KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
-
Figur I ist ein Diagramm des pKK223-3-Plasmids, das das Gen für aFGF enthält.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Fibroblasten-Mitogene, die aus dem Gehirn stammen, wurden zuerst von Trowell et al.,
J. Exp. Biol. 16 : 60-70 (1939) und Hoffman, Growth 4 : 361-376 (1940) beschrieben.
Sodann wurde gezeigt, daß Hypophysenextrakte auch eine potente Mitogenaktivität
gegenüber Fibroblasten aufwiesen, Armelin, Proc. Natl. Acad. Sci USA 70 : 2702-2706
(1973). Die teilweise Reinigung sowohl des zerebralen als auch des hypophysären
Fibroblasten-Wachstumsfaktors (FGF) ergab eine Mitogenaktivität gegen eine Vielzahl
von Typen differenzierter Zellen, einschließlich der vaskulären Endothelzellen,
Gospodarowicz et al Natl. Cancer Inst. Monogr. 48 : 109-130 (1978). Kürzlich wurde
gezeigt, daß FGF in zwei Formen vorliegt, als saurer FGF (aFGF) und als basischer
FGF (bFGF). Beide Formen wurden in Hirn-Präparationen identifiziert, Thomas und
Gimenez-Gallego, TIBS 11 : 81-84 (1986). Zahlreiche Zelltypen, einschließlich
primärer Fibroblasten, vaskulärer und kornealer Endothelzellen, Chondrozyten,
Osteoblasten, Myoblasten, glatter Muskel- und Gliazellen, reagieren auf eine
Stimulation mit entweder gereinigtem aFGF oder bFGF mit einer Synthese von DNA
und einer Teilung, Esch et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 6507-6511(1985); Kuo
et al Fed Proc. 44 : 695 (1985).
-
Reiner, aus Rinderhirn stammender aFGF reagiert bei vaskulären Endothelzellen in
Kultur nicht nur als potentes Mitogen, sondern löst auch in vivo ein Blutgefäßwachstum
aus, Thomas et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 6409-6413 (1985). Die mitogene
Fibroblastenaktivität von aFGF kann auch angewendet werden, um die Wundheilung zu
beschleunigen, Thomas, U.S.-Patentschrift 4 444 760. Die Erfindung stellt ein
genetisches Konstrukt und ein Mittel zur Expression bereit, das die Produktion großer
Mengen von reinem aFGF erlaubt, die therapeutisch verwendet werden können.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
-
Demgemäß ist es Aufgabe der Erfindung, eine Nucleotid-Basensequenz sowohl für
Rinder-aFGF als auch für menschlichen aFGF aus den Aminosäuresequenzen der
spezifischen Proteine bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe ist es, Gene zu produzieren,
die für die spezifischen aFGFs kodieren und die Gene in geeignete Klonierungsvektoren
einbauen. Eine weitere Aufgabe ist es, einen geeigneten Wirt mit jedem der
rekombinanten Vektoren zu transformieren und die Expression der spezifischen aFGF-Gene
auszulösen. Eine weitere Aufgabe ist es, biologisch aktiven Rinder-aFGF und
menschlichen aFGF zu isolieren. Diese und weitere Aufgaben der Erfindung gehen aus der
folgenden Beschreibung hervor.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Einzigartige Gene, die für die Aminosäuresequenz des sauren
Rinder-Fibroblastenwachstumsfaktors (aFGF) und für den menschlichen aFGF kodieren, werden
konstruiert. Das Rindergen entstammt aus einer umgekehrten Translation der
aFGF-Aminosäuresequenz, während das menschliche Gen durch spezifische
Punktmutationen des Rindergens abgeleitet wird. Jedes Genkonstrukt wird in einen
Expressionsvektor inseriert, der zur Transformation eines geeigneten Wirtes verwendet
wird. Die transformierten Wirtszellen produzieren den rekombinanten aFGF
(r-aFGF) für Mensch oder Rind, der gereinigt wird und eine Aktivität aufweist, die
derjenigen des nativen Proteins entspricht.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
-
Der saure Fibroblastenwachstumsfaktor kommt in verschiedenen mikroheterogenen
Formen vor, die aus verschiedenen Gewebequellen und Zelltypen, die bekanntlich
aFGF enthalten, isoliert werden. Mikroheterogene Formen bezieht sich, wie hier
verwendet, auf ein einzelnes Genprodukt, das ein aus einer einzelnen DNA-Geneinheit
produziertes Peptid ist, das im Anschluß an die Translation strukturell modifiziert wird.
Die strukturellen Modifikationen führen jedoch zu keinerlei deutlichen Veränderung in
der biologischen Aktivität des Peptids. Die Modifikationen können entweder in vivo
oder während des Isolierungs- und Reinigungsverfahrens ablaufen. Eine in vivo-
Modifikation führt zu einer Proteolyse, Glycosylierung, Phosphorylierung oder
Acetylierung am N-Ende, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Eine Proteolyse kann eine
Exoproteolyse umfassen, bei der eine oder mehrere endständige Aminosäuren
sequentiell
enzymatisch unter Bildung einer mikroheterogenen Form gespalten werden, die
weniger Aminosäuren als das ursprüngliche Genprodukt aufweist. Eine
endoproteolytische Modifikation ergibt sich aus der Einwirkung von Endoproteasen, die das Peptid
an spezifischen Stellen innerhalb der Aminosäuresequenz spalten. Ähnliche
Modifikationen können während des Reinigungsverfahrens auftreten, was ebenfalls zu
einer Produktion von mikroheterogenen Formen führt. Die am häufigsten vorkommende
Modifikation, die während der Reinigung auftritt, ist eine Proteolyse, die im
allgemeinen durch die Verwendung von Proteasehemmstoffen auf ein Minimum
beschränkt wird. Unter den meisten Bedingungen, die sich bei der Reinigung von nativem
aFGF ergeben, liegt ein Gemisch von mikroheterogenen Formen vor. Nativer aFGF
bezieht sich auf einen aFGF, der aus Geweben oder Zellen, die aFGF enthalten, isoliert
und gereinigt wird.
-
Erfindungsgemäß sind alle mikroheterogenen Formen des sauren
Fibroblastenwachstumfaktors von Säugern eingeschlossen. Die bevorzugten Ausführungsformen
umfassen die mikroheterogenen Formen des aFGF von Rind und Mensch. Die am
meisten bevorzugten mikroheterogenen Formen des Rinder-aFGF umfassen eine Form
mit 154 Aminosäuren, eine Form mit 140 Aminosäuren und eine Form mit 134
Aminosäuren. Die Form mit 140 Aminosäuren ist in Tabelle III gezeigt, sie stellt die
am meisten bevorzugte Form der Rinderspezies dar. Die Form mit 154 Aminosäuren
umfaßt die folgenden zusätzlichen Aminosäuren; Ala-Glu-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Phe-
Thr-Ala-Leu-Thr-Glu-Lys, wobei das Carboxy-Ende von Lys mit dem Aminoende von
Phe an der ersten Position der Form mit 140 Aminosäuren gebunden ist. Die Form mit
134 Aminosäuren entspricht der Form mit 140 Aminosäuren, außer daß die ersten sechs
Aminosäuren, ausgehend von dem Aminoende, entfernt worden sind. Bei der Isolierung
variieren die relativen Mengen dieser mikroheterogenen Formen mit dem angewendeten
Verfahren, jedoch enthalten alle Präparationen wenigstens einen Teil von jeder Form.
-
Der menschliche aFGF zeigt eine ahnliche Mikroheterogenität wie der Rinder-aFGF.
Die am meisten bevorzugten mikroheterogenen Formen des menschlichen aFGF um
fassen eine Form mit 154 Aminosäuren, eine Form mit 140 Aminosäuren und eine
Form mit 139 Aminosäuren. Die Form mit 140 Aminosäuren unterscheidet sich von der
Rinderform durch 11 Aminosäuren, wie in Tabelle V gezeigt. Die Form mit 154
Aminosäuren enthalt die genaue Sequenz der Form mit 140 Aminosäuren + 14 weitere
Aminosäuren, die, mit einer Ausnahme, mit der Form mit 154 Aminosäuren des Rindes
verknüpft sind. Die Aminosäure an Position 5 des N-Endes oder an Position -10,
ausgehend von dem N Ende der Aminosäure 140 Phe in der menschlichen Form, ist Isoleucin
und ist in der Rinderform durch Threonin ersetzt. Die weitere menschliche N-terminale
Sequenz der 14 Aminosäuren lautet: Ala-Glu-Gly-Glu-Ile-Thr-Thr-Phe-Thr-Ala-Lue-
Thr-Glu-Lys. Eine dritte Form des menschlichen aFGF enthält 139 Aminosäuren und
entspricht der menschlichen Form mit 140 Aminosäuren, von der das Phenylalanin am
Aminoende entfernt worden ist. Der Asparaginrest am Aminoende kann in der Form
mit 139 Aminosäuren des menschlichen aFGF zu Asparaginsäure desaminiert werden.
Die Formen mit 140 und 139 Aminosäuren sind die am meisten bevorzugten Formen
der menschlichen mikroheterogenen Formen.
-
Säuger-r-aFGF wird durch Klonieren des natürlichen Gens aus entweder genomischer
DNA oder cDNA oder durch Konstruktion eines Gens für eine der mikroheterogenen
Formen des Proteins auf der Grundlage der bekannten Aminosäuresequenzen dieser
mikroheterogenen Formen von aFGF der Säugerspezies, einschließlich des Menschen,
produziert. Genom-DNA wird aus Säugerhirn oder Hypophysenzellen extrahiert und für
eine Klonierung entweder durch eine statistische Fragmentierung der hochmolekularen
DNA präpariert, wobei das Verfahren von Maniatis et al., Cell 15 : 687-701(1978)
befolgt wird, oder durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym durch das Verfahren
von Smithies et al., Science 202 : 1284-1289 (1978), präpariert. Die Genom-DNA wird
anschließend in einen geeigneten Klonierungsvektor, im allgemeinen in E. coli-λ-Phage
eingebaut, siehe Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).
-
Um cDNA für den aFGF zu erhalten, wird Poly-(A)-haltige RNA durch das Verfahren
von Aviv und Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. 69 : 1408-1412 (1972), aus Zellen
extrahiert, die den aFGF exprimieren. cDNA wird unter Verwendung reverser Transkriptase
und DNA-Polymerase unter Anwendung der Standardverfahren, die von Maniatis et al.
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, New York (1982) beschrieben sind, hergestellt. Die cDNA wird mit
einem Schwanzstück versehen und in einen geeigneten Vektor, im allgemeinen pBR322,
durch ein Verfahren kloniert, das demjenigen von Wensink, et al Cell 3 : 315-325
(1974) entspricht.
-
Die klonalen Genom-DNA- oder cDNA-Bibliotheken werden durch Hybridisierung mit
einer Oligonucleotid-Sonde einem Screening unterzogen, um diejenigen Klone zu
identifizieren, die aFGF-Sequenzen enthalten. Die Sequenz der Oligonucleotid-
Hybridisierungssonde basiert auf der bestimmten Aminosäuresequenz von aFGF.
Maniatis et al., supra, Anderson und Kingston, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 6838-
6842 (1983) und Suggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 78 : 6613-6617 (1981)
beschreiben verschiedene Verfahren für ein Screening von Genom- und cDNA-Klonen.
-
Das bevorzugte Verfahren, um ein Gen für Säuger-aFGF zu erhalten, ist die Synthese
des Gens. Das Gen kann auf der Grundlage der Aminosäuresequenz einer
mikroheterogenen Form des aFGF, erhalten aus irgendeinem Säuger, einschließlich des Menschen,
synthetisiert werden. Das bevorzugte Verfahren ist die Verwendung der Rinder-
Aminosäuresequenz für aFGF und eine chemische Punktmutation der Basensequenz, um
die Gene für die anderen Spezies herzustellen. Die Amiosäuresequenzen für
RinderaFGF und menschlichen aFGF werden beschrieben in der U.S.-Patentanmeldung,
Seriennummer 868 473, eingereicht am 30 Mai 1986, die eine Teilfortsetzung der
U.S.-Patentanmeldung, Seriennummer 774 359, eingereicht am 12. September 1985,
ist, die eine Teilfortsetzung der U.S.-Patentanmeldung, Seriennummer 685 923,
eingereicht am 24. Dezember 1984 (jetzt aufgegeben), ist.
-
Die synthetischen Gene basieren auf der bestimmten Rinder-Aminosäuresequenz, die
anschließend von Gimenez-Gallego et al., Science 230 : 1385-1388(1985) beschrieben
worden ist, und auf der menschlichen Aminosäuresequenz, wie beschrieben von
Gimenez-Gallego et al. Biochem. Biophys. Res. Comm., 138 : 611-617 (1986). Die
einzigartige Nucleotidsequenz der Form mit 140 Aminosäuren von Rinder-aFGF
entstammt einer umgekehrten Translation der Aminosäuresequenz durch ein Verfahren, das
demjenigen von Itakura et al., Science 198 : 1056-1063 (1977) entspricht. Die
verschiedenen neuen Nucleotidsequenzen, die der nativen Aminosäuresequenz des Rinder-aFGF
entsprechen, sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
TABELLE I
-
worin Q = C oder T,
-
P = A oder G, und
-
N = A, T, C oder G
-
Die erfindungsgemäße Nucleotidsequenz umfaßt die folgenden Eigenschaften: Codons,
die von Escherichia coli- und Säugerzellen bevorzugt werden, waren möglich,
Eliminierung von Sequenzen mit mehrfachen Komplementareigenschaften, Einarbeitung
einzigartiger Restriktionsstellen überall in das Gen, endständige klebrige
Restriktionsenzym-Enden zur Erleichterung der Insertion des Gens in die Plasmide, eine zentral
gelegene einzigartige Restriktionsstelle, um die Anordnung des Gens in zwei Hälften zu
ermöglichen, vorzugsweise ein N-terminales Methionin-Codon für eine Startstelle für
die Translation und Stoppcodons in Tandemanordnung für die Translation.
-
Obschon die folgende Beschreibung und die Beispiele die Erfindung bezüglich einer
bestimmten Nucleotidsequenz für Rinder-aFGF erläutern, ist es selbstverständlich, daß
die Erfindung irgendeine der in Tabelle I aufgeführten Permutationen ein schließen
könnte. Die folgende Tabelle enthält die bevorzugte Nucleotidsequenz:
TABELLE II
-
Das Gen wird mit einem Leaderteil konstruiert, der eine einzelne Restriktionsenzym-
Schnittstelle und ein N-terminales Methionin-Codon für eine Translationsstartstelle
enthält. Das Gen enthält weiterhin einen Schwanz, der die Translationsstoppcodons in
Tandemanordnung und zwei Restriktionsenzym-Schnittstellen enthält. Die
Komplementäreigenschaft der DNA ermöglicht eine Auswahl von Basensequenzen, die
ihrerseits den Einbau einzigartiger Restriktionsenzym-Schnittstellen überall in dem Gen
ermöglicht. Die bevorzugte Basensequenz des Gens mit der Lage der
Restriktionsenzym-Schnittstellen ist in der folgenden Tabelle gezeigt:
Tabelle III
TABELLE III (Fortsetzung)
-
Die Gensequenz für jeden Strang des doppelsträngigen Moleküls ist statistisch in 8
Nucleotidsequenzen aufgeteilt. Die Oligonucleotide werden mit sich überlappenden
Enden konstruiert, um die Bildung der doppelsträngigen DNA zu ermöglichen. Die
folgende Tabelle enthält eine Anordnung einer Vielzahl von
Oligonucleotid-Anordnungen, die zur Produktion des Gens für den Rinder-aFGF verwendet werden.
TABELLE IV
-
Die in Tabelle IV gezeigten Oligonucleotide sind hauptsächlich als Beispiel für die
Oligonucleotid-Untereinheiten angegeben und sollten nicht als deren Einschränkung
gedeutet werden. Die zusammengesetzte Basensequenz, die die Überlappung zeigt, und
die Anordnung der Oligonucleotide, sind in Tabelle III gezeigt.
-
Das Rindergen wird in zwei Stufen zusammengesetzt. Zunächst die Hälfte, die dem
N-terminalen Teil des Proteins entspricht und als zweites die C-terminale Hälfte. Im
allgemeinen werden die Oligonucleotide mit Hilfe von T4-Polynucleotidkinase in
Gegenwart von entweder ATP oder ³²P-markiertem ATP mit Phosphatgruppen
versehen. Bei der ersten Reaktion von jeder Stufe werden diejenigen Oligonucleotide, die
einen Strang des Gens bilden, mit Ausnahme der meisten 5'-Oligonucleotide mit
Phosphatgruppen versehen. Bei der zweiten Reaktion werden diejenigen
Oligonucleotide, die den zweiten Strang bilden mit Phosphatgruppen versehen, mit
Ausnahme der meisten 5'-Oligonudeotide. Wenn mit Phosphatgruppen versehene
Oligonucleotide verwendet werden, wird etwa 1 pmol des ³²P-markierten
Oligonucleotids zur späteren Identifizierung der Produkte hinzugegeben. Die
Verknüpfung wird in einem geeigneten Puffer, wie in demjenigen, der etwa 60 mM
Tris, etwa pH 7,6, etwa 5 mM Dithiothreitol (DTT), etwa 10 mM MgCl&sub2; und etwa
30 uM ATP enthält und auf den er jedoch nicht beschränkt ist, bei etwa 90ºC, etwa
4 Minuten lang durchgeführt, wobei ein schneller Transfer auf etwa 60ºC und eine
langsame Abkühlung auf etwa 30ºC folgen. Die Ligasierung wird in einem geeigneten
Puffer durchgeführt, wie in einem, der etwa 60 mM Tris, etwa pH 7,6, etwa 10 mM
DTT, etwa 10 mM MgCl&sub2;, etwa 1 mM ATP und etwa 0,03 Einheiten T4 DNA-Ligase
enthält und auf den er jedoch nicht beschränkt ist, bei etwa 20ºC für etwa 1 1/2
Stunden lang durchgeführt.
-
Die ligasierten Oligonucleotide werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und
anschließende Ethanolfällung gereinigt. Die Oligonucleotide werden erneut in einem
Puffer aufgelöst, der etwa 20 ul etwa 80%iges Formamid, etwa 50 mM Tris-Borat,
etwa pH 8,3, etwa 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), etwa 0,1%
(Gew./Vol.) Xylencyanol und etwa 0,1% (Gew./Vol.) Bromphenolblau enthält. Jede
Probe wird bei etwa 90ºC etwa 3 Minuten lang erhitzt und in etwa 10% Harnstoff
Polyacrylamidgel bei etwa 75 Watt etwa 5 Stunden lang einer Elektrophorese
unterzogen. Die Banden für die N-terminale Base 231 werden entfernt, vereinigt und
bei etwa 4ºC in etwa 0,5 M Ammoniumacetat, enthaltend etwa 1 mM EDTA, bei etwa
pH 8, eluiert. Die Banden für die C-terminale Base 209 werden auf dieselbe Weise
behandelt.
-
Die synthetischen Gensequenzen, die entweder für den N-terminalen oder C-terminalen
Teil des aFGF kodieren, werden in das Plasmid pBR322 eingebaut. Es ist insbesondere
wünschenswert und beabsichtigt, daß die Verwendung weiterer Plasmide, in die das
aFGF-Gen eingebaut werden können und die die Expression des aFGF-Gens
ermöglichen, innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen. Die wiederverknüpften
Oligonucleotide, etwa 300 fmol und 100 fmol des gewonnenen N-Endes mit 231
Basenpaaren , werden für das N-Ende jeweils mit etwa 100 fmol agarosegelgereinigtem
etwa 3,9 Kilobasen (kb) EcoRI-BamHI pBR322 ligasiert. Das C-Ende mit 209 bp wird
auf dieselbe Weise unter Verwendung von BamHI-SalI-pBR322 konstruiert. Die
Ligasierung wird in einem Puffer, der etwa 25 mM Tris, etwa pH 7,8, etwa 10 mM
DTT, etwa 10 mM MgCl&sub2;, etwa 0,4 mM ATP mit etwa einer Einheit T4-DNA-Ligase
enthält, etwa 1 Stunde lang bei etwa 20ºC durchgeführt. Jeder mit den Genhälften
ligasierte Vektor wird verwendet, um kompetente Bakterienzellen, wie E. coli-RR1
(Bethesda Research Laboratories, BRL), zu transformieren, wobei die Verfahren der
Lieferfirmen befolgt wurden. Die transformierten Zellen werden für ein Wachstum in
Ampicillin ausgewählt und durch Restriktionsanalyse der
Minilysat-Plasmidpräparationen auf das Vorliegen entweder des EcoRI-BamHI-Inserts mit 231 Basenpaaren oder
des BamHI-SalI-Inserts mit 209 bp einem Screening unterzogen.
-
Die DNA-Sequenz der Klone, die Inserts von geeigneter Größe enthalten, werden unter
Verwendung der chemischen DNA-Sequenzierungsverfahren von Maxam und Gilbert,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 560-564 (1977), bestimmt.
-
Das endgültige synthetische aFGF-Gen in voller Länge wurde kloniert, indem die
N-terminale Klonhälfte mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI gespalten wurde,
wobei mit alkalischer Phosphatase behandelt wurde, und dies mit einem gelgereinigten
209 bp-BamHI-SalI-Insert der C-terminalen Klonhälfte ligasiert wurde. Dieses ligasierte
Material wurde wie zuvor zur Transformation der kompetenten RR1-Zellen verwendet.
-
Die Expression des synthetischen aFGF-Gens wird durch eine Reihe von verschiedenen
Promotor-Expressionssystemen erzielt. Es ist gewünscht und beabsichtigt, daß die
Verwendung weiterer Promotor-Expressionssysteme zur Expression des intakten
aFGF-Gens innerhalb des Umfangs der Erfindung eingeschlossen ist. Das bevorzugte
Konstrukt verwendet den E. coli-tac-Promotor, ein Hybrid zwischen den Regionen des
trp-Promotors und des lac-Promotors, wie beschrieben von deBoer et al., Proc Natl.
Acad. Sci. USA 80 : 21-25 (1983). Das pKK 223-3-Plasmid (Pharmacia), das den
tac-Promotor und den rrnB-rRNA-Transkriptionsterminator enthält, wurde modifiziert,
um die von pBR322 stammende SalI-Restriktionsenzymschnittstelle zu entfernen. Es
erwies sich, daß der rrnB-rRNA-Terminator die Expression durch starke Promotoren
ermöglicht, Gentz et al., Proc Natl. Acad. Sci., USA 78 : 4936-4940 (1981); Brosius,
Gene 27 : 78 : 161-172 (1984).
-
Die DNA des pKK223-3 Plasmids wird durch Restriktionsenzyme gespalten, um ein
DNA-Fragment von 2,7 kb zur Erzeugung des Klons pKK 2,7 herzustellen. Das
synthetische aFGF-Gen wird von seinem pBR322-Vektor abgespalten und nach der
Restriktion von pKK 2,7 mit EcoRI und SalI zu dem pKK 2,7-Plasmid transferiert. Die
resultierende Rekombinante, die in Fig. 1 gezeigt ist, wird in JM105- (Pharmacia)
oder DH5-(BRL)-Zellen aus E. coli transformiert und exprimiert.
-
Eine ortspezifische Mutagenese ist ein wirksamer Weg, um die Aminosäuresequenz
einer Säugerspezies von aFGF in die aFGF-Aminosäuresequenz einer anderen Spezies
umzuwandeln. Die folgende Beschreibung betrifft die ortspezifische mutagene
Umwandlung von Rinder-aFGF in der Form mit 140 Aminosäuren zu menschlichem
aFGF. Es versteht sich jedoch, daß das Verfahren angewendet werden kann, um jeden
aFGF einer Säugerspezies in denjenigen irgendeiner anderen Spezies umzuwandeln. Die
einzige Einschränkung der Umwandlung besteht darin, daß die Aminosäuresequenzen
von beiden aFGF bekannt sein müssen. Die folgende Tabelle führt die Aminosäuren
auf, die ersetzt werden müssen, und die Stelle auf der Aminosäure-Genkarte von
Rinder-aFGF, Tabelle III, bei der die Substitutionen vorgenommen werden:
Tabelle V
Aminosäure Lage substituierte Aminosäuren menschlicher aFGF für Rinder-aFGF
-
Wie mit der Rinder-Gensequenz werden 8 Oligonucleotide, die die menschliche
Gensequenz darstellen, durch dasselbe Verfahren, das für die Rinderoligonucleotide
angewendet worden ist, konstruiert. Die folgende Tabelle enthält eine von einer Vielzahl
von Oligonucleotid-Anordnungen, die verwendet wird, um das menschliche aFGF-Gen
herzustellen.
TABELLE VI
-
Das klonierte synthetische Rindergen für aFGF wird durch eine Reihe gerichteter
Punktmutationen in ein synthetisches menschliches Gen für aFGF umgewandelt. Die
oligonucleotidgerichtete Mutagenese des klonierten Gens ermöglicht eine Veränderung
der Basensequenz des Rinder-aFGF, so daß die resultierende Aminosäuresequenz die in
Tabelle V gezeigten substituierten Aminosäuren enthält, und den menschlichen aFGF
darstellt. In dem Rindergen wird zur Entfernung von Phenylalanin am Amino-Ende zur
Herstellung der menschlichen mikroheterogenen Form von aFGF mit 139 Aminosäuren
eine Deletion vorgenommen. Eine Punktmutation wird durchgeführt, um das Asparagin
an Position 2 durch Asparaginsäure zu ersetzen. Alternativ wird Asparagin zu
Asparaginsäure desaminiert. Die Verfahren zur Durchführung dieser Verfahren werden
unten beschrieben oder sind in der Technik bekannt. Die oligonucleotidgerichtete
Mutagenese wird unter Verwendung der in der Technik bekannten Standardverfahren
durchgeführt, Zoller und Smith, Methods in Enzymology, 100 : 468-500 (1983); Norris
et al. Nucleic Acids Research, 11 : 5103-5112 (1983) und Zoller und Smith, DNA 3.
479-488 (1984). Die durch eine standardisierte oligonucleotidgerichtete Mutagenese
durchgeführten Punktmutationen sind in der folgenden Tabelle VII dargestellt. Der Ort
der Basenmutagenese kann aus Tabelle III entnommen werden. Die Punktmutationen
werden hauptsächlich als Beispiel für die Veränderungen dargestellt, die sich in dem
menschlichen aFGF-Gen ergeben und keine Einschränkung hierauf haben sollten.
TABELLE VII
Basen-Ort substituierte Base menschlicher aFGF für Rinder-aFGF entsprechende menschliche Aminosäure
-
Die Expressionsklone werden bei etwa 37ºC in einem geeigneten Wachstumsmedium
gezüchtet, das aus etwa 1% Tryptophan, etwa 0,5% Hefeextrakt, etwa 0,5% NaCl,
etwa 0,4% Glucose und etwa 50 ug/ml Ampicillin besteht. Wenn die optische Dichte
bei 550 nm etwa 0,5 erreicht, kann Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)
zugegeben werden, um eine Endkonzentration von etwa 1 mM zu ergeben. Das Wachstum
wird bei 37ºC etwa 3 Stunden lang fortgesetzt. Die Zellen werden aus 1 l
Kulturmedium durch Zentrifugieren geerntet und in einem Aufbruchpuffer, der etwa 10 mM
Natriumphosphat bei etwa pH 7, etwa 5 mM EDTA, etwa 10,6 ug/ml
N-p-Toluolsulfonyl-L-phenylalaninchlormethylketon (TPCK), etwa 34,3 ug/ml Pepstatin A, etwa
87 ug/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (TMFF), etwa 15 ug/ml pankreatischer
Rindertrypsin-Hemmstoff (BPTI) und etwa 25,2 ug/ml Leupeptin enthält,
resuspendiert. Die Zellen werden entweder sofort aufgebrochen oder eingefroren und
bei -70ºC aufbewahrt und unmittelbar nach dem Auftauen in etwa 3 Durchgängen
durch eine French Press-Zelle bei etwa 12 000 psi bei etwa 4ºC aufgebrochen. Die
überstehende Flüssigkeit wird durch Zentrifugieren gesammelt.
-
Der rekombinante aFGF wird durch ein einzigartiges zweistufiges chromatographisches
Verfahren bis zur Homogenität gereinigt, wobei eine Kombination aus Heparin-
Sepharose-Affinitätschromatographie und anschließender reversed
phase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) eingesetzt wird. Der rohe r-aFGF wird auf eine
Heparin-Sepharosesäule in einem verdünnten Puffer, wie etwa 10 mM Phosphat- oder
Trispuffer, etwa pH 6 bis 8, aufgegeben, die anschließend mit einer niedrigen
Konzentration an Salz wie etwa 0,8 M NaCl gewaschen wird, bis die Absorption bei
280 nm auf etwa den Hintergrund absinkt. r-aFGF wird mit einer gepufferten Lösung
mit hoher Salzkonzentration, wie etwa 10 mM Natriumphosphat oder Tris, etwa pH 6
bis 8, die etwa 1,5 M NaCl enthält, eluiert. Das Eluat wird anschließend durch reversed
phase-HPLC über ein Harz, bestehend aus kovalent verknüpften Alkylsilanketten mit
Alkylgruppen, die 3 bis 18 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 4 Kohlenstoffatome,
besitzen, gereinigt. Der r-aFGF wird direkt auf die HPLC-Säule aufgetragen, die mit
einer verdünnten Säure, wie etwa 10 mM Trifluoressigsäure, Essigsäure oder
Phosphorsäure, equilibriert worden ist, und mit einem linearen Gradienten aus einem
organischen Lösungsmittel, wie Acetonitril oder Ethanol eluiert. Bereits früher wurde
beschrieben, daß aFGF aus Rinderhirn sowohl an Heparin-Sepharose, Maciag et al.
Science 225 : 932-935 (1984), als auch an reversed phase-HPLC-Säulen, Thomas et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81. 357 361(1984) ein Teil von mehrstufigen
Reinigungsprotokollen, bindet. Teilweise auf der Grundlage des relativ großen
Überflusses an r-aFGF in Bakterienlysaten wird hier gezeigt, daß diese zwei Stufen
allein ausreichen, um homogen reines r-aFGF von etwa 16 000 Dalton, nachgewiesen
durch Elektrophorese in Polyacrylamidgelen, zu erhalten. Diese zwei Stufen allein
ergeben kein reines aFGF aus Hirn.
-
Die mitogene Aktivität von gereinigtem aFGF wird durch Einbau von ³H-Thymidin in
DNA durch Zellinienfibroblasten, vorzugsweise BALB/c 3T3 A31 (American Type
Culture Collection), bestimmt. Der rekombinante aFGF zeigt die höchste Reaktion bei
etwa 1 mg Protein, oder weniger, pro ml in dem Fibroblasten-Stimulationstest.
-
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Förderung der
Heilung von Wunden durch Auftragen des neuen Peptids entweder mit oder ohne
Heparin, vorzugsweise mit Heparin, erfindungsgemäß etwa 1 bis etwa 500 ug/cm² auf
die Wundfläche entweder topisch oder subkutan in die Wunde in einer Menge von etwa
0,1 bis 100 ug/cm² Fläche bei der topischen Anwendung.
-
Für die Anwendung sind verschiedene pharmazeutische Formulierungen, wie Salben,
Pasten, Lösungen, Gele, feste wasserlösliche Polymere, wie Albumine, Gelatine,
Hydroxypropylcellulose, Plurone, Tetrone oder Alginate, in die der aktive Bestandteil
in Mengen von 1 bis 100 ug/ml eingearbeitet wird, geeignet.
-
Die Fähigkeit von aFGF, die Teilung in verschiedene Zelltypen einschließlich
Fibroblasten, vaskulärer und cornealer Endothelzellen und dergleichen, zu stimulieren,
macht diese Peptide als pharmazeutische Mittel geeignet. Diese Verbindungen können
zur Behandlung von Wunden bei Säugern, einschließlich beim Menschen, durch
Verabreichung des neuen r-aFGF an Patienten, die einer solchen Behandlung bedürfen,
verwendet werden.
-
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne jedoch dieselbe hierauf zu
beschränken.
BEISPIEL 1
Oligonuceleotid-Synthese
-
Oligonucleotide wurden gemäß dem von Matteucci und Caruthers, J. Am. Chem. soc.
103 : 3185-3191(1981), Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters 22 : 1859-1862
(1981) beschriebenen Verfahren synthetisiert. Die Basensequenzen der synthetisierten
Oligonucleotide sind in Tabelle IV gezeigt.
BEISPIEL 2
Zusammenbau des aFGF-Gens
-
Die Oligonucleotide aus Beispiel 1 wurden als zwei separate Einheiten, der
N-terminalen Hälfte (231 bp) und der C-terminalen Hälfte (209 bp), zusammengebaut. Die zwei
Hälften wurden anschließend zu dem intakten synthetischen Gen vereinigt (siehe Tabelle
III). Zunächst wurden die Oligonucleotide in dem folgenden Reaktionsgemisch mit
Phosphatgruppen versehen: 70 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 10 mM MgCl&sub2;, 33 uM
ATP, 0,3 Einheiten T4-Polynucleotidkinase pro ul und 2,5 pmol Oligonucleotid pro ul.
Das Gemisch wurde 1,5 Stunden lang bei 37ºC inkubiert und anschließend noch eine
weitere Stunde, nachdem dem Gemisch 0,2 Einheiten/ul Kinase und ATP zugesetzt
worden waren, um eine Konzentration von 100 mM zu ergeben. Zur radioaktiven
Markierung enthielt das Ausgangsgemisch 37 nCi/ul [γ-³²p]-ATP.
-
Die Verknüpfung und Ligasierung wurden während zwei getrennter Reaktionen
vorgenommen. Bei jeder Reaktion wurden jeweils 100 pmol der 8 Oligonucleotide
hinzugegeben. Bei einer Reaktion wurden die Oligonucleotide, die einen Strang des
C-terminalen oder N-terminalen Halbgen s ausmachen, mit Phosphatgruppen versehen,
mit der Ausnahme der meisten 5'-Oligonucleotide. Bei der zweiten Reaktion wurden die
Oligonucleotide, die den Gegenstrangaufbauen, mit Phosphatgruppen versehen,
wiederum mit der Ausnahme der meisten 5'-Oligonucleotide. Somit wurden bei jeder
Reaktion drei Oligonucleotide 5 mit Phosphatgruppen versehen und 5 nicht. Wenn die
mit Phosphatgruppen versehenen Oligonucleotide verwendet wurden, wurde auch ein
pmol ³²P-markiertes Oligonucleotid zur späteren Identifizierung der Produkte
hinzugegeben. Jedes Reaktionsgemisch enthielt 200 ul mit 70 mM Tris pH 7,6, 5 mM
DTT, 10 mM MgCl&sub2; und 30 um ATP. Die Oligonucleotide wurden verknüpft, indem
sie 4 Minuten lang auf 90ºC erhitzt wurden, das Reaktionsgemisch anschließend sofort
auf 60ºC gebracht wurde und langsam auf 30ºC abkühlen gelassen wurde. Die
Ligasierung wurde in 400 ul, enthaltend 60 mM Tris pH 7,6,10 mM DTT, 10 mM
MgCl&sub2;, 1 mM ATP und 0,03 Einheiten T4-DNA-Ligase pro ul, indem 1,5 Stunden
lang bei 20ºC ligasiert wurde, vorgenommen.
-
Zur Reinigung der ligasierten Oligonucleotide wurde eine Polyacrylamid-
Gelelektrophorese angewendet. Die ligasierten Oligonucleotide wurden mit Ethanol
ausgefällt, wieder in 20 ul 80%igem Formamid, 50 mM Tris-Borat, pH 8,3, 1 mM
EDTA, 0,1% (Gew./Vol.) Xylolcyanol und 0,1% (Gew./Vol.) Bromphenolblau
aufgelöst. Jede Probe wurde 3 Minuten lang bei 90ºC erhitzt und in einem 10%
Harnstoff-Polyacrylamidgel bei 75 Watt 5 Stunden lang einer Elektrophorese
unterzogen. Die Oligonucleotid-Banden wurden sichtbar gemacht, indem das Gel auf
einem Film Röntgenstrahlen ausgesetzt wurde. Die Banden der 231 Basen einer jeden
Reaktion für das N-Ende wurden aus dem Gel ausgeschnitten, vereinigt und bei 4ºC in
1 ml 0,5 M Ammoniumacetat, 1 mM EDTA, pH 8, eluiert. Die eluierte DNA wurde
mit Ethanol ausgefällt und in 30 ul 70 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT und 10 mM
MgCl&sub2; erneut aufgelöst. Die Banden der 209 Basen des C-Endes wurden auf dieselbe
Weise eluiert.
-
Die gelgereinigten Oligonucleotide wurden vor der Transformation durch Erhitzen auf
90ºC für 4 Minuten und langsames Abkühlen auf 20ºC verknüpft. Unter der
Annahme einer 5%igen Wiedergewinnung der Ausgangsoligonucleotide zu Beginn
wurden 300 fmol und 100 fmol der gewonnenen verknüpften 231 bp-Oligonucleotide mit
jeweils 100 fmol agarosegelgereinigter 3,9 kb-EcoRI-BamHI-pBR322-Fragment-DNA in
20 ul 25 mM Tris, pH 8,7,1 mM DTT, 10 mM MgCl&sub2;, 0,4 mM ATP mit einer
Einheit T4-DNA-Ligase bei 20ºC 1 Stunde lang ligasiert. Die verknüpften
209 bp-Oligonucleotide wurden mit agarosegereinigter 3,9 kb-BamHI-SalI pBR322-
Fragment-DNA unter denselben Bedingungen, wie die 231 Basenpaarfragmente,
ligasiert. Die Reaktionsgemische der Ligasierung wurden in H&sub2;O 1 : 5 verdünnt. 1 ul der
Verdünnung wurde verwendet um 20 ul kompetenter E. coli-RR1-Zellen (BRL), wie
von der Lieferfirma beschrieben, zu transformieren. Die Transformanten wurden durch
Restriktionsanalyse von Minilysat-Plasmidpräparationen für ein Wachstum in Ampicillin
ausgewählt und auf die Gegenwart des 231 bp-EcoRI-BamHI- oder
209 bp-BamHI-SalI-Inserts einem Screening unterzogen.
-
Die DNA-Sequenz der Klone, die die Inserts mit geeigneter Größe enthielten, wurde
unter Verwendung der chemischen DNA-Sequenzierungsverfahren von Maxam und
Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 560-564 (1977) bestimmt. Da keiner der
231 bp-Klone die korrekte Sequenz aufwies, wurde ein Klon, der die korrekte Sequenz
enthielt, wie folgt hergestellt. Ein Klon mit der korrekten Sequenz zwischen der KpnI-
und BamHI-Schnittstelle wurde mit KpnI und SalI, das in dem pBR322-Vektor
schneidet,
geschnitten. Die 400 bp-Bande wurde gelgereinigt und mit der 3,8 kb KpnI-SalI-
Bande eines zweiten Klons, der die richtige Sequenz von der EcoRI- zu der
KpnI-Schnittstelle des aFGF-Geninserts enthielt, ligasiert. Nach der Transformation
wurde ein resultierender Klon sequenziert, um sicherzustellen, daß die gewünschte
Sequenz erhalten worden war.
-
Da ein Klon, der die korrekte 209 bp-Sequenz enthielt, erhalten worden war, war keine
weitere Manipulation dieser Klone erforderlich. Das fertige synthetische
aFGF-Gen in voller Länge wurde durch Spalten der N-terminalen Klonhälfte mit
BamHI und SalI, Behandeln mit alkalischer Phosphatase und Ligasieren mit dem
gelgereinigten 209 bp-BamHl-SalI-Insert der C-terminalen Klonhälfte kloniert. Dieses
ligasierte Material wurde, wie zuvor, zur Transformation kompetenter RR1-Zellen
verwendet.
BEISPIEL 3
Expression des synthetischen Rinder-aFGF-Gens
-
Das intakte aFGF-Gen aus Beispiel 2 wurde in ein modifiziertes pKK223-3-Plasmid
eingebaut. Das pKK223-3-Plasmid (Pharmacia) enthält den tac-Promotor, der ein
Hybrid zwischen den Regionen des trp-Promotors und des lac-Promotors darstellt,
deBoer et al., Proc Natl. Acad. Sci 80 : 21-25 (1983). Dieses Plasmid enthält auch den
rrnb-rRNA-Transkriptionsterminator, eine starke Terminatorsequenz, von der
herausgefunden wurde, daß sie die Expression aus starken Promotoren ermöglicht, Gentz et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 4936-4940 (1981), Brosius, Gene 27 : 161-172
(1984). Das pKK 223-3-Plasmid wurde modifiziert, um die von pBR322 stammende
SalI-Restriktionsenzymschnittstelle zu entfernen. Dies wurde durch Spalten der
pKK223-3-Plasmid-DNA mit NdeI und NarI und durch eine Rezirkulation des
2,7 kb-DNA-Fragments zur Erzeugung des Klons pKK 2,7 erreicht. Das synthetische
aFGF-Gen wurde anschließend von seinem pBR322-Vektor abgespalten und nach der
Restriktion dieses Expressionsvektors mit EcoRI und SalI zu pKK2,7 übergeführt.
Diese Konstruktion ordnet das Ausgangsmethionin des synthetischen Gens 11 Basen
stromabwärts von der Shine-Dalgarno-Ribosomenbindungsstelle an. Die resultierende
Rekombinante, die in Fig. 1 gezeigt ist, wurde zu E. coli-JM105-Zellen und auch zu
E. coli DH5-Zellen transformiert.
-
Die Expressionsklone wurden bei 37ºC in LB-Nährlösung (1% Tryptophan, 0,5%
Hefeextrakt, 0,5% NaCl), enthaltend 0,4% Glucose und 50 ug/ml Ampicillin,
gezüchtet. Wenn die frei wählbare Dichte bei 550 nm 0,5 erreichte, wurde IPTG
zugegeben, so daß sich 1 mM ergab, und das Wachstum wurde 3 Stunden lang bei
37ºC fortgesetzt. Die Zellen wurden durch 20minütiges Zentrifugieren bei 10 000 · g
geerntet. Die Zellen aus 1 l Kulturmedium wurden in 20 ml 10 mM Natriumphosphat
pH 7,2, (Heparin-Sepharosepuffer) 5 mM EDTA, 10 N 6 ug/ml TPCK, 34,3 ug/ml
Pepstatin A, 87 ug/ml PMSF, 15 ug/ml BPTI und 34,3 ug/ml Leupeptin resuspendiert.
Die resuspendierten Zellen wurden schnell in einem Bad aus Trockeneis/Ethanol
eingefroren und über Nacht bei -70ºC aufbewahrt.
BEISPIEL 4
Extraktion und Reinigung von rekombinantem aFGF
-
Die gefrorenen Zellen aus Beispiel 3 wurden aufgetaut und noch 87 ug/ml PMSF
hinzugegeben. Die Präparation wurde bei 12 000 psi und 4ºC dreimal durch eine French-
Druckzelle passiert. Das resultierende Lysat wurde bei 93 000 · g 30 Minuten lang zur
Entfernung des Zellabfalls zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, mit 1 N NaOH
auf pH 7,2 eingestellt und auf eine Heparin-Sepharose (Pharmacia)-Säule von
1,6 · 10 cm aufgegeben, die bei 4ºC mit einer Flußgeschwindigkeit von 20 ml/h
betrieben wurde, wobei 2 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Das Pellet wurde in 5 ml
10 mM Natriumphosphat, 2 m NaCl, pH 7,2, resuspendiert, bei 93 000 · g 30 Minuten
rezentrifugiert, und der Überstand mit 3 Volumina 10 mM Natriumphosphat pH 7,2,
falls notwendig, mit 1 M NaOH wieder auf pH 7,2 eingestellt, verdünnt und auf
dieselbe Heparin-Sepharose-Säule aufgegeben. Nach dem Aufgeben wurde die Säule mit
10 mM Natriumphosphat, 0,8 M NaCl, pH 7,2, gewaschen, bis die Absorption bei 280
nm auf den Hintergrund zurückfiel. Gebundener r-aFGF wurde als Einzelpeak mit 10
mM Natriumphosphat, 1,5 M NaCl, pH 7,2, eluiert. Die vereinigten Fraktionen der
Heparin-Sepharose-Säule wurden durch reversed phase-HPLC unter Verwendung einer
4,6 mm · 25 cm C&sub4;-Säule (Separations Group) gereinigt, wie beschrieben von Thomas
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 357-361(1984). Der r-aFGF-Peak, der als
einzelner Hauptpeak eluiert wurde, der aus einer Vielzahl kleinerer verunreinigender
Peaks aufgelöst wurde, legte nahe, daß das Protein homogen rein war. Die
Polyacrylamid-Geldektrophorese wurde zur Bestätigung der Reinheit angewendet. Der
gereinigte r-aFGF wurde einer Elektrophorese unterzogen, wobei das Verfahren von
O'Farrell, J. Biol. Chem. 250 : 4007-4021 (1975) angewendet wurde. Die
Silberanfärbung zeigte eine einzige Bande mit einer Molmasse von 16 000 Dalton. Die
Identität des Proteins als aFGF wurde sowohl durch eine Aminosäureanalyse als auch
durch die Bestimmung der Sequenz am Aminoende bestätigt.
BEISPIEL 5
Biologische Aktivität von rekombinantem Rinder-aFGF
-
Die biologische Aktivität des gereinigten r-aFGF aus Beispiel 4 wurde unter
Verwendung eines mitogenen Fibroblastentest, wie beschrieben von Thomas et al., J
Biol. Chem. 225 : 5517-5520 (1980), bewertet. BALB/c 3T3 A31-Fibroblasten
(American Type Culture Collection) wurden zu 2 · 10&sup4; Zellen pro 35 mm
Durchmesser-Vertiefung in Kulturmedien ausplattiert, die 10% hitzeinaktiviertes
Kalbserum enthielten und in 7% CO&sub2; (pH 7,35 v± 0,05) inkubiert. Die Zellen wurden
durch Ersatz des Mediums mit 0,5% hitzeinaktivieitem Kalbserum 6, was nach 24
Stunden erneut wiederholt wurde, völlig ruhiggestellt. 55 Stunden nach dem
Ausplattieren wurden 50 ug Heparin, die Testproben und 1,1 ug Dexamethason
hinzugegeben. Nach 70 Stunden wurden jeder Vertiefung 2 uCi [Methyl-³H]-Thymidin
(20 Ci/mmol, New England Nuclear) und 3 ug unmarkiertes Thymidin (Sigma)
zugesetzt, nach 95 Stunden wurden die Zellen zur Bestimmung des radioaktiven Einbaus
in DNA bearbeitet. Jeder Wert für die Dosis-Antwort war der Mittelwert von drei
Bestimmungen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
TABELLE VIII Mitogene Reaktionen von BALB/c 3T3 Fibroblasten auf Rinder-aFGF
Konzentration r-aFGF CPM r-aFGF Hirn-aFGF
-
Die Aktivität von rekombinantem aFGF entsprach derjenigen von aFGF aus Hirn oder
war leicht höher. Der gereinigte r-aFGF wies eine halb maximale Stimulation der DNA-
Synthese bei 71 ug/ml auf, während der gereinigte, aus Hirn stammende aFGF einen
halb maximalen Wert von 126 ug/ml aufwies.
BEISPIEL 6
Mutagenese des Rinder-aFGF-Gens zu dem menschlichen aFGF-Gen
-
Zur Erleichterung der Mutagenese des Rinder-aFGF-Gens wurde das synthetische Gen
aus Beispiel 2 auf M13mp19, einen einzelsträngigen DNA-Bakteriophagenvektor,
übergeführt. Standard-Mutageneseverfahren wurden angewendet, wie beschrieben von
Zoller und Smith, Methods in Enzymology, 100 : 468-500 (1983); Norris et al. Nucleic
Acids Research 11 : 5103-5112 und Zoller und Smith, DNA 3 : 479-488. Das
RinderpKK-aFGF-Plasmid wurde mit EcoRI und SalI gespalten, siehe Tabelle III. Das
resultierende 440 bp-Fragment wurde, wie in Beispiel 2, auf Agarosegel gereinigt. Die
M13mp19-RF-Vektor-DNA (BRL) wurde mit denselben zwei Endonucleasen gespalten.
Die Enden wurden anschließend in 100 ul 10 mM Tris-Puffer, pH 8,0, mit 100
Einheiten bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Eine Ligasierung wurde
unter Verwendung von 50 ng der behandelten Vektor-DNA und von 12 ng der aFGF-
Genfragmenet-DNA in 10 ul 25 mM Tris pH 7,8,10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT,
0,4 mM ATP mit 2 Einheiten T4-DNA-Ligase bei 4ºC 16 Stunden lang durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch wurde in Wasser 1 : 5 verdünnt. 1 ul der Verdünnung wurde
verwendet, um 20 ul kompetenter E. coli-DH5-Zellen (BRL), wie von der Lieferfirma
beschrieben, zu transformieren. Die Zellen wurden mit E. coli-JM105-Wirtszellen
(Pharmacia) in 0,03% X-gal und 0,3 mM IPTG ausplattiert. Nach der Inkubation bei
37ºC wurden farblose Plaques isoliert. Ein Phagenklon, der das Rinder-aFGF-Gen
enthielt, nämlich M13mp19-aFGF, wurde ausgewählt.
-
Acht Oligonucleotide wurden bestimmt, um die menschliche Sequenz festzulegen, und
synthetisiert, siehe Tabelle VI.
-
Oligomer 8 enthält eine weitere Mutation, bei der Thymin an Position 386 in dem
Rindergen durch Cytosin in dem menschlichen Gen ersetzt ist. Diese Mutation
ermöglicht den Einbau einer Restriktionsschnittstelle, ohne die Aminosäuresequenz von
menschlichem aFGF zu verändern.
-
Die menschlichen Oligomere 1, 2, 3, 4, 6, und 8 wurden phosphoryliert, und 15 pmol
wurden jeweils einzeln mit 0,5 pmol einzelsträngiger M13mp19-aFGF-Phagen-DNA in
10 ul 20 mM Tris, pH 7,5,10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM DTT bei 65ºC
10 Minuten lang und anschließend bei 23ºC 10 Minuten lang phosphoryliert.
Geschlossene ringförmige doppelsträngige Moleküle wurden anschließend in 20 ul
20 mM Tris, pH 7,5,10 mM MgCl&sub2;, 25 mM NaCl, 5,5, mM DTT, 0,5 mM ATP,
0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dGTP, 0,25 mM dTTP
unter Verwendung von einer Einheit T4-DNA-Ligase und zwei Einheiten des Klenow
Fragments von DNA-Polymerase I durch eine 17stündige Inkubation bei 15ºC
hergestellt. Die Präparationen wurden jeweils verwendet, um kompetente JM105-Zellen zu
transformieren. Die resultierenden transformierten Plaques wurden durch
Hybridisierung mit dem geeigneten Oligomeren selektiert, das unter Verwendung von
³²P-ATP und Polynucleotidkinase radioaktiv markiert worden war. Die Bedingungen
der Hybridisierung wurden für jede Probe optimal gestaltet, um die Bildung von
Hybriden zu verhindern, die Veränderungen einzelner Basen enthalten. Einzelsträngige
DNA wurde aus dem Phagenkion isoliert, der die Mutationen 4 des menschlichen
Oligomeren enthielt. Das obige Verfahren wurde unter Verwendung des menschlichen
Oligomeren 5 wiederholt, um ein Klon zu erzeugen, der sowohl die Mutationen 4 und 5
des Oligomeren enthielt.
-
Bei den folgenden Verfahren wurden die Rind-zu-Mensch-Sequenzmutationen in diesen
Klonen auf der Basis von M13 zu einem Klon auf der Basis von pBR322 vereinigt.
RF-DNAs wurden aus den Klonen hergestellt, die die Basenveränderungen, die von den
menschlichen Oligomeren 1, 2, 6 und 8 festgelegt werden, enthalten. Die DNA des
menschlichen Mutantenklons 1 wurde mit EcoRI geschnitten, die Enden wurden mit
bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und die DNA mit HindIII
geschnitten. Die menschliche mutante DNA 2 wurde mit HindIII geschnitten, mit
Phosphatase behandelt und anschließend mit BamHI geschnitten. Die menschliche
mutante DNA 6 wurde mit BamHI geschnitten, mit Phosphatase behandelt und
anschließend mit ApaI geschnitten. Gleichermaßen wurde die menschliche mutante DNA
8 mit ApaI geschnitten, die Enden wurden dephosphoryliert und die DNA mit SalI
geschnitten. Die vier DNA-Präparationen wurden auf 2% Agarose einer Elektrophorese
unterzogen, die Fragmente von 45 bp, 190 bp, 135 bp und 70 bp aus den mutanten
DNAs, die die menschlichen Mutationen 1, 2, 6 bzw. 8 enthielten, wurden von dem
Gel eluiert. Etwa 60 fmol von jedem Fragment wurden kollektiv mit etwa 60 fmol eines
gelgereinigten 3,7 kb-EcoRI-SalI-Fragments von pBR322 in 5 ul 25 mM Tris
pH 7,8,10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 0,4 mM ATP mit 1,5 Einheiten T4-DNA-Ligase
16 Stunden lang bei 12ºC ligasiert. Das Reaktionsgemisch wurde in H&sub2;O 1 : 5
verdünnt. 1 ul Verdünnung wurde verwendet, um 20 ul kompetenter E.coli DH5-Zellen
(BRL), wie von der Lieferfirma beschrieben, zu transformieren. Ein Klon, der die
Mutationen enthält, die von allen vier mutanten Oligomeren festgelegt worden sind,
wurde durch Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden, die von jedem der
Oligomere hergestellt worden waren, ausgewählt. Das 140 bp KpnI-BamHI-DNA-
Fragment, das aus geschnittener RF-DNA des menschlichen M13 Klons aus Mutation 3
isoliert worden war, wurde mit Endonuclease-Spaltprodukten dieser menschlichen DNA
der Mutationen 1-2-6-8 ligasiert und in kompetente DH5-Zellen transformiert, um einen
Klon mit den menschlichen Mutationen 1-2-3-6-8 zu erzeugen. Die Fragmente der
Verdauung mit BamHI-PstI dieses letzteren Klons wurden mit den Fragmenten der
Verdauung von RF-DNA mit BamHI-PstI aus dem menschlichen 4-5-Klon auf der Basis
von M13 ligasiert. Das Ligasierungsgemisch wurde verwendet, um kompetente DH5-
Zellen zu transformieren. Ein Klon, der die menschlichen Mutationen 1-2-3-4-5-6-8
enthielt, wurde durch Oligomer-Hybridisierung selektiert. Das EcoRI-SalI-DNA-
Fragment des aFGF-Gens dieses rekombinanten Plasmids wurde mit
phosphatasebehandelter EcoRI-SalI geschnittener RF-DNA von M13mp18 (BRL)
ligasiert. Mit dieser ligasierten DNA wurden kompetente DH5-Zellen transformiert.
Die transformierten Zellen wurden auf JM105-Wirtszellen ausplattiert, um einen M13-
Klon zu erzeugen. Die einzelsträngige Phagen-DNA dieses Klons wurde mit dem
menschlichen Oligomeren 7 verknüpft. Ein M13-Mon, der sämtliche gewünschten
Mutationen enthielt, wurde erhalten, wobei das oben beschriebene Verfahren befolgt
wurde. Aus diesem Klon wurde RF-DNA hergestellt und mit EcoRI und SalI
geschnitten. Die resultierende 440 bp-Bande wurde gelgereinigt und mit dem 2,7 kb-EcoRI-
SalI-DNa-Fragment des pKK2, 7-tac-Promotor-Expressionsvektors ligasiert. Diese DNA
wurde zur Transformation kompetenter DH5-Zellen verwendet, wodurch der
menschliche pKK-aFGF-Expressionsklon erzeugt wurde, der zur Herstellung der
menschlichen Form von aFGF verwendet wurde.
-
Menschliches r-aFGF wurde durch dasselbe Verfahren gereinigt, das für
Rinderr-aFGF verwendet wurde, siehe Beispiel 4.
-
Der menschliche r-aFGF wurde so eingeschätzt, daß er wenigstens eine Reinheit von
99,75% besitzt, bezogen auf die Gegenwart einer einzelnen intensiven Bande auf einem
SDS-Elektrophoresegel mit Silberanfärbung, das mit 400 nm gereinigtem menschlichem
aFGF beladen war und eine Empfindlichkeit von etwa 1ng/Bande aufwies. Das
Protokoll ist in Beispiel 4 beschrieben.
-
Der reine rekombinante menschliche aFGF wurde auf die Mitogenaktivität unter
Verwendung des Einbaus von ³H-Thymidin in subkonfluente BAlb/c 3T3-Zellen, wie
für das rekombinante Rinderprotein in Beispiel 5 beschrieben, eingebaut. Wie zuvor mit
menschlichem aFGF aus Hirn beobachtet, der an vaskulären Endothelzellen getestet
wurde, zeigte das rekombinante menschliche Protein einen größeren Unterschied bei der
Heparinaktivierung (50 mg/ml) als es entweder für den aus Hirn stammenden oder den
rekombinanten Rinder-aFGF der Fall ist, Gimenez-Gallego et al Biochem. Biophys.
Res. Comm. 135 : 541-548 (1986). Die Ergebnisse des rekombinanten menschlichen
aFGF auf BAlb/c 3T3-Zellen sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Tabelle IX Mitogen Reaktionen von BAIb/c 3T3-Fibroblasten auf den menschlichen r-aFGF
Konzentration CPM -Heparin +Heparin
-
* Picogramm = 10-12 Gramm
-
In Gegenwart von Heparin tritt die halbmaximale Stimulation bei etwa 42 pg/ml ein. In
Abwesenheit von Heparin wurde der Peak auch bei der höchsten Konzentration, die
jedoch größer als etwa 30 mg/ml sein muß, nicht klar erreicht.