JPH07224096A - ヒト酸性繊維芽細胞成長因子をコードする人工ｄｎａそれを含むプラスミド及び宿主を用いて生産される組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子 - Google Patents
ヒト酸性繊維芽細胞成長因子をコードする人工ｄｎａそれを含むプラスミド及び宿主を用いて生産される組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】ヒト酸性繊維芽細胞成長因子の生産。
【構成】組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子を生産する
ために、ウシ酸性繊維芽細胞成長因子をコードするＤＮ
Ａをヒト酸性繊維芽細胞成長因子をコードするように人
工的に変異させたＤＮＡを用いて生産された組換えヒト
酸性繊維芽細胞成長因子。 【効果】形質転換大腸菌において組換えヒト酸性繊維芽
細胞成長因子を生産できる。
ために、ウシ酸性繊維芽細胞成長因子をコードするＤＮ
Ａをヒト酸性繊維芽細胞成長因子をコードするように人
工的に変異させたＤＮＡを用いて生産された組換えヒト
酸性繊維芽細胞成長因子。 【効果】形質転換大腸菌において組換えヒト酸性繊維芽
細胞成長因子を生産できる。
Description
【０００１】脳由来繊維芽細胞マイトジェン（ｍｉｔｏ
ｇｅｎ）はトロウェルら、ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンタル・バイオロジー、第１６巻、第６０−７０
頁、１９３９年〔Ｔｒｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，１６：６０−７０（１０３９）〕及びホフマ
ン，グロース、第４巻、第３６１−３７６頁、１９４０
年〔Ｈｏｆｆｍｏｎ，Ｇｒｏｗｔｈ ４：３６１−３７
６（１９４０）〕によって最初に発表された。脳下垂体
抽出物も繊維芽細胞に対して有効なマイトジェン活性を
有することがその後明らかにされた〔アルメリン，プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンスＵＳＡ、第７０巻、第２７０２−２７０６
頁、１９７３年（Ａｅｍｅｌｉｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ ７０：２７０２−２７０６
（１９７３）〕。脳及び下垂体双方の繊維芽細胞成長因
子（ＦＧＦ）の部分精製体は、脈管系内皮細胞をはじめ
とする様々なタイプの分化細胞に対してマイトジェン活
性を示した〔ゴスポダロウイグズら、ナショナル・キャ
ンサー・インスティテュート・モノグラフ、第４８巻、
第１０９−１３０頁、１９７８年（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏ
ｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ，４
８：１０９−１３０（１９７８）〕。最近になり、ＦＧ
Ｆは２つの型、即ち酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）及び塩基性
ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）として存在することが判明し、両型
とも脳調製物中で確認された〔トーマス及びギメネツ−
ガレゴ、ＴＩＢＳ、第１１巻、第８１−８４頁、１９８
６年（Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌ
ｌｅｇｏ，ＴＩＢＳ １１：８１−８４（１９８
６））〕。
ｇｅｎ）はトロウェルら、ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンタル・バイオロジー、第１６巻、第６０−７０
頁、１９３９年〔Ｔｒｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，１６：６０−７０（１０３９）〕及びホフマ
ン，グロース、第４巻、第３６１−３７６頁、１９４０
年〔Ｈｏｆｆｍｏｎ，Ｇｒｏｗｔｈ ４：３６１−３７
６（１９４０）〕によって最初に発表された。脳下垂体
抽出物も繊維芽細胞に対して有効なマイトジェン活性を
有することがその後明らかにされた〔アルメリン，プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンスＵＳＡ、第７０巻、第２７０２−２７０６
頁、１９７３年（Ａｅｍｅｌｉｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ ７０：２７０２−２７０６
（１９７３）〕。脳及び下垂体双方の繊維芽細胞成長因
子（ＦＧＦ）の部分精製体は、脈管系内皮細胞をはじめ
とする様々なタイプの分化細胞に対してマイトジェン活
性を示した〔ゴスポダロウイグズら、ナショナル・キャ
ンサー・インスティテュート・モノグラフ、第４８巻、
第１０９−１３０頁、１９７８年（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏ
ｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ，４
８：１０９−１３０（１９７８）〕。最近になり、ＦＧ
Ｆは２つの型、即ち酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）及び塩基性
ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）として存在することが判明し、両型
とも脳調製物中で確認された〔トーマス及びギメネツ−
ガレゴ、ＴＩＢＳ、第１１巻、第８１−８４頁、１９８
６年（Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌ
ｌｅｇｏ，ＴＩＢＳ １１：８１−８４（１９８
６））〕。
【０００２】様々なタイプの細胞、例えば一次繊維芽細
胞、脈管系及び角膜系内皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、
筋原細胞、平滑筋細胞及び神経膠細胞は、精製ａＦＧＦ
又はｂＦＧＦによる刺激に反応してＤＮＡ合成を行い、
分裂する〔エスク（Ｅｓｃｈ）ら、プロシーディング・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳ
Ａ、第８２巻、第６５０７−６５１１頁、１９８５年；
クオら、フェデレーション・プロシーディング、第４４
巻、第６９５頁、１９８５年（Ｋｕｏ ｅｔａｌ．，Ｆ
ｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ４４：６
９５（１９８５）〕。
胞、脈管系及び角膜系内皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、
筋原細胞、平滑筋細胞及び神経膠細胞は、精製ａＦＧＦ
又はｂＦＧＦによる刺激に反応してＤＮＡ合成を行い、
分裂する〔エスク（Ｅｓｃｈ）ら、プロシーディング・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳ
Ａ、第８２巻、第６５０７−６５１１頁、１９８５年；
クオら、フェデレーション・プロシーディング、第４４
巻、第６９５頁、１９８５年（Ｋｕｏ ｅｔａｌ．，Ｆ
ｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ４４：６
９５（１９８５）〕。
【０００３】純粋なウシ脳由来ａＦＧＦは、培地中にお
いて脈管系内皮細胞の有効なマイトジェンとして作用す
るのみならず、生体内において血管成長を誘導する〔ト
ーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第
８２巻、第６４０９−６４１３頁、１９８５年）。ａＦ
ＧＦの繊維芽細胞マイトジェン活性は、創傷治癒を促進
させるためにも利用することができる〔トーマス、米国
特許第４，４４４，７６０号明細書〕。本発明は、治療
上利用可能な純粋なａＦＧＦを大量に産生し得る遺伝子
構造体及び発現手段を提供する。
いて脈管系内皮細胞の有効なマイトジェンとして作用す
るのみならず、生体内において血管成長を誘導する〔ト
ーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第
８２巻、第６４０９−６４１３頁、１９８５年）。ａＦ
ＧＦの繊維芽細胞マイトジェン活性は、創傷治癒を促進
させるためにも利用することができる〔トーマス、米国
特許第４，４４４，７６０号明細書〕。本発明は、治療
上利用可能な純粋なａＦＧＦを大量に産生し得る遺伝子
構造体及び発現手段を提供する。
【０００４】したがって、特定タンパク質のアミノ酸配
列からヒトａＦＧＦのヌクレオチド塩基配列を得ること
が、本発明の目的である。もう１つの目的は、特定のａ
ＦＧＦについてコードする遺伝子を製造し、かつ遺伝子
を適当なクローニング用ベクターに組入れることであ
る。他の目的は、各々の組換えベクターで適当な宿主を
形質転換し、かつ特定のａＦＧＦ遺伝子の発現を誘導さ
せることである。もう１つの目的は、生物学的活性ヒト
ａＦＧＦを単離かつ精製することである。本発明のこれ
らの及び他の目的は、下記説明により明らかとなるであ
ろう。
列からヒトａＦＧＦのヌクレオチド塩基配列を得ること
が、本発明の目的である。もう１つの目的は、特定のａ
ＦＧＦについてコードする遺伝子を製造し、かつ遺伝子
を適当なクローニング用ベクターに組入れることであ
る。他の目的は、各々の組換えベクターで適当な宿主を
形質転換し、かつ特定のａＦＧＦ遺伝子の発現を誘導さ
せることである。もう１つの目的は、生物学的活性ヒト
ａＦＧＦを単離かつ精製することである。本発明のこれ
らの及び他の目的は、下記説明により明らかとなるであ
ろう。
【０００５】本発明においてはウシ酸性繊維芽細胞成長
因子（ａＦＧＦ）及びヒトａＦＧＦのアミノ酸配列につ
いてコードする独特な遺伝子が組立てられる。ウシ遺伝
子はａＦＧＦアミノ酸配列の逆翻訳により得られ、一方
ヒト遺伝子はウシ遺伝子の特異的点変異により得られ
る。各々の遺伝子構造体は発現ベクターに挿入され、適
当な宿主を形質転換するために使用される。形質転換さ
れた宿主細胞はヒト又はウシの組換えａＦＧＦ（ｒ−Ｆ
ＧＦ）を産生するが、これは精製されると天然タンパク
質に匹敵する活性を有するようになる。
因子（ａＦＧＦ）及びヒトａＦＧＦのアミノ酸配列につ
いてコードする独特な遺伝子が組立てられる。ウシ遺伝
子はａＦＧＦアミノ酸配列の逆翻訳により得られ、一方
ヒト遺伝子はウシ遺伝子の特異的点変異により得られ
る。各々の遺伝子構造体は発現ベクターに挿入され、適
当な宿主を形質転換するために使用される。形質転換さ
れた宿主細胞はヒト又はウシの組換えａＦＧＦ（ｒ−Ｆ
ＧＦ）を産生するが、これは精製されると天然タンパク
質に匹敵する活性を有するようになる。
【０００６】酸性繊維芽細胞成長因子は、様々な微異構
造（わずかに構造が異なる、（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏ
ｇｅｎｅｏｕｓ））型として存在し、ａＦＧＦを含有す
ることが知られた様々な組織源及び細胞タイプから単離
される。本発明で使用される各微異構造型とは単一遺伝
子産物、即ち単一ＤＮＡ遺伝子単位から産生されるペプ
チド類であって、翻訳後に構造修正されたものを意味す
る。しかしながら、構造修正はペプチドの生物学的活性
にいかなる顕著な変化も与えない。修正は、生体内で又
は単離精製過程において起きる。生体内修正は、格別限
定されないが、Ｎ末端におけるタンパク質分解、グリコ
シル化、ホスホリル化又はアセチル化の結果として生じ
る。タンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）として
は端部タンパク質分解（ｅｘｏｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉ
ｓ）があり、この場合には１以上の末端アミノ酸が連続
的に酵素分解され、元の遺伝子産物よりもアミノ酸が少
ない微異構造型を生じる。中間部タンパク質分解（Ｅｎ
ｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）修正はエンドプロテアー
ゼ作用によるものであって、この酵素はアミノ酸配列中
の特定部位でペプチドを切断する。同様の修正は精製過
程でも生じ、微異構造型を産生するようになる。精製時
に最も一般的に生じる修正はタンパク質分解であるが、
通常プロテアーゼ阻害剤の使用によって最小に抑制され
る。ほとんどの条件下において、微異構造型混合物は天
然ａＦＧＦの精製後に存在する。天然ａＦＧＦとは、ａ
ＦＧＦ含有組織又は細胞から単離精製されるａＦＧＦの
ことである。
造（わずかに構造が異なる、（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏ
ｇｅｎｅｏｕｓ））型として存在し、ａＦＧＦを含有す
ることが知られた様々な組織源及び細胞タイプから単離
される。本発明で使用される各微異構造型とは単一遺伝
子産物、即ち単一ＤＮＡ遺伝子単位から産生されるペプ
チド類であって、翻訳後に構造修正されたものを意味す
る。しかしながら、構造修正はペプチドの生物学的活性
にいかなる顕著な変化も与えない。修正は、生体内で又
は単離精製過程において起きる。生体内修正は、格別限
定されないが、Ｎ末端におけるタンパク質分解、グリコ
シル化、ホスホリル化又はアセチル化の結果として生じ
る。タンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）として
は端部タンパク質分解（ｅｘｏｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉ
ｓ）があり、この場合には１以上の末端アミノ酸が連続
的に酵素分解され、元の遺伝子産物よりもアミノ酸が少
ない微異構造型を生じる。中間部タンパク質分解（Ｅｎ
ｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）修正はエンドプロテアー
ゼ作用によるものであって、この酵素はアミノ酸配列中
の特定部位でペプチドを切断する。同様の修正は精製過
程でも生じ、微異構造型を産生するようになる。精製時
に最も一般的に生じる修正はタンパク質分解であるが、
通常プロテアーゼ阻害剤の使用によって最小に抑制され
る。ほとんどの条件下において、微異構造型混合物は天
然ａＦＧＦの精製後に存在する。天然ａＦＧＦとは、ａ
ＦＧＦ含有組織又は細胞から単離精製されるａＦＧＦの
ことである。
【０００７】本発明と、酸性繊維芽細胞成長因子に関し
てすべての哺乳動物の微異構造型を包含すると考えられ
る。好ましい態様としては、ａＦＧＦのウシ及びヒト微
異構造型がある。ウシａＦＧＦの最も好ましい微異構造
型としては、１５４アミノ酸型、１４０アミノ酸型及び
１３４アミノ酸型である。１４０アミノ酸型は表３に示
されており、ウシ種の中では最も好ましい。１５４アミ
ノ酸型は、１４０アミノ酸型の１位のアミノ末端Ｐｈｅ
にカルボキシル末端Ｌｙｓが結合した下記の余分なアミ
ノ酸を有する：Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ。１３４アミノ酸型は、アミ
ノ末端の最初の６アミノ酸が欠落していること以外は１
４０アミノ酸と同一である。単離された場合に、これら
微異構造型の各々の量は適用される工程に応じて変動す
るが、但しすべての調製物が各々の型を少なくとも一部
含有している。ヒトａＦＧＦは、ウシａＦＧＦと同様の
微異構造性を示す。ヒトａＦＧＦの最も好ましい微異構
造型としては、１５４アミノ酸型、１４０アミノ酸型及
び１３９アミノ酸型がある。ヒト１４０アミノ酸型は、
表５で示されるように、１１個のアミノ酸についてウシ
型と異なっている。１５４アミノ酸型は、ヒト１４０ア
ミノ酸型と全く同じ配列に加えて、ウシ１５４アミノ酸
型に結合している１４個の余分のアミノ酸配列と１つを
除き同一の配列を含む。Ｎ末端から数えて５番目あるい
は１４０アミノ酸型のＮ末端であるＰｈｅから数えて−
１０番目のアミノ酸はウシ型ではスレオニンであるがヒ
ト型ではイソロイシンである。余分な１４アミノ酸Ｎ末
端配列はＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｕｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓである。ヒトａＦＧＦの第三の型は
１３９のアミノ酸を有し、アミノ末端のフェニルアラニ
ンが除かれたヒト１４０アミノ酸型と同一である。ヒト
ａＦＧＦの１３９アミノ酸型において、アミノ末端アス
パラギン残基は、アスパラギン酸に脱アミド化されてい
てもよい。１４０及び１３９アミノ酸型はヒト微異構造
型の最も好ましい型である。
てすべての哺乳動物の微異構造型を包含すると考えられ
る。好ましい態様としては、ａＦＧＦのウシ及びヒト微
異構造型がある。ウシａＦＧＦの最も好ましい微異構造
型としては、１５４アミノ酸型、１４０アミノ酸型及び
１３４アミノ酸型である。１４０アミノ酸型は表３に示
されており、ウシ種の中では最も好ましい。１５４アミ
ノ酸型は、１４０アミノ酸型の１位のアミノ末端Ｐｈｅ
にカルボキシル末端Ｌｙｓが結合した下記の余分なアミ
ノ酸を有する：Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ。１３４アミノ酸型は、アミ
ノ末端の最初の６アミノ酸が欠落していること以外は１
４０アミノ酸と同一である。単離された場合に、これら
微異構造型の各々の量は適用される工程に応じて変動す
るが、但しすべての調製物が各々の型を少なくとも一部
含有している。ヒトａＦＧＦは、ウシａＦＧＦと同様の
微異構造性を示す。ヒトａＦＧＦの最も好ましい微異構
造型としては、１５４アミノ酸型、１４０アミノ酸型及
び１３９アミノ酸型がある。ヒト１４０アミノ酸型は、
表５で示されるように、１１個のアミノ酸についてウシ
型と異なっている。１５４アミノ酸型は、ヒト１４０ア
ミノ酸型と全く同じ配列に加えて、ウシ１５４アミノ酸
型に結合している１４個の余分のアミノ酸配列と１つを
除き同一の配列を含む。Ｎ末端から数えて５番目あるい
は１４０アミノ酸型のＮ末端であるＰｈｅから数えて−
１０番目のアミノ酸はウシ型ではスレオニンであるがヒ
ト型ではイソロイシンである。余分な１４アミノ酸Ｎ末
端配列はＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｕｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓである。ヒトａＦＧＦの第三の型は
１３９のアミノ酸を有し、アミノ末端のフェニルアラニ
ンが除かれたヒト１４０アミノ酸型と同一である。ヒト
ａＦＧＦの１３９アミノ酸型において、アミノ末端アス
パラギン残基は、アスパラギン酸に脱アミド化されてい
てもよい。１４０及び１３９アミノ酸型はヒト微異構造
型の最も好ましい型である。
【０００８】哺乳動物ｒ−ａＦＧＦは、ゲノムＤＮＡ又
はｃＤＮＡ由来天然遺伝子をクローニングするか、又は
ヒトを含む哺乳動物種由来ａＦＧＦのこれら微異構造型
の公知アミノ酸配列に基づくタンパク質微異構造型の１
つに関する遺伝子の組立てによって製造される。ゲノム
ＤＮＡは、マニアティスら、セル、第１５巻、第６８７
−７１０頁、１９７８年〔Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ １５：６８７−７０１（１９７８）〕
の方法による高分子量ＤＮＡのランダムな断片化によ
り、又はスミシーズら、サイエンス、第２０２巻、第１
２８４−１２８９頁、１９７８年〔Ｓｍｉｔｈｉｅｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２：１２８４−１
２８９（１９７８）〕の方法による制限酵素を用いた切
断によって、クローニング用に製造される。次いでゲノ
ムＤＮＡは適当なクローニング用ベクター、即ち一般的
には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラムダファージに組込まれ
る〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、分子クロー
ニング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバー
研究所、コールドスプリングハーバー，ニューヨーク
州、１９８２年〕。
はｃＤＮＡ由来天然遺伝子をクローニングするか、又は
ヒトを含む哺乳動物種由来ａＦＧＦのこれら微異構造型
の公知アミノ酸配列に基づくタンパク質微異構造型の１
つに関する遺伝子の組立てによって製造される。ゲノム
ＤＮＡは、マニアティスら、セル、第１５巻、第６８７
−７１０頁、１９７８年〔Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ １５：６８７−７０１（１９７８）〕
の方法による高分子量ＤＮＡのランダムな断片化によ
り、又はスミシーズら、サイエンス、第２０２巻、第１
２８４−１２８９頁、１９７８年〔Ｓｍｉｔｈｉｅｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２：１２８４−１
２８９（１９７８）〕の方法による制限酵素を用いた切
断によって、クローニング用に製造される。次いでゲノ
ムＤＮＡは適当なクローニング用ベクター、即ち一般的
には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラムダファージに組込まれ
る〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、分子クロー
ニング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバー
研究所、コールドスプリングハーバー，ニューヨーク
州、１９８２年〕。
【０００９】ａＦＧＦ用のｃＤＮＡを得るために、ポリ
（Ａ）含有ＲＮＡがアビブ（Ａｖｉｖ）及びレーダー
（Ｌｅｄｅｒ）、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス、第６９巻、第１４０
８−１４１２頁、１９７２年の方法によりａＦＧＦ発現
細胞から抽出される。ｃＤＮＡは、マニアティスら、分
子クローニング、実験マニュアル、コールドスプリング
ハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニュー
ヨーク州；１９８２年に記載されているような標準的方
法により、リバーストランスクリプターゼ及びＤＮＡポ
リメラーゼを用いて製造される。ｃＤＮＡは、ウエンシ
ンク（Ｗｅｎｓｉｎｋ）ら、セル、第３巻、第３１５−
３２５頁、１９７４年の方法に類似した方法によって、
切り取られかつ適当なベクター、通常はｐＢＲ３２２に
組込まれてクローニングされる。クローンゲノムＤＮＡ
又はｃＤＮＡライブラリーを、オリゴヌクレオチドプロ
ーブとのハイブリッド形成によって、ａＦＧＦ配列含有
クローンを確認するためにスクリーニングする。オリゴ
ヌクレオチドハイブリッド形成用プローブの配列は、既
知ａＦＧＦアミノ酸配列に基づいている。マニスティス
ら、同上及びアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）及びキ
ングストン（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ）、プロシーディング・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳ
Ａ、第８０巻、第６８３８−６８４２頁、１９８３年及
びサッグス（Ｓｕｇｇｓ）ら、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、
第７８巻、第６６１３−６６１７頁、１９８１年は、ゲ
ノム及びｃＤＮＡクローンの様々なスクリーニング方法
について記載している。
（Ａ）含有ＲＮＡがアビブ（Ａｖｉｖ）及びレーダー
（Ｌｅｄｅｒ）、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス、第６９巻、第１４０
８−１４１２頁、１９７２年の方法によりａＦＧＦ発現
細胞から抽出される。ｃＤＮＡは、マニアティスら、分
子クローニング、実験マニュアル、コールドスプリング
ハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニュー
ヨーク州；１９８２年に記載されているような標準的方
法により、リバーストランスクリプターゼ及びＤＮＡポ
リメラーゼを用いて製造される。ｃＤＮＡは、ウエンシ
ンク（Ｗｅｎｓｉｎｋ）ら、セル、第３巻、第３１５−
３２５頁、１９７４年の方法に類似した方法によって、
切り取られかつ適当なベクター、通常はｐＢＲ３２２に
組込まれてクローニングされる。クローンゲノムＤＮＡ
又はｃＤＮＡライブラリーを、オリゴヌクレオチドプロ
ーブとのハイブリッド形成によって、ａＦＧＦ配列含有
クローンを確認するためにスクリーニングする。オリゴ
ヌクレオチドハイブリッド形成用プローブの配列は、既
知ａＦＧＦアミノ酸配列に基づいている。マニスティス
ら、同上及びアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）及びキ
ングストン（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ）、プロシーディング・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳ
Ａ、第８０巻、第６８３８−６８４２頁、１９８３年及
びサッグス（Ｓｕｇｇｓ）ら、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、
第７８巻、第６６１３−６６１７頁、１９８１年は、ゲ
ノム及びｃＤＮＡクローンの様々なスクリーニング方法
について記載している。
【００１０】哺乳動物ａＦＧＦの遺伝子を得るための好
ましい方法は、遺伝子を合成することである。遺伝子
は、ヒトを含むいずれかの哺乳動物から得られるａＦＧ
Ｆ微異構造型のアミノ酸配列に基づいて合成されてもよ
い。好ましい方法は、ａＦＧＦに関するウシアミノ酸配
列を用い、かつ他種遺伝子を製造するために塩基配列を
化学的に点変異させることである。ウシ及びヒトａＦＧ
Ｆに関するアミノ酸配列は、１９８６年５月３０日出願
の米国特許出願第８６８，４７３号明細書で開示されて
いるが、この出願は１９８５年９月１１２日出願の米国
特許出願第７７４，３５９号の一部継続出願であり、更
に後者の出願は１９８４年１２月２４日出願の米国特許
出願第６８５，９２３号（現在放棄されている）の一部
継続出願である。
ましい方法は、遺伝子を合成することである。遺伝子
は、ヒトを含むいずれかの哺乳動物から得られるａＦＧ
Ｆ微異構造型のアミノ酸配列に基づいて合成されてもよ
い。好ましい方法は、ａＦＧＦに関するウシアミノ酸配
列を用い、かつ他種遺伝子を製造するために塩基配列を
化学的に点変異させることである。ウシ及びヒトａＦＧ
Ｆに関するアミノ酸配列は、１９８６年５月３０日出願
の米国特許出願第８６８，４７３号明細書で開示されて
いるが、この出願は１９８５年９月１１２日出願の米国
特許出願第７７４，３５９号の一部継続出願であり、更
に後者の出願は１９８４年１２月２４日出願の米国特許
出願第６８５，９２３号（現在放棄されている）の一部
継続出願である。
【００１１】合成遺伝子は、ギメネズ−ガレゴ（Ｇｉｍ
ｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ）ら、サイエンス、第２３０
巻、第１３８５−１３８８頁、１９８５年に記載された
既知ウシアミノ酸配列及びギメネズ−ガレゴら、バイオ
ケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケーションズ、第１３８巻、第６１１−６１７頁、
１９８６年〔Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａ
ｔｉｏｎｓ，１３８：６１１−６１７（１９８６）〕に
記載されたヒトアミノ酸配列に基づいている。ウシａＦ
ＧＦの１４０アミノ酸型の独特なヌクレオチド配列は、
イタクラら、サイエンス、第１９８巻、第１０５６−１
０６３頁、１９７７年の方法と同様の方法によって、ア
ミノ酸配列の逆翻訳から誘導される。ウシａＦＧＦの天
然アミノ酸配列に対応する様々な新規ヌクレオチド配列
は、下記表に示されている：
ｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ）ら、サイエンス、第２３０
巻、第１３８５−１３８８頁、１９８５年に記載された
既知ウシアミノ酸配列及びギメネズ−ガレゴら、バイオ
ケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケーションズ、第１３８巻、第６１１−６１７頁、
１９８６年〔Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａ
ｔｉｏｎｓ，１３８：６１１−６１７（１９８６）〕に
記載されたヒトアミノ酸配列に基づいている。ウシａＦ
ＧＦの１４０アミノ酸型の独特なヌクレオチド配列は、
イタクラら、サイエンス、第１９８巻、第１０５６−１
０６３頁、１９７７年の方法と同様の方法によって、ア
ミノ酸配列の逆翻訳から誘導される。ウシａＦＧＦの天
然アミノ酸配列に対応する様々な新規ヌクレオチド配列
は、下記表に示されている：
【表１】 上記において、Ｑ＝Ｃ又はＴ Ｐ＝Ａ又はＧ Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｃ又はＧである。
【００１２】本発明のヌクレオチド配列は、下記の特徴
を有する；大腸菌及び哺乳動物細胞にとって好ましいコ
ドンを有しており、可能であれば多重相補性配列の欠
落、遺伝子全体にわたる独特な制限部位の組込み、遺伝
子をプラスミドに挿入させ易くするための末端制限酵素
付着端、２つに分かれた遺伝子をアセンブリー（ａｓｓ
ｅｍｂｌｙ）させるために中央に位置する各酵素１つづ
つの制限部位、好ましくは翻訳開始部位としてのＮ末端
メチオニンコドン及び直列的翻訳停止コドンといった特
徴を有する。
を有する；大腸菌及び哺乳動物細胞にとって好ましいコ
ドンを有しており、可能であれば多重相補性配列の欠
落、遺伝子全体にわたる独特な制限部位の組込み、遺伝
子をプラスミドに挿入させ易くするための末端制限酵素
付着端、２つに分かれた遺伝子をアセンブリー（ａｓｓ
ｅｍｂｌｙ）させるために中央に位置する各酵素１つづ
つの制限部位、好ましくは翻訳開始部位としてのＮ末端
メチオニンコドン及び直列的翻訳停止コドンといった特
徴を有する。
【００１３】以下の記載及び実施例はウシａＦＧＦの具
体的なヌクレオチド配列に関する本発明を説明したもの
であるが、本発明にあっては表１に掲載されたいずれの
組換え体をも包含していると理解されたい。下記表は好
ましいヌクレオチド配列を有している：
体的なヌクレオチド配列に関する本発明を説明したもの
であるが、本発明にあっては表１に掲載されたいずれの
組換え体をも包含していると理解されたい。下記表は好
ましいヌクレオチド配列を有している：
【表２】
【００１４】遺伝子は、単一制限酵素切断部位及び翻訳
開始部位としてのＮ末端メチオニンコドンを含んだリー
ダー部分を有するように組立てられる。遺伝子は、直列
的翻訳停止コドン及び２つの制限酵素切断部位を含んだ
尾部をも有している。ＤＮＡの相補性によって、遺伝子
全体にわたり独特な制限酵素切断部位を組込んだ塩基配
列を選択することができる。制限酵素切断部位の位置に
関して好ましい遺伝子塩基配列は、下記表に示されてい
る：
開始部位としてのＮ末端メチオニンコドンを含んだリー
ダー部分を有するように組立てられる。遺伝子は、直列
的翻訳停止コドン及び２つの制限酵素切断部位を含んだ
尾部をも有している。ＤＮＡの相補性によって、遺伝子
全体にわたり独特な制限酵素切断部位を組込んだ塩基配
列を選択することができる。制限酵素切断部位の位置に
関して好ましい遺伝子塩基配列は、下記表に示されてい
る：
【表３】
【表４】
【００１５】二本鎖分子の各々の鎖の遺伝子配列は８つ
のヌクレオチド配列にランダムに分割される。オリゴヌ
クレオチドは二本鎖ＤＮＡを形成し得る重複した末端を
有するように組立てられる。下記表は、ウシａＦＧＦ遺
伝子を製造するために用いられる多数のオリゴヌクレオ
チド配列例を示している。
のヌクレオチド配列にランダムに分割される。オリゴヌ
クレオチドは二本鎖ＤＮＡを形成し得る重複した末端を
有するように組立てられる。下記表は、ウシａＦＧＦ遺
伝子を製造するために用いられる多数のオリゴヌクレオ
チド配列例を示している。
【表５】
【表６】
【００１６】表４で示したオリゴヌクレオチドはあくま
でもオリゴヌクレオチドサブユニットの一例として記載
されているのであり、それら自体に限定されると解釈す
べきではない。オリゴヌクレオチドの重複及び配置（ａ
ｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を示す複合塩基配列は表３に示
されている。
でもオリゴヌクレオチドサブユニットの一例として記載
されているのであり、それら自体に限定されると解釈す
べきではない。オリゴヌクレオチドの重複及び配置（ａ
ｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を示す複合塩基配列は表３に示
されている。
【００１７】ウシ遺伝子は２つの工程、即ち最初はタン
パク質Ｎ末端部分に対応する半分、第２にＣ末端側の半
分に関してアセンブル（ａｓｓｅｍｂｌｅ）される。通
常オリゴヌクレオチドはＡＴＰ又は32Ｐ−標識ＡＴＰの
存在下においてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理さ
れる。各工程の最初の反応において、遺伝子の一方の鎖
を構成するオリゴヌクレオチドは最も５′側のオリゴヌ
クレオチドを除きキナーゼ処理される。第２の反応にお
いて、他の鎖を構成するオリゴヌクレオチドは最も５′
側のオリゴヌクレオチドを除きキナーゼで処理される。
キナーゼ処理オリゴヌクレオチドが使用される場合に
は、約１ｐｍｏｌの32Ｐ−標識オリゴヌクレオチドが後
における生成物の確認のために加えられる。アニーリン
グは、適当な緩衝液、例えば格別限定されないが、約ｐ
Ｈ７．６のトリス約６０ｍＭ、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）約５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 約１０ｍＭ、ＡＴＰ約３０
μＭを含有する緩衝液中約９０℃で約４分間処理し、次
いで約６０℃まで急速に温度を下げ、約３０℃まで徐々
に温度を下げることによって行なわれる。結合は、適当
な緩衝液、例えば格別限定されないが、約ｐＨ７．６の
トリス約６０ｍＭ、ＤＴＴ約１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 約１
０ｍＭ、ＡＴＰ約１ｍＭ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ約０．
０３単位を含有する緩衝液中約２０℃で約１．５時間か
けて行なわれる。
パク質Ｎ末端部分に対応する半分、第２にＣ末端側の半
分に関してアセンブル（ａｓｓｅｍｂｌｅ）される。通
常オリゴヌクレオチドはＡＴＰ又は32Ｐ−標識ＡＴＰの
存在下においてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理さ
れる。各工程の最初の反応において、遺伝子の一方の鎖
を構成するオリゴヌクレオチドは最も５′側のオリゴヌ
クレオチドを除きキナーゼ処理される。第２の反応にお
いて、他の鎖を構成するオリゴヌクレオチドは最も５′
側のオリゴヌクレオチドを除きキナーゼで処理される。
キナーゼ処理オリゴヌクレオチドが使用される場合に
は、約１ｐｍｏｌの32Ｐ−標識オリゴヌクレオチドが後
における生成物の確認のために加えられる。アニーリン
グは、適当な緩衝液、例えば格別限定されないが、約ｐ
Ｈ７．６のトリス約６０ｍＭ、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）約５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 約１０ｍＭ、ＡＴＰ約３０
μＭを含有する緩衝液中約９０℃で約４分間処理し、次
いで約６０℃まで急速に温度を下げ、約３０℃まで徐々
に温度を下げることによって行なわれる。結合は、適当
な緩衝液、例えば格別限定されないが、約ｐＨ７．６の
トリス約６０ｍＭ、ＤＴＴ約１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 約１
０ｍＭ、ＡＴＰ約１ｍＭ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ約０．
０３単位を含有する緩衝液中約２０℃で約１．５時間か
けて行なわれる。
【００１８】結合されたオリゴヌクレオチドは、エタノ
ール沈降後ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製
される。オリゴヌクレオチドは、約８０％ホルムアミド
約２０μｌ、約ｐＨ８．３のトリスホウ酸約５０ｍＭ、
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）約１ｍＭ、キシレ
ンシアノール約０．１％（ｗ／ｖ）及びブロモフェノー
ルブルー約０．１％（ｗ／ｖ）を含有する緩衝液に再溶
解される。各サンプルは約９０℃で約３分間加熱され、
約７５ワットで約５時間約１０％尿素−ポリアクリルア
ミドゲル中で電気泳動に供される。２３１塩基Ｎ末端側
バンドが回収され、一つにまとめられ、約ｐＨ８のＥＤ
ＴＡ約１ｍＭ含有の酢酸アンモニウム約０．５Ｍ中で約
４℃で溶離される。２０９塩基Ｃ末端側バンドも同様の
方法で処理される。
ール沈降後ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製
される。オリゴヌクレオチドは、約８０％ホルムアミド
約２０μｌ、約ｐＨ８．３のトリスホウ酸約５０ｍＭ、
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）約１ｍＭ、キシレ
ンシアノール約０．１％（ｗ／ｖ）及びブロモフェノー
ルブルー約０．１％（ｗ／ｖ）を含有する緩衝液に再溶
解される。各サンプルは約９０℃で約３分間加熱され、
約７５ワットで約５時間約１０％尿素−ポリアクリルア
ミドゲル中で電気泳動に供される。２３１塩基Ｎ末端側
バンドが回収され、一つにまとめられ、約ｐＨ８のＥＤ
ＴＡ約１ｍＭ含有の酢酸アンモニウム約０．５Ｍ中で約
４℃で溶離される。２０９塩基Ｃ末端側バンドも同様の
方法で処理される。
【００１９】ａＦＧＦのＮ末端側又はＣ末端側について
コードする合成遺伝子配列はｐＢＲ３２２プラスミドに
組込まれる。本発明の範囲内には、ａＦＧＦ遺伝子を組
込むことができかつａＦＧＦ遺伝子を発現させることが
できる他のプラスミドの使用も含まれることが、特に望
まれるし更にはそのように考えられる。再アニーリング
されるオリゴヌクレオチド、即ち約３００ｆｍｏｌ及び
約１００ｆｍｏｌの回収された２３１塩基対Ｎ末端は、
それぞれＮ末端用にアガロースゲル精製された約１００
ｆｍｏｌの約３．９キロ塩基（ｋｂ）ＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ ｐＢＲ３２２に結合せしめられる。２０９ｂｐ
Ｃ末端はＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ ｐＢＲ３２２を用いて
同様の方法により組立てられる。結合は、約ｐＨ７．８
のトリス約２５ｍＭ、ＤＴＴ約１ｍＭ、ＭｇＣｌ2 約１
０ｍＭ、ＡＴＰ約０．４ｍＭ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ約
１単位を含有した緩衝液中約２０℃で約１時間かけて行
なわれる。各々半分の遺伝子が結合したベクターは、供
給者の処理をかけた大腸菌ＲＲ１〔ベセスダリサーチラ
ボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ＢＲＬ〕のようなコンピ
テント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細菌細胞を形質転換させ
るために使用される。形質転換された細胞は、アンピシ
リン中で増殖するものについて選択され、少量溶離物プ
ラスミド調製物の制限分析により２３１塩基対（ｂｐ）
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ挿入物又は２０９ｂｐ Ｂａｍ
ＨＩ−ＳａｌＩ挿入物の存在に関してスクリーニングさ
れる。
コードする合成遺伝子配列はｐＢＲ３２２プラスミドに
組込まれる。本発明の範囲内には、ａＦＧＦ遺伝子を組
込むことができかつａＦＧＦ遺伝子を発現させることが
できる他のプラスミドの使用も含まれることが、特に望
まれるし更にはそのように考えられる。再アニーリング
されるオリゴヌクレオチド、即ち約３００ｆｍｏｌ及び
約１００ｆｍｏｌの回収された２３１塩基対Ｎ末端は、
それぞれＮ末端用にアガロースゲル精製された約１００
ｆｍｏｌの約３．９キロ塩基（ｋｂ）ＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ ｐＢＲ３２２に結合せしめられる。２０９ｂｐ
Ｃ末端はＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ ｐＢＲ３２２を用いて
同様の方法により組立てられる。結合は、約ｐＨ７．８
のトリス約２５ｍＭ、ＤＴＴ約１ｍＭ、ＭｇＣｌ2 約１
０ｍＭ、ＡＴＰ約０．４ｍＭ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ約
１単位を含有した緩衝液中約２０℃で約１時間かけて行
なわれる。各々半分の遺伝子が結合したベクターは、供
給者の処理をかけた大腸菌ＲＲ１〔ベセスダリサーチラ
ボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ＢＲＬ〕のようなコンピ
テント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細菌細胞を形質転換させ
るために使用される。形質転換された細胞は、アンピシ
リン中で増殖するものについて選択され、少量溶離物プ
ラスミド調製物の制限分析により２３１塩基対（ｂｐ）
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ挿入物又は２０９ｂｐ Ｂａｍ
ＨＩ−ＳａｌＩ挿入物の存在に関してスクリーニングさ
れる。
【００２０】適当な大きさの挿入物を有するクローンの
ＤＮＡ配列は、マキサム（Ｍａｘａｍ）及びギルバート
（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、プロシーディン・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７４巻、
第５６０−５６４、１９７７年の化学的ＤＮＡ配列法に
よって決定される。完全な鎖長の最終ａＦＧＦ合成遺伝
子は、Ｎ末端側の半分のクローンを制限酵素ＢａｍＨＩ
及びＳａｌＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理
し、かつＣ末端側の半分のクローンのゲル精製２０９ｂ
ｐ ＨａｍＨＩ−ＳａｌＩ挿入物にこれを結合させるこ
とによって精製された。この結合物質は、上記のような
コンピテントＲＲＩ細胞を形質転換させるために用いら
れる。
ＤＮＡ配列は、マキサム（Ｍａｘａｍ）及びギルバート
（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、プロシーディン・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７４巻、
第５６０−５６４、１９７７年の化学的ＤＮＡ配列法に
よって決定される。完全な鎖長の最終ａＦＧＦ合成遺伝
子は、Ｎ末端側の半分のクローンを制限酵素ＢａｍＨＩ
及びＳａｌＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理
し、かつＣ末端側の半分のクローンのゲル精製２０９ｂ
ｐ ＨａｍＨＩ−ＳａｌＩ挿入物にこれを結合させるこ
とによって精製された。この結合物質は、上記のような
コンピテントＲＲＩ細胞を形質転換させるために用いら
れる。
【００２１】合成ａＦＧＦの発現は、いくつかの異なっ
たプロモーター−発現系によって行なわれる。本発明の
範囲内には、完全ａＦＧＦ遺伝子の発現のための他のプ
ロモーター−発現系の使用も含まれることが望まれ意図
される。好ましい構造体は、デボア（ｄｅＢｏｅｒ）
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８０巻、第２１−２５
頁、１９８３年に記載されているような大腸菌ｔａｃプ
ロモーター、即ちｔｒｐプロモーター及びｌａｃプロモ
ーターの領域間のハイブリッドを用いている。ｔａｃプ
ロモーター及びｒｒｎＢｒＲＮＡ転写ターミネーターを
有するプラスミドｐＫＫ２２３−３〔ファルマシア（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）〕は、ｐＢＲ３２２由来ＳａｌＩ制
限酵素部位を取除くように修正された。ｒｒｎＢｒＲＮ
Ａターミネーターは強いプロモーターからの発現を可能
にすることが明らかにされている〔ゲンズ（Ｇｅｎｔ
ｚ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７８巻、第４９３６
−４９４０、１９８１年；ブロシウス，ジーン、第２７
巻、第１６１−１７２頁、１９８４年（Ｂｒｏｓｉｕ
ｓ，Ｇｅｎｅ ２７：１６１−１７２（１９８４）〕。
たプロモーター−発現系によって行なわれる。本発明の
範囲内には、完全ａＦＧＦ遺伝子の発現のための他のプ
ロモーター−発現系の使用も含まれることが望まれ意図
される。好ましい構造体は、デボア（ｄｅＢｏｅｒ）
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８０巻、第２１−２５
頁、１９８３年に記載されているような大腸菌ｔａｃプ
ロモーター、即ちｔｒｐプロモーター及びｌａｃプロモ
ーターの領域間のハイブリッドを用いている。ｔａｃプ
ロモーター及びｒｒｎＢｒＲＮＡ転写ターミネーターを
有するプラスミドｐＫＫ２２３−３〔ファルマシア（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）〕は、ｐＢＲ３２２由来ＳａｌＩ制
限酵素部位を取除くように修正された。ｒｒｎＢｒＲＮ
Ａターミネーターは強いプロモーターからの発現を可能
にすることが明らかにされている〔ゲンズ（Ｇｅｎｔ
ｚ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７８巻、第４９３６
−４９４０、１９８１年；ブロシウス，ジーン、第２７
巻、第１６１−１７２頁、１９８４年（Ｂｒｏｓｉｕ
ｓ，Ｇｅｎｅ ２７：１６１−１７２（１９８４）〕。
【００２２】ｐＫＫ２２３−３プラスミドＤＮＡは制限
酵素で切断され、クローンｐＫＫ２．７を得るための
２．７ｋｂＤＮＡ断片を製する。合成ａＦＧＦ遺伝子は
そのｐＢＲ３２２ベクターから切離され、ＥｃｏＲＩ及
びＳａｌＩでｐＫＫ２．７を制限した後ｐＫＫ２．７プ
ラスミドに組込まれる。得られる図１の組換え体は大腸
菌ＪＭ１０５（ファルマシア）又はＤＨ５（ＢＲＬ）細
胞に導入され、発現せしめられる。
酵素で切断され、クローンｐＫＫ２．７を得るための
２．７ｋｂＤＮＡ断片を製する。合成ａＦＧＦ遺伝子は
そのｐＢＲ３２２ベクターから切離され、ＥｃｏＲＩ及
びＳａｌＩでｐＫＫ２．７を制限した後ｐＫＫ２．７プ
ラスミドに組込まれる。得られる図１の組換え体は大腸
菌ＪＭ１０５（ファルマシア）又はＤＨ５（ＢＲＬ）細
胞に導入され、発現せしめられる。
【００２３】特定部位変異誘発法は、ある哺乳動物種の
ａＦＧＦのアミノ酸配列を別種のａＦＧＦアミノ酸配列
に変換するための有効な方法である。以下の記載は、１
４０アミノ酸型ウシａＦＧＦからヒトａＦＧＦへの特定
部位変異誘発変換に関するものであるが、この方法はい
かなる哺乳動物種のａＦＧＦをいかなる他の種のａＦＧ
Ｆに変換するためにも使用することができる。変換に際
しての唯一の制限は、両者のａＦＧＦのアミノ酸配列が
いずれも既知でなければならないということである。下
記表は、置き換えられねばならないアミノ酸及び表３の
ウシａＦＧＦアミノ酸地図上において置き換えられる位
置を掲載している：
ａＦＧＦのアミノ酸配列を別種のａＦＧＦアミノ酸配列
に変換するための有効な方法である。以下の記載は、１
４０アミノ酸型ウシａＦＧＦからヒトａＦＧＦへの特定
部位変異誘発変換に関するものであるが、この方法はい
かなる哺乳動物種のａＦＧＦをいかなる他の種のａＦＧ
Ｆに変換するためにも使用することができる。変換に際
しての唯一の制限は、両者のａＦＧＦのアミノ酸配列が
いずれも既知でなければならないということである。下
記表は、置き換えられねばならないアミノ酸及び表３の
ウシａＦＧＦアミノ酸地図上において置き換えられる位
置を掲載している：
【表７】
【００２４】ウシ遺伝子配列においてヒト遺伝子配列を
表わす８つのオリゴヌクレオチドは、ウシオリゴヌクレ
オチドの場合と同様の方法によって組立てられる。下記
表は、ヒトａＦＧＦ遺伝子を得るために利用される様々
なオリゴヌクレオチド配列を示す。
表わす８つのオリゴヌクレオチドは、ウシオリゴヌクレ
オチドの場合と同様の方法によって組立てられる。下記
表は、ヒトａＦＧＦ遺伝子を得るために利用される様々
なオリゴヌクレオチド配列を示す。
【表８】
【００２５】クローンされた合成ウシａＦＧＦ遺伝子
は、一連の特定部位（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）点変異によっ
てヒト合成ａＦＧＦ遺伝子に変換される。クローン遺伝
子のオリゴヌクレオチド特定部位変異誘発により、得ら
れるアミノ酸配列が表５に示される置き換えられたアミ
ノ酸を有するヒトａＦＧＦとなるように、ウシａＦＧＦ
の塩基配列を変換する。切除がウシ遺伝子において行な
われ、ａＦＧＦのヒト１３９アミノ酸微異構造型を得る
ようにアミノ末端フェニルアラニンを取除く。点変異
は、２位アスパラギンをアスパラギン酸で置換えるため
に行なわれる。又は、アスパラギンは脱アミド化されて
アスパラギン酸に変換される。これらの操作を行なうた
めの方法は以下に記載されており、技術的に公知であ
る。オリゴヌクレオチド特定部位変異誘発は技術的に公
知の標準的方法を用いて行なわれる〔ゾラー及びスミ
ス，メソッズ・イン・エンザイモロジー、第１００巻、
第４６８−５００頁、１９８３年（Ｚｏｌｌｅｒ ａｎ
ｄ Ｓｎｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，１００：４６８−５００（１９８３））；ノリ
スら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１１巻、
第５１０３−５１１２頁、１９８３年（Ｎｏｒｒｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，１１：５１０３−５１１２（１９８３））；
ゾラー及びスミス、ＤＮＡ、３：４７９−４８８（１９
８４）〕。標準的オリゴヌクレオチド特定部位変異誘発
により行なわれる点変異は下記表７に示されている。塩
基変異位置は表３で見ることができる。点変異はヒトａ
ＦＧＦ遺伝子に変わるための変化例として示されている
だけであり、それ自体に限定されると解釈すべきではな
い。
は、一連の特定部位（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）点変異によっ
てヒト合成ａＦＧＦ遺伝子に変換される。クローン遺伝
子のオリゴヌクレオチド特定部位変異誘発により、得ら
れるアミノ酸配列が表５に示される置き換えられたアミ
ノ酸を有するヒトａＦＧＦとなるように、ウシａＦＧＦ
の塩基配列を変換する。切除がウシ遺伝子において行な
われ、ａＦＧＦのヒト１３９アミノ酸微異構造型を得る
ようにアミノ末端フェニルアラニンを取除く。点変異
は、２位アスパラギンをアスパラギン酸で置換えるため
に行なわれる。又は、アスパラギンは脱アミド化されて
アスパラギン酸に変換される。これらの操作を行なうた
めの方法は以下に記載されており、技術的に公知であ
る。オリゴヌクレオチド特定部位変異誘発は技術的に公
知の標準的方法を用いて行なわれる〔ゾラー及びスミ
ス，メソッズ・イン・エンザイモロジー、第１００巻、
第４６８−５００頁、１９８３年（Ｚｏｌｌｅｒ ａｎ
ｄ Ｓｎｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，１００：４６８−５００（１９８３））；ノリ
スら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１１巻、
第５１０３−５１１２頁、１９８３年（Ｎｏｒｒｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，１１：５１０３−５１１２（１９８３））；
ゾラー及びスミス、ＤＮＡ、３：４７９−４８８（１９
８４）〕。標準的オリゴヌクレオチド特定部位変異誘発
により行なわれる点変異は下記表７に示されている。塩
基変異位置は表３で見ることができる。点変異はヒトａ
ＦＧＦ遺伝子に変わるための変化例として示されている
だけであり、それ自体に限定されると解釈すべきではな
い。
【００２６】
【表９】
【００２７】発現クローンは、トリプトン約１％、酵母
エキス約０．５％、ＮａＣｌ約０．５％、グルコース約
０．４％及びアンピシリン約５０μｇ／ｍｌからなる適
当な増殖培地中約３７℃で増殖せしめられる。５５０ｎ
ｍにおける光学濃度が約０．５に達したときに、イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
が最終濃度約１ｍＭになるまで加えられてもよく、培養
は約３７℃で約３時間続けられる。培地１リットルから
細胞が遠心分離によって回収され、約ｐＨ７．２のリン
酸ナトリウム約１０ｍＭ、ＥＤＴＡ約５ｍＭ、Ｎ−ｐ−
トルエンスルホニル−Ｌ−フェニルアラニン−クロロメ
チル−ケトン（ＴＰＣＫ）約１０．６μｇ／ｍｌ、ペプ
スタチンＡ約３４．３μｇ／ｍｌ、フェニルメチルスル
ホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）約８７μｇ／ｍｌ、ウシ
膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）約１５μｇ／
ｍｌ及びロイペプチン約２５．２μｇ／ｍｌを含有する
破壊用緩衝液に再懸濁される。細胞は直ちに破壊される
か、又は−７０℃で凍結保存されて約１２，０００ｐｓ
ｉ（約８４０ｋｇ／ｃｍ3 ）約４℃のフレンチプレスセ
ルに約３回通して解凍後直ちに破壊される。上澄液は遠
心分離によって回収される。
エキス約０．５％、ＮａＣｌ約０．５％、グルコース約
０．４％及びアンピシリン約５０μｇ／ｍｌからなる適
当な増殖培地中約３７℃で増殖せしめられる。５５０ｎ
ｍにおける光学濃度が約０．５に達したときに、イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
が最終濃度約１ｍＭになるまで加えられてもよく、培養
は約３７℃で約３時間続けられる。培地１リットルから
細胞が遠心分離によって回収され、約ｐＨ７．２のリン
酸ナトリウム約１０ｍＭ、ＥＤＴＡ約５ｍＭ、Ｎ−ｐ−
トルエンスルホニル−Ｌ−フェニルアラニン−クロロメ
チル−ケトン（ＴＰＣＫ）約１０．６μｇ／ｍｌ、ペプ
スタチンＡ約３４．３μｇ／ｍｌ、フェニルメチルスル
ホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）約８７μｇ／ｍｌ、ウシ
膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）約１５μｇ／
ｍｌ及びロイペプチン約２５．２μｇ／ｍｌを含有する
破壊用緩衝液に再懸濁される。細胞は直ちに破壊される
か、又は−７０℃で凍結保存されて約１２，０００ｐｓ
ｉ（約８４０ｋｇ／ｃｍ3 ）約４℃のフレンチプレスセ
ルに約３回通して解凍後直ちに破壊される。上澄液は遠
心分離によって回収される。
【００２８】組換えａＦＧＦは、ヘパリン−セファロー
スアフィニティクロマトグラフィー次いで逆相高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を併用する独特な２工
程クロマトグラフィー操作によって、均一になるまで精
製される。粗製ｒ−ａＦＧＦは、約ｐＨ６〜８の約１０
ｍＭリン酸又はトリスのような希緩衝液が入ったヘパリ
ンセファロースカラムに供され、次いで２８０ｎｍの吸
光度がほぼバックグランドに低下するまで約０．８ＭＮ
ａＣｌのような低濃度塩で洗浄される。ｒ−ａＦＧＦは
ＮａＣｌ約１．５Ｍを含有する約ｐＨ６〜８の約１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム又はトリスのような高塩濃度緩衝液
で溶離せしめられる。溶離物は次いで３〜１８個の炭素
原子、好ましくは４個の炭素原子を有するアルキル基を
もつ共有結合アルキルシラン鎖からなる樹脂の逆相ＨＰ
ＬＣによって精製される。ｒ−ａＦＧＦは、約１０ｍＭ
のトリフルオロ酢酸、酢酸又はリン酸のような希酸で平
衡化されたＨＰＬＣカラムに直接供され、アセトニトリ
ル又はエタノールのような有機溶媒の直線的勾配により
溶離される。ウシ脳由来ａＦＧＦは、多段階精製プロト
コールの一部として、マシアグ（Ｍａｃｉａｇ）ら，サ
イエンス，第２２５巻，第９３２−９３５頁，１９８４
年によりヘパリン−セファロース双方に及びハーマス
ら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス ＵＳＡ，第８１巻，第３５７−３
６１頁，１９８４年により逆相ＨＰＬＣカラムに結合す
ることがすでに明らかにされていた。細胞溶離物中で比
較的豊富にｒ−ａＦＧＦが存在するということにある程
度基づけば、これら２工程のみでポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動から確認されるように約１６，０００ドルト
ンの均一で純粋なｒ−ａＦＧＦを得るために十分である
ことが証明される。しかしながら、これら２工程のみで
は脳から純粋なａＦＧＦを得ることはできない。
スアフィニティクロマトグラフィー次いで逆相高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を併用する独特な２工
程クロマトグラフィー操作によって、均一になるまで精
製される。粗製ｒ−ａＦＧＦは、約ｐＨ６〜８の約１０
ｍＭリン酸又はトリスのような希緩衝液が入ったヘパリ
ンセファロースカラムに供され、次いで２８０ｎｍの吸
光度がほぼバックグランドに低下するまで約０．８ＭＮ
ａＣｌのような低濃度塩で洗浄される。ｒ−ａＦＧＦは
ＮａＣｌ約１．５Ｍを含有する約ｐＨ６〜８の約１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム又はトリスのような高塩濃度緩衝液
で溶離せしめられる。溶離物は次いで３〜１８個の炭素
原子、好ましくは４個の炭素原子を有するアルキル基を
もつ共有結合アルキルシラン鎖からなる樹脂の逆相ＨＰ
ＬＣによって精製される。ｒ−ａＦＧＦは、約１０ｍＭ
のトリフルオロ酢酸、酢酸又はリン酸のような希酸で平
衡化されたＨＰＬＣカラムに直接供され、アセトニトリ
ル又はエタノールのような有機溶媒の直線的勾配により
溶離される。ウシ脳由来ａＦＧＦは、多段階精製プロト
コールの一部として、マシアグ（Ｍａｃｉａｇ）ら，サ
イエンス，第２２５巻，第９３２−９３５頁，１９８４
年によりヘパリン−セファロース双方に及びハーマス
ら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス ＵＳＡ，第８１巻，第３５７−３
６１頁，１９８４年により逆相ＨＰＬＣカラムに結合す
ることがすでに明らかにされていた。細胞溶離物中で比
較的豊富にｒ−ａＦＧＦが存在するということにある程
度基づけば、これら２工程のみでポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動から確認されるように約１６，０００ドルト
ンの均一で純粋なｒ−ａＦＧＦを得るために十分である
ことが証明される。しかしながら、これら２工程のみで
は脳から純粋なａＦＧＦを得ることはできない。
【００２９】純粋なａＦＧＦのマイトジェン活性は、細
胞系繊維芽細胞、好ましくはＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３ Ａ
３１〔米国型培養寄託機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）〕における
ＤＮＡ中への 3Ｈ−チミジンの取込み量から調べられ
る。組換えａＦＧＦは、繊維芽細胞刺激アッセイにおい
て、タンパク質約１ｎｇ／ｍｌ以下で最大の応答性を示
す。
胞系繊維芽細胞、好ましくはＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３ Ａ
３１〔米国型培養寄託機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）〕における
ＤＮＡ中への 3Ｈ−チミジンの取込み量から調べられ
る。組換えａＦＧＦは、繊維芽細胞刺激アッセイにおい
て、タンパク質約１ｎｇ／ｍｌ以下で最大の応答性を示
す。
【００３０】本発明のもう１つの態様は、本発明の約１
〜約５００μｇ／ｃｍ2 の新規ペプチドを創傷表面に局
所適用表面当たり約０．１〜１００μｇ／ｃｍ2 の量
で、ヘパリンと併用して又は併用しないで、好ましくは
ヘパリンと併用して創傷時に局所又は皮下投与すること
による、創傷治癒促進方法である。適用に際しては、様
々な処方剤、例えば軟膏、ペースト、溶液、ゲル、固体
水溶性ポリマー、例えばアルブミン、ゼラチン、ヒドロ
キシプロピルセルロース、プルロニック、テトロニック
又はアルギネートが使用されるが、それらの中に活性成
分は約１〜約１００μｇ／ｍｌの量で含有される。
〜約５００μｇ／ｃｍ2 の新規ペプチドを創傷表面に局
所適用表面当たり約０．１〜１００μｇ／ｃｍ2 の量
で、ヘパリンと併用して又は併用しないで、好ましくは
ヘパリンと併用して創傷時に局所又は皮下投与すること
による、創傷治癒促進方法である。適用に際しては、様
々な処方剤、例えば軟膏、ペースト、溶液、ゲル、固体
水溶性ポリマー、例えばアルブミン、ゼラチン、ヒドロ
キシプロピルセルロース、プルロニック、テトロニック
又はアルギネートが使用されるが、それらの中に活性成
分は約１〜約１００μｇ／ｍｌの量で含有される。
【００３１】繊維芽細胞、脈管系及び角膜系内皮細胞等
をはじめとする様々な細胞型において分裂を促進するａ
ＦＧＦ活性は、これらのペプチド類を薬剤として使用す
ることを可能ならしめる。これらの化合物は、創傷治療
を要する患者に新規ｒ−ａＦＧＦを投与することによ
り、ヒトを含む哺乳動物の創傷治療のために使用するこ
とができる。下記実施例は本発明を説明するものである
が、しかしながらそれ自体に限定されるわけではない。
をはじめとする様々な細胞型において分裂を促進するａ
ＦＧＦ活性は、これらのペプチド類を薬剤として使用す
ることを可能ならしめる。これらの化合物は、創傷治療
を要する患者に新規ｒ−ａＦＧＦを投与することによ
り、ヒトを含む哺乳動物の創傷治療のために使用するこ
とができる。下記実施例は本発明を説明するものである
が、しかしながらそれ自体に限定されるわけではない。
【００３２】
実施例１オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチドを、マチューシ及びカルザース、ジ
ャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテー、
第１０３巻，第３１８５−３１９１頁，１９８１年（Ｍ
ａｔｔｅｕｃｃｉ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ１０３：３１８５−３１９１（１９
８１））；ビューケージ及びカルザース，テトラヘドロ
ン・レターズ，第２２巻，第１８５９−１８６２頁，１
９８１年〔Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅ
ｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ２２：
１８５９−１８６２（１９８１）〕に記載された方法に
従い合成した。合成オリゴヌクレオチドの塩基配列は表
４に示されている。
ャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテー、
第１０３巻，第３１８５−３１９１頁，１９８１年（Ｍ
ａｔｔｅｕｃｃｉ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ１０３：３１８５−３１９１（１９
８１））；ビューケージ及びカルザース，テトラヘドロ
ン・レターズ，第２２巻，第１８５９−１８６２頁，１
９８１年〔Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅ
ｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ２２：
１８５９−１８６２（１９８１）〕に記載された方法に
従い合成した。合成オリゴヌクレオチドの塩基配列は表
４に示されている。
【００３３】実施例２ａＦＧＦ遺伝子のアセンブリー 実施例１のオリゴヌクレオチドをＮ末端側の半分（２３
１ｂｐ）及びＣ末端側の半分（２０９ｂｐ）の２つの分
離単位としてアセンブリーした。次いで、この２つの半
分を完全合成遺伝子とするために結合した。表３参照。
最初にオリゴヌクレオチドを次の反応混合物中でキナー
ゼ処理した：ｐＨ７．６のトリス７０ｍＭ、ＤＴＴ５ｍ
Ｍ、ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＡＴＰ３３μＭ、Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ０．３単位／μｌ及びオリゴヌクレ
オチド２．５ｐｍｏｌ／μｌ。混合物を３７℃で１．５
時間インキュベートし、次いでキナーゼ０．２単位／μ
ｌ及び濃度１００ｍＭとなるまでのＡＴＰを混合物に加
えた後、更に１時間インキュベートした。放射線標識す
るため、最初の混合物は〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰ３７ｎＣ
ｉ／μｌを含有していた。
１ｂｐ）及びＣ末端側の半分（２０９ｂｐ）の２つの分
離単位としてアセンブリーした。次いで、この２つの半
分を完全合成遺伝子とするために結合した。表３参照。
最初にオリゴヌクレオチドを次の反応混合物中でキナー
ゼ処理した：ｐＨ７．６のトリス７０ｍＭ、ＤＴＴ５ｍ
Ｍ、ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＡＴＰ３３μＭ、Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ０．３単位／μｌ及びオリゴヌクレ
オチド２．５ｐｍｏｌ／μｌ。混合物を３７℃で１．５
時間インキュベートし、次いでキナーゼ０．２単位／μ
ｌ及び濃度１００ｍＭとなるまでのＡＴＰを混合物に加
えた後、更に１時間インキュベートした。放射線標識す
るため、最初の混合物は〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰ３７ｎＣ
ｉ／μｌを含有していた。
【００３４】アニーリング及び結合は２つの別々の反応
で行なった。各反応において、８つのオリゴヌクレオチ
ドを各々１００ｐｍｏｌ加えた。１つの反応において、
Ｃ末端側又はＮ末端側の半分の遺伝子の一方の鎖を構成
するオリゴヌクレオチドを、最も５′側のオリゴヌクレ
オチドを除き、キナーゼで処理した。第２の反応におい
て、反対鎖を構成するオリゴヌクレオチドを、同じく最
も５′側のオリゴヌクレオチドを除き、キナーゼで処理
した。各反応において３つのオリゴヌクレオチドはリン
酸化されたが、５つはリン酸化されなかった。キナーゼ
処理オリゴヌクレオチドを使用する場合には、32Ｐ−標
識オリゴヌクレオチド１ｐｍｏｌを後における生成物の
確認のために加えた。各反応液は、ｐＨ７．６のトリス
７０ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ及びＡＴ
Ｐ３０μＭを含有した２００μｌの液体であった。オリ
ゴヌクレオチドを９０℃で４分間加熱し、次いで直ちに
反応液を６０℃に下げ、更に３０℃まで徐々に冷却する
ことによってアニーリングした。結合は、ｐＨ７．６の
トリス６０ｍＭ、ＤＴＴ１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １０ｍ
Ｍ、ＡＴＰ１ｍＭ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ０．０３単位
／μｌを含有した４００μｌ中において２０℃で１．５
時間インキュベートすることにより行なった。
で行なった。各反応において、８つのオリゴヌクレオチ
ドを各々１００ｐｍｏｌ加えた。１つの反応において、
Ｃ末端側又はＮ末端側の半分の遺伝子の一方の鎖を構成
するオリゴヌクレオチドを、最も５′側のオリゴヌクレ
オチドを除き、キナーゼで処理した。第２の反応におい
て、反対鎖を構成するオリゴヌクレオチドを、同じく最
も５′側のオリゴヌクレオチドを除き、キナーゼで処理
した。各反応において３つのオリゴヌクレオチドはリン
酸化されたが、５つはリン酸化されなかった。キナーゼ
処理オリゴヌクレオチドを使用する場合には、32Ｐ−標
識オリゴヌクレオチド１ｐｍｏｌを後における生成物の
確認のために加えた。各反応液は、ｐＨ７．６のトリス
７０ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ及びＡＴ
Ｐ３０μＭを含有した２００μｌの液体であった。オリ
ゴヌクレオチドを９０℃で４分間加熱し、次いで直ちに
反応液を６０℃に下げ、更に３０℃まで徐々に冷却する
ことによってアニーリングした。結合は、ｐＨ７．６の
トリス６０ｍＭ、ＤＴＴ１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １０ｍ
Ｍ、ＡＴＰ１ｍＭ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ０．０３単位
／μｌを含有した４００μｌ中において２０℃で１．５
時間インキュベートすることにより行なった。
【００３５】ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、
結合したオリゴヌクレオチドを精製した。結合したオリ
ゴヌクレオチドをエタノールで沈降させ、８０％ホルム
アミド、ｐＨ８．３のトリスホウ酸塩５０ｍＭ、ＥＤＴ
Ａ１ｍＭ、０．１％（ｗ／ｖ）キシレンシアノール及び
０．１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーの２０μｌ
中に再溶解させた。各サンプルを９０℃で３分間加熱
し、７５ワットで５時間１０％尿素−ポリアクリルアミ
ドゲル中で電気泳動にかけた。オリゴヌクレオチドバン
ドは、ゲルをＸ線フィルムに露出することにより視覚化
させた。Ｎ末端側のための各反応における２３１塩基バ
ンドをゲルから取出し、一つにまとめ、ｐＨ８の酢酸ア
ンモニウム０．５Ｍ、ＥＤＴＡ１ｍＭの１ｍｌで４℃に
て溶離させた。溶離されたＤＮＡをエタノールで沈降さ
せ、ｐＨ７．６のトリス７０ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ及びＭ
ｇＣｌ2 １０ｍＭの３０μｌに再溶解した。Ｃ末端側の
２０９塩基バンドも同様に溶離させた。
結合したオリゴヌクレオチドを精製した。結合したオリ
ゴヌクレオチドをエタノールで沈降させ、８０％ホルム
アミド、ｐＨ８．３のトリスホウ酸塩５０ｍＭ、ＥＤＴ
Ａ１ｍＭ、０．１％（ｗ／ｖ）キシレンシアノール及び
０．１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーの２０μｌ
中に再溶解させた。各サンプルを９０℃で３分間加熱
し、７５ワットで５時間１０％尿素−ポリアクリルアミ
ドゲル中で電気泳動にかけた。オリゴヌクレオチドバン
ドは、ゲルをＸ線フィルムに露出することにより視覚化
させた。Ｎ末端側のための各反応における２３１塩基バ
ンドをゲルから取出し、一つにまとめ、ｐＨ８の酢酸ア
ンモニウム０．５Ｍ、ＥＤＴＡ１ｍＭの１ｍｌで４℃に
て溶離させた。溶離されたＤＮＡをエタノールで沈降さ
せ、ｐＨ７．６のトリス７０ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ及びＭ
ｇＣｌ2 １０ｍＭの３０μｌに再溶解した。Ｃ末端側の
２０９塩基バンドも同様に溶離させた。
【００３６】ゲル精製オリゴヌクレオチドを形質転換前
に４分間かけて９０℃まで加熱し、２０℃まで徐々に冷
却することによりアニーリングした。最初の出発オリゴ
ヌクレオチドからの回収率を５％と仮定し、アニーリン
グされて回収された２３１ｂｐオリゴヌクレオチドの３
００ｆｍｏｌ及び１００ｆｍｏｌをそれぞれ、ｐＨ７．
８のトリス２５ｍＭ、ＤＴＴ１ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １０ｍ
Ｍ、ＡＴＰ０．４ｍＭ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位の
２０μｌ中２０℃で１時間かけてアガロースゲル精製さ
れた３．９ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ、ｐＢＲ３２２
ＤＮＡ断片１００ｆｍｏｌに結合させた。アニーリング
された２０９ｂｐオリゴヌクレオチドも２３１塩基対断
片の場合と同様の条件下で、アガロース精製された３．
９ｋｂＢａｍＨＩ−ＳａｌｐＢＲ３２２ＤＮＡ断片に結
合させた。結合反応液を水で１：５に希釈し、希釈液１
μｌを用いて供給者の指示に従いコンピテント大腸菌Ｒ
Ｒ１細胞（ＢＲＬ）２０μｌを形質転換させた。形質転
換株をアンピシリン中での増殖性に基づき選択し、ミニ
ライゼイトプラスミド調製物の制限分析により、２３１
ｂｐＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ１又は２０９ｂｐＢａｍＨ１
−ＳａｌＩ挿入物の存在に関してスクリーニングする。
に４分間かけて９０℃まで加熱し、２０℃まで徐々に冷
却することによりアニーリングした。最初の出発オリゴ
ヌクレオチドからの回収率を５％と仮定し、アニーリン
グされて回収された２３１ｂｐオリゴヌクレオチドの３
００ｆｍｏｌ及び１００ｆｍｏｌをそれぞれ、ｐＨ７．
８のトリス２５ｍＭ、ＤＴＴ１ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １０ｍ
Ｍ、ＡＴＰ０．４ｍＭ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位の
２０μｌ中２０℃で１時間かけてアガロースゲル精製さ
れた３．９ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ、ｐＢＲ３２２
ＤＮＡ断片１００ｆｍｏｌに結合させた。アニーリング
された２０９ｂｐオリゴヌクレオチドも２３１塩基対断
片の場合と同様の条件下で、アガロース精製された３．
９ｋｂＢａｍＨＩ−ＳａｌｐＢＲ３２２ＤＮＡ断片に結
合させた。結合反応液を水で１：５に希釈し、希釈液１
μｌを用いて供給者の指示に従いコンピテント大腸菌Ｒ
Ｒ１細胞（ＢＲＬ）２０μｌを形質転換させた。形質転
換株をアンピシリン中での増殖性に基づき選択し、ミニ
ライゼイトプラスミド調製物の制限分析により、２３１
ｂｐＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ１又は２０９ｂｐＢａｍＨ１
−ＳａｌＩ挿入物の存在に関してスクリーニングする。
【００３７】適当な大きさの挿入物を有するクローンの
ＤＮＡ配列は、マキサム及びギルバート、プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
スＵＳＡ，第７４巻，第５６０−５６４頁，１９７７年
の化学的ＤＮＡ配列法により決定した。いずれの２３１
ｂｐクローンも正しい配列を有していなかったため、正
しい配列を有するクローンを次のようにして得た。Ｋｐ
ｎＩ及びＢａｍＨＩ部位間で正しい配列をもつ１つのク
ローンを、ＫｐｎＩ及び、ｐＢＲ３２２ベクターを切断
するＳａｌＩにより切断した。４００ｂｐバンドをゲル
精製し、ａＦＧＦ遺伝子挿入物がＥｃｏＲＩ部位からＫ
ｐｎＩ部位までは正しい配列を有する第２のクローンの
３．８ｋｂＫｐｎＩ−ＳａｌＩバンドに結合させた。形
質転換後、望ましい配列が得られていることを確認する
ために、得られたクローンを配列決定した。正しい２０
９ｂｐ配列を有するクローンは１コ得られたことから、
これらクローンを更に操作することは不要であった。完
全鎖長を有する最終ａＦＧＦ合成遺伝子は、Ｎ末端側の
半分のクローンをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し、ア
ルカリホスファターゼで処理し、かつこれをＣ末端側の
半分のクローンのゲル精製２０９ｂｐＢａｍＨＩ−Ｓａ
ｌＩ挿入物に結合させることにより複製した。この結合
せしめられた物質は、前記のようにコンピテントＲＲ１
細胞を形質転換させるために用いた。
ＤＮＡ配列は、マキサム及びギルバート、プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
スＵＳＡ，第７４巻，第５６０−５６４頁，１９７７年
の化学的ＤＮＡ配列法により決定した。いずれの２３１
ｂｐクローンも正しい配列を有していなかったため、正
しい配列を有するクローンを次のようにして得た。Ｋｐ
ｎＩ及びＢａｍＨＩ部位間で正しい配列をもつ１つのク
ローンを、ＫｐｎＩ及び、ｐＢＲ３２２ベクターを切断
するＳａｌＩにより切断した。４００ｂｐバンドをゲル
精製し、ａＦＧＦ遺伝子挿入物がＥｃｏＲＩ部位からＫ
ｐｎＩ部位までは正しい配列を有する第２のクローンの
３．８ｋｂＫｐｎＩ−ＳａｌＩバンドに結合させた。形
質転換後、望ましい配列が得られていることを確認する
ために、得られたクローンを配列決定した。正しい２０
９ｂｐ配列を有するクローンは１コ得られたことから、
これらクローンを更に操作することは不要であった。完
全鎖長を有する最終ａＦＧＦ合成遺伝子は、Ｎ末端側の
半分のクローンをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し、ア
ルカリホスファターゼで処理し、かつこれをＣ末端側の
半分のクローンのゲル精製２０９ｂｐＢａｍＨＩ−Ｓａ
ｌＩ挿入物に結合させることにより複製した。この結合
せしめられた物質は、前記のようにコンピテントＲＲ１
細胞を形質転換させるために用いた。
【００３８】実施例３合成ウシａＦＧＦ遺伝子の発現 実施例２の完全ａＦＧＦ遺伝子を修正ｐＫＫ２２３−３
プラスミドに組込んだ。ｐＫＫ２２３−３プラスミド
（ファルマシア）は、ｔｒｐプロモーター及びｌａｃプ
ロモーターの領域間のハイブリッドであるｔａｃプロモ
ーターを有する〔デボアら、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ，
第８０巻，第２１−２５頁，１９８３年〕。このプラス
ミドはまた、強いプロモーターからの発現を可能にする
ことが判明した強いターミネーター配列であるｒｒｎＢ
ｒＲＮＡ転写ターミネーターも有している〔ゲンズ
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７８巻，第４９３６−４
９４０頁，１９８１年；ブロシウス，ジーン，第２７
巻，第１６１−１７２頁，１９８４年〕。ｐＫＫ２２３
−３プラスミドを修正して、ｐＢＲ３２２由来ＳａｌＩ
制限酵素部位を取除いた。これは、ｐＫＫ２２３−３プ
ラスミドＤＮＡをＮｄｅＩ及びＮａｒＩで切断し、クロ
ーンｐＫＫ２．７を得るために２．７ｋｂＤＮＡ断片を
再環化することにより行なった。次いで合成ａＦＧＦ遺
伝子をそのｐＢＲ３２２ベクターから切除し、この発現
ベクターをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで制限した後ｐＫＫ
２．７に組込んだ。この構造体は、シャイン−ダルガー
ノＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）リボソーム結合部位
の１１塩基下流に合成遺伝子の開始メチオニンを有して
いる。図１に示されている得られた組換え体を大腸菌Ｊ
Ｍ１０５細胞及び大腸菌ＤＨ５細胞に組込んで形質転換
させた。
プラスミドに組込んだ。ｐＫＫ２２３−３プラスミド
（ファルマシア）は、ｔｒｐプロモーター及びｌａｃプ
ロモーターの領域間のハイブリッドであるｔａｃプロモ
ーターを有する〔デボアら、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ，
第８０巻，第２１−２５頁，１９８３年〕。このプラス
ミドはまた、強いプロモーターからの発現を可能にする
ことが判明した強いターミネーター配列であるｒｒｎＢ
ｒＲＮＡ転写ターミネーターも有している〔ゲンズ
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７８巻，第４９３６−４
９４０頁，１９８１年；ブロシウス，ジーン，第２７
巻，第１６１−１７２頁，１９８４年〕。ｐＫＫ２２３
−３プラスミドを修正して、ｐＢＲ３２２由来ＳａｌＩ
制限酵素部位を取除いた。これは、ｐＫＫ２２３−３プ
ラスミドＤＮＡをＮｄｅＩ及びＮａｒＩで切断し、クロ
ーンｐＫＫ２．７を得るために２．７ｋｂＤＮＡ断片を
再環化することにより行なった。次いで合成ａＦＧＦ遺
伝子をそのｐＢＲ３２２ベクターから切除し、この発現
ベクターをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで制限した後ｐＫＫ
２．７に組込んだ。この構造体は、シャイン−ダルガー
ノＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）リボソーム結合部位
の１１塩基下流に合成遺伝子の開始メチオニンを有して
いる。図１に示されている得られた組換え体を大腸菌Ｊ
Ｍ１０５細胞及び大腸菌ＤＨ５細胞に組込んで形質転換
させた。
【００３９】発現クローンは０．４％グルコース及びア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有のＬＢブイヨン（１％ト
リプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）中
３７℃で培養した。５５０ｎｍにおける光学濃度が０．
５に達したときに、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるまで加え、
培養を３７℃で３時間続けた。細胞を１０，０００ｘｇ
で２０分間の遠心分離により回収し、培養液１リットル
から得た細胞をｐＨ７．２のリン酸ナトリウム１０ｍ
Ｍ、（ヘパリン−セファロース緩衝液）ＥＤＴＡ５ｍ
Ｍ、ＴＰＣＫ１０．６μｇ／ｍｌ、ペプスタチンＡ３
４．３μｇ／ｍｌ、ＰＭＳＦ８７μｇ／ｍｌ、ＢＰＴＩ
１５μｇ／ｍｌ及びロイペプチン３４．３μｇ／ｍｌの
２０ｍｌ中に再懸濁した。再懸濁された細胞をドライア
イス／エタノール浴中で急速に凍結させ、−７０℃で一
夜保存した。
ンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有のＬＢブイヨン（１％ト
リプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）中
３７℃で培養した。５５０ｎｍにおける光学濃度が０．
５に達したときに、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるまで加え、
培養を３７℃で３時間続けた。細胞を１０，０００ｘｇ
で２０分間の遠心分離により回収し、培養液１リットル
から得た細胞をｐＨ７．２のリン酸ナトリウム１０ｍ
Ｍ、（ヘパリン−セファロース緩衝液）ＥＤＴＡ５ｍ
Ｍ、ＴＰＣＫ１０．６μｇ／ｍｌ、ペプスタチンＡ３
４．３μｇ／ｍｌ、ＰＭＳＦ８７μｇ／ｍｌ、ＢＰＴＩ
１５μｇ／ｍｌ及びロイペプチン３４．３μｇ／ｍｌの
２０ｍｌ中に再懸濁した。再懸濁された細胞をドライア
イス／エタノール浴中で急速に凍結させ、−７０℃で一
夜保存した。
【００４０】実施例４組換えａＦＧＦの抽出及び精製 実施例３の凍結細胞を解凍し、更にＰＭＳＦ８７μｇ／
ｍｌを加え、調製物を１２，０００ｐｓｉ（約８４０ｋ
ｇ／ｃｍ2 ）約４℃で３回フレンチプレスセルに通し
た。得られた溶離物を９３，０００ｘｇで３０分間遠心
分離し、細胞破壊物を除去した。上澄を回収し、１Ｍ
ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整し、１．６×１０ｃｍヘパ
リン−セファロース（ファルマシア）カラムに供し、４
℃において流速２０ｍｌ／ｈｒで操作し、２ｍｌ分画を
集めた。ペレットをｐＨ７．２のリン酸ナトリウム１０
ｍＭ、ＮａＣｌ２Ｍの５ｍｌに再懸濁し、９３，０００
ｘｇで３０分間再遠心分離し、上澄をｐＨ７．２のリン
酸ナトリウム１０ｍＭの３倍容量で希釈し、必要であれ
ば１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．２に再調製し、同様のヘパ
リン−セファロースカラムに供した。
ｍｌを加え、調製物を１２，０００ｐｓｉ（約８４０ｋ
ｇ／ｃｍ2 ）約４℃で３回フレンチプレスセルに通し
た。得られた溶離物を９３，０００ｘｇで３０分間遠心
分離し、細胞破壊物を除去した。上澄を回収し、１Ｍ
ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整し、１．６×１０ｃｍヘパ
リン−セファロース（ファルマシア）カラムに供し、４
℃において流速２０ｍｌ／ｈｒで操作し、２ｍｌ分画を
集めた。ペレットをｐＨ７．２のリン酸ナトリウム１０
ｍＭ、ＮａＣｌ２Ｍの５ｍｌに再懸濁し、９３，０００
ｘｇで３０分間再遠心分離し、上澄をｐＨ７．２のリン
酸ナトリウム１０ｍＭの３倍容量で希釈し、必要であれ
ば１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．２に再調製し、同様のヘパ
リン−セファロースカラムに供した。
【００４１】充填後、２８０ｎｍの吸光度がバックグラ
ンドに低下するまでｐＨ７．２のリン酸ナトリウム１０
ｍＭ、ＮａＣｌ０．８Ｍで洗浄した。結合したｒ−ａＦ
ＧＦをｐＨ７．２のリン酸ナトリウム１０ｍＭ、ＮａＣ
ｌ１．５Ｍにより単一ピークとして溶離させた。ヘパリ
ン−セファロースカラムからプールされた分画は、トー
マスら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ，第８１巻，第３５７
−３６１頁，１９８４年に記載されているように４．６
ｍｍ×２５ｃｍＣ4 カラム〔セパレーショングループ
（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）〕を用いて逆
相ＨＰＬＣにより精製した。ｒ−ａＦＧＦは多数の小さ
な汚染ピークから離れた単一の大きなピークとして溶出
したことから、このことはタンパク質が均一的に純粋で
あることを示唆している。ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により、純粋であることを確認した。精製されたｒ
−ａＦＧＦをオーフエレル，ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー，第２５０巻，第４００７−４
０２１頁，１９７５年。０′Ｆａｒｒｅｌｌ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ２５０：４００７−４０２１（１９７５）〕の方法
に従い電気泳動に供した。銀染色では分子量１６，００
０ドルトンの単一バンドを示した。ａＦＧＦとしてのタ
ンパク質の同一性は、アミノ酸分析及びアミノ末端配列
決定によって確認された。
ンドに低下するまでｐＨ７．２のリン酸ナトリウム１０
ｍＭ、ＮａＣｌ０．８Ｍで洗浄した。結合したｒ−ａＦ
ＧＦをｐＨ７．２のリン酸ナトリウム１０ｍＭ、ＮａＣ
ｌ１．５Ｍにより単一ピークとして溶離させた。ヘパリ
ン−セファロースカラムからプールされた分画は、トー
マスら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ，第８１巻，第３５７
−３６１頁，１９８４年に記載されているように４．６
ｍｍ×２５ｃｍＣ4 カラム〔セパレーショングループ
（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）〕を用いて逆
相ＨＰＬＣにより精製した。ｒ−ａＦＧＦは多数の小さ
な汚染ピークから離れた単一の大きなピークとして溶出
したことから、このことはタンパク質が均一的に純粋で
あることを示唆している。ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により、純粋であることを確認した。精製されたｒ
−ａＦＧＦをオーフエレル，ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー，第２５０巻，第４００７−４
０２１頁，１９７５年。０′Ｆａｒｒｅｌｌ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ２５０：４００７−４０２１（１９７５）〕の方法
に従い電気泳動に供した。銀染色では分子量１６，００
０ドルトンの単一バンドを示した。ａＦＧＦとしてのタ
ンパク質の同一性は、アミノ酸分析及びアミノ末端配列
決定によって確認された。
【００４２】実施例５ウシ組換えａＦＧＦの生物学的活性 実施例４で精製されたｒ−ａＦＧＦの生物学的活性は、
トーマスら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー，第２２５巻，第５５１７−５５２０頁，１９
８０年に記載された繊維芽細胞マイトジェンアッセイに
より評価した。ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３ Ａ３１繊維芽細胞
（米国型培養寄託機関）を１０％熱不活化子牛血清含有
培地中３５ｍｍ直径ウエル当たり２×１０4 細胞で培養
し、７％ＣＯ2 中でインキュベートした（ｐＨ７．３５
±０．０５）。細胞は、培地を６時間後及び再度２４時
間後に０．５％熱不活化子牛血清と交換することによ
り、完全に静止状態に入った。培養５５時間目に、ヘパ
リン５０μｇ、試験サンプル及びデキサメタゾン１．１
μｇを加え、７０時間目に各ウエルに２μＣｉ〔メチル
− 3Ｈ〕−チミジン〔２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ニューイン
グランドヌクレア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌ
ｅａｒ）〕及び末標識チミジン〔シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ）〕３μｇを加え、９５時間目にＤＮＡ中に取込まれ
た放射線標識量を調べるためにプロセッシングした。各
々の用量応答値は試験３回の平均であった。結果は下記
表に示されている：
トーマスら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー，第２２５巻，第５５１７−５５２０頁，１９
８０年に記載された繊維芽細胞マイトジェンアッセイに
より評価した。ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３ Ａ３１繊維芽細胞
（米国型培養寄託機関）を１０％熱不活化子牛血清含有
培地中３５ｍｍ直径ウエル当たり２×１０4 細胞で培養
し、７％ＣＯ2 中でインキュベートした（ｐＨ７．３５
±０．０５）。細胞は、培地を６時間後及び再度２４時
間後に０．５％熱不活化子牛血清と交換することによ
り、完全に静止状態に入った。培養５５時間目に、ヘパ
リン５０μｇ、試験サンプル及びデキサメタゾン１．１
μｇを加え、７０時間目に各ウエルに２μＣｉ〔メチル
− 3Ｈ〕−チミジン〔２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ニューイン
グランドヌクレア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌ
ｅａｒ）〕及び末標識チミジン〔シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ）〕３μｇを加え、９５時間目にＤＮＡ中に取込まれ
た放射線標識量を調べるためにプロセッシングした。各
々の用量応答値は試験３回の平均であった。結果は下記
表に示されている：
【表１０】
【００４３】組換えａＦＧＦの活性は、脳由来ａＦＧＦ
の活性と同等であるか又はそれよりもやや高い。精製ｒ
−ａＦＧＦは約７１ｐｇ／ｍｌにおいて１／２最大ＤＮ
Ａ合成促進値を示したが、精製脳由来ａＦＧＦは１／２
最大値が１２６ｐｇ／ｍｌであった。
の活性と同等であるか又はそれよりもやや高い。精製ｒ
−ａＦＧＦは約７１ｐｇ／ｍｌにおいて１／２最大ＤＮ
Ａ合成促進値を示したが、精製脳由来ａＦＧＦは１／２
最大値が１２６ｐｇ／ｍｌであった。
【００４４】実施例６ウシａＦＧＦ遺伝子からヒトａＦＧＦ遺伝子への変異 ウシａＦＧＦ遺伝子の変異を促進させるために、実施例
２の合成遺伝子を一本鎖ＤＮＡバクテリオファージベク
ターＭ１３ｍｐ１９に組込んだ。ゾラー及びスミス，メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー，第１００巻，第４６
８−５００頁，１９８３年；ノリスら，ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ，第１１巻，第５１０３−５１１２
頁；ゾラー及びスミス，ＤＮＡ，第３巻，第４７９−４
８８頁に報告された標準的変異誘発操作を利用した。ウ
シｐＫＫ−ａＦＧＦプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＳａｌ
Ｉで切断し（表３参照）、得られる４４０ｂｐ断片を実
施例２と同様にアガロースゲル精製した。
２の合成遺伝子を一本鎖ＤＮＡバクテリオファージベク
ターＭ１３ｍｐ１９に組込んだ。ゾラー及びスミス，メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー，第１００巻，第４６
８−５００頁，１９８３年；ノリスら，ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ，第１１巻，第５１０３−５１１２
頁；ゾラー及びスミス，ＤＮＡ，第３巻，第４７９−４
８８頁に報告された標準的変異誘発操作を利用した。ウ
シｐＫＫ−ａＦＧＦプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＳａｌ
Ｉで切断し（表３参照）、得られる４４０ｂｐ断片を実
施例２と同様にアガロースゲル精製した。
【００４５】ベクターＭ１３ｍｐ１９ＲＫ ＤＮＡ（Ｂ
ＲＬ）を上と同じ２つのエンドヌクレアーゼで切断し、
しかる後末端を細菌アルカリホスファターゼ１００単位
含有のｐＨ８．０の１０ｍＭトリス緩衝液１００μｌ中
で脱ホスホリル化した。結合は、ｐＨ７．８のトリス２
５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＤＴＴ１ｍＭ、ＡＴＰ
０．４ｍＭ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位の１０μｌ中で
処理ベクターＤＮＡ５０ｎｇ及びａＦＧＦ遺伝子断片Ｄ
ＮＡ１２ｎｇを用い、４℃で１６時間かけて行なった。
反応混合物を水で１：５に希釈し、希釈液１μｌを用い
て供給者が述べるようにコンピテント大腸菌ＤＨ５細胞
（ＢＲＬ）２０μｌを形質転換した。細胞を０．０３％
Ｘ−ｇａｌ及び０．３ｍＭＩＰＴＧ中大腸菌ＪＭ１０５
（ファルマシア）宿主細胞と一緒に培養し、３７℃でイ
ンキュベート後、無色プラークを単離した。ウシａＦＧ
Ｆ遺伝子含有の１つのファージクローンＭ１３ｍｐ１９
−ａＦＧＦを選択した。
ＲＬ）を上と同じ２つのエンドヌクレアーゼで切断し、
しかる後末端を細菌アルカリホスファターゼ１００単位
含有のｐＨ８．０の１０ｍＭトリス緩衝液１００μｌ中
で脱ホスホリル化した。結合は、ｐＨ７．８のトリス２
５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＤＴＴ１ｍＭ、ＡＴＰ
０．４ｍＭ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位の１０μｌ中で
処理ベクターＤＮＡ５０ｎｇ及びａＦＧＦ遺伝子断片Ｄ
ＮＡ１２ｎｇを用い、４℃で１６時間かけて行なった。
反応混合物を水で１：５に希釈し、希釈液１μｌを用い
て供給者が述べるようにコンピテント大腸菌ＤＨ５細胞
（ＢＲＬ）２０μｌを形質転換した。細胞を０．０３％
Ｘ−ｇａｌ及び０．３ｍＭＩＰＴＧ中大腸菌ＪＭ１０５
（ファルマシア）宿主細胞と一緒に培養し、３７℃でイ
ンキュベート後、無色プラークを単離した。ウシａＦＧ
Ｆ遺伝子含有の１つのファージクローンＭ１３ｍｐ１９
−ａＦＧＦを選択した。
【００４６】８つのオリゴヌクレオチドがヒト配列を特
定化するようにデザインされ、これらを合成した（表６
参照）。オリゴマー８は、ウシ遺伝子における３８６位
のチミンがヒト遺伝子においてはシトシンで置き換えら
れた変異部分を有している。この変異によって、ヒトａ
ＦＧＦアミノ酸配列を変更せずに制限部位を組込むこと
が可能となる。
定化するようにデザインされ、これらを合成した（表６
参照）。オリゴマー８は、ウシ遺伝子における３８６位
のチミンがヒト遺伝子においてはシトシンで置き換えら
れた変異部分を有している。この変異によって、ヒトａ
ＦＧＦアミノ酸配列を変更せずに制限部位を組込むこと
が可能となる。
【００４７】ヒトオリゴマー１，２，３，４，６及び８
をリン酸化し、各々の１５ｐｍｏｌをそれぞれｐＨ７．
５のトリス２０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＮａＣｌ５
０ｍＭ、ＤＴＴ１ｍＭの１０μｌ中６５℃で１０分間次
いで２３℃で１０分間かけてＭ１３ｍｐ１９−ａＦＧＦ
一本鎖ファージＤＮＡ０．５ｐｍｏｌとアニーリングし
た。次いで環状二本鎖分子をｐＨ７．５のトリス２０ｍ
Ｍ、ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＮａＣｌ２５ｍＭ、ＤＴＴ
５．５ｍＭ、ＡＴＰ０．５ｍＭ、ｄＡＴＰ０．２５ｍ
Ｍ、ｄＣＴＰ０．２５ｍＭ、ｄＣＴＰ０．２５ｍＭ、ｄ
ＧＴＰ０．２５ｍＭ、ｄＴＴＰ０．２５ｍＭの２０μｌ
中、Ｔ４ＤＮＡリガーセ１単位及びＤＮＡポリメラーゼ
クレノウ断片２単位を用い、１５℃で１７時間インキュ
ベートすることにより製造した。調製物を各々用いてコ
ンピテントＪＭ１０５細胞を形質転換し、得られる形質
転換株プラークを32Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキ
ナーゼで標識された適当なオリゴマーとのハイブリッド
形成により選択した。ハイブリッド形成条件は、各々の
プローブが塩基１個が違えばハイブリッドを形成しない
ように最適化させた。一本鎖ＤＮＡをヒトオリゴマー４
変異体含有ファージクローンから単離し、上記操作をヒ
トオリゴマー５を用いて繰返して、オリゴマー４及び５
変異体双方を有するクローンを生成させた。
をリン酸化し、各々の１５ｐｍｏｌをそれぞれｐＨ７．
５のトリス２０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＮａＣｌ５
０ｍＭ、ＤＴＴ１ｍＭの１０μｌ中６５℃で１０分間次
いで２３℃で１０分間かけてＭ１３ｍｐ１９−ａＦＧＦ
一本鎖ファージＤＮＡ０．５ｐｍｏｌとアニーリングし
た。次いで環状二本鎖分子をｐＨ７．５のトリス２０ｍ
Ｍ、ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＮａＣｌ２５ｍＭ、ＤＴＴ
５．５ｍＭ、ＡＴＰ０．５ｍＭ、ｄＡＴＰ０．２５ｍ
Ｍ、ｄＣＴＰ０．２５ｍＭ、ｄＣＴＰ０．２５ｍＭ、ｄ
ＧＴＰ０．２５ｍＭ、ｄＴＴＰ０．２５ｍＭの２０μｌ
中、Ｔ４ＤＮＡリガーセ１単位及びＤＮＡポリメラーゼ
クレノウ断片２単位を用い、１５℃で１７時間インキュ
ベートすることにより製造した。調製物を各々用いてコ
ンピテントＪＭ１０５細胞を形質転換し、得られる形質
転換株プラークを32Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキ
ナーゼで標識された適当なオリゴマーとのハイブリッド
形成により選択した。ハイブリッド形成条件は、各々の
プローブが塩基１個が違えばハイブリッドを形成しない
ように最適化させた。一本鎖ＤＮＡをヒトオリゴマー４
変異体含有ファージクローンから単離し、上記操作をヒ
トオリゴマー５を用いて繰返して、オリゴマー４及び５
変異体双方を有するクローンを生成させた。
【００４８】下記方法において、これらＭ１３担持クロ
ーン（Ｍ１３−ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｅ）におけるウシ
配列からヒト配列への変異体を１つのｐＢＲ３２２担持
クローンに組込んで結合させた。ＲＦＤＮＡを、ヒトオ
リゴマー１，２，６及び８で特定化された塩基変更部分
を有するクローンから得た。ヒト１変異体クローンのＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、末端を細菌アルカリホスフ
ァーターゼで脱ホスホリル化し、ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断した。ヒト２変異ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切
断し、ホスファターゼで処理し、次いでＢａｍＨＩで切
断した。ヒト６変異ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、ホス
ファターゼ処理し、次いでＡｐａＩで切断した。同様
に、ヒト８変異ＤＮＡをＡｐａＩで切断し、末端を脱ホ
スホリル化し、ＤＮＡをＳａｌＩで切断した。これら４
つのＤＮＡ調製物を２％アガロースによる電気泳動に供
し、ヒト１，２，６及び８変異体を有する変異ＤＮＡか
ら４５ｂｐ、１９０ｂｐ、１３５ｂｐ及び７０ｂｐの断
片をそれぞれゲルから溶離させた。約６０ｆｍｏｌの各
断片を一まとめにして、ｐＨ７．８のトリス２５ｍＭ、
ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＤＴＴ１ｍＭ、ＡＴＰ０．４ｍＭ
及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１．５単位の５μｌ中１２℃で
１６時間かけてｐＢＲ３２２由来の約６０ｆｍｏｌのゲ
ル精製３．７ｋｂＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片に結合せせ
た。反応混合物を水で１：５に希釈し、希釈液１μｌを
用いて供給者が述べるようにコンピテント大腸菌ＤＨ５
細胞（ＢＲＬ）２０μｌを形質転換させた。
ーン（Ｍ１３−ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｅ）におけるウシ
配列からヒト配列への変異体を１つのｐＢＲ３２２担持
クローンに組込んで結合させた。ＲＦＤＮＡを、ヒトオ
リゴマー１，２，６及び８で特定化された塩基変更部分
を有するクローンから得た。ヒト１変異体クローンのＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、末端を細菌アルカリホスフ
ァーターゼで脱ホスホリル化し、ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断した。ヒト２変異ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切
断し、ホスファターゼで処理し、次いでＢａｍＨＩで切
断した。ヒト６変異ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、ホス
ファターゼ処理し、次いでＡｐａＩで切断した。同様
に、ヒト８変異ＤＮＡをＡｐａＩで切断し、末端を脱ホ
スホリル化し、ＤＮＡをＳａｌＩで切断した。これら４
つのＤＮＡ調製物を２％アガロースによる電気泳動に供
し、ヒト１，２，６及び８変異体を有する変異ＤＮＡか
ら４５ｂｐ、１９０ｂｐ、１３５ｂｐ及び７０ｂｐの断
片をそれぞれゲルから溶離させた。約６０ｆｍｏｌの各
断片を一まとめにして、ｐＨ７．８のトリス２５ｍＭ、
ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＤＴＴ１ｍＭ、ＡＴＰ０．４ｍＭ
及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１．５単位の５μｌ中１２℃で
１６時間かけてｐＢＲ３２２由来の約６０ｆｍｏｌのゲ
ル精製３．７ｋｂＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片に結合せせ
た。反応混合物を水で１：５に希釈し、希釈液１μｌを
用いて供給者が述べるようにコンピテント大腸菌ＤＨ５
細胞（ＢＲＬ）２０μｌを形質転換させた。
【００４９】４種すべての変異オリゴマーにより特定さ
れる変異部分を有するクローンを、各々のオリゴマーか
ら得られる放射線標識プローブとのハイブリッド形成に
より選択した。ヒト３変異体Ｍ１３クローンの切断ＲＦ
ＤＮＡから単離された１４０ｂｐ ＫｐｎＩ−ＢａｍＨ
Ｉ ＤＮＡ断片をこのヒト１−２−６−８変異ＤＮＡの
エンドヌクレアーゼ切断生成物に結合させ、ＤＨ５コン
ピテント細胞に組込んで形質転換させ、ヒト１−２−３
−６−８変異体を有するクローンを得た。この後者のク
ローンのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ切断断片をヒト４−５Ｍ
１３担持クローン由来ＲＦＤＮＡのＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ
Ｉ切断断片に結合し、結合混合物を用いてＤＨ５コンピ
テント細胞を形質転換させた。ヒト１−２−３−４−５
−６−８変異体を有するクローンをオリゴマーハイブリ
ッド形成により選択し、この組換えプラスミドのａＦＧ
Ｆ遺伝子ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ
１８（ＢＲＬ）のホスファターゼ処理ＥｃｏＲＩ−Ｓａ
ｌＩ切断ＲＦＤＮＡに結合させた。コンピテントＤＨ５
細胞をこの結合ＤＮＡで形質転換させ、形質転換細胞を
ＪＭ１０５宿主細胞上で培養して、Ｍ１３クローンを得
た。
れる変異部分を有するクローンを、各々のオリゴマーか
ら得られる放射線標識プローブとのハイブリッド形成に
より選択した。ヒト３変異体Ｍ１３クローンの切断ＲＦ
ＤＮＡから単離された１４０ｂｐ ＫｐｎＩ−ＢａｍＨ
Ｉ ＤＮＡ断片をこのヒト１−２−６−８変異ＤＮＡの
エンドヌクレアーゼ切断生成物に結合させ、ＤＨ５コン
ピテント細胞に組込んで形質転換させ、ヒト１−２−３
−６−８変異体を有するクローンを得た。この後者のク
ローンのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ切断断片をヒト４−５Ｍ
１３担持クローン由来ＲＦＤＮＡのＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ
Ｉ切断断片に結合し、結合混合物を用いてＤＨ５コンピ
テント細胞を形質転換させた。ヒト１−２−３−４−５
−６−８変異体を有するクローンをオリゴマーハイブリ
ッド形成により選択し、この組換えプラスミドのａＦＧ
Ｆ遺伝子ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ
１８（ＢＲＬ）のホスファターゼ処理ＥｃｏＲＩ−Ｓａ
ｌＩ切断ＲＦＤＮＡに結合させた。コンピテントＤＨ５
細胞をこの結合ＤＮＡで形質転換させ、形質転換細胞を
ＪＭ１０５宿主細胞上で培養して、Ｍ１３クローンを得
た。
【００５０】このクローンの一本鎖ファージＤＮＡをヒ
ト７オリゴマーとアニーリングし、すべての望ましい変
異体含有のＭ１３クローンを上記操作に従い得た。ＲＦ
ＤＮＡをこのクローンから得、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ
で切断した。得られる４４０ｂｐバンドをゲル精製し、
ｐＫＫ２．７ｔａｃプロモーター発現ベクターの２．７
ｋｐＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片と結合させた。こ
のＤＮＡを用いてコンピテントＤＨ５細胞を形質転換さ
せ、これによってヒトａＦＧＦ型製造用に使われるヒト
ｐＫＫ−ａＦＧＦ発現クローンを得た。
ト７オリゴマーとアニーリングし、すべての望ましい変
異体含有のＭ１３クローンを上記操作に従い得た。ＲＦ
ＤＮＡをこのクローンから得、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ
で切断した。得られる４４０ｂｐバンドをゲル精製し、
ｐＫＫ２．７ｔａｃプロモーター発現ベクターの２．７
ｋｐＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片と結合させた。こ
のＤＮＡを用いてコンピテントＤＨ５細胞を形質転換さ
せ、これによってヒトａＦＧＦ型製造用に使われるヒト
ｐＫＫ−ａＦＧＦ発現クローンを得た。
【００５１】ヒトｒ−ａＦＧＦをウシｒ−ａＦＧＦの場
合と同様の操作によって精製した（実施例４参照。）ヒ
トｒ−ａＦＧＦは、精製ヒトｒ−ａＦＧＦ４００ｎｇを
用いた感度約１ｎｇ／バンドである銀染色ＳＤＳ電気泳
動ゲルにおいて単一の強いバンドが存在することから、
少なくとも純度９９．７５％であると判断された。プロ
トコールは実施例４に記載されている。
合と同様の操作によって精製した（実施例４参照。）ヒ
トｒ−ａＦＧＦは、精製ヒトｒ−ａＦＧＦ４００ｎｇを
用いた感度約１ｎｇ／バンドである銀染色ＳＤＳ電気泳
動ゲルにおいて単一の強いバンドが存在することから、
少なくとも純度９９．７５％であると判断された。プロ
トコールは実施例４に記載されている。
【００５２】純粋な組換えヒトａＦＧＦは、実施例５の
ウシ組換えタンパク質の場合と同様に準集密状態（ｓｕ
ｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞中への
3Ｈ−チミジン取込み量からマイトジェン活性に関して
調べられた。脈管系内皮細胞に対して試験されたヒト脳
由来ａＦＧＦから既に観察されているように、組換えヒ
トタンパク質はヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）活性化の面
で脳由来又は組換えウシａＦＧＦの場合と比較し大きな
違いを示しており〔ギメネズ−ガレゴら、バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーションズ，第１３５巻，第５４１−５４８頁，１９８
６年〕、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞における組換えヒトａ
ＦＧＦの結果は下記表に示されている：
ウシ組換えタンパク質の場合と同様に準集密状態（ｓｕ
ｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞中への
3Ｈ−チミジン取込み量からマイトジェン活性に関して
調べられた。脈管系内皮細胞に対して試験されたヒト脳
由来ａＦＧＦから既に観察されているように、組換えヒ
トタンパク質はヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）活性化の面
で脳由来又は組換えウシａＦＧＦの場合と比較し大きな
違いを示しており〔ギメネズ−ガレゴら、バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーションズ，第１３５巻，第５４１−５４８頁，１９８
６年〕、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞における組換えヒトａ
ＦＧＦの結果は下記表に示されている：
【表１１】 ヘパリン存在下において、１／２最大促進は約４２ｐｇ
／ｍｌのときに生じた。ヘパリン非存在下では、ピーク
は最大濃度であっても明らかに到達したとはいえない
が、約３０ｎｇ／ｍｌ以上であろう。
／ｍｌのときに生じた。ヘパリン非存在下では、ピーク
は最大濃度であっても明らかに到達したとはいえない
が、約３０ｎｇ／ｍｌ以上であろう。
【００５３】配列番号：１ 配列の長さ：１４０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦ 配列 Phe Asn Leu Pro Leu Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys 5 10 15 Ser Asn Gly Gly Tyr Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp 20 25 30 Gly Thr Lys Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Cys Ala 35 40 45 Glu Ser Ile Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Phe 50 55 60 Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn 65 70 75 80 Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr 85 90 95 Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys His Trp Phe Val Gly Leu Lys 100 105 110 Lys Asn Gly Arg Ser Lys Leu Gly Pro Arg Thr His Phe Gly Gln Lys 115 120 125 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 140
【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：４２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
１つ 配列
１つ 配列
【化７】
【００５５】配列番号：３ 配列の長さ：４４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に適したウシａＦＧＦ
をコードする合成ＤＮＡ配列 配列
をコードする合成ＤＮＡ配列 配列
【化８】
【化９】
【００５６】配列番号：４ 配列の長さ：５８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
１つ 配列
１つ 配列
【化１０】
【００５７】配列番号：５ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化１１】
【００５８】配列番号：６ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化１２】
【００５９】配列番号：７ 配列の長さ：５９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化１３】
【００６０】配列番号：８ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化１４】
【００６１】配列番号：９ 配列の長さ：６５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化１５】
【００６２】配列番号：１０ 配列の長さ：６７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化１６】
【００６３】配列番号：１１ 配列の長さ：６２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化１７】
【００６４】配列番号：１２ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化１８】
【００６５】配列番号：１３ 配列の長さ：５８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化１９】
【００６６】配列番号：１４ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化２０】
【００６７】配列番号：１５ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化２１】
【００６８】配列番号：１６ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化２２】
【００６９】配列番号：１７ 配列の長さ：５５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化２３】
【００７０】配列番号：１８ 配列の長さ：５６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化２４】
【００７１】配列番号：１９ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ウシａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化２５】
【００７２】配列番号：２０ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ヒトａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化２６】
【００７３】配列番号：２１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ヒトａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化２７】
【００７４】配列番号：２２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ヒトａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化２８】
【００７５】配列番号：２３ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ヒトａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化２９】
【００７６】配列番号：２４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ヒトａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化３０】
【００７７】配列番号：２５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ヒトａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化３１】
【００７８】配列番号：２６ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ヒトａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化３２】
【００７９】配列番号：２７ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴： 他の情報 ヒトａＦＧＦをコードする合成ＤＮＡ配列の
部分 配列
部分 配列
【化３３】
【図１】 ＯＦＧＦ遺伝子を有するｐＫＫ２２３−３
プラスミドの遺伝子地図である。
プラスミドの遺伝子地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/20 1/22 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ (72)発明者 リンダ ジエー．ケリー アメリカ合衆国，10704 ニユーヨーク, ヨンカース，ブロンクス リヴアー ロー ド 219，アパートメント ４エル (72)発明者 ケネス エー．トーマス，ジユニヤ アメリカ合衆国，07928 ニユージヤーシ イ，チヤサム，ワシントン アヴエニユー 245 (72)発明者 ギレルモ ギメネス−ギヤレゴ アメリカ合衆国，07306 ニユージヤーシ イ，ジヤーシイ シテイ，ケネデイ ブー ルヴアード 2652
Claims (10)
- 【請求項１】 下記ヌクレオチド配列によってコードさ
れる組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子。 【化１】 - 【請求項２】 下記アミノ酸配列を有する請求項１記載
の組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子。 【化２】 - 【請求項３】 １位のフェニルアラニンにメチオニンが
結合している、請求項２記載の組換えヒト酸性繊維芽細
胞成長因子。 - 【請求項４】 １位のフェニルアラニンが欠落し、２位
のアミノ酸がアスパラギンまたはアスパラギン酸であ
る、請求項３記載の組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因
子。 - 【請求項５】 下記工程： ａ．ヒト酸性繊維芽細胞成長因子ａＦＧＦをコードする
下記ヌクレオチド配列を有するプラスミドを製造する
（ヌクレオチド配列はプラスミド含有宿主によって発現
されることができる）： 【化３】 次いで ｂ．プラスミドを細菌宿主中に組み込む：及び ｃ．ヒトａＦＧＦを生産するヌクレオチド配列の発現に
とって適した条件下にプラスミド含有宿主を維持する：
を含む工程よりなる組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子
の製造方法。 - 【請求項６】 工程ｂにおいて、宿主が大腸菌である請
求項５記載の組換えヒト繊維芽細胞成長因子の製造方
法。。 - 【請求項７】 薬学的担体及び、下記ヌクレオチド配列
によってコードされる組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因
子の有効創傷治癒量を含有する創傷治療用医薬組成物。 【化４】 - 【請求項８】 組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子が下
記アミノ酸配列： 【化５】 を有する請求項７記載の創傷治療用医薬組成物。 - 【請求項９】 組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子が、
アミノ酸配列の１位のフェニルアラニンにさらにメチオ
ニンが結合したアミノ酸配列を有する請求項７記載の創
傷治療用医薬組成物。 - 【請求項１０】 下記ヌクレオチド配列によってコード
される組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）
を精製する方法であって、 【化６】 次の工程： ａ．組換えａＦＧＦを、ヘパリンセファロースクロマト
グラフィマトリックス及び塩化ナトリウム溶離剤により
部分的に精製し； ｂ．部分精製されたａＦＧＦを、４個の炭素原子を有す
るアルキルシラン基質ならびにトリフルオロ酢酸、リン
酸及び酢酸からなる群から選ばれた少なくとも１つの酸
と、アセトニトリル及びエタノールのうちの少なくとも
１つの有機溶媒とからなる溶離液勾配を用いる逆相高速
液体クロマトグラフィにより最終精製すること；を含む
方法。
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