C에서 30 분 정도 항온반응한 후, 초음파처리하였다. 용해성 분획을 얻어내어 20°C에 보관하였다. 친화성 컬럼 시스템(Affininty column system)을 이용하여, 레진에 Ni²⁺을 붙인 후, 위에서 얻은 단백질을 투석하였다. 먼저 끈끈한 레진을 컬럼에 로딩(2 ml)하고, 다 빠져나가면 멸균된 증류수를 6 ml 정도 로딩하여 흐름 속도를 확인하였다. 그리고나서 차징 완충용액(charging buffer; 50 mM NiSO₄)를 10 ml 흘려준 후, 결합 완충용액(binding buffer; 20mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl/ pH 7.9) 를 6 ml 흘려준다. 결합 완충용액이 다 빠져나가면 위에서 얻은 단백질 시료를 1ml 흘려준다. 발현된 단백질에는 히스티딘이 발현되어 있을 것임으로, 결합 완충용액으로 인하여 얻고자 하는 단백질이 레진에 결합 될 것이다. 이 단계에서 결합 완충용액를 10ml씩 두 번 로딩하여 흘려보낸 후, 비특이적 결합 단백질을 씻어내기 위해 세척 완충용액 (100 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl/ pH 7.9)를 10ml씩 세 번 로딩하여 준다. 그리고 용출 완충용액 (1 M 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl/ pH 7.9)를 넣어 주어 원하는 단백질을 용출하였다. 사용했던 레진을 다시 사용하기 위해 스트립 완충용액 (100 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl/ pH 7.9)를 넣어주어 완전히 레진을 깨끗하게 씻어내고, 멸균된 증류수로 세척 후, 20% EtOH 10 ml정도 넣어 레진을 보관하였다 (단백질 정제에 관련된 실험은 콜드 룸, 4°C에서 하도록 함). 분리정제 각 단계의 단백질의 전기영동 사진을 도 3에 보였다. 정제를 마친 시료의 탈염을 하기 위해 투석를 시행하였다. 먼저 분해 완충용액에 20 % 글리세롤을 넣어서 완충용액을 준비하고 새로운 PMSF, BME를 넣어준 후, 투석 튜브에 시료를 넣어서 교반 플레이트 상에서 튜브가 적당히 잠기도록 하여, 콜드 룸에서 하룻밤 돌려준다. 이렇게 준비된 단백질을 브래드포드 방법(Bradford method)을 통해 정량한 후, 사용하기 전까지 20 °C보관해 놓는다. 발현된 단백질은 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다(도 3 참조).

(2) 녹용 DNA 서열분석 및 PDGF-B 선별작업

1) 녹용 DNA의 전장길이 서열분석

총 1,110 의 염기로 이루어져 있고 이를 서열목록 번호 1로 나타내었다. 서열번호 1은 도 8 처럼 개시 코돈인 ATG와 종결코돈인 TAG를 갖는다. 이들은 완전히 발현될 수 있는 729개의 전장길이의 전전형태(prepro-form)을 갖는다. 가운데 밑줄친 AGC로 시작해서 ACC로 끝나는 부분이 인간의 PDGF B와 DNA 염기서열을 비교했을때의 성숙된 형태에서 327의 핵산으로 이루어져 있고 이것을 번역 했을 때 111개의 아미노산으로 이루어진다. 이를 서열번호 5로 나타내었다.

2) 녹용 PDGF-B cDNA의 번역

인터넷상의 녹용 PDGF-B cDNA를 번역 프로그램으로 번역한 결과, 도 9에서 보는 것처럼 개시 아미노산인 메티오닌으로 시작하여 알라닌으로 끝나는 것(밑줄로 표시된 부분)을 볼 수 있었고 성숙형의 PDGF-B는 세린으로 시작해서 트레오닌으로 끝나는 것을 알 수 있었다. 성숙한 PDGF-B는 도 9에서 굵게 표시되었다.

3) 녹용 PDGF-B cDNA의 다른종과의 상동성 비교

인간의 혈소판 유래 성장인자와는 88% 유사하였고(도 10) 다른 종간 핵산의 특이적 부분에 따라 84 %에서 98 %의 높은 상동성을 보였다.

4) 녹용 PDGF-B 단백질 level에서의 다른종과의 상동성 비교

인간의 PDGF B 단백질과 68% 유사하였고(도 11) 다른 종간 단백질 특이한 부분에 따라 32 %에서 98 %의 상동성을 보였다. 인간과 녹용 PDGF-B를 비교했을 때 95..182 지역(보다 자세하게는 146..159 베타-스트랜드 지역, 160..161 수소결합 지역, 162..175 베타-스트랜드 지역의 서열이 다름)이 달라 PDGF- 베타 수용체 결합으로 일어나는 신호전달 체계인 ERK 1/2의 인산화와 더 나아가 상처 치료효과에도 지대한 영향을 나타낼 것으로 사료된다.

[실시예 3] 녹용의 PDGF-B 처리에 따른 상처치유 효과

(1) 재료 및 방법

녹용의 PDGF-B 폴리펩타이드의 활성을 측정하기 위해, 먼저 인간의 섬유세포를 분양 받아 배양하였다. 배지는 특정 배지이며 2일 정도 키워서 배양접시에 70% 정도 자라면 배지를 제거해주고, PBS로 2번 정도 세척해주었다. 일정한 곳에 4군데 정도 상처(scraper 이용)를 내어 PBS로 두 번 정도 세척해 준 후, 배양 배지를 첨가해 준다. 상처를 주기 전과 후의 세포의 모습을 관찰하였다.

세포에 상처를 주고 24시간 후, 배지를 제거한 다음, 새 배지에 정제된 PDGF-B(M) 폴리펩타이드를 희석하여 10ng/ml정도 넣고 24~72시간 배양하면서 세포의 변화를 관찰하였다. PDGF-B의 성장 인자로서의 활성(Dose effect 와 time course)을 측정하기 위한 방법으로 인간의 PDGF-B 유전자 재조합에 의해 얻은 폴리펩타이드( SIGMA에서 구입)와 녹용에서 얻은 PDGF-B 폴리펩타이드를 0, 1, 10, 100 ng/ml로 처리하고, 각 세포에서 인산-ERK1/2(phospho-Extracellular signal-Regulated Kinase 1/2) 항체를 가지고 웨스턴블랏팅을 통해 PDGF-B의 수용체 결합에 의해 일어나는 ERK1/2의 활성화 상태인 인산화를 확인하였다.

(2) 결과

상처입은 세포의 경우, 우선 24~72 시간 배양하여 본 결과, 자연치유되는 현상은 볼 수 없었다. 상처입은 세포에 PDGF-B 폴리펩타이드를 첨가한 경우에는 48시간 후부터 상처 주위에 세포가 늘어져 자라기 시작하였으며, 처리 후 3일째에는 상처로 인한 빈공간이 채워지는 것을 확인할 수 있었다. 처리 후 5일 째된 세포에서는 상처부위의 빈공간이 80% 채워진 것을 확인하였다(도 4 및 도 5 ).

녹용으로부터 분리된 PDGF-B를 손상된 인간의 섬유아세포에 처리하였을 때 24시간 및 72시간 후 회복 효과가 있었다(도 6 ).

상처를 주지 않은 정상적인 세포에서 녹용 PDGF-B가 인간 PDGF-B보다 상처치유 효과가 우수한지를 항- 인산-ERK1/2(phospho-Extracellular signal-Regulated Kinase 1/2) 항체를 가지고 웨스턴 블랏팅을 통해 ERK 1/2의 활성화를 알아본 결과 30분, 6시간 동안 1, 10 ng을 처리했을 때 인간 PDGF-B 처리를 했을 때와 비교해 별다른 차이를 보이지 않았다. 그러나, 24시간 동안 1, 10ng을 처리했을 때 30분, 6시간 처리했을 때보다 뚜렷한 차이가 보였고 (각각 44%, 72% 증가) 인간 PDGF-B (각각 22%, 45% 증가) 보다 현저히 인산화가 됨을 보였다.(도 7 및 표 1)

(표 1) 사슴 PDGF B 및 인간 PDGF B의 Erk 1/2에 대한 인산화 효과 비교

구 분	대조구	1 ng/ml	10 ng/ml	100 ng/ml
녹용 PDGF B	100 %	144 %	172 %	121 %
인간 PDGF B	100 %	122 %	145 %	99 %

표 1에서 각각을 100ng/ml 처리했을 때는 오히려 감소하는 경향을 보였는데, 이는 너무나 많은 아고니스트 농도 때문에 수용체가 다운-조절된 결과로 여겨진다. 10ng/ml의 농도가 적당한 농도로 확인되었다.

본 발명에 따른 사슴의 녹용으로부터 분리되어진 신규한 PDGF 타입 B 단백질은 상처난 일반 섬유아세포에 투여했을 때 48시간 후 거의 완전하게 상처가 회복 됨을 보이고, 정상세포에서도 PDGF 타입 B 단백질 처리 후 24 시간 후에 세포성장의 주요 신호전달체계인 ERK 1/2의 인산화가 인간 PDGF 타입와 비교하여 증가됨을 보여, 상처나 궤양치료제로서의 인간 PDGF 타입 B 보다 좋았다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 타입 B 단백질.
2. 삭제
3. 제 1 항의 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 타입 B 단백질을 암호화하는 유전자.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 유전자가 서열번호 1의 78에서 803의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 타입 B 유전자.
5. 제 1 항에 기재된 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 타입 B 단백질을 포함하는 세포의 증식, 발생, 분화, 창상치유, 퇴행성 신경질환, 허혈성 신경질환 또는 신경손상 질환 치료를 위한 조성물.

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