DK175786B1 - Kloning og ekspression af sur fibroblastvækstfaktor - Google Patents

Description

DK 175786 B1 i i i

Fig. I viser skematisk pKK223-3 plasmidet indeholdende genet for aFGF.

Hjerneafledte fibroblastmitogener blev først beskrevet af 5 Trowell et al., J. Exp. Biol. 16: 60-70 (1939) og Hoff man, Growth 4: 361-376 (1940). Det blev derefter vist, at hypofyseekstrakter også havde kraftig mitogen aktivitet I for fibroblaster, Armelin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: ! 2702-2706 (1973) . Delvis rensning af både hjerne- og hy- 10 pofysefibroblasvækstfaktor (FGF) afslørede mitogen aktivitet mod en række forskellige typer adkilte celler, herunder vaskulære endothelialceller, Gospodarowicz et al.,

Natl. Cancer Inst. Monogr. 48: 109-130 (1978). Det er fornyligt blev vist, at FGF eksisterer på to former, sur 15 FGF (aFGF) og basisk FGF (bFGF) , og begge former er blevet identificeret i hjernepræparater, Thomas og Gimenez-Gallego, TIBS 11:81-84 (1986). Adskillige celletyper re sponderer til stimulering med enten renset aFGF eller bFGF ved syntetisering af DNA og delen, herunder primære 20 fibroblaster, vaskulære celler og hornhinde endothelialceller, chondrocyter, osteoblaster, myoblaster, glatmu-skelceller og glialceller, Esch et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 82:6507-6511 (1985), Kuo et al., Fed. Proc.

44:695 (1985).

25

Ren kvæghjerneafledt aFGF virker ikke blot som et kraf-' tigt mitogen for vaskulære endothelialceller i kultur, men inducerer også blodkarvækst in vivo, Thomas et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6409-6413 (1985). Den fi- 30 broblastmitogene aktivitet for aFGF kan også anvendes til at fremme sårheling, Thomas, US patentskrift nr.

4 444 760. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en genetisk konstruktion og midler til ekspression, der muliggør produktion af store mængder ren aFGF, der kan an-35 vendes terapeutisk.

I DK 175786 B1 I

I 2 I

i i

I Det tilsigtes derpå med den foreliggende opfindelse at I

I tilvejebringe en nucleotidbasesekvens for såvel bovin aF- I

I GF som human aFGF ud fra de specifikke proteiners amino- I

syresekvenser. Det tilsigtes også med den foreliggende I

B 5 opfindelse at tilvejebringe gener, der koder for de spe- I

B cifikke aFGFer og inkorporerer generne i passende klo- I

B ningsvektorer. Derudover tilsigtes det med opfindelsen at I

B transformere en passende vært med hver af de rekombinante I

B vektorer og at inducere ekspression af de specifikke aFGF I

B 10 gener. Desuden tilsigtes det med opfindelsen at isolere I

B og rense biologisk aktiv bovin aFGF og human aFGF. Opfin- I

B delsen vil blive beskrevet nærmere i det efterfølgende. I

B I

B Enestående gener kodende for aminosyresekvensen for bovin I

B 15 sur fibroblastvækstfaktor (aFGF) og human aFGF konstrue- I

B res. Det bovine gen er afledt fra omvendt translation af I

aFGF aminosyresekvensen, mens det humane gen er afledt I

ved specifikke punktmutationer af det bovine gen. Hver I

genkonstruktion indsættes i en ekspressionsvektor, som I

20 anvendes til at transformere en passende vært. De trans- I

formerede værtceller producerer rekombinant aFGF I

(r-aFGF), humant eller bovint, som renses og har en akti- I

vitet ækvivalent med nativt protein. I

H i 25 Sure fibroblastvækstfaktorer eksisterer i forskellige mi- I

kroheterogene former, som isoleres fra de forskellige I

H vævskilder og celletyper, der er kendte for at indeholde I

aFGF. Mikroheterogene former som anvendt heri refererer I

til et enkelt genprodukt, der er et peptid produceret ud I

30 fra en enkelt genenhed af DNA, som er strukturelt modif i- I

ceret efter translation. De strukturelle modifikationer I

resulterer imidlertid ikke i nogle væsentlige ændringer i I

biologisk aktivitet af peptidet. Modifikationerne kan I

H finde sted enten in vivo eller under isoleringen og ren s- I

H 35 ningsprocessen. In vivo modifikation resulterer i, men er I

ikke begrænset til, proteolyse, glycolysering, phosphory- I

i 3 DK 175786 B1 lering eller acetylering ved den N-terminale ende. Pro-teolyse kan omfatte exoproteolyse, hvori en eller flere terminale aminosyrer kløves sekventielt, enzymatisk til fremstilling af en mikroheterogen form, som har færre 5 aminosyrer end det oprindelige genprodukt. Endoproteol y-tisk modifikation er et resultat af virkningen af endo-proteaser, som kløver peptidet ved specifikke lokaliseringer inde i aminosyresekvensen. Lignende modifikationer kan forekomme under rensningsprocessen, som også result e-10 rer i produktion af mikroheterogene former. Den mest almindelige modifikation forekommende under rensning er proteolyse, som generelt holdes på et minimum ved anvendelse af proteaseinhibitorer. Under de fleste tilstande . er en blanding af mikroheterogene former til stede efter 15 rensning af nativt aFGF. Nativt aFGF refererer til aFGF isoleret og renset fra væv eller celler, der indeholder aFGF.

Opfindelsen omfatter alle mikroheterogene former for sur 20 fibroblastvækstfaktor fra pattedyr. De foretrukne udfø relsesformer omfatter bovine og humane mikroheterogene former af aFGF. De mest foretrukne mikroheterogene former for bovin aFGF omfatter en form med 154 aminosyrer, en med 14 0 aminosyrer og en med 134 aminosyrer. Formen med 25 14 0 aminosyrer fremgår af tabel III, og det er den mest foretrukne af de ovennævnte bovine arter. Formen med 154 aminosyrer omfatter yderligere følgende aminosyrer: Ala-Glu-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Phe-Thr-Ala-Leu-Thr-Glu-Lys, hvor den cabroxylterminale Lys er knyttet til den aminotermi-30 nåle Phe ved første stilling i formen med 140 aminosyrer.

Formen med de 134 aminosyrer er identisk med formen med de 14 0 aminosyrer med undtagelse af, at de 6 første aminosyrer fra den aminoterminale ende er blevet fjernet.

Efter isolering varierer de relative mængder af disse mi* 35 kroheterogene former afhængigt af den fremgangsmåde, der j

I DK 175786 B1 I

I I

er blevet anvendt, men alle præparater indeholder i det I

mindste en del af hver form. I

Humant aFGF udviser en lignende mikroheterogenicitet som I

5 bovin aFGF. De mest foretrukne mikroheterogene former for I

humant aFGF omfatter en form med 154 aminosyrer, 140 am i- I

nosyrer eller 139 aminosyrer. Den humane form med 140 I

aminosyrer afviger fra den bovine form med 11 aminosyrer,

hvilket fremgår af tabel V. Formen med 154 aminosyrer in- H

H 10 deholder den nøjagtige sekvens for den humane form med H

H 140 aminosyrer plus 14 yderligere aminosyrer associeret H

med den bovine form med 154 aminosyrer på en undtagelse H

nær. Aminosyren i den femste stilling fra den N-terminale H

ende eller stilling -10 som bestemt ud fra den 140 amino- H

15 syre Phe N-terminus i den humane form og erstatter thre o- H

nin i den bovine form. De yderligere 14 aminosyrer i den H

H humane N-terminale sekvens er: Ala-Glu-Gly-Glu-Ile-Thr- I

H Thr-Phe-Thr-Ala-Leu-Thr-Glu-Lys. En tredie form for human H

H aFGF indeholder 139 aminosyrer og er ækvivalent med den H

H 20 humane form med 140 aminosyrer, hvor den aminoterminale I

H phenylalanin er fjernet. Den aminoterminale asparaginrest I

I kan være deamideret til aspartinsyre i den humane form I

I for aFGF med 139 aminosyrer. Formerne med 140 og 139 am i- H

I nosyrer er de mest foretrukne former af de humane mikro- H

I 25 heterogene former. H

I Pattedyrs r-aFGF produceret ved kloning af det naturlige I

I gen fra enten den genome DNA eller cDNA eller ved kon- I

I struktion af gen for en af de mikroheterogene former for I

30 proteinet baseret på den kendte aminosyresekvens for dis- I

se mikroheterogene former for aFGF fra pattedyrarter, I

herunder mennesket. Genomt DNA ekstraheres fra pattedyrs- H

hjerne eller hypofyseceller og forberedes for kloning ved H

I enten tilfældig fragmentering af højmolekylvægt DNA efter I

I 35 teknikken af Maniatis et al., Cell 15: 687-701 (1978) el- I

ler ved kløvning med et restriktionsenzym ved metoden af I

5 DK 175786 B1

Smithies et al., Science 202:1284-1289 (1978). Den genome : DNA inkorporeres derpå i en passende kloningsvektor, al- I mindeligvis E. coli lambda fag, se Maniatis et al., Mole cular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 5 Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) .

For at opnå cDNA for aFGF ekstraheres poly -(A)-holdig RNA fra celler, der udtrykker aFGF ved metoden af Aviv og Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. 69:1408-1412 (1972). cDNA

10 fremstilles under anvendelse af omvendt transskriptase og DNA polymerase under anvendelse af standardteknikker som beskrevet af Maniatis et al.., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) . cDNA tailes og klones ind i en 15 passende vektor, sædvanligvis pBR322, ved en teknik, der ligner den af Wensink, et al.. Cell 3:315 -325 (1974).

De klonale genome DNA eller cDNA biblioteker screenes for at identificere de kloner, der indeholder aFGF-sekvenser, 20 ved hybridisering med en oligonucleotidprobe. Sekvensen for oligonucleotid-hybridiseringsproben er baseret på den bestemte aminosyresekvens for aFGF. Maniatis et al., supra, Anderson og Kingston, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6838-6842 (1983) og Suggs et al., Proc. Natl. Acad.

25 Sci. USA 78:6613-6617 (1981) beskriver forskellige procedurer til screening af genome og cDNA kloner.

Den foretrukne procedure til opnåelse af et gen for pattedyrs aFGF er at syntetisere genet. Genet kan syntetis e-30 res baseret på aminosyresekvensen for en mikroheterogen form for aFGF opnået fra et vilkårligt pattedyr, herunder mennesket. Den foretrukne metode er at anvende den bovine aminosyresekvens for aFGF og kemisk punktmutere basesekvensen til fremstilling af generne for andre arter. Ami-35 nosyresekvenserne for bovint og humant aFGF er omtalt i US patentansøgning nr. 868 473, indleveret den 30. maj

I DK 175786 B1 I

I I

1986, som er en continuation-in-part af US patentansøg- I

I ning nr. 774 359, der blev indleveret den 12. september I

I 1985, som igen er en continuation-in-part af US patent- I

ansøgning nr. 685 923, der blev indleveret den 24. decern- I

5 ber 1984, og som nu er faldet. I

I De syntetiske gener er baseret på den bestemte bovine I

H aminosyresekvens tidligere beskrevet af Gimenez-Gallego I

I et al., Science 230:1385-1388 (1985) og den humane amino- I

H 10 syresekvens som beskrevet af Gimenez-Gallégo et al.. Bio- I

I chem. Biophys. Res. Comm., 138:611-617 (1986). Den unikke I

I nucleotidsekvens af den 14 0 aminosyre store form af bo- I

vint aPGF er afledt fra omvendt translation af aminosyr e- I

I sekvensen ved en teknik lignende den af Itakura et al., I

I 15 Science 198: 1056-1063 (1977). De forskellige hidtil I

I ukendte nucleotidsekvenser svarende til den native amino-

H syresekvens for bovint aFGF fremgår af følgende tabel: H

* 175786 B1 7

TABEL I

5 ,0 15 20

Phe Asn leu Pro Leu GTy Asn Tyr Lys lys Pro Lys Leo Leo Tyr Cys Ser Asn Gly Gly 5 TTO aao C TN CCN CTN GGN AAQ TAQ AAP AAP CCN AAP CTN CTN TAQ TGO TCN AAQ GGN CGn TTP TTP TTP TTP agq 25 30 35 40

Tyr Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Lys Asp Arg Ser Asp Gin lo TA0 TT<^ CTN CGN ATt* CTN CCN GGN ACn gtn ggn acn aap gaq cgn tcn gaq cap

TTP AGP ΑΤΑ TTP AGP AGQ

4S 50 55 60

His Ile Gin Leu Gin Leu Cys Ala Glu Ser ile Gly Glo Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu

CAQ ATO CAP CTN CAP CTN TGQ GCN GAP TCN AT0 GGN GAP GTN TAQ ATQ AAP TCN ACN GAP

15 ATA TTP TTP AGQ ATA ATA AGO

65 70 7S 80

Thr Gly Gin Phe Leo Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leo Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn

ACN GGN CAP TTQ CTN GCN ATG GAQ ACN GAQ GGN CTN CTN TAQ GGN TCN CAP ACN CCN AAO

TTP TTP TTP AGQ

20 β5 90 95 løg

Glu Glo Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys gap gap tgq ctn ttq ctn gap cgn ctn gap gap Aaq caq taq aaq acn taq atq tcn aap

TTP TTP AGP TTP ATA AGQ

^ 105 110 115 120

Lys His Ala Glu Lys His Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Arg Ser Lys Leu Gly

AAP CAQ GCN Gap aap caq tgg TTQ GTN GGN ctn aap aap AAQ GGN cgn TCN AAP CTN GGN

TTP AGP AGQ TTP

125 130 135 140

Pro Arg Thr Hi* phe Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp

CCN CGN ACN CAQ tto GGN CAP AAP GCN ATQ CTN TTQ CTN CCN CTN CCN GTN TCN TCN GAQ

AGP ATA TTP TTP TTP aGQ agq hvor Q = c eller T, 35 p = A eller G, og

N = A. T, c eller G

I DK 175786 B1 I

I I

Nucleotidsekvensen ifølge opfindelsen omfatter følgende I

I egenskaber: codoner foretrukne af Escherichia coli og I

I pattedyrsceller, hvor det muligt, eliminering af sekven- I

I ser med flere komplementariteter, inkorporering af unikke I

5 restriktionssteder genet igennem, terminale restriktions- I

I enzymklæbrige ender for at lette indsætningen af genet i I

plasmider, et centralt lokaliseret unikt restriktionssted I

H for at tillade samling af genet i to halvdele, foretruk- I

I kent en N-terminal methionincodon for et translationalt I

I 10 startsted og tandem translationale stopcodoner.

I Mens den efterfølgende beskrivelse og eksemplerne illu- I

I strerer den foreliggende opfindelse med hensyn til en I

I særlig nucleotidsekvens for bovint aFGF, vil det forstås, I

15 at den omhandlede opfindelse kunne omfatte en vilkårlig I

I af de permutationer, der er oprenset i tabel I. Følgende H

tabel indeholder den foretrukne nucleot idsekvens: H

9 DK 175786 B1

TABEL II

ttcaatctgccactgggtaattacaaaaagccaaagcttctttactgctctaacggtggt 60 5 TACTTTCTCCGCATCCTGCCAGATGGTACCGTGGACGGCACCAAAGATCGTTCTGATCAA 120 10 CATATTCAACTGCAGCTGTGCGCCGAATCTATCGGTGAAGTTTACATCAAATCTACCGAA 180 15 ACTGGTCAATTCCTTGCCATGGACACTGATGGCCTGCTGTACGGATCCCAGACCCCAAAC 240 20 GAGGAGTGCCTTTTCCTGGAGCGCCTGGAGGAAAACCATTACAACACCTACATCTCTAAA 300 25 AAGCATGCTGAGAAACATTGGTTCGrAGGCCTTAAGAAAAATGGCCGCTCTAAACTGGGC 360 30 CCTCGTACTCACTTTGGTCAAAAAGCTATCCTGTTCCTGCCACTGCCAGTGAGCTCTGAC 420 35

I DK 175786 B1 I

10 I

H Genet konstrueres med en iederdel indeholdende et enkelt I

restriktionskløvningssted og en N-terminal methionincodon I

H for et translationalt startsted. Genet indeholder også en I

H hale indeholdende tandem translationale stopcodoner og to I

5 restriktionsenzymkløvningssteder. Den komplementære egen- I

I skab for DNA tillader et valg af basesekvenser, som igen I

tillader inkorporering af unikke restriktionsenzymkløv- I

ningssteder fordelt i genet. Den foretrukne genbasese- I

kvens med lokalisering af restriktionsenzymkløvningsst e- I

10 derne er vist i den følgende tabel: I

H

11 DK 175786 B1

>· < k u O

5 υ O x o o t/> O *— < Η- O 2 μ- P N*is5 c ^ o o ^ " <3 O p- M < 4 (JO O u en

^ H < k O O M

•Λ < K 4« ~Q t3 I

< u u «/> jq < ?

ί ^ >* 3 ίϋ S

^ ^ K r— * > m

T* < ►- O O O

U · kJ O W · O O

£ 91*43- >* *< *- *· < t~“ k- k- <

>* O O 3 0 kJ

r— O O φ #— <

O O kJ _# O O

6 kJ O D O O

* < k- φ kl < < <3 o _j o 3 ^ o o >» o o

fl) O H < pa·» O O LJ

> O O O o /Nf o O

Ok. *- kJ O O CL. (Ni < m -c kJ O »-* r* «λ <k-

►— <£ μ» c < O kJ

>* k- C O. k. μ. < r- O u ^ r u c

O O O V— < H

tx η < α o *Λ < K tSI < < · t3 o -¾ · <3 i_i

O p-» < V— *J OkjM

k Π O. O A »- < o 0.^00 X < t- 3 O kJ *0 o O 2

tt k- < »- O O

-J kJ O < O kJ

A kJ O 3 ►— <

*— k*· < A *— ^ CD

M < k kJ O uJ

O O kJ O p“* a O kJ O

t_ ® O kJ ^ JC O ♦— < < kJ O *—» Ο. fM »— < D kJ O c < »- A ►— < · *— 2 ♦—

-J kJ O O kJ O

A k- «X », μ- <

-C k- < #— p* O kJ

Q- k- < O P·* O kJ

y o o k w K- <

>» * < k— .C · kJ O

_ *— *— <: μ- *r ►*— O >* k- < OD < μ.

CJ *— O kJ \0 /— 2 μ- , o o ο o 3 u j >* H- < k kJ o

i r— O kJ JC O O

i_J O O kJ P- »— ZZ C kJ O k >- <

Η »Λ <i Ql kJ O

tH < O < *— 4Λ ©μ- <

w «OJ=. < ΙΛ 00 < K

A kJ O >* — < *— I— (/> »— < «J 2 ·—

ti] «* kJ O A kJ O

__ ^ O kJ r— K <

Ck kJ >- <tf pp c < w k- O i- kJTCJ" H>* < μ- >> < μ· ♦- Η- < Η» I- < D · h-1—Jtt_ r— · ♦— < A ♦— < <T> I— 2

•J kJ O > O kJ

D μ- « ·-· 3 < ►— A H < ►- r— -tf μ-

-J kJ O ·— o o kJ

«Λ O kJ TD >» "T— <

>> < C r— O kJ

_f « ►» ·· O O kJ

O <L X A kJ O

U O kJ O *— O ►— «<

O. ^kJO *-* «o < K

O V» o kJ o k P μ. < ·“ >> i K ιΛΑ kJ O ·—* —J <j >— W1 k* < k- >» 2 t 3 s i- c -j 2 Η- o δ kJ x k. kJ o «β kJ o

>s pi «i p- »— kJ O

C · O kJ

C ·—< V-· << vi kJ O O

*λ <C v— >* o kJ *—· < «i kJ >—' <r >» μ- < d o u n «— O kJ *—» φρ^μ-<Μ

O OkJCJ —I vO kJ O D

D O kJ ·—* C m O U > A >— < μ- α.

-J kJ O o kJ o pp O O <ί K 3 O O kJ *-* v. CNJkJO Α μ < vi

Q. kJ O -J — kJ <3 CL

3 O kJ C < >— A »- < r- < »-

-J kJ O O kJ O

C μ- < A k- < ^ <C μ r— μ ^

< <! μ» ·— < μ- I

·“ A kJ kD vi μ- < -C · μ· < — ' < μ o. μ- < X kJ o ·* O kj o c < μ- A *— < ^ p- 2 ♦— X ^ μ Ρ» o kJ O m U O p α. μ < P- H- α *λ < *— u μ o < o kj cd -5 ώ

I DK 175786 B1 I

I

^b < >* ^ —I O « ►“ L «O ^ < « n u d

to *— < B

9» O O

i. O O

>\ o O B

o o o C · >- <

v* < *- B

<4 < ►“ H

>*$►·» ^B -j < ^ b

vt O W

Μ >% < μ- B

3 »— b

2 o ^-5- I

-J *7 O — .

^B o >» ro u O o B

«— i— ti o B

<- o ci U

< *-

> O o B

^B o . o O

5 ^B o. · *- « α Ου o

L. O U C

H H- ^ V B

^B *— <! B

^B < i- — ^B x o o ♦- *- ^B in < *- O *-* ^B >. < *- O * ^B o < L- < wo D o o u o d U w

^B r- rsj < ♦— rsi o o B

<o #— < w < ·— os B

u O K < o

< o o «— <►—<·> B

vi ►— <. x o o uj B

^B < *- α. < *— B

χ u O <Λ *— <t ^B ν% *~» o o < ^ B -j — < *- ►- <

oa. o O B

^4 o >* < ►- v λ < ►- ^B +J u »- < i. *- < ^B in q ud φ o o

V *φ <3 5 *C o 5 o I

+ r Η < φ O O Ό

L μ O < ^ ΙΛ O < Η «Λ B

^B Z u o o o *— tv o u

Vj >» ro <t ►— «U ^ ^ C *-«

Q_ »— »— <f >OotO

s_ UOO O < ♦— *“ X O O t-r—OO^

π- «χ η- cl «η O

H c U O 3 ^ O U fl ^B ^ <c 3 *- _joo »—( U · t_J O O · <. *—

>N < I— W <_» O

i- >— < a. u o K- *4 μ- < D O t_) n; — < k- φ *- < ^B η- X : O -J u d r: c j_i c> o o ^B < v> < ►- x *— < ^B - L_ < < *- CL »- < r~i -, < ►- s c u ^ O < *- Φ o ^ <t

ocooo —i o u» o B

^B 0 3 N ϋ U ΟΦ^ΟΟ

9> r— < ►· fh r· H < B

H O L3 U <—

^B 3 o <j - «r, B

Η φ < r- B

H —i o *-· < c u B

^B cn u O ^ w B

H LOOO)>s<^-> B

H < » o O *e —i · <i B

^B d O v-> x c 3 ♦— B

o 3 u o u o I

Η soo >t μ. < B

^B φ »- < i— o B

H o o o ·* o <3 o B

H « o o o φη-< B

^B x — x 3 - B

^B cl h < w Cl ^ < B

^B 3 o L- 3 vi o o o B

^B φ\ο*-< ··- oo < »^ B

Η J (V u u x«noo B

^B «i o o «- ♦— < B

Η >» o o x o o B

^B 9 σ> o o σ> ►- < v B

^B #- w < v- u o o ^ B

^B o o o < o o w* B

^B doo o ♦— < B

^B ·· * < »- l ^ * o o B

^B o o o ο.ηοθΜ B

^B o c o o o >* *— o o *» B

Η CO M < h- tvi ^ O U CL B

^B < 3 i- ^»ooo< B

^B o < ►· s o o B

u o o φ »- < B

^B cl o o .j o o B

B

^B i B

13 DK 175786 B1

Gensekvensen for hver streng af det dobbelstrengede molekyle er tilfældigt delt i 8 nucleotidsekvenser. Oligo-nucleotiderne er konstrueret med overlappende ender for at tillade dannelse af den dobbelstrengede DNA. Følgende 5 tabel indeholder en af de flere mulige oligonucleotidar-rangementer, der anvendes til fremstilling af det bovine aFGF gen.

TABEL IV

10 0LIG0-1 10 20 30 40 50 58 5’ AATTCATGTT CAATCTGCCA CTGGGTAATT ACAAAAAGCC AAAGCTTCTT TACTGCTC 3‘ 15 0LIG0-2 10 20 30 40 45 5' AGAAGCTTTG GCTTTTTGTA ATTACCCAGT GGCAGATTGA ACATG 3' 0LIG0-3 10 20 30 40 50 60 5' TAACGGTGGT TACTTTCTCC GCATCCTGCC AGATGGTACC GTGGACGGCA CCAAAGATCG 3' 20 0LIG0-4 10 20 30 40 50 59 5’ TGCCG1CCAC GGTACCATCT GGCAGGATGC GGAGAAAGTA ACCACCGTTA GAGCAGTAA 3' 0L1G0-5 10 20 30 40 46 5' TTCTGATCAA CATATTCAAC TGCAGCTGTG CGCCGAATCT ATCGGT 3' 25 01IG0-6 10 20 30 40 50 60 65 5' GTAAACTTCA CCGATAGATT CGGCGCACAG CTGCAGTTGA ATATGTTGAT CAGAACGATC TTTGG 3* OLIGO-7 10 20 30 40 50 60 67 5' GAAGTTTACA TCAAATCTAC CGAAACTGGT CAATTCCTTG CCATGGACAC TGATGGCCTG CTGTACG 3’ 35

I DK 175786 B1 I

I 14 I

I TABEL IV (fortsat) I

I 5 01IG0-8 10 20 30 40 50 60 62 I

S' GA1CCGIACA GCAGGCCATC AGTGTCCAIG GCAAGGAATl GACCAGTTTC GGTAGAUTG AT 3* I

I OLIGO-9 10 20 30 40 SO 52 I

I 5' GATCCCAGAC cccaaacgag gagtgccttt tcctggagcg cctggaggaa AA 3' I

10 I

OLIGO-IO 10 20 30 40 SO 58 I

H 5* gttgtaatgg TTTTCCTCCA GGCGCTCCAG GAAAAGGCAC TCCTCGTTTG GGGTCTGG 3· I

I OLI GO—11 10 20 30 40 48 I

5' CCATTACAAC ACCTACATCT CIAAAAAGCA TGCTGAGAAA CATTGGTT 3* I

I 15 I

OLIGO-12 10 20 30 40 46 I

5' ggcctacgaa ccaatgtttc tcagcatgct ttttagagai gtaggt 3* I

OLIGO-13 10 20 30 40 50 53 I

s· cgtaggcctt aagaaaaatg gccgctctaa actgggccct cgtactcact TTG 3’ I

I I

OLIGO-14 10 20 39 40 50 S5 I

5' gcttutgac caaagtgagt acgagggccc agtttagagc GGCCATTTTT cttaa 3' I

OLIGO-15 10 20 30 40 50 56 I

25 5’ GTCAAAAAGC TATCCTGTTC CTGCCACTGC CaGTGAGCTC TGACTAATaG ATATCG 3' I

0L1G0-16 10 20 30 40 50 I

5* TCGACGATAT CTATTAGTCA GAGC1CACTG GCAGTGGCAG GAACAGGATA 3' j I

i l

I 30 I

H De i tabel IV viste oligonucleotider præsenteres blot som I

et eksempel på oligonucleotidunderenheder og skal ikke I

H betragtes som begrænset dertil. Den sammensatte basese- I

kvens, der viser overlapningen og arrangementet af oligo- I

H 35 nucleotiderne, er vist i tabel III. I

15 DK 175786 B1

Det bovine gen samles i to trin: først den halvdel, der svarer til den N-terminale del af proteinet, og dernæst som den anden C-terminale halvdel. Generelt kinaseres oligonucleotiderne med T4 polynucleotidkinase i nærværel-5 se af enten APT eller 32P-mærket ATP. I første reaktion i hvert trin kinaseres de oligonucleotider, som udgør den ene streng af genet, med undtagelse af det meste 5'-oligonucleotid. I den anden reaktion kinaseres oligonucleotiderne, som udgør den anden streng, med undtagelse 10 af det meste 5'-oligonucleotid. Når kinaserede oligonucleotider anvendes, tilsættes ca. 1 pmol af det 32P-mærkede oligonucleotid til senere identificering af produkterne. Spændingsudligning udføres i en passende puffer, såsom en indeholdende, men ikke begrænset til, ca.

15 60 mM Tris, ca. pH 7,6, ca. 5 mM dithiothreitol (DTT) , ca. 10 mM MgClz og ca. 30 μΜ ATP ved ca' 90 "C i ca. 4 minutter efterfulgt af en hurtig overføring til ca. 60 °C og en hurtig afkøling til ca. 30 °C. Ligering udføres i en passende puffer, såsom en indeholdende, men ikke be-20 grænset til, ca. 60 mM Tris, ca. pH 7,6, ca. 10 mM DTT, j ca. 10 mM MgCli, ca. 30 μΜ ATP og ca. 0,03 enheder T4 DNA ligase ved ca. 20 °C i ca. 1,5 time.

De ligerende oligonucleotider renses ved polyacrylamidge-25 lelektrophorese efterfulgt af et ethanoludfældning. Oligonucleotiderne genopløses i en puffer indeholdende ca.

20 μΐ ca. 80%’s formamid, ca. 50 mM Tris-borat, ca. pH

i 8,3, ca. 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), ca.

0,1% efter vægt/vol. xylencyanol og ca. 0,1% efter vægt/-30 vol. bromphenolblåt. Hver prøve opvarmes ved ca. 90 °C i ca. 3 minutter og elektrophoreseres i en ca. 10%'s urinstof-polyacrylamidgel ved ca. 75 Watt i ca. 5 timer. De 231 base N-terminale bånd fjernes, kombineres og elueres ved ca. 4 °C i ca. 0,5 M ammoniumacetat indeholdende ca.

35 1 mM EDTA ved ca. pH 8. De 209 base C-terminale bånd be handles på samme måde.

I DK 175786 B1 I

I 16 I

I De syntetiske gensekvenser kodende for enten ' den N- I

, terminale eller den C-terminale del af aFGF inkoporeres i I

I pBR322 plasmidet. Det er særligt ønsket og tilsigtet, at I

5 der af opfindelsen omfattes anvendelsen af andre plasmi- I

der, i hvilke aFGF genet kan inkorporeres, og som vil I

tillade ekspression af aFGF genet. Genspændingsudiignede I

I oligonucleotider, ca. 300 fmol og ca. 100 fmol af den ud- I

vundne 231 basepar N-terminale ende ligeres hver især til I

10 ca. 100 fmol agarosegel renset ca. 3,9 kilobase (kb) Ec o- I

RI-BamHI pBR322 for den N-terminale ende. Den 209 bp C- I

terminale ende konstrueres på samme måde under anvendelse I

af BamHI-Sall pBR322. Ligering udføres i en puffer inde- I

holdende ca. 20 mM Tris, ca. pH 7,8, ca. 1 mM DTT, ca. 10 I

15 mM MgCls, ca. 0,4 mM ATP, med ca. 1 enhed T4 DNA ligase i I

ca. 1 time ved ca. 20 °C. Hver halvgen ligeret vektor an- I

vendes til at transformere kompetente bakterieceller, så- I

H som E. coli RR1 (Bethesda Research Laboratories, BRL), I

idet man følger leverandørens procedurer. De transforme- I

20 rede celler vælges for vækst i ampicillin og screenes for I

H tilstedeværelsen af enten den 231 basepar (bp) EcoRI- I

BamHI indsat eller den 209 bp BamHI-Sall indsat ved re- I

striktionsanalyse af minilysat plasmidpræparationer. DNA I I

sekvensen for kloner indeholdende indsatse med den pas- . I

25 sende størrelse bestemmes under anvendelse af Maxam og I

Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564 (1977) ke- I

misk DNA sekvensteknik. I

Det endelige fuldlængdede aFGF syntetiske gen blev klonet - · I

H 30 ved kløvning af den N-terminale halvklon med restrikti- ' I

onsenzymer BamHI og Sall, behandling med alkalisk I

H phosphatase og ligering deraf til den gelrensede 209 bp I

H BamHI-Sall indsat af den C-terminale halvklon. Dette li- I

H gerede materiale blev anvendt til at transformere kompe- I

35 tente RR1 celler som før. I

17 DK 175786 B1

Ekspression af det syntetiske aFGF gen følges af en række forskellige promotor-ekspressionssystemer. Det er ønsket og tilsigtet, at der i opfindelsen omfattes anvendelse af ' i andre promotor-ekspressionssystemer til ekspression af 5 . det intakte aFGF gen. Den foretrukne konstruktion gør i brug af E. coli tac promotor, en hybrid mellem områder af j trp promotoren og lac promotoren som beskrevet af deBoer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983).

Plasmid pKK 223-3 (Pharmacia), som indeholder tac promo-10 toren og rrnB rRNA transskriptionsterminatoren, blev modificeret til fjernelse af det pBR322-afledte Sall ré- striktionsenzymsted. rrnB rRNA terminatoren har vist at tillade ekspression ved stærke promotorer, Gentz et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4936-4940 (1981); Brosius, 15 Gene 27: 161-172 (1984).

pKK223-3 plasmid DNA kløves med restriktionsenzymer til fremstilling af et 2,7 kb DNA fragment til dannelse af klon pKK 2,7. Det syntetiske aFGF gen kløves fra dets 20 pBR322 vektor og overføres til pKK 2,7 plasmidet efter restriktion af pKK 2,7 med EcoRI og Sall. Den resulterende rekombinant, der er vist i fig. 1, transformeres over i E. coli JM105 (Pharmacia) eller DH5 (BRL) celler og udtrykkes .

25

Stedsspecifik mutagenese er en effektiv måde til at overføres aminosyresekvensen fra en pattedyrart af aFGF til aFGF aminosyresekvens fra en anden art. Den følgende beskrivelse angår den stedsspecifikke mutagene overføring 30 af bovint aFGF, 140 aminosyreform til humant aFGF, idet det imidlertid forstås, at processen kan anvendes til at overføre en vilkårlig pattedyrart aFGF til aFGF fra en anden art. Den eneste begrænsning på overføringen er, at aminosyresekvenserne for begge aFGFer må være kendt. Den 35' efterfølgende tabel angiver de aminosyrer, som må udskif- Η

I DK 175786 B1 I

I

tes, og lokaliseringen på det bovine aFGF aminosyrekort, I

I tabel III, hvor substitutionerne foretages: I

I TABEL V I

5 I

Aminosyre- Substituerede aminosyrer I

lokalisering Humant aFGF for Bovin aFGF I

I 5 Pro Leu I

i 10 21 His Tyr I

I 35 Arg Lys I

47 Ser Cys I

I 51 Val Ile I

64 Tyr Phe I

I 15 106 Asn His I

I 116 Ser Arg I

I 117 Cys Ser I

119 Arg Leu I

125 Tyr Phe I

I 20 I

Som med den bovine gensekvens konstrueres 8 oligonucleo- I

tider repræsenterende den humane gensekvens ved samme I

procedure som den, der blev anvendt for de bovine oligo- I

nucleotider. Følgende tabel indeholder en af flere oligo- I

25 nucleotidarrangementer, der anvendes til at producere det I

humane aFGF gen. I

19 DK 175786 B1

TABEL VI

OLIGO-1 5’ CTGCCACCGGGTAATTAC 3' 5 OL IGO-2 5' CGGTGGTCACTTTCTCCG 3‘ OLIGO-3 5' CGGCACCAGAGATCGTTC 3* 10 OLIGO-4 5 ' GCAGCTGTCCGCCGAATCTGTCGGTGAAG 3’ ! OLIGO-5 5’ CTGGTCAATACCTTGCCATGG 3' j 15 OL1GO-6 5’ GCTGAGAAAAATTGGTTCG 3' OLIGO-7 5* GGCCGCGTTTACAGCTGCCATTTTTCTTAAGG 3* 20 OLIGO-8 5’ CGTACTCACTATGGCCAAAAAGCTATCC 3'

Det klonede syntetiske bovine gen for aFGF overføres til 25 et humant syntetisk gen for aFGF ved en række dirigerede punktmutationer. Oligonucleotid-dirigeret mutagenese af det klonede gen tilader ændringer af basesekvensen for bovin aFGF, så at den resulterende aminosyresekvens indeholder de substituerede aminosyrer, der er vist i tabel 30 V, og er human aFGF. Den udsletning foretages i det bovine gen for at fjerne den aminoterminale phenylalanin til fremstillingen af den humane 139 aminosyre mikroheteroge-ne form for.aFGF. En punktmutation udføres for at erstatte asparagin i den anden stilling med aspartinsyre. Al-35 ternativt deamideres asparaginen til aspartinsyre. Metoderne til udførelse af disse procedurer er beskrevet i

I DK 175786 B1 I

I I

I det følgende og kendt i teknikken. Den oligonucleotid- I

I dirigerede mutagenese udføres under anvendelse af stan- I

I dardprocedurer kendt i teknikken, Zoller og Smith, Me- I

j thods in Enzymology, 100:468-500 (1983); Norris et al., I

I j 5 Nucleic Acids Research, 11:5103-5112 (1983) og Zoller og I

I Smith, DNA, 3:479-488 (1984). Punktmutationerne udført I

I ved standardiseret oligonucleotid-dirigeret mutagenese er I

vist i den efterfølgende tabel VII. Lokaliseringen af ba- I

semutagenesen kan ses i tabel III. Punktmutationerne er

I 10 kun vist som et eksempel på ændringer, som vil resultere I

I i det humane aFGF gen, og skal ikke betragtes som begræ η- I

sende. I

I TABEL VII I

I 15 I

I Baseloka- Substitueret base Tilsvarende I

I lisering Human aFGF for bovin aFGF humane aminosyrer I

I 22 C T Pro I

I 20 69 C T His I

I . 112 G A Arg I

I 148 C G Ser I

I 159 G A Val I

199 A T Tyr I

I 25 324 A C Asn I

I 354 A C Ser I

358 G C Cys I

I 364 G T Arg I

I 365 C G Arg I

I 30 382 A T Tyr I

Ekspressionsklonerne dyrkes ved ca. 3 7 °C i et passende : I

vækstmedium, som består af ca. 1% trypton, ca. 0,5% gæ- I

rekstrakt, ca. 0,5% NaCl, ca. 0,4% glucose og ca. 50 I

35 Mg/ml ampicillin. Når den optiske densitet ved 550 nm når I

ca. 0,5, kan isopropyl-β-D-thioglactopyranosid (IPTG) I

21 DK 175786 B1 tilsættes til en slutkoncentration på ca. 1 mM, og væksten fortsættes ved ca. 37 °C i ca. 3 timer. Cellerne fra 1 liter dyrkningsmedium høstes ved centrifugering og re-suspenderet i en afbrydelsespuffer indeholdende ca. 10 mM 5 natriumphosphat ved ca. pH 7,2, ca. 5 mM EDTA, ca. 10,6

Mg/ml N-p-toluensulfonyl-L-phenylalanin-chlormethylketon (TPCK), ca. 34,3 μg/mlk pepstatin A, ca. 87 μg/ml phenyl -methylsulfonylfluorid (PMSF), ca. 15 ^g/ml bovin pancrea-tisk trypsininhibitor (BPTI) og ca. 25,2 Mg/ml leupeptin.

10 Celler brydes enten fra eller fryses og opbevares ved -70 °C og brydes straks efter optøning ved ca. tre passager gennem en Fransk trykcelle ved ca. 12.000 psi ved ca. 4 °C. Den overliggende væske samles ved centrifugering.

15 Den rekombinanten aFGF renses til homogenisitet ved en unik totrinskromatografisk procedure, der gør brug af kombination af heparin/Sepharose-affinitetskromatografi efterfulgt af omvendtfaset HPLC. Den rå r-aFGF anbringes på en heparin/Sepharose-søjle i en fortyndet puffer, så-20 som ca. 10 mM phosphat eller Tris, ca. pH 6-8, som derefter vaskes med en opløsning med lav saltkoncentration, såsom ca. 0,8 M NaCl, indtil absorbansen ved 280 nm falder til ca. baggrundsabsorbansen. r-aFGF fortyndes derpå med en pufret opløsning med høj saltkoncentration, såsom 2 5 ca. 10 mM natriumphosphat eller Tris, ca. pH 6-8, inde holdende ca. 1,5 M NaCl. Eluatet renses derpå ved omvendtfaset HPLC på en harpiks bestående af kovalent bundne alkylsilankæder med alkylgrupper med 3-18 carbonato-mer, foretrukkent 4 carbonatomer. r-aFGF påføres direkte 30 HPLC-søjlen bragt i ligevægt i en fortyndet syre, såsom ca. 10 mM trifluoreddikesyre, eddikesyre eller phosphor-syre og elueret med en lineær gradient organisk opløsningsmiddel, såsom acetonitril eller ethanol. Bovint hjerne-afledt aFGF blev tidligere beskrevet som bindende 35 til såvel heparin/Sepharose-søjler som til omvendtfasede HPLC-søjler, jævnfør Maciag et al., Science 225:932-935

I DK 175786 B1 I

I 22 I

I (1984) og Thomas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA I

I 81:357-361 (1984) som del af flertrinsrensninger. Til I

I dels baseret på den relative høje mængde r-aFGF i bakte- I

rielysater vises disse to trin alene at være tilstrække- I

5 lige til at opnåe homogent rent r-aFGF med ca. 16.000 I

daltons som bestemt ved elektrophorese i polyacrylamidge- I

I ler. Disse to trin alene giver ikke rent aFGF fra hjer- I

nen. I

10 Mitogenaktivitet af den rensede aFGF bestemmes ved inkor- I

H porering af 3H-thymidin i DNA med celleliniefibroblaster, I

foretrukkent BALB/c 3T3 A31 (American Type Culture Col- I

lection). Den rekombinante aFGF viser et spidsrespons ved I

ca. 1 ng protein eller mindre pr. ml i den fibroblastst i- I

I 15 mulerende prøve. I

En anden udførelsesform for opfindelsen er en metode til I

at fremme helingen af sår ved påføring af det hidtil I

ukendte peptid, enten med eller uden heparin, foretruk- I

20 kent med heparin, ca. 1 til ca. 500 μg/cm2 til sårområdet I

enten topisk eller subkutant i såret i en mængde på ca. I

0,1 til 100 μg/cm2 af overflade til topisk anvendelse. I

H 1 Til påføring er forskellige farmaceutiske formuleringer I

25 nyttige, såsom salver, pastaer, opløsninger, geler, faste I

H vandopløselige polymere, såsom albuminer, gelatiner, hy- I

H droxypropylcellulose, pluronics, tetronics eller algina- I

ter, hvori den aktive bestanddel inkorporeres i mængder I

på ca. 1 til ca. 100 μς/ιηΐ. I

I 30 I

H aFGF's evne til at stimulere heling i forskellige celle- I

typer, herunder fibroblaster, vaskulære og corneale en- I

dotheliale celler og lignende gør disse peptider nyttige I

H som farmaceutiske midler. Disse forbindelser kan anvendes I

H 35 til at behandle sår hos pattedyr, herunder mennesker, ved I

23 DK 175786 B1 ' administerering af hidtil ukendt r-aFGF til patienter med behov for sådan behandling.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterføl-5 gende eksempler.

EKSEMPEL 1 01 igonucleotidsyntese 10

Oligonucleotider blev syntetiseret efter den teknik, der er beskrevet af Matteucci og Cauthers i J.A. Chem. Soc. 103:3185-3191 (1981) og af Beaucage og Caruthers i Tetrahedron Letters 22:1859-1862 (1981). Basesekvenserne for 15 de syntetiserede oligonucleotider er vist i tabel IV.

EKSEMPEL 2

Samling af aFGF genet 20

Oligonucleotiderne fra eksempel 1 blev samlet som to separate enheder, den N-terminale halvdel (231 bp) og den C-terminale halvdel (209 bp). De halvdele blev derpå kombineret for at gøre det syntetiske gen intakt, se tabel 25 III. Til at begynde med blev oligonucleotiderne kinaseret i følgende reaktionsblanding: 70 mM Tris pH 7,6, 5 mM

DTT, 10 mM MgCl2, 33 μΜ ATP, 0,3 enheder T4 polynucleotid pr. μ1ϊί&τ. Blandingen blev inkuberet i 1,5 timer ved 37 OC og derpå endnu 1 time efter supplering af blandingen 30 med 0,2 enheder/^liter kinase og ATP til opnåelse af en koncentration på 100 mM. Til radioaktiv mærkning indeholdt den oprindelige blanding 37 nCi/^liter [ γ-32Ρ] -ATP.

Spændingsudligningen og ligeringeme blev foretaget i to 35 separate reaktioner. I hver reaktion blev 100 pmol af hver af de 8 oligonucleotider tilsat. I en reaktion blev

I DK 175786 B1 I

I 24 I

I de oligonucleotider, som udgør en streng af den C- I

I terminale eller N-terminale halvdel af genet, kinaseret I

I med undtagelse af 51-oligonucleotidet. I den anden reak- I

I tion blev de oligonucleotider, som udgør den modsatte I

I 5 streng, kinaseret, igen med undtagelse af 51-oligonucleo- I

tidet. I hver reaktion blev der således kinaseret 3 oli- I

gonucleotider, og 5 oligonucleotid blev ikke kinaseret. I

Når kinaserede oligonucleotider blev anvendt, blev l pmol I

af det 32P-mærkede oligonucleotid også tilsat til senere I

10 identificering af produkterne. Hver reaktion indeholdt I

I 200 Mliter 70 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 10 mM MgClz og 30 I

μΜ ATP. Oligonucleotiderne blev udlignet ved opvarmning I

I til 90 °C i 4 minutter, hvorpå reaktionen straks blev I

I overført til 60 °C og fik lov at afkøle langsomt til 30 I

I 15 °C. Ligering blev foretaget i 400 μϋίθΓ indeholdende 60 I

I mM Tris pH 7,6, 10 mM DTT, 10 mM MgCL·, 1 mM ATP og 0,03 I

enheder T4 DNA ligase pr. μϋίβΓ ved inkubering ved 20 °C I

i 1,5 timer. I

20 Polyacrylamidgelelektrophorese blev anvendt til at rense I

de ligerede oligonucleotider. De ligerede oligonucleoti- I

der blev udfældet med ethanol, genopløst i 20 μϋίΒΤ 80% I

formamid, 50 mM Tris-borat pH 8,3, 1 mM EDTA, 0,1% efter I

vægt/vol. xylencyanol og 0,1% efter vægt/vol. bromphe- I

25 nolblåt. Hver prøve blev opvarmet ved 90 °C i 3 minutter I

og elektrophoreseret i 10%'s urinstof-polyacrylamidgel I

ved 75 W i 5 timer. Oligonucleotidbåndene blev gjort syn- I

lige ved at udsætte gelen for røntgenfilm. I

30 231 basebåndene for hver reaktion for den N-terminale en- I

de blev skåret ud af gelen, kombineret og elueret ved 4 I

°C i 1 ml 0,5 M ammoniumacetat, 1 mM EDTA pH 8. Den elue- I

rede DNA blev udfældet med ethanol og genopløst i 30 I

μΐiter 70 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT og 10 mM MgCL·. De 209 I

H 35 basebånd for den C-terminale ende blev elueret på samme , I

I måde. I

- ----- —1 DK 175786 B1 25

De gelrensede oligonucleotider blev spændingsudlignet før transformation ved opvarmning til 90 °C i 4 minutter og langsomt afkølet til 20 °C. Under antagelse af et udbytte 5 på 5% fra de oprindelige oligonucleotider blev 300 fmol og 100 fmol udvundne, spændingsudlignede 231 bp oligonucleotider hver ligeret til 100 fmol agarosegelrenset 3,9 kb EcoRI-BamHI pBR322 fragment DNA i 20 eliter 25 mM Tris pH 7,8, 1 mM DTT, 10 mM MgCl2, 0,4 mM ATP med 1 en- 10 hed T4 DNA ligase i 1 time ved 20 °C. De udlignede 209 bp oligonucleotider blev ligeret til agaroserenset 3,9 kb BamHI-Sall pBR322 fragment DNA under samme betingelser som 231 baseparfragmenterne. Ligeringsreaktionerne blev fortyndet 1:5 i H2O, og 1 pliter fortynding blev anvendt 15 til at transformere 20 μΙ^βΓ kompetente E. coli RR1 celler (BRL) som beskrevet af leverandøren. Transformanterne j blev udvalgt for vækst i ampicillin og screenet for til- i stedeværelsen af den 231 bp EcoRI-BamHI eller den 209 BamHI-Sall indsat ved restriktionsanalyse af minilysat-20 plasmidpræparater.

DNA-sekvensen af kloner indeholdende indsatse med passende størrelse blev bestemt under anvendelse af den kemiske DNA sekvensteknik af Maxam og Gilbert, Proc. Natl. Acad.

25 Sci. USA 74:560-564 (1977). Da ingen af de 231 bp kloner havde den korrekte sekvens, blev der fremstillet en klon indeholdende den korrekte sekvens som følger. En klon med den korrekte sekvens mellem Kpnl og med BamHI stederne blev kløvet med Kpnl og med Sall, som kløver i pBR322 ! i 30 vektoren. 400 bp båndet blev gelrenset og ligeret til 3,8 kb KpnI-Sall båndet fra en anden klon indeholdende den korrekte sekvens fra EcoRI stedet til Kpnl stedet af aFGF genindsatsen. Efter transformation blev en resulterende klon sekvenseret for at sikre, at den ønskede sekvens var 35 blevet opnået.

I DK 175786 B1 I

26 I

Da en klon indeholdende den korrekte 209 bp sekvens var I

opnået, var ingen yderligere manipulation af disse kloner I

I påkrævet. Det endelige fuldlængdede aFGF syntetiske gen I

5 blev klonet ved kløvning af den N-terminale halvklon med

H BamHI og Sall, behandling med alkalisk phosphatase og 1 i- I

I gering til den gelrensede 209 bp BamHI-Sall indsats af I

I den C-terminale halvklon. Dette ligerede materiale blev I

I j anvendt til at transformere kompetente RR1 celler som I

I 10 før. I

EKSEMPEL 3 I

I I

I i Ekspression af det syntetiske bovine aFGF gen I

I I

Η I

! Det intakte aFGF gen fra eksempel 2 blev inkorporeret i

I et modificeret pKK223-3 plasmid. pKK223-3 plasmidet I

(Pharmacia) indeholder tac-promotoren, som er en hybrid I

mellem regioner i trp-promotoren og lac-promotoren, de- I

I 20 Boer et al., proc. Natl. Acad. Sci. OSA 80:21-25 (1983). I

Dette plasmid indeholder også rrnB rRNA transskrip- I

tionsterminatoren, en stærk terminatorsekvens, der har I

I vist sig at tillade ekspression fra stærke promotorer, I

I Gentz et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4936-4940 : I

25 (1981), Brosius, Gene 27:161-172 (1984). pKK223-3 plasmi- ! I

det blev modificeret til fjernelse af det pBR322-afledte : I

Sall restriktioonsenzymsted. Dette skete ved kløvning af I

pKK223-3 plasmid DNA med Ndel og Narl og recirkulering af I

det 2,7 kb DNA. fragment til dannelse af klon pKK2,7. Det I

30 syntetiske aFGF gen blev derpå kløvet fra sin pBR322 vek- I

tor og overført til pKK2,7 efter restriktion af denne I

ekspressionsvektor med EcoRI og Sall. Denne konstruktion . I

anbringer det initierende methionin for det syntetiske I

gen 11 baser efter Shine-Dalgarno ribosombidningsstedet. I

35 Den resulterende rekombinant, der er vi st på fig. 1, I

27 DK 175786 B1 blev transformeret i E. coli JM105 celler og også i E. coli DH5 celler.

Ekspressionsklonerne blev dyrket ved 37 OC i LB boilion 5 (1% trypton, 0,5% gærekstrakt, 0,5% NaCl) indholdende 0,4% glucose og 10 Mg/ml ampicillin. Når den optiske de n-sitet ved 550 nm nåede 0,5, blev der tilsat IPTG for at give 1 mM, og dyrkningen blev fortsat ved 37 °C i 3 timer. Cellerne blev høstet ved centrifugering ved 10.000 x 10 g i 20 minutter, og cellerne fra 1 liter kultur blev re-suspenderet i 20 ml 10 mM natriumphosphat pH 7,2 (hepa-rin/saccharose-puffer) 5 mM EDTA, 10 N 6 μg/ml TPCK, 34,3 pg/ml pepstatin A, 87 μg/ml PMSF, 15 μg/ml BPTI og 34,3 ! μg/ml leupeptin. De resuspenderede celler blev hurtigt 15 frosset i et tøris/ethanol-bad og opbevaret natten over ved -70 °C.

EKSEMPEL 4

20 Ekstraktion og rensning af rekombinant aFGF

De frosne celler fra eksempel 3 blev optøet, yderligere 87 μg/ml PMSF blev tilsat, og præparatet blev passeret gennem en Fransk trykcelle ved 12.000 psi tre gange ved 4 25 °C. Det resulterende lysat blev centrifugeret ved 93.000 x g i 30 minutter til fjernelse af celledebris. Den ove r-liggende væske blev fjernet., indstillet til pH 7,2 med l M NaOH og anbragt på en 1,6 x 10 cm heparin/Sepharose -søjle (Pharmacia) drevet ved 4 °C med en strømningsha-30 stighed på 20 ml pr. time under opsamling af 2 ml fraktioner. Pellet blev resuspenderet i 5 ml 10 mM natriumphosphat, 2 M NaCl, pH 7,2, gencentrifugeret ved 93.000 x g i 30 minutter, og den overliggende væske blev fortyndet med 3 volumen 10 mM natriumphosphat, pH 7,2, 35 genindstillet til pH 7,2 med 1 M NaOH, om nødvendig, og anbragt på samme heparin/sepharose-søj le. Efter påføring Μ Η

I DK 175786 B1 I

I 28 I

I blev søjlen vasket méd 10 mM natriumphosphat, 0,8 M NaCl, I

I pH 7,2, indtil absorbansen ved 280 nra faldt til baggrund- I

I sabsorbansen. Bundet r-aFGF blev elueret som en enkelt I

spids med 10 mM natriumphosphat, 1,5 M NaCl, pH 7,2. De I

5 samlede fraktioner fra heparin/sepharose-søjlen blev ren- I

set ved omvendtfaset HPLC under anvendelse af en 4,6 mm x I

25 cm C«-søjle (Separations Group) som beskrevet af Tho- I

I mas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:357-361 (1984). I

r-aFGF elueredes som en enkelt hovedspids, der blev op- I

I 10 løst fra flere mindre forurenende spidser, hvilket anty- I

dede, at proteinet var homogent rent. Polyacrylamidgele- I

H lektrophorese blev anvendt til at bekræfte renhed. Den I

<- rensede r-aFGF blev elektrophoreseret ved at følge tek- I

I nikken af O'Farrell, J. Biol. Chem. 250:4007-4021 (1975). I

15 Sølvfarvning afslørede et enkelt bånd med en molekylmasse I

på 16.000 daltons. Identitet af proteinet som aFGF blev I

bekræftet ved såvel aminosyreanalyse som aminoterminal I

sekvensbestemmelse. I

20 EKSEMPEL 5 I

I Biologisk aktivitet af bovin rekombinant aFGF ,· I

Biologiske aktivitet af den rensede r-aFGF fra eksempel 4 I

25 blev bedømt under anvendelse af en fibroblastmitogen pr ø- I

ve som beskrevet af Thomas et al., J. Biol. Chem. I

225:5517-5520 (1980). BALB/c 3T3 A31 fibroblaster (Ameri- . ; I

can Type Culture Collection) blev udstrøget med 2 x ΙΟ4 | I

celler pr. brønd med 35 mm i diameter i et dyrkningsmed i- I

H 30 um indeholdende 10% varmeinaktiviteret kalveserum og in- I

kuberet i 7% CO2 (pH 7,35 ± 0,05). Cellerne blev fuldt I

lantente ved at erstatte mediet med 0,5% varmeinaktiveret I

kalveserum 6 og igen 24 timer senere. 55 timer efter ud- I

strygning blev der tilsat 50 μg heparin, testprøver og I

35 1,1 μg dexamethason, ved 70 timer blev hver brønd supple- I

H ret med 2 μΟί [methyl-3-H]-thymidin (20 Ci/mmol, New Eng- I

w DK 175786 B1 29 land Nuclear) og 3 ptg umærket thymidln (Sigma) , og ved 95 timer blev cellerne behandlet til bestemmelse af radiomærke inkorporeret i DNA. Hver dosisresponspunkt var gennemsnittet af tre bestemmelser. Resultaterne fremgår af 5 den efterfølgende tabel:

TABEL VIII

Mitogene respons af BALB/c 3T3 10 Fibroblaster mod bovin r -aFGF

Koncentration CPM

r-aFGF (ng/ml) r-aFGF Hjerne-aFGF

15 0,003 268 231 0,010 498 329 0,031 1550 1017 0,100 7031 3684 0,316 9319 11353 20 1.000 4718 9050

Aktiviteten af den rekombinante aFGF var lig med eller lidt større end aktiviteten af hjerneafledt aFGF. Den rensede r-aFGF havde en halv-maksimal stimulering af DNA 25 syntese ved ca. 71 pg/ml, mens renset hjerneafledt aFGF havde en halvmaksimal værdi ved 126 pg/ml.

EKSEMPEL 6 30 Mutagenese af bovint aFGF gen til det humane aFGF gen

For at lette mutagenesen af det bovine aFGF gen blev det syntetiske gen fra eksempel 2 overført til Ml3mpl9, en enkeltstrenget DNA bakteriofag vektor. Standardmutagen e-35 seprocedurer blev anvendt som rapporteret af Zoller og Smith, Methods in Enzymology, 100:468-500 (1983); Norris

I DK 175786 B1 I

I 30 I

I et al., Nucleic AcidsResearch, 11:5103-5112 og Zoller og I

I Smith, DNA, 3:479-488. Det bovine pKK-aFGF plasmid blev I

kløvet med EcoRI og Sall, se tabel III, og det resulte- I

I i rende 440 bp fragment blev agarosegelrenset som i eksem- I

5 pel 2. Vektor M13mpl9 RF DNA (BRL) blev kløvet med de I

samme to endonucleaser, og enderne blev derefter I

I dephosphoryleret i 100 //liter 10 mM Tris pH 8,0 puffer I

I med 100 enheder bakteriel alkalisk phosphatase. En lige- I

I ring blev foretaget under anvendelse af 50 ng af den be- I

10 handlede vektor DNA og 12 ng af aFGF genfragment DNA i 10 I

I μliter 25 mM Tris pH 7,8, 10 mM MgClz, 1 mM DTT, 0,4 mM I

ATP, med 2 enheder T4 DNA ligase i 16 timer ved 4 °C. Re- I

aktionsblandingen blev fortyndet 1:5 i H2O, og 1 ^liter I

I opløsning blev anvendt til at transformere 20 ^liter kom- I

15 petente E. coli DH5 celler (BRL) som beksrevet af leve- I

I randøren. Cellerne blev udstøjet med E. coli JM105 (Phar- I

I macia) værtsceller i 0,03% X-gal og 0,3 mM IPTG; efter I

I inkubering ved 37 °C blev der opnået farveløst plaques. I

En fagklon indeholdende det bovine aFGF blev udvalgt, I

I 20 M13mpl9-aFGF. I

8 oligonucleotider blev designet for at specificere den I

humane sekvens og syntetiseret, se tabel VI. I

25 Oligomer 8 indeholder en yderligere mutation, i hvilken I

thymin ved sted 386 i det bovine gen er erstattet med c y- I

tosin i det humane gen. Denne mutation tillader inkorpo- .il

rering af et restriktionssted uden ændring af den humane I

aFGF aminosyresekvens. , I

I 30 I

De humane oligomere 1, 2, 3, 4, 6 og 8 blev phosphoryle- I

ret, 15 pmol af hver blev sammensmeltet individuelt med I

0,5 pmol M13mpl9-aFGF enkeltstrenget fag DNA i 10 μΙ^βΓ I

20 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT i 10 I

H 35 minutter ved 65 °C efterfulgt af 10 minutter ved 23 °C. I

Lukketcirklerede dobbeltstrengede molekyler blev derpå . I

31 DK 175786 B1 fremstillet i 20 Mliter 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgClz, 25 mM NaCl. 5,5 mM DTT, 0,5 mM ATP, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dGTP, 0,25 mM dTTP under anvendelse af 1 enhede T4 DNA ligase og 2 enheder DNA pol y-5 merase I Klenow fragment ved inkubering ved 15 °C i 17 timer. Præparaterne blev hver især anvendt til at transformer kompetente JM105 celler, og de resulterende transformante plaques blev udvalgt ved hybridisering med den passende oligomere, som var blevet radiomærket under an-10 vendelse 32P-ATP og polynucleotidkinase. Betingelserne for hybridisering blev optimeret for hver probe for at forhindre dannelse af hybrider indeholdende enkeltbaseæn-dringer. Enkeltstrenget DNA blev isoleret fra fagklonen indeholdende human oligomer 4 mutationer, og ovennævnte 15 procedure blev gentaget under anvendelse af human oligomer 5 for at danne en klon indeholdende såvel oligomer 4 som 5 mutationer.

I de følgende procedurer blev de bovine-til-humane se-20 kvensmutationer i M13-baserede kloner kombineret i en pBR322-baseret klon. RF DNAer blev fremstillet ud fra kloner indeholdende baseændringer specificeret af humane oligomere 1, 2, 6 og 8. DNA fra den humane 1 mutantklon blev kløvet med EcoRI, enderne blev dephosphoryleret med 25 bakteriel alkalisk phosphatse, og DNA blev kløvet med Hindlll. Den humane 2 mutant DNA blev kløvet med Hindlll, behandlet med phosphatase og derpå kløvet med BamHI. Den humane 6 mutant DNA blev kløvet med BamHI, phosphataseb e-handlet og derefter kløvet med Apal. Ligeledes blev den 30 humane 8 mutant DNA kløvet med Apal, enderne blev phosphoryleret, og DNA blev kløvet med Sall. Disse fire DNA præparater blev elektrophoreseret gennem 2% agarose, og fragmenterne af 45bp, 190 bp, 135 bp og 70 bp fra de mutante DNAer indeholdende humane 1, 2, 6 og 8 mutationer 35 blev elueret fra gelen. Ca. 60 fmol af hver fragment blev kollektivt ligeret til ca- 60 fmol af et gelrenset 3,7 kb

32 I

DK 175786 B1 I

EcoRI -Sall fragment fra pBR322 i 5 μliter 25 mM Tris pH I

7,8, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,4 mM ATP med 1,5 enheder I

T4 DNA ligase i 16 timer ved 12 0C. Reaktionsblandingen H

blev fortyndet 1:5 i H2O, og 1 μliter fortynding blev an- H

5 vendt til at transformere 20 /eliter kompetente E. coli I

DH5 celler (BRL) som beskrevet af leverandøren. En klon H

indeholdende mutationerne specificeret af alle fire mu- I

tantoligomere blev valgt ved hybridisering med radiomær- H

kede prober fremstillet ud fra hver af de oligomere. Det H

10 140 bp KpnI-BamHI DNA fragment isoleret fra kløvet RF DNA I

af de humane 3 mutant M13 klon blev ligeret til endo- I

nucleasekløvningsprodukter fra den humane 1-2-6-8 mutant H

DNA og transformeret i DH5 kompetente celler for at danne H

en klon med de humane 1-2-3-6-8 mutationer. BamHI-PstI I

15 nedbrydningsfragmenter af sidstnævnte klon blev ligeret H

til BamHI-PstI nedbrydningsfragmenter af RF DNA fra den H

humane 4-5 M13-baserede klon, og ligeringsblandingen blev H

anvendt til at transformere DH5 kompetente celler. En I

klon indeholdende de humane 1-2-3-4-5-6-8 mutationer blev I

20 udvalgt ved oligomer hybridisering, og aFGF gen EcoRI- I

Sall DNA fragmentet af dette rekombinante plasmid blev I

ligeret til phosphatase-behandlet EcoRI-Sall-kløvet RF I

DNA af M13mpl8 (BRL). Kompetente DH5 celler blev trans- I

formeret med ligeret DNA, og de transformerede celler H

25 blev udbredt på JM105 værtsceller for at danne en M13 I

klon. Den enkeltstrengede fag DNA af denne klon blev sam- H

mensmeltet med den humane 7 oligomere, og en M13 klon in- H

deholdende alle de ønskede mutationer blev opnået ved at H

gå frem efter proceduren som beskrevet i det foregående. H

30 RF DNA blev fremstillet ud fra denne klon og kløvet med H

EcoRI og Sall. Det resulterende 440 bp bånd blev gelren- H

set og ligeret til det 2,7 kb EcoRI-Sall DNA fragment af I

pKK2,7 tac-promotor-ekspressionsvektor. Denne DNA blev

anvendt til at transformere kompetente DH5 celler, hvor- H

35 ved man dannede den humane pKK-aFGF ekspressionsklon an- H

vendt til produktion af den humane form for aFGF. H

33 DK 175786 B1 •

Den humane r-aFGF blev renset ved samme procedure som anvendt for den bovine r-aFGF, se eksempel 4. Den humane r-aFGF blev bedømt som værende mindst 99,75% ren baseret på tilstedeværelsen, af et intenst bånd på en sølvfarvet 5 SDS elektrophoretisk gel påført 400 ng renset human r-aFGF og med en intensitet på ca. 1 ng/bånd. Protokollen er beskrevet i eksempel 4.

Den rene rekombinante humane aFGF blev prøvet for mitogen 10 aktivitet urider anvendelse af 3H-thymidin inkorporering i sammenflydende BALB/c 3T3 celler som beskrevet for det bovine rekombinante protein i eksempel 5. Som tidligere observeret med human hjerne-afledt aFGF afprøvet på vaskulære endothelialceller udviser det rekombinante hu- i 15 mane protein en større forskel i heparin (50 /ig/ml) akti- | vering end tilfældet er for såvel hjerne-afledt som re- i kombinant bovint aFGF, Gimenez-Gallego et al., Biochem. i

Biophys. Res. Comm. 135:541-548 (1986); Resultaterne er rekombinant human aFGF på BALB/c 3T3 celler fremgår føl- ' 20 gende tabel: .

i j

I DK 175786 B1 I

I I

H

I TABEL IX I

I Mitogen respons for BALB/c 3T3 fibroblaster mod human I

I r-aFGF I

I 5 I

Koncentration I

r-aFGF c PM I

(picogram/ml)’ - heparin + heparin I

I o 3574 991 I

I 1 4156 1336 I

I ' 3,16 4216 1802 I

I 10,0 4092 2617 I

I 31,6 4155 4824 I

I 100 4274 10489 I

I 316 6060 14584 I

1000 (1 ng) 6811 10547 I

I 3160 7910 12357 I

I 10000 8597 9143 I

31600 9700 9057 I

I 100000 11166 9277 I

I 1000000 15864 12425 I

* picogram = 10'12 gram I

I nærværelse af heparin forekommer den halv-maksimale H

I 10 stimulering ved ca. 42 pg/ml. I fravær af heparin var I

I spidsen ikke klart nået selv ved den højeste koncentra- I

tion men må være større end ca. 50 ng/ml. I

Claims (5)

35 DK 175786 B1 Patentkrav :

1. En nukletoidsekvens, der koder for rekombinant humant 5 sur fibroblastvækstfaktor, med følgende aminosyresekvens: 1 10 20 PheAsnleuProleuGlyAsnTyrlyslysProlysLeuLeuTyrCysSerAsnGlyGlyTyrPheleuArglleLeu 10 30 40 50 ProAspGIyThrValAspGIyThrlysAspArgSerAspGlnHi si1eGlnleuGlnleuCysAl aGIuSerl1eGlyGIu 60 70 80 15 Val Tyr11elysSerThrGluThrG!yGInPheleuAlaHetAspThrAspGlyleuleuTyrGI ySerGl nTbrProAsn 90 100 GIuGIuCysLeuPheLeuGluArgleuGl uGIuAsnHi sTyrAsnThrTyrlleSerlysLysHi sAlaGI uLysHi sT rp 20 110 120 130 PheValGl yLeuLysLysAsnGlyArgSerlysLeuGlyProArgThrHIsPKeGlyGInLysAlalleleuPheLeuPro 140 25 LeuProValSerSerAsp . i hvilken koden for phenylalanin kommer efter en kode for methionin, specielt en sådan nucleotidsekvens, som har 30 basesekvensen: 35 I DK 175786 B1 I I 36 I I 1 20 40 60 80 I AATTCATGnCAATCrGCCACCGGGTAATTACAAAAAGCCAAAGCTTCrTTACTGCTCTAACGGTGGTUCTnCTCCGC I I GTACAAGTTAGACGGTGGCCCAnAATGTTmCGGTTTCGAAGAAATGACGAGATTGCCACCAGTGAAAGAGGCG I I 5 100 120 140 . 160 I I atcctgccautggtaccgtggacggcaccagagatcgttctgatcaacatattcaactgcagctgtccgccgaatctgt* I TAGGACGGTCTACCATGGCACCTGCCGTGGTCTCTAGCAAGACTAGTTGTATAAGTTGACGTCGACAGGCGGCTTAGACA I I 180 200 220 240 I I 10 CGGTGAAGTTTACATCAAATCTACCGAAACTGGTCAATACCTTGCCATGGACACTGATGGCCTGCTGTACGGATCCCAGA I I GCCACnCAAATGTAGTTTAGATGGCTTTGACCAGTTATGGAAC6GTACCT6T6ACTACCGGACGACATGCCtAGG6TCT I I 260 280 300 320 I CCCCAAAC6AGGAGTGCCTmCCTGGAGCGCCTG&AGGAAAACCATTACAA0vCCTACATCTC7AMAAGCttGCTGAG I . _ ggggtttgctcctcacggaaaaggacctcgcggacctccttttggtaatgttgtggatgtagagatttticgtacgactc I lb 3A0 360 380 «00 I AAAAATTGGTTCGTAGGCCTTAAGAAAAATGGCAGCTGTAAACGCGGCCCTCGTaCTCaCUTGGCCAAAAAGCTATCCT I TmTAACCAAGCATCCGGAATTCTTTTlACCGTCGACATTTGCGCCGGGAGCATGAGTGATACCGGTnTTCGATAGGA I I 20 I 420 400 H GIICCTGCCACTGCCAGTGAGCTCTGACTAATAGATATCG I H : caaggacggtgacggtcactcgagactgattatctatagcagct. I

2. Ekspressionsplasmid, kendetegnet ved, at I H 25 det omfatter nucleotidsekvensen ifølge krav i indsat I deri. . I i1 I

3. Vært, kendetegnet ved, at den er kompatibel I H med og indeholder plasmidet ifølge krav 2. I H 30 I

4. Plasmid ifølge krav 2, kendetegnet ved, at I det er i stand til at udtrykke aminosyresekvensen for hu- I H man sur fibroblastvækstfaktor. I ! I 37 DK 175786 B1

5. Fremgangsmåde til rensning af rekombinant sur fibroblast vækstfaktor i ren form, kendetegnet ved, at den omfatter følgende trin: 5 a. delvis rensning af rekombinant aFGF med heparin -, Sepharose-matrix affinitets-kromatografi og et accepter bart elueringsmiddel; efterfulgt af b. endelig rensning af delvist renset rekombinant aFGF 10 ved omvendtfaset HPLC under anvendelse af et alkylsilan- substrat og et .accepterbart elueringsmiddel. j