JPS6394991A - 酸性繊維芽細胞成長因子のクロ−ニング及び発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 脳由来繊維芽細胞マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）はト
ロウェルら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
バイオロジー、第１６巻、第５ｏ−７ｏｂ。

１９３９年（Ｔｒｏｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉ−ｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、土６　：　６０−７０　（１９３９））及び
ホフマン、グロース、第４巻、第３６１−３７６頁、１
９４０年（Ｈｏｆｆｍｏｎ、　Ｇｒｏｗｔｈ　４　：３
６１−３７６　（１９４０））によって最初に発表され
た。脳下垂体抽出物も繊維芽細胞に対して有効なマイト
ジェン活性を有することがその後明らかにされた〔アル
メリン、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７０巻、第２７０２
−２７０６頁。

１９７３年（Ａｒｍｅｌｉｎ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
　ｏｆ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅ＋ｗｙ　　ｏｆ　
　５ｃｉｅｎｃｅ　　ＵＳＡ　　　−７二−〇：２７０
２−２７０６　（１９７３））。脳及び下垂体双方の繊
維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の部分精製体は、脈管系内
皮細胞をはじめとする様々なタイプの分化細胞に対して
マイトジェン活性を示した〔ゴスボダロウイクズら、ナ
ショナル・キャンサー・インスティテユート・モノグラ
フ、第４８巻、第１０９−１３０頁、１９７８年（Ｇｏ
ｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｍｏｎｏｇ
ｒａｐｈ　、土ｌ：１０９−１３０　（１９７８）））
。最近になり、ＦＧＦは２つの型、即ち酸性ＦＧＦ　（
ａＦＧＦ）及び塩基性ＦＧＦ　（ｂＦＧＦ）として存在
することが判明し、両型とも脳調製物中で確認された〔
トーツス及びギメネツーガレゴ、ＴｌＢ５．第１１巻、
第８１−８４頁、１９８６年（Ｔｈｏｍａｓ　ａｎｄＧ
ｉｍｅｎｅｚ　−Ｇａｌｌｅｇｏ、　ＴｌＢ５工土：８
ｌ−８４（１９８６）））。様々なタイプの細胞、例え
ば−次繊維芽細胞、脈管系及び角膜系内皮細胞、軟骨細
胞、骨芽細胞、筋原細胞、平滑筋細胞及び神経膠細胞は
、ＤＮＡ及び分割体を合成させるための精製ａＦＧＦ又
はｂＦＧＦによる促進に対し応答する〔エスク（Ｅｓｃ
ｈ）　　ら、プロシーディング・オプ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８２巻、第６５
０７−６５１１頁。

１９８５年；クオら、フエデレーション・プロシーディ
ング、第４４巻、第６９５頁、１９８５年（Ｋｕｏ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇ　４４　：６９５　（１９８５））。

純粋なウシ脳由来ａ　ＦＧＦは、培地中において脈管系
内皮細胞の有効なマイトジェンとして作用するのみなら
ず、生体内において血管成長を誘導する〔トーツス（Ｔ
ｈｏｍａｓ）　　ら、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８２巻
、第６４０９−６４１３頁。

１９８５年）。ａＦＧＦの繊維芽細胞マイトジェン活性
は、創傷治癒を促進させるためにも利用することができ
る〔トーマス、米国特許第４．４４４，７６０号明細書
〕。本発明は、治療上利用可能な純粋なａＦＧＦを大量
に産生じ得る遺伝子構造体及び発現手段を提供する。

したがって、特定タンパク質のアミノ酸配列からウシａ
　ＦＧＦ及びヒトａ　ＦＧＦ双方のヌクレオチド塩基配
列を得ることが、本発明の目的である。

もう１つの目的は、特定のａ　ＦＧＦについてコードす
る遺伝子を製造し、かつ遺伝子を適当なりローニング用
ベクター組入れることである。他の目的は、各々の組換
えベクターで適当な宿主を形質転換し、かつ特定のａＦ
ＧＦ遺伝子の発現を誘導させることである。もう１つの
目的は、生物学的活性のウシａ　ＦＧＦ及びヒ）ａＦＧ
Ｆを単離かつ精製することである。本発明のこれらの及
び他の目的は、下記説明により明らかとなるであろう。

ウシ酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）及びヒトａ　
ＦＧＦのアミノ酸配列についてコードする独特な遺伝子
が組立てられる。ウシ遺伝子はａＦＧＦアミノ酸配列の
逆翻訳により得られ、一方ヒト遺伝子はウシ遺伝子の特
異的点変異により得られる。各々の遺伝子構造体は発現
ベクターに挿入され、適当な宿主を形質転換するために
使用される。形質転換された宿主細胞はヒト又はウシの
組換えａＦＧＦ　（ｒ−ａＦＧＦ）を産生ずるが、これ
は精製されると天然タンパク質に匹敵する活性を有する
ようになる。

酸性繊維芽細胞成長因子は、様々な微異構造（わずかに
構造が異なる、（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕ
ｓ））型として存在し、ａ　ＦＧＦを含有することが知
られた様々な組織源及び細胞タイプから単離される。

本発明で使用される各微異構造型は単一遺伝子産物、即
ち単−ＤＮＡ遺伝子単位から産生されるペプチド類であ
って、翻訳後に構造修正される。しかしながら、構造修
正はペプチドの生物学的活性にいかなる顕著な変化も与
えない。修正は、生体内で又は単離精製過程において起
きる。生体内修正は、格別限定されないが、Ｎ末端にお
けるタンパク質分解、グリコジル化、ホスホリル化又は
アセチル化の結果として生じる。タンパク質分解（ｐｒ
ｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）としては端部タンパク質分解（ｅ
ｘｏｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）があり、この場合には１
以上の末端アミノ酸が連続的に酵素分解され、元の遺伝
子産物よりもアミノ酸が少ない微異構造型を生じる。中
間部タンパク質分解（Ｅｎｄｏｐｒｏ　ｔｅｏ　ｌ　ｙ
　ｔ　ｉｃ）修正はエンドプロテアーゼ作用によるもの
であって、この酵素はアミノ酸配列中の特定部位でペプ
チドを切断する。同様の修正は精製過程でも生じ、微異
構造型を産生ずるようになる。精製時に最も一般的に生
じる修正はタンパク質分解であるが、通常プロテアーゼ
阻害剤の使用によって最小に抑制される。はとんどの条
件下において、微異構造型混合物は天然ａ　ＦＧＦの精
製後に存在する。天然ａ　ＦＧＦとは、ａ　ＦＧＦ含有
組織又は細胞から単離精製されるａ　ＦＧＦのことであ
る。

本発明は、酸性繊維芽細胞成長因子に関してすべての哺
乳動物の微異構造型を包含すると考えられる。好ましい
態様としては、ａ　ＦＧＦのウシ及びヒト微異構造型が
ある。ウシａＦＧＦの最も好ましい微異構造型としては
、１５４アミノ酸型、１４０アミノ酸型及び１３４アミ
ノ酸型である。

１４０アミノ酸型は第３表に示されており、ウシ種の中
では最も好ましい。１５４アミノ酸型は、１４０アミノ
酸型の１位のアミン末端Ｐｈｅにカルボキシル末端Ｌｙ
ｓが結合した下記の余分なアミノ酸を有する： 八Ｉａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｙｓ　、　　１３４アミノ酸型は、アミノ末端の
最初の６アミノ酸が欠落していること以外は１４０アミ
ノ酸と同一である。単離された場合に、これら微異構造
型の各々の量は適用される工程に応じて変動するが、但
しすべての調製物が各々の型を少なくとも一部含有して
いる。

ヒ）ａＦＧＦは、ウシａ　ＦＧＦと同様の微異構造性を
示す。ヒ）ａＦＧＦの最も好ましい微異構造型としては
、１５４アミノ酸型、１４０アミノ酸型及び１３９アミ
ノ酸型がある。ヒト１４０アミノ酸型は、第５表で示さ
れるように、１１個のアミノ酸についてウシ型と異なっ
ている。１５４アミノ酸型は、１つの例外を除き、ヒト
１４０アミノ酸型とウシ１５４アミノ酸型に結合した１
４個の余分のアミノ酸との正確な配列を存する１４０ア
ミノ酸のＰｈｅ　Ｎ末端から位置決めされるＮ末端の５
位又は−１０位のアミノ酸はイソロイシンであって、ウ
シ型におけるスレオニンに代わって用いられている。余
分な１４アミノ酸Ｎ末端配列はＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−
八１ａ−Ｌｕｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓである。ヒト
ａ　ＦＧＦの第三の型は１３９のアミシ酸を有し、アミ
ノ末端のフェニルアラニンが除かれたヒト１４０アミノ
酸型と同一である・ヒトａ　ＦＧＦの１３９アミノ酸型
において、アミノ末端アスパラギン残基は、アスパラギ
ン酸に脱アミド化されていてもよい。１４０及び１３９
アミノ酸型はヒト微異構造型の最も好ましい型である。

哺乳動物ｒ−ａＦＧＦは、ゲノムＤＮＡ又はＣＤＮＡ由
来天然遺伝子をクローニングするが、又はヒトを含む哺
乳動物種由来ａ　ＦＧＦのこれら微異構造型の公知アミ
ノ酸配列に基づくタンパク質微異構造型の１つに関する
遺伝子の組立てによって製造される。ゲノムＤＮＡは、
マニアナイスら、セル、第１５巻、第６８７−７０１頁
、１９７８年（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃ
ｅ１ｌ　１５　：　６８７−７０１（１９７８））の方
法による高分子１ＤＮＡのランダムな断片化により、又
はスミシーズら、サイエンス、第２０２巻、第１２８４
−１２８９真、１９７８年（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ　ｅｔ　
ａｌ、＋　５ｃｉｅｎｃｅ　　２０２：１２８４−１２
８９　　（１９７８））の方法による制限酵素での切断
によって、クローニング用に製造される。次いでゲノム
ＤＮＡは適当なりローニング用ベクター、即ち一般的に
は大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）ラムダファージに組込まれる〔マニアテイス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、分子クローニング、実験マニ
ュアル、コールドスプリングハーバ−研究所、コールド
スプリングハーバ−、ニューヨーク化。

１９８２年〕。

ａ　ＦＧＦ用のｃＤＮＡを得るために、ポリ（Ａ）含有
ＲＮＡはアビブ（Ａｖｉｖ）及びレーダー（Ｌｅｄｅｒ
）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス、第６９巻、第１４０８−１４１２
頁、１９７２年の方法によりａ　ＦＧＦ発現細胞から抽
出される。ｃＤＮＡは、マニアティスら、分子クローニ
ング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバ−研
究所、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク州；
ｊ９８２年に記載されているような標準的方法により、
リバーストランスクリプターゼ及びＤＮＡポリメラーゼ
を用いて製造される。ｃＤＮＡは、ウエンシンク（Ｗｅ
ｎｓｉｎｋ）ら、セル、第３巻、第３１５−３２５頁、
１９７４年の方法に類似した方法によって、尾部形成さ
れかつ適当なベクター、通常はｐＢＲ３２２に組込まれ
てクローニングされる。

クローンゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、オ
リゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成によっ
て、ａ　ＦＧＦ配列含有クローンを確認するためにスク
リーニングされる。オリゴヌクレオチドハイブリッド形
成用プローブの配列は、既知ａ　ＦＧＦアミノ酸配列配
列づいている。マニアティスら、同上及びアンダーソン
（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）及びキングストン（Ｋｉｎｇｓｔ
ｏｎ）　、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８０巻、第６８３
８−６８４２頁、１９’８３年及びサソグス（Ｓｕｇｇ
ｓ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７８巻、第６６１３
−６６１７頁、１９８１年は、ゲノム及びｃ　ＤＮＡク
ローンの様々なスクリーニング方法について記載してい
る。

哺乳動物ａＦＧＦの遺伝子を得るための好ましい方法は
、遺伝子を合成することである。遺伝子は、ヒトを含む
いずれかの哺乳動物から得られるａＦＧＦ微異構造型の
アミノ酸配列に基づいて合成されてもよい。好ましい方
法は、ａ　ＦＧＦに関するウシアミノ酸配列を用い、か
つ他種遺伝子を製造するために塩基配列を化学的に点変
異させることである。ウシ及びヒトａ　ＦＧＦに関する
アミノ酸配列は、１９８６年５月３０日出願の米国特許
出願第８６８．４７３号明細書で開示されているが、こ
の出願は１９８５年９月１２日出願の米国特許出願第７
７４　、３５９号の一部継続出願であり、更に後者の出
願は１９８４年１２月２４日出願の米国特許出願第６８
５．９２３号（現在放棄されている）の一部′ｍ続出願
である。

合成遺伝子は、ギメネズーガレゴ（Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇ
ａｌｌｅｇｏ）ら、サイエンス、第２３０巻、第１３８
５−１３８８頁、１９８５年に記載された既知ウシアミ
ノ酸配列及びギメネズーガレゴら、バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ンズ、第１３８巻、第６１１−６１７頁、１９８６年（
Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉ−ｃａｔｉｏ
ｎｓ、１３８　：　６　Ｌ　１−６１７　　（１９８６
）　）に記載されたヒトアミノ酸配列に基づいている。

ウシａＦＧＦの１４０アミノ酸型の独特なヌクレオチド
配列は、イタクラら、サイエンス、第１９８巻、第１０
５６−１０６３頁、１９７７年の方法と同様の方法によ
って、アミノ酸配列の逆翻訳から誘導される。ウシａＦ
ＧＦの天然アミノ酸配列に対応する様々な新規ヌクレオ
チド配列は、下記表に示されている： ０、、　（Ｊ　　　　＜　（Ｊ　＜　　　、Ｊ　ＣＪ←
Ｃ：ａ　　　　　　　　　　ロ　　　ψ　　ロー　　　
　　　　　　Ｃ：３　　　　＞２：　　　　　　　　　
　（）　　　　偽　　ｄの＜　＜　　　ｍ−＜　　　＋
　１４０　　−く口ｏ　　　ｚ　　　　　　　　　　　
　　　ｔｓ　　　ｚ　　　ｅＩＩ　　　　　　　　　：
Ｉ　　ｚ　　　ｏ＋　　　　　　　　ｓ、＋　　　２　
　　ＣＩ＋Ｉ＋＋２　　　１Ｄ　ｅｌｌ　ｄ　　’　ｌ
／ｌ　Ｏ−ｋ　２　（１４Ｑ　　　−←←　　≧く　　
　Φυクロー＞（ΦＣＪＣｊ　　　１１＋← 口Ｑ　　　←←　　　リ←く　　〉口 ■０ロ　　−υ　　　−（ｊロ　　−Ｑ膿−ｃ５　　　
わψく　　−一ロ　　のΦ←←コ　　Ｚ　　ロー　　　
　　　　　　　リ　　ζ＝　　　　　　　　　　　　　
　ψ　　ロー　　　　　　　　　　　　　　コ　　２　
　ローＣロ　　　ＣＩロ　　　−Ｑ←　　−Ｑ←コ≧＝
　　　ロー　　　　　　　　　　（Ｄ　　　ｃｌ　　　
　　　　　　　ｌｊ’）　　　　ＨＯ−ｕ）　　　ω　
　００＋←　　　−ＣＪ　Ｉ−ｔ　　　（ｊ　ｕ　　　
　！　（Ｊ？　＜　　　　（ｊ　（ｊ　　　　−＜　　
　　ＣＬ、　ｕ上記において、Ｑ＝Ｃ又はＴ Ｐ＝Ａ又はＧ Ｎ＝Ａ、　Ｔ、　Ｃ又はＧである。

本発明のヌクレオチド配列は、下記の特徴苓する；大腸
菌及び哺乳動物細胞にとって好ましコドンを有しており
、可能であれば多重相補ｆ：列の欠落、遺伝子全体にわ
たる独特な制限部イア組込み、遺伝子をプラスミドに挿
入させ易くｊための末端制限酵素付着端、２つに分かれ
たｉ子をアセンブリー（ａｓｓｅｍｂｌｙ）させるため
に・ｉに位置する独特な制限部位、好ましくは翻訳上部
位としてのＮ末端メチオニンコドン及び直ダ翻訳停止コ
ドンといった特徴を有する。

以下の記載及び実施例はウシａ　ＦＧＦの具番なヌクレ
オチド配列に関する本発明を説明しｔのであるが。本発
明にあっては第１表に掲ｍｌ　；’だいずれの組換え体
をも包含していると理解−たい。下記表は好ましいヌク
レオチド配列をイでいる； ロ　　　ロ　　　ロ　　　ＣＩ　　　　Ｃ１００■へ田
でＯ■へ −−へ　　　の　　　の　　　寸 遺伝子は、単−制限酵素切断部位及び翻訳開始部位とし
てのＮ末端メチオニンコドンを含んだリーダ一部分有す
るように組立てられる。遺伝子は、直列的翻訳停止コド
ン及び２つの制限酵素切断部位を含んだ尾部をも有して
いる。ＤＮＡの相補性によって、遺伝子全体にわたり独
特な制限酵素切断部位を組込んだ塩基配列を選択するこ
とができる。制限酵素切断部位の位置に関して好ましい
遺伝子塩基配列は、下記表に示されている：二本鎖分子
の各々の鎖の遺伝子配列は８つのヌクレオチド配列にラ
ンダムに分割される。オリゴヌクレオチドは二本鎖ＤＮ
Ａを形成し得る重複した末端を有するように組立てられ
る。下記表は、ウシａ　ＦＧＦ遺伝子を製造するために
用いられる多数のオリゴヌクレオチド配列例を示してい
る。

ｈ　　　　ｒｂ 〉、　　　　ｐ、　　　　）、　　　　）−コ＼　　　
　ｐｌ　　　　づ、セ哨　　セわ　　セ哨　　セフ　　
セの　　セの　　セの〕、 口　　　ｈ’ｈｈｈｈ’ｎｈ’ｎ り、　　　）、　　　〉、　　　づ、　　　５、　　　
コ、　　　コ、　　　　’：５−　　　　’：Ｓ＋セ的
　　セの　　セい　　セフ　　セフ　　セの　　セわ　
　セの　　セの第４表で示したオリゴヌクレオチドはあ
くまでもオリゴヌクレオチドサブユニットの一例として
記載されているのであり、それら自体に限定されると解
釈すべきではない。オリゴヌクレオチドの重複及び配置
（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を示す複合塩基配列は第３
表に示されている。

ウシ遺伝子は２つの工程、即ち最初はタンパク質Ｎ末端
部分に対応する半分、第２にＣ末端側の半分に関してア
センブル（ａｓｓｅｍｂｌｅ）される。通常オリゴヌク
レオチドはＡＴＰ又は３２ｐ−標識ＡＴＰの存在下にお
いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理される。各工
程の最初の反応において、遺伝子の一方の鎖を構成する
オリゴヌクレオチドは最も５′側のオリゴヌクレオチド
を除きキナーゼ処理される。第２の反応において、他の
鎖を構成するオリゴヌクレオチドは最も５′側のオリゴ
ヌクレオチドを除きキナーゼで処理される。キナーゼ処
理オリゴヌクレオチドが使用される場合には、約１　ｐ
ｍｏｊ２の３２ｐ−標識オリゴヌクレオチドが後におけ
る生成物の確認のために加えられる。

アニーリングは、適当な緩衝液、例えば格別限定されな
いが、約ｐＨ７，６のトリス約６０ｍＭ、ジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）約５ｍＭ、ＭｇＣｆｆ２約１０ｍＭＡ
ＴＰ約３０μ門を含有する緩衝液巾約９０℃で約４分間
処理し、次いで約６０℃まで急速に温度を下げ、約３０
℃まで徐々に温度を下げることによって行なわれる。結
合は、適当な緩衝液、例えば格別限定されないが、約ｐ
Ｈ７，６のトリス約６０ｍＭ、ＤＴＴ約１０ｍＭ、　Ｍ
ｇ　Ｃｊ！ｚ約１０ｍＭ、ＡＴＰ約１ｍＭ及びＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ約０．０３単位を含有する緩衝液巾約２０℃
で約１．５時間かけて行なわれる。

結合されたオリゴヌクレオチドは、エタノール沈降後ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により精製される。オリ
ゴヌクレオチドは、約８０％ホルムアミド約２０μ！、
約ｐＨ８，３のトリスホウ成約５０ｍＭ、エチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）約１ｍＭ、キシレンシアツール
約０．１％（ｗ／ｖ）及びブロモフェノールブルー約０
．１％（Ｗ／Ｖ）を含有する緩衝液に再溶解される。各
サンプルは約９０℃で約３分間加熱され、約７５ワツト
で約５時間約１０％尿素−ポリアクリルアミドゲル中で
電気泳動に供される。２３１塩基Ｎ末端側バンドが回収
され、一つにまとめられ、約ｐＨ８のＥＤＴＡ約１ｍＭ
含有の酢酸アンモニウム約０．５Ｍ中約４℃で溶離され
る。２０９塩基Ｃ末端側バンドも同様の方法で処理され
る。

ａ　ＦＧＦのＮ末端側又はＣ末端側についてコードする
合成遺伝子配列はｐＢＲ３２２プラスミドに組込まれる
。本発明の範囲内には、ａＦＧＦｉｉ伝子を組込むこと
ができかつａ　ＦＧＦ遺伝子を発現させることができる
他のプラスミドの使用も含まれることが、特に望まれる
し更にはそのように考えられる。再アニーリングされる
オリゴヌクレオチド、即ち約３００ｆｍｏβ及び約１０
０１００ｆの回収された２３１塩基対Ｎ末端は、それぞ
れＮ末端用にアガロースゲル精製された約１００　ｆｍ
ｏ文の約３．９キロ塩基（ｋｂ）　ＥｃｏＲＩ　−Ｂａ
ｍ［ｐ　Ｂ　Ｒ３２２に結合せしめられる。２０９ｂｐ
Ｃ末端はＢａｍＨＩ　−５ａｌＩ　ｐ　Ｂ　Ｒ３２２を
用いて同様の方法により組立てられる。結合は、約ｐＨ
７，８のトリス約２５ｍＭ、ＤＴＴ約１ｍＭ、Ｍｇ（！
！、約１０ｍＭ、ＡＴＰ約０．４ｍＭ及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ約１単位を含有し　た緩衝液巾約２０℃で約１時
間かけて行なわれる。各々半分の遺伝子が結合したベク
ターは、供給者の処理をうけた大腸菌ＲＲ１〔ベセスダ
リサーチラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＢＲＬ　）の
ようなコンピテント（ｃｏｍｐｅ　ｔｅｎ　ｔ）細菌細
胞を形質転換させるために使用される。形質転換された
細胞は、アンピシリン中で増殖するものについて選択さ
れ、少量溶離物プラスミド調製物の制限分析により２３
１塩基対（ｂｐ）　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ挿入物又は
２０９　ｂｐ　ＢａｍｔＨ−ＳａｌＩ挿入物の存在に関
してスクリーニングされる。

適当な大きさの挿入物を有するクローンのＤＮＡ配列は
、マキサム（Ｍａｘａｍ）及びギルバート（Ｇｉｌｂｅ
ｒｔ）、プロシーディング・オプ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７４巻、第５６０−
５６４．１９７７年の化学的ＤＮＡ配列法によって決定
される。

十分な鎖長の最終ａ　ＦＧＦ合成遺伝子は、Ｎ末端側の
半分のクローンを制限酵素Ｂａｍ旧及び５ａｌｌで切断
し、アルカリホスファターゼで処理し、かつＣ末端側の
半分のクローンのゲル精製２０９ｂｐ１１ａｍＨＩ　−
５ａｌＩ挿入物にこれを結合させることによって複製さ
れた。この結合物質は、上記のようなコンピテントＲＲ
Ｉ細胞を形質転換させるために用いられる。

合成ａ　ＦＧＦの発現は、いくつかの異なったプロモー
ター−発現系によって行なわれる。本発明の範囲内には
、完全ａ　ＦＧＦ遺伝子の発現のための他のプロモータ
ー−発現系の使用も含まれることが望まれ更にはそのよ
うに考えられる。好ましい構造体は、デボア（ｄｅＢｏ
ｅｒ）　ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８０巻、第２１
−２５頁。

１９８３年に記載されているような大腸菌ｔａｃプロモ
ーター、即ちｔｒｐプロモーター及びｌａｃプロモータ
ーの領域間のハイブリッドを用いている。

ｔａｃプロモーター及びｒｒｎＢｒＲＮＡ転写ターミネ
ータ−を有するプラスミドｐＫＫ２２３−３〔ファルマ
シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）は、ｐＢＲ３２２由来
５ａｌｌ制限酵素部位を取除くように修正された。

ｒｒｎＢｒＲＮＡターミネータ−は強いプロモーターに
よって発現せしめられることが明らかにされた〔ゲンズ
（Ｇｅｎ　ｔｚ）ら、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７８巻
、第４９３６．−４９４０．１９８１年；ブロシウス、
ジーン、第２７巻、第１６１−１７２頁。

１９８４年（Ｂｒｏｓｉｕｓ、　Ｇｅｎｅ　２７　：　
１６１−１７２（１９８４））。

ｐＫＫ２２３−３プラスミドＤＮＡは制限酵素で切断さ
れ、クローンｐ　Ｋ　Ｋ　２．７を得るための２．７ｋ
ｂＤＮＡ断片を製する。合成ａ　ＦＧＦ遺伝子はそのｐ
ＢＲ３２２ベクターから切離され、ＥｃｏＲ１及び５ａ
ｌｒでｐ　Ｋ　Ｋ　２．７を制限した後ｐ　Ｋ　Ｋ　２
．７プラスミドに組込まれる。得られる第１図の組換え
体は大腸菌ＪＭ１０５（ファルマシア）又はＤＨ５（Ｂ
ＲＬ）細胞に導入され、発現せしめられる。

特定部位変異誘発法は、ある哺乳動物種のａＦＧＦのア
ミノ酸配列を別種のａ　ＦＧＦアミノ酸配列配列換する
ための有効な方法である。以下の記載は、１４０アミノ
酸型ウシａ　ＦＧＦからヒトａＦＧＦへの特定部位変異
誘発変換に関するものであるが、この方法はいかなる哺
乳動物種のａＦＧＦをいかなる他の種のａＦＧＦに変換
するためにも使用することができる。変換に際しての唯
一の制限は、両者のａ　ＦＧＦのアミノ酸配列がいずれ
も既知でなければならないということである。下記表は
、置き換えられねばならないアミノ酸及び第３表のウシ
ａＦＧＦアミノ酸地図上において置き換えられる位置を
掲載している： 第５表 置き換えられるアミノ酸 ヱ〕ノｍ　　　ヒトａＦＧＦ　　　　　ウシａＦＧＦ５
　　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　　Ｌｅｕ２１　　　　
　　Ｈｉｓ　　　　　　Ｔｙｒ３５　　　　　　Ａｒｇ
　　　　　　　Ｌｙｓ４７　　　　　　Ｓｅｒ　　　　
　　　Ｃｙｓ５１　　　　　　Ｖａｔ　　　　　　　Ｊ
ｌｅ６４　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　　Ｐｈｅｌ　
０６　　　　　　Ａｓｎ　　　　　　Ｈｉｓｌ　１６　
　　　　　Ｓｅｒ　　　　　　　Ａｒｇｌ　１７　　　
　　　Ｃｙｓ　　　　　　　５ｅｒ１１９　　　　　　
　　　　八ｒｇ　　　　　　　　　　　　Ｌｅｕｌ　２
５　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　　Ｐｈｅウシ遺伝子
配列においてヒト遺伝子配列を表わす８つのオリゴヌク
レオチドは、ウシオリゴヌクレオチドの場合と同様の方
法によって組立てられる。下記表は、ヒ）ａＦＧＦ遺伝
子を得るために利用される様々なオリゴヌクレオチド配
列を示す。

第６表 ｂ　　　’　　　ＣＧＴＡＣＴＣＡＣＴＡＴＧＧＣＣＡ
ＡＡＡＡＧＣＴＡＴＣＣ３”クローンされた合成ウシａ
　ＦＧＦ遺伝子は、一連の特定部位（ｄｉｒｅｃｔｅｄ
）点変異によってヒト合成のａＦＧＦ遺伝子に変換され
る。クローン遺伝子のオリゴヌクレオチド特定部位変異
誘発により、得られるアミノ酸配列が第５表に示される
置き換られたアミノ酸を有するヒトａＦＧＦとなるよう
に、ウシａ　ＦＧＦの塩基配列を変換する。切除がウシ
遺伝子において行なわれ、ａ　ＦＧＦのヒト１３９アミ
ノ酸微異構造型を得るようにアミノ末端フェニルアラニ
ンを取除く。

点変異は、２位アスパラギンをアスパラギン酸で置換え
るために行なわれる。又は、アスパラギンは脱アミド化
されてアスパラギン酸に変換される。これらの操作を行
なうための方法は以下に記載されており、技術的に公知
である。オリゴヌクレオチド特定部位変異誘発は技術的
に公知の標準的方法を用いて行なわれる〔シラー及びス
ミス、メソッズ・イン・エンゲイモロジー。第１００巻
、第４６８−５００頁、　１９８３年（Ｚｏｌｌｅｒ　
ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ＋１００：４６８−５００　（１９８３
））；ノリスら、ヌクレイツク・アシフズ・リサーチ、
第１１＠、第５１０３−５１１２頁、１９８３年（Ｎｏ
ｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

土工：５１０３−５１１２　（１９８３））；シラー及
びスミス、ＤＮＡ、主：４７９−４８８（１９８４））
。標準的オリゴヌクレオチド特定部位変異誘発により行
なわれる点変異は下記表７に示されている。塩基変異位
置は第３表で見ることができる。点変異はヒトａＦＧＦ
ｉｉ伝子に変わるための変化例として示されているだけ
であり、それ自体に限定されると解釈すべきではない。

第７表 置き換えられる塩基　　　対応ヒト 塩１冒虻置　　ヒトａＦＧＦ　　　ウシａＦＧＦ　　　
ヱ」２υ文２２　　　　　ＣＴ　　　　　Ｐｒ。

６９　　　　　ＣＴ　　　　　ｌ１ｉｓＩ　Ｌ　２　　
　　　Ｇ　　　　　　Ａ　　　　　Ａｒｇｌ　４８　　
　　　ＣＧ　　　　　５ｅｒ１５９　　　　　Ｇ　　　
　　　Ａ　　　　　Ｖａｌｌ　９９　　　　　Ａ　　　
　　　Ｔ　　　　　Ｔｙｒ３　２　４　　　　　　　　
　　Ａ　　　　　　　　　　　　ＣＡｓｎ３５４　　　
　　Ａ　　　　　　Ｃ５ｅｒ３５８　　　　　Ｇ　　　
　　　ＣＣｙｓ３６４　　　　　　　　　　Ｇ　　　　
　　　　　　　Ｔ　　　　　　　　　Ａｒｇ３　６　５
　　　　　　　　　ＣＧ　　　　　　　　　Ａｒｇ３８
２　　　　　Ａ　　　　　　ＴＴｙｒ発現クローンは、
トリプトン約１％、酵母エキス約０．５％、Ｎａｃｅ約
０．５％、グルコース約０．４％及びアンピシリン約５
０μｇ／ｍｌｌからなる適当な増殖培地巾約３７℃で増
殖せしめられる。

５５０ｎｍにおける光学濃度が約０．５に達したときに
、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ
ＰＴＧ）が最終濃度約１ｍＭになるまで加えられてもよ
く、培養は約３７℃で約３時間続けられる。培地ｌｌか
ら細胞が遠心分離によって回収され、約ｐＨ’／、２の
リン酸ナトリウム約１０ｍＭ、ＥＤＴＡ約５ｍＭ、Ｎ　
　Ｉ）−トルエンスルホニル−し−フェニルアラニン−
クロロメチル−ケトン（ＴＰＣＫ）約１０．６．ｃｒｇ
／ｎｕ、ペプスタチンＡ約３４．３μｇ／ｍｌ、フェニ
ルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）約８７ｕｇ
／ｍｎ、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）
約１５、ｃｏｇ／ｎｊ！及びロイペプチン約２５．２μ
ｇ／ｍ１を含有する破壊用緩衝液に再懸濁される。細胞
は直ちに破壊されるか、又は−７０℃で凍結保存されて
約１２，０００ｐｓｉ　　（約８４０ｋｇ／ａｎり約４
℃のフレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）加圧セルに約３回通して
解凍後直ちに破壊される。上澄液は遠心分離によって回
収される。

組換えａＦＧＦは、ヘパリンーセファロースアフィニテ
ィクロマトグラフィー次いで逆相高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ”）を併用する独特な２工程クロ
マトグラフイ一操作によって、均一になるまで精製され
る。粗製ｒ−ａＦＧＦは、約ｐＨ６〜８の約１０ｍＭリ
ン酸又はトリスのような希緩衝液が入ったヘパリン−セ
ファロースカラムに供され、次いで２８０ｎｍの吸光度
がほぼバックグランドに低下するまで約０．８　Ｍ　Ｎ
　ａ　Ｃ１のような低濃度塩で洗浄される。ｒ−ａＦＧ
ＦはＮａＣＩｌ約１．５Ｍを含有する約ｐＨ６〜８の約
１０ｍＭリン酸ナトリウム又はトリスのような高塩濃度
緩衝液で溶離せしめられる。溶離物は次いで３〜１８個
の炭素原子、好ましくは４個の炭素原子を有するアルキ
ル基をもつ共有結合アルキルシラン鎖からなる樹脂の逆
相ＨＰＬＣによって精製される。ｒ−ａ　ＦＧＦは、約
１０ｍＭのトリフルオロ酢酸、酢酸又はリン酸のような
希酸で平衡化されたＨＰＬＣカラムに直接供され、アセ
トニトリル又はエタノールのような有機溶媒の直線的勾
配により溶離される。ウシ脳由来ａ　ＦＧＦは、多段階
精製プロトコールの一部として、マシアグ（Ｍａｃｉａ
ｇ）ら、サイエンス、第２２５巻、第９３２−９３５頁
。

１９８４年によりヘパリン−セファロース双方に及びト
ーマスら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ。

第８１巻、第３５７−３６１頁、１９８４年により逆相
ＨＰＬＣカラムに結合することがすでに明らかにされて
いた。細胞溶離物中で比較的豊富にｒ−ａＦＧＦが存在
するということにある程度基づけば、これら２工程のみ
でポリアクリルアミドゲル電気泳動から確認されるよう
に約１６，０００ドルトンの均一で純粋なｒ−ａＦＧＦ
を得るために十分であることが証明される。しかしなが
ら、これら２工程のみでは脳から純粋なａ　ＦＧＦを得
ることはできない。

純粋なａ　ＦＧＦのマイトジェン活性は、細胞系繊維芽
細胞、好ましくはＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３　Ａ３１　（米
国型培養寄託機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ））におけるＤＮＡ
中への３Ｈ−チミジンの取込み量がら調べられる。組換
えａ　ＦＧＦは、繊維芽細胞刺激アッセイにおいて、タ
ンパク質約１ｎｇ／ｍｘ以下で弱い応答性を示す。

本発明のもう１つの態様は、本発明の約１〜約５００μ
ｇ／ｃｒＡの新規ペプチドを創傷表面に局所適用表面当
たり約０．１〜１００μｇ／ｃｉの量で、ヘパリンと併
用して又は併用しないで、好ましくはヘパリンと併用し
て創傷時に局所又は皮下投与することによる、創傷治癒
促進方法である。

適用に際しては、様々な処方剤、例えば軟膏、ペースト
、溶液、ゲル、固体水溶性ポリマー、例えばアルブミン
、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、プルロニ
ック、テトロニック又はアルギネートが使用されるが、
それらの中に活性成分は約１〜約１００μｇ／ｍｅの量
で含有される。

繊維芽細胞、脈管系及び角膜系内皮細胞等をはじめとす
る様々な細胞型において分裂を促進するａ　ＦＧＦ活性
は、これらのペプチド類を薬剤として使用することを可
能ならしめる。これらの化合物は、創傷治療を要する患
者に新規ｒ−ａＦＧＦを投与することにより、ヒトを含
む哺乳動物の創傷治療のために使用することができる。

下記実施例は本発明を説明するものであるが、しかしな
がらそれ自体に限定されるわけではない。

実施例１ オリゴヌクレオチドム オリゴヌクレオチドを、マチューシ及びカルザース、ジ
ャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテー、
第１０３巻、第３１８５−３１９１頁。

１９８１年（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔ
ｈｅｒｓ、　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　１０３　：　３１
８５−３１９１　　（１９８１））；ビューケージ及び
カルザース、テトラヘドロン・レターズ、第２２巻。

第１８５９−１８６２頁、１９８１年（Ｂｅａｕｃａｇ
ｅａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２　：　１８５９−１８６２
　（１９８１））に記載された方法に従い合成した。合
成オリゴヌクレオチドの塩基配列は第４表に示されてい
る。

実施例２ ａＦＧＦ゛伝　のアセンブリー 実施例１のオリゴヌクレオチドをＮ末端側の半分（２３
１ｂｐ）及びＣ末端側の半分（２０９ｂｐ）の２つの分
離単位としてアセンブリーした。次いで、この２つの半
分を完全合成遺伝子とするために結合した。第３表参照
。最初にオリゴヌクレオチドを次の反応混合物中でキナ
ーゼ処理した＝ｐＨ７，６のトリス７０ｍＭ、ＤＴＴ５
ｍＭ、　Ｍｇ　ＣＩ！ｚ　　１０ｍＭ、ＡＴＰ３３μＭ
、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ０．３単位／μｌ及び
オリゴヌクレオチド２．５ｐｍｏ　ｊ！　／　／Ｊ　ｌ
　ｏ混合物を３７°Ｃで１．５時間インキュベートし、
次いでキナーゼ０．２単位／μｌ及び濃度１００ｍＭと
なるまでのＡＴＰを混合物に加えた後、更に１時間イン
キュベートした。放射線標識するため、最初の混合物は
Ｃｒ−３２Ｐ）−ＡＴＰ３７ｎＣｉ／μβを含有してい
た。

アニーリング及び結合は２つの別々の反応で行なった。

各反応において、８つのオリゴヌクレオチドを各々１０
１００ｐ／加えた。１つの反応において、Ｃ末端側又は
Ｎ末端側の半分の遺伝子の一方の鎖を構成する老すゴヌ
クレオチドを、最も５′側のオリゴヌクレオチドを除き
、キナーゼで処理した。第２の反応において、反対類を
構成するオリゴヌクレオチドを、同じく最も５′側のオ
リゴヌクレオチドを除き、キナーゼで処理した。各反応
において３つのオリゴヌクレオチドはリン酸化されたが
、５つはリン酸化されなかった。キナーゼ処理オリゴヌ
クレオチドを使用する場合には、３ｔｐ−標識オリゴヌ
クレオチドｌｐｍｏｌを後における生成物の確認のため
に加えた。各反応液は、ＰＨ７，６のトリス７０ｍＭ、
ＤＴＴ５ｍＭ、ＭｇＣｊ２２１０ｍＭ及びＡＴＰ３０μ
Ｍを含有した２００μｆｆｉの液体であった。オリゴヌ
クレオチドを９０°Ｃで４分間加熱し、次いで直ちに反
応液を６０℃に下げ、更に３０℃まで徐々に冷却するこ
とによってアニーリングした。結合は、ｐＨ７，６のト
リス６０ｍＭ、ＤＴＴｌｏｍＭ、Ｍｇ　（／！ｚ　　１
０ｍＭ、ＡＴＰｌｍＭ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ０．０３
単位／μｌを含有した４００με中において２０℃で１
．５時間インキュベートすることにより行なった。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動により結合したオリゴ
ヌクレオチドを精製した。結合したオリゴヌクレオチド
をエタノールで沈降させ、８０％ホルムアミド、ｐＨ８
，３のトリスホウ酸塩５０ｍＭ、ＥＤＴＡｌｍＭ、０．
１％（ｗ／ｖ）キシレンシアツール及び０．１％（Ｗ／
Ｖ）ブロモフェノールブルーの２０μβ中に再溶解させ
た。各サンプルを９０℃で３分間加熱し、７５ワツトで
５時間１０％尿素−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳
動にかけた。オリゴヌクレオチドバンドは、ゲルをＸ線
フィルムに露出することにより視覚化させた。

Ｎ末端側における各々の反応の２３１塩基バンドをゲル
から取出し、一つにまとめ、ｐＨ８の酢酸アンモニウム
０．５Ｍ、ＥＤＴＡ　１ｍＭの１　　ｍｌで４℃にて溶
離させた。溶離されたＤＮＡをエタノールで沈降させ、
ｐＨ７，６のトリス７０ｍＭ、ＤＴ７５ｍＭ及びＭｇＣ
ｌ！ｚ　　１０ｍＭの３０μｌに再溶解した。

Ｃ末端側の２０９塩基バンドを同様に溶離させた。

ゲル精製オリゴヌクレオチドを形質転換前に４分間かけ
て９０℃まで加熱し、２０℃まで徐々に冷却することに
よりアニーリングした。最初の出発オリゴヌクレオチド
からの回収率を５０％と仮定し、アニーリングされて回
収された３００　ｆｍｏｌ及び１００．　ｆｍｏＪＬの
２３１ｂｐオリゴヌクレオチドをそれぞれ、ｐ）１７．
８のトリス２５ｍＭ、　Ｄ　ＴＴ　１ｍＭ、Ｍｇ　Ｃ１
ｚ　　１０ｍＭ、ＡＴＰｏ、４ｍＭ及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ１単位の２０μβ中２０℃で１時間かけてアガロー
スゲル精製された３、　９　ｋｂＥｃｏＲＴ　−Ｂａｍ
ＨＩｐＢＲ３２２ＤＮＡ断片１００ｆ１００ｆに結合さ
せた。アニーリングされた２０９ｂｐオリゴヌクレオチ
ドを２３１塩基対断片の場合と同様の条件下でアガロー
ス精製された３、　９　ｋｂ　ＢａｍＨＩ−Ｓａｌ　ｐ
　Ｂ　Ｒ３２２ＤＮＡ断片に結合させた。結合反応液を
水で１：５に希釈し、希釈液１ｐ、ｌを用いて供給者が
述べているようなコンピテント大腸菌ＲＲＩ細胞（ＢＲ
Ｌ）２０μｌを形質転換させた。形質転換株をアンピシ
リン中での増殖性に基づき選択し、少量溶離物プラスミ
ド調製物の制限分析により２３１ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ又は２０９ｂｐ　ＢａｍＨｒ　−５ａｌＩ挿入物
の存在に関してスクリーニングする。

適当な大きさの挿入物を有するクローンのＤＮＡ配列は
、マキサム及びギルバートプロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ、第
７４巻５第５６０−５６４頁、１９７７年の化学的ＤＮ
Ａ配列法により決定した。いずれの２３１ｂｐクローン
も正しい配列を有していなかったため、正しい配列を有
するクローンを次のようにして得た。Ｋｐｎ　ｒ及びＢ
ａｍ１１１部位間で正しい配列をもつ１つのクローンを
、ｐＢＲ３２２ベクター中において切断するＫｐｎ　Ｉ
及び５ａｌＴにより切断した。４００ｂｐバンドをゲル
精製し、ａＦＧＦ遺伝子挿入物におけるＥｃｏＲ１部位
からＫｐｎ１部位までの正しい配列を有する第２のクロ
ーンの３．８　ｋｂＫｐｎｌ−５ａｌｌバンドに結合さ
せた。形質転換後、望ましい配列が得られていることを
確認するために、得られたクローンを配列決定した。

正しい２０９ｂｐ配列を有するクローンが得られたこと
から、これらクローンを更に操作することは不要であっ
た。十分な鎖長を有する最終ａＦＧＦ合成遺伝子は、Ｎ
末端側の半分のクローンをＢａｍＨＩ及び５ａｌｌで切
断し、アルカリホスファターゼで処理し、かつこれをＣ
末端側の半分のクローンのゲルに精製２０９ｂｐ　Ｂａ
ｍＨＩ−ＳａｌＩ挿入物に結合させることにより複製し
た。この結合せしめられた物質は、前記のようにコンピ
テントＲＲＩ細胞を形質転換させるために用いた。

実施例３ 人ＪウシａＦＧＦ゛云　のゞ工 実施例２の完全ａ　ＦＧＦ遺伝子を修正ｐＫＫ２２３−
３プラスミドに組込んだ。ｐＫＫ２２３−３プラスミド
（ファルマシア）は、ｔｒｐプロモーター及びＩａｃプ
ロモーターの領域間のハイブリッドであるＩａｃプロモ
ーターを有する〔デポアら。

プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス　ＵＳＡ、第８０巻、第２１−２５頁、
１９８３年〕。このプラスミドは、強いプロモーターに
より発現せしめられることが判明した強いターミネータ
−配列であるｒｒｎＲｒＲＮＡＲＮＡ翻訳タータネ−ク
ーている〔ゲンズら、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７８巻
、第４９３６−４９４０頁、１９８１年；ブロシウス、
ジーン。

第２７巻、第１６１−１７２頁、１９８４年〕。

ｐＫＫ２２３−３プラスミドを修正して、ｐＢＲ３２２
由来５ａｉｌ制限酵素部位を取除いた。これは、ｐＫＫ
２２３−３プラスミドＤＮＡをＮｄｅｌ及びＮａｒＩで
切断し、クローンｐ　Ｋ　Ｋ　２．７を得るために２．
７ｋｂＤＮＡ断片を再環化することにより行なった。次
いで合成ａ　ＦＧＦ遺伝子をそのｐＢＲ３２２ベクター
から切除し、この発現ベクターをＥｃｏＲＩ及び５ａｌ
ｌで制限した後ｐ　Ｋ　Ｋ　２．７に組込んだ。この構
造体は、シャインーダルガーノ５ｈｉｎｅ−［１ａ１ｇ
ａｒｎｏ）　　リポソーム結合部位の１１塩基下流に合
成遺伝子の開始メチオニンを有している。第１図に示さ
れている得られた組換え体を大腸菌ＪＭ１０５細胞及び
大腸菌ＤＨ５細胞に組込んで形質転換させた。

発現クローンは０．４％グルコース及びアンピシリン５
０μｇ／ｍｌ含有のＬＢブイヨン（１％トリプトン、０
．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣ１）中３７℃で培養
した。５５０ｎｍにおける光学濃度が０．５に達したと
きに、Ｉ　ＰＴＧを１ｍＭとなるまで加え、培養を３７
℃で３時間続けた。細胞を１０、ＯＯＯｎｍ　ｘｇで２
０分間の遠心分離ニヨリ回収し、培養液１１から得た細
胞をｐＨ７，２のリン酸ナトリウム１０ｍＭ、（ヘパリ
ン−セファロース緩ｉｉ　）ＥＤＴＡ５ｍＭ、ＴＰＣＫ
　１０．６／１ｇ／　ｍｌ、ベプスクチンＡ　３４．３
μｇ／ｍ！、ＰＭＳＦ８７μｇ／　ｍｅＳＢＰＴＩ　１
５μｇ／　ｍｅ及びロイペプチン３４．３μｇ／ｍｌの
２０ｍｊ２中に再Ｑｉした。

再懸濁された細胞をドライアイス／エタノール浴中で急
速に凍結させ、−７０℃で一夜保存した。

実施例４ 組　えａＦＧＦの　　　び　１１ 実施例３の凍結細胞を解凍し、更にＰＭＳ　Ｆ８１ｐｇ
／ｍｌ！を加え、調製物を１２，０ＯＯｐｓｉ　　（約
８４０　ｋｇ／ｃｎＯ約４℃で３回フレンチ加圧セルに
通した。得られた溶離物を９３，０００　ｘｇで３０分
間遠心分離し、細胞破壊物を除去した。上澄を回収し、
ＩＭＮａＯＨでｐＨ７，２に調整し、１．６Ｘ１０ｃｍ
ヘパリン−セファロース（ファルマシア）カラムに供し
、４℃において流速２０ｍｊ２／ｈｒで操作し、２ｍ１
分画を集めた。ベレットをｐＨ７，２のリン酸ナトリウ
ム１０ｍＭ、ＮａＣ１２Ｍの５　ｍｌに再懸濁し、９３
，０００　ｘｇで３０分間再遠心分離し、上澄をｐＨ７
，２のリン酸ナトリウム１０ｍＭの３倍容量で希釈し、
必要であればＩ　Ｍ　Ｍａｉｌ（でｐＨ７，２に再調製
し、同様のヘパリン−セファロースカラムに供した。

充填後、２８０ｎｍの吸光度がバ・ツクグランドに低下
するまでｐＨ７，２のリン酸ナトリウム１０ｍＭ、Ｎａ
（ｌｏ、８Ｍで洗浄した。結合したｒ−ａＦＧＦをｐＨ
７，２のリン酸ナトリウム１０ｍＭ１、ＮａＣ１１，５
Ｍにより単一ピークとして溶離させた。ヘパリン−セフ
ァロースカラムからプールされた分画は、トーツスら、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス　ＵＳＡ、第８１巻、第３５７−３６１
頁、１９８４年に記載されているように４．５１！ＩＩ
ＩＸ　２５ａｎ０４カラム〔セパレーショングループ（
Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ））を用いて逆相
ＨＰＬＣにより精製した。１−　ａ　ＦＧＦは多数の小
さな汚染ピークから離れた単一の大きなピークとして溶
出したことから、このことはタンパク質が均一的に純粋
であることを示唆している。ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により、純粋であることを確認した。精製された
ｒ−ａＦＧＦをオーフエレル、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、第２５０巻、第４００７−
４０２１頁、１９７５年、　Ｏ’　Ｆａｒｒｅｌｌ　Ｊ
ｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　２５０　：　４００７−４０２１　　（１９
７５））の方法に従い電気泳動に供した。銀染色では分
子量１６．０００ドルトンの単一バンドを示した。ａ　
ＦＧＦとしてのタンパク質の同一性は、アミノ酸分析及
びアミノ末端配列決定によって確認された。

実施例５ ウシ　　えａＦＧＦの生物８・ゞ 実施例４で精製されたｒ−ａＦＧＦの生物学的活性は、
トーツスら、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第２２５巻、第５５１７−５５２０頁、１９
８０年に記載された繊維芽細胞マイトジェンアッセイに
より評価した。ＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３　Ａ３１繊維芽細
胞（米国型培養寄託機関）を１０％熱不活化子牛血清含
有培地中３５１１直径ウェル当たり２Ｘ１０’細胞で培
養し、７％ＣＯＺ中でインキュベートした（ｐＨ７，３
５±０．０５）。細胞は、培地を６時間後及び再度２４
時間後に０．５％熱不活化子牛血清と交換することによ
り、十分に穏やかに増殖するようになった。培養５−５
時間目に、ヘパリン５０μｇ、試験サンプル及びデキサ
メタシン１．１Ｍｇを加え、７０時間目に各ウェルに２
μＣ１〔メチル−３ｎ）−チミジン（２０Ｃｉ／　ｍｍ
ｏｌ、ニューイングランドヌクレア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄＮｕｃｌｅａｒ　）　］及び未標識チミジン〔シ
グマ（Ｓｉｇｍａ）　）３μｇを加え、９５時間目にＤ
ＮＡ中に取込まれた放射線標識量を調べるためにプロセ
ッシングした。各々の用量応答値は試験３回の平均であ
った。

結果は下記表に示されている： 第８表 ｒ−ａＦＧＦ濃度　　　　　　　ＣＰＭ−航ｄ１０−ｒ
−ａＦＧＦ　　”ａＦＧＦＯ，００３２６８２３１ ０，０１０４９８３２９ ０，０３１１５５０１０１？ ０．１００　　７０３１　３６８４ ０．３１６　　９３１９　１１３５３ １．０００　　４７１８　９０５０ 組換えａ　ＦＧＦの活性は、脳由来ａ　ＦＧＦの活性と
同等であるか又はそれよりもやや高い。精製ｒ−ａＦＧ
Ｆは約７１ｐｇ／ｗａにおいて局最大ＤＮＡ−合成促進
値を示したが、精製脳由来ａ　ＦＧＦは２最大値が１２
６ｐｇ／　ｍｌであった。

実施例６ ウシａ　ＦＧＦ遺伝子からヒ）ａＦＧＦ遺伝子へのウシ
ａＦＧＦ遺伝子の変異を促進させるために、実施例２の
合成遺伝子を一重鎖ＤＮＡバクテリオファージベクター
Ｍ１３ｍρ１９に組込んだ。

シラー及びスミス、メソッズ・イン・エンゲイモロジー
。第１００巻、第４６８−５００頁、　１９８３年；ノ
リスら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１１巻
、第５１０３−５１１２頁；シラー及びスミス、ＤＮＡ
、第３巻、第４７９−４８８頁に報告された標準的変異
誘発操作を利用した。

ウシｐＫＫ−ａＦＧＦプラスミドをＥｃｏＲＩ及び５ａ
ｉｌで切断しく第３表参照）、得られる４４０ｂｐ断片
を実施例２と同様にアガロースゲル精製した。　　　□
ベクターＭｌ　３ｍｐｌ　９ＲＫ　　ＤＮＡ　（ＢＲＬ
）を同一の２つのエンドヌクレアーゼで切断し、しかる
後末端を細菌アルカリホスファターゼ１００単位含有の
ｐＨ８，０の１０ｍＭ）リス緩衝液１００μｌ中で脱ホ
スホリル化した。結合は、ｐＨ７，８のトリス２５ｍＭ
、Ｍｇ　Ｃ１ｔ　１０ｍＭ、ＤＴ７１ｍＭ、ＡＴＰｏ、
４ｍＭ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位の１０μＪ中で処理
ベクターＤＮＡ５０ｎｇ及びａ　ＦＣＦ遺伝子断片ＤＮ
Ａ１２ｒ１ｇを用い、４℃で１６時間かけて行なった。

反応混合物を水で１＝５に希釈し、希釈液１μｌを用い
て供給者が述べるようにコンピテント大腸菌ＤＨ５細胞
（ＢＲＬ）２０μ２を形質転換した。細胞を０．０３％
Ｘ−ｇａｌ及び０．３　ｍＭ　ＩＰＴＧ中大腸菌Ｊ′Ｍ
１０５（ファルマシア）宿主細胞と一緒に培養し、３７
℃でインキュベート後、無色プラークを単離した。ウシ
ａＦＧＦ遺伝子含有の１つのファージクローンＭ１３ｍ
ｐ１９−ａＦＧＦを選択した。

８つのオリゴヌクレオチドはヒト配列を特定化したもの
であると考えられ、これらを合成した（第６表参照）。

オリゴマー８は、ウシ遺伝子における３８６位のチミン
がヒト遺伝子におけるシトシンで置き換えられた変異部
分を有している。この変異によって、ヒ）ａＦＧＦアミ
ノ酸配列を変更せずに制限部位を組込むことが可能とな
る。

ヒトオリゴマー１．２．３．４．６及び８をホスホリル
化し、各々の１５ｐｍｏＩｌをそれぞれｐＨ７，５のト
リス２０ｍＭ、Ｍｇ　Ｃ１ｚ　　１０ｍＭ、ＮａＣｌ３
０ｍＭ、ＤＴ７１ｍＭの１０１Ｌｊｌ！中６５℃で１０
分間次いで２３℃で１０分間かけてＭ１３ｍｐ１９−ａ
ＦＧＦ−重鎖ファージＤ　Ｎ　Ａ　０．５　ｐｍｏ　ｊ
２とアニーリングした。次いで環状二本鎖分子はｐＨ７
，５０トリス２０ｍＭ、Ｍｇ　Ｃ１ｔ　　１０ｍＭ、Ｎ
ａ　Ｃｊ！　２５ｍＭ、ＤＴ７５．５ｍＭ、ＡＴＰｏ、
５ｍＭ、ｄＡＴＰｏ、２５ｍＭ、ｄ　ＣＴ　Ｐ　０．２
５ｍＭ、ｄｃＴＰｏ、２５ｎ＋Ｍ、ｄＧＴＰＯ，２５ｍ
Ｍ、ｄ　ＴＴ　Ｐ　０．２５ｍＭの２ｏｐｉ中、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１単位及びＤＮＡポリメラーゼエクレノウ
断片２単位を用い、１５℃で１７時間インキヱベートす
ることにより製造した。調製物を各々用いてコンビテン
）ＪＭ１０５細胞を形質転換し、得られる形質転換株プ
ラークを”ｐ’ｊＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼ
で標識された適当なオリゴマーとのハイブリッド形成に
より選択した。ハイブリッド形成条件は、各々のプロー
ブが塩基１個が変化したハイブリッドの形成を妨げるよ
うに最適化させた。−末鎖ＤＮＡをヒトオリゴマ−４変
異体含有ファージクローンから単離し、上記操作をヒト
オリゴマー５を用いて繰返して、オリゴマー４及び５変
異体双方を有するクローンを生成させた。

下記方法において、これらＭ１３担持クローン（Ｍ　１
３−ｂａｓｅｄ　ｃｌｏｎｅ）におけるウシ配列からヒ
ト配列への変異体を１つのｐＢＲ３２２担持クローンに
組込んで結合させた。ＲＦ　　ＤＮＡを、ヒトオリゴマ
ー１．２．６及び８で特定化された塩基変更部分を有す
るクローンから得た。ヒト１変異体クローンのＤＮＡを
ＥｃｏＲＩで切断し、末端を細菌アルカリホスファター
ゼで脱ホスホリル化し、ＤＮＡを旧ｎｄｌＩＩで切断し
た。ヒト２変異ＤＮＡをＨｉｎｄＤＩで切断し、ホスフ
ァターゼで処理し、次いでＢａｍＨＩで切断した。ヒド
ロ変異ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、ホスファターゼ処
理し、次いでＡｐａｌで切断した。同様に、ヒト８変異
ＤＮＡをＡｐａｌで切断し、末端を脱ホスホリル化し、
ＤＮＡを５ａｌｌで切断した。。これら４つのＤＮＡ調
製物を２％アガロースによる電気泳動に供し、ヒト１．
　２．　６及び８変異体を有する変異ＤＮＡから４５ｂ
ｐ、１９０ｂｐ、１３５ｂｐ及び７０ｂｐの断片をそれ
ぞれゲルから溶離させた。約６０ｆｍｏｌの各断片を−
まとめにして、ｐＨ７，８のトリス２５ｍＭ、ＭｇＣｊ
？ｚ１０ｍＭ、ＤＴＴｌｍＭ、ＡＴＰｏ、４ｍＭ及びＴ
４ＤＮＡリガーゼ１．５単位の５μβ中１２℃で１６時
間かけてｐＢＲ３２２由来の約６０ｆｍｏｆのゲル精製
３．７ｋｂＥｃｏＲＩ　−３ａｉｌ断片に結合させた。

反応混合物を水で１＝５に希釈し、希釈液１μｌを用い
て供給者が述べるようにコンピテント大腸菌ＤＨ５細胞
（ＢＲＬ）２０μｌを形質転換させた。４種すべての変
異オリゴマーにより特定される変異部分を有するクロー
ンを、各々のオリゴマーから得られる放射線標識プロー
ブとのハイブリッド形成により選択した。ヒト３変異体
Ｍ１３クローンの切断ＲＦ　　ＤＮＡから単離された１
　４０ｂｐ　Ｋｐｎｌ−ＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片をこ
のヒト１−２−６−８変異ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ
切断生成物に結合させ、ＤＨ５コンピテント細胞に組込
んで形質転換させ、ヒ）１−２−３−６−８変異体を有
するクローンを得た。この後者のクローンのＢａｍ１ｌ
ｌ−Ｐｓｔｌ切断断片をヒト４−５Ｍ１３担持クローン
由来ＲＦ　　ＤＮＡのＢａｍＨＩ　−ＰｓｔＩ切断断片
に結合し、結合混合物を用いてＤＨ５コンピテント細胞
を形質転換させた。ヒト１−２−３−４−５−６−８変
異体を有するクローンをオリゴマーハイブリッド形成に
より選択し、この組換えプラスミドのａ　ＦＧＦ遺伝子
ＥｃｏＲＩ　−５ａｉｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片をＭｌ　３ｍ
ｐｌ　８　（ＢＲＬ）のホスファターゼ処理ＥｃｏＲＩ
−Ｓａｉｌ切断ＲＦ　　ＤＮＡに結合させた。コンビテ
ン）ＤＨ５細胞をこの結合ＤＮＡで形質転換させ、形質
転換細胞をＪＭ１０５宿主細胞上で培養して、Ｍ１３ク
ローンを得た。このクローンの一末鎖ファージＤＮＡを
ヒト７オリゴマーとアニーリングし、すべての望ましい
変異体含有のＭ１３クローンを上記操作に従い得た。Ｒ
Ｆ　　ＤＮＦをこのクローンから得、ＥｃｏＲＩ及び５
ａｌＩで切断した。得られる４４０ｂｐバンドをゲル精
製し、ｐ　Ｋ　Ｋ　２．７ｔａｃプロモ一ター発現ベク
ターの２．７　ｋｐ　ＨｃｏＲＩ　−５ａｌｌ　Ｄ　Ｎ
　Ａ断片と結合させた。このＤＮＡを用いてコンピテン
トＤＨ５細胞を形質転換させ、これによってヒトａＦＧ
Ｆ型製造用に使われるヒトｐＫＫ−ａＦＧＦ発現クロー
ンを得た。

ヒトｒ−ａＦＧＦをウシｒ−ａＦＧＦの場合と同様の操
作によって精製した（実施例４参照。）ヒトｒ−ａＦＧ
Ｆは、精製ヒトｒ−ａＦＧＦ４００ｎｇが供されかつ感
度約１ｎｇ／バンドの銀染色ＳＤＳ電気泳動ゲルにおい
て単一の強いバンドが存在することから、少なくとも純
度９９．７５％であると判断された。プロトコールは実
施例４に記載されている。

純粋な組換えヒトａＦＧＦは、実施例５のウシ組換えタ
ンパク質の場合と同様に、準融合性（ｓｕｂｃｏｎｆｌ
ｕｅｎｔ）ＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３細胞中への３Ｈ−チミ
ジン取込み量からマイトジェン活性に関して調べられた
。脈管系内皮細胞に対して試験されたヒト脳由来ａ　Ｆ
ＧＦから既に観察されているように、組換えヒトタンパ
ク質はヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）活性化の面で脳由来
又は組換えウシａ　ＦＧＦの場合と比較し大きな違いを
示しており〔ギメネズーガレゴら、バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ンズ、第１３５巻、第５４１−５４８頁、１９８６年〕
、Ｂａ１ｂ／ｃ　３Ｔ３細胞における組換えヒトａ　Ｆ
ＧＦの結果は下記表に示されている： 第９表 ｒ−ａＦＧＦ濃度　　　　　　　ＣＰＭ昆ａ１はニ　　
　ニニベ１２”ヘパリン３．１６　　　　　４２１６　
　　　　　１８０２１０．０　　　　　　４０９２　　
　　　　２６１７３１．６　　　　　　４１５５　　　
　　　４８２４１０００（ｌｎｇ）　　　　　６８１１
　　　　　１０５４７１００００００（１μｇ　）　　
　　１５８６４　　　　　１２４２５”　　ｐｇ　＝１
０−”ｇ ヘパリン存在下において、２最大促進は約４２ｐｇ／ｍ
ｚのときに生じた。ヘパリン非存在下では、ピークは最
大濃度であっても明らかに到達したとはいえないが、約
３０ｎｇ／ｍ１以上であろう。

【図面の簡単な説明】

第１図はａ　ＦＧＦ遺伝子を有するｐＫＫ２２３−３プ
ラスミドの図である。 出願人　：　メルク　エンド　カムパニーインコーボレ
ーテッド ＩＧ−１ 手続補正書（方式） 昭和６２年ｌＯ月２２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換えウシ酸性繊維芽細胞成長因子。 ２、下記アミノ酸配列を有する組換えウシ酸性繊維芽細
   胞成長因子： 【遺伝子配列があります】 ３、１位のフェニルアラニンにメチオニンが結合した、
   特許請求の範囲第２項記載の組換えウシ酸性繊維芽細胞
   成長因子。 ４、組換えウシ酸性繊維芽細胞成長因子の微異構造型。 ５、ウシ酸性繊維芽細胞成長因子についてコードするヌ
   クレオチド配列。 ６、特許請求の範囲第２項記載の組換えウシ酸性繊維芽
   細胞成長因子についてコードするヌクレオチド配列。 ７、特許請求の範囲第３項記載の組換えウシ酸性繊維芽
   細胞成長因子についてコードするヌクレオチド配列。 ８、塩基配列が下記配列： 【遺伝子配列があります】 （上記において、ＱはＣ又はＴであり、ＰはＡ又はＧで
   あり、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧである）のいずれかである
   、特許請求の範囲第６項記載のヌクレオチド配列。 ９、フェニルアラニンに関するコードがメチオニンに関
   するコードの後に位置する、特許請求の範囲第８項記載
   のヌクレオチド配列。 １０、塩基配列が： 【遺伝子配列があります】 である、特許請求の範囲第９項記載のヌクレオチド配列
   。 １１、特許請求の範囲第１０項記載のヌクレオチド配列
   が挿入された発現プラスミド。 １２、構造が第１図に示されている、特許請求の範囲第
   １１項記載のプラスミド。 １３、プラスミドがｐＢＲ３２２である、特許請求の範
   囲第１１項記載のプラスミド。 １４、特許請求の範囲第１１項記載のプラスミドと適合
   しかつそれを含有する宿主。 １５、宿主が大腸菌である、特許請求の範囲第１４項記
   載の宿主。 １６、宿主が大腸菌ＪＭ１０５又は大腸菌ＤＨ５である
   、特許請求の範囲第１５項記載の宿主。 １７、プラスミドがウシ酸性繊維芽細胞成長因子のアミ
   ノ酸配列を発現させることができる、特許請求の範囲第
   １１項記載のプラスミド。 １８、応答性細胞中においてＤＮＡ合成を促進し得る特
   許請求の範囲第１４項記載の宿主によって産生されるタ
   ンパク質。 １９、下記工程： ａ、ウシ酸性繊維芽細胞成長因子についてコードするヌ
   クレオチド配列を有するプラス ミドを製造する（ヌクレオチド配列はプラ スミド含有宿主によって発現せしめられる ことができる）；次いで ｂ、プラスミドを宿主中に組込む；及び ｃ、ウシ酸性繊維芽細胞成長因子を産生するヌクレオチ
   ド配列の発現にとって適した条 件下にプラスミド含有宿主を維持する； からなるウシ酸性繊維芽細胞成長因子の製造方法。 ２０、工程ａにおいて、ヌクレオチド配列が特許請求の
   範囲第１０項記載のヌクレオチド配列である、特許請求
   の範囲第１９項記載の方法。 ２１、工程ｂにおいて、宿主が大腸菌である、特許請求
   の範囲第１９項記載の方法。 ２２、薬学的担体及び特許請求の範囲第１項記載の組換
   えウシ酸性繊維芽細胞成長因子の有効創傷治癒量を含有
   する創傷治療用医薬組成物。 ２３、薬学的担体及び特許請求の範囲第２項記載の組換
   えウシ酸性繊維芽細胞成長因子の有効創傷治癒量を含有
   する創傷治療用医薬組成物。 ２４、薬学的担体及び特許請求の範囲第３項記載の組換
   えウシ酸性繊維芽細胞成長因子の有効創傷治癒量を含有
   する創傷治療用医薬組成物。 ２５、創傷治癒促進方法であって、 特許請求の範囲第２項記載の組換えウシ酸性繊維芽細胞
   成長因子の有効創傷治癒量のかかる治療を要する患者へ
   の投与からなることを特徴とする方法。 ２６、創傷治癒促進方法であって、 特許請求の範囲第３項記載の組換えウシ酸性繊維芽細胞
   成長因子の有効創傷治癒量のかかる治療を要する患者へ
   の投与からなることを特徴とする方法。 ２７、組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子。 ２８、下記アミノ酸配列を有する組換えヒト酸性繊維芽
   細胞成長因子： 【遺伝子配列があります】 ２９、１位のフェニルアラニルにメチオニンが結合した
   、特許請求の範囲第２８項記載の組換えヒト酸性繊維芽
   細胞成長因子。 ３０、１位のフェニルアラニンが欠落し、２位のアミノ
   酸がアスパラギン又はアスパラギン酸である、特許請求
   の範囲第２８項記載の組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因
   子。 ３１、組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子の微異構造型
   。 ３２、ヒト組換え酸性繊維芽細胞成長因子についてコー
   ドするヌクレオチド配列。 ３３、特許請求の範囲第２９項記載のヒト組換え酸性繊
   維芽細胞成長因子についてコードするヌクレオチド配列
   。 ３４、塩基配列が： 【遺伝子配列があります】 である、特許請求の範囲第３３項記載のヌクレオチド配
   列。 ３５、塩基配列が特許請求の範囲第３４項記載の塩基配
   列を生じるように点変異によって置き換えられている、
   特許請求の範囲第１０項記載のヌクレオチド配列。 ３６、特許請求の範囲第３４項記載のヌクレオチド配列
   が挿入された発現プラスミド。 ３７、構造が第１図に示されている、特許請求の範囲第
   ３６項記載のプラスミド。 ３８、プラスミドがｐＢＲ３２２である、特許請求の範
   囲第３７項記載のプラスミド。 ３９、特許請求の範囲第３６項記載のプラスミドと適合
   しかつそれを含有する宿主。 ４０、大腸菌である、特許請求の範囲第３９項記載の宿
   主。 ４１、宿主が大腸菌ＪＭ１０５又は大腸菌ＤＨ５である
   、特許請求の範囲第４０項記載の宿主。 ４２、ヒト酸性繊維芽細胞成長因子に関する遺伝子を発
   現させることができる、特許請求の範囲第３６項記載の
   プラスミド。 ４３、ヒト酸性繊維芽細胞成長因子に関する合成ヌクレ
   オチド配列を発現させることができる、特許請求の範囲
   第３６項記載のプラスミド。 ４４、応答性細胞中においてＤＮＡ合成を促進し得る特
   許請求の範囲第３９項記載の宿主により産生されるタン
   パク質。 ４５、下記式工程： ａ、ヒトａＦＧＦについてコードするヌクレオチド配列
   を有するプラスミドを製造する （ヌクレオチド配列はプラスミド含有宿主 によって発現せしめられることができる）；次いで ｂ、プラスミドを宿主中に組込む；及び ｃ、ヒトａＦＧＦを産生するヌクレオチド配列の発現に
   とって適した条件下にプラスミ ド含有宿主を維持する； からなるヒトａＦＧＦの製造方法。 ４６、工程ａにおいて、ヌクレオチド配列が特許請求の
   範囲第３４項記載のヌクレオチド配列である、特許請求
   の範囲第４５項記載の方法。 ４７、工程ｂにおいて、宿主が大腸菌である、特許請求
   の範囲第４５項記載の方法。 ４８、薬学的担体及び特許請求の範囲第２７項記載の組
   換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子の有効創傷治癒量を含
   有する創傷治療用医薬組成物。 ４９、薬学的担体及び特許請求の範囲第２８項記載の組
   換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子の有効創傷治癒量を含
   有する創傷治療用医薬組成物。 ５０、薬学的担体及び特許請求の範囲第２９項記載の組
   換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子の有効創傷治癒量を含
   有する創傷治療用医薬組成物。 ５１、薬学的担体及び組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因
   子の微異構造型の有効創傷治癒量を含有する創傷治療用
   医薬組成物。 ５２、創傷治癒促進方法であって、 特許請求の範囲第２７項記載の組換えヒト酸性繊維芽細
   胞成長因子の有効創傷治癒量のかかる治療を要する患者
   への投与からなることを特徴とする方法。 ５３、創傷治癒促進方法であって、 特許請求の範囲第２８項記載の組換えヒト酸性繊維芽細
   胞成長因子の有効創傷治癒量のかかる治療を要する愚者
   への投与からなることを特徴とする方法。 ５４、創傷治癒促進方法であって、 特許請求の範囲第２９項記載の組換えヒト酸性繊維芽細
   胞成長因子の有効創傷治癒量のかかる治療を要する患者
   への投与からなることを特徴とする方法。 ５５、創傷治癒促進方法であって、 組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子の微異構造型の有効
   増殖促進量のかかる治療を要する患者への投与からなる
   ことを特徴とする方法。 ５６、下記工程： ａ、アフィニティークロマトグラフィー担体及び許容さ
   れる溶離剤による組換えａＦＧ Ｆの部分精製；次いで ｂ、アルキルシラン基質及び許容される溶離剤を用いる
   逆相高速液体クロマトグラフィ ーによる部分精製組換えａＦＧＦの最終精 製； からなる純粋型への組換え酸性繊維芽細胞成長因子（ａ
   ＦＧＦ）の精製方法。 ５７、工程ａにおいて、アフィニティー担体がヘパリン
   −セファロースである、特許請求の範囲第５６項記載の
   方法。 ５８、工程ｂにおいて、アルキルシラン基質が３〜１８
   個の炭素原子を有する、特許請求の範囲第５６項記載の
   方法。 ５９、工程ｂにおいて、アルキルシラン基質が４個の炭
   素原子を有する、特許請求の範囲第５６項記載の方法。 ６０、工程ａにおいて、ａＦＧＦが塩化ナトリウムで溶
   離せしめられる、特許請求の範囲第５６項記載の方法。 ６１、工程ｂにおいて、ａＦＧＦが酸及び有機溶媒から
   なる溶離液勾配により精製せしめられる、特許請求の範
   囲第５６項記載の方法。 ６２、酸がトリフルオロ酢酸、リン酸又は酢酸である、
   特許請求の範囲第６１項記載の方法。 ６３、有機溶媒がアセトニトリル又はエタノールである
   、特許請求の範囲第６１項記載の方法。