JPH082309B2 - 突然変異体の酸性繊維芽細胞成長因子 - Google Patents
突然変異体の酸性繊維芽細胞成長因子Info
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Description
【発明の詳細な説明】 動物細胞、特にヒト細胞の成長を制御する物質および
それらが作用する機構の発見は、現在組織修復および創
傷治癒に関する生物医学的研究の主流の1つである。中
胚葉由来の多くの細胞を包含する様々な細胞に対するマ
イトジェンである繊維芽細胞成長因子(FGFS)、が確認
されており、それらは、組織修復を生じる有糸分裂を誘
発することができることが示唆されている。繊維芽細胞
マイトジェン活性は最初に中枢神経系からの組織抽出液
に見い出された。脳由来繊維芽細胞マイトジェンはトロ
ウェル(Trowell)等ジェー.エクスポ.バイオル.
(J.Exp.Boil.)第16巻、60〜70頁(1939年)およびホ
フマン、グロース(Growth)第4巻、361〜376頁(1940
年)によって最初に記載されている。その後下垂体抽出
液もまた繊維芽細胞に対して有効なマイトジェン活性を
有することが示された。アメリン、プロク.ナトル.ア
カド.サイ.(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA第70巻、2702
〜2706頁(1973年)。脳および下垂体両繊維芽細胞成長
因子の部分精製品は血管内皮細胞を包含する分化細胞の
様々な細胞型に対してマイトジェン活性を示した、ゴス
ポダロウィツ(Gospodarowicz)等、(ナトル.キャン
サーインスト.モノグル)Natl.Cancer Inst.Monogr.第
48巻、109〜130頁(1978年)。繊維芽細胞成長因子は元
来、ミエリン塩基性タンパク質の限定加水分解から誘導
される1個のペプチドであると考えられていた。最近で
は、FGFは2つの形態、酸性FGF(aFGF)および塩基性FG
F(bFGF)で存在し、両形態は哺乳類の脳から分離精製
することができることが示されている。トーマスおよび
ギメネツ−ガレゴ(Gimenez-Gallego)、ティーアイビ
ーエス(TIBS)第11巻、81〜84頁(1986年)。多くの細
胞型は精製aFGFあるいはbFGFのいずれかでの刺激に応答
してDNAを合成し、一次繊維芽細胞を包含する血管およ
び角膜内皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、平滑
筋、グリア細胞および神経芽細胞を分裂させる、エシュ
(Esch)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第82巻、6507〜65
11頁(1985年)、クオ(Kuo)等、フェド.プロク.(F
ed.Proc.)第44巻、695頁(1985年)、ゲンスブルガー
(Gensburger)等、シー.アール.アカド.スク.(C.
R.Acad.Sc.)パリ第303巻、465〜468頁(1986年)。純
粋なウシ脳由来のaFGFは培養の血管内皮細胞に対して有
効なマイトジェンとして作用するだけでなく生体内で血
管の成長を誘発する、トーマス等、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA第82巻、6409〜6413頁(1985年)。また精製aFGF
のマイトジェン活性は創傷治癒を促進するために使用す
ることができる。トーマス米国特許第4,444,760号に記
載。
それらが作用する機構の発見は、現在組織修復および創
傷治癒に関する生物医学的研究の主流の1つである。中
胚葉由来の多くの細胞を包含する様々な細胞に対するマ
イトジェンである繊維芽細胞成長因子(FGFS)、が確認
されており、それらは、組織修復を生じる有糸分裂を誘
発することができることが示唆されている。繊維芽細胞
マイトジェン活性は最初に中枢神経系からの組織抽出液
に見い出された。脳由来繊維芽細胞マイトジェンはトロ
ウェル(Trowell)等ジェー.エクスポ.バイオル.
(J.Exp.Boil.)第16巻、60〜70頁(1939年)およびホ
フマン、グロース(Growth)第4巻、361〜376頁(1940
年)によって最初に記載されている。その後下垂体抽出
液もまた繊維芽細胞に対して有効なマイトジェン活性を
有することが示された。アメリン、プロク.ナトル.ア
カド.サイ.(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA第70巻、2702
〜2706頁(1973年)。脳および下垂体両繊維芽細胞成長
因子の部分精製品は血管内皮細胞を包含する分化細胞の
様々な細胞型に対してマイトジェン活性を示した、ゴス
ポダロウィツ(Gospodarowicz)等、(ナトル.キャン
サーインスト.モノグル)Natl.Cancer Inst.Monogr.第
48巻、109〜130頁(1978年)。繊維芽細胞成長因子は元
来、ミエリン塩基性タンパク質の限定加水分解から誘導
される1個のペプチドであると考えられていた。最近で
は、FGFは2つの形態、酸性FGF(aFGF)および塩基性FG
F(bFGF)で存在し、両形態は哺乳類の脳から分離精製
することができることが示されている。トーマスおよび
ギメネツ−ガレゴ(Gimenez-Gallego)、ティーアイビ
ーエス(TIBS)第11巻、81〜84頁(1986年)。多くの細
胞型は精製aFGFあるいはbFGFのいずれかでの刺激に応答
してDNAを合成し、一次繊維芽細胞を包含する血管およ
び角膜内皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、平滑
筋、グリア細胞および神経芽細胞を分裂させる、エシュ
(Esch)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第82巻、6507〜65
11頁(1985年)、クオ(Kuo)等、フェド.プロク.(F
ed.Proc.)第44巻、695頁(1985年)、ゲンスブルガー
(Gensburger)等、シー.アール.アカド.スク.(C.
R.Acad.Sc.)パリ第303巻、465〜468頁(1986年)。純
粋なウシ脳由来のaFGFは培養の血管内皮細胞に対して有
効なマイトジェンとして作用するだけでなく生体内で血
管の成長を誘発する、トーマス等、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA第82巻、6409〜6413頁(1985年)。また精製aFGF
のマイトジェン活性は創傷治癒を促進するために使用す
ることができる。トーマス米国特許第4,444,760号に記
載。
酸性繊維芽細胞成長因子は元来、BALB/c3T3繊維芽細
胞に対するマイトジェン活性に基づきウシ脳から均一に
まで精製された、トーマス等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
第81巻、357〜361頁(1984年)。この脳由来成長因子が
再精製され、その血管内皮およびアストログリア細胞に
対するマイトジェン活性(内皮細胞成長因子およびアス
トログリア成長因子1)、場所(網膜由来成長因子、眼
由来成長因子IIあるいは脳由来成長因子)およびヘパリ
ン−セファロースへの結合(分類1ヘパリン結合成長因
子またはペパリン結合成長因子α)に基づいて多数の実
験室で新たに命名されている、トーマスおよびギメネツ
−ガレゴTIBS第11巻、81〜84頁(1986年)。ウシaFGFの
アミノ酸配列は、決定されており塩基性FGFに非常に相
同性が高く、繊維芽細胞マイトジェンインターロイキン
1−アルファおよび1−βに関係していることが認めら
れた。ギメネツ−ガレゴ等サイエンス第230巻、1385〜1
388頁(1985年)。ヒトaFGFの完全なアミノ酸配列は精
製タンパク質から、ギメネツ−ガレゴ等、バイオケム.
バイオフィ.レス.コム.(Biochem.Biophy.Res.Com
m.)第138巻、611〜617頁(1986年)および遺伝子から
ジェーエ等、サイエンス第233巻、541〜545頁(1986
年)決定されている。
胞に対するマイトジェン活性に基づきウシ脳から均一に
まで精製された、トーマス等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
第81巻、357〜361頁(1984年)。この脳由来成長因子が
再精製され、その血管内皮およびアストログリア細胞に
対するマイトジェン活性(内皮細胞成長因子およびアス
トログリア成長因子1)、場所(網膜由来成長因子、眼
由来成長因子IIあるいは脳由来成長因子)およびヘパリ
ン−セファロースへの結合(分類1ヘパリン結合成長因
子またはペパリン結合成長因子α)に基づいて多数の実
験室で新たに命名されている、トーマスおよびギメネツ
−ガレゴTIBS第11巻、81〜84頁(1986年)。ウシaFGFの
アミノ酸配列は、決定されており塩基性FGFに非常に相
同性が高く、繊維芽細胞マイトジェンインターロイキン
1−アルファおよび1−βに関係していることが認めら
れた。ギメネツ−ガレゴ等サイエンス第230巻、1385〜1
388頁(1985年)。ヒトaFGFの完全なアミノ酸配列は精
製タンパク質から、ギメネツ−ガレゴ等、バイオケム.
バイオフィ.レス.コム.(Biochem.Biophy.Res.Com
m.)第138巻、611〜617頁(1986年)および遺伝子から
ジェーエ等、サイエンス第233巻、541〜545頁(1986
年)決定されている。
脳から精製した天然のaFGFまたは組換え誘導aFGF(γ
−aFGF)は培養のBalb/c3T3繊維芽細胞および血管内皮
細胞を最適に刺激するためにヘパリンの併用投与を必要
とする。ヒト脳由来および組換えaFGFはヘパリンの存在
下での最適活性に比べてヘパリン不在下で培養のこれら
の細胞に対する活性は約1〜5%にすぎない。aFGF最大
活性に対して必要とされるヘパリン用量は比較的低い一
方、ヘパリンが恐らく有害な副作用を誘発するためヘパ
リンを用いずにaFGFを投与することが望ましい。ほとん
どのタンパク質の活性を破壊する標準条件である強い加
熱、極端なpHおよびプロテアーゼの存在のほかに純粋な
ヒトaFGFまたは凍結乾燥および酸に不安定である。純粋
なaFGFは酸化によって連鎖内または連鎖間ジスルフィド
結合により架橋され20mMジチオスレイトールを用いてジ
スルフィド還元することによって活性形態で回収するこ
とができる。ヘパリンはaFGFの集合を仲介する分子間ジ
スルフィド結合を阻害することができる。またこの不均
一グリコサミノグリカンであるヘパリンがトリプシンに
よって加熱変性およびタンパク質の加水分解からaFGFを
安定化することは注目されている。その結果として外因
性あるいは内因性ヘパリンのいずれも組織修復に関連す
る生体内活性に必要とされる。本発明は天然aFGFに比べ
てヘパリンの不在下で生物学的活性が高められた組換え
体由来aFGFの突然変異形態を提供するものである。
−aFGF)は培養のBalb/c3T3繊維芽細胞および血管内皮
細胞を最適に刺激するためにヘパリンの併用投与を必要
とする。ヒト脳由来および組換えaFGFはヘパリンの存在
下での最適活性に比べてヘパリン不在下で培養のこれら
の細胞に対する活性は約1〜5%にすぎない。aFGF最大
活性に対して必要とされるヘパリン用量は比較的低い一
方、ヘパリンが恐らく有害な副作用を誘発するためヘパ
リンを用いずにaFGFを投与することが望ましい。ほとん
どのタンパク質の活性を破壊する標準条件である強い加
熱、極端なpHおよびプロテアーゼの存在のほかに純粋な
ヒトaFGFまたは凍結乾燥および酸に不安定である。純粋
なaFGFは酸化によって連鎖内または連鎖間ジスルフィド
結合により架橋され20mMジチオスレイトールを用いてジ
スルフィド還元することによって活性形態で回収するこ
とができる。ヘパリンはaFGFの集合を仲介する分子間ジ
スルフィド結合を阻害することができる。またこの不均
一グリコサミノグリカンであるヘパリンがトリプシンに
よって加熱変性およびタンパク質の加水分解からaFGFを
安定化することは注目されている。その結果として外因
性あるいは内因性ヘパリンのいずれも組織修復に関連す
る生体内活性に必要とされる。本発明は天然aFGFに比べ
てヘパリンの不在下で生物学的活性が高められた組換え
体由来aFGFの突然変異形態を提供するものである。
従って本発明の目的は組換え体ウシおよびヒトaFGF遺
伝子をヘパリンの不在下で天然または組換え体タンパク
質より活性なタンパク質をコードすることができる遺伝
子に突然変異によって変換することである。本発明の他
の目的は、特定の遺伝子を適当なクローニングベクター
に組込むことである。さらに目的は適当な宿主を組換え
体ベクターの各々で形質転換することであり、特定の突
然変異aFGF遺伝子の発現を誘発することである。本発明
のさらに他の目的は生物学的に活性なウシおよびヒト突
然変異aFGFを単離および精製することである。本発明の
これらのそして他の目的は次の説明から明らかとなる。
伝子をヘパリンの不在下で天然または組換え体タンパク
質より活性なタンパク質をコードすることができる遺伝
子に突然変異によって変換することである。本発明の他
の目的は、特定の遺伝子を適当なクローニングベクター
に組込むことである。さらに目的は適当な宿主を組換え
体ベクターの各々で形質転換することであり、特定の突
然変異aFGF遺伝子の発現を誘発することである。本発明
のさらに他の目的は生物学的に活性なウシおよびヒト突
然変異aFGFを単離および精製することである。本発明の
これらのそして他の目的は次の説明から明らかとなる。
突然変異ウシおよびヒトaFGFをコードする新規な遺伝
子が構成される。固有の遺伝子は、特定の点変異によっ
て切換え体ウシおよびヒト天然aFGFをコードする遺伝子
から誘導される。各遺伝子の構成物は適当な宿主を形質
転換するために使用される発現ベクターに挿入される。
形質転換された宿主細胞は、ヒトまたはウシの突然変異
組換え体aFGFを産生する。精製された変異aFGFは変異し
ていない形態に比べてヘパリンの不在下で生物学的活性
が増大または改良されている。
子が構成される。固有の遺伝子は、特定の点変異によっ
て切換え体ウシおよびヒト天然aFGFをコードする遺伝子
から誘導される。各遺伝子の構成物は適当な宿主を形質
転換するために使用される発現ベクターに挿入される。
形質転換された宿主細胞は、ヒトまたはウシの突然変異
組換え体aFGFを産生する。精製された変異aFGFは変異し
ていない形態に比べてヘパリンの不在下で生物学的活性
が増大または改良されている。
酸性繊維芽細胞成長因子は種々のミクロ不均質形態で
存在し、aFGFを含有することが知られている種々の組織
源および細胞型から分離される。本明細書中で使用され
るミクロ不均質形態は1個の遺伝子生産物を意味し、DN
Aの1個の遺伝子単位から産生されるタンパク質であ
り、翻訳された後構造修飾を受ける。しかしながらこれ
らの構造修飾はペプチドの生物学的活性の著しいいかな
る変化も生じない。“生物的活性”および“生物学的に
活性な”は交換して使用することができ、本明細書中で
は天然、組換え体または突然変異体組換えaFGFが実施例
7に記載される休止DBalb/c3T3繊維芽細胞のDNA合成を
刺激する能力、上述の細胞型のいずれかを刺激する能力
または当該技術に記載される作用のいずれかを実施する
能力として定義される。修飾は、生体内あるいは分離お
よび精製過程中のいずれかで行なうことができる。生体
内修飾は、N末端でのアセチル化、タンパク質の加水分
解、グリコシル化またはリン酸化を生じるがこれらに限
定されない。タンパク質の加水分解は、タンパク質のエ
キソ加水分解を包含することができ、1個以上の末端ア
ミノ酸を順次酵素的に切断して元の遺伝子生産物より少
ないアミノ酸を有するミクロ不均質形態を生成する。ま
たタンパク質の加水分解は、アミノ酸配列内の特定の位
置でペプチドを切断するエンドプロテアーゼの作用から
生じるタンパク質の内部加水分解の修飾を包含すること
ができる。類似の修飾は精製過程中に起こる可能性があ
り、ミクロ不均質形態が生じることになる。精製中に生
じる最も普通の修飾は、タンパク質の加水分解であり、
一般にプロテアーゼ阻害剤の使用によって最小限に維持
される。ほとんどの条件下でミクロ不均質形態の混合物
は、天然aFGFの精製後に存在する。天然aFGFはaFGFを包
含する組織または細胞から分離および精製されたaFGFを
意味する。
存在し、aFGFを含有することが知られている種々の組織
源および細胞型から分離される。本明細書中で使用され
るミクロ不均質形態は1個の遺伝子生産物を意味し、DN
Aの1個の遺伝子単位から産生されるタンパク質であ
り、翻訳された後構造修飾を受ける。しかしながらこれ
らの構造修飾はペプチドの生物学的活性の著しいいかな
る変化も生じない。“生物的活性”および“生物学的に
活性な”は交換して使用することができ、本明細書中で
は天然、組換え体または突然変異体組換えaFGFが実施例
7に記載される休止DBalb/c3T3繊維芽細胞のDNA合成を
刺激する能力、上述の細胞型のいずれかを刺激する能力
または当該技術に記載される作用のいずれかを実施する
能力として定義される。修飾は、生体内あるいは分離お
よび精製過程中のいずれかで行なうことができる。生体
内修飾は、N末端でのアセチル化、タンパク質の加水分
解、グリコシル化またはリン酸化を生じるがこれらに限
定されない。タンパク質の加水分解は、タンパク質のエ
キソ加水分解を包含することができ、1個以上の末端ア
ミノ酸を順次酵素的に切断して元の遺伝子生産物より少
ないアミノ酸を有するミクロ不均質形態を生成する。ま
たタンパク質の加水分解は、アミノ酸配列内の特定の位
置でペプチドを切断するエンドプロテアーゼの作用から
生じるタンパク質の内部加水分解の修飾を包含すること
ができる。類似の修飾は精製過程中に起こる可能性があ
り、ミクロ不均質形態が生じることになる。精製中に生
じる最も普通の修飾は、タンパク質の加水分解であり、
一般にプロテアーゼ阻害剤の使用によって最小限に維持
される。ほとんどの条件下でミクロ不均質形態の混合物
は、天然aFGFの精製後に存在する。天然aFGFはaFGFを包
含する組織または細胞から分離および精製されたaFGFを
意味する。
本発明は、すべての動物の酸性繊維芽細胞成長因子の
ミクロ不均質形態を包含することを企図している。好適
な実施態様はウシおよびヒトaFGFのミクロ不均質形態を
包含する。ウシaFGFの最も好適なミクロ不均質形態は15
4個のアミノ酸形態、140個のアミノ酸形態および134個
のアミノ酸形態を包含する。140個のアミノ酸形態は表
Iに示され、ギメネツ−ガレゴ等、サイエンス第230
巻、1385〜1388頁(1985年)、ウシ種の最も好適な形態
である。
ミクロ不均質形態を包含することを企図している。好適
な実施態様はウシおよびヒトaFGFのミクロ不均質形態を
包含する。ウシaFGFの最も好適なミクロ不均質形態は15
4個のアミノ酸形態、140個のアミノ酸形態および134個
のアミノ酸形態を包含する。140個のアミノ酸形態は表
Iに示され、ギメネツ−ガレゴ等、サイエンス第230
巻、1385〜1388頁(1985年)、ウシ種の最も好適な形態
である。
ウシaFGFの140個のアミノ酸形態組換え体のヌクレオ
チド配列を第2表に示す。
チド配列を第2表に示す。
154個のアミノ酸形態は、さらに次のアミノ酸Ala-Glu
-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Phe-Thr-Ala-Leu-Thr-Glu-Lysを
包含し、カルボキシル末端Lysが140個のアミノ酸形態の
最初の位置のアミノ末端Pheに付加されている。ウシaFG
Fの154個のアミノ酸形態のアミノ末端アラニン残基はア
セチル化することができる。134個のアミノ酸形態は、
アミノ末端の最初の6個のアミノ酸が除かれている以外
は140個のアミノ酸形態と一致する。天然aFGFが分離さ
れる場合、これらのミクロ不均質形態の相対量は使用さ
れる過程に依存して異なるが一般にこれらの形態の少な
くとも2個を含有する。
-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Phe-Thr-Ala-Leu-Thr-Glu-Lysを
包含し、カルボキシル末端Lysが140個のアミノ酸形態の
最初の位置のアミノ末端Pheに付加されている。ウシaFG
Fの154個のアミノ酸形態のアミノ末端アラニン残基はア
セチル化することができる。134個のアミノ酸形態は、
アミノ末端の最初の6個のアミノ酸が除かれている以外
は140個のアミノ酸形態と一致する。天然aFGFが分離さ
れる場合、これらのミクロ不均質形態の相対量は使用さ
れる過程に依存して異なるが一般にこれらの形態の少な
くとも2個を含有する。
ヒトaFGFは、ウシaFGFのそれと類似のミクロ不均質性
を示す。ヒトaFGFの最も好適なミクロ不均質形態は154
個のアミノ酸形態、140個のアミノ酸形態および139個の
アミノ酸形態を包含する。140個のヒトアミノ酸形態は
第8表に示されるように11個のアミノ酸によってウシ形
態と異なる。154個のアミノ酸形態は、140個のアミノ酸
形態と全く同一のアミノ酸配列を含み、更に一つの例外
を除き154個のウシアミノ酸形態に関連した14個のアミ
ノ酸の配列を含有する。154個のヒト形態ではN−末端
から5番目の位置、即ち140個のアミノ酸形態のN末端P
heから数えて−10位のアミノ酸はイソロイシンであり、
ウシ形態ではスレオニンである。さらに14個のアミノ酸
ヒトN末端配列はAla-Glu-Gly-Glu-Ile-Thr-Thr-Phe-Th
r-Ala-Leu-Thr-Glu-Lysである。さらに154個のアミノ酸
形態のアミノ酸はN末端Ala、−14からカルボキシル末
端Lys、−1と番号付けされる。−14位のアミノ末端ア
ラニン残基はアセチル化することができる。ヒトaFGFの
3番目の形態は139個のアミノ酸を含有し、アミノ末端
フェニルアラニン残基が除かれた140個のヒトアミノ酸
形態に相当する。アミノ末端アスパラギン残基はヒトaF
GFの139個のアミノ酸形態ではアスパラギン酸にアミド
分解することができる。140個および139個のアミノ酸形
態は、ヒトミクロ不均質形態の最も好適な形態である。
140個のアミノ酸形態は、第3表に示される。ギメネツ
−ガレゴ等バイオケム.バイオフィス.レス.コム.
(Biochem.Biophys.Res.Comm.)第138巻、611〜617頁
(1986年)。
を示す。ヒトaFGFの最も好適なミクロ不均質形態は154
個のアミノ酸形態、140個のアミノ酸形態および139個の
アミノ酸形態を包含する。140個のヒトアミノ酸形態は
第8表に示されるように11個のアミノ酸によってウシ形
態と異なる。154個のアミノ酸形態は、140個のアミノ酸
形態と全く同一のアミノ酸配列を含み、更に一つの例外
を除き154個のウシアミノ酸形態に関連した14個のアミ
ノ酸の配列を含有する。154個のヒト形態ではN−末端
から5番目の位置、即ち140個のアミノ酸形態のN末端P
heから数えて−10位のアミノ酸はイソロイシンであり、
ウシ形態ではスレオニンである。さらに14個のアミノ酸
ヒトN末端配列はAla-Glu-Gly-Glu-Ile-Thr-Thr-Phe-Th
r-Ala-Leu-Thr-Glu-Lysである。さらに154個のアミノ酸
形態のアミノ酸はN末端Ala、−14からカルボキシル末
端Lys、−1と番号付けされる。−14位のアミノ末端ア
ラニン残基はアセチル化することができる。ヒトaFGFの
3番目の形態は139個のアミノ酸を含有し、アミノ末端
フェニルアラニン残基が除かれた140個のヒトアミノ酸
形態に相当する。アミノ末端アスパラギン残基はヒトaF
GFの139個のアミノ酸形態ではアスパラギン酸にアミド
分解することができる。140個および139個のアミノ酸形
態は、ヒトミクロ不均質形態の最も好適な形態である。
140個のアミノ酸形態は、第3表に示される。ギメネツ
−ガレゴ等バイオケム.バイオフィス.レス.コム.
(Biochem.Biophys.Res.Comm.)第138巻、611〜617頁
(1986年)。
ヒトaFGFの140個のアミノ酸形態組換え体のヌクレオ
チド配列は第4表に示される。
チド配列は第4表に示される。
哺乳類aFGFの遺伝子を得るための好適な操作は遺伝子
を合成することであり、これが翻訳タンパク質の最適化
および変異誘発の容易さを与えるからである。遺伝子
は、ヒトを含むいかなる動物からも得られるaFGFのミク
ロ不均質形態のアミノ酸配列に基づいて合成することが
できる。好適な方法はウシアミノ酸配列をaFGFとして使
用し、他の種類の遺伝子を作成するために塩基配列を化
学的に点変異するものである、リネメイヤー(Linemeye
r)等、バイオテクノル.(Biotechnol.)第5巻、960
〜965頁(1987年)。
を合成することであり、これが翻訳タンパク質の最適化
および変異誘発の容易さを与えるからである。遺伝子
は、ヒトを含むいかなる動物からも得られるaFGFのミク
ロ不均質形態のアミノ酸配列に基づいて合成することが
できる。好適な方法はウシアミノ酸配列をaFGFとして使
用し、他の種類の遺伝子を作成するために塩基配列を化
学的に点変異するものである、リネメイヤー(Linemeye
r)等、バイオテクノル.(Biotechnol.)第5巻、960
〜965頁(1987年)。
合成遺伝子はギメネツ−ガレゴ等、サイエンス第230
巻、1385〜1388頁(1985年)に記載される決定ウシアミ
ノ酸配列およびギメネツ−ガレゴ等、バイオケム.バイ
オフィス.レス.コム.第138巻、611〜617頁(1986
年)に記載されるヒトアミノ酸配列に基づき、第1表お
よび第3表に示される。ウシaFGFの140個のアミノ酸形
態の固有のヌクレオチド配列は、イタクラ等サイエンス
第198巻、1056〜1063頁(1977年)と類似の技術によっ
てアミノ酸配列の逆翻訳から誘導される。ウシaFGFの天
然アミノ酸配列に対応する種々の新規なヌクレオチド配
列は次の表に示される。
巻、1385〜1388頁(1985年)に記載される決定ウシアミ
ノ酸配列およびギメネツ−ガレゴ等、バイオケム.バイ
オフィス.レス.コム.第138巻、611〜617頁(1986
年)に記載されるヒトアミノ酸配列に基づき、第1表お
よび第3表に示される。ウシaFGFの140個のアミノ酸形
態の固有のヌクレオチド配列は、イタクラ等サイエンス
第198巻、1056〜1063頁(1977年)と類似の技術によっ
てアミノ酸配列の逆翻訳から誘導される。ウシaFGFの天
然アミノ酸配列に対応する種々の新規なヌクレオチド配
列は次の表に示される。
ウシ遺伝子は、1個の制限酵素切断部位を含む先導部
および翻訳開始部位であるN−末端メチオニンコドンを
含む。また遺伝子はタンデム翻訳停止コドンと2つの制
限酵素切断部位を持つ尾部を有する。遺伝コードの重複
は、塩基配列を選択する余地があり、順次遺伝子中に固
有の制限酵素切断部位を組込むことができる。制限酵素
切断部位の位置を有する好適なウシ遺伝子塩基配列は次
の表に示される。
および翻訳開始部位であるN−末端メチオニンコドンを
含む。また遺伝子はタンデム翻訳停止コドンと2つの制
限酵素切断部位を持つ尾部を有する。遺伝コードの重複
は、塩基配列を選択する余地があり、順次遺伝子中に固
有の制限酵素切断部位を組込むことができる。制限酵素
切断部位の位置を有する好適なウシ遺伝子塩基配列は次
の表に示される。
二重鎖分子の各々の連鎖に対する遺伝子配列は8個の
ヌクレオチド配列にランダムに分けられる。オリゴヌク
レオチドは二重鎖DNAを形成することができる重複して
いる末端で構成される。次の表は、ウシaFGF遺伝子を生
成するために使用される多数のオリゴヌクレオチド配置
の1つを含む。
ヌクレオチド配列にランダムに分けられる。オリゴヌク
レオチドは二重鎖DNAを形成することができる重複して
いる末端で構成される。次の表は、ウシaFGF遺伝子を生
成するために使用される多数のオリゴヌクレオチド配置
の1つを含む。
第7表に例示されたオリゴヌクレオチドはオリゴヌク
レオチドサブユニットの具体例として存在するにすぎず
それらに限定されるものとして解釈されるべきではな
い。オリゴヌクレオチドの重複および配列を示す複合塩
基配列は第2表に例示される。
レオチドサブユニットの具体例として存在するにすぎず
それらに限定されるものとして解釈されるべきではな
い。オリゴヌクレオチドの重複および配列を示す複合塩
基配列は第2表に例示される。
ウシ遺伝子は、まずタンパク質のN末端部分に対応す
る半分と2番目のC末端の半分の2段階で組み立てられ
る。一般にオリゴヌクレオチドはATPあるいは32P−標識
ATPの存在下でT4ポリヌクレオチドキナーゼで5′がリ
ン酸化(キナーゼ化)される。各段階の1番目の反応で
は遺伝子の片方の鎖を形成するオリゴヌクレオチドが、
最も5′側に位置するオリゴヌクレオチドを除いてキナ
ーゼ化される。2番目の反応では、もう一方の鎖を形成
するオリゴヌクレオチドが、最も5′側に位置するオリ
ゴヌクレオチドを除いてキナーゼ化される。キナーゼ化
されたオリゴヌクレオチドを使用する場合、添加された
オリゴヌクレオチドの約1%が後で生成物の同定を行な
うために32P標識される。アニーリングは約60mM TRIS、
pH約7.6、約5mMジチオスレイトール(DTT)、約10mM Mg
Cl2および約30μM ATPを含むようなものであるがこれに
限定されない適当な緩衝液中約90℃で約4時間なった後
約60℃に速かに移し、約30℃に徐冷した。連結反応は約
60mM TRIS、pH約7.6、約10mM DTT、約10mM MgCl2、約1m
M ATPおよび約0.03ユニットT4 DNAリガーゼのようなも
のであるがこれに限定されない適当な緩衝液中約20℃で
約1/2時間行なわれる。
る半分と2番目のC末端の半分の2段階で組み立てられ
る。一般にオリゴヌクレオチドはATPあるいは32P−標識
ATPの存在下でT4ポリヌクレオチドキナーゼで5′がリ
ン酸化(キナーゼ化)される。各段階の1番目の反応で
は遺伝子の片方の鎖を形成するオリゴヌクレオチドが、
最も5′側に位置するオリゴヌクレオチドを除いてキナ
ーゼ化される。2番目の反応では、もう一方の鎖を形成
するオリゴヌクレオチドが、最も5′側に位置するオリ
ゴヌクレオチドを除いてキナーゼ化される。キナーゼ化
されたオリゴヌクレオチドを使用する場合、添加された
オリゴヌクレオチドの約1%が後で生成物の同定を行な
うために32P標識される。アニーリングは約60mM TRIS、
pH約7.6、約5mMジチオスレイトール(DTT)、約10mM Mg
Cl2および約30μM ATPを含むようなものであるがこれに
限定されない適当な緩衝液中約90℃で約4時間なった後
約60℃に速かに移し、約30℃に徐冷した。連結反応は約
60mM TRIS、pH約7.6、約10mM DTT、約10mM MgCl2、約1m
M ATPおよび約0.03ユニットT4 DNAリガーゼのようなも
のであるがこれに限定されない適当な緩衝液中約20℃で
約1/2時間行なわれる。
連結されたオリゴヌクレオチドはエタノール沈殿、つ
いでポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製され
る。オリゴヌクレオチドは約80%ホルムアミド約20μ
l、約50mM TRIS−ホウ酸塩、約pH8.3、約1mMエチレン
ジアミン四酢酸(EDTA)、約0.1%(W/V)キシレンシア
ノールおよび約0.1%(W/V)ブロモフェノールブルーを
含む緩衝液に再び溶解する。各々の試料を約90℃で約3
分間加熱し、約10%尿素−ポリアクリルアミドゲル中約
75ワットで約5時間電気泳動にかけた。231塩基N末端
バンドを切り出し、混合してpH約8において約1mM EDTA
を含む約0.5M酢酸アンモニウム中約4℃で溶離する209
塩基C末端バンドを同様の方法で処理する。
いでポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製され
る。オリゴヌクレオチドは約80%ホルムアミド約20μ
l、約50mM TRIS−ホウ酸塩、約pH8.3、約1mMエチレン
ジアミン四酢酸(EDTA)、約0.1%(W/V)キシレンシア
ノールおよび約0.1%(W/V)ブロモフェノールブルーを
含む緩衝液に再び溶解する。各々の試料を約90℃で約3
分間加熱し、約10%尿素−ポリアクリルアミドゲル中約
75ワットで約5時間電気泳動にかけた。231塩基N末端
バンドを切り出し、混合してpH約8において約1mM EDTA
を含む約0.5M酢酸アンモニウム中約4℃で溶離する209
塩基C末端バンドを同様の方法で処理する。
aFGFのN末端あるいはC末端部分をコードしている合
成遺伝子配列はpBR322プラスミドに組込まれる。aFGF遺
伝子が組込まれaFGF遺伝子を発現することができる他の
プラスミドの使用が本発明の範囲内に包含されることは
特に望まれ企図される。約300fmoleまたは約100fmoleの
再アニールさせた回収231塩基対のN末端側オリゴヌク
レオチドは約100fmoleのアガロースゲルで精製した約3.
9キロベース(kb)EcoRl-BamHI pBR 322に各々連結され
る。209bpC末端はBamHI-SalI pBR 322を使用して同様の
方法で組み立てられる。連結反応は、約25mM TRIS、pH
約7.8、約1mM DTT、約10mM MgCl2、約0.4mM ATPを含む
緩衝液中で約1ユニットのT4 DNAリガーゼを用いて約1
時間約20℃で行なわれる。各々の半遺伝子連結ベクター
は大腸菌RPI(ベテスダ リサーチ ラボラトリーズ、B
RL)のような細菌のコンピテント細胞を供給者の方法に
したがって形質転換するために使用される。形質転換さ
れた細胞はアンピシリン存在下での増殖により選択さ
れ、231ベースペア(bp)EcoRl-BamHIインサートあるい
は209bp BamHI-SalIインサートを有するかは微小溶菌液
プラスミド標品の制限解析によって選別される。
成遺伝子配列はpBR322プラスミドに組込まれる。aFGF遺
伝子が組込まれaFGF遺伝子を発現することができる他の
プラスミドの使用が本発明の範囲内に包含されることは
特に望まれ企図される。約300fmoleまたは約100fmoleの
再アニールさせた回収231塩基対のN末端側オリゴヌク
レオチドは約100fmoleのアガロースゲルで精製した約3.
9キロベース(kb)EcoRl-BamHI pBR 322に各々連結され
る。209bpC末端はBamHI-SalI pBR 322を使用して同様の
方法で組み立てられる。連結反応は、約25mM TRIS、pH
約7.8、約1mM DTT、約10mM MgCl2、約0.4mM ATPを含む
緩衝液中で約1ユニットのT4 DNAリガーゼを用いて約1
時間約20℃で行なわれる。各々の半遺伝子連結ベクター
は大腸菌RPI(ベテスダ リサーチ ラボラトリーズ、B
RL)のような細菌のコンピテント細胞を供給者の方法に
したがって形質転換するために使用される。形質転換さ
れた細胞はアンピシリン存在下での増殖により選択さ
れ、231ベースペア(bp)EcoRl-BamHIインサートあるい
は209bp BamHI-SalIインサートを有するかは微小溶菌液
プラスミド標品の制限解析によって選別される。
適当なサイズのインサートを含むクローンのDNA配列
は、マキサムおよびギルバート、プロク.ナトル.アカ
ド.サイ.USA第74巻、560〜564頁(1977年)化学的DNA
配列決定手法によって決定される。
は、マキサムおよびギルバート、プロク.ナトル.アカ
ド.サイ.USA第74巻、560〜564頁(1977年)化学的DNA
配列決定手法によって決定される。
最終の全長aFGF合成遺伝子は、N末端半クローンを制
限酵素BamHIおよびSalIで切断し、アルカリ性ホスファ
ターゼで処理し、これをC末端半クローンのゲル精製20
9bp BamHI-SalIインサートに連結させることによってク
ローニングされた。この連結物質は、前のようにRRIコ
ンピテント細胞を形質転換するために使用された。
限酵素BamHIおよびSalIで切断し、アルカリ性ホスファ
ターゼで処理し、これをC末端半クローンのゲル精製20
9bp BamHI-SalIインサートに連結させることによってク
ローニングされた。この連結物質は、前のようにRRIコ
ンピテント細胞を形質転換するために使用された。
合成aFGF遺伝子の発現は、多数の異なったプロモータ
ー発現系によって達成される無傷のaFGF遺伝子の発現に
対する他のプロモーター発現系の使用が本発明の範囲に
包含されることが望まれ企図される。好適な構成物はデ
ボエル等、プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第80巻、
21〜25頁(1983年)によって記載される大腸菌trpプロ
モーターとlacプロモーターの領域間のハイブリッドで
あるtacプロモーターを使用する。tacプロモーターとrr
nB rRNA転写ターミネーターを含むプラスミドpKK223−
3(ファーマシア)を修飾してpBR322由来のSalI制限酵
素部位を除去した。rrnB rRNAターミネーターは強力な
プロモーターによって発現させるために示されている、
ゲンツ等、プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第78巻、
4936〜4940頁(1981年)ブロシウス遺伝子第27巻、161
〜172頁(1984年)。
ー発現系によって達成される無傷のaFGF遺伝子の発現に
対する他のプロモーター発現系の使用が本発明の範囲に
包含されることが望まれ企図される。好適な構成物はデ
ボエル等、プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第80巻、
21〜25頁(1983年)によって記載される大腸菌trpプロ
モーターとlacプロモーターの領域間のハイブリッドで
あるtacプロモーターを使用する。tacプロモーターとrr
nB rRNA転写ターミネーターを含むプラスミドpKK223−
3(ファーマシア)を修飾してpBR322由来のSalI制限酵
素部位を除去した。rrnB rRNAターミネーターは強力な
プロモーターによって発現させるために示されている、
ゲンツ等、プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第78巻、
4936〜4940頁(1981年)ブロシウス遺伝子第27巻、161
〜172頁(1984年)。
pKK223−3プラスミドDNAは2.7kb DNA断片を生成する
制限酵素で切断されてクローンpKK2.7を生ずる。合成aF
GF遺伝子は、そのpBR322ベクターから切断され、EcoRI
及びSalIで制限切断されたpKK2.7プラスミドに取込まれ
る。第1図に示される得られた組換え体は大腸菌JM105
(ファーマシア)またはDH5(BRL)に形質転換され発現
される。
制限酵素で切断されてクローンpKK2.7を生ずる。合成aF
GF遺伝子は、そのpBR322ベクターから切断され、EcoRI
及びSalIで制限切断されたpKK2.7プラスミドに取込まれ
る。第1図に示される得られた組換え体は大腸菌JM105
(ファーマシア)またはDH5(BRL)に形質転換され発現
される。
部位特異的変異誘発は、aFGFの1哺乳類のアミノ酸配
列を別の種類のaFGFアミノ酸配列に転換するのに有効な
方法である。次の説明はウシaFGFの140個のアミノ酸形
態(天然形態に従って数えて)のヒトaFGFへの部位特異
的突然変異転換に関するがこの方法は、いかなる哺乳類
aFGFも、他の種類のものに転換するために使用すること
ができる。転換について唯一の制限は両aFGFのアミノ酸
配列が既知でなければならないことである。次の表は、
置換されねばならないアミノ酸および置換基が生成され
る第6表のウシaFGFアミノ酸地図の位置を列挙する。
列を別の種類のaFGFアミノ酸配列に転換するのに有効な
方法である。次の説明はウシaFGFの140個のアミノ酸形
態(天然形態に従って数えて)のヒトaFGFへの部位特異
的突然変異転換に関するがこの方法は、いかなる哺乳類
aFGFも、他の種類のものに転換するために使用すること
ができる。転換について唯一の制限は両aFGFのアミノ酸
配列が既知でなければならないことである。次の表は、
置換されねばならないアミノ酸および置換基が生成され
る第6表のウシaFGFアミノ酸地図の位置を列挙する。
ウシ遺伝子配列でのようにヒト遺伝子配列を表わす8
個のオリゴヌクレオチドはウシオリゴヌクレオチドに対
して使用したと同様の操作によって構成される。次の表
は、ヒトaFGF遺伝子を生成するために使用される多数の
オリゴヌクレオチド配列の1組を含む。
個のオリゴヌクレオチドはウシオリゴヌクレオチドに対
して使用したと同様の操作によって構成される。次の表
は、ヒトaFGF遺伝子を生成するために使用される多数の
オリゴヌクレオチド配列の1組を含む。
クローニングされた合成ウシaFGF遺伝子は、一連の指
向点突然変異によってaFGFに対するヒト合成遺伝子に転
換される。クローン遺伝子のオリゴヌクレオチド指向変
異誘発は、ウシaFGFの塩基配列を変化させるので得られ
たアミノ酸配列は第8表に示される置換アミノ酸を含有
し、ヒトaFGFである。欠失はウシ遺伝子中でなされてaF
GFの139個のヒトアミノ酸ミクロ不均質形態の生成に対
してアミノ末端フェニルアラニンが除去される。点突然
変異は2番目の位置のアスパラギンをアスパラギン酸に
置換するために行なわれる。他方アスパラギンはアスパ
ラギン酸にアミノ分解される。これらの操作を実施する
方法は以下に記載されあるいは当業界で既知である。オ
リゴヌクレオチド指向変異誘発は、当業界で既知の標準
操作を使用して行なわれる。ゾラーおよびスミス、メソ
ッズインエンザイモロジー、第100巻、468〜500頁(198
3年)、ノリス等、ヌクレイック アシッズ リサーチ
第11巻、5103〜5112頁(1983年)およびゾラーおよびス
ミス、DNA3巻、479〜488頁(1984年)。ウシ型からヒト
型に転換するための点突然変異は、標準化されたオリゴ
ヌクレオチド指向変異誘発によって行なわれ、次の表に
示される。塩基突然変異誘発の位置は第10表に示される
ことができる。
向点突然変異によってaFGFに対するヒト合成遺伝子に転
換される。クローン遺伝子のオリゴヌクレオチド指向変
異誘発は、ウシaFGFの塩基配列を変化させるので得られ
たアミノ酸配列は第8表に示される置換アミノ酸を含有
し、ヒトaFGFである。欠失はウシ遺伝子中でなされてaF
GFの139個のヒトアミノ酸ミクロ不均質形態の生成に対
してアミノ末端フェニルアラニンが除去される。点突然
変異は2番目の位置のアスパラギンをアスパラギン酸に
置換するために行なわれる。他方アスパラギンはアスパ
ラギン酸にアミノ分解される。これらの操作を実施する
方法は以下に記載されあるいは当業界で既知である。オ
リゴヌクレオチド指向変異誘発は、当業界で既知の標準
操作を使用して行なわれる。ゾラーおよびスミス、メソ
ッズインエンザイモロジー、第100巻、468〜500頁(198
3年)、ノリス等、ヌクレイック アシッズ リサーチ
第11巻、5103〜5112頁(1983年)およびゾラーおよびス
ミス、DNA3巻、479〜488頁(1984年)。ウシ型からヒト
型に転換するための点突然変異は、標準化されたオリゴ
ヌクレオチド指向変異誘発によって行なわれ、次の表に
示される。塩基突然変異誘発の位置は第10表に示される
ことができる。
ウシaFGF遺伝子の突然変異を促進するために一重鎖DN
Aバクテリオファージベクターである標準ベクター、M13
mp19に取り込ませる。ウシpKK-aFGFプラスミドをEcoRI
とSalIで切断し得られた440bp断片はゲル精製される。
ベクターM13mp19RF DNAを同じ2つのエンドヌクレアー
ゼで切断し、末端を順次細菌アルカリ性ホスファターゼ
で脱リン酸化する。ベクターDNAとaFGF遺伝子断片DNAを
連結させ、混合物は大腸菌DH5細胞を形質転換するため
に使用する。ウシaFGF遺伝子を含むファージクローン、
M13mp19−baFGFが選択される。
Aバクテリオファージベクターである標準ベクター、M13
mp19に取り込ませる。ウシpKK-aFGFプラスミドをEcoRI
とSalIで切断し得られた440bp断片はゲル精製される。
ベクターM13mp19RF DNAを同じ2つのエンドヌクレアー
ゼで切断し、末端を順次細菌アルカリ性ホスファターゼ
で脱リン酸化する。ベクターDNAとaFGF遺伝子断片DNAを
連結させ、混合物は大腸菌DH5細胞を形質転換するため
に使用する。ウシaFGF遺伝子を含むファージクローン、
M13mp19−baFGFが選択される。
第9表に示されるヒトオリゴマーはリン酸化され個々
にM13mp19−baFGF一重鎖ファージDNAにアニーリングさ
れる。閉環二重鎖分子はT4 DNAリガーゼとDNAポリメラ
ーゼIクレノウ断片で製造される。標本は各々JM105コ
ンピテント細胞を形質転換するために使用され得られた
形質転換細胞プラークはポリヌクレオチドキナーゼを使
用して標識された適当なオリゴマーを用いるハイブリッ
ト形成によって選択される。一重鎖DNAは、ヒトオリゴ
マー4突然変異を含むファージクローンから分離され上
記の操作をヒトオリゴマー5を使用して繰り返し、オリ
ゴマー4と5突然変異の両方を含むクローンを生成す
る。
にM13mp19−baFGF一重鎖ファージDNAにアニーリングさ
れる。閉環二重鎖分子はT4 DNAリガーゼとDNAポリメラ
ーゼIクレノウ断片で製造される。標本は各々JM105コ
ンピテント細胞を形質転換するために使用され得られた
形質転換細胞プラークはポリヌクレオチドキナーゼを使
用して標識された適当なオリゴマーを用いるハイブリッ
ト形成によって選択される。一重鎖DNAは、ヒトオリゴ
マー4突然変異を含むファージクローンから分離され上
記の操作をヒトオリゴマー5を使用して繰り返し、オリ
ゴマー4と5突然変異の両方を含むクローンを生成す
る。
次の操作では、これらのM13ベースクローンにおける
ウシ型からヒト型への配列突然変異を1つのpBR322ベー
スクローンに組み合わせた。RF DNAはヒトオリゴマー
1、2、6および8によって列挙された塩基変化を含む
クローンから製造された。ヒト1突然変異体クローンの
DNAはEcoRIで切断され、末端は細菌アルカリ性ホスファ
ターゼで脱リン酸化され、DNAはHindIIIで切断された。
ヒト2突然変異体DNAは、HindIIIで切断され、ホスファ
ターゼで処理された後BamHIで切断された。ヒト6突然
変異体DNAは、BamHIで切断され、ホスファターゼ処理さ
れた後ApaIで切断された。同様にヒト8突然変異体DNA
は、ApaIで切断され、末端が脱リン酸化され、DNAはSal
Iで切断された。これらの4つのDNA標本は2%アガロー
スにより電気泳動にかけられ、各ヒト1、2、6および
8突然変異を含む突然変異体DNAからの45bp、190bp、13
5bpおよび70bpの断片はゲルから溶離された。各断片容
量は、T4DNAリガーゼでpBR322からのゲル精製3.7kb Eco
Rl-SalI断片に集合的に連結され供給者によって記載さ
れる通り大腸菌DH5コンピテント細胞(BRL)を形質転換
するために使用される。全部で4つの突然変異体オリゴ
マーによって列挙された突然変異を含むクローンは各々
のオリゴマーから製造された放射性標識プローブを用い
るハイブリッド形成によって選択される。ヒト3突然変
異体M13クローンの切断RF DNAから分離された140bp Kpn
I-BamHI DNA断片はこのヒト1−2−6−8突然変異体D
NAのエンドヌクレアーゼ切断生成物に連結されDH5コン
ピテント細胞に形質転換されてヒト1−2−3−6−8
突然変異を有するクローンを生成する。この後者のクロ
ーンのBamHI-PstI消化断片はヒト4−5M13ベースクロー
ンからのRF DNAのBamHI-PstI消化断片に連結され、連結
混合物はDH5コンピテント細胞を形質転換するために使
用される。ヒト1−2−3−4−5−6−8突然変異を
含むクローンはオリゴマーハイブリッド形成により選択
され、この組変えプラスミドのaFGF遺伝子EcoRI-SalI D
NA断片はM13mp18(BRL)のホスファターゼ処理EcoRI-Sa
lI-切断RF DNAに連結される。コンピテントDH5細胞はこ
の連結DNAで形質転換され、形質転換された細胞はJM105
宿主細胞に平板にされる。このクローンの一重鎖ファー
ジDNAはヒト7オリゴマーとアニーリングされ、所望の
突然変異全てを含むM13クローンは上述した操作により
得られた。ヒトaFGFはM13mp18−haFGFに指定される。
ウシ型からヒト型への配列突然変異を1つのpBR322ベー
スクローンに組み合わせた。RF DNAはヒトオリゴマー
1、2、6および8によって列挙された塩基変化を含む
クローンから製造された。ヒト1突然変異体クローンの
DNAはEcoRIで切断され、末端は細菌アルカリ性ホスファ
ターゼで脱リン酸化され、DNAはHindIIIで切断された。
ヒト2突然変異体DNAは、HindIIIで切断され、ホスファ
ターゼで処理された後BamHIで切断された。ヒト6突然
変異体DNAは、BamHIで切断され、ホスファターゼ処理さ
れた後ApaIで切断された。同様にヒト8突然変異体DNA
は、ApaIで切断され、末端が脱リン酸化され、DNAはSal
Iで切断された。これらの4つのDNA標本は2%アガロー
スにより電気泳動にかけられ、各ヒト1、2、6および
8突然変異を含む突然変異体DNAからの45bp、190bp、13
5bpおよび70bpの断片はゲルから溶離された。各断片容
量は、T4DNAリガーゼでpBR322からのゲル精製3.7kb Eco
Rl-SalI断片に集合的に連結され供給者によって記載さ
れる通り大腸菌DH5コンピテント細胞(BRL)を形質転換
するために使用される。全部で4つの突然変異体オリゴ
マーによって列挙された突然変異を含むクローンは各々
のオリゴマーから製造された放射性標識プローブを用い
るハイブリッド形成によって選択される。ヒト3突然変
異体M13クローンの切断RF DNAから分離された140bp Kpn
I-BamHI DNA断片はこのヒト1−2−6−8突然変異体D
NAのエンドヌクレアーゼ切断生成物に連結されDH5コン
ピテント細胞に形質転換されてヒト1−2−3−6−8
突然変異を有するクローンを生成する。この後者のクロ
ーンのBamHI-PstI消化断片はヒト4−5M13ベースクロー
ンからのRF DNAのBamHI-PstI消化断片に連結され、連結
混合物はDH5コンピテント細胞を形質転換するために使
用される。ヒト1−2−3−4−5−6−8突然変異を
含むクローンはオリゴマーハイブリッド形成により選択
され、この組変えプラスミドのaFGF遺伝子EcoRI-SalI D
NA断片はM13mp18(BRL)のホスファターゼ処理EcoRI-Sa
lI-切断RF DNAに連結される。コンピテントDH5細胞はこ
の連結DNAで形質転換され、形質転換された細胞はJM105
宿主細胞に平板にされる。このクローンの一重鎖ファー
ジDNAはヒト7オリゴマーとアニーリングされ、所望の
突然変異全てを含むM13クローンは上述した操作により
得られた。ヒトaFGFはM13mp18−haFGFに指定される。
ヘパリン不在下では純粋なaFGFは恐らく不正確に安定
化した分子内ジスルフィド結合の生成および分子間ジス
ルフィド結合によって生成される集塊のために活性が低
くなる。ジスルフィド共有結合は2つの分離したポリペ
プチド鎖の連鎖間ジスルフィド結合あるいは一重鎖分子
内連鎖ジスルフィド内の異なった位置のいずれかの2つ
のシステイン残基間で形成される。酵素酸化的ヨウ素化
を行なった場合活性分子はpH約9.1において3M塩化グア
ニジニウムの存在下20mMジチオトレイトールで還元する
ことによって回収することができる。本発明は、特定の
位置に対する位置指向変異誘発または異質の分子内また
は分子間共有結合を形成することができるアミノ酸およ
び酸化を受けやすいアミノ酸の置換或いは欠失を利用す
る。本明細書中で使用される置換は、所望のアミノ酸が
望まれないアミノ酸に置換されるようにaFGFのDNA塩基
配列の慎重な変化を意味する。望まれないアミノ酸は、
望ましくない共有結合特にジスルフィド結合を形成する
ものまたは空気酸化されるものであって分子の生物学的
活性を低下させる可能性のあるものをさす。本明細書中
で使用される欠失は、望ましくないアミノ酸の脱離を生
じるaFGFのDNA塩基配列の慎重な変化を意味する。分子
内および分子間共有結合生成に関連する第一級アミノ酸
はシステインであり、一方酸化傾向のあるアミノ酸はシ
ステイン、メチオニンおよびトリプトファンを包含す
る。システイン残基は、ジスルフィド結合を形成しない
いかなるアミノ酸にも置き換えることができる。システ
インの置換に好適なアミノ酸はセリンである。酸化傾向
のアミノ酸は酸化に抵抗するいかなるアミノ酸にも置き
換えることができ、アラニン、バリン、ロイシンおよび
イソロイシンを包含するがこれらに限定されない。
化した分子内ジスルフィド結合の生成および分子間ジス
ルフィド結合によって生成される集塊のために活性が低
くなる。ジスルフィド共有結合は2つの分離したポリペ
プチド鎖の連鎖間ジスルフィド結合あるいは一重鎖分子
内連鎖ジスルフィド内の異なった位置のいずれかの2つ
のシステイン残基間で形成される。酵素酸化的ヨウ素化
を行なった場合活性分子はpH約9.1において3M塩化グア
ニジニウムの存在下20mMジチオトレイトールで還元する
ことによって回収することができる。本発明は、特定の
位置に対する位置指向変異誘発または異質の分子内また
は分子間共有結合を形成することができるアミノ酸およ
び酸化を受けやすいアミノ酸の置換或いは欠失を利用す
る。本明細書中で使用される置換は、所望のアミノ酸が
望まれないアミノ酸に置換されるようにaFGFのDNA塩基
配列の慎重な変化を意味する。望まれないアミノ酸は、
望ましくない共有結合特にジスルフィド結合を形成する
ものまたは空気酸化されるものであって分子の生物学的
活性を低下させる可能性のあるものをさす。本明細書中
で使用される欠失は、望ましくないアミノ酸の脱離を生
じるaFGFのDNA塩基配列の慎重な変化を意味する。分子
内および分子間共有結合生成に関連する第一級アミノ酸
はシステインであり、一方酸化傾向のあるアミノ酸はシ
ステイン、メチオニンおよびトリプトファンを包含す
る。システイン残基は、ジスルフィド結合を形成しない
いかなるアミノ酸にも置き換えることができる。システ
インの置換に好適なアミノ酸はセリンである。酸化傾向
のアミノ酸は酸化に抵抗するいかなるアミノ酸にも置き
換えることができ、アラニン、バリン、ロイシンおよび
イソロイシンを包含するがこれらに限定されない。
本発明は不正確な分子内または分子間結合または酸化
的変化の生成のため天然または組換え体aFGFの活性を低
下させるかまたは不活性にすることができる1種以上の
システインおよびいくつかの非末端メチオニン残基の位
置特異的突然変異を包含することを企図している。ヒト
およびウシ組換え体および天然タンパク質は、ウシおよ
びヒト両aFGFの140個の天然アミノ酸形態によって定義
される通り16および83位に共通に位置した2つのシステ
イン残基および67位に共通に位置したメチオニン残基を
含有する。ウシおよびヒトaFGFの各々は各々47および11
7位に3番目のシステイン残基を含有する。ジスルフィ
ド結合したシステイン残基の位置は同族タンパク質中で
は保存性が高いため、共通のシステイン残基はジスルフ
ィド結合をする可能性が最も高い、従ってウシ及びヒト
aFGFで異なった位置にある3番目のシステイン残基は、
十分に活性のあるタンパク質中でジスルフィド結合して
いるとは考えにくい。本発明の新規な突然変異体aFGFは
共通でないシステイン残基で置換された形態を包含する
ばかりでなく、すべてのシステインが置換されるか欠失
されたもの、システインのいずれか1つまたは2つが置
換または欠失されたものさらにメチオニンが置換または
欠失されたものを包含する。位置指向変異誘発によるヒ
トまたはウシaFGF中のいずれか1つの特に特有のシステ
イン、すべてのシステイン3個のシステインまたはメチ
オニンの2つを置換または欠失することにより望ましく
ない分子内及び分子間ジスルフィド結合及び酸化形態の
生成を変えることができる。
的変化の生成のため天然または組換え体aFGFの活性を低
下させるかまたは不活性にすることができる1種以上の
システインおよびいくつかの非末端メチオニン残基の位
置特異的突然変異を包含することを企図している。ヒト
およびウシ組換え体および天然タンパク質は、ウシおよ
びヒト両aFGFの140個の天然アミノ酸形態によって定義
される通り16および83位に共通に位置した2つのシステ
イン残基および67位に共通に位置したメチオニン残基を
含有する。ウシおよびヒトaFGFの各々は各々47および11
7位に3番目のシステイン残基を含有する。ジスルフィ
ド結合したシステイン残基の位置は同族タンパク質中で
は保存性が高いため、共通のシステイン残基はジスルフ
ィド結合をする可能性が最も高い、従ってウシ及びヒト
aFGFで異なった位置にある3番目のシステイン残基は、
十分に活性のあるタンパク質中でジスルフィド結合して
いるとは考えにくい。本発明の新規な突然変異体aFGFは
共通でないシステイン残基で置換された形態を包含する
ばかりでなく、すべてのシステインが置換されるか欠失
されたもの、システインのいずれか1つまたは2つが置
換または欠失されたものさらにメチオニンが置換または
欠失されたものを包含する。位置指向変異誘発によるヒ
トまたはウシaFGF中のいずれか1つの特に特有のシステ
イン、すべてのシステイン3個のシステインまたはメチ
オニンの2つを置換または欠失することにより望ましく
ない分子内及び分子間ジスルフィド結合及び酸化形態の
生成を変えることができる。
位置特異的変異誘発はゲノムDNA、cDNAから生成され
た好ましくはウシまたはヒトr−aFGFでまたはヒトを含
む哺乳類からのaFGFのミクロ不均一形態に基づくタンパ
ク質のミクロ不均質形態の1種以上に対する遺伝子の組
み立てによって行なわれる。ゲノムDNAは、哺乳類の脳
または下垂体細胞から抽出され、マニアチス等、セル第
15巻、687〜701頁(1978年)の手法により高分子量のラ
ンダム分裂あるいはスミチエス等、サイエンス第202
巻、1284〜1289頁(1978年)の方法によって制限酵素で
の切断によってクローンに調製される。次にゲノムDNA
は、適当なクローニングベクター、一般に大腸菌λファ
ージに組込まれる、マニアチス等、モレキュラークロー
ニング、ラボラトリーマニュアル、コールドスプリング
ハーバーラボラトリー コールドスプリングハーバー、
ニューヨーク(1982年)参照。
た好ましくはウシまたはヒトr−aFGFでまたはヒトを含
む哺乳類からのaFGFのミクロ不均一形態に基づくタンパ
ク質のミクロ不均質形態の1種以上に対する遺伝子の組
み立てによって行なわれる。ゲノムDNAは、哺乳類の脳
または下垂体細胞から抽出され、マニアチス等、セル第
15巻、687〜701頁(1978年)の手法により高分子量のラ
ンダム分裂あるいはスミチエス等、サイエンス第202
巻、1284〜1289頁(1978年)の方法によって制限酵素で
の切断によってクローンに調製される。次にゲノムDNA
は、適当なクローニングベクター、一般に大腸菌λファ
ージに組込まれる、マニアチス等、モレキュラークロー
ニング、ラボラトリーマニュアル、コールドスプリング
ハーバーラボラトリー コールドスプリングハーバー、
ニューヨーク(1982年)参照。
cDNAをaFGFとして得るためにポリ(A)含有RNAは、
アビブおよびレダー、プロク.ナトル.アカド.サイ.
第69巻、1408〜1412頁(1972年)の方法によってaFGFを
発現する細胞から抽出される。cDNAはマニアチス等、モ
レキュラークローニング、ラボラトリーマニュアル、コ
ールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプ
リングハーバー、ニューヨーク(1982年)に記載される
標準手法を使用して逆転写酵素およびDNAポリメラーゼ
を使用して調製される。cDNAはウェンシンク等、セル第
3巻、315〜325頁(1974年)と同様の手法によって連結
され適当なベクター通常pBR322にクローンされる。
アビブおよびレダー、プロク.ナトル.アカド.サイ.
第69巻、1408〜1412頁(1972年)の方法によってaFGFを
発現する細胞から抽出される。cDNAはマニアチス等、モ
レキュラークローニング、ラボラトリーマニュアル、コ
ールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプ
リングハーバー、ニューヨーク(1982年)に記載される
標準手法を使用して逆転写酵素およびDNAポリメラーゼ
を使用して調製される。cDNAはウェンシンク等、セル第
3巻、315〜325頁(1974年)と同様の手法によって連結
され適当なベクター通常pBR322にクローンされる。
クローナルゲノムDNAまたはcDNAライブラリーはオリ
ゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリッド形成によ
りaFGF配列を含有するクローンを確認するために選別さ
れる。オリゴヌクレオチドハイブリッド法プローブの配
列はaFGFの決定アミノ酸配列に基づいている。マニアチ
ス等、上記、アンダーソンおよびキングストン、プロ
ク.ナトル.アカド.サイ.USA第80巻、6838〜6842頁
(1983年)およびサッグス等プロク.ナトル.アカド.
サイ.USA第78巻、6613〜6617頁(1981年)はゲノムおよ
びcDNAクローンを選別する種々の操作を記載している。
好適な操作は、上述の通り合成されたウシおよびヒト遺
伝子を特異的に点突然変異するものである。
ゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリッド形成によ
りaFGF配列を含有するクローンを確認するために選別さ
れる。オリゴヌクレオチドハイブリッド法プローブの配
列はaFGFの決定アミノ酸配列に基づいている。マニアチ
ス等、上記、アンダーソンおよびキングストン、プロ
ク.ナトル.アカド.サイ.USA第80巻、6838〜6842頁
(1983年)およびサッグス等プロク.ナトル.アカド.
サイ.USA第78巻、6613〜6617頁(1981年)はゲノムおよ
びcDNAクローンを選別する種々の操作を記載している。
好適な操作は、上述の通り合成されたウシおよびヒト遺
伝子を特異的に点突然変異するものである。
位置特異的変異誘発は、ゾラーおよびスミス、メソッ
ズ イン エンザイム.(Methods in Enzym.)第100
巻、468〜500頁(1983年)ノリス等、ヌクレイック ア
シズ レス.(Nucleic Acids Res.)第11巻、5103〜51
12頁(1983年)およびゾラーおよびスミス、DNA第3
巻、479〜488頁(1984年)の操作によりM13mp18−haFGF
またはM13mp19−baFGFのようなヒトまたはウシaFGF一重
鎖バクテリオファージ組換え体クローンで行なわれる。
各々の種に対する3個のオリゴヌクレオチドがヒトaFGF
遺伝子では16、83及び117位、そしてウシ遺伝子では1
6、47及び83位のシステインコドンの代わりにセリンコ
ドンを定義するようにデザインされる。1個のオリゴヌ
クレオチドは67位のヒトまたはウシaFGFのメチオニンコ
ドンの代わりにロイシンコドンを規定するようにデザイ
ンされる。合成されたヒトオリゴマーは次の表に示され
突然変異塩基は下線が引かれている。
ズ イン エンザイム.(Methods in Enzym.)第100
巻、468〜500頁(1983年)ノリス等、ヌクレイック ア
シズ レス.(Nucleic Acids Res.)第11巻、5103〜51
12頁(1983年)およびゾラーおよびスミス、DNA第3
巻、479〜488頁(1984年)の操作によりM13mp18−haFGF
またはM13mp19−baFGFのようなヒトまたはウシaFGF一重
鎖バクテリオファージ組換え体クローンで行なわれる。
各々の種に対する3個のオリゴヌクレオチドがヒトaFGF
遺伝子では16、83及び117位、そしてウシ遺伝子では1
6、47及び83位のシステインコドンの代わりにセリンコ
ドンを定義するようにデザインされる。1個のオリゴヌ
クレオチドは67位のヒトまたはウシaFGFのメチオニンコ
ドンの代わりにロイシンコドンを規定するようにデザイ
ンされる。合成されたヒトオリゴマーは次の表に示され
突然変異塩基は下線が引かれている。
類似のオリゴマーは、ウシaFGF遺伝子の適当な領域に
対して確認され特異的突然変異は以下に記載される通り
行なわれる。
対して確認され特異的突然変異は以下に記載される通り
行なわれる。
ヒトオリゴマーはリン酸化されM13mp18−haFGFまたは
M13mp19−baFGF一重鎖DNA個々にアニーリングされる。D
NAの2番目の連鎖はプライマーとしてアニーリングされ
たオリゴマーを使用して合成される。各々のシステイン
突然変異遺伝子は、大腸菌DH5コンピテント細胞のよう
な適当な宿主を形質転換するために使用される。形質転
換された細胞は大腸菌JM105細胞のようなM13ウィルスに
対して使用し得る宿主のローン上で培養する。形質転換
されたプラークは適当に標識されたオリゴマーを用いる
ハイブリッド形成によって選択される。ハイブリッド形
成の条件は各々のプローブに対して1個の塩基変化を含
有するハイブリッドの保持を防止するように最適にされ
る。一重鎖DNAはサンガー等、プロク.ナトル.アカ
ド.サイ.USA第74巻、5463〜5467頁(1977年)の方法を
使用するDNA配列解析のためにシステインからセリンへ
の突然変異の各々を含むファージクローンから分離され
る。RF DNAは各クローンごとに調製し、EcoRI及びSalI
で切断されアガロースゲル電気泳動によって精製され
る。精製440bpインサートはpKK2.7tacプロモーター発現
ベクターの2.7kbEcoRI-SalI DNA断片に個々に連結され
る。連結DNAはコンピテントDH5細胞を形質転換するため
に使用され、突然変異システインコドンを有するDNAを
含むクローンはハイブリッド形成によって適当なオリゴ
マーに選択される。各々のaFGF遺伝子インサートはマキ
サムおよびギルバート、メサッド イン エンザイモロ
ジー第65巻、499〜560頁(1980年)の方法によって配列
決定される。ヒトDNA由来の1個の塩基変化を含有する
クローンはタンパク質の置換位置に対してpKK−haFGF
(Ser16)、pKK−haFGF(Ser83)およびpKK−haFGF(Se
r117)に指定され、ウシDNAはpKK−baFGF(Ser16)、pK
K−baFGF(Ser47)およびpKK−baFGF(Ser83)に指定さ
れる。
M13mp19−baFGF一重鎖DNA個々にアニーリングされる。D
NAの2番目の連鎖はプライマーとしてアニーリングされ
たオリゴマーを使用して合成される。各々のシステイン
突然変異遺伝子は、大腸菌DH5コンピテント細胞のよう
な適当な宿主を形質転換するために使用される。形質転
換された細胞は大腸菌JM105細胞のようなM13ウィルスに
対して使用し得る宿主のローン上で培養する。形質転換
されたプラークは適当に標識されたオリゴマーを用いる
ハイブリッド形成によって選択される。ハイブリッド形
成の条件は各々のプローブに対して1個の塩基変化を含
有するハイブリッドの保持を防止するように最適にされ
る。一重鎖DNAはサンガー等、プロク.ナトル.アカ
ド.サイ.USA第74巻、5463〜5467頁(1977年)の方法を
使用するDNA配列解析のためにシステインからセリンへ
の突然変異の各々を含むファージクローンから分離され
る。RF DNAは各クローンごとに調製し、EcoRI及びSalI
で切断されアガロースゲル電気泳動によって精製され
る。精製440bpインサートはpKK2.7tacプロモーター発現
ベクターの2.7kbEcoRI-SalI DNA断片に個々に連結され
る。連結DNAはコンピテントDH5細胞を形質転換するため
に使用され、突然変異システインコドンを有するDNAを
含むクローンはハイブリッド形成によって適当なオリゴ
マーに選択される。各々のaFGF遺伝子インサートはマキ
サムおよびギルバート、メサッド イン エンザイモロ
ジー第65巻、499〜560頁(1980年)の方法によって配列
決定される。ヒトDNA由来の1個の塩基変化を含有する
クローンはタンパク質の置換位置に対してpKK−haFGF
(Ser16)、pKK−haFGF(Ser83)およびpKK−haFGF(Se
r117)に指定され、ウシDNAはpKK−baFGF(Ser16)、pK
K−baFGF(Ser47)およびpKK−baFGF(Ser83)に指定さ
れる。
システイン残基のいずれか2つまたは全て3つの置換
は多重点突然変異によってまたは上述の通りウシに対し
てM13mp19およびヒトに対してM13mp18にクローンされpK
K2.7にサブクローンされたヒトあるいはウシ組換え体野
生型および(Ser16)、(Ser47)、(Ser83)および(S
er117)突然変異体合成遺伝子の制限断片を組み合わせ
ることによって達成される。多数の突然変異が上述の通
りウシあるいはヒトの1個の突然変異aFGF構成物で行な
われることができるが次の例示はヒトaFGFを包含するこ
とは理解されるべきである。pKK−haFGF(Ser16、32)
およびpKK−haFGF(Ser16、32)組換え体はM13mp18(Se
r16)の0.23kb EcoRI-BamHI断片をpKK2.7に導入した後M
13mp18(Ser83)あるいはM13mp18(Ser117)からの0.2k
b BamHI-SalI断片を挿入することによって組み立てられ
る。pKK2.7ベクターは、マルチクローニング配列のBamH
I部位を残しながらtacプロモーターの上流でBamHI部位
を除去するために修飾される。対応する制限酵素で消化
した後連結反応および適当な宿主を形質転換してクロー
ンを選択し、組換え体約3.1kbに対して予期される分子
量を有するプラスミドを含有するものを選別する。適当
な細菌宿主は大腸菌DH5、JM105またはAB1899を包含する
ことができるが、これらに限定されない。
は多重点突然変異によってまたは上述の通りウシに対し
てM13mp19およびヒトに対してM13mp18にクローンされpK
K2.7にサブクローンされたヒトあるいはウシ組換え体野
生型および(Ser16)、(Ser47)、(Ser83)および(S
er117)突然変異体合成遺伝子の制限断片を組み合わせ
ることによって達成される。多数の突然変異が上述の通
りウシあるいはヒトの1個の突然変異aFGF構成物で行な
われることができるが次の例示はヒトaFGFを包含するこ
とは理解されるべきである。pKK−haFGF(Ser16、32)
およびpKK−haFGF(Ser16、32)組換え体はM13mp18(Se
r16)の0.23kb EcoRI-BamHI断片をpKK2.7に導入した後M
13mp18(Ser83)あるいはM13mp18(Ser117)からの0.2k
b BamHI-SalI断片を挿入することによって組み立てられ
る。pKK2.7ベクターは、マルチクローニング配列のBamH
I部位を残しながらtacプロモーターの上流でBamHI部位
を除去するために修飾される。対応する制限酵素で消化
した後連結反応および適当な宿主を形質転換してクロー
ンを選択し、組換え体約3.1kbに対して予期される分子
量を有するプラスミドを含有するものを選別する。適当
な細菌宿主は大腸菌DH5、JM105またはAB1899を包含する
ことができるが、これらに限定されない。
突然変異体haFGF(Ser16、83、117)はpKK−haFGF(S
er16、83)の0.13kb Sphl-Sall断片を117位のCysの代り
にSerをコードしているpKK−haFGF(Ser117)の対応す
る断片に置き換えることによって組み立てられる。pKK
−haFGF(Ser16、83)の3kb Sphl-Sall断片は、分取用
アガロースゲル電気泳動、電気溶離によって精製され、
同様の方法で5%ポリアクリルアミドゲルから精製され
るpKK−haFGF(Ser117)の0.13kb Sphl-Sall断片に連結
される。精製フラグメントは連結され、組換え体は上述
の通り選択される。
er16、83)の0.13kb Sphl-Sall断片を117位のCysの代り
にSerをコードしているpKK−haFGF(Ser117)の対応す
る断片に置き換えることによって組み立てられる。pKK
−haFGF(Ser16、83)の3kb Sphl-Sall断片は、分取用
アガロースゲル電気泳動、電気溶離によって精製され、
同様の方法で5%ポリアクリルアミドゲルから精製され
るpKK−haFGF(Ser117)の0.13kb Sphl-Sall断片に連結
される。精製フラグメントは連結され、組換え体は上述
の通り選択される。
pKK−haFGF(Ser83、117)突然変異体は、pKK−haFGF
の0.3kb Pstl断片非突然変異形態を83および117位のCys
の代わりにSerのコドンを包含するpKK−haFGF(Ser16、
83、117)断片に上記の技術を使用して置き換えること
によって組み立てられる。形質転換体はPstl-Sall消化
によって解析されて連結断片の配向が決定される。全て
の遺伝子はサンガー等、プロク.ナトル.アカド.サ
イ.USA第74巻、5463〜5467頁(1977年)のジデオキシ法
によって配列される。
の0.3kb Pstl断片非突然変異形態を83および117位のCys
の代わりにSerのコドンを包含するpKK−haFGF(Ser16、
83、117)断片に上記の技術を使用して置き換えること
によって組み立てられる。形質転換体はPstl-Sall消化
によって解析されて連結断片の配向が決定される。全て
の遺伝子はサンガー等、プロク.ナトル.アカド.サ
イ.USA第74巻、5463〜5467頁(1977年)のジデオキシ法
によって配列される。
突然変異aFGF遺伝子の発現は、多数の異なった宿主細
胞の多数の異なったプロモーター−発現系によって達成
される。無傷突然変異aFGF遺伝子の発現に対して他の宿
主細胞およびプロモーター発現系の使用が本発明の範囲
内に包含されることは希望され企図される。宿主細胞は
細菌、酵母、昆虫および哺乳類細胞を包含する。また抗
原はウイルスで発現されることができる。遺伝子は多数
の原核細胞および種々の真核細胞で発現されることがで
きるが、好適な宿主細胞は大腸菌である。突然変異aFGF
の発現に使用することができる発現ベクターは、pBR32
2、pPLa2311、pKC30、ptac12、λgt11、CheY、pASl、pL
C24、pSB226、SV40およびpKK223−3を包含し、pKK223
−3が好適であるがこれらに限定されない。大腸菌発現
ベクターは、一般に所望のタンパク質の最初のアミノ酸
に付加されたメチオニン残基を翻訳することができる。
本発明は、末端メチオニンを有する突然変異体γ−aFGF
だけでなく酵母細胞、哺乳類細胞または細菌細胞のよう
な細胞型の翻訳後、末端メチオニンが除去された突然変
異体γ−aFGFを包含することは理解される。発現ベクタ
ーはDNA配列中aFGF遺伝子の発現を高める1種以上のシ
ストロンをさらに包含することができる。スコナー等プ
ロク.ナトル.アカド.サイ.USA第83巻、8506〜8510頁
(1986年)。好適な構成物は大腸菌tacプロモーター、
デボエル等、プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第80
巻、21〜25頁(1983年)に記載されるtrpプロモーター
とlacプロモーターの領域間のハイブリットを使用す
る。tacプロモーターおよびrrnBrRNA転写ターミネター
を含むプラスミド、pKK223−3(ファーマシア)はpBR3
22誘導SalI制限酵素部位を除去するために修飾される。
rrnB rRNAターミネターは、強力プロモーターによる発
現を起こさせることがすでに示されている。ゲンツ等、
プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第78巻、4936〜4940
頁(1981年)ブロシウス、Gene第27巻、161〜172頁(19
84年)。
胞の多数の異なったプロモーター−発現系によって達成
される。無傷突然変異aFGF遺伝子の発現に対して他の宿
主細胞およびプロモーター発現系の使用が本発明の範囲
内に包含されることは希望され企図される。宿主細胞は
細菌、酵母、昆虫および哺乳類細胞を包含する。また抗
原はウイルスで発現されることができる。遺伝子は多数
の原核細胞および種々の真核細胞で発現されることがで
きるが、好適な宿主細胞は大腸菌である。突然変異aFGF
の発現に使用することができる発現ベクターは、pBR32
2、pPLa2311、pKC30、ptac12、λgt11、CheY、pASl、pL
C24、pSB226、SV40およびpKK223−3を包含し、pKK223
−3が好適であるがこれらに限定されない。大腸菌発現
ベクターは、一般に所望のタンパク質の最初のアミノ酸
に付加されたメチオニン残基を翻訳することができる。
本発明は、末端メチオニンを有する突然変異体γ−aFGF
だけでなく酵母細胞、哺乳類細胞または細菌細胞のよう
な細胞型の翻訳後、末端メチオニンが除去された突然変
異体γ−aFGFを包含することは理解される。発現ベクタ
ーはDNA配列中aFGF遺伝子の発現を高める1種以上のシ
ストロンをさらに包含することができる。スコナー等プ
ロク.ナトル.アカド.サイ.USA第83巻、8506〜8510頁
(1986年)。好適な構成物は大腸菌tacプロモーター、
デボエル等、プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第80
巻、21〜25頁(1983年)に記載されるtrpプロモーター
とlacプロモーターの領域間のハイブリットを使用す
る。tacプロモーターおよびrrnBrRNA転写ターミネター
を含むプラスミド、pKK223−3(ファーマシア)はpBR3
22誘導SalI制限酵素部位を除去するために修飾される。
rrnB rRNAターミネターは、強力プロモーターによる発
現を起こさせることがすでに示されている。ゲンツ等、
プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第78巻、4936〜4940
頁(1981年)ブロシウス、Gene第27巻、161〜172頁(19
84年)。
pKK223−3プラスミドDNAは、制御酵素で切断されて
クローンpKK 2.7を生じる2.7kbDNA断片を生成する。合
成aFGF遺伝子は、そのpBR322ベクターから切断されpKK
2.7をEcoRIおよびSalIで限定した後pKK 2.7プラスミド
に取込まれる。第1図に示される得られた組換え体は、
大腸菌JM105(ファーマシア)またはDH5(BRL)に形質
転換され発現される。
クローンpKK 2.7を生じる2.7kbDNA断片を生成する。合
成aFGF遺伝子は、そのpBR322ベクターから切断されpKK
2.7をEcoRIおよびSalIで限定した後pKK 2.7プラスミド
に取込まれる。第1図に示される得られた組換え体は、
大腸菌JM105(ファーマシア)またはDH5(BRL)に形質
転換され発現される。
好適な発現を高めるベクターは所望のタンパク質をコ
ードしている遺伝子、即ち第2シストロン、の上流に位
置する第1シストロンの核酸配列を有する。突然変異aF
GFは第2シストロンである。第1シストロンは一般に停
止コドンの上流にシャイン−ダルガルノの配列を含有す
る。発現を高めるベクターは野生型または突然変異体aF
GFの発現を高めるのに有効な第1シストロンである次の
ヌクレオチド配列 AATTATGTATCGATTAAATAAGGAGGAAT TACATAGCTAATTTATTCCTCCTTATTAA (pKK2.7)(シストロン1,2オリゴマー)(aFGF)を含
有するが、これらに限定されない。第1シストロンはEc
oRI部位で適当なpKK−haFGF構成物に挿入される。挿入
はEcoRIクローニング部位の不全を生じる。組換え体は
上述したような適当な宿主細胞に形質転換され発現され
る。この構成物は、野生型または突然変異体aFGF発現の
約10倍の増加を生じる。発現が高められるベクターを含
有するプラスミドはpKK 2c−haFGFに指定される。本発
明は、pKK 2c−haFGF(Ser16)、pKK 2c−haFGF(Ser8
3)、pKK 2c−haFGF(Ser117)、pKK 2c−haFGF(Ser1
6、83)、pKK 2c−haFGF(Ser16、117)、pKK 2c−haFG
F(Ser83、117)、pKK 2c−haFGF(Ser16、83、117)の
ような発現を高めるベクターを含有するクローンを包含
することが企図される。
ードしている遺伝子、即ち第2シストロン、の上流に位
置する第1シストロンの核酸配列を有する。突然変異aF
GFは第2シストロンである。第1シストロンは一般に停
止コドンの上流にシャイン−ダルガルノの配列を含有す
る。発現を高めるベクターは野生型または突然変異体aF
GFの発現を高めるのに有効な第1シストロンである次の
ヌクレオチド配列 AATTATGTATCGATTAAATAAGGAGGAAT TACATAGCTAATTTATTCCTCCTTATTAA (pKK2.7)(シストロン1,2オリゴマー)(aFGF)を含
有するが、これらに限定されない。第1シストロンはEc
oRI部位で適当なpKK−haFGF構成物に挿入される。挿入
はEcoRIクローニング部位の不全を生じる。組換え体は
上述したような適当な宿主細胞に形質転換され発現され
る。この構成物は、野生型または突然変異体aFGF発現の
約10倍の増加を生じる。発現が高められるベクターを含
有するプラスミドはpKK 2c−haFGFに指定される。本発
明は、pKK 2c−haFGF(Ser16)、pKK 2c−haFGF(Ser8
3)、pKK 2c−haFGF(Ser117)、pKK 2c−haFGF(Ser1
6、83)、pKK 2c−haFGF(Ser16、117)、pKK 2c−haFG
F(Ser83、117)、pKK 2c−haFGF(Ser16、83、117)の
ような発現を高めるベクターを含有するクローンを包含
することが企図される。
突然変異発現クローンは、約1%のトリプトン、約0.
5%の酵母エキス、約0.5%のNaCl、約0.4%のグルコー
スおよび約50μg/mlのアンピシリンからなる適当な増殖
培地中で約37℃で増殖される。550nmにおける光学濃度
が約0.5に達する場合、イソプロピル−β−D−チオガ
ラクトピラノシド(IPTG)を添加して最終濃度約1mMを
得ることができ、増殖は約37℃で約24時間まで続けられ
る。培地1からの細胞を遠心分離によって回収し、約
100mMリン酸塩および約5mg/mlEDTAを含む洗浄緩衝液に
再懸濁させる。再懸濁の最後にリゾチーム約0.1mg/mlを
添加し、懸濁液を緩かに振盪しながら約30℃で約15分間
湯置する。細胞を遠心分離で集め、約100mMリン酸ナト
リウムpH約6.0、約3mM EDTA、約0.03mMN−p−トルエン
スルホニル−L−フェニル−アラニンクロロメチルケト
ン(TPCK)、約0.05mMペプスタチンA、約0.05mMフッ化
フェニルメチルスルホニル(PMSF)、約0.05mMロイペプ
チンおよび約15μg/mlウシ膵臓トリプシンインヒビター
(BPTI)を含有する破壊緩衝液に再懸濁させる。細胞を
直接破壊あるいは凍結させ−70℃で貯蔵し、20,000ps
i、約4℃でフレンチプレッシャーセル(French pressu
re cell)に約2回通過して解凍した直後に破壊され
る。上澄み液を遠心分離により集め、凍結乾燥する。
5%の酵母エキス、約0.5%のNaCl、約0.4%のグルコー
スおよび約50μg/mlのアンピシリンからなる適当な増殖
培地中で約37℃で増殖される。550nmにおける光学濃度
が約0.5に達する場合、イソプロピル−β−D−チオガ
ラクトピラノシド(IPTG)を添加して最終濃度約1mMを
得ることができ、増殖は約37℃で約24時間まで続けられ
る。培地1からの細胞を遠心分離によって回収し、約
100mMリン酸塩および約5mg/mlEDTAを含む洗浄緩衝液に
再懸濁させる。再懸濁の最後にリゾチーム約0.1mg/mlを
添加し、懸濁液を緩かに振盪しながら約30℃で約15分間
湯置する。細胞を遠心分離で集め、約100mMリン酸ナト
リウムpH約6.0、約3mM EDTA、約0.03mMN−p−トルエン
スルホニル−L−フェニル−アラニンクロロメチルケト
ン(TPCK)、約0.05mMペプスタチンA、約0.05mMフッ化
フェニルメチルスルホニル(PMSF)、約0.05mMロイペプ
チンおよび約15μg/mlウシ膵臓トリプシンインヒビター
(BPTI)を含有する破壊緩衝液に再懸濁させる。細胞を
直接破壊あるいは凍結させ−70℃で貯蔵し、20,000ps
i、約4℃でフレンチプレッシャーセル(French pressu
re cell)に約2回通過して解凍した直後に破壊され
る。上澄み液を遠心分離により集め、凍結乾燥する。
突然変異aFGFをカチオン交換体マトリックス次にヘパ
リン−セファロースアフィニティマトリックス次に逆相
高性能液体クロマトグラフィ(HPLC)を使用する3工程
クロマトグラフィ処理によって均質に精製する。凍結乾
燥した上澄み液をリン酸緩衝液約100mM、pH約6.0に再懸
濁し、同一緩衝液で平衡にしたカチオン交換体、好まし
くはCM−セファデックスに添加する。CM−セファデック
スをタンパク質1g当り沈降樹脂約6.5mlの割合で添加す
る。樹脂を閃光ガラス漏斗に集め、リン酸塩緩衝食塩水
約100mMリン酸塩および約150mMNaCl、pH約6で3回洗浄
する。樹脂を同一緩衝液に再懸濁し、カラムに充填し、
約600mMNaCl緩衝液で洗浄溶離する。ヘパリン−セファ
ロースを約10mMリン酸塩緩衝液、pH約7.2に平衡にし、
タンパク質1g当り沈降樹脂約1mlの割合で溶出液に添加
し、約4℃で約1時間緩かに振盪し、樹脂複合体を漏斗
に集める。樹脂を同一緩衝液に再懸濁させ、1時間につ
き1〜2カラム容量でカラムに装填する。カラムを約10
mMリン酸塩、pH約7.2および約0.8M NaClを含有する緩衝
液で洗浄し、同一緩衝液中1.5M NaClで溶離する。各々
のタンパク質を集め、さらに逆相HPLCで精製する。画分
をHPLC逆相カラム約C3に装填し、約10mMトリフルオロ酢
酸(TFA)で平衡にし、約0〜100%の4mM TFA、約0〜6
7%のCH3CNの勾配で約30分間溶離する。
リン−セファロースアフィニティマトリックス次に逆相
高性能液体クロマトグラフィ(HPLC)を使用する3工程
クロマトグラフィ処理によって均質に精製する。凍結乾
燥した上澄み液をリン酸緩衝液約100mM、pH約6.0に再懸
濁し、同一緩衝液で平衡にしたカチオン交換体、好まし
くはCM−セファデックスに添加する。CM−セファデック
スをタンパク質1g当り沈降樹脂約6.5mlの割合で添加す
る。樹脂を閃光ガラス漏斗に集め、リン酸塩緩衝食塩水
約100mMリン酸塩および約150mMNaCl、pH約6で3回洗浄
する。樹脂を同一緩衝液に再懸濁し、カラムに充填し、
約600mMNaCl緩衝液で洗浄溶離する。ヘパリン−セファ
ロースを約10mMリン酸塩緩衝液、pH約7.2に平衡にし、
タンパク質1g当り沈降樹脂約1mlの割合で溶出液に添加
し、約4℃で約1時間緩かに振盪し、樹脂複合体を漏斗
に集める。樹脂を同一緩衝液に再懸濁させ、1時間につ
き1〜2カラム容量でカラムに装填する。カラムを約10
mMリン酸塩、pH約7.2および約0.8M NaClを含有する緩衝
液で洗浄し、同一緩衝液中1.5M NaClで溶離する。各々
のタンパク質を集め、さらに逆相HPLCで精製する。画分
をHPLC逆相カラム約C3に装填し、約10mMトリフルオロ酢
酸(TFA)で平衡にし、約0〜100%の4mM TFA、約0〜6
7%のCH3CNの勾配で約30分間溶離する。
精製突然変異組換え体aFGFのマイトジェン活性は3H−
チミジンを細胞系繊維芽細胞によるDNA、好ましくはBAL
B/c3T3A31(アメカンタイプカルチュアコレクション)
に組込むことによって定量する。プラスミドpKK−haFGF
(Ser16)からの突然変異体タンパク質は繊維芽細胞を
非突然変異ヒトaFGFに等しいかまたは低いレベルで刺激
した。突然変異体タンパク質pKK−haFGF(Ser117)はヘ
パリンの不在下で非突然変異形態より高い刺激活性を示
した。
チミジンを細胞系繊維芽細胞によるDNA、好ましくはBAL
B/c3T3A31(アメカンタイプカルチュアコレクション)
に組込むことによって定量する。プラスミドpKK−haFGF
(Ser16)からの突然変異体タンパク質は繊維芽細胞を
非突然変異ヒトaFGFに等しいかまたは低いレベルで刺激
した。突然変異体タンパク質pKK−haFGF(Ser117)はヘ
パリンの不在下で非突然変異形態より高い刺激活性を示
した。
十分制御され非常に再現性のあるマイトジェンアッセ
イは野性型haFGFとCysの相対的マイトジェン比活性をSe
r突然変異体と比較するために必要である。血清のない
培養液中のBalb/c3T3細胞の集密的培養は、バックグラ
ウンドレベルからDNA合成のピークまでの完全な応答を
起こさせるaFGF濃度範囲、少なくとも1og3以上の濃度範
囲の2倍段階希釈液で刺激した。1刺激単位は1/2最大
応答を生じる1ml当りのaFGFの量として計算される。マ
イトジェン比活性は純粋aFGF1mg当りの刺激単位数であ
る。さらにアッセイは原液をTFA/CH3CNの約50μgまた
はこれ以下のaFGF/mlに希釈することによって標定され
る。希釈液は異なった試料を比較できるようにいかなる
濃縮現象も排除する。
イは野性型haFGFとCysの相対的マイトジェン比活性をSe
r突然変異体と比較するために必要である。血清のない
培養液中のBalb/c3T3細胞の集密的培養は、バックグラ
ウンドレベルからDNA合成のピークまでの完全な応答を
起こさせるaFGF濃度範囲、少なくとも1og3以上の濃度範
囲の2倍段階希釈液で刺激した。1刺激単位は1/2最大
応答を生じる1ml当りのaFGFの量として計算される。マ
イトジェン比活性は純粋aFGF1mg当りの刺激単位数であ
る。さらにアッセイは原液をTFA/CH3CNの約50μgまた
はこれ以下のaFGF/mlに希釈することによって標定され
る。希釈液は異なった試料を比較できるようにいかなる
濃縮現象も排除する。
Cys117あるいはいずれか2つのCys残基または全て3
つのCys残基のSerへの転換は、ヘパリンの不在下でタン
パク質の比活性が7〜20倍増加する。ヘパリンの存在下
でさえ全部で4個の複数突然変異体は、野生型ヒトγ−
aFGFより活性でありhaFGF(Ser83、117)は約2.7倍活性
である。ヘパリンは野生型aFGFの活性を20倍刺激する
が、突然変異体の活性を約3〜5倍しか相乗しない。
つのCys残基のSerへの転換は、ヘパリンの不在下でタン
パク質の比活性が7〜20倍増加する。ヘパリンの存在下
でさえ全部で4個の複数突然変異体は、野生型ヒトγ−
aFGFより活性でありhaFGF(Ser83、117)は約2.7倍活性
である。ヘパリンは野生型aFGFの活性を20倍刺激する
が、突然変異体の活性を約3〜5倍しか相乗しない。
ヒトaFGFの3個のCys残基全部またはいずれか2つのS
erへの転換はヘパリン不在下でタンパク質の比活性が7
〜20倍増加する。ヘパリンの存在下でさえ全部で4個の
複数突然変異体は非突然変異haFGFより活性であり、haF
GF Ser(83、117)は3倍近く活性がある。
erへの転換はヘパリン不在下でタンパク質の比活性が7
〜20倍増加する。ヘパリンの存在下でさえ全部で4個の
複数突然変異体は非突然変異haFGFより活性であり、haF
GF Ser(83、117)は3倍近く活性がある。
突然変異組換え体aFGFは、これらに限定されないが火
傷、切傷または裂傷から生じる軟組織の創傷および骨
折、靱帯および腱裂傷のような骨格筋創傷および粘液嚢
および腱の炎症の修復を促進または治癒するのに有用で
ある。本明細書中で使用される組織修復はaFGFのそばの
中胚葉、外胚葉または神経外胚葉誘発細胞による組織の
再生として定義される。また突然変異γ−aFGFは軟骨お
よび軟骨質組織の治癒および再生を促進するのに有用で
ある。角膜組織を包含する軟組織修復のための突然変異
aFGFの投与は一般に局所、皮下、静脈または眼内によ
る。軟組織は、上述した骨格筋系に関連するものを除く
すべての組織を包含する。新規なペプチドはヘパリンを
用いてまたは用いずに好ましくはヘパリンを用いずに本
発明のタンパク質約0.1〜100μg/cm2/日を創傷面に、
局所的または皮下には約1〜100μg/cm3/日投与するこ
とができる。局所投与の最も好適な範囲は、約1〜10μ
g/cm2/日である。
傷、切傷または裂傷から生じる軟組織の創傷および骨
折、靱帯および腱裂傷のような骨格筋創傷および粘液嚢
および腱の炎症の修復を促進または治癒するのに有用で
ある。本明細書中で使用される組織修復はaFGFのそばの
中胚葉、外胚葉または神経外胚葉誘発細胞による組織の
再生として定義される。また突然変異γ−aFGFは軟骨お
よび軟骨質組織の治癒および再生を促進するのに有用で
ある。角膜組織を包含する軟組織修復のための突然変異
aFGFの投与は一般に局所、皮下、静脈または眼内によ
る。軟組織は、上述した骨格筋系に関連するものを除く
すべての組織を包含する。新規なペプチドはヘパリンを
用いてまたは用いずに好ましくはヘパリンを用いずに本
発明のタンパク質約0.1〜100μg/cm2/日を創傷面に、
局所的または皮下には約1〜100μg/cm3/日投与するこ
とができる。局所投与の最も好適な範囲は、約1〜10μ
g/cm2/日である。
ヘパリンは糖D−グルコサミンと異なった程度に硫酸
化されD−グルクロン酸の等量部からなる硫酸化グリコ
サミノグリカンである。直接治癒に利用するためには非
変性形態並びに溶液形態で市販で入手することができ
る。ヘパリンがaFGFと局所または皮下で投与される場
合、好適な濃度は1日に投与されるaFGF量(質量)の約
3〜30倍である。
化されD−グルクロン酸の等量部からなる硫酸化グリコ
サミノグリカンである。直接治癒に利用するためには非
変性形態並びに溶液形態で市販で入手することができ
る。ヘパリンがaFGFと局所または皮下で投与される場
合、好適な濃度は1日に投与されるaFGF量(質量)の約
3〜30倍である。
骨格筋および軟骨の修復または治癒に対して突然変異
γ−aFGFは損傷部位に手術中にあるいは注射で投与され
るのが好ましい。突然変異aFGFの緩慢な放出形態の外科
的注入は成長因子の放出が延長して持続されることが考
慮される。緩慢な放出に対する突然変異aFGFの処方方法
は当業界で既知である。骨格筋治癒に対する用量レベル
は約10〜100μg/cm3/日である。
γ−aFGFは損傷部位に手術中にあるいは注射で投与され
るのが好ましい。突然変異aFGFの緩慢な放出形態の外科
的注入は成長因子の放出が延長して持続されることが考
慮される。緩慢な放出に対する突然変異aFGFの処方方法
は当業界で既知である。骨格筋治癒に対する用量レベル
は約10〜100μg/cm3/日である。
さらにその上突然変異体γ−aFGFは血管増殖(血管形
成)、血管修復(損傷した内皮細胞をもとへもどすな
ど)といった生体内血管組織修復の助長を促進し、注入
の血管生成に対して適当な基質上の内皮細胞の増殖を刺
激するのに有用である。新規な突然変異体γ−aFGFペプ
チドの生体内血管形成作用は約1〜1000μg/cm3/日、
好ましくは約10〜100μg/cm2/日を皮下のような内部投
与によって達成される。表面修復の好適な適用範囲は約
100ng〜100μg/cm2/日であり、最適適用範囲は約1〜1
0μg/cm2/日である。広い血管修復は1回の服用量約0.
1〜100ng/cm3または持続注入約1〜1000pg/cm3/日によ
って達成される。血管生成に対する適当な基質上の内皮
細胞の試験管内増殖は約1〜10ng/ml/日の投与によって
達成される。
成)、血管修復(損傷した内皮細胞をもとへもどすな
ど)といった生体内血管組織修復の助長を促進し、注入
の血管生成に対して適当な基質上の内皮細胞の増殖を刺
激するのに有用である。新規な突然変異体γ−aFGFペプ
チドの生体内血管形成作用は約1〜1000μg/cm3/日、
好ましくは約10〜100μg/cm2/日を皮下のような内部投
与によって達成される。表面修復の好適な適用範囲は約
100ng〜100μg/cm2/日であり、最適適用範囲は約1〜1
0μg/cm2/日である。広い血管修復は1回の服用量約0.
1〜100ng/cm3または持続注入約1〜1000pg/cm3/日によ
って達成される。血管生成に対する適当な基質上の内皮
細胞の試験管内増殖は約1〜10ng/ml/日の投与によって
達成される。
また突然変異体γ−aFGFは血栓作用の治療に血管内皮
細胞によるプラスミノーゲン活性化因子の生体内誘発に
有用である。血栓作用は、血管内の血栓の形成から起こ
り、血栓症発作、深部静脈血栓症、心筋梗塞、および他
の内科症状を生じ組織の壊死を起こし、しばしば患者の
死に至らしめる。前に形成された血餅の消化および血餅
形成の予防は突然変異体γ−aFGFによって仲介され血栓
症の治療を高めることができる。また突然変異体γ−aF
GFでの前処理は血餅の形成が非常に危険にある人を含む
動物に血餅の形成を予防するために使用することができ
る。血栓症の治療に望ましい突然変異体γ−aFGFの用量
範囲は約10μg〜10mg/kg/日である。
細胞によるプラスミノーゲン活性化因子の生体内誘発に
有用である。血栓作用は、血管内の血栓の形成から起こ
り、血栓症発作、深部静脈血栓症、心筋梗塞、および他
の内科症状を生じ組織の壊死を起こし、しばしば患者の
死に至らしめる。前に形成された血餅の消化および血餅
形成の予防は突然変異体γ−aFGFによって仲介され血栓
症の治療を高めることができる。また突然変異体γ−aF
GFでの前処理は血餅の形成が非常に危険にある人を含む
動物に血餅の形成を予防するために使用することができ
る。血栓症の治療に望ましい突然変異体γ−aFGFの用量
範囲は約10μg〜10mg/kg/日である。
また突然変異および野生型γ−aFGFは、アルツハイマ
ー病で損傷または破壊される海馬ニューロンおよび破壊
が麻痺を引き起こす運動および知覚ニューロンを維持刺
激することを包含する中枢および末梢神経組織修復を促
進するのに有用である。損傷神経組織は突然変異または
野生型aFGFによって刺激されてその領域の損傷神経を再
集団にし、ニューロンからの軸索の増殖を促進する神経
芽細胞の有糸分裂によってさらに、ニューロンを生成す
ることができる。ペプチドは軟組織あるいは骨格筋組織
の創傷治癒に記載した通り投与することができる。
ー病で損傷または破壊される海馬ニューロンおよび破壊
が麻痺を引き起こす運動および知覚ニューロンを維持刺
激することを包含する中枢および末梢神経組織修復を促
進するのに有用である。損傷神経組織は突然変異または
野生型aFGFによって刺激されてその領域の損傷神経を再
集団にし、ニューロンからの軸索の増殖を促進する神経
芽細胞の有糸分裂によってさらに、ニューロンを生成す
ることができる。ペプチドは軟組織あるいは骨格筋組織
の創傷治癒に記載した通り投与することができる。
局所適用に対して種々の医薬処方が、本発明の有効化
合物の投与に有用である。かかる処方は親水性ワセリン
またはポリエチレングリコール軟膏のような軟膏、キサ
ンタンゴムのようなゴムを含有するペースト、アルコー
ルまたは水溶液のような溶液、水酸化アルミニウムまた
はアルギン酸ナトリウムゲルのようなゲル、ヒトまたは
動物アルブミンのようなアルブミン、ヒトまたは動物コ
ラーゲンのようなコラーゲン、アルキルセルロース、ヒ
ドロキシアルキルセルロースおよびアルキルヒドロキシ
アルキルセルロース例えばメチルセルロース、ヒドロキ
シエチルヒセルロース、カルボキシメチルセルロース、
ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシ
プロピルセルロースのようなセルロース、プルロニック
F−127で例示されるプルロニック(商標名)ポリオー
ルのようなポロキサマー、テトロニック1508のようなテ
トロニックおよびアルギン酸ナトリウムのようなアルギ
ン酸塩を包含するが、これに限定されない。医薬処方は
突然変異aFGF化合物の1種以上を約0.1〜100μg/mlの量
で包含する。
合物の投与に有用である。かかる処方は親水性ワセリン
またはポリエチレングリコール軟膏のような軟膏、キサ
ンタンゴムのようなゴムを含有するペースト、アルコー
ルまたは水溶液のような溶液、水酸化アルミニウムまた
はアルギン酸ナトリウムゲルのようなゲル、ヒトまたは
動物アルブミンのようなアルブミン、ヒトまたは動物コ
ラーゲンのようなコラーゲン、アルキルセルロース、ヒ
ドロキシアルキルセルロースおよびアルキルヒドロキシ
アルキルセルロース例えばメチルセルロース、ヒドロキ
シエチルヒセルロース、カルボキシメチルセルロース、
ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシ
プロピルセルロースのようなセルロース、プルロニック
F−127で例示されるプルロニック(商標名)ポリオー
ルのようなポロキサマー、テトロニック1508のようなテ
トロニックおよびアルギン酸ナトリウムのようなアルギ
ン酸塩を包含するが、これに限定されない。医薬処方は
突然変異aFGF化合物の1種以上を約0.1〜100μg/mlの量
で包含する。
非局所適用に対して突然変異体は標準医薬的実施によ
りリン酸塩緩衝液食塩水、リン酸塩緩衝食塩水リンゲル
液などの医薬的に許容し得る担体または賦形剤と併用し
て医薬組成物で投与される。
りリン酸塩緩衝液食塩水、リン酸塩緩衝食塩水リンゲル
液などの医薬的に許容し得る担体または賦形剤と併用し
て医薬組成物で投与される。
突然変異aFGFが繊維芽細胞、血管および角膜内皮細胞
などを包含する種々の細胞型の分裂を刺激する能力はこ
れらのペプチドを医薬剤として有用にする。これらの化
合物は新規な突然変異γ−FGFを治療を必要としている
患者に投与することによってヒトを含む哺乳類の傷を治
療するために使用することができる。
などを包含する種々の細胞型の分裂を刺激する能力はこ
れらのペプチドを医薬剤として有用にする。これらの化
合物は新規な突然変異γ−FGFを治療を必要としている
患者に投与することによってヒトを含む哺乳類の傷を治
療するために使用することができる。
次の実施例は本発明を具体的に説明するものである
が、それらに限定されるものではない。
が、それらに限定されるものではない。
実施例1 オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチドはマッテウシおよびカルザース、
ジェー.アム.ケム.ソク.第103巻、3185〜3191頁(1
981年)、ビューケージおよびカルザース、テトラヘド
ロンレターズ第22巻、1859〜1862頁(1981年)に記載さ
れる手法に従って合成された。合成オリゴヌクレオチド
の塩基配列は第7、9および11表に示される。
ジェー.アム.ケム.ソク.第103巻、3185〜3191頁(1
981年)、ビューケージおよびカルザース、テトラヘド
ロンレターズ第22巻、1859〜1862頁(1981年)に記載さ
れる手法に従って合成された。合成オリゴヌクレオチド
の塩基配列は第7、9および11表に示される。
実施例2 aFGF遺伝子のアッセンブリー 実施例1で得たウシオリゴヌクレオチドを2つの別の
ユニット、N末端ハーフ(231bp)およびC末端ハーフ
(209bp)として構成した。次に2つのハーフを無傷合
成遺伝子として組み合わせた、第6表参照。最初にオリ
ゴヌクレオチドを次の反応混合液中でキナーゼ化した。
70mMトリスpH7.6、5mM DTT、10mM MgCl2、33μMATP、1
μl当り0.3ユニットT4ポリヌクレオチドキナーゼおよ
び1μl当り2.5pモルオリゴヌクレオチド。混合液を37
℃で1.5時間温置し次に0.2ユニット/μlキナーゼおよ
びATPを混合液に追加した後さらに1時間温置して濃度1
00mMを得た。放射性標識に対して開始混合液は[γ−32
P]−ATP37nCi/μlを含有した。
ユニット、N末端ハーフ(231bp)およびC末端ハーフ
(209bp)として構成した。次に2つのハーフを無傷合
成遺伝子として組み合わせた、第6表参照。最初にオリ
ゴヌクレオチドを次の反応混合液中でキナーゼ化した。
70mMトリスpH7.6、5mM DTT、10mM MgCl2、33μMATP、1
μl当り0.3ユニットT4ポリヌクレオチドキナーゼおよ
び1μl当り2.5pモルオリゴヌクレオチド。混合液を37
℃で1.5時間温置し次に0.2ユニット/μlキナーゼおよ
びATPを混合液に追加した後さらに1時間温置して濃度1
00mMを得た。放射性標識に対して開始混合液は[γ−32
P]−ATP37nCi/μlを含有した。
アニーリングおよび連結反応は2つの別の反応で行な
った。各々の反応において8種のオリゴペプチドの各々
100pmole添加した。1番目の反応ではC末端またはN末
端ハーフ遺伝子の1本鎖を作製するオリゴペプチドを、
最も5′側に位置するオリゴヌクレオチドを除いてキナ
ーゼ化した。2番目の反応では対立する連鎖を作製する
オリゴヌクレオチドを再び最も5′側に位置するオリゴ
ヌクレオチドを除いてキナーゼ化した。従って各反応で
は3種のオリゴヌクレオチドをキナーゼ化し5種はしな
かった。キナーゼ化オリゴヌクレオチドを使用する場
合、32P標識オリゴヌクレオチド1pモルはまた後の生成
物の同定のために添加した。各反応は70mMトリスpH7.
6、5mM DTT、10mM MgCl2および30μMATPと共に200μl
を含有した。オリゴヌクレオチドを90℃に4分間加熱し
た後直ちに反応物を60℃に移し、30℃に徐々に冷却させ
ておくことによってアニーリングした。連結反応は60mM
トリスpH7.6、10mM DTT、10mM MgCl2、1mM ATPおよび1
μl当り0.03ユニットT4DNAリガーゼを含む400μl中20
℃で1.5時間温置することによって行なった。
った。各々の反応において8種のオリゴペプチドの各々
100pmole添加した。1番目の反応ではC末端またはN末
端ハーフ遺伝子の1本鎖を作製するオリゴペプチドを、
最も5′側に位置するオリゴヌクレオチドを除いてキナ
ーゼ化した。2番目の反応では対立する連鎖を作製する
オリゴヌクレオチドを再び最も5′側に位置するオリゴ
ヌクレオチドを除いてキナーゼ化した。従って各反応で
は3種のオリゴヌクレオチドをキナーゼ化し5種はしな
かった。キナーゼ化オリゴヌクレオチドを使用する場
合、32P標識オリゴヌクレオチド1pモルはまた後の生成
物の同定のために添加した。各反応は70mMトリスpH7.
6、5mM DTT、10mM MgCl2および30μMATPと共に200μl
を含有した。オリゴヌクレオチドを90℃に4分間加熱し
た後直ちに反応物を60℃に移し、30℃に徐々に冷却させ
ておくことによってアニーリングした。連結反応は60mM
トリスpH7.6、10mM DTT、10mM MgCl2、1mM ATPおよび1
μl当り0.03ユニットT4DNAリガーゼを含む400μl中20
℃で1.5時間温置することによって行なった。
連結オリゴヌクレオチドを精製するためにポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を使用した。連結オリゴヌクレオ
チドをエタノールで沈降させ、80%ホルムアミド、50mM
TRIS−ホウ酸塩pH8.3、1mM EDTA、0.1%(W/V)キシレ
ンシアノールおよび0.1%(W/V)ブロモフェノールブル
ーの20μlに再溶解した。各試料を90℃で3分間加熱し
10%尿素−ポリアクリルアミドゲル中75ワットで5時間
電気泳動にかけた。オリゴヌクレオチドバンドはゲルを
X線フィルムにさらすことによって可視された。
ルアミドゲル電気泳動を使用した。連結オリゴヌクレオ
チドをエタノールで沈降させ、80%ホルムアミド、50mM
TRIS−ホウ酸塩pH8.3、1mM EDTA、0.1%(W/V)キシレ
ンシアノールおよび0.1%(W/V)ブロモフェノールブル
ーの20μlに再溶解した。各試料を90℃で3分間加熱し
10%尿素−ポリアクリルアミドゲル中75ワットで5時間
電気泳動にかけた。オリゴヌクレオチドバンドはゲルを
X線フィルムにさらすことによって可視された。
N末端に対する各反応の231ベースバンドをゲルから
切り取り、混合し、0.5M酢酸アンモニウム、1mM EDTA p
H8の1ml中4℃で溶離した。溶離したDNAをエタノールで
沈降させ、70mMトリスpH7.6、5mM DTTおよび10mM MgCl2
の30μlに再溶解した。C末端の209ベースバンドを同
様の方法で溶離した。
切り取り、混合し、0.5M酢酸アンモニウム、1mM EDTA p
H8の1ml中4℃で溶離した。溶離したDNAをエタノールで
沈降させ、70mMトリスpH7.6、5mM DTTおよび10mM MgCl2
の30μlに再溶解した。C末端の209ベースバンドを同
様の方法で溶離した。
ゲル精製オリゴヌクレオチドを形質転換前に90℃に4
分間加熱し、20℃に徐々に冷却することによってアニー
リングした。最初の出発オリゴヌクレオチドから5%回
収されるとして回収アニーリング231bpオリゴヌクレオ
チド300fモルおよび100fモリを各々25mMトリスpH7.8、1
mM DTT、10mM MgCl2、0.4mM ATPの20ml中で1ユニットT
4DNAリガーゼと共に、アガロースゲル精製3.9kb EcoRI-
BamHI pBR322断片DNA100mlに20℃1時間連結した。アニ
ーリングした209bpオリゴヌクレオチドをアガロース精
製3.9kb BamHI-SalI pBR322断片DNAに231ベースペア断
片と同じ条件下で連結した。連結反応物は1:5H2Oに希釈
し、希釈液1μlを供給者によって記載される通り大腸
菌RRIコンピテント細胞(BRL)20μlを形質転換するた
めに使用した。形質転換体はアンピシリン存在下での増
殖により選択し、ミニ溶菌液プラスミド標品の制限酵素
解析によって231 bp EcoRI-BamHIまたは209bp BamHI-Sa
lIインサートの存在を選別した。
分間加熱し、20℃に徐々に冷却することによってアニー
リングした。最初の出発オリゴヌクレオチドから5%回
収されるとして回収アニーリング231bpオリゴヌクレオ
チド300fモルおよび100fモリを各々25mMトリスpH7.8、1
mM DTT、10mM MgCl2、0.4mM ATPの20ml中で1ユニットT
4DNAリガーゼと共に、アガロースゲル精製3.9kb EcoRI-
BamHI pBR322断片DNA100mlに20℃1時間連結した。アニ
ーリングした209bpオリゴヌクレオチドをアガロース精
製3.9kb BamHI-SalI pBR322断片DNAに231ベースペア断
片と同じ条件下で連結した。連結反応物は1:5H2Oに希釈
し、希釈液1μlを供給者によって記載される通り大腸
菌RRIコンピテント細胞(BRL)20μlを形質転換するた
めに使用した。形質転換体はアンピシリン存在下での増
殖により選択し、ミニ溶菌液プラスミド標品の制限酵素
解析によって231 bp EcoRI-BamHIまたは209bp BamHI-Sa
lIインサートの存在を選別した。
適当なサイズのインサートを含むクローンのDNA配列
はマキサムおよびギルバート、プロク.ナトル.アカ
ド.サイ.USA第74巻、560〜564頁(1977年)の化学的DN
A配列決定法を使用して決定した。231bpクローンのいず
れも正確な配列を有しないため、正確な配列を含むクロ
ーンを次の通り調製した。KpnIとBamHI部位の間の正確
な配列を有する1個のクローンをKpnIでおよびpBR322ベ
クター中を切断するSalIで切断した。400bpバンドをゲ
ル精製し、aFGF遺伝子インサートのEcoRI部位からKpnI
部位まで正確な配列を含む2番目のクローンの3.8kbのK
pnIおよびSalIで切断したバンドに連結した。形質転換
後生成したクローンを所望の配列が得られたことを確認
するために配列決定した。
はマキサムおよびギルバート、プロク.ナトル.アカ
ド.サイ.USA第74巻、560〜564頁(1977年)の化学的DN
A配列決定法を使用して決定した。231bpクローンのいず
れも正確な配列を有しないため、正確な配列を含むクロ
ーンを次の通り調製した。KpnIとBamHI部位の間の正確
な配列を有する1個のクローンをKpnIでおよびpBR322ベ
クター中を切断するSalIで切断した。400bpバンドをゲ
ル精製し、aFGF遺伝子インサートのEcoRI部位からKpnI
部位まで正確な配列を含む2番目のクローンの3.8kbのK
pnIおよびSalIで切断したバンドに連結した。形質転換
後生成したクローンを所望の配列が得られたことを確認
するために配列決定した。
正確な209bp配列を含むクローンが得られたため、こ
れらのクローンの操作はさらに必要としなかった。最終
全長aFGF合成遺伝子はBamHIおよびSalIでN末端ハーフ
クローンを切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理
し、これをC末端ハーフクローンのゲル精製209bp BamH
I-SalIインサートに連結した。この連結物質を前のよう
にRR1コンピテント細胞を形質転換するために使用し
た。
れらのクローンの操作はさらに必要としなかった。最終
全長aFGF合成遺伝子はBamHIおよびSalIでN末端ハーフ
クローンを切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理
し、これをC末端ハーフクローンのゲル精製209bp BamH
I-SalIインサートに連結した。この連結物質を前のよう
にRR1コンピテント細胞を形質転換するために使用し
た。
実施例3 ウシaFGF遺伝子のヒトaFGF遺伝子への変異誘発 ウシaFGF遺伝子の変異誘発を促進するために、実施例
2で得た合成遺伝子をM13mp19一重鎖DNAバクテリオファ
ージベクターに導入した。ゾラーおよびスミス、メソッ
ズインエンザイモロジー第100巻、468〜500頁(1983
年)、ノリス等、ヌクレイックアシッズリサーチ第11
巻、5103〜5112頁(1983年)およびゾラーおよびスミ
ス、DNA、第3巻、479〜488頁(1984年)に報告される
通り変異誘発標準操作を使用した。ウシpKK-aFGFプラス
ミドをEcoRI-SalIで切断し、得られた440bp断片を実施
例2のようにアガロースゲル精製した。ベクターM13mp1
9RF DNA(BRL)を2つの同じエンドヌクレアーゼで切断
し、末端を順次細菌アルカリ性ホスファターゼ100ユニ
ットを有する10mMトリスpH8.0 100μl中で脱リン酸化
した。連結反応を処理ベクターDNA50ngとaFGF遺伝子断
片DNA12ngを使用してT4DNAリガーゼ2ユニットを有する
25mMトリスpH7.8、10mM MgCl2、1mM DTT、0.4mM ATPの1
0μl中4℃で16時間行なった。反応混合液を1:5H2Oに
希釈し、希釈液1μlを供給者によって記載される通り
大腸菌DH5コンピテント細胞(BRL)20μlを形質転換す
るために使用した。細胞を0.03%X−galおよび0.3mM I
PTG中大腸菌JM105(ファーマシア)宿主細胞を平板にし
37℃で温置した後、無色のプラークを分離した。ウシaF
GF遺伝子を含む1つのファージクローン、M13mp19−baF
GFを選択した。
2で得た合成遺伝子をM13mp19一重鎖DNAバクテリオファ
ージベクターに導入した。ゾラーおよびスミス、メソッ
ズインエンザイモロジー第100巻、468〜500頁(1983
年)、ノリス等、ヌクレイックアシッズリサーチ第11
巻、5103〜5112頁(1983年)およびゾラーおよびスミ
ス、DNA、第3巻、479〜488頁(1984年)に報告される
通り変異誘発標準操作を使用した。ウシpKK-aFGFプラス
ミドをEcoRI-SalIで切断し、得られた440bp断片を実施
例2のようにアガロースゲル精製した。ベクターM13mp1
9RF DNA(BRL)を2つの同じエンドヌクレアーゼで切断
し、末端を順次細菌アルカリ性ホスファターゼ100ユニ
ットを有する10mMトリスpH8.0 100μl中で脱リン酸化
した。連結反応を処理ベクターDNA50ngとaFGF遺伝子断
片DNA12ngを使用してT4DNAリガーゼ2ユニットを有する
25mMトリスpH7.8、10mM MgCl2、1mM DTT、0.4mM ATPの1
0μl中4℃で16時間行なった。反応混合液を1:5H2Oに
希釈し、希釈液1μlを供給者によって記載される通り
大腸菌DH5コンピテント細胞(BRL)20μlを形質転換す
るために使用した。細胞を0.03%X−galおよび0.3mM I
PTG中大腸菌JM105(ファーマシア)宿主細胞を平板にし
37℃で温置した後、無色のプラークを分離した。ウシaF
GF遺伝子を含む1つのファージクローン、M13mp19−baF
GFを選択した。
ヒト配列を特定するために8種のオリゴヌクレオチド
が指定され合成した。第9表参照。オリゴマー8はさら
に突然変異を含みウシ遺伝子の386部位におけるチミン
はヒト遺伝子のシトシンに置き換えられる。この突然変
異は、ヒトaFGFアミノ酸配列を変化させずに制限部位を
組込ませることができる。
が指定され合成した。第9表参照。オリゴマー8はさら
に突然変異を含みウシ遺伝子の386部位におけるチミン
はヒト遺伝子のシトシンに置き換えられる。この突然変
異は、ヒトaFGFアミノ酸配列を変化させずに制限部位を
組込ませることができる。
ヒトオリゴマー1、2、3、4、6、および8をリン
酸化し、各々15pモルを20mMトリスpH7.5、10mM MgCl2、
50mM NaCl、1mM DTTの10μl中で65℃で10分間、次に23
℃で10分間M13mp19−baFGF一重鎖ファージDNA0.5pモル
に個々にアニーリングした。次に閉環二重鎖分子を20mM
トリスpH7.5、10mM MgCl2、25mM NaCl、5.5mM DTT、0.5
mM ATP、0.25mM dATP、0.25mM d CTP、0.25mM d GTP、
0.25mM d TTPの20μl中でT4DNAリガーゼ1ユニットお
よびDNAポリメラーゼエクレノウフラグメント2ユニッ
トを使用して15℃で17時間温置することによって調製し
た。標本を各々JM105コンピテント細胞を形質転換する
ために使用し、得られた形質転換体プラークを32P−ATP
およびポリヌクレオチドキナーゼを使用して放射性標識
した適当なオリゴマーを用いてハイブリッド形成によっ
て選択した。ハイブリッド形成の条件は、1個の塩基変
化を含むハイブリッド形成を防止するために各プローブ
に対して最適にした。一重鎖DNAをヒトオリゴマー4突
然変異を含むファージクローンから分離し、ヒトオリゴ
マー5を使用して上記操作を繰り返してオリゴマー4お
よび5突然変異を含むクローンを生成した。
酸化し、各々15pモルを20mMトリスpH7.5、10mM MgCl2、
50mM NaCl、1mM DTTの10μl中で65℃で10分間、次に23
℃で10分間M13mp19−baFGF一重鎖ファージDNA0.5pモル
に個々にアニーリングした。次に閉環二重鎖分子を20mM
トリスpH7.5、10mM MgCl2、25mM NaCl、5.5mM DTT、0.5
mM ATP、0.25mM dATP、0.25mM d CTP、0.25mM d GTP、
0.25mM d TTPの20μl中でT4DNAリガーゼ1ユニットお
よびDNAポリメラーゼエクレノウフラグメント2ユニッ
トを使用して15℃で17時間温置することによって調製し
た。標本を各々JM105コンピテント細胞を形質転換する
ために使用し、得られた形質転換体プラークを32P−ATP
およびポリヌクレオチドキナーゼを使用して放射性標識
した適当なオリゴマーを用いてハイブリッド形成によっ
て選択した。ハイブリッド形成の条件は、1個の塩基変
化を含むハイブリッド形成を防止するために各プローブ
に対して最適にした。一重鎖DNAをヒトオリゴマー4突
然変異を含むファージクローンから分離し、ヒトオリゴ
マー5を使用して上記操作を繰り返してオリゴマー4お
よび5突然変異を含むクローンを生成した。
次の操作ではこれらのM13ベースクローン中のウシか
らヒトへの配列突然変異を1つのpBR322ベースクローン
に組み合わせた。RF DNAはヒトオリゴマーおよび1、
2、6および8によって指定される塩基変化を含むクロ
ーンから調製された。ヒト1突然変異体クローンのDNA
をEcoRIで切断し、末端を細菌アルカリ性ホスファター
ゼで脱リン酸化し、DNAをHindIIIで切断した。ヒト2突
然変異体DNAをHindIIIで切断し、ホスファターゼ処理し
た後、BamHIで切断した。ヒト6突然変異体DNAをBamHI
で切断し、ホスファターゼ処理した後 ApaIで切断し
た。同様にヒト8突然変異体をApaIで切断し、末端を脱
リン酸化しDNAをSalIで切断した。これらの4つのDNA標
本を2%アガロースにより電気泳動にかけ各ヒト1、
2、6および8突然変異を含む突然変異体DNAからの45b
p、190bp、135bp、および70bpの断片をゲルから溶離し
た。各断片約60fモルをT4DNAリガーゼ1.5ユニットを有
する25mMトリスpH7.8、10mM MgCl2、1mM DTT、0.4mM AT
Pの5μl中12℃で16時間pBR322からのゲル精製3.7kbEc
oRI-SalI断片約60fモルに集合的に連結した。反応混合
液を1:5H2Oに希釈し、希釈液1μlを供給者によって記
載される通り大腸菌DH5コンピテント細胞(BRL)20μl
を形質転換するために使用した。全部で4つの突然変異
体オリゴマーによって列挙された突然変異を含むクロー
ンを各々のオリゴマーから製造された放射線標識プロー
ブを用いるハイブリッド形成によって選択した。ヒト3
突然変異体M13クローンの切断RF DNAから分離された140
bp KpnI−BamHI DNA断片をこのヒト1−2−6−8突然
変異体DNAのエンドヌクレアーゼ切断生成物に連結してD
H5コンピテント細胞に形質転換してヒト1−2−3−6
−8突然変異を有するクローンを生成した。この後者の
クローンのBamHI-PctI消化断片をヒト4−5M13−ベース
クローンからのRF DNAのBamHI-PctI消化断片に連結し、
連結混合物はDH5コンピテント細胞を形質転換するため
に使用した。ヒト1−2−3−4−5−6−8突然変異
を含むクローンをオリゴマーハイブリッド形成により選
択し、この組換えプラスミドのaFGF遺伝子EcoRI-SalI D
NA断片をM13mp18 (BRL)のホスファターゼ処理EcoRI-S
alI−切断RF DNAに連結した。コンピテントDH5細胞をこ
の連結DNAで形質転換し、形質転換した細胞をJM105宿主
細胞上で培養した。このクローンの一重鎖ファージDNA
をヒト7オリゴマーとアニーリングし、所望の突然変異
全てを含むM13クローンを上述した操作により得た。RF
DNAをこのクローンから調製し、EcoRIおよびSalIで切断
した。得られた440bpバンドをゲル精製し、pKK2.7tacプ
ロモーター発現ベクターの2.7kb EcoRI-SalI DNA断片に
連結した。このDNAをコンピテントDH5細胞を形質転換す
るために使用してaFGFのヒト形態の生成に使用されるヒ
トpKK-aFGF発現クローンを生成した。
らヒトへの配列突然変異を1つのpBR322ベースクローン
に組み合わせた。RF DNAはヒトオリゴマーおよび1、
2、6および8によって指定される塩基変化を含むクロ
ーンから調製された。ヒト1突然変異体クローンのDNA
をEcoRIで切断し、末端を細菌アルカリ性ホスファター
ゼで脱リン酸化し、DNAをHindIIIで切断した。ヒト2突
然変異体DNAをHindIIIで切断し、ホスファターゼ処理し
た後、BamHIで切断した。ヒト6突然変異体DNAをBamHI
で切断し、ホスファターゼ処理した後 ApaIで切断し
た。同様にヒト8突然変異体をApaIで切断し、末端を脱
リン酸化しDNAをSalIで切断した。これらの4つのDNA標
本を2%アガロースにより電気泳動にかけ各ヒト1、
2、6および8突然変異を含む突然変異体DNAからの45b
p、190bp、135bp、および70bpの断片をゲルから溶離し
た。各断片約60fモルをT4DNAリガーゼ1.5ユニットを有
する25mMトリスpH7.8、10mM MgCl2、1mM DTT、0.4mM AT
Pの5μl中12℃で16時間pBR322からのゲル精製3.7kbEc
oRI-SalI断片約60fモルに集合的に連結した。反応混合
液を1:5H2Oに希釈し、希釈液1μlを供給者によって記
載される通り大腸菌DH5コンピテント細胞(BRL)20μl
を形質転換するために使用した。全部で4つの突然変異
体オリゴマーによって列挙された突然変異を含むクロー
ンを各々のオリゴマーから製造された放射線標識プロー
ブを用いるハイブリッド形成によって選択した。ヒト3
突然変異体M13クローンの切断RF DNAから分離された140
bp KpnI−BamHI DNA断片をこのヒト1−2−6−8突然
変異体DNAのエンドヌクレアーゼ切断生成物に連結してD
H5コンピテント細胞に形質転換してヒト1−2−3−6
−8突然変異を有するクローンを生成した。この後者の
クローンのBamHI-PctI消化断片をヒト4−5M13−ベース
クローンからのRF DNAのBamHI-PctI消化断片に連結し、
連結混合物はDH5コンピテント細胞を形質転換するため
に使用した。ヒト1−2−3−4−5−6−8突然変異
を含むクローンをオリゴマーハイブリッド形成により選
択し、この組換えプラスミドのaFGF遺伝子EcoRI-SalI D
NA断片をM13mp18 (BRL)のホスファターゼ処理EcoRI-S
alI−切断RF DNAに連結した。コンピテントDH5細胞をこ
の連結DNAで形質転換し、形質転換した細胞をJM105宿主
細胞上で培養した。このクローンの一重鎖ファージDNA
をヒト7オリゴマーとアニーリングし、所望の突然変異
全てを含むM13クローンを上述した操作により得た。RF
DNAをこのクローンから調製し、EcoRIおよびSalIで切断
した。得られた440bpバンドをゲル精製し、pKK2.7tacプ
ロモーター発現ベクターの2.7kb EcoRI-SalI DNA断片に
連結した。このDNAをコンピテントDH5細胞を形質転換す
るために使用してaFGFのヒト形態の生成に使用されるヒ
トpKK-aFGF発現クローンを生成した。
実施例4 aFGF遺伝子のシステインコドンの変異誘発 実施例3で得たヒトaFGF一重鎖バクテリオファージ組
換えクローン、M13mp18−haFGFをゾラーおよびスミス、
メソッズインエンザイモロジー第100巻、468〜500頁(1
983年)、ノリス等、ヌクレイックアシッズリサーチ、
第11巻、5103〜5112頁(1983年)およびゾラーおよびス
ミス、DNA、第3巻、479〜488頁(1984年)に報告され
る操作を使用して突然変異を誘発させた。3種のオリゴ
ヌクレオチドを16,83および117位のヒトaFGF遺伝子のシ
ステインコドンの各々の代わりにセリンコドンを指定す
るためにデザインした。合成されたオリゴマーは第11表
に示され突然変異塩基は下線が引かれている。
換えクローン、M13mp18−haFGFをゾラーおよびスミス、
メソッズインエンザイモロジー第100巻、468〜500頁(1
983年)、ノリス等、ヌクレイックアシッズリサーチ、
第11巻、5103〜5112頁(1983年)およびゾラーおよびス
ミス、DNA、第3巻、479〜488頁(1984年)に報告され
る操作を使用して突然変異を誘発させた。3種のオリゴ
ヌクレオチドを16,83および117位のヒトaFGF遺伝子のシ
ステインコドンの各々の代わりにセリンコドンを指定す
るためにデザインした。合成されたオリゴマーは第11表
に示され突然変異塩基は下線が引かれている。
オリゴマーをリン酸化し、各々の15pモルを20mMトリ
スpH7.5、10mM MgCl2、50mM NaClおよび1mM DTTの10μ
l中65℃で10分間次に23℃で10分間M13mp18−haFGF一重
鎖DNA330ngに個々にアニーリングした。DNAの2番目の
連鎖をT4DNAリガーゼ3単位およびDNAポリメラーゼIク
レノウフラグメント0.4単位を用いて20mMトリスpH7.5、
10mMMgCl2、25mM NaCl、5.5mM DTT、0.5mM ATP、0.25mM
d ATP、0.25 d CTP、0.25mM d GTP、0.25mM d TTPの20
μl中でプライマーとしてアニーリングオリゴマーを使
用して12℃で17時間温置することによって合成した。3
種の標本を各々1:5H2Oに希釈し、希釈液1μlを供給者
によって 記載される通り大腸菌DH5コンピテント細胞
(ベテスダリサーチラボラトリー)20μlアリコートを
形質転換するために使用した。形質転換された細胞をM1
3ウイルスに対して宿主細胞として作用する大腸菌JM105
細胞のローン上で培養した。得られた形質転換体プラー
クを32P−ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼを使用し
て放射性標識した適当なオリゴマーとハイブリッド形成
して選択した。ハイブリッド形成の条件は各々のプロー
ブに対して1個の塩基変化を含有するハイブリッドの保
持を防止するように最適にした。
スpH7.5、10mM MgCl2、50mM NaClおよび1mM DTTの10μ
l中65℃で10分間次に23℃で10分間M13mp18−haFGF一重
鎖DNA330ngに個々にアニーリングした。DNAの2番目の
連鎖をT4DNAリガーゼ3単位およびDNAポリメラーゼIク
レノウフラグメント0.4単位を用いて20mMトリスpH7.5、
10mMMgCl2、25mM NaCl、5.5mM DTT、0.5mM ATP、0.25mM
d ATP、0.25 d CTP、0.25mM d GTP、0.25mM d TTPの20
μl中でプライマーとしてアニーリングオリゴマーを使
用して12℃で17時間温置することによって合成した。3
種の標本を各々1:5H2Oに希釈し、希釈液1μlを供給者
によって 記載される通り大腸菌DH5コンピテント細胞
(ベテスダリサーチラボラトリー)20μlアリコートを
形質転換するために使用した。形質転換された細胞をM1
3ウイルスに対して宿主細胞として作用する大腸菌JM105
細胞のローン上で培養した。得られた形質転換体プラー
クを32P−ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼを使用し
て放射性標識した適当なオリゴマーとハイブリッド形成
して選択した。ハイブリッド形成の条件は各々のプロー
ブに対して1個の塩基変化を含有するハイブリッドの保
持を防止するように最適にした。
サンガー等、プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第74
巻、5463〜5467頁(1977年)のジデオキシヌクレオチド
鎖終結方法を使用するDNA配列解析のためにシステイン
からセリンへの突然変異の各々を含むファージクローン
から一重鎖DNAを分離した。次にRF DNAを各々がデザイ
ンされた突然変異の1つを含む3個のクローンから調製
し、EcoRIおよびSalIで切断した後、放出されたFGF遺伝
子インサートをアガロースゲル電気泳動によって分離し
た。精製440bpインサートをT4DNAリガーゼ3単位を有す
る25mMトリスpH7.8、10mMMgCl2、1mM DTT0.4mM ATPの10
μl中でpKK2.7tacプロモーター発現ベクターの2.7kb E
coRI-SalI DNA断片に14℃で2時間各々連結した。連結
したDNAをDH5コンピテント細胞を形質転換するために使
用し、突然変異Cysコドンを有するDNAを含むクローンを
適当なオリゴマーとのハイブリッド形成によって選択し
た。これらのクローンのプラスミドDNA中のFGF遺伝子イ
ンサートをマキサムおよびギルバート、メソッズインエ
ンザイモロジー第65巻、499〜560頁(1980年)の化学的
方法によって完全に配列決定した。1つのクローンは、
83位のシステインコドンの代わりにセリンコドンを生じ
るように元のヒトaFGF発現クローンとは塩基が1個だけ
変化しており、pKK-haFGF(Ser83)として指定する。
巻、5463〜5467頁(1977年)のジデオキシヌクレオチド
鎖終結方法を使用するDNA配列解析のためにシステイン
からセリンへの突然変異の各々を含むファージクローン
から一重鎖DNAを分離した。次にRF DNAを各々がデザイ
ンされた突然変異の1つを含む3個のクローンから調製
し、EcoRIおよびSalIで切断した後、放出されたFGF遺伝
子インサートをアガロースゲル電気泳動によって分離し
た。精製440bpインサートをT4DNAリガーゼ3単位を有す
る25mMトリスpH7.8、10mMMgCl2、1mM DTT0.4mM ATPの10
μl中でpKK2.7tacプロモーター発現ベクターの2.7kb E
coRI-SalI DNA断片に14℃で2時間各々連結した。連結
したDNAをDH5コンピテント細胞を形質転換するために使
用し、突然変異Cysコドンを有するDNAを含むクローンを
適当なオリゴマーとのハイブリッド形成によって選択し
た。これらのクローンのプラスミドDNA中のFGF遺伝子イ
ンサートをマキサムおよびギルバート、メソッズインエ
ンザイモロジー第65巻、499〜560頁(1980年)の化学的
方法によって完全に配列決定した。1つのクローンは、
83位のシステインコドンの代わりにセリンコドンを生じ
るように元のヒトaFGF発現クローンとは塩基が1個だけ
変化しており、pKK-haFGF(Ser83)として指定する。
また他の2つのシステインからセリンへの突然変異の
各々を含むクローンはさらに列挙されない変化を含有し
た。所望の1個の塩基突然変異体を生成するために次の
連結反応および形質転換を行なった。16位にセリンコド
ンを有するクローンの410bpHindIII誘発DNA断片を分離
し、元のpKK−haFGF発現クローンの2.7kbHindIII誘導断
片に連結した。117位にセリンコドンを含むクローンの2
30bp Ncol−SalI誘導DNAを分離し、pKK−haFGFの2.9kb
Ncol−SalI誘導断片に連結した。これらの連結試料の各
々をDH5コンピテント細胞を形質転換するために使用
し、ハイブリッド形成および配列決定技術をpKK−haFGF
(Ser16)およびpKK−haFGF(Ser117)に指定される他
の2つの所望の1個の塩基突然変異体を確認するために
使用した。これらの3種のクローンをヒトaFGFのSer1
6、Ser83およびSer117形態の生成に使用した。
各々を含むクローンはさらに列挙されない変化を含有し
た。所望の1個の塩基突然変異体を生成するために次の
連結反応および形質転換を行なった。16位にセリンコド
ンを有するクローンの410bpHindIII誘発DNA断片を分離
し、元のpKK−haFGF発現クローンの2.7kbHindIII誘導断
片に連結した。117位にセリンコドンを含むクローンの2
30bp Ncol−SalI誘導DNAを分離し、pKK−haFGFの2.9kb
Ncol−SalI誘導断片に連結した。これらの連結試料の各
々をDH5コンピテント細胞を形質転換するために使用
し、ハイブリッド形成および配列決定技術をpKK−haFGF
(Ser16)およびpKK−haFGF(Ser117)に指定される他
の2つの所望の1個の塩基突然変異体を確認するために
使用した。これらの3種のクローンをヒトaFGFのSer1
6、Ser83およびSer117形態の生成に使用した。
2または3個のシステイン(Cys)がセリン(Ser)に
変換されているヒトaFGFの位置指向突然変異体を非突然
変異野性型の限定断片を組み合わせることによって組み
立てSer(16)、Ser(83)およびSer(117)突然変異体
合成遺伝子は上述した通りpKK2.7にクローンされ、M13m
p18にサブクローンされている。pKK−haFGF(Ser16、8
3)およびpKK−haFGF(Ser16、117)組換え体はまずSer
16に対するコドンを包含するM13mp18(Ser16)の0.23kb
EcoRI-BamHI断片をpKK2.7に導入し、次にM13mp18(Ser
83)あるいはM13mp18(Ser117)からの0.2kb BamHI−Sa
lI断片を挿入することによって組み立てた。pKK2.7ベク
ターが2つのBamHI部位、即ちマルチクローニング配列
とtacプロモーターの上流に位置する2番目の部位を有
するため、上流にある2番目のBamHI部位が除去された
修飾pKK2.7ベクターをこれらの構成に使用した。対応す
る制限酵素で消化し次いで連結反応を行ないAB1899コン
ピテント細胞(大腸菌ジェネティックストックセンタ
ー)を形質転換した後アンピシリン耐性クローンを選択
し、組換え体(3.1kb)に予期された分子量を有するプ
ラスミドを含むものを選別した。
変換されているヒトaFGFの位置指向突然変異体を非突然
変異野性型の限定断片を組み合わせることによって組み
立てSer(16)、Ser(83)およびSer(117)突然変異体
合成遺伝子は上述した通りpKK2.7にクローンされ、M13m
p18にサブクローンされている。pKK−haFGF(Ser16、8
3)およびpKK−haFGF(Ser16、117)組換え体はまずSer
16に対するコドンを包含するM13mp18(Ser16)の0.23kb
EcoRI-BamHI断片をpKK2.7に導入し、次にM13mp18(Ser
83)あるいはM13mp18(Ser117)からの0.2kb BamHI−Sa
lI断片を挿入することによって組み立てた。pKK2.7ベク
ターが2つのBamHI部位、即ちマルチクローニング配列
とtacプロモーターの上流に位置する2番目の部位を有
するため、上流にある2番目のBamHI部位が除去された
修飾pKK2.7ベクターをこれらの構成に使用した。対応す
る制限酵素で消化し次いで連結反応を行ないAB1899コン
ピテント細胞(大腸菌ジェネティックストックセンタ
ー)を形質転換した後アンピシリン耐性クローンを選択
し、組換え体(3.1kb)に予期された分子量を有するプ
ラスミドを含むものを選別した。
突然変異体haFGF(Ser16、83、117)はpKK−haFGF(S
er16、83)の0.13kbSphl-Sall断片を117位のCysの代わ
りにSerをコードしているpKK(Ser117)の対応する断片
に置き換えることによって組み立てた。pKK(Ser16、8
3)の3kb Sphl-Sall断片を分取用アガロースゲル電気泳
動、電気溶離によって精製し、同様の方法で5%ポリア
クリルアミドゲルから精製したpKK(Ser117)の0.13kb
Sphl-Sall断片に連結した。精製した断片を連結し、AB1
899細胞の形質転換後、アンピシリン耐性に対して組換
え体を選択した。
er16、83)の0.13kbSphl-Sall断片を117位のCysの代わ
りにSerをコードしているpKK(Ser117)の対応する断片
に置き換えることによって組み立てた。pKK(Ser16、8
3)の3kb Sphl-Sall断片を分取用アガロースゲル電気泳
動、電気溶離によって精製し、同様の方法で5%ポリア
クリルアミドゲルから精製したpKK(Ser117)の0.13kb
Sphl-Sall断片に連結した。精製した断片を連結し、AB1
899細胞の形質転換後、アンピシリン耐性に対して組換
え体を選択した。
pKK−haFGF(Ser83、117)の組み立てにはpKK haFGF
の0.3kb Pstl断片を基本的に同様の方法を使用して83お
よび117位の代わりにSerのコドンを包含するpKK−haFGF
(Ser16、83、117)の同様の断片に置き換えた。アンピ
シリン耐性に対して選択されたAB1899をPstl−SalI消化
により解析して連結断片の配向を決定した。すべての突
然変異体遺伝子をUSB社の配列装置を使用するジデオキ
シによって配列決定した。
の0.3kb Pstl断片を基本的に同様の方法を使用して83お
よび117位の代わりにSerのコドンを包含するpKK−haFGF
(Ser16、83、117)の同様の断片に置き換えた。アンピ
シリン耐性に対して選択されたAB1899をPstl−SalI消化
により解析して連結断片の配向を決定した。すべての突
然変異体遺伝子をUSB社の配列装置を使用するジデオキ
シによって配列決定した。
実施例5 合成ウシaFGF遺伝子の発現 実施例4で得た無傷aFGF遺伝子を修飾pKK223−3プラ
スミドに組込んだ。pKK223−3プラスミド(ファーマシ
ア)はtrpプロモーターとlacプロモーターの領域間のハ
イブリッドであるtacプロモーターを含有する、デボア
等、プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第80巻、21〜25
頁(1983年)。またこのプラスミドはrrnB rRNA転写終
結因子を含み、強力な終結因子配列は強力なプロモータ
ーから発現させることが見い出されている、ゲンツ等、
プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第78巻、4936〜4940
頁(1981年)ブロシウス、ジェン第27巻、161〜172頁
(1984年)。pKK223−3プラスミドを修飾してpBR322由
来のSalI制限酵素部位を除去した。これは、pKK223−3
プラスミドDNAをNdeIおよびNavlで切断し、DNA断片をク
レノウDNAポリメラーゼでブラント末端とし、2.7kbDNA
断片を再環化してクローンpKK2.7を生成することによっ
て達成した。次に合成aFGF遺伝子をそのpBR322ベクター
から切断し、EcoRIおよびSalIで制限切断したpKK2.7に
組み込んだ。この構成物は、シャイン−ダルガルノリボ
ゾーム結合部位の11塩基下流に合成遺伝子の開始メチオ
ニンが位置する。第1図に例示される得られた組換えベ
クターを大腸菌JM105細胞にさらに大腸菌DH5細胞に形質
転換した。
スミドに組込んだ。pKK223−3プラスミド(ファーマシ
ア)はtrpプロモーターとlacプロモーターの領域間のハ
イブリッドであるtacプロモーターを含有する、デボア
等、プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第80巻、21〜25
頁(1983年)。またこのプラスミドはrrnB rRNA転写終
結因子を含み、強力な終結因子配列は強力なプロモータ
ーから発現させることが見い出されている、ゲンツ等、
プロク.ナトル.アカド.サイ.USA第78巻、4936〜4940
頁(1981年)ブロシウス、ジェン第27巻、161〜172頁
(1984年)。pKK223−3プラスミドを修飾してpBR322由
来のSalI制限酵素部位を除去した。これは、pKK223−3
プラスミドDNAをNdeIおよびNavlで切断し、DNA断片をク
レノウDNAポリメラーゼでブラント末端とし、2.7kbDNA
断片を再環化してクローンpKK2.7を生成することによっ
て達成した。次に合成aFGF遺伝子をそのpBR322ベクター
から切断し、EcoRIおよびSalIで制限切断したpKK2.7に
組み込んだ。この構成物は、シャイン−ダルガルノリボ
ゾーム結合部位の11塩基下流に合成遺伝子の開始メチオ
ニンが位置する。第1図に例示される得られた組換えベ
クターを大腸菌JM105細胞にさらに大腸菌DH5細胞に形質
転換した。
発現クローンを0.4%グルコースおよび50μg/mlアン
ピシリンを含有するLBブイヨン(1%トリプトン、0.5
%酵母エキス、0.5%NaCl)中37℃で増殖させた。550nm
における光学密度が0.5に達した時、IPTGを添加して1mM
を得、37℃で3時間増殖を続けた。10,000xgで20分間遠
心分離によって細胞を回収し、培養液1からの細胞を
1:1のグリセロール/リン酸塩緩衝食塩水に再懸濁さ
せ、ドライアイス/エタノール浴中で速かに凍結させ、
−70℃で一晩貯蔵した。
ピシリンを含有するLBブイヨン(1%トリプトン、0.5
%酵母エキス、0.5%NaCl)中37℃で増殖させた。550nm
における光学密度が0.5に達した時、IPTGを添加して1mM
を得、37℃で3時間増殖を続けた。10,000xgで20分間遠
心分離によって細胞を回収し、培養液1からの細胞を
1:1のグリセロール/リン酸塩緩衝食塩水に再懸濁さ
せ、ドライアイス/エタノール浴中で速かに凍結させ、
−70℃で一晩貯蔵した。
実施例6 高発現ベクター 実施例4のaFGFの突然変異形態に対して発現が高めら
れたレベルは配列をコードしているaFGFの上流にシスト
ロンをさらに導入するために実施例3の表現ベクターを
修飾することによって生じた。2種のオリゴヌクレオチ
ドを69頁に示される通りの配列で合成した。アニールし
た場合これらのオリゴマーは、EcoRI切断で生じた伸長
部に相補的な4塩基の5′伸長部、ATG翻訳開始コドン
に続きTAA終止コドンの前に位置する7コドンの読み取
り枠、更に終止コドンの上流で読み取り枠内にあるシャ
インダルガルノリボゾーム結合部位を与える。各オリゴ
マー1pモルを使用して、オリゴマーをDNAリガーゼ緩衝
液20μl中で70℃に10分間加熱し、徐々に冷却すること
によって一緒にアニーリングした。アニーリングした混
合液0.3pモルをT4DNAリガーゼ3単位を含む最終容量25
μlのEcoRI切断pKK−haFGFプラスミドDNA0.1pモルに14
℃で2.5時間連結した。連結したDNA5ngを使用してコン
ピテント大腸菌JM105細胞を形質転換した。形質転換体
はEcoRI部位がこの挿入によって失われるので、制限酵
素解析によってさらにイムノブロット解析によって選別
した。高レベルのFGF生成を示す1つのクローン発現ベ
クターは上記マキサムおよびギルバートの化学的手法に
よって配列決定されて新しいシストロン配列の正確な挿
入を確認した。次にこの高発現pKK2c−haFGFベクターを
形質転換操作によって大腸菌DH5に導入した。
れたレベルは配列をコードしているaFGFの上流にシスト
ロンをさらに導入するために実施例3の表現ベクターを
修飾することによって生じた。2種のオリゴヌクレオチ
ドを69頁に示される通りの配列で合成した。アニールし
た場合これらのオリゴマーは、EcoRI切断で生じた伸長
部に相補的な4塩基の5′伸長部、ATG翻訳開始コドン
に続きTAA終止コドンの前に位置する7コドンの読み取
り枠、更に終止コドンの上流で読み取り枠内にあるシャ
インダルガルノリボゾーム結合部位を与える。各オリゴ
マー1pモルを使用して、オリゴマーをDNAリガーゼ緩衝
液20μl中で70℃に10分間加熱し、徐々に冷却すること
によって一緒にアニーリングした。アニーリングした混
合液0.3pモルをT4DNAリガーゼ3単位を含む最終容量25
μlのEcoRI切断pKK−haFGFプラスミドDNA0.1pモルに14
℃で2.5時間連結した。連結したDNA5ngを使用してコン
ピテント大腸菌JM105細胞を形質転換した。形質転換体
はEcoRI部位がこの挿入によって失われるので、制限酵
素解析によってさらにイムノブロット解析によって選別
した。高レベルのFGF生成を示す1つのクローン発現ベ
クターは上記マキサムおよびギルバートの化学的手法に
よって配列決定されて新しいシストロン配列の正確な挿
入を確認した。次にこの高発現pKK2c−haFGFベクターを
形質転換操作によって大腸菌DH5に導入した。
haFGF(Ser117)突然変異体を例えばこの高発現ベク
ターで発現させるためにpKK−haFGF(Ser117)の0.23kb
Ncol−SalI断片をpKK2c−haFGFの2.5kb Ncol−SalI断
片に連結しコンピテント細胞に形質転換した。他の突然
変異haFGFをpKK2c−haFGFの野生型配列を含む適当な制
限断片を突然変異haFGFの類似の制限断片に置き換える
同様の方法で2つのシトロン高発現ベクターに導入し
た。
ターで発現させるためにpKK−haFGF(Ser117)の0.23kb
Ncol−SalI断片をpKK2c−haFGFの2.5kb Ncol−SalI断
片に連結しコンピテント細胞に形質転換した。他の突然
変異haFGFをpKK2c−haFGFの野生型配列を含む適当な制
限断片を突然変異haFGFの類似の制限断片に置き換える
同様の方法で2つのシトロン高発現ベクターに導入し
た。
実施例7 突然変異aFGFの抽出および精製 実施例5で得た凍結細胞を解凍し、100mMリン酸塩緩
衝液、pH7.2、EDTA5mg/mlで50mlを生成する十分量に再
懸濁し、細胞を28,000xgで5分間遠心分離によって集め
た。細胞を2回洗浄し、遠心分離で集め、同一緩衝液50
mlに再懸濁した。660nmにおける3種の突然変異体株懸
濁液の消衰はpKK−haFGF(Ser117)株、103、pKK−haFG
F(Ser16)株、108、pKK−haFGF(Ser83)株59であっ
た。各試料にリゾチーム0.1mg/mlを与え、30℃で緩かに
振盪しながら15分間温置した。細胞を遠心分離で集め、
100mMリン酸塩、pH6.0、3mM EDTA、0.05mM、TPCK、0.05
mMペプスタチンA、0.05mMロイペプチンおよび15μg/ml
BPTIからなる破壊緩衝液50mlに再懸濁した。各細胞の懸
濁液を4℃に維持し、予め冷却したフレンチフレッシャ
ーセルに20,000psi、4℃で2回通過させて破壊した。
破壊した細胞懸濁液をSS−34ソーバルローターに15,000
rpmで15分間さらにベックマン超遠心分離機の70Tiロー
ターに45,000rpmで60分間4℃において遠心分離した。
上澄み液を集め、55ml容量に対する280nmにおける吸光
度はpKK−haFGF(Ser117)、44、pKK−haFGF(Ser1
6)、40およびpKK−haFGF(Ser83)、23を決定し、その
試料を−70℃で凍結した。
衝液、pH7.2、EDTA5mg/mlで50mlを生成する十分量に再
懸濁し、細胞を28,000xgで5分間遠心分離によって集め
た。細胞を2回洗浄し、遠心分離で集め、同一緩衝液50
mlに再懸濁した。660nmにおける3種の突然変異体株懸
濁液の消衰はpKK−haFGF(Ser117)株、103、pKK−haFG
F(Ser16)株、108、pKK−haFGF(Ser83)株59であっ
た。各試料にリゾチーム0.1mg/mlを与え、30℃で緩かに
振盪しながら15分間温置した。細胞を遠心分離で集め、
100mMリン酸塩、pH6.0、3mM EDTA、0.05mM、TPCK、0.05
mMペプスタチンA、0.05mMロイペプチンおよび15μg/ml
BPTIからなる破壊緩衝液50mlに再懸濁した。各細胞の懸
濁液を4℃に維持し、予め冷却したフレンチフレッシャ
ーセルに20,000psi、4℃で2回通過させて破壊した。
破壊した細胞懸濁液をSS−34ソーバルローターに15,000
rpmで15分間さらにベックマン超遠心分離機の70Tiロー
ターに45,000rpmで60分間4℃において遠心分離した。
上澄み液を集め、55ml容量に対する280nmにおける吸光
度はpKK−haFGF(Ser117)、44、pKK−haFGF(Ser1
6)、40およびpKK−haFGF(Ser83)、23を決定し、その
試料を−70℃で凍結した。
CM−セファデックスを含有する100mMリン酸塩緩衝液p
H6.0 200mlをタンパク質1g当り沈降樹脂6.5mlの比率で
(タンパク質溶液1mg/mlの1cmを通過させた吸光度が1.0
と仮定して)上澄み液に添加することによって凍結し
た。試料を燒結ガラス漏斗に集め、150mM NaClを含む10
0mMリン酸塩緩衝液200mlでpH6.0において3回洗浄し
た。樹脂ケークを同一緩衝液200mlに再懸濁させ、断面A
rGA1cm2当り、12ml×hr-1のカラムに充填し、600mM NaC
lを含む150mMリン酸塩緩衝液で同じ流速で洗浄した。60
0mM NaCl緩衝液で溶離したタンパク質を含有する画分を
プールし、pH7.2に調節し、伝導率を脱イオン水で10μ
s×cm-1に調節した。次に10mMリン酸塩pH7.2で平衡に
したヘパリン−セファロース(新しく調製した)(伝導
率1.3μs×cm-1)をタンパク質1mg当り、沈降樹脂1ml
の比率で添加(上記と同様に仮定した吸光度係数を使用
する)し、懸濁液を4℃で1時間緩かに振盪し、樹脂を
漏斗に集め、同一緩衝液で再懸濁し、1時間当り1〜2
カラム容量でカラムに充填した。充填カラムを10mMリン
酸塩、0.8M NaClpH7.2で同じ流速において280nmにおけ
る溶出液の吸光度が溶離緩衝液以上の光学吸光度単位0.
01以内の安定値に低下するまで洗浄し、次に緩衝液を10
mMリン酸塩、1.5M NaClpH7.2に変えた。1.5M緩衝液で溶
離したタンパク質を含む画分(280nmにおける吸光度に
よって監視した)を一緒にプールし、10mM TFAで平衡に
したC3逆相HPLCカラムに装填し、0〜67%CH3CNでの勾
配で30分間溶離した。
H6.0 200mlをタンパク質1g当り沈降樹脂6.5mlの比率で
(タンパク質溶液1mg/mlの1cmを通過させた吸光度が1.0
と仮定して)上澄み液に添加することによって凍結し
た。試料を燒結ガラス漏斗に集め、150mM NaClを含む10
0mMリン酸塩緩衝液200mlでpH6.0において3回洗浄し
た。樹脂ケークを同一緩衝液200mlに再懸濁させ、断面A
rGA1cm2当り、12ml×hr-1のカラムに充填し、600mM NaC
lを含む150mMリン酸塩緩衝液で同じ流速で洗浄した。60
0mM NaCl緩衝液で溶離したタンパク質を含有する画分を
プールし、pH7.2に調節し、伝導率を脱イオン水で10μ
s×cm-1に調節した。次に10mMリン酸塩pH7.2で平衡に
したヘパリン−セファロース(新しく調製した)(伝導
率1.3μs×cm-1)をタンパク質1mg当り、沈降樹脂1ml
の比率で添加(上記と同様に仮定した吸光度係数を使用
する)し、懸濁液を4℃で1時間緩かに振盪し、樹脂を
漏斗に集め、同一緩衝液で再懸濁し、1時間当り1〜2
カラム容量でカラムに充填した。充填カラムを10mMリン
酸塩、0.8M NaClpH7.2で同じ流速において280nmにおけ
る溶出液の吸光度が溶離緩衝液以上の光学吸光度単位0.
01以内の安定値に低下するまで洗浄し、次に緩衝液を10
mMリン酸塩、1.5M NaClpH7.2に変えた。1.5M緩衝液で溶
離したタンパク質を含む画分(280nmにおける吸光度に
よって監視した)を一緒にプールし、10mM TFAで平衡に
したC3逆相HPLCカラムに装填し、0〜67%CH3CNでの勾
配で30分間溶離した。
突然変異株の精製データを以下に示す。
pKK−haFGF(Ser16) 0.6M NaCl緩衝液を用いた全量24mlのCM−セファデッ
クスカラムから画分25〜31を溶離し、タンパク質含有量
3.5mgを脱イオン水で125mlにし(最終伝導率7mS/cm)、
ヘパリン−セファロース4mlを添加した。カラムを6ml/h
で運転した。1.5M NaClで溶離した画分55〜57をC3カラ
ムに注入した。このカラムから主要ピークを集め、タン
パク質含有量80μgを有した。
クスカラムから画分25〜31を溶離し、タンパク質含有量
3.5mgを脱イオン水で125mlにし(最終伝導率7mS/cm)、
ヘパリン−セファロース4mlを添加した。カラムを6ml/h
で運転した。1.5M NaClで溶離した画分55〜57をC3カラ
ムに注入した。このカラムから主要ピークを集め、タン
パク質含有量80μgを有した。
pKK−haFGF(Ser83) 0.6M NaCl緩衝液を用いた全量40mlのCM−セファデッ
クスカラムから画分19〜33を溶離し、タンパク質含有量
4.0mgを脱イオン水で150mlにし(最終伝導率10mS/c
m)、ヘパリン−セファロース4mlを添加した。カラムを
6ml/hで運転した。1.5M NaClで溶離した画分40〜44をC3
カラムに注入した。このカラムから主要ピークを集め、
タンパク質含有量は80μgであった。
クスカラムから画分19〜33を溶離し、タンパク質含有量
4.0mgを脱イオン水で150mlにし(最終伝導率10mS/c
m)、ヘパリン−セファロース4mlを添加した。カラムを
6ml/hで運転した。1.5M NaClで溶離した画分40〜44をC3
カラムに注入した。このカラムから主要ピークを集め、
タンパク質含有量は80μgであった。
pKK−haFGF(Ser117) 0.6M NaCl緩衝液を用いた全量57mlのCM−セファデッ
クスカラムから画分19〜33を溶離し、タンパク質含有量
11.4mgを脱イオン水で250mlにし(最終伝導率12mS/c
m)、ヘパリン−セファロース10mlを添加した。カラム
を11ml/hで運転した。1.5M NaClで溶離した画分59〜62
をC3カラムに注入した。このカラムから主要ピークを集
め、タンパク質含有量は614μgであった。
クスカラムから画分19〜33を溶離し、タンパク質含有量
11.4mgを脱イオン水で250mlにし(最終伝導率12mS/c
m)、ヘパリン−セファロース10mlを添加した。カラム
を11ml/hで運転した。1.5M NaClで溶離した画分59〜62
をC3カラムに注入した。このカラムから主要ピークを集
め、タンパク質含有量は614μgであった。
多数突然変異体のタンパク質生成物を同様の操作で精
製した。aFGFのすべての形態、組換え野生型および突然
変異体は、1本の16kDaバンドだけが還元後検出域値の1
00倍以上の試料量で行なったSDS15%ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により検出されることから高度に精製さ
れている。
製した。aFGFのすべての形態、組換え野生型および突然
変異体は、1本の16kDaバンドだけが還元後検出域値の1
00倍以上の試料量で行なったSDS15%ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により検出されることから高度に精製さ
れている。
実施例8 突然変異aFGFの生物学的活性 実施例7で得た精製γ−aFGFの生物学的活性をトーマ
ス等、ジェー.バイオル.ケム.第225巻、5517〜5520
頁(1980年)を改良した繊維芽細胞マイトジェンアッセ
イを使用して評価した。BALB/c3T3A31繊維芽細胞(アメ
リカンタイプカルチュアコレクション)を10%加熱不活
化仔ウシ血清を含む培地で96ウェルの培養皿に1ウェル
当り3×104細胞を蒔き、7%CO2(pH7.35±0.05)中に
温置した。細胞は、培地を6及び24時間後に1.0%加熱
不活化仔牛血清に置換することにより完全に休止した。
平板にした後55時間でヘパリンで5μgの存在下または
不在下で試験試料10μlおよびデキサメタゾン0.11μg
を添加し、70時間で各ウェルに[メチル−3H]−チミジ
ン(20Ci/ミリモル、ニューイングランドヌクレア)0.2
μCiおよび無標識チミジン0.3μgを補足し、95時間で
細胞をDNAに組込まれた放射性標識の定量に対して処理
した。各々の用量−応答点は4回の定量の平均とした。
ただ1つの突然変異を有するSer−117突然変異体の結果
は次の表に示され、野性型に等しいかまたは高い活性を
示している。
ス等、ジェー.バイオル.ケム.第225巻、5517〜5520
頁(1980年)を改良した繊維芽細胞マイトジェンアッセ
イを使用して評価した。BALB/c3T3A31繊維芽細胞(アメ
リカンタイプカルチュアコレクション)を10%加熱不活
化仔ウシ血清を含む培地で96ウェルの培養皿に1ウェル
当り3×104細胞を蒔き、7%CO2(pH7.35±0.05)中に
温置した。細胞は、培地を6及び24時間後に1.0%加熱
不活化仔牛血清に置換することにより完全に休止した。
平板にした後55時間でヘパリンで5μgの存在下または
不在下で試験試料10μlおよびデキサメタゾン0.11μg
を添加し、70時間で各ウェルに[メチル−3H]−チミジ
ン(20Ci/ミリモル、ニューイングランドヌクレア)0.2
μCiおよび無標識チミジン0.3μgを補足し、95時間で
細胞をDNAに組込まれた放射性標識の定量に対して処理
した。各々の用量−応答点は4回の定量の平均とした。
ただ1つの突然変異を有するSer−117突然変異体の結果
は次の表に示され、野性型に等しいかまたは高い活性を
示している。
4本の滴定曲線は最大上昇の1/2で比較する。ヘパリ
ン不在下のWTはピークに達しないため他の3欄のピーク
と同じと仮定して、1/2最大値を推定した。
ン不在下のWTはピークに達しないため他の3欄のピーク
と同じと仮定して、1/2最大値を推定した。
精製反応物1.51mg/mlを含有する原液からすべての希
釈液を調製した。Ser−117突然変異体はヘパリンの存在
下で野生型と少なくとも同じ活性である。野生型の活性
は、突然変異体より約10倍以上ヘパリンに依存してお
り、その結果WTaFGFのヘパリン依存の90%がSer−117突
然変異体では排除される。
釈液を調製した。Ser−117突然変異体はヘパリンの存在
下で野生型と少なくとも同じ活性である。野生型の活性
は、突然変異体より約10倍以上ヘパリンに依存してお
り、その結果WTaFGFのヘパリン依存の90%がSer−117突
然変異体では排除される。
生物学的活性を評価するために使用されたマイトジェ
ン活性のアッセイは突然変異および野生型aFGFが比較で
きるように修飾された。加熱不活化仔ウシを1%インシ
ュリン−セレン−トランスフェリン(ITS)、L−ヒス
チジン0.4g、1Mエタノールアミン50μl、75%DMED1
当りリノール酸5.35mgを有するウシ血清アルブミン1.25
g、ペニシリン−ストレプトマイシンの両方を含む25%H
am'S F12および上述したL−グルタミンに置き換えた。
完全な服用量−応答アッセイは上述した通りバックグラ
ウンドレベルからDNA合成のピークまでの完全な応答を
起こさせるaFGF濃度範囲、少なくともlog3以上の濃度範
囲の2倍段階希釈液で行われた。すべての濃度点は96ウ
ェル皿中の集密的Balb/c3T3細胞の4連で行なった。1
刺激単位単位は、1/2最大応答を生じる1ml当りのaFGFの
量として計算した。マイトジェン比活性は純粋なaFGF1m
g当りの刺激単位数である。aFGFの全試料は同じTFA/CH3
CN溶媒で50μg/mlに予め希釈した。野生型および突然変
異aFGFの活性は次の表で比較される。
ン活性のアッセイは突然変異および野生型aFGFが比較で
きるように修飾された。加熱不活化仔ウシを1%インシ
ュリン−セレン−トランスフェリン(ITS)、L−ヒス
チジン0.4g、1Mエタノールアミン50μl、75%DMED1
当りリノール酸5.35mgを有するウシ血清アルブミン1.25
g、ペニシリン−ストレプトマイシンの両方を含む25%H
am'S F12および上述したL−グルタミンに置き換えた。
完全な服用量−応答アッセイは上述した通りバックグラ
ウンドレベルからDNA合成のピークまでの完全な応答を
起こさせるaFGF濃度範囲、少なくともlog3以上の濃度範
囲の2倍段階希釈液で行われた。すべての濃度点は96ウ
ェル皿中の集密的Balb/c3T3細胞の4連で行なった。1
刺激単位単位は、1/2最大応答を生じる1ml当りのaFGFの
量として計算した。マイトジェン比活性は純粋なaFGF1m
g当りの刺激単位数である。aFGFの全試料は同じTFA/CH3
CN溶媒で50μg/mlに予め希釈した。野生型および突然変
異aFGFの活性は次の表で比較される。
組換え野生型haFGF、1個のSer突然変異体および多重
Ser突然変異体の相対的安定性を定量した。マイトジェ
ン活性は、ヒト血清アルブミン1mg/mlを含有する37℃に
おいてpH7.3にCO2で緩衝した連続試料希釈液として通常
使用される血清のないDME溶液で0、1および8日温置
することにより測定した。マイトジェン試料はヘパリン
500μg/mlの存在下または不在下で、検定における最大
濃度の10倍濃縮液に等価な512ng/mlで貯蔵した。各々の
試料を貯蔵し、ヘパリンの存在下あるいは不在下で検定
した。各々0日を100%活性として比較することにより
相対的安定性を貯蔵時間の作用として第2図に示す。第
2図において▼は野生型に対応し、▲はhaFGF(Ser16)
に対応し、■はhaFGF(Ser83)に対応し、●はhaFGF(S
er117)に対応し、▽はhaFGF(Ser16、83)に対応し、
△はhaFGF(Ser16、117)に対応し、□はhaFGFに対応
し、○はhaFGF(Ser16、83、117)に対応する。
Ser突然変異体の相対的安定性を定量した。マイトジェ
ン活性は、ヒト血清アルブミン1mg/mlを含有する37℃に
おいてpH7.3にCO2で緩衝した連続試料希釈液として通常
使用される血清のないDME溶液で0、1および8日温置
することにより測定した。マイトジェン試料はヘパリン
500μg/mlの存在下または不在下で、検定における最大
濃度の10倍濃縮液に等価な512ng/mlで貯蔵した。各々の
試料を貯蔵し、ヘパリンの存在下あるいは不在下で検定
した。各々0日を100%活性として比較することにより
相対的安定性を貯蔵時間の作用として第2図に示す。第
2図において▼は野生型に対応し、▲はhaFGF(Ser16)
に対応し、■はhaFGF(Ser83)に対応し、●はhaFGF(S
er117)に対応し、▽はhaFGF(Ser16、83)に対応し、
△はhaFGF(Ser16、117)に対応し、□はhaFGFに対応
し、○はhaFGF(Ser16、83、117)に対応する。
ヘパリンの存在下野生型haFGFおよび突然変異体の活
性の喪失は、指数崩壊に密接に適合する、第4A図参照。
Ser(16)を除く突然変異すべての活性は野性型マイト
ジェンより安定である。最も安定な突然変異は安定性が
減少する順にSer(16、83、117)、Ser(117)、Ser(1
6、83)、Ser(83、117)、Ser(16、83)およびSer(8
3)、Ser(16)である。Ser(83)の安定性は野生型よ
りわずかだけ高い。aFGFの種々の形態は、ヘパリンの不
在下で安定でなく、Ser(16、83、117)は明らかに除い
て崩壊は時間の簡単な関数ではないように思われる。
性の喪失は、指数崩壊に密接に適合する、第4A図参照。
Ser(16)を除く突然変異すべての活性は野性型マイト
ジェンより安定である。最も安定な突然変異は安定性が
減少する順にSer(16、83、117)、Ser(117)、Ser(1
6、83)、Ser(83、117)、Ser(16、83)およびSer(8
3)、Ser(16)である。Ser(83)の安定性は野生型よ
りわずかだけ高い。aFGFの種々の形態は、ヘパリンの不
在下で安定でなく、Ser(16、83、117)は明らかに除い
て崩壊は時間の簡単な関数ではないように思われる。
大腸菌DH5中でセリン117突然変異を発現することがで
きる遺伝子を含むA48−lalと命名された発現ベクターpK
K−haFGF(Ser117)の試料はブダペスト条約に従って19
87年9月30日にアメリカンタイプカルチュアコレクショ
ン、12301パークラウンドライブ、ロックビル、マリー
ランド20852USAに寄託され、ATCC番号67522に指定され
ている。
きる遺伝子を含むA48−lalと命名された発現ベクターpK
K−haFGF(Ser117)の試料はブダペスト条約に従って19
87年9月30日にアメリカンタイプカルチュアコレクショ
ン、12301パークラウンドライブ、ロックビル、マリー
ランド20852USAに寄託され、ATCC番号67522に指定され
ている。
第1図は、突然変異体γ−aFGFの遺伝子を含むpKK223−
3プラスミドを示す図である。 第2図は、ヘパリンの存在下(A)とヘパリン不在下
(B)での組換え野生型haFGFと種々の突然変異体の相
対的安定性を比較するものである。
3プラスミドを示す図である。 第2図は、ヘパリンの存在下(A)とヘパリン不在下
(B)での組換え野生型haFGFと種々の突然変異体の相
対的安定性を比較するものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07K 14/50 8318−4H C12P 21/02 H 9282−4B //(C12P 21/02 C12R 1:19) A61K 37/24 ACB (56)参考文献 特開 昭61−28393(JP,A) 特開 昭61−12289(JP,A) 国際公開87/1728(WO,A)
Claims (39)
- 【請求項1】下記アミノ酸配列 [式中、Xの一つまたはそれ以上が独立に分子内または
分子間ジスルフィド結合を形成できないアミノ酸を表
し、残りのXはシステインを表す;Yはメチオニン或いは
空気酸化を受けないアミノ酸を表す] を有し、その生物活性が本来の酸性繊維芽細胞成長因子
に比べ増強され且つヘパリン依存性が低いことを特徴と
する、生物学的に活性を有する組換え変異ヒト酸性繊維
芽細胞成長因子及びそのすべてのミクロ不均質形態(そ
のN末端で通常のアミノ酸に更にメチオニンが付加され
たものも含む)。 - 【請求項2】154、140または139個のアミノ酸からな
る、請求項1記載の変異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子及
びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項3】ジスルフィド結合を形成できないアミノ酸
がセリンである請求項1記載の変異ヒト酸性繊維芽細胞
成長因子及びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項4】第16位、83位及び117位の3個全部のシス
テインが分子内または分子間ジスルフィド結合を形成で
きないアミノ酸に置換されている請求項1記載の変異ヒ
ト酸性繊維芽細胞成長因子及びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項5】154、140または139個のアミノ酸からな
る、請求項4記載の変異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子及
びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項6】ジスルフィド結合を形成できないアミノ酸
がセリンである請求項4記載の変異ヒト酸性繊維芽細胞
成長因子及びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項7】第16位、83位及び117位のシステインの内
2個が分子内または分子間ジスルフィド結合を形成でき
ないアミノ酸に置換されている請求項1記載の変異ヒト
酸性繊維芽細胞成長因子及びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項8】154、140または139個のアミノ酸からな
る、請求項7記載の変異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子及
びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項9】ジスルフィド結合を形成できないアミノ酸
がセリンである請求項7記載の変異ヒト酸性繊維芽細胞
成長因子及びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項10】第117位のシステインが分子内または分
子間ジスルフィド結合を形成できないアミノ酸に置換さ
れている請求項1記載の変異ヒト酸性繊維芽細胞成長因
子及びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項11】154、140または139個のアミノ酸からな
る請求項10記載の変異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子及び
そのミクロ不均質形態。 - 【請求項12】ジスルフィド結合を形成できないアミノ
酸がセリンである請求項10記載の変異ヒト酸性繊維芽細
胞成長因子及びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項13】第67位のメチオニン残基が空気酸化を受
けないアミノ酸に置換され、且つN末端で通常の1番目
のアミノ酸に更にメチオニンが付加されていてもよい、
請求項1、4、7、または10のいずれかに記載の変異ヒ
ト酸性繊維芽細胞成長因子及びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項14】空気酸化を受けないアミノ酸がアラニ
ン、バリン、ロイシン或いはイソロイシンのいずれかで
ある、請求項13記載の変異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子
及びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項15】空気酸化を受けないアミノ酸がロイシン
である、請求項13記載の変異ヒト酸性繊維芽細胞成長因
子及びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項16】下記アミノ酸配列 [式中、Xの一つまたはそれ以上が独立に、分子内また
は分子間ジスルフィド結合を形成できないアミノ酸を表
し、残りのXはシステインを表す;Yはメチオニン或いは
空気酸化を受けないアミノ酸を表す] を有し、その生物活性が本来の酸性繊維芽細胞成長因子
に比べ増強され且つヘパリン依存性が低いことを特徴と
する、生物学的に活性を有する組換え変異ヒト酸性繊維
芽細胞成長因子及びそのすべてのミクロ不均質形態(そ
のN末端で通常のアミノ酸に更にメチオニンが付加され
たものも含む)をコードするDNA配列。 - 【請求項17】上流にさらに酸性繊維芽細胞成長因子の
発現を高めるシストロンがついている、請求項16記載の
DNA配列。 - 【請求項18】第16、83、117位のアミノ酸すべてが分
子内または分子間ジスルフィド結合を形成できないアミ
ノ酸である変異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子をコードす
る、請求項16記載のDNA配列。 - 【請求項19】上流にさらに酸性繊維芽細胞成長因子の
発現を高めるシストロンがついている、請求項18記載の
DNA配列。 - 【請求項20】第16、83、117位のアミノ酸の内2個が
分子内または分子間ジスルフィド結合を形成できないア
ミノ酸である変異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子をコード
する、請求項16記載のDNA配列。 - 【請求項21】上流にさらに酸性繊維芽細胞成長因子の
発現を高めるシストロンがついている、請求項20記載の
DNA配列。 - 【請求項22】第117位のアミノ酸がジスルフィド結合
を形成できないアミノ酸である変異ヒト酸性繊維芽細胞
成長因子をコードする、請求項16記載のDNA配列。 - 【請求項23】上流にさらに酸性繊維芽細胞成長因子の
発現を高めるシストロンがついている、請求項22記載の
DNA配列。 - 【請求項24】7位のアミノ酸が空気酸化を受けないア
ミノ酸である変異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子をコード
する、請求項16記載のDNA配列。 - 【請求項25】上流にさらに酸性繊維芽細胞成長因子の
発現を高めるシストロンがついている、請求項24記載の
DNA配列。 - 【請求項26】医薬担体及び請求項1、4、7、10のい
ずれかに記載の組換え変異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子
及びそのミクロ不均質形態の有効量を包含している、軟
組織、骨格筋組織、軟骨、血管組織、及び神経組織の修
復及びプラスミノーゲン活性化因子産生のための医薬組
成物。 - 【請求項27】医薬担体及び請求項4に記載の組換え変
異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子及びそのミクロ不均質形
態の有効量を包含している、軟組織、骨格筋組織、軟
骨、血管組織、及び神経組織の修復及びプラスミノーゲ
ン活性化因子産生のための医薬組成物。 - 【請求項28】医薬担体及び請求項7に記載の組換え変
異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子及びそのミクロ不均質形
態の有効量を包含している、軟組織、骨格筋組織、軟
骨、血管組織、及び神経組織の修復及びプラスミノーゲ
ン活性化因子産生のための医薬組成物。 - 【請求項29】医薬担体及び請求項10に記載の組換え変
異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子及びそのミクロ不均質形
態の有効量を包含している、軟組織、骨格筋組織、軟
骨、血管組織、及び神経組織の修復及びプラスミノーゲ
ン活性化因子産生のための医薬組成物。 - 【請求項30】医薬担体及び請求項13に記載の組換え変
異ヒト酸性繊維芽細胞成長因子及びそのミクロ不均質形
態の有効量を包含している、軟組織、骨格筋組織、軟
骨、血管組織、及び神経組織の修復及びプラスミノーゲ
ン活性化因子産生のための医薬組成物。 - 【請求項31】a.変異ヒト繊維芽細胞成長因子をコード
するDNA配列を含むプラスミドを供給し(但しそのDNA配
列はそのプラスミドを含む宿主中で発現される)、 b.プラスミドを宿主に組み込み、 c.該酸性繊維芽細胞成長因子の発現に適当な条件下でプ
ラスミドを含有する宿主を維持する の段階よりなることを特徴とする請求項1、4、7、10
のいずれかに記載の生物学的に有効な組換え変異ヒト酸
性繊維芽細胞成長因子及びそのミクロ不均質形態の製造
寸法。 - 【請求項32】140個のアミノ酸からなる天然ウシ酸性
繊維芽細胞成長因子に従って数えて16、47及び83位のシ
ステイン残基の2個以上或いは83位のシステインだけが
分子内または分子間ジスルフィド結合を生成することが
できないアミノ酸に置換され、その生物活性が本来の酸
性繊維芽細胞成長因子に比べ増強され且つヘパリン依存
性が低いことを特徴とする、任意によりN−末端で通常
の1番目のアミノ酸に更にメチオニンが付加されていて
もよい生物学的に有効な組換え変異ウシ酸性繊維芽細胞
成長因子及びそのミクロ不均質形態。 - 【請求項33】140個のアミノ酸からなる天然ウシ酸性
繊維芽細胞成長因子に従って数えて67位のメチオニン残
基が非空気酸化アミノ酸に置換され、任意によりN−末
端で通常の1番目のアミノ酸に更にメチオニンが付加さ
れていてもよい請求項32記載の生物学的に有効な組換え
変異ウシ酸性繊維芽細胞成長因子及びそのミクロ不均質
形態。 - 【請求項34】下記アミノ酸配列 を有し、第117位のアミノ酸がセリンであることを特徴
とする生物学的に有効な組換え変異ヒト酸性繊維芽細胞
成長因子及びそのすべてのミクロ不均質形態(N−末端
で第1番目のアミノ酸に更にメチオニンが付加されたも
のを含む)。 - 【請求項35】67位のメチオニン残基がロイシンに置換
される請求項34記載の組換え変異ヒト酸性繊維芽細胞成
長因子及びそのすべてのミクロ不均質形態。 - 【請求項36】下記アミノ酸配列 を有し、第83位及び第117位のアミノ酸がセリンである
ことを特徴とする生物学的に有効な組換え変異ヒト酸性
繊維芽細胞成長因子及びそのすべてのミクロ不均質形態
(N−末端で第1番目のアミノ酸に更にメチオニンが付
加されたものを含む)。 - 【請求項37】67位のメチオニン残基がロイシンに置換
される請求項36記載の組換え変異ヒト酸性繊維芽細胞成
長因子及びそのすべてのミクロ不均質形態。 - 【請求項38】下記アミノ酸配列 を有し、第16位、第83位及び第117位のアミノ酸がセリ
ンであることを特徴とする生物学的に有効な組換え変異
ヒト酸性繊維芽細胞成長因子及びそのすべてのミクロ不
均質形態(N、末端で第1番目のアミノ酸に更にメチオ
ニンが付加されたものを含む)。 - 【請求項39】第67位のメチオニン残基がロイシンに置
換された請求項38記載の組換え変異ヒト酸性繊維芽細胞
成長因子及びそのすべてのミクロ不均質形態。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US244,431 | 1981-03-16 | ||
US11260087A | 1987-10-22 | 1987-10-22 | |
US112,600 | 1987-10-22 | ||
US24443188A | 1988-09-16 | 1988-09-16 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02484A JPH02484A (ja) | 1990-01-05 |
JPH082309B2 true JPH082309B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=26810140
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63264261A Expired - Lifetime JPH082309B2 (ja) | 1987-10-22 | 1988-10-21 | 突然変異体の酸性繊維芽細胞成長因子 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
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JP (1) | JPH082309B2 (ja) |
KR (1) | KR970009340B1 (ja) |
AT (1) | ATE117723T1 (ja) |
AU (1) | AU623351B2 (ja) |
CA (1) | CA1340363C (ja) |
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DK (1) | DK174961B1 (ja) |
ES (1) | ES2070125T3 (ja) |
IE (1) | IE65360B1 (ja) |
IL (1) | IL88034A (ja) |
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