ES2307550T3

ES2307550T3 - Di-u oligomero de un di-, tri-,tetra- o pentametro de proteinas de fusion recombinantes.

Info

Publication number: ES2307550T3
Application number: ES00987425T
Authority: ES
Inventors: Jurg Tschopp; Pascal Schneider; Nils Holler
Original assignee: Topotarget Switzerland SA
Current assignee: Topotarget Switzerland SA
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 2000-12-20
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2020-12-20
Also published as: WO2001049866A1; US20030053984A1; IL150215A; CA2395632C; CN1526020A; BR0017054A; US20130202552A1; ZA200205069B; AU783833B2; US20040235117A1; EP1985706A2; AU2367301A; EP1985706A3; CN100385002C; ATE397076T1; IL150215A0; KR100767980B1; US20120009211A1; JP2003518949A; EP1246925B1

Abstract

Proteína de fusión, caracterizada porque la proteína de fusión recombinante contiene un componente A y un componente B, siendo el componente A una sección extracelular de una citoquina TNF y el componente B una sección multimerizante y oligomerizante de una proteína ACRP30, que multimeriza y oligomeriza la proteína de fusión sin la acción de moléculas terceras.

Description

Di- u oligómero de un di-, tri-, tetra- o pentámero de proteínas de fusión recombinantes.

La presente invención se refiere a di- u oligómeros de di-, tri-, tetra- o pentámeros de proteínas de fusión recombinantes, presentando las proteínas de fusión recombinantes por lo menos un componente A y por lo menos un componente B. Además, la presente invención se refiere a la utilización de di- u oligómeros de este tipo para la preparación de un medicamento u a su utilización para el diagnóstico in vitro. Finalmente, la presente invención se refiere también a proteínas de fusión que comprenden un componente A y un componente B, comprendiendo el componente B una sección multimerizante y oligomerizaante o un derivado funcional de la misma, seleccionada del grupo constituido por la clase de las proteínas C1q o de las colectinas. La presente invención se refiere también a secuencias de ADN que codifican para una proteína de fusión de este tipo, así como a vectores de expresión y células hospedadoras que contienen la secuencia de ADN o el vector de expresión.

Las proteínas que ocurren fisiológicamente como di-, tri-, tetra- o pentámeros se encuentran naturalmente en gran número. Las interacciones en las superficies de dichas proteínas di- o multimerizantes en solución pueden dar lugar a aglomeraciones de proteínas espontáneas o bien retrasadas, por ejemplo, cinéticamente, puesto que las mismas dependen de la concentración o del medio. Esto se debe a las interacciones hidrófobas, enlaces de los puentes de hidrógeno y/o las fuerzas de Coulomb.

Sin embargo, además de esto, en proteínas determinadas pueden encontrarse motivos estructurales que dan lugar a la formación de estructuras supersecundarias específicas intermoleculares dependientes de la estructura y por tanto a proteínas di- o multiméricas. La formación de estructuras supersecundarias se basa en las secuencias de aminoácidos características de las proteínas que forman dichas d- o multímeros. Entre las estructuras supersecundarias pueden citarse, por ejemplo, los llamados "coiled-coil helices", los cuales provocan una di- o multimerización de proteínas por interacción de \alpha-hélices características, que ocurren en cada proteína que forma la estructura "coiled-coil". La hélice "coiled-coil" como "dominio de di- o multimerización" de proteínas es estructuralmente una superhélice de dos o más hebras, helicoidal. Los motivos de coiled-coil de este tipo ocurren en particular en proteínas di- o multiméricas extracelulares, pero de forma más particular en proteínas o complejos de proteínas del tejido conectivo.

Así, por ejemplo, Beck et al. (J. Mol. Biol. (1996) 256, 909-923) describen una proteína del tejido conectivo, el denominado Cartilage Matrix Protein (CMP), cuya agregación para dar un homotrímero se basa en una hélice triple, la cual es el resultado de la agregación de tres hélices complementarias (cada una como componente de un polipéptido), con modelo coiled-coil. La parte característica de la secuencia de aminoácidos de una hélice de este tipo que forma una hélice triple es el modelo héptado (abcdefg)_{n}. Sus aminoácidos en las posiciones a y d llevan por lo general cadenas laterales apolares, permitiendo de esta manera la formación de la estructura superhelicoidal descrita anteriormente, aquí como hélice triple de tres hélices.

Además, la literatura describe también que en otra proteína de matriz extracelular (Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP)) interaccionan entre sí incluso cinco hélices en forma de una hélice coiled-coil de cinco hebras formando pentámeros. (Kajava, PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 24:218-226 (1996); Malshkevich et al., Science, Vol. 274, 761-765, 1996).

Además de las proteínas de matriz COMP y CMP, las cuales no pertenecen a la clase de los colágenos, en las proteínas de la clase de los colágenos se encuentran también fenómenos de multimerización específicos dependientes de la estructura por medio de la formación de estructuras supersecundarias. La estructura de las fibras de colágeno está caracterizada por el tropocolágeno, que consiste en tres polipéptidos helicoidales torcidos. La protofibrilla de un pelo se compone también de una hélice triple de \alpha-queratina con el motivo "coiled-coil", pero de paso a la izquierda.

Con el fin de aumentar la avidez de ligandos, Terskikh et al. (PNAS, Vol. 94, 1663-1668, 1997) han propuesto utilizar proteínas de fusión que presentan un péptido corto con función de ligando y el dominio "coiled-coil" de la proteína de matriz COMP. Para estos pentámeros se ha podido comprobar una avidez aumentada, pero no ha sido posible obtener agregados de orden más alto por dicha ruta.

Además, debido a sus homologías de secuencia en sus secciones multimerizantes respectivas, las proteínas C1q, colágeno \alpha1 (X), \alpha2 (VII), la proteína de hibernación, ACRP30, la proteína de la estructura de oído interno, el cerebelino, y la multimerina se han resumido como clase de proteínas bajo el nombre de clase de C1q. (Kischore y Reid, Immunopharmacol., 42 (1999) 15-21), que igualmente están presentes debido a su estructura como di- o multímeros. Entre las proteínas de dicha clase con propiedades de multimerización, por ejemplo la estructura de la proteína C1q conocida del sistema de complementos está caracterizada por monómeros que cada uno presenta un dominio de "cabeza" globular y una sección de secuencia helicoidal "similar al colágeno". Es a través de dicha sección de secuencia helicoidal, que forma una hélice triple "coiled-coil", que trimerizan los monómeros. Seis de dichos trímeros C1q forman a su vez un oligómero, basándose la oligomerización de los trímeros de proteína otra vez en interacciones entre las hélices triples individuales "coiled-coil". Dicha disposición estructural de la proteína o del complejo de proteína C1q multi-(oligo-)merizado da por resultado una estructura denominado "bouquet", en la que se ha asegurado que 18 dominios de "cabeza" globulares, dispuestos por el extremo C-terminal se unen para dar un hexámero de
trímeros.

Una estructura similar a la de la proteína C1q puede observarse también en la proteína ACRP30, una proteína de la clase de C1q (Hu et al., J. Biol. Chem. Vol. 271, nº 18, 10697-10703, 1996). Dicha proteína de suero secretado por adipocitos está constituido con toda probabilidad por tetrámeros de trímeros, en los que se unen, igual que en la proteína C1q, dominios globulares C-terminales a través de hélices triples similares a colágeno. Probablemente, cuatro de dichas hélices triples forman finalmente otra vez un oligómero por medio de interacciones correspondientes. La publicación de Shapiro y Scherer (Current Biology 1998, 8:335-338) incluye una representación de la estructura de un homotrímero de ACRP30 determinado por análisis estructural por rayos X.

Además, por la literatura se conocen también proteínas de la clase de colectinas, que están caracterizadas por un dominio en forma de colágeno, una región de cuello y además de esto un dominio de unión de una lectina globular carboxi-terminal. Las colectinas ocurren también fisiológicamente como oligómeros de trímeros. Así, por ejemplo, las proteínas Lung Surfactant Protein A (SP-A) y la proteína de unión de manosa (MBP), cada una de la clase de colectinas, trimerizan por interacción de su dominio "similar al colágeno" y finalmente están presentes como hexámeros de trímeros (Epstein et al., Current Opinion in Immunology, Vol. 8, nº 1, 1996, 29-35). Por tanto, las proteínas conocidas por el nombre de colectinas también forman oligómeros (por ejemplo hexámeros) de multímeros (por ejemplo trímeros).

Por la literatura, también puede apreciarse que un gran número de proteínas que son activas fisiológicamente como moléculas señal pueden transducir una señal biológica sólo en estados determinados. Así, por ejemplo, el FasL unido a membranas es activo biológicamente, es decir, de forma apoptótica, mientras que la fracción no unida a membranas, obtenida tras la escisión de la sección de proteína extracelular de la sección unida a membranas (denominada sFasL), no es capaz de ejercer fisiológicamente una acción apoptótica sobre las células de destino. En la publicación de Schneider et al. (J. Exp. Med. Vol. 187, nº 8, 1998, 1205-1213), se ha descrito que la acción biológica de trímeros de sFasL, que - tal como se ha explicado anteriormente - se obtienen por escisión de la sección de proteína unida a membranas, puede reactivarse no obstante con relación a su función fisiológica, utilizando anticuerpos reticulantes. A tal fin, se construyó y expresió una proteína de fusión, constituida por el dominio trimérico de FasL, una secuencia de ligador corta y un marcaje "flag" (con la secuencia de aminoácidos "flag" (código de letra única) DYKDDDDK), y las proteínas de fusión de este tipo trimerizadas no debido a la estructura (es decir, no a través de interacciones de superestructuras específicas dando como resultado la formación de una estructura supersecundaria) se reticularon por medio de anticuerpos dirigidos contra el marcaje "flag".

Las moléculas sFasL reticuladas de esta forma por unión con anticuerpos presentan un incremento significante de la actividad apoptótica específica frente a los trímeros de FasL no reticulados. Sin embargo, dicho procedimiento propuesto por Schneider et al. adolecen del inconveniente de que, aparte de las proteínas FasL recombinantes, no unidas a membranas con el dominio de trimerización, deben utilizarse también anticuerpos específicos, es decir, que un incremento de la actividad biológica puede conseguir sólo proporcionando otra fracción de moléculas. Además de esto, la enseñanza propuesta por Schneider et al. no permite asegurar un grado de oligomerización de los multímeros exactamente especificado o determinable. Esto se debe al hecho de que los anticuerpos producen una dimerización de los trímeros de FasL o también una amplia gama de complejos oligomerizados que puede incluir agregados enormes de sFasL/anticuerpos. Por tanto, puesto que se requiere un producto exactamente definido con eficacia máxima para su aplicación en medicina, el camino propuesto por Schneider et al. para la reactivación o aumento de la actividad de FasL da un resultado no practicable.

El objetivo central de la presente invención es proporcionar compuestos que eviten los inconvenientes del estado de la técnica, en particular presenten también una actividad biológica aumentada o bien provoquen una reactivación de la actividad biológica.

Dicho objetivo es conseguido por el objeto de la reivindicación 1, es decir, di- y oligómeros de un di-, tri-, tetra- o pentámero de proteínas de fusión recombinantes, por el hecho de que las proteínas de fusión recombinantes presentan por lo menos un componente A y por lo menos un componente B, comprendiendo el componente A una proteína o una sección de proteína con función biológica, en particular con función de unión, y el componente B una proteína o una sección de proteína que di- u oligomeriza el di-, tri-, tetra- o pentámero de una proteína de fusión recombinante con función biológica sin la acción de moléculas terceras o bien agrega proteínas de fusión en di- o multímeros y une dichos di- o multímeros simultáneamente sin efecto de moléculas terceras en un dí- u oligómero.

En la descripción de la presente invención, los términos di-, tri-, tetra- o pentámero se resumen bajo el nombre de multímero, por los cuales se entienden complejos de proteínas constituidos por dos, tres, cuatro o cinco polipéptidos agregados (proteínas). En cambio, los agregados del próximo orden más alto, es decir, las agregaciones de dos o más di-, tri-, tetra- o pentámeros en el sentido citado anteriormente se denominan dí- u oligómeros. Por una proteína o sección de proteína con función biológica (componente A en la proteína de fusión) se entienden en particular proteínas que presentan una función de ligando, especialmente para anticuerpos o receptores (es decir, como componente de unión que puede interactuar con una o más molécula(s)), secuencias de aminoácidos modificadas, por ejemplo secuencias de aminoácidos con principios activos acoplados de forma covalente o no covalente (posiblemente de forma organo-química), anticuerpos o secuencias de anticuerpos con parátopes o también hormonas, por ejemplo hormonas peptídicas. La presente invención comprende especialmente secuencias de aminoácidos de proteínas señal, que biológicamente ya son activas como monómeros y cuya acción puede incrementarse por ello al ser presentes en un complejo según la invención como componentes o bien se vuelven activas como el componente A de la proteína de fusión por medio de una poli- u oligomerización iniciada según la invención o sólo una oligomerización iniciada según la invención (si el componente A de la proteína de fusión ya está presente como trímero). En el caso de las proteínas señal fisiológicas, unidas a membranas, por ejemplo citoquinas TNF, se prefieren los productos de escisión que comprenden las secciones extramembranas, en particular extracelulares. Sin embargo, como componente A en la proteína de fusión recombinante pueden utilizarse también secuencias de aminoácidos que son activas como antígenos. Finalmente, pueden utilizarse como componente A también receptores, por ejemplo receptores de la clase de receptores TNF, por ejemplo pertenecientes a la clase de las proteínas de membrana del tipo I (por ejemplo FasR) o secciones o derivados de receptores de este tipo, que también presentan una función de unión (y por tanto pueden interaccionar como componente de unión con otra molécula) y por tanto pueden incluirse bajo el término "ligando" tal como definido para los fines de la presente invención. Los fragmentos de este tipo de receptores biológicos, capaces de enlace son aptos en particular para ser utilizados como medicamento si el ligando complementario biológico está presente en el paciente en una concentración alta no fisiológica.

En una forma de realización preferida, los componentes A pueden comprender los multímeros presentes en los oligómeros según la invención, es decir, di-, tri-, tetra- o pentámeros, como componentes A idénticos (oligómeros de homo-di- o multímeros) o componentes A distintos (oligómeros de heterodí- o multímeros). De esta forma, proteínas con componentes A distintos, si se desea, con funciones biológicas distintas, pueden ser unidos en los dí- o multímeros de oligómeros según la invención. En este caso, los heterodí- o heteromultímeros individuales agregados en el dí- u oligómero según la invención pueden ser también iguales o distintos, es decir, si se desea, un dí- u oligómero según la invención puede componerse también de heterodí- u -oligómeros distintos.

No obstante, también es posible que las proteínas de fusión en el dímero o multímero correspondiente como subunidad del dí- u oligómero sean idénticas, mientras que las subunidades individuales configuradas como dí- u oligómero sean distintas (heterodí- o heteroligómero de homodí-, trí-, tetrá- o pentámeros). De esta manera, pueden ser asociados en un hexámero de trímeros según la invención, por ejemplo, hasta seis homotrímeros distintos, relativo al componente A. Esto permite realizar actividades biológicas por lo general finamente moduladas por medio de la selección, disposición, combinación específica y/o número de los componentes A en el dí- u oligómero. Es conocido que efectos biológicos determinados sólo consiguen el efecto biológico deseado, por ejemplo una activación de células, por interacción de por lo menos dos ligandos (en el sentido biológico, no en el sentido ampliado de la presente invención). Esto es deseable, por ejemplo, al combinarse interleucinas determinadas con relación a su efecto como activadores de células T o B. Según la invención, efectores de este tipo que sólo se vuelven activos al ser presentes en una combinación pueden estar dispuestos en un complejo según la invención. Sin embargo, también es posible que se proporcionen composiciones que contienen oligómeros distintos, relativo a su componente correspondiente.

En otra forma de realización preferida, el componente A en la proteína de fusión recombinante es una hormona peptídica, un factor de crecimiento, una citoquina, interleucina o una sección de los mismos, preferentemente una sección capaz de enlace. Sin embargo, como componente A en la proteína de fusión recombinante, que forma parte de un oligómero según la invención, pueden utilizarse también derivados funcionales de los péptidos y/o proteínas citados anteriormente.

Con el nombre de derivados funcionales de proteínas, secciones de proteínas o péptidos, biológicamente activos, se denominan en particular las proteínas que mantienen la función biológica, pero presentan diferencias de secuencias con relación a las secuencias nativas correspondientes. Dichas diferencias de secuencias pueden ser una o más inserciones, deleciones o substituciones, prefiriéndose una homología de secuencia de por lo menos un 70% y prefiriéndose particularmente una homología de secuencia de por lo menos un 85% entre el derivado utilizado y la secuencia nativa. Entre el término de derivados funcionales, se incluyen en particular las secuencias de aminoácidos que presentan una substitución conservadora, relativo a las secuencias fisiológicas. Con el nombre de substituciones conservadoras se denominan las substituciones en las que se intercambian los aminoácidos procedentes de la misma clase. En particular, existen aminoácidos con cadenas laterales alifáticas, cadenas laterales cargadas positiva o negativamente, grupos aromáticos en las cadenas laterales o aminoácidos cuyas cadenas laterales pueden formar puentes de hidrógeno, por ejemplo cadenas laterales que poseen una función hidroxi. Esto significa que por ejemplo un aminoácido con una cadena lateral polar puede ser substituido por otro aminoácido igualmente con una cadena lateral polar o por ejemplo un aminoácido caracterizado por una cadena lateral hidrófoba es substituido por otro aminoácido igualmente con una cadena lateral hidrófoba (por ejemplo serina (treonina) por treonina (serina) o leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)).

Por un ligando se entiende para los fines de la presente invención todas las moléculas que participan en las reacciones de unión. Por tanto, un ligando puede ser también una proteína normalmente denominada como receptor. Un receptor de este tipo puede ser también un "ligando" para los fines de la presente invención si enlaza con una molécula señal.

Según la invención, se prefieren oligómeros de trímeros de proteínas de fusión recombinantes, en particular trí- o tetrámeros de trímeros (3 x 3 ó 4 x 3) o hexámeros de trímeros (6 x 3).

Se prefiere en particular un dí- u oligómero de un dí-, trí-, tetra- o pentámero de proteínas de fusión recombinantes si el componente A en la proteína de fusión recombinante es una citoquina de la clase de citoquinas TNF, una sección de una citoquina TNF de este tipo o un derivado funcional de una citoquina TNF o de una sección de una citoquina TNF correspondiente. Dichas citoquinas TNF utilizadas pueden provocar efectos apoptóticos, proliferativos o activadores en las células de destino por enlace con los receptores correspondientes. En una lista no final, se incluyen, entre las citoquinas TNF, en particular las proteínas CD40L, FasL, TRAIL, TNF, CD30L, OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APRIL, EDA, VEGI y BAFF. El componente A utilizado preferentemente en la proteína de fusión recombinante son secciones extracelulares de las citoquinas TNF citadas anteriormente, unidas a membranas o sus derivados funcionales. Se prefieren dichos productos de escisión de forma particularmente preferida cuando se mantiene su funcionalidad biológica correspondiente, en particular su capacidad de enlace con el receptor correspondiente. Los derivados funcionales en el sentido citado anteriormente de las citoquinas TNF citadas anteriormente o secciones de las citoquinas TNF pueden utilizarse también como componente A de la proteína de fusión. En una forma de realización especialmente preferida, se ha seleccionado el componente A de la proteína de fusión recombinante del grupo constituido por hFasL (AA 139-261), hTRAIL (AA 95-281), hCD40L (AA 116-261) y m- o hTNF\alpha (AA 77-235).

Sin embargo, receptores (receptores unidos a membranas o intracelulares), en particular receptores de proteínas de la clase de las citoquinas TNF, en particular los receptores fisiológicos de las citoquinas TNF citadas anteriormente, o secciones o derivados de receptores se utilizan en una forma de realización preferida como componente A en la proteína de fusión recombinante. En el caso de que se utilicen secciones de receptores como componente A, éstas serán en particular secciones de la secuencia de proteína fisiológica de receptores de este tipo, que están dispuestos fuera de la membrana. Las secciones particularmente aptas son las secciones extracelulares de receptores de este tipo. Por ejemplo, según la invención, puede(n) haberse aplicado(s) el(los) dominio(s) de enlace de un receptor, en particular de un receptor que se une a una citoquina de la clase de las citoquinas TNF (por ejemplo FasR, CD30, CD40, GITR, TNF-R1 y/o TNF-R2) en una inmunoglobulina dimérica (fragmento Fc dimérico), en los que dichos dímeros pueden di- u oligomerizarse a su vez por medio de un componente B, por ejemplo una sección del tipo colágeno que es capaz de dimerizar u oligomerizar dí- o multímeros para dar complejos diméricos u oligoméricos según la invención. Aptos para esto son por ejemplo tetrámeros de dí- o multímeros (por ejemplo por medio de secciones de ACRP30 que forman tetrámeros), pentámeros de dí- o multímeros (por ejemplo por medio de secciones de secuencia de un monómero del complejo COMP) utilizadas como componente B o bien hexámeros de dí- o multímeros (por ejemplo por medio de secciones tetramerizantes de ACRP30 o también un hexámero de dímeros o multímeros (por ejemplo por medio de secciones hexamerizantes de los monómeros del complejo C1q) .

Por lo tanto, según la invención, hay las siguientes opciones: El componente A seleccionado para una proteína de fusión recombinante a formar parte de un oligómero según la invención, ya está presente como tal en solución en forma de un dí- o multímero. En tal caso, el componente B sólo reforzará la di- o multimerización del componente A y sustancialmente provocará la di- u oligomerización de las proteínas de fusión recombinantes. Esta situación se da por ejemplo cuando el componente A a oligomerizar como componente(s) de una proteína de fusión es un ligando TNF o una sección o derivado del mismo, que típicamente ya están presentes trimerizados en solución. Sin embargo, en el caso de que el componente A como tal no muestra en solución una di- o multimerización mediada por interacciones en la superficie, el componente B tendrá que asegurar según la invención tanto una di- o multimerización del componente A como una di- u oligomerización de las proteínas de fusión recombinantes di- o multimerizadas. Esto es típicamente necesario, por ejemplo, en el caso de que receptores o secciones de los mismos formen el componente A en la proteína de fusión recombinante.

La presente invención se refiere también a dí- u oligómeros de di-, tri-, tetra- o pentámeros de proteínas de fusión recombinantes en los que preferentemente el componente A es un antígeno o una sección de un antígeno. Es deseable que los antígenos utilizados sean los de agentes virales, bacterianos o protozoológicos. Dichos antígenos pueden ser cualquier antígeno típico de un agente patógeno, por ejemplo secciones de proteína y/o estructuras de carbohidratos específicas, pero típicamente serán antígenos de superficie de los agentes patógenos en cuestión o bien secciones de proteínas de superficie de agentes patógenos que igualmente presentan propiedades antigénicas. Podría tratarse por ejemplo en una lista no final de hemaglutinina, neuraminidasa, PreS1, PreS2, antígeno HBs, gp120, gp41 o también determinados antígenos tumorales típicos.

Sin embargo, en una forma de realización preferida, el componente A de la proteína de fusión recombinante puede ser también una secuencia de aminoácido apta para funcionar como portador de un agonista de receptor o antagonista de receptor. Así, por ejemplo, una molécula organoquímica pequeña, activa como principio activo farmacológico, puede acoplarse típicamente de forma covalente a una secuencia de aminoácido de este tipo, por ejemplo a través de un enlace éter a treonina o serina, o a través de un enlace amida o un enlace éster. En este caso, la presente invención proporcionará complejos oligoméricos grandes de por ejemplo 18 proteínas de fusión (por ejemplo 3 x 6 proteínas de fusión) cada una con un agonista de receptor o un antagonista de receptor acoplada a la misma. Con esto puede conseguirse una mejora sustancial de la eficacia o de la avidez de moléculas organoquímicas de este tipo en sus respectivos receptores, aplicadas a un portador de proteína di- u oligomérico, por ejemplo para ser utilizadas como medicamento en la medicina humana o veterinaria.

Típicamente, el componente B, que está presente en el dí- u oligómero en forma di- o multimerizada, será una proteína de la clase de las proteínas C1q o de las colectinas. Se prefieren en particular las proteínas de las clases de C1q y de las colectinas como componente B de la proteína de fusión recombinante cuando se transcribe o traduce sólo su secuencia de di-/multimerización o de di-/oligomerización en la proteína de fusión recombinante. Los dominios "cabeza" que son mayoritariamente globulares (Figura 14), contenidos en la secuencia de los monómeros nativos, no aparecerán por tanto como producto de traducción en la proteína de fusión recombinante según la invención y por tanto tampoco forman parte del componente B en la misma. El componente B citado anteriormente de una proteína de fusión recombinante según la invención presentará una secuencia que típicamente presentará en la mayoría de los casos una funcionalidad tanto de di-/multimerización y de di-/oligomerización, puesto que las secciones de las proteínas de las clases citadas anteriormente del tipo colágeno, utilizadas como componente B, típicamente participan en la formación de por ejemplo hélices triples, que a su vez poseen la capacidad de formar una estructura di- u oligomérica con otras hélices triples (por ejemplo un tetrá- o hexámero de por ejemplo hélices triples).

Por tanto, típicamente, la proteína de fusión recombinante multi- u oligomerizaante comprenderá como componente B los dominios de las proteínas de las clases de las proteínas C1q y de las colectinas que son responsables de la di-/multimerización o di-/oligomerización, mientras que sus dominios "cabeza" respectivos se reemplazarán con otras proteínas o secciones de proteína que también ejercen una función biológica como componente A. Por tanto, dentro de la presente invención, el término "proteína de fusión recombinante" debe entenderse de tal manera que el componente A, del cual hay por lo menos uno, y el componente B, del cual hay por lo menos uno, están artificialmente fusionados en la proteína de fusión recombinante, es decir, que una proteína de fusión recombinante tal como se ha definido para las fines de la invención no corresponde a ninguna proteína que ocurre naturalmente.

Derivados funcionales, es decir, los que di- u oligomerizan, de las proteínas de la clase de las proteínas C1q o de la clase de las colectinas o derivados de secciones de las proteínas citadas anteriormente pueden utilizarse también como componente B para la agregación de proteínas de fusión recombinantes para dar dí- u oligómeros. De éstos, por ejemplo el componente B contendrá la secuencia de la proteína C1q, MBP, SP-A ("lung surfactant protein A"), SP-D ("lung surfactant protein D"), BC (conglutinina de suero bovino), CL43 (colectina-43 bovino) y/o ACRP30 o la(s) secuencia(s) de secciones di- u oligomerizantes de por lo menos una de las proteínas citadas anteriormente o también de derivados funcionales de dichas proteínas o de las secciones de los derivados funcionales. Se prefieren en particular los dí- u oligómeros de proteínas de fusión recombinantes cuando el componente B de la proteína de fusión recombinante es una sección de proteína de la proteína C1q o de la proteína ACRP30, en particular de la variante humana o de otra variante de mamífero, especialmente de la variante murina, en las que una sección de proteína correspondiente de este tipo típicamente no presenta un dominio "cabeza" globular de la proteína nativa C1q o ACRP30.

Una forma de realización especialmente preferida de la presente invención son dí- y oligómeros de dí-, trí-, tetrá- o pentámeros de proteínas de fusión recombinantes cuyos componente B contiene una secuencia de aminoácido según la Figura 6A (secuencia enmarcada) o la Figura 6B o un derivado funcional de dicha(s) secuencia(s) de aminoácido o una sección de dicha(s) secuencia(s). Típicamente, dicha sección puede ser una sección de la proteína mACRP30 (m: murina) por ejemplo con los aminoácidos 18 a 111 o una sección de la variante humana (hACRP30) por ejemplo con los aminoácidos 18 a 108. Por tanto, según la invención, puede proporcionarse en particular una proteína de fusión cuyos componentes A y B son de origen humano, con lo cual puede descartarse cualquier reacción inmune al ser utilizada de forma terapéutica en el ser humano.

Se prefieren en particular los dí- y oligómeros de dí-, trí-, tetrá- o pentámeros de proteínas de fusión recombinantes de este tipo que presentan secuencias de organismos hospedadores distintos. Se prefieren especialmente los agregados según la invención cuando proceden de proteínas de fusión quimeras, en las que el componente A procede de otra especie de animal que el componente B. De esta forma, puede ser ventajoso si el componente A corresponde a una secuencia de aminoácido del ratón, rata, cerdo u otro vertebrado, en particular de un mamífero, o un derivado funcional de la misma y el componente B es de origen humano o viceversa. Se prefieren también los complejos según la invención de las proteínas de fusión cuyo componente A corresponde a una secuencia de un virus, bacteria o protozoos, combinado con un componente B de origen humano. Naturalmente, las secuencias del componente A y del componente B en una proteína de fusión según la invención pueden proceder también de la misma especie de animal.

En otra forma de realización preferida de la presente invención, la multi- y/u oligomerización de las proteínas de fusión se efectúa por medio de una secuencia de aminoácidos corta de más de 6 aminoácidos, preferentemente de 8 a 20 aminoácidos, que está presente en las proteínas de fusión recombinantes como componente B. La di- u oligomerización de proteínas de fusión típicamente conseguida por medio de dichas secuencias de aminoácido cortas, que ya están presentes como tales en solución como dí- u multímeros no como resultado de estructuras supersecundarias, sino de interacción superficial, se basa preferentemente en la formación de puentes de disulfuro, hecho posible por la secuencia de aminoácido específica en la proteína de fusión recombinante. Esto significa que el componente B presenta preferentemente por lo menos una cisteina, que entonces puede formar una unión covalente con la cisteina, de la que hay por lo menos una, de una proteína de fusión de por lo menos otro dí- o multímero. Para el caso preferido de que el componente B contiene una secuencia de aminoácido corta de di- u oligomerizacíon de 8 a 20 aminoácidos, un ejemplo a mencionar sería la secuencia de aminoácido (código de una sola letra) VDLEGSTSTNGRQCAGIRL. Dicha secuencia que comprende 18 aminoácidos presenta, en la posición 11, un radical de cisteina que puede formar un puente de disulfuro entre los dí- o multímeros.

Como componente B pueden utilizarse también derivados funcionales o secciones de dicha secuencia que comprende 18 aminoácidos. De éstos, hay que destacar en particular la secuencia VDLEGSTSTNGRQSAGIRL que, a pesar de que en su posición 11 el radical cisteina se ha substituido por un radical serina, puede asegurar una di- u oligomerización de los multímeros de la proteína de fusión.

Las proteínas de fusión pueden estar configuradas en una forma de realización preferida también de tal forma que, aparte de la di- u oligomerización de proteínas de fusión recombinantes di- o multimerizadas, pueden formarse agregados de orden más alto. Dichos agregados de orden más alto, que a su vez comprenden dos o más dí- u oligómeros, pueden proporcionarse por ejemplo por reticulación utilizando anticuerpos. Los anticuerpos están dirigidos contra epítopes en la(s) proteína(s) de fusión de un complejo según la invención, preferentemente contra un epítope del componente B. Pero también es posible que la proteína de fusión presente, aparte de los componentes A y B, secciones de secuencia adicionales, que sirven de antígenos para los anticuerpos reticulantes. Dentro de la presente invención, se prefieren en este contexto las denominadas secuencias "Tag", por ejemplo un "flag tag", es decir, la secuencia de aminoácido DYKDDDDK, o también por ejemplo un tag "his" (que contiene varias histidinas consecutivas).

Sin embargo, dentro de la presente invención, se proporcionan de forma particularmente preferida agregados de orden más alto de tal forma que la proteína de fusión contenga más de un componente B. Por tanto, con el fin de formar agregados de orden más alto, la proteína de fusión comprenderá un componente B1 para la formación de dí- u oligómeros y además por lo menos otro componente B (por ejemplo un componente B2), que típicamente es distinto del componente B1. El componente B 2, que debe ocurrir en por una proteína de fusión de un dí- u oligómero según la invención, asegura que los dí- u oligómeros se reticulan dando agregados de orden más alto. Por ejemplo, el componente B1 puede ser una sección di- u oligomerizante de una proteína de las clases de proteínas C1q o colectinas, mientras que el componente B2 es una secuencia de 8 a por ejemplo 28 aminoácidos que forma por lo menos un puente de disulfuro. En caso de formar por lo menos un puente de disulfuro entre dos oligómeros distintos, se proporcionará un agregado de orden más alto según la invención o un dímero de un oligómero.

Además, es preferido incorporar, entre el componente A y el(los) componente(s) B o, si la proteína de fusión contiene varios componentes B, también entre dichos por lo menos dos componentes B, una denominada secuencia de ligador. Dichas secuencias de ligador sirven para la segregación estructural de los componentes funcionales distintos en la proteína de fusión recombinante y pueden asumir preferentemente una función "bisagra", es decir, una secuencia de aminoácido de estructura flexible.

Con esto, la presente invención se refiere de forma generalizada a dí- u oligómeros o agregados de orden más alto, que se distinguen en particular por una eficacia biológica aumentada y/o avideces aumentadas en proteínas complementarias. De esta forma, la presente invención se refiere también a procedimientos que sirven para el aumento de la eficacia biológica y/o el incremento de la avidez de biomoléculas o fármacos con función de ligando tal como se ha definido para los fines de la presente invención. Los procedimientos de este tipo se distinguen por la recombinación de por lo menos un componente A, que corresponde a una proteína o secuencia de proteína con función biológica, con por lo menos un componente B di- o multimerizante y di- u oligomerizante, consiguiéndose dicho aumento de la actividad biológica y/o avidez del componente A por el hecho de que la proteínas de fusión recombinadas se di- u oligomerizan a continuación por medio de poli- y oligomerización dando dí- u oligómeros de dí- o multímeros. El procedimiento es especialmente preferido cuando el componente A es una citoquina TNF, una sección de una citoquina TNF o un derivado funcional de una proteína de este tipo o de una sección de proteína. Otro procedimiento preferido es la recombinación de por lo menos un componente A con por lo menos un componente B dando una proteína de fusión recombinante, de los que por lo menos un componente A es un receptor o una sección de un receptor, preferentemente de un receptor TNF. Por lo que atañe a las formas de realización de un procedimiento según la invención de este tipo, son aplicables las formas de realización preferidas descritas para los dí- u oligómeros según la reivindicación.

Los dí- u oligómeros de la presente invención son aptos para la preparación de un medicamento o para el tratamiento de enfermedades o trastornos previstos para ser utilizados en la medicina, es decir, tanto en la medicina humana como la medicina veterinaria. Los agregados de orden más alto formados según la invención a partir de los dí- u oligómeros son aptos también para ser utilizados como medicamento o para la preparación de un medicamento de este tipo. Los dí- u oligómeros o los agregados de orden más alto permiten tratar una amplia gama de enfermedades o trastornos. En una lista de ningún modo final, los dí- u oligómeros o agregados de orden más alto de este tipo pueden utilizarse para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos hiperinflamatorios, enfermedades autoinmunes, enfermedades basadas en trastornos hiper- o hipoapópticos, enfermedades neurodegenerativas, pero también para el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades tumorales y/o trastornos endocrinológicos. Entre las enfermedades infecciosas para las que pueden administrarse los dí- u oligómeros, se incluyen en particular las infecciones bacterianas o protozoológicas, pero en particular las infecciones virales, en cuyo caso el componente A en la proteína de fusión recombinante comprende de forma particularmente preferida anticuerpos o secciones de anticuerpos que llevan parátopes. Se prefieren los dí- u oligómeros o los agregados de orden más alto particularmente cuando la enfermedad hace necesario un tratamiento con citoquinas biológicamente activas, incluyendo por ejemplo el tratamiento o la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores, en particular de tumores del sistema linfático.

Los dí- u oligómeros según la invención se utilizarán también como vacuna o para la preparación de una vacuna para la inmunización activa o pasiva contra las enfermedades infecciosas. A tal fin, el componente A utilizado en la proteína de fusión recombinante será típicamente un antígeno apto para la vacunación en caso de inmunización activa. Para esto son aptos en particular antígenos de superficie o secciones de antígenos de superficie de bacterias, virus o protozoos, por ejemplo de plasmodiums o tripanosomas. En una lista no final, una vacuna que contiene dí- u oligómeros o agregados de los mismos, en la que las proteínas de fusión recombinantes comprenden por lo menos un componente A, es decir, uno o más antígeno(s) idénticos o distintos de los agentes patógenos, puede utilizarse para la vacunación contra la rubéola, sarampión, poliomielitis, rabia, tétano, difteria, BCG, tuberculosis, malaria, fiebre amarilla, VIH o virus gripales, por ejemplo rinovirus. Según la invención, también es posible una combinación de antígenos distintos en un dí- u oligómero o un agregado de orden más alto, en el que antígenos distintos procedentes del mismo agente patógeno pueden combinarse en un dí- u oligómero o también antígenos procedentes de dos o más agentes patógenos pueden combinarse en un dí- u oligómero o en un agregado de orden más alto. Para esto, la proteína de fusión puede contener típicamente dos o más componentes A1, A2 a AX, que entonces formará parte de un dí- u oligómero o de un agregado de orden más alto, o bien dos o más proteínas de fusión que se distinguen con relación a por lo menos un componente A en un dí- u oligómero o un agregado de orden más alto puede combinarse con por lo menos un componente B.

Preferentemente, por lo menos dos tipos diferentes de dí- u oligómeros según la invención pueden estar contenidos también en una composición a utilizar como medicamento o como vacuna o para su preparación.

En otra forma de realización preferida, el componente A de una proteína de fusión según la invención es un modulador inmunológico, por ejemplo una interleucina (IL), en particular IL-2.

Además, la presente invención se refiere también a la utilización de los dí- u oligómeros según la invención como adyuvante de inmunización y/o vacunación. Es conocido que muchos antígenos administrados para la inmunización inician una respuesta inmune insatisfactoria en el sujeto. Los adyuvantes tienen por objetivo aumentar el efecto inmunológico. Los adyuvantes de este tipo son aptos como componente A en una proteína de fusión según la invención y por ello como parte de un dí- u oligómero según la invención. Por ejemplo, el componente A puede contener una secuencia de aminoácido del ligando CD40 (CD40L) o la secuencia o sección de secuencia de una interleucina, por ejemplo de una interleucina 1 a 12. La función fisiológica de CD40L consiste en controlar la transición de una célula B en reposo al ciclo celular. En un complejo di- u oligomerizado según la invención, pueden ser combinados también interleucinas, por ejemplo IL-4, IL-5, IL-6 y/o CD40L (proteínas de fusión recombinantes distintos en un dí- y oligómero) o pueden ocurrir en una composición (por lo menos dos tipos de dí- u oligómeros distintos, que cada uno pueden haberse elaborados a partir de proteínas de fusión idénticas o distintas), que típicamente comprenden, aparte del (de los) inmunógeno(s), por lo menos un, preferentemente dos o más, tipos de dí- u oligómero según la invención.

Los dí- u oligómeros o agregados de orden más alto de una composición de este tipo pueden estar constituidos, relativo al (a los) componente(s) A, por proteínas de fusión idénticos o diferentes. Apta como componente A es cualquier secuencia fisiológica con propiedades co-estimulantes y/o propiedades que activan el sistema inmune (respuesta inmune celular o humoral). Estas secuencias pueden ser compuestos fisiológicos o compuestos sintéticos. Por tanto, la presente invención se refiere también a composiciones que contienen uno o más tipos de dí- u oligómeros según la invención, además de uno o más inmunógenos, en las que un tipo de dí- u oligómero según la invención puede estar configurado preferentemente de tal manera que un complejo di- u oligomerizado de este tipo contiene más que un modulador/adyuvante inmunológico, es decir, que está presente un heterodí- u oligómero. Si se desea, un heterodí- u oligómero según la invención puede unir también una o más proteínas de fusión con un imunógeno como componente A o por lo menos una proteína de fusión con un componente de adyuvante como componente A, por ejemplo CD40L. En un heterooligómero según la invención también son posibles dos o más proteínas de fusión con componentes de adyuvante o modular inmunológico que son distintos uno del otro. Por tanto, la presente invención se refiere también a la utilización de homo- o heterooligómeros de este tipo o de composiciones que contienen por lo menos un tipo de homo- o heterooligómero, como medicamento o como vacuna en la medicina humana o veterinaria.

Dentro de la presente invención, los dí- u oligómeros se utilizan preferentemente para la preparación de un medicamento o para el tratamiento de las enfermedades o trastornos citados anteriormente de tal forma que son aptos para la administración parenteral, es decir, por ejemplo subcutánea, intramuscular o intravenosa, u oral o intranasal. La administración de dí- u oligómeros o de agregados de los mismos como vacuna o como base para la preparación de una vacuna se llevará a cabo igualmente de forma preferida en una forma de administración parenteral u oral, pero, si se desea, también en un forma de administración intranasal.

Los dí- u oligómeros o agregados de orden más alto según la invención pueden servir de medicamento por sí solos o utilizarse para la preparación de un medicamento. Sin embargo, pueden utilizarse también en combinación con otros principios activos como medicamento. Sin embargo, los dí- u oligómeros o agregados de orden más alto según la invención pueden combinarse también con excipientes, sustancias auxiliares y/o aditivos farmacéuticamente aceptables. Las rutas de preparación correspondientes se conocen por "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980), que forma parte de la memoria de patente de la presente invención. Entre los excipientes aptos para la administración parenteral, se incluyen por ejemplo agua estéril, soluciones de sal común estériles, polialquilenglicoles, naftaleno hidrogenado y en particular multímeros de lactida compatibles, copolímero de lactida/glicolida o copolímeros de /polioxietileno/polioxipropileno.

Los dí- u oligómeros o agregados correspondientes de orden más alto según la invención se utilizan también preferentemente en el área del diagnóstico in vitro o bien por ejemplo para procedimientos de purificación bioquímicos. Una posibilidad es la utilización de dí- u oligómeros o agregados de los mismos de orden más alto en columnas de purificación que pueden estar cargadas con complejos de este tipo. Por tanto, la presente invención se refiere también a la utilización de complejos de este tipo para fines de detección.

Además, por la presente invención se conocen también procedimientos para la preparación de proteínas de asociación específica, que, debido a sus interacciones en la superficie de proteínas, interactuan con la misma y por tanto están presentes como tales en solución en forma di- o multimerizada. En particular en caso de citoquinas TNF o preferentemente secciones solubles de citoquinas de este tipo que trimerizan en solución, es deseable proporcionarlas en una estequiometría determinada en una fracción pura. El caso es que con una co-expresión simple de proteínas distintas, capaces de asociación entre sí, por ejemplo de tres citoquinas TNF distintas o secciones diferentes de citoquinas TNF de este tipo, están presentes todas las distribuciones estadísticamente posibles de las proteínas co-expresadas en los trímeros asociados después de la expresión, es decir, por ejemplo los trímeros deseados de las proteínas P1, P2 y P3, pero también los trímeros de dos proteínas P1 y una proteína P3, etc.

Los oligómeros según la invención pueden utilizarse en el procedimiento para obtener heteromultímeros determinados deseados, por ejemplo heterotrímeros de citoquinas TNF o secciones de citoquinas TNF de este tipo. A tal fin, se construyen proteínas de fusión diferentes y se expresan preferentemente en una célula hospedadora. Las proteínas de fusión aquí expresadas presentan, como componente B, secciones de secuencias de proteínas que forman homooligómeros de heteromultímeros, es decir, por ejemplo un trímero de tres cadenas distintas, de los caules los trímeros idénticos di- u oligomerizan. Preferentemente, dichos componentes B en las proteínas de fusión corresponden a secciones de secuencias de proteínas de la clase de complementos o colectinas, por ejemplo C1q, que forma homohexámeros de heterotrímeros. Por tanto, en una proteína de fusión, el componente B es una sección de secuencia prevista por la proteína nativa para la multimerización de una cadena en el heteromultímero que se ha combinado con un componente A, por ejemplo una citoquina TNF, mientras que otras proteínas de fusión (a formar parte del heterotrímero) presentan cada una combinaciones de otro componente A, es decir, por ejemplo de otra citoquina TNF o de una sección de la misma, con otra sección de secuencia para la heteromultimerización distinta de la primera y presente en la proteína nativa, por ejemplo la proteína C1q.

Preferentemente, las proteínas de fusión diferentes que forman el heteromultímero se expresan en una célula hospedadora. Los heteromultímeros entonces se agregan para dar homooligómeros, puesto que el componente B sólo puede oligomerizar heteromultímeros idénticos. Según la invención, por ejemplo tres proteínas de fusión distintas pueden expresarse con componentes A que cada uno son diferentes, es decir, preferentemente citoquinas TNF distintas, que se combinan con la cadena \alpha, \beta y \gamma multi- u oligmomerizante, respectivamente, de C1q. En este caso, en los oligómeros asociados se encontrarán exclusivamente heteromultímeros que comprenden todas las tres citoquinas TNF. Al contrario, no ocurren heteromultímeros con otra estequiometría. Por tanto, según la invención, sólo por medio de la selección de las proteínas de fusión puede obtenerse un producto específico con relación a su estequiometría y no sujeto a una distribución estadística.

Además, se prefiere utilizar proteínas de fusión o procedimientos para la preparación de heteromultímeros de una estequiometría predeterminada que presentan un ligador entre el componente A y el componente B. Se prefieren los ligadores especialmente cuando comprenden por lo menos un punto de corte proteolítico que permite separar los componentes A procedentes del complejo de homooligómeros (de heteromultímeros) de los componentes B. De esta forma, se obtiene finalmente una fracción que se compone exclusivamente del heteromultímero deseado, por ejemplo un heterotrímero de tres citoquinas TNF distintas. El punto de corte proteolítico en el ligador es preferentemente una secuencia consensuada de trombina.

La presente invención se refiere también a proteínas de fusión que se describen a continuación y que son aptas para la di- u oligomerización de di- o multímeros si la proteína de fusión recombinante comprende por lo menos un componente A y por lo menos un componente B, comprendiendo el componente A una proteína o una sección de proteína con función biológica, en particular con función de ligando para anticuerpos o receptores o bien un anticuerpo o una sección de un anticuerpo y comprendiendo el componente B una sección di- o multimerizante y di- u oligomerizante o un derivado funcional de una sección de este tipo de una proteína, seleccionada del grupo constituido por la clase de las proteínas C1q o de las colectinas. Se prefieren dichas proteínas de fusión especialmente cuando el componente B de la proteína de fusión recombinante contiene una sección multi- y/u oligomerizante de las proteínas C1q, MBP, SP-A, SP-D, BC, CL43 y ACRP30. Un derivado funcional de una sección de este tipo de las proteínas citadas anteriormente puede utilizarse también dentro de la presente invención. En este caso, una proteína de fusión comprenderá típicamente, además de un componente A dotado con actividad biológica, un componente B que presenta exclusivamente la sección de las proteínas citadas anteriormente responsable de la agregación, pero preferentemente no el dominio "cabeza" globular de las mismas.

También apta como componente B de una proteína de fusión según la invención es preferentemente una secuencia que contiene la secuencia de aminoácido del dominio colágeno oligomerizante del ligando EDA, en particular la variante de un mamífero, especialmente la variante humana, o de un fragmento oligomerizante o del derivado funcional de un dominio de este tipo. De forma especialmente preferida, el componente B utilizado es una sección de secuencia que contiene los aminoácidos 160 a 242 de la proteína humana EDA o de un derivado funcional, por ejemplo de un fragmento. Preferentemente, dicho componente B será un hexámero.

La presente invención se refiere también a las secuencias de ADN que codifican para las proteínas de fusión del tipo citado anteriormente. Las secuencias de ADN de este tipo se expresan en vectores de expresión, refiriéndose la presente invención también a los vectores de expresión correspondientes que contienen una secuencia de ADN para las proteínas de fusión según la invención. Las células hospedadoras transfectadas con las secuencias de ADN que codifican para las proteínas de fusión según la invención también forman parte de la presente invención. En este contexto, se prefieren especialmente las células hospedadoras que se han transfectado con vectores de expresión que contienen otra vez las secuencias de ADN que codifican para las proteínas de fusión según la invención.

La presente invención se refiere también a receptores, en particular receptores que se unen a los ligandos de las moléculas señal de la clase de las citoquinas TNF que están presentes en forma di- u multimerizada. Así, por ejemplo, un receptor de este tipo, un derivado del mismo o una sección de un receptor o derivado, en particular una sección que comprende el área extracelular del receptor, del cual se prefieren otra vez el(los) dominio(s) de enlace, pueden estar presentes como componente A de una proteína de fusión que forma parte de un di- u multímero. La dimerización puede conseguirse por recombinación con secciones de inmunoglobulinas, en particular fragmentos Fc, mientras que la multimerización puede conseguirse por ejemplo tras recombinación con los dominios de multimerización correspondientes de proteínas. A tal fin, son aptas por ejemplo todas las secciones de secuencia de proteínas que generan di- o multímeros formando estructuras supersecundarias, por ejemplo hélices "coiled-coil" o hélices triples típicos del tipo colágeno (por ejemplo CMP, COMP, colágeno, laminina). Las secciones de proteínas de la clase de C1q o de las colectinas son típicamente aptas para una di- o multimerización de receptores o secciones de receptores. Así, por ejemplo, la sección extracelular de un miembro de la clase de los receptores TNF, por ejemplo el receptor Fas (FasR), puede expresarse como componente A en forma de un pentámero por recombinación con los dominios de pentamerización correspondientes de COMP como componente B. Dichas secciones pueden ser homo- o heterodí- o multímeros de proteínas de fusión que comprenden un receptor o una sección de receptor.

Dichos dí- u multímeros de una proteína recombinante con un componente A que contiene un receptor o una sección de receptor también son aptos como medicamentos o para la preparación de un medicamento, Su utilización es indicada especialmente cuando concentraciones aumentadas extracelulares de los ligandos de receptores correspondientes se observen en un cuadro clínico. Dichas concentraciones pueden ser también concentraciones aumentadas de moléculas señal unidas a membranas, por ejemplo citoquinas TNF, en las células mismas o de moléculas señal solubles. Sin embargo, la utilización de multímeros de este tipo es también deseable siempre cuando se desea impedir o reducir la activación de una cadena de transducción de señales, iniciada en el receptor correspondiente típicamente unido a membranas, a través de la utilización de dí- u multímeros exógenos solubles según la invención que desplazan las moléculas señal del sitio de unión y que están constituidos por proteínas de fusión que contienen como componente A un receptor o una sección de receptor.

A continuación, la presente invención se ilustrará con mayor detalle haciendo referencias a las siguientes figuras:

En la Figura 1, se ha representado, en el código de letra única, la secuencia de aminoácido de una proteína de fusión recombinante (2) según la invención que ocurre en un oligómero según la invención (hexámero de FasL), es decir, en el dímero de un trímero. Como componente A se denomina una sección de secuencia de hFasL (A5 103 ó 139 a 281), mientras que como componente B aparece el ligador específico (que tiene por resultado una dimerización) con la secuencia VDLEGSTSNGRQCAGIRL. Además, la Figura 1 contiene la secuencia de aminoácido de la proteína de fusión recombinante (1), que, según el estado de la técnica, sólo aparece como parte de un trímero de FasL, es decir, que no presenta un componente B que di- u oligomeriza el presente multímero, aquí trímero. Las secciones recombinantes de las dos proteínas de fusión (1) y (2) se han caracterizado en la Figura 1 por encima de los datos de secuencia con relación a su funcionalidad respectiva.

La Figura 2 comprende en la Figura 2A el resultado de una electroforesis sobre gel (SDS-PAGE) de proteínas de fusión según la invención (2), es decir, con la secuencia de ligador específica (componente B), en condiciones reductoras (r) y no reductoras (nr). En condiciones no reductoras en solución, el oligómero es eluido según la invención como complejo nativo constituido por seis polipéptidos según la invención (proteínas de fusión (2)), puesto que según la invención se produce un puente de disulfuro entre los componentes B de dos proteínas de fusión según la invención (2), que cada una forman parte de trímeros distintos. Como resultado se obtiene por tanto un oligómero según la invención como hexámero de FasL con un peso molecular que es aproximadamente seis veces el peso molecular de la proteína de fusión según la invención (2) en forma monomérica. En condiciones desnaturalizantes (por ejemplo en SDS-PAGE), las proteínas de fusión según la invención migran en ausencia de agentes reductoras como dímeros, puesto que se produce un puente de disulfuro entre dos monómeros. En cambio, en condiciones reductoras y desnaturalizantes, los monómeros de la proteína de fusión (2) según la invención migran en el gel SDS. Un oligómero según la invención, aquí un dímero de un trímero, de una proteína de fusión según la invención, por ejemplo de una proteínas de fusión (2) tal como se ha representado en la Figura (1), se ha representado esquemáticamente en la Figura 2B.

En la Figura 3, se ha representado el resultado de los ensayos citotóxicos en función de las concentraciones de trímeros de FasL (trímero de tres proteínas de fusión del estado de la técnica, por ejemplo la proteína de fusión (1) según la Figura 1 que no presentan un componente B) o del dímero de FasL según la invención (hexámero como dímero de trímeros) representado esquemáticamente en la Figura 2B en presencia (\blacksquare, \ding{115}) o ausencia (\Box, \Delta) de anticuerpos anti-flag M2 para células A20 o Jurkat. La densidad óptica a 490 nm es una medida de la viabilidad de las células (una alta densidad óptica corresponde a un bajo efecto apoptótico de las sustancias adicionadas y por tanto a una alta viabilidad de la células). El efecto apoptótico de los dímeros de FasL de trímeros (hexámeros) según la invención (Figuras 3B y 3D, en cada caso \Delta) sobre las células A20 (Figuras 3A y 3B) y las células Jurkat (Figuras 3C y 3D) frente al efecto de los trímeros de FasL de proteínas de fusión sin componente B bi- u oligomerizante (estado de la técnica, Figuras 3A y 3C, en cada caso \Box) es 3 a 10 veces más alto. Al adicionarse también anticuerpos anti-flag, dirigidos contra la secuencia flag de las proteínas de fusión (1) y (2) según la Figura 1 y aumentan por ejemplo también el grado de oligomerización de las proteínas de fusión según la invención aún más por reticulación, la actividad apoptótica viene aumentada en todas las preparaciones (Figuras 3A a 3D, en cada caso \blacksquare o \ding{115}).

En la Figura 4, se ha representado la secuencia de aminoácido de una proteína de fusión (3) según la invención, teniendo en cuenta la substitución (C\rightarrowS) en la zona de ligador específica (componente B de la proteína de fusión (3)) ("Super-FasL"). Por lo demás, ver la descripción para la Fig. 1. Los experimentos de filtración sobre gel han demostrado que "Super-FasL" está presente en solución en una forma dimerizada según la invención como hexámero. En condiciones desnaturalizantes sobre SDS-PAGE, las proteínas de fusión (3) según la invención migran como monómeros, incluso en ausencia de agentes reductores, puesto que no se puede formar ningún puente de disulfuro en la zona de ligador debido a la substitución de aminoácido C\rightarrowS.

La Figura 5 muestra de forma análoga a la Figura 3 la viabilidad de células A20 (Figura 5B) o Jurkat (Figura 5D) tras adición de agregados según la invención de la proteína de fusión (3) según la invención según la Fig. 4 ("Super-FasL") en presencia (\medbullet) o ausencia (\medcirc) de anticuerpos anti-flag M2. Las proteínas de fusión (3) según la invención producen un efecto apoptótico aproximadamente por lo menos 1000 veces más fuerte en comparación con los trímeros de FasL del estado de la técnica sin componente B bi- u oligomerizante (Figura 3A (células A-20) y Figura 3C (células Jurkat) utilizados para fines comparativos. La adición de anticuerpos anti-flag M2 (\medbullet) es capaz de aumentar la actividad apoptótica en comparación con la preparación sin anticuerpos anti-flag en menor grado, aproximadamente 2 veces, preferentemente por lo menos 1,5 veces (Figuras 5B y 5D) tanto sobre las células A20 como las células Jurkat por medio de oligomerización adicional de "Super-FasL" dando agregados de orden más alto según la invención. De esto resulta que el grado de oligomerización (aquí como dímero de trímeros) conseguido para el inicio de la apoptosis, posiblemente a través de oligomerización sobre la superficie de las células, utilizando el ligador específico de una proteína de fusión (3) según la invención como componente B, ya es casi óptimo y puede aumentarse aún más en menor grado por medio de los agregados de orden más alto según la invención.

En la Figura 6A, se ha representado la secuencia de aminoácido de una proteína de fusión (4) según la invención, FasL-ACRP30, en la que la proteína de fusión (4) (del extremo N-terminal al C-terminal) presenta una secuencia flag, una secuencia de ligador como componente B, los aminoácidos 18 a 111 de la proteína mACRP30 (m: murina), el ligador LQ y después los aminoácidos 139 a 281 de hFasL como componente A.

En la Figura 6B, se ha representado otra proteína de fusión. Comprende el dominio de colágeno del ligando humano ACRP30 (hACRP30, con los aminoácidos 18 a 111), cuyo extremo N-terminal se ha fusionado con un marcaje flag (DYKDDDDK) y cuyo extremo C-terminal se ha fusionado con el dominio extracelular de FasL humano (AA 139 a 281). Una secuencia de ligador (MHVD) se ha insertado tanto entre el extremo C-terminal de hACRP30 y hFasL como entre el marcaje flag y el extremo N-terminal de hACRP30 (GPGQVQLQ). Todos los datos citados anteriormente se refieren al código de letra única de los aminoácidos.

La Figura 6C representa unas curvas que resultan de la titulación de células Jurkat-T por un lado con FasL y por otro lado con la proteína de fusión hACRP30/FasL con la adición de anticuerpos M2 anti-flag (+) y sin la adición de anticuerpos M2 anti-flag (-). A tal fin, los sobrenadantes (OPTIMEM) de células 293 transfectadas transitoriamente con FasL o hACRP30/FasL y que expresan dichas proteínas se adicionaron a células Jurkat-T. En experimentos consecutivos, a tal fin se utilizaron concentraciones descendientes representadas en el eje x de la Figura 6C, y se determinó la tasa de supervivencia de las células Jurkat de cada experimento utilizando la prueba de citotoxicidad estándar descrita en otro lugar. Por la curva, puede apreciarse que FasL es inactivo (\blacklozenge) en ausencia de anticuerpos M2 de reticulación transversa y que sólo el efecto de reticulación transversa del anticuerpo M2 provoca efectos citotóxicos. En cambio, una proteína de fusión según la invención, es decir, hACRP30/FasL, muestra el efecto correspondiente ya sin adición de anticuerpos M2 (\ding{115}). La adición de anticuerpos M2 es apenas capaz de aumentar el efecto de la proteína de fusión según la invención.

De forma análoga a la Figura 3, la Figura 7 muestra la viabilidad de células BJAB tras adición de trímeros de FasL que no son capaces de bi- u oligomerización (ejemplo comparativo a base de la proteína de fusión (1) según la Figura 1; Figura 7A) y de oligómeros según la invención, aquí tetrámeros de trímeros, es decir, dodecámeros, de la proteína de fusión según la invención (4) según la Fig. 6A en presencia (\ding{115}) o ausencia (\Delta) de anticuerpos anti-flag M2. Mientras que los trímeros de FasL no según la invención manifiestan ningún efecto apoptótico sobre las células BJAB en ausencia de anticuerpos oligomerizantes por unión a la secuencia "flag" (Figura 7A, (\Delta)), un dodecámero según la invención (tetrámero de trímeros) de la proteína de fusión (4) induce la muerte celular ya a una concentración de aproximadamente 10 ng/ml (K_{50} = 8 ng/ml) (Figura 7B). Esto se manifiesta claramente en la reducción de la DO (densidad óptica) a 490 nm. Esta actividad apoptótica puede incrementarse ligeramente por adición de anticuerpos anti-flag M2 a una preparación de dodecámeros según la invención, constituidos por proteínas de fusión de FasL-ACRP30 según la invención, es decir, un dodecámero según la invención representa un estado de agregación ya casi óptimo con relación a la actividad apoptótica. Al contrario, una agregación ulterior iniciada por anticuerpos adecuados dando agregados de orden más alto según la invención no es capaz de provocar otros efectos biológicos
significantes.

La secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión según la invención (5), que contiene los aminoácidos 95 a 281 de hTRAIL como componente A en combinación con el dominio de oligomerización de ACRP30 (AA 18-111) como componente B se ha representado en la Figura 8 (TRAIL-ACRP30). Por tanto, según la invención, la proteína de fusión (5) está presente en solución como oligómero, es decir, como tetrámero de trímeros.

En la Figura 9, se ha reproducido la viabilidad de células Jurkat tras adición de trímeros de TRAIL (proteína de fusión con una secuencia "flag" en el extremo N-terminal y los aminoácidos 95 a 281 de TRAIL humano) según el estado de la técnica sin capacidad de bi- u oligomerización (experimento comparativo, Figura 9A) y de dodecámeros según la invención de la proteína de fusión según la invención (5), TRAIL-ACRP30, en presencia (\ding{115}) o ausencia (\Delta) de anticuerpos anti-flag M2. Las observaciones experimentales de la Figura 9 corresponden a los resultados representados en la Figura 7. Mientras que los trímeros de TRAIL no manifiestan un efecto apoptótico sobre las células Jurkat de anticuerpos anti-flag oligomerizantes por unión a la secuencia "flag" (Figura 9A (\Delta)), el dodecámero según la invención de la proteína de fusión (5) induce la muerte celular también en este experimento ya a una concentración de aproximadamente 100 ng/ml (\approx K_{50}) (Figura 9B (\Delta)). Además, la adición combinada de dodecámeros de TRAIL y de anticuerpos anti-flag puede convertir los oligómeros según la invención en agregados de orden más alto por medio de un incremento adicional del grado de agregación, los cuales presentan una actividad apoptótica incrementada aún más (por lo menos 10 veces más) (Figura 9B, (\ding{115})).

La secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión según la invención (6), que contiene los aminoácidos 77 a 235 de mTNF\alpha (m: murina) como componente A en combinación con el dominio de oligomerización de mACRP30 (AA 18-111) como componente B y una secuencia "flag" con un ligador en el extremo N-terminal, se ha representado en la Figura 10 (TNF\alpha -ACRP30). Por tanto, la proteína de fusión (6) está presente en solución como dodecámero, es decir, oligómero (tetrámero) de multímeros (trímeros).

En la Figura 11, se ha representado el resultado de un experimento de proliferación de células. En dicho experimento, como grado de la proliferación de las células CT6, se determinó la incorporación de ^{3}[H]-timidina en las células CT6 de ratones como función de la concentración de trímeros de una proteína de fusión según el estado de la técnica (secuencias de "flag" y de ligador en el extremo N-terminal con los próximos aminácidos 77 a 235 de TNF\alpha murina) sin componente B, es decir, del trímero de mTNF\alpha (Figura 11A), o de dodecámeros según la invención (4x3) de la proteína de fusión según la invención (6) según la Figura 10, de mTNF\alpha-ACRP30 (Figura 11B). La incorporación de ^{3}[H]-timidina se ha representado en "cpm" ("counts per minute"). Los experimentos se llevaron a cabo en presencia (\ding{115}) o ausencia (\Delta) de anticuerpos anti-flag M2. Según dicho experimento, el trímero de mTNF\alpha conocido del estado de la técnica, tras unión al receptor TNF 2 (TNF-R2), presenta un bajo efecto de proliferación sobre las células CT6 (Figura 11A, \Delta). Un efecto de proliferación claramente incrementado puede observarse sólo tras adición de anticuerpos anti-flag (\ding{115}), debido a su efecto de reticulación y con ello de oligomerización.

En cambio, los oligómeros de los trímeros según la invención, aquí el dodecámero de la proteína de fusión según la invención (6) muestran un alto efecto de proliferación en la Figura 11B, que puede observarse ya a 5 ng/ml (\Delta). En cambio, la combinación de anticuerpos anti-flag reticulantes y de dodecámeros según la invención (\ding{115}) como referencia puede conseguir un aumento solamente ligero del efecto de proliferación en comparación con el resultado al adicionar solamente el dodecámero según la invención. Esto demuestra que un oligómero según la invención, aquí en forma de un dodecámero, provoca ya un efecto de proliferación casi óptimo.

La secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión según la invención (7), que contiene los aminoácidos 116 a 261 de hCD40L (h: humano) como componente A en combinación con el dominio de oligomerización de ACRP30 (AA 18-111) como componente B se ha representado en la Figura 12 (CD40L-ACRP30).

En la Figura 13 - igual que en la Figura 11 - se ha representado el resultado de un experimento de proliferación de células. Sin embarbo, a diferencia de la Figura 11, se utilizaron PBL humanos (linfocitos sanguíneos periféricos). Se ha representado el efecto de CD40L convencional, que está presente en solución en forma de un trímero (secuencias de "flag" y de ligador, igual que en la Figura 12, seguidas de secuencia de AA 16 a 261 de hCD40L sin componente oligomerizante B; Figura 13A) con relación a la proliferación de las células en comparación con el efecto de los dodecámeros según la invención de proteínas de fusión según la invención (7) según la Figura 12, CD40L-ACRP30 (Figura 13B). Los experimentos realizados en ausencia (\Delta) de anticuerpos anti-flag M2 muestran que el trímero de CD40L presenta casi ningún efecto de proliferación, mientras que en la Figura 13B puede detectarse un efecto de proliferación correspondiente ya a una concentración mucho menor de hCD40L. En el eje x, se ha trazado en la Fig. 13B el parámetro "1/dilución", es decir, no las concentraciones absolutas, puesto que se adicionó un sobrenadante concentrado cuya concentración absoluta es desconocida. La combinación de anticuerpos anti-flag reticulantes y de dodecámeros de la proteína de fusión según la invención (7) (\ding{115}) como referencia puede producir otro traslado del efecto de proliferación correspondiente hacia concentraciones más bajas por formación de agregados de orden más alto.

La Figura 14 representa esquemáticamente la estructura de multímeros oligomerizantes. Las Figuras 14A y 14B representan esquemáticamente el aspecto de "protéinas haz" (bundle proteins) nativas con su estructura ya oligomerizada en su estado nativo (Fig. 14A: el hexámero de trímeros de dominios cabeza que forman la proteína complementaria C1q; Fig. 14B: el tetrámero de trímeros de dominios cabeza que forman ACRP30, una proteína de suero producida por adipocitos). Dichos oligómeros se utilizan para multimerizar y oligomerizar los dominios cabeza de los monómeros nativos en el complejo de C1q y de ACRP30. Mientras que el complejo de oligomerización de C1q está constituido por tres productos de gen distintos, el complejo de oligomerización de ACRP30 es un homododecámero, es decir, productos de gen multi- y oligomerizados idénticos. Cada cadena de polipéptidos individual en la que están basados los dos complejos de oligomerización nativos citados anteriormente dispone de un dominio cabeza, una zona de secuencia que puede formar un hélice triple de colágeno y una zona de secuencia que puede oligomerizar 6 (complejo de C1q) ó 4 (complejo de ACRP30) hélices triples de colágeno para dar finalmente un haz de hélices (helix bundle) constituido por 18 y 12 monómeros, respectivamente.

En la Figura 14C, se ha representado esquemáticamente un multímero oligomerizado según la invención de una proteína de fusión según la invención (por ejemplo de la proteína de fusión (4) según la Fig. 6A, FasL-ACRP30), que comprende como componente A cuatro ligandos TNF trimerizados (por ejemplo el ligando TNF FasL) o secciones de ligandos TNF que son oligomerizadas por zonas de secuencia en forma de colágeno de la proteína ACRP30 como componente B, que están presentes por ejemplo en una proteína de fusión según la invención, dando un homododecámero según la invención.

La Figura 15A describe la construcción de otra proteína de fusión según la invención, es decir, hEDA/FasL. En esta construcción, se utiliza el dominio de colágeno de EDA humano (aminoácidos 160 a 242) como componente B, al que se ha acoplado por el extremo N-terminal un epítope "flag" a través de un ligador y por el extremo C-terminal un componente A también a través de un ligador, en la Fig. 15A FasL (AA 139-281), es decir, el dominio extracelular de FasL o un fragmento del mismo). La proteína de fusión según la invención hEDA/FasL está presente como hexámero, dímero de trímeros. La proteína EDA es otro miembro de la clase TNF, que comprende, además de un dominio transmembrana y un dominio TNF, también un dominio de colágeno (ver la Fig. 15A arriba) y 391 AA en la forma humana.

La Figura 15B representa investigaciones con la proteína de fusión según la invención hEDA/FasL. Con el fin de preparar la proteína de fusión, se amplificó en primer lugar el dominio de colágeno de EDA humana (AA 160 a 242) con cebadores adecuados y, a continuación, el producto resultante se fusionó con las secuencias correspondientes en el extremo N-terminal o C-terminal para "flag" y el dominio extracelular de FasL humano (AA 139 a 281). La Figura 15B representa curvas obtenidas de la titulación de células Jurkat-T con FasL por un lado y la proteína de fusión hEDA/FasL por otro lado con la adición de anticuerpos anti-flag M2 y sin adición de anticuerpos anti-flag M2. A tal fin, se adicionaron sobrenadantes (OPTIMEM) de células 293 transfectadas transitoriamente con FasL o hEDA/FasL y que expresan dichas proteínas a células Jurkat-T. En experimentos consecutivos, se utilizaron las concentraciones descendientes representadas en el eje x de dichas proteínas representadas en la Figura 15B, y se determinó la tasa de supervivencia de las células Jurkat en cada caso con la ayuda de la prueba de citotoxicidad estándar descrita en otro lugar. La representación gráfica muestra claramente que FasL es inactivo sin los anticuerpos M2 de reticulación transversa (\Box) y que sólo la acción de reticulación transversa de los anticuerpos M2 produce los efectos citotóxicos (\blacksquare). En cambio, la acción correspondiente se consigue con una proteína de fusión según la invención, es decir, hEDA/FasL, ya sin adición de anticuerpos M2 (\medcirc). En este caso, la adición de anticuerpos M2 puede aumentar aún el efecto de la proteína de fusión según la invención (\medbullet).

A continuación, la presente invención se ilustrará con mayor detalle haciendo referencia a las siguientes formas de realización ejemplificativas.

Para las seis siguientes formas de realización ejemplificativas, hay que utilizar las siguientes situaciones experimentales de (a) a (f), si son pertinentes y no son aplicables modificaciones correspondientes publicadas en otro lugar:

(a) Construcciones de vectores para las proteínas de fusión FasL, TRAIL, TNF\alpha y CD40L

Un fragmento de ADN que codifica para el péptido señal de hemoaglutinina, incluyendo 6 bases de la secuencia no traducida en la zona 5' (CAA AAC ATG GCT ATC ATC TAC CTC ATC CTC CTG TTC ACC GCT GTG CGG GGC), así como el epítope "flag" (GAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA), el ligador (GGA CCC GGA CAG GTG CAG), los punto de corte de restricción PstI, SalI, XhoI y BamHI se clonaron entre los puntos de corte de restricción HindI-II y BamHI de un vector PCRIII modificado (InVitrogen, NV Leek, Países Bajos), en el que se eliminaron las bases 720-769 por deleción (PS 038). Para el vector de expresión del FasL trimérico, se amplificaron los aminoácidos 139 a 281 de la secuencia que codifica para el FasL humano, enmarcados por los puntos de corte de restricción PstI y EcoRI, y se clonaron en el vector PCRIII modificado.

Para el FasL hexamérico, se clonaron la secuencia que codifica para los aminoácidos 103 a 281, enmarcados por ambos lados de puntos de corte EcoRI así como adicionalmente por el extremo 5' por la secuencia de ligador GGCTT y por el extremo 3' por el codón de terminación (TAA) y por la secuencia natural, no traducida (GAG AAG CAC TTT GGG ATT CTT TCC ATT ATG ATT CTT TGT TAC AGG CAC CGA GAT GTT GAA GCC) en el punto de corte EcoRI del vector PS 038. El "Super-FasL" (Figura 4, proteína de fusión (3)) se produjo introduciendo una mutación puntual en la secuencia de ligador del vector PS 038, reemplazando la secuencia CAGTGTGCTG por el lado 5' del punto de corte EcoRI con CAGTCTGCAG con la ayuda de métodos de mutación de PCR. A continuación, el FasL (aminoácidos 103 a 281) se clonó en el PS 038 modificado de la forma descrita anteriormente.

Para TRAIL humano, TNF\alpha murina y CD40L humano, se amplificaron partes de los dominios extracelulares (TRAIL: aminoácidos 95 a 281, TNF\alpha: aminoácidos 77 a 235, CD40L: aminoácidos 116 a 261 con puntos de corte de restricción PstI por el extremo 5' y un codón de terminación así como puntos de corte de restricción SpeI y EcoRl por el extremo 3' por PCR y se clonaron en el vector PCRII (Invitrogen). Para la expresión de los ligandos como trímeros, se insertó en primer lugar la secuencia GAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA, que codifica para el tag "flag", así como la secuencia de ligador GGA CCC GGA CAG GTG CAG entre los puntos de corte BamHI y PstI en el vector pQE-16 (Qiagen) (PS330). A continuación, los ligandos se subclonaron en PS 330 como fragmentos PstI/SpeI.

El vector de expresión para FasL-ACRP30 se construyó de la siguiente manera. La secuencia que codifica para los aminoácidos 18 a 111 del ACRP30 murino, enmarcada por los puntos de corte de restricción NsI y PstI, se clonó en el punto de corte PstI del vector que codifica para FasL trimérico por medio del clon EST AA673154 utilizando PCR (de tal forma que el punto de corte NsiI/PstI se encontró por el lado 5' de la secuencia codificante). Los vectores para la expresión de las proteínas de fusión de las otras citoquinas TNF con ACRP30 se generaron por substitución de la secuencia correspondiente de FasL en el vector de expresión FasL-ACRP30 con la secuencia de ligando correspondiente en los puntos de corte de restricción puntos de corte de restricción PstI y EcoRI.

(b) Expresión y purificación de las proteínas recombinantes

Para la expresión de los trímeros de TRAIL, TNF\alpha y CD40L, se establecieron clones estables en bacterias (cepa M15 con plásmido pRep4, Qiagen). Los clones correspondientes se pre-cultivaron durante la noche en un caldo LB con ampicilina (100 \mug/ml) y kanamicina (50 \mug/ml) a 37ºC, sirviendo dichos clones para la inoculación del cultivo principal (dilución 1:50, crecimiento a 37ºC), que tras una hora fueron inducidos durante seis horas con IPTG 0,5 mM (Sigma) para la expresión. Las bacterias se cosecharon por centrifugación, se lavaron dos veces en PBS, se lisiaron en la "French Press", y el lisado se separó de los residuos insolubles por centrifugación. Para todas las proteínas FasL, se generaron clones estables en células HEK293 por selección en 800 \mug/ml de G418 (ver también en el lugar citado: Schneider et al., J. Exp. Med. 1998).

Los ligandos triméricos y hexaméricos así como Super-FasL se purifiacaron a partir de los sobrenadantes de los clones estables o de los lisados bacterianos por medio de cromatografía por afinidad sobre agarosa M2 (Sigma, Suiza), se eluyeron con citrato/NaOH 50 mM (pH = 2,5) y se neutralizaron inmediatamente con 0,2 volúmenes de Tris-HCl (pH = 8). El tampón se sustituyó por PBS en concentradores (Centrikon-30, Amicon Corp., Easton, TX, EE.UU.).

Las fusiones de FasL con ACRP30 murino se purificaron de la siguiente manera. A los sobrenadantes se adicionaron NaCl 50mM y CaCl_{2} 1 mM, y el valor pH se ajustó en 7,0 por adición de ácido clorhídrico/NaOH. A continuación, la proteína recombinante se unió a agarosa M1 (Sigma, Suiza) y se eluyó con TBS-EDTA (10 mM). El tampón se sustituyó por PBS en concentradores. La concentración de las proteínas purificadas se determinó por el método de ácido bicinchónico (Pierce Chemical Co., Rockford, IL; USA) utilizando albúmina de suero bovino como estándar, y la puridad de las muestras se determinó por SDS-PAGE y la coloración con azul de Coomassie.

Las proteínas de fusión de TRAIL, TNF\alpha y CD40L con ACRP30 se adicionaron en los ensayos correspondientes en forma de sobrenadantes concentrados, preparados de la siguiente manera: células 293-T se transfectaron con los plásmidos de expresión correspondientes por el método de fosfato cálcico. Tras incubación de las células durante 16 horas con el precipitado, las células se lavaron con PBS y se incubaron en un medio libre de suero (Optimem, Gibco BRL) durante 4 días. Los sobrenadantes se concentraron a una veintena parte de sus volúmenes iniciales por medio de concentradores, y se comprobó la presencia de la proteína por "Western Blotting". En el caso de TRAIL-ACRP30 y TNF\alpha-ACRP30, se compararon las titulaciones de dichas proteínas con las titulaciones de TRAIL trimerizado o TNF\alpha purificado, con el fin de determinar la concentración de cada proteína recombinante.

(c) Comprobación del peso molecular de los multímeros por cromatografía por permeación en gel

El tamaño de las proteínas de fusión distintas se determinó por filtración en gel sobre Superdex 200 HR10/30 (Pharmacia). La proteína recombinante se aplicó a la columna junto con los estándares internos catalasa y ovalbúmina en caso de los ligandos triméricos y hexaméricos y con feritina y ovalbúmina en caso de las proteínas de fusión de ACRP30 en un volumen de 200 \mul y, a continuación se eluyó con PBS (0,5 ml/min) y se coleccionó en fracciones de 0,25 ml. La presencia de las proteínas en las diferentes fracciones, tras precipitación con ácido tricloroacético, se determinó por "Western Blotting". El tamaño de las proteínas se determinó por medio de una línea de regresión constituida por tiroglobulina (669 KDa), feritina (440 kDa), catalasa (262 kDa), aldolasa (158 kDa), albúmina de suero bovino (67 kDa), ovalbúmina (43 kDa), quimotripsinógeno A (25 kDa) y ribonucleasa A (13,7 kDa).

(d) Células

Células A20 de B-linfoma murinas se guardaron en DMEM, que contenía un 5% de FCS inactivado por calor. Las células T Jurkat de linfoblastoma, células BJAB Burkitt de linfoma se cultivaron en RPMI acompañadas de un 10% de FCS. Las células renales 293 de embriones humanos se cultivaron en una mezcla de varias sustancias F12 en DMEM (1:1) acompañadas de un 2% de FCS. Todos los medios contenían antibióticos (penicilina y estreptomicina a 5 \mug/ml cada una y neomicina a 10 \mug/ml). La línea celular T murina citotóxica CT6 dependiente de IL-2 se cultivó en RPMI, ayudado de un 10% de FCS, piruvato sódico 1 mM, 2-mercaptoetanol 50 \muM, Hepes 10 mM y un 10% de sobrenadante celular EL-4 acondicionado.

(e) Ensayo citotóxico

El ensayo citotóxico se realizó sustancialmente tal como descrito anteriormente por Schneider et al. (J. Biol. Chem. 272:18827-18833, 1997). Se incubaron 50.000 células durante 16 horas en 100 \mul del medio, conteniendo el medio las concentraciones de ligandos indicadas en presencia o ausencia de 1 \mug/ml de anticuerpos M2 (2 \mug/ml para TRAIL). Las tasas de supervivencia de las células se determinaron con la ayuda de PMS/MTS (metosulfato de fenazina/sal de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-5-[3-carboximetoxifenil]-2-[4-sulfofenil]-2H-tetrazolio) (Promega Corp., Madison, WI, USA). Se dejó desarrollar el color durante el tiempo requerido (típicamente de 1-3 horas). La absorbancia se midió a 490 nm.

(f) Ensayo de proliferación de células B

Células CD19-positivas se seleccionaron de PBL (linfocitos sanguíneos periféricos) humanos por FACS-Sorting utilizando "beads" magnéticos y se purificaron, mientras que células CD19-negativas se irradiaron con 3000 rad. 100.000 células CD19-positivas purificadas se incubaron con 100.000 PBL CD19-negativos autólogos irradiados en 120 \mul de medio (RPMI 10% de FCS, antibióticos) con las proteínas de fusión de CD40L solubles tituladas con o sin anticuerpos M2 (10 \mug/ml durante 72 horas en placas de 96 pocillos. A continuación, las células se pulsaron con ^{3}[H]-timidina durante 6 horas, y se midió su incorporación por medio de conteo de escintilación líquida ("Liquid Scintillation Counting").

Por lo demás, con relación a la descripción de los métodos utilizados para la realización de las formas de realización ejemplificativas, se hace referencia explícitamente a Schneider et al. (J. Exp. Med., Vol. 187, nº 8, 1998, 1205-1213) y a las publicaciones citadas allí como referencias.

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1ª Forma de realización ejemplificativa

Se expresó una proteína de fusión recombinante (2) que presentaba los aminoácidos 103 a 281 del hFasL (h: humano) como componente A y por el extremo N-terminal del aminoácido 103 del componente A una secuencia de 18 AA (VDLEGSTSNGRQCAGIRL, un denominado ligador específico) como componente B. Además, al extremo N-terminal de la proteína de fusión (extremo N-terminal del componente B), se había acoplado una secuencia "flag" con los aminoácidos DYKDDDDK seguida de una secuencia de ligador GPGQVQLQ (Figura 1).

Para experimentos comparativos, se expresó una proteína de fusión (1) que por el extremo N-terminal presentaba igualmente la secuencia "flag" citada anteriormente seguida de la misma secuencia de ligador por el extremo C-terminal, a la que seguían por el extremo C-terminal los aminoácidos 139 a 281 de hFasL. Por tanto, la proteína de fusión (1) se distinguió de la proteína de fusión (2) por una deleción que comprendía el ligador específico y los aminoácidos 103 a 138 de hFasL (Figura 1).

La construcción del vector de las proteínas de fusión (1) y (2) se realizó según el procedimiento descrito en (a). La expresión y purificación de las proteínas de fusión se realizaron según el procedimiento representado en (b).

Las proteínas de fusión purificadas (1) se sometieron a condiciones reductoras o no reductoras y, a continuación, se separaron por electroforesis de gel (Figura 2) en conexión con una determinación aproximada del peso molecular de las bandas correspondientes.

Por fin, se tomaron células A20 y Jurkat cultivadas según (d) y se sometieron a un ensayo citotóxico según (e). Para cada una de las dos líneas celulares, se realizó el ensayo con concentraciones ascendientes de la proteína de fusión trimerizada (1) o de dímeros de trímeros (es decir, hexámeros) de la proteína de fusión (2) en presencia o ausencia de anticuerpos anti-flag M2 (Sigma, Buchs, Suiza) (Figura 3), midiendo la absorbancia a una DO de 490 nm.

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2ª Forma de realización ejemplificativa

Se expresó una proteína de fusión recombinante (3) que presentaba los aminoácidos 103 a 281 del hFasL como componente A y por el extremo N-terminal del aminoácido 103 del componente A una secuencia de 18 AA (VDLEGSTSNGRQCAGIRL, ligador específico) como componente B. Además, al extremo N-terminal de la proteína de fusión (extremo N-terminal del componente B), se había acoplado una secuencia "flag" con los aminoácidos DYKDDDDK seguida de una secuencia de ligador GPGQVQLQ (Figura 4).

Para fines de comparación, se expresó, tal como se hizo en la 1ª forma de realización ejemplificativa, la proteína de fusión (1) (Figura 4).

Las construcciones del vector de las proteínas de fusión (3) y (1) se realizaron según el procedimiento representado para la 1ª forma de realización ejemplificativa. La expresión y purificación de las proteínas de fusión se realizaron según el procedimiento representado en (b).

Por fin, se tomaron células A20 y Jurkat cultivadas según (d) y se sometieron a un ensayo citotóxico según (e). Para cada una de las dos líneas celulares, se realizó el ensayo con concentraciones ascendientes de la proteína de fusión trimerizada (3) en presencia o ausencia de anticuerpos anti-flag M2 (Sigma, Buchs, Suiza) (Figura 5), midiendo la absorbancia a una DO de 490 nm.

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3ª Forma de realización ejemplificativa

Se expresó una proteína de fusión recombinante (4) que presentaba los aminoácidos 139 a 281 del hFasL como componente A y por el extremo N-terminal del aminoácido 139 del componente A primero el ligador dimérico con la secuencia LQ y entonces continuando por el extremo N-terminal una secuencia de 94 AA de la proteína mACRP30 (AA 18 a 111), el dominio de oligomerización, como componente B. Además, al extremo N-terminal de la proteína de fusión (4) (extremo N-terminal del componente B), se había acoplado una secuencia "flag" con los aminoácidos DYKDDDDK seguida de una secuencia de ligador GPGQVQLH (Figura 6A).

Para fines de comparación, se utilizó la proteína de fusión (1).

La expresión y purificación de las proteínas de fusión se realizaron según el procedimiento representado en (b).

Por fin, se tomaron células de linfoma BJAB-Burkitt cultivadas según (d) y se sometieron a un ensayo citotóxico según (e). El ensayo se realizó con concentraciones ascendientes de la proteína de fusión trimerizada (1) y de trímeros oligomerizados (dodecámeros) de la proteína de fusión (4), es decir, del FasL-ACRP30 recombinante (4x3), respectivamente, en presencia o ausencia de anticuerpos anti-flag M2 (Sigma, ver arriba) (Figura 7), midiendo la absorbancia a una DO de 490 nm.

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4ª Forma de realización ejemplificativa

Se expresó una proteína de fusión recombinante (5) que presentaba los aminoácidos 95 a 281 del hTRAIL (h: humano) como componente A y por el extremo N-terminal del aminoácido 95 del componente A primero el ligador dimérico con la secuencia LQ y entonces continuando por el extremo N-terminal una secuencia de 94 AA de la proteína mACRP30 (AA 18 a 111), el dominio de oligomerización, como componente B. Además, al extremo N-terminal de la proteína de fusión (extremo N-terminal del componente B), se había acoplado una secuencia "flag" con los aminoácidos DYKDDDDK seguida de una secuencia de ligador GPGQVQLH (Figura 8).

Para fines de comparación, se expresó una proteína de fusión (no representada en la Figura 8) que está presente en solución como trímero (TRAIL trimérico). Dicha proteína del experimento comparativo presenta del extremo N-terminal al extremo C-terminal la secuencia "flag", el ligador con la secuencia GPGQVQLH y finalmente hTRAIL (AA 95 a 281). Por tanto, a diferencia de la proteína de fusión (5), falta el componente B (mACRP30: AA 18 a 111) y el ligador con la secuencia LQ.

La expresión y purificación de las proteínas de fusión se realizaron según los procedimientos representados en (b).

Por fin, se tomaron células T-Jurkat de linfoblastoma cultivadas según (d) y se sometieron a un ensayo citotóxico según (e). El ensayo se realizó con concentraciones ascendientes de trímeros de la proteína de fusión sin la secuencia ACRP30 (para fines comparativos) y de trímeros oligomerizados (dodecámeros) de la proteína de fusión (5), es decir, un dodecámero del TRAIL-ACRP30 recombinante (4x3), respectivamente, en presencia o ausencia de anticuerpos anti-flag M2 (Sigma, ver arriba) (Figura 9), midiendo la absorbancia a una DO de 490 nm.

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5ª Forma de realización ejemplificativa

Se expresó una proteína de fusión recombinante (6) que presentaba los aminoácidos 77 a 235 del mTNF\alpha (m: murino) como componente A y por el extremo N-terminal del aminoácido 85 del componente A primero el ligador dimérico LQ y entonces continuando por el extremo N-terminal una secuencia de 94 AA de la proteína mACRP30 (AA 18 a 111), el dominio de oligomerización, como componente B. Además, al extremo N-terminal de la proteína de fusión (extremo N-terminal del componente B), se había acoplado una secuencia "flag" con los aminoácidos DYKDDDDK seguida de una secuencia de ligador GPGQVQLH (Figura 10).

Para experimentos comparativos, se expresó una proteína de fusión (no representada en la Figura 10) que está presente en solución como trímero (TNF\alpha trimérico). Dicha proteína del experimento comparativo presenta del extremo N-terminal al extremo C-terminal la secuencia "flag", el ligador con la secuencia GPGQVQLH y finalmente mTNF\alpha (AA 77 a 235). Por tanto, a diferencia de la proteína de fusión (6), falta el componente B (mACRP30: AA 18 a 111) y el ligador con la secuencia LQ.

Utilizando un ensayo de proliferación de células según (f), se midieron los efectos producidos por adición de concentraciones ascendientes de trímeros de TNF\alpha u oligómeros de TNF\alpha-ACRP30 (homododecámero de TNF\alpha) en presencia o ausencia de anticuerpos anti-flag M2 (Sigma, ver arriba) a células CT6.

A tal fin, las células CT6 se sometieron durante 4 días a concentraciones reducidas de sobrenadante de EL-4 (2,5%) antes del experimento de proliferación. Las células se incubaron en placas de titulación de 96 pocillos (40.000 células/pocillo) con las concentraciones indicadas de oligómeros de TNF\alpha-ACRP30 o mTNF-\alpha en presencia o ausencia de 2 \mug/ml de mac M2 y en ausencia de sobrenadante de EL-4 durante 16 horas. Las células se pulsaron con [^{3}H]-timidina (0,5 \muCi/pocillo) durante otras 6 horas, se sometieron a tres ciclos de congelación y fusión y finalmente se cosecharon. Finalmente, la incorporación de [^{3}H]-timidina se controló por medio de una medición por escintilación líquida (Figura 11).

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6ª Forma de realización ejemplificativa

Se expresó una proteína de fusión recombinante (7) que presentaba los aminoácidos 116 a 261 de hCD40L (h: humano) como componente A y por el extremo N-terminal del aminoácido 95 del componente A primero el ligador dimérico LQ y entonces continuando por el extremo N-terminal una secuencia de 94 AA de la proteína mACRP30 (AA 18 a 111), el dominio de oligomerización, como componente B. Además, al extremo N-terminal de la proteína de fusión (extremo N-terminal del componente B), se había acoplado una secuencia "flag" con los aminoácidos DYKDDDDK seguida de una secuencia de ligador GPGQVQLH (Figura 12).

Para experimentos comparativos, se expresó una proteína de fusión (no representada en la Figura 12) que está presente en solución como trímero (CD40L trimérico). Dicha proteína del experimento comparativo presenta del extremo N-terminal al extremo C-terminal la secuencia "flag", el ligador con la secuencia GPGQVQLH y finalmente hCD40L (AA 116 a 261). Por tanto, a diferencia de la proteína de fusión (7), falta el componente B (mACRP30: AA 18 a 111) y el ligador con la secuencia LQ.

Finalmente, se llevó a cabo el ensayo de proliferación de células descrito en (f) de forma análoga para PBL, adicionándose el trímero de CD40L o los oligómeros de CD40L-ACRP30 (homododecámeros) en presencia o ausencia de anticuerpos anti-flag M2 (Sigma, ver arriba) (Figura 13).

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7ª Forma de realización ejemplificativa

7.1 Procedimiento experimental

La 7ª forma de realización ejemplificativa se refiere a proteínas de fusión constituidas por un componente A multi- y oligomerizante y un receptor como componente B.

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(A) Construcción del vector

Las proteínas de fusión se construyeron a partir de un vector PCR-3 modificado (de Invitrogen) como secuencia de módulos intercambiables en el siguiente orden (de 5' a 3'): (a) un módulo de HindIII/SalI, que contiene el dominio extracelular de un receptor, precedido por una secuencia Kozak GCCACC ( en caso de hTNF-R1 (aminoácidos 1-211); h-TRAIL-R1 (aminoácidos 1-239), h-TRAIL-R2 (aminoácidos 1-212), h-TRAIL-R3 (aminoácidos 1-240) y hCD40 (aminoácidos 1-193) o en caso de hFasR (aminoácidos 1-170) precedido por 24 nucleótidos de la región 5' no traducida); (b) un ligador de 14 aminoácidos (PQPQPKPQPKPEPE) en un cassette de SalI/XhoI (tal como descrito en Terskih et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1663); (c) un dominio de oligomerización en un módulo XhoI/NotI en caso de OPG (aminoácidos 187-401, aquí descrito como \deltaN-OPG), CMP (aminoácidos 451-493), GenBank 115555); COMP (aminoácidos 32-75, GenBank 1705995); (d) un cassette NotI/XbaI, que contiene un marcaje His_{6}-myc combinado y un codón de terminación. El dominio de oligomerización estaba enmarcado por las secuencias de aminoácidos GGCC y ARTPGGGS en los extremos N-terminal y C-terminal, respectivamente. Para todos los constructos, se utilizaron ligadores. En caso de los constructos de Fc, se clonaron la región "hinge", los dominios CH2 y CH3 y el codón de terminación de hIgG1 como cassette de SalI/NotI, tal como fue descrito anteriormente (Schneider et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 18827; Schneider et al. (1998) J. Exp. Med. 187, 1205). Líneas de células estables derivadas de HEK-293 se establecieron para la preparación de proteínas recombinantes por selección en 800 \mug/ml de G418 con la ayuda del método descrito anteriormente (Schneider et al. (1997) ver
arriba).

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(B) Transfección transitoria

Las células 293T se transfectaron por el método de CaCl_{2}, tal como descrito anteriormente (Schneider et al. 1997, ver arriba) y se lavaron con PBS, antes de incubarlas en un medio Optimem libre de suero durante tres días. Los sobrenadantes se concentraron 30 veces y se mantuvieron congelados hasta ser utilizados. La concentración de las proteínas de fusión Fas/\deltaN-OPG y Fas/CMP en un medio Optimem concentrado se determinó por medio de una titulacíon sobre "Western Blots" utilizando Fas/COMP purificado como estándar.

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(C) Purificación de las proteínas recombinantes

Los sobrenadantes de células 293 transfectadas establemente se colocaron en agarosa M2 (como ligandos) o proteína A-sepharosa (proteínas de fusión Fc), se lavaron con PBS y se eluyeron con citrato/NaOH 50 mM (pH 2,5). El eluado se neutralizó con Tris-HCl (pH 8), y el tampón se reemplazó por PBS en concentradores Centrikon-30 (de Amicon, Easton, Texas). Las proteínas de fusión COMP y CMP se purificaron en columnas Hi-Trap-Chelate. A tal fin, los sobrenadantes de las células 293 transfectadas establemente se suplementaron con NaCl 500 mM y imidazola 10 mM, la mezcla resultante se pasó por columnas pre-cubiertas con ZnSO_{4} 0,5 M (pH 2,5) y se equilibraron en PBS. La columna se lavó con PBS, y las proteínas se eluyeron con PBS que contenía EDTA 50 mM. El tampón se reemplazó por PBS tal como descrito anteriormente.

Flag-FasL y Flag-TRAIL se prepararon tal como descrito anteriormente (Schneider et al., 1997, J. Biol. Chem. 272, 18827 y Thome et al., 1997, Nature 386, 517). Ambas publicaciones se han incorporado con todo su contenido en la presente memoria de patente por referencia. Flag-CD40L (AA 116 a 261) se expresó en bacterias y se purificó sobre agarosa M2, tal como se ha descrito para Flag-TRAIL. Las concentraciones de proteína se determinaron por el método del ácido bicinchónico. El grado de purificación se investigó por medio de SDS-PAGE y el marcaje con Coomassie Blue.

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(D) Cromatografía de permeación en gel

Como parte de la cromatografía de permeación en gel, se colocó la cantidad correspondiente de la proteína de fusión en un volumen de 200 \mul en una columna Superdex 200 HR 10/30 (de Pharmacia) y se eluyó con 0,5 ml/min de PBS, registrando al mismo tiempo la absorbancia a 280 nm. Las fracciones individuales (0,25 ml) se analizaron en ensayos de citotoxicidad, tal como se describirá a continuación. Para la determinación del peso molecular, se calibró la columna con las proteínas estándares tiroglobulina (669 kD), ferritina (440 kD), catalasa (262 kD), aldolasa (158 kD), albúmina de suero bovino (67 kD), ovalbúmina de pollo (43 kD), quimotripsinógeno A (25 kD) y ribonucleasa A (13,7 kD).

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(E) ELISA de Competición

El ensayo ELISA de competición se llevó a cabo tal como se describirá a continuación. Placas ELISA de 96 pocillos se recubrieron con receptor/proteína de fusión Fc (0,2 \mug/ml en PBS, 100 \mul, 16 horas, 25ºC). Los pocillos se saturaron en PBS a 37ºC durante una hora, conteniendo el PBS un 5% de suero fetal de ternera (como tampón bloqueador). Al utilizar sCD40L, el tampón bloqueador era PBS que contenía un 4% de leche libre de grasa y un 0,05% de Tween-20. Se disolvieron las proteínas de fusión de competición Fc o COMP de forma seriada en 100 \mul de un tampón bloqueador en presencia o ausencia de 1 \mug/ml de la proteína. Los ligandos se adicionaron a una concentración constante: (sFasL: 2 \mug/ml 36 nM, sTNF\alpha: 0,02 \mug/ml, 0,36 mM; sTRAIL: 0,1 \mug/ml, 1,4 nM; sCD40L: 0,5 \mug/ml, 9,2 nM, todos en un tampón bloqueador) y podían formar una unión durante una hora a 37ºC. Los ligandos unidos se identificaron con anticuerpos anti-flag M2 (1 \mug/ml en un tampón bloqueador, 100 \mul, 45 minutos, 37ºC), anticuerpos cabra-antiratón, acoplados a peroxidasa, 1:2000 en un tampón bloqueador, 100 \mul, 30 minutos, 37ºC) y hidrocloruro de o-fenilendiamina (0,3 mg/ml en ácido cítrico 50 mM, Na_{2}HPO_{4} 100 mM, 0,01% de H_{2}O_{2}). La absorbancia se midió a 490 nm.

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(F) Ensayos de citotoxicidad

Los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos en un volumen de 100 \mul sustancialmente tal como se ha descrito en Schneider et al. (1997) ver arriba. Los receptores quimeras se diluyeron de forma seriada en un medio que contenía tales cantidades de ligandos citotóxicos que eran capaces de inducir la muerte celular en más de un 95% de los casos. Donde se haya indicado, la proteína A se utilizó en una concentración de 1 \mug/ml. sFasL se utilizó en presencia 1 \mug/ml de M2 y sTRAIL en presencia de 2 \mug/ml de M2. En las series de ensayo con sTNF\alpha, no se utilizaron anticuerpos M2. Las células se sometieron a una incubación de 16 horas, y sus tasas de supervivencia se determinaron utilizando el sistema de prueba PMS/TMS (metosulfato de fenazina/3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-5-[3-carboximetoxifenil]-2-[sulfofenil]-2H-tetrazolio, en forma de sal) (Promega, Madison, Wisconsin). La absorbancia se midió a 490 nm. Para poder especificar las concentraciones molares de las proteínas de fusión distintas, se estimó el peso molecular de la siguiente manera: [(M_{r}+3 kDa teórico por gliano N-acoplado prognosticado) x multiplicidad]. Fas:Fc, :COMP, :CMP, :dN-OPG: 98, 172, 100 y 105 kDa, respectivamente. TRAILR2:Fc, :COMP, :CMP, dN-OPG: 86, 142, 82 y 93 kDa, respectivamente, TNF-R1:Fc, :COMP: 104 y 187 kDa. CD40:Fc, :COMP: 101 y 180 kDa. TRAIL-R2:Fc: 86 kDa, TRAIL-R3:Fc: 127 kDa. Flag-TRAIL, Flag-FasL, Flag-TNF\alpha, Flag-CD40L: 71, 55, 56 y 54 kDa, respectivamente.

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(G) Mediciones BIAcore

Las mediciones BIAcore se llevaron a cabo sobre chips de sensores modificados con CM5-carboximetildextrano (de BIAcore AB, Uppsala, Suecia) a un caudal de 5 \mul/min. Los chips CM5 se activaron con una adición de 50 \mul de una mezcla 1:1 de N-etil-N'(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida:N-hidroxisuccinimida. Seis \mul de una solución a 100 \mug/ml de anticuerpos monoclonales anti-flag M2 en NahCO_{3} 10 mM (pH 5,5) se pasaron por la superficie activada. Una adición de 50 \mul de etanolamina-HCl desactivó los ésteres de N-hidroxisuccinimida que quedaban. La cantidad de anticuerpos M2 inmovilizados, necesaria para este procedimiento, era de aproximadamente 4600 unidades. Para el análisis de las interacciones de FasL-Fas:proteína de fusión y de TRAIL-TRAIL-R2:proteína de fusión, una cantidad constante de ligando marcado se inmovilizó en una superficie M2 modificada. Para conseguir esto, se aplicó una adición de 7 \mul de flag-FasL flag-TRAIL a 2,5 \mug/ml a la superficie. Esto dio lugar a una unión de aproximadamente 100 a 150 unidades. Por cierto, dichas condiciones permitieron una mínima disociación de los ligardos de la superficie M2, mientras permitieron al mismo tiempo una unión de receptor subsiguiente suficiente para el análisis. A continuación, la unión de receptor:proteína de fusión se analizó por medio de inyecciones de 15 \mul de receptor:proteína de fusión a concentraciones entre 1 y 100 \mug/ml, lo que corresponde a 100 a 150 unidades. Se midieron la cinética de asociación durante 3 minutos y la cinética de disociación durante 3 a 5 minutos. A continuación, se regeneró la superficie (para dar una simple superficie M2) por medio de una adición de 5 \mul de citrato-HCl 50 mM (pH 2,5). Era posible realizar hasta 30 secuencias consecutivas de unión y regeneración sin cambio significante de las propiedades de unión de los anticuerpos M2 inmovilizados. Las cinéticas de disociación y asociación se analizaron por medio del programa para el análisis de la cinética del fabricante empleando los modelos AB=A+B y A+B=AB.

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(H) Cultivo de hepatocitos de ratón primarios

Para el cultivo de hepatocitos de ratón primarios, se sacrificaron ratones C57BL/6, y se quitó inmediatamente la parte del hígado por encima del vaso biliar, para mantenerla entonces en un "Hepatocyte Attachment Medium" (HAM). Por la parte del hígado se pasó primero por perfusión 16 ml de Hepes 10 mM (pH 7,6), con el fin de eliminar los eritrocitos, y, a continuación, la parte de hígado se trató con 12 ml de colagenasa H a 0,5 mg/ml (de Boehringer Mannheim) en Hepes (CaCl_{2} 4 mM) y luego se homogeneizó en una placa de Petri en Hepes. Las células se lavaron en Hepes, se centrifugaron (100 g, 30 segundos) y se resuspendieron en una solución de Percoll isotónica al 60% (de Pharmacia) en HAM y se recentrifugaron (700 g, 2 min). Todos los tampones y el medio se utilizaron a 37ºC. Las células sedimentadas se resuspendieron en HAM, se contaron, se colocaron en placas de microtítulo de pocillos planos (10.000 por pocillo, 200 \mul), permiténdolas adherir. Se adicionó la mezcla experimental (inhibidores diluidos de forma seriada, sFasL (concentración final: 400 ng/ml, 7 nM) y anticuerpos M2 (concentración final: 1 \mug/ml), y las células se incubaron durante otras 16 horas. El sobrenadante se retiró, HAM fresco (100 \mul) se adicionó, y la prueba de supervivencia PMS/MTS se realizó tal como se ha descrito anteriormente.

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(I) Muerte celular inducida por activación

Placas de pocillos planos se recubrieron con CD3 TR66 anti-humano (10 \mug/ml) en PBS durante 3 horas a 37ºC. Las placas se lavaron dos veces en PBS y una vez con el medio RPMI.1640. Células Jurkat (5 x 10^{5} células por ml, 100 \mul) se mezclaron con los inhibidores, y la mezcla resultante se distribuyó a cada pocillo, luego la mezcla se centrifugó (200 g, 3 min) y se incubó durante 24 horas a 37ºC. La capacidad de supervivencia de células se midió (a una DO de 490 nm) tal como se ha descrito anteriormente. La protección celular específica (en %) se calculó de la siguiente manera: [(anti-CD3 + inhibidor) - (anti-CD3)] [(control) - (anti-CD3)] x 100.

Para proporcionar un cultivo de leucocitos mixto, se cultivaron células esplénicas de ratones deficientes en perforina o gld C57BL/6 (H-2^{b}) juntas con células esplénicas irradiadas con rayos gamma (36 Gy) de ratones Balb/c (H-2^{d}) durante 5 días. Antes de ser utilizadas, de las muestras se eliminaron las células no viables por medio de una centrifugación por gradiente sobre Ficoll-Paque (de Pharmacia Biotech). El marcaje se realizó según los métodos descritos anteriormente (Kataoka et al.). Dicho en pocas palabras, las células de destino (células A20) se marcaron con [^{51}Cr]-cromato sódico (de Dupont, Boston, MA) durante 1 hora, se lavaron tres veces con RPMI 1640, las células MLC se mezclaron con las células de destino (10^{4} células por pocillo) en placas de microtítulo en forma de U en presencia o ausencia de Fas:Fc y Fas:COMP a 40 \mug/ml para dar un volumen final de 200 \mul, y las placas se centrifugaron (200 g, 3 min). Tras 4 horas de incubación, se retiraron los sobrenadanates y se midió su radiactividad. La liberación de [^{51}Cr] específica (en %) se determinó con la siguiente fórmula: [(liberación experimental) - (liberación espontánea) / (liberación máxima - liberación espontánea] x 100.

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(K) Marcaje con FACS

Para el marcaje con FACS, el clono CD40L^{+} Jurkat D 1.1 (5x10^{5} células) se incubó con 2 \mug de CD40:COMP en un tampón FACS (PBS, 10% de suero fetal de ternera y 0,02% de NaN_{3}). Fas:COMP se utilizó como control negativo. El receptor:COMP se detectó con 1 \mug del anticuerpo 9E10 anti-myc, seguido de un tratamiento con el anticuerpo cabra-anti-ratón marcado con FITC (1:100). Las incubaciones se realizaron durante 20 min a 4ºC en 50 \mul del tampón FACS.

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(L) Ensayo de proliferación de células B

Para el ensayo de proliferación de células B, se purificaron células CD19^{+} de linfocitos sanguíneos humanos periféricos con "beads" (bolitas) magnéticas, y los células CD19^{-} restantes se irradiaron (3000 rad). 10^{5} de células CD19^{+} purificadas se mezclaron con 10^{5} células CD19^{-} de PBL irradiados de forma autóloga en 120 \mul de un medio que contenía sCD40L a una concentración de 100 ng/ml (1,8 nM), anticuerpos M2 a 10 \mug/ml con o sin la proteína A a una concentración de 1 \mug/ml y las concentraciones indicadas de CD40:Fc o CD40:COMP. A continuación, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos durante 72 horas, se pulsaron con [^{3}H]-timidina (1 \muCi/pocillo) durante 6 horas y se cosecharon. La incorporación de [^{3}H]-timidina se controló por conteo por escintilación líquida.

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7.2 Resultados de la 7ª forma de realización ejemplificativa

Las proteínas de fusión constituidas por los dominios extracelulares de un receptor fusionado con la parte Fc de IgG (receptor:Fc) son conocidos por el estado de la técnica como agentes inhibidores para la investigación de las interacciones receptor/ligando. En la 7ª forma de realización ejemplificativa, se investigó el tamaño de la proteína de fusión Fas:Fc purificada por cromatografía de exclusión y se halló que se eluyó un solo pico con el tiempo de retención esperado. Las fracciones que contenían Fas:Fc eran capaces de proteger células A20 expuestas a una dosis letal de FasL soluble (sFasL) contra la muerte celular, a pesar de que el grado de protección (hasta un 50%) era excepcionalmente bajo, teniendo en cuenta que la relación de Fas:Fc a FasL en el ensayo era aproximadamente 1000.

Una actividad protector débil se observó en algunas de las fracciones anteriores del eluado, probablemente debido al contenido de pequeñas cantidades no detectables de complejos de alto peso molecular de Fas:Fc. Según la invención, se reconoció que los agregados de este tipo de mayor grado de agregación de la proteína de fusión pueden actuar como inhibidores potentes de la muerte celular iniciada por FasL. Por tanto, inicialmente se aumentó dicha fracción de alto peso molecular de Fas:Fc agregado, adicionando la proteína A que funciona como reticulante transverso de inmunoglobulinas. En cuanto el análisis se realizó en condiciones en las que sólo aproximadamente un 10% de la Fas:FC inyectada se desplazó hacia las fracciones eluidas antes, era obvio que el complejo de Fas:Fc de alto peso molecular es un antagonista verdadero de la citotoxicidad iniciada por FasL. En cambio, las fracciones restantes de Fas:Fc todavía fueron eluidos como dímeros y sólo daban una protección parcial a las células a pesar una concentración 10 veces más alta. Según la invención, dichos resultados de la 7ª forma de realización ejemplificativa demuestran que la formación de los agregados más altos de Fas:Fc aumentan sustancialmente la actividad protectora especifica.

A base de dichos hallazgos se construyeron, según la invención, complejos de proteínas de fusión que, debido al incremento del grado de oligomerización de Fas, presentan una mejor actividad frente a FasL y mejoran las propiedades inhibidoras. Entre los ejemplos de las proteínas de fusión según la invención, se incluyen las en las que los dominios extracelulares de receptores de la clase TNF, por ejemplo Fas, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TNF-R1 o CD40, se han fusionado a través de un ligador de 14 aminoácidos con los dominios oligomerizantes o bien del denominado Cartilage Oligomeric Matrix Protein ((COMP); proteína de fusión denominada: receptor:COMP) o Cartilage Matrix Protein ((CMP); proteína de fusión: receptor:CMP). Dichas proteínas de matriz o sus dominios presentan la propiedad nativa de formar estructuras coiled-coil de pentámeros o trímeros. Las proteínas de fusión citadas anteriormente (así como las proteínas de fusión receptor:Fc como controles) se han expresado en células de mamíferos y purificado por cromatografía de afinidad sobre columnas de quelado metálico o sobre la proteína A. En la 7ª forma de realización ejemplificativa, se han unido los receptores Fas y TRAIL-R2 también al dominio de dimerizacion C-terminal de la proteína osteoprotegerina de la clase TNF (receptor dN-OPG).

Los receptores que se habían fusionado con COMP o CMP han oligomerizado, como ha podido demostrarse por su lenta migración en gel de poliacrilamida en condiciones no reductoras. Fas:COMP y TRAIL-R2:CMP fueron eluidos como picos bien definidos con pesos moleculares aparentes de aproximadamente 400 y 170 kDa, respectivamente al aplicarse el método de cromatografía de permeación en gel. Los pesos moleculares coinciden con estructuras triméricas y pentaméricas de las proteínas de fusión. Por tanto, de los experimentos de la 7ª forma de realización ejemplificativa puede concluirse que las propiedades de agregación de los dominios de oligomerización coiled-coil de las proteínas de matriz citadas anteriormente no se ven perjudicadas por su fusión con proteínas o dominios de proteínas) de la clase de receptores TNF.

La proteína de fusión Fas:COMP presenta una K_{D} más baja que Fas:Fc, si a las proteínas de fusión se les ha dado la posibilidad de competir por la unión sFasL frente a la Fas:Fc aplicada. Coincidiendo con este resultado, se ha medido una constante de disociación de 0,77 nM para la interacción de FasL-Fas:COMP, que es aproximadamente 8 a 9 veces más baja que los valores de comparación para Fas:Fc. En la gran mayoría de las líneas de células ensayadas, resulta que la actividad inhibidora de Fas:COMP es aproximadamente 10 a 20 veces más alta que la para la proteína de fusión dimérica Fas:Fc, mientras que los resultados para los agregados Fas:Fc, provocados por la proteína A de reticulación transversa (Fas:Fc/PA), presentaban valores entre los para Fas:COMP y Fas:Fc. La actividad protectora de la proteína de fusión dimérica Fas:dN-OPG era comparable a la del complejo dimérico Fas:Fc. Fas:CMP trimérico inhibió la lisis mediada por sFasL con aproximadamente la misma eficacia que Fas:Fc/PA , es decir, 5 veces menos eficaz que Fas:COMP. La actividad inhibidora de Fas:COMP era tan buena o mejor que la de los anticuerpos monoclonales Nok-1, 4H9 y 4A5, que bloquean FasL. La actividad inhibidora superior de Fas:COMP en comparación con el complejo Fas:Fc podía apreciarse también por los experimentos con hepatocitos primarios del ratón o un sistema de modelo para la muerte celular inducida por activación con células Jurkat activadas con anti-CD3. En todos dichos experimentos, se obtuvo un valor de protección medio para Fas:Fc/PA. Además, se investigó si Fas:COMP es capaz de inhibir la acción de FasL expresado sobre CTL. La muerte de las células A20 en un sistema de prueba de 4 horas depende únicamente de perforina y de los caminos de transducción de señales dependientes de FasL, puesto que los CTL, que son deficientes tanto para perforina como para FasL, no afectan a dichas células en absoluto. En un experimento correspondiente, las células A20 fueron matadas tanto por CTL deficientes en perforina como por CTL deficientes en FasL. Fas:Fc y Fas:COMP provocaban específicamente un cierto grado de protección para las células expuestas a CTL deficientes en perforina.

Al comparar las afinidades de sCD40L para CD40:Fc, CD40:Fc/PA o CD40:COMP según la invención por ELISA de competición, se observó un aumento considerable de la afinidad (de 30 veces) para el receptor pentamerizado, mientras que para CD40:Fc/PA se obtuvo otra vez un efecto medio (de 8 veces). Para contestar a la pregunta si CD40:COMP también es capaz de reconocer CD40L unido a membranas, se realizó la línea de células D1.1 derivatizada por Jurkat, que expresa constitutivamente la proteína de superficie CD40L, con el fin de realizar un análisis de marcaje con FACS por medio de las proteínas de fusión CD40 como muestras. Un marcaje significante se observó para CD40:COMP según la invención, lo que indica que CD40:COMP es realmente capaz de formar una unión con CD40L nativo no procesado. Con el fin de investigar la actividad específica de la proteína de fusión CD40 en un sistema biológico, se intentaba inhibir la proliferación dependiente de CD40L de células B humanas que se habían co-estimulado con un receptor de células anti-B. Ni CD40:Fc ni CD40:Fc/PA eran capaces de perjudicar la proflieración de forma significante, incluso cuando se administraron en altas dosis. Al contrario, CD40:COMP según la invención era capaz de bloquear la proliferación ya a dosis relativamente bajas.

Como resumen de las investigaciones de la presente forma de realización ejemplificativa, puede constatarse que la inhibición de la apoptosis inducida por FasL por inhibición competitiva aumentó en función del grado de oligomerización y las actividades relativas de los inhibidores distintos (expresado como la relación de sus valores IC_{50} correspondientes) quedaron relativamente constantes para las líneas de células distintas. La eficacia inhibidora aumentada de Fas:COMP según la invención en comparación con Fas:Fc es probablemente el resultado de su mayor avidez. Resultados similares se obtuvieron también para la actividad de la proteína de fusión CD40. CD40:COMP según la invención es claramente superior a CD40:Fc en la inhibición de la proliferación inducida por CD40L de células D primarias in vitro. Con esto los resultados de la 7ª forma de realización ejemplificativa demuestran que pueden obtenerse constantes de disociación en el área de bajos valores nanomolares para los receptores, tales como por ejemplo Fas y CD40, que en su forma nativa se distinguen por una afinidad media para sus ligandos, si, tal como es previsto según la invención, forman parte de proteínas de fusión que se distinguen por un mayor grado de oligomerización.

<110> Apotech Research and Development Ltd.

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<120> Di- u oligómero de un di-, tri-, tetra- o pentámero de proteínas de fusión recombinantes

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<130> AP01P004WO

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<140> PCT/EP00/13032

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<141> 2000-12-20

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<160> 7

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<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Trímero de FasL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Flag

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(159)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FasL humano aa 139-281

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Hexámero de FasL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Flag

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador específico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(34)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador específico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(70)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FasL humano aa 103-138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (71)..(213)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FasL humano aa 139-281

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Super-FasL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Flag

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(34)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador específico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(70)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FasL humano aa 103-138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (71)..(213)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FasL humano aa 139-281

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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4

5

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: FasL-ACRP30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

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<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Flag

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(108)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ACRP30 de ratón aa 18-111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

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<222> (109)..(110)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

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<222> (111)..(252)

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<223> FasL humano aa 139-281

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 296

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: TRAIL-ACRP30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

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<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Flag

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(108)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ACRP30 de ratón aa 18-111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (109)..(110)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (111) .. (296)

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<223> TRAIL humano aa 95-281

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: TNFa-ACRP30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Flag

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(108)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ACRP30 de ratón aa 18-111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (109)..(110)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (111)..(268)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TNFa de ratón aa 77-235

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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10

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: CD40L-ACRP30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Flag

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(108)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ACRP30 de ratón aa 18-111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (109)..(110)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> DOMINIO

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<222> (111)..(255)

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<223> CD40L de humano aa 116-261

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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12

13

Claims

1. Proteína de fusión, caracterizada porque la proteína de fusión recombinante contiene un componente A y un componente B, siendo el componente A una sección extracelular de una citoquina TNF y el componente B una sección multimerizante y oligomerizante de una proteína ACRP30, que multimeriza y oligomeriza la proteína de fusión sin la acción de moléculas terceras.

2. Proteína de fusión según la reivindicación 1, caracterizada porque el componente B contiene una secuencia de aminoácido tal como se ha especificado según la Fig. 6A para la secuencia de los aminoácidos 18 a 111 de mACRP30, o tal como se ha especificado según la Fig. 6B para la secuencia de los aminoácidos 18 a 108 de hACRP30.

3. Proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el componente A es una sección de una citoquina TNF, seleccionada de entre el grupo constituido por CD40L, FasL, TRAIL, TNF-a, CD30L, OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APRIL, EDA, VEGI y BAFF.

4. Proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el componente A es una sección de una citoquina TNF, seleccionada de entre el grupo constituido por hFasL (AA 139-261), hTRAIL (AA 95-281), hCD40L (AA 116-261) y m- o hTNF\alpha (AA 77-235).

5. Proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque las proteínas de fusión recombinantes presentan una secuencia ligador entre el componente A y el componente B.

6. Dí- u oligómero de proteínas de fusión recombinantes según una de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Secuencia de ADN, caracterizada porque la secuencia de ADN codifica para una proteína de fusión según una de las reivindicaciones 1 a 5.

8. Vector de expresión, caracterizado porque el vector de expresión contiene una secuencia de ADN según la reivindicación 7.

9. Célula hospedadora, caracterizada porque la célula hospedadora se transfecta con un vector de expresión según la reivindicación 8.

10. Utilización de dí- u oligómeros según la reivindicación 6 para la preparación de un medicamento.

11. Utilización de dí- u oligómeros según la reivindicación 6 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de trastornos hiperinflamatorios, enfermedades autoinmunes, enfermedades basadas en trastornos hiper- o hipoapópticos, de enfermedades infecciosas, en particular enfermedades infecciosas virales, enfermedades tumorales, en particular tumores del sistema linfático y/o trastornos endocrinológicos.

12. Utilización de dí- u oligómeros según la reivindicación 6 para la preparación de un medicamento para la administración parenteral u oral.

13. Utilización de dí- u oligómeros según la reivindicación 6 para el diagnóstico in vitro.

14. Medicamento, caracterizado porque el medicamento contiene un dí- u oligómero de proteínas de fusión recombinantes según la reivindicación 6.