DK175856B1 - Nukleotid sekvens, ekspressionsplasmid og fremgangsmåde til oprensning af aFGF - Google Patents

Description

DK 175856 B1 i

Beskrivelse af figur.

Fig. 1 viser skematisk pKK223-3 plasmidet, som indeholder genet for aFGF. Baggrund for opfindelsen.

5 Hjemeafledte fibroblastmitogener blev først beskrevet af Trowell et al., J.

Exp. Biol. 16: 60-70 (1939) og Hoffman, Growth 4: 361-376 (1940). Det blev derefter vist, at hypofyseekstrakter også havde kraftig mitogen aktivitet for fi-brobiaster, Armelin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2702-2706 (1973). Delvis rensning af både hjerne- og hypofysefibroblasvækstfaktor (FGF) afslørede 10 mitogen aktivitet mod en række forskellige typer adkilte celler, herunder vaskulære endothelialceller, Gospodarowicz et al., Natl. Cancer Inst. Mo-nogr. 48: 109-130 (1978). Det er fomyligt blev vist, at FGF eksisterer på to former, sur FGF (aFGF) og basisk FGF (bFGF), og begge former er blevet identificeret i hjemepræparater, Thomas og Gimenez-Gallego, TIBS 11:81 -15 84 (1986). Adskillige celletyper responderer til stimulering med enten renset aFGF eller bFGF ved syntetisering af DNA og delen, herunder primære fi-broblaster, vaskulære celler og hornhinde endothelialceller, chondrocyter, osteoblaster, myoblaster, glatmuskelceller og glialceller, Esch et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 82:6507-6511 (1985), Kuo et al., Fed. Proc. 44:695 20 (1985).

Ren kvæghjemeafledt aFGF virker ikke blot som et kraftigt mitogen for vaskulære endothelialceller i kultur; men inducerer også blodkarvækst in vivo, Thomas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6409-6413 (1985). Den fi-25 broblastmitogene aktivitet for aFGF kan også anvendes til at fremme sårheling, Thomas, US patentskrift nr. 4 444 760. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en genetisk konstruktion og midler til ekspression, der muliggør produktion af store mængder ren aFGF, der kan anvendes terapeutisk.

3 0 Formål med opfindelsen.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en nukleotidba-sesekvens for såvel bovin aFGF som human aFGF ud fra de specifikke proteiners aminosyresekvenser. Et andet formål er at fremstille gener, som koder for de specifikke aFGF, samt at indbygge generne i passende klonings 35 værter. Et yderligere formål er at transformere en passende vært med hver af de rekombinante vektorer og at inducere ekspression af de specifikke aF- 2 DK 175856 B1 GF gener. Endnu et formål er at isolere og oprense biologisk aktiv bovin aF-GF og human aFGF. Disse og andre formål vil fremgå af den følgende beskrivelse.

5 Sammendrag af opfindelsen.

Der konstrueres unikke gener, som koder for aminosyresekvensen for bovin sur fibroblastvækstfaktor (aFGF) og human aFGF. Det bovine gen er afledt fra omvendt translation af aFGF aminosyresekvensen, mens det humane gen er afledt ved specifikke punktmutationer af det bovine gen. Hver genio konstruktion indsættes i en ekspressionsvektor, som anvendes til at transformere en passende vært. De transformerede værtceller producerer rekom-binant aFGF (r-aFGF), humant eller bovint, som renses og har en aktivitet ækvivalent med nativt protein.

15 Detaljeret beskrivelse

Sure fibroblastvækstfaktorer eksisterer i forskellige mikroheterogene former, som isoleres fra de forskellige vævskilder og celletyper, der er kendte for at indeholde aFGF. Mikroheterogene former som anvendt heri refererer til et enkelt genprodukt, som er et peptid produceret ud fra en enkelt genenhed af 20 DNA, hvilket DNA er strukturelt modificeret efter translation. De strukturelle modifikationer resulterer imidlertid ikke i nogle væsentlige ændringer i biologisk aktivitet af peptidet. Modifikationerne kan finde sted enten in vivo eller under isoleringen og rensningsprocessen. In vivo modifikation resulterer i, men er ikke begrænset til, proteolyse, glycolysering, phosphorylering eller 25 acetylering ved den N-terminale ende. Proteolyse kan omfatte exoproteoly-se, hvori en eller flere terminale aminosyrer kløves sekventielt, enzymatisk til fremstilling af en mikroheterogen form, som har færre aminosyrer end det oprindelige genprodukt. Endoproteolytisk modifikation er et resultat af virkningen af endoproteaser, som kløver peptidet ved specifikke lokaliseringer 30 inde i aminosyresekvensen. Lignende modifikationer kan forekomme under rensningsprocessen, som også resulterer i produktion af mikroheterogene former. Den mest almindelige modifikation forekommende under rensning er proteolyse, som generelt holdes på et minimum ved anvendelse af protea-seinhibitorer. Under de fleste tilstande er en blanding af mikroheterogene 35 former til stede efter rensning af nativt aFGF. Nativt aFGF refererer til aFGF isoleret og renset fra væv eller celler, der indeholder aFGF.

3 DK 175856 B1

Opfindelsen omfatter alle mikroheterogene former for sur fibroblastvækstfak-tor fra pattedyr. De foretrukne udførelsesformer omfatter bovine og humane k mikroheterogene former af aFGF. De mest foretrukne mikroheterogene for- 5 . mer for bovin aFGF omfatter en form med 154 aminosyrer, en med 140 ami- ! nosyrer og en med 134 aminosyrer. Formen med 140 aminosyrer fremgår af tabel III, og det er den mest foretrukne af de ovennævnte bovine arter. Formen med 154 aminosyrer omfatter yderligere følgende aminosyrer: 10 Ala-Glu-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Phe-Thr-Ala-Leu-Thr-Glu-Lys, hvor den carboxylterminale Lys er knyttet til den aminoterminale Phe ved . første stilling i formen med 140 aminosyrer. Formen med de 134 aminosyrer er identisk med formen med de 140 aminosyrer med undtagelse af, at de 6 15 første aminosyrer fra den aminoterminale ende er blevet fjernet. Efter isolering varierer de relative mængder af disse mikroheterogene former afhængigt af den fremgangsmåde, der er blevet anvendt, men alle præparater indeholder i det mindste en del af hver form.

20 Humant aFGF udviser en lignende mikroheterogenicitet som bovin aFGF. De mest foretrukne mikroheterogene former for humant aFGF omfatter en form med 154 aminosyrer, 140 aminosyrer eller 139 aminosyrer. Den humane form med 140 aminosyrer afviger fra den bovine form med 11 aminosyrer, hvilket fremgår af tabel V. Formen med 154 aminosyrer indeholder den nøj-25 agtige sekvens for den humane form med 140 aminosyrer plus 14 yderligere aminosyrer associeret med den bovine form med 154 aminosyrer på en undtagelse nær. Aminosyren i den femste stilling fra den N-terminale ende eller stilling -10 som bestemt ud fra den 140 aminosyre Phe N-terminus i den humane form og erstatter threonin i den bovine form. De yderligere 14 amino-30 syrer i den humane N-terminale sekvens er:

Ala-Glu-Gly-Glu-lle-Thr-Thr-Phe-Thr-Ala-Leu-Thr-Glu-Lys.

En tredie form for human aFGF indeholder 139 aminosyrer og er ækvivalent 35 med den humane form med 140 aminosyrer, hvor den aminoterminale phe-nylalanin er fjernet. Den aminoterminale asparaginrest kan være deamideret 4 DK 175856 B1 til aspartinsyre i den humane form for aFGF med 139 aminosyrer. Formerne med 140 og 139 aminosyrer er de mest foretrukne former af de humane mi-kroheterogene former.

5 Pattedyrs r-aFGF produceret ved kloning af det naturlige gen fra enten den genome DNA eller cDNA eller ved konstruktion af gen for en af de mikrohe-terogene former for proteinet baseret på den kendte aminosyresekvens for disse mikroheterogene former for aFGF fra pattedyrarter, herunder menne sket. Genomt DNA ekstraheres fra pattedyrshjeme eller hypofyseceller og 10 forberedes for kloning ved enten tilfældig fragmentering af højmolekylvægt DNA efter teknikken af Maniatis et al., Cell 15: 687-701 (1978) eller ved kløvning med et restriktionsenzym ved metoden af Smithies et al., Science 202:1284-1289 (1978). Den genome DNA inkorporeres derpå i en passende kloningsvektor, almindeligvis E. coli lambda fag, se Maniatis et al., Molecular 15 Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).

For at opnå cDNA for aFGF ekstraheres poly-(A)-holdig RNA fra celler, der udtrykker aFGF ved metoden af Aviv og Leder, Proc. Natl. Acad. Sci.

20 69:1408-1412 (1972). cDNA fremstilles under anvendelse af omvendt trans- skriptase og DNA polymerase under anvendelse af standardteknikker som beskrevet af Maniatis et al.., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982). cDNA tai-les og klones ind i en passende vektor, sædvanligvis pBR322, ved en teknik, 25 der ligner den af Wensink, et al., Cell 3:315-325 (1974).

De klonale genome DNA eller cDNA biblioteker screenes for at identificere de kloner, der indeholder aFGF-sekvenser, ved hybridisering med en oligo-nukleotidprobe. Sekvensen for oligonukleotid-hybridiseringsproben er base-3 0 ret på den bestemte aminosyresekvens for aFGF. Maniatis et al., supra, Anderson og Kingston, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6838-6842 (1983) og Suggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6613-6617 (1981) beskriver forskellige procedurer til screening af genome og cDNA kloner.

3 5 Den foretrukne procedure til opnåelse af et gen for pattedyrs aFGF er at syntetisere genet. Genet kan syntetiseres baseret.på aminosyresekvensen for 5 DK 175856 B1 en mikroheterogen form for aFGF opnået fra et vilkårligt pattedyr, herunder mennesket. Den foretrukne metode er at anvende den bovine aminosyrese-kvens for aFGF og kemisk punktmutere basesekvensen til fremstilling af generne for andre arter. Aminosyresekvenseme for bovint og humant aFGF er 5 . omtalt i US patentansøgning nr. 868 473, indleveret den 30. maj 1986, som er en continuation-in-part af US patentansøgning nr. 774 359, der blev indleveret den 12. september 1985, som igen er en continuation-in-part af US patentansøgning nr. 685 923, der blev indleveret den 24. december 1984, og som nu er faldet.

10

De syntetiske gener er baseret på den bestemte bovine aminosyresekvens tidligere beskrevet af Gimenez-Gallego et al., Science 230:1385-1388 (1985) og den humane aminosyresekvens som beskrevet af Gimenez-Gallego et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 138:611-617 (1986). Den unikke nu- 15 kleotidsekvens af den 140 aminosyre store form af bovint aFGF er afledt fra omvendt translation af aminosyresekvensen véd en teknik lignende den af Itakura et al., Science 198: 1056-1063 (1977). De forskellige hidtil ukendte nukleotidsekvenser svarende til den native aminosyresekvens for bovint aFGF fremgår af følgende tabel: 20 6 DK 175856 B1

TABEL I

5 '0 IS 20

Phe Asn Leu Pro leu 61 y Asn Tyr Lys Lys Pr<> Lys Uu L#u Tyr Cys Ser Asn G1y G1y

5 TTQ AAQ CTN CCN CTN 6GN AAQ TAQ AAP AAP CCN AAP C TN CTN TAO TGQ TCN AAQ GGN GGN

TTP TTP TTP TTP agq 25 30 35 40

Tyr Phe Leu Arg Ile leu Pro Asp Gly Thr Val Asp G1y Thr Lys Asp Arg Ser Asp Gin

io TAQ TT(> c™CGH ATG c™ CCN GGN ACN G™ ^06,1 ACN ^CGN TCN ^ CAP

TTP AGP ATA TTP AGP AGQ

45 50 55 60

His Ile Gin Leu Gin Leu Cys AU Glu Ser lle Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu

CAQ ATO CAP CTN CAP CTN TGQ GCN GAP TCN ATQ GGN GAP GTN TAQ ATQ AAP TCN ACN GAP

^5 ATA TTP TTP AGQ ΑΤΑ ΑΤΑ AGO

65 70 75 BO

Thr Gly Gir, Phe Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn

ACN GGN CAP TTQ CTN GCN ATG GAQ ACN GAQ GGN CTN CTN TAQ GGN TCN CAP ACN CCN AAQ

7TP TTP TTP AGO

20 85 90 95 ,00

Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr lie Ser Lys

GAP GAP TGQ CTN TTQ CTN GAP CGN CTN GAP GAP AAQ CAQ TAQ AAQ ACN TAQ ATQ TCN AAP

TTP TTP AGP TTP ATA AGQ

25 105 1,0 1 15 120

Lys His Ala Glu Lys His Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn G1 y. Arg Ser Lys Leu Gly

AAP CAQ GCN GAP AAP CAQ TGG TTQ GTN GGN CTN AAP AAP AAQ GGN CGN TCN AAP CTN GGN

TTP AGP AGQ TTP

125 130 135 ho.

30 Pr® Arg Thr His Phe Gly Gin Lys Ala He Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp

CCN CGN ACN CAQ TTQ GGN CAP AAP GCN ATQ CTN TTQ CTN CCN CTN CCN GTN TCN TCN GAQ

AGP ATA TTP TTP TTP AGQ AGQ

hvor Q - C eller T,

35 P = A eller G, og N = A, T, C eller G

DK 175856 B1 7 ·

Nukleotidsekvensen ifølge opfindelsen omfatter følgende egenskaber, codo-ner foretrukne af Escherichia coli og pattedyrs celler, hvor det muligt, eliminering af sekvenser med flere komplementariteter, inkorporering af unikke restriktionssteder genet igennem, terminale .restriktionsenzymklæbrige ender 5 for at lette indsætningen af genet i plasmider, et centralt lokaliseret unikt restriktionssted for at tillade sarnling af genet i to halvdele, fortrinsvist en N-terminal methionincodon som start for translation og tandem translation stopcodoner.

lo Den efterfølgende beskrivelse og eksemplerne illustrerer den foreliggende opfindelse med hensyn til en særlig nukleotidsekvens for bovint aFGF, men den foreliggende opfindelse vil kunne omfatte en vilkårlig af de permutationer, der er oprenset i tabel I. Tabel II indeholder den foretrukne nukleotidsekvens: 15 8 DK 175856 B1

TABEL II

TTCAATCTGCCACTGGGTAATTACAAAAAGCCAAAGCTTCTTTACTGCTCTAACG6TGGT 60 5 TACTTTCTCCGCATCCTGCCAGATGGTACCGTGGACGGCACCAAAGATCGTTCTGATCAA 120 10 CATATTCAACTGCAGCTGTGCGCCGAATCTATCGGTGAAGTTTACATCAAATCTACCGAA 180 15 ACTGGTCAATTCCTTGCCATGGACACTGATGGCCTGCTGTACGGATCCCAGACCCCAAAC 240 20 GAGGAGTGCCTTTTCCTGGAGCGCCTGGAGGAAAACCATTACAACACCTACATCTCTAAA 300 25 AAGCATGCTGAGAAACATTGGTTCGTAGGCCTTAAGAAAAATGGCCGCTCTAAACTGGGC 360 30 CCTCGTACTCACTTTGGTCAAAAAGCTATCCTGTTCCTGCCACTGCCAGTGAGCTCTGAC 420 35 9 DK 175856 B1

Genet konstrueres med en lederdel indeholdende et enkelt restriktionskløvningssted og en N-terminal methionincodon for et translationalt startsted.

Genet indeholder også en hale indeholdende tandem translationale stopco-doner og to restriktionsenzymkløvningssteder. Den komplementære egen- .

5 skab for DNA tillader et valg af basesekvenser, som igen tillader inkorporering af unikke restriktionsenzymkløvningssteder fordelt i genet. Den foretrukne genbasesekvens med lokalisering af restriktionsenzymkløvningsstedeime er vist i tabel III: 10 DK 175856 B1

W *- < L· O O

« u o £ υ o

(Λ O Η < H* O <C >— I

si < c ir α u L *-15 O ^ 04 < *—

< (J O <3 O O

Qi k < 1. U 13 *-*

M < ►- « O X

< <2 o v> Η < § «* ^ μ* >» « k d >1 ^ K f- l71 Q ω

J < H- O U U

L · (J 19 k · L> O

je oLiL >» < *- >* υ (β · a iD o r· o o «» *— < O O O «4 U *3

Op O O 3 O O

V» «i l·· φ k· < < o υ -i u α

r- 43 O >* . O O

<0 O μ- < r- 0430 > O (3 o o rv u u o w ^ o O OO. CM ^ < m jc u o η γν w < *">

Η < K C < 0 O

>» μ < d u »- < *— O O >C JC. o 0 o o o »— < k α μ- < α o o v· < μ ιΑ < ^ < « o o < · o υ o ^ < μ *-» ^ u n

k O u O Φ k < O

fi. M o O X < »- U

3 (3 0 * O O Z

0 μ < — O O

~J O O < O O

Φ O O 3 M ^ r— μ·» < Φ Η < O0 *— -«* *- -i o o w

<λ O U O «"· Φ O U O

4- (D O <J ^ -C O i- < < U o ^ cl c\j μ· < 3 O O C < M*

01 H- < . »— < H

J U 0 13 O O

Of μ- < >1 ►- < 4S »- < r- r— «3 0

O. >- < 43 O O

L U 0 U w k- <

>% < ►- £ · O O

μ- μ- < μ- < μ- o>* h < 03 ί μ· «Ν*μ- (30 O»— < >— o o o o o u

>» N* < k O O

«— 43 O jC O O

>1 o o o μ- < ♦— m c O O l· μ- < t— m <r μ- φ o o u-ι «c o < μ v> o μ < 4- ^ U=L· < v* O < »— 0» (J 43 >S «— < uj (Λ μ < -j < μ-

Γ «* (J o Φ O O

£ >» c o — ►· < PC o μ < μ* <f ►— S i (j u w oro- 2 >» < μ- >ι < μ- Μ μ- μ- < μ- μ- «ς 3 · μ* < r— · μ < Οι μ» < Φ μ < -4 ο Ο > 4JS Ο 3 »— < . ο <. μ- φ μ < μ f- « ^ _Ι ϋ Ο μ Ο ta Ο •Λ ο ο ό >% μ- < >1 < μ- C r— Ο Ο < μ» Ο 43 Ο Ο < μ- χ Φ Ο Ο k Ο Ο Ο r- Ο μ- < ο_ ο υ i? μ *ο^μ» ο μ ο ο ο k μ < χ < κ m οι t_> Ο ·-* Ο < μ- ν> μ* < «**

Μ < μ- 3 < Η- C

_j < ^ ο <3 ο χ .

k u Ο m ο ο >η γ^. -C μ- ι— ο Ο < * ο ο /-» C *—* μ < νι υ Ο £ vi < μ >> Ο .ο w· < < <~ ο 1— < >* *— < 3 Ο Ο <— r— Ο Ο ^ Φ « μ < μ Ο 19 υ ν otnoOs 3 43 Ο *—* C μι Ο Ο > φ μ < μ- < μ» ο.

_J U 0 ο ο ο W

Ο Ο < μ 3 ο ο U ·μ μ rg ο ο « μ* « νι α. υ ο ο μ υ Ο ο.

3 ο ο c < μ- ο» μ- < μ- < ο ο <3 ο ο ο C μ- < Φ μ- < ΙΛ < μ- c— μ < < < μ* *— < ►- #— φ ο ο i« μ- < -c . < — · < μα. μ- < χ ο 43 ** (3ο ο c < μ φ ►- < *τ ι— < μ- X Ο U Ο « kJ 43 μ Ο. μ < μ μ- α νι < ι— u μ- ο < 0 U Ο < w

«— ^ UJ

* 11 DK 175856 B1 «Λ < ft— >i < ►- —i O ^ *— t so »- <

o (*) u W

«/> ^ < σ» u d u u u < u o >« u o

r O U

19 19 Vi C · μ- < < 3 ·— •Λ «< ►- >» < >· —J ·< f- •λ <3 o >* .< h- -i < »· 3 μ» < <* O >— -tf -i u“ «— .

o >> ro o o 3 — f— CS O «i «—O C g (Λ »— < *- «0 ft- <

> C <J

ei u O

£ ΓΓ 5 α ου o u O o ^r k ►- < tt V« fr— < — < μ- X Vi O ft— *-· V» < f u r- >* «« ft— O ft -i < μ- < *Λ 3 O O li ~ O 19 Vi —'

p- N < H> Μ ΤΓ U O

O Π O U - v >- < >

« ft— < w < H- OC

«— u o »- < o < O U « < ft— ti

* Η- < Λ u U W

·*- . < ft- A. · < μ- X U O «Λ ^ < «) m O U < ^ •J . tfC »- μ- < OM W tf H O O. u o

O X < K V M tf K

J. — -J <C ft— — < O u

Φ O u O 41 O O

«1 ft— < «Λ I— < <-» 7 o o O l u <3 w r* p— *— ·< φ o vi ms L ·-* O ·« ft- ΙΛ O < »Λ r u o o O »— cm <3 u U >» Γ0 < t— <0 T7 ft— < I—* L- ft- *— < > o u « s. l o o o <r ft— »—

£ .OO Ur— O O W

♦— tt p- o. m o o

IH C U U 3 *— O O

L-J ** < »— Φ *—· H < r < -2 w h o 3 H V · O O O . < μ

>> < ft- L. O O

1 »- ►- < o. O O

H «* *- < 3 O O

(aj — < ft- 4> ft— <C

/r z <- O o o o •r c .Li O 4l o o < ** <c ft- jC μ- <r O < <5 H- CL· ft— <

^ 3 < I— 3 O O

r- O < »- Φ O μ- <

O €0 0 0 O o O O

03 N O U O « ^ U O

O' p· <Ή D p· H < O O O P> M < >.

3 O o «ο »- tt

41 μ- -tf »— uHJ

—J U O H < o o CA U O μ M tf μ· C o O φ >s tf μ.

« «oo« o « «tf ft— 3 O O X C tf ft-

P*T < H p- tf H

O O O O O o 3 O O >* ft- <

4» H tf p— O

o o O <—* o o o φ O O O 4) ft— < JC ft— < — .C μ- tf CL *— tf w CL . ^ <

3 O μ tf M OOO

4> tf) μ < μ- <Q tf μ -* cm o o x ro o o V» O O L μ- <

X 13 O £ U O

υ η μ < μ- tf μ ι—»- 3 <n O O O) μ < v f— μ« tf μ μ 19 y _» o O o < o o «-» 3 O O O μ tf *- · < μ >> μ · u o O O o (L ro o O ·-«

O C O O O >* — O O <D

CO M tf μ fSJ p— μι O O Q.

tf tf μ — O O O < o tf μ 3 . o o L O O 41 ft— < o. O O O o o 12 DK 175856 B1

Gensekvensen for hver streng af det dobbeltstrengede molekyle er tilfældigt delt i 8 nukleotidsekvenser. Oligonukleotiderne er konstrueret med overlappende ender for at tillade dannelse af den dobbeltstrengede DNA. Følgende tabel indeholder en af de flere mulige oligonukleotidarrangementer, der an-5 vendes til fremstilling af det bovine aFGF gen.

TABEL IV

10 01IG0-1 10 20 30 40 50 S8 5' AATTCATGTT CAATCTGCCA CTGGGTAATT ACAAAAAGCC AAAGCTtCTT FACTGCTC 3' 15 OLIGO-2 10 20 30 40 45 5' AGAAGCTTTG GCTTTTTGTA ATTACCCAGT GGCAGATTGA ACATG 3' OLIGO-3 10 20 30 40 50 60 S' TAACGGTGGT TACTTTCTCC GCATCCTGCC AGATGGTACC GTGGACGGCA CCAAAGATCG 3* 20 OLIGO-4 10 20 30 40 50 59 5* TGCCGTCCAC GGTACCATCT GGCAGGATGC GGAGAAAGTA ACCACCGTTA GAGCAGTAA 3' 0LIG0-5 10 20 30 40 46 5' TTCTGATCAA CATATTCAAC FGCAGCTGTG CGCCGAATCT ATCGGT 3* 25 01IG0-6 10 20 30 40 50 60 65 5' GTAAACTTCA CCGATAGATT CGGCGCACAG CTGCA6TTGA ATATGTTGAT CAGAACGATC TTTGG 3’

OlIGO-7 10 20 30 40 50 60 67 3° 5' GAAGTTTACA TCAAATCTAC CGAAACTGGT CAATTCCTTG CCATGGACAC TGATGGCCTG CTGTACG 3· 35 13 DK 175856 B1 } TABEL IV (fortsat) 5 01IG0-8 10 20 30 40 50 60 62 5* GATCCGTACA GCAGGCCATC AGTGTCCATG GCAAGGAATT GACCAGTTTC GGTAGAfTTG At 3· 0LIG0-9 10 20 30 40 50 S2 5' GATCCCAGAC CCCAAACGAG GAGTGCCTTT TCCTGGAGCG CCTGGAGGAA AA 3* 10 OLIGO-IO 10 20 30 40 50 58 5’ GTTGTAATGG TTTTCCTCCA GGCGCTCCAG GAAAAGGCAC TCCTCGTTTG GGGTCTGG 3‘ j OLIGO-11 10 20 30 40 48 5' CCATTACAAC ACCTACATCT CTAAAAAGCA TGCTGAGAAA CATTGGTT 3' 15 0LIG0-12 10 20 30 40 46 S' GGCCTACGAA CCAATGTTTC TCAGCATGCT TTTTAGAGAT GTAGGT 3* OLIGO-13 10 20 30 40 50 53 5' CGTAGGCCTT AAGAAAAATG GCCGCTCIAA ACTGGGCCCT CGTACTCACT TTG 3* 20 OUGO-14 10 20 39 40 50 55 ♦ 5’ GCTTTTTGAC CAAAGTGAGT AC6AGGGCCG AGTTTAGAGC GGCCATTTTT CTTAA 3' OLIGO-15 10 20 30 40 50 56 25 5* 6TCAAAAAGC TATCCTGTTC CTGCCACTGC CAGTGAGCTC TGACTAATAG ATATCG 3' 01IG0-16 10 20 30 40 50 5’ TCGACGATAT CTATTAGTCA GAGCTCACTG GCAGTGGCAG GAACAGGATA 3' 30

De i tabel IV viste oligonukleotider præsenteres blot som et eksempel på oli-gonukleotidunderenheder og skal ikke betragtes som begrænset dertil. Den sammensatte basesek- vens, der viser overlapning og arrangement af oligo-nukleotiderne, er vist i tabel III.

35 14 .

DK 175856 B1

Det bovine gen samles i to trin: først den halvdel, der svarer til den N-terminale del af proteinet, og dernæst som den anden C-terminale halvdel. Generelt kinaseres oligonukleotideme med T4 polynukleotidkinase i nærværelse af enten APT eller 32P-mærket ATP. I første reaktion i hvert trin kinase-5 res de oligonukleotider, som udgør den ene streng af genet, med undtagelse · af det meste 5'-oligonukleotid. I den anden reaktion kinaseres oligonukleoti-derne, som udgør den anden streng, med undtagelse af det meste 5'-oligonukleotid. Når kinaserede oligonukleotider anvendes, tilsættes ca. 1 pmol af det 32P-mærkede oligonukleotid til senere identificering af produkter-10 ne. Spændingsudligning udføres i en passende puffer, såsom en indeholdende, men ikke begrænset til, ca. 60 mM Tris, ca. pH 7,6, ca. 5 mM dithiothreitol (DTT), ca. 10 mM MgCfe og cå. 30 μΜ ATP ved ca. 90 °C i ca.

4 minutter efterfulgt af en hurtig overføring til ca. 60 °C og en hurtig afkøling til ca. 30 °C. Ugering udføres i en passende puffer, såsom en indeholdende, 15 men ikke begrænset til, ca. 60 mM Tris, ca. pH 7,6, ca. 10 mM DTT, ca. 10 mM MgCfe, ca. 30 μΜ ATP og ca. 0,03 enheder T4 DNA ligase ved ca. 20 °C i ca. 1,5 time.

De ligerende oligonukleotider renses ved polyacrylamidgelelektrophorese ef-20 terfulgt af et ethanoludfældning. Oligonukleotideme genopløses i en puffer indeholdende ca. 20 μΙ ca. 80%’s formamid, ca. 50 mM Tris-borat, ca. pH 8,3, ca. 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), ca. 0,1% efter vægt/vol. xylencyanol og ca. 0,1 % efter vægt/vol. bromphenolblåt. Hver prøve opvarmes ved ca. 90 °C i ca. 3 minutter og elektrophoreseres i en ca. 10%’s urin-25 stof-polyacrylamidgel ved ca. 75 Watt i ca. 5 timer. De 231 base N-terminale bånd fjernes, kombineres og elueres ved ca. 4 °C i ca. 0,5 M ammoniumacetat indeholdende ca. 1 mM EDTA ved ca. pH 8. De 209 base C-terminale bånd behandles på samme måde.

30 De syntetiserede gensekvenser, som koder for enten den N-terminale eller den C-terminale del af aFGF inkorporeres i pBR322 plasmidet. Det er særligt ønsket og tilsigtet, at der af opfindelsen omfattes anvendelsen af andre plasmider, i hvilke aFGF genet kan inkorporeres, og som vil tillade ekspression af aFGF genet. Genspændingsudlignede oligonukleotider, ca. 300 fmol 35 og ca. 100 fmol af den udvundne 231 basepar N-terminale ende ligeres hver især til ca. 100 fmol agarosegel renset ca. 3,9 kilobase (kb) EcoRI-BamHI

15 DK 175856 B1 pBR322 for den N-terminale ende. Den 209 bp C-terminale ende konstrueres på samme måde under anvendelse af BamHI-Sall pBR322. Ligering udføres i en puffer indeholdende ca. 20 mM Tris, ca. pH 7,8, ca. 1 mM DTT, ca. 10 mM MgCl2, ca. 0,4 mM ATP, med ca. 1 enhed T4 DNA ligase i ca. 1 5 time ved ca. 20 °C. Hver halvgen ligeret vektor anvendes til at transformere kompetente bakterieceller, såsom E. coli RR1 (Bethesda Research Laboratories, BRL), idet man følger leverandørens procedurer. De transformerede celler vælges for vækst i ampicillin og screenes for tilstedeværelsen af enten den 231 basepar (bp) EcoRI-BamHI indsat eller den 209 bp BamHI-Sall ind-10 sat ved restriktionsanalyse af minilysat plasmidpræparationer. DNA sekvensen for kloner indeholdende en indsats med en passende størrelse, bestemmes under anvendelse af Maxam og Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564 (1977) kemisk DNA sekvenstekriik.

15 Det endelige fuldlængde, syntetiske aFGF gen blev klonet véd kløvning af den N-terminale halvklon med restriktionsenzymer BamHI og Sall, behandling med alkalisk phosphatase og ligering deraf til den gelrensede 209 bp BamHI-Sall indsat af den C-terminale halvklon. Dette ligerede materiale blev anvendt til at transformere kompetente RR1 celler som før.

20

Ekspression af det syntetiske aFGF gen følges af en række forskellige promotor-ekspressions systemer. Det er ønsket og tilsigtet, at der i opfindelsen omfattes anvendelse af andre promotor-ekspressions systemer til ekspression af det intakte aFGF gen. Den foretrukne konstruktion gør brug af E. coli 25 tac promotor, en hybrid mellem områder af trp promotoren og.lac promotoren som beskrevet af deBoer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983). Plasmid pKK 223-3 (Pharmacia), som indeholder tac promotoren og rmB rRNA transskriptionsterminatoren, blev modificeret til fjernelse af det pBR322-afledte Sall restriktionsenzymsted. rmB rRNA terminatoren har vist 30 at tillade ekspression ved stærke promotorer, Gentz et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 78:4936-4940 (1981); Brosius, Gene 27:161-172 (1984).

pKK223-3 plasmid DNA kløves med restriktionsenzymer til fremstilling af "et 2,7 kb DNA fragment til dannelse af klon pKK 2,7. Det syntetiske aFGF gen 35 kløves fra dets pBR322 vektor og overføres til pKK 2,7 plasmidet efter restriktion af pKK 2,7 med EcoRI og Sall. Den resulterende rekombinant, der 16 DK 175856 B1 er vist i fig. 1, transformeres over i E. coli JM105 (Pharmacia) eller DH5 (BRL) celler og udtrykkes.

Stedspecifik mutagenese er en effektiv måde til at overføre aminosyrese-5 kvensen fra en pattedyrart af aFGF til aFGF aminosyresekvens fra en anden art. Den følgende beskrivelse angår den stedspecifikke mutagene overføring af bovint aFGF, 140 aminosyreform til humant aFGF, idet det må forstås, at processen kan anvendes til at overføre en vilkårlig pattedyrart aFGF til aFGF fra en anden art. Den eneste begrænsning på overføringen er, at aminosyre 10 sekvensen for begge aFGFer må være kendt. Den efterfølgende tabel angiver de aminosyrer, som må udskiftes, og lokaliseringen på det bovine aFGF aminosyrekort, tabel III, hvor substitutionerne foretages: TABEL V__· _

Aminosyre Substituerede aminosyrer for_ lokalisering_ humant aFGF_ bovint aFGF_ 5_Pro_Leu_ 21_Jjis_Tyr__ 35_Arg_Lys _ 47_Ser_Cys_ 51_Val_Jle__ 64_Tyr_Phe _ 106_Asn ._His_ 116 _Ser_Arg__ 117 _Cys_Ser_ 119_Arg_Leu_ 125_Tyr_Phe_ 15 20 17 DK 175856 B1

TABEL VI

OUGO-1 5' CTGCCACCGGGTAATTAC 3‘ 5 OLIGO-2 5’CGGTGGTCACTTTCTCCG 3’ OUGO-3 5’ CGGCACCAGAGATCGTTC 3' OUGO-4 5' GCAGCTGTCCGCCGAATCTGTCGGTGAAG 3’ OLIGO-5 5' CT66TCAATACCTTGCCATGG 3’ OLIGO-6 10 5’ GCTGAGAAAAATTGGTTC6 3' OLIGO-7 5’ GGCCGCGTTTACAGCTGCCA11 111CTTAAGG 3' OLIGO-8 5’ CGTACTCACTATGGCCAAAAAGCTATCC 3' 15

Som med den bovine gensekvens konstrueres 8 oligonukleotider repræsenterende den humane gensekvens ved samme procedure som den, der blev anvendt for de bovine oligonukleotider. Tabel VI indeholder en af flere oligo-nukleotidarrangementer, der anvendes , til at producere det humane aFGF 20 gen.

Det klonede syntetiske bovine gen for aFGF overføres til et humant syntetisk gen for aFGF ved en række dirigerede punktmutationer. Oligonukleotid-dirigeret mutagenese af det klonede gen tillader ændringer af basesekven-25 sen for bovin aFGF, så den resulterende aminosyresekvens indeholder de substituerede aminosyrer, der er vist i tabel V, og er human aFGF. Til fremstilling af den humane 139 aminosyre mikroheterogene form for aFGF fjernes den aminoterminale phenylalanin ved en sletning foretaget i det bovine gen. En punktmutation udføres for at erstatte asparagin i den anden stilling 30 med aspartinsyre. Alternativt deamideres asparaginen til aspartinsyre. Metoderne til udførelse af disse procedurer er beskrevet i det følgende og kendt i teknikken. Den oligonukleotid-dirigerede mutagenese udføres under anvendelse af standardprocedurer kendt i teknikken, Zoller og Smith, Methods in Enzymology, 100:468-500 (1983); Norris et al., Nukleic Acids Research, 35 11:5103-5112 (1983) og Zoller og Smith, DNA, 3:479-488 (1984). Punktmu tationerne udført ved standardiseret oligonukleotid-dirigeret mutagenese er 18 DK 175856 B1 vist i den efterfølgende tabel Vil. Lokaliseringen af basemutagenesen kan ses i tabel III. Punktmutationerne er kun vist som et eksempel på ændringer, som vil resultere i det humane aFGF gen, og skal ikke betragtes som begrænsende.

5

TABEL VII

Base Substitueret base for_Tilsvarende lokalisering_humant aFGF bovint aFGF_human aminosyre 22_C_T_Pro 69_C_T _His 112_G_ A _Arg 148_C___G_Ser 159_G_A_Val_ 199_A_T_ Tyr_ 324_A C_ Asn_ 354_A_C_Ser_ 358 G C Cys 364 _G_T_Arg__ 365 _C_G_Arg_ 382 |a [t Tyr

Ekspressionskloneme dyrkes ved ca. 37 °C i et passende vækstmedium, som består af ca. 1% trypton, ca. 0,5% gær ekstrakt, ca. 0,5% NaCI, ca. lo 0,4% glukose og ca. 50 pg/ml ampicillin. Når den optiske densitet ved 550 nm når ca. 0,5, kan isopropyl-p-D-thioglactopyranosid (IPTG) tilsættes til en slutkoncentration på ca. 1 mM, og væksten fortsættes ved ca. 37 °C i ca. 3 timer. Cellerne fra 1 liter dyrkningsmedium høstes ved centrifugering og genopløst i en afbrydelsespuffer indeholdende ca. 10 mM natriumphosphat 15 ved ca. pH 7,2, ca. 5 mM EDTA, ca. 10,6 pg/ml N-p-toluensulfonyl-L-phenylalanin-chlormethylketon (TPCK), ca. 34,3 pg/mlk pepstatin A, ca. 87 pg/ml phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), ca. 15 pg/ml bovin pancreatisk trypsininhibitor (BPTI) og ca. 25,2 pg/ml leupeptin. Celler brydes enten fra eller fryses og opbevares ved -70 °C og brydes straks efter optøning ved ca.

19 DK 175856 B1 tre passager gennem en Fransk trykcelle ved ca. 12.000 psi ved ca. 4 °C.

Den overliggende væske samles ved centrifugering.

Den rekombinanten aFGF renses til homogenisitet ved en unik totrinskroma-5 tografisk procedure, der gør brug af kombination af heparin/Sepharose^· affinitetskromatografi efterfulgt af omvendt faset HPLC. Den rå r-aFGF anbringes på en heparin/Sepharose-søjle i en fortyndet puffer, såsom ca. 10 mM phosphat eller Tris, ca. pH 6-8, som derefter vaskes med en opløsning med lav saltkoncentration, såsom ca. 0,8 M NaCI, indtil absorbansen ved 10 280 nm falder til ca. baggrundsabsorbansen. r-aFGF elueres derpå med en buffer opløsning med høj saltkoncentration, såsom ca. 10 mM na-triumphosphat eller Tris, ca. pH 6-8, indeholdende ca. 1,5 M NaCI. Eluatet renses derpå ved omvendt faset HPLC på en harpiks bestående af kovalent bundne alkylsilankæder med alkylgrupper med 3-18 carbonatomer, fortrins-15 vist 4 carbonatomer. r-aFGF påføres direkte HPLC-søjlen bragt i ligevægt i en fortyndet syre, såsom ca. 10 mM trifluoreddikesyre, eddikesyre eller phosphorsyre og elueret med en lineær gradient organisk opløsningsmiddel, såsom acetonitril eller ethanol. Bovint hjerne-afledt aFGF blev tidligere beskrevet som bindende til såvel heparin/Sepharose-søjter som til omvendtfa-20 sede HPLC-søjler, jævnfør Maciag et al., Science 225:932-935 (1984) og Thomas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:357-361 (1984) som del af flertrins rensninger. Til dels baseret på den relative høje mængde r-aFGF i bak-terielysater vises disse to trin alene at være tilstrækkelige til at opnå homogent rent r-aFGF med ca. 16.000 daltons som bestemt ved elektrophorese i 25 polyacrylamidgeler. Disse to trin alene giver ikke rent aFGF fra hjernen.

Mitogenaktivitet af den rensede aFGF bestemmes ved inkorporering af 3H-thymidin i DNA med celleliniefibroblaster, fortrinsvist BALB/c 3T3 A31 (American Type Culture Collection). Den rekombinante aFGF viser et spidsre-30 spons ved ca. 1 ng protein eller mindre pr. ml i den fibroblaststimulerende prøve.

En anden udførelsesform for opfindelsen er en metode til at fremme helingen af sår ved påføring af det hidtil ukendte peptid, enten med eller uden 35 heparin, fortrinsvist med heparin, ca. 1 til ca. 500 pg/cm2 til sårområdet enten 20 DK 175856 B1 topisk eller subkutant i såret i en mængde på ca. 0,1 til 100 pg/cm2 af overflade til topisk anvendelse.

Til påføring er forskellige farmaceutiske formuleringer nyttige, såsom salver, 5 pastaer, opløsninger, geler, faste vandopløselige polymere, såsom albuminer, gelatiner, hydroxypropylcellulose, pluronics, tetronics eller alginater, hvori den aktive bestanddel inkorporeres i mængder på ca. 1 til ca. 100 pg/ml.

10 aFGFs evne til at stimulere heling i forskellige celletyper, herunder fi-broblaster, vaskulære og corneale endotheliale celler og lignende gør disse peptider nyttige som farmaceutiske midler. Disse forbindelser kan anvendes til at behandle sår hos pattedyr, herunder mennesker, ved administrering af hidtil ukendt r-aFGF til patienter med behov for sådan behandling.

15

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler. EKSEMPEL 1 20 Oligonukleotidsyntese

Oligonukleotider blev syntetiseret efter den teknik, der er beskrevet af Mat-teucci og Cauthers i J.A. Chem. Soc. 103:3185-3191 (1981) og af Beaucage og Caruthers i Tetrahedron Letters 22:1859-1862 (1981). Basesekvenseme for de syntetiserede oligonukleotider er vist i tabel IV.

25 EKSEMPEL 2 Samling af aFGF genet

Oligonukleotideme fra eksempel 1 blev samlet som to separate enheder, 30 den N-terminale halvdel (231 bp) og den C-terminale halvdel (209 bp). De halvdele blev derpå kombineret for at gøre det syntetiske gen intakt, se tabel III. Til at begynde med blev oligonukleotideme kinaseret i følgende reaktionsblanding: 70 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 10 mM MgCfe, 33 pM ATP, 0,3 enheder T4 polynukleotid pr. pliter. Blandingen blev inkuberet i 1,5 timer ved 35 37 0C og derpå endnu 1 time efter supplering af blandingen med 0,2 enhe- der/pliter kinase og ATP til opnåelse af en koncentration på 100 mM. Til ra- 21 DK 175856 B1 dioaktiv mærkning indeholdt den oprindelige blanding 37 nCi/pliter [y-32P]-ATP.

Spændingsudligningen og ligeringerne blev foretaget i to separate reaktio-5 ner. I hver reaktion blev 100 pmol af hver af de 8 oligonukleotider tilsat. I en reaktion blev de oligonukleotider, som udgør en streng af den C-terminale eller N-terminale halvdel af genet, kinaseret med undtagelse af 5'-oligonukleotidet. I den anden reaktion blev de oligonukleotider, som udgør den modsatte streng, kinaseret, igen med undtagelse af 5'-oligonukleotidet. I 10 hver reaktion blev der således kinaseret 3 oligonukleotider, og 5 oligonukleo-tid blev ikke kinaseret. Når kinaserede oligonukleotider blev anvendt, blev 1 pmol af det 32P-mærkede oligonukleotid også tilsat til senere identificering af . produkterne. Hver reaktion indeholdt 200 pliter 70 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 10 mM MgCtø og 30 pM ATP. Oligonukleotideme blev udlignet ved op-15 varmning til 90 °C i 4 minutter, hvorpå reaktionen straks blev overført til 60 0C og fik lov at afkøle langsomt til 30 °C. Ligering blev foretaget i 400 pliter indeholdende 60 mM Tris pH 7,6, 10 mM DTT, 10 mM MgCfe, 1 mM ATP og 0,03 enheder T4 DNA ligase pr. pliter ved inkubering ved 20 °C i 1,5 timer.

20 Polyacrylamidgelelektrophorese blev anvendt til at rense de ligerede oligonukleotider. De ligerede oligonukleotider blev udfældet med ethanol, genopløst i 20 pliter 80% formamid, 50 mM Tris-borat pH 8,3, 1 mM EDTA, 0,1% efter vægt/vol. xylencyanol og 0,1% efter vægt/vol. bromphenolblåt. Hver prøve blev opvarmet ved 90 °C i 3 minutter og elektrophoreseret i 10%'s 25 urinstof-polyacrylamidgel ved 75 W i 5 timer. Oligonukleotidbåndene blev gjort synlige ved at udsætte gelen for røntgenfilm.

231 basebåndene for hver reaktion for den N-terminale ende blev skåret ud af gelen, kombineret og elueret ved 4 °C i 1 ml 0,5 M ammoniumacetat, 1 30 mM EDTA pH 8. Den eluerede DNA blev udfældet méd ethanol og genopløst i 30 pliter 70 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT og 10 mM MgCl2. De 209 basebånd for den C-terminale ende blev elueret på samme måde.

De gelrensede oligonukleotider blev spændingsudlignet før transformation 35 ved opvarmning til 90 °C i 4 minutter og langsomt afkølet til 20 °C. Under antagelse af et udbytte på 5% fra de oprindelige oligonukleotider blev 300 DK 175856 B1 22 fmol og 100 fmol udvundne, spændingsudlignede 231 bp oligonukleotider hver ligeret til 100 fmol agarosegelrenset 3,9 kb EcoRI-BamHI pBR322 fragment DNA i 20 pliter 25 mM Tris pH 7,8, 1 mM DTT, 10 mM MgCI2, 0,4 mM ATP med 1 enhed T4 DNA ligase i 1 time ved 20 °C. De udlignede 209 5 bp oligonukleotider blev ligeret til agaroserenset 3,9 kb BamHI-Sall pBR322 fragment DNA under samme betingelser som 231 baseparfragmenteme. Ligeringsreaktionerne blev fortyndet 1:5 i H20, og 1 pliter fortynding blev anvendt til at transformere 20 pliter kompetente E. coli RR1 celler (BRL) som beskrevet af leverandøren. Transformanteme blev udvalgt for vækst i ampi-10 cillin og screenet for tilstedeværelsen af den 231 bp EcoRI-BamHI eller den 209 BamHI-Sall indsat ved restriktionsanalyse af minilysatplasmidpræpara-ter.

DNA-sekvensen af kloner indeholdende indsatse med passende størrelse 15 blev bestemt under anvendelse af den kemiske DNA sekvensteknik af Ma-xam og Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564 (1977). Da ingen af de 231 bp kloner havde den korrekte sekvens, blev der fremstillet en klon indeholdende den korrekte sekvens som følger. En klon med den korrekte sekvens mellem Kpnl og med BamHI stederne blev kløvet med Kpnl og med 20 Sall, som kløver i pBR322 vektoren. 400 bp båndet blev gelrenset og ligeret til 3,8 kb Kpnl-Sall båndet fra en anden klon indeholdende den korrekte sekvens fra EcoRI stedet til Kpnl stedet af aFGF genindsatsen. Efter transformation blev en resulterende klon sekvenseret for at sikre, at den ønskede sekvens var blevet opnået.

25

Da en klon indeholdende den korrekte 209 bp sekvens var opnået, var ingen yderligere manipulation af disse kloner påkrævet. Det endelige fuldlængdede aFGF syntetiske gen blev klonet ved kløvning af den N-terminale halvklon 30 med BamHI og Sall, behandling med alkalisk phosphatase og ligering til den gelrensede 209 bp BamHI-Sall indsats af den C-terminale halvklon. Dette li-gerede materiale blev anvendt til at transformere kompetente RR1 celler som før.

35 23 DK 175856 B1 EKSEMPEL 3

Ekspression af det syntetiske bovine aFGF gen

Det intakte aFGF gen fra eksempel 2 blev inkorporeret i et modificeret 5 pKK223-3 plasmid. pKK223-3 plasmidet (Pharmacia) indeholder tac- promotoren, som er en hybrid mellem regioner i trp-prpmotoreh og lac-promotoren, deBoer et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983). Dette plasmid indeholder også rmB rRNA transskriptionsterminatoreri, en stærk terminatorsekvens, der har vist sig at tillade ekspression fra stærke promoto-10 rer, Gentz et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4936-4940 (1981), Brosius,

Gene 27:161-172 (1984). pKK223-3 plasmidet blev modificeret til fjernelse af det pBR322-afledte Sall restriktioonsenzymsted. Dette skete ved kløvning af pKK223-3 plasmid DNA med Ndel og Narl og recirkulering af det 2,7 kb DNA fragment til dannelse af klon pKK2,7. Det syntetiske aFGF gen blev derpå 15 kløvet fra sin pBR322 vektor og overført til pKK2,7 efter restriktion af denne ekspressionsvektor med EcoRI og Sall. Denne konstruktion anbringer det.initierende methionin for det syntetiske gen 11 baser efter Shine-Dalgamo ri-bosombidningsstedet. Den resulterende rekombinant, der er vist på fig. 1, blev transformeret i E. coli JM105 celler og også i E. coli DH5 celler.

20

Ekspressionskloneme blev dyrket ved 37 0C i LB bouillon (1% trypton, 0,5% gærekstrakt, 0,5% NaCI) indeholdende 0,4% glukose og 10 pg/ml ampicillin.

Når den optiske densitet ved 550 nm nåede 0,5, blev der tilsat IPTG for at give 1 mM, og dyrkningen blev fortsat ved 37 °C i 3 timer. Cellerne blev hø-25 stet ved centrifugering ved 10.000 x g i 20 minutter, og cellerne fra.1 liter kultur blev genopløst i 20 ml 10 mM natriumphosphat pH 7,2 (heparin/-saccharose-puffer) 5 mM EDTA, 10 N 6 pg/ml TPCK, 34,3 pg/ml pepstatin A, 87 pg/ml PMSF, 15 pg/ml BPTI og 34,3 pg/ml leupeptin. De genopløste celler blev hurtigt frosset i et tøris/ethanol-bad og opbevaret natten over ved -70 30 °C.

EKSEMPEL 4

Ekstraktion og rensning af rekombinant aFGF 35 De frosne celler fra eksempel 3 blev optøet, yderligere 87 pg/ml PMSF blev tilsat, og præparatet blev passeret gennem en Fransk trykcelle ved 12.000 24 DK 175856 B1 psi tre gange ved 4 °C. Det resulterende lysat blev centrifugeret ved 93.000 x g i 30 minutter til fjernelse af celledebris. Den overliggende væske blev fjernet, indstillet til pH 7,2 med 1 M NaOH og anbragt på en 1,6 x 10 cm he-parin/Sepharose-søjle (Pharmacia) drevet ved 4 °C med en strømningsha-5 stighed på 20 ml pr. time under opsamling af 2 ml fraktioner. Pellet blev genopløst i 5 ml 10 mM natriumphosphat, 2 M NaCI, pH 7,2, gencentrifugeret ved 93.000 x g i 30 minutter, og den overliggende væske blev fortyndet med 3 volumen 10 mM natriumphosphat, pH 7,2, genindstillet til pH 7,2 med 1 M NaOH, om nødvendig, og anbragt på samme heparin/sepharose-søjle. Efter 10 påføring blev søjlen vasket med 10 mM natriumphosphat, 0,8 M NaCI, pH 7,2, indtil absorbansen ved 280 nm faldt til baggrundsabsorbansen. Bundet r-aFGF blev elueret som en enkelt spids med 10 mM natriumphosphat, 1,5 M NaCI, pH 7,2. De samlede fraktioner fra heparin/sepharose-søjlen blev renset ved omvendtfaset HPLC under anvendelse af en 4,6 mm x 25 cm C4-15 søjle (Separations Group) som beskrevet af Thomas et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 81:357-361 (1984). r-aFGF elueredes som en enkelt hovedspids, der blev opløst fra flere mindre forurenende spidser, hvilket antydede, at proteinet var homogent rent. Polyacrylamidgelelektrophorese blev anvendt til at bekræfte renhed. Den rensede r-aFGF blev elektrophoreseret ved at følge 20 teknikken af O'Farrell, J. Biol. Chem. 250:4007-4021 (1975). Sølvfarvning afslørede et enkelt bånd med en molekylmasse på 16.000 daltons. Identitet af proteinet som aFGF blev bekræftet ved såvel aminosyreanalyse som amino-terminal sekvensbestemmelse.

25 EKSEMPEL 5

Biologisk aktivitet af bovin rekombinant aFGF

Biologisk aktivitet af den rensede r-aFGF fra eksempel 4 blev bedømt under anvendelse af en fibroblastmitogen prøve som beskrevet af Thomas et al., J.

30 Biol. Chem. 225:5517-5520 (1980). BALB/c 3T3 A31 fibroblaster (American Type Culture Collection) blev udstrøget med 2 x 104 celler pr. brønd med 35 mm i diameter i et dyrkningsmedium indeholdende 10% varmeinaktiviteret kalveserum og inkuberet i 7% CO2 (pH 7,35 ± 0,05). Cellerne blev fuldt lan-tente ved at erstatte mediet med 0,5% varmeinaktiveret kalveserum 6 og 35 igen 24 timer senere. 55 timer efter udstrygning blev der tilsat 50 pg heparin, testprøver og 1,1 pg dexamethason, ved 70 timer blev hver brønd suppleret 25 DK 175856 B1 med 2 pCi [methyl-3-H]-thymidin (20 Ci/mmol, New England Nuklear) og 3 pg umærket thymidin (Sigma), og ved 95 timer blev cellerne behandlet til bestemmelse af radiomærke inkorporeret i DNA. Hver dosisresponspunkt var gennemsnittet af tre bestemmelser. Resultaterne fremgår af den efterfølgen-5 de tabel:

TABEL VIII

Mitogent respons af BALB/c 3T3 Fibroblaster mod bovin r-aFGF

Koncentration CPM___' r-aFGF (ng/ml)_r-aFGF_Hjerne aFGF_ 0,003 _ 268_ 231 0,01_ 498 329_ 0,031 1550_ 1017_ 0,1_ 7031_ 3684_ 0,316_9319 _ 11353_ 1.000 |4718 [9050

Aktiviteten af den rekombinante aFGF var lig med eller lidt større end aktiviteten af hjerneafledt aFGF. Den rensede r-aFGF havde en halv-maksimal 10 stimulering af DNA syntese ved ca. 71 pg/ml, mens renset hjemeafledt aFGF havde en halvmaksimal værdi ved 126 pg/ml.

EKSEMPEL 6 15 Mutagenese af bovint aFGF gen til det humane aFGF gen

For at lette mutagenesen af det bovine aFGF gen blev det syntetiske gen fra eksempel 2 overført til M13mp19, en enkeltstrenget DNA bakteriofag vektor. Standardmutageneseprocedurer blev anvendt som rapporteret af Zoller og Smith, Methods in Enzymology, 100:468-500 (1983); Norris et al., Nucleic 20 AcidsResearch, 11:5103-5112 og Zoller og Smith, DNA, 3:479-488. Det bovine pKK-aFGF plasmid blev kløvet med EcoRI og Sall, se tabel III, og det resulterende 440 bp fragment blev agarosegelrenset som i eksempel 2. Vektor M13mp19 RF DNA (BRL) blev kløvet med de samme to endonukleaser, og enderne blev derefter dephosphoryleret i 100 pliter 10 mM Tris pH 8,0 26 DK 175856 B1 puffer med 100 enheder bakteriel alkalisk phosphatase. En ligering blev foretaget under anvendelse af 50 ng af den behandlede vektor DNA og 12 ng af aFGF genfragment DNA i 10 pliter 25 mM Tris pH 7,8, 10 mM MgCI2, 1 mM DTT, 0,4 mM ATP, med 2 enheder T4 DNA ligase i 16 timer ved 4 °C. Reak-5 tionsblandingen blev fortyndet 1:5 i H20, og 1 pliter opløsning blev anvendt til at transformere 20 pliter kompetente E. coli DH5 celler (BRL) som beskrevet af leverandøren. Cellerne blev udstøjet med E. coli JM105 (Pharmacia) værtsceller i 0,03% X-gal og 0,3 mM IPTG; efter inkubering ved 37 °C blev der opnået farveløst plaques. En fagklon indeholdende det bovine aFGF blev 10 udvalgt, M13mp19-aFGF.

! 8 oligonukleotider blev designet for at specificere den humane sekvens og syntetiseret, se tabel VI.

15 Oligomer 8 indeholder en yderligere mutation, i hvilken thymin ved sted 386 i det bovine gen er erstattet med cytosin i det humane gen. Denne mutation tillader inkorporering af et restriktionssted uden ændring af den humane aFGF aminosyresekvens.

20 De humane oligomere 1,2, 3, 4, 6 og 8 blev phosphoryleret, 15 pmol af hver blev sammensmeltet individuelt med 0,5 pmol M13mp19-aFGF enkeltstren-get fag DNA i 10 pliter 20 mM Tris pH 7,5,10 mM MgCI2, 50 mM NaCI, 1 mM DTT i 10 minutter ved 65 0 C efterfulgt af 10 minutter ved 23 °C. Lukketcirkulære dobbeltstrengede molekyler blev derpå fremstillet i 20 pliter 20 mM 25 Tris pH 7,5, 10 mM MgCI2, 25 mM NaCI, 5,5 mM DTT, 0,5 mM ATP, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dGTP, 0,25 mM dTTP under anvendelse af 1 enhed T4 DNA ligase og 2 enheder DNA polymerase I Klenow fragment ved inkubering ved 15 °C i 17 timer. Præparaterne blev hver især anvendt til at transformer kompetente JM105 celler, og de resulte-30 rende transformante plaques blev udvalgt ved hybridisering med den passende oligomere, som var blevet radiomærket under anvendelse 32P-ATP og polynukleotidkinase. Betingelserne for hybridisering blev optimeret for hver probe for at forhindre dannelse af hybrider indeholdende enkeltbaseændrin-ger. Enkeltstrenget DNA blev isoleret fra fagklonen indeholdende human oli-3 5 gomer 4 mutationer, og ovennævnte procedure blev gentaget under anven- DK 175856 B1 27 delse af human oligomer 5 for at danne en klon indeholdende såvel oligomer , 4 som 5 mutationer.

i I de følgende procedurer blev de bovin-til-human sekvensmutationer i M13-5 baserede kloner kombineret i en pBR322-baseret klon. RF DNA blev fremstillet ud fra kloner indeholdende baseændringer specificeret af humane oli- ' gomere 1, 2, 6 og 8. DNA fra den humane 1 mutantklon blev kløvet med EcoRI, enderne blev dephosphoryleret med bakteriel alkalisk phosphatase, og DNA blev kløvet med Hindlll. Den humane 2 mutant DNA blev kløvet med · ίο Hindlll, behandlet med phosphatase og derpå kløvet med BamHI. Den humane 6 mutant DNA blev kløvet med BamHI, behandlet med phosphatase og derefter kløvet med Apal. Ligeledes blev den humane 8 mutant DNA kløvet med Apal, enderne blev phosphoryleret, og DNA blev kløvet med Sall.

Disse fire DNA præparater blev elektrophoreseret gennem 2% agarose, og 15 fragmenterne af 45bp, 190 bp, 135 bp og 70 bp fra mutant DNA indehoiden-| de humane 1, 2, 6 og 8 mutationer blev elueret fra gelen. Ca. 60 fmol af hver fragment blev kollektivt ligeret til ca. 60 fmol af et gelrenset 3,7 kb EcoRI-Sall fragment fra pBR322 i 5 pliter 25 mM Tris pH 7,8, 10 mM MgCfe, 1 mM DTT, 0,4 mM ATP med 1,5 enheder T4 DNA ligase i 16 timer ved 12 0C.

2 o Reaktionsblandingen blev fortyndet 1:5 i H20, og 1 pliter fortynding blev anvendt til at transformere 20 pliter kompetente E. coli DH5 celler (BRL) som beskrevet af leverandøren. En klon indeholdende mutationerne specificeret af alle fire mutantoligomere blev valgt ved hybridisering med radiomærkede prober fremstillet ud fra hver af de oligomere. Det 140 bp Kpnl-BamHI DNA 25 fragment isoleret fra kløvet RF DNA af de humane 3 mutant M13 klon blev ligeret til endonukleasekløvningsprodukter fra den humane 1-2-6-8 mutant DNA og transformeret i DH5 kompetente celler for at danne en klon med de humane 1-2-3-6-8 mutationer. BamHI-Pstl nedbrydningsfragmenter af sidstnævnte klon blev ligeret til BamHI-Pstl nedbrydningsfragmenter af RF DNA 30 fra den humane 4-5 M13-baserede klon, og blandingen fra ligeringen blev anvendt til at transformere DH5 kompetente celler. En klon indeholdende de ' humane 1-2-3-4-5-6-8 mutationer blev udvalgt ved oligomer hybridisering, og aFGF gen EcoRI-Sall DNA fragmentet af dette rekombinante plasmid blev ligeret til phosphatase-behandlet EcoRI-Sall-kløvet RF DNA af M13mp18 35 (BRL). Kompetente DH5 celler blev transformeret med ligeret DNA, og de transformerede celler blev udbredt på JM105 værtsceller for at danne en 28 DK 175856 B1 M13 klon. Den enkeltstrengede fag DNA af denne klon blev sammensmeltet med den humane 7 oligomere, og en M13 klon indeholdende alle de ønskede mutationer blev opnået ved at gå frem efter proceduren som beskrevet i det foregående. RF DNA blev fremstillet ud fra denne klon og kløvet med 5 EcoRI og Sall. Det resulterende 440 bp bånd blev gelrenset og ligeret til det 2,7 kb EcoRI-Sall DNA fragment af pKK2,7 tac-promotor-ekspressionsvektor. Denne DNA blev anvendt til at transformere kompetente DH5 celler, hvorved man dannede den humane pKK-aFGF ekspressionsklon anvendt til produktion af den humane form for aFGF. io

Den humane r-aFGF blev renset ved samme procedure som anvendt for den bovine r-aFGF, se eksempel 4. Den humane r-aFGF blev bedømt som værende mindst 99,75% ren baseret på tilstedeværelsen af et intenst bånd på en sølvfarvet SDS elektroforese gel påført 400 ng renset human r-aFGF og 15 med en intensitet på ca. 1 ng/bånd. Protokollen er beskrevet i eksempel 4.

Den rene rekombinante humane aFGF blev prøvet for mitogen aktivitet under anvendelse af 3H-thymidin inkorporering i sammenflydende BALB/c 3T3 celler som beskrevet for det bovine rekombinante protein i eksempel 5. Som 20 tidligere observeret med human hjerne-afledt aFGF afprøvet på vaskulære endotheiialceller udviser det rekombinante humane protein en større forskel i heparin (50 pg/ml) aktivering end tilfældet er for såvel hjerne-afledt som re-kombinant bovint aFGF, Gimenez-Gallego et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 135:541-548 (1986); Resultaterne er rekombinant human aFGF på 2 5 BALB/c 3T3 celler fremgår følgende tabel: 29 DK 175856 B1

TABEL IX

Mitogen respons for BALB/c 3T3 fibroblaster mod human r-aFGF Koncentration

r-aFGF CPM

(picogram/ml)‘_- heparin_+ heparin_' 0 3574 991 1 4156 1336 3,16 4216 1802 10,0 4092 2617 31,6 4155 4824 100 4274 10489 316 6060 14584 1000(1 ng) 6811 10547 3160 7910 12357 10000 8597 9143 31600 9700 9057 100000 11166 9277 1000000 15864 12425 * picogram - 10'12 gram I nærværelse af heparin forekommer den halv-maksimale stimulering ved ca.

5 42 pg/ml. I fravær af heparin var spidsen ikke klart nået selv ved den højeste koncentration men må være større end ca. 50 ng/ml.

Claims (5)

1. En nukleotid sekvens, som koder for rekombinant human sur fi-broblastvækstfaktor og som har følgende aminosyre sekvens: 5 l 10 20 25 • PheAsnLeuProProGlyAsnTyrLysLysProLysLeuLeuTyrCysSerAsnGlyGlyHisPhelieuArglle 30 40 50 LeuProAspGlyThrValAspGlyThrArgAspArgSerAspGlnHisIleGlnLeuGlnLeuSerAlaGluSer 51 60 - 70 75 ValGlyGluValTyrIleLysSerThrGluThrGlyGlnTyri.euAlaMetAspThrAspGlyLeuLeuTyrGly 80 90 100 SerGlnThrProAsnGluGluCysLeuPheLeuGluArgLeuGluGluAsnHisTyrAsnThrTyrlleSerLys 101 110 120 125

10 LysHisAlaGluLysAsnTrpPheValGlyLeuLysLysAsnGlySerCysLysArgGlyProArgThrHisTyr 130 140 GlyGlnLysAlalleLeuPheLeuProLeuProValSerSerAsp hvor der i phenylalaninen i den første position er tilknyttet en methionin, og hvor basesekvensen er: 15 I 2β 4Q 60 80 AATTCATGTTCAAlCTGCCACCGGGTAAriACAAeAAGCCAAAGCTrCITT'ACTGCTCTAACGCTGGTCACTnCTCCGC GT ACAAGTI AGACGGT GGCCCAn AAIGTTITI CGCTTTCGAAGaAATGaCGAGATTGCCACCAGTGAAAGAGGCG too U0 140 . 160 ATCCTGCCAGAIGGTACCGTGGACGGCACCAGAGATCGTTCTGATCAACATATTCAACTGCÅGCIGTCCGCCGAATCTGT· j TAGGACGGTCIACCATGGCACCIGCCGTGGTCTCTAGCAAGACTAGTTGTATAAGTTGACGTCGACAGGCGGCTTAGACA j 180 . 200 *220 240 CGGTGAAGmACATCAAATCTACCGAAACTGGTCAAlACCTTGCCATGGACACTGATGGCCTGCTGTACGGATCCCAGA GCCACTTCAAAIGTAGTTTaGATGGCT.TTGACCAGTI AIGGAACGGTACCTGTGACIACCGGaCGaCatgCCTaGGGTCT 260 . 280 300 320 CCCCAAACGAGGAGTGCCTTTTCCTGGAGCGCCTGGÅGGAAAACCA7TACAACACCTACATCICTAÅ4AAGCATGCiGAG GGGGTITGCTCCTCACGGAAAAGGACCT CGCGGACC1CCTTT1GGT aaIGT TGTGGATGl AGAGATTTTTCGT ACGACTC 340 360 380 400 aaaaatiggttcgtaggccttmgaaaaatggcagctgtaaacgcggcccicgtactcactatggccaaaaagciatcct tttti*accaagcatccggaattctttttaccgtcgacatttgcgccgggagcatgagtgataccggiitttcgatagga 420 440 GTICCIGCCACTGCCAGTGAGCICIGACTAArAGATATCG CAAGGaCGGTGACGGTCACICGAGaCIGATTATCIATAGCaGCT . DK 175856 B1 i _

2. Et ekspressionsplasmid, hvori nukleotidsekvensen angivet i krav 1 er indsat.

3. En vært, som er kompatibel med og som indeholder plasmidet angivet i 5 krav 2.

4. Plasmid ifølge krav 2, som er i stand til at udtrykke genet for human sur fi-broplastvækstfaktor.

5. Fremgangsmåde til oprensning af sur fibroblastvækstfaktor (aFGF) i ren form omfattende de følgende trin: a. delvis rensning af rekombinant aFGF ved en heparin-Sepharose affinitets kromatografi matrix og en acceptabel eluent; efterfulgt af 15 b. endelig oprensning delvist oprenset rekombinant aFGF ved omvendt fase hplc (high performance liquid chromatography) ved brug af alkyl silan substrat og en acceptabel eluent.