KR960009725B1 - 산성 섬유아세포 성장인자의 클로닝 및 발현 - Google Patents
산성 섬유아세포 성장인자의 클로닝 및 발현 Download PDFInfo
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Abstract
요약없음
Description
제1도는 산성 섬유아세포 성장인자(aFGF)에 대한 유전자를 함유하는 pKK 223-3 플라스미드를 도시한 것이다.
본 발명은 소의 산성 섬유아세포 성장인자(acidic fibroblast growth factor ; aFGF) 및 인간의 aFGF에 관한 것이다.
뇌에서 유래하는 섬유아세포 유사분열물질은 트로웰 등[Trowell et al., J. Exp. Biol. 16 : 60-70(1939)]과 호프만[Hoffman, Growth 4 : 361-376(1940)]에 의해서 최초로 기술되었다. 이어서, 뇌하수체 추출물 역시 섬유아세포에 대한 강력한 유사분열촉진 활성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. [참조 : Armelin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 : 2702-2706(1973)]. 뇌와 뇌하수체 섬유아세포 성장인자(FGF)의 부분 정제물은, 혈관 내피세포를 포함한 각종 형태의 분화세포에 대해 유사분열촉진 활성을 나타낸다. [참조 : Gospodarowicz et al., Natl. Cancer Inst. Momogr. 48 : 109-130(1978)]. FGF는 두가지 형태, 즉, 산성 FGF(aFGF)와 염기성 FGF(bFGF)로 존재하며, 둘다 뇌 표본 중에서 동정된다는 것이 최근에 밝혀졌다[참조 : Thomas and Gimenez-Gallego, TBS 11 : 81-84(1984)]. 일차 섬유아세포, 혈관 및 각막 내피세포, 연골세포, 조골세포, 근원세포, 평활근 및 신경교세포를 포함하는 수많은 형태의 세포들은 정제된 aFGF 또는 bFGF에 의한 자극에 반응하여 DNA를 합성하고 분열한다[참조 : Each et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 6507-6511(1985) : Kuo et al., Fed. Proc. 44 : 695(1985)].
순수한 소의 뇌로부터 유도된 aFGF는 배양물 중의 혈관 내피세포에 대한 강력한 유사분열물질로서 작용할 뿐만 아니라, 생체내에서 혈관의 성장도 유도한다[참조 : Thomas etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 6409-6413(1985)]. aFGF의 섬유아세포 유사분열촉진 활성은 또한 창상의 치유를 촉진시키는데도 이용될 수 있다[참조 : Thomas, 미합중국 특허 제4,444,760호]. 본 발명은 치료학적으로 사용될 수 있는 순수한 aFGF의 대량 생산을 위한 유전자의 작제 및 발현방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 목적은 특정 단백질의 아미노산 서열로부터 소 aFGF 및 인간 aFGF 둘다에 대한 뉴클레오타이드 염기 서열을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 특정한 aFGF를 암호화하는 유전자를 제공하고, 이 유전자를 적합한 클로닝 벡터내로 도입시키는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 각각의 재조합 벡터로 적절한 숙주를 형질전환시켜 특정한 aFGF 유전자의 발현을 유도하는 것이다. 또다른 목적은 생물학적으로 활성인 소 aFGF 및 인간 aFGF를 분리 및 정제하는 것이다. 본 발명의 상기 목적 및 기타 목적은 하기의 설명으로부터 명백해질 것이다.
소의 산성 섬유아세포 정상인자(aFGF) 및 인간 aFGF의 아미노산 서열을 암호화하는 독특한 유전자가 작제된다. 소의 유전자는 aFGF 아미노산 서열의 역해독으로부터 유도되고, 인간의 유전자는 소 유전자의 특정한 점 돌연변이(point mutation)에 의해 유도된다. 각 유전자의 작제물을 발현벡터내에 삽입시키고, 이 벡터를 사용하여 적절한 숙주를 형질전환시킨다. 형질전환된 숙주세포는 인간 또는 소의 재조합 aFGF(r-aFGF)를 생산하며, 이것은 정제되어 천연 단백질과 동등한 활성을 갖는다.
산성 섬유아세포 성장인자는, aFGF를 함유하는 것으로 알려진 각종 형태의 세포 및 조직 공급원으로부터 분리되는 다양한 미소 이종형(micorheterogeneous form)으로 존재한다. 본원에서 사용된 미소 이종형은 단일 유전자 생성물을 말하며, 이것은 DNA의 단일 유전자 단위로부터 생성된 펩타이드로서 해독에 따라 구조적으로 변형된다. 그러나, 구조적 변형은 펩타이드의 생물학적인 활성에 있어서 현저한 변화를 초래하지는 않는다. 변형은 생체내에서 일어나거나, 또는 분리 및 정제과정 중에 발생할 수 있다. 생체내에서의 변형은 N-말단에서의 단백질분해(proteolysis), 글리코실화(glycosylation), 인산화 또는 아세틸화를 유발하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 단백질분해는, 1개 이상의 말단 아미노산이 연속적으로 효소적으로 분해되어 원래의 유전자 생성물보다 적은 수의 아미노산을 갖는 미소 이종형을 생산하는 엑소-단백질분해성(exoproteolysis)를 포함할 수 있다. 엔도-단백질분해성(endoproteolytic) 변형은 아미노산 서열내의 특정위치에서 펩타이드를 분해하는 엔도프로테아제의 작용으로 유발된다. 유사한 변형이 정제과정 중에서도 발생하여 또한 미소 이종형을 생성시킨다. 정제 도중 발생하는 가장 일반적인 변형은 단백질 분해인데, 이는 통상적으로 프로테아제 억제제를 사용함으로써 최소화된다. 대부분의 조건하에서는, 천연 aFGF의 정제후에도 미소 이종형과의 혼합물이 존재하게 된다. 천연 aFGF는 aFGF를 함유하는 조직 또는 세포로부터 분리 및 정제된 aFGF를 말한다.
본 발명은 산성 섬유아세포 성장인자의 모든 포유류 미소 이종형을 포함하는 것으로 고려된다. 바람직한 양태는 소 및 인간 aFGF의 미소 이종형을 포함한다. 소 aFGF의 가장 바람직한 미소 이종형은 154개 아미노산형, 140개 아미노산형 및 134개 아미노산형을 포함한다. 표 Ⅲ에 나타나 있는 140개 아미노산형은 소에 존재하는 가장 바람직한 종류이다. 154개 아미노산형은 추가의 아미노산인 Ala-Glu-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Thr-Phe-Thr-Ala-Leu-Thr-Glu-Lys을 함유하며, 여기서 카복실말단 Lys은 140개 아미노산형의 제1위치에 존재하는 아미노말단 Phe에 결합된다. 134개 아미노산형은 아미노말단의 처음 6개 아미노산이 제거된 점을 제외하고는 140개 아미노산형과 동일하다. 분리시, 이들 미소 이종형의 상대적인 양은 사용된 방법에 따라 변하지만, 모든 표본은 각각의 형의 적어도 일부분을 함유한다.
인간 aFGF는 소 aFGF와 유사한 미소 이질성을 나타낸다. 가장 바람직한 인간 aFGF의 미소 이종형은 154개 아미노산형, 140개 아미노산형 및 139개 아미노산형을 포함한다. 표 Ⅴ에서 보는 바와 같이 인간의 140개 아미노산형은 소의 140개 아미노산형과는 11개의 아미노산이 다르다. 인간 154개 아미노산형은 인간의 140개 아미노산형의 정확한 서열과 함께, 소의 154개 아미노산형에 결합되어 있는 추가의 14개 아미노산(단, 1개의 아미노산이 다르다)을 함유한다. 인간 154개 아미노산형에서는 N-말단 제5위치, 또는 140개의 아미노산형의 Phe N-말단으로부터 -10위치에 있는 아미노산이 이소로이신이며, 소의 아미노산형에서는 이것이 트레오닌으로 대체된다. 인간 154개 아미노산형의 N-말단에 추가되는 14개의 아미노산 서열은 다음과 같다 : Ala-Glu-Gly-Glu-Ile-Thr-Phe-Thr-Ala-Leu-Thr-Glu-Lys. 인간 aFGF의 세번째 형은 139개의 아미노산을 함유하며, 아미노 말단의 페닐알라닌이 제거된 인간의 140개 아미노산형과 동일하다. 인간 aFGF의 139개의 아미노산형에서 아미노 말단 아스파라긴 잔기는 탈아미드화 되어 아스파르트산이 될 수 있다. 인간의 140개 및 139개 아미노산형이 인간 미소 이종형중에서 가장 바람직한 형태이다.
포유류의 r-aFGF는, 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 천연 유전자를 클로닝하거나, 인간을 포함한 포유동물종으로부터 aFGF의 미소 이종형의 공지된 아미노산 서열을 기초로 하여 단백질의 미소 이종형중 하나에 대한 유전자를 작제함으로써 생산된다. 게놈 DNA는 포유류의 뇌 또는 뇌하수체 세포로부터 추출되며, 클로닝하기 위해 문헌[참조 : Maniatist et al., Cell 15 : 687-701(1978)]의 기술에 따라 고분자량 DNA를 랜덤하게 단편화시키거나 문헌[참조 : Smithies et al., Science 202 : 1284-1289(1978)]의 방법에 의해 제한효소를 이용하여 분해시켜 제조한다. 이어서, 게놈 DNA를 적절한 클로닝 벡터, 통상적으로 에스케리키아 클라이람다 파지(E. Coil lambda phage)에 도입시킨다[참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1982)]
aFGF에 대한 cDNA를 수득하기 위하여, 하기 문헌에서의 방법으로 aFGF를 발현시키는 세포로부터 폴리(A)-함유 RNA를 추출한다[참조 : Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Scic. 69 : 1408-1402(1972)]. cDNA는 하기 문헌에 기술되어 있는 표준 기술을 이용하여 역전사효소 및 DNA 폴리머라제를 사용해서 제조된다[참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1982)]. cDNA를 하기 문헌의 방법과 유사한 기술에 의해 테일링하고, 적합한 벡터, 통상 pBR32[Bethesda Research Laboratories로부터 입수 : 문헌 Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1982)에 기술됨)내에 클로닝한다[참조 : Wensink et al., Cell 3 : 315-325(1974)].
클론의 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 올리고뉴클레오타이드 프로브와의 하이브리드화에 의해 aFGF 서열을 함유하는 클론을 동정한다. 올리고뉴클레오타이드 하이브리드화 프로브의 서열은 aFGF의 결정된 아미노산 서열을 기초로 한다. 문헌에는 게놈 클론 및 cDNA 클론을 스크리닝하는 각종 방법이 기술되어 있다[참조 : Maniatis et al., supra, Anderson and kingston, Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 80 : 6838-6842(1983) 및 suggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 6613-6617(1981)].
포유류의 aFGF에 대한 유전자를 수득하기 위한 바람직한 방법은 유전자를 합성하는 것이다. 유전자는, 인간을 포함한 포유동물로부터 수득된 미소 이종형 aFGF의 아미노산 서열을 기초로 하여 합성할 수 있다. 바람직한 방법은, 소 aFGF에 대한 아미노산 서열을 사용하고 염기 서열을 화학적으로 점 돌연변이시켜 다른 종에 대한 유전자를 제조하는 것이다. 소 및 인간 aFGF에 대한 아미노산 서열은 1984년 12월 24일자 미합중국 특허원 제685,923호(현재 포기됨)의 연속출원인 1985년 9월 12일자 미합중국 특허원 제774,359호의 연속출원인 1986년 5월 30일자 미합중국 특허원 제868,473호에 기술되어 있다.
합성 유전자는 하기 문헌에 기술되어 있는 확정된 소의 아미노산 서열[Gimenez-Gallego et al., Science 230 : 1385-1388(1983)] 및 인간의 아미노산 서열[Gimenez-Gallego et al., Biochem. Biophys, Res. Comm., 138 : 611-617(1986)]을 기초로 한다. 소 aFGF의 140개 아미노산형에 대한 독특한 뉴클레오 이드 서열은 문헌[Itakura et al,, Science 198 : 1056-1063(1977)]의 방법과 유사한 기술에 의한 아미노산 서열의 역해독으로부터 유도된다. 소 aFGF의 천연 아미노산 서열에 상응하는 여러가지 신규한 뉴클레오타이드 서열을 하기의 표에 기재한다.
표 Ⅰ
여기서, Q=C 또는 T이고, P=A 또는 G이며, N=A, T, C 또는 G이다.
발명의 뉴클레오타이드 서열은 다음의 특징을 갖는다 : 에스케리키아 콜라이 및 가능한 경우, 포유류의 세포에 의해 바람직한 코돈, 다중 상보성을 갖는 서열의 제거, 유전자를 통한 독특한 제한 부위의 도입, 유전자의 폴라스미드내로의 삽입을 용이하게 해주는 말다 제한효소 접착 말단, 반수체 형태의 유전자 두개의 조합을 가능하게 하는 중심에 위치한 단일 제한부위, 바람직하게는 해독 개시부위에 대한 N-말단 메티오닌 코돈, 및 탠뎀(tnadem) 해독 중지 코돈.
이하의 설명 및 실시예는 소 aFGF의 특정한 뉴클레오타이드 서열의 관점에서 본 발명을 설명하고 있으나, 본 발명은 표 Ⅰ에 기재되어 있는 어떤 순열이라도 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 하기의 표는 바람직한 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.
표 Ⅱ
유전자는, 단일 제한효소 절단부위 및 해독 개시부위에 대한 N-말단 메티오닌 코돈을 함유하는 리더 부분을 갖도록 작제된다. 또한, 유전자는 탠뎀 해독 정지 코돈 및 2개의 제한효소 절단부위를 함유하는 말단부분을 갖는다. DNA의 상보성은, 유전자를 통해 독특한 제한효소 절단부위가 차례로 도입될 수 있도록 하는 염기 서열의 선택을 가능하게 한다. 제한효소 절단부위가 위치하는 유전자의 바람직한 염기 서열은 하기의 표 Ⅲ에 기재되어 있다 :
표 Ⅲ
이본쇄 분자의 각 쇄(strand)에 대한 유전자 서열은 8개의 뉴클레오타이드 서열로 랜덤하게 분리한다. 올리고 뉴클레오타이드는 이본쇄 DNA를 형성시키는 오버랩핑(overlapping)말단을 갖도록 작제된다. 하기의 표 Ⅳ는 소 aFGF 유전자를 생산하는데 사용되는 많은 올리고뉴클레오타이드 배열중의 하나를 나타낸 것이다.
표 Ⅳ
표 Ⅳ에 기재한 올리고뉴클레오타이드는 단지 올리고뉴클레오타이드 서브유니트의 한 예로서 제시된 것이며, 이에 대해 제한적으로 설명하는 것은 아니다. 올리고뉴클레오타이드의 오버랩핑 및 배열을 나타내는 복합 염기 서열은 표 Ⅲ에 기재되어 있다.
소 유전자는 2단계로 조합된다. 즉, 첫번째는 단백질의 N-말단부분에 상응하는 절반이며 두번째는 C-말단 절반으로 이루어진다. 일반적으로 올리고뉴클레오타이드는 ATP 또느32P-표지된 ATP의 존재하에서 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 인산화한다. 각 단계의 첫번째 반응에서는, 유전자의 하나의 쇄를 형성하고 올리고뉴클레오타이드들을, 가장 큰 5' 올리고뉴클레오타이드를 제외하고, 인산화시킨다. 두번째의 반응에서는, 제2의 본쇄를 형성하는 올리고뉴클레오타이드들을 가장 큰 5' 올리고뉴클레오타이드를 제외하고, 인산화시킨다. 인산화된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 경우, 후에 생성물을 동정하기 위하여32P-표지된 올리고뉴클레오타이드 약 1pmol을 가한다. 아닐링은 적절한 완충액[예를 들면, TRIS 약 60mM, pH 약 7.6,디티오트레이톨(DTT) 약 5mM, MgCl2약 10 mM, ATP 약 30μM를 함유하는 완충액, 단, 이로서 한정되지는 않는다]중에서 약 90℃로 약 4분동안 수행한 다음, 이어서 신속히 약 60℃로 옮기고 약 30℃로 서서히 냉각시킨다. 연결반응(ligation)은 적절한 완충액[예를 들면, TRIS 약 60mM, pM 약 7.6, DTT 약 10mM, MgCl2약 10mM, ATP 약 1mM 및 T4 DNA 리가제 약 0.03 단위를 함유하는 완충액, 단, 이로서 한정되지는 않는다]중에서, 약 20℃로 약 1.5시간 동안 수행한다.
연결된 올리고뉴클레오타이드는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 이용하여 정제한 다음, 에탄올로 침전시킨다. 올리고뉴클레오타이드를 약 80% 포름아미드 약 20㎛, TRIS-보레이트 약 50mM, pH 약 8.3, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 약 1mM, 약 0.1%(W/V) 크실렌 시아놀, 및 약 0.1%(W/V) 브로모페놀 블루를 함유하는 완추액중에 재용해시킨다. 각 시료를 약 90℃에서 약 3분 동안 가열한 다음, 약 10% 우레아-폴리아크릴아미드 겔 중에서, 약 75와트로 약 5시간 동안 전기영동시킨다. 231개의 염기 N-말단 밴드를 분리하여 합한 다음, EDTA 약 1mM을 함유하는 pH 8의 암모늄 아세테이트 약 0.5M 중에서, 약 4℃로 용출시킨다. 209개의 염기 C-말단 밴드를 동일한 방식으로 처리한다.
aFGF의 N-말단 또는 C-말단 부분을 암호화하는 합성 유전자 서열을 pBR322 플라스미드에 도입시킨다. 이것은 특히 바람직한 경우이며, aFGF 유전자가 도입될 수 있고 aFGF 유전자의 발현을 허용하는 그밖의 플라스미드를 사용하는 것도 본 발명의 범주에 포함된다. 재아닐링된 올리고뉴클레오타이드인 회수된 N-말단 231개 염기쌍 약 300fmole 및 약 100fmole을 각각, 아가로즈 겔로 정제된 N-말단에 대한 3.9킬로염기(kb) EcoRI-BamHI pBR322 약 100fmole에 연결시킨다. 209bp C-말단은 BamHI-SalI pBR322를 사용하여 동일한 방법으로 작제한다. 연결 반응은, TRIS 약 25mM, pH 약 7.8, DTT 약 1mM, MgCl2약 10mM, ATP 약 0.4mM과 함께 T4 DNA 리가제 약 1단위를 함유하는 완충액 중에서, 약 20℃로 약 1시간 동안 수행한다. 각각 반-유전자 연결된 벡터를 사용하며, 에스케리키아 콜라이 RRI(Bethesda Research Laboratories, BRL)등의 컴피턴트 세균 세포를 공급자들의 방법에 따라 형질전환시킨다. 형질전환된 세포를 암피실린 중에서의 성장으로 선별한 다음, 미니-용해질(mini-lysate) 플라스미드 작제물의 제한분석에 의해 231개 염기쌍(bp) EcoRI-BamHI 삽입물 또는 209개 bp BamHI-SalI 삽입물의 존재에 대해 스크리닝한다.
적절한 크기의 삽입물을 함유하는 클론의 DNA 서열을 막삼과 길버트의 화학적 DNA 서열 기술을 이용하여 측정한다[참조 : Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 560-564(1977)].
최종 완전-길이의 aFGF 합성 유전자는, N-말단 절반 클론을 제한효소 BamHI 및 SalI로 절단하고, 알칼리성 포스파타로제로 처리한 다음, 이것을 C-말단 절반 클론의 겔 정제된 209bp BamHI-SalI 삽입물에 연결시킴으로써 클로닝한다. 이 연결된 물질을 사용하여 상기에서와 같이 컴피턴트 RRI 세포를 형질전환시킨다.
합성 aFGF 유전자의 발현은 상이한 다수의 프로모터-발현 시스템에 의해 이루어진다. 이것은 바람직한 경우이며, 완전한 aFGF 유전자의 발현을 위한 프로모터-발현 시스템의 사용도 본 발명의 범주에 포함된다. 바람직한 작제물로서, 하기 문헌에 기술되어있는 바와 같은 trp 프로모터와 lac 프로모터 영역들 사이의 하이브리드인 이.콜라이 tac 프로모터를 사용한다[참조 : deBoer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80 : 21-25(1983)]. tac 프로모터와 rrnB rRNA 전사 터미네이터를 함유하는 플라스미드 pKK 223-3(Pharmacia)를 변형시켜 pBR322-유도된 SalI 제한효소 부위를 제거한다. rrnB rRNA 터미네이터는 강력한 프로모터에 의해 발현되는 것으로 밝혀졌다[참조 : Gentz et al., Proc. Natl. Acad. USA 78 : 4936-4940(1981) ; Brosius, Gene 27 : 161-172(1984)].
pKK 223-3 플라스미드 DNA를 제한 효소로 절단하여 2.7kb DNA 단편으로 만들고 클론 pKK 2.7을 생성시킨다.
합성 aFGF 유전자를 이의 pBR322 벡터로부터 절단하여, pKK 2.7을 EcoRI 및 SalI으로 제한분핸시킨 후에, pKK 2.7 플라스미드에 옮긴다. 생성된 재조합체(제1도에 도시됨)로 이.콜라이 JM 105(Pharmacia) 또는 DH5(BRL) 세포를 형질 전환시켜 발현시킨다.
부위특이적 돌연변이는 포유류의 특정한 aFGF 아미노산 서열을 다른 종의 aFGF 아미노산 서열로 전환시키는 유효한 방법이다. 하기의 설명은, 소 aFGF의 140개 아미노산형의 인간 aFGF로 부위특이적 돌연변이적 전환에 관한 것이지만, 이 방법은 특정한 포유류의 aFGF를 어떤 다른 종의 aFGF로 전환시키는데 사용할 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 전환에 있어서의 제한은 단지, 양쪽의 aFGF 아미노산 서열이 모두 알려져 있어야 한다는 것이다. 하기의 표는 치환되어야 하는 아미노산 및 치환이 일어나야 하는 표 Ⅲ에서의 소 aFGF 아미노산 지도상의 위치를 기재한 것이다 :
표 Ⅴ
소의 유전자 서열을 사용하여, 인간의 유전자 서열을 나타내는 8개의 올리고뉴클레오타이드를 소의 올리고뉴클레오타이드에서 사용하는 것과 동일한 방법으로 작제한다. 하기의 표는 인간 aFGF 유전자를 생산하는데 사용되는 다수의 올리고뉴클레오타이드 배열중의 하나를 나타내었다.
표 Ⅵ
aFGF에 대해 클로닝된 합성 소 유전자는 일련의 지시된 점 돌연변이에 의해 aFGF에 대한 인간 합성 유전자로 전환된다. 클로닝된 유전자의 올리고뉴클레오타이드-유도된 돌연변이 유발 반응은 생성된 아미노산 서열이 표 Ⅴ의 치환된 아미노산을 함유하고 인간 aFGF가 되도록 소 aFGF의 염기 서열로 변형시킨다. aFGF의 인간 139개 아미노산형 미소이종형을 생성시키기 위해 아미노 말단 페닐 알라딘이 제거되도록 소 유전자에서 결실을 수행한다. 점 돌연변이의 수행은 제2위치의 아스파라긴을 아스파르트산으로 대체시킨다. 한편, 아스파라긴은 아스파르트산으로 탈아미드화된다. 이들 과정을 수행하는 방법은 하기에 기술되어 있으며 당해 기술분야에 공지되어 있다. 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이 유발 반응은 당해 기술분야에 공지된 표준방법을 이용하여 수행된다[참조 : Zoller and Smith, Methods in Enzymology, 100 : 468-500(1983) : Norris et al., Nucleic Acids Research, 11 : 5103-5112(1983) ; 및 Zoller and Smith, DNA, 3 : 479-488(1984)]. 표준화된 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이 유발 반응에 의해 수행되는 점 돌연변이는 하기의 표 Ⅶ에 기재되어 있다. 염기의 돌연변이 유발 반응 위치는 표 Ⅲ에서 찾아볼 수 있다. 점 돌연변이는 인간 aFGF 유전자를 유발할 수 있는 변화의 한 예로서 제시된 것일 뿐이며, 이로서 제한되는 것은 아니다.
표 Ⅶ
발현클론을 트립톤 약 1%, 효모 추출물 약 0.5%, NaCl 약 0.5%, 글루코오즈 약 0.4% 및 암피실린 약 50㎍/ml로 구성돈 성장 배지 중에서 37℃로 성장시킨다. 500nm에서의 흡광도가 약 0.5에 도달하면, 이소프로필-β-D-티오갈락토 피라노사이드(IPTG)를 최종 농도가 약 1mM이 되도록 가한 다음, 37℃에서 약 3시간 동안 계속 성장시킨다.
배양배지 1l로부터 원심분리하여 세포를 수거한 후, 인산나트륨 약 10mM, pH 약 7.2, EDTA 약 5mM, N-P-톨루엔설포닐-L-페닐알라닌 클로로메틸 케톤(TPCK) 약 10.6㎍/ml, 펩스타틴 A 약 34.3㎍/ml, 페닐메틸 설포닌 플루오라이드(PMSF) 약 87㎍/ml, 소의 췌장 트립신 억제제(BPTI) 약 15㎍/ml, 및 로이펩신 약 25.2㎍/ml를 함유하는 분해 완충액중에 재현탁시킨다. 세포를 즉시 분해시키거나, 또는 동결시킨 다음 -70℃에서 보관하고 해빙시킨 직후에 약 12,000psi, 약 4℃에서 프렌치 압력 셀(French pressure cell)을 약 3회 통과시켜 파쇄시킨다. 상등액은 원심분리하여 수거한다.
재조합 aFGF는 헤파린-세파로오즈 친화성 크로마토그라피에 이어서 역상 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)를 수행하는 조합법을 이용하여 독특한 2-단계 크로마토그라피 방법에 의해 균질하게 정제한다. 조 r-aFGF를 pH가 약 6 내지 8인 약 10mM의 인산염 또는 TRIS와 같은 묽은 완충액중의 헤파린-세파로오즈 컬럼상에 충진시킨 다음, 280nm에서의 흡광도가 거의 기저상태로 떨어질 때까지, 약 0.8M NaCl 등의 저농도 염으로 연속해서 세척한다. r-aFGF를 약 1.5M NaCl을 함유하는 pH 약 6내지 8인 약 10mM의 인산나트륨 또는 TRIS와 같은 고농도의 완충된 염 용액으로 용출시킨다.
이어서, 용출액을 탄소수 3 내지 18, 바람직하게는 탄소수 4의 알킬 그룹을 갖는 공유결합된 알킬 실란 쇄로 구성된 수지상에서 역상 HPLC하여 정제한다. r-aFGF를 약10mM 트리플루오로아세트산, 아세트산 또는 인산 등의 묽은 산 중에서 평형상태인 HPLC 컬럼에 직접 적용시킨 다음, 아세토니트릴 도는 에탄올 등의 선형 구배의 유기용매로 용출시킨다. 소의 뇌-유래 aFGF는 헤파린-세파로오즈[참조 : Maciag et al., Science 225 : 932-935(1984)], 및 다단계 정제방법중의 일부로서 역상 HPLC 컬럼[참조 : Thomas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 357-361(1984)]둘다에 결합하는 것으로 이미 기술되어 있다. 세균 용해질중의 비교적 풍부한 r-aFGF에 부분적을 근거하여 이들 2단계만으로도 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동법에 의해 수득되는 것과 같은 약 16,000달톤의 순수한 균질성의 r-aFGF를 충분히 수득할 수 있음이 증명되었다. 이들 2단계만으로는 뇌로부터 순순한 aFGF는 수득할 수 없다.
정제된 aFGF의 유사분열 촉진 활성은 섬유 아세포 세포주, 바람직하게는 BALB/c 3T3 A31(American Type Culture Collection)에 의한 DNA로의3H-티미딘 도입에 의해 측정한다. 재조합 aFGF는 섬유아세포 자극 시험에 있어서 ml당 단백질 약 1ng 또는 그 미만에서 피크반응을 나타낸다.
본 발명의 또다른 양태는, 신규한 펩타이드를 단독으로 또는 헤파린과 함께, 바람직하게는 헤파린과 함께, 국소 또는 피하로 창상부위의 cm2당, 본 발명의 물질 약 1 내지 500㎍의 양으로, 국소적으로 적용하는 경우 표면 cm2당 약 0.1 내지 약 100㎍/ml양으로 적용시켜 창상의 치유를 촉진시키는 방법이다.
투약을 위하여, 활성 성분 약 1 내지 약 100㎍/ml의 양을 혼입시킨 연고제, 페이스트제, 액제, 겔, 수용성 고체 중합체(예 : 알부민, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로오즈, 플루로닉스, 테트로닉스 또는 알기네이트)등의 각종 약제학적인 제형이 유용하다.
섬유아세포, 혈관 및 각막 내피세포 등을 포함하는 각종 형태의 세포에 있어서 분열을 촉진시키는 aFGF의 능력은 이들 펩타이드가 약제로서 유용하도록 한다. 이들 화합물은 치료를 필요로 하는 환자에게 신규한 r-aFGF를 투여함으로써 인간을 포함한 포유류의 창상을 치료하는데 사용할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하나 이들로써 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
올리고뉴클레오타이드 합성
올리고뉴클레오타이드는 하기 문헌들에 기술된 방법에 따라 합성한다[참조 : Matteucci 및 Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103 : 3185-3191(1981) ; Beaucage 및 Caruthers, Tetrahedron Letters 22 : 1859-1862(1981)]. 합성된 올리고뉴클레오타이드의 염기 서열은 표(Ⅳ)에 나타내었다.
실시예 2
aFGF 유전자의 조합
실시예 1로부터의 올리고뉴클레오타이드를 2개의 별도 단위, 즉 N-말단 절반(231bp) 및 C-말단 절반(209bp)으로 조합한다. 이어서, 2개의 절반들을 완전한 합성 유전자를 만들기 위해 합한다[표 (Ⅲ) 참조]. 우선 올리고뉴클레오타이드를 70mM 트리스 pH 7.6, 5mM DTT, 10mM MgCl2, 33μM ATP, 1μl 당 0.3 단위의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제, 및 1μl 당 2.5pmole의 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 반응 혼합물중에서 인산화시킨다. 혼합물을 37℃에서 1.5시간 동안 항온처리한 다음 혼합물에 0.2 단위/μl의 키나제 및 100mM의 농도를 제공하는 ATP를 보충한 후에 추가로 1시간 동안 항온처리한다. 방사성 표지를 위해, 초기 혼합물에는 37nCi/μl의 [r-32P]-ATP를 함유시킨다.
아닐링 연결반응을 2개의 별도반응으로 수행한다. 각 반응에서, 8개의 올리고뉴클레오타이드 각각 100pmole씩을 첨가한다. 하나의 반응에서, C-말단 또는 N-말단 절반 유전자의 하나의 쇄를 이루는 올리고뉴클레오타이드들을 가장 큰 5' 올리고뉴클레오타이드를 제외하고 인산화시킨다. 두번째 반응에서, 반대 쇄를 이루는 올리고뉴클레오타이드들을, 다시 가장 큰 5' 올리고뉴클레오타이드를 제외하고 인산화시킨다. 즉, 각 반응에서 3개의 올리고뉴클레오타이드가 인산화되고 5개의 올리고뉴클레오타이드가 인산화되지 않았다. 인산화된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 경우, 후에 생성물을 동정하기 위해32P-표지된 올리고뉴클레오타이드 1pmole을 가한다. 각 반응물에는 70mM 트리스 pH 7.6, 5mM DTT, 10mM MgCl2및 30μM ATP로 이루어진 용액을 200μl를 함유시킨다. 올리고뉴클레오타이드를 90℃로 4분 동안 가열한 다음, 즉시 반응 혼합물을 60℃로 옮기고 30℃로 서서히 냉각시킴으로써 아닐링시킨다. 연결반응은 60mM 트리스 pH 7.6, 10mM DTT, 10mM MgCl2, 1mM ATP 및 1μl당 0.03 단위의 T4 DNA리가제를 함유하는 용액 400μl 중에서 20℃로 1.5시간 동안 배양함으로써 수행한다.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 사용하여 연결된 올리고뉴클레오타이드를 정제한다. 연결된 올리고뉴클레오타이드를 에탄올로 사용하여 침전시킨 다음, 80% 포름아미드, 50mM 트리스-보레이트 pH 8.3, 1mM EDTA, 0.1%(W/V) 크실렌 시아놀 및 0.1%(W/V) 브루모페놀 블루로 이루어진 용액 20μl에 재용해시킨다. 각 시료를 90℃에서 3분 동안 가열하고, 10% 우레아-폴리아크릴아미드 겔중 75와트에서 5시간 동안 전기영동시킨다. 올리고뉴클레오타이드 밴드는 겔을 X-레이 필름에 노출시킴으로써 가시화된다.
N-말단에 대한 각 반응 혼합물의 231 염기 밴드를 겔로부터 절단하여 합한 다음, 암모늄 아세테이트 0.5M 및 EDTA 1mM 용액 1ml(pH=8)중 4℃에서 용출시킨다. 용출된 DNA를 에탄올로 사용하여 침전시키고, 70mM 트리스 pH 7.6, 5mM DTT 및 10mM MgCl2의 용액 30μl중에 재용해시킨다. C-말단의 209 염기 밴드를 동일한 방식으로 용출시킨다.
겔 정제된 올리고뉴클레오타이드를 형질전환시키기 전에 90℃로 4분 동안 가열한 다음 20℃로 서서히 냉각시킴으로써 아닐링시킨다. 초기 출발 올리고뉴클레오타이드로부터의 회수율을 5%로 가정하여, 회수된 아닐링된 231bp 올리고뉴클레오타이드 300fmole 및 100fmole을 각각, 25mM 트리스 pH 7.8, 1mM DTT, 10mM MgCl2, 0.4mM ATP 및 1단위의 T4 DNA 리가제의 완충액 20μl중 20℃에서 1시간 동안 아가로즈겔로 정제된 3.9kb EcoRI-BamHI pBR 322 단편 DNA 100fmole에 연결시킨다. 아닐링된 209bp 올리고뉴클레오타이드는 상기 231 염기쌍 단편과 동일한 조건하에서 아가로즈로 정제된 3.9kb BamHI-SalI pBR322 단편 DNA에 연결시킨다. 연결 반응물을 H2O 중에서 1 : 5로 희석시킨 다음, 희석액 1μl를 사용하여 공급자에 의해 기술된 바대로 컴피턴트이. 콜라이 RRI세포(BRL) 20μl를 형질전환시킨다. 형질전환체를 암피실린 중에서의 성장으로 선별한 다음, 미니-용해질 플라스미드 생성물의 제한분석에 의해 231bp EcoRI-BamHI 또는 209 BamHI-SalI 삽입물의 존재에 대해 스크리닝한다.
적절한 크기의 삽입물을 함유하는 클론의 DNA 서열을 하기 문헌에 기술된 화학적인 DNA 서열 기술을 사용하여 결정한다[참조 : Maxam 및 Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 560-564(1977)]. 231bp 클론중 어느것도 정확한 서열을 가지고 있지 않으므로, 정확한 서열을 함유하는 클론을 다음과 같이 제조한다. KpnI 부위와 BamHI 부위 사이에 정확한 서열을 갖는 하나의 클론을 pBR322 벡터 중에서 KpnI 및 SalI 으로 절단한다. 400bp 밴드를 겔 정제한 다음, aFGF 유전자 삽입물의 EcoRI 부위로부터 KpnI 부위까지의 정확한 서열을 함유하는 제2클론의 3.8kb KpnI-SalI 밴드에 연결시킨다. 형질전환시킨 후, 생성된 클론을 서열화하여 목적하는 서열이 수득되었는지를 확인한다.
정확한 209bp 서열을 함유하는 클론이 수득되므로, 이들 클론에 대해서는 추가의 조작이 필요치 않다. 최종의 완전-길이 aFGF 합성 유전자는 N-말단 절반 클론을 BamHI 및 SalI 으로 절단하고, 알칼리성 포스파타제로 처리한 다음, 이것을 C-말단 절반 클론의 겔 정제된 209bp BamHI-SalI 삽입물에 연결시킴으로써 클로닝한다. 이 연결된 물질을 사용하여 상기에서와 같이 컴피턴트 RRI 세포를 형질전환시킨다.
실시예 3
합성 소 aFGF 유전자의 발현
실시예 2로부터의 완전한 aFGF 유전자를 변형된 pKK 223-3 플라스미드내로 도입시킨다. pKK223-3 플라스미드(Pharmacia)는 trp 프로모터 영역과 lac 프로모터의 영역 사이의 하이브리드인 tac 프로모터를 함유한다[참조 : deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 21-25(1983)]. 이 플라스미드는 또한 강한 프로모터로부터 발현시키는 것으로 밝혀진 강한 터미네이터 서열인 rrnB rRNA 전사 터미네이터를 함유한다.[참조 : Gentz et al., Proc. Natl. Acad. USA 78 : 4936-4940(1981) ; Brosius, Gene 27 : 161-172(1984)]. pKK 223-3 플라스미드를 변형시켜 pBR322-유도된 SalI 제한효소 부위를 제거한다. 이것은 pKK223-3 플라스미드 DNA를 NdeI 및 NarI으로 절단시키고, 2.7kb DNA 단편을 재환상화시켜 클론 pKK 2.7을 생성시킴으로써 수행한다. 이어서 합성 aFGF 유전자를 이의 pBR322 벡터로부터 절단하고, pKK 2.7을 EcoRI 및 SalI으로 제한시킨 후, 이 발현 벡터로 합성 aFGF 유전자를 옮긴다. 이러한 작제법으로, 합성 유전자 11염기쌍의 처음에 메티오닌을 Shine-Dalgarno 리보좀 결합 부위의 하부스트림에 위치시킨다. 생성된 재조합체(제1도 참조)를 사용하여, 이. 콜라이 JM 105 세포 및 또한 이. 콜라이 DH5 세포를 형질전환시킨다.
발현 클론을 0.4% 글루코오즈 및 50㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 육즙(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl)중 37℃에서 성장시킨다. 550nm에서의 흡광도가 0.5에 도달하면, IPTG를 첨가하여 1mM 농도를 수득한 다음, 37℃에서 3시간 동안 계속 성장시킨다. 세포를 10,000xg 에서 20분동안 원심분리시켜 수거하고 배양물 1l로부터의 세포를 10mM 인산나트륨 pH 7.2(헤파린-세파로오즈 완충액) 5mM EDTA, 10N 6㎍/ml TPCK, 34.3 ㎍/ml 펩스타틴 A, 87㎍/ml PMSF, 15㎍/ml BPTI, 및 34.3㎍/ml 로이펩틴을 함유하는 용액 20ml중에 재현탁시킨다. 재현탁된 세포를 드라이아이스/에탄올 욕에서 신속히 동결시키고 -70℃에서 밤새 보관한다.
실시예 4
재조합 aFGF의 추출 및 정제
실시예 3에서 수득된 동결시킨 세포를 해빙시켜 추가로 PMSF 87㎍/ml를 가한 다음, 12,000psi하에 4℃에서 생성물을 프렌치 압력 쎌에 3회 통과시킨다. 생성된 용해질을 93,000 xg으로 30분간 원심분리하여 파쇄물을 제거한다. 상등액을 분리하여 1M NaOH를 사용하여 pH 7.2로 조절한 후, 4℃에서 1.6×10cm 헤파린-세파로오즈(Pharmacia) 컬럼상에 유출 속도를 20ml/시간으로 충전시켜 2ml씩의 분획을 모은다. 펠렛을 pH 7.2의 10mM 인산나트륨과 2M NaCl를 함유하는 용액 5ml중에 재현탁시킨 다음, 30분 동안 93,000xg로 재원심분리시키고 상등액을 pH 7.2 의 10mM 인산나트륨을 사용하여 3배의 용적으로 희석시키고, 필요에 따라 1M NaOH로 pH를 7.2로 재조절한 후, 동일한 헤파린-세파로오즈 컬럼상에 충진시킨다. 충진시킨 후, 280nm에서의 흡광도가 기저상태로 떨어질 때까지, pH 7.2 의 10mM 인산나트륨과 0.8M NaCl을 함유하는 용액으로 컬럼을 세척한다. 결합된 r-aFGF는 10mM 인산나트륨과 1.5M NaCl을 함유하는 용액(pH 7.2)을 사용하여 단일 피크로서 용출시킨다. 헤파린-세파로오즈 컬럼으로부터 모은 분획들을 하기 문헌에 기술된 바와 같이 4.6mm×25cm C4컬럼(Separation Group)을 사용하여 역상 HPLC에 의해 정제한다[참조 : Thomas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 357-361(1984)]. r-aFGF는 오염물의 다중의 소 피크로부터 해상되어 단일의 주 피크로서 용출되며, 이는 단백질이 균질하게 순수한 상태임을 시사한다. 순도를 확인하는데는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법이 이용된다. 정제된 r-aFGF를 하기 문헌의 기술에 따라 전기영동한다[참조 : O'Farrell J. Biol. Chem. 250 : 4007~4021(1975)]. 은 염색법에 의해 분자 질량이 16,000달톤인 단일 밴드가 나타난다. aFGF로서의 단백질의 동일성은 아미노산 분석 및 아미노 말단 서열을 결정함으로써 확인된다.
실시예 5
소 재조함 aFGF의 생물학적 활성
실시예 4로부터 수득한 정제된 r-aFGF의 생물학적 활성은 하기 문헌에 기술된 섬유아세포의 유사분열 시험을 이용하여 평가된다[참조 : Thomas et al., J. Biol. Chem. 225 : 5517-5520(1980)]. BALB/c 3T3 A1 섬유아세포(American Type Culture Collection)를 10% 가열-불활성화된 송아지 혈청을 함유하는 배양 배지 중에서 2×104개의 세포/35mm 직경 웰의 농도로 도말한 다음, 7% CO2(pH 7.35±0.005) 중에서 배양한다. 세포 배지는 0.5% 가열-불활성화된 송아지 혈청으로 6시간 후에 대체시키고 다시 24시간 후에 대체시킴으로써 전혀 반응하지 않게 된다. 도말한지 55시간 후, 헤파린 50㎍, 시험 시료 및 덱사메타손 1.1㎍을 가하고, 70시간 후엔 각각의 웰에[메틸-3H ]-티미딘(20Ci/mmole, New England Nuclear) 2μCi 및 표시되지 않은 티미딘(시그마)를 보충시키고, 95시간 후에 DNA에 도입된 방사성 표지물질을 측정한다. 각 용량-반응점은 3회 측정한 것의 평균 값을 취한다. 결과는 하기의 표에 기재되어 있다 :
표 Ⅷ
재조합 aFGF의 활성은 뇌에서 유래한 aFGF의 활성과 동일하거나 또는 이보다 조금 더 크다. 정제된 r-aFGF는 약 71pg/ml에서 DNA 합성의 반-최대 자극치를 갖는 반면, 정제된 뇌 유래 aFGF는 126pg/ml가 반-최대치이다.
실시예 6
소 aFGF 유전자의 인간 aFGF 유전자로의 돌연변이 유발
소 aFGF 유전자의 돌연변이 유발을 촉진시키기 위하여, 실시예 2로부터의 합성유전자를 일본쇄 DNA 박테리오 파지 벡터인 M13mp19에 옮긴다. 표준 돌연변이 유발방법은 하기 문헌에 보고된 방법을 이용한다[참조 : Zoller and Smith, Methods in Enzymology, 100 : 468-500(1983) ; Norris et al., Nucleic Acids Research, 11 : 5103-5112(1983) ; 및 Zoller and Smith, DNA, 3 : 479-488]. 소 pKK-aFGF 플라스미드를 EcoRI 및 SalI로 절단하고(표 Ⅲ 참조). 생성된 440bp 단편을 실시예 2에서와 같이 아가로즈 겔 정제한다. 벡터 M13mp19 RF DNA(BRL)를 동일한 2개의 엔도 뉴클레아제로 절단하고, 그 말단 부분을 10mM TRIS pH 8.0 완충액 100μl 중에서 세균의 알칼리성 포스파타제 100단위를 사용하여 연속적으로 탈인산화시킨다. 연결반응은 T4 DNA 리가제 2단위를 함유하는 25mM TRIS, pH7.8,10mM MgCl2, 1mM DTT, 0.4mM ATP의 완충액 10μl중에서 처린된 벡터 DNA 50mg 및 aFGF 유전자 단편 DNA 12ng을 이용하여 4℃에서 16시간 동안 수행한다. 반응 혼합물을 H2O 중에서 1 : 5로 희석시킨 다음, 희석액 1μl를 사용하여 공급자에 의해 기술된 바와 같이 컴피턴트 이. 콜라이 DH 5세포(BRL) 20μl를 형질전환시킨다. 0.03% X-gal 및 0.3mM IPTG 중에서 상기 세포를 이. 콜라이 JM 105(Pharmacia) 숙주세포상에 도말하고 ; 37℃에서 배양한 후, 무색 플라크를 분리시킨다. 소 aFGF 유전자을 함유하는 하나의 파지 클론인 M13mp19-aFGF를 선별한다.
8개의 올리고뉴클레오타이드는 인간 서열을 특정화하도록 설계되고 합성된다(표Ⅵ 참조).
올리고머 8은 소 유전자 중의 386 부위의 티민이 인간 유전자 중의 시토신으로 대체되는 추가의 돌연변이를 포함한다. 이 돌연변이는 인간 aFGF 아미노산 서열을 변화시킴이 없이 제한부위의 도입을 허용한다.
인간 올리고머 1, 2, 3, 4, 6 및 8을 인산화시킨 후, 각각의 올리고머 15pmole을 각각 20mM 트리스, pH 7.5, 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 1mM DTT를 함유하는 용액 10μl중에서, 65℃로 10분 동안 및, 이어서 23℃에서 10분 동안 0.5pmole의 M13mp19-aFGF 일본쇄 파지 DNA에 개별적으로 아닐링시킨다. 이어서, 폐환된 환상 이본쇄 분자를 20mM 트리스 pH 7.5, 10mM MgCl2, 25mM NaCl, 5.5mM DTT, 0.5mM ATP, 0.25mM dATP, 0.25mM dCTP, 0.25mM dCTP, 0.25mM dGTP, 0.25mM dTTP을 함유하는 용액 20μl중에서 T4DNA리가제 1단위와 DNA 폴리머라제 I 클레노우(Klenow) 단편 2단위를 사용하여 15℃에서 17시간 동안 항온처리시킴으로써 작제한다. 각 작제물을 사용하여 컴피던트 JM105 세포를 형질 전환시킨 다음, 생성된 형질전환채 플라크를32P-ATP 와 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 방사성 표지한 적절한 올리고머와 하이브리드화를 시켜 선별한다. 하이브리드화의 조건은 단일 염기 변화를 함유하는 하이브리드의 형성을 방지하도록 각각의 프로브에 대해 최적화시킨다. 일본쇄 DNA를 인간 올리고머 4 돌연변이를 함유하는 파지 클론으로부터 분리하고, 인간 올리고머 5를 이용하여 상기의 방법을 반복 수행함으로써 올리고머 4 및 5의 돌연변이 모두를 함유하는 클론을 생성시킨다.
하기 방법으로, 이들 M13-기본 클론에서의 소에서 인간 서열로의 돌연변이체를 하나의 pBR322-기본 클론에 조합한다. RF DNA는 인간 올리고머 1, 2, 6 및 8에 의해 특정화된 염기의 변화가 있는 클론으로부터 제조된다. 인간 1 돌연변이체 클론의 DNA를 EcoRI으로 절단하고 그 말단을 세균의 알칼리성 포스파타제로 탈인산화시킨 다음, DNA를 HindⅢ로 절단한다. 인간 2 돌연변이체 DNA를 Hind Ⅲ으로 절단하고 포스파타제로 처리한 다음, BamHI으로 절단한다. 인간 6 돌연변이체 DNA를 BamHI로 절단하고 포스파타제로 처리한 다음, 이어서 ApaI으로 절단한다. 마찬가지로,인간 8 돌연변이체 DNA를 ApaI으로 절단하여 그 말단을 탈인산화시킨 다음 DNA를 SalI로 절단한다. 이 들 4개의 DNA 생성물을 2% 아가로즈를 통해 전기영동시키고, 인간 1, 2, 6 및 8 돌연변이체를 함유하는 돌연변이체 DNA로부터의 각각의 45bp, 190bp, 135bp 및 70bp 단편을 겔로 부터 용출시킨다.
각각의 단편 약 60fmole을 25mM 트리스 pH 7.5, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 0.4mM ATP를 함유하는 용액 5μl중에서 T4 DNA 리가제 1.5 단위를 사용하여 12 ℃에서 16시간 동안, pBR 322 의 겔-정제된 3.7kb EcoRI-SalI 단편 약 60fmole에 집합적으로 연결시킨다. 반응 혼합물은 H2O를 사용하여 1 : 5로 희석시키고, 희석액 1μl를 사용하여 공급자의 의해 기술된 컴피턴트 이. 콜라이 DH5 세포(BRL) 20μl를 형질전환시킨다. 4개의 돌연변이체 올리고머 모두에 의해 특정화된 돌연변이체를 함유하는 클론을 각각의 올리고머로부터 제조된 방사성 표지된 프로브와의 하이브리드화에 의해 선택된다. 인간 3 돌연변이체 M13 클론의 절단된 RF DNA로부터 분리된 140bp KpnI-BamHI DNA 단편을 인간 1-2-6-8 돌연변이체 DNA의 엔도뉴클레아제 절단 생성물에 연결시킨 다음, DH5의 컴피턴트 세포내로 형질전환시켜 인간 1-2-3-6-8 돌연변이를 갖는 클론을 생성시킨다. 후자의 클론의 BamHI-PstI 분해 단편을 인간 4-5 M13-기본 클론으로 부터의 RF DNA의 BamHI-PstI 분해 단편에 연결시킨 다음, 연결 혼합물을 사용하여 적절한 DH5 컴피턴트 세포를 형질전환시킨다. 올리고머 하이브리드화에 의해 인간 1-2-3-4-5-6-8 돌연변이를 갖는 클론을 선택하고, 이 재조합 플라스미드의 aFGF 유전자 EcoRI-SalI DNA 단편을 M13mp18(BRL)의 포스타제로 처리된 EcoRI-SalI-절단 RF DNA에 연결시킨다.
이렇게 연결된 DNA로 컴피턴트 DH5 세포를 형질전환시킨 후, 형질전환된 세포를 JM105 숙주 세포상에 도말하여 M13 클론을 생성시킨다. 이 클론의 일본쇄 파지 DNA를 인간 7 올리고머와 아닐링시키고, 모든 목적하는 돌연변이를 갖는 M13 클론을 상기에서 기술한 방법에 따라 수득한다. 이 클론으로부터 RF DNA를 작제한 다음 EcoRI 및 SalI으로 절단한다. 생성된 440bp 밴드를 겔 정제한 후, pKK 2.7tac 프로모터 발현 벡터의 2.7kb EcoRI-SalI DNA 단편에 연결시킨다. 이 DNA를 사용하여 컴피턴트 DH5 세포를 형질전환시키고, aFGF의 인간형을 생산하는데 사용되는 인간 pKK-aFGF 발현 클론을 생성시킨다.
인간 r-aFGF를 소 r-aFGF에 사용한 것과 동일한 방법으로 정제한다(실시예 4 참조). 인간 r-aFGF는 약 1ng/밴드의 감도를 가지며 정제된 인간 r-aFGF 400ng으로 충진된 은 염색된 SDS 전기영동 겔상에서 나타나는 단일의 강한 밴드에 근거하여 99.75% 이상의 순도를 갖는 것으로 판단된다. 이 방법은 실시예 4에 기술되어 있다.
순수한 재조합 인간 aFGF는 실시예 5에서 소의 재조합 단백질에 대해 기술한 바와 같이 융합 BALB/c 3T3 세포내로의3H-티미딘 도입을 사용하여 유사분열 활성을 시험한다. 혈관 내피 세포상에서 시험한 인간의 뇌에서 유래된 aFGF에 대해 이미 관찰된 바에 따르면, 재조합 인간 단백질은 헤파린(50㎍/ml)를 활성화시키는데 있어서 뇌에서 유래된 aFGF 또는 재조합 소 aFGF와는 매우 상이하며[참조 : Gimenez-Gallego et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 135 : 541-548(1986)] ; Balb/c 3T3 세포상에서 재조합 인간 aFGF에 대한 결과는 하기의 표에 기재되어 있다.
Ⅸ
인간 r-aFGF에 대한 Balb/c 3T3 섬유아세포의 유사분열 반응
* 피코 그램=10-12그램
헤파린의 존재하에서, 반-최대자극은 약 42pg/ml에서 나타난다. 헤파린이 결여된 상태에서는, 최고의 농도에서도 피크가 명확하게 나타나지 않으며 농도가 약 30mg/ml보다 커야 피크가 나타난다.
Claims (44)
- 하기의 아미노산 서열을 갖는 재조합 소 산성 섬유아세포 성장인자(recombinant bovine acidic fibroblast growth factor).
- 제1항에 있어서, 메티오닌이 제1위치의 페닐알라닌에 결합되어 있는 재조합 소 산성 섬유아세포 성장인자.
- 제1항의 재조합 소 산성 섬유아세포 성장인자의 미소 이종형(microheterogeneous form).
- 제1항의 재조합 소 산성 섬유아세포 성장인자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
- 제2항의 재조합 소 산성 섬유아세포 성장인자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
- 제4항에 있어서, 염기 서열이 다음 염기 서열 중의 어느 하나인 뉴클레오타이드 서열.
상기 서열에서, Q는 C 또는 T이며, P는 A 또는 G이고, N은 A, T, C 또는 G이다. - 제6항에 있어서, 메티오닌에 대한 코드가 페닐알라닌에 대한 코드의 앞에 있는 뉴클레오타이드 서열.
- 제7항에 있어서, 염기 서열이 하기와 같은 뉴클레오타이드 서열.
- 삽입된 제8항의 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 구조가 제1도에 도시되어 있는 발현 플라스미드.
- 제9항에 있어서, 플라스미드가 pBR 322인 플라스미드.
- 제9항의 플라스미드에 대해 적합하며 이 플라스미드를 함유하는 에스케리키아 콜라이(Escherichiacoli) 숙주.
- 제11항에 있어서, 숙주가 에크케리키아 콜라이 JM105 또는 에스케리키아 콜라이 DH5인 숙주.
- 제9항에 있어서, 제1항의 소 산성 섬유아세포 성장인자의 아미노산 서열을 발현시킬 수 있는 플라스미드.
- 일차 섬유아세포, 혈관 및 각막 내피세포, 연골세포, 조골세포, 근원세포, 평활근세포 및 신경교 세포에서 DNA 합성을 촉진시킬 수 있는 제11항의 숙주에 의해 생성된 제1항의 단백질.
- a) 제1항의 소 산성 섬유아세포 성장인자를 암호화하는 제8항의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드를 제조하고[여기서 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드를 함유한 숙주에 의해 발현될 수 있다] ; b) 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 숙주내에 도입시키고 ; c) 플라스미드를 함유한 숙주를 소 산성 섬유아세포 성장인자를 생성하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시키기에 적합한 조건하에 유지시키는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 제1항의 소 산성 섬유아세포 성장인자를 제조하는 방법.
- 약제학적 담체, 및 1 내지 100㎍/ml의 제1항의 재조합 소 산성 섬유아세포 성장인자를 포함함을 특징으로 하는 창상 치유용 약제학적 조성물.
- 약제학적 담체, 및 1 내지 100㎍/ml의 제3항의 재조합 소 산성 섬유아세포 성장인자를 포함함을 특징으로 하는 창상 치유용 약제학적 조성물.
- 하기의 아미노산 서열을 갖는 재조합 인간 산성 섬유아세포 성장인자.
- 제18항에 있어서, 메티오닌이 제1위치의 페닐알라닌에 결합되어 있는 재조합 인간 산성 섬유아세포 성장인자.
- 제18항에 있어서, 제1위치의 페닐알라닌이 제거되고 제2위치의 아미노산이 아스파라긴 또는 아스파르트산인 재조합 인간 산성 섬유아세포 성장인자.
- 제18항의 재조합 인간 산성 섬유아세포 성장인자의 미소 이종형.
- 제18항의 재조합 인간 산성 섬유아세포 성장인자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
- 제19항의 재조합 인간 산성 섬유아세포 성장인자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
- 제23항에 있어서, 염기 서열이 하기와 같은 뉴클레오타이드 서열.
- 제8항에 있어서, 염기 서열이 점 돌연변이(point mutation)에 의해 치환되어 제24항의 염기 서열을 제공하는 뉴클레오타이드 서열.
- 삽입된 제24항의 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 구조가 제1도에 도시되어 있는 발현 플라스미드.
- 제26항에 있어서, 플라스미드가 pBR 322인 플라스미드.
- 제26항의 플라스미드에 대해 적합하며 이 플라스미드를 함유하는 에스케리키아 콜라이 숙주.
- 제28항에 있어서, 숙주가 에스케리키아 콜라이 JM105 또는 에스케리키아 콜라이 DH5인 숙주.
- 제26항에 있어서, 제18항의 인간 산성 섬유아세포 성장인자의 유전자를 발현시킬 수 있는 플라스미드.
- 제26항에 있어서, 제18항의 인간 산성 섬유아세포 성장인자에 대한 합성 뉴클레오타이드 서열을 발현시킬 수 있는 플라스미드.
- 일차 섬유아세포, 혈관 및 각막 내피세포, 연골세포, 조골세포, 근원세포, 평활근세포 및 신경교 세포에서 DNA 합성을 촉진시킬 수 있는 제28항의 숙주에 의해 생성된 제18항의 단백질.
- a) 제18항의 인간 aFGF를 암호화하는 제24항의뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드를 제조하고[여기서 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드를 함유하는 숙주에 의해 발현될 수 있다] ; b) 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 숙주내에 도입시키고 ; c) 플라스미드를 함유한 숙주를 인간 aFGF를 생성하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시키기에 적합한 조건하에 유지시키는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 제28항의 인간 aFGF를 제조하는 방법.
- 약제학적 담체, 및 1 내지 100㎍/ml의 제28항의 재조합 인간 산성 섬유아세포 성장인자를 포함함을 특징으로 하는 창상 치유용 약제학적 조성물.
- 약제학적 담체, 및 1 내지 100㎍/ml의 제29항의 재조합 인간 산성 섬유아세포 성장인자를 포함함을 특징으로 하는 창상 치유용 약제학적 조성물.
- 약제학적 담체, 및 1 내지 100㎍/ml의 제31항의 재조합 인간 산성 섬유아세포 성장인자의 미소 이종형을 포함함을 특징으로 하는 창상 치유용 약제학적 조성물.
- a) 친화성 크로마토그라피 매트릭스와 허용되는 용출제를 사용하여 재조합 aFGF를 부분적으로 정제하고, b) 부분적으로 정제된 재조합 aFGF를, 알킬 실란 지지체 및 허용되는 용출제를 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그라피에 의해 최종적으로 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 재조합 산성 섬유아세포 성장인자(aFGF)를 순수한 형태로 정제하는 방법.
- 제37항에 있어서, 단계 a)에서의 친화성 매트릭스가 헤파린-세파로즈인 방법.
- 제37항에 있어서, 단계 b)에서의 알킬 실란 지지체가 3 내지 18개의 탄소원자를 함유하는 방법.
- 제37항에 있어서, 단계 b)에서의 알킬 실란 지지체가 4개의 탄소원자를 함유하는 방법.
- 제37항에 있어서, 단계 a)에서 aFGF를 염화나트륨으로 용출시키는 방법.
- 제37항에 있어서, 단계 b)에서 aFGF를 산과 유기 용매를 포함하는 용출구배에 의해 정제하는 방법.
- 제42항에 있어서, 산이 트리플루오로아세트산, 인산 또는 아세트산인 방법.
- 제42항에 있어서, 유기 용매가 아세토니트릴 또는 에탄올인 방법.
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