DK174961B1 - Fibroblast-vækstfaktor, nucleotidsekvens kodende derfor, præparat indeholdende faktoren og fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents

Description

DK 174961 B1

Den foreliggende opfindelse angår en rekombinant, biologisk aktiv form af sur fibroblast vækstfaktorprotein, med en længde på 154,140 eller 139 aminosyrer, nucleotidsekvens der koder for nævnte vækstfaktorprotein, anvendelse af nævnte vækstffaktorprotein til fremstilling af et lægemiddel, frem-5 gangsmåde til fremstilling af nævnte vækstfaktorprotein, farmaceutisk præparat, rekombinant bovin biologisk aktiv form af sur fibroblast vækstfaktorprotein med en længde på 154,140 eller 134 aminosyrer samt rekombinant human mutant biologisk aktiv sur fibroblast vækstfaktor protein.

10 Opdagelsen af forbindelser, der kontrollerer væksten af dyreceller, specielt menneskeceller, og den mekanisme, ved hvilken de arbejder, er for øjeblikket et af hovedemnerne inden for den biomedicinske research, der angår vævsheling og sårheling. Fibroblastvækstfaktorer (FGF’er), mitogener for forskellige celletyper herunder mange celler af mesodermal oprindelse, er 15 blevet identificeret, og man har foreslået, at de kan inducere mitose, hvilket vil resultere i opbygning af væv. Fibroblast mitogen aktivitet blev først observeret med ekstrakter af væv fra det centrale nervesystem. Fibroblast mitogener stammende fra hjernen blev først beskrevet af Trowell et al., J. Exp. Biol.

1j6: 60-70 (1939) og Hoffman, Growth 4: 361-376 (1940). Man påviste heref-20 ter, at profyseekstrakter også havde kraftig mitogen virkning på fibroblastoide celler, Amelin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2702-2706 (1973). Delvis rensning af både hjerne og hypofyse fibroblast vækstfaktor afslørede mitogen virkning på en række celletyper af differentierede celler, herunder vaskulære endotheliale celler, Gospodarowicz et al., Natl. Cancer Inst. Monogr. 48:109-25 130 (1978). Fibroblast vækstfaktor blev oprindeligt antaget for at være et en kelt peptid stammende fra den begrænsede proteolyse af myelin grundprotein. Det er for nylig blevet vist, at FGF eksisterer i to former, sur FGF (aFGF) og basisk FGF (bFGF), og begge former kan isoleres og renses fra pattedyrhjerner, Thomas og Gimenez-Gallego, TIBS 11; 81-84 (1986). Adskillige cel-30 letyper giver respons på stimulering med enten renset aFGF eller bFGF ved at syntetisere DNA og dele, herunder primære fibroblaster, vaskulære og 2 DK 174961 B1 coreneale endotheliale celler, chondrocyter, osteroblaster, myoblaster, glat-muskel, gliale celler og neuroblaster, Esch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6507-6511 (1985); Kuo et al., Fed. Proc. 44: 695 (1985); Gensburger et al., C.R. Acad. Sc. Paris 303: 465-468 (1986). Rent bovin hjerne-afledt aFGF 5 virker ikke alene som et kraftigt mitogen på vaskulære endotheliale celler i kultur, men enducerer også blodkarvækst in vivo, Thomas, et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 82: 6409-6413 (1985). Den mitogene virkning af renset aFGF kan også anvendes til at fremme såropheling, USA patentskrift nr. 4 444 760.

10 Sur fibroblast vækstfaktor blev oprindeligt renset til homogenitet fra bovin hjerne baseret på dens mitogene virkning på BALB/c 3T3 fibroblaster, Thomas, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 357-361 (1984). Denne vækstfaktor stammende fra hjernen er blevet renset igen og atter fået nyt navn i en hel række laboratorier både på dens: mitogene virkning på vaskulære endothe-15 liale og astrogliale celler (endothelial cellevækstfaktor og astroglial vækstfaktor 1), kilde (retinal-afledt vækstfaktor, øje-afledt vækstfaktor II og måske hjerne-afledt vækstfaktor) og binding til heparin-sepharose (klasse 1 heparin-bindende vækstfaktor eller heparinbindende vækstfaktor a), Thomas og Gi-menez-Gallego, TIBS H: 81-84 (1986). Aminosyresekvensen for bovint aF-20 GF er blevet bestemt, og er anerkendt for at være højt homolog med basisk FGF og beslægtet med fibroblast mitogenerne interleukin 1-α og 1-β, Gime-nez-Gallego et al., Science 230:1385-1388 (1985). Den fuldstændige ami-nosyresekvens af human aFGF er blevet bestemt ud fra det rensede protein, Gimenez-Gallego, et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 138: 611-617 (1986) 25 og fra genet Jaye et al., Science 233: 541-545 (1986).

WO 87/01728 beskriver DNA sekvenser, der koder for sur fibroblast vækstfaktor og diverse derivater af dette stof, samt fremstilling af stofferne. Der er ikke beskrevet muterede former med forøget egenskaber af sur fibroblast 30 aFGF.

DK 174961 B1 3

Nativt aFGF renset fra hjerne eller rekombinant-afledt aFGF (r-aFGF) kræver den samtidige administrering af heparin for optimalt at stimulere Balb/c 3T3 fibroblaster og vakulære endotheliale celler i kultur. Humant hjerne-afledt og rekombinant aFGF er kun ca. 1-5 % så aktiv på disse celler i kultur uden he-5 parin i forhold til optimal aktivitet i nærvær af heparin. Medens de nødvendige doser til opnåelse af maksimal aFGF aktivitet er forholdsvis lave, kan det være ønskeligt at administrere aFGF uden heparin, da heparin i betragtelig grad kan udløse uheldige bivirkninger. Rent humant aFGF er udover de standardbetingelser, der ødelægger de fleste proteiners aktivitet, ekstrem varme, pH 10 og tilstedeværelsen af proteaser, også labil over for lyofilisering og oxidering.

Det rene aFGF blive tværbundet ved hjælp af intrakæder eller interkædedi-sulfidbindinger ved oxidering og kan genvindes i aktiv form ved disulfid reduktion med 20 mM dithiothreitol. Heparin kan hæmme intermolekylær disulfid bindingsfrembragt aggregation af aFGF. Denne heterogene glycosami-15 noglycan har også vist sig at stabilisere aFGF mod varmedenaturering og proteolytisk nedbrydning af trypsin. Som en følge heraf er enten exogent eller endogent heparin nødvendig for in vivo aktiviteten i forbindelse med reparation af væv. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer enestående muterede former af rekombinant-afledt aFGF, der udviser en forøget biologisk aktivitet 20 uden tilstedeværelsen af heparin i forhold til nativt aFGF.

Opfindelsen har således til hensigt ved mutation at omdanne rekombinante bovine og humane aFGF gener til gener, der er i stand til at kode proteiner, der er mere aktive uden heparin end det native eller rekombinante protein. Et 25 andet formål er at indarbejde særlige gener i passende kloningsvektorer.

Herudover har opfindelsen til hensigt at transformere en passende vært med hver af de rekombinante vektorer og inducere udtrykkelse af de særlige muterede aFGF gener. Herudover har opfindelsen til hensigt at isolere og rense biologisk aktivt bovint og humant muteret aFGF. Opfindelsen forklares nær-30 mere nedenfor.

DK 174961 B1 4

Nucleotidsekvenseme ifølge opfindelsen, der koder for muteret bovint og humant aFGF, opbygges. De specielle gener stammer fra gener, der koder rekombinant nativt bovint og humant aFGF ved specifik pladsmutering. Hver genkonstruktion indføres i en udtrykkelsesvektor, der anvendes til at trans-5 formere en passende vært. De transformerede værtsceller frembringer specielt muteret rekombinant aFGF, humant eller bovint, der renses og som udviser forøget eller forbedret biologisk aktivitet uden heparin i forhold til de ik-ke-muterede former.

10 Sur fibroblast vækstfaktor eksisterer i forskellige mikroheterogene former, der isoleres fra forskellige vævskilder og celletyper, der vides at indeholde aFGF. Mikroheterogene former omtalt i foreliggende beskrivelse med krav betegner et enkelt genprodukt, der er et protein frembragt af en enkelt genenhed af DNA, der strukturelt er modificeret efter translation. Disse strukturelle modifi-15 kationer resulterer imidlertid ikke i nogen signifikante ændringer af peptidets biologiske aktivitet. Biologisk aktivitet og biologisk aktiv anvendes vilkårligt og betegner i foreliggende beskrivelse med krav evnen af nativt, rekombinant eller mutant rekombinant aFGF til at stimulere DNA syntese i hvilende Balb/c 3T3 fibroblaster således som beskrevet i eksempel 7 til at stimulere en hvil-20 ken som helst celletype beskrevet ovenfor eller til at udføre en hvilken som helst af de funktioner, der er beskrevet indenfor fagområdet. Modifikationerne kan foregå enten in vivo eller under isoleringen og rensningsprocessen. In vivo modifikation bevirker, men er ikke begrænset til, acetylering ved N-endestillingen, proteolyse, glycosylering eller phosphorylering. Proteolyse 25 kan omfatte exoproteolyse, hvor en eller flere endestillede aminosyrer efter hinanden spaltes enzymatisk til frembringelse af mikroheterogene former, der indeholder færre aminosyrer, end det oprindelige genprodukt. Proteolyse kan også omfatte endoproteolytisk modifikation, der er et resultat af indvirkningen af endoproteaser, der spalter peptidet på særlige steder inden i aminosyre-30 sekvensen. Lignende modifikationer kan forekomme under rensningsprocessen, der også resulterer i produktionen af mikroheterogene former. Den mest DK 174961 B1 5 almindelige modifikation, der sker under rensning, er proteolyse, der sædvanligvis holdes på et minimum under anvendelsen af proteaseinhibitorer.

Under de fleste betingelser forefindes en blanding af mikroheterogene former efter rensning af nativt aFGF. Nativt aFGF betyder aFGF isoleret og renset 5 fra væv eller celler, der indeholder aFGF.

Opfindelsen tilvejebringer en rekombinant bovin, biologisk aktiv, form af sur fibroblast vækstfaktorprotein med en længde på 154,140 eller 139 aminosyrer, fremstillet fra en enkelt DNA-genenhed, således at proteinet omfatter 10 ombytning af én eller flere af cysteinresterne ved stilling 16, 83 og 117 i det tilsvarende native protein, nummereret i overensstemmelse med den native bovine form af sur fibroblast vækstfaktor med en længde på 140 aminosyrer De mest foretrukne mikroheterogene former af bovint aFGF omfatter en 154 aminosyreform, en 140 aminosyreform og en 134 aminosyreform. 140 ami-15 nosyreformen er angivet i tabel I Gimenez-Gallego et al., Science 230:1385-1388 (1985) med en aminosyre, der ikke er i stand til at danne intramoleky-lære eller intermolekylære disulfidbindinger og efter valg med yderligere en methionin bundet til den første amino syre ved N-enden.

DK 174961 B1 6

TABEL I

Aminosyresekvens af bovint aFGF

1 10 20 PheAsnLeuProleuGlyAsnTyrLyslysProLysLeuLeuTyrCysSerAsnGlyGlyTyrPheLeuArglleLeu 30 40 $0

ProAspGlyThrValAspGlyThrLysAspArgSerAspGlnHisIleGlnleuGlnLeuCysAl aGluSerlleGl yGlu 60 70 80

ValTyrlleLysSerThrGluThrGlyGlnPheLeuAlaHetAspThrAspGlyLeuLeuTyrGlySerGl nThrProAsn 90 100 GIuGluCysLeuPheLeuGluArgLeuGluGluAsnHi sTyrAsnThrTyrlleSerLysLysHisAlaGlulysHi sTrp 110 120 130

PheValGIyLeuLysLysAsnGlyArgSerLysLeuGlyProArgThrHisPheGlyGInLysAla11eLeuPheLeuPro 140

LeuProValSerSerAsp

Nucleotidsekvensen af den 140 aminosyreform rekombinant, af bovint aFGF er angivet i tabel II.

5 DK 174961 B1 7

TABEL II

Nucleotidsekvens af bovint aFGF

1 20 40 60 80

AATTCATGTTCAATCTGCCACTGGGTAATTACAAAAAGCCAAAGCTTCTTTACTGCTCTAACGGTGGTTACTTTCTCCGC GTACAAGTTAGACGGTGACCCATTAATGTTTTTCGGTTTCGAAGAAAT6ACGAGATTGCCACCAATGAAAGAGGCG

100 120 140 160 ATCCTGCCAGATGGTACCGTGGACGGCACCAAAGATCGTTCTGATCAACATATTCAACTGCAGCTGTGCGCCGAATCTAT TAGGACGGTCTACCATGGCACCTGCCGTGGTTTCTAGCAAGACTAGTTGTATAAGTTGACGTCGACACGCGGCTTAGATA 180 200 220 240 '

CGGTGAAGTTTACATCAAATCTACCGAAACTGGTCAATTCCTTGCCATGGACACTGATGGCCTGCTGTACGGATCCCAGA GCCACTTCAAATGTAGTTTAGATGGCTTTGACCAGTTAAGGAACGGTACCTGTGACTACCGGACGACATGCCTAG6GTCT

260 280 300 320

CCCCAAACGAGGAGTGCCTTTTCCTGGAGCGCCTGGAGGAAAACCATTACAACACCTACATCTCTAAAAAGCATGCTGAG GGGGTTTGCTCCTCACGGAAAAGGACCTCGC6GACCTCCTTTTGGTAATGTTGTGGATGTAGAGATTTTTCGTACGACTC

340 360 380 400 aaacattggttcgtaggccttaagaaaaatggccgctctaaactgggccctcgtactcactttggtcaaaaagctatcct tttgtaaccaagcatccggaattctttttaccggcgagatttgacccgggagcatgagtgaaaccagtttttcgatagga 420 440 gttcctgccactgccagtgagctctgactaatagatatcg caaggacggtgacggtcactcgagactgattatctatagcagct 154 aminosyreformen omfatter følgende yderligere aminosyrer: Ala-Glu-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Phe-Thr-Ala-Leu-Thr-Glu-Lys, med carboxylendestillingen 5 Lys knyttet til aminosyreendestilling Phe ved den første stilling af den 140 aminosyreform. Den aminoendestillede alaninrest af den 154 aminosyreform af bovint aFGF kan acetyleres. Den 134 aminosyreform er identisk med 140 aminosyreformen bortset fra, at de første 6 aminosyrer af aminosyreendestil-lingen er blevet fjernet. Dersom nativt aFGF isoleres varierer de relative DK 174961 B1 8 mængder af disse mikroheterogene former afhængig af den anvendte metode, men indeholder sædvanligt mindst to af disse former.

Humant aFGF udviseren lignende mikroheterogenitet med bovint aFGF. De 5 mest foretrukne mikroheterogene former af humant aFGF omfatter en 154 aminosyreform, en 140 aminosyreform og en 139 aminosyreform. Den humane 140 aminosyreform er forskellig fra den bovine form med 11 aminosyrer, således som angivet i tabel VIII. 154 aminosyreformen indeholder den nøjagtige sekvens af den humane 140 aminosyreform plus 14 yderligere 10 aminosyrer i forbindelse med den bovine 154 aminosyreform, med en undtagelse. Aminosyren ved fem-stillingen af N-endestillingen eller ved -10 stillingen bestemt ud fra den 140 aminosyre Phe N-endestilling i den humane form er isoleucin og erstatter threoninen i den bovine form. Den yderligere 14 aminosyre humane N-endestillede sekvens er: Ala-Glu-Gly-Glu-lle-Thr-Thr-Phe-15 Thr-Ala-Leu=Thr-Glu-Lys. De yderligere aminosyrer af den 154 aminosyre form er nummereret fra det N-endestillede Ala, -14, til det carboxylendestille-de Lys, -1. Den aminoendestillede alaninrest ved -14 stillingen kan være ace-tyleret. En tredie form af humant aFGF indeholder 139 aminosyrer og er ækvivalent med den humane 140 aminosyreform, idet den aminoendestillede 20 phenylalaninrest er fjernet. Den aminoendestillede asparaginrest kan være deamideret til asparaginsyre i 139 aminosyreformen af humant aFGF. 140 og 139 aminosyreformeme er de mest foretrukne former for de humane mikroheterogene former.

25 Opfindelsen tilvejebringer yderligere en rekombinant human, biologisk aktiv form af sur fibroblast vækstfaktorprotein med en længde på 154, 140 eller 139 aminosyrer, fremstillet fra en enkelt DNA-genenhed, ejendommelig ved, at proteinet omfatter ombytning af en eller flere af cysteinresteme ved stilling 16, 83 og 117 i det tilsvarende native protein, nummereret i overensstemmel-30 se med den native humane form af sur fibroblast vækstfaktor med en længde på 140 aminosyrer, der har følgende aminosyresekvens angivet i tabel III, DK 174961 B1 9

Gimenez-Gallego et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 138: 611-617 (1986) med en aminosyre der ikke er i stand til at danne intramolekylære eller inter-molekylære disulfidbindinger.

TABEL III

Aminosyresekvens af humant aFGF

1 10 20 PheAsnLeuProProGlyAsnTyrLysLysProLysleuleuTyrCysSerAsnGlyGlyHi sPheLeuArglleLeu 30 40 50

ProAspGlyThrValAspGlyThrArgAspArgSerAspGl nHisIleGlnLeuGlnLeuSerAlaGluSerValGlyGlu 60 70 80

Val Tyril elysSerThrGluThrGlyGlnTyrleoAl aHetAspThrAspGIyLeuLeuTyrGlySerGlnThrProAsn 90 100

GluGluCysLeuPheLeuGl uArgLeuGluGluAsnHi sTyrAsnThrTyrlleSerLysLysHi sAlaGl ulysAsnTrp 110 120 130

PheValGlyLeuLysLysAsnGl ySerCysLysArgGlyProArgThrHisTyrGlyGlnLysAlalleLeuPheLeuPro 140

LeuProValSerSerAsp 5

Nucleotidsekvensen af 140 aminosyreformen, rekombinant, af human aFGF er angivet i tabel IV.

10

TABEL IV

DK 174961 B1 10

Nucleotidsekvens af humant aFGF

1 » 40 60 60

AATTCATGTTCAA1CTGCCACCGGGTAATTACAAAAAGCCAAAGCTTCT7TACTGCTCTAACGGTGG7CACTTTCTCCGC 6TACAA6TTAGACGGTGGCCCATTAATGTTTTTCGGTTTCGAAGAAATGACGAGATTGCCACCAGTGAAAGAGGCG

100 120 140 160 ATCCTGCCA6ATGGTACCGTGGACGGCACCAGAGA1CGTTCTGATCAACATATTCAACTGCAGCTGTCCGCCGAATCTGT taggacggtctaccatggcacctgccgtggtctctagcaagactagttgiataagttgacgtcgacaggcggcttagaca ISO 200 220 240

CGGTGAAGTTTACATCAAATCTACCGAAACTGGTCAATACCTTGCCATGGACACTGATGGCCTGCTGTACGGATCCCAGA GCCACTTCAAATGIAGTTTAGATGGCnTGACCAGTTATGGAACGGTACCTGTGACTACCGGACGACATGCCTAGGGTCT

260 280 300 320

CCCCAAACGAGGAGTGCCTTTTCCTGGAGCGCCTGGAGGAAAACCAnACAACACCUCATCTCTAAAAAGCATGCIGAG GGGGTTIGCTCCTCACGGAAAAGGACCTCGCGGACCTCCTTTTGGTAATGTTGTGGATGTAGAGATTTTTCGTACGACTC

340 360 300 400

AAAAA7TGGTTCG1AGGCCTTAAGAAAAATGGCAGCT6TAAACGCGGCCCTCGTACTCACT4TGGCCAAAAAGCTATCCT TTTTTAACCAAGCATCCGGAATTCTTiTTACCGTCGACATlTGCGCCGGGAGCATGAGTGATACCG6IT1TICGATAGGA

420 440

GTTCCTGCCACTGCCAGTGAGCTCTGACTAATAGATATC6 CAAGGACG62GACGGTCACTCGA&ACTGATTATCTATAGCAGCT

5

Den foretrukne metode til at opnå et gen for pattedyr aFGF er at syntetisere genet, fordi dette muliggør optimering af translateret protein og let mutage-nese. Genet kan syntetiseres baseret på aminosyresekvens af en mikrohete-10 rogen form af aFGF opnået fra et hvilket som helst dyr, herunder mennesker.

Den foretrukne metode er at anvende den bovine aminosyresekvens for aFGF og kemisk punkt-mutere basesekvensen til frembringelse af generne for andre arter. Linemeyer et al., Biotechnol. 5: 960-965 (1987).

15 De syntetiske gener er baseret på den fastlagte bovine aminosyresekvens beskrevet af Gimenez-Gallego et al., Science 230:1385-1388 (1985) og den DK 174961 B1 11 humane aminosyresekvens beskrevet af Gimenez-Gallego et al., Biochem.

Biophys. Res. Comm., 138: 611-617 (1986) og angivet i tabel I og III. Den unikke nucleotidsekvens af den 140 aminosyreform af bovint aFGF er stammende fra omvendt translation af aminosyresekvensen ved en metode, der 5 er lig med den der er beskrevet af Itakura et al., Science 198:1056-1063 (1977). Forskellige hidtil ukendte nucleotidsekvenser svarende til den native aminosyresekvens af bovint aFGF er angivet i følgende tabel:

I DK 174961 B1 I

I 12 I

I TABEL V I

I S 10 15 20 I

I Pho Am Lou Pro Lev Gly Aon Tyr tys lys Pr« tys lov Lov Tyr Cys Sor Am Gly Gly I

I TTQ AAQ C TN CCN CTN GGN AAQ TAO AAP AAP CCN AAP CTN CTN TAQ TGQ TCN AAO GGN GGN I

I TTP TIP TTP TIP AGO I

I 25 30 3S 40 I

I lyr Phe Lou Arg II o Lou Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr lys Asp Arg Sor Asp Gin I

I TAO HQ CTN CGN ATO CTN CCN GAQ GGN ACN GIN GAQ GGN ACN AAP GAQ CGN TCN GAQ CAP I

I TTP AGP ATA TIP AGP AGO I

I 45 50 SS 60 I

I Nis Ilo Gin Lou Gin Lou Cys Ala Glu Ser Ile Gly Glu Val Tyr Ila Lys Sor Thr Glu I

I CAO ATO CAP CTN CAP CTN TGQ GCN GAP TCN ATQ GGN GAP GIN TAO ATO AAP TCN ACN GAP I

I ATA TTP TIP AGO ATA ATA AGO I

I 65 TO 75 Μ I

I Thr Gly Gin Pho Lov Ala Hot Asp Thr Asp Gly Lou Lou Tyr Gly Sor Gin Ihr Pro Am I

I ACN GGN CAP TTO CTN GCN ATS GAQ ACN GAQ GGN CTN CTN TAQ GGN TCN CAP ACN CCN AAQ I

I TTP TTP ITP AGQ I

I 85 90 95 100 I

I Glu Giv Cys Lou Pho Lou Glu Arg Lou Glu Glu Asn Nit Tyr Asn Thr Tyr Ilo Sor Lys . I

I gap Gap tgo CTn ttq ctn gap CGn CTn Gap Gap aaQ Caq taq aaQ acn taq atq icn aap I

I TIP TIP AGP TTP A1A AGQ I

I IDS <10 116 120 I

I lys Mis Ala Giv Lyt His Trp Pho Vol Gly Lou lys lys Asn Gly Arg Ser Lys Lou Gly I

I AAP CAQ GCN GAP AAP CAQ TGG TTQ GTN GGN CTN AAP AAP AAQ GGN CGN TCN AAP CTN GGN I

I TTP »GP AGQ TTP I

I 125 130 135 1A0 I

I pro Arg Ihr His Pho Gly Gin lys Alo Ho leu Pht leu Pro lou Pro Vol Ser Sor Asp I

I CCN CGN ACN CAQ ITQ GGN CAP AAP GCN ATQ CTN TTQ ΠΝ CCN CTN CCN GTN TCN TCN GAQ I

I l6p ATA ITP ITP TTP AGQ AGQ I

hvor Q = C eller T, I

P = A eller G, og I

N = A, T, C eller G I

DK 174961 B1 13

Det bovine gen er konstrueret med en lederstilling indeholdende et enkelt restriktionsenzym spaltningssted og en N-endestillet methionincodon som translationsstartsted. Genet indeholder også en hale indeholdende tandem translationelle stopcodoner og 2 restriktionsenzymspaltningssteder. Mæng-5 den af den genetiske kode muliggør en udvælgelse af basesekvenser, der for deres vedkommende muliggør indarbejdning af unikke restriktionsenzymspaltningssteder i hele genet. Den foretrukne bovine genbasesekvens med beliggenheden af restriktionsenzymspaltningsstedeme er angivet i følgende tabel.

10 -- DK 174961 B1 14

t- >- < C O O

o« u O x o O

</> O V- < N- o < ►- σι cN*a< c <J o u ♦- O cj *- cg < ►-

< cj O u O

O. h- c L. u <3 —*

vi < Of cjo X

^ <J CJ cn H < e 1/1 < W- >* <j H Ό

>> < »- f— L9 O CD

-I < I— O “ o

i- · c O w . cj O

J2 CJ >% < H- ►» |B K < >1 o O 3 O o «— O O Φ H- < O O O —I U o O. CJ O D o o i/1 < C- 4l Η» < < o o —j o o

r— O c> >* O O

ro O *— < O O O

> O O C/ o CM O O

o t- ^ o O O C. fSJ ►— < m -C CJ O *-· r- vi < ►—

t— < t— C < O O

>s ·— < Q. C *— <

«— O CJ X X CJ O

O O O l— «Ϊ t—

O. »- < O. CJ O

Vi < w ιΛ ►— < * o υ < * o o o ^ < »— +> o cj — c co ci O οι V- < o o. *— u u r <f-w

2 o o «0 U O Z

Φ »- < *— o o -l u o c o o O' U 19 3 ►— < r-1 r— ►- < 4) ►» ^ 00 —* <x ·— -J O O ' σ> o cj o ^ qj o o o c co o o π x o *~ < < cj O ^ o. n k < 3 CJ <3 C < *- ω ►— < »— <ar h- -J CJ o o CJ o 4j *— < >% H- < JC >- < *— *—· O c

O. t— < O **· O CJ

C CJ O C W H- < >. · < *- .C ' c/ <-5 I— ♦- < ►- < >— O i- < 03 < I— . . cC 15 u \Or- ·— M ld o o o o o

N >s *- < c O O

^ r- O CJ -C CJ o u cj o ►— < ^ c CJ O t- »— <

Γ3 VI < »— 4) CJ O

< o < c- i/> o K < £Q t* O & < vi CO <ί ►- 3· qj Q o >> ~ <c »- t-f vi M O oj cj o >% Ol CJ r- W < o H < — <i_is t. CJ o t. cj“ >s <1 »— >s < ►* c H < *- »- < 3 · t-L^ r- · *- < 41 C < <0 t— < -j cj <3 > o cj 3 c < 3 < ♦- 4r ^ « r— <[ ►— —» o o -· o ϋ o VI O CJ "O >k ^ <

>* < C c r- O CJ

—i < t— ··- O o Cl O < ♦— X 4J Cl o C OCJO r- o ^ < O. c ϋ ϋ I-H >o < o vi o cj oc — <r »->, <1 u- ui βι g O ·-»

mJ ^ C. V) H- < W

(Λ < C- 3 C

>S < C- f— < H- «- —j <r c- o o o j: C CJ <3 ro c> o

>s < C- r— CJ O

*“—·♦— < < · O CJ r—· c w K- < vi g o vo vi < c. >, o Cl < < t- CJ w < »1 ►— < 3 o CJ *-· r— O U »-i O) r-i »— < ·— O o U N «J \J*) CJ O 3 3 O O tJ C wj O Cl > 0» »- < < K o,

—J Cl O O Cl O M

O o < c- 3 O <3 o +> C C>j CJ <3 Φ V » CL· cj O -j -go ec

3 O CJ C < K

Φ ►- < < f- ^ CJ (3 O Cl 13 C I— < QJ V- « VI <f C- Γ— C- < < < *- I-· < ►- ^ «I Cl O VI c < -C *- <! — · < w

&. »- < Σ O O

t-ι O Cl O C <« C-

41 ♦— ·< O r < K

X O CO m U O N ØL I- < /—

t- QC VI < U

h> o < <3 u - oa < c ·— < Ui DK 174961 B1 15 VI tf »— >* <1 ίο © tf κι- NO k- < o> ro o o i/> ►— c σι o o

v. O O

tf (5 O

>» O 15

g U

O O O

C · t- < V) tf v— < < ►- un tf ♦—

• tf H

—J tf h- un 15 o >s tf h- —I tf I- 5 »- < 0J o »— tf- 0 ^ UfTj ·« O >% M (J o 3 — /— 15 O —' *— lo 15 o </» i— tf f- Π» t— tf

> 15 O

01 U o •C “tf d. · »- tf

Q. <5 15 O

1- O U tf *— μ- tf tf V» I— tf ·*“ <t *- ^ X 15 O >- — «η tf *— 15 *— >% tf μ- <5 Ό

5 tf I— tf tO

. 3 O 15 15 *—« o 15 O ^

45 <— C\J < i— iSi tf 15 O

/H 15 ΓΟ 5 15 — tf ►— tf > V* ft i— < < tf >— os

0) *— O 15 »— tf C

il tf 15 15 *— tf»— U

. v> μ- tf x: i5 15 uj M — tf *- Q. tf ΙΟ X u ID to I— tf .Γ. VI ri 15 15 tf — *W >, — . < μ- . tf *— *— -J — tf μ- I— tf O Urt «—I tf »— O CL 15(5 O >* tf >— tf cn <i— M ·— —J tf»— — tf 15 15 >* »-tf U I- tf

Oi 15 15 <U 15 15

*/1 »—tf 1/1 *— tf »-H

-I 0J 1515 1- <5 15 U

ti *— »-tf O 015»« (34 *-*Otf»— t/> © tf I— l/>

®U O 15 O r- CM 15 O

>. ΓΟ tf »— »0 tf »— tf r— o; i— »— tf > o u uo c_å L. u g O tf H- »— ” .Π <5 15 U f-1 15 O *—» »— tf Ql tO 15 15 C 15^5 3 15 15 VI tf f— Φ *—i »— tf tf tf »— 5 15 15 L · 15 15 O · tf »— »s < t— L. 15 15

»- I- tf Q. 15 O

ui (— tf 3 15 15 «“ tf *— 0» ►— tf X 15 15 —I 15 15 C JJ 15 01 15 15 VI tf ♦— .C H- tf tf tf I— O. ►- tf 3 tf i— 3 15 15 *— O tf >— Φ O ►— tf O 03 15 15 —I O 15 15 03 M O <5 O 0» ? U 13 O» r* tf»— ΓΟ i— ►— tf O 15 <5 — *-· tf »— 3 o o m t— < 01 »-tf »— 151 15 -5 ϋ O N tf IS <5 σι 15 O ·— v> tf »— i. i3 i5 ω >i < >— tf · <5 (5 »0 -5 - tf »— 3 15 «5 X C tf »— r- tf ^ »— tf

O 15 15 O 15 O

3 O 15 >» »-tf 0» l— tf »— 15 -5 15 O ·—* 15 ^7 15

Oj o g o oi t— tf JZ h- tf ~ X f- tf O. h- tf i—· Q» *— tf 3 O »- tf VI O <5 15

0> vO tf — CO < K

•5 CM O 15 X 0015 «Λ 15 15 1- l·- tf >N 15 O -C O 15 15 ρί »- tf ►— tf »— 3 © id o σι »— tf tf r— i—« tf »— L. ύ U »· 15 O O tf O (5 *—» 3 15 O O ►— tf r» · tf H- W m · U <3 15 150 O. 00 5 15 >-* O C 015 O >» O 15 « CO vi tf )— CM #- u_i 15 O Q.

< < μ- i- 15 15 O tf O tf t- 3 <5 0 i- O 15 Φ tf Q. O 15 J 15 <5 DK 174961 B1 16

Gensekvensen for hver streng af det dobbeltstrengede molekyle opdeles tilfældigt i 8 nucleotidsekvenser. Oligonucletideme er konstrueret med overlappende ender for at muliggøre dannelsen af det dobbeltstrengede DNA.

Følgende tabel indeholder en af en hel række oligonucleotidarrangementer, 5 der anvendes til at frembringe det bovine aFGF gen.

TABEL VII

OlIGO-1 10 20 30 40 50 55 5' AATTCATGTT CAATCTGCCA CTGGGTAATT ACAAAAAGCC AAAGCTTCTT TACTGCTC 3’ 011G0-2 10 20 30 40 45 5* AGAAGCTTT6 GCTTTTTGTA ATTACCCAGT GGCAGATTGA ACATG 3* OL I GO-3 10 20 30 40 50 60 .

5' TAACGGTGGT tactttctcc gcatcctgcc agatggtacc GTGGACGGCA CCAAAGATCG 3' 0LIG0-4 10 20 30 40 50 59 5' TGCCGTCCAC GGTACCATCT GGCAGGATGC GGAGAAAGTA ACCACCGHA GAGCAGTAA 3‘ 0LIG0-5 10 20 30 40 46 5’ TTCTGATCAA CATATTCAAC TGCAGCTGTG CGCCGAATCT ATCGGT 3* 01IG0-6 10 20 30 40 50 60 65 5' GTAAACTTCA CCGATAGATT CGGCGCACAG CTGCAGTTGA ATATGTTGAT CAGAACGATC TTTGG 3' 0L1G0-7 10 20 30 40 50 60 67 5' GAAGTTTACA TCAAATC1AC cgaaactggt CAATTCCTTG ccatggacac tgaiggcctg ctgtacg 3’ DK 174961 B1 17 0LIG0-8 10 20 30 40 50 60 62 5* GATCCGTACA GCAGGCCATC AGTGTCCATG GCAAGGAATT GACCAGTTTC GGTAGATTTG AT 3' OLIGO-9 10 20 30 40 50 52 5’ GATCCCAGAC CCCAAACGAG GAGTGCCTTT TCHGGAGCG CCTGGA6GAA AA 3' OUGO-IO 10 20 30 40 50 58 5’ gttgtaatgg ttttcctcca ggcgctccag gaaaaggcac tcctcgtttg GGGTCTGG 3’ OLIGQ-11 10 2 0 30 40 48 5· CCATTACMC acctacatct ctaaaaagca jgctgagaaa CATTGGTT 3· OLIGO-12 10 20 30 40 46 5* GGCCTACGAA CCAATGTTTC TCaGCATGCT TTTTAGAGAr GTAGGT 3' OLI GO-13 10 20 30 40 50 S3 5' CGTAGGCCTT AAGAAAAATG GCCGCTCTAA ACTGGGCCCT CGTACTCACT TTG 31 OUGO-14 10 20 39 40 50 55 5' GCTTTTTGAC CAAAGTGAGT ACGAGGGCCC AGTTTAGAGC GGCCATTTTT CTTAA 3’ 0LIG0-15 10 20 30 40 50 56 5· GTCAAAAAGC TATCCTGTTC CTGCCACTGC CAGTGAGCTC TGACTAATAG ATATCG 3' OLIGO-16 10 20 30 40 50 5‘ TCGACGATAT ctattagtca GAGCTCACTG gcagtggcag GAACAGGATA 3*

Oligonucleotiderne angivet i tabel VII er kun angivet som et eksempel på oli-gonucleotidunderenheder og er ikke begrænset til disse. Den sammensatte 5 basesekvens, der viser overlapningen og arrangementet af oligonucleotiderne, er angivet i tabel II.

Det bovine gen samles i to trin: først, den halve svarende til den N- DK 174961 B1 18 endestillede del af proteinet; og derefter, den C-endestillede del. Generelt kinasebehandlet oligonucleotiderne med T4 polynucleotidkinase i nærværelse af enten ATP eller 32P-mærket ATP. Ved den første omsætning i hvert trin kinasebehandlet oligonucleotiderne, der udgør den ene streng af genet, bort-5 set fra det meste 5’ oligonucleotid. Ved den anden reaktion kinasebehandles oligonucleotiderne, der udgør den anden streng, bortset fra det meste 5' oligonucleotid. Når kinasebehandlede oligonucleotider anvendes, er ca. 1 % af det tilsatte oligonucleotid 32P-mærket til senere identifikation af produkterne. Annealing udføres i en passende puffer f.eks. en sådan, der indeholder, men 10 ikke er begrænset til ca. 60 mM Tris, ca. pH 7,6, ca. 5 mM dithiothreitol (DTT), ca. 10 mM MgCfe og ca. 30 μΜ ATP ved ca. 90 °C i ca. 4 minutter efterfulgt af hurtig overførsel til ca. 60 °C og en langsom afkøling til ca. 30 °C. Ligering udføres i et passende puffer f.eks. en sådan, men ikke begrænset til, på ca. 60 mM Tris, ca. pH 7,6, ca. 10 mM DTT, ca. 10 mM MgCk, ca. 1 mM 15 ATP og ca. 0,03 enheder T4 DNA ligase ved ca. 20 °C i ca. 1 og Vz time.

De ligerede oligonucleotider renses ved polyacrylamidgelelektrophorese efterfulgt af ethanoludfældning. Oligonucleotiderne opløses atter i en puffer indeholdende ca. 20 pi af ca. 80 % formamid, ca. 50 mM Tris-borat, ca. pH 20 8,3, ca. 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), ca. 0,1 vægt/rumfang-% xylencyanol og ca. 0,1 vægt/rumfang-% bromphenolblåt. Hver prøve opvarmes ved ca. 90 °C i ca. 3 minutter og elektrophoresebehandles i ca. en 10% urinstof-polyacrylamidgel ved ca. 75 watt i ca. 5 timer. 231 base N-endestillede bånd fjernes, kombineres og elueres ved ca. 4 °C i 0,5 M am-25 moniumacetat indeholdende ca. 1 mM EDTA ved ca. pH 8. De 209 base C-endestillede bånd behandles på samme måde.

De syntetiske gensekvenser, der koder for enten de N-endestillede eller de C-endestillede dele af aFGF inkorporeres i pBR322 plasmidet. Det er specielt 30 ønsket og tilsigtet, at der inden for opfindelsens rammer kan anvendes andre plasmider, hvori aFGF genet kan indarbejdes, og som vil muliggøre udtryk- DK 174961 B1 19 kelsen af aFGF genet. Re-annealede oligonucleotider, ca. 300 fmol og ca.

100 fmol af den udvundne 231 basepar N-endestilling ligeres hver til ca. 100 fmol agarosegel-renset ca. 3,9 kilobasé (kb) EcoRI-BamHI pBR322 for N-endestillingen. Den 209 bp C-endestilling konstrueres på samme måde under 5 anvendelse af BamHI-Sall pBR322. Ligation udføres i en puffer indeholdende ca. 25 mM Tris, ca. pH 7,8, ca. 1 mM DTT, ca. 10 mM MgCk, ca. 0,4 mM ATP med ca. 1 enhed T4 DNA ligase i ca. 1 time ved ca. 20 °C. Hver halvgen ligeret vektor anvendes til at transformere kompetente bakterieceller, som f.eks. E. coli RR1 (Bethesda Research Laboratories, BRL) idet man an-10 vender leverandørens anvisninger. De transformerede celler selekteres for vækst i ampicillin og afsøges for tilstedeværelsen af enten det 231 basepar (bp) EcoRI-BamHI indskud eller det 209 bp BamHI-Sall indskud ved restriktionsanalyse af mini-lysat plasmid præparationer.

15 DNA sekvensen af kloner indeholdende indskud af passende størrelse bestemmes under anvendelse af Maxam og Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-564 (1977) kemiske DNA sekvensteknikker.

Det endelige fuldlængdede aFGF syntetiske gen blev klonet ved at spalte 20 den N-endestillede halvklon med restriktionsenzymer BamHI og Sall, behandlet med alkalisk phosphatase og ligere dette til det rensede 209 bp BamHI-Sall indskud af den C-endestillede halvklon. Dette ligerede materiale blev anvendt til at transformere kompetente RR1 celler som tidligere beskrevet.

25

Udtrykkelse af det syntetiske aFGF gen udføres med en hel række forskellige promotor-udtrykkelsessystemer. Det skal forstås således, at inden for den foreliggende opfindelses rammer falder også anvendelsen af andre promotor-udtrykkelsessystemer til udtrykkeisen af det intakte aFGF gen. Den fore-30 trukne konstruktion anvender E. coli tac promotoren, et hybrid mellem regionerne af trp promotoren og lac promotoren således som beskrevet af deBoer DK 174961 B1 20 et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983). Plasmid pKK223-3 (Pharmacia), der indeholder tac promotoren og rmB rRNA transskrip-tionsterminatoren, blev modificeret for at fjerne det pBR322-afledte Sall restriktionsenzymsted. rmB rRNA terminatoren har vist sig at muliggøre udtryk-5 kelse med stærke promotorer Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4936-4940 (1981); Brosius, Gene 27:161-172 (1984).

pKK223-3 plasmid DNA’et spaltes med restriktionsenzymer til frembringelse af et 2,7 kb DNA fragment til frembringelse af klon pKK2,7. Det syntetiske 10 aFGF gen spaltes fra dets pBR322 vektor og overføres til pKK2,7 plasmidet efter restriktionsbehandling af pKK2,7 med EcoRI og Sall. Den fremstillede rekombinant, angivet i fig. 1, transformeres i E. coli JM105 (Pharmacia) eller DH5 (BRL) celler og udtrykkes.

15 Stedsspecifik mutagenese er en effektiv måde til at omdanne aminosyrese- kvensen fra en pattedyrart af aFGF til aFGF aminosyresekvensen af en anden art. Følgende beskrivelse angår den stedsspecifikke mutageneseom-dannelse af bovint aFGF, 140 aminosyreform (nummereret i overensstemmelse med den native form), til human aFGF, det skal imidlertid bemærkes, 20 at processen kan anvendes til at omdanne aFGF fra et hvilket som helst pattedyrart til aFGF fra en hvilken som helst anden art. Den eneste begrænsning ved omdannelsen er, at aminosyresekvensen for begge aFGF'er skal være kendt. Følgende tabel angiver de aminosyrer, der skal være substitueret, og beliggenheden på det bovine aFGF aminosyrekort tabel VI, ved hvil-25 ket substitutionerne er foretaget: DK 174961 B1 21

TABEL VIII

Aminosyre Substituerede aminosyre

beliggenhed humant aFGF_for bovint aFGF

5 Pro Leu 21 His Tyr 35 Arg Lys 47 Ser Cys 51 Val Ile 64 Tyr Phe 106 Asn His 116 Ser Arg 117 Cys Ser 119 Arg Leu 125 Tyr Phe

Som med den bovine gensekvens konstrueres 8 oligonucleotider, der repræsenterer den humane gensekvens, ved samme metode som anvendt for de 5 bovine oligonucleotider. Følgende tabel indeholder en af en hel række oligo-nucleotidarrangementer, der anvendes til frembringe det humane aFGF gen.

DK 174961 B1

22 I

TABEL IX I

OLIGO-1 ί I

5' CTGCCACCGGGTAATTAC 3' I

OLIGO—2 I

5* CGGTGGTCACTTTCTCCG 3' I

OLIGO-3 I

5 ‘ CGGCACCAGAGATCGTTC 3‘ I

OLIGO-4 I

5 ‘ GCAGCTGTCCGCCGAATCTGTCGGTGAAG 3* I

OLIGO-5 I

5 * CTGGTCAATACCTTGCCATGG 3 ' I

OLIGO-6 I

5* GCTGAGAAAAATTGGTTCG 3’ I

OLIGO-7 I

5' GGCCGCGTTTACAGCTGCCATTTTTCTTAAGG 3‘ I

OLIGO-8 I

5’ CGTACTCACTATGGCCAAAAAGCTATCC 3‘ I

I Det klonede syntetiske bovine gen for aFGF omdannes til et humant synteti- I

I ske gen for aFGF ved en hel række dirigerede punktmutationer. Oligonucleo- I

I 5 tid-dirigeret mutagenese af det klonede gen muliggør ændringen af basese- I

I kvensen for bovint aFGF, således at den fremkomne aminosyresekvens in- I

DK 174961 B1 23 deholder de substituerede aminosyrer angivet i tabel VIII og er humant aF-GF. En deletion foretages i det bovine gen for at fjerne det aminoendestiilede phenylalanin til frembringelse af den humane 139 aminosyremikroheterogene form af aFGF. En punktmutation udføres for at erstatte den anden stillings 5 asparagin med asparaginsyre. Alternativt deamineres asparaginen til aspa· raginsyre. Metoderne til udførelse af disse procedurer er beskrevet nedenfor eller er velkendte af fagmanden. Den oligonucleotid-dirigerede mutagenese udføres under anvendelse af standardmetoder velkendt indenfor fagområdet Zoller og Smith, Methods in Enzymology, 100: 468-500 (1983); Norris et al., 10 Nucleic Acids Research, H: 5103-5112 (1983); og Zoller and Smith, DNA, 3: 479-488 (1984). Punktmutationerne af den bovine til humane omdannelse udføres under anvendelse af standardiseret oligonucleotid-rettet mutagense og er angivet i følgende tabel. Beliggenheden af basemutagensen fremgår af tabel X.

15

TABEL X

Base be- Substitueret base Tilsvarende liqgenhed humant aFGF for bovint aFGF human aminosyre 22 C T Pro 69 C T His 112 G A Arg 148 C G Ser 159 G A Val 199 A T Tyr 324 A C Asn 354 A C Ser 358 G C Cys 364 G T Arg 365 C G Arg 382 A T Tyr DK 174961 B1 24

At fremme mutagenesen af det bovine aFGF overføres det til en standard vektor, M13mp19, en enkeltstrenget DNA bakteriofag vektor. Det bovine pKK-aFGF plasmid spaltes med EcoRI og Sall, og det fremstillede 440 bp fragment gelrenses. Vektor M13mp19 RN DNA spaltes med de samme to 5 endonucleaser, og enderne dephorphoryleres herefter med bakteriel alkalisk phosphatase. Vektor DNA'et og aFGF genfragment DNA'et ligeres, og blandingen anvendes til at transformere E. coli DH5 celler. En fag klon indeholdende det bovine aFGF gen selekteres, M13mp19-baFGF.

10 De humane oligomere angivet i tabel IX phosphoryleres og anneales enkeltvis til M13mp19-baFGF enkeltstrenget fag DNA. Lukket-ringformede dobbeltstrenget molekyler fremstilles med T4 DNA ligase og DNA polymerase I kle-now fragment. Præparationerne blev hver især anvendt til at transformere kompetente JM105 celler, og de fremkomne transformante plaques selekte-15 res ved hybridisering med den passende oligomer, der er mærket under anvendelse af polynucleotidkinase. Enkeltstrenget DNA isoleres fra fag klonen indeholdende de humane oligomere 4 mutationer, og den ovennævnte metode gentages under anvendelse af den humane oligomer 5 til frembringelse af en klon, der indeholder både oligomer 4 og 5 mutationerne.

20 I de efterfølgende metoder blev de bovine-til-humane sekvensmutationer i disse M13-baserede kloner kombineret ind i en pBR322-baseret klon. RF DNA'er blev fremstillet ud fra kloner indeholdende baseforandringerne specificeret af humane oligomere 1, 2, 6 og 8. DNA'et af den humane 1 mutant-25 klon blev spaltet med EcoRI, enderne blev dephosphoryleret med bakteriel alkalisk phosphatase, og DNA'et blev spaltet med Hindlll. Det humane 2 mutant DNA blev spaltet med Hindlll, behandlet med phosphatase og derefter spaltet med BamHI. Det humane 6 mutant DNA blev spaltet med BamHI, phosphatasebehandlet og herefter spaltet med Apal. På samme måde blev 30 det humane 8 mutant DNA spaltet med Apal, enderne blev dephosphoryleret, og DNA blev spaltet med Sall. Disse 4 DNA præparationer blev elektropho- DK 174961 B1 25 resebehandlet gennem 2% agarose, og fragmenterne på 45 bp, 190 bp, 135 bp og 70 bp fra de mutante DNA'er indeholdende henholdsvis humane 1, 2, 6 og 8 mutationer blev elueret fra gelen. Rumfang af hver fragment blev samlet ligeret til et gelrenset 3,7 kb EcoRl-Sall fragment fra pBR322 med T4 DNA 5 ligase og anvendt til at transformere kompetente E. coli DH5 celler (BRL) udført som anbefalet af leverandøren. En klon indeholdende mutationerne specificeret af alle fire mutante oligomere selekteres ved hybridisering med radiomærkede prober, der er fremstillet ud fra hver af de oligomere. Det 140 bp Kpnl-BamHI DNA fragment isoleret fra spaltet RF DNA af den humane 3 10 mutant M13 klon ligeres til endonuclasespaltningsprodukter af dette humane 1-2-6-8 mutant DNA og transformeres ind i DH5 kompetente celler til frembringelse afen klon med de humane 1-2-3-6-8 mutationer. BamHI-Pstl nedbrydningsfragmenterne af sidstnævnte klon ligeres til BamHI-Pstl nedbryd-ningsfragmenteme af RF DNA fra den humane 4-5 M13-baserede klon, og 15 ligationsblandingen anvendes til at transformere DH5 kompetente celler. En klon indeholdende de humane 1-2-3-4-5-6-8 mutationer selekteres ved oligomer hybridisering, og aFGF gen EcoRl-Sall DNA fragmentet af dette re-kombinante plasmid ligeres til phosphatase-behandlet EcoRI-Sall-spaltet RF DNA fra M13mp18 (BRL). Kompetente DH5 celler transformeres med dette 20 ligerede DNA, og de transformerede celler udstryges på JM105 værtsceller til frembringelse af en M13 klon. Det enkeltstrengede fag DNA af denne klon blev annealet med den humane 7 oligomer, og en M14 klon indeholdende alle de ønskede mutationer blev opnået ved at arbejde som beskrevet ovenfor. Den humane aFGF klon er betegnet M13mp18-haFGF.

25

Rent aFGF uden heparin bliver mindre aktiv sandsynligvis på grund af frembringelsen af ukorrekt stabiliserede intramolekylære disulfidbindinger og aggregater dannet af intermolekylære disulfidbindinger. De kovalente disulfidbindinger dannes mellem 2 cysteinrester enten i to adskilte polypeptidkæder, 30 interkædedisulfidbinding eller i forskellige stillinger inden for en enkelt kæde, intrakædedisulfidbinding. Når det drejer sig om enzymatisk oxidativ iodering, DK 174961 B1 26 kan de aktive molekyler genvindes ved reduktion med 20 mM dithiothreitol i nærværelse af 3 M guanidiniumchlorid ved en pH-værdi på ca. 9,1. Den foreliggende opfindelse anvender steds-dirigeret mutagense til den specifikke substitution eller deletion af aminosyrer, der er i stand til at danne fremmede 5 intramolekylære eller intermolekylære kovalente bindinger og oxidationsfølsomme aminosyrer. Substitution anvendt i foreliggende beskrivelse med krav betyder en tilsigtet ændring i DNA basesekvensen af aFGF, således at en uønsket aminosyre bliver erstattet med en ønsket aminosyre. Den uønskede aminosyre kan være en sådan, der danner uønskede kovalente bindinger, 10 specielt disulfidbindinger, eller en sådan, der er luft-oxiderbar, der begge kan nedsætte molekylets biologiske aktivitet. En deletion anvendt i foreliggende beskrivelse med krav angiver en tilsigtet ændring i DNA basesekvensen af aFGF, hvilket resulterer i fjernelse af den uønskede aminosyre. Den primære aminosyre i forbindelse med intramolekylær eller intermolekylær kovalent 15 bindingsdannelse er cystein, medens aminosyreme, der er oxidationsføl somme omfatter cystein, methionin og tryptophan. Cysteinresten eller resterne kan erstattes med en hvilken som helst aminosyre, der ikke vil danne disulfidbindinger. Den foretrukne aminosyre til erstatning af cystein er serin. Oxidationsfølsomme aminosyrer erstattes med en hvilket som helst aminosy-20 re der er oxidationsmodstandsdygtighed, dette omfatter men er ikke begrænset til alanin, valin, leucin og isoleucin.

Opfindelsen omfatter også steds-specifikke mutationer af en eller flere af cy-steinresteme og en hvilket som helst ikke-endestillet methioninrest, der kan 25 gøre nativt eller rekombinant aFGF mindre aktivt eller inaktivt på grund af dannelsen af ukorrekte intramolekylære eller intermolekylære bindinger eller oxidative ændringer. Det rekombinante og native humane og bovine protein indeholder cysteinrester fælles beliggende ved stillingerne 16 og 83 og en methioninrest fælles beliggende ved stilling 67 defineret for den native 140 30 aminosyreform af både bovint og humant aFGF. Bovine og humant aFGF’er indeholder hver en tredie cysteinrest ved henholdsvis stillingerne 47 og 117.

DK 174961 B1 27

De fælles cysteinrester er de mest sandsynlige til at danne en disulfid binding, da beliggenheden af cysteinrester i disulfid bindingerne er højt bevarede i homologe proteiner. Således er de tredie cysteinrester, der er i forskellige beliggenheder i bovine og humane aFGF’er, meget sandsynligvis ikke 5 fundet i disulfidbindingerne i de fuldt aktive proteiner. Det skal forstås således, at de hidtil ukendte mutante aFGF'er ifølge opfindelsen ikke alene omfatter formerne substitueret ved de ikke-fælles cysteinrester, men også alle de, der har al cysteinet substitueret eller fjernet, sådanne hvori en vilkårlig af den ene eller de to cysteiner er substitueret eller fjernet og sådanne, hvori 10 methioninet er substitueret eller fjernet. Substitution eller fjernelse af en vil kårlig, specielt af det unikke cystein, alle cysteiner, to af de tre cysteiner eller methionin i det humane eller bovine aFGF ved steds-dirigeret mutagenese-kan ændre dannelsen af uønskede intramolekylære eller intermolekylære disulfidbindinger og oxiderede former.

15

Steds-specifik mutagenese udføres fortrinsvis på bovint eller humant r-aFGF frembragt ud fra genomt DNA, cDNA eller ved konstruktion af gener for en eller flere af de mikroheterogene former af proteinet baseret på de mikrohete-rogene former af aFGF fra pattedyrarter, herunder mennesket. Genomt DNA 20 ekstraheres fra pattedyr hjerne- eller hypofyseceller og præpareres til kloning ved enten randomiseret fragmentering af højmolekylært DNA efterfulgt af metoden beskrevet af Maniatis et al., Cell 15: 687-701 (1978) eller ved spaltning med et restriktionsenzym således som beskrevet af Smithies et al., Science 202:1284-1289 (1978). Det genome DNA indarbejdes herefter i en 25 passende kloningsvektor, sædvanligvis E. coli Xfag, se Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).

Det opnåede cDNA for aFGF, poly (A)-holdigt RNA ekstraheres fra celler, der 30 udtrykker aFGF ved metoden beskrevet af Aviv og Leder, Proc. Natl. Acad.

Sci. 69:1408-1412 (1972). cDNA'et fremstilles under anvendelse af omvendt DK 174961 B1 28 transscriptase og DNA polymerase under anvendelse af standardmetoder således som angivet i Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SPring Harbor, New York (1982). cDNA afsluttes og klones ind i en passende vektor, sædvanligvis pBR322 5 ved en metode, der svarer til den beskrevet af Wensink, et al., Cell 3: 315-325(1974).

De klonale genome DNA eller cDNA biblioteker afsøges for at identificere klonerne indeholdende aFGF sekvenser ved hybridisering med en oligo-10 nucleotidprobe. Sekvensen af oligonucleotidhybridiseringsproben er baseret på den bestemte aminosyresekvens for aFGF. Maniatis et al., supra, Anderson and Kingston, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6838-6842 (1983) og Suggs et at., proc. natl. Acad. Sci. USA 78: 6613-6617 (1981) beskriver forskellige metoder til at afsøge genome og cDNA kloner. Den foretrukne meto-15 de er specifikt at punktmutere de syntetiserede bovine og humane gener således som beskrevet ovenfor.

Steds-specifik mutagenese udføres på en human eller bovin aFGF enkelt-strenget bakteriofag rekombinant klon som f.eks. M13mp18-haFGF eller 20 M13mp19-baFGF efterfulgt af metoderne beskrevet af Zoller, og Smith,

Methods in Enzym. 100: 468-500 (1983), Norris et al., Nucleic Acids Res. 11: 5103-5112 (1983) og Zoller and Smith, DNA 3: 479-488 (1984). Tre oligo-nucleotider for hver art designes til at specificere serincodoner i stedet for hver af cysteincodoneme fra det humane aFGF ved stillinger 16, 83 og 117 25 og ved stillingerne 16, 47 og 83 for det bovine gen. Et oligonucleotid er designet til at specificere en leucincodon i stedet for methionincodonen af det humane eller bovine aFGF ved stilling 67. De humane syntetiserede oligome-re er angivet i følgende tabel med de muterede baser understreget.

DK 174961 B1 29

TABEL XI

Cystein 1 (16) 5 * CCGTTAGAGGAGTAAAGAAGC 3· ( Cystein! 2 (83) 5 ‘ GGAAAAGGGACTCCTCG 3'

Cystein·. 3 (117) 5' CCGCGTTTAGAGCTGCC 3'

Methionin (67) 5’ CCATCAGTGTCCAGGGCAAGG 3'

Lignende oligomere identificeres i passende regioner af det bovine aFGF gen, og de specifikke mutationer udføres som beskrevet nedenfor.

5

De humane oligomere phosphoryleres og anneales hver for sig enten til M13mp18-haFGF eller M13mp19-baFGF enkel-strenget DNA. En anden streng af DNA syntetiseres under anvendelse af den annealede oligomer som primer. Hvert cystein muterede gen anvendes til at transformere en pas-10 sende vært som f.eks. en kompetente E. coli DH5 celle. De transformerede celler udstryges på et dække af en acceptabel vært for M13 viruset som f.eks. E. coli JM105 celler. De transformerede plaques selekteres ved hybri-disering med den passende mærkede oligomer. Hybridiseringsbetingelser optimeres for hver probe for at forhindre tilbageholdelse af hybrider indehol-15 dende enkeltbase ændringer. Enkeltstrenget DNA isoleres fra fagkloner indeholdende hver af cystein-til-serinmutationerne til DNA sekvensanalyse under anvendelse af metoden beskrevet af Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 74: 5463-5467 (1977). RF DNA’er fremstilles for hver klon, spaltes med EcoRI og Sall og renses ved agarosegelelektrophorese. De rensede 440 bp 20 indskud ligeres individuelt til 2,7 kb EcoRI-Sall DNA fragmentet af pKK2,7 tac promotorudtrykkelsesvektoren. De ligerede DNA’er bliver anvendt til at transformere kompetente DH5 celler, og kloner indeholdende DNA med de muterede cysteincodoner selekteres ved hybrisering til den passende oligomer.

Hvert aFGF gen indskud sekvenseres således som beskrevet af Maxam og 25 Gilbert, Methods in Enzymology 65: 499-560 (1980). Kloner indeholdende DK 174961 B1 30 den enkelte baseændring fra det oprindeligt humane DNA betegnes: pKK-haFGF (Ser 16), pKK-haFGF (Ser 83) og pKK-haFGF (Ser 117); medens det bovine DNA betegnes pKK-baFGF (Ser 16), pKK-baFGF (Ser 47), pKK-baFGF (Ser 83) for beliggenheden af substitutionen i proteinet.

5

Substitution af en vilkårlig af to eller alle tre af cysteinresterne udføres ved multiple punktmutationer eller ved at kombinere restriktionsfragmenteme af enten humane eller bovine rekombinant wild-type og (Ser 16), (Ser 47), (Ser 83) og (Ser 117) mutante syntetiske gener, klonet i M13mp19 for bovine og 10 M13mp18 for humane og subklonet i pKK2,7 som beskrevet ovenfor. Det skal forstås således, at de mange mutationer kan udføres med enten de bovine eller humane enkelt mutations aFGF konstruktioner som beskrevet ovenfor, imidlertid omfatter følgende illustrering kun humant aFGF. pKK-haFGF (Ser 16, 32) og pKK-haFGF (Ser 16, 32) rekombinanterne konstrue-15 res ved at indføre 0,23 Kb EcoRI-BamHI fragmentet af M13mp18 (Ser 16) i pKK2,7 efterfulgt af indførsel af 0,2 kb BamHI-Sall fragmenterne enten fra M13mp18 (Ser 83) eller fra M13mp18 (Ser 117). pKK2,7 vektoren er modificeret for at fjerne BamHI stedet ovenfor tac promotoren, medens BamHI stedet efterlades i multikloningssekvensen. Efter nedbrydning med de tilsvaren-20 de restriktionsenzymer, efterfølges af ligation og transformation af en passende vært selekteres kloner og afsøges for de, der indeholder plasmider med den forventede molekylvægt for rekombinanterne, ca. 3,1 Kb. En passende bakteriel vært kan omfatte men er ikke begrænset til E. coli DH5, JM105 og AB1899.

25

Det mutante haFGF (Ser 16, 83,117) konstrueres ved at erstatte 0,13 Kb Sphl-Sall fragmentet af pKK-haFGF (Ser 16, 83) med det tilsvarende fragment af pKK-haFGF (Ser 117), der koder for Ser i stedet for Cys i 117 stillingen. 3 Kb Sphl-Sall fragmentet af pKK-haFGF (Ser 16, 83) med det tilsva-30 rende fragment af pKK-haFGF (Ser 117) der koder for Ser i stedet for Cys i 117 stillingen. 3 Kb Sphl-Sall fragmentet af pKK-haFGF (Ser 16, 83) renses DK 174961 B1 31 ved præparativ agarosegelelektrophorese, elektroelueres og ligeres til 0,13 kb Sphl-Sall fragmentet af pKK-haFGF (Ser 117), der er renset fra en 5% polyacrylamidgel på den samme måde. De rensede fragmenter ligeres, og rekombinanter selekteres som beskrevet ovenfor.

5 pKK-haFGF (Ser 83,117) mutanten er opbygget ved at erstatte 0,3 kb Pstl fragmentet af pKK-haFGF, den ikke muterede form, med fragmentet pKK-haFGF (Ser 16, 83,117), der omfatter codoneme for Ser i stedet for Cys ved stillingerne 83 og 117 under anvendelse af ovennævnte metoder. Transfor« 10 manter analyseres ved Pstl-Sall nedbrydning til bestemmelse af orienterin gen af de ligerede fragmenter. Alle gener sekvenseres ved hjælp af dideo-xymetoden beskrevet af Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467(1977).

15 Udtrykkelse af et muteret aFGF gen udføres med en række forskellige pro-motor-udtrykkelsessystemer i en række forskellige værtsceller. Inden for den foreliggende opfindelses rammer falder også anvendelsen af andre værtsceller og promotor-udtrykkelsessystemer til udtrykkeisen af det intakte muterede aFGF gen. Værtscellerne omfatter bakterier, gær, insekter og pattedyrceller.

20 Antigenerne kan også blive udtrykt i virus. Skønt generne kan udtrykkes i en hel række prokaryotiske celler og forskellige eukaryotiske celler er den foretrukne værtscelle Escherichia coli. Udtrykkelsesvektorerne, der kan anvendes til udtrykkelse af det muterede aFGF omfatter, men er ikke begrænset til pBR322, pPLa2311, pKC30, ptacl 2, Xgt11, CheY, pAS1, pLC24, pSB226, 25 SV40 og pKK223-3, idet pKK223-3 foretrækkes. Escherichia coli udtrykkel-sesvektorer muliggør sædvanligvis translation af en methioninrest bundet til den første aminosyre af det ønskede protein. Opfindelsen omfatter ikke alene mutant r-aFGF med et endestillet methionin, men også mutant r-aFGF, der har både det endestillede methionin fjernet efter translation i sådanne celle-30 typer som gærceller, pattedyrceller eller bakterieceller. Udtykkelsesvektoren kan have inkluderet i DNA sekvensen en eller flere yderligere cistroner, der DK 174961 B1 32 vil forøge udtrykkeisen af aFGF genet (Schoner et al., Proc. natl. Acad. Sci USA 83: 8506-8510 (1986). Den foretrukne konstruktion anvender E. coli tac promotoren, et hybrid mellem regioner af trp promotoren og lac promotoren således som beskrevet af deBoer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 21-25 5 (1983). Plasmid pKK223-3 (Pharmacia), der indeholder tac promotoren og rrnB rRNA transskriptionsterminatoren, blev modificeret for at fjerne det pBR322-afledte Sall restriktionsenzymsted. rmbB rRNA terminatoren har vist sig at muliggøre udtrykkelse med stærke promotorer Gentz et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 78: 4936-4940 (1981); Brosius, Gene 27; 161-172 (1984).

10 pKK223-3 plasmid DNA'et er spaltet med restriktionsenzymer til frembringelse af et 2,7 kb DNA fragment for at frembringe klonen pKK2,7. Det syntetiske aFGF gen er spaltet fra dens pBR322 vektor og overført til pKK2,7 plasmidet efter restriktionsbehandling af pKK2,7 med EcoRI og Sall. Den fremstillede 15 rekombinante, vist i fig. 1, er transformeret i E. coli JM105 (Pharmacia) eller DH5 (BRL) celler og udtrykt.

Den foretrukne forøgende udtrykkelsesvektor vil indeholde en nucleotidse-kvens, den første cistron, ovenfor genet, der koder det andet protein, den 20 anden cistron. Det muterede aFGF vil være den anden cistron. Den første cistron vil sædvanligvis indeholde en Shine-Dalgamo sekvens ovenfor stop-codonen. En forøgende udtrykkelsesvektor kan indeholde men er ikke begrænset til følgende nucleotidsekvens:

25 AATTATGTATCGATTAAATAAGGAGGAAT

TACATAGCTAATTTATTC CTCCTTATTAA (pKK2,7) (cistron 1,2 oligomere) (aFGF) der er en effektiv første cistron til at forøge udtrykkeisen af wild-type eller mu-30 tant aFGF. Den første cistron er indført i den passende pKK-haFGF konstruktion ved EcoRI stedet. Indførslen bevirker i tab af EcoRI kloningsstedet.

DK 174961 B1 33

Den rekombinante transformeres ind i en passende værtscelle, således som de beskrevet ovenfor, og udtrykkes. Denne konstruktion bevirker ca. en 10-fold forøgelse i wild-type eller mutant aFGF udtrykkelse. Plasmlderne indeholdende den forøgende udtrykkelsesvektor betegnes pKK2c-haFGF. Opfin-5 delsen omfatter også kloner indeholdende den forøgende udtrykkelsesvektor som f.eks.: pKK2c-haFGF (ser 16), pKK2c-haFGF (Ser 83), pKK2c-haFGF (Ser 117), pKK2c-haFGF (Ser 16, 83), pKK2c-haFGF (Ser 16, 117), pKK2c-haFGF (Ser 83, 117), pKK2c-haFGF (Ser 16, 83, 117).

10 De muterede udtrykkelseskloner dyrkes ved ca. 37 °C i et passende dyrkningssubstrat, der består af ca. 1% trypton, ca. 0,5% gærekstrakt, ca. 0,5%

NaCI, ca. 0,4% glucose og ca. 50 pg/ml ampicillin. Når den optiske densitet ved 500 nm når ca. 0,5, kan isopropyl-p-D-thiogalactopyranosid (IPTG) tilsættes til opnåelse af en slutkoncentration på ca. 1 mM, og dyrkningen fort-15 sætter ved ca. 37 °C i indtil ca. 24 timer. Cellerne fra 1 liter dyrkningssubstrat høstes ved centrifugering og genopslæmmes i en vaskepuffer indeholdende ca. 100 mM phosphat og ca. 5 mg/ml EDTA. Efter den sidste genopslæmning tilsættes ca. 0,1 mg/ml lysozym, og suspensionen inkuberes under forsigtig omrøring ved ca. 30 °C i ca. 15 minutter. Cellerne indsamles ved cen-20 trifugering og genopslæmmes i en itubrydningspuffer indeholdende ca. 100 mM natriumphosphat ved ca. pH 6,0, ca. 3 mM EDTA, ca. 0,03 mM N-p-toluensulfonyl-L-phenyl-alaninchlormethylketon (TPCK), ca. 0,05 mM pepsta-tin A, ca. 0,05 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), ca. 0,05 mM leupep-tin og ca. 15 pg/ml bovint pancreas trypsininhibitor (BPTI). Cellerne itubrydes 25 enten straks eller fryses og lagres ved -70 °C og itubrydes straks efter optøning ved ca. 2 passager gennem en French trykcelle ved ca. 20.000 psi ved ca. 4 °C. Den supernatante væske opsamles efter centrifugering og lyofilise-res.

30 De muterede aFGF'er renses til homogenitet ved hjælp af en tretrins kromatografimetode, der anvender en kationbyttermatrix efterfulgt af en heparin- DK 174961 B1 34 sepharose affinitetsmatrix efterfulgt af omvendt fase væskekromatografi med høj ydeevne (HPLC). De lyofiliserede supernatante væsker genopslæmmes i phosphatpuffer, ca. 100 mM, ca. pH 6,0 og sættes til en kationbytter, fortrinsvis CM-sephadex, der er bragt i ligevægt med den samme puffer. CM-5 sephadex tilsættes i et forhold på ca. 6,5 ml anbragt harpiks pr. gram protein. Harpiksen opsamles på en cintret glastragt og vaskes tre gange med phosphatpufret saltvand, ca. 100 mM phosphat og ca. 150 mM NaCI ved en pH-værdi på ca. 6. Harpiksen genoplæmmes i den samme puffer, pakkes i en søjle, vaskes og elueres med ca. 600 mM NaCI puffer. Heparin-sepharose 10 bringes i ligevægt med ca. 10 mM phosphatpuffer, pH ca. 7,2 sat til eluatat i et forhold på ca. 1 ml anbragt harpiks pr. 1 mg protein, forsigtig rystet i ca. 1 time ved ca. 4 °C, og harpiks-proteinkomplekset opsamles i en tragt. Harpiksen genopslæmmes i den samme puffer og pakkes i en søjle med 1-2 rumfang pr. time. Søjlen bliver vasket med en puffer indeholdende ca. 10 mM 15 phosphat, pH ca. 7,2 og ca. 0,8 mM NaCI og elueres med 1,5 M NaCI i den samme puffer. Hvert protein blev opsamlet og yderligere renset ved omvendt fase HPLC. Fraktioner anbringes på en HPLC omvendt fase søjle, ca. C3, bragt i ligevægt med ca. 10 mM trifluoreddikesyre (TFA) og eluere med en gradient på fra 0 til ca. 100% 4 mM TFA, ca. 0-67% CH3CN i ca. 30 minutter.

20

Mitogenaktivitet af de rensede muterede rekombinante aFGF'er bestemmes ved inkorporering af 3H-thymidin i DNA celler med cellelinie fibroblaster, fortrinsvis BALB/c 3T3 A31 (American Type Cylture Collection). Mutante proteiner fra plasmider pKK-haFGF (Ser 16) og pKK-haFGF (Ser 83) stimulerede 25 fibroblaster i et niveau lig med eller lavere end ikke-muteret humant aFGF.

Mutant protein pKK-haFGF (Ser 117) viste en stimulerende virkning, der er højere end de ikke-muterede former uden heparin.

En udmærket kontrolleret og særdeles reproducerbar mitogen undersøgel-30 sesmetode kræver at sammenligne de relative specifikke aktiviteter af wild-type haFGF og cys med ser mutanter. Sammenflydende kulturer af BALB/c DK 174961 B1 35 3T3 celler i serumfri dyrkningsvæske blev stimuleret med efterfølgende tofold fortyndinger over mindst 3 log størrelser af aFGF koncentration, der udvidede den fuldstændige opståen af responset fra baggrund til top DNA syntese. En stimulerende enhed beregnes som den mængde aFGF pr. ml, der frembrin-5 ger et halvt maksimalt respons. Den specifikke mitogene aktivitet er antallet af stimulerende enheder pr. mg rent aFGF. Undersøgelsen er yderligere standardiseret ved at fortynde stamopløsninger til ca. 50 pg aFGF/ml af TFA/CH3CN eller mindre. Fortyndingen fjerner eventuel koncentrationsvirkning, således at forskellige prøver kan sammenlignes.

10

Omdannelse af Cys 117, en vilkårlig af de to Cys eller alle Cys rester til Ser bevirker en 7-20 fold forøgelse af proteinets specifikke aktivitet uden heparin.

Selv i nærværelse af heparin er alle 4 multiple mutante mere aktive end wild-type humant r-aFGF med haFGF (Ser 83,117) som den der er ca. 2,7 gange 15 mere aktiv. Skønt heparin stimulerer aktiviteten af wild-type aFGF 20 gange, potentierer den aktiviteten af mutanterne med kun ca. 3- til ca. 5-gange.

Omdannelsen af enten alle, eller af en vilkårlig af to, af tre Cys rester i humant aFGF til Ser bevirker en 7-20 fold forøgelse i den specifikke aktivitet af 20 proteinet uden heparin. Selv i tilstedeværelse af heparin er alle fire multiple mutanter mere aktive end ikke-muteret haFGF, idet haFGF Ser (83,117) er næsten 3 gange mere aktiv.

Muteret rekombinant aFGF kan anvendes til at fremme reparation eller ophe-25 ling af men er ikke begrænset til sår i blødt væv som et resultat af forbrændinger, snitsår eller lacerationer og cutan ulceration sammen med muskelskeletsår som f.eks. knoglebrud, overrivning af ligamenter og sener og inflammation af bursa og sener. Vævsopheling anvendt i foreliggende beskrivelse med krav er defineret som frembringelsen af væv efter stimulering af 30 mesodermal, ectodermal eller neuroectodermal afledte celler med aFGF.

Muteret r-aFGF kan også anvendes til at fremme heling og regenerering af DK 174961 B1 36 brusk og bruskvæv. Administrering af muteret aFGF til anvendelse ved heling af blødt væv herunder hornhinde vil sædvanligvis være ved topisk, subkutant, intravenøs eller interoculær applikation. Bløde væv omfatter alle væv, bortset fra dem, der står i forbindelse med muskel-skeletsystemet som be-5 skrevet ovenfor. Peptiderne ifølge opfindelsen kan administreres med eller uden heparin, fortrinsvis uden heparin, i ca. 0,1 til ca. 100 pg/cm2/dag protein til sårarealet enten topisk eller subkutant ca. 1 til ca. 100 pg/cm3/dag. Den foretrukne tilførselsmængde til topisk administrering er ca. 1 til ca. 10 pg/cm2/dag.

10

Heparin er et sulfateret glycosaminoglycan bestående af lige dele af sukkerarter med D-glusoamin og D-glucoronsyre, der er sulfateret i varierende grad. Det kan får kommercielt i en umodificeret form såvel som i en opløsningsform til direkte terapeutisk anvendelse. Dersom heparin administreres 15 med aFGF til topiske eller subkutane formål er den foretrukne koncentration fra ca. 3 gange til ca. 30 gange mængden (masse) af aFGF administreret pr. dag.

Til genopretning af muskel-skelet og bruskdele eller opheling, administreres 20 det muterede r-aFGF fortrinsvis på stedet for beskadigelsen enten kirurgisk eller ved injektion. Kirurgiske implanter af langsomt frigørende former af det muterede aFGF vil muliggøre en kontinuert frigørelse af vækstfaktoren gennem et længere tidsrum. Metoder til formulering af muteret aFGF til langsom frigørelse er velkendt indenfor fagområdet. Dosismængden til opheling i for-25 bindelse med muskel-skeletskader vil være ca. 10 til ca. 100 pg/cm3/dag.

Mutant r-aFGF kan yderligere anvendes til at fremme genoprettelsen af in vivo vaskulær vævsopheling, som f.eks. vækst af blodkar (angiogenese) eller reparation af blodkar (f.eks. som erstatning for beskadigede endotheliale cel-30 ler) og ved at stimulere endothelial cellevækst på passende substrater til frembringelse af blodkar til implantering. In vivo angiogeneseaktivitet af de DK 174961 B1 37 mutante r-aFGF peptider ifølge opfindelsen udføres ved indre administrering f.eks. subkutant af ca. 1 til 1000 pg/cm3/dag idet den mere foretrukne mængde er ca. 10 til ca. 100 pg/cm3/dag. Det foretrukne område for tilførsel til genopretning af overfladen er ca. 100 ng til ca. 100 pg/cm2/dag, idet det mest 5 foretrukne område er ca. 1 til ca. 10 pg/cm2/dag. Reparation af store kar udføres med en enkelt dosis på ca. 0,1 til ca. 100 ng/cm3 eller ved kontinuert infusion af ca. 1 til ca. 1000 pg/cm3/dag. In vitro vækst af endotheliale celler på passende substrater til frembringelse af blodkar udføres ved administrering af ca. 1 til ca. 10 ng/ml/dag.

10

Mutant r*aFGF kan også anvendes ved in vivo induktion af plaminogen aktivator af vaskulære endotheliale celler til behandling af thrombotiske anfald. Thrombotiske anfald bevirker dannelse af thrombi inde i blodkarrene, der kan resultere i thrombotiske hjerteslag, dybvenethrombose, myocardial infarkt og 15 andre medicinske tilstande, der kan forårsage necrose af væv og ofte på længere sigt døden for patienten. Nedbrydning af forud dannede koagler og forhindringen af yderligere koageldannelse kan kontrolleres ved hjælp af mutant r-aFGF, hvorved men forøger behandlingen af thrombotiske anfald. Forbehandling med mutant r-aFGF kan også anvendes til at forhindre dannelsen 20 af koagler i dyr, herunder mennesker, der har en stor risiko for koageldannelse. Det ønskede dosisområde af mutant r-aFGF til behandling af thrombotiske anfald er ca. 10 pg -10 mg/kg/dag.

Muteret og wild-type r-aFGF kan også anvendes til at fremme genopretning 25 af centrale og perifere nervevæv herunder opretholdelse og stimulering hip-pocampale neuroner, og neuroner, der er beskadigede eller ødelagt ved Alzheimer's sygdom og motoriske og sanse neuroner, hvis ødelæggelse forårsager lammelse. Beskadigede nervevæv kan stimuleres med muteret eller wild-type aFGF til at frembringe yderligere neuroner ved mitose af neu-30 roblaster for at genbefolke de beskadigede nerver i området og for at fremme neuritudvækst fra neuronerne. Peptiderne kan også administreres som be- DK 174961 B1 38 skrevet til opheling af sår af enten blødt eller væv fra muskel-knoglevæv.

Til topisk anvendelse kan bruges forskellige farmaceutiske præparater til administrering af den aktive forbindelse ifølge opfindelsen. Sådanne præpa-5 rater omfatter men er ikke begrænset til salver som f.eks. hydrofil petrolatum eller polyethylenglycolsalve; pastaer, der kan indeholde gummiarter som f.eks. xanthangummi; opløsninger som f.eks. alkoholiske eller vandige opløsninger; geler som f.eks. aluminiumhydroxid eller natriumalginatgeler; albuminer som f.eks. humane eller animate albuminer; collagener som f.eks.

10 humane eller animalske collagener, celluloser som f.eks. alkylcellulose, hy-droxyalkylcelluloser og alkylhydroxyalkylcelluloser f.eks. methylcellulose, hy-droxyethylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose og hydroxypropylcellubse; poloxamere som f.eks. Pluronic® polyoler som f.eks. Pluronic F-127; tetroner som f.eks. "tetronic" 1508 og alginater som 15 f.eks. natriumalginat. De farmaceutiske præparater indeholder en eller flere af de muterede aFGF forbindelser i mængder på ca. 0,1 til ca. 100 pg/ml.

Til ikke-topisk anvendelse administreres det mutante r-aFGF sammen med farmaceutisk acceptable bærestoffer eller fortyndingsmidter som f.eks.

20 phosphatpuffer, saltvand, phosphatpufret saltvand, Ringer's opløsning og lignende i et farmaceutisk præparat efter standard farmaceutisk praksis.

Det muterede aFGF’s evne til at stimulere deling i forskellige celletyper herunder fibroblaster, vaskulære og corneale endotheliale celler og lignende 25 bevirker, at disse peptider er værdifulde som farmaceutiske midter. Forbindelserne kan anvendes til at behandle sår på pattedyr, herunder på mennesker ved at administrere det muterede r-aFGF ifølge opfindelsen til patienter der har behov for en sådan behandling.

30 Følgende eksempler illustrerer opfindelsen nærmere.

DK 174961 B1 39 EKSEMPEL 1 Oliaonucleotidsvntese 5 Oligonucleotider blev syntetiseret således som beskrevet Matteucci og Ca-ruthers, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191 (1981); Beaucage og Caruthers, Tetrahedron Letters 22:1859-1862 (1981). Basesekvenserne af de syntetiserede oligonucleotider er angivet i tabel VII, IX og XI.

10 EKSEMPEL 2

Samling af aFGF genet

De bovine oligonucleotider fra eksempel 1 blev samlet som to adskilte enhe-15 der, den N-endestillede halvdel (231 bp) og den C-endestillede halvdel (209 bp). De to halvdele blev herefter kombineret til det intakte syntetiske gen, se tabel VI. Først blev oligonucleotiderne kinasebehandlet i følgende reaktionsblanding: 70 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 10 mM MgCh, 33 μΜ ATP, 0,3 enheder T4 polynucleotidkinase pr. μΙ, og 2,5 pmol oligonucleotid pr. μΙ. Blan-20 dingen blev inkuberet 1,5 timer ved 37 °C og herefter yderligere 1 time efter at have til at blandingen 0,2 enheder/μΙ kinase og ATP til opnåelse af en koncentration på 100 mM. Til radioaktiv mærkning indeholdt den oprindelige blanding 37 nCi/μΙ [γ-32Ρ]-ΑΤΡ.

25 Annealingen og ligationerne blev foretaget ved to adskilte reaktioner. Til hver reaktion blev 100 pmol af hver af de 8 oligonucleotider tilsat. Ved en reaktion var oligonucleotiderne, der udgør en streng af det C-endestillede eller N-endestillede halve gen, kinasebehandlet med undtagelsen af det meste 5' oligonucleotid. Til den anden reaktion blev oligonucleotiderne, der udgør den 30 modsatte streng, kinasebehandlet, atter bortset fra det meste 5’ oligonucleotid. Således blev ved hver reaktion 3 oligonucleotider kinasebehandlet og 5 DK 174961 B1 40 blev ikke. Når kinasebehandlede oligonucleotider blev anvendt, blev 1 pmol 32P-mærket oligonucleotid også tilsat til senere identifikation af slutprodukter-ne. Hver reaktion indeholdt 200 pi med 70 mM Tris Ph 7,6, 5 mM DTT, 10 mM MgCI2 og 30 μΜ ATP. Oligonucleotiderne blev annealet ved opvarmning 5 til 90 °C i 4 minutter, herefter blev reaktionsblandingen straks overført til 60 °C og henstod for langsomt at afkøle til 30 °C. Ligation blev foretaget i 400 μΙ indeholdende 60 mM Tris pH 7,6,10 mM DTT, 10 mM MgCI2,1 mM ATP og 0,03 enheder T4 DNA ligase pr. μΙ ved at inkubere ved 20 °C i 1,5 timer.

10 Polyacryiamidgelelektrophorese blev foretaget for at rense de ligerede oligonucleotider. De ligerede oligonucleotider blev udfældet med ethanol, atter opløst i 20 μΙ 80% formamid, 50 mM Tris-borat pH 8,3, 1 mM EDTA, 0,1 vægt/rumfang-% xylencyanol og 0,1 vægt/rumfang-% bromphenolblåt. Hver prøve blev opvarmet 3 minutter ved 90 °C og elektrophoresebehandlet i en 15 10% urinstof-polyacrylamidgel ved 75 watt i 5 timer. Oligonudeotidbåndene blev visualiseret ved eksponering af gelen på røntgenfilm.

231 basebåndene fra hver omsætning til fremstilling af N-endestillingen blev udskåret af gelen, kombineret og elueret ved 4 °C i 1 ml 0,5 M ammonium-20 acetat, 1 mM EDTA pH 8. Det eluerede DNA blev udfældet med ethanol og atter opløst i 30 μΙ 70 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT og 10 mM MgCb- 209 basebåndene fra C-endestillingen blev elueret på samme måde.

De gelrensede oligonucleotider blev annealet inden transformation ved op-25 varmning til 90 °C i 4 minutter og langsom afkøling til 20 °C. Idet man antog en 5% genudvindelse fra de oprindelige udgangs oligonucleotider, blev 300 fmol og 100 fmol af udvundne annealede 231 bp oligonucleotider hver ligeret til 100 fmol af agarosegelrenset 3,9 kb EcoRI-BamHI pBR322 fragment DNA i 20 μΙ 25 mM Tris pH 7,8,1 mM DTT, 10 mM MgCI2, 0,4 mM ATP med 1 30 enhed T4 DNA ligase i 1 time ved 20 °C. De annealede 209 bp oligonucleoti- DK 174961 B1 41 der blev ligeret til agaroserenset 3,9 kb BamHI-Sall pBR322 fragment DNA under de samme betingelser som 231 bp fragmenterne. Ligationsreaktionsblandingerne blev fortyndet 1:5 i h^O, og 1 μΙ af fortyndingen blev anvendt til at transformere 20 μΙ kompetente E. coli RR1 celler (BRL) efter leverandø-5 rens forskrifter. Transformanterne blev selekteret for vækst i ampicillin og afsøgt for tilstedeværelsen af 231 bp EcoRI-BamHI eller 209m bp BamHI-Sall indskuddet ved restriktionsanalyse af mini-lysat plasmidpræparater.

DNA sekvensen af kloner indeholdende indskuddet af passende størrelse 10 blev bestemt under anvendelse af den kemiske DNA sekvenseringsmetode beskrevet af Maxam og Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-564 (1977). Da ingen af 231 bp klonerne havde den korrekte sekvens, blev en klon indeholdende den korrekte sekvens fremstillet på følgende måde. En klone med den korrekte sekvens mellem Kpnl og BamHI stederne blev spal-15 tet med Kpnl og med Sall, der spalter i pBR322 vektoren. 400 bp båndet blev gelrenset og ligeret til 3,8 kb Kpnl-Sall båndet af en anden klon, der indeholdt den korrekte sekvens fra EcoRI stedet til Kpnl stedet af aFGF genindskuddet. Efter transformation blev en frembragt klon sekvensbedømt for at sikre, at man havde opnået den ønskede sekvens.

20

Da man havde opnået en klon indeholdende den korrekte 209 bp sekvens var yderligere manipulation af disse kloner ikke nødvendig. Det endeligt fremstillede fuldlængdede aFGF syntetiske gen blev klonet ved spaltning af den N-endestillede halv-klon med BamHI og Sall, behandling med alkalisk 25 phosphatase og ligering af dette til det genrensede 209 bp BamHI-Sall indskud af den C-endestillede halv-klon. Dette ligerede materiale blev anvendt til transformation af kompetente RR1 celler som beskrevet tidligere.

EKSEMPEL 3 DK 174961 B1 42

Mutaaenese af det bovine aFGF gen til det humane aFGF gen 5 For at lette mutagenesen af det bovine aFGF gen blev det syntetiske gen fra eksempel 2 overført til M13mp19, en enkeltstrenget DNA bakteriofag vektor.

Standard mutagenesemetoder blev anvendt som beskrevet af Zoller og Smith, Methods in Enzymology, 100: 468*500 (1983); Norris et al., Nucleic Acids Research, ϋ: 5103-5112 (1983); og Zoller and Smith, DNA 3: 479-488 10 (1984). Det bovine pKK-aFGF plasmid blev spaltet med EcoRI og Sall, og det fremstillede 440 bp fragment blev agarosegelrenset som beskrevet i eksempel 2. Vektor M13mp19 RF DNA (BRL) blev spaltet med de samme to endonucleaser, og enderne blev herefter dephosphoryleret i 100 μ110 mM Tris pH 8,0 puffer med 100 enheder bakteriel alkalisk phosphatase. EN liga-15 tion blev udført under anvendelse af 50 ng af det behandlede vektor DNA og 12 ng af aFGF genfragment DNA'et i 10 μΙ 25 mM Tris pH 7,8,10 mM MgCh, 1 mM DTT, 0,4 mM ATP, med 2 enheder T4 DNA ligase i 16 timer ved 4 °C. Reaktionsblandingen blev fortyndet 1:5 i H20, og 1 μΙ af fortyndingen blev anvendt til at transformere 20 μΙ kompetente E. coli DH5 celler (BRL) efter 20 leverandørens forskrifter. Cellerne blev udhældt på plade med E. coli JM105 (Pharmacia) værtsceller i 0,03% X-gal og 0,3 mM IPTG; efter inkubation ved 37 °C blev farveløse plaques isoleret. 1 fag klon indeholdende det bovine aFGF gen blev selekteret, M13mp19-baFGF.

25 8 oligonucleotider blev designet til at udgøre den humane sekvens og synte tiseret, se tabel IX. Oligomer 8 indeholder en yderligere mutation, hvori thy-min ved plads 386 i det bovine gen er erstattet med cytosin i det humane gen. Denne mutation muliggør indarbejdelse af et restriktionssted uden at ændre den humane aFGF aminosyresekvens.

De humane oligomere 1, 2, 3, 4, 6 og 8 blev phosphorylerede, og 15 pmol af 30 DK 174961 B1 43 hver blev annealet hver for sig til 0,5 pmol M13mp19-baFGF enkeltstrenget fag DNA i 10 pi 20 mM Tris pH 7,5,10 mM MgCfe, 50 mM NaCI, 1 mM DTT i 10 minutter ved 65 °C efterfulgt af 10 minutter ved 23 °C. Lukkede cirkulære dobbeltstrengede molekyler blev herefter fremstillet i 20 ml 20 mM Tris pH 5 7,5, 10 mM MgCI2, 25 mM NaCI, 5,5 mM DTT, 0,5 mM ATP, 0,25 mM dATP, . 0,26 mMd CTP, 0,25 mM dGTP, 0,25 mM dTTP, under anvendelse af 1 en hed T4 DNA ligase og 2 enheder DNA polymerase I klenow fragment ved inkubering ved 15 °C i 17 timer. Præparaterne blev hver især anvendt til at transformere kompetente JM105 celler, og de fremkomne transformante pla-10 ques blev selekteret ved hybridisering med den passende oligomer, der var blevet radiomærket under anvendelse af 32P-ATP og polynucleotidkinase. Betingelserne for hybridisering blev optimeret for hver probe for at forhindre dannelsen af hybrider, der indeholdt enkeltbaseændringer. Enkeltstrenget DNA blev isoleret fra fagklonen indeholdende de humane oligomer 4 mutati-15 oner, og ovennævnte metode blev gentaget under anvendelse af den humane oligomer 5 til frembringelse af en klon, der indeholdt både oligomer 4 og 5 mutationer, I de efterfølgende behandlinger blev de bovine-til-humane sekvensmutatio-20 ner i disse M13-baserede kloner kombineret til en pBR322-baseret klon. RF DNA'er blev fremstillet ud fra kloner indeholdende baseændringerne specificeret af humane oligomere 1,2, 6 og 8. DNA’et af den humane 1 mutant klon blev spaltet med EcoRI, enderne blev dephosphoryleret med bakteriel alkalisk phosphatase, og DNA’et blev spaltet med Hindlll.

25

Det humane 2 mutant DNA blev spaltet med Hindlll, behandlet med phosphatase og herefter spaltet med BamHI. Det humane 6 mutant DNA blev spaltet med BamHI, phosphatasebehandlet og derefter spaltet med Apal. På samme måde blev det humane 8 mutant DNA spaltet med Apal, 30 enderne blev dephorphoryleret, og DNA'et blev spaltet med Sall. Disse fire DNA præparationer blev elektrophoresebehandlet gennem 2% agarose, og DK 174961 B1 44 fragmenterne på henholdsvis 45 bp, 190 bp, 135 bp og 70 bp fra de mutante DNA’er indeholdende henholdsvis humane 1,2, 6 og 8 mutationer blev elue-ret fra gelen. Omtrent 60 fmol af hvert fragment blev samlet ligeret til ca. 60 fmol af et gelrenset 3,7 kb EcoRI-Sall fragment fra pBR322 i 5 ιηλ 25 mM 5 Tris pH 7,8,10 mM MgCb, 1 mM DTT, 0,4 mM ATP, med 1,5 enheder T4 DNA ligase i 16 timer ved 12 °C. Reaktionsblandingen blev fortyndet 1:5 i H2O, og 1 pi af fortyndingen blev anvendt til at transformere 20 μΙ kompetente E. coli DH5 celler (BRL) som anbefalet af leverandøren. En klon indeholdende mutationerne, der er specificeret af alle 4 mutante oligomere, blev se-10 lekteret ved hybridisering med radiomærkede prober fremstillet ud fra hver af de oligomere. 140 bp Kpnl-BamHI DNA fragmentet isoleret fra spaltet RF DNA af den humane 3 mutant M13 klon blev ligeret til endonucleasespalt-ningsprodukter af dette human 1 -2-6-8 mutant DNA og transformeret ind i DH5 kompetente celler til frembringelse af en klon med de humane 1-2-3-6-8 15 mutationer. BamHI-Pstl nedbrydningsfragmenterne af denne sidstnævnte klon blev ligeret til BamHI-Pstl nedbrydningsfragmenterne af RF DNA fra den humane 4-5 M13-baserede klon, og ligationsblandingen blev anvendt til at transformere DH5 kompetente celler. En klon indeholdende de humane 1-2- 3-4-5-6-8 mutationer blev selekteret ved oligomer hybridisering, og aFGF gen 20 EcoRI-Sall DNA fragmentet af dette rekombinante plasmid blev ligeret til phosphatase-behandlet EcoRI-Sall-spaltet RF DNA af M13mp18 (BRL).

Kompetente DH5 celler blev transformeret med dette ligerede DNA, og de transformerede celler blev udstrøget på JM105 værtsceller til frembringelse af en M13 klon. Det enkeltstrengede fag DNA fra denne klon blev annealet 25 med den humane 7 oligomer, og en M13 klon indeholdende alle de ønskede mutationer blev opnået i overensstemmelse med den ovenfor beskrevne metode. RF DNA blev fremstillet ud fra denne klon og spaltet med EcoRI og Sa ll. Det fremkomne 440 bp bånd blev gelrenset og ligeret til 2,7 kb EcoRI-Sall DNA fragmentet af denne pKK 2,7 tac promotor udtrykkelsesvektor. Dette 30 DNA blev anvendt til at transformere kompetente DH5 celler, hvorved der blev frembragt den humane pKK-aFGF udtrykkelsesklon, der anvendtes til DK 174961 B1 45 fremstilling af den humane form af aFGF.

EKSEMPEL 4 5 Mutaqenese af cvstein codonerne af aFGF genet

En human aFGF enkeltstrenget bakteriofag rekombinant klon, M13mp18-haFGF, fra eksempel 3 blev muteret under anvendelse af metoderne angivet af Zollerog Smith, Methods in Enzymology, 100: 468-500 (1983); Norris et 10 al., Nucleic Acids Research, H: 5103-5112 (1983); og Zoller and Smith, DNA 3: 479-488 (1984). Tre oligonucleotider blev designet til at specificere serin-codonerne i stedet hver af cysteincodonerne fra det humane aFGF gen ved stillingerne 16, 83 og 117. De fremstillede oligomere er angivet i tabel XI med de muterede baser understreget.

15

De oligomere blev phosphoryleret, og 15 pmol af hver blev annealet hver for sig til 330 ng M13mp18-haFGF enkeltstrenget DNA i 10 pi 20 mM Tris pH 7,5,10 mM MgCI2l 50 mM NaCI og 1 mM DTT i 10 minutter ved 65 °C efterfulgt af 10 minutter ved 23 °C. En anden streng DNA blev syntetiseret under 20 anvendelse af annealede oligomer som primer i 20 μΙ 20 mM Tris pH 7,5,10 mM MgCI2, 25 mM NaCI, 5,5 mM DTT 0,5 mM ATP, 0,25 mM dATP, 0,26 mM dCTP, 0,25 mM dTTP under anvendelse af 3 enheder T4 DNA ligase og 0,4 enheder DNA polymerase I klenow fragment ved inkubering ved 12 °C i 17 timer. De tre præparationer blev hver især fortyndet 1:5 i H20, og 1 μΙ for-25 tynding blev anvendt til at transformere 20 μΙ prøver af kompetente E. coli DH5 celler (Bethesda Research Labs) som anbefalet af leverandøren. Transformerede celler blev udhældt på en plade medet bunddække af E. coli JM105 celler, der virker som værtsceller for M13 viruset. De fremkomne transformante plaques blev selekteret ved hybridisering med den passende 30 oligomer, der var radiomærket under anvendelse af 32P-ATP og polynucleo-tidkinase. Betingelserne for hybridisering blev optimeret for hver probe for at DK 174961 B1 46 forhindre tilbageholdelse af hybrider, der indeholdt enkeltbaseændringer.

Enkeltstrenget DNA blev isoleret fra fagkloner indeholdende hver af cystein-til-serin mutationerne til DNA sekvensanalyse under anvendelse af dideoxy-5 nucleotidkædeafslutningsmetoden beskrevet af Sanger et al., proc. Natl.

Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977). RF DNA'er blev herefter fremstillet ud fra tre kloner, der hver indeholdt en af de specificerede mutationer, og efter spaltning med EcoRI og Sall blev de frigjorte FGF indskud isoleret ved agro-segelelektrophorese. De rensede 440 bp indskud blev hver ligeret til 2,7 kb 10 EcoRI-Sall DNA fragmentet af pKK2,7 tac promotorudtrykkelsesvektoren i 10 pi 25 mM Tris pH 7,8, 10 mM MgCfe, 1 mM DTT, 0,4 mM ATP, med 3 enheder T4 DNA ligase i 2 timer ved 14 °C. De ligerede DNA'er blev anvendt til at transformere kompetente DH5 celler, og kloner indeholdende DNA med de muterede Cys codoner blev selekteret ved hybridisering til den passende 15 oligomer. FGF gen indskud i plasmid DNA'et fra disse kloner blev sekvense-ret fuldstændigt under anvendelse af den kemiske metode beskrevet af Ma-xam og Gilbert, Methods in Enzymology 65:499-560 (1980). En klon indeholdt kun den enkelte baseændring fra den oprindelige humane aFGF ud-trykkelsesklon, hvor der var frembragt en serin codon i stedet for en cystein-20 codon ved stilling 83 og er betegnet som pKK-haFGF (Ser 83).

Klonerne, der indeholder hver af de andre to cystein-til-serin mutationer, indeholdt også yderligere ikke-specifikke forandringer. For at opnå de ønskede enkelte basemutanter, blev følgende ligationer og transformationer udført.

25 Det 410 bp Hindlll-afiedte DNA fragment af klonen med serin codonen ved stilling 16 blev isoleret og ligeret til det 2,7 kb Hindlll-afiedte fragment af den oprindelige pKK-haFGF udtrykkelsesklon. Det 230 bp Ncol-Sall-afledte DNA fragment af klonen indeholdende serin codonen ved stilling 117 blev isoleret og ligeret til det 2,9 kb Ncol-Sall-afledte fragment af pKK-haFGF. Hver af 30 disse ligerede prøver blev anvendt til at transformere kompetente DH5 celler; hybridiserings- og sekvenseringsmetoder blev anvendt for at identificere de DK 174961 B1 47 to ønskede enkeltbase mutanter betegnet pKK-haFGF (Ser 16) og pKK-haFGF (Ser 117). Disse tre kloner blev anvendt til produktion af Ser 16, Ser 83 og Ser 117 formerne af det humane aFGF.

5 Plads-dirigerede mutanter af humant aFGF med to eller tre cystein (Cys) rester omdannet til serin (Ser) rester blev konstrueret ved at kombinere restriktionsfragmenter af de ikke-muterede wild-type og Ser (16), Ser (83) og Ser (117) mutante syntetiske gener, og disse er blevet klonet i pKK2,7 og sub-klonet i M13mp18 som beskrevet ovenfor. pKK-haFGF (Ser 16, 83) og pKK-10 haFGF (Ser 16,117) rekombinanterne blev først konstrueret ved at indføre 0,23 kb EcoRI-BamHI fragmentet af M13mp18 (Ser 16), der omfatter codo-nen for Ser 16, i pKK2,7 efterfulgt af indførsel af 0,2 kb BamHI-Sall fragmenterne enten fra M13mp18 (Ser 83) eller fra M13mp18 (Ser 117). Da pKK2,7 vektoren indeholder 2 BamHI steder, et i multikloningssekvensen og det an-15 det ovenfor tac promotoren, blev en modificeret pKK2,7 vektor, hvori det andet ovenfor liggende BamHI sted var fjernet, anvendt ved disse konstruktioner. Efter nedbrydning med de tilsvarende restriktionsenzymer, efterfølgende ligation og transformation af AB1899 kompetente celler (E. coli Genetic Stock Center), blev ampicillin resistente kloner selekteret og afsøgt for sådanne, 20 der indeholder plasmider med den forventede molekylvægt for rekombinanterne (3,1 kb).

Det mutante haFGF (Ser 16, 83,117) blev konstrueret ved at erstatte 0,13 kb Sphl-Sall fragmentet af pKK-haFGF (Ser 16, 83) med det tilsvarende frag-25 ment af pKK (Ser 117), der koder for Ser i stedet for Cys i stilling 117. 3 kb Sphl-Sall fragmentet af pKK (Ser 16, 18) blev renset ved præparativ agaro-segelelektrophorese, elektroeluering og ligeret til 0,13 kb Sphl-Sall fragmentet af pKK (Ser 117) oprenset fra en 5 % polyacrylamidgel på samme måde.

De rensede fragmenter blev ligeret, og rekombinanter blev selekteret for am-30 picillinresistens efter transformation af AB1899 celler.

DK 174961 B1 48 ΤΗ konstruktion af pKK-haFGF (Ser 83,117) blev 0,3 kb Pstil fragmentet af pKK haFGF erstattet med det samme fragment fra pKK-haFGF (Ser 16, 83, 117), der omfatter codonerne for Ser i stedet for Cys ved stillingerne 83 og 117 under anvendelse af fundamentalt den samme strategi. AB1899 trans-5 formanter selekteret for ampicillin resistens blev analyseret ved Pstl-Sall nedbrydning for at fastlægge orienteringen af de ligerede fragmenter. Alle mutante gener blev sekvenseret ved dideoxymetoden under anvendelse af "Sequence" kit fra USB Corp.

10 EKSEMPEL 5

Udtrvkkelse af det syntetiske bovine aFGF gen 15 De intakte aFGF gener fra eksempel 4 blev inkorporeret i en modificeret pKK223-3 plasmid. pKK223-3 plasmidet (Pharmacia) indeholder tac promotoren, der er et hybrid mellem regionerne for trp promotoren og lac promotoren, deBoer et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983). Dette plasmid indeholder også rmB rRNA transskriptionsterminatoren, en stærk 20 terminatorsekvens der har vist at muliggøre udtrykkelse fra stærke promotorer Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4936-4940 (1981);

Brosius, Gene 27: 161-172 (1984). pKK223-3 plasmidet blev modificeret for at fjerne den pBR322-afledte Sall restriktionsenzymplads. Dette blev udført ved at spalte pKK223-3 plasmid DNA med Ndel og Narl, stumpafslutte DNA 25 fragmentet med Klenow DNA polymerase og atter ringslutte 2,7 kb DNA fragmentet til frembringelse af klon pKK2,7. Det syntetiske aFGF gen blev herefter spaltet fra dets pBR322 vektor og overført til pKK2,7 efter af have begrænset udtrykkelsesvektoren med EcoRI og Sall. Denne konstruktion anbringer det begyndende methionin af det syntetiske gen 11 baser nedenfor 30 Shine-Dalgarno ribosom bindingsstedet. De fremkomne rekombinante vektorer som angivet eksempelvis i fig. 1 blev transformeret ind i E. coli JM105 celler og også ind i E. coli DH5 celler.

DK 174961 B1 49 E. coli DH5 celler.

Udtrykkelsesklonerne blev dyrket ved 37 °C i LB bouillon (1% trypton, 0,5% gærekstrakt, 0,5% NaCI) indeholdende 0,4% glucose og 50 pg/ml ampicillin.

5 Når den optiske densitet ved 550 nm nåede 0,5 blev IPTG tilsat til opnåelse af 1 mM, og dyrkningen fortsatte 3 timer ved 37 °C. Cellerne blev høstet ved centrifugering ved 10.000 x g i 20 minutter, og cellerne fra 1 liter af dyrkningskulturen blev genopslæmmet i glycerol/phosphatpufret saltvand 1:1 og hurtigt frosset i et tøris/ethanolbad og lagret natten over ved -70 °C.

10 EKSEMPEL 6

Vektor til forøget udtrvkkelse 15 Forøgede niveauer for udtrykkelse af de muterede former af aFGF fra eksempel 4 blev tilvejebragt ved modifikation af udtrykkelsesvektoren fra eksempel 3 ved at indføre en yderligere cistron ovenfor den aFGF kodende sekvens. To oligonucleotider blev syntetiseret med sekvenserne som angivet på side 35. Når disse oligomere er annealet giver de 5’ forlængelser på 4 20 baser, der er komplementære med forlængelserne opnået ved EcoRI spaltning, en 7 codon åben læseramme efterfulgt af ATG translationsinitiationsco-donen og forud for en TAA stop codon, og et yderligere Shine-Dalgarno ribosombindingssted beliggende indenfor den åbne læseramme ovenfor stopco-donen. Under anvendelse af 1 pmol af hver oligomer blev de oligomere an-25 nealet sammen i 20 pi DNA ligasepuffer ved at opvarme til 70 °C i 10 minutter og langsomt afkøle. Den annealede blanding, 0,3 pmol, blev ligeret til 0,1 pmol EcoRI-spaltet pKK-haFGF plasmid DNA i et slutrumfang på 25 μΙ indeholdende 3 enheder T4 DNA ligase (Pharmacia) i 2,5 timer ved 14 °C. Det ligerede DNA, 5 ng, blev anvendt til at transformere kompetente E. coli 30 JM105 celler. Transformanterne blev afsøgt ved restriktionsanalyse, da Eco RI pladsen er gået tabt ved dette indskud og ved immunoaftryksanalyse. Ud- DK 174961 B1 50 trykkelsesvektoren af en klon, der demonstrerer højere niveauer for FGF produktion, blev sekvenseret ved hjælp af den kemiske metode beskrevet af Maxan og Gilbert, supra, for at verificere det korrekte indskud af de nye cistronsekvenser. Herefter blev denne højudtrykkelses pKK2c-haFGF vektor 5 overført til E. coli DH5 ved hjælp af transformationsmetoder.

For at udtrykke f.eks. det haFGF (Ser 117) mutante gen i denne højudtryk· kelsesvektor blev 0,23 kb Ncol-Sall fragment af pKK-haFGF (Ser 117) ligeret til 2,5 kb Ncol-Sall fragment af pKK2c-haFGF og transformeret ind i kompe-10 tente celler. De andre muterede haFGF'er blev overført til den to cistronhøj-udtrykkelsesvektor på lignende måde, idet passende restriktionsfragmenter indeholdende wild-type sekvenserne af pKK2c-haFGF blev erstattet med analoge restriktionsfragmenter af det muterede haFGF.

15 EKSEMPEL 7

Ekstraktion og rensning af muteret aFGF

De frosne celler fra eksempel 5 blev optøet og genopslæmmet i en tilstræk-20 kelig mængde til at opnå 50 ml med 100 mM phosphatpuffer, pH 7,2, 5 mg/ml EDTA og cellerne blev opsamlet ved centrifugering ved 28.000 x g i 5 minutter. Cellerne blev vasket en anden gang, opsamlet ved centrifugering og genopslæmmet i 50 ml af den samme puffer. Ekstinktionerne af de tre mutante stammesuspensioner ved 660 nm var stamme pKK-haFGF (Ser 25 117), 103; stanne pKK-haFGF (Ser 16), 108; stamme pKK-haFGF (Ser 83), 59. Hver prøve blev tilsat 0,1 mg/ml lysozym og blev inkuberet 15 minutter under forsigtig omrystning ved 30 °C. Cellerne blev opsamlet ved centrifugering og genopslæmmet i 50 ml itubrydningspuffer bestående af 100 mM phosphat; pH 6,0, 3 mM EDTA; 0,05 mM, TPCK, 0,05 mM, Pepstatin A, 0,05 30 mM, Leupeptin og 15 pg/ml BPTI. Hver cellesuspension blev holdt ved 4 °C og itubrudt ved to passager gennem en forud afkølet French trykcelle ved DK 174961 B1 51 20.000 psi ved 4 °C. Suspensionerne af de iturevne celler blev centrifugeret i 15 minutter ved 15.000 omdrejninger pr. minut i SS-34 Sorvall rotor og i 60 minutter ved 45.000 omdrejninger pr. minut i en 70 Ti rotor i en Beckman ul-tracentrifuge ved 4 °C. Den supematante væske blev opsamlet, ekstinktio-5 neme ved 280 nm for et 55 ml rumfang blev bestemt: pKK-haFGF(Ser 117), 44; pKK-haFGF (Ser 16), 40 og pKK-haFGF (Ser 83), 23, og prøverne blev frosset ved -70 °C.

De supematante væskedele blev optøet ved tilsætning af 200 ml 100 mM 10 phosphatpuffer, pH 6,0, indeholdende CM-Sephadex i et forhold på 6,5 ml bundfældet harpiks pr. gram protein (idet man antager absorbans gennem en 1 cm pude af 1 mg/ml proteinopløsning som 1,0). Prøven blev opsamlet på en sintret glastragt og vasket tre gange med 200 ml 100 mM phosphatpuffer indeholdende 150 mM NaCI ved en pH-værdi på 6,0. Harpikskagen blev 15 genopslæmmet i 200 ml af den samme puffer, pakket i en søjle ved 12 ml x time'1 pr. cm2 tværsnits-ArGA og vasket med denne strømningshastighed ved 150 mM phosphat indeholdende 600 mM NaCI. Fraktionerne, der indeholdt proteinet, blev elueret med 600 mM NaCI puffer og slået sammen, pH indstillet til 7,2, og ledningsevnen blev indstillet med afioniseret vand til 10 pS 20 x cm'1. Heparin-Sepharose (frisk fremstillet) bragt i ligevægt med 10 mM

phosphat pH 7,2 (ledningsevne 1,3 pS x cm'1) blev herefter tilsat i en mængde på 1 ml bundfældet harpiks pr. mg protein (under anvendelse af den samme antagende ekstinktionskoefficient som ovenfor), suspensionen blev forsigtigt rystet i 1 time ved 4 °C, og harpiksen blev opsamlet i en tragt, gen-25 opslæmmet i samme puffer og pakket i en søjle med 1-2 søjlerumfang pr. time. Den pakkede søjle blev renset med 10 mM phosphat, 0,8 M NaCI pH 7,2 ved samme strømningshastighed, indtil ekstinktionen af eluatet ved 280 nm aftog til en stabil værdi, til indenfor 0,01 optiske absorbansenheder over elueringspufferen, og herefter blev pufferen ændret til 10 mM phosphat, 1,5 30 M NaCI pH 7,2. Fraktionerne, der indeholdt det protein, der eluerede med 1,5 M puffer (kontrolleret ved ekstinktion ved 280 nm) blev slået sammen og an- DK 174961 B1 52 bragt på en C3 omvendt fase HPLC søjle bragt i ligevægt med 10 mM TRA og elueret med en gradient fra 0-67% CH3CN i 30 minutter.

Rensningsresultaterne for de mutante stammer er angivet nedenfor: 5 pKK-haFGF tSer 161

Fraktionerne 25-31, der eluerede fra Cm-Sephadexsøjlen med 0,6 M NaCI puffer i et totalrumfang på 24 ml og et proteinindhold på 3,5 mg, blev indstillet 10 til 125 ml med afioniseret vand (slutledningsevne: 7 mS/cm) og 4 ml heparin-Sepharose blev tilsat. Søjlen blev kørt ved 6 ml/time. Fraktionerne 55-57 elueret med 1,5 M NaCI blev indsprøjtet på C3 søjlen. Fra denne søjle blev en hovedtop opsamlet med et proteinindhold på 80 pg.

15 pKK-haFGF (Ser 831

Fraktionerne 19-33, der eluerede fra Cm-Sephadexsøjlen med 0,6 M NaCI puffer i et totalrumfang på 40 ml og et proteinindhold på 4,0 mg, blev indstillet til 150 ml med afioniseret vand (slutledningsevne: 10 mS/cm) og 4 ml hepa-20 rin-Sepharose blev tilsat. Søjlen blev kørt ved 6 ml/time. Fraktionerne 40-44 elueret med 1,5 M NaCI blev indsprøjtet på C3 søjlen. Fra denne søjle blev en hovedtop opsamlet med et proteinindhold på 80 pg.

DK 174961 B1 53 pKK-haFGF (Ser 117)

Fraktionerne 19-33, der eluerede fra Cm-Sephadexsøjlen med 0,6 M NaCI puffer i et totalrumfang på 57 ml og et proteinindhold på 11,4 mg, blev indstil-5 let til 250 ml med afioniseret vand (slutledningsevne: 12 mS/cm) og 10 ml heparin-Sepharose blev tilsat. Søjlen blev kørt ved 11 ml/time. Fraktionerne 59-62 elueret med 1,5 M NaCI blev indsprøjtet på C3 søjlen. Fra denne søjle blev en hovedtop opsamlet med et proteinindhold på 614 pg.

10 Proteinprodukterne fra de multiple mutanter blev renset ved samme metoder.

Alle former for aFGF, rekombinant wild-type og mutanterne blev højrensede, da kun enkelte 16 kDa bånd blev observeret efter reduktion og elektrophore-se i SDS 15% polyacrylamidgel ved belastninger 100 gange over detektions-grænsen.

15 EKSEMPEL 7

Biologisk aktivitet af muteret aFGF

20 Den biologiske aktivitet af det rensede r-aFGF fra eksempel 6 blev bedømt under anvendelse af den fibroblast mitogene undersøgelsesmetode modificeret efter Thomas et al., J. Biol. Chem 225: 5517-5520 (1980). BALB/c 3T3 A31 fibroblaster (American Type Culture Collection) blev udsået i 3 x 104 celler pr. 100 μΙ pr. brønd i 96-brønds dyrkningsskåle i dyrkningssubstrat inde-25 holdende 10 % varme-inaktiveret kalveserum og inkuberet i 7 % CO2 (pH

7,35 ± 0,05). Cellerne blev fuldstændig passive ved at erstatte substratet med 1,0 % varme-inaktiveret kalveserum 6 og atter 24 timer senere. 55 timer efter udsåning blev 10 μΙ forsøgsprøver med eller uden 5 pg heparin og 0,11 pg dexamethason tilsat, ved 70 timer blev hver brønd yderligere tilsat 0,2 pCi 30 [methyl-3H]-thymidin (20 Ci/mmol, New England Nuclear) og 0,3 pg umærket thymidin (Sigma), og efter 95 timers forløb blev cellerne bearbejdet til be- DK 174961 B1 54 stemmelse af indarbejdet radiomærke i DNA. Hver dosisresponspunkt var gennemsnit af 4 bestemmelser. Resultaterne af Ser-117 mutanten, den eneste mutantform der viste aktivitet svarende til eller større end wild-typen, er angivet i følgende tabel: 5

TABEL XII

Mitogene respons af BALB/c 3T3 fibroblaster på muteret aFGF

10

Dosis Wild-type Ser-117 mutant (amt/ml) -heparin +heparin -heparin +heparin 3,16 pg 1449 724 2055 883 15 10,0 pg 1917 914 2662 1255 31.6 pg 1547 1007 3076 2748 100 pg 2263 2498 4833 8067 316 pg 2647 14945 11505 44193 1,00 ng 3975 54516 22869 66778 20 3,16 ng 6400 68447 40487 60306 10,0 ng 12665 61294 54163 56326 31.6 ng 21843 56552 70670 59854 100 ng 44744 66816 66802 63856 25 Titreringskurverne blev sammenlignet halvvejs på deres stigning. Wild-type uden heparin når ikke en top, således at topstørrelsen er antaget som observeret for de andre tre toppe, og den halv-maksimale værdi er ekstrapoleret.

DK 174961 B1 55

TABEL XIII

Sammenligninger af koncentrationer nødvendige for at opnå halv-maksimal stimulering 5

Koncentration af 1/2 Prøve Heparin maksimal stimulering WT - 66 ng/ml 10 + 0,56 ng/ml

Ser-117 - 2,3 ng/ml

Mutant + 0,20 ng/ml 15 Alle fortyndinger blev fremstillet ud fra en stamopløsning indeholdende 1,51 mg/ml rensede reaktanter. Ser-117 mutanten er mindst så aktiv som wild-typen i nærværelse af heparin. Aktiviteten af wild-typen er ca. 10 fold større afhængig af heparin end mutanten, som en følge heraf er 90 % af heparinaf-hængigheden af wild-type aFGF elimineret i Ser-117 mutante.

20

Den mitogene undersøgelsesmetode, der anvendes til at bedømme biologisk aktivitet, blev modificeret, således at muteret og wild-type aFGF kunne sammenlignes. Varmeinaktiveret kalveserum blev erstattet med 1 % insulin-selenium-transferin (ITS), 0,4 g L-histidin, 50 μ11M ethanolamin, 1,25 g bo-25 vint serumalbumin med 5,35 mg linolsyre pr. liter 75% DMED, 25% Ham’s F12 indeholdende både penicillin-streptomycin og L-glutamin som beskrevet ovenfor. Fulde dosis-respons undersøgelser blev foretaget som beskrevet ovenfor ved efterfølgende tofold fortyndinger over mindst 3 log størrelsesordener af aFGF koncentration, der fra den fuldstændige stigning af responset 30 fra baggrunden gennem top DNA synteseniveauer. Alle koncentrationspunkter blev foretaget 4 gange på sammenflydende BALB/c 3T3 celler i 96 brønds skåle. En stimulerende enhed blev beregnet som den mængde aFGF pr. ml, DK 174961 B1 56 der frembragte et halv-maksimalt respons. Den specifikke mitogene aktivitet er antallet af sådanne stimulerende enheder pr. mg rent aFGF. Alle prøver af aFGF blev forfortyndet til 50 pg/ml i det samme TFA/CH3CN opløsningsmiddel. Aktiviteterne af wild-type og muteret aFGF er sammenlignet i følgende 5 tabel.

TABEL XIV

DK 174961 B1 57

Gange

Prøve Med heparin Uden heoarin forøgelse 5 WT 5,37 ng/ml 269 pg/ml 20,0 {0,186 x 106) ( 3,72 X 106)

Ser 16 33,9 ng/ml 400 pg/ml 84,8 10 (0,030 x 106) ( 2,50 X 106)

Ser 83 4,36 ng/ml 251 pg/ml 17,4 (0,229 X 106) ( 3,98 X 106) 15 Ser 117 182 ng/ml 240 pg/ml 7,58 (0,549 x 106) ( 4,17 x 106)

Ser 16,83 800 pg/ml 195 pg/ml 4,10 (1,25 X 106) ( 5,13 X 106) 20

Ser 16,117 741 pg/ml 148 pg/ml 5,01 (1,35 X 106) ( 6,76 X 106)

Ser 83,117 295 pg/ml 100 pg/ml 2,95 25 (3,39 x 10é) (10,0 x 106)

Ser 16, 427 pg/ml 107 pg/ml 3,99 83, 117 (2,34 X 106) { 9,35 X 106)

30 De relative stabiliteter af den rekombinante wild-type haFGF, i enkelte Ser mutanter og de multiple Ser mutanter blev bestemt. Mitogene aktiviteter blev målt efter 0,1 og 8 dages inkubation i serumfri DME opløsninger, der normalt anvendes til seriel prøvefortyndinger, der var CCVpufret til pH 7,3 ved 37 °C

DK 174961 B1 58 indeholdende 1 mg/ml humant serumalbumin. Mitogene prøver blev lagret ved 512 ng/ml med eller uden 500 pg heparin/ml svarende til 10-fold koncentrater, hvorfra det højeste koncentrationspunkt i undersøgelsen blev fortyndet. Hver prøve blev lagret og undersøgt enten med eller uden heparin. De 5 relative stabiliteter, efter indstilling hvor dag 0 aktivitet sattes til 100 % er angivet i fig. 2 som en funktion af lagringstiden. I fig. 2:.. svarer til wild-type; Δ svarer til haFGF (Ser 16);.. svarer til haFGF (Ser 83); o svarer til haFGF (Ser 117);.. svarer til haFGF (Ser 16, 83); Δ svarer til haFGF (Ser 16,117); .. svarer til haFGF (Ser 83, 117); og o svarer til haFGF (Ser 16, 83, 117).

10

Tabene af aktivitet af wild-type haFGF og mutanterne i nærværelse af heparin nærmer sig tæt ved en eksponentiel aftagen, se fig. 4A. Aktiviteterne af alle mutanterne bortset fra Ser (16) er mere stabile end wild-type mitogene.

De mest stabile mutanter i aftagende orden for stabilitet er Ser (16, 83, 117), 15 Ser (117), Ser (16, 83), Ser (83,117), Ser (16, 83) og Ser (83), Ser (16).’

Stabiliteten af Ser (83) var kun lidt højere end wild-typens. Forskellige former for aFGF var mindre stabile uden heparin og helt bortset fra Ser (16, 83,117) synes nedgangen ikke at være en simpel eksponentiel afhængig af tiden.

20 En prøve af udtrykkelsesvektoren pKK-haFGF (Ser 117) betegnet A48-1a1 indeholdende genet, der er i stand til at udtrykke serin 117 mutanten i E. coli DH5 blev deponeret i American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA den 30. september 1987 under Budapest traktaten og betegnet ATCC nr. 67522.

25

Claims (20)

1. Rekombinant human, biologisk aktiv form af sur fibroblast vækstfaktorprotein med en længde på 154,140 eller 139 aminosyrer, fremstillet fra en 5 enkelt DNA-genenhed, kendetegnet ved, at proteinet omfatter ombytning af én eller flere af cysteinresteme ved stilling 16, 83 og 117 i det tilsvarende native protein, nummereret i overensstemmelse med den native humane form af sur fibroblast vækstfaktor med en længde på 140 aminosyrer, der har følgende aminosyresekvens: 10 1 .10 20 PheAsnleuProProGl yAsnTyrlysLysProLysleul.eiiTyrCysSerAsnG1 yGl yHisPKeLeuArgll eleu 30 40 50 ProAspGI yThrVal AspGI yThrArgAspArgSerAspGl nHi s Π eGI nleuGl nLeuSerAlaGIuSerVilGI yGl u 60 70 ao Val TyrllelylSerThrGluThrGlyGl oTyrleuAl aHetAspThrAspGl yLeuleuIyrGI ySerGlnThrProAsn 90 100 GI uGl uCysleuPheleuGl uAroUuGluGl u As nHi slyrAsnThrTyr'lleSerlyslysHisAlaGlulysAsnTrp 110 120 130 PheValGl yleulyslysAsnG1yS«rCysLysArgGlyProArgThrHisTyrGl yG1nlysAlaI1eLeuFh«LcuPro M0 LeuProValSerSerAsp med en aminosyre, der ikke er i stand til at danne intramolekylære eller in-termolekylære disulfidbindinger. 15

2. Rekombinant human, biologisk aktiv form af sur fibroblast vækstfaktor- DK 174961 B1 protein med en længde på 154,140 eller 139 aminosyrer, fremstillet fra en enkelt DNA-genenhed, kendetegnet ved, at proteinet omfatter ombytning af alle tre cysteiner ved stilling 16, 83 og 117 i det tilsvarende native protein, nummereret i overensstemmelse med den native humane form af sur 5 fibroblast vækstfaktor med en længde på 140 aminosyrer som defineret i krav 1, med en aminosyre, der ikke er i stand til at danne intramolekylære eller intermolekylære disulfid bindinger.

3. Rekombinant human, biologisk aktiv form af sur fibroblast vækstfaktor-10 protein med en længde på 154,140 eller 139 aminosyrer, fremstillet fra en enkelt DNA-genenhed, kendetegnet ved, at proteinet omfatter ombytning afen vilkårlig af to af cysteinresteme i stilling 16, 83 eller 117 i det tilsvarende native protein, nummereret i overensstemmelse med den native humane form af sur fibroblast vækstfaktor med en længde på 140 aminosyrer 15 som defineret i krav 1, med en aminosyre, der ikke er i stand til at danne intramolekylære eller intermolekylære disulfidbindinger.

4. Rekombinant human, biologisk aktiv form af sur fibroblast vækstfaktorprotein med en længde på 154,140 eller 139 aminosyrer, fremstillet fra en 20 enkelt DNA-genenhed, kendetegnet ved, at proteinet omfatter ombytning af cysteinet ved stilling 117 i det tilsvarende native protein, nummereret i overensstemmelse med den native humane form af sur fibroblast vækstfaktor med en længde på 140 aminosyrer som defineret i krav 1, med en aminosyre, der ikke er i stand til at danne intramolekylære eller intermolekylære 25 disulfidbindinger, hvor proteinet udviser større biologisk aktivitet end den tilsvarende native form af human sur fibroblast vækstfaktoprotein med en længde på 154,140 eller 139 aminosyrer.

5. Rekombinant human form af sur fibroblast vækstfaktorprotein ifølge et 30 hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at den har et yderligere methionin knyttet til den første aminosyre ved N-endestillingen. DK 174961 B1

6. Rekombinant human form af sur fibroblast vækstfaktorprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at den ombyttede aminosyre er serin. 5

7. Rekombinant human form af sur fibroblast vækstfaktorprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at methioninresten ved stilling 67, nummereret i overensstemmelse med den native humane form af sur fibroblast vækstfaktor med en længde på 140 aminosyrer som 10 defineret i krav 1, er erstattet af en ikke-luft-oxiderbar aminosyre.

8. Rekombinant human form af sur fibroblast vækstfaktorprotein ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den ikke-luft-oxiderbare aminosyre er enten alanin, valin, leucin eller isoleucin. 15

9. Rekombinant human form af sur fibroblast vækstfaktorprotein ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den ikke-luft-oxiderbare aminosyre er leucin.

10. Nucleotidsekvens, kendetegnet ved, at den koder for den rekom-20 binante humane form af sur fibroblast vækstfaktorprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9.

11. Nucleotidsekvens ifølge krav 10, kendetegnet ved, at der ovenfor sekvensen for rekombinant human form af sur fibroblast vækstfaktorprotein 25 er knyttet en cistron, der forøger udtrykkelse af den sure fibroblast vækstfaktor.

12. Farmaceutisk præparat til opheling af blødt væv, væv i forbindelse med muskel-knogle systemet, brusk, vaskulært væv og nervevæv og til fremstil- 30 ling af plasminogen aktivitator, kendetegnet ved, at det omfatter en farmaceutisk bærer og en effektiv mængde af den rekombinante humane DK 174961 B1 form af sur fibroblast vækstfaktorprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9.

13. Anvendelse af den rekombinante humane form af sur fibroblast vækst-5 faktorprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9 til fremstilling af et lægemiddel, der er anvendeligt til at fremme opheling af blødt væv, væv i forbindelse med muskel-knoglesystemet, brusk, vaskulært væv og nervevæv eller til at fremme produktion af plasminogen aktivator.

14. Fremgangsmåde til fremstilling af en rekombinant human, biologisk aktiv form af sur fibroblast vækstfaktorprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, kendetegnet ved, at den omfatter følgende trin: a. tilvejebringelse af et plasmid indeholdende en nucleotidsekvens, 15 der koder for en human form af sur fibroblast vækstfaktorprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, idet nucleotidsekvensen udtrykkes af en vært indeholdende plasmidet, efterfulgt af 20 b. indarbejdelse af plasmidet i værten, og c. opretholdelse af værten indeholdende plasmidet under passende betingelser for udtrykkelse af nucleotidsekvensen, der producerer rekombi- 25 nant humant sur fibroblast vækstfaktorprotein.

15. Rekombinant bovin, biologisk aktiv form af sur fibroblast vækstfaktorprotein med en længde på 154,140 eller 134 aminosyrer, fremstillet fra en enkelt DNA-genenhed, kendetegnet ved, at proteinet omfatter ombyt-30 ning af én eller flere af cysteinresteme ved stilling 16, 47 og 83 i det tilsvarende native protein, nummereret i overensstemmelse med den native bovi- DK 174961 B1 ne form, der har følgende aminosyresekvens: 1 10 20 PheAsoleuProLeuGl yAsnTyrLysLysProlysLeuleulyrCysSerAsn&lyGlyTyrPheleuArgneleu 30 40 50 ProAjpGl yThrVal Asp GI yThrlysAjpArgSerAspGl nHi s 1 1 eGl nleuGl nleuCysAlaGluSerlleGl yGl u “ 60 70 80 Val Tyr Π etysSerTh rGl uThrGl yGl nPheleuAl aMetAspThrAspGl yLeuLeuTyrGl ySerGl nThrProAsn 90 - 100 GluGluCysLeuPheleuGluArgLeuGluGluAsnHiiTyrAsnlhrlyrlleSerlyslyiHisAlaGlutysHijIrp . 110 120 130 PheVal GI yleulysLysAsnGlyArgSerlysLeuGlyProArglhrHl sPheGI yGl nCysAl alleLeuPheleuPro 140 LeuProValSerSerAsp 5 med en aminosyre, der ikke er i stand til at danne intramolekylære eller in-termolekylære disulfidbindinger og eventuelt med et yderligere methionin knyttet til den første aminosyre ved N-endestillingen af den mikroheterogene form.

16. Rekombinant bovin, sur fibroblast vækstfaktorprotein ifølge krav 15, kendetegnet ved, at methioninresten ved stilling 67, nummereret i overensstemmelse med den native bovine form med en længde på 140 ami* nosyrer som defineret i krav 15, er erstattet af en ikke-luft-oxiderbar aminosyre og eventuelt med et yderligere methionin knyttet til den første aminosyre 15 ved N-endestillingen af proteinerne.

17. Rekombinant human mutant, biologisk aktiv, sur fibroblast vækstfaktorprotein med følgende aminosyresekvens: DK 174961 B1 -»4 -10 -1 1 Al 4—GI υ—GI y—GI o-11 e—Thr-Thr—Phe—Thr-Al a-Leu—Thr-Gl «ι-ly s-Phe-Atn-Leo-Pro- 10 20 Pro-Gl y-Asn-Tyr-Lys-Lys-Pro-lyi-Leu-leu-Tyr-Cyi-Ser-Aici-Gl y-Gl y-Hi s-Phe- 30 40 Leu-Arg-Ile-Leu-Pro—Asp-Gi y-Thr-Val-Asp—GI y-Thr-Arg-Asp—Arg-Ser-Asp—GI n- S0 His-lle-Gln-Leu-Gln-leu-Ser-Ala-Glu-Ser-Val-Gly-Gl u-Val-Tyr-He-Lys-Ser-Thr- 60 70 GI u-Thr-Gl y-Gl n-Tyr-Leu-Al a-Met-Asp-Thr-As"p-Gl y-leu-leu-T yr-Gl y-Ser-Gl n- 80 90 Thr-Pro-Asn^Glu-G1u-Cys-Leu-Phe-Lev~Glu-Arg-Leu-Gl u-Glu-Asn-His-Tyr-Ajn- 100 110 Thr-Tyr-Ile-Ser-lys-Lys-Hi s-Ala-Glu-lys-Asn-T rp-Phe-Val -GI y-Liu-Lys-Lys- 120 130 Asn-Gl y—Ser—Ser—Lys-Arg-Gl y-Pre-Arg-Thr-Hi s-1 yr-Gl y—Gin-Ly s-Al a-I le-leu- 140 Ph e-Le u-P ro-l« u-P ro-Val-S e r-Ser—Asp eller 5 DK 174961 B1 ph«-ASn-leu_pro_ ,0 20 Pro-G1 y-Asn-f yr-Lys-Lys-Pro-Lys-t_eu-L«u-T yr-Cys-S«r-Asn-Gl y-H; s_phe_ 3° 40 Leu-Ar9-ne-t.eu-Pre-Asp-Gly-Thr-Val-Aip-Gly-T»ir-Ar9-As|>-Arg-Ser-Asp^;in- 50 ' Hi s- Π e-Gl n-Le«r-61n-teu-$er-Al a-61 u-Ser-Val -GI y-61 u-Val -Tyr-Π e-Lyi-Se r-1 hr- 60 70 . 61 o-Thr-61 yi-61 n^-Tyr-leu-AI a-Mct-Asp-Thr^Asp-Glyrleo-Leo-Tyr-Gl y-Ser—Gln- 80 90 Thr-Pro-Asn-Gl u-Gl u-Cys-Lev-Phe-leu-Gl u-Arg-Leu-GlG^Gl u-Asn-Hi s-T yr-Asn-

100 UO Thr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Hi s-Al a-Gl«-lyS-Asn-Trp-Ph*-Val-61y-Leu-LyS"*-ys- 120 13° Asn—GI y-Ser-Ser-lyj-Arg-Gl y—Pre-Arg—Thr-tiis-fyr-Gl y-Gln«-tys-Ali-Il*_^*u" 140 Phe—L«u-Prp-l«o-P ro-Val-Ser-Ser-A»p eller 2 Asn-Leu-Pro- DK 174961 B1 10 20 Pro-Gly-Asn-Tyr-lys-Lys-Pro-LyS-l-eu-Leu-Tyr-Cys-Ser-Asr>-Gly-Gly_nis_pht-- 30 “ 40 Leu-Arg-IT e-leu-Pro-As p-G1 y-Thr-Val -Asp-Gi y-Thr-Arg-Asp-Arg-Ser-Asp-GT n- 50 His-lTe-Gl o-Leu-Gl n-leu-Se r-Ala-GT υ-Ser-Val-Gi y—Cl u-V*l-Tyr-Il*-ly*-Ser-Thr- 60 70 . GI y-Thr-61 y—GI η—T y r—Leu—Al a-Met—Asp—Thr—Asp—GI y-Leu-Leu—Tyr—GI y—Ser—GT n- 80 00 Th r-Pro-Asn^lu—GI u-CyS-Leu-PKe-Leu-Glu—Arg—l€u-G1u-Glu—Asn—His—Tyr—Asn- · 100 110 Thr-Tyr-He-Ser-Lys-Lys-His-Al a-G1u-Lys-Asn-Trp-Phe-VaT-G1y-i.eu-LyS-ly*- 120 130 Asn-G1 y-Ser-Ser-lys-Arg-GI y-Pro-Arg-Thr-Hi s-T yr-GT y-GT n-Lys-ATa-ITe-leu- 140 Ph«-Leu-Pro-leu-Pro-Va1-S*r-Ser-Asp eventuelt med et yderligere methionin knyttet til den første aminosyre ved N-endestillingen af proteinerne. 5

18. Rekombinant human mutant, biologisk aktiv sur fibroblast vækstfaktorprotein med følgende aminosyresekvens: DK 174961 B1 -14 -10 -1 l Ala-Glu-Gly-Glu-Ile—Thr-Thr-Phe-Thr-Al a-leu-Thr-Glo-Lys-Phe-Asn-leu-Pro- . 10 20 Pro-61 y-Asn-Tyr-Lys-lys—Pro-Lys-leu-Leu-Tyr-Cys-Ser-Asn-Gl y-61 y-Hi s-Phe- 30 40 Leu—Arg-Ile—Leu-Pro-Asp-Gly-Thr—Val-Asp-Gl y-Thr-Arg-Asp-Arg—Ser-Asp-Cl n- S0 -His—Ile—Gin—Leu-Gl n-Leu-Ser-Ala—Glu—SerAVal-Gly-Glu-VAl-Tyr—Ile-Lys-Ser—Thr- 60 70 . GI u-Thr-SI y—61 n-T yr-Leu-Al a-Met-Asp—T hr-Asp-Gl y-Leu-leu-T yr-6Vy-Ser-61 o- 80 90 Thr-Pro—Asn-Gl u-61 u-Ser-leu-Phe-Leu—GI u-Arg-l eu-Gl u-Glu-Asn-His-Tyr-Asn- 100 110 Thr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-His-Ala-Glo—Lys-Asn-T rp-Phe-Val-Gl y-Leu-Lys-Lys- 120 130 Aso-61 y-Ser-Ser-Lys-Arg-Gl y—Pro-Arg-Thr-Hi s-Tyr-61 y-Gln-Lys-Ala-Il e-Lew- 140 Phe-leu-Pro-Leu-Pro-Val-Ser-Ser-Asp eller Pti*-AM-t*u-P ro- i DK 174961 B1 10 20 Pro-Gl y-Asn-Tyr-(.ys-(.yS-Pro-l_ys-L<u~Leu—T yr-Cys-Ser-Asn-Gl y-Gl y-Hi j-Ph*- 30 40 Icu-Arg-lle-Lcu-Pro-Asp-Gly-Thr-Val -Asp-Gi y-Thr-Arj-Asp-Arg-Ser-Asp-Gl n- 50 His-Ile-t1o-L(U701n-L(u-SerTAl»-O1(i-Sér-Vi)-i1y-Gl«*Vl1-Tjr-Ut-Lys-Str-Thr- 60 70 GI u-Thr-Gl y-Gln-ly i—Leu-Ala-tV t-Asp-T hr-Asp-^Gl y-l>'<»-»l.eit-Tyr-Gl'y-Ser-Gl«- 80 90 Thr-Pro-Asn-GTu-Glu-Ser-leu-Phe-leu-Gl u-Arg—leu-Glu-Glu-As«—His-T yr-Asn- 100 1(0 Thr-Tyr-n«-Se>"-(.yS—lys-Κϊ s—A)a-G1u-(.ys—Asn-Trp-Phe-Val-Gl y-Leu-Lys-Lys-

120 OO Asn-Gl y-$er-5er-lys-Arg-Gl y-Pro-Arg-Thr-Hi x-T yr-Gl y-GI n-lys-Al a-11 e-Liu- 140 Phe—L iu-Pro—<.*«—P ro—'V» 1 - S* r—S« r-A s p eller *in-Leu-Pro- DK 174961 B1 10 20 Pro-Gl y-Asn-Tjrr-lys-Lys-Pr&-t.yi-teu-t.eu-Tyr-Cys-Ser-Asn-Uy_c1 y-Hi s_phe_ - " 30 - 40 teu-Arg-Ne-teu-fro-Aip-Gl y-Thr-Val -Asp-Gi y-ihr-Ar^-Asp-^rg^jjr^jp^] n_ SO •H> S-Π e-Glo-Leu-Gl o-Leu-Se r-Al a-Glu-Ser-Val-Cly-61u-Vél-Typ_n e_(.yS_Ser-Ihr- 60 70 GI u-Thr-Gl y-Cl (\_T yr-teo-Al 3-Met-Asp-Thr-A$p-£l y-le«.—Leu-Tyr-Gl y-Ser-G"1 n- 80 90 T6r-Pro-Asn-G1u-Glu-Ser-Leu-Phe-leo-Gl«»-Arg-teg-G1u-Gl*>-Asn-Hj s-Tyr-Asn- 100 110 Thr-Iyr-Jle-Ser^LyS-Lys-His-Ala-Glu-l-ys-Aso-trp-Phe-Val-Gl y-Leu-Lys-Lys- 120 130 Aso-Gly-Ser-Ser-Lys-Arg-G1y-Pro-Arg-Thr-«?s-Iyr-01 y-Gln-lys-Al a-llc-Leu- 140 Phe-Leu-Pro-leo-Pro-Val-Ser-Ser-Asp eventuelt med et yderligere methionin knyttet til den første aminosyre ved N-endestillingen af proteinerne. 5

19. Rekombinant human mutant, biologisk aktiv sur fibroblast vækstfaktorprotein med følgende aminosyresekvens: DK 174961 B1 -14 -10 -1 1 AT a-G1 u-GI y-61 υ-Il e-lhr-Thr-Pti^-Thr-Al a-Leu-Thr-Glu-l.yi-Phi-Asn-Leu-Pro- 10 - 20 Pro-Gly-Asn-Tyr-lys-Lys-Pro-Lys-leu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Asn-Gly-Gl y-His-Phe- 30 40 Leu-Arg-lle-teu-Pro-Asp-Gly-Thr-Val-Ajp-Gly-Thr-Arg-Asp-Arg-Ser-Atp-Gln- .'· SO ' His-Πe-Gln-leu—GIn-L*«-Ser—Ala-GTu-$«r-Val -GI y-Glu-Val-Tyr-Π e-lys-Ser-Thr- 60 70 61 u-Thr-GI y-Glo-Tyr-Leu-Al a-Met-Asp-Thr-Asp-Gl y-Leu-Leu-lyr-Gl y-Ser-Gl n- 60 90 Th r-Pro-Asn-Gl u—Glu-Ser-Lcu-Phe-Leu-Gl ti-Arc-Leu—Glu-Gl u-Asn-Kis-Tyr-As«- 100 110 Thr-Tyr-Il e-Ser-Ly s-Lys-H i s-Al a-GI u-Ly s-Aso-T rp-Phe-Val -G) y-Leu-ly s-ty*- 120 130 Asn-Gl y-Ser-Ser-Lys-Arg-Gly-Pro-Arg-Thr-Hi s-Tyr-Gly-Gln-lys-Al a-I1 e-L*u- 140 Phe-leu-Pro-leu-Pro-Val-Ser-Ser-Ajp eller Phe-Asn-teu-Pro- i DK 174961 B1 10 20 Pro-G1 y-Asn-Tyr—Lys-tys-Prc-Lys-leu-Leu-Tyr-Ser-Sfr-Asn-Gl y-Gl y-His-Phe- » 30 «0 Leu-Arg-ne-Leg-Pro-Asp-Gly-Thr-Val-Asp-Gly-Thr-Arg-Asp-Aro-Ser-Ajp-Gln- - 50 His-Ile-GIn-Leu—Gln-Leu-Ser-Ala-Glu-Se r-Val-Gly-Glu-Vil-Tyr-ne-Lys-Ser-Thr-r 60 70 GT g-Th r-Gl y-GI n-Tyr-Leu-Al a-Met-As p-Thr-As p-Gl y-leu-Le«-Tyr-Gl y-Ser-61n- 80 90 Thr-Pro-Asn-GI u-Gl u-Ser-leg-Phe-Leg—GI u-Arg-Leu-61 u-G1 u-Asn-Hi s-T yr-Ajn- 100 no Thr-Tyr-ne-Ser-Lys-Lys-Wis-Ala-Glu-Lys-Asn-Trp-Phe-Val-Gl y-leu-lys-lys- 120 130 Asn-Gl y-Ser-Ser-Lys-Arg-Gly-Pro-Arg-Thr-Hi s-Tyr-Gl y-Gl n-Lys-Al a-lle-Lfo- 140 Phe-Leu-Pro-Leu-Pro-Vat-S«r-Ser-Asp eller **®-l.*u-Pro- DK 174961 B1 >0 " 20 P ro-61 y-Ain-Tyr-Ly s-Lyt-Pro-tys-Leu-leu-Iy r-S«r-S«r-Asiv-G1 s_phe_ 3° 40 L«u-Arg-Il e-Ueu-Pro-Asp-GTy-Thr-Val-Asp-61y-Thr-Arg-4sp-Are-ser_aSpT^il|_ _ SO Ki f-ilc-Cl n-Leu-Gl ri-Leu-Ser-Al a-GVu-Ser-Val -GI y-Glu-Vil-T yr-p e-Lys-S«r-Thr- 60 70 61 u-Utr-Gl y-Gl n-Tyr-lcu-Al a-Me t-Asp-Th r-As p-61 jr-Leu-leu-Ty r-Gl y-Scr-&1 n- 80 90 Thr-Pro-Asn-61 u—GI u-Ser-leu-Phe-Leu-Gl u-Aro-Leu-Gl u—GI u-Asn-Hi f-Tyr-Asn-

100 UO Thr-Tyr-Ile-$er-LyS-lys-Mi s-Al a-Gl u-lys-A*n-Trp-Phf-Val-GI y-leu-lyi-lyi- 120 130 Asn-61 y-S«r-Sir-lys-Arg-Gly-Pro-Arg-Thr-+lis-Iyr-Gly-Glfi-Lyi-Ala-ne_!.tti- 140 Ph*-leu-P ro-Leu-P ro-Val-Ser-Ser-Asp eventuelt med et yderligere methionin knyttet til den første aminosyre ved N-endestillingen af proteinerne. 5

20. Rekombinant mutant, human sur fibroblast vækstfaktorprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 17,18 eller 19, kendetegnet ved, at methioninresten ved stilling 67 er erstattet af leucin. DK 174961 B1 ·» FIG-1 STILL?NG rH>Tn 6416 Λ IyPstl rrnB fcoffl STILLING ·> Wl___ l 6840 J / FUSION PBR3ZZ / /får ^\/X Bam Hl PBR322 STw 'Ljf ^%\) I (Narl/Ndel) J I I fusion y\ 1 \ 4/3 ' 2298 J J DK 174961 B1 CM cb C 1»»» i i i i i 1111 i i i i i - — ιητ'ΐ—i - /o 4ό - oo lÉu 1 I *1 1 L — I« i .... i » I» 1 « .^ O μ CO 111' ' ' »—i-«-111 i i i i *r i 111 i i 2 \ * i i »- O o o — 2 131IAIJDIV 9Π3(ΙΝΙΜ) %