ES2654144T3 - Polipéptido útil en terapia celular adoptiva - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que tiene la fórmula: St-R1-S1-Q-S2-R2 en la que St es una secuencia de tallo que, cuando el polipéptido se expresa en la superficie de una célula diana, hace que los epítopos R y Q se proyecten desde la superficie celular; R1 y R2 son epítopos de unión a Rituximab que tiene, cada uno, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID No. 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16; S1 y S2 son secuencias espaciadoras, que pueden ser iguales o diferentes; y que tienen una longitud combinada de al menos aproximadamente 10 aminoácidos de tal manera que la distancia entre R1 y R2 es demasiado larga para que el polipéptido se una a los dos sitios de unión de antígeno de Rituximab simultáneamente; y Q es un epítopo de unión a QBEnd10 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2.
Description
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DESCRIPCION
Polipéptido útil en terapia celular adoptiva Campo de la invención
La presente invención se refiere a un polipéptido útil en terapia celular adoptiva (TCA). El polipéptido comprende un epítopo que permite la selección de las células transducidas y un epítopo que permite a las células expresar el polipéptido a delecionar. La presente invención también proporciona un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, una célula que comprende dicho ácido nucleico y usos terapéuticos de los mismos.
Antecedentes de la invención
La terapia celular adoptiva (TCA) ha resultado ser prometedora en la aplicación clínica contra enfermedades infecciosas y malignas. Por ejemplo, se han desarrollado células T citotóxicas específicas para el virus Epstein-Barr (EBV-CTL) para tratar enfermedades linfoproliferativas post-trasplante (PTLD) después del trasplante de células madre o de órganos (Brewin et al (2009) 114:4792-4803). Se han usado células T modificadas por ingeniería genética de manera que reconocen CD19 para tratar el linfoma folicular (Kochenderfer et al (2010) Blood 116:4099- 4102). Se ha usado TCA que utiliza linfocitos autólogos modificados genéticamente para expresar receptores de células T anti-tumorales para tratar el melanoma mestastásico (Rosenberg y Dudley (2009) Curr. Opin. Immunol. 21:233-240).
El éxito notificado de linfocitos T específicos para antígenos tumorales para el tratamiento de melanoma y malignidades asociadas con EBV ha llevado a intentar redirigir las células T efectoras y, de esta manera, ampliar la gama de tumores que pueden tratar.
Se han generado por ingeniería genética células T que comprenden receptores de células T (TCR) con nuevas especificidades. También se han desarrollado receptores de antígenos quiméricos (CAR) que comprenden un dominio de unión a antígeno, típicamente procedente de un anticuerpo, acoplado a un endodominio de transducción de señales derivado de un receptor de células T. Por lo tanto, los CAR tienen la especificidad de un anticuerpo junto con los mecanismos efectores citotóxicos de la célula T.
Hay varios ensayos clínicos en curso que usan linfocitos T modificados con CAR para inmunoterapia de malignidades del linaje de células B (Kohn et al (2011) Mol. Ther. 19:432-438). Actualmente se encuentran en desarrollo clínico células T anti-GD2 transducidas con CAR para uso en el tratamiento de neuroblastoma (Pule et al (2008) Nat. Med. 14:1264-1270). También se han presentado datos que muestran eficacia en estudios clínicos de CAR en linfoma del adulto. Para proporcionar un ejemplo adicional, las células T transducidas con receptores de células T nativos que reconocen antígenos de melanoma han dado como resultado remisiones espectaculares en el melanoma diseminado.
GENES SUICIDAS
La mayor eficacia de la inmunoterapia adoptiva se ha asociado con informes de acontecimientos adversos graves. Se han notificado acontecimientos adversos agudos, tales como tormentas de citocinas, después de la infusión de células T modificadas por ingeniería genética. Además, se han producido acontecimientos adversos crónicos y otros acontecimientos predichos por modelos animales. Por ejemplo, Las células T redirigidas a la anhidrasa carbónica IX (CAIX), un antígeno expresado por el carcinoma renal, produjo hepatotoxicidad en varios pacientes debido a la expresión inesperada de CAIX sobre el epitelio biliar. Los estudios de transferencia de receptores de células T nativas contra el melanoma han producido vitíligo e iritis en algunos pacientes debido a la expresión del antígeno diana en la piel y en el iris. Se ha notificado una enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) parecida al síndrome debido al emparejamiento cruzado de TCR en ratones después de la transferencia de TCR nativos. Se ha notificado un trastorno linfoproliferativo en un modelo animal después de la transferencia adoptiva con algunos CAR que incorpora coestimulación. Finalmente, siempre está presente el riesgo de mutagénesis insercional del vector. Aunque las toxicidades agudas pueden solucionarse mediante una dosificación cuidadosa, es probable que las toxicidades crónicas sean independientes de la dosis de células.
Como las células T modificadas por ingeniería genética pueden expandirse y persistir durante años después de la administración, es deseable incluir un mecanismo de seguridad para permitir la supresión selectiva de células T infundidas de forma adoptiva en vista de la toxicidad.
Los genes suicidas permiten la supresión selectiva de células transducidas in vivo. Dos genes suicidas están bajo ensayo clínico: HSV-TK e iCasp9.
La expresión de la timidina quinasa del virus Herpes Simplex (HSV-TK) en células T confiere susceptibilidad a ganciclovir. El uso de HSV-Tk está limitado en escenarios clínicos de inmunosupresión profunda tales como
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trasplante de médula ósea hapoidéntica ya que esta proteína viral es muy inmunogénica. Además, impide el uso de Ganciclovir para el tratamiento de citomegalovirus.
Más recientemente, se ha descrito la Caspasa 9 inducible (iCasp9), que puede activarse mediante la administración de un agente farmacéutico de molécula pequeña (AP20187). El uso de la iCasp9 depende de la disponibilidad de AP20187 de grado clínico. Además, el uso de una molécula pequeña experimental además del producto celular modificado por ingeniería genética puede ocasionar problemas normativos.
Por lo tanto, existe la necesidad de un gen suicida mejorado que solucione los problemas asociados con la inmunogenicidad y la disponibilidad del fármaco inductor que están asociados con los genes suicidas conocidos
GENES MARCADORES
Para maximizar la eficacia de la terapia celular adoptiva, es deseable disponer de un mecanismo para controlar la eficacia de la transducción y seleccionar las células transducidas. Entonces puede proporcionarse al paciente una población purificada de células transducidas.
Algunas estrategias de modificación de células T por ingeniería genética no tienen como resultado la expresión transgénica de proteínas de superficie fácilmente detectables. En estos casos, es difícil la medición de la transducción y el rastreo de las células en sangre periférica. Además, en algunas situaciones, es esencial administrar solo células T transducidas, por ejemplo, en protocolos de terapia génica para GvHD. En este caso, se requiere un marcador que permita la clasificación del grado clínico.
Se han descrito varios genes marcadores. El primero fue el gen de resistencia a neomicina, ahora de interés histórico ya que esta proteína xenogénica tan solo permite una lenta clasificación por selección con antibiótico. También se ha propuesto el receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad. Aunque no es inmunogénico, demostró efectos biológicos inesperados.
Más recientemente, se ha usado como marcador CD34 truncado. Este tiene la ventaja de que se puede adquirir fácilmente el sistema de selección de CD34 CliniMACS de Miltenyi para la clasificación de grado clínico. Sin embargo, se ha notificado que la inclusión del transgén para CD34 puede llevar a la búsqueda aberrante de células T transducidas (Lange et al (2007) Stem Cells Dev.16:297-304).
Asimismo, incluso la proteína CD34 truncada tiene una secuencia codificante larga y es probable que la inclusión de esta proteína como gen marcador ponga a prueba la capacidad de empaquetamiento del vector y la eficacia de la transcripción.
por lo tanto, existe la necesidad de un gen marcador mejorado que solucione los problemas asociados con la inmunogenicidad, la actividad biológica inesperada y las secuencias codificantes largas que están asociadas con los genes marcadores conocidos.
Descripción de las figuras
Figura 1. Unión de QBEND10 a CD34 de longitud completa (CD34), epítopo fusionado al tallo de CD8 a través de un enlazador (QL8), sin un enlazador (Q8) o fusionado directamente al dominio transmembrana de CD8a (Q). Los vectores retrovirales usados coexpresan eGFP. Se concluyó que se necesita un espaciador para la unión eficaz de OBEND10, pero no el enlazador flexible.
Figura 2. Las células T transducidas con un sobrenadante de bajo título podrían enriquecerse casi hasta la pureza usando el kit de selección de CD34 de Miltenyi.
Figura 3. Diferentes intentos con los agentes de unión a Rituximab que se unen a FACS mostrados abajo: (a) CD20 de longitud completa. Toda la parte restante unida a tallo de CD8. (b) Bucle extracelular principal de CD20 que incluye 5 restos en los dos lados del puente disulfuro; (c) Bucle extracelular principal de CD20 desde las cisteínas del puente disulfuro; (d) El mimétopo circular de Perosa (2007, J. Immunol 179:7967-7974); (e) el mimétopo lineal de Perosa (2007, como se ha indicado anteriormente). La construcción (d) se seleccionó porque otras construcciones no pudieron unirse, tuvieron una baja unión o dieron un patrón de unión bifásico.
Figura 4. (a) Viñeta que muestra la estructura de RQR8; (b) la unión de QBEND10 se compara con la de CD34 de longitud completa (izquierda); La unión de Rituximab a RQR8 se compara con la de CD20 de longitud completa (derecha). Nota, eGFP se coexpresa (c) La eficacia de destrucción después de la exposición al complemento y la activación de rituximab en células vivas muestra la supresión de prácticamente todas las células T transducidas.
Figura 5. (a) Expresión de un CAR anti-GD2 de 3a generación en células T humanas detectadas por FACS y (b) función de células T no transducidas (NT), células T anti-CD19 y células T anti-GD2 (HuK) en ensayo de
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liberación de cromo contra la línea celular diana GD2+. (c) Un TCRap nativo que reconoce el antígeno menor de histocompatibilidad HA-1 expresado en CTL específicas para EBV detectadas por tinción con tetrámero. (d) Destrucción de blastos PHA HLA-A2+ positivos para HA-1 (HH), y ausencia de destrucción de blastos HLA-A2+ negativos para HA-1 (RR) por estas EBV-CTL transducidas.
Figura 6. Modelo de GvHD. Se irradiaron ratones Balb/c receptores y recibieron 107 células de médula ósea con supresión de T procedentes de ratones C57BL/6. Los ratones de control no recibieron células adicionales; el ratón de ensayo recibió 3x106 esplenocitos de C57BL/6 clasificados magnéticamente transducidos con RQR8. (a) Análisis FACS de esplenocitos teñidos para CD4 y Thy1.1 el día 29 después de BMT. En el ratón de control están presentes linfocitos receptores residuales (Thy1.1+), pero no en el ratón receptor, lo que indica GvHD. (b) Esplenocitos de nuevo en el día 29 teñidos con QBEnd10 - pueden verse linfocitos transducidos injertados en el ratón receptor. (c) Histología de intestino de ratón de control y (d) ratón receptor que muestra una clara GvHD en el sistema digestivo de este último.
Figura 7. BLI de esplenocitos transducidos en modelo de ratón de GvHD. (a) Los presentes inventores han clonado RQR8 en fase con su Luciferasa de luciérnaga de codones optimizados, desplazada al rojo, separada por la secuencia de autoescisión 2A (RQR8-2A-FLuc). (b) Se transdujeron 6 esplenocitos negros con el vector anterior, se clasificaron y se administraron como DLI. La obtención de imágenes bioluminiscentes se realizó 7 días después en (b) animales vivos y (c) intestinos diseccionados.
Figura 8. Unión de anticuerpo recombinante Ritux-IgG2a murino (Ritux-mG2a) a células T Jurkat no transducidas, Construcción de células T Jurkat transducidas solo con el epítopo de OBEnd10 y células T Jurkat transducidas solo con la construcción RQR8. (eGFP se coexpresa).
Figura 9. Construcciones que coexpresan RQR8 con (a) CAR anti-GD2 o TCR nativo anti-HA1
Figura 10. Construcciones propuestas con (a) epítopo de Qbend10 en el tallo de CD8 (Q8, como control), (b) RQR8 aislado, o Q8 coexpresado con (c) iCasp9 o (d) HSV-TK. También se muestran construcciones modificadas por ingeniería genética para coexpresar Luciferasa de Luciérnaga (FLuc).
Figura 11. Mapeo de epítopo más fino de unión de QBEnd10
Figura 12. Epítopo de unión a Rituximab basado en construcciones de unión a mimétopo
Figura 13. Construcciones remodificadas por ingeniería genética
Figura 14. Ensayo de CDC con construcciones remodificadas por ingeniería genética.
Figura 15. Evaluación del modelo de GvHD
Figura 16. Diagrama esquemático que muestra la estructura cristalina y la distancia aproximada Resumen de aspectos de la invención
La presente invención se refiere a un polipéptido compacto que comprende tanto un resto marcador como un resto suicida. El polipéptido puede coexpresarse con un transgén terapéutico, tal como un gen que codifica un TCR o CAR.
El resto marcador comprende un epítopo mínimo de CD34 que permite la selección eficaz de células transducidas usando, por ejemplo, el sistema CD34 cliniMACS de Miltenyi.
El resto suicida comprende un epítopo mínimo basado en el epítopo de CD20. Las células que expresan un polipéptido que comprende esta secuencia pueden destruirse selectivamente usando un anticuerpo lítico tal como Rituximab.
La combinación de marcador y polipéptido suicida se expresa de manera estable en la superficie celular después, por ejemplo, de la transducción retroviral de su secuencia codificante.
Sería un desafío técnico coexpresar CD20 y CD34 además de un transgén terapéutico (tal como un transgén que codifica un TCR o CAR) debido a los límites de empaquetamiento del vector y a la complicación de los efectos biológicos tanto de CD34 como de CD20. Al proporcionar un polipéptido que comprende los epítopos de unión de estas proteínas, los presentes inventores han proporcionado un marcador/polipéptido suicida altamente compacto, cuya secuencia codificante es suficientemente pequeña como para empaquetarse fácilmente y coexpresarse con un transgén de modificación de células T, pero que conserva la funcionalidad en términos de selección de marcadores y supresión selectiva a través del resto suicida. Al proporcionar los epítopos de unión, la combinación de
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marcador/polipéptido suicida evita los efectos biológicos asociados con las moléculas CD34 y CD20 de longitud completa.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene la fórmula:
St-R1 -S1-Q-S2-R2 en la que
St es una secuencia de tallo que, cuando el polipéptido se expresa en la superficie de una célula diana, hace que los epítopos R y Q se proyecten desde la superficie celular;
R1 y R2 son epítopos de unión a Rituximab que tiene, cada uno, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID No. 1,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16;
S1 y S2 son secuencias espaciadoras, que pueden ser iguales o diferentes; y que tienen una longitud combinada de al menos aproximadamente 10 aminoácidos de tal manera que la distancia entre R1 y R2 es demasiado larga para que el polipéptido se una a los dos sitios de unión de antígeno de Rituximab simultáneamente; y Q es un epítopo de unión a OBEnd10 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ iD No. 2.
R1 y R2 pueden tener, cada uno, la secuencia mostrada como SEQ ID No. 7.
La distancia entre R1 y R2 puede ser mayor de 76.57A.
La secuencia del tallo puede proceder de CD8 alfa.
La secuencia del tallo puede comprender la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3.
El polipéptido puede comprender la secuencia mostrada como SEQ ID No. 4, o una variante de la misma que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID No. 4 y que (i) se une a QBEND10; (ii) se une a Rituximab y (iii) cuando se expresa en la superficie de una célula, induce la destrucción mediada por el complemento de la célula en presencia de Rituximab.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención fusionado a una proteína de interés (POI).
La POI puede ser un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR).
La proteína de fusión puede comprender un péptido autoescindible entre el polipéptido y la proteína de interés.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención o la proteína de fusión de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.
El vector también puede comprender un transgén de interés que puede codificar un receptor de antígeno quimérico o un receptor de células T.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una célula que expresa un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
La célula puede coexpresar el polipéptido y una POI en la superficie celular.
También se proporciona una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.
La célula puede ser una célula T.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para fabricar una célula de acuerdo con el quinto aspecto de la invención que comprende la etapa de transducir o transfectar una célula ex vivo con un vector de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método ex vivo para investigar la eficacia de transducción de un método de terapia génica que comprende la etapa de detectar la expresión del epítopo de unión a QBEnd10 en la superficie de células transfectadas o transducidas ex vivo con un vector de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención.
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En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método para seleccionar células que expresan una POI, que comprende las siguientes etapas:
(i) detectar la expresión del epítopo de unión a QBEnd10 en la superficie de células transfectadas o transducidas ex vivo con un vector de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención; y
(ii) seleccionar las células que se identifican como células que expresan el epítopo de unión a QBEnd10.
En un noveno aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar una población purificada de células enriquecidas en células que expresan una POI, que comprende la etapa de seleccionar las células que expresan una POI entre una población de células usando un método de acuerdo con el octavo aspecto de la invención.
El método puede comprender las siguientes etapas:
(i) transducir o transfectar una población de células aisladas de un paciente ex vivo con un vector de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención; y
(ii) seleccionar células que expresan la POI de la población transducida/transfectada de células por un método de acuerdo con el octavo aspecto de la invención.
En un décimo aspecto, la presente invención proporciona una población celular que está enriquecida en células que expresan un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención y, por lo tanto, enriquecida en células que expresan una POI.
Las células transducidas pueden rastrearse usando un método in vivo que comprende la etapa de detección de la expresión de un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención en la superficie celular.
Como se describe en este documento, puede usarse Rituximab en un método para suprimir una célula de acuerdo con el quinto aspecto de la invención, comprendiendo el método la etapa de exponer las células a rituximab.
Una célula de acuerdo con el quinto aspecto de la invención, o una población celular de acuerdo con el décimo aspecto de la invención, puede usarse en un método para tratar una enfermedad en un sujeto.
El método puede comprender las siguientes etapas:
(i) transducir o transfectar una muestra de células aisladas de un sujeto con un vector de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, y
(ii) devolver las células transducidas/transfectadas al paciente.
El método puede ser para tratar cáncer.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula de acuerdo con el quinto aspecto de la invención o una población celular de acuerdo con el décimo aspecto de la invención para uso en terapia mediante transferencia celular adoptiva.
Descripción detallada
La presente invención proporciona un polipéptido que comprende un epítopo marcador y un epítopo suicida.
GEN MARCADOR
Un gen marcador es una proteína que normalmente no se expresa por la célula diana, que permite la identificación de una transducción satisfactoria.
En el polipéptido de la presente invención, se usa un marcador derivado de CD34. CD34 es una glicoproteína de la superficie celular y funciona como factor de adhesión célula-célula. También interviene en la unión de células madre a la matriz extracelular de la médula ósea o directamente a células estromáticas.
CD34 no se expresa por los linajes hematopoyéticos totalmente diferenciados, por lo que es un marcador ideal para las células T modificadas.
Las células que expresan CD34 pueden identificarse y aislarse fácilmente usando el sistema magnético de selección de células CliniMACS de Miltenyi, que es un reactivo usado habitualmente para el aislamiento clínico de células madre. El sistema de selección de CD34 CliniMACS utiliza el anticuerpo monoclonal QBEnd10 para conseguir la selección celular.
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Los presentes inventores han mapeado el epítopo de unión a QBEnd10 del interior del antígeno CD34 (véanse los ejemplos) y han determinado que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2.
ELPTQGTFSNVSTNVS (SEQ ID No. 2).
El polipéptido de la presente invención comprende un epítopo de unión a QBEnd10 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 2.
GEN SUICIDA
Un gen suicida codifica una proteína que posee una capacidad inducible de llevar hasta la muerte celular.
En el polipéptido de la presente invención, se usa un resto suicida que está basado en el antígeno CD20 de células B.
Las células que expresan CD20 pueden eliminarse selectivamente mediante tratamiento con el anticuerpo Rituximab. Como no existe expresión de CD20 en las células plasmáticas, se conserva la inmunidad humoral después del tratamiento con Rituximab a pesar de la supresión del compartimento de células B.
La secuencia del epítopo de unión a Rituximab de CD20 es CEPANPSEKNSPSTQYC (SEQ ID No. 5).
Perosa et al (2007, J. Immunol 179:7967-7974) describen una serie de péptidos cíclicos heptaméricos constreñidos por cisteína, que llevan el motivo antigénico reconocido por el mAb anti-CD20 Rituximab, pero tienen diferentes aminoácidos alrededor del motivo. En total se describieron once péptidos, tal y como se muestra en la siguiente tabla:
- Péptido
- Secuencia de inserción
- R15-C
- acPYANPSLc (SEQ ID No. 6)
- R3-C
- acPYSNPSLc (SEQ ID No. 7)
- R7-C
- acPFANPSTc (SEQ ID No. 8)
- R8-, R12-, R18-C
- acNFSNPSLc (SEQ ID No. 9)
- R14-C
- acPFSNPSMc (SEQ ID No. 10)
- R16-C
- acSWANPSQc (SEQ ID No. 11)
- R17-C
- acMFSNPSLc (SEQ ID No. 12)
- R19-C
- acPFANPSMc (SEQ ID No. 13)
- R2-C
- acWASNPSLc (SEQ ID No. 14)
- R10-C
- acEHSNPSLc (SEQ ID No. 15)
- R13-C
- acWAANPSMc (SEQ ID No. 16)
Li et al (2006 Cell Immunol 239:136-43) también describen mimótopos de Rituximab, que incluyen la secuencia: QDKLTQWPKWLE (SEQ ID No. 1).
El polipéptido de la presente invención comprende un epítopo de unión a Rituximab que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la sEq ID No. 1,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16.
El polipéptido de la presente invención puede comprender un epítopo de unión a Rituximab que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 7.
La unión a Rituximab puede consistir esencialmente en una de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16.
Cuando se usan dos secuencias de aminoácidos de unión a Rituximab idénticas (o similares), lo mejor puede ser usar diferentes secuencias de ADN para codificar las dos partes R. En muchos sistemas de expresión, las secuencias homólogas pueden ocasionar acontecimientos de recombinación indeseados. Usando la degeneración del código genético, pueden usarse codones alternativos para conseguir variación en la secuencia de ADN sin alterar la secuencia de la proteína, previniendo de esta manera los acontecimientos de recombinación homóloga.
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SECUENCIA DEL TALLO
El polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de tallo que, cuando el polipéptido se expresa en la superficie de una célula diana, hace que los epítopos de R y Q se proyecten hacia afuera de la superficie de la célula diana.
La secuencia de tallo hace que los epítopos de R y Q se alejen suficientemente de la superficie celular como para facilitar la unión de, por ejemplo, Rituximab y/o QBEnd10.
La secuencia de tallo eleva los epítopos desde la superficie celular.
La secuencia de tallo puede ser una secuencia de aminoácidos básicamente lineal. La secuencia de tallo puede ser suficientemente larga como para distanciar los epítopos de R y Q de la superficie de la célula diana, pero no tan larga que su secuencia codificante comprometa el empaquetamiento del vector y la eficacia de la transducción. La secuencia de tallo puede tener, por ejemplo entre 30 y 100 aminoácidos de longitud. La secuencia de tallo puede tener aproximadamente 40-50 aminoácidos de longitud.
La secuencia de tallo puede tener un alto grado de glicosilación.
La secuencia de tallo puede comprender o ser aproximadamente equivalente en longitud a la secuencia:
La secuencia de tallo puede comprender además un dominio transmembrana, opcionalmente junto con una secuencia de anclaje intracelular. El dominio transmembrana y la secuencia de anclaje intracelular pueden proceder de la misma proteína que la parte extracelular de la secuencia de tallo o pueden proceder de una proteína diferente. El dominio transmembrana y la secuencia de anclaje intracelular pueden proceder de CD8.
Una secuencia de tallo de CD8 que comprende un dominio transmembrana y un anclaje intracelular puede tener la siguiente secuencia:
PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLL SLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV (SEQ ID No. 17).
Dentro de esta secuencia, la parte subrayada corresponde al tallo de CD8a; la parte central corresponde al dominio transmembrana; y la parte en negrita corresponde al anclaje intracelular.
ESPACIADORES
El polipéptido de la presente invención tiene la fórmula:
St-R1 -S1-Q-S2-R2 en la que
St es una secuencia de tallo
R1 y R2 son epítopos de unión a rituximab; y
Q es un epítopo de unión a QBEnd10.
En la fórmula anterior, S1 y S2 son secuencias espaciadoras, que pueden ser iguales o diferentes.
Rituximab es una molécula de anticuerpo clásica que tiene dos sitios de unión a antígeno, uno en cada punta de la molécula en forma de Y.
Las secuencias espaciadoras pueden tener una longitud y configuración tales que, cuando el polipéptido se expresa en la superficie celular, la distancia entre R1 y R2 es demasiado larga para que el polipéptido se una a los dos sitios de unión a antígeno de una molécula de Rituximab simultáneamente.
Las secuencias espaciadoras S1 y S2 pueden tener una longitud combinada de al menos aproximadamente 10 aminoácidos.
En el polipéptido expresado, la distancia entre R1 y R2 puede ser mayor de 76.57 A. Por ejemplo, la longitud y configuración de las secuencias espaciadoras pueden ser tales que la distancia entre R1 y R2 sea al menos de 78,
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80 u 85 A. Para realizar este cálculo, puede suponerse que la distancia molecular entre aminoácidos separados en un esqueleto lineal es de aproximadamente 3A por aminoácido.
La secuencia o secuencias enlazadoras pueden ser sustancialmente lineales. Pueden comprender o consistir en restos de serina y glicina. La secuencia o secuencias enlazadoras pueden tener la fórmula general:
S-(G)n-S
en la que S es serina, G es Glicina y n es un número entre 2 y 8. El, o cada, enlazador puede comprender o consistir en la secuencia S-G-G-G-S.
La longitud combinada del epítopo Q y el espaciador o espaciadores (es decir, la longitud de la parte de S1-Q-S2 del péptido puede tener al menos 28 aminoácidos.
SECUENCIA DE RQR8
El polipéptido de la invención puede comprender o consistir en la secuencia de 136 aminoácidos mostrada como SEQ ID. No. 4.
CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSP APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS LVITLYCNHRNRRRVCKCPRPW (SEQ ID No. 4)
El polipéptido también puede comprender un péptido señal en el extremo amino. El péptido señal puede comprender o consistir, por ejemplo, en la secuencia mostrada como SEQ ID No. 18
MGTSLLCWMALCLLGADHADA (SEQ ID No. 18)
Un polipéptido que comprende dicho péptido señal y la secuencia de 136 aminoácidos proporcionada anteriormente, por lo tanto, tendría la siguiente secuencia de 157 aminoácidos:
MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAK PTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRG LDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV (SEQ ID No. 19)
Una vez que se ha expresado el polipéptido por la célula diana, se escinde el péptido señal, dando como resultado el péptido maduro de 136aa.
La proteína CD34 nativa tiene una longitud de 385 aminoácidos, por lo tanto, se requiere 1 kb de la secuencia de ADN para la expresión de CD34 de longitud completa. De esta manera, la construcción RQR8 entera tiene aproximadamente 1/3 del tamaño de la proteína CD34 sola.
Por lo tanto, la construcción RQR8 tiene un tamaño mucho más manejable que el gen marcador de CD34 de longitud completa. Esto tiene la ventaja añadida de comprender un elemento de gen suicida con una sensibilidad lítica al menos igual a la demostrada por CD20 de longitud completa.
El polipéptido de la invención puede comprender o consistir en una variante de la secuencia mostrada como SEQ ID No. 4, que tiene al menos un 70%, un 80% o un 90% de identidad con la secuencia mostrada como SEQ ID No. 4, siempre que conserve la actividad funcional del polipéptido de SEQ ID No. 4. Por ejemplo, la secuencia variante debe (i) unirse a QBEND10; (ii) unirse a Rituximab y (iii) cuando se expresa en la superficie de una célula, debe inducir la destrucción mediada por el complemento de la célula en presencia de Rituximab.
Las comparaciones de homología pueden realizarse a simple vista o con la ayuda de programas de comparación de secuencia disponibles fácilmente, Tales como el paquete Bestfit GCG Wisconsin.
PROTEÍNA DE FUSIÓN
El polipéptido de la invención puede estar en forma de una proteína de fusión, en la que el polipéptido está fusionado a una proteína de interés (POI).
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La proteína de fusión puede comprender un péptido autoescindible entre el polipéptido y la proteína de interés. Dicho péptido autoescindible debe permitir la coexpresión del polipéptido y la POI dentro de la célula diana, seguido de la escisión de manera que el polipéptido y la POI se expresen como proteínas separadas en la superficie celular. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender el péptido 2A de autoescisión de la fiebre aftosa.
PROTEÍNA DE INTERÉS
La proteína de interés es una molécula para la expresión en la superficie de una célula diana. La POI puede ejercer un efecto terapéutico o profiláctico cuando la célula diana es una célula in vivo.
La POI puede ser un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR).
Los receptores de antígenos quiméricos se generan por unión de un dominio de reconocimiento de antígeno (ectodominio) a la parte transmembrana e intracelular de una molécula de señalización (endodominio). El ectodominio procede la mayoría de las veces de cadenas variables de anticuerpo (por ejemplo, un ScFv), pero también puede generarse a partir de dominios variables del receptor de células T u otras moléculas. El endodominio puede comprender la parte intracelular de CD3-Z. El endodominio puede comprender un dominio citoplásmico tripartito CD28-OX40-CD3Z.
La POI puede ser un CAR o TCR con especificidad por un antígeno asociado a tumores, es decir, una proteína que se expresa o sobreexpresa en células cancerosas. Dichas proteínas incluyen ERBB2 (HER-2/neu), que se sobreexpresa en el 15-20% de los pacientes con cáncer de mama y está asociado con una enfermedad más agresiva; CD19, que se sobreexpresa en la mayoría de las malignidades de células B; carboxi-anhidrasa-IX, que se sobreexpresa con frecuencia en el carcinoma de células renales; GD2, que se expresa por células de neuroblastoma; p53; MART-1 (DMF5); gp100:154; NY-ESO-1; y CEA.
SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido o proteína de fusión de la invención.
El ácido nucleico, cuando se expresa por una célula diana, hace que el polipéptido codificado se exprese en la superficie celular de la célula diana. cuando el ácido nucleico codifica tanto el polipéptido como la POI (por ejemplo, como una proteína de fusión), tanto el polipéptido de la invención como la POI se expresarían en la superficie de la célula diana.
La secuencia de ácido nucleico puede ser ARN o ADN, tal como ADNc.
VECTOR
La presente invención también proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención. El vector también puede comprender un transgén de interés, es decir, un gen que codifica una POI.
El vector debe ser capaz de transfectar o transducir una célula diana, de tal manera que exprese el polipéptido de la invención y, opcionalmente, una proteína de interés.
El vector puede ser un vector no viral tal como un plásmido.
El vector puede ser un vector viral, tal como un vector retroviral o lentiviral.
El vector puede comprender un ácido nucleico que codifica el polipéptido y un ácido nucleico que comprende la POI como entidades separadas, o como una sola secuencia de nucleótidos. Si están presentes como una sola secuencia de nucleótidos, pueden comprender una o más secuencias de sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) entre las dos partes codificantes para permitir la traducción de la secuencia cadena abajo.
CÉLULA
La presente invención también proporciona una célula que expresa un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención. la célula puede coexpresar el polipéptido y una POI en la superficie celular.
La presente invención también proporciona una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
La célula puede haberse transducido o transfectado con un vector de acuerdo con la invención.
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La célula puede ser adecuada para la terapia celular adoptiva.
La célula puede ser una célula T, tal como un linfocito T citotóxico (CTL). La célula T puede tener una especificidad existente. Por ejemplo, Puede ser una célula T específica para el virus Epstein-Barr (EBV).
La célula puede derivar de un paciente. Por ejemplo, la célula puede haberse retirado de un paciente y después puede haberse transducido ex vivo con un vector de acuerdo con la presente invención.
Las poblaciones de células T que son adecuadas para TCA incluyen: células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en general, células CD8+ (por ejemplo, PBMC de las que se ha suprimido CD4); PBMC de las que se han suprimido selectivamente las células T reguladoras (Treg); células T de memoria central (Tcm) aisladas; CTL específicas para EBV; y CTL específicas para tres virus.
la presente invención también comprende una población celular que comprende una célula de acuerdo con la presente invención. La población celular puede haberse transducido con un vector de acuerdo con la presente invención. Una proporción de las células de la población celular puede expresar un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención en la superficie celular. Una proporción de las células de la población celular puede coexpresar un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención y una POI en la superficie celular. La población celular puede ser una población celular ex vivo derivada de un paciente.
SELECCIÓN USANDO LA SECUENCIA DEL MARCADOR
En el presente documento se describe un método para medir la transducción con un transgén de interés (que codifica una proteína de interés POI), que comprende la etapa de transducir una población de células con un vector que coexpresa el polipéptido de la invención y la proteína de interés y detectar la expresión del epítopo de unión a QBEnd10 en la superficie de las células, en donde la proporción de células que expresan el polipéptido de la invención corresponde a la proporción de células transducidas con el transgén de interés.
La presente invención proporciona un método para seleccionar células que expresan una POI que comprende las siguientes etapas:
(i) detectar la expresión del epítopo de unión a QBEnd10 en la superficie de las células transfectadas o transducidas ex vivo con un vector de la presente invención que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la POI; y
(ii) seleccionar las células que se identifican como células que expresan el epítopo de unión a QBEnd10.
Las células pueden clasificarse usando el sistema CD34 cliniMACS de Miltenyi. este sistema está bien adaptado para uso en la clasificación de grado clínico en servicios GMP.
Las células que expresan el epítopo de unión a QBEnd10 pueden identificarse y/o clasificarse por métodos conocidos en la técnica tales como FACS.
La presente invención también proporciona un método para preparar una población purificada de células enriquecidas en células que expresan una POI, que comprende la etapa de seleccionar las células que expresan una POI de una población de células usando el método descrito anteriormente.
La presente invención también proporciona una población purificada de células que expresan una POI preparada por dicho método.
En la población purificada de células, al menos el 80%, 85%, 90% o 95% de las células pueden expresar una POI (y un polipéptido de acuerdo con la presente invención).
En el presente documento se describe un método para rastrear células transducidas in vivo, que comprende la etapa de detectar la expresión del polipéptido de la invención en la superficie celular. Las células pueden rastrearse in vivo por métodos conocidos en la técnica tales como formación de imágenes bioluminiscentes. Para estas aplicaciones, el polipéptido de la invención puede modificarse por ingeniería genética para coexpresarse con una proteína detectable, tal como luciferasa.
DELECIÓN USANDO LA SECUENCIA SUICIDA
La presente divulgación también proporciona un método para delecionar células transducidas por un vector de acuerdo con la presente invención, que comprende la etapa de exponer las células al complemento y Rituximab.
Cuando el polipéptido de la invención se expresa en la superficie de una célula, la unión de Rituximab a los epítopos R del polipéptido produce la lisis de la célula.
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Puede unirse más de una molécula de Rituximab por polipéptido expresado en la superficie celular. Cada epítopo R del polipéptido puede unirse a una molécula distinta de Rituximab.
La deleción de células puede tener lugar in vivo, por ejemplo, mediante la administración de Rituximab a un paciente.
La decisión de suprimir las células transferidas puede deberse a los efectos indeseables que se detectan en el paciente que son atribuibles a las células transferidas. Por ejemplo, pueden detectarse niveles de toxicidad inaceptables.
MÉTODO TERAPÉUTICO
La transferencia adoptiva de células T modificadas genéticamente es un enfoque atractivo para generar respuestas inmunitarias deseables, tales como una respuesta inmunitaria anti-tumoral.
En el presente documento se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una célula de acuerdo con la invención al sujeto. El método puede comprender la etapa de administrar una población de células a un sujeto. La población de células puede enriquecerse en células que expresan un transgén de interés usando un método descrito anteriormente.
El método puede implicar las siguientes etapas:
(i) tomar una muestra de células, tal como una muestra de sangre de un paciente,
(ii) extraer las células T,
(iii) transducir o transfectar las células T con un vector de la presente invención que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de marcador/suicida y un transgén de interés,
(iv) expandir las células transducidas ex-vivo
(v) devolver las células al paciente.
Las células transducidas pueden poseer una propiedad terapéutica deseada tal como un mejor direccionamiento y destrucción específica de tumor.
Las células de la presente invención pueden usarse para tratar un cáncer. Como se explica en Rosenburg y Dudley (2009 - como se ha indicado anteriormente), prácticamente todos los tumores son igualmente susceptibles a la lisis usando un enfoque TCA y todos pueden estimular la liberación de citocinas por los linfocitos antitumorales cuando estos se encuentran con un antígeno tumoral.
Las células de la presente invención, por ejemplo, pueden usarse para tratar linfoma, malignidades del linaje B, carcinoma de células renales (RCC) metastásico, melanoma metastásico o neuroblastoma.
Como alternativa, las células de la invención pueden usarse para tratar o prevenir una enfermedad no cancerosa. la enfermedad puede ser una enfermedad infecciosa o una afección asociada con un trasplante.
Las células de la invención pueden usarse para tratar o prevenir la enfermedad linfoproliferativa post-trasplante (PTLD)
La invención se describirá a continuación adicionalmente por medio de ejemplos, que pretenden servir para ayudar a un experto habitual en la materia a poner en práctica la invención y de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Mapeo de epítopos del epítopo QBEnd10 del antígeno CD34
Los presentes inventores pretendieron por primera vez encontrar el epítopo de CD34 que se une a QBEND10, el anticuerpo usado en el sistema de selección de CD34 CliniMACS de Miltenyi. Con este objetivo, generaron una biblioteca retroviral de supuestos epítopos de unión a QBEnd10 del antígeno CD34 nativo.
Al aislar un dominio de unión a QBEnd10, se consiguió una minimización adicional del epítopo de unión a QBEnd10 usando una estrategia de supresión bidireccional (Figura 11).
Se obtuvo una construcción de unión a epítopo mínima final que contenía solo 16 restos de aminoácido y que tenía la secuencia ELPTQGTFSNVSTNVS.
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Ejemplo 2 - Introducción de un espaciador para distanciar el epítopo de CD34 de la superficie celular
Se ensayaron diversas combinaciones de tallo y enlazador para investigar mejoras en la presentación del epítopo. para ensayar la eficacia de unión del gen marcador, se usó un vector bicistrónico que expresaba eGFP como marcador de la transfección satisfactoria.
El tallo usado procedía de CD8alfa. Esta estructura altamente glucosilada actúa como un espaciador eficaz, al elevar el epítopo de la superficie celular. Tiene una longitud relativamente corta: solo de 49 aminoácidos.
Se consideraron tres construcciones: dos construcciones unidas al tallo de CD8, con y sin una secuencia enlazadora flexible, para proyectar el supuesto epítopo lejos de la superficie celular, en comparación con una construcción próxima a la membrana más pequeña. La construcción unida al tallo de CD8 podría conseguir una unión igual de QBEND10 que la de CD34 de longitud completa (Figura 1). Se demostró que las células T transducidas con esta construcción se clasificaban magnéticamente de forma rápida usando perlas QBEnd10 de Miltenyi (Figura 2).
Ejemplo 3 - Inclusión de un epítopo de unión a Rituximab
Los presentes inventores decidieron mapear el epítopo del antígeno CD20 de células B como supuesto gen suicida. Rituximab es extremadamente lítico para células que expresan CD20. Datos cristalográficos recientes han identificado que la interacción de unión a Rituximab está localizada en el bucle extracelular grande. Basándose en estos datos, los presentes inventores generaron un par de construcciones que expresaban versiones de esta estructura de bucle mínima.
En primer lugar coexpresaron diferentes fragmentos del bucle extracelular principal de CD20 que, según se identificó por cristalografía, estaban en el sitio de unión a Rituximab. Estas construcciones no pudieron unirse a Rituximab.
A continuación, probaron con mimétopos de unión a Rituximab lineales y circulares (descritos por Perosa et at (2006) como se ha indicado anteriormente). Los mimétopos son secuencias peptídicas identificadas por presentación en fagos, que demuestran buena unión de un anticuerpo diana. Seleccionaron tanto un mimétopo circular, constreñido por enlaces disulfuro, como un mimétopo lineal para su consideración (Figura 12). La inclusión del mimétopo circular (11 aminoácidos) produjo una excelente unión a Rituximab (Figura 3).
Una vez demostrada la unión eficaz a Rituximab, realizaron ensayos funcionales para evaluar la eficacia funcional de las construcciones de combinación usando ensayos de CDC in vitro. Sin embargo, la destrucción mediada por el complemento fue baja, siendo solo del 65% (datos no mostrados). Se generaron diversas construcciones para intentar solucionar este problema (Figura 13).
Una construcción final que comprendía dos mimétopos circulares de CD20 que flanqueaban un solo epítopo de QBEnd10 en el tallo de CD8 permitieron una unión óptima de QBend10 y Rituximab, así como una destrucción mediada por el complemento altamente eficaz (denominada RQR8, Figuras 4 y 14).
Esta construcción RQR8 solo tiene 136 aminoácidos de longitud. La unión de QBEND10 es similar a la de CD34 de longitud completa. Las células T transducidas con RQR8 pudieron clasificarse de manera eficaz usando CD34 cliniMACS (datos no mostrados). La unión de Rituximab aumentó 3,4 veces con respecto al CD20 nativo. la destrucción mediada por el complemento pudo suprimir >97% de células T transducidas clasificadas.
Ejemplo 4 - Construcción de la versión de IgG2a murina de Rituximab
Rituximab, con sus regiones constantes de IgG1 humana, no es particularmente lítico en ratones. El hibridoma IDEC-2B8 es una fuente de regiones variables de Rituximab, pero es un hibridoma de IgG1 de ratón. Para producir un equivalente murino a Rituximab, fue necesario generar una versión de IgG2a de ratón. Los presentes inventores clonaron las regiones variables de cadena pesada y ligera en fase con regiones constantes kappa / IgG2a de ratón. Después se generó un mAb recombinante (denominado Ritux-mG2a) a partir de células K562 en suspensión. Este se une a RQR8 (figura 8), y es el equivalente funcional a Rituximab en el modelo de ratón en términos de lisis mediada por el complemento y ADCC.
Ejemplo 5 - El uso de RQR8 para aplicaciones de terapia génica de cánceres de células T
Los presentes inventores han generado previamente un receptor de antígeno quimérico anti-GD2 de 3a generación [figura 5 (a) y (b)]. También han optimizado un TCR nativo hA-118 para expresión transgénica [figura 5(c) y (d)]. Los dos se han coexpresado con RQR8.
Se construyeron dos construcciones de ensayo en las que el gen de RQR8 se coexpresaba con (a) un CAR o (b) un TCR nativo (figura 8). El péptido 2A de autoescisión de la fiebre aftosa permitió la coexpresión.
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La eficacia de la coexpresión / escisión de 2A se ensayó en células T donadoras normales por citometría de flujo (como se muestra en la figura 5) y transferencia de Western. La función de las células T transducidas no clasificadas y clasificadas se comparó por ensayo de liberación de cromo, proliferación y matriz de perlas de citocinas en respuesta a las dianas y controles.
También se caracterizó el fenotipo extendido de células T clasificadas y no clasificadas. La pérdida de actividad efectora de poblaciones generales transducidas se midió antes y después del agotamiento con Rituximab / complemento.
Ejemplo 6 - Ensayo in vivo de RQR8 y comparación in vivo con otros genes suicidas
Los presentes inventores han desarrollado un modelo de ratón de GvHD. Los esplenocitos transducidos con RQR8 provocan GvHD después de la administración (figura 6). Para ensayar RQR8 in vivo, ratones trasplantados recibieron esplenocitos transducidos con RQR8-2A-FLuc o Q8-2A-FLuc de control [(a') y (b') figura 10]. Se administró Ritux-mG2a el día 10 cuando la GvHD era evidente por la pérdida de peso a la mitad de los ratones.
Es posible rastrear las células T in vivo por formación de imágenes bioluminiscentes (BLI) con una luciferasa de luciérnaga que se ha optimizado para el uso in vivo (figura 7). En este experimento, se compara la disminución de la señal BLI y el peso durante 7 días. Después de esto, se sacrifican los ratones. La persistencia de células T donantes se mide por citometría de flujo cuantitativa en la sangre, médula ósea y bazo. GvHD se mide por la evaluación histológica del intestino e hígado.
Tal y como se muestra en la Figura 15, existe un claro efecto beneficioso en los ratones que reciben RQR8 como se ilustra por la supervivencia y resolución de GvHD. La médula ósea parece ser el depósito de células donadoras. Los datos ilustrados por esta imagen representan el injerto residual de células transgénicas en los ratones receptores después de la supresión mediada por Rituximab murino. La altura de las barras indica el nivel proporcional de células T injertadas como una proporción del compartimento de células T en el ratón al final del experimento. Claramente, las barras rojas son considerablemente mayores que las barras verdes, lo que demuestra el nivel de injerto de células transgénicas en ausencia de supresión mediada por Rituximab.
Para comparar iCasp9 y HSV-TK con RQR8, se administran esplenocitos transducidos con construcciones (b'), (c') y (d') a ratones trasplantados. En el día 10, se administran respectivamente ritux-mG2a, AP20187 y Ganciclovir. Después se miden la reducción de la señal BLI a lo largo del tiempo y la pérdida de peso por cuantificación de la persistencia de las células T donadoras y la GvHD por histología tras el sacrificio el día 17.
CONCLUSIONES
Los presentes inventores han creado un marcador/gen suicida de 136 aminoácidos para células T. La proteína traducida se expresa de manera estable en la superficie celular después de la transducción retroviral. Se une a QBEND10 con igual afinidad que CD34 de longitud completa. Además, la construcción se une a Rituximab, y el diseño de epítopo dual suscita una destrucción mediada por el complemento de gran efecto. Debido al pequeño tamaño de la construcción, puede coexpresarse fácilmente con transgenes típicos modificados por ingeniería genética de células T, tales como receptores de células T o receptores de antígenos quiméricos y otros, que permiten una fácil detección, selección celular así como supresión de células a la vista de la toxicidad inaceptable observada con los reactivos / agentes farmacéuticos disponibles en el mercado.
Aunque la presente invención se ha descrito en relación con realizaciones preferidas específicas, debe entenderse que la invención según se reivindica no debe considerarse limitada indebidamente a dichas realizaciones específicas. De hecho, deben considerarse dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones diversas modificaciones de los modos descritos para poner en práctica la invención que son evidentes para los expertos en terapia celular, ingeniería genética de células T, biología molecular o campos relacionados.
Claims (14)
- 510152025303540455055REIVINDICACIONES1. Un polipéptido que tiene la fórmula:St-R1 -S1-Q-S2-R2 en la queSt es una secuencia de tallo que, cuando el polipéptido se expresa en la superficie de una célula diana, hace que los epítopos R y Q se proyecten desde la superficie celular;R1 y R2 son epítopos de unión a Rituximab que tiene, cada uno, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID No. 1,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16;S1 y S2 son secuencias espaciadoras, que pueden ser iguales o diferentes; y que tienen una longitud combinada de al menos aproximadamente 10 aminoácidos de tal manera que la distancia entre R1 y R2 es demasiado larga para que el polipéptido se una a los dos sitios de unión de antígeno de Rituximab simultáneamente; y Q es un epítopo de unión a QBEnd10 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ iD No. 2.
- 2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la distancia entre R1 y R2 es mayor de 76,57 A.
- 3. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que comprende la secuencia mostrada como SEQ ID No. 4.
- 4. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación anterior fusionado a una proteína de interés (POl).
- 5. Una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la proteína de fusión de la reivindicación 4.
- 6. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5.
- 7. Una célula que expresa un polipéptido se acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
- 8. Una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5.
- 9. Un método para fabricar una célula de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 que comprende la etapa de transducir o transfectar una célula ex vivo con un vector de acuerdo con la reivindicación 6.
- 10. Un método ex vivo para investigar la eficacia de transducción de un método de terapia génica que comprende la etapa de detectar la expresión del epítopo de unión a QBEnd10 en la superficie de células transfectadas o transducidas ex vivo con un vector de acuerdo con la reivindicación 6.
- 11. Un método para seleccionar células que expresan una POl, que comprende las siguientes etapas:(i) detectar la expresión del epítopo de unión a QBEnd10 en la superficie de células transfectadas o transducidas ex vivo con un vector de acuerdo con la reivindicación 6; y(ii) seleccionar las células que se identifican como células que expresan el epítopo de unión a QBEnd10.
- 12. Un método para preparar una población purificada de células enriquecida en células que expresan una POl, que comprende la etapa de seleccionar células que expresan una POl de una población de células usando un método de acuerdo con la reivindicación 11.
- 13. Una población de células que está enriquecida en células que expresan un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y, por lo tanto, enriquecida en células que expresan una POl.
- 14. Una célula de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 o una población de células de acuerdo con la reivindicación 13 para uso en transferencia celular adoptiva.
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