JP2003518949A - 組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマー - Google Patents

組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマー

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、組み換え融合タンパク質が、少なくとも１つの成分Ａ及び少なくとも１つの成分Ｂとを有し、その際、成分Ａは生物学的機能を有する、特に抗体に対して、可溶性又は膜質のシグナル分子に対して又はレセプターに対してリガンド機能を有するタンパク質又はタンパク質断片または抗体又は抗体の断片を有し、かつ成分Ｂは第３の分子の作用なしで前記の組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーをバイマー化又はオリゴマー化するタンパク質又はタンパク質断片を有することを特徴とする組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのオリゴマーに関する。さらに、本発明は、医薬の製造のためのこの種のバイマー又はオリゴマーの使用、バイマー又はオリゴマーに堆積する融合タンパク質、このＤＮＡ−配列及び発現ベクターもしくはこのＤＮＡ−配列を有する宿主細胞に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又は
ペンタマーのバイマー又はオリゴマーに関し、その際、前記の組み換え融合タン
パク質は少なくとも１つの成分Ａ及び少なくとも１つの成分Ｂを有する。さらに
、本発明は、医薬品を製造するためのこの種のバイマー又はオリゴマーの使用も
しくはインビトロ−診断のためのその使用に関する。最後に、本発明は、成分Ａ
及び成分Ｂを有し、その際、成分Ｂは、Ｃ１ｑ−タンパク質又はコレクチンの種
類からなるグループから選択されるタンパク質のマルティマー化及びオリゴマー
化する断片又はこのような断片の官能性の誘導体を含有する融合タンパク質にも
関する。この種の融合タンパク質をコードするＤＮＡ−配列並びにＤＮＡ配列を
有する発現ベクター及びＤＮＡ配列もしくは発現ベクターを有する宿主細胞も本
発明の対象である。
【０００２】 生理学的にダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーとして出現する
タンパク質は自然界においても多数存在する。溶液中でダイマー化又はマルティ
マー化するタンパク質の表面に関する相互作用に基づき、タンパク質は濃度に依
存するか又は環境に依存して、自発的に又は例えば動的に遅れて堆積する。これ
は、疎水性の相互作用、水素結合及び／又はクーロン力が原因である。
【０００３】 このほかに、特定のタンパク質の場合、特異的な構造に依存する分子間の超二
次構造を形成し、それによりタンパク質のダイマー又はタンパク質のマルティマ
ーを形成する構造モチーフが見られる。超二次構造の形成は、このダイマー又は
マルティマーを形成するタンパク質の特徴的なアミノ酸配列に起因する。超二次
構造として、例えば、いわゆる「コイルド−コイル−ヘリックス（Ｃｏｉｌｅｄ
−Ｃｏｉｌ−Ｈｅｌｉｃｅｓ）」が挙げられ、これが、コイルド−コイル形を形
成するそれぞれのタンパク質において生じる特徴的なα−ヘリックスの相互作用
によりタンパク質のダイマー化又はマルティマー化を引き起こす。タンパク質の
分子間の「ダイマー化又はマルティマー化ドメイン」としてのコイルド−コイル
−ヘリックスは、構造上二本鎖又は多本鎖の相互にねじれたスーパーヘリックス
を示す。この種のコイルド−コイル−モチーフは特に細胞外のタンパク質ダイマ
ー又はタンパク質マルティマーにおいて発生し、特に結合組織のタンパク質又は
タンパク質複合体において発生する。
【０００４】 例えば、Ｂｅｃｋら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６） ２５６，９０９
−９２３）は結合組織タンパク質、いわゆる軟骨マトリックスタンパク質（ＣＭ
Ｐ）を記載しており、この結合組織タンパク質のホモトリマーへの凝集は、コイ
ルド−コイル−モデルを有する三重らせんに起因し、前記の三重らせんは３つの
相補的ヘリックス（それぞれポリペプチドの成分として）の堆積の結果である。
このような三重らせんを形成するヘリックスのアミノ酸配列についてこの場合７
つのモデル（ａｂｃｄｅｆｇ）nが特徴的である。位置ａ及びｄのこのアミノ酸
は、通常、無極性の側鎖を有し、それにより上記のスーパーヘリカル構造の形成
（この場合、３本のヘリックスからなる三重らせんとして）を可能にする。
【０００５】 さらに、それどころか他の細胞外マトリックスタンパク質（軟骨オリゴマーマ
トリックスタンパク質（ＣＯＭＰ））の場合には５本のヘリックスが５本鎖コイ
ルド−コイル−ヘリックスの形で相互に作用し、それによりペンタマーを形成す
ることができることが文献に記載されている。（Ｋａｊａｖａ，ＰＲＯＴＥＩＮ
Ｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４
：２１８−２２６ （１９９６）；Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，Ｖｏｌ．２７４，７６１−７６５，１９９６）。
【０００６】 コラーゲン類からなるタンパク質に所属しないマトリックスタンパク質ＣＯＭ
Ｐ及びＣＭＰの他に、さらに、コラーゲン類からなるタンパク質の場合でも、特
別な構造によるマルティマー化現象が超二次構造を形成することにより見られる
。この場合、コラーゲン繊維の構造は３本のらせん状にねじれたポリペプチドか
らなるトロポコラーゲンに特徴がある。毛髪のプロトフブリッレ（Ｐｒｏｔｏｆ
ｆｂｒｉｌｌｅ）は、左巻きのモチーフ「コイルド−コイル」を有するα−ケラ
チンからなる三重らせんから構築されている。
【０００７】 リガンドの活性を高めるために、Ｔｅｒｓｋｉｋｈら（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９
４，１６６３−１６６８，１９９７）は、リガンド機能とマトリックスタンパク
質ＣＯＭＰの「コイルド−コイル−ドメイン」とを有する短いペプチドを有する
融合タンパク質を使用することを提案している。このペンタマーについては高め
られた活性が検出されるが、その際、この方法ではより高い構造の凝集体は得る
ことができない。
【０００８】 さらに、それぞれのマルティマー化する配列断片内のその配列相同性に基づき
、タンパク質Ｃ１ｑ、コラーゲンα１（Ｘ）、α２（ＶＩＩ）、越冬タンパク質
、ＡＣＲＰ３０、内部の耳構造タンパク質、セレベリン及びトリマーはタンパク
質種としてＣ１ｑ−種の名称の元にまとめられており（Ｋｉｓｃｈｏｒｅ及びＲ
ｅｉｄ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４２ （１９９９） １５−２１
）、前記の種は同様に構造によってダイマー又はマルティマーとして存在する。
この種内に現れるマルティマー化特性を有するタンパク質の中で、例えば相補シ
ステムから公知のタンパク質Ｃ１ｑの構造は、それぞれ球形の、いわゆる「ヘッ
ド」−ドメイン及び「コラーゲン類似の」ヘリックス配列断片を有するモノマー
により特徴付けられる。コイルド−コイル−三重らせんを形成するこのヘリック
ス配列断片を介してモノマーはトリマー化する。この６つのＣ１ｑトリマーは１
つのオリゴマーを形成し、その際、タンパク質トリマーのオリゴマー化は個々の
コイルド−コイル−三重らせんの間の相互作用に起因する。この結果、この構造
的配置は、タンパク質もしくはマルティマー化された（オリゴマー化された）タ
ンパク質複合体Ｃ１ｑにおいて、「ブーケ」として表される構造を生じ、その際
、１８個の球状のＣ末端配置された「ヘッド」−ドメインが結合してトリマーか
ら六量体になることが確認される。
【０００９】 タンパク質Ｃ１ｑの場合と類似の構造は、タンパク質ＡＣＲＰ３０の場合にも
、同様にＣ１ｑ−種からのタンパク質も見られる（Ｈｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１，Ｎｒ．１８，１０６９７−１０７０３，１９９６）。
脂肪細胞から分泌される血清タンパク質は、優勢な確率で、トリマーのクアトロ
マーであり、この場合、Ｃ１ｑタンパク質の場合でも同様に、球状のＣ末端ドメ
インはコラーゲン類似の三重らせんを介して結合する。推測によりこの三重らせ
んの４つは、相応する相互作用により最終的に再びオリゴマーを形成する。Ｓｈ
ａｐｉｒｏ及びＳｃｈｅｒｅｒ （Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９８
，８：３３５−３３８）の刊行物には、ＡＣＲＰ３０のホモトリマーのＸ線構造
分析を用いて測定された構造が示されている。
【００１０】 さらに、この文献からはコレクチンのクラスからのタンパク質が公知であり、
このタンパク質はコラーゲン類似ドメイン、頸部領域及びさらに球状のカルボキ
シ末端のレクチン結合ドメインにより特徴付けられる。コレクチンは生理学的に
トリマーのオリゴマーとして出現する。このように、タンパク質の肺界面活性タ
ンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）及びマンノース−結合タンパク質（ＭＢＰ）はそれぞれ
コレクチンの種からのその「コラーゲン類似の」ドメインの相互作用によってト
リマー化され、最終的にトリマーのヘキサマーとして存在する（Ｅｐｓｔｅｉｎ
ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．
８，Ｎｏ．１，１９９６，２９−３５）。それに従って、コレクチンの名称で公
知のタンパク質もマルティマー（例えばトリマー）のオリゴマー（例えばヘキサ
マー）を形成する。
【００１１】 さらに、この文献からは、多数の生理学的にシグナル分子として作用するタン
パク質が特定の状態においてだけ生物学的シグナルを変換できることが記載され
ている。例えば膜質に配置されたＦａｓＬは生物学的な、つまりアポトーシスの
作用があるが、細胞外タンパク質断片が膜質の断片から脱離（いわゆるｓＦａｓ
Ｌ）した後は膜に結合していないｓＦａｓＬ−フラクションは生理学的に目的細
胞にアポトーシス作用をもはや及ぼすことができない。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１８７，Ｎｏ．８，１９９８，１２０５−１２
１３）の刊行物には、前記したように膜質タンパク質断片から脱離した後に得ら
れるｓＦａｓＬ−トリマーの生物学的作用は、それにもかかわらず架橋する抗体
の使用によってその生理学的機能に関して再活性することができることが記載さ
れている。このため、ＦａｓＬのトリマー化ドメイン、短いリンカー配列及びフ
ラッグ−マーカー（フラッグ−アミノ酸配列（一文字コード）ＤＹＫＤＤＤＤＫ
を有する）からなる融合タンパク質を構築し、発現し、この種の構造に制限され
ない（つまり特別な二次構造−相互作用を介在せずに超二次構造を形成する結果
となる）トリマー化された融合タンパク質を、フラッグ−マーカーに対して結合
する抗体によって架橋した。
【００１２】 この種の抗体結合により架橋したｓＦａｓＬ−分子は、架橋していないｓＦａ
ｓＬ−トリマーと比較して特異的なアポトーシス活性の明らかな向上を示す。し
かしながら Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらが提案したこの手法は、トリマー化ドメイン
を有する組み換えられた、膜に結合していないＦａｓＬ−タンパク質の他に特異
的な抗体を使用しなければならず、つまり生物学的活性の向上は他の分子フラク
ションの供給によってのみ達成されるという欠点を有する。さらに、Ｓｃｈｎｅ
ｉｄｅｒらにより提案された教示により、マルティマーの正確に設定された又は
決定可能なオリゴマー化度を保証するのは不可能である。この抗体により、つま
りＦａｓＬ−トリマーが結合してダイマーになるか又はオリゴマー化された複合
体から巨大なｓＦａｓＬ−／抗体−凝集物までの広い帯域が出現することになる
。例えば医学的用途のために、最大の作用を有する正確に定義された生成物が要
求されるので、従って、結局、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらにより提案された方法はｓ
ＦａｓＬ−活性を再活性化するかもしくは高めるために有効ではない。
【００１３】 本発明の中心的な課題は、先行技術の欠点を回避し、特に向上された生物学的
活性を有するか又は生物学的活性を再活性化させる化合物を提供することであっ
た。
【００１４】 前記の課題は、請求項１記載の対象により、つまり、組み換え融合タンパク質
のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマー
において、組み換え融合タンパク質が少なくとも１つの成分Ａ及び少なくとも１
つの成分Ｂを有し、その際、成分Ａは生物学的機能を有する、特に結合機能を有
するタンパク質又はタンパク質断片を有し、成分Ｂは、生物学的機能を有する組
み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーを第
三の分子を作用させずにバイマー化又はオリゴマー化するか又は融合タンパク質
をダイマー又はマルティマーに凝集させ及びこのダイマー又はマルティマーを同
時に第三の分子を作用させずに結合させてバイマー又はオリゴマーにするタンパ
ク質又はタンパク質断片を有することにより解決される。
【００１５】 本発明の表現において、ダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーの
概念は、マルティマーの名称にまとめられ、これらは２つ、３つ、４つ又は５つ
のまとめられたポリペプチド（タンパク質）からなるタンパク質複合体であると
解釈される。それに対して、より高次の構造の凝集体は、つまり前記の意味のダ
イマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーの２つ以上の凝集物がバイマー
又はオリゴマーとして表される。生物学的機能を有するタンパク質又はタンパク
質断片（融合タンパク質中の成分Ａ）とは、抗体又はレセプターにとって全く特
別にリガンド機能を有する特別なタンパク質（つまり、１つ又は複数の分子との
結合パートナーとして相互作用することができ）、修飾されたアミノ酸配列、例
えば共有又は非共有で結合した作用物質（場合により有機化学的性質）を有する
アミノ酸配列、抗体又は抗原結合部位を有する抗体の断片又はホルモン、例えば
ペプチドホルモンであると解釈される。特に、本発明は、融合タンパク質中の成
分Ａとして、生物学的にすでにモノマーとして活性でありかつ相応して本発明に
よる複合体の構成成分としてその作用を向上させるシグナルタンパク質のアミノ
酸配列であるか又は本発明により誘導されるマルティマー化又はオリゴマー化に
よるか又は本発明によりもっぱら誘導されるオリゴマー化（融合タンパク質の成
分Ａがすでに存在する場合）により始めて活性化されるシグナルタンパク質のア
ミノ酸配列である。生理学的に膜質のシグナルタンパク質の場合、例えばＴＮＦ
−サイトカインの場合、膜外の、特に細胞外のタンパク質断片を有する分解生成
物であるのが有利である。しかしながら、抗原として作用することができるアミ
ノ酸配列も、成分Ａとして組み換え融合タンパク質中に使用することができる。
最終的に、成分Ａとしてレセプター、例えばＴＮＦ−レセプター種（例えばＦａ
ｓＲ）からのレセプター、又はこのようなレセプターの断片もしくは誘導体を使
用することができ、これは同様に結合機能を有し（従って他の分子との結合パー
トナーとして相互作用する）、かつ本発明の範囲内で従って「リガンド」の概念
に相当する。生物学的レセプターのこの種の結合可能な断片は、相補的な生物学
的リガンドが患者において非生理的に高い濃度で存在する場合に、特に医薬とし
ての使用に適している。
【００１６】 有利な実施形態において、成分Ａは本発明によるオリゴマー中に存在するマル
ティマー、つまりダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマー、同様の成
分Ａ（ホモダイマー又はホモマルティマーのオリゴマー）又は異なる成分Ａ（ヘ
テロダイマー又はヘテロマルティマーのオリゴマー）を有することができる。こ
のように、多様な成分Ａを有するタンパク質は、本発明によるオリゴマーのダイ
マー又はマルティマー内で場合により多様な生物学的機能と結合することができ
る。バイマー又はオリゴマーの形に凝集した個々のヘテロダイマー又はヘテロマ
ルティマーは、同様に同じ又は異なることができ、つまり本発明によるバイマー
又はオリゴマーは場合により多様なヘテロダイマー又はヘテロオリゴマーから構
成されることができる。
【００１７】 もちろん、この融合タンパク質はそれぞれのダイマー又はマルティマー中でバ
イマー又はオリゴマーのサブユニットとして同一であることもでき、それに対し
てダイマー又はマルティマーとして表される個々のサブユニットはバイマー又は
オリゴマー中で異なることもできる（ホモダイマー、ホモトリマー、ホモクアト
ロマー又はホモペンタマーのヘテロバイマー又はヘテロオリゴマー）。このよう
に、例えばトリマーの本発明によるヘキサマーは成分Ａに関して６種までの異な
るホモトリマーが会合していることができる。このように、バイマー又はオリゴ
マー中での成分Ａの選択、配置、特異的結合及び／又は数によって、一般に繊細
に調整された生物学的活性を生じさせることができる。特定の生物学的作用が、
少なくとも２つのリガンド（本発明の拡張された範囲内ではなく、生物学的意味
において）の相互作用により始めて、所望の生物学的作用、例えば細胞活性を引
き起こすことは公知である。これは、例えば特定のインターロイキンとの組み合
わせた場合に、その作用に関してＴ細胞活性剤又はＢ細胞活性剤として期待され
る。本発明の場合に、この種の組み合わせて始めて作用するエフェクターは、本
発明による複合体中に配置することができる。一般に、例えばそのそれぞれの成
分Ａに関して異なるオリゴマーを含有する組成物を提供することも考えることも
できる。
【００１８】 さらに有利な実施形態において、組み換え融合タンパク質中の成分Ａは、ペプ
チドホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン又はここれらの断片
、有利に結合可能な断片である。しかしながら、前記のペプチド及び／又はタン
パク質の機能的誘導体も、本発明のオリゴマーの構成成分である組み換え融合タ
ンパク質中の成分Ａとして使用することができる。
【００１９】 生物学的に活性のタンパク質、タンパク質断片又はペプチドの機能的誘導体と
して、特に、生物学的機能を維持するが、相応する天然の配列とは配列上に差異
があるタンパク質が挙げられる。この配列の差異は、１以上の挿入、欠失又は置
換であることができ、この場合、使用された誘導体と天然の配列との間では少な
くとも７０％の配列の相同性が有利であり、少なくとも８５％の配列の相同性が
特に有利である。特に、機能的誘導体の概念は、生理的配列と比較して同類置換
を有するようなアミノ酸配列である。同類置換として、同じクラスから由来する
アミノ酸が相互に交換されたような置換が挙げられる。特に、脂肪族側鎖を有す
るアミノ酸、正又は負に帯電した側鎖を有するアミノ酸、側鎖中に脂肪族基を有
するアミノ酸又は水素結合を行うことができる側鎖を有するアミノ酸、例えばヒ
ドロキシ官能基を有する側鎖を有するアミノ酸が存在する。このことは、例えば
極性の側鎖を有する１つのアミノ酸が、同じ極性の側鎖を有する他の１つのアミ
ノ酸と置き換えられるか又は例えば疎水性側鎖を特徴とする１つのアミノ酸が、
同様に疎水性の側鎖を有する他の１つのアミノ酸と置き換えられることを意味す
る（例えば、セリン（トレオニン）をトレオニン（セリン）と置き換えるもしく
はロイシン（イソロイシン）をイソロイシン（ロイシン）と置き換える）。
【００２０】 リガンドとは、本発明の範囲内で、全ての結合反応に関与する分子であると解
釈される。リガンドは、従って、通常レセプターとして表されるタンパク質であ
る。レセプターがシグナル分子と結合するような場合でも、このようなレセプタ
ーは本発明の範囲内ではリガンドである。
【００２１】 本発明の場合に、組み換え融合タンパク質のトリマーのオリゴマー、特にトリ
マーのトリマー又はクアトロマー（３×３又は４×３）又はトリマーのヘキサマ
ー（６×３）が有利である。
【００２２】 組み換え融合タンパク質中の成分ＡがＴＮＦ−サイトカインの種類からのサイ
トカイン、このようなＴＮＦ−サイトカインの断片、又はＴＮＦ−サイトカイン
の機能性の誘導体又は相応するＴＮＦ−サイトカイン断片である場合に、組み換
え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマ
ー又はオリゴマーが特に有利である。この場合、使用したＴＮＦ−サイトカイン
は目標細胞で相応するレセプターに結合することにより、アポトーシス作用、増
殖作用又は活性化作用を引き起こすことができる。制限のない列挙において、Ｔ
ＮＦ−サイトカインとして、特にタンパク質のＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩ
Ｌ、ＴＮＦ、ＣＤ３０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、Ｌｔａ、Ｌｔ
ａｂ２、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４１−ＢＢ、ＧＩＴＲＬ、ＡＰＲＩＬ、ＥＤ
Ａ、ＶＥＧＩ及びＢＡＦＦが挙げられる。組み換え融合タンパク質中の成分Ａと
して、この場合有利に、前記の膜質ＴＮＦ−サイトカインの細胞外断片又はその
機能性の誘導体が使用される。それぞれの生物学的機能性、特にそれぞれのレセ
プターとの結合能力が維持されている場合に、この分解生成物が特に有利である
。上記の範囲内で、前記のＴＮＦ−サイトカインの機能性の誘導体又はＴＮＦ−
サイトカインの断片も、融合タンパク質の成分Ａとして使用することができる。
特に有利な実施形態において、組み換え融合タンパク質の成分Ａは、ｈＦａｓＬ
（アミノ酸１３９〜２６１）、ｈＴＲＡＩＬ（アミノ酸９５〜２８１）、ｈＣＤ
４０Ｌ（アミノ酸１１６〜２６１）及びｍ又はｈＴＮＦα（アミノ酸７７〜２３
５）からなるグループから選択される。
【００２３】 しかしながら、レセプター（膜質の又は細胞内のレセプター）、特にＴＮＦ−
サイトカインの種類のタンパク質のレセプター、特に前記のＴＮＦ−サイトカイ
ンの生理学的レセプター、もしくはそのレセプターの断片又は誘導体も、有利な
実施形態において、組み換え融合タンパク質中の成分Ａとして使用される。レセ
プターの断片を成分Ａとして使用する場合には、特に生理学的に膜外に配置され
ているこの種のレセプターの生理学的タンパク質配列の断片である。この場合、
この種のレセプターの細胞外断片が特に有利に挙げられる。例えば、本発明の場
合、レセプターの１つ又は複数の結合ドメイン、特にＴＮＦ−サイトカインの種
類のサイトカインが結合するレセプター（例えばＦａｓＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０
、ＧＩＴＲ、ＴＮＦ−Ｒ１及び／又はＴＮＦ−Ｒ２）の１つ又は複数の結合ドメ
インは、ダイマー化する免疫グロブリン（ダイマー化するＦｃ−断片）上に載せ
られていることができ、このダイマーは、ダイマー又はマルティマーをバイマー
化又はオリゴマー化することができる成分Ｂ、例えばコラーゲン類似の断片によ
り、バイマー化又はオリゴマー化されて、本発明によるバイマー複合体又はオリ
ゴマー複合体になることができる。この場合、例えばダイマー又はマルティマー
のテトラマー（ＡＣＲＰ３０のテトラマー化する断片により）、ダイマー又はマ
ルティマーのペンタマー（例えばＣＯＭＰ−複合体からのモノマーの、成分Ｂと
して使用された相応する配列断片により）又はダイマー又はマルティマーのヘキ
サマー（例えばＣ１ｑ−複合体のモノマーからのヘキサマー化する断片により）
が挙げられる。
【００２４】 本発明により、従って次の可能性が生じる：本発明によるオリゴマーの成分と
なるべき組み換え融合タンパク質のために選択された成分Ａは、すでにそれ自体
溶液の形でダイマー又はマルティマーとして存在する。成分Ｂは、このような場
合に、成分Ａのダイマー化又はマルティマー化をさらに強化し、主に組み換え融
合タンパク質のバイマー化又はオリゴマー化を生じさせる。この状況は、例えば
、成分Ａとして、すでに溶液の形で一般的にトリマー化されている少なくとも１
つのＴＮＦ−リガンドもしくはその断片又は誘導体が、融合タンパク質の成分と
してオリゴマー化されている場合に見られる。しかしながら、成分Ａがそれ自体
溶液の形で表面−相互作用によって媒介されるダイマー化又はマルティマー化を
示さない場合には、成分Ｂは本発明の場合に成分Ａのダイマー化又はマルティマ
ー化並びにダイマー化又はマルティマー化された組み換え融合タンパク質のバイ
マー化又はオリゴマー化も保証しなければならない。これは、例えば一般に、レ
セプター又はその断片が組み換え融合タンパク質中の成分Ａを形成する場合に必
要である。
【００２５】 本発明の範囲内で、組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロ
マー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマーも開示され、この場合、有利に成
分Ａは抗原又は抗原の断片である。この場合、ウイルス、バクテリア又は原虫の
病原体の抗原を使用するのが有利である。これは、病原体の任意の典型的な抗原
、例えばタンパク質断片及び／又は特異的炭水化物構造体であることができるが
、一般に、それぞれの病原体の表面抗原又は同様の抗原特性を有する病原体の表
面タンパク質の断片であることもできる。この場合、例えば制限のない列挙にお
いて、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、ＰｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２、ＨＢｓ−
抗原、ｇｐ１２０、ｇｐ４１又は特定のタイプの腫瘍−抗原が考えられる。
【００２６】 しかしながら、組み換え融合タンパク質の成分Ａは、有利な実施形態において
、アミノ酸配列であることができ、このアミノ酸配列はレセプターアゴニスト又
はレセプターアンタゴニストのためのキャリアとして機能するために適している
。薬理作用物質として活性の、小さな有機化学的分子が、一般にこの種のアミノ
酸配列と共有結合することもでき、例えばエーテルル結合を介してトレオニン又
はセリンと、又はアミド上の結合又はエステル結合を介して結合することもでき
る。本発明により、例えば１８個の融合タンパク質（例えば３×６個の融合タン
パク質）とそれぞれ結合したレセプターアゴニスト又はレセプターアンタゴニス
トとの大きなオリゴマー複合体が提供される。それにより、例えば医学又は獣医
学において薬剤として使用するために、この種の有機化学的分子と、バイマー化
又はオリゴマー化されたタンパク質キャリア上に配置されたそのそれぞれのレセ
プターとの結合活性もしくは有効性の著しい改善が達成される。
【００２７】 ダイマー化又はマルティマー化されてバイマー又はオリゴマーの形で存在する
組み換え融合タンパク質の成分Ｂは、一般にＣ１ｑ−タンパク質又はコレクチン
の種類からなるタンパク質である。Ｃ１ｑ−又はコレクチンの種類のタンパク質
は、このダイマー化配列／マルティマー化配列もしくはバイマー化配列／オリゴ
マー化配列だけが組み換え融合タンパク質中に転写されるかもしくは翻訳される
場合には、組み換え融合タンパク質の成分、つまり成分Ｂとして特に有利である
。天然のモノマーの配列中に含まれている少なくとも球状の「ヘッド」−ドメイ
ン（図１４）は、翻訳産物としても、本発明による組み換え融合タンパク質中に
出現せず、従って組み換え融合タンパク質中の成分Ｂの構成要素でもない。本発
明による組み換え融合タンパク質中の前記の成分Ｂは、一般にダイマー化／マル
ティマー化もしくはバイマー化／オリゴマー化する機能性を少なくとも重複して
有している配列を有する、それというのも、成分Ｂとして使用される、前記の種
類のタンパク質のコラーゲン−類似の断片は、例えば三重ヘリックスの結合に関
与しており、これはさらに他の三重ヘリックスと共にバイマー構造又はオリゴマ
ー構造（例えば三重ヘリックスのテトラマー又はヘキサマー）を形成することが
できる。
【００２８】 従って、一般に、Ｃ１ｑ−タンパク質又はコレクチンの種類からのタンパク質
の、マルティマー化及びオリゴマー化する融合タンパク質は、ダイマー化又はマ
ルティマー化もしくはバイマー化及びオリゴマー化に関与するドメインを成分Ｂ
として有し、そのそれぞれの「ヘッド」−ドメインは成分Ａとして他の同様に生
物学的機能を利用するタンパク質又はタンパク質断片により置き換えられる。「
組み換え融合タンパク質」の概念は、本発明の範囲内で、少なくとも１種の成分
Ａと少なくとも１種の成分Ｂとが組み換え融合タンパク質中に人工的に融合され
ているものであると、つまり融合タンパク質は、本発明の範囲内で、天然に出現
するタンパク質ではないと解釈される。
【００２９】 Ｃ１ｑ−タンパク質の種類又はコレクチンの種類からのタンパク質の機能的な
、つまりバイマー化する又はオリゴマー化する誘導体もしくは前記のタンパク質
の断片の誘導体のは、バイマー又はオリゴマーを形成するために組み換え融合タ
ンパク質の凝集のための成分Ｂとして使用することができる。この場合、成分Ｂ
は、タンパク質Ｃ１ｑ、ＭＢＰ、ＳＰ−Ａ（肺表面活性タンパク質Ａ）、ＳＰ−
Ｄ（肺表面活性タンパク質Ｄ）、ＢＣ（ウシ血清コングルチニン）、ＣＬ４３（
ウシコレクチン−４３）及び／又はＡＣＲＰ３０もしくは前記のタンパク質の少
なくとも１つ又はこのタンパク質の機能的誘導体又はこの機能的誘導体の断片の
バイマー化又はオリゴマー化する断片の１つ以上の配列を含有する。組み換え融
合タンパク質の成分Ｂがタンパク質Ｃ１ｑ又はタンパク質ＡＣＲＰ３０のタンパ
ク質断片である場合に、組み換え融合タンパク質のバイマー又はオリゴマーが有
利であり、この場合、このようなそれぞれのタンパク質断片は一般に天然のタン
パク質Ｃ１ｑ又はＡＣＲＰ３０の球状の「ヘッド」−ドメインを有していない。
【００３０】 本発明の特に有利な実施形態として、成分Ｂが図６Ａによるアミノ酸配列（枠
で囲った配列）もしくは図６Ｂによるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列の機能
性の誘導体もしくはこの配列の断片を含有する組み換え融合タンパク質のダイマ
ー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマーである。
これは、一般に、例えばアミノ酸１８〜１１１を有するｍＡＣＲＰ３０（ｍ：マ
ウス）のタンパク質の断片であるか、又は例えばアミノ酸１８〜１０８を有する
ヒト変異体（ｈＡＣＲＰ３０）の断片である。従って、特に、本発明の場合に融
合タンパク質を提供することができ、この融合タンパク質の成分Ａ及びＢはヒト
起源であり、その結果、ヒトにおける治療的使用の際に場合による免疫反応を排
除することができる。
【００３１】 多様な宿主生物からの配列を有するような融合タンパク質のダイマー又はマル
ティマーのバイマー又はオリゴマーが特に有利である。本発明による凝集体がキ
メラ融合タンパク質から由来し、その際、成分Ａは成分Ｂとは異なる動物種から
由来する場合に、この本発明による凝集体は特に有利である。このように、成分
Ａはマウス、ラット、ブタ又は他の脊椎動物、特にほ乳類からのアミノ酸配列又
はその機能的な誘導体であり、成分Ｂはヒト起源であるかもしくはその逆である
のが有利である。成分Ａがウイルス、バクテリア又は原虫からの配列であり、ヒ
ト起源の成分Ｂと組み合わせた融合タンパク質の本発明による複合体も有利であ
る。もちろん、本発明による融合タンパク質中の成分Ａと成分Ｂとの配列は、同
じ動物種から由来することもできる。
【００３２】 本発明のもう一つの有利な実施形態において、融合タンパク質のマルティマー
化及び／又はオリゴマー化は、組み換え融合タンパク質中に成分Ｂとして存在す
る６個以上のアミノ酸の、有利に８〜２０個のアミノ酸の短いアミノ酸配列によ
って行われる。この短いアミノ酸配列により一般に達成される、すでにそれ自体
超二次構造によってではなく、表面相互作用によって溶液の形でダイマー又はマ
ルティマーとして存在する融合タンパク質のバイマー化又はオリゴマー化は、有
利に、組み換え融合タンパク質中の特異的アミノ酸配列により可能となるジスル
フィド架橋の形成に基づく。このことは、成分Ｂが有利に少なくとも１つのシス
テインを有し、このシステインが酸化条件下で、他の少なくとも１つのダイマー
又はマルティマーの融合タンパク質の少なくとも１つのシステインと共有結合を
形成できることを意味する。成分Ｂが短いバイマー化又はオリゴマー化する８〜
２０個のアミノ酸配列を含有する有利な場合では、例としてアミノ酸配列（一文
字コード）ＶＤＬＥＧＳＴＳＮＧＲＱＣＡＧＩＲＬが挙げられる。この１８個の
アミノ酸を有する配列は位置１１でシステイン残基を有し、このシステイン残基
がダイマー又はマルティマーの間でジスルフィド架橋を形成することができる。
【００３３】 この１８個のアミノ酸を有する配列の機能的な誘導体又は断片も成分Ｂとして
使用できる。この場合、特に配列ＶＤＬＥＧＳＴＳＮＧＲＱＳＡＧＩＲＬを挙げ
ることができ、この場合、位置１１でシステイン残基はセリン残基に置き換えら
れているが、この残基は融合タンパク質−マルティマーのバイマー化又はオリゴ
マー化を保証することができる。
【００３４】 この融合タンパク質は有利な実施形態においても、ダイマー化した又はマルテ
ィマー化した融合タンパク質のバイマー化又はオリゴマー化を介してより高次の
構造の凝集体を形成することができるように構成されている。２つ又はそれ以上
のバイマー又はオリゴマーを有するより高次の構造のこの凝集体は、例えば抗体
を介して架橋することにより提供することができる。この抗体は、本発明による
複合体の１つ又は複数の誘導タンパク質上にあるエピトープ、有利に成分Ｂの１
つのエピトープに結合する。しかしながら、この融合タンパク質も成分Ａ及びＢ
の他にさらに、架橋する抗体に対する抗原として作用する配列断片を有すること
もできる。本発明の範囲内で、この関連において、いわゆるＴａｇ−配列、例え
ばＦｌａｇ−Ｔａｇ、つまりアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ、又は同様に例えば
Ｈｉｓ−Ｔａｇ（複数の連続するヒスチジンを含有）が有利である。
【００３５】 しかしながら、本発明の範囲内で、より高次の構造の凝集体は、１つ以上の成
分Ｂを組み換え融合タンパク質中に含有されていることにより提供されるのが特
に有利である。従って、より高次の凝集体の形成のために、成分Ｂ１はバイマー
又はオリゴマーの形成のために含まれ、さらに一般に成分Ｂ１とは異なっている
少なくとももう一つの成分Ｂ（例えば成分Ｂ２）を含むのが有利である。本発明
によるバイマー又はオリゴマーの融合タンパク質中に少なくとも出現しなければ
ならない成分Ｂ２は、バイマー又はオリゴマーが架橋してより高次の構造の凝集
体になることを保証する。例えば、成分Ｂ１はＣ１ｑ−タンパク質又はコレクチ
ン−タンパク質の種類からのタンパク質のバイマー化する又はオリゴマー化する
断片であり、成分Ｂ２は少なくとも１つのジスルフィド架橋を形成する８から例
えば２８個のアミノ酸の長さの配列である。２つのことなるオリゴマーの間に少
なくとも１つのジスルフィド架橋を形成する場合に、より高次の構造の本発明に
よる凝集体、例えばオリゴマーのバイマーが提供される。
【００３６】 さらに、成分Ａと１又は複数の成分Ｂとの間に、又は複数の成分Ｂが融合タン
パク質中にが入する場合、少なくとも２つの成分Ｂとの間に、いわゆるリンカー
配列を挿入するのが有利である。このリンカー配列は、組み換え融合タンパク質
中の異なる機能性成分の構造的な分離のために用いられ、有利に「ヒンジ」−機
能も担うことができる、つまりフレキシブルな構造のアミノ酸配列である。
【００３７】 従って、本発明の場合に全く一般的に、より高い生物学的有効性及び／又は相
補的タンパク質とのより高い結合活性を特徴とするバイマー又はオリゴマーもし
くはより高次の構造の凝集体を開示することができる。このように、本発明の他
の対象として存在する、本発明の範囲内でリガンド機能を有する生体分子又は薬
剤の生物学的有効性を高めるため及び／又は結合活性を高めるために用いる方法
も開示される。この種の方法は、生物学的機能を有するタンパク質又はタンパク
質断片である少なくとも１つの成分Ａを、少なくとも１つのダイマー化するか又
はマルティマー化しかつバイマー化するか又はオリゴマー化する成分Ｂと組み換
えることを特徴としており、その際、成分Ａの生物学的活性の向上及び／又は結
合活性の向上は、組み換え融合タンパク質が引き続きマルティマー化及びオリゴ
マー化によりバイマー化又はオリゴマー化されてダイマー又はマルティマーのバ
イマー又はオリゴマーになることにより達成される。成分ＡがＴＮＦ−サイトカ
イン、ＴＮＦ−サイトカインの断片又はこのようなタンパク質又はタンパク質断
片の機能的誘導体である場合に、この方法は特に有利である。さらに有利な方法
は、少なくとも１つの成分Ａの少なくとも１つの成分Ｂとの組み換えにより組み
換え融合タンパク質にすることであり、その際、少なくとも１つの成分Ａはレセ
プター又は断片、有利にＴＮＦ−レセプターである。本発明によるこのような方
法の１つの有利な実施形態に関して、同様に本発明によるバイマー又はオリゴマ
ーについて予め記載された有利な実施形態が該当する。
【００３８】 本発明のバイマー又はオリゴマーは、医薬の製造、もしくは疾患又は障害の治
療、医学的、つまりヒト医学的又は獣医学的使用が挙げられる。バイマー又はオ
リゴマーから本発明により形成されたより高次の構造の凝集体も、医薬としての
使用もしくは医薬の製造のために適している。広範囲の疾患又は障害が、本発明
の請求項に記載されたバイマー又はオリゴマーもしくはより高次構造の凝集体に
よって治療することができる。制限のない列挙において、この種のバイマー又は
オリゴマーもしくはより高次構造の凝集体は、過剰炎症性障害、自己免疫疾患、
高アポトーシス反応又は低アポトーシス反応に起因する疾患、神経変性疾患の治
療するための医薬の製造のため、同様に感染性疾患、腫瘍疾患及び／又は内分泌
疾患の治療のための医薬の製造のために使用することができる。感染性疾患にお
いては、バクテリア感染又は原虫感染、特にウイルス感染の場合のバイマー又は
オリゴマーの投与が挙げられ、この場合、組み換え融合タンパク質中の成分Ａと
して抗体又はパラトープを有する抗体の断片が特に有利である。バイマー又はオ
リゴマー又はこのより高次の構造の凝集体は、疾患が、例えば腫瘍、特にリンパ
系の腫瘍の治療のため又はその治療のための医薬の製造のために、生物学的活性
のサイトカインを用いた治療が必要となる場合に特に適している。
【００３９】 さらに、本発明によるバイマー又はオリゴマーを、感染性疾患に対する能動的
又は受動的免疫化のためのワクチンとして又はワクチンの製造のために使用する
ことができる。この場合、組み換え融合タンパク質中の成分Ａとして一般にワク
チン化のために適した抗原が、能動的免疫化の場合に使用される。このために、
バクテリア、ウイルス又は原虫、例えばプラスモジウム又はトリパノソーマの特
別な表面抗原又は表面抗原の断片が提供される。制限のない列挙において、バイ
マー又はオリゴマー又はその凝集体を含有するワクチン（この場合、組み換え融
合タンパク質は少なくとも１つの成分Ａ、つまり病原体の１又は複数の同じ又は
異なる抗原を有する）は、風疹、麻疹、ポリオ、狂犬病、破傷風、ジフテリア、
ＢＣＧ、結核、マラリア、黄熱、ＨＩＶ又はインフルエンザ、例えばライノウイ
ルスに対するワクチン化のために使用することができる。バイマー又はオリゴマ
ー又はバイマー又はオリゴマーからのより高次構造の凝集体中の多様な抗原の組
み合わせも本発明の場合に可能であり、この場合、同じ病原体からの異なる抗原
をバイマー又はオリゴマー内で組み合わせるか、又は２以上の病原体からの抗原
をバイマー又はオリゴマー内で又はより高次構造の凝集体内で組み合わせること
もできる。一般的に、このために２つ以上の成分Ａ１、Ａ２〜ＡＸを、本発明に
よるバイマー又はオリゴマー又はより高次の構造の凝集体の成分である１つの融
合タンパク質内に含有することができるか、又は少なくとも１つの成分Ａに関連
して多様な２以上の融合タンパク質をバイマー又はオリゴマー又はより高次の構
造の凝集体中に少なくとも１つの成分Ｂによって組み合わせられる。
【００４０】 少なくとも２つの異なる本発明によるバイマー又はオリゴマーを、医薬又はワ
クチンとして使用するためのもしくはそれらの製造のための組成物中に含有する
こともできる。
【００４１】 もう一つの本発明による実施形態において、本発明による融合タンパク質内の
成分Ａは免疫調節剤、例えばインターロイキン（ＩＬ）、特にＩＬ−２である。
【００４２】 さらに、本発明の範囲内で免疫化アジュバント及び／又はワクチン化アジュバ
ントとしての本発明によるバイマー又はオリゴマーの使用も開示される。免疫化
のために投与される多くの抗体は被験者において不十分な免疫応答を引き起こす
だけであることは公知である。アジュバントは免疫作用を高める課題を有する。
この種のアジュバントは本発明による融合タンパク質内の成分Ａとして及びそれ
により本発明によるバイマー又はオリゴマーの成分として挙げられる。例えば、
成分ＡはＣＤ４０−リガンド（ＣＤ４０Ｌ）からなるアミノ酸配列又はインター
ロイキン、例えばインターロイキン１〜１２のいずれか１つの配列又は配列断片
を含有することができる。ＣＤ４０Ｌの生理学的課題は、細胞サイクル中への休
止Ｂ−細胞の移行を制御することである。本発明によるバイマー化又はオリゴマ
ー化された複合体内に、インターロイキン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−
６及び／又はＣＤ４０Ｌも組み合わせることができる（バイマー又はオリゴマー
内での多様な組み換え融合タンパク質）か又はこれらが組成物の成分として出現
し（それぞれ同じ又は異なる融合タンパク質から構成されていてもよい少なくと
も２つの異なるバイマー又はオリゴマー）、前記の組成物は一般に１つ又は複数
の免疫原のほかに、少なくと１つの、有利に２つ又はそれ以上の本発明によるバ
イマー又はオリゴマーを含有する。
【００４３】 このような組成物のバイマー又はオリゴマー又はより高次の構造の凝集体は、
成分Ａに関して同じ又は異なる融合タンパク質から構成されていることができる
。この場合、成分Ａとして、それぞれの共刺激する特性及び／又は免疫系（細胞
性又は体液性の免疫応答）を活性化する特性を有する生理学的配列が挙げられる
。これは、生理学的化合物又は合成化合物であることができる。従って、１又は
複数の本発明によるバイマー又はオリゴマーを、１又は複数の免疫原の他に含有
し、この場合、本発明によるバイマー又はオリゴマーは有利に、この種のバイマ
ー化又はオリゴマー化した複合体中で１以上の免疫調節剤／免疫アジュバントを
含有するように構成されている、つまりヘテロバイマー又はヘテロオリゴマーで
あることができるような組成物も開示される。場合により、本発明によるヘテロ
バイマー又はヘテロオリゴマーは、成分Ａとして免疫原を有する１又は複数の融
合タンパク質、並びに成分Ａとしてアジュバント−成分、例えばＣＤ４０Ｌを有
する少なくとも１つの融合タンパク質を統合することができる。本発明によるヘ
テロオリゴマー内でそれぞれ異なるアジュバント成分又は免疫原−成分を有する
２又はそれ以上の異なる融合タンパク質も考えられる。従って、この種のホモオ
リゴマー又はヘテロオリゴマー又は、少なくとも１つの本発明によるヘテロオリ
ゴマー又はホモオリゴマーを含有する組成物の、ヒト医学又は獣医学の医薬又は
ワクチンとしての使用も開示される。
【００４４】 バイマー又はオリゴマーは本発明の範囲内で、有利に前記の疾患又は障害の治
療のため又は医薬の製造のために有利に使用され、この医薬は腸管外の、つまり
例えば皮下、筋肉内又は静脈内の投与又は経口又は鼻腔内の投与に適している。
ワクチンとしてもしくはワクチンの製造用のベースとしてバイマー又はオリゴマ
ー又はこれらの凝集体を投与することは、同様に、腸管外又は経口投与形で行う
のが有利であるが、しかしながら場合により鼻孔内投与形でも行うことができる
。
【００４５】 本発明によるバイマー又はオリゴマーもしくはより高次の構造の凝集体は、単
独で医薬として用いることができ、又は医薬の製造のために使用することもでき
る。これは、しかしながら他の活性作用成分と組み合わせて医薬として使用する
こともできる。本発明によるバイマー又はオリゴマーもしくはより高次の構造の
凝集体は、調剤学的に認容性の担持剤、助剤及び／又は添加剤と組み合わせるこ
ともできる。相応する製造方法は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ■ｓ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” （Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔ
ｏｎ，ＰＡ，１９８０）に開示されており、これは本発明の開示の構成部分であ
る。腸管外投与のために、担持材料として例えば滅菌水、滅菌食塩水、ポリアル
キレングリコール、水素化ナフタレン及び特に生体適合性のラクチドポリマー、
ラクチド／グリコリドコポリマー又はポリオキシエチレン−／ポリオキシプロピ
レンコポリマーが挙げられる。
【００４６】 本発明によるバイマー又はオリゴマー又は相応するより高次の構造の凝集体は
、有利にインビトロ診断の分野で又は例えば生化学精製法のために使用される。
バイマー又はオリゴマーもしくはそれらの相応するより高次の構造の凝集体を精
製カラム上で使用することも考えられ、前記の精製カラムはこの種の複合体を含
有することができる。従って、本発明の範囲内で検出の目的でのこの種の複合体
の使用も開示されている。
【００４７】 さらに、本発明の範囲内で、その相互作用に基づきタンパク質表面上で機能し
、従ってそれ自体溶液の形でダイマー化又はマルティマー化して存在する特異的
に会合するタンパク質を製造するための方法も開示されている。特に、溶液の形
でトリマー化したＴＮＦ−サイトカイン又は有利にこの種のサイトカインの可溶
性断片の場合に、これは特定の化学量論で純粋なフラクションの形で提供するの
が望ましい。相互に会合可能な異なるタンパク質、例えば３つの異なるＴＮＦ−
サイトカイン又はこの種のＴＮＦ−サイトカインの多様な断片を簡単に同時発現
させる場合には、つまり同時発現したタンパク質の全ての統計学的に可能な分布
が、この発現後に会合するトリマーにおいて存在し、つまり例えばタンパク質Ｐ
１、Ｐ２及びＰ３からなる所望のトリマー、同様に２つのタンパク質Ｐ１と１つ
のタンパク質Ｐ３とからなるトリマーなども存在する。
【００４８】 本発明によるオリゴマーは、特定の所望のヘテロマルティマーを得るために、
例えばＴＮＦ−サイトカインのヘテロトリマー又はこの種のＴＮＦ−サイトカイ
ンの断片を得るために方法に従って使用することができる。このために、異なる
融合タンパク質は構築され、有利に宿主細胞内で発現される。ここで発現された
融合タンパク質は、成分Ｂとしてこのようなタンパク質の配列断片を有し、この
タンパク質はヘテロマルチまーのホモオリゴマーを形成する、つまり３つの異な
る鎖からなるトリマーを形成し、この場合、同じトリマーがバイマー化又はオリ
ゴマー化する。有利に、融合タンパク質中のこの成分Ｂは、相補的種類又はコレ
クチンの種類、例えばＣ１ｑからのタンパク質の配列断片であり、この断片はヘ
テロトリマーのホモヘキサマーを形成する。従って、一方の融合タンパク質内に
は、成分Ｂとして、ヘテロマルティマー中で鎖のマルティマー化するための天然
タンパク質を想定する配列断片が、成分Ａ、例えばＴＮＦ−サイトカインと組み
合わせられており、他の融合タンパク質（ヘテロトリマーの形で出現する）は、
他の成分Ａ、つまり例えば他のＴＮＦ−サイトカイン又はその断片と、それぞれ
他の天然タンパク質、例えばＣ１ｑ−タンパク質中に存在する、ヘテロマルティ
マー化するための配列断片とを組み合わせて有している。
【００４９】 有利に宿主細胞内では、ヘテロマルティマーを形成することができる異なる融
合タンパク質が発現される。このヘテロマルティマーはホモオリゴマーに堆積さ
れる、それというのもこの成分Ｂは同じヘテロマルティマーだけをオリゴマー化
することができるためである。本発明により、それぞれ、Ｃ１ｑのマルティマー
化する及びオリゴマー化するα−、β−又はγ−鎖と組み合わされて、それぞれ
異なる成分Ａ、つまり有利に異なるＴＮＦ−サイトカインを有する例えば異なる
３つの融合タンパク質を発現することができる。会合するオリゴマー中には、も
っぱら、全て３つのＴＮＦ−サイトカインを有するヘテロマルティマーが存在す
る。他の化学量論のヘテロマルティマーはそれに対して出現しない。融合タンパ
ク質の選択によってだけ、従って、本発明の場合にその化学量論において特異的
でかつ統計的分布の影響下にない生成物が得られる。
【００５０】 さらに、成分Ａと成分Ｂとの間にリンカーを有するような融合タンパク質の使
用並びに所定の化学量論のヘテロマルティマーの獲得方法が有利である。リンカ
ーが少なくとも１つのタンパク質加水分解性の断片を含有し、この断片は成分Ａ
を成分Ｂの（ヘテロマルティマーの）ホモオリゴマーから分離することができる
場合に、このリンカーは特に有利である。従って、最終的に、もっぱら３つの異
なるＴＮＦ−サイトカインからの所望のヘテロマルティマー、例えばヘテロトリ
マーからなるフラクションが得られる。リンカー中のタンパク質加水分解性の断
片は、有利にトロンビン−コンセンサス配列である。
【００５１】 本発明のもう一つの対象として、本発明の融合タンパク質が記載され、この融
合タンパク質は、この組み換え融合タンパク質が少なくとも１つの成分Ａ及び少
なくとも１つの成分Ｂを有する限り、ダイマー又はマルティマーのバイマー化も
しくはオリゴマー化のために適しており、その際、前記の成分Ａは生物学的機能
を有する、特に抗体又はレセプターに対してリガンド機能を有するタンパク質又
はタンパク質断片、又は抗体又は抗体の断片を含有し、成分Ｂは、Ｃ１ｑ−タン
パク質又はコレクチンの種類からなるグループから選択されるタンパク質の、ダ
イマー化するか又はマルティマー化しかつバイマー化又はオリゴマー化する断片
又はこのような断片の機能的誘導体を含有する。組み換え融合タンパク質の成分
Ｂが、タンパク質Ｃ１ｑ、ＭＢＰ、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｄ、ＢＣ、ＣＬ４３及びＡ
ＣＲＰ３０を含有する場合、マルティマー化する及び／又はオリゴマー化する断
片この種の融合タンパク質が特に有利である。本発明のタンパク質のこのような
断片の機能的誘導体も本発明の範囲内で使用することができる。融合タンパク質
はこの場合、生物学的活性を付与する成分Ａの他に一般に、もっぱら凝集のため
に用いられる前記のタンパク質の断片を有する（しかしながら有利に球状の「ヘ
ッド」−ドメインではない）成分Ｂを含有する。
【００５２】 本発明による融合タンパク質の成分Ｂとして有利に、リガンドＥＤＡオリゴマ
ー化するコラーゲンドメインのアミノ酸配列、特に哺乳動物の変異体、さらに特
にヒトの変異体、又はこのようなドメインのオリゴマー化する断片又は機能的な
誘導体を有する配列も挙げられる。特に有利に、成分Ｂは、ヒトタンパク質ＥＤ
Ａ又はその機能的な誘導体、例えば断片のアミノ酸１６０〜２４２を有する配列
断片が使用される。これは有利にヘキサマーである。
【００５３】 本発明のもう一つの対象は、前記の種類の融合タンパク質をコードするＤＮＡ
−配列である。この種のＤＮＡ−配列は、発現ベクター中で発現し、この場合、
本発明による融合タンパク質に対応するＤＮＡ−配列を含有する相応する発現ベ
クターも本発明の対象である。さらに、本発明による融合タンパク質をコードす
るＤＮＡ−配列が導入されているような宿主細胞も本発明に属する。この関連で
、発現ベクターがトランスフェクションされている宿主細胞が特に有利であり、
この場合、発現ベクターは本発明による融合タンパク質をコードするＤＮＡ−配
列を含有する。
【００５４】 本発明のもう一つの対象は、レセプター、特に、ダイマー化又はマルティマー
かされて存在するＴＮＦ−サイトカインの種類からシグナル分子−リガンドを形
成するレセプターである。この種のレセプター、その誘導体又はレセプター又は
誘導体の断片、特にレセプターの細胞外領域を有する断片（この場合結合ドメイ
ンが有利である）は、ダイマー又はマルティマーの構成部分である融合タンパク
質の成分Ａとして存在することができる。このダイマー化は免疫グロブリンの断
片、特にＦｃ−フラグメントと組み換えることにより達成することができ、マル
ティマー化は、例えばタンパク質の相応するマルティマーかドメインと組み換え
ることにより達成することができる。このために、例えば、超二次構造の形成に
よりダイマー又はマルティマーを生じる、例えば「コイルド−コイル−ヘリック
ス」又は一般的なコラーゲン類似の三重ヘリックス（例えばＣＭＰ、ＣＯＭＰ、
コラーゲン、ラミニン）を生じるタンパク質の全ての配列断片が適している。Ｃ
１ｑ−種類からのタンパク質又はコレクチンの断片も、一般にレセプター又はレ
セプター断片のダイマー化又はマルティマー化のために適している。例えば、成
分ＡとしてのＴＮＦ−レセプターの種類、例えばＦａｓ−レセプター（ＦａｓＲ
）からの構成要素の細胞外断片を、成分ＢとしてのＣＯＭＰの相応するペンタマ
ー化ドメインと置き換えることによりペンタマーの形で発現させることができる
。この場合、レセプター又はレセプター断片を有するホモダイマー又はヘテロダ
イマー又はホモマルティマー又はヘテロマルティマーである。
【００５５】 レセプター又はレセプター断片を含有する成分Ａを備えた組み換えタンパク質
のこのダイマー又はマルティマーも、医薬として又は医薬の製造のために用いら
れる。これは特に、相応するレセプターリガンドの高められた細胞外濃度が疾患
症状において生じる場合に用いられる。これは、細胞自体の上の膜質のシグナル
分子、例えばＴＮＦ−サイトカイン又は可溶性シグナル分子の高められた濃度の
場合でも同様である。一般的な相応する膜質レセプターにより引き起こされるシ
グナルトランスダクションの連鎖の活性化が、シグナル分子を除去する結合性の
外因性の可溶性の本発明による、成分Ａとしてレセプター又はレセプター断片を
有するダイマー又はマルティマーの使用により抑制又は減少させられる場合に、
この種のマルティマーの使用は、基本的に常に望ましい。
【００５６】 本発明は次の図面によりさらに詳説される。
【００５７】 図１には、１文字コードで、本発明によるオリゴマー（ＦａｓＬ−ヘキサマー
）の、つまりトリマーのバイマーの形で出現する組み換えられた本発明による融
合タンパク質（２）のアミノ酸配列を示す。成分Ａとして、ｈＦａｓＬ（アミノ
酸１０３もしくは１３９〜２８１）の配列断片が表され、成分Ｂとして、配列Ｖ
ＤＬＥＧＳＴＳＮＧＲＱＣＡＧＩＲＬを有する特異的な（結果としてバイマーを
形成する）リンカーが存在する。さらに、図１には組み換え融合タンパク質（１
）のアミノ酸配列も示されており、この配列は先行技術によりＦａｓＬ−トリマ
ーの成分としてのみ存在し、つまりこのマルティマー、この場合トリマーは、バ
イマー又はオリゴマーを形成する成分Ｂを有していない。２つの融合タンパク質
（１）及び（２）の組み換えられた断片は、図１においてその配列の記載の上方
に、それぞれの機能に関して記されている。
【００５８】 図２は、図２Ａにおいて、本発明による、つまり特異的なリンカー配列（成分
Ｂ）を有する融合タンパク質（２）の、還元性の条件下（ｒ）で及び非還元性の
条件下（ｎｒ）でのゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す。非還元性
の条件下で溶液の形で、本発明の場合にオリゴマーが、本発明によるポリペプチ
ド（融合タンパク質（２））からなる天然の複合体として溶出する、それという
のも本発明の場合、それぞれの異なるトリマーの成分である２つの本発明による
融合タンパク質（２）の成分Ｂの間でジスルフィド架橋が形成されるためである
。従って、結果として本発明によるオリゴマーは、モノマーの形の本発明による
融合タンパク質（２）のほぼ６倍の分子量に相当する分子量を有するＦａｓＬ−
ヘキサマーとして存在する。変性する条件を与えた場合（例えばＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ上で）、本発明による融合タンパク質は還元剤の不在で、２つのモノマー間の
ジスルフィド架橋の形成によるダイマーとして移動する。還元性でかつ変性する
条件下では、それに対して本発明による融合タンパク質はＳＤＳ−ゲル状を移動
する。本発明によるオリゴマー、この場合、本発明による融合タンパク質もしく
は融合タンパク質（２）のトリマーのバイマーを図１で示したと同様に、図２Ｂ
に図式的に示した。
【００５９】 図３では、ＦａｓＬ−トリマー（先行技術の３つの融合タンパク質からなるト
リマー、例えば図１による、成分Ｂを有していない融合タンパク質（１）からな
るトリマー）又は図２Ｂに図式的に示した本発明によるＦａｓＬ−バイマー（ヘ
キサマー、トリマーのバイマーとして）の濃度に依存する、Ａ２０−細胞もしく
はＪｕｒｋａｔ−細胞に対するアンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（■、▲）で
又は不在（□、△）での細胞毒性アッセイの結果を示す。４９０ｎｍでの光学密
度は、細胞の生存能力についての尺度である（高い光学密度は、添加した物質の
わずかなアポトーシス作用に相当し、従って細胞の高い生存能力に相当する）。
Ａ２０−細胞（図３Ａ及び３Ｂ）に関して及びＪｕｒｋａｔ−細胞（図３Ｃ及び
３Ｄ）に関して、本発明によるトリマーのＦａｓＬ−バイマー（ヘキサマー）（
図３Ｂ及び３Ｄ、それぞれ△）のアポトーシス作用は、バイマー化する又はオリ
ゴマー化する成分Ｂなしの融合タンパク質のＦａｓＬ−トリマー（先行技術、図
３Ａ及び３Ｃ、それぞれ□）の作用と比較して３倍〜１０倍高い。図１による融
合タンパク質（１）及び（２）のフラッグ−配列に対して結合するアンチ−フラ
ッグ−抗体を付加的に添加しかつ架橋により本発明による融合タンパク質のオリ
ゴマー化度をさらに高めた場合に、全てのバッチ（図３Ａ〜３Ｄ、それぞれ■又
は▲）においてアポトーシス活性が向上する。
【００６０】 図４では、特異的なリンカー領域（融合タンパク質（３）の成分Ｂ）における
（Ｃ→Ｓ）−置換を考慮した、本発明による融合タンパク質（３）のアミノ酸配
列を示す（スーパー−ＦａｓＬ）。他の記載箇所は図１の記載を参照する。ゲル
濾過試験により、「スーパー−ＦａｓＬ」は本発明によるバイマー化した形でヘ
キサマーとして溶液中に存在することが示された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での変性
する条件下で、本発明による融合タンパク質（３）は還元剤の不在でも、モノマ
ーとして移動する、それというのも、アミノ酸置換Ｃ→Ｓに基づきリンカー領域
内ではジスルフィド架橋が形成できないためである。
【００６１】 図５は図３と同様に、図４による本発明による融合タンパク質（３）の本発明
による凝集体（スーパー−ＦａｓＬ）の添加による、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ
２の存在（●）又は不在（○）でのＡ２０−細胞（図５Ｂ）又はＪｕｒｋａｔ−
細胞（図５Ｄ）生存能力を示す。本発明による融合タンパク質（３）は、比較の
ために使用した先行技術による、バイマー化又はオリゴマー化する成分Ｂを有し
ていないＦａｓＬ−トリマー（図３Ａ（Ａ２０−細胞）及び図３Ｃ（Ｊｕｒｋａ
ｔ−細胞））と比べて、少なくともほぼ１０００倍強いアポトーシス作用を引き
起こした。アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２（●）の添加は、「スーパー−ＦａｓＬ
」の十分なオリゴマー化により本発明によるより高次構造の凝集体を形成するこ
とで、Ａ２０−細胞でも及びＪｕｒｋａｔ−細胞でも、アンチ−フラッグ−抗体
なしのバッチに対してアポトーシス活性を、わずかに、約２倍、有利に少なくと
も１．５倍上昇させる（図５Ｂ及び５Ｄ）。このことから、成分Ｂとして使用さ
れた、本発明による融合タンパク質（３）の特異的リンカーにより生じたオリゴ
マー化度（この場合、トリマーのバイマーとして）は、アポトーシス作用につい
て、場合により細胞表面でのオリゴマー化により、かつより高次の構造の本発明
による凝集体によってなおわずかに向上することができることを示す。
【００６２】 図６Ａには本発明による融合タンパク質（４）、ＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０のア
ミノ酸配列を示し、この場合、融合タンパク質（４）（Ｎ末端からＣ末端の順序
で）、フラッグ−配列、成分Ｂとしてのリンカー配列、タンパク質ｍＡＣＲＰ３
０（ｍ：マウス）のアミノ酸１８〜１１１、リンカーＬＱ及び成分Ａとしてのｈ
ＦａｓＬのアミノ酸配列１３９〜２８１を有する。
【００６３】 図６Ｂにはもう一つの融合タンパク質が示されている。これはヒトＡＣＲＰ３
０−リガンド（ｈＡＣＲＰ３０−リガンド、アミノ酸１８〜１１１）のコラーゲ
ン−ドメインを有し、この場合、このＮ−末端はフラッグ−標識（ＤＹＫＤＤＤ
ＤＫ）に融合し、かつこのＣ−末端はヒトＦａｓＬ（アミノ酸１３９〜２８１）
の細胞外ドメインと融合している。ｈＡＣＲＰ３０及びｈＦａｓＬのＣ−末端の
間にはリンカー配列（ＭＨＶＤ）が挿入されており、同様にフラッグ−標識とｈ
ＡＣＲＰ３０のＮ−末端との間にはリンカー配列（ＧＰＧＱＶＱＬＱ）が挿入さ
れている。全ての前記の記載はアミノ酸の一文字コードに関して参照される。
【００６４】 図６Ｃは曲線の推移を表し、この曲線の推移は、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２
の添加下（＋）で及びアンチ−フラッグ−抗体Ｍ２を添加せずに、一方はＦａｓ
Ｌを用いた、及び他方は融合タンパク質ｈＡＣＲＰ３０／ＦａｓＬを用いたＪｕ
ｒｋａｔ−Ｔ−細胞の力価から得られた。このため、上澄液（ＯＰＴＩＭＥＭ）
を一時的にＦａｓＬ又はｈＡＣＲＰ３０／ＦａｓＬでトランスフェクションしか
つこのタンパク質を発現する２９３細胞からＪｕｒｋａｔ−Ｔ−細胞へ移した。
連続する実験において、図６Ｃのｘ−軸上に示した減少する前記のタンパク質の
濃度が記入され、それぞれＪｕｒｋａｔ−細胞の生存率を他の箇所に記載した標
準−細胞毒性試験を用いて決定した。このプロットから、ＦａｓＬは交差架橋す
るＭ２−抗体なしで不活性であり（◆）、抗体Ｍ２の交差反応する作用が始めて
細胞毒効果を引き起こすことは明らかである。それに対して、本発明による融合
タンパク質、つまりｈＡＣＲＰ３０／ＦａｓＬの相応する作用は、Ｍ２−抗体の
添加なしでもすでに達成されている（▲）。Ｍ２−抗体の添加は、この場合本発
明による融合タンパク質の作用をほとんど向上させることができない。
【００６５】 図７は図３と同様に、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（▲）で又は不在（
△）での、バイマー化できない又はオリゴマー化できないＦａｓＬ−トリマー（
図１による融合タンパク質（１）をベースとする比較試験、図７Ａ）及び本発明
によるオリゴマー、この場合トリマーのテトラマー、図６によるつまり本発明に
よる融合タンパク質（４）のドデカマーの添加によるＢＪＡＢ−細胞の生存能力
を示す。本発明によるＦａｓＬ−トリマーはフラッグ−配列との結合によりオリ
ゴマー化する抗体の不在では、ＢＪＡＢ−細胞に対するアポトーシス作用は展開
しないが（図７Ａ（△））、本発明による融合タンパク質（４）のドデカマー（
トリマーのテトラマー）はすでに約１０ｎｇ／ｍｌ（Ｋ５０＝８ｎｇ／ｍｌ）の
濃度で細胞死（図７Ｂ）を誘導する。このことは、４９０ｎｍのＯＤの減少によ
りさらに明らかである。このアポトーシス活性は、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２
を、本発明によるＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０−融合タンパク質からなる本発明によ
るででカマーのバッチに添加することによりわずかに高めることができ、つまり
本発明によるドデカマーはアポトーシス活性に関してすでにほぼ最適化された凝
集状態である。相応する抗体により引き起こされる、より高次の構造の本発明に
よる凝集体へのさらなる凝集は、それに対してさらなる明らかな生物学的効果を
生じることはない。
【００６６】 本発明による融合タンパク質（５）のアミノ酸配列は図８に示されており（Ｔ
ＲＡＩＬ−ＡＣＲＰ３０）、この融合タンパク質は、成分ＡとしてｈＴＲＡＩＬ
のアミノ酸９５〜２８１を、成分ＢとしてＡＣＲＰ３０（アミノ酸１８〜１１１
）のオリゴマー化ドメインと組み合わせて含有している。従って、本発明の場合
に融合タンパク質（５）はオリゴマーとして、つまりトリマーのテトラマーとし
て溶液中に存在する。
【００６７】 図９は、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（▲）で又は不在（△）で、バイ
マー化能力又はオリゴマー化能力のない先行技術によるＴＲＡＩＬ−トリマー（
Ｎ−末端にフラッグ配列及びヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜２８１を有する融
合タンパク質）（比較試験、図９Ａ）の添加による及び本発明による融合タンパ
ク質（５）、ＴＲＡＩＬ−ＡＣＲＰ３０の本発明によるドデカマーの添加による
Ｊｕｒｋａｔ−細胞の生存能力を示す。図９における実験による観察は、図７で
示された結果に一致する。本発明によるＴＲＡＩＬ−トリマーはフラッグ−配列
との結合によりオリゴーマー化する抗体の不在では、Ｊｕｒｋａｔ−細胞に対す
るアポトーシス作用は展開しないが（図９Ａ（△））、この試験でも本発明によ
る融合タンパク質（５）のドデカマーはすでに約１００ｎｇ／ｍｌ（≒Ｋ５０）
の濃度で細胞死（図９Ｂ）を誘導する。ＴＲＡＩＬ−ドデカマーとアンチ−フラ
ッグ−抗体とを組み合わせた添加は、さらに、本発明によるオリゴマーからさら
にオリゴマー化度がさらに向上されることにより、そのより高次の構造の本発明
による凝集体を形成し、この凝集体はこの場合、さらに向上された（少なくとも
１０倍の）アポトーシスを誘導する活性を示す（図９Ｂ（▲））。
【００６８】 本発明による融合タンパク質（６）のアミノ酸配列は図１０に示されており（
ＴＮＦα−ＡＣＲＰ３０）、前記の配列は、成分ＡとしてｍＴＮＦα（ｍ：マウ
ス）のアミノ酸７７〜２３５を、成分ＢとしてｍＡＣＲＰ３０（アミノ酸１８〜
１１１）のオリゴマー化ドメインと組み合わせて含有し、かつＮ−末端にリンカ
ー配列を備えたフラッグ−配列を有する。従って、この融合タンパク質（６）は
、ドデカマーとして、つまりマルティマー（トリマー）のオリゴマー（テトラマ
ー）として溶液中に存在する。
【００６９】 図１１中には、細胞増殖試験の結果が示されている。この場合、ＣＴ６−細胞
の細胞増殖についての尺度としてマウスのＣＴ６−細胞内への［3Ｈ］−チミジ
ンの取り込みを、成分Ｂなしの先行技術による融合タンパク質のトリマー（Ｎ末
端でのフラッグ−配列及びリンカー−配列とそれに続くマウスＴＮＦαからのア
ミノ酸７７〜２３５）、つまりｍＴＮＦα−トリマーの濃度の関数として、又は
ｍＴＮＦα−ＡＣＲＰ３０（図１１Ｂ）の図６による本発明による融合タンパク
質（６）の本発明によるドデカマー（４×３）の濃度の関数として測定した。こ
の［3Ｈ］−チミジン−取り込みを「ｃｐｍ」（１分あたりのカウント数）で示
した。この試験は、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（▲）で又は不在（△）
で行った。この場合、先行技術から公知の、ｍＴＮＦαのトリマーは、ＴＮＦ−
レセプター２（ＴＮＦ−Ｒ２）との結合後に、わずかなＣＴ６−細胞に関する増
殖効果を示しただけである（図１１Ａ、△）。アンチ−フラッグ−抗体（▲）の
添加の後にようやく、その架橋しかつそれによりオリゴマー化する作用により、
明らかに高められた増殖効果が観察することができた。
【００７０】 それに対して、本発明によるトリマーのオリゴマー、この場合本発明による融
合タンパク質（６）のドデカマーは、図１１Ｂにおいて著しい増殖作用が示され
、この増殖作用はすでに５ｎｇ／ｍｌですでに観察することができる（△）。対
照としての架橋するアンチ−フラッグ−抗体と本発明によるドデカマーとの組み
合わせ（▲）は、本発明によるドデカマーの単独での添加の場合の結果と比較し
た場合に、それに対して増殖作用のわずかな向上を示しただけであった。このこ
とから、本発明によるオリゴマー（ここではドデカマーの形態で存在する）は、
すでにほとんど最適化された増殖作用を引き起こすことが認識できる。
【００７１】 本発明による融合タンパク質（７）のアミノ酸配列が図１２に示されており（
ＣＤ４０Ｌ−ＡＣＲＰ３０）、この融合タンパク質は、成分ＡとしてｈＣＤ４０
Ｌ（ｈ：ヒト）のアミノ酸１１６〜２６１を、成分ＢとしてＡＣＲＰ３０（アミ
ノ酸１８〜１１１）のオリゴマー化ドメインと組み合わせて含有している。
【００７２】 図１３中には、図１１においても示したように、細胞増殖試験の結果を示す。
この場合、図１１との差異は、ヒトＰＢＬ（末梢血液リンパ球）を使用したこと
である。トリマーの形で溶液中に存在する従来のＣＤ４０Ｌ（フラッグ−配列及
びリンカー−配列、図１２において同様、それに引き続く、ｈＣＤ４０Ｌのアミ
ノ酸１６〜２６１の配列をオリゴマー化する成分Ｂなしで有する、図１３Ａ）の
細胞の増殖に関する作用が、図１２による本発明による融合タンパク質（７）の
本発明によるドデカマー、ＣＤ４０Ｌ−ＡＣＲＰ３０（図１３Ｂ）の作用と比較
して示されている。アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の不在（△）で行った試験は、
ＣＤ４０Ｌ−トリマーがほとんど増殖作用を示さないことを示しており、図１３
Ｂにおいてはすでにわずかな濃度のｈＣＤ４０Ｌの場合でも相応する増殖作用が
検出可能である。ｘ−軸上に、図１３Ｂの場合には、尺度「１／希釈」、つまり
絶対的でない濃度がプロットされる、それというのも絶対的な濃度が不明である
濃度が高められた上澄液が添加されるためである。対照としての架橋するアンチ
−フラッグ−抗体及び本発明による融合タンパク質（７）のドデカマーの組み合
わせ（▲）は、より高次の構造の凝集体の形成により、相当する増殖作用がさら
に低い濃度にシフトすることを生じさせる。
【００７３】 図１４はオリゴマー化されたマルティマーの構造を図式的に示す。図１４Ａ及
び１４Ｂはすでに天然でおオリゴマー化された構造を有する天然の「束状タンパ
ク質の」外観図を示す（図１４Ａ：補体タンパク質Ｃ１ｑを形成するヘッドドメ
イン−トリマーのヘキサマー、図１４Ｂ：ＡＣＲＰ３０を形成するヘッドドメイ
ン−トリマーのテトラマー、脂肪細胞により産生される血清タンパク質）。従っ
て、Ｃ１ｑ−複合体の場合又はＡＣＲＰ３０−複合体の場合に天然のモノマーの
ヘッドドメインがマルティマー化又はオリゴマー化されている。Ｃ１ｑオリゴマ
ー化複合体は３つの異なる遺伝子産物から構成されており、ＡＣＲＰ３０−オリ
ゴマー化複合体はホモドデカマー、つまり同じマルティマー化された又はオリゴ
マー化された遺伝子産物である。２つの前記した天然のオリゴマー化複合体はそ
れぞれ、基本的に１つのポリペプチド鎖がそれぞれヘッドドメイン、コラーゲン
−三重ヘリックスを形成することができる配列領域及び６個（Ｃ１ｑ−複合体）
もしくは４個（ＡＣＲＰ３０−複合体）のコラーゲン−三重ヘリックスを最終的
に１８もしくは１２個のモノマーからなるヘリックス束にオリゴマー化すること
ができる配列領域を提供する。
【００７４】 図１４Ｃには、本発明による融合タンパク質（例えば図６による融合タンパク
質（４）、ＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０）の本発明によるオリゴマー化されたマルテ
ィマーが示されており、このマルティマーは成分Ａとして４つのトリマー化した
ＴＮＦ−リガンド（例えばＴＮＦ−リガンドＦａｓＬ）又はＴＮＦ−リガンドの
断片を有し、例えば成分Ｂとして本発明による融合タンパク質中に存在するＡＣ
ＲＰ３０−タンパク質のコラーゲン類似の配列領域によってオリゴマー化されて
本発明によるホモドデカマーになる。
【００７５】 図１５Ａはもう一つの本発明による融合タンパク質、つまりｈＥＤＡ／Ｆａｓ
Ｌの構造を記載する。この場合、成分ＢとしてヒトＥＤＡ（アミノ酸１６０〜２
４２）のコラーゲンドメインを用い、このＮ−末端にはリンカーを介してフラッ
グ−エピトープが連結されており及びＣ−末端には成分Ａが連結されており、こ
れは図１５ＡではＦａｓＬ（アミノ酸１３９〜２８１、つまりＦａｓＬの細胞外
ドメイン又はその断片）である。本発明による融合タンパク質ｈＥＤＡ／Ｆａｓ
Ｌはヘキサマー（２×３）として存在する。タンパク質ＥＤＡは、ＴＮＦ−種類
のもう一つの構成要素であり、膜貫通−ドメイン及びＴＮＦ−ドメインの他にな
おコラーゲン−ドメインを有し（図１５Ａの上方の図を参照）及びヒト型の３９
１個のアミノ酸を有する。
【００７６】 図１５Ｂは本発明による融合タンパク質ｈＥＤＡ／ＦａｓＬを用いた試験を示
す。この融合タンパク質の製造のために、まずヒトＥＤＡのコラーゲンドメイン
（アミノ酸１６０〜２４２）を相応するプライマーで増幅させ、相応する配列を
用いてＮ−末端及びＣ−末端でフラッグ及びヒトＦａｓＬの細胞外ドメイン（ア
ミノ酸１３９〜２８１）を融合した。図１５Ｂは曲線の推移を示し、この曲線の
推移は、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の添加下で及びアンチ−フラッグ−抗体Ｍ
２を添加せずに、一方はＦａｓＬを用いた、及び他方は融合タンパク質ｈＥＤＡ
／ＦａｓＬを用いたＪｕｒｋａｔ−Ｔ−細胞の力価から得られた。このため、上
澄液（ＯＰＴＩＭＥＭ）を一時的にＦａｓＬ又はｈＥＤＡ／ＦａｓＬでトランス
フェクションしかつタンパク質を発現する２９３細胞からＪｕｒｋａｔ−Ｔ−細
胞へ移した。連続する実験において、図１５Ｂのｘ−軸上に示した減少する前記
のタンパク質の濃度が記入され、それぞれＪｕｒｋａｔ−細胞の生存率を他の箇
所に記載した標準−細胞毒性試験を用いて決定した。このプロットから、Ｆａｓ
Ｌは交差架橋するＭ２−抗体なしで不活性であり（□）、この場合、抗体Ｍ２の
交差反応する作用が始めて細胞毒効果を引き起こす（■）ことは明らかである。
それに対して、本発明による融合タンパク質、つまりｈＥＤＡ／ＦａｓＬの相応
する作用は、Ｍ２−抗体の添加なしでもすでに達成されている（○）。Ｍ２−抗
体の添加は、この場合本発明による融合タンパク質の作用をなお向上させること
ができる（●）。
【００７７】 本発明は次の実施例によりさらに詳説される。 次の実験的な所与性（ａ）〜（ｆ）は、該当するかつ上記の相応する箇所に開示
のない変更が、次の６つの実施例に通用する場合には、参照される： （ａ） ＦａｓＬ−融合タンパク質、ＴＲＡＩＬ−融合タンパク質、ＴＮＦα
−融合タンパク質及びＣＤ４０Ｌ−融合タンパク質についてのベクターの構築 ヘマグルチニンのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ−断片（５−領域中の
翻訳されない配列（ＣＡＡ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＡＴＣ ＡＴＣ ＴＡＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＣＣ ＧＣＴ ＧＴＧ ＣＧＧ ＧＧＣ）の６つの塩基並びにフラッグ−エピトープ（ＧＡＴ ＴＡＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＧＡＴ ＡＡＡ）、リンカー（ＧＧＡ ＣＣＣ Ｇ
ＧＡ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ）、制限切断部位ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ
及びＢａｍＨＩを含む）を、塩基７２０から７６９は除去（ＰＳ０３８）されて
いる改良されたＰＣＲＩＩＩ−ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＶ Ｌｅｅ
ｋ，Ｎｉｅｄｅｒｌａｎｄｅ）の制限切断部位Ｈｉｎｄｌ−ＩＩ及びＢａｍＨＩ
間にクローニングした。トリマーのＦａｓＬの発現のために、ヒトＦａｓＬをコ
ードする、制限切断部位Ｐｓｔｌ及びＥｃｏＲＩで囲まれた配列のアミノ酸１３
９〜２８１を、ＰＣＲ法で増幅し、改良ＰＣＲＩＩＩ−ベクター中でクローニン
グした。
【００７８】 ヘキサマーのＦａｓＬのために、両側ともＥｃｏＲＩ切断部位並びにさらにリ
ンカー配列ＧＧＣＴＴの５′−末端の及び停止コドン（ＴＡＡ）の３′−末端で
囲まれたアミノ酸１０３〜２８１をコードする配列及び天然の翻訳されない配列
（ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＧＧ ＡＴＴ ＣＴＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＡＴＧ ＡＴＴ ＣＴＴ ＴＧＴ ＴＡＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＧＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＣＣ）を、ベクター（ＰＳ０３８）のＥｃｏＲＩ−切断部
位内へクローニングした。「スーパー−ＦａｓＬ」（図４、融合タンパク質（３
））を、ベクターＰＳ０３８のリンカー配列内での点突然変異の導入により、Ｅ
ｃｏＲＩ−切断部位の５′−側の配列ＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧを、ＰＣＲ−突然変
異法を用いてＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧに置き換えることにより製造した。さらに、
前記した方法でＦａｓＬ（アミノ酸１０３〜２８１）を改良されたＰＳ０３８中
にクローニングした。
【００７９】 ヒトＴＲＡＩＬ、マウスＴＮＦα及びヒトＣＤ４０Ｌのために、細胞外ドメイ
ンの一部（ＴＲＡＩＬ：アミノ酸９５〜２８１、ＴＮＦα：アミノ酸７７〜２３
５、ＣＤ４０Ｌ：アミノ酸１１６〜２６１）を、５′−末端でのＰｓｔｌ−制限
切断部位及び停止コドン並びに３′−末端でのＳｐｅｌ−制限切断部位及びＥｃ
ｏＲＩ−制限切断部位で、ＰＣＲによって増幅し、ベクターＰＣＲＩＩ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。トリマーとしてのリガンドの発現のた
めに、まずフラッグ−タグをコードする配列ＧＡＴ ＴＡＣ ＡＡＡ ＧＡＣ
ＧＡＴ ＧＡＣ ＧＡＴ ＡＡＡ、並びにリンカー配列ＧＧＡ ＣＣＣ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧをベクターｐＱＥ−１６（Ｑｉａｇｅｎ）中の切断部
位ＢａｍＨＩ及びＰｓｔｌの間に挿入した（ＰＳ３３０）。引き続き、このリガ
ンドをＰｓｔｌ／Ｓｐｅｌ−断片としてＰＳ３３０中にサブクローニングした。
【００８０】 ＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０のための発現ベクターとして次のように構築した。Ｅ
ＳＴ−クローンＡＡ６７３１５４を用いて、ＰＣＲにより、制限切断部位Ｎｓｉ
ｌ及びＰｓｔｌにより囲まれるマウスＡＣＲＰ３０をコードする配列のアミノ酸
１８〜１１１を、トリマーのＦａｓＬをコードするベクターのＰｓｔｌ−切断部
位内へクローニングした（融合されたＮｓｉｌ／Ｐｓｔｌ−切断部位はコード化
する配列の５′−側にある状態である）。ＡＣＲＰ３０を用いた残りのＴＮＦ−
サイトカインの融合タンパク質の発現のためのベクターは、発現ベクターＦａｓ
Ｌ−ＡＣＲＰ３０中のＦａｓＬの相応する配列を、それぞれのリガンド配列に制
限切断部位Ｐｓｔｌ及びＥｃｏＲＩ内へ置き換えることにより製造した。
【００８１】 （ｂ） 組み換えタンパク質の発現及び精製： トリマーのＴＲＡＩＬ、ＴＮＦα及びＣＤ４０Ｌのために、バクテリア（株Ｍ
１５、プラスミドｐＲｅｐ４を有する、Ｑｉａｇｅｎ）中での安定なクローンを
作成した。それぞれのクローンを、一晩中、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）
及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢ−ブイヨン中で３７℃で予備
インキュベーションし、メイン培養（希釈１：５０、３７℃で生長）の接種のた
めに用い、これを６時間後に発現のために０．５ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ）
を用いて誘導した。このバクテリアを遠心分離により収穫し、ＰＢＳ中で２回洗
浄し、「フレンチプレス」で溶菌し、このライゼートから不溶解物を遠心分離に
より除去した。全てのＦａｓＬ−タンパク質のために、ＨＥＫ２９３−細胞中で
安定なクローンをＧ４１８ ８００μｇ／ｍｌ中での選択によって作成した（前
記の箇所：Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８を参照）。
【００８２】 トリマーの及びヘキサマーのリガンドもしくはスーパー−ＦａｓＬは、安定な
クローンの上澄み又はバクテリアのライゼートから、アフィニティクロマトグラ
フィーを用いてＭ２−アガロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｃｈｗｅｉｚ）上で精製し、
シトレート−ＮａＯＨ ５０ｍＭ（ｐＨ＝２．５）で溶出し、直ちにトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ＝８） ０．２容量で中和した。この緩衝液をＰＢＳと濃縮機中で交
換した（Ｃｅｎｔｒｉｋｏｎ−３０，Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔｏｎ
，ＴＸ，ＵＳＡ）。
【００８３】 ＦａｓＬとマウスＡＣＲＰ３０との融合物を次のように精製した。上澄液にＮ
ａＣｌ ５０ｍＭ及びＣａＣｌ2 １ｍＭを添加し、ｐＨ値を塩酸／苛性ソーダ
を用いて７．０に調節した。さらに、組み換えられたタンパク質をＭ１−アガロ
ース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｃｈｗｅｉｚ）上に結合させ、ＴＢＳ−ＥＤＴＡ（１０ｍ
Ｍ）中に溶離させた。この緩衝液をＰＢＳと濃縮機中で交換した。精製されたタ
ンパク質の濃度は、ビシンコニン酸−法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）により、標準としてウシ血清アルブミ
ンを使用して測定し、試料の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー−ブルー染
色によって測定した。
【００８４】 ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦα及びＣＤ４０ＬのＡＣＲＰ３０との融合タンパク質は、
それぞれの分析において、濃縮された上澄液の形で提供され、次のように製造し
た：２９３Ｔ−細胞をそれぞれの発言プラスミドを用いてリン酸カルシウム−法
によりトランスフェクションした。この細胞を１６時間沈殿物と一緒にインキュ
ベーションした後、この細胞をＰＢＳで洗浄し、４日間血清不含の培地（Ｏｐｔ
ｉｍｅｍ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中でインキュベートした。この上澄液を最初の
容量の２０分の１にまで濃縮により減少させ、タンパク質の存在を「ウエスタン
−ブロット」により調査した。ＴＲＡＩＬ−ＡＣＲＰ３０及びＴＮＦα−ＡＣＲ
Ｐ３０の場合に、組み換えタンパク質のそれぞれの濃度を測定するために、この
タンパク質の力価を、精製されたトリマーのＴＲＡＩＬ又はＴＮＦαの力価と比
較した。
【００８５】 （ｃ） ゲル浸透クロマトグラフィーによるマルティマーの分子量の調査 多様な融合タンパク質のサイズを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ１０／３
０ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のゲル濾過により測定した。組み換えタンパク質を
、トリマー及びヘキサマーのリガンドの場合に内部標準のカタラーゼ及びオバル
ブミンと一緒に、ＡＣＲＰ３０−融合タンパク質に対してはフェリチン及びオバ
ルブミンと一緒に、２００μｌの容量のカラムに入れ、次いでＰＢＳ（０．１ｍ
ｌ／ｍｉｎ）で溶離し、０．２５ｍｌのフラクションを捕集した。多様なフラク
ション中のタンパク質の存在をトリクロロ酢酸による沈殿の後で「ウェスタン−
ブロット」により測定した。このタンパク質のサイズは、チログロブリン（６６
９ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ）、カタラーゼ（２６２ｋＤａ）、アル
ドラーゼ（１５８ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、オバルブミン
（４３ｋＤａ）、キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）及びリボヌクレアーゼ
Ａ（１３．７ｋＤａ）からなる回帰直線を用いて測定した。
【００８６】 （ｄ） 細胞 マウスＢ−リンパ腫Ａ２０−細胞を、５％熱不活性化ＦＣＳを含有するＤＭＥ
Ｍ中に保持した。ヒトＴ−リンパ管形成−Ｊｕｒｋａｔ−細胞、ＢＪＡＢ Ｂｕ
ｒｋｉｔｔ−リンパ腫細胞を、１０％ＦＣＳを有するＲＰＭＩ中に採った。ヒト
−胚の腎細胞２９３を、２％のＦＣＳを有するＤＭＥＭ Ｍｅｈｅｓｔｏｆｆｍ
ｉｘ Ｆ１２（１：１）中で培養した。全ての培地は抗生物質（ペニシリン、ス
トレプトマイシン、それぞれ５μｇ／ｍｌ及びネオマイシン１０μｇ／ｍｌ）を
含有していた。ＩＬ−２依存性のマウス細胞毒性Ｔ−セルラインＣＴ６を、１０
％のＦＣＳ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、２メルカプトエタノール５０μＭ、
Ｈｅｐｅｓ １０ｍＭ及びコンディショニングしたＥＬ−４細胞上澄液 １０％
を添加したＲＰＭＩ中に採った。
【００８７】 （ｅ） 細胞毒性アッセイ この細胞毒性アッセイを、予め主にＳｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７２：１８８２７−１８８３３，１９９７）に記載されたと同様に実
施した。この場合、５００００個の細胞を１６時間の間に、１００μｌの培地中
でインキュベーションし、その際、この培地はＭ２−抗体１μｇ／ｍｌ（ＴＲＡ
ＩＬについては２μｇ／ｍｌ）の存在又は不在で示されたリガンド濃度を含んで
いた。細胞生存率を、ＰＭＳ／ＭＴＳ（フェナンジンメトスルフェート ３−［
４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−５−［３−カルボキシエトキシフェ
ニル］−２−［４−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、塩）（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて測定した。呈色が必要な
時間（一般に１〜３時間）で行われた。吸光度を４９０ｎｍで測定した。
【００８８】 （ｆ） Ｂ−細胞−増殖アッセイ ＣＤ１９−陽性−細胞を、磁性「ビード」を備えたヒトＰＢＬ（末梢血液リン
パ球）のＦＡＣＳ−選別により選択し、精製し、それに対してＣＤ１９−陰性−
細胞を３０００ｒａｄで放射線照射した。１０００００個の精製されたＣＤ１９
−陽性の細胞を、１０００００個のＣＤ１９−陰性の自己放射線照射されたＰＢ
Ｌと一緒に、滴定された可溶性のＣＤ４０Ｌ−融合タンパク質を有し、Ｍ２−抗
体（１０μｇ／ｍｌを有する又は有しない培地（ＲＰＭＩ １０％ ＦＣＳ、抗
生物質）１２０μｌ中で７２時間に９６ウェル−プレート中でインキュベーショ
ンした。引き続き、この細胞を６時間［3Ｈ］−チミジンと共にパルス負荷し、
液体−シンチレーションカウンタ（“Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏ
ｎ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ”）を用いて組み込みを測定した。
【００８９】 この後は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１８７，
Ｎｒ．８，１９９８，１２０５−１２１３）に記載された実施例の実施のために
使用した方法の記載及び前記文献に参考資料として引用された刊行物を参照する
。
【００９０】 第１の実施例 成分ＡとしてｈＦａｓＬ（ｈ：ヒト）のアミノ酸１０３〜２８１を有し、成分
Ｂとして成分Ａのアミノ酸１０３からＮ−末端の１８アミノ酸長さの配列（ＶＤ
ＬＥＧＳＴＳＮＧＲＱＣＡＧＩＲＬ、いわゆる特異的リンカー）を有する組み換
え融合タンパク質（２）を発現させた。さらに、この融合タンパク質のＮ−末端
（成分ＢのＮ−末端）にはアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するフラッグ−配列及
びそれに続くリンカー−配列ＧＰＧＱＶＱＬＱが連結している（図１）。
【００９１】 比較試験のために、Ｎ−末端が同様に前記のフラッグ−配列、同じＣ−末端に
続くリンカー−配列及びそれのＣ−末端に続くｈＦａｓＬのアミノ酸１３９〜２
８１を有する融合タンパク質（１）を発現させた。融合タンパク質（１）は融合
タンパク質（２）とは、特異的リンカー及びｈＦａｓＬのアミノ酸１０３〜１３
８の欠失により異なる（図１）。
【００９２】 融合タンパク質（１）及び（２）のベクター構築は、（ａ）に記載された方法
によって行った。融合タンパク質の発現及び精製は（ｂ）に示された方法によっ
て行った。
【００９３】 精製された融合タンパク質（１）を還元性の条件下に又は非還元性の条件下に
置き、引き続きゲル電気泳動により分離し（図２）、それぞれのバンドの分子量
のだいたいの測定と関連づけた。
【００９４】 最後に（ｄ）により接種したＡ２０細胞及びＪｕｒｋａｔ−細胞を取り出し、
（ｅ）による細胞毒性アッセイを行った。それぞれ２つのセルラインに対してこ
のアッセイはそれぞれトリマー化した融合タンパク質（１）又は融合タンパク質
（２）のトリマーのバイマー（つまりヘキサマー）の濃度の上昇と共に、アンチ
−フラッグ−Ｍ２−抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｃｈｗｅｉｚ）の存在又
は不在において、実施し（図３）、その間に吸光度をＯＤ４９０ｎｍで測定した
。
【００９５】 第２の実施例 成分ＡとしてｈＦａｓＬのアミノ酸１０３〜２８１を有し、成分Ｂとして成分
Ａのアミノ酸１０３からＮ−末端の１８アミノ酸長さの配列（（ＶＤＬＥＧＳＴ
ＳＮＧＲＱＳＡＧＩＲＬ、いわゆる特異的リンカー）を有する組み換え融合タン
パク質（３）を発現させた。さらに、この融合タンパク質のＮ−末端（成分Ｂの
Ｎ−末端）にはアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するフラッグ−配列及びそれに続
くリンカー−配列ＧＰＧＱＶＱＬＱが連結している（図４）。
【００９６】 比較試験のために、第１の実施例の場合と同様に、融合タンパク質（１）を発
現させた（図４）。
【００９７】 融合タンパク質（３）及び（１）のベクター構築は第１の実施例に記載した方
法により実施した。融合タンパク質の発現及び精製は（ｂ）に示された方法によ
って行った。
【００９８】 最後に（ｄ）により接種したＡ２０細胞及びＪｕｒｋａｔ−細胞を取り出し、
（ｅ）による細胞毒性アッセイを行った。それぞれ２つのセルラインに対してこ
のアッセイはそれぞれ融合タンパク質（３）ののトリマーの濃度の上昇と共に、
アンチ−フラッグ−Ｍ２−抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｃｈｗｅｉｚ）の
存在又は不在において実施し（図５）、その間に吸光度をＯＤ４９０ｎｍで測定
した。
【００９９】 第３の実施例 成分ＡとしてｈＦａｓＬのアミノ酸１３９〜２８１及び成分Ａのアミノ酸１３
９のＮ末端にまず配列ＬＱを有するリンカー−ダイマー及び次いでさらにＮ末端
に成分Ｂとして９４のアミノ酸長さのタンパク質ｍＡＣＲＰ３０（アミノ酸１８
〜１１１）からの配列、オリゴマー化ドメインを有する組み換え融合タンパク質
（４）を発現させた。さらに、この融合タンパク質（４）のＮ−末端（成分Ｂの
Ｎ−末端）にはアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するフラッグ−配列及びそれに続
くリンカー−配列ＧＰＧＱＶＱＬＨが連結している（図６）。比較のために融合
タンパク質（１）を使用した。
【０１００】 融合タンパク質の発現及び精製は（ｂ）に示された方法によって行った。
【０１０１】 最後に（ｄ）により接種したＢＪＡＢ−Ｂｕｒｋｉｔｔ−リンパ腫−細胞を取
り出し、（ｅ）による細胞毒性アッセイを行った。このアッセイは、それぞれ融
合タンパク質（１）のトリマー又は融合タンパク質（４）のオリゴマー化したト
リマー（ドデカマー）、つまり組み換えＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０（４×３）の濃
度の上昇と共に、アンチ−フラッグ−Ｍ２−抗体（Ｓｉｇｍａ，前記参照）の存
在又は不在で実施し（図７）、その際、吸光度をＯＤ４９０ｎｍで測定した。
【０１０２】 第４の実施例 成分ＡとしてｈＴＲＡＩＬ（ｈ：ヒト）のアミノ酸９５〜２８１及び成分Ａの
アミノ酸９５のＮ末端にまず配列ＬＱを有するリンカー−ダイマー及び次いでさ
らにＮ末端に成分Ｂとして９４のアミノ酸長さのタンパク質ｍＡＣＲＰ３０（ア
ミノ酸１８〜１１１）からの配列、オリゴマー化ドメインを有する組み換え融合
タンパク質（５）を発現させた。さらに、この融合タンパク質のＮ−末端（成分
ＢのＮ−末端）にはアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するフラッグ−配列及びそれ
に続くリンカー−配列ＧＰＧＱＶＱＬＨが連結している（図８）。
【０１０３】 比較試験のために、トリマーとして溶液中に存在（ＴＲＡＩＬ−トリマー）す
る融合タンパク質（図８には示されていない）を発現させた。この比較試験タン
パク質はＮ−末端からＣ−末端までフラッグ−配列、配列ＧＰＧＱＶＱＬＨを有
するリンカー及び最後にｈＴＲＡＩＬ（アミノ酸９５〜２８１）を有する。融合
タンパク質（５）と異なるのは、つまり成分Ｂ（ｍＡＣＲＰ３０：アミノ酸１８
〜１１１）及び配列ＬＱを有するリンカーが存在しないところである。
【０１０４】 融合タンパク質の発現及び精製は（ｂ）に示された方法によって行った。
【０１０５】 最後に（ｄ）により接種したＴ−リンパ芽球−Ｊｕｒｋａｔ−細胞を取り出し
、（ｅ）による細胞毒性アッセイを行った。このアッセイは、それぞれＡＣＲＰ
３０−配列を有していない融合タンパク質のトリマー（比較のため）又は融合タ
ンパク質（５）のオリゴマー化したトリマー、つまり組み換えＦａｓＬ−ＡＣＲ
Ｐ３０（５×３）のドデカマーの濃度の上昇と共に、アンチ−フラッグ−Ｍ２−
抗体（Ｓｉｇｍａ，前記参照）の存在又は不在で実施し（図９）、その際、吸光
度をＯＤ４９０ｎｍで測定した。
【０１０６】 第５の実施例 成分ＡとしてｍＴＮＦα（ｍ：マウス）のアミノ酸７７〜２３５及び成分Ａの
アミノ酸８５のＮ末端にまずリンカー−ダイマーＬＱ及び次いでさらにＮ末端に
成分Ｂとして９４のアミノ酸長さのタンパク質ｍＡＣＲＰ３０（アミノ酸１８〜
１１１）からの配列、オリゴマー化ドメインを有する組み換え融合タンパク質（
６）を発現させた。さらに、この融合タンパク質のＮ−末端（成分ＢのＮ−末端
）にはアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するフラッグ−配列及びそれに続くリンカ
ー−配列ＧＰＧＱＶＱＬＨが連結している（図１０）。
【０１０７】 比較試験のために、トリマーとして溶液中に存在（ＴＮＦα−トリマー）する
融合タンパク質（図１０には示されていない）を発現させた。この比較試験タン
パク質はＮ−末端からＣ−末端までフラッグ−配列、配列ＧＰＧＱＶＱＬＨを有
するリンカー及び最後にｍＴＮＦα（アミノ酸７７〜２３５）を有する。融合タ
ンパク質（６）と異なるのは、つまり成分Ｂ（ｍＡＣＲＰ３０：アミノ酸１８〜
１１１）及び配列ＬＱを有するリンカーが存在しないところである。
【０１０８】 融合タンパク質の発現及び精製は（ｂ）に示された方法によって行った。
【０１０９】 （ｆ）による細胞増殖アッセイを用いて、ＴＮＦα−トリマー又はＴＮＦα−
ＡＣＲＰ３０−オリゴマー（ＴＮＦαのホモドデカマー）の添加によりアンチ−
フラッグ−Ｍ２−抗体（Ｓｉｇｍａ，上記参照）の存在で又は不在で、ＣＴ６−
細胞に対して生じる効果を測定した。
【０１１０】 このためＣＴ６−細胞は増殖試験の前に４日間の間、ＥＬ−４−上澄液（２．
５％）の減少させた濃度の存在に置いた。この細胞を９６−ウェル−滴定プレー
ト（４００００細胞／ウェル）中で、１６時間の間に、ＴＮＦα−ＡＣＲＰ３０
−オリゴマー又はｍＴＮＦ−αの示された濃度で、Ｍ２−ｍＡｋ ２μｇ／ｍｌ
の存在又は不在でかつＥＬ−４−上澄液の不在でインキュベーションした。この
細胞をさらに６時間の間、［3Ｈ］チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）と共にパ
ルスをかけ、凍結及び融解の３回のサイクルにさらに、最後に収穫した。この［ 3 Ｈ］チミジン−組み込みを最終的に液体シンチレーションカウンタにより調査
した（図１１）。
【０１１１】 第６の実施例 成分ＡとしてｈＣＤ４０Ｌ（ｈ：ヒト）のアミノ酸１１６〜２６１及び成分Ａ
のアミノ酸９５のＮ末端にまずリンカー−ダイマーＬＱ及び次いでさらにＮ末端
に成分Ｂとして９４のアミノ酸長さのタンパク質ｍＡＣＲＰ３０（アミノ酸１８
〜１１１）からの配列、オリゴマー化ドメインを有する組み換え融合タンパク質
（７）を発現させた。さらに、この融合タンパク質のＮ−末端（成分ＢのＮ−末
端）にはアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するフラッグ−配列及びそれに続くリン
カー−配列ＧＰＧＱＶＱＬＨが連結している（図１２）。
【０１１２】 比較試験のために、トリマーとして溶液中に存在（ＣＤ４０Ｌ−トリマー）す
る融合タンパク質（図１２には示されていない）を発現させた。この比較試験タ
ンパク質はＮ−末端からＣ−末端までフラッグ−配列、配列ＧＰＧＱＶＱＬＨを
有するリンカー及び最後にｈＣＤ４０Ｌ（アミノ酸１１６〜２６１）を有する。
融合タンパク質（７）と異なるのは、つまり成分Ｂ（ｍＡＣＲＰ３０：アミノ酸
１８〜１１１）及び配列ＬＱを有するリンカーが存在しないところである。
【０１１３】 融合タンパク質の発現及び精製は（ｂ）に示された方法によって行った。
【０１１４】 最後に、（ｆ）に記載した細胞増殖アッセイをＰＢＬに関して実施したと同様
に実施し、その際、ＣＤ４０Ｌ−トリマー又はＣＤ４０Ｌ−ＡＣＲＰ３０−オリ
ゴマー（ホモドデカマー）はアンチ−フラッグ−Ｍ２−抗体（Ｓｉｇｍａ，上記
参照）の存在下で又は不在下で添加した（図１３）。
【０１１５】 第７の実施例 ７．１ 実験的な実施 この第７の実施例は、マルティマー化し及びオリゴマー化する成分Ａ及び成分
Ｂとしてレセプターからなる融合タンパク質を扱う。
【０１１６】 （Ａ） ベクター構築 この融合タンパク質を改良されたＰＣＲ−３−ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）から、交換可能なモジュールの順序として、次の順序（５′から３′）で構
築した： （ａ） ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ−モジュール、このモジュールはレセプター
の細胞外ドメインを有しており、その際、Ｋｏｚａｋ−配列ＧＣＣＡＣＣが先行
し（ｈＴＮＦ−Ｒ１（アミノ酸１〜２１１）；ｈ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（アミノ酸
１〜２３９）、ｈ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（アミノ酸１〜２１２）、ｈ−ＴＲＡＩＬ
−Ｒ３（アミノ酸１〜２４０）及びｈＣＤ４０（アミノ酸１〜１９３）の場合又
はｈＦａｓＲ（アミノ酸１〜１７０）の場合、５′−翻訳されない領域の２４個
のヌクレオチドの先行することによる）；（ｂ） ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ−カセッ
ト中の１４−アミノ酸長さのリンカー（ＰＱＰＱＰＫＰＱＰＫＰＥＰＥ）（例え
ば、Ｔｅｒｓｋｉｋｈら（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９４，１６６３に記載されている）；Ｘｈｏｌ／ＮｏｔＩ−モジュー
ル中でのオリゴマー化ドメイン、ＯＰＧ（アミノ酸１８７〜４０１、ここではδ
Ｎ−ＯＰＧとして記載されている）、ＣＭＰ（アミノ酸４５１〜４９３、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ １１５５５５）；ＣＯＭＰ（アミノ酸３２〜７５、ＧｅｎＢａｎｋ
１７０５９９５）の場合に；（ｄ）ＮｏｔＩ／ＸｂａＩ−カセット、これは組み
合わせられたＨｉｓ6−ｍｙｃ−マーキング及び停止コドンを含有する。このオ
リゴマー化ドメインは、Ｎ−末端もしくはＣ−末端でアミノ酸配列ＧＧＣＣ及び
ＡＲＴＰＧＧＧＳに囲まれていた。リンカーは全ての構築のために使用した。Ｆ
ｃ−構築物の場合、「ヒンジ」−領域、ＣＨ２及びＣＨ３−ドメイン及びｈＩｇ
Ｇ１の停止コドンを、前記（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９７） Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ ２７２，１８８２７；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９８） Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１８７，１２０５）に記載したようなＳａｌＩ／ＮｏｔＩ−カセ
ットとしてクローニングした。安定なＨＥＫ−２９３を誘導するセルラインは組
み換えタンパク質の製造のために、前記した方法（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９
９７）上記参照）を用いてＧ４１８ ８００μｇ／ｍｌ中で選択することにより
準備した。
【０１１７】 （Ｂ） 一時的なトランスフェクション ２９３Ｔ−細胞を前記（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９７）上記参照）に記載
したようにＣａＣｌ2−法を用いてトランスフェクションし、ＰＢＳで洗浄し、
その後３日間、血清不含の最適化−培地中でインキュベーションした。上澄液を
３０倍に濃縮し、使用するまで凍結保存した。Ｆａｓ／δＮ−ＯＰＧ及びＦａｓ
／ＣＭＰ−融合タンパク質の濃縮された最適化培地中での濃度は、「ウェスタン ブロット」での滴定を用いて、標準として精製されたＦａｓ／ＣＯＭＰを用い
ながら測定した。
【０１１８】 （Ｃ） 組み換えタンパク質の精製 安定にトランスフェクションされた２９３−細胞の上澄液を、Ｍ２−アガロー
ス（リガンドとして）又はタンパク質−Ａ−セファロース（Ｆｃ−融合タンパク
質）上に置き、ＰＢＳで洗浄し、シトレート−ＮａＯＨ（ｐＨ２．５）５０ｍＭ
で溶離した。この溶離液をトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和し、この緩衝液をＰ
ＢＳとＣｅｎｔｒｉｋｏｎ−３０濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｔｅｘ
ａｓ）中で交換した。ＣＯＭＰ−融合タンパク質及びＣＭＰ−融合タンパク質を
ＨｉＴｒａｐ−キレートカラムで精製した。このために安定にトランスフェクシ
ョンされた２９３−細胞の上澄液にＮａＣｌ ５００ｍＭ及びイミダゾール１０
ｍＭを補充し、ＺｎＳＯ4（ｐＨ２．５）０．５Ｍで予め被覆したカラムを通過
させ、ＰＢＳ中で平衡化させた。このカラムをＰＢＳで洗浄し、タンパク質をＥ
ＤＴＡ ５０ｍＭを有するＰＢＳで溶離した。この緩衝液を前記したようにＰＢ
Ｓと交換した。
【０１１９】 フラッグ−ＦａｓＬ及びフラッグ−ＴＲＡＩＬは、予め（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ
ら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１８８２７及びＴｈｏｍｅら
，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ ３８６，５１７）に記載されたと同様に製造した。
この２つの刊行物は全ての範囲が本発明の対象の開示の構成成分である。フラッ
グ−ＣＤ４０Ｌ（アミノ酸１１６〜２６１）はバクテリア中で発現させ、フラッ
グ−ＴＲＡＩＬについて記載されたと同様にＭ２−アガロース上で精製した。こ
のタンパク質濃度はビシンコニン酸法を用いて測定した。この純度はＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ及びクーマシー−ブルー−マーキングを用いて調査した。
【０１２０】 （Ｄ） ゲル浸透クロマトグラフィー ゲル浸透クロマトグラフィーの範囲内で、それぞれの量の融合タンパク質を２
００μｌの体積でＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ１０／３０ （Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）に置き、ＰＢＳ中で０．５ｍｌ／ｍｉｎで溶離させ、その際、同時に２
８０ｎｍで吸光度を記録した。個々のフラクション（０．２５ｍｌ）を次に記載
したように毒性試験で分析した。分子量の決定のために、カラムを標準タンパク
質のチログロブリン（６６９ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ）、カタラー
ゼ（２６２ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６
７ｋＤａ）、オバルブミン（４３ｋＤａ）、キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤ
ａ）及びリボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）を用いて校正した。
【０１２１】 （Ｅ） 競合ＥＬＩＳＡ 競合ＥＬＩＳＡは次に記載するように実施した。９６「ウェル」−ＥＬＩＳＡ
−プレートをレセプター／Ｆｃ−融合タンパク質（ＰＢＳ中で０．２μｇ／ｍｌ
、１００μｌ、１６時間、２５℃）で被覆した。この「ウェル」は１時間３７℃
でＰＢＳ中で飽和し、その際、ＰＢＳはウシ胎児血清５％（遮断する緩衝液とし
て）を含有した。ｓＣＤ４０Ｌの使用の場合、遮断する緩衝液は脂肪不含のミル
ク４％及びＴｗｅｅｎ−２０ ０．０５％を含有するＰＢＳであった。競合する
Ｆｃ又はＣＯＭＰ−融合タンパク質を、タンパク質Ａ１μｇ／ｍｌの存在又は不
在で、遮断する緩衝液１００ｍｌ中に滅菌して溶かした。このリガンドは一定の
濃度で添加され（ｓＦａｓＬ：２μｇ／ｍｌ、３．６ｎＭ、ｓＴＮＦα：０．０
２μｇ／ｍｌ、０．３６ｍＭ、ｓＴＲＡＩＬ：０．１μｇ／ｍｌ、１．４ｎＭ、
ｓＣＤ４０Ｌ：０．５μｇ／ｍｌ、９．２ｎＭ、全て遮断する緩衝液中で）１時
間の間３７℃で結合させることができた。結合したリガンドをＭ２−アンチ−フ
ラッグ−抗体（遮断する緩衝液中で１μｇ／ｍｌ、１００μｌ、４５分、３７℃
）、ヤギ−アンチマウス−抗体（ペルオキシダーゼとけつごう、遮断する緩衝液
中で１：２０００、１００μｌ、３０分、３７℃）及びｏ−フェニレンジアミン
ヒドロクロリド（クエン酸５０ｍＭ中で０．３ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4、）１
００ｍＭ、Ｈ2Ｏ2 ０．０１％）で同定した。この吸光度は４９０ｎｍで測定し
た。
【０１２２】 （Ｆ） 細胞毒性試験 この際某毒性試験を９６「ウェル」−プレート中で１００μｌの容量で、主に
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，（１９９７）（上記参照）に記載されたように実施した
。キメラレセプターは、９５％を越える細胞死を誘導することができる程度の細
胞毒性リガンドの量を含有する培地中でシリアルに希釈した。記載されたように
、タンパク質Ａを１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ｓＦａｓＬはＭ２ １μｇ／
ｍｌの存在で使用し、ｓＴＲＡＩＬはＭ２ ２μｇ／ｍｌの存在で使用した。Ｍ
２−抗体は一連の試験においてｓＴＮＦαと一緒に使用しなかった。この細胞を
１６時間インキュベーションし、その生存率をＰＭＳ／ＭＴＳ−試験システム（
フェナジンメトスルフェート／３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］
−５−［３−カルボキシメトキシフェニル］−２−［４−スルホフェニル］−２
Ｈ−テトラゾリウム、塩の形で）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ）を使用しながら測定した。吸光度を４９０ｎｍで測定した。多様な
融合タンパク質のモル濃度を表示するために、分子量を次のように査定した：［
（理論上のＭr＋３ｋＤａ／予想したＮ−結合したＧｌｙａｎ）×多重性］。Ｆ
ａｓ：Ｆｃ、：ＣＯＭＰ、：ＣＭＰ、：δＮ−ＯＰＧ：９８，１７２，１００も
しくは１０５ｋＤａ。ＴＲＡＩＬＲ２：Ｆｃ、：ＣＯＭＰ、：ＣＭＰ、：δＮ−
ＯＰＧ：８６，１４３，８２及び９３ｋＤａ。ＴＮＦＲ１：Ｆｃ、：ＣＭＰ：１
０４及び１８７。ＣＤ４０Ｌ：Ｆｃ、：ＣＯＭＰ：１０１及び１８０ｋＤａ。Ｔ
ＲＡＩＬＲ２：Ｆｃ：８６ｋＤａ、ＴＲＡＩＬＲ３：Ｆｃ：１２７ｋＤａ。フラ
ッグ−ＴＲＡＩＬ、フラッグ−ＦａｓＬ、フラッグ−ＴＮＦα、フラッグ−ＣＤ
４０Ｌ：７１、５５，５６もしくは５４ｋＤａ。
【０１２３】 （Ｇ） ＢＩＡｃｏｒｅ−測定 ＢＩＡｃｏｒｅ−測定をＣＭ５−カルボキシメチルデキストラン変性センサー
チップ（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）で、５μｌ／
ｍｉｎの流量速度で実施した。ＣＭ５−チップは、Ｎ−エチル−Ｎ′（３−ジメ
チルアミノプロピル）−カルボジイミド：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの１：
１混合物の５０μｌ−添加で活性化させた。ＮａＨＣＯ3（ｐＨ５．５）１０ｍ
Ｍ中のＭ２−アンチ−フラッグモノクローナル抗体の１００μｇ／ｍｌ溶液６μ
ｌを、次いで活性化した表面上に流した。１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌの５０
μｌ−添加は残留したＨ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを失活させた。こ
の手順のために消費された固定されたＭ２−抗体の量は、約４６００ユニットで
あった。ＦａｓＬ−Ｆａｓ：融合タンパク質及びＴＲＡＩＬ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２
：融合タンパク質の相互作用の分析のために、一定量の標識したリガンドをＭ２
変性表面上に固定した。この達成のために、フラッグ−ＦａｓＬ又はフラッグ−
ＴＲＡＩＬ ２．５μ／ｍｌの７μｌ−添加量をこの表面に塗布した。これによ
り約１００〜１５０ユニットが結合した。この条件は、その他にＭ２−表面から
リガンドの最小の解離を許容し、一方で同時に分析のために十分な次のレセプタ
ー結合を許容する。次いでレセプター：融合タンパク質の結合を、１〜１００μ
ｇ／ｍｌの濃度、１００〜１５０ユニットに相当の精製されたレセプター：融合
タンパク質の１５μｌ注入により分析した。この会合速度を３分間測定し、解離
速度を３〜５分間測定した。次いで、この表面をシトレート−ＨＣｌ（ｐＨ２．
５）５０ｍＭの５μｌ−添加により（簡単なＭ２−表面に）再生した。３０回連
続するまでの結合及び再生の推移を、固定されたＭ２−抗体の結合特性の明らか
な変化がなく実施できた。この解離速度及び会合速度は、製造元の反応速度分析
プログラムを用いてモデルＡＢ＝Ａ＋Ｂ及びＡ＋Ｂ＝ＡＢを使用しながら分析し
た。
【０１２４】 （Ｈ） 第１マウス−肝細胞の培養 第１マウス−肝細胞の培養のためにＣ５７ＢＬ／６マウスを犠牲にし、胆管上
方の肝臓領域を即座に切除し、これを「肝細胞−アタッチメント−培地」（ＨＡ
Ｍ）中に保持した。この肝臓領域をまずＨｅｐｅｓ １０ｍＭ（ｐＨ７．６）１
６ｍｌで灌流させ、赤血球を除外し、次いでＨｅｐｅｓ（４ｍＭ ＣａＣｌ2）
中の０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）１２ｍｌで処理し、次いでペトリ皿中でＨｅｐｅｓ中でホモジナイズドし
た。この細胞をＨｅｐｅｓ中で洗浄し、次いで遠心分離（１００×ｇ、３０秒）
し、ＨＡＭ中の６０％の等張パーコール溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中に再懸濁
させ、さらに遠心分離（７００×ｇ、２分）した。全ての緩衝液及び培地を３７
℃で添加した。沈殿した細胞をＨＡＭ中に再懸濁させ、カウントし、平板シャー
レ状のマイクロタイタープレート上に置き（ウェル１つあたり１００００、２０
０μｌ）、相応して付着させることができた。実験混合物（シリアルに希釈した
インヒビター、ｓＦａｓＬ、最終濃度：４００ｎｇ／ｍｌ、７ｎＭ）及びＭ２−
抗体（最終濃度：１μｇ／ｍｌ）を添加し、この細胞をさらに６時間インキュベ
ーションした。この上澄液を取り除き、新鮮なＨＡＭ（１００μｌ）を添加し、
上記したような生存能力試験ＰＭＳ／ＭＴＳを実施した。
【０１２５】 （Ｉ） 活性化誘導された細胞死 平板シャーレ状のマイクロタイタープレートをＰＢＳ中のアンチ−ヒトＣＤ３ ＴＲ６６（１０μｇ／ｍｌ）で３時間３７℃で被覆した。このプレートをＰＢ
Ｓ中で２回洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０培地で１回洗浄した。Ｊｕｒｋａｔ−細
胞（１ｍｌあたり５×１０5細胞、１００μｌ）をインヒビターと混合し、各「
ウェル」に分配し、次いで遠心分離（２００×ｇ、３ｍｉｎ）し、２４時間の間
３７℃でインキュベーションした。この細胞生存能力（ＯＤ４９０ｎｍで）を、
前記したように測定した。特異的な細胞保護率（％で）を次のように計算した：
［（アンチ−ＣＤ３＋インヒビター）−（アンチ−ＣＤ３）］／［（対照）−（
アンチ−ＣＤ３）］×１００。
【０１２６】 混合した白血球培養の準備のために、パーフォリン−欠損した又はｇｌｄ Ｃ
５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b）からの脾臓細胞をＢａｌｂ／ｃ−マウス（Ｈ−
２d）からの脾臓細胞と一緒に５日間培養した。その使用の前に生命力のない細
胞を試料から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ）で勾配−遠心分離により除去した。マーキングを前記した方法（Ｋａｔａｏ
ｋａら）により実施した。簡単に説明すると、目標細胞（Ａ２０−細胞）をナト
リウム［51Ｃｒ］−クロメート（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて
１時間の間にマーキングし、次いでＲＰＭＩ １６４０で３回洗浄した。ＭＬＣ
−細胞を目標細胞（「ウェル」あたり１０4個の細胞）とＵ字形のマイクロタイ
タープレート中でＦａｓ：Ｆｃ及びＦａｓ：ＣＯＭＰの存在又は不在で、４０μ
ｇ／ｍｌの場合に２００ｍｌの最終容量で混合し、このプレートを遠心分離（２
００×ｇ、３ｍｉｎ）した。４時間インキュベーションした後に上澄液を除去し
、放射能を測定した。この特異的［51Ｃｒ］−遊離率（％で）を次の式を用いて
決定した：［（実験による遊離−自発的遊離）／（最大遊離−自発的遊離）］×
１００。
【０１２７】 （Ｋ） ＦＡＣＳ−マーキング ＦＡＣＳ−マーキングのために、ＣＤ４０Ｌ+−Ｊｕｒｋａｔ−クローン−Ｄ
１．１（５×１０5個の細胞）を、ＦＡＣＳ−緩衝液中のＣＤ４０：ＣＯＭＰ
２μｇ（ＰＢＳ、ウシ胎児血清１０％及びＮａＮ3 ０．０２％）と一緒にイン
キュベーションした。Ｆａｓ：ＣＯＭＰをネガティブな対照として使用した。レ
セプター：ＣＯＭＰを９Ｅ１０アンチ−ｍｙｃ−抗体１μｇを用いて、及び引き
続きＦＩＴＣマーキングしたヤギ−アンチ−マウス−抗体（１：１００）を用い
る処理で検出した。インキュベーションを４℃で２０分間でＦＡＣＳ−緩衝液５
０μｌ中で実施した。
【０１２８】 （Ｌ） Ｂ−細胞−増殖試験 Ｂ−細胞−増殖アッセイのために、ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）からのＣ
Ｄ１９+−細胞を、磁性の「ビード」（小球）を用いて精製し、残りのＣＤ１９- −細胞を照射した（３０００ｒａｄ）。１０5個の精製されたＣＤ１９+−細胞を
１０5個のＣＤ１９-自己由来した照射されたＰＢＬと、培地１２０μｌ中で混合
し、この培地はｓＣＤ４０Ｌを１００ｎｇ／ｍｌ（１．８ｎＭ）の濃度で、Ｍ２
−抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で、プラス又はマイナスのタンパク質Ａを１μｇ
／ｍｌの濃度で、及びＣＤ４０：Ｆｃ又はＣＤ４０：ＣＯＭＰの記載された濃度
で含有する。この細胞を次いで７２時間９６ウェル−プレート中で培養し、６時
間［3Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）と共にパルスをかけ、収穫した。この
［3Ｈ］チミジン組み込みを液体−シンチレーションカウントにより調査した。
【０１２９】 ７．２ 第７の実施例の結果 ＩｇＧのＦｃ−部分（レセプター：Ｆｃ）に融合したレセプターの細胞外ドメ
インからなる融合タンパク質はレセプターリガンド−相互作用の研究のためにイ
ンヒビター性の抗原として先行技術から公知である。第７の実施例において精製
したＦａｓ：Ｆｃ−融合タンパク質のサイズを排除クロマトグラフィーにより調
査し、個々のピークを期待された保持時間で溶離した。Ｆａｓ：Ｆｃ含有フラク
ションは、可溶性ＦａｓＬ（ｓＦａｓＬ）の致死投与量にさらされたＡ２０−細
胞を細胞死から保護することができたが、しかしながら、試験においてＦａｓ：
ＦｃとＦａｓＬとの評価した割合が約１０００であるように配慮する場合に、保
護（５０５まで）の程度は著しく低かった。
【０１３０】 弱い保護活性は溶離液のより早い時期の若干のフラクションにおいても観察さ
れ、これらのフラクションはおそらくわずかな検出不可能な量のＦａｓ：Ｆｃの
高分子量複合体を有していた。本発明により、融合タンパク質のこの種のより高
い凝集体をＦａｓＬにより誘導される細胞死の有力なインヒビターとして機能で
きることは明らかである。従って、まず免疫グロブリンに交差架橋する薬剤のタ
ンパク質Ａを添加することにより、この凝集したＦａｓ：Ｆｃの高分子量フラク
ションを高めた。注入したＦａｓ：Ｆｃ約１０％だけを早期に溶離したフラクシ
ョンにずらした条件でこの分析を実施した場合、高分子量のＦａｓ：Ｆｃ−複合
体はＦａｓＬにより誘導される細胞毒性の有効なアンタゴニストであることが明
らかとなった。これと比べて、残りのＦａｓ：Ｆｃ−フラクションがいまだにダ
イマーとして溶離しかつ１０倍より赤い濃度であっても細胞に対して部分的な保
護しか提供しないことが明らかになった。本発明の場合に、個のだ７の実施例の
結果は、より高いＦａｓ：Ｆｃ−凝集物の形成が特異的な保護活性を著しく高め
ることを示した。
【０１３１】 この認識に基づいて、従って、Ｆａｓのオリゴマー化度の拡大に基づきＦａｓ
Ｌに対してより良好な活性を示しかつインヒビター特性を改善する融合タンパク
質からなる本発明による複合体を構築した。本発明による融合タンパク質は例え
ば、ＴＮＦ−ファミリーのレセプターの細胞外ドメイン、例えばＦａｓ、ＴＲＡ
ＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＮＦ−Ｒ１又はＣＤ４０
、１４アミノ酸長さを越えるリンカーと、いわゆる軟骨オリゴマーマトリックス
タンパク質（（ＣＯＭＰ）；レセプター：ＣＯＭＰとして表す融合タンパク質）
又はいわゆる軟骨マトリックスタンパク質（（ＣＭＰ）；レセプター：ＣＭＰと
して表す融合タンパク質）のオリゴマー化するドメインとが融合されているよう
なものである。このマトリクス−タンパク質もしくはそのドメインは、天然の特
性を有し、コイルド−コイル−構造のペンタマーもしくはトリマーを形成する。
前記の融合タンパク質（並びに対照としてのレセプター：Ｆｃ−融合タンパク質
）は哺乳動物細胞中で発現し、金属キレート化ラム上で又はタンパク質Ａ上での
アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。このレセプターＦａｓ及びＴ
ＲＡＩＬ−Ｒ２は第７の実施例において、タンパク質のＣ−末端のダイマー化ド
メインにＴＮＦ−ファミリーからのオステオプロテゲリンが結合されていた（レ
セプター：δＮ−ＯＰＧ）。
【０１３２】 ＣＯＭＰ又はＣＭＰに融合されたこのレセプターは、非還元性の条件下でポリ
アクリルアミドゲル中でゆっくりと移行させることにより示すことができるよう
にオリゴマー化する。Ｆａｓ：ＣＯＭＰ及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２：ＣＭＰは、ゲル
−浸透クロマトグラフィー法を使用した場合に約４００もしくは１７０ｋＤａの
明白な分子量を有する十分に限定された「ピーク」として溶離した。この分子量
は融合タンパク質のペンタマーもしくはトリマーの構造と一致する。第７の実施
例の試験から、従って、前記のマトリックスタンパク質のコイルド−コイル−オ
リゴマー化ドメインの凝集特性は、ＴＮＦ−レセプターファミリーのタンパク質
（又はタンパク質ドメイン）に融合することによっても悪い影響を及ぼさないと
結論づけることができる。
【０１３３】 この融合タンパク質Ｆａｓ：ＣＯＭＰは、載せられたＦａｓ：Ｆｃに対してｓ
ＦａｓＬ−結合をめぐって競合することがある場合、この融合タンパク質Ｆａｓ
：ＣＯＭＰはＦａｓ：Ｆｃよりも低いＫDを示す。この結果の一致において、Ｆ
ａｓＬ−Ｆａｓ：ＣＯＭＰ−相互作用について０．７７ｎＭの解離定数が測定さ
れ、これはＦａｓ：Ｆｃに対する比較値よりも約８〜９倍低い。著しく多数の試
験されたセルラインにおいて、Ｆａｓ：ＣＯＭＰの阻害活性は、ダイマーの融合
タンパク質Ｆａｓ：Ｆｃに対する阻害活性よりも約１０倍〜２０倍高く、交差架
橋するタンパク質Ａにより生じたＦａｓ：Ｆｃ−凝集体（Ｆａｓ：Ｆｃ／ＰＡ）
に対する結果は、Ｆａｓ：ＣＯＭＰについての値及びＦａｓ：Ｆｃについての値
の間の値を示した。ダイマーのＦａｓ：δＮ−ＯＰＧ−融合タンパク質の保護活
性は、ダイマーのＦａｓ：Ｆｃ−複合体の保護活性と比較可能であった。トリマ
ーのＦａｓ：ＣＭＰは、ｓＦａｓＬにより媒介された溶菌をほぼＦａｓ：Ｆｃ／
ＰＡと同じ程度有効に阻害し、結果として、つまりＦａｓ：ＣＯＭＰよりも５倍
少ない有効性であった。Ｆａｓ：ＣＯＭＰの阻害活性は良好であり、ＦａｓＬに
より遮断されたモノクローナル抗体Ｎｏｋ−１、４Ｈ９及び４Ａ５よりも良好で
あった。Ｆａｓ：Ｆｃ−複合体と比較したＦａｓ：ＣＯＭＰの優秀な阻害活性は
、初期マウス肝細胞を用いた試験から又はアンチ−ＣＤ３活性化されたＪｕｒｋ
ａｔ−細胞を用いた活性化誘導された細胞死についてのモデルシステムからも明
白である。全てのこの試験において、Ｆａｓ：Ｆｃ／ＰＡについては平均的な保
護作用値を示した。さらに、Ｆａｓ：ＣＯＭＰが、ＣＴＬｓで発現されたＦａｓ
Ｌの作用を阻害するかどうかが試験された。Ａ２０−細胞の４時間の試験系にお
ける細胞死は、パーフォリン及びＦａｓＬ−依存性のシグナル伝達経路に依存す
る、それというのもパーフォリン並びにＦａｓＬ欠損しているＣＴＬｓはこの細
胞に関して作用を示さないからである。相応する試験において、Ａ２０−細胞は
期待通りにパーフォリン−誘導したＣＴＬｓ並びにＦａｓＬ−誘導したＣＴＬｓ
を殺した。Ｆａｓ：Ｆｃ及びＦａｓ：ＣＯＭＰは特異的に、パーフォリン−欠損
したＣＴＬｓにさらされた細胞に対する一定の程度の保護を引き起こした。
【０１３４】 競合ＥＬＩＳＡによるｓＣＤ４０ＬのＣＤ４０：Ｆｃ、ＣＤ４０：ＦＣ／ＡＣ
又は本発明によるＣＤ４０：ＣＯＭＰに対する親和性の比較において、ペンタマ
ー化されたレセプターについて親和性の著しい向上（３０倍）が観察され、一方
ＣＤ４０：ＦＣ／ＡＣについて中程度の効果（８倍）が生じた。ＣＤ４０：ＣＯ
ＭＰが膜結合するＣＤ４０Ｌも認識できるかどうかの問題に関して、膜タンパク
質ＣＤ４０Ｌを構成的に発現するＪｕｒｋａｔ−誘導化されたセルラインＤ１．
１はＦＡＣＳ−マーキング分析の実施のためにＣＤ４０−融合タンパク質を試料
として使用して実施した。明らかなマーキングが本発明によるＣＤ４０：ＣＯＭ
Ｐについて観察され、それによりＣＤ４０−ＣＯＭＰは実際に天然のプロセッシ
ングされていないＣＤ４０Ｌと結合できることが示された。ＣＤ４０Ｌ−融合タ
ンパク質の生体システム中での特異的活性を試験するために、アンチ−Ｂ−細胞
−レセプターで共刺激されているＣＤ４０Ｌ依存するヒトＢ−細胞の増殖を阻害
することを試験した。ＣＤ４０：ＦｃもＣＤ４０：ＦＣ／ＡＣも、高い投与量で
投与した場合であっても明らかに増殖に悪い影響を及ぼすことなかった。これと
は反対に、本発明によるＣＤ４０：ＣＯＭＰは、比較的低い投与量の場合ですで
に増殖を遮断することができた。
【０１３５】 要約すると、本発明による実施例の試験から、ＦａｓＬ−誘導化されたアポト
ーシスの競合するインヒビターによる阻害がオリゴマー化度に依存して増大し、
かつ多様なインヒビターの比活性（そのそれぞれのＩＣ50−値の割合として表す
）は多様なセルラインに対して比較的一定にとどまることが確認された。本発明
によるＦａｓ：ＣＯＭＰのＦａｓ：Ｆｃと比較して高められた阻害作用は、おそ
らくその高い抗体結合力の結果である。同様の結果が、本発明によるＣＤ４０−
融合タンパク質の活性についても測定された。本発明によるＣＤ４０：ＣＯＭＰ
は、インビトロでプライマリーＤ−細胞のＣＤ４０Ｌ−誘導された増殖の阻害に
おいてＣＤ４０：Ｆｃを明らかに上回っている。従って、実施例７の結果は、例
えばＦａｓ及びＣＤ４０のようなレセプターに対して、低ナノモーラル領域で解
離定数は得られ、これは天然でこのリガンドに対して中程度の親和性を特徴付け
ており、本発明により考慮されるような融合タンパク質の構成単位である場合、
比較的高いオリゴマー化度により特徴付けられることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、１文字コードで、本発明によるオリゴマー（ＦａｓＬ−ヘキサマー）
の、つまりトリマーのバイマーの形で出現する組み換えられた本発明による融合
タンパク質（２）のアミノ酸配列を示す。
【図２】 図２は、図２Ａに本発明による、つまり特異的なリンカー配列（成分Ｂ）を有
する融合タンパク質（２）の、還元性の条件下（ｒ）で及び非還元性の条件下（
ｎｒ）でのゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を、そして図２Ｂに本発明
によるオリゴマー、この場合、本発明による融合タンパク質もしくは融合タンパ
ク質（２）のトリマーのバイマーを示す。
【図３Ａ】 図３Ａは、Ａ２０−細胞（図３Ａ及び３Ｂ）に関して示す。
【図３Ｂ】 図３ＢはＪｕｒｋａｔ−細胞（図３Ｃ及び３Ｄ）に関して示す。
【図４】 図４は、特異的なリンカー領域（融合タンパク質（３）の成分Ｂ）における（
Ｃ→Ｓ）−置換を考慮した、本発明による融合タンパク質（３）のアミノ酸配列
を示す（スーパー−ＦａｓＬ）。
【図５Ａ】 図５ＡはＡ２０−細胞生存能力を示す。
【図５Ｂ】 図５ＢはＪｕｒｋａｔ−細胞（図５Ｄ）生存能力を示す。
【図６Ａ】 図６Ａは本発明による融合タンパク質（４）、ＦａｓＬ−ＡＣＲＰ３０のアミ
ノ酸配列を示する。
【図６Ｂ】 図６Ｂはもう一つの融合タンパク質が示す。
【図６Ｃ】 図６Ｃは曲線の推移を示す。
【図７】 図７は図３と同様に、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（▲）で又は不在（
△）での、バイマー化できない又はオリゴマー化できないＦａｓＬ−トリマー（
図１による融合タンパク質（１）をベースとする比較試験、図７Ａ）及び本発明
によるオリゴマー、この場合トリマーのテトラマー、図６によるつまり本発明に
よる融合タンパク質（４）のドデカマーの添加によるＢＪＡＢ−細胞の生存能力
を示す。
【図８】 図８は本発明による融合タンパク質（５）のアミノ酸配列を示す。
【図９】 図９は、アンチ−フラッグ−抗体Ｍ２の存在（▲）で又は不在（△）で、バイ
マー化能力又はオリゴマー化能力のない先行技術によるＴＲＡＩＬ−トリマー（
Ｎ−末端にフラッグ配列及びヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜２８１を有する融
合タンパク質）（比較試験、図９Ａ）の添加による及び本発明による融合タンパ
ク質（５）、ＴＲＡＩＬ−ＡＣＲＰ３０の本発明によるドデカマーの添加による
Ｊｕｒｋａｔ−細胞の生存能力を示す。
【図１０】 図１０は本発明による融合タンパク質（６）のアミノ酸配列を示す。
【図１１】 図１１は、細胞増殖試験の結果を示す。
【図１２】 図１２は本発明による融合タンパク質（７）のアミノ酸配列を図１２す。
【図１３】 図１３は、図１１においても示したように、細胞増殖試験の結果を示す。
【図１４】 図１４はオリゴマー化されたマルティマーの構造を図式的に示す。
【図１５Ａ】 図１５Ａはもう一つの本発明による融合タンパク質、つまりｈＥＤＡ／Ｆａｓ
Ｌの構造を示す。
【図１５Ｂ】 図１５Ｂは本発明による融合タンパク質ｈＥＤＡ／ＦａｓＬを用いた試験を示
す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１０月３日（２００２．１０．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/02 Ａ６１Ｋ 39/08 39/04 39/12 39/05 39/13 39/08 39/145 39/12 39/20 39/13 Ａ６１Ｐ 5/00 39/145 29/00 39/20 31/04 Ａ６１Ｐ 5/00 31/12 29/00 35/00 31/04 37/06 31/12 43/00 １０５ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/005 37/06 14/195 43/00 １０５ 14/44 Ｃ０７Ｋ 14/005 14/47 14/195 14/475 14/44 14/52 14/47 14/525 14/475 14/575 14/52 14/705 14/525 16/18 14/575 19/00 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 19/00 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 15/00 ＺＮＡＡ 1/19 5/00 Ａ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 5/10 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA61 BA80 CA04 CA07 DA02 DA05 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA11 4B065 AA26X AA90X AA91X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4C084 AA02 CA01 CA04 CA11 CA53 DA01 DA12 DB01 DB52 MA52 MA55 NA14 ZB082 ZB112 ZB262 ZB332 ZB352 ZB382 ZC022 ZC552 4C085 AA03 BA02 BA51 BA53 BA63 BA69 CC07 CC08 DD62 4H045 AA10 AA30 BA10 BA41 CA01 CA11 CA40 CA50 DA01 DA30 DA50 DA75 EA22 EA29 EA31 EA50 FA74

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマ
    ー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマーにおいて、前記の組み換え融合タン
    パク質が少なくとも１つの成分Ａ及び少なくとも１つの成分Ｂを有し、その際、
    成分Ａは生物学的機能を有する、特に抗体に対する、可溶性又は膜質のシグナル
    分子に対する又はレセプターに対するリガンド機能を有するタンパク質又はタン
    パク質断片、又は抗体又は抗体の断片を有し、成分Ｂは、第３の分子の作用なし
    で、組み換えタンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーを
    バイマー化するか又はオリゴマー化するタンパク質又はタンパク質断片を有する
    ことを特徴とする、組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマ
    ー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマー。
  2. 【請求項２】 ダイマー、トリマー、クアトロマー、又はペンタマー中の融
    合タンパク質の成分Ａが同じ又は異なっていることを特徴とする、請求項１記載
    の組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマー
    のバイマー又はオリゴマー。
  3. 【請求項３】 組み換え融合タンパク質の成分Ａがペプチドホルモン、成長
    因子、サイトカイン、インターロイキン、これらの断片又は前記の配列の機能的
    誘導体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の組み換え融合タンパク質
    のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマー
    。
  4. 【請求項４】 組み換え融合タンパク質の成分Ａが、ＴＮＦ−サイトカイン
    の種類からのサイトカイン、このようなＴＮＦ−サイトカインの断片又は前記の
    配列の機能的誘導体であることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１
    項記載の組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペン
    タマーのバイマー又はオリゴマー。
  5. 【請求項５】 組み換え融合タンパク質の成分ＡがＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、
    ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−α、ＣＤ３０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、
    Ｌｔａ、Ｌｔａｂ２、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４１−ＢＢ、ＧＩＴＲＬ、ＡＰ
    ＲＩＬ、ＥＤＡ、ＶＥＧＩ及びＢＡＦＦからなるグループから選択されるＴＮＦ
    −サイトカインまたはＴＮＦ−サイトカインの断片、又は前記配列の機能的誘導
    体であることを特徴とする、請求項４記載の組み換え融合タンパク質のダイマー
    、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマー。
  6. 【請求項６】 組み換え融合タンパク質の成分Ａがウイルス性、バクテリア
    性又は原虫性の病原体の抗原又は抗原の断片であることを特徴とする、請求項１
    又は２記載の組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又は
    ペンタマーのバイマー又はオリゴマー。
  7. 【請求項７】 組み換え融合タンパク質の成分Ａがウイルス性、バクテリア
    性又は原虫性の病原体の表面抗原又は表面抗原の断片であることを特徴とする、
    請求項６記載の組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又
    はペンタマーのバイマー又はオリゴマー。
  8. 【請求項８】 ダイマー、トリマー、クアトロマー、又はペンタマー中の融
    合タンパク質の成分Ａが連結したレセプターアゴニスト又はレセプターアンタゴ
    ニストを有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１又は２記載の組
    み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバ
    イマー又はオリゴマー。
  9. 【請求項９】 融合タンパク質の成分ＢがＣ１ｑ−タンパク質及びコレクチ
    ンの種類からなるグループから選択されるタンパク質のマルティマー化する又は
    オリゴマー化する断片又はこのような断片の機能的誘導体を有することを特徴と
    する、請求項１から８までのいずれか１項記載の組み換え融合タンパク質のダイ
    マー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマー。
  10. 【請求項１０】 成分Ｂが、Ｃ１ｑ、ＭＢＰ、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｄ、ＢＣ、
    ＣＬ−４３及びＡＣＲＰ３０からなるグループから選択されるタンパク質のマル
    ティマー化する又はオリゴマー化する断片又はその機能的誘導体を有することを
    特徴とする、請求項９記載の組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、ク
    アトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマー。
  11. 【請求項１１】 成分Ｂは、ｍＡＣＲＰ３０のアミノ酸１８〜１１１の配列
    について図６Ａにより示したアミノ酸配列又はその機能的誘導体、又はｈＡＣＲ
    Ｐ３０のアミノ酸１８〜１０８の配列について図６Ｂにより示したアミノ酸配列
    又はその機能的誘導体を有し、この場合、図６Ａ及び６Ｂはこの請求項の構成要
    素であることを特徴とする、請求項１０記載の組み換え融合タンパク質のダイマ
    ー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマー。
  12. 【請求項１２】 成分Ｂが８〜２０個のアミノ酸の配列を有し、この配列が
    組み換え融合タンパク質のダイマー又はマルティマーをバイマー化する又はオリ
    ゴマー化することを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載の組み
    換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイ
    マー又はオリゴマー。
  13. 【請求項１３】 成分Ｂが１又は複数のジスルフィド架橋を形成することを
    特徴とする、請求項１２記載の組み換え融合タンパク質のダイマー、トリマー、
    クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマー。
  14. 【請求項１４】 成分Ｂがアミノ酸配列ＬＥＧＳＴＳＮＧＲＱＣＡＧＩＲＬ
    又はその機能的誘導体を有することを特徴とする、請求項１３記載の組み換え融
    合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又
    はオリゴマー。
  15. 【請求項１５】 成分Ｂが配列ＬＥＧＳＴＳＮＧＲＱＳＡＧＩＲＬ又はその
    機能的誘導体を有することを特徴とする、請求項１２記載の組み換え融合タンパ
    ク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴ
    マー。
  16. 【請求項１６】 マルティマー化されたか又はオリゴマー化された融合タン
    パク質が、抗体による認識及び架橋のための抗原性断片を有することを特徴とす
    る、請求項１から１５までのいずれか１項記載の組み換え融合タンパク質のダイ
    マー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又はオリゴマー。
  17. 【請求項１７】 融合タンパク質が成分Ａ及び成分Ｂの間にリンカー配列を
    有することを特徴とする、請求項１から１６までのいずれか１項記載の組み換え
    融合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー
    又はオリゴマー。
  18. 【請求項１８】 融合タンパク質が２つ又はそれ以上の異なる成分Ｂをを有
    することを特徴とする、請求項１から１７までのいずれか１項記載の組み換え融
    合タンパク質のダイマー、トリマー、クアトロマー又はペンタマーのバイマー又
    はオリゴマー。
  19. 【請求項１９】 医薬の製造のための、請求項１から１８までのいずれか１
    項記載のバイマー又はオリゴマーの使用。
  20. 【請求項２０】 過剰炎症性障害、自己免疫疾患、高アポトーシス反応又は
    低アポトーシス反応に起因する疾患、感染性疾患、特にウイルス性の感染性疾患
    、腫瘍疾患、特にリンパ系の腫瘍及び／又は内分泌疾患の治療のための医薬の製
    造のための、請求項１から１８までのいずれか１項記載のバイマー又はオリゴマ
    ーの使用。
  21. 【請求項２１】 感染性疾患、特にウイルス性感染性疾患に対する能動的又
    は受動的免疫化のためのワクチンの製造のための、請求項１から１８までのいず
    れか１項記載のバイマー又はオリゴマーの使用。
  22. 【請求項２２】 風疹、麻疹、ポリオ、狂犬病、破傷風、ジフテリア、ＢＣ
    Ｇ、結核、マラリア、黄熱、ＨＩＶ又はインフルエンザに対するワクチン化のた
    めの請求項２１記載のワクチンの製造のための、請求項１から１８までのいずれ
    か１項記載のバイマー又はオリゴマーの使用。
  23. 【請求項２３】 腸管外又は経口投与のための、請求項１９又は２０記載の
    医薬の製造のため又は請求項２１又は２２記載のワクチンの製造のための、請求
    項１から１８までのいずれか１項記載のバイマー又はオリゴマーの使用。
  24. 【請求項２４】 インビトロ診断のための、請求項１から１８までのいずれ
    か１項記載のバイマー又はオリゴマーの使用。
  25. 【請求項２５】 組み換え融合タンパク質が１つの成分Ａ及び１つの成分Ｂ
    を有し、その際、成分Ａは生物学的機能を有する、特に抗体に対する、可溶性又
    は膜質のシグナル分子に対する又はレセプターに対するリガンド機能を有するタ
    ンパク質又はタンパク質断片、又は抗体又は抗体の断片を有し、成分Ｂは、Ｃ１
    ｑ−タンパク質又はコレクチンの種類からなるグループから選択される、マルテ
    ィマー化する及びオリゴマー化する断片又はこのような断片の機能的誘導体を有
    することを特徴とする、融合タンパク質。
  26. 【請求項２６】 融合タンパク質の成分Ｂが、Ｃ１ｑ、ＭＢＰ、ＳＰ−Ａ、
    ＳＰ−Ｄ、ＢＣ、ＣＬ−４３及びＡＣＲＰ３０からなるグループから選択される
    タンパク質のマルティマー化する又はオリゴマー化する断片又はその機能的誘導
    体を含有することを特徴とする、請求項２５記載の融合タンパク質。
  27. 【請求項２７】 ＤＮＡ−配列が請求項２５又は２６記載の融合タンパク質
    をコードすることを特徴とする、ＤＮＡ−配列。
  28. 【請求項２８】 発現ベクターが請求項２７記載のＤＮＡ−配列を有するこ
    とを特徴とする、発現ベクター。
  29. 【請求項２９】 宿主細胞が請求項２８記載の発現ベクターでトランスフェ
    クションされていることを特徴とする、宿主細胞。
  30. 【請求項３０】 成分Ａ及び成分Ｂを有する組み換え融合タンパク質のダイ
    マー又はマルティマーにおいて、成分Ａはレセプター又はレセプターの断片又は
    誘導体を有し、成分Ｂは、免疫グロブリン、Ｃ１ｑ−タンパク質又はコレクチン
    の種類からなるグループから選択されるタンパク質のマルティマー化する断片を
    有することを特徴とする、組み換え融合タンパク質のダイマー又はマルティマー
    。
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