ES2854675T3

ES2854675T3 - Polipéptidos de transposasa y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2854675T3
Application number: ES16711096T
Authority: ES
Inventors: Laurence Cooper; Natalya Belousova
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2015-03-11
Filing date: 2016-03-10
Publication date: 2021-09-22
Anticipated expiration: 2036-03-10
Also published as: WO2016145146A1; HK1248757A1; DK3268470T3; JP6775515B2; IL254394B; MX2021014712A; PL3268470T3; RU2017134741A3; US20230151344A1; MX2017011679A; AU2016229094A1; ZA201706420B; RU2017134741A; RU2735700C2; IL285286A; US20200216826A1; EP3268470A1; JP2021035363A; EP3268470B1; AU2020202653A1

Abstract

Un polipéptido recombinante que tiene actividad de transposasa que comprende una secuencia al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido comprende una Arg en la posición correspondiente a la posición 14; una Ala en la posición correspondiente a la posición 33; una His en la posición correspondiente a la posición 115; una Asp en la posición correspondiente a la posición 214; una Ala en la posición correspondiente a la posición 215; una Val en la posición correspondiente a la posición 216; un Gln en la posición correspondiente a la posición 217; una His en la posición correspondiente a la posición 243; una Arg en la posición correspondiente a la posición 136; una His en la posición correspondiente a la posición 253 y una Arg en la posición correspondiente a la posición 255.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos de transposasa y usos de los mismos

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a los campos de la medicina, inmunología, biología celular y biología molecular. En determinados aspectos, el campo de la invención se refiere a polipéptidos de transposasas y su uso en ingeniería genética.

2. Descripción de la técnica relacionada

En la era de la genómica funcional, existe la necesidad de medios eficaces para alterar la secuencia codificante en el genoma de las células. Dicha ingeniería del genoma se puede utilizar para producir células con transgenes expresados de forma estable y para la reprogramación celular. Una herramienta adecuada utilizada en la ingeniería del genoma son los sistemas de transposones/transposasas. Los transposones o elementos transponibles incluyen una secuencia de ácido nucleico (corta) con secuencias de repetición terminales cadena arriba y cadena abajo de la misma y codifican enzimas que facilitan la escisión e inserción del ácido nucleico en secuencias de ADN diana. Se han adaptado varios sistemas de transposones/transposasas para inserciones genéticas de secuencias de ADN heterólogas, incluida la Bella Durmiente (SB (Sleeping Beauty)), un elemento de tipo Tcl/mariner de pescado que exhibe actividad de transposición en una diversidad de líneas celulares cultivadas de vertebrados, células madre embrionarias e in vivo (Ivics et al., 1997). Sin embargo, ninguno de estos sistemas ha sido adoptado para la ingeniería de células de mamífero/humanas. Por consiguiente, existe la necesidad de sistemas de transposones/transposasas con un alto nivel de actividad en células y organismos mamíferos. Los documentos WO2010008564 y WO03089618 divulgan sistemas de transposones.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención es como se define en las reivindicaciones.

En una primera realización, se proporciona un polipéptido recombinante que comprende o consiste en una actividad de transposasa mejorada en células de mamífero. En algunos aspectos, un polipéptido de las realizaciones comprende o consiste en una secuencia al menos un 90 % idéntica a la s Eq ID NO: 1 (hSB110) o SEQ ID NO: 3 (hSB81). En determinados aspectos, un polipéptido comprende o consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o una secuencia al menos un 90 % idéntica a la longitud completa de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 y exhibe actividad de transposasa en células de mamífero. En un aspecto adicional, el polipéptido comprende o consiste en una secuencia al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3, exhibe actividad de transposasa en células de mamífero, y comprende una o más de las siguientes características: una Arg en la posición correspondiente a la posición 136 (en hSB110), una His en la posición correspondiente a la posición 253 (en hSB110), una Arg en la posición correspondiente a la posición 255 (en hSB 110) y/o una Thr en la posición correspondiente a la posición 314 (en HSB110). En aspectos adicionales, el polipéptido al menos un 90 % idéntico anterior no comprende la secuencia de una enzima transposasa de origen natural o no comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 (SB11), SEQ ID NO: 6 (SB10) o SEQ ID NO: 7 (SB100x). En algunos aspectos, un polipéptido de las realizaciones comprende o consiste en una secuencia al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 (hSB110) o SEQ ID NO: 3 (hSB81). En algunos aspectos, un polipéptido de las realizaciones comprende o consiste en una secuencia al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 (hSB110) o SEQ ID NO: 3 (hSB81) y exhibe actividad de transposasa en células de mamífero. En algunos aspectos, a polipéptido de las realizaciones comprende o consiste en una secuencia al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 (hSB110) o SEQ ID NO: 3 (hSB81), exhibe actividad de transposasa en células de mamífero, y comprende o consiste en una o más de las siguientes características: una Arg en la posición correspondiente a la posición 136 (en hSB110), una His en la posición correspondiente a la posición 253 (en hSB110), una Arg en la posición correspondiente a la posición 255 (en hSB110) y/o una Thr en la posición correspondiente a la posición 314 (en hSB110). En algunos aspectos, el polipéptido al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico anterior no comprende la secuencia de una enzima transposasa de origen natural o no comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 (SB11), SEQ ID NO: 6 (SB10) o SEQ ID NO: 7 (SB100x). Aún en aspectos adicionales, un polipéptido de transposasa de las realizaciones comprende o consiste además en una secuencia polipeptídica heteróloga fusionada al extremo N-terminal o C-terminal de la secuencia de transposasa. Por ejemplo, la secuencia polipeptídica heteróloga puede comprender o consistir en un indicador, una etiqueta de purificación o un polipéptido de penetración celular (CPP). En aspectos adicionales, la célula de mamífero en la que los polipéptidos de las realizaciones exhiben actividad de transposasa son células humanas. En otros aspectos, las células humanas son células inmunes. En otros aspectos, las células inmunes humanas son linfocitos T. En aspectos adicionales, los linfocitos T son linfocitos T auxiliares (linfocitos T^h), linfocitos T citotóxicos (linfocitos Tc o CTL), linfocitos T de memoria (linfocitos T^cm), linfocitos T efectores (linfocitos T^em), linfocitos T reguladores (linfocitos Treg; también conocidos como linfocitos T supresores), linfocitos T citolíticos naturales (linfocitos NKT), linfocitos T invariantes asociados a la mucosa, linfocitos T alfa-beta (linfocitos Tap) y/o linfocitos T gamma-delta (linfocitos Ty§).

Aún en un aspecto adicional, un polipéptido de las realizaciones comprende o consiste en una secuencia al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 (hSB110) o SEQ ID NO: 3 (hSB81), comprende una o más de las siguientes características: una Arg en la posición correspondiente a la posición 136 (en hSB110), una His en la posición correspondiente a la posición 253 (en hSB110), una Arg en la posición correspondiente a la posición 255 (en hSB110) y/o una Thr en la posición correspondiente a la posición 314 (en hSB110) y comprende además una o más de las siguientes características adicionales: una Arg en la posición correspondiente a la posición 14 (en hSB110), una Ala en la posición correspondiente a la posición 33 (en hSB110), una His en la posición correspondiente a la posición 115 (en hSB110), una Asp en la posición correspondiente a la posición 214 (en hSB110), una Ala en la posición correspondiente a la posición 215 (en hSB110), una Val en la posición correspondiente a la posición 216 (en hSB110), un Gln en la posición correspondiente a la posición 217 (en hSB110), y/o una His en la posición correspondiente a la posición 243 (en hSB110). En algunos aspectos, el polipéptido al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico anterior no comprende la secuencia de una enzima transposasa de origen natural o no comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 (SB11), SEQ ID NO: 6 (SB10) o SEQ ID NO: 7 (SB100x). En algunos aspectos, un polipéptido de las realizaciones comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de las características de secuencia seleccionadas del grupo que consiste en: una Arg en la posición correspondiente a la posición 14 (en hSB110), una Ala en la posición correspondiente a la posición 33 (en hSB110), una His en la posición correspondiente a la posición 115 (en hSB110), una Asp en la posición correspondiente a la posición 214 (en hSB110), una Ala en la posición correspondiente a la posición 215 (en hSB110), una Val en la posición correspondiente a la posición 216 (en hSB110), un Gln en la posición correspondiente a la posición 217 (en hSB110), y una His en la posición correspondiente a la posición 243 (en hSB110). En aspectos adicionales, el polipéptido al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico anterior comprende la secuencia DAVQ en las posiciones correspondientes a las posiciones 214-217 (en hSB110).

En algunos aspectos, el polipéptido de las realizaciones comprende o consiste en una secuencia al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 (hSB110), comprende una Asn en la posición correspondiente a la posición 314 (en hSB110) y comprende una o más de las siguientes características: una Arg en la posición correspondiente a la posición 136 (en hSB110), una His en la posición correspondiente a la posición 253 (en hSB110), y/o una Arg en la posición correspondiente a la posición 255 (en hSB110). En algunos aspectos, el polipéptido al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico anterior no comprende la secuencia de una enzima transposasa de origen natural o no comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 (SB11), SEQ ID NO: 6 (SB10) o SEQ ID ⁿO: 7 (SB100x). En aspectos específicos, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 1.

En otros aspectos, el polipéptido de las realizaciones comprende o consiste en una secuencia al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 3 (hSB81), comprende una Thr en la posición correspondiente a la posición 314 (en hSB110) y comprende una o más de las siguientes características: una Arg en la posición correspondiente a la posición 136 (en hSB110), una His en la posición correspondiente a la posición 253 (en hSB110), y/o una Arg en la posición correspondiente a la posición 255 (en hSB110). En algunos aspectos, el polipéptido al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico anterior no comprende la secuencia de una enzima transposasa de origen natural o no comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 (SB11), SEQ ID NO: 6 (SB10) o SEQ ID NO: 7 (SB100x). En aspectos específicos, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 3.

En una realización adicional, se proporciona una molécula de polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que codifica un polipéptido según las realizaciones. La molécula puede ser un vector de expresión de ADN en algunos aspectos. Por ejemplo, el vector de expresión de ADN puede comprender una secuencia codificante de transposasa unida operativamente a un promotor para la expresión in vitro del polipéptido (por ejemplo, un promotor T7 o SP6) o un promotor para la expresión del polipéptido en células de mamífero. En algunos aspectos, la molécula de polinucleótido puede ser un ARN o un ARNm. En aspectos adicionales, el ARN puede comprender una caperuza 5', un motivo IRES, una UTR 5' (heteróloga), una UTR 3' (heteróloga) y/o una secuencia de poli(A). El ARN puede comprender adicionalmente una secuencia de poli(A) de 20 a 300 nucleótidos en algunos aspectos.

Aún en una realización adicional, la invención proporciona un procedimiento para preparar un polipéptido de transposasa como se ha descrito anteriormente, que comprende transfectar una célula con un polinucleótido que codifica un polipéptido de transposasa y expresar el polipéptido a partir del polinucleótido. Todavía en una realización adicional, la invención proporciona una célula huésped que comprende un polipéptido o una molécula de polinucleótido de las realizaciones. En algunos casos, la célula es una célula de mamífero, tal como una célula humana. En determinados aspectos, la célula es una célula madre o una célula madre pluripotente inducida (iPS). En otros aspectos, la célula es un linfocito citolítico natural (NK), un precursor de un linfocito N^k, un linfocito T, un precursor de un linfocito T, o una célula inmune. En algunos casos, la célula puede comprender un ARN que codifica un polipéptido de transposasa de las realizaciones. Aún en realizaciones adicionales, se proporciona una población de células, comprendiendo dichas células un polipéptido o una molécula de polinucleótido de las realizaciones.

En otra realización, se proporciona un procedimiento para genomanipular una célula que comprende: transfectar la célula con un polipéptido de transposasa como se ha descrito anteriormente o un ácido nucleico que codifica el polipéptido de transposasa y un vector de ADN que comprende una secuencia que codifica un elemento genético seleccionado flanqueado por las repeticiones de transposones, a continuación incubar la célula en condiciones apropiadas para la actividad de transposasa (transitoria o estable), integrando así el elemento genético seleccionado en el genoma de la célula y produciendo una célula manipulada. En determinados aspectos, un vector de ADN que codifica un elemento genético seleccionado flanqueado por repeticiones de transposones comprende además una secuencia que codifica un polipéptido de transposasa de las realizaciones. Por lo tanto, en determinados aspectos, un procedimiento de las realizaciones comprende transfectar una célula con un vector de ADN que comprende una secuencia que codifica un elemento genético seleccionado flanqueado por repeticiones de transposones y una secuencia que codifica una transposasa de las realizaciones, que está bajo el control de una secuencia promotora, a continuación incubar la célula en las condiciones apropiadas para la expresión y actividad de transposasa, integrando así el elemento genético seleccionado en el genoma de la célula y produciendo una célula manipulada. En algunos aspectos, el procedimiento comprende la tercera etapa de aislar o cultivar la célula manipulada. En algunos aspectos, el elemento genético seleccionado es un marcador detectable o seleccionable. En aspectos adicionales, el elemento genético seleccionado puede codificar un anticuerpo, un ácido nucleico inhibidor (por ejemplo, un ARN de interferencia pequeño (ARNip)), un polipéptido terapéutico, un receptor de linfocitos T (TCR), un receptor de antígeno quimérico (CAR), o un potenciador de la función de las células inmunes. En aspectos específicos, el elemento genético seleccionado codifica un CAR o TCR. Todavía en aspectos adicionales, el elemento genético seleccionado puede ser un gen o una porción del mismo que se usa para reemplazar o modificar el gen correspondiente de una célula (por ejemplo, para alterar la secuencia o expresión del gen o para "inactivar" la expresión génica en la célula). En algunos aspectos, la célula transfectada es una célula de mamífero, tal como una célula humana. En algunos casos, la célula puede ser una célula madre o una célula iPS. En determinados aspectos, la célula puede ser una célula del sistema inmunitario o un precursor de la misma, tal como un linfocito NK, un linfocito T, un precursor de un linfocito NK, o un precursor de un linfocito T.

En algunos aspectos, la transfección de células puede comprender el uso de un reactivo de transfección de base química, electroporación de las células u otras tecnologías que proporcionen el suministro de ácido nucleico y/o proteína al citoplasma y el núcleo de las células. Por ejemplo, las células se pueden transfectar usando precipitados de sal (por ejemplo, precipitados de CaPO4), lípidos (por ejemplo, lípidos cargados o no polares), polímeros catiónicos, complejos de PEG y/o complejos de proteínas (por ejemplo, polipéptidos catiónicos). En algunos aspectos, las transfecciones pueden implicar el uso de liposomas, tales como liposomas de fosfolípidos (por ejemplo, liposomas que incorporan un glicerofosfolípido o esfingolípidos). Todavía en aspectos adicionales, las células pueden transducirse con un vector viral (por ejemplo, vector de virus adenoviral, viral adeno-asociado, retroviral (por ejemplo, lentiviral) o vaccinia). En determinados aspectos, un vector viral para su uso según las realizaciones es un vector viral no integrante. Un experto en la técnica reconocerá que, en determinados aspectos, una transposasa de las realizaciones puede administrarse a las células juntas o por separado de un ácido nucleico que codifica repeticiones de transposones. Por ejemplo, en determinados aspectos, se puede administrar una transposasa a las células como un polipéptido recombinante usando un reactivo de transfección de proteínas, y la molécula de ácido nucleico que comprende las repeticiones de transposones se puede administrar usando un sistema de transfección de ácido nucleico o un vector viral. En aspectos adicionales, un ARN que codifica una transposasa se cotransfecta con un ADN que comprende repeticiones de transposones y un elemento genético seleccionado.

En aspectos adicionales, el procedimiento comprende además transfectar una población celular con un polipéptido de transposasa de las realizaciones o un ácido nucleico que codifica el polipéptido de transposasa y un vector de ADN que comprende una secuencia que codifica un elemento genético seleccionado flanqueado por repeticiones de transposones, y a continuación incubar la población en las condiciones apropiadas para la actividad de transposasa, integrando así el elemento genético seleccionado en el genoma de las células y produciendo una población de células manipuladas. En aspectos específicos, el procedimiento comprende transfectar una población de linfocitos T, o precursores de linfocitos T, con un polipéptido de transposasa o un ácido nucleico que codifica el polipéptido de transposasa y un vector de ADN que comprende una secuencia que codifica un CAR flanqueado por repeticiones de transposones e incubar el población en las condiciones apropiadas para la actividad de transposasa, integrando así el cAr en el genoma de las células y produciendo una población de linfocitos T o precursores de linfocitos T manipulados. En aspectos adicionales, el procedimiento comprende transfectar una población de linfocitos T, o precursores de linfocitos T, con un vector de ADN que comprende una secuencia que codifica un CAR flanqueado por repeticiones de transposones y una secuencia que codifica una transposasa de las realizaciones (unida operativamente a un promotor), e incubar la población en las condiciones apropiadas para la actividad de transposasa, integrando así el CAR en el genoma de las células y produciendo una población de linfocitos T o precursores de linfocitos T manipulados. El cultivo de células manipuladas en un medio que mejora selectivamente la proliferación de linfocitos T que expresan CAR puede realizarse adicionalmente en algunos aspectos.

Aún en una realización adicional, se proporciona un procedimiento para proporcionar una respuesta de linfocitos T en un sujeto humano que tiene una enfermedad que comprende obtener primero una población de linfocitos T o precursores de linfocitos T manipulados, según las realizaciones, opcionalmente cultivar las células en un medio que mejore selectivamente la proliferación de linfocitos T que expresan CAR, y a continuación administrar una cantidad eficaz de linfocitos T que expresan CAR al sujeto para proporcionar una respuesta de linfocitos T.

Por lo tanto, en algunos aspectos, un procedimiento de las realizaciones comprende: (a) obtener una muestra de células del sujeto, comprendiendo la muestra linfocitos T o progenitores de linfocitos T; (b) transfectar las células con un ADN que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) flanqueado por transposón y una transposasa de las realizaciones eficaz para integrar el ADN que codifica el CAR en el genoma de las células, para proporcionar una población de células que expresan CAR transgénicas; (c) opcionalmente, cultivar la población de células CAR transgénicas ex vivo en un medio que mejore selectivamente la proliferación de linfocitos T que expresan CAR; y (d) administrar una cantidad eficaz de las células CAR transgénicas al sujeto para proporcionar una respuesta de linfocitos T. Por lo tanto, en algunos aspectos, las células CAR transgénicas se cultivan ex vivo durante menos de 21 días, tal como durante menos de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 días o menos. En determinados aspectos, las células CAR se cultivan ex vivo no más de 3 a 5 días. Todavía en aspectos adicionales, las etapas (a)-(d) del presente procedimiento (es decir, obtener muestras de células para administrar linfocitos T con CAR) se completan en no más de 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, o 5 días. En aspectos adicionales, la muestra de células del sujeto puede ser una muestra de menos de aproximadamente 200 ml de sangre periférica o de cordón umbilical. En algunos aspectos, la muestra puede extraerse por aféresis. En determinados aspectos, la muestra se extrae mediante un procedimiento que no implica aféresis (por ejemplo, por venopunción). Todavía en aspectos adicionales, la muestra de células tiene un volumen inicial de menos de 175 ml, menos de aproximadamente 175 ml, menos de 150 ml, menos de aproximadamente 150 ml, menos de 125 ml, menos de aproximadamente 125 ml, menos de 100 ml, menos de aproximadamente 100 ml, menos de 75 ml, menos de aproximadamente 75 ml, menos de 50 ml, menos de aproximadamente 50 ml, menos de 25 ml, o menos de aproximadamente 25 ml (por ejemplo, la muestra de células tiene un volumen inicial de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200 ml, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 ml, o entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200 ml cuando se obtiene del sujeto).

En algunos aspectos, los procedimientos de las realizaciones se refieren a la transfección de las células con un ADN que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) y una transposasa. Los procedimientos de transfección de células se conocen bien en la técnica, pero en determinados aspectos, se emplean procedimientos de transfección altamente eficientes tales como electroporación. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden introducir en las células usando un aparato de nucleofección. En determinadas realizaciones, la etapa de transfección no implica infectar o transducir las células con virus, lo que puede causar genotoxicidad y/o conducir a una respuesta inmunitaria contra células que contienen secuencias virales en un sujeto tratado.

Otros aspectos de las realizaciones se refieren a la transfección de células con un vector de expresión que codifica un CAR. Se conoce en la técnica una amplia gama de construcciones CAR y vectores de expresión para las mismas. Por ejemplo, en algunos aspectos, el vector de expresión CAR es un vector de expresión de ADN tal como un plásmido, un vector de expresión lineal o un episoma. En algunos aspectos, el vector comprende secuencias adicionales, tales como la secuencia que facilita la expresión del CAR, tal como un promotor, potenciador, señal de poli-A y/o uno o más intrones. En determinados aspectos, la secuencia codificante de CAR está flanqueada por secuencias de transposones, de modo que la presencia de una transposasa permite que la secuencia codificante se integre en el genoma de la célula transfectada.

Como se ha detallado anteriormente, en determinados aspectos, las células se transfectan adicionalmente con una transposasa de las realizaciones que facilita la integración de una secuencia codificante de CAR en el genoma de las células transfectadas. En algunos aspectos, la transposasa se proporciona como vector de expresión de ADN. En determinados aspectos, la transposasa se proporciona como un a Rn expresable o una proteína de manera que la expresión a largo plazo de la transposasa no se produce en las células transgénicas. Por ejemplo, en algunos aspectos, la transposasa se proporciona codificada por un ARNm (por ejemplo, un ARNm que comprende una caperuza y una cola de poli-A).

Todavía en aspectos adicionales, una célula CAR transgénica de las realizaciones comprende además un vector de expresión para la expresión de una citocina unida a membrana que estimula la proliferación y/o supervivencia de los linfocitos T. En particular, las células CAR que comprenden dichas citocinas pueden proliferar y/o perdurar con poco o ningún cultivo ex vivo con células de activación y propagación (AaPC) o células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC) debido a la simulación proporcionada por la expresión de citocinas. Asimismo, dichas células CAR pueden proliferar in vivo incluso cuando no están presentes grandes cantidades de antígeno reconocido por el CAR (por ejemplo, como en el caso de un paciente con cáncer en remisión o un paciente con enfermedad residual mínima). En algunos aspectos, las células CAR comprenden un vector de expresión de ADN o ARN para la expresión de una citocina Cy y elementos (por ejemplo, un dominio transmembrana) para proporcionar la expresión superficial de la citocina. Por ejemplo, las células CAR pueden comprender versiones unidas a membrana de IL-7, IL-15 o IL-21. En algunos aspectos, la citocina se une a la membrana mediante la fusión de la secuencia codificante de citocinas con el receptor de la citocina. Por ejemplo, una célula puede comprender un vector para la expresión de una proteína de fusión IL-15-IL-15Ra. Todavía en aspectos adicionales, un vector que codifica una citocina Cy unida a membrana es un vector de expresión de ADN, tal como un vector integrado en el genoma de las células CAR o un vector extracromosómico (por ejemplo, un vector episómico). Todavía en aspectos adicionales, la expresión de la citocina Cy unida a membrana está bajo el control de un promotor inducible (por ejemplo, un promotor inducible por fármacos) de modo que la expresión de la citocina en las células CAR (y por lo tanto la proliferación de las células CAR) puede controlarse induciendo o suprimiendo la actividad promotora.

Los aspectos de las realizaciones se refieren a la obtención de una muestra de un paciente que comprende linfocitos NK, linfocitos NKT, linfocitos T o células progenitoras de linfocitos T. Por ejemplo, en algunos casos, la muestra es una muestra de sangre de cordón umbilical, una muestra de sangre periférica (por ejemplo, una fracción de células mononucleares) o una muestra del sujeto que comprende células madre pluripotentes. En algunos aspectos, se puede cultivar una muestra del sujeto para generar células madre pluripotentes inducidas (iPS) y estas células se pueden utilizar para producir linfocitos NK, linfocitos NKT o linfocitos T. Las muestras de células se pueden cultivar directamente del sujeto o se pueden crioconservar antes de su uso. En algunos aspectos, obtener una muestra celular comprende extraer una muestra celular. En otros aspectos, la muestra es obtenida por un tercero. Todavía en aspectos adicionales, una muestra de un sujeto puede tratarse para purificar o enriquecer los linfocitos T o los progenitores de linfocitos T en la muestra. Por ejemplo, la muestra puede someterse a purificación en gradiente, selección de cultivo celular y/o clasificación celular (por ejemplo, a través de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)).

En algunos aspectos, un procedimiento de las realizaciones comprende además el uso de células presentadoras de antígeno (por ejemplo, para la expansión de células manipuladas). Por ejemplo, las células presentadoras de antígeno pueden ser células dendríticas, células de activación y propagación (AaPC), o células presentadoras de antígeno artificiales inactivadas (por ejemplo, irradiadas) (aAPC). Los procedimientos para producir dichas células presentadoras de antígeno se conocen en la técnica y se detallan adicionalmente en esta invención. Por lo tanto, en algunos aspectos, las células CAR transgénicas se cultivan conjuntamente con células presentadoras de antígeno (por ejemplo, aAPC inactivadas) ex vivo durante un periodo de tiempo limitado para expandir la población de células CAR. La etapa de cocultivo de células CAR se puede realizar en un medio que comprende, por ejemplo, interleucina-21 (IL-21) y/o interleucina-2 (IL-2). En algunos aspectos, el cocultivo se realiza en una relación de células CAR con respecto a células presentadoras de antígeno de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10; de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:5; o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:3. Por ejemplo, el cocultivo de células CAR y células presentadoras de antígeno puede tener una relación de aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2 o aproximadamente 1:3.

En algunos aspectos, las células para el cultivo de células CAR tales como las AaPC o las aAPC se manipulan para expresar polipéptidos específicos para potenciar el crecimiento de las células CAR. Por ejemplo, las células pueden comprender (i) un antígeno dirigido por el CAR (es decir, que se expresa en las células CAR transgénicas); (ii) CD64; (ii) CD86; (iii) CD137L; y/o (v) IL-15 unida a membrana, expresada en la superficie de las aAPC. En algunos aspectos, las AaPC o aAPC comprenden un anticuerpo de unión a CAR o un fragmento del mismo expresado en la superficie de las AaPC o aAPC. Preferentemente, las AaPC o las aAPC para su uso en los presentes procedimientos se prueban y se confirma que están libres de material infeccioso y/o se prueban y se confirma que están inactivadas y no proliferan.

Aunque la expansión en AaPC o aAPC puede aumentar el número o la concentración de células CAR en un cultivo, este procedimiento es laborioso y costoso. Además, en algunos aspectos, un sujeto que necesite terapia debe volver a infundirse con células CAR transgénicas en el menor tiempo posible. Por lo tanto, en algunos aspectos, el cultivo ex vivo de las células CAR transgénicas no dura más de 14 días, no más de 7 días o no más de 3 días. Por ejemplo, el cultivo ex vivo (por ejemplo, cultivo en presencia de AaPC o aAPC) se puede realizar para menos de una población que duplique las células CAR transgénicas. En otros aspectos más, las células transgénicas no se cultivan ex vivo en presencia de AaPC o aAPC.

Todavía en aspectos adicionales, un procedimiento de las realizaciones comprende una etapa para enriquecer la población celular para linfocitos T que expresan CAR después de la transfección de las células o después de la expansión ex vivo de las células. Por ejemplo, la etapa de enriquecimiento puede comprender la clasificación de las células (por ejemplo, mediante FACS), por ejemplo, utilizando un antígeno unido por el CAR o un anticuerpo de unión a CAR. Todavía en aspectos adicionales, la etapa de enriquecimiento comprende el agotamiento de las células diferentes de linfocitos T o el agotamiento de las células que carecen de expresión de CAR. Por ejemplo, las células CD56+ pueden agotarse de una población de cultivo. Aún en aspectos adicionales, una muestra de células CAR se conserva (o se mantiene en cultivo) cuando las células se administran al sujeto. Por ejemplo, una muestra puede crioconservarse para su posterior expansión o análisis.

En determinados aspectos, las células CAR transgénicas se inactivan para la expresión de un receptor de linfocitos T endógenos y/o HLA endógeno. Por ejemplo, los linfocitos T pueden manipularse para eliminar la expresión del receptor de linfocitos T (TCR) alfa/beta endógeno. En realizaciones específicas, los linfocitos T con CAR+ se modifican genéticamente para eliminar la expresión de TCR. En algunos aspectos, hay una alteración del receptor de linfocitos T a/p en los linfocitos T que expresan CAR utilizando nucleasas con dedos de cinc (ZFN). En determinados aspectos, la cadena ap del receptor de linfocitos T en los linfocitos T que expresan CAR se inactiva, por ejemplo, mediante el uso de nucleasas con dedos de cinc.

Como se detalla adicionalmente en esta invención, las células CAR de las realizaciones se pueden usar para tratar una amplia gama de enfermedades y afecciones. Esencialmente, cualquier enfermedad que implique la expresión específica o mejorada de un antígeno particular puede tratarse dirigiendo las células CAR al antígeno. Por ejemplo, las enfermedades autoinmunitarias, las infecciones y los cánceres pueden tratarse con procedimientos y/o composiciones de la invención. Incluyen cánceres, tales como cánceres primarios, metastásicos, recurrentes, sensibles a la terapia, refractarios a la terapia (por ejemplo, cáncer quimio-refractario). El cáncer puede ser de sangre, pulmón, cerebro, colon, próstata, mama, hígado, riñón, estómago, cuello del útero, ovario, testículos, glándula pituitaria, esófago, bazo, piel, hueso, etc. (por ejemplo, linfomas de linfocitos B o melanomas). En el caso del tratamiento del cáncer, las células CAR típicamente se dirigen a un antígeno de células cancerosas (también conocido como antígeno asociado a tumores (TAA)).

En aspectos adicionales, las células CAR transgénicas de las realizaciones pueden usarse para tratar sujetos que tienen una enfermedad residual mínima (por ejemplo, un sujeto que tiene cantidades muy bajas de antígeno dirigido a CAR presente), tales como pacientes con cáncer que están en remisión aparente. Usando nuevas técnicas de diagnóstico altamente sensibles, los antígenos asociados al cáncer (o células cancerosas) pueden detectarse en pacientes que no exhiben síntomas de cáncer evidentes. Dichos pacientes pueden tratarse mediante los presentes procedimientos para eliminar la enfermedad residual mediante el uso de células CAR dirigidas a antígenos. En determinadas realizaciones, las células CAR transgénicas para el direccionamiento de la enfermedad residual comprenden además la expresión de una citocina proliferativa unida a membrana, ya que estas células conservarán la capacidad de expandirse in vivo a pesar de la baja cantidad de antígeno diana.

Los procedimientos de las realizaciones se pueden utilizar para elaborar (por ejemplo, para ensayos clínicos) linfocitos T con CAR+ con especificidad de unión para diversos antígenos tumorales (por ejemplo, CD19, ROR1, CD56, EGFR, CD33, CD123, c-met, GD2). Los linfocitos T con CAR+ generados con esta tecnología se pueden utilizar para tratar pacientes con leucemias (por ejemplo, AML, ALL, CML), infecciones y/o tumores sólidos. Por ejemplo, los procedimientos de las realizaciones pueden usarse para tratar enfermedades proliferativas celulares, infecciones fúngicas, víricas, bacterianas o parasitarias. Los patógenos que pueden dirigirse incluyen, sin limitación, Plasmodium, trypanosome, Aspergillus, Candida, HSV, RSV, EBV, CMV, virus JC, virus BK, o patógenos de ébola. Otros ejemplos de antígenos que pueden ser dirigidos por células CAR de las realizaciones incluyen, sin limitación, CD19, ^cD20, antígeno carcinoembrionario, alfafetoproteína, CA-125, 5T4, MUC-1, antígeno tumoral epitelial, antígeno asociado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de unión a folato, glucoproteína de la envoltura del VIH-1 gp120, glucoproteína de la envoltura del VIH-1 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, meotelina, GD3, HERV-K, IL-11Ralfa, cadena kappa, cadena lambda, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII o VEGFR2. En determinados aspectos, el procedimiento de las realizaciones se refiere al direccionamiento de células que expresan CD19 o HERV-K. Por ejemplo, una célula CAR dirigida a HERV-K puede comprender un CAR que incluye la secuencia scFv del anticuerpo monoclonal 6H5. Todavía en aspectos adicionales, un CAR de las realizaciones puede conjugarse o fusionarse con una citocina, tal como IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 o una combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos para tratar a un individuo con una afección médica que comprende la etapa de proporcionar una cantidad eficaz de células de la población de células descrita en esta invención, incluyendo más de una vez en algunos aspectos, tal como al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más días de diferencia. En aspectos específicos, el cáncer es cáncer de vejiga, sangre, hueso, médula ósea, cerebro, mama, colon, esófago, gastrointestinal, encía, cabeza, riñón, hígado, pulmón, nasofaringe, cuello, ovario, próstata, piel, estómago, testículo, lengua o útero. En determinados aspectos, el cáncer es un linfoma, leucemia, linfoma no Hodgkin, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica, leucemia linfocítica crónica o enfermedades autoinmunitarias asociadas a linfocitos B.

Como se usa en esta invención en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, "un" o "una" pueden significar uno o más. Como se usa en esta invención en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, cuando se usan junto con la palabra "que comprende", las palabras "un" o "una" pueden significar uno o más de uno. Como se usa en esta invención, en la memoria descriptiva y la reivindicación, "otro" o "adicional" puede significar al menos un segundo o más.

Como se usa en esta invención en la especificación y las reivindicaciones, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente del error para el dispositivo, empleándose el procedimiento para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien indican determinadas realizaciones de la invención, se dan únicamente a modo de ilustración, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en esta invención.

Figura 1: Una estrategia ejemplar para la manipulación de células basada en transposasas. En este ejemplo, se producen linfocitos T manipulados que expresan un CAR. Los linfocitos T se cotransfectan con una construcción de ADN de transposón que codifica un CAR flanqueado por repeticiones de transposones junto con un ARNm que codifica la transposasa. En este caso, se utiliza un sistema de electroporación 4D-NUCLEOFECTOR™ (Lonza Group Ltd., Suiza) para la transfección. Una vez introducida en las células, la transposasa se expresa de forma transitoria y media la integración de la construcción CAR en el ADN genómico. El ARNm que codifica la transposasa se degrada dentro de las células, lo que garantiza que no exista una expresión a largo plazo de transposasa en las células.

Figura 2: Los histogramas muestran datos de citometría de flujo de linfocitos T humanos transfectados con CAR como se describe en la figura 1. Los resultados se comparan entre dos transposasas recombinantes de las realizaciones, hSB110 y hSB81, frente a SB100x. Los paneles superiores muestran el número de células positivas para CAR (eje y) frente a células que se han vuelto inviables, según lo evaluado mediante tinción con 7AAD (7-Aminoactinomicina D) (eje x), 8 días después de la transfección. Los paneles inferiores muestran el número de células positivas para la expresión de CAR (eje y) y que expresan CD3 (eje x), 15 días después de la transfección. Los resultados de los estudios muestran que las transposasas recombinantes de las realizaciones son significativamente más eficientes en la manipulación de células que SB100x. El día 8 después de la transfección, más del 22 % de las células electroporadas con ARNm que codifican hSB110 y hSB81 expresan CAR en comparación con sólo el 15 % de las células resultantes del uso de SB100x. Asimismo, el día 15, más del 80 % de la población celular sometida a electroporación con hSB110 y hSB81 coexpresó CAR y CD3 en comparación con solo el 73,4 % de las células resultantes del uso de SB100x.

DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

1. Ingeniería genética de las células

La ingeniería genética de las células ha surgido como una técnica potente para proporcionar una expresión estable de genes deseados en una amplia gama de células. Recientemente, dicha tecnología incluso se ha aplicado a células utilizadas para intervenciones terapéuticas en una variedad de enfermedades. Por ejemplo, los linfocitos T genomanipulados que expresan receptores dirigidos a un antígeno asociado a una enfermedad se encuentran actualmente en ensayos clínicos como terapia contra el cáncer. Los sistemas de transposasa son un sistema deseable para su uso en ingeniería, especialmente en el caso de células utilizadas como agentes terapéuticos, ya que no introducen elementos genéticos heterólogos que se mantengan en las células, una característica común de los sistemas de ingeniería basados en virus. Sin embargo, se necesita una alta eficiencia para proporcionar una cantidad suficiente de linfocitos T manipulados que se requieren para la intervención terapéutica.

Los estudios de esta invención demuestran nuevas enzimas transposasas recombinantes, denominadas hSB110 y hSB81, que exhiben una eficiencia significativamente mejorada en la ingeniería de células humanas. Por ejemplo, cuando se usaron para la integración de construcciones de expresión de CAR en linfocitos T humanos primarios, las nuevas transposasas pudieron producir poblaciones de células donde más del 20 % de las células exhibieron expresión de CAR el día 8 después de la transfección (figura 2). Además, el día 15, más del 80 % de las células de la población transfectada fueron positivas para la expresión de CAR (figura 2). Esta ingeniería genética de alta eficiencia de células humanas representa una mejora significativa con respecto a los sistemas de ingeniería basados en transposasas anteriores.

Las secuencias codificantes de transposasa de las realizaciones pueden emplearse para la ingeniería genética de alta eficacia de células de mamífero. Por ejemplo, las transposasas pueden usarse para la producción rápida de poblaciones de linfocitos T que expresan CAR. En una realización, el ARNm que codifica la transposasa se cotransfecta en linfocitos T (o precursores de linfocitos T) junto con un vector de ADN que codifica el casete de expresión de CAR deseado, flanqueado por repeticiones de transposones. A continuación, los linfocitos T que expresan CAR pueden purificarse y/o expandirse selectivamente. En el caso de los linfocitos T utilizados para terapia, es deseable que se necesite la menor expansión posible para reducir el tiempo y el coste de la preparación de las células. Cabe destacar que las transposasas proporcionadas en esta invención mejoran significativamente tal procedimiento de ingeniería aumentando la proporción de células que exhiben una expresión estable del CAR y que, por lo tanto, están disponibles para una expansión adicional.

II. Polipéptidos de transposasa y secuencias codificantes

Como se describe en el resumen anterior, determinados aspectos de las realizaciones se refieren a polipéptidos de transposasa recombinantes y ácidos nucleicos que codifican los mismos. En determinados aspectos, una transposasa para su uso según las realizaciones es un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. En determinados aspectos, las realizaciones de transposasa pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a las secuencias de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, los polipéptidos de transposasa de las realizaciones pueden modificarse adicionalmente mediante una o más sustituciones de aminoácidos mientras se mantiene su actividad enzimática. En algunos casos, una posición de aminoácido se puede sustituir por un aminoácido en una posición correspondiente de una secuencia de transposasa diferente. Por ejemplo, la secuencia de transposasas adicionales se proporciona en las Patentes de EE.UU. N.° 6.489.458; 7.148.203; 8.227.432; la Pub. de Patente de EE.UU. N.° 2011/0117072; Mates et al., 2009 y en Ivics et al., 1997.

En algunos aspectos, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones donde la sustitución es por un aminoácido que tiene una hidrofilicidad similar. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. Por lo tanto, dicha sustitución conservadora puede realizarse en una transposasa y probablemente solo tendrá efectos menores sobre su actividad. Como se detalla en la patente de EE.UU. 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (0,5); histidina -0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Estos valores pueden usarse como guía y, por lo tanto, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, los que están dentro de ±1 y los que están dentro de ±0,5 comprenden las realizaciones contempladas. Por lo tanto, cualquiera de los polipéptidos de transposasa descritos en esta invención puede modificarse mediante la sustitución de un aminoácido por un aminoácido diferente, pero homólogo, con un valor de hidrofilicidad similar. Los aminoácidos con hidrofilicidades dentro de /-1,0, o /-0,5 puntos se consideran homólogos.

Todavía en aspectos adicionales, un polipéptido de transposasa de las realizaciones se fusiona con una secuencia polipeptídica heteróloga, tal como una etiqueta de purificación (por ejemplo, una etiqueta T7, poli-His o GST), un indicador o un CPP. Por ejemplo, el polipéptido se puede fusionar (o conjugar) a un indicador, tal como un agente de imagen. Se entenderá que en determinados casos, una proteína de fusión puede comprender aminoácidos adicionales posicionados entre la transposasa y un polipéptido heterólogo. En general, estas secuencias se denominan de forma intercambiable "secuencias enlazadoras" o "regiones enlazadoras". Un experto en la técnica reconocerá que las regiones enlazadoras pueden tener una o más aminoácidos de longitud y, a menudo, comprenden uno o más residuos de glicina que confieren flexibilidad al enlazador. Dichas secuencias enlazadoras pueden repetirse 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más veces o combinarse con uno o más enlazadores diferentes para formar una matriz de secuencias enlazadoras. Por ejemplo, en algunas aplicaciones, una región enlazadora puede comprender un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, para la eliminación de una etiqueta de purificación o CPP).

Como se usa en esta invención, los términos CPP y péptido de translocación de membrana (MTP) se usan indistintamente para referirse a secuencias peptídicas que mejoran la capacidad de un polipéptido para internalizarse por una célula. Los ejemplos de CPP para su uso según las realizaciones incluyen, sin limitación, segmentos peptídicos derivados de Tat del VIH, VP22 del virus del herpes, el producto génico homeobox de Drosophila Antennapedia, protegrina I, el T1 CPP, T2 CPP o INF7 CPP (véase, por ejemplo, la Pub. de Patente de EE.UU. N.° 20140140976).

III. Ingeniería celular

Los aspectos de las realizaciones se refieren a la ingeniería genética de células de mamífero usando transposasas de las realizaciones. Generalmente, dichos procedimientos implicarán introducir en las células (i) un primer vector que codifica la transposasa (o un polipéptido de transposasa) y (ii) un segundo vector que codifica un elemento genético deseado que está flanqueado por repeticiones de transposones. Cualquier tipo de célula de mamífero puede genomanipularse mediante tal procedimiento. Sin embargo, en determinados aspectos, la célula (población celular) es una célula madre, una célula iPS, una célula inmune o un precursor de estas células. Los procedimientos descritos a continuación abordan el ejemplo específico de ingeniería de linfocitos T (u otras células inmunes) para la expresión de CAR. Sin embargo, un experto en la técnica reconocerá que las metodologías podrían aplicarse igualmente a cualquier tipo de célula o construcción de ingeniería dados.

Por lo tanto, en determinadas realizaciones se proporcionan procedimientos para elaborar y/o expandir los linfocitos T redirigidos específicos de antígeno que comprenden transfectar linfocitos T con un vector de expresión que contiene una construcción de ADN que codifica un CAR. Opcionalmente, dichas células se estimulan con células positivas al antígeno, antígeno recombinante o un anticuerpo contra el receptor para hacer que las células proliferen.

En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para transfectar de manera estable y redirigir linfocitos T. Tal transfección según las realizaciones puede realizarse mediante cualquiera de las diversas técnicas de transfección que son bien conocidas en la técnica. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos se pueden introducir en las células usando vectores virales o partículas virales. De hecho, la mayoría de los investigadores han utilizado vectores virales para transportar genes heterólogos a los linfocitos T. Sin embargo, en algunos aspectos, la transfección de las realizaciones no implica el uso de un vector viral. Por ejemplo, la transfección puede ser por electroporación, uso de lípidos cargados o no, polímeros o polipéptidos catiónicos, precipitación de sal u otra transferencia de ácido nucleico no viral (tal como, pero sin limitación, sonoporación). En determinados aspectos, la transfección utiliza ADN desnudo (o ARN o proteína, en el caso de una transposasa). Mediante el uso de ADN desnudo, se puede reducir el tiempo necesario para producir linfocitos T redirigidos. "ADN desnudo" significa que el ADN que codifica un CAR está contenido en un casete de expresión o vector en la orientación adecuada para la expresión. Un procedimiento de electroporación de las realizaciones produce transfectantes estables que expresan y transportan CAR en sus superficies.

En algunos aspectos, un CAR de las realizaciones puede definirse además como un "TCR quimérico" que se refiere a un receptor que se expresa por los linfocitos T y que comprende los dominios de señalización intracelular, transmembrana y extracelular, donde el dominio extracelular es capaz de unirse específicamente de una manera sin restricciones de MHC a un antígeno que normalmente no está unido por un receptor de linfocitos T de esa manera. La estimulación de los linfocitos T por el antígeno en condiciones adecuadas da como resultado la proliferación (expansión) de las células y/o la producción de IL-2. El procedimiento es aplicable a la transfección con TCR quiméricos que son específicos para cualquier antígeno diana dado, tal como los TCR quiméricos que son específicos para HER2/Neu (Stancovski et al., 1993), ERBB2 (Moritz et al., 1994), proteína de unión a folato (Hwu et al., 1995), carcinoma de células renales (Weitjens et al., 1996), y glucoproteínas de la envoltura del VIH-1 gp120 y gp41 (Roberts et al., 1994). Otros antígenos diana de la superficie celular incluyen, pero sin limitación, CD20, antígeno carcinoembrionario, mesotelina, ROR1, c-Met, C^d56, GD2, GD3, alfafetoproteína, CD23, CD30, CD123, IL-11 Ralfa, cadena kappa, cadena lambda, CD70, CA-125, MUC-1, EGFR y variantes, antígeno tumoral epitelial, etc.

En determinados aspectos, los linfocitos T para su uso según las realizaciones son linfocitos T humanas primarias, tales como linfocitos T derivadas de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), PBMC recogidas después de la estimulación con G-CSF, médula ósea o sangre de cordón umbilical. Las condiciones incluyen el uso de ARNm y ADN y electroporación. Después de la transfección, las células se pueden infundir inmediatamente o se pueden almacenar. En determinados aspectos, después de la transfección, las células pueden propagarse durante días, semanas o meses ex vivo como una población en masa en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 días o más después de la transferencia de genes a las células. En un aspecto adicional, después de la transfección, los transfectantes se clonan y un clon que demuestra la presencia de un solo casete de expresión integrado o mantenido episómicamente o plásmido, y la expresión del receptor quimérico se expande ex vivo. El clon seleccionado para la expansión demuestra la capacidad de reconocer específicamente y lisar células diana que expresan antígenos. Los linfocitos T recombinantes pueden expandirse mediante estimulación con IL-2 u otras citocinas (por ejemplo, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 y otras). Los linfocitos T recombinantes pueden expandirse mediante estimulación con células presentadoras de antígenos artificiales. Los linfocitos T recombinantes pueden expandirse en células presentadoras de antígenos artificiales o con un anticuerpo, tal como OKT3, que reticula CD3 en la superficie de los linfocitos T. Los subconjuntos de linfocitos T recombinantes se pueden eliminar en células presentadoras de antígenos artificiales o con un anticuerpo, tal como alemtuzumab, que se une a CD52 en la superficie de los linfocitos T. En un aspecto adicional, las células modificadas genéticamente se pueden crioconservar.

La propagación (supervivencia) de los linfocitos T después de la infusión puede evaluarse mediante: (i) q-PCR y/o PCR digital (por ejemplo, PCR Droplet Digital™ (Bio-Rad, Hercules, California) usando cebadores específicos para el transposón y/o CAR; (ii) citometría de flujo usando un anticuerpo específico para el CAR; y/o (iii) citometría de flujo usando TAA soluble.

En determinadas realizaciones de la invención, las células CAR se administran a un individuo que lo necesite, tal como un individuo que tiene cáncer o una infección. A continuación, las células mejoran el sistema inmunitario del individuo para atacar a las respectivas células cancerosas o patógenas. En algunos casos, el individuo recibe una o más dosis de linfocitos T con CAR específicos de antígeno. En los casos donde al individuo se le proporcionen dos o más dosis de linfocitos T con CAR específicos de antígeno, la duración entre las administraciones debería ser suficiente para permitir el tiempo de propagación en el individuo, y en realizaciones específicas la duración entre dosis es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días.

Una fuente de linfocitos T alogénicos o autólogos que se modifican para incluir ambos un receptor de antígeno quimérico (y, en algunos casos, que carecen de TCR funcional) puede ser de cualquier tipo, pero en realizaciones específicas las células se obtienen de un banco de sangre de cordón umbilical, sangre periférica, células madre embrionarias humanas o células madre pluripotentes inducidas, por ejemplo. Las dosis adecuadas para un efecto terapéutico serían al menos 105 o entre aproximadamente 105 y aproximadamente 101° células por dosis, por ejemplo, preferentemente en una serie de ciclos de dosificación. Un régimen de dosificación ejemplar consiste en cuatro ciclos de dosificación de una semana de dosis crecientes, comenzando al menos en aproximadamente 105 células el Día 0, por ejemplo, aumentando gradualmente hasta una dosis objetivo de aproximadamente 101° células dentro de varias semanas de iniciar una un esquema de escalada de dosis intrapaciente. Los modos de administración adecuados incluyen inyección intravenosa, subcutánea, intracavitaria (por ejemplo, mediante un dispositivo de acceso a depósito), intraperitoneal y directa en una masa tumoral.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede usarse en solitario o en combinación con otros agentes bien establecidos útiles para tratar el cáncer. Ya sea que se administre en solitario o en combinación con otros agentes, la composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar a través de diversas rutas y en diversos sitios en el cuerpo de un mamífero, particularmente en un ser humano, para lograr un efecto particular. Un experto en la técnica reconocerá que, aunque se puede usar más de una vía para la administración, una vía particular puede proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía. Por ejemplo, puede usarse ventajosamente la

administración intradérmica sobre la inhalación para el tratamiento del melanoma. La administración local o sistémica

se puede lograr mediante la administración que comprende la aplicación o instilación de la formulación en las

cavidades corporales, la inhalación o insuflación de un aerosol, o mediante la introducción parenteral, que comprende

la administración intramuscular, intravenosa, intraporta, intrahepática, peritoneal, subcutánea o intradérmica.

Se puede proporcionar una composición de las realizaciones en forma de dosificación unitaria donde cada unidad de

dosificación, por ejemplo, una inyección, contiene una cantidad predeterminada de la composición, en solitario o en

combinación apropiada con otros agentes activos. El término forma de dosificación unitaria como se usa en esta

invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y

animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la composición de la presente invención, en

solitario o en combinación con otros agentes activos, calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto

deseado, en asociación con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable, cuando sea apropiado.

Las especificaciones para las formas de dosificación unitaria de la presente invención dependen de la

farmacodinámica particular asociada con la composición farmacéutica en el sujeto particular.

De forma deseable, una cantidad eficaz o un número suficiente de linfocitos T transducidos aislados está presente en

la composición y se introduce en el sujeto de manera que se establezcan respuestas antitumorales específicas a largo

plazo para reducir el tamaño de un tumor o eliminar el crecimiento o rebrote tumoral que de otro modo se produciría

en ausencia de dicho tratamiento. De forma deseable, la cantidad de linfocitos T transducidos reintroducidos en el

sujeto causa aproximadamente o al menos aproximadamente el 10 %, aproximadamente o al menos

aproximadamente el 20 %, aproximadamente o al menos aproximadamente el 30 %, aproximadamente o al me aproximadamente el 40 %, aproximadamente o al menos aproximadamente el 50

imadamente o al me aproximadamente el 60 %, aproximadamente o al menos aproximadamente el 70 %, aproximadamente o al me aproximadamente el 80 %, aproximadamente o al menos aproximadamente el 90 %, aproximadamente o al menos

aproximadamente el 95 %, aproximadamente o al menos aproximadamente el 98 %, o aproximadamente o el 100 %

de la disminución del tamaño tumoral en comparación con el tamaño original o inicial (por ejemplo, "día de terapia 0")

del tumor.

Por consiguiente, la cantidad de linfocitos T transducidos administrados debe tener en cuenta la vía de administración

y debe ser tal que se introduzca un número suficiente de linfocitos T transducidos para lograr la respuesta terapéutica

deseada. Además, las cantidades de cada agente activo incluidas en las composiciones descritas en esta invención

(por ejemplo, la cantidad por cada célula a contactar o la cantidad por determinado peso corporal) pueden variar en

diferentes aplicaciones. En general, de forma deseable, la concentración de linfocitos T transducidos debería ser

suficiente para proporcionar en el sujeto que está siendo tratado al menos de aproximadamente 1 x 106 a

aproximadamente 1 x 109 linfocitos T transducidos, incluso de forma más deseable, de aproximadamente 1 x 107 a

aproximadamente 5 x 108 linfocitos T transducidos, aunque se puede utilizar cualquier cantidad adecuada superior,

por ejemplo, más de 5 x 108 células, o inferior, por ejemplo, menos de 1 x 107 células. El programa de dosificación

puede basarse en terapias basadas en células bien establecidas (véase, por ejemplo, Topalian y Rosenberg, 1987;

Pat. de EE.UU. N.° 4.690.915), o puede emplearse una estrategia de infusión continua alternativa.

Estos valores proporcionan una guía general de la gama de linfocitos T transducidos que utilizará el médico tras

optimizar el procedimiento de la presente invención para la puesta en práctica de la invención. La enumeración en

esta invención de dichos intervalos de ninguna manera excluye el uso de una cantidad mayor o menor de un

componente, como podría justificarse en una aplicación particular. Por ejemplo, la dosis y el programa reales pueden

variar dependiendo de si las composiciones se administran en combinación con otras composiciones farmacéuticas,

o dependiendo de las diferencias interindividuales en la farmacocinética, la disposición del fármaco y el metabolismo.

Un experto en la técnica puede realizar fácilmente los ajustes necesarios según las exigencias de la situación

particular.

IV. Manipulación de construcciones

En determinados aspectos específicos, se usa un sistema de transposasa de las realizaciones para manipular una

célula con una construcción de expresión que termina con un elemento genético seleccionado. En dichos aspectos,

el elemento genético seleccionado está flanqueado por repeticiones de transposones que son funcionales con una

transposasa de las realizaciones, tales como las secuencias IR/DR. El elemento genético seleccionado puede

comprender cualquier secuencia que se desee transfectar en una célula, pero en determinados aspectos, el elemento

codifica una secuencia codificante de polipéptidos y secuencias de control de expresión apropiadas para la expresión

en mamíferos. En algunos aspectos específicos, el elemento genético seleccionado codifica un resto de unión a

antígeno, tal como un anticuerpo, un receptor de linfocitos T o un receptor de antígeno quimérico (CAR). Como se usa

en esta invención, el término "antígeno" es una molécula capaz de unirse por un anticuerpo o receptor de linfocitos T

o CAR.

Por lo tanto, las realizaciones de la presente invención implican ácidos nucleicos, incluidos ácidos nucleicos que

codifican un polipéptido con CAR específico de antígeno, incluido un CAR que ha sido humanizado para reducir la

inmunogenicidad (hCAR), que comprende un dominio de señalización intracelular, un dominio transmembrana y un

dominio extracelular que comprende uno o más motivos de señalización. En determinadas realizaciones, el CAR puede reconocer un epítopo compuesto por el espacio compartido entre uno o más antígenos. Pueden usarse receptores de reconocimiento de patrones, tales como Dectina 1, para derivar especificidad con respecto a un antígeno de carbohidrato. En determinadas realizaciones, la región de unión puede comprender regiones determinantes complementarias de un anticuerpo monoclonal, regiones variables de un anticuerpo monoclonal, y/o fragmentos de unión a antígeno del mismo. En otra realización, esa especificidad se deriva de un péptido (por ejemplo, citocina) que se une a un receptor. Una región determinante de complementariedad (CDR) es una secuencia de aminoácidos corta que se encuentra en los dominios variables de las proteínas del receptor de antígeno (por ejemplo, inmunoglobulina y receptor de linfocitos T) que complementa un antígeno y, por lo tanto, proporciona al receptor su especificidad para ese antígeno en particular. Cada cadena polipeptídica de un receptor de antígeno contiene tres CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Dado que los receptores de antígenos se componen típicamente de dos cadenas polipeptídicas, hay seis CDR para cada receptor de antígeno que pueden entrar en contacto con el antígeno; cada cadena pesada y ligera contiene tres CDR. Debido a que la mayoría de las variaciones de secuencia asociadas con inmunoglobulinas y receptores de linfocitos T se encuentran en las CDR, estas regiones a veces se denominan dominios hipervariables. Entre estos, CDR3 muestra la mayor variabilidad ya que está codificada por una recombinación de las regiones VJ (VDJ en el caso de la cadena pesada y la cadena ap de TCR).

Se contempla que los ácidos nucleicos con CAR humanos son genes humanos para potenciar la inmunoterapia celular para pacientes humanos. En una realización específica, la invención incluye un ADNc de CAR de longitud completa o una región codificante. Las regiones o el dominio de unión a antígeno pueden comprender un fragmento de las cadenas VH y VL de un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal humano particular, tales como las descritas en la Patente de EE.UU. 7.109.304, o pueden comprender cualquier otro antígeno de unión a antígeno. El fragmento también puede ser cualquier número de dominios de unión a antígeno diferentes de un anticuerpo específico de antígeno humano. En una realización más específica, el fragmento es un scFv específico de antígeno codificado por una secuencia que está optimizada para el uso de codones humanos para la expresión en células humanas.

La disposición podría ser multimérica, tal como un diacuerpo o multímeros. Lo más probable es que los multímeros se formen por emparejamiento cruzado de la porción variable de las cadenas ligera y pesada en lo que Winters ha denominado diacuerpo. La porción de bisagra de la construcción puede tener múltiples alternativas desde ser totalmente eliminada, a tener la primera cisteína mantenida, a una sustitución de prolina en lugar de serina, a ser truncada hasta la primera cisteína. La porción Fc se puede eliminar. Cualquier proteína que sea estable y/o se dimerice puede servir para este propósito. Se podría usar solo uno de los dominios Fc, por ejemplo, el dominio CH2 o CH3 de la inmunoglobulina humana. También se podría utilizar la región bisagra, CH2 y CH3 de una inmunoglobulina humana que se ha modificado para mejorar la dimerización. También se podría usar solo la porción de bisagra de una inmunoglobulina. También se podrían utilizar porciones de CD8alfa.

El dominio de señalización intracelular de un receptor de antígeno quimérico de las realizaciones es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmune en la que se ha colocado el receptor quimérico. El término "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula diferenciada. La función efectora de un linfocito T, por ejemplo, puede ser la actividad citolítica o actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas. La función efectora en un linfocito T sin tratar, de memoria o de tipo memoria incluye la proliferación dependiente de antígeno. Por lo tanto, el término "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de la función efectora y dirige a la célula para que realice una función especializada. Aunque normalmente se empleará todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no será necesario utilizar el polipéptido intracelular completo. En la medida en que una porción truncada del dominio de señalización intracelular pueda encontrar uso, dicha porción truncada puede usarse en lugar de la cadena intacta siempre que transduzca la señal de la función efectora. Por lo tanto, el término dominio de señalización intracelular pretende incluir cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de la función efectora. Ejemplos incluyen la cadena zeta del receptor de linfocitos T o cualquiera de sus homólogos (por ejemplo, eta, delta, gamma o épsilon), cadena MB1, B29, Fc RIII, Fc RI y combinaciones de moléculas de señalización, tales como CD3Z y CD28, CD27, 4-1BB, DAP-10, OX40, y combinaciones de las mismas, así como otras moléculas y fragmentos similares. Pueden usarse porciones de señalización intracelular de otros miembros de las familias de proteínas activadoras, tales como F^cyRⁱII y F^ceRI. Véanse Gross et al. (1992), Stancovski et al. (1993), Moritz et al. (1994), Hwu et al. (1995), Weijtens et al. (1996), y Hekele et al. (1996) para las divulgaciones de los receptores de linfocitos T quiméricos que utilizan estos dominios transmembrana e intracelulares alternativos. En determinadas realizaciones, el dominio intracelular de CD3 Z humano se usa para la activación.

El dominio extracelular específico de antígeno y el dominio de señalización intracelular pueden estar unidos por un dominio transmembrana, tal como la bisagra de IgG4Fc humana y las regiones Fc. Las alternativas incluyen el dominio transmembrana CD4 humano, el dominio transmembrana CD28 humano, el dominio CD3Z humano transmembrana o un dominio CD3Z humano mutado en cisteína, u otros dominios transmembrana de otras proteínas de señalización transmembrana humanas, tales como CD16 y CD8 y el receptor de eritropoyetina. Pueden añadirse modificaciones adicionales a las secuencias de aminoácidos transmembrana.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico con CAR comprende una secuencia que codifica otros receptores coestimuladores, tales como un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular CD28 modificado. Otros receptores coestimuladores incluyen, pero sin limitación, uno o más de CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10 y 4-1BB (CD137). Además de una señal primaria iniciada por CD3 Z, una señal adicional proporcionada por un receptor coestimulador humano insertado en un CAR humano es importante para la activación completa de los linfocitos T y podría ayudar a mejorar la persistencia in vivo y el éxito terapéutico de la inmunoterapia adoptiva.

En realizaciones particulares, la invención se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y casetes de expresión que incorporan secuencias de ADN que codifican el CAR. Los vectores de la presente invención están diseñados, principalmente, para administrar genes deseados a células inmunes, preferentemente linfocitos T bajo el control de promotores eucariotas regulados, por ejemplo, promotor MNDU3, promotor CMV, promotor EFIalfa o promotor de ubiquitina. Además, los vectores pueden contener un marcador seleccionable, si no es por otra razón, para facilitar su manipulación in vitro. En otras realizaciones, el CAR puede expresarse a partir de ARNm in vitro transcrito a partir de una plantilla de ADN.

Las moléculas receptoras de antígeno quimérico son recombinantes y se distinguen por su capacidad tanto para unir antígenos como para transducir señales de activación a través de motivos de activación de inmunorreceptores (ITAM) presentes en sus colas citoplásmicas. Las construcciones de receptor que utilizan un resto de unión a antígeno (por ejemplo, generado a partir de anticuerpos monocatenarios (scFv)) proporcionan la ventaja adicional de ser "universales" en el sentido de que se unen al antígeno nativo en la superficie de la célula diana de una manera independiente de HLA. Por ejemplo, varios laboratorios han informado sobre construcciones scFv fusionadas con secuencias que codifican la porción intracelular de la cadena zeta del complejo CD3 (Z), la cadena gamma del receptor Fc y la tirosina cinasa de Sky (Eshhar et al., 1993; Fitzer-Attas et al., 1998). Se han documentado mecanismos efectores de linfocitos T redirigidos que incluyen el reconocimiento de tumores y la lisis por CTL en varios sistemas de antígeno-scFv: Z murinos y humanos (Eshhar, 1997; Altenschmidt et al., 1997; Brocker et al., 1998).

Hasta la fecha, las regiones de unión a antígenos no humanos se utilizan típicamente en la construcción de un receptor de antígeno quimérico. Un problema potencial con el uso de regiones de unión a antígenos no humanos, tales como los anticuerpos monoclonales murinos, es la falta de funcionalidad efectora humana y la incapacidad de penetrar en masas tumorales. En otras palabras, dichos anticuerpos pueden ser incapaces de mediar en la lisis dependiente del complemento o lisar las células diana humanas a través de la toxicidad celular dependiente de anticuerpos o la fagocitosis mediada por el receptor Fc para destruir las células que expresan CAR. Además, los anticuerpos monoclonales no humanos pueden ser reconocidos por el huésped humano como una proteína extraña y, por lo tanto, las inyecciones repetidas de dichos anticuerpos extraños pueden conducir a la inducción de respuestas inmunitarias que conducen a reacciones de hipersensibilidad perjudiciales. En el caso de los anticuerpos monoclonales de base murina, esto a menudo se denomina respuesta de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA). Por lo tanto, es más preferido el uso de anticuerpos humanos porque no provocan una respuesta HAMA tan fuerte como los anticuerpos murinos. De forma similar, el uso de secuencias humanas en el CAR puede evitar el reconocimiento inmunomediado y, por lo tanto, la eliminación por los linfocitos T endógenos que residen en el receptor y reconocen el antígeno procesado en el contexto de ^hL^a.

En algunas realizaciones, el receptor de antígeno quimérico comprende: a) un dominio de señalización intracelular, b) un dominio transmembrana, y c) un dominio extracelular que comprende una región de unión a antígeno.

En realizaciones específicas, los dominios de señalización del receptor intracelular en el CAR incluyen los del complejo del receptor de antígeno de linfocitos T, tal como la cadena zeta de CD3, también dominios de señalización coestimuladores de Fcy RIII, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2, en solitario o en serie con CD3zeta, por ejemplo. En realizaciones específicas, el dominio intracelular (que puede denominarse dominio citoplásmico) comprende parte o la totalidad de uno o más de la cadenas zeta de TCR, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, F^ceRI^y, ICOS/CD278, IL-2Rbeta/CD122, IL-2Ralfa/CD132, DAP10, DAP12, y CD40. En algunas realizaciones, se emplea cualquier parte del complejo del receptor de linfocitos T endógenos en el dominio intracelular. Pueden emplearse uno o múltiples dominios citoplásmicos, ya que los llamados CAR de tercera generación tienen al menos dos o tres dominios de señalización fusionados entre sí para un efecto aditivo o sinérgico, por ejemplo.

En determinadas realizaciones del receptor de antígeno quimérico, la porción específica de antígeno del receptor (que puede denominarse dominio extracelular que comprende una región de unión a antígeno) comprende un antígeno asociado a tumor o un dominio de unión a antígeno específico de patógeno que incluye un antígeno de carbohidrato reconocido por receptores de reconocimiento de patrones, tal como Dectina 1. Un antígeno asociado a tumor puede ser de cualquier tipo siempre que se exprese en la superficie celular de las células tumorales. Las realizaciones ejemplares de antígenos asociados a tumores incluyen CD19, CD20, antígeno carcinoembrionario, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, antígeno tumoral epitelial, antígeno asociado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, etc. En determinadas realizaciones, el CAR se puede expresar conjuntamente con una citocina unida a membrana para mejorar la persistencia cuando hay una cantidad baja de antígeno asociado a tumor. Por ejemplo, CAR puede expresarse conjuntamente con IL-15 unida a membrana.

En determinadas realizaciones, los antígenos asociados a tumores intracelulares pueden ser dirigidos, tales como HA-1, survivina, WT1 y p53. Esto se puede lograr mediante un CAR expresado en un linfocito T universal que reconoce el péptido procesado descrito a partir del antígeno asociado a tumor intracelular en el contexto de HLA. Además, el linfocito T universal puede modificarse genéticamente para expresar un emparejamiento de receptor de linfocitos T que reconoce el antígeno asociado a tumor procesado intracelular en el contexto de HLA.

El patógeno puede ser de cualquier tipo, pero en realizaciones específicas, el patógeno es un hongo, una bacteria o un virus, por ejemplo. Los patógenos virales ejemplares incluyen los de las familias de Adenoviridae, virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), virus sincitial respiratorio (RSV), virus JC, virus BK, HSV, familia de virus HHV, Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Polyomavirus, Rhabdoviridae y Togaviridae. Los virus patógenos ejemplares causan viruela, influenza, paperas, sarampión, varicela, ébola y rubéola. Los hongos patógenos ejemplares incluyen Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis y Stachybotrys. Las bacterias patógenas ejemplares incluyen Streptococcus, Pseudomonas, Shigella, Campylobacter, Staphylococcus, Helicobacter, E. coli, Rickettsia, Bacillus, Bordetella, Chlamydia, Spirochetes y Salmonella. En una realización, el receptor de patógenos Dectina 1 puede usarse para generar un CAR que reconoce la estructura de carbohidrato en la pared celular de los hongos. Los linfocitos T genéticamente modificados para expresar el CAR en función de la especificidad de Dectina 1 pueden reconocer Aspergillus y dirigirse al crecimiento de las hifas. En otra realización, los CAR se pueden preparar basándose en un anticuerpo que reconoce determinantes virales (por ejemplo, las glucoproteínas de CMV y Ébola) para interrumpir las infecciones virales y la patología.

En algunas realizaciones, el antígeno patógeno es un antígeno de carbohidrato de Aspergillus para el que el dominio extracelular en el CAR reconoce patrones de carbohidratos de la pared celular fúngica, tal como a través de la Dectina 1.

Un inmunorreceptor quimérico según la presente invención se puede producir por cualquier medio conocido en la técnica, aunque preferentemente se produce utilizando técnicas de ADN recombinante. Una secuencia de ácido nucleico que codifica las diversas regiones del receptor quimérico se puede preparar y ensamblar en una secuencia codificante completa mediante técnicas estándar de clonación molecular (selección de bibliotecas genómicas, PCR, ligadura asistida por cebadores, bibliotecas scFv de levaduras y bacterias, mutagénesis de sitio dirigido, etc.). La región codificante resultante puede insertarse en un vector de expresión y usarse para transformar una línea de linfocitos T alogénicos huésped de expresión adecuada.

Como se usa en esta invención, una construcción de ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico o polinucleótido pretende significar una molécula de ADN que puede transformarse o introducirse en un linfocito T y transcribirse y traducirse para producir un producto (por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico).

En una construcción de ácido nucleico ejemplar (polinucleótido) empleada en las presentes realizaciones, el promotor está unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor quimérico, es decir, está posicionado para promover la transcripción del ARN mensajero del ADN que codifica el receptor quimérico. El promotor puede ser de origen genómico o generado sintéticamente. Se conocen bien en la técnica una diversidad de promotores para su uso en linfocitos T (por ejemplo, el promotor CD4 divulgado por Marodon et al. (2003)). El promotor puede ser constitutivo o inducible, donde la inducción está asociada con el tipo de célula específico o con un nivel específico de maduración, por ejemplo. Como alternativa, también son adecuados varios promotores virales bien conocidos. Los promotores de interés incluyen el promotor de p-actina, los promotores temprano y tardío de SV40, el promotor de inmunoglobulina, el promotor de citomegalovirus humano, el promotor de retrovirus y el promotor del virus Friend formador de focos en el bazo. Los promotores pueden o no estar asociados con potenciadores, donde los potenciadores pueden estar asociados naturalmente con el promotor particular o asociados con un promotor diferente. La secuencia del marco de lectura abierto que codifica el receptor quimérico puede obtenerse de una fuente de ADN genómico, una fuente de ADNc, o puede sintetizarse (por ejemplo, mediante PCR), o combinaciones de los mismos. Dependiendo del tamaño del ADN genómico y del número de intrones, puede ser deseable usar ADNc o una combinación del mismo, ya que se encuentra que los intrones estabilizan el ARNm o proporcionan expresión específica de linfocitos T (Barthel y Goldfeld, 2003). Además, puede ser más ventajoso usar regiones no codificantes endógenas o exógenas para estabilizar el ARNm.

Para la expresión de un receptor de antígeno quimérico de la presente invención, la región de iniciación de la transcripción endógena o de origen natural de la secuencia de ácido nucleico que codifica los componentes N-terminales del receptor quimérico puede usarse para generar el receptor quimérico en el huésped diana. Como alternativa, se puede usar una región de iniciación de la transcripción exógena que permita la expresión constitutiva o inducible, donde la expresión se puede controlar dependiendo del huésped diana, el nivel de expresión deseado, la naturaleza del huésped diana, y similares.

Asimismo, una secuencia señal que dirige el receptor quimérico a la membrana superficial puede ser la secuencia señal endógena del componente N-terminal del receptor quimérico. Opcionalmente, en algunos casos, puede ser deseable intercambiar esta secuencia por una secuencia señal diferente. Sin embargo, la secuencia señal seleccionada debe ser compatible con la ruta secretora de los linfocitos T de modo que el receptor quimérico esté presente en la superficie del linfocito T.

De manera similar, puede proporcionarse una región de terminación por la región de terminación de la transcripción endógena o de origen natural de la secuencia de ácido nucleico que codifica el componente C-terminal del receptor quimérico. Como alternativa, la región de terminación puede derivarse de una fuente diferente. En su mayor parte, la fuente de la región de terminación generalmente no se considera crítica para la expresión de una proteína recombinante y se puede emplear una amplia diversidad de regiones de terminación sin afectar negativamente a la expresión.

Las construcciones quiméricas de la presente invención encuentran aplicación en sujetos que tienen o se sospecha que tienen cáncer al reducir el tamaño de un tumor o prevenir el crecimiento o rebrote de un tumor en estos sujetos. Por consiguiente, la presente invención se refiere además a un procedimiento para reducir el crecimiento o prevenir la formación de tumores en un sujeto introduciendo una construcción quimérica de la presente invención en un linfocito T aislado del sujeto y reintroduciendo en el sujeto el linfocito T transformado, produciendo así respuestas antitumorales para reducir o eliminar tumores en el sujeto. Los linfocitos T adecuados que pueden usarse incluyen linfocitos citotóxicos (CTL) o cualquier célula que tenga un receptor de linfocitos T que necesite ser alterado. Como es bien conocido por un experto en la técnica, están fácilmente disponibles diversos procedimientos para aislar estas células de un sujeto. Por ejemplo, usando la expresión de marcadores de superficie celular o usando kits disponibles comercialmente (por ejemplo, ISOCELL™ de Pierce, Rockford, Ill.).

Se contempla que la construcción quimérica se puede introducir en los propios linfocitos T del sujeto como ADN desnudo, combinarse con otros reactivos (incluyendo, pero sin limitación, lípidos, polímeros catiónicos, complejos de PEG, complejos de proteínas), o en un vector. Se conocen en la técnica procedimientos de transfección estable de linfocitos T mediante electroporación usando ADN desnudo. Véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 6.410.319. El ADN desnudo generalmente se refiere al ADN que codifica un receptor quimérico de la presente invención contenido en un vector de expresión plasmídico en la orientación adecuada para la expresión. Ventajosamente, el uso de ADN desnudo reduce el tiempo necesario para producir linfocitos T que expresan el receptor quimérico de la presente invención.

Una vez que se establece que el linfocito T transfectado o transducido es capaz de expresar el receptor quimérico como una proteína de membrana superficial con la regulación deseada y al nivel deseado, se puede determinar si el receptor quimérico es funcional en la célula huésped para proporcionar la inducción de señal deseada. Posteriormente, los linfocitos T transducidos se reintroducen o se administran al sujeto para activar respuestas antitumorales en el sujeto. Para facilitar la administración, los linfocitos T transducidos según la invención se pueden hacer en una composición farmacéutica o en un implante apropiado para su administración in vivo, con portadores o diluyentes apropiados, que además pueden ser farmacéuticamente aceptables. Se han descrito en la técnica los medios para elaborar tal composición o un implante (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Mack, ed. (1980)). Cuando sea apropiado, los linfocitos T transducidos se pueden formular en una preparación en forma semisólida o líquida, tal como una cápsula, solución, inyección, inhalante o aerosol, de las formas habituales para su respectiva vía de administración. Pueden utilizarse medios conocidos en la técnica para prevenir o minimizar la liberación y absorción de la composición hasta que alcance el tejido u órgano diana, o para asegurar la liberación programada de la composición. Sin embargo, es deseable que se emplee una forma farmacéuticamente aceptable que no deje sin efecto a las células que expresan el receptor quimérico. Por lo tanto, es deseable que los linfocitos T transducidos se puedan convertir en una composición farmacéutica que contenga una solución salina equilibrada, preferentemente solución salina equilibrada de Hanks, o solución salina normal.

V. Kits de las realizaciones

Cualquiera de las composiciones descritas en esta invención puede estar comprendida en un kit. En algunos aspectos, en el kit se proporciona un polipéptido de transposasas de las realizaciones, o un ácido nucleico que codifica del mismo. Tal kit puede incluir una diversidad de elementos adicionales, tal como un vector de ADN que codifica repeticiones de transposones, reactivos de transfección, células, una construcción de expresión de cAr , medios, aAPC, factores de crecimiento, anticuerpos (por ejemplo, para clasificar o caracterizar linfocitos T con CAR) y/o plásmidos que codifican CAR o transposasa.

En un ejemplo no limitante, un kit comprende un polipéptido de transposasas de las realizaciones, o un ácido nucleico que codifica el mismo, uno o más reactivos para generar una construcción de expresión de CAR (que tiene repeticiones de transposones flanqueantes), células para la transfección de la construcción de expresión, y/o uno o más instrumentos para obtener células para la transfección de la construcción de expresión (tal instrumento puede ser una jeringa, pipeta, fórceps, y/o cualquier aparato médicamente aprobado). Todavía en aspectos adicionales, se incluye un dispositivo de transfección tal como un dispositivo de electroporación.

En algunas realizaciones, en el kit se proporcionan una construcción de expresión para eliminar la expresión endógena de TCR a/p, uno o más reactivos para generar la construcción, y/o linfocitos T con CAR+. En algunas realizaciones, se incluyen construcciones de expresión que codifican una o más nucleasas con dedos de cinc.

Los kits pueden comprender una o más composiciones en alícuotas adecuadas de la presente invención o reactivos para generar composiciones de la invención. Los componentes de los kits se pueden envasar en medio acuoso o de forma liofilizada. Los medios de recipiente de los kits pueden incluir al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringa u otro medio de recipiente, en el que se puede colocar un componente, y preferentemente, en alícuotas adecuadas. Cuando haya más de un componente en el kit, el kit también generalmente contendrá un segundo, tercer u otro recipiente adicional en el que los componentes adicionales se pueden colocar por separado. Sin embargo, un vial puede contener diversas combinaciones de componentes. Los kits de la presente invención también incluirán típicamente un medio para contener la construcción de receptor quimérico y cualquier otro recipiente de reactivo en un confinamiento cerrado para la venta comercial. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección o soplado en los que, por ejemplo, se mantienen los viales deseados.

VI. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar determinadas realizaciones de la invención. Se debe apreciar por los expertos en la técnica que las técnicas divulgadas en los siguientes ejemplos representan técnicas que el inventor ha descubierto que funcionan bien en la práctica de la invención y, por lo tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deberían, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones específicas que se divulgan y todavía obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 1 - Transposasas recombinantes con alta actividad en las células humanas

Las secuencias de ADN que codifican las transposasas derivadas originalmente de Salmo salar (salmón del Atlántico) se manipularon y se humanizaron en un intento de producir enzimas con mayor eficacia en células humanas. Las secuencias de dos de las transposasas producidas (y sus secuencias codificantes de ácido nucleico) se muestran a continuación y se han denominado hSB110 y hSB81.

hSBllO (SEQ ID NO: 1):

1 mgkskeisqd lrkrivdlhk sgsslgaisk rlavprssvq tivrkykhhg ttqpsyrsgr

61 rrvlsprder tlvrkvqinp rttakdlvkm leetgtkvsi stvkrvlyrh nlkghsarkk

121pllqnrhkka rlrfarahgd kdrtfwrnvl wsdetkielf ghndhryvwrkkgeackpkn

181tiptvkhggg simlwgcfaaggtgalhkidgimdavqyvdilkqhlktsv rklklgrkwv

241fqhdndpkht skhvrkwlkdnkvkvlewpsqspdlnpienlwaelkkrvrarrptnltql

301hqlcqeewak ihpnycgklvegypkrltqvkqfkgnatky

hSBllO (SEQ ID NO: 2):

1 ATGGGCAAGAGCAAAGAGATCAGCCAGGACCTGCGGAAGCGGATCGTGGACCTGCACAAG

61 AGCGGCTCTAGCCTGGGCGCCATCAGCAAGAGACTGGCCGTGCCTAGAAGCAGCGTGCAG

121 ACCATCGTGCGGAAGTACAAGCACCACGGCACCACCCAGCCCAGCTACAGATCTGGAAGG

181 CGGAGAGTGCTGAGCCCCAGGGACGAGAGAACACTCGTGCGCAAGGTGCAGATCAACCCC

241 CGGACCACCGCCAAGGACCTCGTGAAGATGCTGGAAGAGACAGGCACCAAGGTGTCCATC

301 AGCACCGTGAAGCGGGTGCTGTACCGGCACAACCTGAAGGGCCACAGCGCCAGAAAGAAG

361 CCCCTGCTGCAGAACAGACACAAGAAGGCCCGGCTGAGATTCGCCAGAGCCCACGGCGAC

421 AAGGACAGAACCTTCTGGCGGAACGTGCTGTGGAGCGACGAGACAAAGATCGAGCTGTTC

481 GGCCACAACGACCACAGATACGTGTGGCGGAAGAAGGGCGAGGCCTGCAAGCCCAAGAAC

541 ACCATCCCCACAGTGAAGCACGGCGGAGGCAGCATCATGCTGTGGGGCTGTTTTGCCGCT

601 GGCGGCACAGGCGCCCTGCACAAAATCGACGGCATCATGGACGCCGTGCAGTACGTGGAC

661 ATCCTGAAGCAGCACCTGAAAACCTCTGTGCGGAAGCTGAAGCTGGGCCGGAAATGGGTG

721 TTCCAGCACGACAACGACCCCAAGCACACCAGCAAGCACGTGCGGAAATGGCTGAAGGAC

781 AACAAAGTGAAAGTGCTGGAATGGCCCAGCCAGTCCCCCGACCTGAACCCCATCGAAAAC

841 CTGTGGGCCGAGCTGAAGAAAAGAGTGCGGGCCAGACGGCCCACCAACCTGACACAGCTG

901 CACCAGCTGTGCCAGGAAGAGTGGGCCAAGATCCACCCCAACTACTGCGGCAAGCTGGTG

961 GAAGGCTACCCCAAGAGGCTGACCCAAGTGAAACAGTTCAAGGGCAACGCCACCAAGTAC

1021TGA

hSB81 (SEQ ID NO: 3):

1 mgkskeisqdlrkrivdlhk sgsslgaisk rlavprssvq tivrkykhhg ttqpsyrsgr

61 rrvlsprder tlvrkvqinp rttakdlvkm leetgtkvsi stvkrvlyrh nlkghsarkk

121pllqnrhkka rlrfarahgd kdrtfwrnvl wsdetkielf ghndhryvwrkkgeackpkn

181tiptvkhggg simlwgcfaaggtgalhkid gimdavqyvdilkqhlktsv rklklgrkwv

241fqhdndpkht skhvrkwlkdnkvkvlewps qspdlnpienlwaelkkrvrarrptnltql

301hqlcqeewakihptycgklv egypkrltqv kqfkgnatky

hSB81 (SEQ ID NO: 4):

1 ATGGGCAAGAGCAAAGAGATCAGCCAGGACCTGCGGAAGCGGATCGTGGACCTGCACAAG

61 AGCGGCTCTAGCCTGGGCGCCATCAGCAAGAGACTGGCCGTGCCTAGAAGCAGCGTGCAG

121 ACCATCGTGCGGAAGTACAAGCACCACGGCACCACCCAGCCCAGCTACAGATCTGGAAGG

181 CGGAGAGTGCTGAGCCCCAGGGACGAGAGAACACTCGTGCGCAAGGTGCAGATCAACCCC

241 CGGACCACCGCCAAGGACCTCGTGAAGATGCTGGAAGAGACAGGCACCAAGGTGTCCATC

301 AGCACCGTGAAGCGGGTGCTGTACCGGCACAACCTGAAGGGCCACAGCGCCAGAAAGAAG

361 CCCCTGCTGCAGAACAGACACAAGAAGGCCCGGCTGAGATTCGCCAGAGCCCACGGCGAC

421 AAGGACAGAACCTTCTGGCGGAACGTGCTGTGGAGCGACGAGACAAAGATCGAGCTGTTC

481 GGCCACAACGACCACAGATACGTGTGGCGGAAGAAGGGCGAGGCCTGCAAGCCCAAGAAC

541 ACCATCCCCACAGTGAAGCACGGCGGAGGCAGCATCATGCTGTGGGGCTGTTTTGCCGCT

601 GGCGGCACAG GCGCCCTGCA CAAAATCGAC GGCATCATGG ACGCCGTGCA GTACGTGGAC

661 ATCCTGAAGC Ag CACCTGAA AAc CTCTGTG CGGAAGCTGA AGCTGGGCCG GAAATGGGTG

721 TTCCAGCACG ACAACGACCC CAAGCACACC AGCAAGCACG TGCGGAAATG GCTGAAGGAC

781 AACAAAGTGA AAGTGCTGGA ATGGCCCAGC CAGTCCCCCG ACCTGAACCC CATCGAAAAC

841 CTGTGGGCCG AGCTGAAGAA AAGAGTGCGG GCCAGACGGC CCACCAACCT GACACAGCTG

901 CACCAGCTGT GCCAGGAAGA GTGGGCCAAG ATCCACCCCA CCTACTGCGG CAAGCTGGTG

961 GAAGGCTACC CCAAGAGGCT GACCCAAGTG AAACAGTTCA AGGGCAACGC CACCAAGTAC

1021 TGA

A continuación, se ensayaron las transposasas hSB110 y hSB81, así como una transposasa de control, para determinar su capacidad para producir linfocitos T humanos manipulados con un CAR integrado genéticamente. El protocolo para estos estudios se muestra en la figura 1. Se cotransfectaron linfocitos T humanos con una construcción de ADN de transposón que codificaba el CAR flanqueado por repeticiones de transposones junto con un ARNm que codificaba los polipéptidos de transposasas. Para las transfecciones se utilizó un sistema de electroporación 4D-NUCLEOFECTOR™ (Lonza). Después de la electroporación, las células se cultivaron y se evaluó la expresión de CAR mediante citometría de flujo.

Los resultados de estos estudios se muestran en la figura 2. Los histogramas de los paneles superiores muestran el número de células positivas para CAR (eje y) frente a células que se han vuelto inviables, según lo evaluado mediante tinción con 7AAD (eje x), 8 días después de la transfección. Los paneles inferiores muestran el número de células positivas para CAR (eje y) y que expresan CD3 (eje x), 15 días después de la transfección. Estos resultados demuestran claramente que las transposasas hSB110 y hSB81 son significativamente más eficientes en la manipulación de células que SB100x. El día 8 después de la transfección, más del 22 % de las células electroporadas hSB110 y hSB81 expresan CAR. Solo el 15 % de las células de la electroporación SB100x expresaron CAR en este punto. No se observó ninguna diferencia significativa en el número de células no viables con ninguna de las construcciones de prueba (según lo evaluado por la tinción con 7AAD). Además, el día 15, más del 80 % de las poblaciones celulares sometidas a electroporación con hSB110 y hSB81 coexpresaron CAR y CD3.

REFERENCIAS

U.S. Patent 4,554,101

U.S. Patent 4,690,915

U.S. Patent 6,410,319

U.S. Patent 6,489,458

U.S. Patent 7,148,203

U.S. Patent 8,227,432

U.S. Publn. 2011/0117072

U.S. Publn. 2014/0140976

Altenschmidt et al., Adoptive transfer of in vitro-targeted, activated T lymphocytes results in total tumor regression, J Immunol. 1997 Dec 1;159(11):5509-15.

Barthel and Goldfeld, J. Immunol., 171:3612-3619, 2003

Brocker et al., Adv. Immunol., 68:257, 1998

Eshhar et al., Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc Natl Acad Sci U S A.;90(2):720-4, 1993.

Eshhar, Tumor-specific T-bodies: towards clinical application. Cancer Immunol Immunother. 1997 Nov-Dec;45(3-4):131-6. 1997

Fitzer-Attas et al., Harnessing Syk family tyrosine kinases as signaling domains for chimeric single chain of the variable domain receptors: optimal design for T cell activation. J Immunol. 1998 Jan 1;160(1): 145-54. 1998 Gross et al., Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10024-10028, 1989.

Gross et al. (1992) Endowing T cells with antibody specificity using chimeric T cell receptors. FASEB J. 1992 Dec;6(15):3370-8.

Hekele et al. Growth retardation of tumors by adoptive transfer of cytotoxic T lymphocytes reprogrammed by CD44v6-specific scFv:zeta-chimera. Int J Cancer. 1996 Oct 9;68(2):232-8, 1996.

Hwu et al. (1995) In vivo antitumor activity of T cells redirected with chimeric antibody/T-ceN receptor genes. Cáncer Res. 1995 Aug 1;55(15):3369-73.

Ivics et al., Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells., Cell, 91(4):501-510, 1997.

Kyte and Doolittle, A simple method for displaying the hydropathic character of a protein, J. Mol. Biol., 157(1): 105 32, 1982.

Mates et al., Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat. Genetics. 41(6):753-61, 2009.

Marodon et al., Blood, 101:3416-3423, 2003

Moritz et al. (1994) Cytotoxic T lymphocytes with a grafted recognition specificity for ERBB2-expressing tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 May 10;91(10):4318-22.

Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed., 1980

Roberts et al., Blood, 84:2878, 1994

Stancovski et al., J. Immunol., 151:6577, 1993

Topalian and Rosenberg, 1987

Weijtens et al. (1996) Single chain Ig/gamma gene-redirected human T lymphocytes produce cytokines, specifically lyse tumor cells, and recycle lytic capacity. J Immunol. 1996 Jul 15; 157(2): 836-43.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido recombinante que tiene actividad de transposasa que comprende una secuencia al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido comprende una Arg en la posición correspondiente a la posición 14; una Ala en la posición correspondiente a la posición 33; una His en la posición correspondiente a la posición 115; una Asp en la posición correspondiente a la posición 214; una Ala en la posición correspondiente a la posición 215; una Val en la posición correspondiente a la posición 216; un Gln en la posición correspondiente a la posición 217; una His en la posición correspondiente a la posición 243; una Arg en la posición correspondiente a la posición 136; una His en la posición correspondiente a la posición 253 y una Arg en la posición correspondiente a la posición 255.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende un Asn en la posición correspondiente a la posición 314.

3. El polipéptido de la reivindicación 2, que comprende una secuencia que es al menos un 99 % idéntica a la secuencia de SeQ ID NO: 1.

4. El polipéptido de la reivindicación 3, que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1.

5. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende una Thr en la posición correspondiente a la posición 314.

6. El polipéptido de la reivindicación 5, donde el polipéptido es al menos un 95 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 3.

7. El polipéptido de la reivindicación 5, que comprende una secuencia que es al menos un 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 3.

8. El polipéptido de la reivindicación 7, que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3.

9. Una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. La molécula de polinucleótido de la reivindicación 9, donde la molécula es un ARNm.

11. La molécula de polinucleótido de la reivindicación 9, donde la molécula comprende una secuencia al menos en un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.

12. La molécula de polinucleótido de la reivindicación 9, donde la molécula comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2.

13. Una célula huésped que comprende un polipéptido de la reivindicación 1 o una molécula de polinucleótido de la reivindicación 9.

14. La célula de la reivindicación 13, donde la célula es un linfocito citolítico natural (NK), un linfocito T o un precursor de un linfocito NK o linfocito T.

15. Un procedimiento in vitro para genomanipular una célula que comprende:

(a) transfectar la célula con (i) un ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID No: 1 o 3; y (ii) un ADN que codifica un elemento genético seleccionado flanqueado por repeticiones de transposones; y

(b) incubar la célula en condiciones apropiadas para la actividad de transposasa transitoria o estable, integrando así el elemento genético seleccionado en el genoma de la célula y produciendo una célula manipulada.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, donde el ácido nucleico codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 1.

17. El procedimiento de la reivindicación 15, donde el ácido nucleico codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 3.

18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 15, 16 o 17, donde el elemento genético seleccionado codifica un anticuerpo, un receptor de linfocitos T (TCR), o un receptor de antígeno quimérico (CAR).

19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 15, 16 o 17, donde transfectar la célula comprende electroporar la célula.

20. El procedimiento de la reivindicación 18, donde el elemento genético seleccionado codifica un CAR, donde el CAR se coexpresa con una citocina unida a la membrana.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, donde la citocina unida a la membrana es IL-15.

22. La molécula de polinucleótido de la reivindicación 9, donde la molécula comprende una secuencia al menos en un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.

23. La molécula de polinucleótido de la reivindicación 9, donde la molécula comprende una secuencia al menos en un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.

24. La molécula de polinucleótido de la reivindicación 9, donde la molécula comprende una secuencia al menos en un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.

25. La molécula de polinucleótido de la reivindicación 9, donde la molécula comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4.