JPS6394991A - 酸性繊維芽細胞成長因子のクロ−ニング及び発現 - Google Patents
酸性繊維芽細胞成長因子のクロ−ニング及び発現Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
脳由来繊維芽細胞マイトジェン(mitogen)はト
ロウェルら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
バイオロジー、第16巻、第5o−7ob。
ロウェルら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
バイオロジー、第16巻、第5o−7ob。
1939年(Trowell et al、、 Jou
rnal of Experi−mental Bio
logy、土6 : 60−70 (1939))及び
ホフマン、グロース、第4巻、第361−376頁、1
940年(Hoffmon、 Growth 4 :3
61−376 (1940))によって最初に発表され
た。脳下垂体抽出物も繊維芽細胞に対して有効なマイト
ジェン活性を有することがその後明らかにされた〔アル
メリン、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスUSA、第70巻、第2702
−2706頁。
rnal of Experi−mental Bio
logy、土6 : 60−70 (1939))及び
ホフマン、グロース、第4巻、第361−376頁、1
940年(Hoffmon、 Growth 4 :3
61−376 (1940))によって最初に発表され
た。脳下垂体抽出物も繊維芽細胞に対して有効なマイト
ジェン活性を有することがその後明らかにされた〔アル
メリン、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスUSA、第70巻、第2702
−2706頁。
1973年(Armelin、 Proceeding
of NationalAcade+wy of
5cience USA −7二−〇:270
2−2706 (1973))。脳及び下垂体双方の繊
維芽細胞成長因子(FGF)の部分精製体は、脈管系内
皮細胞をはじめとする様々なタイプの分化細胞に対して
マイトジェン活性を示した〔ゴスボダロウイクズら、ナ
ショナル・キャンサー・インスティテユート・モノグラ
フ、第48巻、第109−130頁、1978年(Go
spodarowicz et al、+Nation
al Cancer In5titute Monog
raph 、土l:109−130 (1978)))
。最近になり、FGFは2つの型、即ち酸性FGF (
aFGF)及び塩基性FGF (bFGF)として存在
することが判明し、両型とも脳調製物中で確認された〔
トーツス及びギメネツーガレゴ、TlB5.第11巻、
第81−84頁、1986年(Thomas andG
imenez −Gallego、 TlB5工土:8
l−84(1986)))。様々なタイプの細胞、例え
ば−次繊維芽細胞、脈管系及び角膜系内皮細胞、軟骨細
胞、骨芽細胞、筋原細胞、平滑筋細胞及び神経膠細胞は
、DNA及び分割体を合成させるための精製aFGF又
はbFGFによる促進に対し応答する〔エスク(Esc
h) ら、プロシーディング・オプ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンスUSA、第82巻、第65
07−6511頁。
of NationalAcade+wy of
5cience USA −7二−〇:270
2−2706 (1973))。脳及び下垂体双方の繊
維芽細胞成長因子(FGF)の部分精製体は、脈管系内
皮細胞をはじめとする様々なタイプの分化細胞に対して
マイトジェン活性を示した〔ゴスボダロウイクズら、ナ
ショナル・キャンサー・インスティテユート・モノグラ
フ、第48巻、第109−130頁、1978年(Go
spodarowicz et al、+Nation
al Cancer In5titute Monog
raph 、土l:109−130 (1978)))
。最近になり、FGFは2つの型、即ち酸性FGF (
aFGF)及び塩基性FGF (bFGF)として存在
することが判明し、両型とも脳調製物中で確認された〔
トーツス及びギメネツーガレゴ、TlB5.第11巻、
第81−84頁、1986年(Thomas andG
imenez −Gallego、 TlB5工土:8
l−84(1986)))。様々なタイプの細胞、例え
ば−次繊維芽細胞、脈管系及び角膜系内皮細胞、軟骨細
胞、骨芽細胞、筋原細胞、平滑筋細胞及び神経膠細胞は
、DNA及び分割体を合成させるための精製aFGF又
はbFGFによる促進に対し応答する〔エスク(Esc
h) ら、プロシーディング・オプ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンスUSA、第82巻、第65
07−6511頁。
1985年;クオら、フエデレーション・プロシーディ
ング、第44巻、第695頁、1985年(Kuo e
t al、、 Federation Proceed
ing 44 :695 (1985))。
ング、第44巻、第695頁、1985年(Kuo e
t al、、 Federation Proceed
ing 44 :695 (1985))。
純粋なウシ脳由来a FGFは、培地中において脈管系
内皮細胞の有効なマイトジェンとして作用するのみなら
ず、生体内において血管成長を誘導する〔トーツス(T
homas) ら、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンスUSA、第82巻
、第6409−6413頁。
内皮細胞の有効なマイトジェンとして作用するのみなら
ず、生体内において血管成長を誘導する〔トーツス(T
homas) ら、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンスUSA、第82巻
、第6409−6413頁。
1985年)。aFGFの繊維芽細胞マイトジェン活性
は、創傷治癒を促進させるためにも利用することができ
る〔トーマス、米国特許第4.444,760号明細書
〕。本発明は、治療上利用可能な純粋なaFGFを大量
に産生じ得る遺伝子構造体及び発現手段を提供する。
は、創傷治癒を促進させるためにも利用することができ
る〔トーマス、米国特許第4.444,760号明細書
〕。本発明は、治療上利用可能な純粋なaFGFを大量
に産生じ得る遺伝子構造体及び発現手段を提供する。
したがって、特定タンパク質のアミノ酸配列からウシa
FGF及びヒトa FGF双方のヌクレオチド塩基配
列を得ることが、本発明の目的である。
FGF及びヒトa FGF双方のヌクレオチド塩基配
列を得ることが、本発明の目的である。
もう1つの目的は、特定のa FGFについてコードす
る遺伝子を製造し、かつ遺伝子を適当なりローニング用
ベクター組入れることである。他の目的は、各々の組換
えベクターで適当な宿主を形質転換し、かつ特定のaF
GF遺伝子の発現を誘導させることである。もう1つの
目的は、生物学的活性のウシa FGF及びヒ)aFG
Fを単離かつ精製することである。本発明のこれらの及
び他の目的は、下記説明により明らかとなるであろう。
る遺伝子を製造し、かつ遺伝子を適当なりローニング用
ベクター組入れることである。他の目的は、各々の組換
えベクターで適当な宿主を形質転換し、かつ特定のaF
GF遺伝子の発現を誘導させることである。もう1つの
目的は、生物学的活性のウシa FGF及びヒ)aFG
Fを単離かつ精製することである。本発明のこれらの及
び他の目的は、下記説明により明らかとなるであろう。
ウシ酸性繊維芽細胞成長因子(aFGF)及びヒトa
FGFのアミノ酸配列についてコードする独特な遺伝子
が組立てられる。ウシ遺伝子はaFGFアミノ酸配列の
逆翻訳により得られ、一方ヒト遺伝子はウシ遺伝子の特
異的点変異により得られる。各々の遺伝子構造体は発現
ベクターに挿入され、適当な宿主を形質転換するために
使用される。形質転換された宿主細胞はヒト又はウシの
組換えaFGF (r−aFGF)を産生ずるが、これ
は精製されると天然タンパク質に匹敵する活性を有する
ようになる。
FGFのアミノ酸配列についてコードする独特な遺伝子
が組立てられる。ウシ遺伝子はaFGFアミノ酸配列の
逆翻訳により得られ、一方ヒト遺伝子はウシ遺伝子の特
異的点変異により得られる。各々の遺伝子構造体は発現
ベクターに挿入され、適当な宿主を形質転換するために
使用される。形質転換された宿主細胞はヒト又はウシの
組換えaFGF (r−aFGF)を産生ずるが、これ
は精製されると天然タンパク質に匹敵する活性を有する
ようになる。
酸性繊維芽細胞成長因子は、様々な微異構造(わずかに
構造が異なる、(microheterogeneou
s))型として存在し、a FGFを含有することが知
られた様々な組織源及び細胞タイプから単離される。
構造が異なる、(microheterogeneou
s))型として存在し、a FGFを含有することが知
られた様々な組織源及び細胞タイプから単離される。
本発明で使用される各微異構造型は単一遺伝子産物、即
ち単−DNA遺伝子単位から産生されるペプチド類であ
って、翻訳後に構造修正される。しかしながら、構造修
正はペプチドの生物学的活性にいかなる顕著な変化も与
えない。修正は、生体内で又は単離精製過程において起
きる。生体内修正は、格別限定されないが、N末端にお
けるタンパク質分解、グリコジル化、ホスホリル化又は
アセチル化の結果として生じる。タンパク質分解(pr
oteolysis)としては端部タンパク質分解(e
xoproteolysis)があり、この場合には1
以上の末端アミノ酸が連続的に酵素分解され、元の遺伝
子産物よりもアミノ酸が少ない微異構造型を生じる。中
間部タンパク質分解(Endopro teo l y
t ic)修正はエンドプロテアーゼ作用によるもの
であって、この酵素はアミノ酸配列中の特定部位でペプ
チドを切断する。同様の修正は精製過程でも生じ、微異
構造型を産生ずるようになる。精製時に最も一般的に生
じる修正はタンパク質分解であるが、通常プロテアーゼ
阻害剤の使用によって最小に抑制される。はとんどの条
件下において、微異構造型混合物は天然a FGFの精
製後に存在する。天然a FGFとは、a FGF含有
組織又は細胞から単離精製されるa FGFのことであ
る。
ち単−DNA遺伝子単位から産生されるペプチド類であ
って、翻訳後に構造修正される。しかしながら、構造修
正はペプチドの生物学的活性にいかなる顕著な変化も与
えない。修正は、生体内で又は単離精製過程において起
きる。生体内修正は、格別限定されないが、N末端にお
けるタンパク質分解、グリコジル化、ホスホリル化又は
アセチル化の結果として生じる。タンパク質分解(pr
oteolysis)としては端部タンパク質分解(e
xoproteolysis)があり、この場合には1
以上の末端アミノ酸が連続的に酵素分解され、元の遺伝
子産物よりもアミノ酸が少ない微異構造型を生じる。中
間部タンパク質分解(Endopro teo l y
t ic)修正はエンドプロテアーゼ作用によるもの
であって、この酵素はアミノ酸配列中の特定部位でペプ
チドを切断する。同様の修正は精製過程でも生じ、微異
構造型を産生ずるようになる。精製時に最も一般的に生
じる修正はタンパク質分解であるが、通常プロテアーゼ
阻害剤の使用によって最小に抑制される。はとんどの条
件下において、微異構造型混合物は天然a FGFの精
製後に存在する。天然a FGFとは、a FGF含有
組織又は細胞から単離精製されるa FGFのことであ
る。
本発明は、酸性繊維芽細胞成長因子に関してすべての哺
乳動物の微異構造型を包含すると考えられる。好ましい
態様としては、a FGFのウシ及びヒト微異構造型が
ある。ウシaFGFの最も好ましい微異構造型としては
、154アミノ酸型、140アミノ酸型及び134アミ
ノ酸型である。
乳動物の微異構造型を包含すると考えられる。好ましい
態様としては、a FGFのウシ及びヒト微異構造型が
ある。ウシaFGFの最も好ましい微異構造型としては
、154アミノ酸型、140アミノ酸型及び134アミ
ノ酸型である。
140アミノ酸型は第3表に示されており、ウシ種の中
では最も好ましい。154アミノ酸型は、140アミノ
酸型の1位のアミン末端Pheにカルボキシル末端Ly
sが結合した下記の余分なアミノ酸を有する: 八Ia−Glu−Gly−Glu−Thr−Thr−T
hr−Phe−Thr−^1a−Leu−Thr−Gl
u−Lys 、 134アミノ酸型は、アミノ末端の
最初の6アミノ酸が欠落していること以外は140アミ
ノ酸と同一である。単離された場合に、これら微異構造
型の各々の量は適用される工程に応じて変動するが、但
しすべての調製物が各々の型を少なくとも一部含有して
いる。
では最も好ましい。154アミノ酸型は、140アミノ
酸型の1位のアミン末端Pheにカルボキシル末端Ly
sが結合した下記の余分なアミノ酸を有する: 八Ia−Glu−Gly−Glu−Thr−Thr−T
hr−Phe−Thr−^1a−Leu−Thr−Gl
u−Lys 、 134アミノ酸型は、アミノ末端の
最初の6アミノ酸が欠落していること以外は140アミ
ノ酸と同一である。単離された場合に、これら微異構造
型の各々の量は適用される工程に応じて変動するが、但
しすべての調製物が各々の型を少なくとも一部含有して
いる。
ヒ)aFGFは、ウシa FGFと同様の微異構造性を
示す。ヒ)aFGFの最も好ましい微異構造型としては
、154アミノ酸型、140アミノ酸型及び139アミ
ノ酸型がある。ヒト140アミノ酸型は、第5表で示さ
れるように、11個のアミノ酸についてウシ型と異なっ
ている。154アミノ酸型は、1つの例外を除き、ヒト
140アミノ酸型とウシ154アミノ酸型に結合した1
4個の余分のアミノ酸との正確な配列を存する140ア
ミノ酸のPhe N末端から位置決めされるN末端の5
位又は−10位のアミノ酸はイソロイシンであって、ウ
シ型におけるスレオニンに代わって用いられている。余
分な14アミノ酸N末端配列はAla−Glu−Gly
−Glu−11e−Thr−Thr−Phe−Thr−
八1a−Lue−Thr−Glu−Lysである。ヒト
a FGFの第三の型は139のアミシ酸を有し、アミ
ノ末端のフェニルアラニンが除かれたヒト140アミノ
酸型と同一である・ヒトa FGFの139アミノ酸型
において、アミノ末端アスパラギン残基は、アスパラギ
ン酸に脱アミド化されていてもよい。140及び139
アミノ酸型はヒト微異構造型の最も好ましい型である。
示す。ヒ)aFGFの最も好ましい微異構造型としては
、154アミノ酸型、140アミノ酸型及び139アミ
ノ酸型がある。ヒト140アミノ酸型は、第5表で示さ
れるように、11個のアミノ酸についてウシ型と異なっ
ている。154アミノ酸型は、1つの例外を除き、ヒト
140アミノ酸型とウシ154アミノ酸型に結合した1
4個の余分のアミノ酸との正確な配列を存する140ア
ミノ酸のPhe N末端から位置決めされるN末端の5
位又は−10位のアミノ酸はイソロイシンであって、ウ
シ型におけるスレオニンに代わって用いられている。余
分な14アミノ酸N末端配列はAla−Glu−Gly
−Glu−11e−Thr−Thr−Phe−Thr−
八1a−Lue−Thr−Glu−Lysである。ヒト
a FGFの第三の型は139のアミシ酸を有し、アミ
ノ末端のフェニルアラニンが除かれたヒト140アミノ
酸型と同一である・ヒトa FGFの139アミノ酸型
において、アミノ末端アスパラギン残基は、アスパラギ
ン酸に脱アミド化されていてもよい。140及び139
アミノ酸型はヒト微異構造型の最も好ましい型である。
哺乳動物r−aFGFは、ゲノムDNA又はCDNA由
来天然遺伝子をクローニングするが、又はヒトを含む哺
乳動物種由来a FGFのこれら微異構造型の公知アミ
ノ酸配列に基づくタンパク質微異構造型の1つに関する
遺伝子の組立てによって製造される。ゲノムDNAは、
マニアナイスら、セル、第15巻、第687−701頁
、1978年(Maniatis et at、、 C
e1l 15 : 687−701(1978))の方
法による高分子1DNAのランダムな断片化により、又
はスミシーズら、サイエンス、第202巻、第1284
−1289真、1978年(Smithies et
al、+ 5cience 202:1284−12
89 (1978))の方法による制限酵素での切断
によって、クローニング用に製造される。次いでゲノム
DNAは適当なりローニング用ベクター、即ち一般的に
は大腸菌(E。
来天然遺伝子をクローニングするが、又はヒトを含む哺
乳動物種由来a FGFのこれら微異構造型の公知アミ
ノ酸配列に基づくタンパク質微異構造型の1つに関する
遺伝子の組立てによって製造される。ゲノムDNAは、
マニアナイスら、セル、第15巻、第687−701頁
、1978年(Maniatis et at、、 C
e1l 15 : 687−701(1978))の方
法による高分子1DNAのランダムな断片化により、又
はスミシーズら、サイエンス、第202巻、第1284
−1289真、1978年(Smithies et
al、+ 5cience 202:1284−12
89 (1978))の方法による制限酵素での切断
によって、クローニング用に製造される。次いでゲノム
DNAは適当なりローニング用ベクター、即ち一般的に
は大腸菌(E。
coli)ラムダファージに組込まれる〔マニアテイス
(Maniatis)ら、分子クローニング、実験マニ
ュアル、コールドスプリングハーバ−研究所、コールド
スプリングハーバ−、ニューヨーク化。
(Maniatis)ら、分子クローニング、実験マニ
ュアル、コールドスプリングハーバ−研究所、コールド
スプリングハーバ−、ニューヨーク化。
1982年〕。
a FGF用のcDNAを得るために、ポリ(A)含有
RNAはアビブ(Aviv)及びレーダー(Leder
)、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス、第69巻、第1408−1412
頁、1972年の方法によりa FGF発現細胞から抽
出される。cDNAは、マニアティスら、分子クローニ
ング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバ−研
究所、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク州;
j982年に記載されているような標準的方法により、
リバーストランスクリプターゼ及びDNAポリメラーゼ
を用いて製造される。cDNAは、ウエンシンク(We
nsink)ら、セル、第3巻、第315−325頁、
1974年の方法に類似した方法によって、尾部形成さ
れかつ適当なベクター、通常はpBR322に組込まれ
てクローニングされる。
RNAはアビブ(Aviv)及びレーダー(Leder
)、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス、第69巻、第1408−1412
頁、1972年の方法によりa FGF発現細胞から抽
出される。cDNAは、マニアティスら、分子クローニ
ング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバ−研
究所、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク州;
j982年に記載されているような標準的方法により、
リバーストランスクリプターゼ及びDNAポリメラーゼ
を用いて製造される。cDNAは、ウエンシンク(We
nsink)ら、セル、第3巻、第315−325頁、
1974年の方法に類似した方法によって、尾部形成さ
れかつ適当なベクター、通常はpBR322に組込まれ
てクローニングされる。
クローンゲノムDNA又はcDNAライブラリーは、オ
リゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成によっ
て、a FGF配列含有クローンを確認するためにスク
リーニングされる。オリゴヌクレオチドハイブリッド形
成用プローブの配列は、既知a FGFアミノ酸配列配
列づいている。マニアティスら、同上及びアンダーソン
(Anderson)及びキングストン(Kingst
on) 、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンスUSA、第80巻、第683
8−6842頁、19’83年及びサソグス(Sugg
s)ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスUSA、第78巻、第6613
−6617頁、1981年は、ゲノム及びc DNAク
ローンの様々なスクリーニング方法について記載してい
る。
リゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成によっ
て、a FGF配列含有クローンを確認するためにスク
リーニングされる。オリゴヌクレオチドハイブリッド形
成用プローブの配列は、既知a FGFアミノ酸配列配
列づいている。マニアティスら、同上及びアンダーソン
(Anderson)及びキングストン(Kingst
on) 、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンスUSA、第80巻、第683
8−6842頁、19’83年及びサソグス(Sugg
s)ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスUSA、第78巻、第6613
−6617頁、1981年は、ゲノム及びc DNAク
ローンの様々なスクリーニング方法について記載してい
る。
哺乳動物aFGFの遺伝子を得るための好ましい方法は
、遺伝子を合成することである。遺伝子は、ヒトを含む
いずれかの哺乳動物から得られるaFGF微異構造型の
アミノ酸配列に基づいて合成されてもよい。好ましい方
法は、a FGFに関するウシアミノ酸配列を用い、か
つ他種遺伝子を製造するために塩基配列を化学的に点変
異させることである。ウシ及びヒトa FGFに関する
アミノ酸配列は、1986年5月30日出願の米国特許
出願第868.473号明細書で開示されているが、こ
の出願は1985年9月12日出願の米国特許出願第7
74 、359号の一部継続出願であり、更に後者の出
願は1984年12月24日出願の米国特許出願第68
5.923号(現在放棄されている)の一部′m続出願
である。
、遺伝子を合成することである。遺伝子は、ヒトを含む
いずれかの哺乳動物から得られるaFGF微異構造型の
アミノ酸配列に基づいて合成されてもよい。好ましい方
法は、a FGFに関するウシアミノ酸配列を用い、か
つ他種遺伝子を製造するために塩基配列を化学的に点変
異させることである。ウシ及びヒトa FGFに関する
アミノ酸配列は、1986年5月30日出願の米国特許
出願第868.473号明細書で開示されているが、こ
の出願は1985年9月12日出願の米国特許出願第7
74 、359号の一部継続出願であり、更に後者の出
願は1984年12月24日出願の米国特許出願第68
5.923号(現在放棄されている)の一部′m続出願
である。
合成遺伝子は、ギメネズーガレゴ(Gimenez−G
allego)ら、サイエンス、第230巻、第138
5−1388頁、1985年に記載された既知ウシアミ
ノ酸配列及びギメネズーガレゴら、バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ンズ、第138巻、第611−617頁、1986年(
Gimenez−Gallego et al、。
allego)ら、サイエンス、第230巻、第138
5−1388頁、1985年に記載された既知ウシアミ
ノ酸配列及びギメネズーガレゴら、バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ンズ、第138巻、第611−617頁、1986年(
Gimenez−Gallego et al、。
Biochemical and Biophysic
al Re5earch Communi−catio
ns、138 : 6 L 1−617 (1986
) )に記載されたヒトアミノ酸配列に基づいている。
al Re5earch Communi−catio
ns、138 : 6 L 1−617 (1986
) )に記載されたヒトアミノ酸配列に基づいている。
ウシaFGFの140アミノ酸型の独特なヌクレオチド
配列は、イタクラら、サイエンス、第198巻、第10
56−1063頁、1977年の方法と同様の方法によ
って、アミノ酸配列の逆翻訳から誘導される。ウシaF
GFの天然アミノ酸配列に対応する様々な新規ヌクレオ
チド配列は、下記表に示されている: 0、、 (J < (J < 、J CJ←
C:a ロ ψ ロー
C:3 >2:
() 偽 dの< < m−< +
140 −く口o z
ts z eII :
I z o+ s、+ 2
CI+I++2 1D ell d ’ l
/l O−k 2 (14Q −←← ≧く
Φυクロー>(ΦCJCj 11+← 口Q ←← リ←く 〉口 ■0ロ −υ −(jロ −Q膿−c5
わψく −一ロ のΦ←←コ Z ロー
リ ζ=
ψ ロー コ 2
ローCロ CIロ −Q← −Q←コ≧=
ロー (D cl
lj’) HO−u) ω
00+← −CJ I−t (j u
! (J? < (j (j −<
CL、 u上記において、Q=C又はT P=A又はG N=A、 T、 C又はGである。
配列は、イタクラら、サイエンス、第198巻、第10
56−1063頁、1977年の方法と同様の方法によ
って、アミノ酸配列の逆翻訳から誘導される。ウシaF
GFの天然アミノ酸配列に対応する様々な新規ヌクレオ
チド配列は、下記表に示されている: 0、、 (J < (J < 、J CJ←
C:a ロ ψ ロー
C:3 >2:
() 偽 dの< < m−< +
140 −く口o z
ts z eII :
I z o+ s、+ 2
CI+I++2 1D ell d ’ l
/l O−k 2 (14Q −←← ≧く
Φυクロー>(ΦCJCj 11+← 口Q ←← リ←く 〉口 ■0ロ −υ −(jロ −Q膿−c5
わψく −一ロ のΦ←←コ Z ロー
リ ζ=
ψ ロー コ 2
ローCロ CIロ −Q← −Q←コ≧=
ロー (D cl
lj’) HO−u) ω
00+← −CJ I−t (j u
! (J? < (j (j −<
CL、 u上記において、Q=C又はT P=A又はG N=A、 T、 C又はGである。
本発明のヌクレオチド配列は、下記の特徴苓する;大腸
菌及び哺乳動物細胞にとって好ましコドンを有しており
、可能であれば多重相補f:列の欠落、遺伝子全体にわ
たる独特な制限部イア組込み、遺伝子をプラスミドに挿
入させ易くjための末端制限酵素付着端、2つに分かれ
たi子をアセンブリー(assembly)させるため
に・iに位置する独特な制限部位、好ましくは翻訳上部
位としてのN末端メチオニンコドン及び直ダ翻訳停止コ
ドンといった特徴を有する。
菌及び哺乳動物細胞にとって好ましコドンを有しており
、可能であれば多重相補f:列の欠落、遺伝子全体にわ
たる独特な制限部イア組込み、遺伝子をプラスミドに挿
入させ易くjための末端制限酵素付着端、2つに分かれ
たi子をアセンブリー(assembly)させるため
に・iに位置する独特な制限部位、好ましくは翻訳上部
位としてのN末端メチオニンコドン及び直ダ翻訳停止コ
ドンといった特徴を有する。
以下の記載及び実施例はウシa FGFの具番なヌクレ
オチド配列に関する本発明を説明しtのであるが。本発
明にあっては第1表に掲ml ;’だいずれの組換え体
をも包含していると理解−たい。下記表は好ましいヌク
レオチド配列をイでいる; ロ ロ ロ CI C100■へ田
でO■へ −−へ の の 寸 遺伝子は、単−制限酵素切断部位及び翻訳開始部位とし
てのN末端メチオニンコドンを含んだリーダ一部分有す
るように組立てられる。遺伝子は、直列的翻訳停止コド
ン及び2つの制限酵素切断部位を含んだ尾部をも有して
いる。DNAの相補性によって、遺伝子全体にわたり独
特な制限酵素切断部位を組込んだ塩基配列を選択するこ
とができる。制限酵素切断部位の位置に関して好ましい
遺伝子塩基配列は、下記表に示されている:二本鎖分子
の各々の鎖の遺伝子配列は8つのヌクレオチド配列にラ
ンダムに分割される。オリゴヌクレオチドは二本鎖DN
Aを形成し得る重複した末端を有するように組立てられ
る。下記表は、ウシa FGF遺伝子を製造するために
用いられる多数のオリゴヌクレオチド配列例を示してい
る。
オチド配列に関する本発明を説明しtのであるが。本発
明にあっては第1表に掲ml ;’だいずれの組換え体
をも包含していると理解−たい。下記表は好ましいヌク
レオチド配列をイでいる; ロ ロ ロ CI C100■へ田
でO■へ −−へ の の 寸 遺伝子は、単−制限酵素切断部位及び翻訳開始部位とし
てのN末端メチオニンコドンを含んだリーダ一部分有す
るように組立てられる。遺伝子は、直列的翻訳停止コド
ン及び2つの制限酵素切断部位を含んだ尾部をも有して
いる。DNAの相補性によって、遺伝子全体にわたり独
特な制限酵素切断部位を組込んだ塩基配列を選択するこ
とができる。制限酵素切断部位の位置に関して好ましい
遺伝子塩基配列は、下記表に示されている:二本鎖分子
の各々の鎖の遺伝子配列は8つのヌクレオチド配列にラ
ンダムに分割される。オリゴヌクレオチドは二本鎖DN
Aを形成し得る重複した末端を有するように組立てられ
る。下記表は、ウシa FGF遺伝子を製造するために
用いられる多数のオリゴヌクレオチド配列例を示してい
る。
h rb
〉、 p、 )、 )−コ\
pl づ、セ哨 セわ セ哨 セフ
セの セの セの〕、 口 h’hhhh’nh’n り、 )、 〉、 づ、 5、
コ、 コ、 ’:5− ’:S+セ的
セの セい セフ セフ セの セわ
セの セの第4表で示したオリゴヌクレオチドはあ
くまでもオリゴヌクレオチドサブユニットの一例として
記載されているのであり、それら自体に限定されると解
釈すべきではない。オリゴヌクレオチドの重複及び配置
(arrangement)を示す複合塩基配列は第3
表に示されている。
pl づ、セ哨 セわ セ哨 セフ
セの セの セの〕、 口 h’hhhh’nh’n り、 )、 〉、 づ、 5、
コ、 コ、 ’:5− ’:S+セ的
セの セい セフ セフ セの セわ
セの セの第4表で示したオリゴヌクレオチドはあ
くまでもオリゴヌクレオチドサブユニットの一例として
記載されているのであり、それら自体に限定されると解
釈すべきではない。オリゴヌクレオチドの重複及び配置
(arrangement)を示す複合塩基配列は第3
表に示されている。
ウシ遺伝子は2つの工程、即ち最初はタンパク質N末端
部分に対応する半分、第2にC末端側の半分に関してア
センブル(assemble)される。通常オリゴヌク
レオチドはATP又は32p−標識ATPの存在下にお
いてT4ポリヌクレオチドキナーゼで処理される。各工
程の最初の反応において、遺伝子の一方の鎖を構成する
オリゴヌクレオチドは最も5′側のオリゴヌクレオチド
を除きキナーゼ処理される。第2の反応において、他の
鎖を構成するオリゴヌクレオチドは最も5′側のオリゴ
ヌクレオチドを除きキナーゼで処理される。キナーゼ処
理オリゴヌクレオチドが使用される場合には、約1 p
moj2の32p−標識オリゴヌクレオチドが後におけ
る生成物の確認のために加えられる。
部分に対応する半分、第2にC末端側の半分に関してア
センブル(assemble)される。通常オリゴヌク
レオチドはATP又は32p−標識ATPの存在下にお
いてT4ポリヌクレオチドキナーゼで処理される。各工
程の最初の反応において、遺伝子の一方の鎖を構成する
オリゴヌクレオチドは最も5′側のオリゴヌクレオチド
を除きキナーゼ処理される。第2の反応において、他の
鎖を構成するオリゴヌクレオチドは最も5′側のオリゴ
ヌクレオチドを除きキナーゼで処理される。キナーゼ処
理オリゴヌクレオチドが使用される場合には、約1 p
moj2の32p−標識オリゴヌクレオチドが後におけ
る生成物の確認のために加えられる。
アニーリングは、適当な緩衝液、例えば格別限定されな
いが、約pH7,6のトリス約60mM、ジチオスレイ
トール(DTT)約5mM、MgCff2約10mMA
TP約30μ門を含有する緩衝液巾約90℃で約4分間
処理し、次いで約60℃まで急速に温度を下げ、約30
℃まで徐々に温度を下げることによって行なわれる。結
合は、適当な緩衝液、例えば格別限定されないが、約p
H7,6のトリス約60mM、DTT約10mM、 M
g Cj!z約10mM、ATP約1mM及びT4DN
Aリガーゼ約0.03単位を含有する緩衝液巾約20℃
で約1.5時間かけて行なわれる。
いが、約pH7,6のトリス約60mM、ジチオスレイ
トール(DTT)約5mM、MgCff2約10mMA
TP約30μ門を含有する緩衝液巾約90℃で約4分間
処理し、次いで約60℃まで急速に温度を下げ、約30
℃まで徐々に温度を下げることによって行なわれる。結
合は、適当な緩衝液、例えば格別限定されないが、約p
H7,6のトリス約60mM、DTT約10mM、 M
g Cj!z約10mM、ATP約1mM及びT4DN
Aリガーゼ約0.03単位を含有する緩衝液巾約20℃
で約1.5時間かけて行なわれる。
結合されたオリゴヌクレオチドは、エタノール沈降後ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により精製される。オリ
ゴヌクレオチドは、約80%ホルムアミド約20μ!、
約pH8,3のトリスホウ成約50mM、エチレンジア
ミン四酢酸(EDTA)約1mM、キシレンシアツール
約0.1%(w/v)及びブロモフェノールブルー約0
.1%(W/V)を含有する緩衝液に再溶解される。各
サンプルは約90℃で約3分間加熱され、約75ワツト
で約5時間約10%尿素−ポリアクリルアミドゲル中で
電気泳動に供される。231塩基N末端側バンドが回収
され、一つにまとめられ、約pH8のEDTA約1mM
含有の酢酸アンモニウム約0.5M中約4℃で溶離され
る。209塩基C末端側バンドも同様の方法で処理され
る。
リアクリルアミドゲル電気泳動により精製される。オリ
ゴヌクレオチドは、約80%ホルムアミド約20μ!、
約pH8,3のトリスホウ成約50mM、エチレンジア
ミン四酢酸(EDTA)約1mM、キシレンシアツール
約0.1%(w/v)及びブロモフェノールブルー約0
.1%(W/V)を含有する緩衝液に再溶解される。各
サンプルは約90℃で約3分間加熱され、約75ワツト
で約5時間約10%尿素−ポリアクリルアミドゲル中で
電気泳動に供される。231塩基N末端側バンドが回収
され、一つにまとめられ、約pH8のEDTA約1mM
含有の酢酸アンモニウム約0.5M中約4℃で溶離され
る。209塩基C末端側バンドも同様の方法で処理され
る。
a FGFのN末端側又はC末端側についてコードする
合成遺伝子配列はpBR322プラスミドに組込まれる
。本発明の範囲内には、aFGFii伝子を組込むこと
ができかつa FGF遺伝子を発現させることができる
他のプラスミドの使用も含まれることが、特に望まれる
し更にはそのように考えられる。再アニーリングされる
オリゴヌクレオチド、即ち約300fmoβ及び約10
0100fの回収された231塩基対N末端は、それぞ
れN末端用にアガロースゲル精製された約100 fm
o文の約3.9キロ塩基(kb) EcoRI −Ba
m[p B R322に結合せしめられる。209bp
C末端はBamHI −5alI p B R322を
用いて同様の方法により組立てられる。結合は、約pH
7,8のトリス約25mM、DTT約1mM、Mg(!
!、約10mM、ATP約0.4mM及びT4DNAリ
ガーゼ約1単位を含有し た緩衝液巾約20℃で約1時
間かけて行なわれる。各々半分の遺伝子が結合したベク
ターは、供給者の処理をうけた大腸菌RR1〔ベセスダ
リサーチラボラトリーズ(Bethesda Re5
earchLaboratories)、BRL )の
ようなコンピテント(compe ten t)細菌細
胞を形質転換させるために使用される。形質転換された
細胞は、アンピシリン中で増殖するものについて選択さ
れ、少量溶離物プラスミド調製物の制限分析により23
1塩基対(bp) EcoRI−BamHI挿入物又は
209 bp BamtH−SalI挿入物の存在に関
してスクリーニングされる。
合成遺伝子配列はpBR322プラスミドに組込まれる
。本発明の範囲内には、aFGFii伝子を組込むこと
ができかつa FGF遺伝子を発現させることができる
他のプラスミドの使用も含まれることが、特に望まれる
し更にはそのように考えられる。再アニーリングされる
オリゴヌクレオチド、即ち約300fmoβ及び約10
0100fの回収された231塩基対N末端は、それぞ
れN末端用にアガロースゲル精製された約100 fm
o文の約3.9キロ塩基(kb) EcoRI −Ba
m[p B R322に結合せしめられる。209bp
C末端はBamHI −5alI p B R322を
用いて同様の方法により組立てられる。結合は、約pH
7,8のトリス約25mM、DTT約1mM、Mg(!
!、約10mM、ATP約0.4mM及びT4DNAリ
ガーゼ約1単位を含有し た緩衝液巾約20℃で約1時
間かけて行なわれる。各々半分の遺伝子が結合したベク
ターは、供給者の処理をうけた大腸菌RR1〔ベセスダ
リサーチラボラトリーズ(Bethesda Re5
earchLaboratories)、BRL )の
ようなコンピテント(compe ten t)細菌細
胞を形質転換させるために使用される。形質転換された
細胞は、アンピシリン中で増殖するものについて選択さ
れ、少量溶離物プラスミド調製物の制限分析により23
1塩基対(bp) EcoRI−BamHI挿入物又は
209 bp BamtH−SalI挿入物の存在に関
してスクリーニングされる。
適当な大きさの挿入物を有するクローンのDNA配列は
、マキサム(Maxam)及びギルバート(Gilbe
rt)、プロシーディング・オプ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスUSA、第74巻、第560−
564.1977年の化学的DNA配列法によって決定
される。
、マキサム(Maxam)及びギルバート(Gilbe
rt)、プロシーディング・オプ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスUSA、第74巻、第560−
564.1977年の化学的DNA配列法によって決定
される。
十分な鎖長の最終a FGF合成遺伝子は、N末端側の
半分のクローンを制限酵素Bam旧及び5allで切断
し、アルカリホスファターゼで処理し、かつC末端側の
半分のクローンのゲル精製209bp11amHI −
5alI挿入物にこれを結合させることによって複製さ
れた。この結合物質は、上記のようなコンピテントRR
I細胞を形質転換させるために用いられる。
半分のクローンを制限酵素Bam旧及び5allで切断
し、アルカリホスファターゼで処理し、かつC末端側の
半分のクローンのゲル精製209bp11amHI −
5alI挿入物にこれを結合させることによって複製さ
れた。この結合物質は、上記のようなコンピテントRR
I細胞を形質転換させるために用いられる。
合成a FGFの発現は、いくつかの異なったプロモー
ター−発現系によって行なわれる。本発明の範囲内には
、完全a FGF遺伝子の発現のための他のプロモータ
ー−発現系の使用も含まれることが望まれ更にはそのよ
うに考えられる。好ましい構造体は、デボア(deBo
er) ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンスUSA、第80巻、第21
−25頁。
ター−発現系によって行なわれる。本発明の範囲内には
、完全a FGF遺伝子の発現のための他のプロモータ
ー−発現系の使用も含まれることが望まれ更にはそのよ
うに考えられる。好ましい構造体は、デボア(deBo
er) ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンスUSA、第80巻、第21
−25頁。
1983年に記載されているような大腸菌tacプロモ
ーター、即ちtrpプロモーター及びlacプロモータ
ーの領域間のハイブリッドを用いている。
ーター、即ちtrpプロモーター及びlacプロモータ
ーの領域間のハイブリッドを用いている。
tacプロモーター及びrrnBrRNA転写ターミネ
ータ−を有するプラスミドpKK223−3〔ファルマ
シア(Pharmacia) )は、pBR322由来
5all制限酵素部位を取除くように修正された。
ータ−を有するプラスミドpKK223−3〔ファルマ
シア(Pharmacia) )は、pBR322由来
5all制限酵素部位を取除くように修正された。
rrnBrRNAターミネータ−は強いプロモーターに
よって発現せしめられることが明らかにされた〔ゲンズ
(Gen tz)ら、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンスUSA、第78巻
、第4936.−4940.1981年;ブロシウス、
ジーン、第27巻、第161−172頁。
よって発現せしめられることが明らかにされた〔ゲンズ
(Gen tz)ら、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンスUSA、第78巻
、第4936.−4940.1981年;ブロシウス、
ジーン、第27巻、第161−172頁。
1984年(Brosius、 Gene 27 :
161−172(1984))。
161−172(1984))。
pKK223−3プラスミドDNAは制限酵素で切断さ
れ、クローンp K K 2.7を得るための2.7k
bDNA断片を製する。合成a FGF遺伝子はそのp
BR322ベクターから切離され、EcoR1及び5a
lrでp K K 2.7を制限した後p K K 2
.7プラスミドに組込まれる。得られる第1図の組換え
体は大腸菌JM105(ファルマシア)又はDH5(B
RL)細胞に導入され、発現せしめられる。
れ、クローンp K K 2.7を得るための2.7k
bDNA断片を製する。合成a FGF遺伝子はそのp
BR322ベクターから切離され、EcoR1及び5a
lrでp K K 2.7を制限した後p K K 2
.7プラスミドに組込まれる。得られる第1図の組換え
体は大腸菌JM105(ファルマシア)又はDH5(B
RL)細胞に導入され、発現せしめられる。
特定部位変異誘発法は、ある哺乳動物種のaFGFのア
ミノ酸配列を別種のa FGFアミノ酸配列配列換する
ための有効な方法である。以下の記載は、140アミノ
酸型ウシa FGFからヒトaFGFへの特定部位変異
誘発変換に関するものであるが、この方法はいかなる哺
乳動物種のaFGFをいかなる他の種のaFGFに変換
するためにも使用することができる。変換に際しての唯
一の制限は、両者のa FGFのアミノ酸配列がいずれ
も既知でなければならないということである。下記表は
、置き換えられねばならないアミノ酸及び第3表のウシ
aFGFアミノ酸地図上において置き換えられる位置を
掲載している: 第5表 置き換えられるアミノ酸 ヱ〕ノm ヒトaFGF ウシaFGF5
Pro Leu21
His Tyr35 Arg
Lys47 Ser
Cys51 Vat J
le64 Tyr Phel
06 Asn Hisl 16
Ser Argl 17
Cys 5er119
八rg Leul 2
5 Tyr Pheウシ遺伝子
配列においてヒト遺伝子配列を表わす8つのオリゴヌク
レオチドは、ウシオリゴヌクレオチドの場合と同様の方
法によって組立てられる。下記表は、ヒ)aFGF遺伝
子を得るために利用される様々なオリゴヌクレオチド配
列を示す。
ミノ酸配列を別種のa FGFアミノ酸配列配列換する
ための有効な方法である。以下の記載は、140アミノ
酸型ウシa FGFからヒトaFGFへの特定部位変異
誘発変換に関するものであるが、この方法はいかなる哺
乳動物種のaFGFをいかなる他の種のaFGFに変換
するためにも使用することができる。変換に際しての唯
一の制限は、両者のa FGFのアミノ酸配列がいずれ
も既知でなければならないということである。下記表は
、置き換えられねばならないアミノ酸及び第3表のウシ
aFGFアミノ酸地図上において置き換えられる位置を
掲載している: 第5表 置き換えられるアミノ酸 ヱ〕ノm ヒトaFGF ウシaFGF5
Pro Leu21
His Tyr35 Arg
Lys47 Ser
Cys51 Vat J
le64 Tyr Phel
06 Asn Hisl 16
Ser Argl 17
Cys 5er119
八rg Leul 2
5 Tyr Pheウシ遺伝子
配列においてヒト遺伝子配列を表わす8つのオリゴヌク
レオチドは、ウシオリゴヌクレオチドの場合と同様の方
法によって組立てられる。下記表は、ヒ)aFGF遺伝
子を得るために利用される様々なオリゴヌクレオチド配
列を示す。
第6表
b ’ CGTACTCACTATGGCCA
AAAAGCTATCC3”クローンされた合成ウシa
FGF遺伝子は、一連の特定部位(directed
)点変異によってヒト合成のaFGF遺伝子に変換され
る。クローン遺伝子のオリゴヌクレオチド特定部位変異
誘発により、得られるアミノ酸配列が第5表に示される
置き換られたアミノ酸を有するヒトaFGFとなるよう
に、ウシa FGFの塩基配列を変換する。切除がウシ
遺伝子において行なわれ、a FGFのヒト139アミ
ノ酸微異構造型を得るようにアミノ末端フェニルアラニ
ンを取除く。
AAAAGCTATCC3”クローンされた合成ウシa
FGF遺伝子は、一連の特定部位(directed
)点変異によってヒト合成のaFGF遺伝子に変換され
る。クローン遺伝子のオリゴヌクレオチド特定部位変異
誘発により、得られるアミノ酸配列が第5表に示される
置き換られたアミノ酸を有するヒトaFGFとなるよう
に、ウシa FGFの塩基配列を変換する。切除がウシ
遺伝子において行なわれ、a FGFのヒト139アミ
ノ酸微異構造型を得るようにアミノ末端フェニルアラニ
ンを取除く。
点変異は、2位アスパラギンをアスパラギン酸で置換え
るために行なわれる。又は、アスパラギンは脱アミド化
されてアスパラギン酸に変換される。これらの操作を行
なうための方法は以下に記載されており、技術的に公知
である。オリゴヌクレオチド特定部位変異誘発は技術的
に公知の標準的方法を用いて行なわれる〔シラー及びス
ミス、メソッズ・イン・エンゲイモロジー。第100巻
、第468−500頁、 1983年(Zoller
and Sm1th、 Methods in Enz
ymology+100:468−500 (1983
));ノリスら、ヌクレイツク・アシフズ・リサーチ、
第11@、第5103−5112頁、1983年(No
rris et al、、 Nucleic Ac1d
s Re5earch。
るために行なわれる。又は、アスパラギンは脱アミド化
されてアスパラギン酸に変換される。これらの操作を行
なうための方法は以下に記載されており、技術的に公知
である。オリゴヌクレオチド特定部位変異誘発は技術的
に公知の標準的方法を用いて行なわれる〔シラー及びス
ミス、メソッズ・イン・エンゲイモロジー。第100巻
、第468−500頁、 1983年(Zoller
and Sm1th、 Methods in Enz
ymology+100:468−500 (1983
));ノリスら、ヌクレイツク・アシフズ・リサーチ、
第11@、第5103−5112頁、1983年(No
rris et al、、 Nucleic Ac1d
s Re5earch。
土工:5103−5112 (1983));シラー及
びスミス、DNA、主:479−488(1984))
。標準的オリゴヌクレオチド特定部位変異誘発により行
なわれる点変異は下記表7に示されている。塩基変異位
置は第3表で見ることができる。点変異はヒトaFGF
ii伝子に変わるための変化例として示されているだけ
であり、それ自体に限定されると解釈すべきではない。
びスミス、DNA、主:479−488(1984))
。標準的オリゴヌクレオチド特定部位変異誘発により行
なわれる点変異は下記表7に示されている。塩基変異位
置は第3表で見ることができる。点変異はヒトaFGF
ii伝子に変わるための変化例として示されているだけ
であり、それ自体に限定されると解釈すべきではない。
第7表
置き換えられる塩基 対応ヒト
塩1冒虻置 ヒトaFGF ウシaFGF
ヱ」2υ文22 CT Pr。
ヱ」2υ文22 CT Pr。
69 CT l1isI L 2
G A Argl 48
CG 5er159 G
A Vall 99 A
T Tyr3 2 4
A CAsn354
A C5er358 G
CCys364 G
T Arg3 6 5
CG Arg38
2 A TTyr発現クローンは、
トリプトン約1%、酵母エキス約0.5%、Nace約
0.5%、グルコース約0.4%及びアンピシリン約5
0μg/mllからなる適当な増殖培地巾約37℃で増
殖せしめられる。
G A Argl 48
CG 5er159 G
A Vall 99 A
T Tyr3 2 4
A CAsn354
A C5er358 G
CCys364 G
T Arg3 6 5
CG Arg38
2 A TTyr発現クローンは、
トリプトン約1%、酵母エキス約0.5%、Nace約
0.5%、グルコース約0.4%及びアンピシリン約5
0μg/mllからなる適当な増殖培地巾約37℃で増
殖せしめられる。
550nmにおける光学濃度が約0.5に達したときに
、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(I
PTG)が最終濃度約1mMになるまで加えられてもよ
く、培養は約37℃で約3時間続けられる。培地llか
ら細胞が遠心分離によって回収され、約pH’/、2の
リン酸ナトリウム約10mM、EDTA約5mM、N
I)−トルエンスルホニル−し−フェニルアラニン−
クロロメチル−ケトン(TPCK)約10.6.crg
/nu、ペプスタチンA約34.3μg/ml、フェニ
ルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)約87ug
/mn、ウシ膵臓トリプシンインヒビター(BPTI)
約15、cog/nj!及びロイペプチン約25.2μ
g/m1を含有する破壊用緩衝液に再懸濁される。細胞
は直ちに破壊されるか、又は−70℃で凍結保存されて
約12,000psi (約840kg/anり約4
℃のフレンチ(French)加圧セルに約3回通して
解凍後直ちに破壊される。上澄液は遠心分離によって回
収される。
、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(I
PTG)が最終濃度約1mMになるまで加えられてもよ
く、培養は約37℃で約3時間続けられる。培地llか
ら細胞が遠心分離によって回収され、約pH’/、2の
リン酸ナトリウム約10mM、EDTA約5mM、N
I)−トルエンスルホニル−し−フェニルアラニン−
クロロメチル−ケトン(TPCK)約10.6.crg
/nu、ペプスタチンA約34.3μg/ml、フェニ
ルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)約87ug
/mn、ウシ膵臓トリプシンインヒビター(BPTI)
約15、cog/nj!及びロイペプチン約25.2μ
g/m1を含有する破壊用緩衝液に再懸濁される。細胞
は直ちに破壊されるか、又は−70℃で凍結保存されて
約12,000psi (約840kg/anり約4
℃のフレンチ(French)加圧セルに約3回通して
解凍後直ちに破壊される。上澄液は遠心分離によって回
収される。
組換えaFGFは、ヘパリンーセファロースアフィニテ
ィクロマトグラフィー次いで逆相高速液体クロマトグラ
フィー(HP L C”)を併用する独特な2工程クロ
マトグラフイ一操作によって、均一になるまで精製され
る。粗製r−aFGFは、約pH6〜8の約10mMリ
ン酸又はトリスのような希緩衝液が入ったヘパリン−セ
ファロースカラムに供され、次いで280nmの吸光度
がほぼバックグランドに低下するまで約0.8 M N
a C1のような低濃度塩で洗浄される。r−aFG
FはNaCIl約1.5Mを含有する約pH6〜8の約
10mMリン酸ナトリウム又はトリスのような高塩濃度
緩衝液で溶離せしめられる。溶離物は次いで3〜18個
の炭素原子、好ましくは4個の炭素原子を有するアルキ
ル基をもつ共有結合アルキルシラン鎖からなる樹脂の逆
相HPLCによって精製される。r−a FGFは、約
10mMのトリフルオロ酢酸、酢酸又はリン酸のような
希酸で平衡化されたHPLCカラムに直接供され、アセ
トニトリル又はエタノールのような有機溶媒の直線的勾
配により溶離される。ウシ脳由来a FGFは、多段階
精製プロトコールの一部として、マシアグ(Macia
g)ら、サイエンス、第225巻、第932−935頁
。
ィクロマトグラフィー次いで逆相高速液体クロマトグラ
フィー(HP L C”)を併用する独特な2工程クロ
マトグラフイ一操作によって、均一になるまで精製され
る。粗製r−aFGFは、約pH6〜8の約10mMリ
ン酸又はトリスのような希緩衝液が入ったヘパリン−セ
ファロースカラムに供され、次いで280nmの吸光度
がほぼバックグランドに低下するまで約0.8 M N
a C1のような低濃度塩で洗浄される。r−aFG
FはNaCIl約1.5Mを含有する約pH6〜8の約
10mMリン酸ナトリウム又はトリスのような高塩濃度
緩衝液で溶離せしめられる。溶離物は次いで3〜18個
の炭素原子、好ましくは4個の炭素原子を有するアルキ
ル基をもつ共有結合アルキルシラン鎖からなる樹脂の逆
相HPLCによって精製される。r−a FGFは、約
10mMのトリフルオロ酢酸、酢酸又はリン酸のような
希酸で平衡化されたHPLCカラムに直接供され、アセ
トニトリル又はエタノールのような有機溶媒の直線的勾
配により溶離される。ウシ脳由来a FGFは、多段階
精製プロトコールの一部として、マシアグ(Macia
g)ら、サイエンス、第225巻、第932−935頁
。
1984年によりヘパリン−セファロース双方に及びト
ーマスら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス USA。
ーマスら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス USA。
第81巻、第357−361頁、1984年により逆相
HPLCカラムに結合することがすでに明らかにされて
いた。細胞溶離物中で比較的豊富にr−aFGFが存在
するということにある程度基づけば、これら2工程のみ
でポリアクリルアミドゲル電気泳動から確認されるよう
に約16,000ドルトンの均一で純粋なr−aFGF
を得るために十分であることが証明される。しかしなが
ら、これら2工程のみでは脳から純粋なa FGFを得
ることはできない。
HPLCカラムに結合することがすでに明らかにされて
いた。細胞溶離物中で比較的豊富にr−aFGFが存在
するということにある程度基づけば、これら2工程のみ
でポリアクリルアミドゲル電気泳動から確認されるよう
に約16,000ドルトンの均一で純粋なr−aFGF
を得るために十分であることが証明される。しかしなが
ら、これら2工程のみでは脳から純粋なa FGFを得
ることはできない。
純粋なa FGFのマイトジェン活性は、細胞系繊維芽
細胞、好ましくはBALB/c 3T3 A31 (米
国型培養寄託機関(American Type Cu
1ture Co11ection))におけるDNA
中への3H−チミジンの取込み量がら調べられる。組換
えa FGFは、繊維芽細胞刺激アッセイにおいて、タ
ンパク質約1ng/mx以下で弱い応答性を示す。
細胞、好ましくはBALB/c 3T3 A31 (米
国型培養寄託機関(American Type Cu
1ture Co11ection))におけるDNA
中への3H−チミジンの取込み量がら調べられる。組換
えa FGFは、繊維芽細胞刺激アッセイにおいて、タ
ンパク質約1ng/mx以下で弱い応答性を示す。
本発明のもう1つの態様は、本発明の約1〜約500μ
g/crAの新規ペプチドを創傷表面に局所適用表面当
たり約0.1〜100μg/ciの量で、ヘパリンと併
用して又は併用しないで、好ましくはヘパリンと併用し
て創傷時に局所又は皮下投与することによる、創傷治癒
促進方法である。
g/crAの新規ペプチドを創傷表面に局所適用表面当
たり約0.1〜100μg/ciの量で、ヘパリンと併
用して又は併用しないで、好ましくはヘパリンと併用し
て創傷時に局所又は皮下投与することによる、創傷治癒
促進方法である。
適用に際しては、様々な処方剤、例えば軟膏、ペースト
、溶液、ゲル、固体水溶性ポリマー、例えばアルブミン
、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、プルロニ
ック、テトロニック又はアルギネートが使用されるが、
それらの中に活性成分は約1〜約100μg/meの量
で含有される。
、溶液、ゲル、固体水溶性ポリマー、例えばアルブミン
、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、プルロニ
ック、テトロニック又はアルギネートが使用されるが、
それらの中に活性成分は約1〜約100μg/meの量
で含有される。
繊維芽細胞、脈管系及び角膜系内皮細胞等をはじめとす
る様々な細胞型において分裂を促進するa FGF活性
は、これらのペプチド類を薬剤として使用することを可
能ならしめる。これらの化合物は、創傷治療を要する患
者に新規r−aFGFを投与することにより、ヒトを含
む哺乳動物の創傷治療のために使用することができる。
る様々な細胞型において分裂を促進するa FGF活性
は、これらのペプチド類を薬剤として使用することを可
能ならしめる。これらの化合物は、創傷治療を要する患
者に新規r−aFGFを投与することにより、ヒトを含
む哺乳動物の創傷治療のために使用することができる。
下記実施例は本発明を説明するものであるが、しかしな
がらそれ自体に限定されるわけではない。
がらそれ自体に限定されるわけではない。
実施例1
オリゴヌクレオチドム
オリゴヌクレオチドを、マチューシ及びカルザース、ジ
ャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテー、
第103巻、第3185−3191頁。
ャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテー、
第103巻、第3185−3191頁。
1981年(Matteucci and Carut
hers、 Journalof American
Chemical 5ociety 103 : 31
85−3191 (1981));ビューケージ及び
カルザース、テトラヘドロン・レターズ、第22巻。
hers、 Journalof American
Chemical 5ociety 103 : 31
85−3191 (1981));ビューケージ及び
カルザース、テトラヘドロン・レターズ、第22巻。
第1859−1862頁、1981年(Beaucag
eand Caruthers、 Tetrahedr
on Letters 22 : 1859−1862
(1981))に記載された方法に従い合成した。合
成オリゴヌクレオチドの塩基配列は第4表に示されてい
る。
eand Caruthers、 Tetrahedr
on Letters 22 : 1859−1862
(1981))に記載された方法に従い合成した。合
成オリゴヌクレオチドの塩基配列は第4表に示されてい
る。
実施例2
aFGF゛伝 のアセンブリー
実施例1のオリゴヌクレオチドをN末端側の半分(23
1bp)及びC末端側の半分(209bp)の2つの分
離単位としてアセンブリーした。次いで、この2つの半
分を完全合成遺伝子とするために結合した。第3表参照
。最初にオリゴヌクレオチドを次の反応混合物中でキナ
ーゼ処理した=pH7,6のトリス70mM、DTT5
mM、 Mg CI!z 10mM、ATP33μM
、T4ポリヌクレオチドキナーゼ0.3単位/μl及び
オリゴヌクレオチド2.5pmo j! / /J l
o混合物を37°Cで1.5時間インキュベートし、
次いでキナーゼ0.2単位/μl及び濃度100mMと
なるまでのATPを混合物に加えた後、更に1時間イン
キュベートした。放射線標識するため、最初の混合物は
Cr−32P)−ATP37nCi/μβを含有してい
た。
1bp)及びC末端側の半分(209bp)の2つの分
離単位としてアセンブリーした。次いで、この2つの半
分を完全合成遺伝子とするために結合した。第3表参照
。最初にオリゴヌクレオチドを次の反応混合物中でキナ
ーゼ処理した=pH7,6のトリス70mM、DTT5
mM、 Mg CI!z 10mM、ATP33μM
、T4ポリヌクレオチドキナーゼ0.3単位/μl及び
オリゴヌクレオチド2.5pmo j! / /J l
o混合物を37°Cで1.5時間インキュベートし、
次いでキナーゼ0.2単位/μl及び濃度100mMと
なるまでのATPを混合物に加えた後、更に1時間イン
キュベートした。放射線標識するため、最初の混合物は
Cr−32P)−ATP37nCi/μβを含有してい
た。
アニーリング及び結合は2つの別々の反応で行なった。
各反応において、8つのオリゴヌクレオチドを各々10
100p/加えた。1つの反応において、C末端側又は
N末端側の半分の遺伝子の一方の鎖を構成する老すゴヌ
クレオチドを、最も5′側のオリゴヌクレオチドを除き
、キナーゼで処理した。第2の反応において、反対類を
構成するオリゴヌクレオチドを、同じく最も5′側のオ
リゴヌクレオチドを除き、キナーゼで処理した。各反応
において3つのオリゴヌクレオチドはリン酸化されたが
、5つはリン酸化されなかった。キナーゼ処理オリゴヌ
クレオチドを使用する場合には、3tp−標識オリゴヌ
クレオチドlpmolを後における生成物の確認のため
に加えた。各反応液は、PH7,6のトリス70mM、
DTT5mM、MgCj2210mM及びATP30μ
Mを含有した200μffiの液体であった。オリゴヌ
クレオチドを90°Cで4分間加熱し、次いで直ちに反
応液を60℃に下げ、更に30℃まで徐々に冷却するこ
とによってアニーリングした。結合は、pH7,6のト
リス60mM、DTTlomM、Mg (/!z 1
0mM、ATPlmM及びT4DNAリガーゼ0.03
単位/μlを含有した400με中において20℃で1
.5時間インキュベートすることにより行なった。
100p/加えた。1つの反応において、C末端側又は
N末端側の半分の遺伝子の一方の鎖を構成する老すゴヌ
クレオチドを、最も5′側のオリゴヌクレオチドを除き
、キナーゼで処理した。第2の反応において、反対類を
構成するオリゴヌクレオチドを、同じく最も5′側のオ
リゴヌクレオチドを除き、キナーゼで処理した。各反応
において3つのオリゴヌクレオチドはリン酸化されたが
、5つはリン酸化されなかった。キナーゼ処理オリゴヌ
クレオチドを使用する場合には、3tp−標識オリゴヌ
クレオチドlpmolを後における生成物の確認のため
に加えた。各反応液は、PH7,6のトリス70mM、
DTT5mM、MgCj2210mM及びATP30μ
Mを含有した200μffiの液体であった。オリゴヌ
クレオチドを90°Cで4分間加熱し、次いで直ちに反
応液を60℃に下げ、更に30℃まで徐々に冷却するこ
とによってアニーリングした。結合は、pH7,6のト
リス60mM、DTTlomM、Mg (/!z 1
0mM、ATPlmM及びT4DNAリガーゼ0.03
単位/μlを含有した400με中において20℃で1
.5時間インキュベートすることにより行なった。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により結合したオリゴ
ヌクレオチドを精製した。結合したオリゴヌクレオチド
をエタノールで沈降させ、80%ホルムアミド、pH8
,3のトリスホウ酸塩50mM、EDTAlmM、0.
1%(w/v)キシレンシアツール及び0.1%(W/
V)ブロモフェノールブルーの20μβ中に再溶解させ
た。各サンプルを90℃で3分間加熱し、75ワツトで
5時間10%尿素−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳
動にかけた。オリゴヌクレオチドバンドは、ゲルをX線
フィルムに露出することにより視覚化させた。
ヌクレオチドを精製した。結合したオリゴヌクレオチド
をエタノールで沈降させ、80%ホルムアミド、pH8
,3のトリスホウ酸塩50mM、EDTAlmM、0.
1%(w/v)キシレンシアツール及び0.1%(W/
V)ブロモフェノールブルーの20μβ中に再溶解させ
た。各サンプルを90℃で3分間加熱し、75ワツトで
5時間10%尿素−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳
動にかけた。オリゴヌクレオチドバンドは、ゲルをX線
フィルムに露出することにより視覚化させた。
N末端側における各々の反応の231塩基バンドをゲル
から取出し、一つにまとめ、pH8の酢酸アンモニウム
0.5M、EDTA 1mMの1 mlで4℃にて溶
離させた。溶離されたDNAをエタノールで沈降させ、
pH7,6のトリス70mM、DT75mM及びMgC
l!z 10mMの30μlに再溶解した。
から取出し、一つにまとめ、pH8の酢酸アンモニウム
0.5M、EDTA 1mMの1 mlで4℃にて溶
離させた。溶離されたDNAをエタノールで沈降させ、
pH7,6のトリス70mM、DT75mM及びMgC
l!z 10mMの30μlに再溶解した。
C末端側の209塩基バンドを同様に溶離させた。
ゲル精製オリゴヌクレオチドを形質転換前に4分間かけ
て90℃まで加熱し、20℃まで徐々に冷却することに
よりアニーリングした。最初の出発オリゴヌクレオチド
からの回収率を50%と仮定し、アニーリングされて回
収された300 fmol及び100. fmoJLの
231bpオリゴヌクレオチドをそれぞれ、p)17.
8のトリス25mM、 D TT 1mM、Mg C1
z 10mM、ATPo、4mM及びT4DNAリガ
ーゼ1単位の20μβ中20℃で1時間かけてアガロー
スゲル精製された3、 9 kbEcoRT −Bam
HIpBR322DNA断片100f100fに結合さ
せた。アニーリングされた209bpオリゴヌクレオチ
ドを231塩基対断片の場合と同様の条件下でアガロー
ス精製された3、 9 kb BamHI−Sal p
B R322DNA断片に結合させた。結合反応液を
水で1:5に希釈し、希釈液1p、lを用いて供給者が
述べているようなコンピテント大腸菌RRI細胞(BR
L)20μlを形質転換させた。形質転換株をアンピシ
リン中での増殖性に基づき選択し、少量溶離物プラスミ
ド調製物の制限分析により231bpEcoRI−Ba
mHI又は209bp BamHr −5alI挿入物
の存在に関してスクリーニングする。
て90℃まで加熱し、20℃まで徐々に冷却することに
よりアニーリングした。最初の出発オリゴヌクレオチド
からの回収率を50%と仮定し、アニーリングされて回
収された300 fmol及び100. fmoJLの
231bpオリゴヌクレオチドをそれぞれ、p)17.
8のトリス25mM、 D TT 1mM、Mg C1
z 10mM、ATPo、4mM及びT4DNAリガ
ーゼ1単位の20μβ中20℃で1時間かけてアガロー
スゲル精製された3、 9 kbEcoRT −Bam
HIpBR322DNA断片100f100fに結合さ
せた。アニーリングされた209bpオリゴヌクレオチ
ドを231塩基対断片の場合と同様の条件下でアガロー
ス精製された3、 9 kb BamHI−Sal p
B R322DNA断片に結合させた。結合反応液を
水で1:5に希釈し、希釈液1p、lを用いて供給者が
述べているようなコンピテント大腸菌RRI細胞(BR
L)20μlを形質転換させた。形質転換株をアンピシ
リン中での増殖性に基づき選択し、少量溶離物プラスミ
ド調製物の制限分析により231bpEcoRI−Ba
mHI又は209bp BamHr −5alI挿入物
の存在に関してスクリーニングする。
適当な大きさの挿入物を有するクローンのDNA配列は
、マキサム及びギルバートプロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス USA、第
74巻5第560−564頁、1977年の化学的DN
A配列法により決定した。いずれの231bpクローン
も正しい配列を有していなかったため、正しい配列を有
するクローンを次のようにして得た。Kpn r及びB
am111部位間で正しい配列をもつ1つのクローンを
、pBR322ベクター中において切断するKpn I
及び5alTにより切断した。400bpバンドをゲル
精製し、aFGF遺伝子挿入物におけるEcoR1部位
からKpn1部位までの正しい配列を有する第2のクロ
ーンの3.8 kbKpnl−5allバンドに結合さ
せた。形質転換後、望ましい配列が得られていることを
確認するために、得られたクローンを配列決定した。
、マキサム及びギルバートプロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス USA、第
74巻5第560−564頁、1977年の化学的DN
A配列法により決定した。いずれの231bpクローン
も正しい配列を有していなかったため、正しい配列を有
するクローンを次のようにして得た。Kpn r及びB
am111部位間で正しい配列をもつ1つのクローンを
、pBR322ベクター中において切断するKpn I
及び5alTにより切断した。400bpバンドをゲル
精製し、aFGF遺伝子挿入物におけるEcoR1部位
からKpn1部位までの正しい配列を有する第2のクロ
ーンの3.8 kbKpnl−5allバンドに結合さ
せた。形質転換後、望ましい配列が得られていることを
確認するために、得られたクローンを配列決定した。
正しい209bp配列を有するクローンが得られたこと
から、これらクローンを更に操作することは不要であっ
た。十分な鎖長を有する最終aFGF合成遺伝子は、N
末端側の半分のクローンをBamHI及び5allで切
断し、アルカリホスファターゼで処理し、かつこれをC
末端側の半分のクローンのゲルに精製209bp Ba
mHI−SalI挿入物に結合させることにより複製し
た。この結合せしめられた物質は、前記のようにコンピ
テントRRI細胞を形質転換させるために用いた。
から、これらクローンを更に操作することは不要であっ
た。十分な鎖長を有する最終aFGF合成遺伝子は、N
末端側の半分のクローンをBamHI及び5allで切
断し、アルカリホスファターゼで処理し、かつこれをC
末端側の半分のクローンのゲルに精製209bp Ba
mHI−SalI挿入物に結合させることにより複製し
た。この結合せしめられた物質は、前記のようにコンピ
テントRRI細胞を形質転換させるために用いた。
実施例3
人JウシaFGF゛云 のゞ工
実施例2の完全a FGF遺伝子を修正pKK223−
3プラスミドに組込んだ。pKK223−3プラスミド
(ファルマシア)は、trpプロモーター及びIacプ
ロモーターの領域間のハイブリッドであるIacプロモ
ーターを有する〔デポアら。
3プラスミドに組込んだ。pKK223−3プラスミド
(ファルマシア)は、trpプロモーター及びIacプ
ロモーターの領域間のハイブリッドであるIacプロモ
ーターを有する〔デポアら。
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス USA、第80巻、第21−25頁、
1983年〕。このプラスミドは、強いプロモーターに
より発現せしめられることが判明した強いターミネータ
−配列であるrrnRrRNARNA翻訳タータネ−ク
ーている〔ゲンズら、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンスUSA、第78巻
、第4936−4940頁、1981年;ブロシウス、
ジーン。
ブ・サイエンス USA、第80巻、第21−25頁、
1983年〕。このプラスミドは、強いプロモーターに
より発現せしめられることが判明した強いターミネータ
−配列であるrrnRrRNARNA翻訳タータネ−ク
ーている〔ゲンズら、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンスUSA、第78巻
、第4936−4940頁、1981年;ブロシウス、
ジーン。
第27巻、第161−172頁、1984年〕。
pKK223−3プラスミドを修正して、pBR322
由来5ail制限酵素部位を取除いた。これは、pKK
223−3プラスミドDNAをNdel及びNarIで
切断し、クローンp K K 2.7を得るために2.
7kbDNA断片を再環化することにより行なった。次
いで合成a FGF遺伝子をそのpBR322ベクター
から切除し、この発現ベクターをEcoRI及び5al
lで制限した後p K K 2.7に組込んだ。この構
造体は、シャインーダルガーノ5hine−[1a1g
arno) リポソーム結合部位の11塩基下流に合
成遺伝子の開始メチオニンを有している。第1図に示さ
れている得られた組換え体を大腸菌JM105細胞及び
大腸菌DH5細胞に組込んで形質転換させた。
由来5ail制限酵素部位を取除いた。これは、pKK
223−3プラスミドDNAをNdel及びNarIで
切断し、クローンp K K 2.7を得るために2.
7kbDNA断片を再環化することにより行なった。次
いで合成a FGF遺伝子をそのpBR322ベクター
から切除し、この発現ベクターをEcoRI及び5al
lで制限した後p K K 2.7に組込んだ。この構
造体は、シャインーダルガーノ5hine−[1a1g
arno) リポソーム結合部位の11塩基下流に合
成遺伝子の開始メチオニンを有している。第1図に示さ
れている得られた組換え体を大腸菌JM105細胞及び
大腸菌DH5細胞に組込んで形質転換させた。
発現クローンは0.4%グルコース及びアンピシリン5
0μg/ml含有のLBブイヨン(1%トリプトン、0
.5%酵母エキス、0.5%NaC1)中37℃で培養
した。550nmにおける光学濃度が0.5に達したと
きに、I PTGを1mMとなるまで加え、培養を37
℃で3時間続けた。細胞を10、OOOnm xgで2
0分間の遠心分離ニヨリ回収し、培養液11から得た細
胞をpH7,2のリン酸ナトリウム10mM、(ヘパリ
ン−セファロース緩ii )EDTA5mM、TPCK
10.6/1g/ ml、ベプスクチンA 34.3
μg/m!、PMSF87μg/ meSBPTI 1
5μg/ me及びロイペプチン34.3μg/mlの
20mj2中に再Qiした。
0μg/ml含有のLBブイヨン(1%トリプトン、0
.5%酵母エキス、0.5%NaC1)中37℃で培養
した。550nmにおける光学濃度が0.5に達したと
きに、I PTGを1mMとなるまで加え、培養を37
℃で3時間続けた。細胞を10、OOOnm xgで2
0分間の遠心分離ニヨリ回収し、培養液11から得た細
胞をpH7,2のリン酸ナトリウム10mM、(ヘパリ
ン−セファロース緩ii )EDTA5mM、TPCK
10.6/1g/ ml、ベプスクチンA 34.3
μg/m!、PMSF87μg/ meSBPTI 1
5μg/ me及びロイペプチン34.3μg/mlの
20mj2中に再Qiした。
再懸濁された細胞をドライアイス/エタノール浴中で急
速に凍結させ、−70℃で一夜保存した。
速に凍結させ、−70℃で一夜保存した。
実施例4
組 えaFGFの び 11
実施例3の凍結細胞を解凍し、更にPMS F81pg
/ml!を加え、調製物を12,0OOpsi (約
840 kg/cnO約4℃で3回フレンチ加圧セルに
通した。得られた溶離物を93,000 xgで30分
間遠心分離し、細胞破壊物を除去した。上澄を回収し、
IMNaOHでpH7,2に調整し、1.6X10cm
ヘパリン−セファロース(ファルマシア)カラムに供し
、4℃において流速20mj2/hrで操作し、2m1
分画を集めた。ベレットをpH7,2のリン酸ナトリウ
ム10mM、NaC12Mの5 mlに再懸濁し、93
,000 xgで30分間再遠心分離し、上澄をpH7
,2のリン酸ナトリウム10mMの3倍容量で希釈し、
必要であればI M Mail(でpH7,2に再調製
し、同様のヘパリン−セファロースカラムに供した。
/ml!を加え、調製物を12,0OOpsi (約
840 kg/cnO約4℃で3回フレンチ加圧セルに
通した。得られた溶離物を93,000 xgで30分
間遠心分離し、細胞破壊物を除去した。上澄を回収し、
IMNaOHでpH7,2に調整し、1.6X10cm
ヘパリン−セファロース(ファルマシア)カラムに供し
、4℃において流速20mj2/hrで操作し、2m1
分画を集めた。ベレットをpH7,2のリン酸ナトリウ
ム10mM、NaC12Mの5 mlに再懸濁し、93
,000 xgで30分間再遠心分離し、上澄をpH7
,2のリン酸ナトリウム10mMの3倍容量で希釈し、
必要であればI M Mail(でpH7,2に再調製
し、同様のヘパリン−セファロースカラムに供した。
充填後、280nmの吸光度がバ・ツクグランドに低下
するまでpH7,2のリン酸ナトリウム10mM、Na
(lo、8Mで洗浄した。結合したr−aFGFをpH
7,2のリン酸ナトリウム10mM1、NaC11,5
Mにより単一ピークとして溶離させた。ヘパリン−セフ
ァロースカラムからプールされた分画は、トーツスら、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス USA、第81巻、第357−361
頁、1984年に記載されているように4.51!II
IX 25an04カラム〔セパレーショングループ(
Separations Group))を用いて逆相
HPLCにより精製した。1− a FGFは多数の小
さな汚染ピークから離れた単一の大きなピークとして溶
出したことから、このことはタンパク質が均一的に純粋
であることを示唆している。ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により、純粋であることを確認した。精製された
r−aFGFをオーフエレル、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、第250巻、第4007−
4021頁、1975年、 O’ Farrell J
ournalof Biological Chemi
stry 250 : 4007−4021 (19
75))の方法に従い電気泳動に供した。銀染色では分
子量16.000ドルトンの単一バンドを示した。a
FGFとしてのタンパク質の同一性は、アミノ酸分析及
びアミノ末端配列決定によって確認された。
するまでpH7,2のリン酸ナトリウム10mM、Na
(lo、8Mで洗浄した。結合したr−aFGFをpH
7,2のリン酸ナトリウム10mM1、NaC11,5
Mにより単一ピークとして溶離させた。ヘパリン−セフ
ァロースカラムからプールされた分画は、トーツスら、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス USA、第81巻、第357−361
頁、1984年に記載されているように4.51!II
IX 25an04カラム〔セパレーショングループ(
Separations Group))を用いて逆相
HPLCにより精製した。1− a FGFは多数の小
さな汚染ピークから離れた単一の大きなピークとして溶
出したことから、このことはタンパク質が均一的に純粋
であることを示唆している。ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により、純粋であることを確認した。精製された
r−aFGFをオーフエレル、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、第250巻、第4007−
4021頁、1975年、 O’ Farrell J
ournalof Biological Chemi
stry 250 : 4007−4021 (19
75))の方法に従い電気泳動に供した。銀染色では分
子量16.000ドルトンの単一バンドを示した。a
FGFとしてのタンパク質の同一性は、アミノ酸分析及
びアミノ末端配列決定によって確認された。
実施例5
ウシ えaFGFの生物8・ゞ
実施例4で精製されたr−aFGFの生物学的活性は、
トーツスら、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第225巻、第5517−5520頁、19
80年に記載された繊維芽細胞マイトジェンアッセイに
より評価した。BALB/c 3T3 A31繊維芽細
胞(米国型培養寄託機関)を10%熱不活化子牛血清含
有培地中3511直径ウェル当たり2X10’細胞で培
養し、7%COZ中でインキュベートした(pH7,3
5±0.05)。細胞は、培地を6時間後及び再度24
時間後に0.5%熱不活化子牛血清と交換することによ
り、十分に穏やかに増殖するようになった。培養5−5
時間目に、ヘパリン50μg、試験サンプル及びデキサ
メタシン1.1Mgを加え、70時間目に各ウェルに2
μC1〔メチル−3n)−チミジン(20Ci/ mm
ol、ニューイングランドヌクレア(New Engl
andNuclear ) ]及び未標識チミジン〔シ
グマ(Sigma) )3μgを加え、95時間目にD
NA中に取込まれた放射線標識量を調べるためにプロセ
ッシングした。各々の用量応答値は試験3回の平均であ
った。
トーツスら、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第225巻、第5517−5520頁、19
80年に記載された繊維芽細胞マイトジェンアッセイに
より評価した。BALB/c 3T3 A31繊維芽細
胞(米国型培養寄託機関)を10%熱不活化子牛血清含
有培地中3511直径ウェル当たり2X10’細胞で培
養し、7%COZ中でインキュベートした(pH7,3
5±0.05)。細胞は、培地を6時間後及び再度24
時間後に0.5%熱不活化子牛血清と交換することによ
り、十分に穏やかに増殖するようになった。培養5−5
時間目に、ヘパリン50μg、試験サンプル及びデキサ
メタシン1.1Mgを加え、70時間目に各ウェルに2
μC1〔メチル−3n)−チミジン(20Ci/ mm
ol、ニューイングランドヌクレア(New Engl
andNuclear ) ]及び未標識チミジン〔シ
グマ(Sigma) )3μgを加え、95時間目にD
NA中に取込まれた放射線標識量を調べるためにプロセ
ッシングした。各々の用量応答値は試験3回の平均であ
った。
結果は下記表に示されている:
第8表
r−aFGF濃度 CPM−航d10−r
−aFGF ”aFGFO,003268231 0,010498329 0,0311550101? 0.100 7031 3684 0.316 9319 11353 1.000 4718 9050 組換えa FGFの活性は、脳由来a FGFの活性と
同等であるか又はそれよりもやや高い。精製r−aFG
Fは約71pg/waにおいて局最大DNA−合成促進
値を示したが、精製脳由来a FGFは2最大値が12
6pg/ mlであった。
−aFGF ”aFGFO,003268231 0,010498329 0,0311550101? 0.100 7031 3684 0.316 9319 11353 1.000 4718 9050 組換えa FGFの活性は、脳由来a FGFの活性と
同等であるか又はそれよりもやや高い。精製r−aFG
Fは約71pg/waにおいて局最大DNA−合成促進
値を示したが、精製脳由来a FGFは2最大値が12
6pg/ mlであった。
実施例6
ウシa FGF遺伝子からヒ)aFGF遺伝子へのウシ
aFGF遺伝子の変異を促進させるために、実施例2の
合成遺伝子を一重鎖DNAバクテリオファージベクター
M13mρ19に組込んだ。
aFGF遺伝子の変異を促進させるために、実施例2の
合成遺伝子を一重鎖DNAバクテリオファージベクター
M13mρ19に組込んだ。
シラー及びスミス、メソッズ・イン・エンゲイモロジー
。第100巻、第468−500頁、 1983年;ノ
リスら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第11巻
、第5103−5112頁;シラー及びスミス、DNA
、第3巻、第479−488頁に報告された標準的変異
誘発操作を利用した。
。第100巻、第468−500頁、 1983年;ノ
リスら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第11巻
、第5103−5112頁;シラー及びスミス、DNA
、第3巻、第479−488頁に報告された標準的変異
誘発操作を利用した。
ウシpKK−aFGFプラスミドをEcoRI及び5a
ilで切断しく第3表参照)、得られる440bp断片
を実施例2と同様にアガロースゲル精製した。 □
ベクターMl 3mpl 9RK DNA (BRL
)を同一の2つのエンドヌクレアーゼで切断し、しかる
後末端を細菌アルカリホスファターゼ100単位含有の
pH8,0の10mM)リス緩衝液100μl中で脱ホ
スホリル化した。結合は、pH7,8のトリス25mM
、Mg C1t 10mM、DT71mM、ATPo、
4mM、T4DNAリガーゼ2単位の10μJ中で処理
ベクターDNA50ng及びa FCF遺伝子断片DN
A12r1gを用い、4℃で16時間かけて行なった。
ilで切断しく第3表参照)、得られる440bp断片
を実施例2と同様にアガロースゲル精製した。 □
ベクターMl 3mpl 9RK DNA (BRL
)を同一の2つのエンドヌクレアーゼで切断し、しかる
後末端を細菌アルカリホスファターゼ100単位含有の
pH8,0の10mM)リス緩衝液100μl中で脱ホ
スホリル化した。結合は、pH7,8のトリス25mM
、Mg C1t 10mM、DT71mM、ATPo、
4mM、T4DNAリガーゼ2単位の10μJ中で処理
ベクターDNA50ng及びa FCF遺伝子断片DN
A12r1gを用い、4℃で16時間かけて行なった。
反応混合物を水で1=5に希釈し、希釈液1μlを用い
て供給者が述べるようにコンピテント大腸菌DH5細胞
(BRL)20μ2を形質転換した。細胞を0.03%
X−gal及び0.3 mM IPTG中大腸菌J′M
105(ファルマシア)宿主細胞と一緒に培養し、37
℃でインキュベート後、無色プラークを単離した。ウシ
aFGF遺伝子含有の1つのファージクローンM13m
p19−aFGFを選択した。
て供給者が述べるようにコンピテント大腸菌DH5細胞
(BRL)20μ2を形質転換した。細胞を0.03%
X−gal及び0.3 mM IPTG中大腸菌J′M
105(ファルマシア)宿主細胞と一緒に培養し、37
℃でインキュベート後、無色プラークを単離した。ウシ
aFGF遺伝子含有の1つのファージクローンM13m
p19−aFGFを選択した。
8つのオリゴヌクレオチドはヒト配列を特定化したもの
であると考えられ、これらを合成した(第6表参照)。
であると考えられ、これらを合成した(第6表参照)。
オリゴマー8は、ウシ遺伝子における386位のチミン
がヒト遺伝子におけるシトシンで置き換えられた変異部
分を有している。この変異によって、ヒ)aFGFアミ
ノ酸配列を変更せずに制限部位を組込むことが可能とな
る。
がヒト遺伝子におけるシトシンで置き換えられた変異部
分を有している。この変異によって、ヒ)aFGFアミ
ノ酸配列を変更せずに制限部位を組込むことが可能とな
る。
ヒトオリゴマー1.2.3.4.6及び8をホスホリル
化し、各々の15pmoIlをそれぞれpH7,5のト
リス20mM、Mg C1z 10mM、NaCl3
0mM、DT71mMの101Ljl!中65℃で10
分間次いで23℃で10分間かけてM13mp19−a
FGF−重鎖ファージD N A 0.5 pmo j
2とアニーリングした。次いで環状二本鎖分子はpH7
,50トリス20mM、Mg C1t 10mM、N
a Cj! 25mM、DT75.5mM、ATPo、
5mM、dATPo、25mM、d CT P 0.2
5mM、dcTPo、25n+M、dGTPO,25m
M、d TT P 0.25mMの2opi中、T4D
NAリガーゼ1単位及びDNAポリメラーゼエクレノウ
断片2単位を用い、15℃で17時間インキヱベートす
ることにより製造した。調製物を各々用いてコンビテン
)JM105細胞を形質転換し、得られる形質転換株プ
ラークを”p’jATP及びポリヌクレオチドキナーゼ
で標識された適当なオリゴマーとのハイブリッド形成に
より選択した。ハイブリッド形成条件は、各々のプロー
ブが塩基1個が変化したハイブリッドの形成を妨げるよ
うに最適化させた。−末鎖DNAをヒトオリゴマ−4変
異体含有ファージクローンから単離し、上記操作をヒト
オリゴマー5を用いて繰返して、オリゴマー4及び5変
異体双方を有するクローンを生成させた。
化し、各々の15pmoIlをそれぞれpH7,5のト
リス20mM、Mg C1z 10mM、NaCl3
0mM、DT71mMの101Ljl!中65℃で10
分間次いで23℃で10分間かけてM13mp19−a
FGF−重鎖ファージD N A 0.5 pmo j
2とアニーリングした。次いで環状二本鎖分子はpH7
,50トリス20mM、Mg C1t 10mM、N
a Cj! 25mM、DT75.5mM、ATPo、
5mM、dATPo、25mM、d CT P 0.2
5mM、dcTPo、25n+M、dGTPO,25m
M、d TT P 0.25mMの2opi中、T4D
NAリガーゼ1単位及びDNAポリメラーゼエクレノウ
断片2単位を用い、15℃で17時間インキヱベートす
ることにより製造した。調製物を各々用いてコンビテン
)JM105細胞を形質転換し、得られる形質転換株プ
ラークを”p’jATP及びポリヌクレオチドキナーゼ
で標識された適当なオリゴマーとのハイブリッド形成に
より選択した。ハイブリッド形成条件は、各々のプロー
ブが塩基1個が変化したハイブリッドの形成を妨げるよ
うに最適化させた。−末鎖DNAをヒトオリゴマ−4変
異体含有ファージクローンから単離し、上記操作をヒト
オリゴマー5を用いて繰返して、オリゴマー4及び5変
異体双方を有するクローンを生成させた。
下記方法において、これらM13担持クローン(M 1
3−based clone)におけるウシ配列からヒ
ト配列への変異体を1つのpBR322担持クローンに
組込んで結合させた。RF DNAを、ヒトオリゴマ
ー1.2.6及び8で特定化された塩基変更部分を有す
るクローンから得た。ヒト1変異体クローンのDNAを
EcoRIで切断し、末端を細菌アルカリホスファター
ゼで脱ホスホリル化し、DNAを旧ndlIIで切断し
た。ヒト2変異DNAをHindDIで切断し、ホスフ
ァターゼで処理し、次いでBamHIで切断した。ヒド
ロ変異DNAをBamHIで切断し、ホスファターゼ処
理し、次いでApalで切断した。同様に、ヒト8変異
DNAをApalで切断し、末端を脱ホスホリル化し、
DNAを5allで切断した。。これら4つのDNA調
製物を2%アガロースによる電気泳動に供し、ヒト1.
2. 6及び8変異体を有する変異DNAから45b
p、190bp、135bp及び70bpの断片をそれ
ぞれゲルから溶離させた。約60fmolの各断片を−
まとめにして、pH7,8のトリス25mM、MgCj
?z10mM、DTTlmM、ATPo、4mM及びT
4DNAリガーゼ1.5単位の5μβ中12℃で16時
間かけてpBR322由来の約60fmofのゲル精製
3.7kbEcoRI −3ail断片に結合させた。
3−based clone)におけるウシ配列からヒ
ト配列への変異体を1つのpBR322担持クローンに
組込んで結合させた。RF DNAを、ヒトオリゴマ
ー1.2.6及び8で特定化された塩基変更部分を有す
るクローンから得た。ヒト1変異体クローンのDNAを
EcoRIで切断し、末端を細菌アルカリホスファター
ゼで脱ホスホリル化し、DNAを旧ndlIIで切断し
た。ヒト2変異DNAをHindDIで切断し、ホスフ
ァターゼで処理し、次いでBamHIで切断した。ヒド
ロ変異DNAをBamHIで切断し、ホスファターゼ処
理し、次いでApalで切断した。同様に、ヒト8変異
DNAをApalで切断し、末端を脱ホスホリル化し、
DNAを5allで切断した。。これら4つのDNA調
製物を2%アガロースによる電気泳動に供し、ヒト1.
2. 6及び8変異体を有する変異DNAから45b
p、190bp、135bp及び70bpの断片をそれ
ぞれゲルから溶離させた。約60fmolの各断片を−
まとめにして、pH7,8のトリス25mM、MgCj
?z10mM、DTTlmM、ATPo、4mM及びT
4DNAリガーゼ1.5単位の5μβ中12℃で16時
間かけてpBR322由来の約60fmofのゲル精製
3.7kbEcoRI −3ail断片に結合させた。
反応混合物を水で1=5に希釈し、希釈液1μlを用い
て供給者が述べるようにコンピテント大腸菌DH5細胞
(BRL)20μlを形質転換させた。4種すべての変
異オリゴマーにより特定される変異部分を有するクロー
ンを、各々のオリゴマーから得られる放射線標識プロー
ブとのハイブリッド形成により選択した。ヒト3変異体
M13クローンの切断RF DNAから単離された1
40bp Kpnl−BamHI DNA断片をこ
のヒト1−2−6−8変異DNAのエンドヌクレアーゼ
切断生成物に結合させ、DH5コンピテント細胞に組込
んで形質転換させ、ヒ)1−2−3−6−8変異体を有
するクローンを得た。この後者のクローンのBam1l
l−Pstl切断断片をヒト4−5M13担持クローン
由来RF DNAのBamHI −PstI切断断片
に結合し、結合混合物を用いてDH5コンピテント細胞
を形質転換させた。ヒト1−2−3−4−5−6−8変
異体を有するクローンをオリゴマーハイブリッド形成に
より選択し、この組換えプラスミドのa FGF遺伝子
EcoRI −5ail D N A断片をMl 3m
pl 8 (BRL)のホスファターゼ処理EcoRI
−Sail切断RF DNAに結合させた。コンビテ
ン)DH5細胞をこの結合DNAで形質転換させ、形質
転換細胞をJM105宿主細胞上で培養して、M13ク
ローンを得た。このクローンの一末鎖ファージDNAを
ヒト7オリゴマーとアニーリングし、すべての望ましい
変異体含有のM13クローンを上記操作に従い得た。R
F DNFをこのクローンから得、EcoRI及び5
alIで切断した。得られる440bpバンドをゲル精
製し、p K K 2.7tacプロモ一ター発現ベク
ターの2.7 kp HcoRI −5all D N
A断片と結合させた。このDNAを用いてコンピテン
トDH5細胞を形質転換させ、これによってヒトaFG
F型製造用に使われるヒトpKK−aFGF発現クロー
ンを得た。
て供給者が述べるようにコンピテント大腸菌DH5細胞
(BRL)20μlを形質転換させた。4種すべての変
異オリゴマーにより特定される変異部分を有するクロー
ンを、各々のオリゴマーから得られる放射線標識プロー
ブとのハイブリッド形成により選択した。ヒト3変異体
M13クローンの切断RF DNAから単離された1
40bp Kpnl−BamHI DNA断片をこ
のヒト1−2−6−8変異DNAのエンドヌクレアーゼ
切断生成物に結合させ、DH5コンピテント細胞に組込
んで形質転換させ、ヒ)1−2−3−6−8変異体を有
するクローンを得た。この後者のクローンのBam1l
l−Pstl切断断片をヒト4−5M13担持クローン
由来RF DNAのBamHI −PstI切断断片
に結合し、結合混合物を用いてDH5コンピテント細胞
を形質転換させた。ヒト1−2−3−4−5−6−8変
異体を有するクローンをオリゴマーハイブリッド形成に
より選択し、この組換えプラスミドのa FGF遺伝子
EcoRI −5ail D N A断片をMl 3m
pl 8 (BRL)のホスファターゼ処理EcoRI
−Sail切断RF DNAに結合させた。コンビテ
ン)DH5細胞をこの結合DNAで形質転換させ、形質
転換細胞をJM105宿主細胞上で培養して、M13ク
ローンを得た。このクローンの一末鎖ファージDNAを
ヒト7オリゴマーとアニーリングし、すべての望ましい
変異体含有のM13クローンを上記操作に従い得た。R
F DNFをこのクローンから得、EcoRI及び5
alIで切断した。得られる440bpバンドをゲル精
製し、p K K 2.7tacプロモ一ター発現ベク
ターの2.7 kp HcoRI −5all D N
A断片と結合させた。このDNAを用いてコンピテン
トDH5細胞を形質転換させ、これによってヒトaFG
F型製造用に使われるヒトpKK−aFGF発現クロー
ンを得た。
ヒトr−aFGFをウシr−aFGFの場合と同様の操
作によって精製した(実施例4参照。)ヒトr−aFG
Fは、精製ヒトr−aFGF400ngが供されかつ感
度約1ng/バンドの銀染色SDS電気泳動ゲルにおい
て単一の強いバンドが存在することから、少なくとも純
度99.75%であると判断された。プロトコールは実
施例4に記載されている。
作によって精製した(実施例4参照。)ヒトr−aFG
Fは、精製ヒトr−aFGF400ngが供されかつ感
度約1ng/バンドの銀染色SDS電気泳動ゲルにおい
て単一の強いバンドが存在することから、少なくとも純
度99.75%であると判断された。プロトコールは実
施例4に記載されている。
純粋な組換えヒトaFGFは、実施例5のウシ組換えタ
ンパク質の場合と同様に、準融合性(subconfl
uent)BALB/c 3T3細胞中への3H−チミ
ジン取込み量からマイトジェン活性に関して調べられた
。脈管系内皮細胞に対して試験されたヒト脳由来a F
GFから既に観察されているように、組換えヒトタンパ
ク質はヘパリン(50μg/ml)活性化の面で脳由来
又は組換えウシa FGFの場合と比較し大きな違いを
示しており〔ギメネズーガレゴら、バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ンズ、第135巻、第541−548頁、1986年〕
、Ba1b/c 3T3細胞における組換えヒトa F
GFの結果は下記表に示されている: 第9表 r−aFGF濃度 CPM昆a1はニ
ニニベ12”ヘパリン3.16 4216
180210.0 4092
261731.6 4155
48241000(lng) 6811
105471000000(1μg )
15864 12425” pg =1
0−”g ヘパリン存在下において、2最大促進は約42pg/m
zのときに生じた。ヘパリン非存在下では、ピークは最
大濃度であっても明らかに到達したとはいえないが、約
30ng/m1以上であろう。
ンパク質の場合と同様に、準融合性(subconfl
uent)BALB/c 3T3細胞中への3H−チミ
ジン取込み量からマイトジェン活性に関して調べられた
。脈管系内皮細胞に対して試験されたヒト脳由来a F
GFから既に観察されているように、組換えヒトタンパ
ク質はヘパリン(50μg/ml)活性化の面で脳由来
又は組換えウシa FGFの場合と比較し大きな違いを
示しており〔ギメネズーガレゴら、バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ンズ、第135巻、第541−548頁、1986年〕
、Ba1b/c 3T3細胞における組換えヒトa F
GFの結果は下記表に示されている: 第9表 r−aFGF濃度 CPM昆a1はニ
ニニベ12”ヘパリン3.16 4216
180210.0 4092
261731.6 4155
48241000(lng) 6811
105471000000(1μg )
15864 12425” pg =1
0−”g ヘパリン存在下において、2最大促進は約42pg/m
zのときに生じた。ヘパリン非存在下では、ピークは最
大濃度であっても明らかに到達したとはいえないが、約
30ng/m1以上であろう。
第1図はa FGF遺伝子を有するpKK223−3プ
ラスミドの図である。 出願人 : メルク エンド カムパニーインコーボレ
ーテッド IG−1 手続補正書(方式) 昭和62年lO月22日
ラスミドの図である。 出願人 : メルク エンド カムパニーインコーボレ
ーテッド IG−1 手続補正書(方式) 昭和62年lO月22日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、組換えウシ酸性繊維芽細胞成長因子。 2、下記アミノ酸配列を有する組換えウシ酸性繊維芽細
胞成長因子: 【遺伝子配列があります】 3、1位のフェニルアラニンにメチオニンが結合した、
特許請求の範囲第2項記載の組換えウシ酸性繊維芽細胞
成長因子。 4、組換えウシ酸性繊維芽細胞成長因子の微異構造型。 5、ウシ酸性繊維芽細胞成長因子についてコードするヌ
クレオチド配列。 6、特許請求の範囲第2項記載の組換えウシ酸性繊維芽
細胞成長因子についてコードするヌクレオチド配列。 7、特許請求の範囲第3項記載の組換えウシ酸性繊維芽
細胞成長因子についてコードするヌクレオチド配列。 8、塩基配列が下記配列: 【遺伝子配列があります】 (上記において、QはC又はTであり、PはA又はGで
あり、NはA、T、C又はGである)のいずれかである
、特許請求の範囲第6項記載のヌクレオチド配列。 9、フェニルアラニンに関するコードがメチオニンに関
するコードの後に位置する、特許請求の範囲第8項記載
のヌクレオチド配列。 10、塩基配列が: 【遺伝子配列があります】 である、特許請求の範囲第9項記載のヌクレオチド配列
。 11、特許請求の範囲第10項記載のヌクレオチド配列
が挿入された発現プラスミド。 12、構造が第1図に示されている、特許請求の範囲第
11項記載のプラスミド。 13、プラスミドがpBR322である、特許請求の範
囲第11項記載のプラスミド。 14、特許請求の範囲第11項記載のプラスミドと適合
しかつそれを含有する宿主。 15、宿主が大腸菌である、特許請求の範囲第14項記
載の宿主。 16、宿主が大腸菌JM105又は大腸菌DH5である
、特許請求の範囲第15項記載の宿主。 17、プラスミドがウシ酸性繊維芽細胞成長因子のアミ
ノ酸配列を発現させることができる、特許請求の範囲第
11項記載のプラスミド。 18、応答性細胞中においてDNA合成を促進し得る特
許請求の範囲第14項記載の宿主によって産生されるタ
ンパク質。 19、下記工程: a、ウシ酸性繊維芽細胞成長因子についてコードするヌ
クレオチド配列を有するプラス ミドを製造する(ヌクレオチド配列はプラ スミド含有宿主によって発現せしめられる ことができる);次いで b、プラスミドを宿主中に組込む;及び c、ウシ酸性繊維芽細胞成長因子を産生するヌクレオチ
ド配列の発現にとって適した条 件下にプラスミド含有宿主を維持する; からなるウシ酸性繊維芽細胞成長因子の製造方法。 20、工程aにおいて、ヌクレオチド配列が特許請求の
範囲第10項記載のヌクレオチド配列である、特許請求
の範囲第19項記載の方法。 21、工程bにおいて、宿主が大腸菌である、特許請求
の範囲第19項記載の方法。 22、薬学的担体及び特許請求の範囲第1項記載の組換
えウシ酸性繊維芽細胞成長因子の有効創傷治癒量を含有
する創傷治療用医薬組成物。 23、薬学的担体及び特許請求の範囲第2項記載の組換
えウシ酸性繊維芽細胞成長因子の有効創傷治癒量を含有
する創傷治療用医薬組成物。 24、薬学的担体及び特許請求の範囲第3項記載の組換
えウシ酸性繊維芽細胞成長因子の有効創傷治癒量を含有
する創傷治療用医薬組成物。 25、創傷治癒促進方法であって、 特許請求の範囲第2項記載の組換えウシ酸性繊維芽細胞
成長因子の有効創傷治癒量のかかる治療を要する患者へ
の投与からなることを特徴とする方法。 26、創傷治癒促進方法であって、 特許請求の範囲第3項記載の組換えウシ酸性繊維芽細胞
成長因子の有効創傷治癒量のかかる治療を要する患者へ
の投与からなることを特徴とする方法。 27、組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子。 28、下記アミノ酸配列を有する組換えヒト酸性繊維芽
細胞成長因子: 【遺伝子配列があります】 29、1位のフェニルアラニルにメチオニンが結合した
、特許請求の範囲第28項記載の組換えヒト酸性繊維芽
細胞成長因子。 30、1位のフェニルアラニンが欠落し、2位のアミノ
酸がアスパラギン又はアスパラギン酸である、特許請求
の範囲第28項記載の組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因
子。 31、組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子の微異構造型
。 32、ヒト組換え酸性繊維芽細胞成長因子についてコー
ドするヌクレオチド配列。 33、特許請求の範囲第29項記載のヒト組換え酸性繊
維芽細胞成長因子についてコードするヌクレオチド配列
。 34、塩基配列が: 【遺伝子配列があります】 である、特許請求の範囲第33項記載のヌクレオチド配
列。 35、塩基配列が特許請求の範囲第34項記載の塩基配
列を生じるように点変異によって置き換えられている、
特許請求の範囲第10項記載のヌクレオチド配列。 36、特許請求の範囲第34項記載のヌクレオチド配列
が挿入された発現プラスミド。 37、構造が第1図に示されている、特許請求の範囲第
36項記載のプラスミド。 38、プラスミドがpBR322である、特許請求の範
囲第37項記載のプラスミド。 39、特許請求の範囲第36項記載のプラスミドと適合
しかつそれを含有する宿主。 40、大腸菌である、特許請求の範囲第39項記載の宿
主。 41、宿主が大腸菌JM105又は大腸菌DH5である
、特許請求の範囲第40項記載の宿主。 42、ヒト酸性繊維芽細胞成長因子に関する遺伝子を発
現させることができる、特許請求の範囲第36項記載の
プラスミド。 43、ヒト酸性繊維芽細胞成長因子に関する合成ヌクレ
オチド配列を発現させることができる、特許請求の範囲
第36項記載のプラスミド。 44、応答性細胞中においてDNA合成を促進し得る特
許請求の範囲第39項記載の宿主により産生されるタン
パク質。 45、下記式工程: a、ヒトaFGFについてコードするヌクレオチド配列
を有するプラスミドを製造する (ヌクレオチド配列はプラスミド含有宿主 によって発現せしめられることができる);次いで b、プラスミドを宿主中に組込む;及び c、ヒトaFGFを産生するヌクレオチド配列の発現に
とって適した条件下にプラスミ ド含有宿主を維持する; からなるヒトaFGFの製造方法。 46、工程aにおいて、ヌクレオチド配列が特許請求の
範囲第34項記載のヌクレオチド配列である、特許請求
の範囲第45項記載の方法。 47、工程bにおいて、宿主が大腸菌である、特許請求
の範囲第45項記載の方法。 48、薬学的担体及び特許請求の範囲第27項記載の組
換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子の有効創傷治癒量を含
有する創傷治療用医薬組成物。 49、薬学的担体及び特許請求の範囲第28項記載の組
換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子の有効創傷治癒量を含
有する創傷治療用医薬組成物。 50、薬学的担体及び特許請求の範囲第29項記載の組
換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子の有効創傷治癒量を含
有する創傷治療用医薬組成物。 51、薬学的担体及び組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因
子の微異構造型の有効創傷治癒量を含有する創傷治療用
医薬組成物。 52、創傷治癒促進方法であって、 特許請求の範囲第27項記載の組換えヒト酸性繊維芽細
胞成長因子の有効創傷治癒量のかかる治療を要する患者
への投与からなることを特徴とする方法。 53、創傷治癒促進方法であって、 特許請求の範囲第28項記載の組換えヒト酸性繊維芽細
胞成長因子の有効創傷治癒量のかかる治療を要する愚者
への投与からなることを特徴とする方法。 54、創傷治癒促進方法であって、 特許請求の範囲第29項記載の組換えヒト酸性繊維芽細
胞成長因子の有効創傷治癒量のかかる治療を要する患者
への投与からなることを特徴とする方法。 55、創傷治癒促進方法であって、 組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子の微異構造型の有効
増殖促進量のかかる治療を要する患者への投与からなる
ことを特徴とする方法。 56、下記工程: a、アフィニティークロマトグラフィー担体及び許容さ
れる溶離剤による組換えaFG Fの部分精製;次いで b、アルキルシラン基質及び許容される溶離剤を用いる
逆相高速液体クロマトグラフィ ーによる部分精製組換えaFGFの最終精 製; からなる純粋型への組換え酸性繊維芽細胞成長因子(a
FGF)の精製方法。 57、工程aにおいて、アフィニティー担体がヘパリン
−セファロースである、特許請求の範囲第56項記載の
方法。 58、工程bにおいて、アルキルシラン基質が3〜18
個の炭素原子を有する、特許請求の範囲第56項記載の
方法。 59、工程bにおいて、アルキルシラン基質が4個の炭
素原子を有する、特許請求の範囲第56項記載の方法。 60、工程aにおいて、aFGFが塩化ナトリウムで溶
離せしめられる、特許請求の範囲第56項記載の方法。 61、工程bにおいて、aFGFが酸及び有機溶媒から
なる溶離液勾配により精製せしめられる、特許請求の範
囲第56項記載の方法。 62、酸がトリフルオロ酢酸、リン酸又は酢酸である、
特許請求の範囲第61項記載の方法。 63、有機溶媒がアセトニトリル又はエタノールである
、特許請求の範囲第61項記載の方法。
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