JP2017514471A - キメラ抗原受容体（ｃａｒ）並びにその製造及び使用方法 - Google Patents

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Abstract

標的抗原を高レベルで発現する細胞を特異的に標的にすることができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＣＡＲ発現Ｔ細胞を提供する。同様に、ＣＡＲ Ｔ細胞療法で、抗原（例えば、癌細胞）を高レベルで発現する細胞を特異的に標的にする方法を提供する。本発明は、例えば、ある抗原を標的とする発現キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）を含む単離されたトランスジェニック細胞であって、前記ＣＡＲは、前記抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜約５００ｎＭである、前記単離されたトランスジェニック細胞を提供する。

Description

本出願は、２０１４年４月２３日に提出された米国仮出願第６１／９８３，１０３号、及び２０１４年４月２３日に提出された米国仮出願第６１／９８３，２９８号の優先権の利益を主張し、その記載内容全体を参照により本明細書に組み込む。
配列表の組込み
２０１５年４月２３日に作成した、１１ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）ある名称「ＵＴＦＣ．Ｐ１２３８ＷＯＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイルに含まれる配列表を、本明細書とともに電子形式で提出し、これを参照により本明細書に組み込む。
１．技術分野
本発明は、一般に、医学、免疫学、細胞生物学、及び分子生物学の分野に関する。特定の態様では、発明の技術分野は免疫療法に関する。より詳細には、本明細書に記載する実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、標的抗原を高発現している細胞を特異的に標的にすることができるＣＡＲ発現Ｔ細胞とに関する。
２．関連技術の記載
臨床グレードＴ細胞の効力は、遺伝子治療と免疫療法とを併用して、（ｉ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の認識、（ｉｉ）注入後の持続性、（ｉｉｉ）腫瘍部位への移行能力、及び（ｉｖ）腫瘍微小環境内でのエフェクター機能の再利用能に優れた効力を有する生物由来製品を人工的に作り出すことにより改善することができる。こうした遺伝子治療と免疫療法との併用により、Ｔ細胞の特異性をＢ細胞系抗原に誘導することができ、そのため、Ｂ細胞性悪性腫瘍が進行している患者は、そのような腫瘍特異的Ｔ細胞の注入により恩恵を受ける（Ｊｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ヒト用途に人工的にＴ細胞の遺伝子を操作する方法のほとんどでは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を安定して発現させるためにレトロウイルス及びレンチウイルスが使用されている（Ｊｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｅｒｔｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。この方法は、現行の医薬品の製造及び品質管理に関する基準（ｃＧＭＰ）に適合しているものの、臨床グレードの組換え型ウイルスの製造及び出荷は限られた数しかない製造施設に依存するため高額になり得る。
ＣＡＲ Ｔ細胞に基づいた治療法の欠点は、標的抗原が正常な非疾患組織にも発現している場合、標的外作用の可能性があることである。したがって、疾患細胞を特異的に標的としつつ、正常組織への副作用を低下させる新しいＣＡＲ Ｔ細胞療法が必要とされている。
Ｊｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｅｒｔｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１
本明細書に記載する特定の実施形態は、抗原を過剰発現する細胞を標的とするためにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を使用することができるという知見に基づいている。したがって、いくつかの態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害活性を、抗原の発現レベルが高い意図する標的細胞（例えば、癌細胞）にのみ集中させる一方で、抗原発現レベルの低い細胞に対する細胞傷害作用を最小限に抑えることができる。特に、中間レベルの標的親和性を有するＣＡＲを使用することによって、抗原を高レベルで発現する細胞に対して選択的に細胞傷害性であるＣＡＲ Ｔ細胞を作製できることがわかった。観察されたかかる作用は、何か特定の機序に拘束されることなく、ＣＡＲ Ｔ細胞による多価抗原への結合で細胞ターゲティングが促進されてよい。別法または追加方法で、標的以外への細胞傷害性を抑えるために、選択ＣＡＲ Ｔ細胞でＣＡＲの発現レベルを調節してよい。
したがって、第１の実施形態では、ある抗原を標的とし、その抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜約５００ｎＭである発現ＣＡＲを含む、トランスジェニック細胞（例えば、単離されたトランスジェニック細胞）を提供する。さらなる実施形態では、ある抗原を標的とする発現ＣＡＲを含むトランスジェニックＴ細胞であって、該Ｔ細胞が抗原に多価結合した時にのみ有意な細胞傷害活性を示すトランスジェニックＴ細胞を提供する。ある態様では、実施形態の単離細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞である。さらに別の態様では、細胞はヒト細胞などの哺乳類細胞である。
さらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）Ｔ細胞がある抗原を多価結合して初めて生じる細胞傷害活性、及び／または（ｉｉ）該抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜約５００ｎＭであるＣＡＲを有する、該抗原に結合する発現ＣＡＲを含むＣＡＲ Ｔ細胞を選択すること、並びに（ｂ）前記の選択ＣＡＲ Ｔ細胞の有効量を被検体に投与して、該抗原を高発現している細胞を選択的に標的にするＴ細胞応答を与えることを含む、被検体における抗原発現細胞を選択的に標的にする方法を提供する。したがって、特定の態様では、実施形態の方法は、疾患細胞上での抗原の高レベル発現に関連した疾患を治療する方法であるとさらに定義される。例えば、実施形態の方法を、癌または自己免疫疾患などの高増殖性疾患の治療、またはウイルス感染、細菌感染または寄生虫感染などの感染症治療のために使用してよい。
さらに別の実施形態では、（ａ）（ｉ）Ｔ細胞がある抗原を多価結合して初めて生じる細胞傷害活性、及び／または（ｉｉ）該抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜約５００ｎＭであるＣＡＲを有する、該抗原に結合する発現ＣＡＲを含むＣＡＲ Ｔ細胞を選択すること、並びに（ｂ）該抗原を異なるレベルで発現している細胞を含む混合細胞集団と、前記の選択ＣＡＲ Ｔ細胞とを接触させて抗原を高発現している細胞を選択的に標的とさせることを含む、混合細胞集団内で抗原発現細胞を選択的に標的にする方法を提供する。例えば、特定の態様では、混合細胞集団は、抗原を発現する非癌細胞と、抗原を高発現している癌細胞とを含む。いくつかの態様では、抗原の高レベルとは、ＣＡＲ Ｔ細胞の標的となる細胞において少なくとも約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００または約１，０００倍高い発現レベルを意味し得る。
さらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）ある抗原に対する親和性が異なる（該抗原に対して異なるオン・オフ率を有する）ＣＡＲ及び／または（ｉｉ）異なるレベルで細胞に発現している（すなわち、細胞表面に異なるレベルで存在する）ＣＡＲを含む、該抗原に結合するＣＡＲを発現している複数のＣＡＲ Ｔ細胞を得ること、（ｂ）該抗原を発現している対照細胞と、該抗原を高レベルで発現している標的細胞とで、細胞の細胞傷害活性を評価すること、並びに（ｃ）標的細胞に対して選択的な細胞傷害性のあるＣＡＲ Ｔ細胞を選択することを含む、ＣＡＲ Ｔ細胞を選択する方法を提供する。さらなる態様では、実施形態の方法は、選択されたＣＡＲ Ｔ細胞または選択されたＴ細胞の集団を増殖させること、及び／またはバンク化することをさらに含む。さらに別の態様では、実施形態の方法は、実施形態の選択ＣＡＲ Ｔ細胞を有効量用いて被検体を治療することを含む。特定の態様では、複数のＣＡＲ Ｔ細胞の取得には、抗原に結合するＣＡＲを発現しているＣＡＲ Ｔ細胞のライブラリーの作製を含むことができる。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞ライブラリーは、ＣＡＲ内にランダムまたは人工的に操作した点変異を含んでよい（例えば、これにより、ＣＡＲの親和性またはオン・オフ率を調節する）。さらなる態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞のライブラリーは、ＣＡＲに異なる発現レベルを与える種々のプロモーターエレメントの制御下でＣＡＲを発現している細胞を含む。
さらに別の実施形態では、ＥＧＦＲ抗原を標的とした発現ＣＡＲを含むトランスジェニック細胞（例えば、単離されたトランスジェニック細胞）を提供し、かかるＣＡＲは、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）のＣＤＲ配列（例えば、配列番号１及び配列番号２を参照のこと）またはセツキシマブのＣＤＲ配列（例えば、配列番号３及び配列番号４を参照のこと）を有する。いくつかの態様では、実施形態の細胞は、配列番号１及び配列番号２のＣＤＲまたは抗原結合部分を有する発現ＣＡＲ配列を含むヒトＴ細胞である。さらなる態様では、実施形態の細胞は、配列番号３及び配列番号４のＣＤＲまたは抗原結合部分を有する発現ＣＡＲ配列を含むヒトＴ細胞である。
実施形態の態様は、ＣＡＲが結合する抗原に関する。いくつかの態様では、抗原は、癌細胞、自己免疫細胞、またはウイルス、細菌若しくは寄生虫により感染している細胞において増加している抗原である。特定の態様では、抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２、癌胎児性抗原、αフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１の外被糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１の外被糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒα、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＶＥＧＦＲ２である。ある特定の態様では、抗原は、ＧＰ２４０、５Ｔ４、ＨＥＲ１、ＣＤ−３３、ＣＤ−３８、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＥＡ、ＦＧＦＲ３、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、Ｆｎ１４、ＥＲＢＢ２またはＥＲＢＢ３である。いくつかのさらなる態様では、抗原は、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２またはＥＲＢＢ３などの増殖因子受容体である。
特定の実施形態の態様は、抗原に結合し、かつ、抗原に対するＫｄが約２ｎＭ〜約５００ｎＭである、選択されたＣＡＲ（またはＣＡＲを含む選択された細胞）に関する。例えば、いくつかの態様では、ＣＡＲは、抗原に対するＫｄが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０ｎＭまたはそれ以上である。さらに別の態様では、ＣＡＲは、抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜約４５０，４００，３５０、３００，２５０，２００，１５０，１００、または５０ｎＭである。さらに別の態様では、ＣＡＲは、抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜５００ｎＭ、５ｎＭ〜２００ｎＭ、５ｎＭ〜１００ｎＭ、または５ｎＭ〜５０ｎＭである。本発明において「ＣＡＲのＫｄ」という場合、ＣＡＲ形成に使用されるモノクローナル抗体について測定したＫｄを意味してよい。
いくつかの態様では、実施形態の選択されたＣＡＲは、ＣＡＲ分子１つあたり２つ、３つ、４つまたはそれ以上の抗原分子に結合することができる。いくつかの態様では、選択されたＣＡＲの抗原結合ドメインの各々は、抗原に対するＫｄが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０ｎＭまたはそれ以上である。さらに別の態様では、選択されたＣＡＲの抗原結合ドメインの各々は、抗原に対するＫｄが約５ｎＭから約４５０，４００，３５０、３００，２５０，２００，１５０，１００、または５０ｎＭの間である。さらに別の態様では、選択されたＣＡＲの抗原結合ドメインの各々は、抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜５００ｎＭ、５ｎＭ〜２００ｎＭ、５ｎＭ〜１００ｎＭ、または５ｎＭ〜５０ｎＭである。
実施形態のいくつかの態様では、実施形態にしたがって使用するための選択されたＣＡＲは、ＥＧＦＲに結合するＣＡＲである。例えば、ＣＡＲは、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）のＣＤＲ配列を含むことができる。例えば、いくつかの態様では、実施形態のＣＡＲは、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）の６つのＣＤＲ（配列番号５〜１０として提供）すべてを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、配列番号１及び配列番号２の抗原結合部分を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、配列番号１及び／または配列番号２に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な配列を含む。さらに別の態様では、実施形態にしたがって使用するためのＣＡＲは、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）のＣＤＲ配列を含まない。
さらなる実施形態では、選択されたＣＡＲ、及び少なくとも、発現させた膜結合型ＩＬ−１５のような発現させた第２の導入遺伝子を含む単離細胞を提供する。例えば、いくつかの態様では、膜結合型ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合タンパク質を含む。場合によっては、そのような第２の導入遺伝子は、ＲＮＡまたはＤＮＡによってコードされる（例えば、染色体外ベクターまたはエピソーマルベクター）。特定の態様では、細胞は、細胞のゲノムに組み込まれた膜結合型ＩＬ−１５をコードするＤＮＡを含む（例えば、トランスポゾンの反復配列が隣接するコードＤＮＡ）。特定の態様では、実施形態の細胞（例えば、膜結合型サイトカインを発現しているヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を使用して、疾患細胞が高レベルの抗原を発現している疾患に罹患した被検体を治療する（または被検体の免疫応答を起こさせる）ことができる。
いくつかの態様では、実施形態の方法は、選択されたＣＡＲ及び場合によってはトランスポザーゼをコードするＤＮＡ（またはＲＮＡ）をＴ細胞にトランスフェクトすることに関する。細胞にトランスフェクトする方法は当技術分野において周知であるが、特定の態様では、電気穿孔法またはウイルスを用いた形質導入などの高効率のトランスフェクション法を使用する。例えば、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（核内直接導入）装置を使用して核酸を細胞内に導入してよい。しかし、好ましくは、トランスフェクション工程では、処置被検体に遺伝毒性を発生させる、及び／またはウイルス配列含有細胞に対する免疫応答をもたらし得る、ウイルスを用いての細胞の感染または形質導入を使用しない。
特定の実施形態の態様は、選択されたＣＡＲをコードする発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることに関する。広範囲なＣＡＲ用発現ベクターは当技術分野で公知であり、本明細書でさらに詳述する。例えば、いくつかの態様では、ＣＡＲの発現ベクターは、プラスミド、線状発現ベクターまたはエピソームなどのＤＮＡ発現ベクターである。特定の態様では、ベクターはさらなる配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡシグナル、及び／または１つまたはそれ以上のイントロンといったＣＡＲ発現を促す配列を含む。好ましい態様では、トランスポザーゼが存在することによりトランスフェクトされた細胞のゲノムにコード配列が組み込まれるよう、ＣＡＲコード配列にトランスポゾン配列が隣接している。
上記で詳述したように、特定の態様では、トランスフェクトされた細胞のゲノムにＣＡＲコード配列が組み込まれやすくするトランスポザーゼを細胞にさらにトランスフェクトする。いくつかの態様では、トランスポザーゼはＤＮＡ発現ベクターとして提供される。ただし、好ましい態様では、トランスポザーゼは、トランスジェニック細胞内でトランスポザーゼの長期発現が生じないように、発現可能なＲＮＡまたはタンパク質として提供される。どのようなトランスポザーゼ系でも実施形態に従ってを使用してよい。しかし、いくつかの態様では、トランスポザーゼはサケ科のＴｃ１様トランスポザーゼ（ＳＢ）である。例えば、かかるトランスポザーゼは、「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ（スリーピングビューティー）」トランスポザーゼであり得、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４８９，４５８号を参照されたい。
さらに別の態様では、実施形態の選択されたＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖を刺激する膜結合型サイトカインを発現させるための発現ベクターをさらに含む。特に、そのようなサイトカインを含んでいる選択されたＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原提示細胞とのエキソビボ培養をほとんどまたは全くしなくても、かかるサイトカインの発現で模倣されているため増殖することができる。同様に、そのようなＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲによって認識される抗原が大量に存在しない場合（例えば、寛解した癌患者または微小残存病変を有する患者の場合と同様）でも生体内で増殖することができる。いくつかの態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｃγサイトカインを発現させるためのＤＮＡまたはＲＮＡの発現ベクター及びサイトカインを表面で発現させるためのエレメント（例えば、膜貫通ドメイン）を含む。例えば、かかるＣＡＲ細胞は、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１の膜結合型を含むことができる。いくつかの態様では、サイトカインコード配列をサイトカインの受容体と融合させてサイトカインを膜に繋ぎ留める（ｔｅｔｈｅｒ）。例えば、細胞は、ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を発現させるためのベクターを含むことができる。さらに別の態様では、膜結合型Ｃγサイトカインをコードするベクターは、ＣＡＲ細胞のゲノムに組み込まれたベクターまたは染色体外のベクター（例えば、及びエピソーマルベクター）といったＤＮＡ発現ベクターである。さらに別の態様では、ＣＡＲ細胞でのサイトカインの発現（また、それによるＣＡＲ細胞の増殖）が、プロモーター活性の誘導または抑制により制御され得るよう、膜結合型Ｃγサイトカインの発現は誘導性プロモーター（例えば、薬物誘導性プロモーター）の制御下にある。
実施形態の態様は、選択されたＣＡＲを発現させるためのＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得ることに関する。いくつかの態様では、細胞を第三者、例えば組織バンクから得る。さらなる態様では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を含む患者由来細胞試料を使用する。例えば、ある場合には、かかる試料は臍帯血試料、末梢血試料（例えば、単核球分画）または被検体から得た多能性細胞を含む試料である。いくつかの態様では、被検体から得た試料を培養して人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を樹立し、これらの細胞を使用してＴ細胞を作製することができる。細胞試料を被検体から直接培養してもよいし、または使用前に凍結保存してもよい。いくつかの態様では、細胞試料の取得には細胞試料の採取を含む。別の態様では、試料を第三者から得る。さらに別の態様では、被検体から得た試料を処理して試料のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞を精製または濃縮することができる。例えば、試料を、勾配精製、細胞培養選択及び／または細胞選別（例えば、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）によるもの）に供することができる。
いくつかの態様では、実施形態の方法は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の取得、作製または使用をさらに含む。例えば、いくつかの態様では、抗原提示細胞は、対象抗原を発現する樹状細胞または対象抗原が搭載されている樹状細胞といった樹状細胞を含む。さらなる態様では、抗原提示細胞は、対象抗原を提示する人工抗原提示細胞を含むことができる。例えば、人工抗原提示細胞は、不活性化された（例えば、照射された）人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であり得る。そのようなａＡＰＣの作製方法は、当該技術分野で公知であり、本明細書でさらに詳述される。
したがって、いくつかの態様では、ＣＡＲ細胞集団を増幅させるために、実施形態のトランスジェニックＣＡＲ細胞と、抗原提示細胞（例えば、不活性化ａＡＰＣ）とを限られた期間エキソビボで共培養する。ＣＡＲ細胞と抗原提示細胞の共培養工程は、例えばインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）及び／またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含む培地で実施可能である。いくつかの態様では、ＣＡＲ細胞とＡＰＣとの比を約１０：１〜約１：１０、約３：１〜約１：５、または約１：１〜約１：３にして共培養を実施する。例えば、ＣＡＲ細胞とＡＰＣの共培養は約１：１、約１：２または約１：３の比であり得る。
いくつかの態様では、選択されたＣＡＲ細胞を培養するためのＡＰＣは、ＣＡＲ細胞の増殖を高めるため、特定のポリペプチドを発現するよう人工的に作られる。例えば、ＡＰＣは、該ＡＰＣ表面上に発現する（ｉ）ＣＡＲが標的とする、トランスジェニックＣＡＲ細胞上に発現する抗原、（ｉｉ）ＣＤ６４、（ｉｉ）ＣＤ８６、（ｉｉｉ）ＣＤ１３７Ｌ、及び／または（ｖ）膜結合型ＩＬ−１５を含むことができる。いくつかの態様では、ＡＰＣは、ＡＰＣ表面に発現するＣＡＲ結合抗体またはその断片を含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ特許公開ＷＯ／２０１４／１９０２７３を参照されたい）。好ましくは、本方法で使用するＡＰＣに、感染性物質についての試験及びそれらがないことの確認、並びに／またはそれらが不活性かつ非増殖性であることの試験及び確認を行う。
ＡＰＣ増幅では培養内のＣＡＲ細胞の数または濃度を増大させることができるが、この方法は労力を要し高額である。さらに、いくつかの態様では、治療を必要としている被検体は、できるだけ短期間のうちに再度トランスジェニックＣＡＲ細胞の注入を受けなければならない。したがって、いくつかの態様では、選択されたＣＡＲ細胞のエキソビボ培養は１４日以内、７日以内または３日以内である。例えば、エキソビボ培養（例えば、ＡＰＣ存在下での培養）は、トランスジェニックＣＡＲ細胞の細胞数倍加１未満で実施可能である。さらに別の態様では、ＡＰＣの存在下でトランスジェニック細胞をエキソビボ培養しない。
さらに別の態様では、実施形態の方法は、ある集団への細胞の投与または接触の前に（例えば、細胞のトランスフェクション後または細胞のエキソビボ増幅後）、細胞集団の選択ＣＡＲ発現Ｔ細胞を濃縮させる工程を含む。例えば、濃縮工程は、例えばＣＡＲが結合した抗原またはＣＡＲ結合抗体を使用することによる、細胞選別（例えば、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によるもの）を含むことができる。さらに別の態様では、濃縮工程は、非Ｔ細胞除去またはＣＡＲ発現を欠く細胞の除去を含む。例えば、ＣＤ５６＋細胞は培養集団から除去され得る。さらに別の態様では、細胞を被検体に投与する場合にＣＡＲ細胞の試料を保存する（または培養のまま維持する）。例えば、試料を後程の増幅または分析用に凍結保存してよい。
特定の態様では、内在性Ｔ細胞受容体及び／または内在性ＨＬＡを発現させるために実施形態のトランスジェニックＣＡＲ細胞を不活性化させる。例えば、Ｔ細胞を人工的に操作して内在性のα／βのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を消失させることができる。具体的な実施形態では、ＣＡＲ＋Ｔ細胞に遺伝子組換えを行いＴＣＲの発現を排除する。いくつかの態様では、ＣＡＲを発現しているＴ細胞内に内在性Ｔ細胞受容体の破壊がある。例えば、場合によっては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して内在性ＴＣＲ（例えば、α／βまたはγ／δＴＣＲ）を欠失または不活性化させる。特定の態様では、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、ＣＡＲを発現しているＴ細胞のＴ細胞受容体αβ鎖をノックアウトする。
本明細書でさらに詳述されるように、実施形態のＣＡＲ細胞を使用して広範な疾患及び病態を治療することができる。本質的に、ある特定の抗原の高発現が生じているいかなる疾患でも、ＣＡＲ細胞にかかる抗原を標的にさせることにより治療可能である。例えば、自己免疫疾患、感染、及び癌を、実施形態の方法及び／または組成物を用いて治療できる。これらには、原発性、転移性、再発性、療法感受性、療法不応性の癌（例えば、化学療法不応の癌）のような癌が含まれる。かかる癌は、血液、肺、脳、結腸、前立腺、乳房、肝臓、腎臓、胃、子宮頚部、卵巣、精巣、下垂体、食道、脾臓、皮膚、骨、及びその他（例えば、Ｂ細胞リンパ腫または黒色腫）の癌であり得る。特定の態様では、実施形態の方法は、びまん性内在性橋膠腫などの神経膠腫を治療する方法としてさらに定義される。癌治療の場合、ＣＡＲ細胞は、典型的にはＥＧＦＲのような癌細胞抗原（腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）としても知られる）を標的とする。
各種腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ＣＤ１２３、ｃ−ｍｅｔ、ＧＤ２）に対するＣＡＲ＋Ｔ細胞を製造するために（例えば、臨床試験用に）、実施形態の諸工程を使用することができる。この技術を使用して樹立したＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用して、白血病（ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ）、感染症及び／または固形腫瘍に罹患した患者を治療することができる。例えば、実施形態の方法を使用して細胞増殖性疾患、真菌感染症、ウイルス感染症、細菌感染症または寄生虫感染症を治療することができる。標的となり得る病原体には、限定されることなく、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、ＨＳＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、またはエボラといった病原体が挙げられる。実施形態のＣＡＲ細胞の標的となり得る抗原のさらなる例には、限定されることなく、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、αフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１の外被糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１の外被糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒα、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、またはＶＥＧＦＲ２が挙げられる。特定の態様では、実施形態の方法は、ＣＤ１９またはＨＥＲＶ−Ｋを発現している細胞を標的にすることに関する。例えば、ＨＥＲＶ−Ｋを標的とするＣＡＲ細胞は、モノクローナル抗体６Ｈ５のｓｃＦｖ配列を含むＣＡＲを含むことができる。さらに別の態様では、実施形態のＣＡＲを、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１などのサイトカインまたはその組み合わせと結合または融合させることができる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現しているＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞（例えば、標的抗原の発現レベルが高い細胞を選択的に死滅させるＣＡＲ発現Ｔ細胞）の集団から得た細胞を有効量被検体に提供する工程を含む、疾患に罹患した個体の治療方法を提供する。いくつかの態様では、細胞は１回以上（例えば、２回、３回、４回、５回またはそれ以上の回数）個体に投与され得る。さらなる態様では、細胞を少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日またはそれ以上の間隔を開けて固体に投与する。具体的な実施形態では、固体は癌、例えば、リンパ腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、またはＢ細胞関連自己免疫疾患に罹患している。
さらなる実施形態では、ＥＧＦＲに標的化した発現ＣＡＲを含む単離されたトランスジェニック細胞（例えば、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞）を提供する。例えば、かかるＣＡＲは、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）のＣＤＲ配列を含むことができる。例えば、いくつかの態様では、実施形態の細胞は、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）の６つのＣＤＲ（配列番号５〜１０として提供）すべてを含むＣＡＲを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、配列番号１及び配列番号２の抗原結合部分を含む。さらなる態様では、ＣＡＲは、配列番号１及び／または配列番号２に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な配列を含む。さらに別の態様では、実施形態の細胞は、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）のＣＤＲ配列を含まないＣＡＲを含む。いくつかの態様では、実施形態の単離されたトランスジェニック細胞を含む医薬組成物を提供する。さらなる関連実施形態では、ＥＧＦＲに標的化した発現ＣＡＲを含み、かつ配列番号５〜１０のＣＤＲ配列を含むトランスジェニックヒトＴ細胞の有効量をＥＧＦＲ陽性の癌に罹患している被検体に投与することを含む、該被検体の治療方法を提供する。
さらなる実施形態では、セツキシマブのＣＤＲ配列を含む発現ＣＡＲを含む単離されたトランスジェニック細胞（例えば、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞）を提供する。例えば、いくつかの態様では、実施形態の細胞は、セツキシマブ（配列番号１１〜１６として提供）の６つのＣＤＲすべてを含むＣＡＲを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、配列番号３及び配列番号４の抗原結合部分を含む。さらなる態様では、ＣＡＲは、配列番号３及び／または配列番号４に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な配列を含む。さらに別の態様では、実施形態の細胞は、セツキシマブのＣＤＲ配列を含まないＣＡＲを含む。いくつかの態様では、実施形態の単離されたトランスジェニック細胞を含む医薬組成物を提供する。さらなる関連実施形態では、ＥＧＦＲに標的化した発現ＣＡＲを含み、かつ配列番号１１〜１６のＣＤＲ配列を含むトランスジェニックヒトＴ細胞の有効量をＥＧＦＲ陽性の癌に罹患している被検体に投与することを含む、該被検体の治療方法を提供する。
本明細書及び請求の範囲で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたはそれ以上を意味してよい。本明細書及び請求の範囲において、語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（を含む）」と併用する場合、語「ａ」または「ａｎ」は１つまたは１つ以上を意味してよい。本明細書及び請求の範囲で使用する場合、「ａｎｏｔｈｅｒ（別の）」または「ａ ｆｕｒｔｈｅｒ（さらなる）」は、少なくとも第２またはそれ以上を意味してよい。
本明細書及び請求の範囲で使用する場合、用語「ａｂｏｕｔ（約）」は、数値測定に使用の方法、デバイスの本質的な誤差変動、または試験の被検体間に存在する数値変動が含まれる一数値を示すために使用される。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、この詳細な説明から本発明の趣旨および範囲内での多種多様な変更及び修正が当業者に明らかとなることから、詳細な説明及び具体的実施例はあくまでも例示のために記載されることを理解されるべきである。
抗ＣＤ３搭載人工抗原提示細胞を用いたヒト初代Ｔ細胞の細胞数増幅。（Ａ）抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を発現させるためＫ５６２の表現型のクローン４を搭載し、１００グレイまで照射しフローサイトメトリーで測定した。（Ｂ）低密度のＯＫＴ３搭載ａＡＰＣ（Ｔ細胞：ａＡＰＣ＝１０：１）または高密度のＯＫＴ３搭載Ｋ５６２（Ｔ細胞：ａＡＰＣ＝１：２）を用いた刺激後のＣＤ３＋Ｔ細胞の細胞数増幅。刺激サイクル後の倍増幅を刺激サイクル前の総Ｔ細胞数にかけて計算した推定細胞数。データは平均±ＳＤとして表される、ｎ＝６、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定）。 低密度ａＡＰＣで増幅したＴ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞を高比率で含有する。（Ａ）２回の刺激サイクル後にフローサイトメトリーで測定したところ、低密度ａＡＰＣと共に増幅させたＴ細胞（Ｔ細胞：ａＡＰＣ＝１０：１）は、高密度ａＡＰＣと共に増幅させたＴ細胞（Ｔ細胞：ａＡＰＣ＝１：２）よりも、有意に多いＣＤ８＋Ｔ細胞及び有意に少ないＣＤ４＋Ｔ細胞を含有する。データは平均として表される、ｎ＝６、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｂ）低密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞及び高密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞のＣＤ４／ＣＤ８比における差は、低密度ａＡＰＣで増幅させた場合にＣＤ４＋Ｔ細胞の倍増幅（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）が低いことによるものである。データは平均±ＳＤとして表される、ｎ＝６、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｃ）低密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞及び高密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞のＣＤ４／ＣＤ８比の差は、細胞生存率の差によるものではない。細胞の生存率は、アネキシンＶｎｅｇＰＩｎｅｇ細胞を生細胞とみなす刺激サイクルを２回行った後の、アネキシンＶ及びＰＩ染色のフローサイトメトリーにより測定した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）。（Ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高密度ａＡＰＣで刺激した場合より低密度ａＡＰＣで刺激した場合の方が増殖は少なかった。２回の刺激サイクル後、細胞増殖マーカーＫｉ−６７を細胞内フローサイトメトリーにより測定した。別々の３ドナーから得た代表的ヒストグラムを示す。 低密度または高密度ａＡＰＣで刺激したＴ細胞における差次的遺伝子発現。２サイクルの刺激の後に、ｍＲＮＡ種の多重デジタルプロファイリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｄｉｇｉｔａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）で測定した場合の、低密度ａＡＰＣまたは高密度ａＡＰＣで刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の差次的遺伝子発現。有意な上方制御または下方制御を受けた転写を、２／３ドナーの転写レベルの倍差１．５超及びｐ＜０．０１により決定した。データは倍差のヒートマップにより表される、ｎ＝３。 低密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞の方がセントラルメモリー表現型のＴ細胞が多い。（Ａ）低密度または高密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞のメモリーのマーカーについて、刺激２サイクルの後、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡについてフローサイトメトリーで測定し解析した。ゲーティングしたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の細胞集団を以下のとおり定義した：エフェクターメモリー＝ＣＣＲ７ｎｅｇＣＤ４５ＲＡｎｅｇ、セントラルメモリー＝ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡｎｅｇ、ナイーブ＝ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋、エフェクターメモリーＲＡ＝ＣＣＲ７ｎｅｇＣＤ４５ＲＡ＋。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｂ）Ｔ細胞のグランザイム及びパーフォリンの細胞内染色について、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋でゲーティングしたＴ細胞集団で２回の刺激サイクルの後、フローサイトメトリーにより測定した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｃ）ＰＭＡ／イオノマイシン刺激後のサイトカイン産生について、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋でゲーティングしたＴ細胞集団で２サイクルの刺激の後、Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色を行いフローサイトメトリーにより測定した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。 ａＡＰＣでＴ細胞数増幅後のＴＣＲ Ｖαの多様性。低密度または高密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞のＴＣＲ Ｖαの多様性について、ｍＲＮＡ種のデジタル多重プロファイリング（ｄｉｇｉｔａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）により測定し、各ＴＣＲ Ｖαの相対存在量を、総ＴＣＲ Ｖα転写量のパーセントとして計算した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）。 ａＡＰＣでＴ細胞数増幅後のＴＣＲ Ｖβの多様性。低密度または高密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞のＴＣＲ Ｖβの多様性を選別したＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞においてｍＲＮＡ種のデジタル多重プロファイリング（ｄｉｇｉｔａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）により測定し、各ＴＣＲ Ｖαの相対存在量を、総ＴＣＲ Ｖα転写量のパーセントとして計算した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）。 ａＡＰＣで細胞数増幅後のＣＤＲ３配列の多様性。ＴＣＲ Ｖβ鎖のＣＤＲ３配列を、ＩｍｍｕｎｏＳＥＱプラットフォームでのハイスループット・シーケンス（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）により決定した。細胞数増幅前の固有配列それぞれの数を、低密度ａＡＰＣ（Ｔ細胞：ａＡＰＣ＝１０：１）または高密度（Ｔ細胞：ａＡＰＣ＝１：２）ａＡＰＣで細胞数増幅した後の同一配列の数に対してプロットした。データを線形回帰にあてはめ、傾きを測定した。別個の２ドナーの代表的データ。 ａＡＰＣで細胞数を増幅させたＴ細胞へのＲＮＡの移入の最適化。（Ａ）ａＡＰＣで増幅後にさまざまなプログラムで電気穿孔したＴ細胞のＧＦＰ ＲＮＡ発現及び生存率。ＧＦＰの蛍光強度中央値をフローサイトメトリーにより測定した。生存率をＰＩ染色及びフローサイトメトリーにより測定した。別個の２ドナーの代表的データ。（Ｂ）１サイクル、２サイクルまたは３サイクルの刺激の後、ａＡＰＣ低密度（Ｔ細胞：ａＡＰＣ＝１０：１）で増幅させたＴ細胞のＧＦＰ ＲＮＡ発現及び生存率。ＧＦＰを発現しているＴ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより測定した。生存率をＰＩ染色及びフローサイトメトリーにより測定した。別個の２ドナーの代表的データ。（Ｃ）さまざまなプログラムを用いた電気穿孔法の後、ａＡＰＣ１細胞に対しＴ細胞１０細胞のａＡＰＣ密度での刺激を２サイクル行ったＴ細胞のＧＦＰ ＲＮＡ発現及び生存率。ＧＦＰを発現しているＴ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより測定した。生存率をＰＩ染色及びフローサイトメトリーにより測定した。別個の２ドナーの代表的データ。（Ｄ）ａＡＰＣ１細胞に対しＴ細胞１０細胞のａＡＰＣ密度での刺激を２サイクル、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋でゲーティングしたＴ細胞で、ＲＮＡを用いないｍｏｃｋ電気穿孔、及びＲＮＡを用いた電気穿孔をそれぞれ行った後に、フローサイトメトリーで測定したメモリーマーカーＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの発現。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）。 ＤＮＡ及びＲＮＡ修飾によるＣＡＲ発現の概略。（Ａ）ＳＢトランスポゾン／トランスポザーゼを用いた電気穿孔法によるＴ細胞のＤＮＡ修飾。正常ドナーのＰＢＭＣにＣＡＲ含有ＳＢトランスポゾン及びＳＢ１１トランスポザーゼで電気穿孔を行い、Ｔ細胞の一部に安定なＣＡＲ発現を生じさせる。ＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）の存在下、γ照射された抗原を発現しているａＡＰＣで刺激することによりＣＡＲ＋Ｔ細胞が経時的に選別されていき、５サイクルの刺激の後ＣＡＲ＋Ｔ細胞は結果的に８５％を超える。次いで、ＣＡＲ介在性機能についてＴ細胞を評価する。（Ｂ）ＲＮＡ電気泳動転写によるＴ細胞の修飾。正常ドナーのＰＢＭＣを、γ照射した抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）搭載Ｋ５６２クローン４ａＡＰＣで刺激する。第２の刺激から３〜５日後、Ｔ細胞をＲＮＡと共に電気穿孔し、ＲＮＡ電気泳動転写後２４時間のＣＡＲ＋Ｔ細胞は９５％を超える。次いで、ＣＡＲ介在性機能についてＴ細胞を評価する。 ＤＮＡ及びＲＮＡの修飾を受けたＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の表現型。（Ａ）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋でゲーティングしたＴ細胞集団における、ＣＡＲのＩｇＧ領域についてフローサイトメトリーを行って測定した、ＲＮＡ修飾Ｔ細胞及びＤＮＡ修飾Ｔ細胞のＣＡＲ発現の蛍光強度中央値。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝８）。（Ｂ）ＣＡＲ＋でゲーティングしたＴ細胞における、ＣＤ４及びＣＤ８についてフローサイトメトリーを行って測定した、ＲＮＡ修飾Ｔ細胞及びＤＮＡ修飾Ｔ細胞のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の割合。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝８）。（Ｃ）フローサイトメトリーにより測定した、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋でゲーティングしたＴ細胞集団におけるメモリーマーカーＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの発現。メモリー集団を以下のとおり定義した：エフェクターメモリー＝ＣＣＲ７ｎｅｇＣＤ４５ＲＡｎｅｇ、セントラルメモリー＝ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡｎｅｇ、ナイーブ＝ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋、エフェクターメモリーＲＡ＝ＣＣＲ７ｎｅｇＣＤ４５ＲＡ＋。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｄ）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋でゲーティングしたＴ細胞集団でフローサイトメトリーにより測定した、抑制受容体ＰＤ−１及び細胞老化マーカーＣＤ５７の発現。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊＊ｐ＜０．０１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｅ）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋でゲーティングしたＴ細胞集団に細胞内サイトカイン染色を行いフローサイトメトリーにより測定した、グランザイムＢ及びパーフォリンの発現。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）。 ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞より多くのサイトカインを産生し、わずかに高い細胞傷害性を表す。（Ａ）ＣＤ８＋でゲーティングしたＴ細胞において、ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞（５サイクルの刺激後）及びＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＲＮＡ移入から２４時間後）のサイトカイン産生について、標的またはＰＭＡ／イオノマイシンと共に４時間インキュベーションした後に細胞内染色及びフローサイトメトリーを行い測定した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｂ）ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋−Ｔ細胞（５サイクルの刺激後）及びＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋−Ｔ細胞（ＲＮＡ移入から２４時間後）の特異的細胞傷害性について、標準的４時間クロム遊離アッセイにより測定した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｃ）エフェクター：標的＝１０：１の比でＣＡＲの蛍光強度中央値に対してプロットした、ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＡ４３１の特異的細胞傷害性。データに線形回帰をあてはめたところ、傾きは、傾き＝０．０２３７±０．０３０となり、傾き０との有意差なく、ｐ＝０．４７９８であった。 Ｔ細胞のＲＮＡ修飾によるＣｅｔｕｘ−ＣＡＲの一過性発現。（Ａ）Ｔ細胞にサイトカインまたは刺激を全く加えずに、ＣＡＲのＩｇＧ部分についてフローサイトメトリーを行いＣＡＲ発現を毎日測定した。別個の３ドナーの代表的データ。（Ｂ）ＲＮＡの移入から２４時間後にＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍＬ）を付加してから、ＣＡＲのＩｇＧ部分についてフローサイトメトリーを行ってＣＡＲ発現を毎日測定した。別個の３ドナーの代表的データ。（Ｃ）ＲＮＡの移入から２４時間後にｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４細胞を付加してから、ＣＡＲのＩｇＧ部分についてフローサイトメトリーを行ってＣＡＲの発現を毎日測定した。別個の３ドナーの代表的データ。 ＲＮＡ修飾によるＣｅｔｕｘ−ＣＡＲの一過性発現により、サイトカイン産生及びＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞傷害性が低下する。（Ａ）ＤＮＡ修飾ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＲＮＡ修飾ＣＤ８＋Ｔ細胞において、標的細胞またはＰＭＡ／イオノマイシンとの４時間のインキュベーション後のＲＮＡ移入から２４時間後及び１２０時間後に細胞内染色及びフローサイトメトリーで測定したＩＦＮ−γ産生。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｂ）ＲＮＡ移入から２４時間後及び１２０時間後に標準的クロム遊離アッセイで測定したＤＮＡ修飾Ｔ細胞及びＲＮＡ修飾Ｔ細胞の特異的細胞傷害性。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｃ）エフェクターと標的との比１０：１の標準的クロム遊離アッセイで測定した、ＲＮＡ移入後２４時間からＲＮＡ移入後１２０時間までの、ＤＮＡ修飾Ｔ細胞及びＲＮＡ修飾Ｔ細胞の特異的細胞傷害性の変化。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。 Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞数増幅。（Ａ）フローサイトメトリーで測定したγ照射ｔＥＧＦＲ＋Ｋ５６２クローン２７の表現型。（Ｂ）Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞数増幅。各刺激サイクルに先立ち、ＣＤ３＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより測定した。刺激サイクル後の倍増幅（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）と刺激を与えられたＣＡＲ＋Ｔ細胞数とを乗算して推定細胞数を計算した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝７）。（Ｃ）ＣＡＲ電気穿孔から２４時間後、及び増幅から２８日後、ＣＡＲのＩｇＧ部分についてフローサイトメトリーを行いＣＤ３＋Ｔ細胞のＣＡＲ発現を測定した。データは平均として表される（ｎ＝７）。（Ｄ）増幅から２８日後、ＣＡＲのＩｇＧ部分についてフローサイトメトリーを行いＣＡＲ発現の蛍光強度中央値を測定した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝７）。 Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、表現型が類似している。（Ａ）ゲーティングしたＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞でフローサイトメトリーにより測定した、増幅から２８日後の総Ｔ細胞集団におけるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の割合。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝７）。（Ｂ、Ｃ）ゲーティングしたＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞集団でフローサイトメトリーにより測定した、Ｔ細胞増幅２８日後のＴ細胞メモリー及び分化マーカーの発現。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝４）。 Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、親和性とは独立したＣＡＲ誘発を介して同等に活性化される。（Ａ）ＥＧＦＲ遮断モノクローナル抗体存在下におけるＥＧＦＲ＋Ａ４３１に応答したＩＦＮ−γの産生。ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、抗ＥＧＦＲ遮断抗体またはアイソタイプ・コントロールを用いてＡ４３１と共培養し、ＩＦＮ−γ産生を細胞内フローサイトメトリーにより測定した。産生パーセントを、ゲーティングしたＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γの平均蛍光強度として計算し、遮断していないＣＤ８＋Ｔ細胞と比べた。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｂ）抗原陰性細胞株と比べた、ＥＬ４細胞でのｔＥＧＦＲ（パネル・上）発現及びＣＡＲ−Ｌ（パネル・下）発現の代表的ヒストグラム。ＥＧＦＲ発現量（ｄｅｎｓｉｔｙ）を定量フローサイトメトリーで測定した。（Ｃ）ＣＤ１９＋、ｔＥＧＦＲ＋、またはＣＡＲＬ＋ＥＬ４細胞との共培養後に細胞内染色及びフローサイトメトリーにより測定した、ゲーティングしたＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝４）、＊＊ｐ＜０．０１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｄ）ＣＤ１９＋、ＥＧＦＲ＋、またはＣＡＲＬ＋ＥＬ４細胞との共培養の３０分後、ｐｈｏｓｆｌｏｗサイトメトリーで測定した、ゲーティングしたＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞のｐ３８及びＥｒｋ１／２のリン酸化。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝２）、＊ｐ＜０．０５、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｅ）標準的４時間クロム遊離アッセイにより測定したＣＤ１９＋、ＥＧＦＲ＋及びＣＡＲＬ＋ＥＬ４細胞の特異的溶解。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝４）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｆ）長時間共培養におけるＥＬ４細胞に対するＴ細胞の相対的割合。種交差反応性のない抗体を用い、ヒト及びマウスそれぞれのＣＤ３についてフローサイトメトリーで測定した、ＥＬ４細胞に対するＴ細胞含有共培養物の割合。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝４）、＊＊ｐ＜０．０１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。 Ｎｉｍｏ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化及び機能的応答はＥＧＦＲ発現の密度に影響される。Ａ）フローサイトメトリーで測定した、Ａ４３１、Ｔ９８Ｇ、ＬＮ１８、Ｕ８７及びＮＡＬＭ−６細胞株でのＥＧＦＲ発現の代表的ヒストグラム。定量フローサイトメトリーで測定した細胞あたりの分子数。複製３試料の代表的データ。Ｂ）ＣＤ８＋細胞にゲートをかけた細胞内フローサイトメトリーで測定した、Ａ４３１、Ｔ９８Ｇ、ＬＮ１８、Ｕ８７及びＮＡＬＭ−６細胞株との共培養に応答した、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝４）、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。Ｃ）標準的４時間クロム遊離アッセイで測定した、ＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＡ４３１、Ｔ９８Ｇ、ＬＮ１８、Ｕ８７及びＮＡＬＭ−６の特異的溶解。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝４）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。 Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の機能の活性化は、ＥＧＦＲ発現密度と直接的かつ正の相関を示す。（Ａ）Ｕ８７由来の腫瘍細胞株４系列（Ｕ８７、Ｕ８７ｌｏｗ、Ｕ８７ｍｅｄ、及びＵ８７ｈｉｇｈ）でフローサイトメトリーにより測定したＥＧＦＲ発現の代表的ヒストグラム。定量フローサイトメトリーで測定した細胞あたりの分子数。三連の実験の代表的データ。（Ｂ）Ｕ８７またはＵ８７ｈｉｇｈとの５分、４５分、及び１２０分の共培養後にｐｈｏｓｆｌｏｗサイトメトリーで測定した、ゲーティングしたＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＥｒｋ１／２及びｐ３８のリン酸化。データは平均蛍光強度±ＳＤとして表される（ｎ＝２）。（Ｃ）ゲーティングしたＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＥＧＦＲレベルを漸増したＵ８７細胞株との４５分の共培養後にｐｈｏｓｆｌｏｗサイトメトリーで測定した、Ｅｒｋ１／２及びｐ３８ＭＡＰキナーゼファミリーメンバーのリン酸化。データは平均蛍光強度±ＳＤとして表される（ｎ＝４）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｄ）細胞内染色及びフローサイトメトリーで測定した、ＥＧＦＲレベルを漸増したＵ８７細胞株との共培養に応答して、ゲーティングしたＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞による産生されたＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝４）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｅ）標準的４時間クロム遊離アッセイで測定した、ＣＡＲ＋Ｔ細胞による、ＥＧＦＲレベルを漸増したＵ８７細胞株の特異的溶解。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝５）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。 相互作用時間を延長してもＥＧＦＲ低密度に応答したＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の機能が回復・（問題を）解消するすることはない。（Ａ）ＣＤ８＋ゲーティングした細胞において、種々のインキュベーション時間の後にＵ８７またはＵ８７ｈｉｇｈで刺激後に、細胞内染色及びフローサイトメトリーによりＩＦＮ−γ産生を測定した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）。（Ｂ）Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋またはＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞との共培養後に残ったＵ８７及びＵ８７ｈｉｇｈの細胞量。Ｕ８７細胞株とＣＡＲ＋Ｔ細胞とを、エフェクター：ターゲット比１：５で３連で共培養した。懸濁Ｔ細胞を接着標的細胞から分離し、接着画分をトリパンブルー色素排除法で計数した。生存パーセントを、［共培養後の回収細胞数］／［Ｔ細胞を含めない細胞数］＊１００として計算した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定） Ｔ細胞表面のＣＡＲ密度を高めても、低密度ＥＧＦＲに対するＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の感受性は回復・（問題を）解消されない。Ａ）ＳＢ系を介したＲＮＡ移入及び従来のＤＮＡ電気穿孔法により修飾されたＴ細胞におけるＣＡＲ発現の代表的ヒストグラム。２つの独立した実験の代表的データ。Ｂ）ＲＮＡ電気泳動転写によりＣＡＲを過剰発現しているＴ細胞における、低抗原密度及び高抗原密度に応答したＩＦＮ−γの産生。Ｕ８７またはＵ８７ｈｉｇｈ標的細胞で刺激後、ＣＤ８＋ゲーティングした細胞の細胞内フローサイトメトリーによりＩＦＮ−γ産生を測定した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝２）。 Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞では、正常な腎上皮細胞の基礎ＥＧＦＲレベルに応答した活性はＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞より少ない。（Ａ）フローサイトメトリーで測定したＨＲＣＥ上のＥＧＦＲ発現の代表的ヒストグラム。定量フローサイトメトリーで測定した細胞あたりの分子数。複製３試料の代表的データ。（Ｂ）細胞内染色及びＣＤ８＋細胞にゲーティングしたフローサイトメトリーで測定した、ＨＲＣＥとの共培養に応答してＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞により産生されたＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝４）、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｃ）標準的４時間クロム遊離アッセイで測定したＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＨＲＣＥの特異的溶解。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。 刺激後、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞はＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞ほど増殖しないが、ＡＩＣＤに対する高い傾向は示さない。（Ａ）ＣＤ８＋細胞にゲーティングしたＫｉ−６７についての細胞内フローサイトメトリーで測定した、Ｕ８７またはＵ８７ｈｉｇｈでの刺激後のＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の増殖。データは平均蛍光強度±ＳＤとして表される（ｎ＝４）、＊＊ｐ＜０．０１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｂ）ＣＤ８＋細胞にゲーティングしたアネキシンＶ及び７−ＡＡＤについてのフローサイトメトリーで測定した、Ｕ８７またはＵ８７ｈｉｇｈで刺激後のＴ細胞の生存率。アネキシンＶｎｅｇ７−ＡＡＤｎｅｇパーセントにより測定した生細胞パーセント。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝４）、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。 Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＣＡＲの優れた下方制御を示す。（Ａ）ＣＡＲのＩｇＧ部分についてのフローサイトメトリーで測定した、Ｕ８７またはＵ８７ｈｉｇｈとの共培養（Ｅ：Ｔ＝１：５）中のＣＡＲの表面発現。［共培養中の％ＣＡＲ＋］／［未刺激培養中の％ＣＡＲ＋］×１００として計算した残存ＣＡＲパーセント。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊＊ｐ＜０．０１。＊ｐ＜０．０５、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。（Ｂ）ＣＤ８＋でゲーティングしたＴ細胞において、Ｕ８７またはＵ８７ｈｉｇｈとの２４時間の共培養後にフローサイトメトリーにより測定した、細胞内及び表面のＣＡＲ発現の代表的ヒストグラム。別個の３ドナーの代表的データ。（Ｃ）ＣＡＲのＦｃ部分についてのフローサイトメトリーで測定した、ＥＧＦＲ＋ＥＬ４またはＣＡＲ−Ｌ＋ＥＬ４との共培養（Ｅ：Ｔ＝１：１）中のＣＡＲの表面発現。［共培養中の％ＣＡＲ＋］／［未刺激培養中の％ＣＡＲ＋］×１００として計算した残存ＣＡＲパーセント。データは平均として表される（ｎ＝２）、＊ｐ＜０．０５、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。 Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は抗原での再惹起に対する応答は低い。Ｕ８７またはＵ８７ｈｉｇｈと共に２４時間インキュベーションの後、ＣＡＲ＋Ｔ細胞をＵ８７またはＵ８７ｈｉｇｈで再惹起し、ＣＡＲ＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生を、細胞内染色及びＣＤ８＋細胞にゲーティングしたフローサイトメトリーで測定した。データは平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、両側ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）。 動物モデル及び処置スケジュールの概略。（Ａ）ガイドスクリュー留置の概略。右前頭葉の、冠状縫合から１−ｍｍ、及び矢状縫合から２．５ｍｍの場所にガイドスクリュー挿入用に１ｍｍの穴をドリルで開ける。（Ｂ）処置スケジュールのタイムライン。ガイドスクリューをマウスの右前頭葉内に移植し、１４日以上置いてから腫瘍注入を行い、その日を試験第０日とする。Ｔ細胞処置開始の１日前に腫瘍をＢＬＩで撮像した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ガイドスクリューを介して頭蓋内に週１回３週間投与した。マウスに能動的処置を行っている間はＴ細胞処置の前後に、その後の残りの実験期間中は毎週、腫瘍増殖をＢＬＩにより評価した。 Ｔ細胞処置に先立つＵ８７ｍｅｄ及びＣＡＲ＋ Ｔ細胞表現型の生着。（Ａ）腫瘍注入から４日後、Ｄ−ルシフェリン注射及び１０分間インキュベーションを行ってから腫瘍をＢＬＩで撮像した。（Ｂ）４日目のＢＬＩフラックス測定値で決定した相対腫瘍量が均等に配分されるようマウスを３群に分けた。（Ｃ）４サイクルの刺激で増幅されたＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ＣＡＲ発現及びＣＤ４／ＣＤ８比についてフローサイトメトリーで評価した。 Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は頭蓋内Ｕ８７ｍｅｄ異種移植片の増殖を阻害する。（Ａ）連続ＢＬＩにより腫瘍の相対的な大きさを評価した。（Ｂ）腫瘍の連続ＢＬＩにより評価した相対的腫瘍増殖。バックグラウンドの発光（グレーの陰影）は、腫瘍がないマウスのＢＬＩとした。１８日目、両側ＡＮＯＶＡ（サイダック（登録商標）（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定）で、未処置マウスとＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ｎ＝７、ｐ＜０．０１）処置マウス（ｎ＝７）との間、及び未処置（ｎ＝７）とＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ｎ＝７、ｐ＜０．０５）処置との間のＢＬＩに有意な差がある。 Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の処置を受けた頭蓋内Ｕ８７ｍｅｄ異種移植片担持マウスの生存期間。（Ａ）Ｔ細胞処置７日以内の独立した２つの実験に由来する頭蓋内Ｕ８７ｍｅｄ−ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅ異種移植片のあるマウスの生存期間。マンテル・コックス・ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ ｌｏｇ−ｒａｎｋ）検定により測定した（ｐ＝０．０００６）、未処置マウス（１４／１４生存）に対するＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置マウス（８／１４生存）の生存期間の有意な低下。（Ｂ）未処置、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置またはＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置を受けた頭蓋内Ｕ８７ｍｅｄ−ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅ異種移植片のあるマウスの生存期間。マンテル・コックス・ログランク検定により測定した（ｐ＝０．０２６９）、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置群の有意な生存延長。 Ｔ細胞処置に先立つＵ８７及びＣＡＲ＋ Ｔ細胞表現型の生着。（Ａ）腫瘍注入から４日後、Ｄ−ルシフェリン注射及び１０分間インキュベーションを行ってから腫瘍をＢＬＩで撮像した。（Ｂ）４日目のＢＬＩフラックス測定値で決定した相対腫瘍量が均等に配分されるようマウスを３群に分けた。（Ｃ）４サイクルの刺激で増幅されたＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ＣＡＲ発現及びＣＤ４／ＣＤ８比についてフローサイトメトリーで評価した。 頭蓋内Ｕ８７異種移植片の増殖をＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋は阻害するが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞はしない。（Ａ）連続ＢＬＩにより腫瘍の相対的な大きさを評価した。（Ｂ）腫瘍の連続ＢＬＩにより評価した相対的腫瘍増殖。２５日目、両側ＡＮＯＶＡ（サイダック（登録商標）の事後検定）による、未処置マウスとＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ｎ＝６、ｐ＜０．０１）処置マウス（ｎ＝６）間に見られるＢＬＩでの有意差。 Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の処置を受けた頭蓋内Ｕ８７異種移植片担持マウスの生存期間。未処置、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置またはＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置を受けた頭蓋内Ｕ８７−ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅ異種移植片のあるマウスの生存期間。マンテル・コックス・ログランク検定により測定した（ｐ＝０．０１５０）、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置群の有意な生存延長。 ＣＡＲ＋Ｔ細胞治療用の抗原レパトアを安全に増幅させるための戦略の概要。戦略は３つのカテゴリーに大別される。すなわち、（ｉ）薬物誘導性自殺または一過性のＣＡＲ発現により、ＣＡＲ発現を制限する、（ｉｉ）発現を低酸素領域に制限するか、またはホーミング受容体を共発現させることにより、ＣＡＲを腫瘍部位に対して標的化させる、及び（ｉｉｉ）腫瘍認識に抗原が２つ必要にさせるためのシグナル分断、正常組織への活性化を防ぐための抑制性ＣＡＲの発現、または高い抗原密度により条件付きで活性化されたＣＡＲの発現により、ＣＡＲ活性化を制限するという戦略である。 構築プラスミドのベクターマップ。（Ａ）セツキシマブ由来ＣＡＲトランスポゾン。以下のとおり注釈を付す。ＨＥＦ−１α／ｐ：ヒト伸長因子−１αプロモーター；ＢＧＨ：ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列；ＩＲ／ＤＲ：逆向き反復配列／順方向反復配列；ＣｏｌＥ１：Ｅ．ｃｏｌｉの最小複製起点；Ｋａｎ／Ｒ：カナマイシン耐性用遺伝子；Ｋａｎ／ｐ：カナマイシン耐性遺伝子プロモーター。（Ｂ）Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）由来ＣＡＲトランスポゾン。以下のとおり注釈を付す。ＨＥＦ−１α／ｐ：ヒト伸長因子−１αプロモーター；ＢＧＨ：ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列；ＩＲ／ＤＲ：逆向き反復配列／順方向反復配列；ＣｏｌＥ１：Ｅ．ｃｏｌｉの最小複製起点；Ｋａｎ／Ｒ：カナマイシン耐性用遺伝子；Ｋａｎ／ｐ：カナマイシン耐性遺伝子プロモーター．（Ｃ）セツキシマブ由来ＣＡＲ／ｐＧＥＭ−Ａ６４プラスミド。以下のとおり注釈を付す。ａｍｐ／Ｒ：アンピシリン耐性遺伝子、ＳｐｅＩ：直鎖化用の制限部位。（Ｄ）Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）由来ＣＡＲ／ｐＧＥＭ−Ａ６４プラスミド。以下のとおり注釈を付す。ａｍｐ／Ｒ：アンピシリン耐性遺伝子、ＳｐｅＩ：直鎖化用の制限部位。（Ｅ）ｔＥＧＦＲ−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏトランスポゾン。以下のとおり注釈を付す。ＨＥＦ−１α／ｐ：ヒト伸長因子−１αプロモーター；ＢＧＨ：ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列；Ｆ２Ａ：自己分解型ペプチドＦ２Ａ；Ｎｅｏ／ｒ：ネオマイシン耐性用遺伝子；ＩＲ／ＤＲ：逆向き反復配列／順方向反復配列；ＣｏｌＥ１：Ｅ．ｃｏｌｉの最小複製起点；Ｋａｎ／Ｒ：カナマイシン耐性用遺伝子；Ｋａｎ／ｐ：カナマイシン耐性遺伝子プロモーター。（Ｆ）ＣＡＲ−Ｌトランスポゾン。以下のとおり注釈を付す。ＨＥＦ−１α／ｐ：ヒト伸長因子−１αプロモーター；Ｚｅｏｃｉｎ Ｒ：ゼオマイシン耐性用遺伝子；ＢＧＨ：ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列；ＩＲ／ＤＲ：逆向き反復配列／順方向反復配列；ＣｏｌＥ１：Ｅ．ｃｏｌｉの最小複製起点；Ｋａｎ／Ｒ：カナマイシン耐性用遺伝子；Ｋａｎ／ｐ：カナマイシン耐性遺伝子プロモーター。 ｐＬＶＵ３Ｇ−ｅｆｆＬｕｃ−Ｔ２Ａ−ｍＫａｔｅＳ１５８Ａのベクターマップ。注釈は以下のとおりである。Ｂ１：ゲートウェイのドナー部位Ｂ１；ｅｆｆＬｕｃ：増強型（ｅｎｈａｎｃｅｄ）ホタルルシフェラーゼ；Ｔ２Ａ：Ｔ２Ａリボソームスキップ部位；ｍＫａｔｅＳ１５８Ａ：増強型（ｅｎｈａｎｃｅｄ）ｍＫａｔｅ赤色蛍光タンパク質；Ｂ２：ゲートウェイのドナー部位Ｂ２、ＨＢＶ ＰＲＥ：Ｂ型肝炎翻訳後制御エレメント；ＨＩＶ ＳＩＮ ＬＴＲ：ＨＩＶ自己不活性化、長末端反復配列；ａｍｐＲ：アンピシリン耐性；ＬＴＲ：長い末端反復配列；ＨＩＶ ｃＰＰＴ：ＨＩＶセントラルポリプリン配列。 ＭＦＩと定量フローサイトメトリーのＡＢＣとを関係付ける標準曲線。飽和量の抗ＥＧＦＲ−ＰＥと共にインキュベーションした後、抗体結合能が既知の微粒子ビーズ標準試料をフローサイトメーターで得た。既知の抗体結合能を、フローサイトメトリーによって得た測定平均蛍光強度に対してプロットし、標準曲線を作成した。
Ｉ．実施形態の態様
Ａ．ＲＮＡ修飾によるＥＧＦＲ特異的ＣＡＲの一過性発現
正常な組織に発現する抗原に対して向けられる、ＣＡＲ Ｔ細胞療法による長期のｏｎ−ｔａｒｇｅｔ（標的上）、ｏｆｆ−ｔｉｓｓｕｅ（標的組織外）毒性の可能性を抑えるために、ＲＮＡ移入によるＣＡＲの一過性発現が提案されてきた。ＲＮＡ移入前のＴ細胞の細胞数増幅は、患者への注入に必要とされる臨床上関連のあるＴ細胞数を得るのに魅力的である。本発明者らは、抗原特異性とは無関係に、抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３を搭載したａＡＰＣでの共培養によるＴ細胞数増幅を検討した。培養Ｔ細胞に対する抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ）の比を変えたところ、得られたＴ細胞集団の表現型が変わった。低密度のａＡＰＣ（Ｔ細胞：ａＡＰＣ＝１０：１）で増幅させたＴ細胞は、高密度ａＡＰＣと共に増幅させたＴ細胞と比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の増加、セントラルメモリー表現型Ｔ細胞の存在の増加、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生低下とＩＬ−２の産生増加、及び増幅後のＴＣＲ多様性のクローン性喪失の大幅な減少と関連していた。低密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞は、電気泳動転写後、ＲＮＡ転写産物の高発現及びＴ細胞生存率の改善を示し、高密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞よりもＲＮＡ電気泳動転写に対し敏感に反応する。
Ｔ細胞増幅にａＡＰＣを使用することの潜在的な有益性は、接着分子ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１の発現という点でＴ細胞との安定な相互作用を形成できることである（Ｓｕｈｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｐａｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）。その上、ａＡＰＣを比較的容易に修飾して共刺激分子の所望のアレイを発現させることができる。したがって、Ｔ細胞数増殖用のａＡＰＣは、Ｔ細胞増幅用の共刺激分子の多様な組み合わせを評価して養子Ｔ細胞療法のための至適なＴ細胞表現型を達成するためのプラットフォームを提供する。本発明者らは、ａＡＰＣの修飾に加え、培養Ｔ細胞中のａＡＰＣ密度が、得られたＴ細胞集団の表現型に及ぼす影響を記載した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、すなわち細胞傷害性Ｔ細胞は、抗腫瘍免疫療法のための理想的なＴ細胞集団として考えられることが多いが、エビデンスによると、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、至適な抗腫瘍応答及びメモリー形成を達成するために生体内でＣＤ４＋Ｔ細胞のヘルプを必要とすることが示唆されている（Ｋａｍｐｈｏｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００１３）。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の理想比率は明らかになっていない（Ｍｕｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。養子免疫療法のために増幅培養でのａＡＰＣ密度を変えてＴ細胞のＣＤ４／ＣＤ８比を偏らせることにより、それらが患者から単離されたＴＩＬであるのか、または遺伝子組換えＴ細胞であるのかという諸問題は臨床試験で取り組まれて良い。最後に、培養中のａＡＰＣの密度を低くしたところ、高いａＡＰＣ密度で増幅させたＴ細胞よりもセントラルメモリー表現型（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡｎｅｇ）Ｔ細胞が多かった。セントラルメモリー表現型Ｔ細胞が持続性に優れていることによる恩恵は、腫瘍抗原に一時的に誘導されるだけのＲＮＡ修飾Ｔ細胞までは及ばない場合があるが、Ｔ細胞の持続によりＴ細胞療法の抗腫瘍作用が改善されることが示されている（Ｋｏｗｏｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｔｅｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。したがって、安定に遺伝子組換えされたＴ細胞またはＴＩＬをセントラルメモリー表現型に再プログラムして優れた持続性を得るために、低密度ａＡＰＣを用いたエキソビボ増幅を使用してよい。
エキソビボで増幅させたＴ細胞でのＲＮＡ修飾によるＣＡＲ発現は、非ウイルス性ＤＮＡ修飾及びＣＡＲの抗原認識を介したＴ細胞増幅によるＣＡＲ発現よりも多様であることがわかった。ＣＡＲが異なる密度で発現しても、標的を特異的に溶解させるＴ細胞の能力に影響はなかったが、これまでの報告にあるように（Ｗｅｉｊｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ある特定の閾値以下で、ＣＡＲが低発現であれば標的の特異的溶解に負の影響があるであろうという考えは妥当である。ＲＮＡ用量で導入遺伝子の発現レベルが決まるようにする、Ｔ細胞のＲＮＡ修飾による調節可能ＣＡＲ発現の記載もある（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。本研究でのＴ細胞のＲＮＡ修飾は同量のＲＮＡを使用して実施されたものであるため、ＣＡＲ発現の多様性はＲＮＡ用量の変更によるものとはならない。その代わり、電気泳動転写後のＣＡＲ発現強度の違いは、ドナー間の多様性によるものと考えられる。現在記載のある、ＲＮＡ移入前のＴ細胞増幅のためのプロトコルは、ＲＮＡ取り込みに対する特定ドナー由来Ｔ細胞の感受性改変において役割を果たしていてよく、また、電気泳動転写のＲＮＡ量の増量により、これらのドナーでのＣＡＲ発現が高まってよい。比較的大量のＲＮＡ移入によりＣＡＲを高発現させることで、ＣＡＲ発現及びＣＡＲ介在性活性が長期間にわたり延長され得る（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＲＮＡ移入によるＣＡＲの長期発現は、特に、Ｔ細胞の刺激でＣＡＲ発現の消失が促進されるようであることから、抗腫瘍活性にとって有益となり得る。しかし、ＣＡＲ発現を延長することで正常組織抗原に応答したＴ細胞活性も高まる場合もあり、ＣＡＲ発現を最適化して、抗腫瘍活性を最大にする一方で正常組織への毒性を低下させるための発現至適持続時間を決定する必要がある。
Ｔ細胞のＲＮＡ修飾を行っても、ＲＮＡの電気泳動転写前にエキソビボ増幅Ｔ細胞で見られたエフェクターメモリーＴ細胞とセントラルメモリーＴ細胞との割合に変化はなく、これまでの報告と同様であった（Ｓｃｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００６）。唯一、比較的低ａＡＰＣ密度で増幅させたＴ細胞（Ｔ細胞：ａＡＰＣ＝１０：１）だけは、さまざまな電気穿孔法条件でも有意な毒性はなく、ＲＮＡ転写産物を効率的に取り込むことができた。このＴ細胞集団は、また、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−α、細胞傷害性エフェクター分子のグランザイムＢとパーフォリンの産生が低下したセントラルメモリー表現型（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡｎｅｇ）を有するＴ細胞をかなりの割合で示した。結果として、ＤＮＡ修飾Ｔ細胞よりもセントラルメモリー表現型Ｔ細胞をかなり多く含有したＲＮＡ修飾Ｔ細胞は、ＥＧＦＲ発現細胞に応答したＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生が低く、また、低エフェクター：ターゲット比でわずかに劣る特異的溶解性を示した。したがって、ＲＮＡ修飾用の前駆Ｔ細胞集団は、ＲＮＡ移入後のＣＡＲ介在性Ｔ細胞機能に大きく影響し、ＲＮＡ修飾されたＴ細胞のサイトカイン産生が低く、特異的溶解がわずかに劣るということは、Ｔ細胞の細胞傷害力が長続きしないインビボモデルでは抗腫瘍効果が低いという解釈をしてよく、また、セントラルメモリーＴ細胞集団の優れた持続性も有益とはならない場合がある。Ｔ細胞とａＡＰＣとを１：２で増幅させたＴ細胞のＲＮＡ修飾は、ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞と同様の、より大きな割合でエフェクターメモリー表現型Ｔ細胞を示し、結果として、より多量のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生能を示すものが望ましい。ＲＮＡ移入前にサイトカインを加えることによって生存率が改善されてよく、さらに電気穿孔プログラムを行ってこれらのＴ細胞に効率的にＲＮＡを移入させてよい。
ＲＮＡの移入を介してＴ細胞に導入したＣｅｔｕｘ−ＣＡＲは一過性の発現をし、また、サイトカインＩＬ−２及びＩＬ−２１の追加並びにＥＧＦＲ発現細胞株の追加を介した抗原刺激などのＴ細胞への刺激により発現の消失が促進された。ＣＡＲ発現の消失に伴い、ＲＮＡ修飾Ｔ細胞は、腫瘍細胞及び正常ヒト腎細胞などのＥＧＦＲ発現細胞株に対する細胞傷害性の低下を示した。ＲＮＡ修飾Ｔ細胞の使用に対する一つの懸念は、これらの細胞は本質的に経時的な腫瘍標的能が低いために、安定的に修飾されたＴ細胞より抗腫瘍効果が低くなるだろうということである。ＲＮＡ移入によりメソテリン特異的ＣＡＲを発現するよう修飾したＴ細胞を中皮腫マウスモデルの処置のために複数回注射したところ、隔週の腫瘍内注射では腫瘍増殖コントロールを示したが、処置中止後、腫瘍の再発を示した（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。播種性白血病マウスモデルのインビボ処置から、ＣＤ１９に特異的なＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞は単回注射後は抗腫瘍活性を有するが、ＣＡＲの分解にしたがいある期間が経過すると、しばしば腫瘍が再発することが示された（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。対照的に、メソテリン特異的ＣＡＲを安定発現しているＴ細胞の腫瘍内単回注射により、優れた抗腫瘍活性が仲介され、ほとんどのマウスを治癒することができた。ＲＮＡ修飾Ｔ細胞の用量の最適化から、後続注入の前に残存ＣＡＲｎｅｇＴ細胞を排除するためのシクロホスファミドと加重分割投与レジメンとを組み合わせた方が疾病負荷コントロールがより効果的であり、抗腫瘍効果は安定的修飾したＴ細胞と同様であることが示された（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。したがって、投与レジメンの最適化により、ＲＮＡ修飾Ｔ細胞の抗腫瘍活性を改善することができる。
Ｂ．ＣＡＲ＋Ｔ細胞はＥＧＦＲ密度に基づいて正常細胞から悪性細胞を区別できる
Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は正常組織抗原を認識することができるため、ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ、ｏｆｆ−ｔｉｓｓｕｅ毒性をもたらし得ると考えられる。したがって、本発明者らは、ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ、ｏｆｆ−ｔｉｓｓｕｅ毒性をＣＡＲの一過性発現により制御する方法として、ＲＮＡ種としてのＣＡＲの発現を検討した。ＣＡＲ発現は一過性であり、ＣＡＲの分解後は正常組織のＥＧＦＲに対する細胞傷害の可能性は低くはなるが、ＣＡＲがかなり分解されないうちに正常組織ＥＧＦＲの認識と同時の速やかなＴ細胞エフェクター機能の可能性は認められなかった。さらに、ＣＡＲ発現を制限することにより、ＣＡＲの分解後はＴ細胞はＥＧＦＲ発現腫瘍に非応答となり、このアプローチによる抗腫瘍活性持続の可能性は低くなる。以上のことから、正常組織の存在下でＣＡＲ活性を制御し、抗腫瘍活性を損なうことなく有害なｏｎ−ｔａｒｇｅｔ、ｏｆｆ−ｔｉｓｓｕｅ毒性を制限する機序について検討した。
内因性Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲの親和性にも、またＭＨＣを介して提示されるペプチドの密度にも依存する（Ｈｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｖｉｏｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ ２０１０）。Ｔ細胞は、エフェクター機能の誘導に必要とされる特定の閾値を超える、ＴＣＲを介した累積シグナルにより活性化される（Ｈｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｒｏｓｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｖｉｏｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。親和性の高いＴＣＲの場合、Ｔ細胞応答の誘発には比較的低い抗原密度で十分である。しかし、親和性が低いＴＣＲでは、同様のエフェクターＴ細胞応答を達成するために、より高い抗原密度を必要とした（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。多くの腫瘍はＴＡＡを過剰発現し、その密度は正常組織での発現よりも高い（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌａｃｕｎｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００９）。神経膠腫におけるＥＧＦＲの増幅と過剰発現にはこの関係が顕著に見られ、ＥＧＦＲは神経膠腫において正常組織よりも過剰に発現しており、また、過剰発現と腫瘍の悪性度は相関し、例えばグレードＩＶの膠芽腫は最も高密度のＥＧＦＲを発現する（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｇａｌａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。したがって、本発明者らは、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲ修飾Ｔ細胞が、ＥＧＦＲ密度に基づいて正常細胞から悪性細胞を区別することができるかどうかについて、ＣＡＲの結合親和性を低くして検討した。
抗原特異性を与えるＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ部分は、モノクローナル抗体セツキシマブのｓｃＦｖ部分に由来し、高親和性を特徴とする（Ｋｄ＝１．９ｘ１０−９）（Ｔａｌａｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。したがって、本発明者らは、モノクローナル抗体Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）由来のＣＡＲを作製した。これは、セツキシマブと高度に重複するエピトープを共有し、解離定数（Ｋｄ＝２．１ｘ１０−８）が１０倍低く、会合速度が５９倍低いことを特徴とする（Ｔａｌａｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｇａｒｒｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｚｕｃｋｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）。会合速度を遅くし、それにより全体的な親和性を低下させることで、ＥＧＦＲを二価でなければ認識しなくなり、これはＥＧＦＲが高密度で発現しないと起こらない。したがって、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）由来のＣＡＲであれば、Ｔ細胞に、ＥＧＦＲ発現密度に基づいて正常組織から悪性組織を区別させることができ得る。
最近の臨床で成功を収めているＣＬＬ及びＡＬＬにおいて、ＣＤ１９−ＣＡＲ＋Ｔ細胞療法に対して完全な腫瘍応答があった患者の持続的なＢ細胞無形成が確認されているが、この毒性は、ＣＤ１９が系統が制限された抗原であるため許容範囲とみなされ、また進行したリンパ腫の場合にはＢ細胞無形成は許容毒性とみなされる（Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＣＡＲ修飾Ｔ細胞を用いてＨＥＲ２及びＣＡＩＸを標的にする臨床試験での重篤な有害事象から、系統及び腫瘍が制限された抗原以外にも安全に標的にできる抗原の範囲を広げるため、正常組織での抗原発現に対するＣＡＲ Ｔ細胞活性を制御する必要性が浮き彫りになっている（Ｌａｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。異常に発現したＴＡＡは、膠芽腫でのＥＧＦＲ発現のように、正常組織よりも腫瘍で過剰発現することが多い（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｇａｌａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。本発明者らは、正常組織に対して応答する可能性を最小に抑えるため、低い抗原密度に対する応答能が低く、一方で、高い抗原密度に応答する適切なエフェクター機能を維持した、ＥＧＦＲに特異的なＣＡＲを開発した。これは、セツキシマブと高度に重複するエピトープを有するがセツキシマブに比して結合動態が低いモノクローナル抗体であるｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）に由来するＥＧＦＲ特異的ＣＡＲを作製することにより達成された（Ｔａｌａｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｇａｒｒｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、低密度及び高密度のＥＧＦＲを標的にすることができたが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は抗原密度に合わせてＴ細胞活性を調節することができ、応答は標的細胞上に発現するＥＧＦＲ密度に依存した。Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞及び正常腎細胞上のＥＧＦＲ低密度に応答してＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞より低い活性を示すが、ＥＧＦＲ高密度に応答して特異性及び機能を同等に誘導することができた。ＣＡＲの親和性は抗原惹起後の増殖に影響を及ぼし、抗原惹起後のＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較すると、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は増殖低下を示したが、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）の傾向増大は示さなかった。その上、ＣＡＲ親和性は、抗原と相互作用した後のＴ細胞表面からのＣＡＲの下方制御に影響を与える。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲは、ＥＧＦＲ高密度との相互作用後、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲよりも短時間でかつ長期の細胞表面からの下方制御を示した。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は抗原との再惹起に応答する能力が低下していたが、それは、ＣＡＲが下方制御された結果または潜在的にＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の機能疲弊の結果であった可能性がある（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
Ｔ細胞機能を最も良く予測する内在性のＴＣＲ結合に関する生化学的パラメータをめぐってかなりの議論がなされ、そこから、ｓｃＦｖのＣＡＲ機能への影響を明らかにする際に厄介となる諸問題が生じてくる。ＴＣＲ結合動態は、解離定数Ｋｄが、解離（ｋｏｆｆ）速度と会合速度（ｋｏｎ）との比に等しい、式
で表され得る（１４）。解離定数（Ｋｄ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）はいずれも、ＴＣＲがｐｅｐＭＨＣを認識した後のＴ細胞機能の重要な決定因子であることが報告されているが、これら２つのパラメータは強く相関していることが多く、そのため、それぞれがＴ細胞機能に及ぼす影響を切り離すことは困難である（Ｋｅｒｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８；ＭｃＫｅｉｔｈａｎ Ｔ．Ｗ． １９９５；Ｎａｕｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。Ｔ細胞誘発の動態校正モデルは、ｋｏｆｆがＴ細胞機能に影響を与え、十分に長い滞留時間がないとＴ細胞のシグナル伝達及び活性化が誘発されないというものである。これは修正されて至適滞留時間の枠が含まれ、ここでは、滞留時間が長ければ、単一ｐｅｐＭＨＣ複合体が複数ＴＣＲを連続誘発させる能力が低下し、Ｔ細胞活性化に不利になる場合がある、（Ｋａｌｅｒｇｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）。しかし、これらのモデルは、滞留時間が非常に短い相互作用でも機能的Ｔ細胞応答を発生させることができるという報告と矛盾する（Ｇｏｖｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ａｌｅｋｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。Ｋｄ値とｋｏｆｆ値との間の高度の相関を減少させ、ｋｏｎ値の動的範囲を拡大させることで、これまでのデータセットのバイアスを小さくすることを目指した最近の解析により、Ｔ細胞誘発のＴ細胞閉じ込め（ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）モデルに包含される、Ｔ細胞活性化に対するｋｏｎの寄与における重要な役割が明らかになった。そこでは、Ｔ細胞機能は、会合速度、解離速度、並びにＴＣＲ及びｐｅｐＭＨＣに関連する膜におけるＴＣＲ及びｐｅｐＭＨＣの拡散という３つの間の数学的関係から求めた、Ｔ細胞閉じ込め（ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）の持続時間と直接相関している（Ｔａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ａｌｅｋｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。興味深いことに、ｋｏｎが低下すると、ＴＣＲ及びｐｅｐＭＨＣは、再結合前にそれぞれの関連する膜に拡散することができ、そのため、相互作用の持続時間がｋｏｆｆ値まで下がる。対照的に、ｋｏｎが高くなると、ＴＣＲは短時間で再結合して滞留時間を延長させることができ、相互作用及び得られるＴ細胞機能の持続時間はＫｄにより最も良く予測される。Ｔ細胞の機能的結合活性を制御するＴＣＲ親和性コンポーネントの役割を定義するために現在行われているこの議論は、他の機能指標よりも優れた機能指標として、生化学的結合パラメータ１つに依存する普遍的モデルに対して警告を発する。その代わり、会合速度と解離速度の組み合わせ、並びに、標的細胞の膜を介して自由に移動する抗原の密度が機能的応答を定義すると考えられる。
内在性ＴＣＲ応答は一般に、モノクローナル抗体の結合性よりもはるかに低い親和性として表現され、これを使用してＣＡＲ特異性を導く（Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。しかし、ＴＣＲ結合親和性を測定するために使用されるＳＰＲ技術は、典型的には三次元で実施され、Ｔ細胞と抗原提示細胞との生理的な相互作用を再現するものではなく、そこでは両結合パートナーは自身のそれぞれの膜内に拘束され、細胞間隙及び適切な分子方向が制限されるために結合する確率が高くなる（Ｈｕｐｐａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。２ＤでのＴＣＲ結合動態測定値から、ＴＣＲの結合は、高い会合速度及び低い解離速度を特徴とする３Ｄ測定値から示唆されるものよりも親和性が高いことが示唆される（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。しかし、他のリガンド／受容体ペア、例えばＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１の結合動態では、３Ｄアッセイまたは２Ｄアッセイでの親和性測定値に差は認められなかった。興味深いことに、細胞骨格の重合を除去すると、２Ｄでの測定値が３Ｄでの測定値まで下がり、このことは、抗原に対するＴ細胞結合を増強させる際の細胞及び細胞骨格の動的プロセスの役割を強調している（Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。細胞骨格相互作用または結合親和性増強作用がＣＡＲにおいて同様に生じるかについては現在のところ不明であり、したがって、ＣＡＲのｓｃＦｖドメインの結合親和性について立てた仮説を、３Ｄアッセイでのモノクローナル抗体の親和性測定値からそのまま仮説として立てることが可能かどうかは明らかでない。さらに、Ｔ細胞結合の全体的な結合活性の増強には、ＭＨＣへの共受容体の結合並びにＴ細胞活性化前後のＴ細胞表面でのＴＣＲナノクラスター及びミクロクラスターの形成といったいくつかの因子が寄与する（Ｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｓｃｈａｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｃｈａｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｙｏｋｏｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＣＡＲはＴ細胞表面にオリゴマーとして発現できるように思われるが、ＣＡＲが内在性Ｔ細胞シグナル伝達複合体とどこまで関与しているのかは不明である。ＣＤ３−ζのみを介してシグナル伝達を行う第１世代ＣＡＲに関する報告では、ＣＡＲ依存性Ｔ細胞活性化を達成するためには内因性ＣＤ３−ζと会合する必要があることが示されているが、膜貫通ＣＤ２８並びに細胞内ＣＤ２８及びＣＤ３−ζを介してシグナル伝達する第２世代ＣＡＲでは、内在性ＴＣＲ−ＣＤ３複合体がＴ細胞表面から拘束されている場合にはＣＡＲ依存性活性化能に差は見られない（Ｂｒｉｄｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｔｏｒｉｋａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。したがって、ＣＡＲと内在性ＴＣＲシグナル伝達機構との会合は、ＣＡＲの立体配置に依存し得る。
ＣＡＲ設計においてｓｃＦｖ親和性の役割に取り組んだ具体的研究は少なく、解離定数Ｋｄの寄与ということに集中している。ＲＯＲ１特異的ＣＡＲを用いた最近の研究では、ｋｏｎ高値かつｋｏｆｆ低値の双方により得た６倍低いＫｄ、すなわちより高い親和性での比較を行っており、親和性の高いＲＯＲ−１特異的ＣＡＲは、ＡＩＣＤの傾向を高めることなく、サイトカインの産生及び特異的溶解などインビトロでのＴ細胞機能を増強させることが示された（Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。その上、高親和性ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞はインビボでの優れた抗腫瘍活性を仲介した。同様に、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の高い親和性でＡＩＣＤの傾向が高まることはなく、ＥＧＦＲ低密度に応答して、サイトカインの産生及び特異的溶解などのＴ細胞機能が増強された。しかしながら、Ｋｄ値の範囲が広い親和性成熟ＨＥＲ２特異的モノクローナル抗体のパネルに由来する一連のＣＡＲに関する先の研究では、親和性に閾値があることが見出され、それ以下ではＣＡＲ依存性Ｔ細胞活性化が低下した。ただし、この閾値より上の値では、親和性を高めていってもＨＥＲ２のさまざまなレベルに応答したＴ細胞の活性化が改善されることはなかった（Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。対照的に、本研究では、高親和性ＣＡＲと低親和性ＣＡＲとで異なる、抗原密度に基づいた標的指向能を同定した。親和性が高いＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞に比して、低いＥＧＦＲ密度に応答したサイトカイン産生及び特異的溶解の増大と関連していた。一方、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲはＣｅｔｕｘ−ＣＡＲに対して親和性が低く、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲのＫｄ値は、親和性閾値を上回り、先の研究がエフェクター機能を有すると予測した範囲内であった。内在性ＴＣＲの研究と同様、これらの結果は、ＣＡＲの親和性を記載する際は解離定数だけの記載をするべきではないことを示しており、ＣＡＲ設計では、個々の解離速度と会合速度との関係を考慮に入れなければいけないことを支持している。
親和性が及ぼすＣＡＲ機能への影響について研究間で見られる矛盾は、解離定数Ｋｄを構成する生化学的パラメータｋｏｆｆ及びｋｏｎの関係が異なっていることにより説明され得る。ＨＥＲ２特異的ＣＡＲは、ｋｏｎ値との相関が最小の、主にｋｏｆｆが異なる広範囲なＫｄ値を示した抗体から得られた（Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。したがって、高親和性相互作用により会合速度は上昇しなかったが、抗原との相互作用持続時間は延長された。対照的に、ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲの高親和性及びＣｅｔｕｘ−ＣＡＲの高親和性はいずれも結合の会合速度上昇の影響を受けた。ＲＯＲ−１特異的ＣＡＲを得るために使用した高親和性モノクローナル抗体は、高親和性は高い会合速度と長い相互作用持続時間の両方により特徴付けられるというような、ｋｏｎ高値及びｋｏｆｆ低値の双方の寄与により、６倍低いＫｄを有した（Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。セツキシマブのＫｄとＮｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）のＫｄの間にある１０倍の差は、主に、セツキシマブのｋｏｎを５９倍高くしｋｏｆｆを５．３倍高くしたことの影響を受けており、セツキシマブが、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）と比して会合速度が大幅に増強はされるが、ほとんどの高親和性相互作用とは対照的に相互作用持続時間が短くなるようにされている（Ｔａｌａｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。したがって、ＣＡＲ設計においてｓｃＦｖドメインの解離速度ではなくむしろ会合速度の改変が、Ｔ細胞機能に対する影響がより大きくなり得る。
これまでの研究で、Ｔ細胞活性化には、それを下回るとＴ細胞活性化が抑止される最小ＣＡＲ密度が必要であることが確立されてきた（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。しかし、ＣＡＲが低密度で発現している場合、抗原発現を十分高くすることによりこの必要性を減らし、ＣＡＲ依存性Ｔ細胞活性化を達成できる（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＣＡＲの発現密度、抗原密度並びにＣＡＲ親和性及びＣＡＲ＋Ｔ細胞機能に対する影響がどのように相互作用するかについて、高親和性及び低親和性のＨＥＲ特異的ＣＡＲを使用した研究で評価した。この研究では、低い抗原密度に応答した、ＣＡＲ密度が低いＴ細胞のＴ細胞機能低下は、Ｔ細胞が親和性の高いＨＥＲ２特異的ＣＡＲを発現した場合に明らかとなるにすぎないことが報告された（Ｔｕｒａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。しかし、ＣＡＲが高密度で発現した場合、ＣＡＲ介在性の細胞傷害性は親和性または抗原密度とは無関係であった。著者らは、低密度ＨＥＲ２に対して高親和性ＣＡＲが低密度で発現した場合に高親和性ＣＡＲの反応が低いのは、連続誘発が誘導されなかった結果であると考えた。ＣＡＲは内在性ＴＣＲとして連続的に誘発しないことが報告されているが（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、これがＣＡＲ特異的であること、また、異なる膜貫通領域、エンドドメイン、及びｓｃＦｖ親和性が連続的に誘発する能力に影響を与え得ることは考えられ得る。本発明者らは、低い抗原密度に対する初期応答でのＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の欠陥を何らみとめなかったが、ＥＧＦＲ＋ａＡＰＣへの反復刺激を介して淘汰されたＣＡＲ発現レベルにより至適ＣＡＲ密度が選択され、最適下限レベルのＣＡＲを発現しているＴ細胞は増幅に失敗し、そのためレパトアから脱落する場合がある。対照的に、本願の知見から、親和性が低いＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、抗原低発現に対して低い感受性を示すが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲの密度を高めても低発現抗原に対するＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の感受性は回復・（問題を）解消しなかったため、異なる機序で制御されている可能性が高いことが示唆される。
低密度でのＣＡＲの発現により抗原への感受性を抑えることができるが、これは、生体内で高抗原密度を選択的に標的とする最適戦略とは考えられず、その主な理由として、低密度で発現したＣＡＲがどのレベルの抗原にも低い感受性を示し、そのために抗腫瘍活性が低くなる可能性があることが挙げられる（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｗｅｉｊｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。さらに、ＣＡＲはＴ細胞表面から一定数のＣＡＲ／抗原で下方制御する（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。したがって、低密度でＣＡＲを発現しているＴ細胞は、Ｔ細胞活性化を達成するための最小密度を下回る密度で下方制御を受けやすくなる。
本研究では、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲよりも結合の会合速度が低いことから低親和性であると予測されたＮｉｍｏ−ＣＡＲは、ＥＧＦＲ発現密度と直接相関したＴ細胞活性化及びＥＧＦＲ密度が低い正常腎細胞に応答した低活性を仲介した。その上、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞に比して、増殖が増強されＣＡＲ下方制御が低かった。Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞に膠芽腫上のＥＧＦＲを標的とさせることは、ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ、ｏｆｆ−ｔｉｓｓｕｅ毒性の可能性を抑えつつ、抗腫瘍活性を仲介する可能性を秘めている。
Ｃ．頭蓋内神経膠腫モデルにおけるＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍効果
膠芽腫など腫瘍によっては正常組織での発現よりもＥＧＦＲが高密度で過剰発現するので、結合親和性を低下させるためにＣＡＲのｓｃＦｖドメインを改変することにより、ＥＧＦＲ高密度の存在下ではＴ細胞を選択的に活性化するが、ＥＧＦＲ低密度の存在下ではＴ細胞活性を抑制できるであろうという仮説を立てた。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ及びＮｉｍｏ−ＣＡＲは、それぞれに異なる親和性及び結合動態でＥＧＦＲ上の重複エピトープに結合し、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲの方が５．３倍低い解離定数を有する、すなわち高親和性であり、５９倍高い会合速度を特徴とするようにする。インビトロ研究では、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲは、外因性サイトカインの非存在下では抗原に応答した増殖が低下していたこと、ＥＧＦＲを結合するＣＡＲのｓｃＦｖドメイン及びＥＧＦＲの密度に依存してＣＡＲの下方制御が増強されていたこと、及び抗原を用いた再惹起に応答したサイトカイン産生が低下していたことも示された。
頭蓋内神経膠腫異種移植の処置におけるＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の有効性評価では、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞はいずれもＥＧＦＲを中程度の密度で発現しているＵ８７ｍｅｄに対する抗腫瘍活性を仲介できるが、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞のみが内因的にＥＧＦＲ密度が低いＵ８７に対する抗腫瘍活性を示したことが実証され、これによりインビトロで得た結論が支持された。
いくつかの研究では、高親和性ＴＣＲの相互作用は優れたインビボ活性をもたらし得ることが示されている、（Ｎａｕｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）が、インビボでの有効性が常にインビトロでのＴ細胞活性に反映されているわけではないことが示されている（Ｃｈｅｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。インビトロで効力の高い高親和性Ｔ細胞はインビボでの応答が減弱していることが示されており、シグナル伝達、増幅及びＴ細胞介在性機能の低下を特徴とする（Ｃｏｒｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。同様に、低親和性相互作用では、インビボでのＴ細胞増幅が抑制されており、その結果、免疫応答の各段階においてＴ細胞がほとんど存在しないことが示されている（Ｚｅｈｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。抗腫瘍効果におけるＴＣＲ親和性の役割を評価するモデルでは、高親和性ＴＣＲ相互作用により抗腫瘍機能が低下し、腫瘍内の存在の減少及び細胞溶解機能の低下を特徴とすることが示されている、（Ｃｈｅｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｅｎｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。したがって、中程度の親和性を有するＴ細胞の方が、高親和性Ｔ細胞より腫瘍増殖をより良く制御し得ることが示唆されている（Ｃｏｒｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。これらの所見にインビトロの所見、すなわち、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は外因性サイトカイン非存在下で刺激した場合に増殖能が低いこと、抗原と会合後はＣＡＲ下方制御が増強していること、及び抗原との再惹起に対する応答能が低いことを合わせると、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞はインビボでの抗腫瘍効果は低い場合がある。本発明者らは、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞に比して抗腫瘍効果が低下しているという所見は得なかったが、腫瘍内注射後のＣＡＲ＋細胞の運命は追跡しなかったため、生体内での増幅の相違は評価しなかった。抗腫瘍活性評価時に、ＣＡＲ＋Ｔ細胞が腫瘍にホーミングするそれぞれの異なる能力の交絡変数を回避するためにＣＡＲ＋Ｔ細胞の腫瘍内注射を選択したが、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞が腫瘍周辺に滞留したことにより腫瘍浸潤が抑制された可能性はある。
Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置では、未処置マウスと比べ、Ｕ８７上のＥＧＦＲ低密度、すなわち正常な腎上皮細胞で測定したＥＧＦＲ密度より約２倍高い密度に応答した腫瘍量の有意な減少またはマウス生存期間の有意な改善はなかった（図１８及び図２１）。対照的に、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＥＧＦＲ低密度のマウス６匹中３匹で腫瘍コントロール及び生存期間延長を示した。Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置により、ＥＧＦＲ密度が非常に低い正常組織に対する細胞傷害可能性を低下させていた可能性もあるが、それらには低密度のＥＧＦＲを発現している腫瘍エスケープバリアントの可能性もある。しかし、膠芽腫内での実質的な不均一性のため、所与の患者の体内で単一の標的がすべての腫瘍細胞上に発現するとは考えにくい（Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｓｚｅｒｌｉｐ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞を用いた実験的膠芽腫モデルの処置では、ＨＥＲ２ｎｕｌｌ腫瘍細胞のエスケープも示された（Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。患者の腫瘍のプロファイリングにより、所与の腫瘍で最大数の細胞を標的にする抗原の組み合わせを同定することができ、ＣＡＲ＋Ｔ細胞に複数抗原を標的とさせることで、単一特異性ＣＡＲ＋Ｔ細胞の治療の治療有効性が改善されることが示されている（Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＥＧＦＲ密度が均一なＵ８７を用いたインビボ実験では、患者の腫瘍内の抗原不均一性は再現されないため、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞またはＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞と、特異性の異なるＣＡＲ＋Ｔ細胞とを組み合わせた評価は、インビボの腫瘍不均一性をより良く再現し得る患者由来の膠芽腫検体に対して実施することができる（Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
意外にも、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞処置の７日以内に有意な毒性を示し、マウス１４匹中６匹がＴ細胞を注射してから７日以内に死亡した。これまで、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲでは、腫瘍を担持していないマウスにＴ細胞を注入してから４８時間後の肝酵素測定による、検出可能なインビボ毒性は報告されていなかった（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。このＣＡＲはマウス抗体由来であったため、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲは正常組織のマウスＥＧＦＲを認識しないと考えられる。その上、抗原非存在下での毒性測定では、腫瘍に抗原を発現している患者におけるＣＡＲ＋ Ｔ細胞の生理学的活性化が再現されない。それは、これらの細胞こそが腫瘍溶解に応答して活性化し、増殖してサイトカインを産生することになるからであり、これらのすべてが測定可能な毒性に寄与し得ると考えられる（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。実際、本研究では、抗原低発現腫瘍を担持するマウスまたは腫瘍のないマウスをＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞で処置したところ、検出可能な毒性を生じなかったが（図４）、これは、観察されたＴ細胞毒性に対してインビボのＴ細胞活性化が担う役割を強調している。
セツキシマブはマウスのＥＧＦＲを認識しないため、ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ、ｏｆｆ−ｔｉｓｓｕｅ毒性がＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞関連の毒性の原因とは考えにくい（Ｍｕｔｓａｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）。このモデルにおけるＣｅｔｕｘ−ＣＡＲを介した毒性について考えられる機序には、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲの抗原特異性を低下させる、クラスタリング、免疫シナプス形成またはＴ細胞の細胞骨格との会合による、Ｔ細胞活性化または増強したと見られる結合活性から生じるサイトカイン関連毒性が挙げられ、これは、ＣＤ８共受容体の結合が高親和性ＴＣＲの結合活性増強に寄与して特異性の消失をもたらすという記載にあるとおりである（Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
以上をまとめると、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、頭蓋内同所性異種移植モデルにおいて、高親和性Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞に匹敵する抗腫瘍活性及び生存期間改善を示し、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞に伴うＴ細胞関連毒性を生じない。対照的に、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＥＧＦＲ密度が低い腫瘍に対して抗腫瘍活性を示すが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は示さない。これらの知見は、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＥＧＦＲ低密度に応答した活性が低いというインビトロ所見と一致する。
Ｄ．ＣＡＲ＋Ｔ細胞療法のための抗原レパトアの安全な増幅
ＣＡＲ＋Ｔ細胞の安全性達成のために開発された方法は、主に、（ｉ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞を腫瘍組織に拘束する、（ｉｉ）ＣＡＲ発現／Ｔ細胞持続性を制限する、及び（ｉｉｉ）ＣＡＲ介在性のＴ細胞活性化を腫瘍に拘束する、という３つの戦略に大別することができる（図３２）。ＣＣＲ２、ＣＣＲ４及びＣＸＣＲ２などホーミング分子をＣＡＲと共にＴ細胞に共発現させて腫瘍部位にホーミングさせるという、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を腫瘍部位に隔離するための記載がある（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｄｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ホーミング受容体を持たないＣＡＲ＋Ｔ細胞に比べて腫瘍組織において富んでいるが、ホーミング受容体を発現しているＣＡＲ＋Ｔ細胞のうち、腫瘍に効率的にホーミングをせず、そのために正常組織を標的にするのが何割なのかは不明である。同様に、腫瘍により分泌されるケモカインが、組織の損傷と治癒の過程で正常組織からも分泌され得る。したがって、これらの治療法に他の治療法、例えば手術、化学療法及び放射線照射を併用すると、治療中、特別な損傷のない正常組織にＴ細胞を引き付ける危険性が考えられる。多くの腫瘍に共通する低酸素条件中に選択的に発現するＣＡＲの開発は、ＣＡＲを酸素依存的分解ドメインに融合させて酸素正常状態におけるＣＡＲの発現及び組織標的能を制限することにより達成されている（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。低酸素状態から酸素正常状態へ移動するＴ細胞のＣＡＲ分解には、数分から数時間かかる場合があるため、ＣＡＲが分解される前にｏｎ−ｔａｒｇｅｔ、ｏｆｆ−ｔｉｓｓｕｅ毒性が起こり得ることは可能である。さらに、多くの腫瘍の中心部は低酸素になっているが、血管に富んだ腫瘍周辺領域にはＣＡＲを分解するのに十分な濃度の酸素があり、周辺領域をＣＡＲ介在性Ｔ細胞活性から保護している（Ｖａｒｔａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
ＣＡＲ＋Ｔ細胞の存在を時間的に制限する戦略には、一過性ＲＮＡ種としてＣＡＲを発現させるといったＴ細胞の自殺遺伝子組換え、及びｉＣａｓｐａｓｅ９自殺スイッチの導入が挙げられ、ｉＣａｓｐａｓｅ９自殺スイッチは二量体化誘導化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）により特異的に活性化されてＴ細胞を死亡させるものである（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０；ＤｉＳｔａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｂｕｄｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。どちらの方法も浸透率が高く、薬物送達によるアポトーシス誘導後またはＲＮＡ導入遺伝子発現が経時的に消失した後、ほぼ完全にＣＡＲ＋Ｔ細胞を抑止する。両戦略ともＣＡＲ＋Ｔ細胞を永久に排除するため、正常組織は保護されるが腫瘍に対する治療有効性も制限される。これらの戦略の制約の一つは、ＣＡＲの減少またはＴ細胞消失以前に、正常細胞に対する強力な活性が存在し、毒性の短期的制限がないことである。Ｔ細胞療法に由来する重篤な有害事象は、臨床症状発症から急速に進行し得るため、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞注入の瞬間から正常組織を保護するための戦略を持つことが望ましい（Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
二重特異的な相補的ＣＡＲは、シグナル伝達ドメインを解離させ、２種の特異性を有する２つのキメラ受容体を発現させることにより、腫瘍上に限定して相互に発現させた２つの抗原の共発現に応答して選択的活性化を達成した。この方法では、ある特異性をＣＤ３ζに融合させて第１世代ＣＡＲを発現させ、また、別の相補的特異性を共刺激エンドドメインに融合させて（キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）と呼ばれる）、抗原の共発現によりＣＡＲ及びＣＣＲが同時に会合しないと完全な活性化及びＴ細胞機能が達成されないようにする（Ｗｉｌｋｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｌａｎｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｋｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。このアプローチは、乳癌のＨＥＲ２とＭＵＣ１、前立腺癌のＰＳＭＡとＰＳＣＡ、及び卵巣癌治療のメソテリン及びα−葉酸受容体に対して誘導された特異性を有する、種々のＣＡＲとＣＣＲペアを用いて導かれた。初期の研究では、Ｔ細胞の活性化及び溶解機能は、ＣＣＲの活性化がない場合に、第１世代ＣＡＲの発現を介して単一の標的発現抗原に対して起こり得ることが示されている。この細胞傷害性は第２世代ＣＡＲで観察されたものよりは低いが、単一抗原を発現している正常組織をＣＡＲが標的にするという残存リスクが依然として少しある（Ｗｉｌｋｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｌａｎｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。この制約を克服するための一戦略は、最適下限の親和性を有する第１世代ＣＡＲを開発し、単一抗原によって活性化された場合にかろうじてＴ細胞が機能し、また、ＣＣＲが連結しないと毒性が救済されないようにすることである（Ｋｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。しかし、この戦略は、腫瘍抗原に対するＴ細胞の感受性を鈍化させることで機能する。この方法では、単一抗原発現組織が認識され標的となることを防ぎ、これにより、正常組織の毒性を潜在的に低下させるが、抗腫瘍活性も低下させる。さらに、効率的なＴ細胞活性化及び腫瘍除去のためには２つの抗原を発現させる必要があり、このため、ＣＡＲを活性化できる腫瘍量が減り、腫瘍エスケープバリアントが発生する可能性が増す。
正常組織にしか見られない抗原に対する特異性、及び腫瘍上ではないＰＤ−１シグナル伝達エンドドメインを融合させた抑制性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）は、正常組織抗原の結合に応答してＴ細胞介在性の殺滅及びサイトカイン産生を有意に抑制できる（Ｆｅｄｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。印象的なことに、ｉＣＡＲのＴ細胞機能抑制は可逆的であり、その後、腫瘍抗原に遭遇すると、Ｔ細胞は機能的に産生的な応答をすることができる。この戦略の成功は、ＣＡＲ、ｉＣＡＲ及び両抗原の化学量論に左右される。したがって、ＣＡＲ／腫瘍抗原の圧倒的発現の存在下でｉＣＡＲ発現または抗原が不十分な場合は、正常組織毒性が起こり得ると予測することが妥当である。この戦略を成功に導くためには、この化学量論的パラメータを各抗原セットごとに評価し厳しく管理する必要がある。
本明細書に記載するのは、正常組織の低密度ＥＧＦＲに応答したＣＡＲ＋Ｔ細胞活性化を弱める一方、腫瘍組織上のＥＧＦＲ高密度に応答したＴ細胞の細胞傷害性を仲介するため、ＣＡＲ設計に使用するｓｃＦｖの親和性に基づいて腫瘍部位に対するＴ細胞活性化を制御する方法である。この方法の利点は、（ｉ）正常組織の毒性低下が、腫瘍に応答した活性減弱と関連していないこと、及び（ｉｉ）Ｔ細胞の活性化／抑制に複数抗原の認識を必要としないことであるが、それには、発現の化学量論及び関連受容体への結合を厳しく管理しなければならない。その上、Ｔ細胞活性化に複数抗原を必要とするため、効率的に標的にされるであろう腫瘍の割合がさらに少なくなる。Ｔ細胞のｏｎ−ｔａｒｇｅｔ、ｏｆｆ−ｔｉｓｓｕｅな組織毒性を拘束する方法はどれも互いに排他的ではなく、複数の戦略を組み合わせることで正常組織の破壊回避が改善され得る。
Ｅ．臨床的意義
膠芽腫患者は、癌免疫療法にとって、ＥＧＦＲに対して特異的なＴ細胞の安全性初期評価に理想的な患者集団となり得る。ＥＧＦＲは膠芽腫に罹患した患者の４０〜５０％に過剰発現している（Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。また、正常脳組織におけるＥＧＦＲの発現は報告されていない（Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＥＧＦＲは正常上皮表面に広く分布しているため、腫瘍切除後にＴ細胞を腔内送達することにより、抗腫瘍能を最大限にしつつ、ＣＮＳ外の上皮表面と相互作用する可能性を最小化できる。膠芽腫患者での初期安全性評価の後は、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞療法を、乳房、卵巣、肺、頭頸部、結腸直腸、及び腎の細胞癌腫など他のＥＧＦＲ発現悪性腫瘍まで広げることが可能であり得る（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
Ｔ細胞のＲＮＡを修飾してＣＡＲを一過性発現させた場合、存在するＣＡＲ＋Ｔ細胞が少ないことにより抗腫瘍効果が低くなる場合があるが、ＲＮＡ修飾Ｔ細胞を複数回、特に加重初回投与量で注入を行うことにより、これらの潜在的な制限を克服することができ、これは先に、ＲＮＡ移入で修飾したＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を用いて進行白血病マウスモデルで示されたとおりである（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＲＮＡ発現により移入されたメソテリン特異的ＣＡＲを用いた臨床試験では、ＣＡＲ部分に対して特異的なＩｇＥ抗体反応がＣＡＲの反復注入に応答して生じることに起因するアナフィラキシーが起こる可能性が示されたが、ＩｇＧ抗体からＩｇＥ抗体へのアイソタイプスイッチを回避するために、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の注入間隔を１０日以内とし、治療を２１日のコースをかけて完了させる投与方法が提案されており、現在検討が進められている（Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これらの課題があるにもかかわらず、ＣＡＲを発現させるためのＲＮＡ修飾には臨床応用における多くの魅力的な利点がある。第一に、Ｔ細胞のＲＮＡ修飾では導入遺伝子のゲノム組込みがなく、そのため、規制上の承認を得るための煩雑な工程が少なくなる可能性があり、これにより、ＣＡＲ＋Ｔ細胞療法の前臨床開発期間が短縮され得る。さらに、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞をＲＮＡの移入によって作製するほうが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン／トランスポザーゼ系を使用するＤＮＡ修飾よりもはるかに速く、Ｔ細胞のＤＮＡ修飾の場合に要するエキソビボ培養時間の約半分の時間で９０％を超えるＣＡＲ＋Ｔ細胞が得られる。規制上の承認プロセスの速さとエキソビボ製造時間を改善することにより、臨床への新しいＣＡＲ＋Ｔ細胞療法をいち早く手に入れ、これらの療法を臨床応用のために微調整する際、改善された有効性を取り次ぐ、ｂｅｎｃｈ−ｔｏ−ｂｅｄｓｉｄｅ（研究現場から臨床現場へ）及びその逆のコミュニケーション時間を早めることができると考えられる。
また、ＲＮＡ修飾は、患者において広く発現したＥＧＦＲのような正常組織抗原に特異的な一過性修飾Ｔ細胞を試験し、ＣＡＲ構造の安全性プロファイルを決定してから、永久的組込みを行ったＣＡＲの評価をさらなる安全対策として行うためのプラットフォームも提供し得る。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲは、ＥＧＦＲ低密度に応答してＴ細胞活性化及び溶解活性を示すことから、Ｔ細胞のＤＮＡ修飾を行ってＣｅｔｕｘ−ＣＡＲを永久的に発現させることは、正常組織の毒性リスクが高いため、現実的な臨床戦略ではないと考えられる。しかし、ＲＮＡ導入で修飾したＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の最初の臨床評価から、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、正常組織毒性を仲介するが、長期の正常組織毒性に関する懸念を解消するためにＣＡＲの一過性発現という安全面での特徴をさらに備えていると決定され得る。
Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は低密度ＥＧＦＲに対する細胞傷害性を仲介する能力が低いため、正常組織毒性を抑制するよう機能するが、低密度ＥＧＦＲを発現する腫瘍に対する有効性も抑制され、低密度でＥＧＦＲを発現している腫瘍エスケープバリアントが増殖してしまう可能性が増す。対照的に、あらゆるレベルのＥＧＦＲ発現に対して特異的溶解活性のあるＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＥＧＦＲを低発現している腫瘍エスケープバリアントが増殖するリスクを減少させるが、強力な毒性の代償としてＥＧＦＲ発現が低い正常組織に対しても増殖を抑制する。さらに、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、中等度の密度のＥＧＦＲを発現している頭蓋内Ｕ８７の処置で示されたように、ＥＧＦＲを発現している正常組織を標的にすることとは無関係に、ある程度のＴ細胞関連毒性を仲介すると思われ、これはおそらくサイトカイン産生の増強または局所炎症の誘導によるものと思われる。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞とＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の関係は、遺伝子組換えＴ細胞療法の安全性と有効性の間で達成されるべきバランスというものを強調している。毒性リスクは増すが優れた腫瘍コントロールの可能性を秘めたＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞、または毒性リスクは低いが腫瘍エスケープバリアント発生の可能性が高いＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞のうち、どちらの戦略がより良い臨床転帰をもたらし得るのかという選択に簡単な答えはない。このバランスに対処するために考えられる臨床戦略の一つは、ＥＧＦＲを高発現している腫瘍バリアントを安定してコントロールするためＤＮＡで修飾したＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞を注入することと、ＥＧＦＲを低発現している腫瘍細胞を除去するためＲＮＡで修飾したＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞を複数注入することとを組み合わせることであり得る。
ＩＩ．定義
本明細書で使用する用語「ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＣＡＲ）（キメラ抗原受容体）」は、例えば、人工のＴ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を意味してよく、人工の特異性を特定の免疫エフェクター細胞に移植する遺伝子工学的に操作した受容体を包含する。ＣＡＲを使用してモノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与し、これにより、多数の特異的Ｔ細胞を、例えば養子細胞療法で使用するために作製して良い。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、例えば、細胞の特異性を腫瘍関連抗原へ導く。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内活性化領域、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。特定の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ膜貫通ドメインに融合させた、モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と、エンドドメインとの融合体を含む。他のＣＡＲ設計の特異性は、受容体のリガンド（例えば、ペプチド類）由来またはデクチンのようなパターン認識受容体由来であってよい。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞系分子ＣＤ１９に対して特異的なＣＡＲを使用してＴ細胞の特異性を誘導することにより悪性Ｂ細胞を標的にすることができる。ある実施形態では、抗原認識ドメインの間隔（ｓｐａｃｉｎｇ）を変更して活性化誘導型細胞死を抑制することができる。ある実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、及び／またはＯＸ４０のようなさらなる共刺激シグナル伝達用ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、共刺激分子、画像診断（例えば、ポジトロン断層撮影）用レポーター遺伝子、プロドラッグ、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体などが加えられた時に条件付きでＴ細胞を排除する分子をＣＡＲと共に共発現させることができる。
本明細書で使用する用語「Ｔ−ｃｅｌｌ受容体（ＴＣＲ）（Ｔ細胞受容体）」は、アルファ（α）鎖とベータ（β）鎖からなるヘテロ二量体で構成されるＴ細胞上のタンパク質受容体を指すが、細胞の中にはＴＣＲがガンマ鎖及びデルタ鎖（γ／δ）からなるものもある。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲを含め、どの細胞上ででも修飾されてよく、これには例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及びガンマ・デルタＴ細胞などが挙げられる。
本発明で使用する場合、用語「ａｎｔｉｇｅｎ（抗原）」とは、抗体またはＴ細胞受容体が結合することのできる分子である。
抗原は、一般に、液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答を誘導してＢリンパ球及び／またはＴリンパ球の産生をもたらすために使われる。
用語「ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ（腫瘍関連抗原）」及び「ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ（癌細胞抗原）」は、本明細書では互換的に使用される。いずれの場合も、各用語は、癌細胞により特異的または選択的に発現したタンパク質、糖タンパク質または炭水化物を指す。
本明細書で、被検体の治療または被検体の細胞を選択的に標的にすることに言及して語句「ｉｎ ｎｅｅｄ ｔｈｅｒｅｏｆ（それを必要とする）」という場合、標的抗原（または高レベルの標的抗原）を発現している細胞の選択的殺滅の恩恵を受けると考えられる疾患状態にある被検体を指す。いくつかの態様では、疾患状態は、被検体において非癌性細胞と比べて標的抗原を高レベルで発現する癌であってよい。例えば、癌は、被検体において非癌性細胞と比べて高レベルのＥＧＦＲを発現する神経膠腫であり得る。
本明細書で、ＣＡＲ Ｔ細胞、またはＣＡＲ Ｔ細胞を含む医薬組成物に関連して語句「ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ（有効量）」を使用する場合、被検体への投与時に、ＣＡＲが結合した標的抗原を発現する（または高発現する）細胞を死滅させるのに十分なＣＡＲ Ｔ細胞量を指す。
ＩＩＩ．キメラ抗原受容体
本明細書に記載する実施形態では、抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする核酸の作製及び同定を行う。いくつかの実施形態では、免疫原性を低下させるためにＣＡＲをヒト化する（ｈＣＡＲ）。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つまたはそれ以上の抗原間で共有する空間で構成されるエピトープを認識し得る。デクチン−１などのパターン認識受容体を使用して炭水化物抗原に対する特異性を導いてよい。ある実施形態では、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、及び／またはその抗原結合断片を含んでよい。いくつかの実施形態では、結合領域はｓｃＦｖである。別の実施形態では、ＣＡＲの結合領域において、受容体または細胞標的に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）を可能性として含める、またはｓｃＦｖ領域の代わりに用いてよい。したがって、いくつかの実施形態では、複数ｓｃＦｖ領域及び／または他の標的タンパク質をコードするベクター複数からＣＡＲを作製して良い。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原受容体（例えば、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメインに見られる短いアミノ酸配列であり、ある抗原に相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）であるため、その特定の抗原に対して自身の特異性を持った受容体を提供する。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。抗原受容体は典型的に２本のポリペプチド鎖で構成されるため、抗原と接触できる各抗原受容体には６つのＣＤＲがあり、すなわち重鎖及び軽鎖それぞれにＣＤＲが３つずつ含有されている。免疫グロブリン及びＴ細胞受容体の選択性に関連した配列変異の大半は、一般にＣＤＲにおいて見られるため、これらの領域は超可変ドメインと呼ばれることがある。これらの中でも、ＣＤＲ３はＶＪ（重鎖及びＴＣＲαβ鎖の場合はＶＤＪ）領域の組換えによりコードされるので最も大きな可変性を示す。
実施形態により作製されるＣＡＲコード核酸は、ヒト患者の細胞免疫療法を向上させるため、１つまたはそれ以上のヒト遺伝子または遺伝子断片を含んでよい。いくつかの実施形態では、完全長ＣＡＲ ｃＤＮＡまたはコード領域を本明細書に記載する方法を介して作製して良い。抗原結合領域または抗原結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１０９，３０４号に記載のような、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の断片を含んでよい。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト抗原特異的抗体の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ領域は、ヒト細胞で発現させるためにヒトコドン使用について最適化された配列によりコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。
ＣＡＲの抗原結合性ドメインの構成は、ダイアボディまたは多量体などの多量体であってよい。多量体は、軽鎖及び重鎖の可変部分をダイアボディと呼ばれるような形態に交差対形成（ｃｒｏｓｓ ｐａｉｒｉｎｇ）させることで形成できる。ＣＡＲのヒンジ部分は、実施形態によっては短縮または除外して良い（すなわち、抗原結合ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインのみを含むＣＡＲを作製する）。ヒンジの多重性を、例えば表１に示すような本願実施形態と共に使用してよい。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、第１のシステイン残基を維持して、またはプロリン残基またはセリン残基による置換で変異させて、または第１のシステイン残基までを切断されて有してよい。Ｆｃ部分をｓｃＦｖから欠失させて抗原結合性領域として使用し実施形態のＣＡＲを作製して良い。いくつかの実施形態では、抗原結合性領域は、Ｆｃドメインのうち１つ、例えば、ヒト免疫グロブリンのＣＨ２またはＣＨ３ドメインいずれかのみをコードして良い。また、２量体化及びオリゴマー化を改善するために修飾されたヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含めても良い。いくつかの実施形態では、ヒンジ部分は、８〜１４アミノ酸のペプチド（例えば、１２アミノ酸のペプチド）、ＣＤ８αの部分、またはＩｇＧ４のＦｃを含むかまたは構成要素として良い。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインを、ＣＤ８アルファなどのオリゴマー形成を促進するドメインを使用して細胞表面から吊して良い。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインを、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）クローン２Ｄ３が認識するドメインを使用して細胞表面から吊して良い（ｍＡｂクローン２Ｄ３は、例えば、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８に記載がある）。
ＣＡＲのエンドドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、ＣＡＲを含む免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化を生じさせるかまたは促進することができる。例えば、エンドドメインは、例えば、サイトカイン分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性といったＴ細胞のエフェクター機能を促進して良い。ナイーブ細胞、メモリー細胞、またはメモリーＴ細胞のエフェクター機能には、抗原依存性の増殖が含まれて良い。用語「ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（細胞内シグナル伝達ドメイン）」または「ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ（エンドドメイン）」とは、エフェクター機能シグナルの伝達及び／または特殊な機能を果たすよう細胞の誘導をできるＣＡＲの部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメイン全体をＣＡＲに含めて良いが、場合によっては、エンドドメインの切断部分を含めて良い。一般に、エンドドメインには、細胞内でエフェクター機能シグナルを伝達する能力を保持している切断型エンドドメインが含まれる。
いくつかの実施形態では、エンドドメインは、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖またはその任意のホモログ（例えば、エータ、デルタ、ガンマ、またはイプシロン）、ＭＢ１鎖、Ｂ２９、Ｆｃ ＲＩＩＩ、Ｆｃ ＲＩ、並びに、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＤＡＰ−１０、ＯＸ４０、及びその組み合わせのようなシグナル伝達分子の組み合わせ、並びに、同様の他の分子及び断片を含む。活性化タンパク質ファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分、例えばＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩを使用できる。これらの膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの代替え例は、例えば、Ｇｒｏｓｓ Ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ Ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｍｏｒｉｔｚ Ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｈｗｕ Ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｗｅｉｊｔｅｎｓ Ｅｔ ａｌ．（１９９６）、及びＨｅｋｅｌｅ Ｅｔ ａｌ．（１９９６）に見ることができ、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、エンドドメインは、ヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインを含んでよい。
抗原特異的細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインは、好ましくは膜貫通ドメインにより結合される。ＣＡＲに含まれ得る膜貫通ドメインには、例えば、ヒトＩｇＧ４のＦｃヒンジ及びＦｃ領域、ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン、膜貫通型ヒトＣＤ３ζドメイン、またはシステイン変異ヒトＣＤ３ζドメイン、または、例えばＣＤ１６とＣＤ８及びエリスロポエチン受容体といったヒト膜貫通型シグナル伝達タンパク質に由来する膜貫通ドメインが挙げられる。膜貫通ドメイン例を例えば表１に記載する。
いくつかの実施形態では、エンドドメインは、例えば、修飾ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、またはＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、若しくは４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激受容体といった共刺激受容体をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζにより開始された一次シグナル、ヒト共刺激受容体により発せられる追加シグナルをＣＡＲ内に含めて形質転換されたＴ細胞をさらに有効に活性化させて良く、これにより、生体内での持続性及び養子免疫療法の治療成功の改善につながり得る。表１に記載のように、エンドドメインまたは細胞内受容体シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３のゼータ鎖を単独で、または、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２、４−１ＢＢといったＦｃγＲＩＩＩ共刺激シグナル伝達ドメインと組み合わせて含んでよい。いくつかの実施形態では、エンドドメインは、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ−２Ｒベータ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２Ｒアルファ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、及びＣＤ４０のうち１つまたはそれ以上の一部または全部を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４またはそれ以上の細胞質ドメインをエンドドメインに含めて良い。例えば、いくつかのＣＡＲでは、少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインをともに融合させると、相加効果または相乗効果をもたらすことができることが観察されている。
いくつかの態様では、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含め、単離された核酸セグメント及び発現カセットを作製して良い。多種多様なベクターデータを使用して良い。いくつかの好ましい実施形態では、ベクターにより、ＣＡＲをコードするＤＮＡをＴ細胞などの免疫に送達することが可能になり得る。ＣＡＲ発現は、例えば、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、またはユビキチンプロモーターといった真核生物の調節されたプロモーターの制御下にあってよい。また、ベクターには、他に理由がない限り、インビトロでのその操作を容易にするために選択可能なマーカーを含有させて良い。いくつかの実施形態では、ＣＡＲを、ＤＮＡ鋳型から転写されたインビトロでのｍＲＮＡから発現させることができる。
キメラ抗原受容体分子は組換え型であり、それらが持つ抗原結合能及びそれらの細胞質尾部に存在する免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ’ｓ）を介した活性化シグナル伝達能により区別される。抗原結合性部分（例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）から作製）を用いた受容体構成体には「普遍的（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」であるというさらなる利点があり、標的細胞表面の天然抗原にＨＬＡ非依存的に結合できる。例えば、ｓｃＦｖ構成体を、ＣＤ３複合体のゼータ鎖（ζ）、Ｆｃ受容体ガンマ鎖、及びチロシンキナーゼｓｋｙの細胞内部分についてコードする配列に融合させて良い（Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｆｉｔｚｅｒ−Ａｔｔａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＣＴＬによる腫瘍の認識及び溶解など、誘導されたＴ細胞エフェクター機構についてマウス及びヒトのいくつかの抗原−ｓｃＦｖ：ζ系で記録されている（Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｂｒｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
抗原結合領域は、例えば、ヒト由来または非ヒト由来のｓｃＦｖであって良い。マウスのモノクローナル抗体などの非ヒト抗原結合領域の使用で考えられる問題として、ヒトエフェクター機能が低いこと、及び腫瘍塊への侵入能が低いことが挙げられる。さらに、非ヒトモノクローナル抗体は、ヒト宿主によって外来タンパク質として認識され得るため、こうした外来性抗体の反復注射により免疫応答誘導がもたらされ、有害な過敏反応を引き起こすことが考えられる。マウス系モノクローナル抗体では、この作用は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応と呼ばれている。いくつかの実施形態では、ヒト抗体またはｓｃＦｖ配列をＣＡＲに含めることにより、一部のマウス抗体に比してＨＡＭＡ反応をほとんど、または全く起こさないという結果になり得る。同様に、ヒト配列をＣＡＲに含めることにより、それを使用して、レシピエント内に存在する、ＨＬＡに基づいて合成抗原を認識し得る内在性Ｔ細胞による免疫介在性の認識または排除のリスクを低下させるかまたは回避し得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、ｃ）ヒンジ領域、及びｄ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン及び膜貫通ドメインはエンドドメインと共に単一ベクターによりコードされ、該単一ベクターは、ヒンジ領域をコードするベクター及び抗原結合領域をコードするベクターで（例えば、トランスポゾン指向相同組換えを介して）融合され得る。その他の実施形態では、細胞内のシグナル伝達領域及び膜貫通領域は、融合されている２つの別々のベクターによりコードされてよい（例えば、トランスポゾン指向相同組換えを介して）。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的部分は、抗原結合領域を含む細胞外ドメインとも言われ、腫瘍関連抗原を選択的に標的にする。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面に発現していればどの種類の抗原であってもよい。実施形態により作製されたＣＡＲが標的とし得る腫瘍関連抗原の例には、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、αフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、デクチン−１等が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的部分はｓｃＦｖである。腫瘍を標的とするｓｃＦｖの例を表１に記載する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲを膜結合型サイトカインと共発現させて、例えば、腫瘍関連抗原の量が少ない場合の持続性を改善して良い。例えば、ＣＡＲは、膜結合型ＩＬ−１５と共発現させることができる。
いくつかの実施形態では、細胞内の腫瘍関連抗原、例えば、ＨＡ−１、サバイビン、ＷＴ１、及びｐ５３などは、ＣＡＲで標的となり得る。これは、ＨＬＡにおいて、細胞内の腫瘍関連抗原から記述されたプロセシングされたペプチドを認識する、普遍的なＴ細胞に発現させたＣＡＲによって達成され得る。さらに、ＨＬＡにおいて、普遍的なＴ細胞に遺伝子組換えを行い、プロセシングされた細胞内腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞受容体ペアリング（ｐａｉｒｉｎｇ）を発現させて良い。
実施形態にしたがって使用するための標的抗原のさらなる例には、限定されることなく、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２癌胎児性抗原、αフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１の外被糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１の外被糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒα、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、ＧＰ２４０、ＣＤ−３３、ＣＤ−３８、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＥＡ、ＦＧＦＲ３、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、Ｆｎ１４、ＥＲＢＢ２またはＥＲＢＢ３５Ｔ４、ＭＵＣ−１、及びＥＧＦＲが挙げられる。ある特定の態様では、実施形態の選択されたＣＡＲは、配列番号１〜２の記載にあるような、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）のＣＤＲまたは抗原結合部分を含む。例えば、ＣＡＲは、ＶＬ ＣＤＲ１ ＲＳＳＱＮＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＤ（配列番号５）；ＶＬ ＣＤＲ２ ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号６）；ＶＬ ＣＤＲ３ ＦＱＹＳＨＶＰＷＴ（配列番号７）；ＶＨ ＣＤＲ１ ＮＹＹＩＹ（配列番号８）；ＶＨ ＣＤＲ２ ＧＩＮＰＴＳＧＧＳＮＦＮＥＫＦＫＴ（配列番号９）及びＶＨ ＣＤＲ３ ＱＧＬＷＦＤＳＤＧＲＧＦＤＦ（配列番号１０）を含むことができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７を参照にされたい。さらに特定の態様では、実施形態のＣＡＲは、配列番号３〜４の記載にあるような、セツキシマブのＣＤＲまたは抗原結合部分を含む。例えば、ＣＡＲは、ＶＬ ＣＤＲ１ ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号１１）；ＶＬ ＣＤＲ２ ＡＳＥＩＳ（配列番号１２）；ＶＬ ＣＤＲ３ ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ（配列番号１３）；ＶＨ ＣＤＲ１ ＮＹＧＶＨ（配列番号１４）；ＶＨ ＣＤＲ２ ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ（配列番号１５）及びＶＨ ＣＤＲ３ ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１６）を含むことができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際（ＰＣＴ）特許公開番号ＷＯ２０１２１００３４６を参照にされたい。
上記で考察したように、いくつかの態様では、選択されたＣＡＲは抗原に結合し、抗原に対するＫｄが約２ｎＭ〜約５００ｎＭであり、その場合、かかる選択されたＣＡＲを含むＴ細胞は、抗原を発現している標的細胞（例えば、癌細胞）に対し細胞傷害性を示す。例えば、いくつかの態様では、ＣＡＲは、抗原に対するＫｄが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０ｎＭまたはそれ以上であり、かかる選択されたＣＡＲを含むＴ細胞は、抗原を発現している標的細胞に対し細胞傷害性を示す。さらに別の態様では、ＣＡＲは、抗原に対するＫｄが約５ｎＭと、約４５０，４００，３５０、３００，２５０，２００，１５０，１００、または５０ｎＭとの間である。さらに別の態様では、ＣＡＲは、抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜５００ｎＭ、５ｎＭ〜２００ｎＭ、５ｎＭ〜１００ｎＭ、または５ｎＭ〜５０ｎＭであり、かかる選択されたＣＡＲを含むＴ細胞は、抗原を発現している標的細胞に対し細胞傷害性を示す。
いくつかの態様では、実施形態の選択されたＣＡＲは、ＣＡＲ分子１つあたり２つ、３つ、４つまたはそれ以上の抗原分子に結合することができ、かかる選択されたＣＡＲを含むＴ細胞は、抗原を発現している標的細胞（例えば、癌細胞）に対し細胞傷害性を示す。いくつかの態様では、選択されたＣＡＲの抗原結合ドメインの各々は、抗原に対するＫｄが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０ｎＭまたはそれ以上であり、かかる選択されたＣＡＲを含むＴ細胞は、抗原を発現している標的細胞に対し細胞傷害性を示す。さらに別の態様では、選択されたＣＡＲの抗原結合ドメインの各々は、抗原に対するＫｄが約５ｎＭと、約４５０，４００，３５０、３００，２５０，２００，１５０，１００、または５０ｎＭとの間であり、かかる選択されたＣＡＲを含むＴ細胞は、抗原を発現している標的細胞に対し細胞傷害性を示す。さらに別の態様では、選択されたＣＡＲの抗原結合ドメインの各々は、抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜５００ｎＭ、５ｎＭ〜２００ｎＭ、５ｎＭ〜１００ｎＭ、または５ｎＭ〜５０ｎＭであり、かかる選択されたＣＡＲを含むＴ細胞は、抗原を発現している標的細胞に対し細胞傷害性を示す。
ＣＡＲに認識される病原体は、本質的にどの種類の病原体であっても良いが、いくつかの実施形態では病原体は真菌、細菌、またはウイルスである。例示的なウイルス性病原体には、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＳＶ、ＨＨＶファミリーのウイルス、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、及びＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、ファミリーのものが挙げられる。例示的な病原性ウイルスは天然痘、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラ、及び風疹を引き起こす。例示的な病原の真菌類には、Ｃａｎｄｉｄａ， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ， Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ， Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ， Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、及びＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓが挙げられる。例示的な病原性細菌には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ， Ｓｈｉｇｅｌｌａ， Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ， Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ， Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ， Ｅ． ｃｏｌｉ， Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ， Ｃｈｌａｍｙｄｉａ， Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａが挙げられる。いくつかの実施形態では、病原体受容体デクチン−１を使用して、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの真菌類の細胞壁上の炭水化物構造を認識するＣＡＲが作製され得る。別の実施形態では、ウイルス性決定因子（例えば、ＣＭＶ及びエボラからの糖タンパク質）を認識する抗体に基づいてＣＡＲを作製して、ウイルス性の感染及び病理を阻止することができる。
いくつかの実施形態では、裸のＤＮＡまたはＣＡＲをコードする好適なベクターを、被検体のＴ細胞（例えば、癌または他の疾患に罹患したヒト患者から得られたＴ細胞）内に導入することができる。裸のＤＮＡを用いた電気穿孔法で安定的にＴ細胞にトランスフェクトする方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照されたい。裸のＤＮＡとは、一般に、発現用プラスミドベクター内に適切な発現方向で含まれる実施形態のキメラ受容体をコードするＤＮＡを指す。いくつかの実施形態では、裸のＤＮＡの使用により、ＣＡＲを発現しているＴ細胞を実施形態の方法で作製するのに要する時間が短縮され得る。
別法として、Ｔ細胞にキメラ構成体を導入するためにウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）を使用できる。一般に、被検体由来のＴ細胞へのトランスフェクトに使用される、ＣＡＲをコードするベクターは、一般に、被検体のＴ細胞内では非複製であるべきである。多数のウイルス系のベクターが知られており、その場合、細胞内に維持されるウイルスコピー数は、細胞の生存率を維持するのに十分少ない数である。実例となるベクターには、ｐＦＢ−ｎｅｏベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））並びに、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ、またはＢＰＶ系のベクターが含まれる。
トランスフェクトまたは形質導入されたＴ細胞が、所望のレベルで所望の制御性を備えた表面膜タンパク質としてＣＡＲを発現できることが確立されたら、キメラ受容体が宿主細胞で機能して所望のシグナルを誘導するかどうかを決定できる。続いて、被検体の抗腫瘍応答を活性化させるため、形質導入された細胞を被検体に再移入または投与する。投与しやすいよう、形質導入された細胞を、適切な、好ましくは薬理学的に許容される担体または希釈剤を用いて、生体内への投与に適切な医薬組成物またはインプラントに製造してよい。そのような組成物またはインプラントの製造手段は、当該技術分野で記載がある（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ， ｅｄ．（１９８０）を参照されたい）。適切な場合、ＣＡＲを発現している形質導入されたＴ細胞は、半固形または液体形態の調製物、例えばカプセル、溶液、注射、吸入、またはエアロゾルに、それぞれの投与経路にあった通常の方法で製剤化可能である。当技術分野で公知の手段を使用して、組成物が標的組織若しくは器官に達するまでは放出及び吸収を予防若しくは最小化する、または組成物の徐放性を確実にすることができる。一般に、キメラ受容体を発現している細胞の効力を失わせない薬理学的に許容される形態の使用が好ましい。したがって、形質導入された細胞を、ハンクスの平衡塩溶液のような平衡塩溶液または通常の生理食塩水を含有する医薬組成物にすることが望ましい。
ＩＶ．実施形態に関する方法及び組成物
特定の態様では、本明細書に記載する実施形態には、ｈＣＡＲをコードするＤＮＡ構成体を含有する発現ベクターをＴ細胞にトランスフェクトし、その後、任意選択で、抗原陽性細胞、組換え型抗原、または受容体に対する抗体で細胞を刺激して細胞を増幅させることを含む、抗原特異的誘導型Ｔ細胞の作製及び／または増幅方法が含まれる。
別の態様では、電気穿孔法、またはウイルスを用いない他の遺伝子導入法（非限定的に音響穿孔法など）により、裸のＤＮＡを用いてＴ細胞に安定的にトランスフェクト及び誘導を行う方法を提供する。ほとんどの研究者は、Ｔ細胞に異種遺伝子を運ぶためにウイルスベクターを使用してきた。裸のＤＮＡの使用により、誘導型Ｔ細胞の作製に要する時間を短縮できる。「Ｎａｋｅｄ ＤＮＡ（裸のＤＮＡ）」とは、発現カセットまたはベクター内に適切な発現方向で含有されたキメラＴ細胞受容体（ｃＴＣＲ）をコードするＤＮＡを意味する。実施形態の電気穿孔法では、表面にキメラＴＣＲ（ｃＴＣＲ）を発現し担持する安定なトランスフェクタントを作製する。
特定の態様では、Ｔ細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、Ｇ−ＣＳＦで刺激後に採取したＰＢＭＣ、骨髄、または臍帯血に由来するＴ細胞のような初代ヒトＴ細胞である。条件は、ｍＲＮＡ及びＤＮＡ及び電気穿孔法の使用を含む。トランスフェクション後、細胞を直ちに注入しても、または保存しても良い。特定の態様では、トランスフェクション後、細胞に遺伝子を導入してから約１、２、３、４、５日またはそれ以上の日数以内に細胞をバルク集団としてエキソビボで数日、数週間、または数か月増殖させてよい。さらなる態様では、トランスフェクション後、トランスフェクタントをクローニングし、組み込まれた、またはエピソームに維持された発現カセット若しくはプラスミドが１つ存在し、キメラ受容体が発現しているクローンをエキソビボで増幅させる。増幅用に選択されたクローンは、ＣＤ１９を発現している標的細胞を、特異的に認識し溶解させる能力を示す。組換え型Ｔ細胞をＩＬ−２、または一般的なガンマ鎖（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１など）を結合する他のサイトカインで刺激して増幅させて良い。組換え型Ｔ細胞を人工抗原提示細胞で刺激して増幅させて良い。組換え型Ｔ細胞を、人工抗原提示細胞上で、または、Ｔ細胞表面のＣＤ３と架橋するＯＫＴ３のような抗体を用いて増幅させて良い。組換え型Ｔ細胞のサブセットは、人工抗原提示細胞上で、またはＴ細胞表面のＣＤ５２を結合するＣａｍｐａｔｈのような抗体を用いて欠失させて良い。さらなる態様では、遺伝子が組換えられた細胞を凍結保存して良い。
注入後のＴ細胞増殖（生存）は、（ｉ）ＣＡＲに対して特異的なプライマーを使用したｑ−ＰＣＲ、（ｉｉ）ＣＡＲに対して特異的な抗体を使用したフローサイトメトリー、及び／または（ｉｉｉ）可溶性ＴＡＡにより評価されうる。
本明細書に記載の実施形態は、Ｂ細胞を含むＢ細胞性悪性腫瘍または障害を標的にすることにも関し、誘導型免疫Ｔ細胞を使用してＣＤ１９特異的細胞表面エピトープを用いる。Ｂ細胞はＴ細胞に免疫刺激抗原を提示する細胞として機能し得ることから、悪性Ｂ細胞は誘導型Ｔ細胞の優れた標的である。ヒトまたをヒト化ＣＡＲを担持するドナー由来ＣＤ１９特異的Ｔ細胞を用いた養子療法の抗腫瘍活性を支持する前臨床研究には、（ｉ）ＣＤ１９＋標的殺滅の誘導、（ｉｉ）ＣＤ１９＋標的／刺激細胞とのインキュベーション後のサイトカインの分泌／発現の誘導、及び（ｉｉｉ）ＣＤ１９＋標的／刺激細胞とのインキュベーション後の持続的増幅が含まれる。
ある実施形態では、ＣＡＲ細胞を、それを必要とする固体、例えば癌または感染症に罹患している固体に送達する。その後、細胞は、固体の免疫系を高め癌または病原性のそれぞれの細胞を攻撃する。場合によっては、固体は１またはそれ以上の用量の抗原特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を与えられる。固体に２またはそれ以上の用量の抗原特異的ＣＡＲ Ｔ細胞が与えられる場合、次の投与までの期間を十分に設けて固体における増殖を可能にするべきであり、具体的な実施形態では、投与間隔をｌ、２、３、４、５、６、７日、またはそれ以上の日数あけるべきである。
キメラ抗原受容体と機能を欠くＴＣＲの双方を含めるために修飾する同種Ｔ細胞の供給源はどの種類であってもよいが、具体的な実施形態では、細胞を、例えば、臍帯血バンク、末梢血バンク、ヒト胚幹細胞バンク、または人工多能性幹細胞バンクから入手する。治療効果がある好適用量は、例えば、１回あたり少なくとも１０５または約１０５〜約１０１０細胞を、好ましくは一連の投与サイクルで行うものと考えられる。例示的な投与レジメンは、１サイクルを１週間をとする４サイクルの用量漸増投与であり、第０日に少なくとも約１０５細胞で開始し、例えば固体内用量漸増スキーム開始の数週間で目標用量の約１０１０細胞まで徐々に増量する。好適な投与方法には、静脈内注射、皮下注射、腔内（例えばリザーバアクセスデバイス）注射、腹腔内注射、及び腫瘍塊への直接注射が挙げられる。
実施形態の医薬組成物は、単独で、または癌治療に有用な十分に確立された他の薬剤と組み合わせて使用できる。実施形態の医薬組成物は、単独で送達しても、または他の薬剤と組み合わせて送達しても、さまざまな経路を介して哺乳類、特にヒトの身体のさまざまな部位へ送達されて特定の効果を達成可能である。投与には１つ以上の経路を使用できるが、特定の経路により、別の経路よりも速やかで有効な反応が得られ得ることを当業者は認識するであろう。
実施形態の組成物は、各投与単位、例えば注射が、所定量の組成物を含有する単位剤形にして単独または他の活性剤との適切な組み合わせで提供され得る。単位剤形という用語は本発明で使用する場合、ヒト及び動物被検体への単位用量として好適な物理的な個別単位を指し、各単位に、所定量の実施形態組成物が単独または他の活性剤と組み合わせて、所望の効果を得るために十分な計算された量で、適切とされる場合に薬理学的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルと共に含有されるものを指す。実施形態の新規な単位剤形の仕様は、特定の被検体における医薬組成物に関連した特定の薬力学に依存する。
望ましくは、長期の特異的抗腫瘍応答が確立され、かかる処置を行わなかった場合よりも腫瘍サイズを縮小させるかまたは腫瘍の増殖若しくは再増殖を排除するよう、有効量または十分な数の単離された形質導入Ｔ細胞を組成物内に存在させ、被検体に導入する。望ましくは、被検体に再移入された形質導入Ｔ細胞の量は、同じ条件で形質導入Ｔ細胞を存在させない場合と比較し、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％の腫瘍サイズ低下をもたらす。
したがって、投与される形質導入Ｔ細胞の量には、投与経路を考慮するべきであり、所望の治療応答を達成するため十分な数の形質導入Ｔ細胞が導入されるようにするべきである。さらに、本明細書に記載の組成物に含まれる各活性剤の量（例えば、接触対象細胞あたりの量または特定の体重あたりの量）は各種用途により異なり得る。一般に、形質導入Ｔ細胞の濃度は、望ましくは、少なくとも約１×１０６〜約１×１０９の形質導入Ｔ細胞、よりさらに望ましくは、約１×１０７〜約５×１０８の形質導入Ｔ細胞を治療される被検体に提供するのに十分な濃度であるべきであるが、上回る量、例えば５×１０８細胞より多い量でも、または下回る量、例えば１×１０７細胞未満でも、任意の好適な量の使用が可能である。投与スケジュールは、十分に確立された細胞ベースの治療に基づき得るが（例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８７年）；米国特許第４，６９０，９１５号を参照されたい）、または代替的な持続注入法を使用できる。
これらの値は、実施形態の方法を最適化する上で医師が利用する形質導入Ｔ細胞の範囲についての一般的指標を提供する。本明細書におけるそのような範囲の引用は、特定の用途において妥当である場合があるため、それより多い量または少ない量の成分の使用を何ら除外するものではない。例えば、実際の用量及びスケジュールは、組成物を他の医薬組成物と組み合わせて投与するかどうかによって、またはＣＡＲを発現している細胞の個体差（例えば、標的抗原に対するＣＡＲ結合親和性）に応じて異なり得る。当業者は、特定の状況の要件に従い、必要ないかなる調整でも容易に行うことができる。
Ｖ．抗原提示細胞
いくつかの場合には、ＡＰＣは、ＣＡＲを用いる治療組成物及び細胞療法製品の調製に有用である。実施形態にしたがって使用するためのＡＰＣには、樹状細胞、マクロファージ及び人工抗原提示細胞が挙げられるがこれらに限定されない。抗原提示系の調製及び使用に関する一般指針については、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、６，３５５，４７９号、６，３６２，００１号及び６，７９０，６６２号；米国特許出願公開第２００９／００１７０００号及び２００９／０００４１４２号、かつ国際公開公報番号ＷＯ２００７／１０３００９を参照されたい）。
ＡＰＣを使用してＣＡＲを発現しているＴ細胞を増殖させて良い。腫瘍抗原との遭遇の間、抗原提示細胞からＴ細胞に送られたシグナルは、Ｔ細胞プログラミング及び以降の細胞の治療有効性に影響し得る。これに刺激を受け、Ｔ細胞に与えられるシグナルに対する至適なコントロールを可能にする、人工抗原提示細胞開発への取組みがなされた（Ｔｕｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。対象とする抗体または抗原に加え、ＡＰＣ系に少なくとも１つの外来性補助分子も含めてよい。補助分子の好適な数及び組み合わせは、どのようなものを使用しても良い。補助分子は、共刺激分子及び接着分子などの補助分子から選択され得る。例示的な共刺激分子には、ＣＤ７０及びＢ７．１（Ｂ７またはＣＤ８０とも呼ばれる）が挙げられ、Ｔ細胞表面のＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ−４分子に結合し、これにより、例えば、Ｔ細胞増幅、Ｔｈ１分化、短期Ｔ細胞生存、及びインターロイキン（ＩＬ）−２などのサイトカイン分泌に影響を与え得る（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４を参照にされたい）。接着分子には、例えば、細胞と細胞または細胞とマトリックスの接触を促進する、セレクチンなどの炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンなど膜貫通結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、及び細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの１回膜貫通型免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質が挙げられる。例示的な接着分子には、ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１などのＩＣＡＭが挙げられる。共刺激分子及び接着分子などの例示的な補助分子の選択、クローニング、調製、及び発現に有用な技術、方法、及び試薬は、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、６，３５５，４７９号、及び６，３６２，００１号に例示されている。
ａＡＰＣにするべく選択される細胞は、好ましくは、細胞内の抗原処理、細胞内のペプチド輸送、及び／または細胞内のＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子−ペプチド負荷を欠損している、または変温性である（すなわち、温度変化に対する感受性が哺乳類の細胞株より低い）、または欠損及び変温の両特性を有する。好ましくは、ａＡＰＣにするべく選択される細胞は、少なくとも１つの対応する内在性細胞（例えば、内在性のＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子及び／または上記のような内在性補助分子）を、細胞内に導入される外因性のＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子及び補助分子成分に発現させる能力も欠失している。さらに、ａＡＰＣは、好ましくは、ａＡＰＣ作製のための修飾を行う前に細胞が獲得していた欠損及び変温特性を保持している。例示的なａＡＰＣは、昆虫細胞株のような抗原処理関連トランスポーター（ＴＡＰ）を欠損している細胞株から構成されるかまたは由来する。例示的な変温昆虫細胞株は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞株のようなショウジョウバエ細胞株（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｊ．ｍ １９７２）である。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞の調製、増殖、及び培養の実例となる方法は、米国特許第６，２２５，０４２号、６，３５５，４７９号、及び６，３６２，００１号に記載がある。
ＡＰＣは、凍結−解凍サイクルに供してよい。例えば、ＡＰＣは、急速に凍結が起きるよう、好適なＡＰＣ含有容器を適切量の液体窒素、固体二酸化炭素（ドライアイス）、または類似の低温物質と接触させることにより凍結させて良い。その後、ＡＰＣを低温物質から外して環境室温条件に曝露するか、または微温の水浴若しくは温かい手で温める方法で解凍時間の短縮を促す解凍しやすい方法のいずれかで凍結ＡＰＣを解凍する。さらに、ＡＰＣは、凍結して長期間保存して後で解凍して良い。凍結ＡＰＣは、解凍した後、その後の使用のために凍結乾燥しても良い。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び他の防腐剤のように凍結−解凍手順に有害な影響を与える可能性のある防腐剤は、凍結−解凍サイクルを受けるＡＰＣ含有培地から有利に除かれ得るか、または、例えば本質的にそのような防腐剤を欠いている培地にＡＰＣを移して、本質的に除去される。
その他の実施形態では、異種核酸及びａＡＰＣ内在性核酸を架橋により不活性化し、不活性化後は細胞の増殖、核酸の複製または発現が本質的に起こらないようにして良い。例えば、ａＡＰＣを、外因性ＭＨＣ及び補助分子の発現、そのような分子のａＡＰＣ表面上での提示、及び提示されたＭＨＣ分子の選択されたペプチド（類）での負荷に続く時点で不活性化して良い。したがって、そのような不活性化され選択されたペプチドを負荷したａＡＰＣは、本質的に増幅または複製不能となり、選択されたペプチドの提示機能を保持して良い。架橋により、実質的にａＡＰＣの抗原提示細胞機能を損なうことなく、細菌及びウイルスなどの汚染微生物が本質的にないａＡＰＣを得ることができる。したがって、架橋を使用して、ａＡＰＣの重要ＡＰＣ機能を維持し、一方で、ａＡＰＣを使用して作製された細胞療法製品の安全性に関する懸念を解消する一助とすることができる。架橋及びａＡＰＣに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９００１７０００号を参照にされたい。
ＶＩ．キット
本明細書に記載の組成物はいずれもキットに含まれて良い。いくつかの実施形態では、同種ＣＡＲ Ｔ細胞はキットで提供され、このキットには、細胞を増幅させるために好適な試薬、培地、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ）、成長因子、抗体（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の選別または特徴付けのため）及び／またはＣＡＲ若しくはトランスポザーゼをコードするプラスミドも含まれ得る。
非限定的な例には、キメラ受容体発現構成体、キメラ受容体発現構成体を作製するための１つまたはそれ以上の試薬、発現構成体のトランスフェクション用の細胞、及び／または発現構成体のトランスフェクション用同種細胞を得るための１つ若しくはそれ以上の器具（そのような器具は、シリンジ、ピペット、鉗子、及び／またはそのような医療用に承認された任意の装置）がある。
いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲα／βの発現を排除するための発現構成体、かかる構成体を作製するための１つまたはそれ以上の試薬、及び／またはＣＡＲ＋Ｔ細胞がキット内に提供される。いくつかの実施形態では、そこに、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（複数可）をコードする発現構成体が含まれる。
いくつかの態様では、キットは、細胞の電気穿孔用の試薬または器具類を含む。
キットは、１つ若しくはそれ以上の好適に分注された実施形態組成物または実施形態組成物を作製するための試薬を含んでよい。キットの構成要素は、水性媒体中に包装するかまたは凍結乾燥形態にして包装してよい。キットの容器手段には、少なくとも１個のバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、または他の容器手段が含まれて良く、その中に一成分を置き、好ましくは、好適に分注して良い。キット内に１つ以上の成分がある場合、キットには一般に、第２、第３、またはさらなる他の容器も含まれることになるので、その中にさらなる成分を別々に置いて良い。しかし、さまざまな組み合わせの成分がバイアルに含まれて良い。実施形態のキットには、典型的には、キメラ受容体構成体を収容する手段及び市販用の他の任意の密閉（ｃｌｏｓｅ ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）試薬容器が含まれることになる。そのような容器には、例えば、中に所望のバイアルを保持する射出成形またはブロー成形したプラスチック製容器が含まれ得る。
ＶＩＩ．実施例
以下の具体的及び非限定的な実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、本願開示を何ら制限するものではない。さらなる詳述がなくても、当業者は、本明細書の記載に基づいて本願開示を最大限に利用できると考えられる。本明細書で引用したすべての刊行物は参照することにより本明細書にその全体が組み込まれる。ＵＲＬまたはそのような他の識別子若しくはアドレスに言及する場合、そのような識別子は変更されることがあり、またインターネット上の特定の情報は入れ替わることがあるが、インターネットで検索すれば同等情報を見出すことができることが理解される。それら言及することは、そのような情報が入手可能であり、公に普及していることを証明する。
実施例１−材料及び方法
プラスミド
セツキシマブ由来ＣＡＲトランスポゾン。セツキシマブ由来のＣＡＲは以下のとおり構成される：ヒトＧＭＣＳＦＲ２シグナルペプチド由来シグナルペプチド（アミノ酸１〜２２；ＮＰ＿７５８４５２．１）、セツキシマブの可変軽鎖（ＰＤＢ：１ＹＹ９＿Ｃ）ｗｈｉｔｌｏｗリンカー（ＡＡＥ３７７８０．１）、セツキシマブの可変重鎖（ＰＤＢ：１ＹＹ９＿Ｄ）、ヒトＩｇＧ４（アミノ酸１６１〜３８９、ＡＡＧ００９１２．１）、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメイン（アミノ酸１５３〜２２０、ＮＰ＿００６１３０）、及びヒトＣＤ３−ζ細胞内ドメイン（アミノ酸５２から１６４まで、ＮＰ＿９３２１７０．１）。ＧＭＣＳＦＲ２の配列、可変軽鎖、ｗｈｉｔｌｏｗリンカー、可変重鎖及び部分的ＩｇＧ４をＧｅｎｅＡＲＴ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によりヒトコドンに最適化して０７００３１０／ｐＭＫとして作製した。これまでに記載のある、ヒト伸長因子１−アルファ（ＨＥＦ１α）プロモーターの制御下のＣＤ１９ＣＤ２８ｍＺ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯをＳＢトランスポゾンの骨格として選択した。０７００３１０／ｐＭＫ及びこれまでに記載のあるＣＤ１９ＣＤ２８ｍＺ／ｐＳＢＳＯ（９３、９４）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｍｎＩで二重消化させた。アガロースゲル電気泳動によりＣＡＲインサート及びトランスポゾン骨格をそれぞれ、１．３ｋｂ及び５．２ｋｂのＤＮＡ断片として同定し、その際、０．８％アガロースゲル中を１５０ボルトで４５分間移動させ、臭化エチジウムで染色して紫外光曝露下で視覚化させて行った。バンドを切断して精製し（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット、Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）、その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を使用してインサートと骨格のモル比３：１でライゲーションを行った。化学的にコンピテントな細菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ニューヨーク州グランドアイランド）に熱ショック形質転換を行い、カナマイシン含有寒天プレートで３７℃にて１２〜１６時間培養して選抜を行い、トランスポゾン骨格に陽性の細菌クローンを同定した。６個のクローンを選択し、選抜用カナマイシン含有ＴＢ培地で３７℃、８時間のｍｉｎｉ−ｃｕｌｔｕｒｅに供した。ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）でｍｉｎｉ−ｃｕｌｔｕｒｅからＤＮＡを調製し、その後、分析用に制限酵素で消化させ、アガロースゲル電気泳動で断片サイズを分析し、ＣｅｔｕｘＣＤ２８ｍＺ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯに陽性のクローンを同定した（図３３Ａ）。陽性クローンを選抜用抗生物質カナマイシンを含むＴＢ培地の大型培養に１：１０００で植菌し、振盪器で対数期の増殖が達成されるまで３７℃、１６時間培養した。ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細菌からＤＮＡを単離した。ＤＮＡの分光光度分析によりＯＤ２６０／２８０読取り値１．８〜２．０が確認された。
Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）由来ＣＡＲトランスポゾン。Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）由来のＣＡＲは以下のとおり構成される：ヒトＧＭＣＳＦＲ２シグナルペプチド由来シグナルペプチド（アミノ酸１〜１９、ＮＰ＿００１１５５００３．１）、ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）の可変軽鎖（ＰＤＢ：３ＧＫＷ＿Ｌ）ｗｈｉｔｌｏｗリンカー（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＥ３７７８０．１）、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）の可変重鎖（ＰＤＢ：３ＧＫＷ＿Ｈ）、ヒトＩｇＧ４（アミノ酸１６１〜３８９、ＡＡＧ００９１２．１）、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメイン（アミノ酸１５３〜２２０、ＮＰ＿００６１３０）、及びヒトＣＤ３−ζ細胞内ドメイン（アミノ酸５２から１６４まで、ＮＰ＿９３２１７０．１）。ＧＭＣＳＦＲ２の配列、可変軽鎖、ｗｈｉｔｌｏｗリンカー、可変重鎖及び部分的ＩｇＧ４をＧｅｎｅＡＲＴによりヒトコドンに最適化し、０８４１５０３／ｐＭＫとして作製した。０８５４１５０３／ｐＭＫ及びこれまでに記載のあるＣＤ１９ＣＤ２８ｍＺ／ｐＳＢＳＯ（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｍｎＩで二重消化させ、ライゲーション、形質転換、大規模増幅及びプラスミドＮｉｍｏＣＤ２８ｍＺ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯ（図３３Ｂ）の精製を上記のように実施した。
ＳＢ１１トランスポザーゼ。ＣＭＶプロモーター（Ｋａｎ−ＣＭＶ−ＳＢ１１）制御下の高活性ＳＢ１１トランスポザーゼをこれまでの記載にあるように（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）使用した。
ｐＧＥＭ／ＧＦＰ／Ａ６４。後に６４のＡ−Ｔ塩基対及びＳｐｅＩ部位が続くＴ７プロモーター制御下ＧＦＰを使用してＧＦＰ ＲＮＡのインビトロ転写を行った。ｐＧＥＭ／ＧＦＰ／Ａ６４のクローニングはこれまでに記載がある（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
セツキシマブ由来のＣＡＲ／ｐＧＥＭ−Ａ６４。セツキシマブ由来のＣＡＲを、ＣｅｔｕｘＣＤ２８ｍＺ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯ及びＣＤ１９ＣＤ２８ｍＺ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯ−ＭＣＳをＮｈｅＩ及びＸｍｎＩで二重消化させることにより、中間ベクターであるｐＳＢＳＯ−ＭＣＳにクローニングした。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲインサート及びｐＳＢＳＯ−ＭＣＳ骨格を、電気泳動後アガロースゲルから抽出し、ＣｅｔｕｘＣＤ２８ｍＺ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯ作製時の記載にあるようにライゲーション、形質転換、及び大規模増幅を行って単離した。ＣｅｔｕｘＣＤ２８ｍＺ（ＣｏＯｐ）をｐＧＥＭ／ＧＦＰ／Ａ６４プラスミドにクローニングし、６４ヌクレオチド長の人工ポリＡテールを有するＲＮＡのインビトロ転写のためにＣｅｔｕｘ−ＣＡＲをＴ７プロモーターの制御下に置いた。ＣｅｔｕｘＣＤ２８ｍＺ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯ−ＭＣＳをＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＶを用いて３７℃で消化させ、ｐＧＥＭ／ＧＦＰ／Ａ６４をＸｂａＩで３７℃にて、次いでＳｍａＩで２５℃にて順次消化させた。消化を受けたＣｅｔｕｘ−ＣＡＲインサート及びｐＧＥＭ／Ａ６４骨格を、０．８％アガロースゲル中を１５０ボルトで４５分間移動させる電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色及びＵＶ光曝露により視覚化した。断片をゲルから切断してＱｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製してから、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてインサートとベクターのモル比３：１にてライゲーションを行い、１６℃で一晩インキュベートした。化学的にコンピテントな細菌Ｄａｍ−／−Ｃ２９２５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を熱ショックにより形質転換し、ｐＧＥＭ／Ａ６４骨格を含有するクローンを選択するためにアンピシリン含有寒天上で３７℃にて一晩培養した。小規模ＤＮＡ増幅用に８個のクローンを選択した、選抜用抗生物質アンピシリンを含むＴＢ培地に植菌し、振盪器で３７℃にて８時間培養した。ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡの精製を実施し、分析用に制限酵素で消化させてから電気泳動を行い、ライゲーション産物ＣｅｔｕｘＣＤ２８ｍＺ／ｐＧＥＭ−Ａ６４（図３３Ｃ）が正確に発現されているクローンを決定した。陽性クローンを選択し、アンピシリン含有ＴＢに１：１０００で植菌した。３７℃で１８時間培養した後、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを精製した。分光測光法により、ＯＤ２６０／２８０比が１．８〜２．０の高品質ＤＮＡが確認された。
Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）由来のＣＡＲ／ｐＧＥＭ−Ａ６４。
ＮｉｍｏＣＤ２８ｍＺ（ＣｏＯｐ）／ｐＳＢＳＯをＮｈｅＩで３７℃にて、またＳｆｉＩで５０℃にて順次消化させ、ｐＧＥＭ／ＧＦＰ／Ａ６４をＸｂａＩで３７℃にて、またＳｆｉＩで５０℃にて順次消化させた。ＮｉｍｏＣＤ２８ｍＺ（ＣｏＯｐ）をｐＧＥＭ／ＧＦＰ／Ａ６４プラスミドにクローニングし、６４ヌクレオチド長の人工ポリＡテールを有するＲＮＡのインビトロ転写のためにＮｉｍｏ−ＣＡＲをＴ７プロモーターの制御下に置いた。消化されたＮｉｍｏ−ＣＡＲインサート及びｐＧＥＭ／Ａ６４骨格を、０．８％アガロースゲル中を１５０ボルトで４５分間移動させる電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色及びＵＶ光曝露により視覚化した。断片をゲルから切断して、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてインサートとベクターのモル比３：１にてライゲーションを行い、１６℃で一晩インキュベートした。化学的にコンピテントな細菌Ｄａｍ−／−Ｃ２９２５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を熱ショックにより形質転換し、ｐＧＥＭ／Ａ６４骨格を含有するクローンを選択するためにアンピシリン含有寒天上で３７℃にて一晩培養した。小規模ＤＮＡ増幅用に８個のクローンを選択した、選抜用抗生物質アンピシリンを含むＴＢ培地に植菌し、振盪器で３７℃にて８時間培養した。ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡの精製を実施し、分析用に制限酵素で消化させてから電気泳動を行い、ライゲーション産物ＮｉｍｏＣＤ２８ｍＺ／ｐＧＥＭ−Ａ６４（図３３Ｄ）が正確に発現されているクローンを決定した。陽性クローンを選択し、アンピシリン含有ＴＢに１：１０００で植菌した。３７℃で１８時間培養した後、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを精製した。分光測光法により、ＯＤ２６０／２８０比が１．８〜２．０の高品質ＤＮＡが確認された。
切断型ＥＧＦＲトランスポゾン。自己分解型ペプチド配列Ｆ２Ａを介してネオマイシン耐性用遺伝子に連結して、切断型ＥＧＦＲをＳＢトランスポゾンにクローニングした。細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインのみを含有する、コドンが最適化されたヒトＥＧＦＲ（アクセッションＮＰ＿００５２１９．２）の切断型０９０９３１２ ＥｒｂＢ１／ｐＭＫ−ＲＱをＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）により合成した。ＥｒｂＢ１／ｐＭＫ−ＲＱをＮｈｅＩ及びＳｍａＩで３７℃にて消化させ、また、ｔＣＤ１９−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ／ｐＳＢＳＯは、ＮｈｅＩで３７℃にて消化させた後、精製工程を間にはさんでＮｒｕＩで３７℃にて順次消化させた（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット、Ｑｉａｇｅｎ）。ｔＥＧＦＲインサート及びＦ２Ａ−Ｎｅｏ／ｐＳＢＳＯ骨格を、０．８％アガロースゲル、１５０ボルト、４５分間移動のゲル電気泳動により分離した。予測サイズのバンドを単離し（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット、Ｑｉａｇｅｎ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて一晩１６℃にてライゲーションを行った。化学的にコンピテントな細胞ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をライゲーション産物を用いて熱ショックで形質転換させ、カナマイシン含有寒天上で一晩培養した。カナマイシン含有ＴＢでの８時間培養による小規模ＤＮＡ増幅用に５個のクローンを植菌した。Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）でＤＮＡを精製し、次いで分析用制限酵素で消化させることにより、ｔＥｒｂＢ１−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ／ｐＳＢＳＯに陽性のクローンを同定した（図３３Ｅ）。陽性クローンを大規模ＤＮＡ増幅用に１：１０００で培養に植菌し、振盪器で３７℃にて１６時間培養した。ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して対数期の増殖にある細菌からのＤＮＡを精製し、分光測光法でＯＤ２６０／２８０読取り値１．８〜２．０のＤＮＡ純度を確認した。
ＣＡＲ−Ｌトランスポゾン。これまでに記載のある２Ｄ３ハイブリドーマ（９４）を使用してＣＡＲ−ＬのｓｃＦｖ配列を導いた。手短に言えば、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により製造者の指示にしたがってＲＮＡをハイブリドーマから抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による逆転写でｃＤＮＡライブラリーを作製した。ＦＲ１領域についての縮重プライマーを使用したＰＣＲでマウスの可変重鎖及び可変軽鎖を増幅させ、次いで、それらをＴＯＰＯ ＴＡベクター内にライゲーションさせた。ＣＡＲ−Ｌを、コドンが最適化された配列として以下のとおり構築した。ヒトＧＭＣＳＦＲシグナルペプチド（アミノ酸１〜２２；ＮＰ＿７５８４５２．１）の後に、２Ｄ３由来ｓｃＦｖをヒトＣＤ８α細胞外ドメイン（アミノ酸１３６〜１８２；ＮＰ＿００１７５９．３）に融合させ、ヒトＣＤ２８（アミノ酸５６〜１２３；ＮＰ＿００１２３０００６．１）の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを配し、ヒトＣＤ３ζ細胞内ドメイン（アミノ酸．４８〜１６３；ＮＰ＿０００７２５．１）で終結させた。ＣＡＲ−Ｌタンパク質をＧｅｎｅＡｒｔで合成し、その後、切断して自己−切断可能な２Ａペプチドをゼオマイシン（ｚｅｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子に融合させてＳＢトランスポゾン内にライゲーションさせ、ＣＡＲ−ｌ−２Ａ−Ｚｅｏとした（図３３Ｆ）（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
細胞株：増殖及び修飾
すべての細胞株は、特に断りのない限り、１０％熱非働化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ−１００（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した完全培地ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）に５％ＣＯ２、湿度９５％及び３７℃に維持された。接着細胞株を通常の方法で７０〜８０％コンフルエントな状態まで培養し、その後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で剥離させてから１：１０で継代する。ＡｍｐＦ＿ＳＴＲ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２２２８８）を製造者の指示にしたがって使用し、ＳＴＲ ＤＮＡ指紋法で細胞株の同一性を確認した。ＳＴＲプロファイルを、公知のＡＴＣＣ指紋（ＡＴＣＣ．ｏｒｇ）、及びＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎデータベース（ＣＬＩＭＡ）バージョン０．１．２００８０８（ワールドワイドウェブｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｉｓｔｇｅ．ｉｔ／ｃｌｉｍａ／）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ３７：Ｄ９２５−Ｄ９３２ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２６８６５２６）と比較した。ＳＴＲプロファイルは、公知のＤＮＡ指紋と一致した。
ＯＫＴ３搭載Ｋ５６２クローン４。Ｋ５６２クローン４は、ペンシルバニア大学Ｍ．Ｄ．であるＣａｒｌ Ｊｕｎｅ氏から贈与されたものであり、先に記載がある（Ｓｕｈｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｐａｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）。クローン４は、ｔＣＤ１９、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ６４及びＩＬ１５−ＧＦＰ融合膜タンパク質を発現させるために修飾され、ＰＡＣＴ下の前臨床研究及び臨床研究用のワーキングセルバンクとして製造されている。Ｋ５６２クローン４は、ＣＤ６４高親和性Ｆｃ受容体への結合により、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を発現するよう作成可能である。ＯＫＴ３をＫ５６２クローン４に搭載するため、Ｘ−ＶＩＶＯ無血清培地（Ｌｏｎｚａ、ドイツ、ケルン）に１×２０％ Ｎ−アセチルシステインを１ｘ１０６細胞／ｍＬの密度で加え、細胞を一晩培養した。この工程によりＦｃ受容体がきれいになり、ＯＫＴ３を至適に結合できる。翌日、細胞を洗浄し、１×２０％ Ｎ−アセチルシステインを加えたＸ−ＶＩＶＯ培地に１ｘ１０６細胞／ｍＬで再懸濁させ、１００Ｇｙで照射した。細胞を洗浄してＰＢＳに１ｘ１０６細胞／ｍＬで再懸濁させＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を濃度１ｍｇ／ｍＬで加え、ローラー上で４℃にて３０分間インキュベートした。細胞を再洗浄して染色し、共刺激分子及びＯＫＴ３の発現をフローサイトメトリーにより確認し、凍結保存した。
ｔＥＧＦＲ＋Ｋ５６２クローン２７。Ｋ５６２クローン２７はＫ５６２クローン９由来であり、ペンシルバニア大学Ｍ．Ｄ．であるＣａｒｌ Ｊｕｎｅ氏から贈与された。これまでに記載があるように（Ｓｕｈｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｐａｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）Ｋ５６２クローン９をレンチウイルスで形質導入し、ｔＣＤ１９、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、及びＣＤ６４を発現させた。クローン２７は、膜に繋留（ｔｅｔｈｅｒ）されたＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質（Ｈｕｒｔｏｎ， Ｌ． Ｖ．、２０１４）を安定的に発現させるため、クローン９をＳＢトランスフェクションを介して修飾し、限界希釈法でクローニングされたものであり、フローサイトメトリーによりすべての導入遺伝子の発現が確認された。Ｋ５６２クローン２７を、切断型ＥＧＦＲを発現するよう、ｔＥｒｂＢ１−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ／ｐＳＢＳＯのＳＢトランスフェクションにより修飾した。ＥＧＦＲを発現しているＫ５６２クローン２７を、ＰＥ標識したＥＧＦＲ特異的抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド、カタログ番号５５５９９７）及び抗ＰＥビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）と共にインキュベートし、その後、磁性カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に流し非標識細胞から分離した。磁気で選択した後、ＥＧＦＲ高発現を維持するため、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）の存在下でｔＥＧＦＲ＋Ｋ５６２クローン２７を培養した。
ＥＬ４、ＣＤ１９＋ＥＬ４、ｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４、及びＣＡＲ−Ｌ＋ＥＬ４。ＥＬ４をＡＴＣＣから入手し、ｔＣＤ１９−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ、ｔＥＧＦＲ−Ｆ２Ａ−ＮｅｏまたはＣＡＲ−ｌ−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏを発現するよう、ＳＢ非ウイルス性遺伝子組換えにより修飾した。Ａｍａｘａ Ｎｕｃｅｌｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）及び初代マウスＴ細胞キット（Ｌｏｎｚａ）を製造者の指示にしたがって使用し、ＥＬ４に電気穿孔を行った。手短に言えば、２ｘ１０６ＥＬ４細胞を９０ｘｇにて１０分間の遠心分離にかけ、３μｇトランスポゾン（ｔＣＤ１９−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ、ｔＥＧＦＲ−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ、またはＣＡＲ−ｌ−２Ａ−Ｚｅｏ）及び２ｕｇ ＳＢ１１トランスポザーゼを含む１００ｕＬ初代マウスＴ細胞緩衝液に再懸濁させ、ＡｍａｘａプログラムＸ−００１を使用して電気穿孔を行った。電気穿孔の後、細胞を直ちに、予め温めた、キット（Ｌｏｎｚａ）と共に提供された初代マウスＴ細胞補足培地に移した。翌日、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を加え、導入遺伝子を発現するよう修飾されたＥＬ４細胞を選択した。修飾後７日目にフローサイトメトリーで発現を確認した。
Ｕ８７、Ｕ８７ｌｏｗ、Ｕ８７ｍｅｄ、及びＵ８７ｈｉｇｈ。Ｕ８７（正式にはＵ８７ＭＧ）をＡＴＣＣ（バージニア州マナサス）から得た。ＥＧＦＲを過剰発現させるため、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ及び細胞株ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＴ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＶＡＣＡ−１００２）を製造者の指示にしたがって使用し、ｔＥｒｂＢ１−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ／ｐＳＢＳＯ及びＳＢ１１を用いた電気穿孔法によりＵ８７ｌｏｗ及びＵ８７ｍｅｄを作製した。手短に言えば、Ｕ８７細胞を８０％コンフルエントな状態まで培養し、その後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で剥離させて回収し、トリパンブルー色素排除法を使用して細胞自動カウント装置（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ、Ａｕｔｏ Ｔ４ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｃｅｌｃｏｍ、マサチューセッツ州ローレンス）で計数した。３μｇのｔＥｒｂＢ１−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ／ｐＳＢＳＯトランスポゾン及び２μｇのＳＢ１１トランスポザーゼを存在させた細胞株キットＴ電気穿孔緩衝液１００μＬに１ｘ１０６のＵ８７細胞を懸濁させ、キュベットに移してプログラムＵ−０２９で電気穿孔を行った。電気穿孔後、細胞は直ちに６ウェルプレートに移され、ＤＭＥＭ完全培地に回収される。翌日、導入遺伝子発現を選択するため、０．３５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を加えた。少なくとも１ｘ１０６細胞まで増殖させた後、フローサイトメトリーを実施しＥＧＦＲ発現を評価した。電気穿孔を行ったＵ８７細胞は、非修飾Ｕ８７に対してわずかに高いＥＧＦＲ発現上昇を示し、これらをＵ８７ｌｏｗとした。Ｕ８７ｍｅｄ細胞を作製するため、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示にしたがって使用して、ｔＥｒｂＢ１−Ｆ２Ａ−Ｎｅｏ及びＳＢ１１をリポフェクタミンでＵ８７細胞に移入した。翌日、ネオマイシン耐性について選抜する培養を行うため、０．３５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を加えた。細胞を相当数まで増殖させた後、フローサイトメトリーにより、ピークが２つある集団であることがわかり、Ｕ８７細胞に対し、互いに排他的に、ＥＧＦＲ過剰発現がわずかであるかまたは高かった。細胞を抗ＥＧＦＲ−ＰＥで染色し、最高ピークの上位５０％についてＦＡＣＳで選別した。細胞が７０％コンフルエントな状態を越えない場合は慎重にサブクローニングし、細胞がＥＧＦＲ発現を維持していることを確認するため、通常のようにフローサイトメトリー分析を実施した。Ｕ８７ｈｉｇｈは、ｗｔＥＧＦＲを過剰発現するＵ８７−１７２ｂ細胞であるが、その細胞を、Ｏｌｉｖｅｒ Ｂoｌｇｅｒ、Ｐｈ．Ｄ．のご厚意により贈与された。
Ｕ８７−ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅ及びＵ８７ｍｅｄ−ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅ。Ｕ８７及びＵ８７ｍｅｄ細胞にｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅ導入遺伝子（図３４）を発現させるため、これまでに記載のあるプロトコル（Ｔｕｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）と同様にレンチウイルスで形質導入を行った。手短に言えば、２９３−ＭＥＴＲパッケージング細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で製造者の指示にしたがって、ｐｃＭＶＲ８．２、ＶＳＶ−Ｇ及びｐＬＶＵ３ＧｅｆｆＬｕｃ−Ｔ２ＡｍＫａｔｅｓ１５８Ａをトランスフェクトした。４８時間後、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を回収し、１００ｋＤａ ＮＭＷＬフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビレリカ）で濃縮した。Ｕ８７及びＵ８７ｍｅｄを導入するため、細胞を７０〜８０％コンフルエントな状態になるまで６ウェルプレートにプレーティングし、その後、ｆｆＬｕｃｍＫａｔｅ ＶＬＰを、８μｇ／ｍＬポリブレンと共に加えた。プレートを１８００ｒｐｍにて１．５時間の遠心分離にかけてから、６時間インキュベートした。インキュベーションの後、上清を除去した。形質導入から２４時間後、細胞はコンフルエントな状態に達し、それを継代培養して、ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅを中程度のレベルで発現している細胞についてＦＡＣＳで選別した。
ヒト腎皮質上皮細胞（ＨＲＣＥ）。健常固体の腎臓近位尿細管及び腎臓遠位尿細管から採取したという記載のあるＨＲＣＥをＬｏｎｚａより入手し、組換え型ヒト上皮増殖因子（ｒｈＥＧＦＲ）、エピネフリン、インスリン、トリヨードサイロニン、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、１０％熱非働化ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、及び２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ−１００（Ｇｉｂｃｏ）を添加した完全Ｒｅｎａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−３１９０）で培養した。ＨＲＣＥはインビトロで寿命があるため、すべての評価は、集団倍加回数が１０未満の細胞で実施された。細胞を７０〜８０％コンフルエントな状態まで培養し、その後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で剥離させ、新鮮な完全Ｒｅｎａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａで１：５にて継代した。
ＮＡＬＭ−６、Ｔ９８Ｇ、ＬＮ１８及びＡ４３１。ＮＡＬＭ−６、Ｔ９８Ｇ、ＬＮ１８、及びＡ４３１をすべてＡＴＣＣから入手し、細胞株の記載のとおり培養した。
Ｔ細胞の修飾及び培養。末梢血単核細胞をＧｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋの健常ドナーから入手し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウィスコンシン州ミルウォーキー）で単離し、凍結保存した。全Ｔ細胞培養を、完全ＲＰＭＩ−１６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ）に１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及び２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を添加して維持した。
ＳＢトランスポゾン／トランスポザーゼでの電気穿孔。これまでに記載があるように（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８）ＳＢ電気穿孔法を実施した。ＰＢＭＣを電気穿孔の当日に解凍し、サイトカイン不含培地完全ＲＰＭＩ−１６４０に１ｘ１０６細胞／ｍＬの密度で２時間静置した。静置期間後、細胞を２００ｘｇにて８分間の遠心分離にかけ、その後、培地に再懸濁させ、細胞自動カウント装置（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ、Ａｕｔｏ Ｔ４ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｃｅｌｃｏｍ）を使用しトリパンブルー色素排除法で計数した。ＰＢＭＣを再び遠心分離にかけ、２ｘ１０８／ｍＬでヒトＴ細胞電気穿孔緩衝液（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＶＰＡ−１００２）に再懸濁させ、その後、１００μＬの細胞懸濁液を１５μｇトランスポゾン（Ｃｅｔｕｘ−またはＮｉｍｏ−ＣＡＲいずれか）及び５μｇ ＳＢ１１トランスポザーゼと混合して電気穿孔キュベットに移し、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）で未刺激ヒトＴ細胞用のプログラムＵ−０１４を使用して電気穿孔を行った。電気穿孔の後、細胞を直ちに、２０％熱非働化ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及び２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ−１００（Ｇｉｂｃｏ）を添加したフェノール不含ＲＰＭＩに移し、一晩かけて回収した。翌日、細胞を、ＣＤ３及びＦｃ（ＣＡＲ発現を測定するため）についてフローサイトメトリーで分析し、トランスポゾンの一過性発現を測定した。
ＣＡＲ＋Ｔ細胞の刺激及び培養。電気穿孔から２４時間後、細胞を、１００Ｇｙ照射ＥＧＦＲ＋Ｋ５６２クローン２７人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）をＴ細胞ＣＡＲ＋：ａＡＰＣ＝２：１の比で用いて刺激した。Ｔ細胞を、フローサイトメトリーでＣＡＲ発現を評価した後７〜９日おきに再刺激した。培養期間全体を通して、Ｔ細胞培養に３０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキー・ヒル）を２〜３日おきに加えた。５０Ｕ／ｍＬでの第２の刺激サイクル後、２〜３日おきに培養にＩＬ−２（アルデロイキン（Ａｌｄｅｌｅｕｋｉｎ）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、スイス）を加えた。１４日目、培養を、ＮＫ細胞（培養中、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋細胞として指定）の存在について評価した。ＮＫ細胞が細胞集団の１０％を超えて示された場合、ＮＫ細胞をＣＤ５６特異的磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で標識し、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で選別することにより、ＮＫ細胞除去を実施した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞含有陰性フロースルーのフローサイトメトリーにより、ＮＫ細胞亜集団が培養から首尾良く除去されていることを確認した。通常は刺激５サイクルの後である、ＣＡＲがＣＤ３＋Ｔ細胞の８５％を超えて発現した場合に培養を機能について評価した。
ＲＮＡインビトロ転写。ＣｅｔｕｘＣＤ２８ｍＺ／ｐＧＥＭ−Ａ６４、ＮｉｍｏＣＤ２８ｍＺ／ｐＧＥＭ−Ａ６４、またはＧＦＰ／ｐＧＥＭ−Ａ６４を、ＲＮＡインビトロ転写用の直鎖状鋳型を得るため、ＳｐｅＩを用いて３７℃で４時間消化させた。０．８％アガロースゲルでのアガロースゲル電気泳動及び単一バンドの存在により、鋳型が完全に直鎖化されたことを確認し、残存消化物をＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製してから小容量で溶出させ濃度０．５μｇ／μＬを達成した。Ｔ７ ｍＭＡＣＨＩＮＥ ｍＭＥＳＳＡＧＥ Ｕｌｔｒａ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＭ１３４５）を製造者のプロトコルにしたがって使用してインビトロ転写反応を実施し、３７℃で２時間インキュベートした。ｍＲＮＡの転写後、ＤＮＡ鋳型１μｇあたり１ユニットの供給されたＴｕｒｂｏ ＤＮＡｓｅを付加してＤＮＡ鋳型を分解させ、さらに３０分、３７℃でインキュベートした。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して転写されたＲＮＡを精製した。濃度及び純度（ＯＤ２６０／２８０値＝２．０〜２．２）を分光測光法により測定し、単回解凍用に分注して−８０℃で凍結した。ＲＮＡ産物の品質は、１ｘＭＯＰＳランニング緩衝液中、ホルムアルデヒド含有アガロースゲル（１％アガロース、１０％１０×ＭＯＰＳランニング緩衝液、６．７％ホルムアルデヒド）で７５ボルト、８０分間のゲル電気泳動を行い、単一の直鎖化バンドの視覚化により評価を行った。
ポリクローナルＴ細胞増幅。抗原とは無関係のＴ細胞数増幅は、ＣＤ３との架橋を介して増幅性刺激を送るＯＫＴ３を搭載した１００Ｇｙ照射Ｋ５６２クローン４を用いて培養することにより達成した。７〜１０日おきに、Ｔ細胞：ａＡＰＣの密度を１０：１または１：２にしてａＡＰＣを加え、５０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２を２〜３日おきに加えた。培養全体を通して、Ｔ細胞密度を０．５〜２ｘ１０６細胞／ｍＬに維持するために培地交換を実施した。
Ｔ細胞へのＲＮＡ電気泳動転写。ＲＮＡ移入３〜５日前に上記のように１００Ｇｙ照射ＯＫＴ３搭載Ｋ５６２クローン４を用いて共培養することによりＴ細胞に刺激を与える。電気泳動転写前にＴ細胞を回収し、細胞自動カウント装置（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ、Ａｕｔｏ Ｔ４ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｃｅｌｃｏｍ）を使用してトリパンブルー色素排除法で計数した。細胞調製中、ＲＮＡを−８０℃フリーザーから取り出し、氷上で解凍した。Ｔ細胞を９０ｘｇにて１０分間の遠心分離にかけ、細胞ペレットを破壊せずに確実に完全除去するよう、上清を慎重に吸引した。Ｔ細胞をＰ３初代細胞４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ緩衝液（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号Ｖ４ＸＰ−３０３２）に懸濁させて濃度を１ｘ１０８／ｍＬとし、各Ｔ細胞懸濁液２０μＬを３μｇのインビトロ転写したＲＮＡと混合し、その後、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキュベットストリップ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号Ｖ４ＸＰ−３０３２）に移した。細胞に、Ａｍａｘａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でプログラムＤＱ−１１５を使用して電気穿孔を行い、その後、キュベットに１５分を最高に静置した。静置期間の後、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ−１００（Ｇｉｂｃｏ）及び２０％熱非働化ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）を添加した温かい回収培地、フェノール不含ＲＰＭＩ１６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ）をキュベットに加え、細胞を回収培地含有６ウェルプレートに穏やかに移してから組織培養インキュベーターに移した。４時間後、５０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２１をＴ細胞に加えた。ＲＮＡの移入から４〜２４時間後、Ｔ細胞をＦｃに対するフローサイトメトリーでＣＡＲ発現について分析した。全ての機能解析は、ＲＮＡ移入後２４時間目に行った。
免疫染色及びフローサイトメトリー
獲得及び分析。フローサイトメトリーデータは、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で収集し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（バージョン３．３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して得た。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョンｘ．０．６、ＴｒｅｅＳｔａｒ、オレゴン州アシュランド）を使用してフローサイトメトリーデータ解析を実施した。
表面免疫染色及び抗体。最高１ｘ１０６細胞の免疫染色を、以下の色素を以下の希釈度（特に明記しない限り）で結合させたモノクローナル抗体を用いて実施した：フルオレセイン（ＦＩＴＣ、１：２５）、フィコエリスリン（ＰＥ、１：４０）、ｃｙａｎｉｎｅ色素に結合させたペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、１：２５）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ、１：４０）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（１：２０）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（１：２０）。特に明記しない限り、抗体はすべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。抗体は、以下に対して特異的なものを使用した：ＣＤ３（クローンＳＫ７）、ＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＣＤ８（クローンＳＫ１）、ＣＤ１９（ＨＩＢ１９）、ＣＤ２７（クローンＬ１２８）、ＣＤ２８（クローンＬ２９３）、ＣＤ４５ＲＡ（クローンＨＩ１００）、ＣＤ４５ＲＯ（クローンＨＩ１００）、ＣＤ５６（クローンＢ１５９）、ＣＤ６２Ｌ（クローンＤＲＥＧ−５６）、ＣＣＲ７（クローンＧＤ４３Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（サンディエゴ）、ＣＡＲとＰｅｒＣＰＣｙ５．５を１：４５で希釈）、ＥＧＦＲ（クローンＥＧＦＲ．１、ＰＥ希釈１：１３．３）、Ｆｃ（ＣＡＲ検出用、クローンＨＩ１０１０４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＬ１５（クローン３４５５９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）、ＰＥ希釈１：２０）、マウスＦ（ａｂ’）２（Ｋ５６２に担持させたＯＫＴ３検出用、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（ペンシルベニア州ウェストグローブ）、カタログ番号１１５−１１６−０７２、ＰＥ希釈１：１００）、ＴＮＦ−α（クローンｍＡｂ１１、ＰＥ希釈１：４０）及びＩＦＮ−γ（クローン２７、ＡＰＣ希釈１：６６．７）、ｐＥｒｋ１／２（クローン２０Ａ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７）、ｐｐ３８（クローン３６／ｐ３８、ＰＥ）及びＫｉ−６７（クローンＢ５６、ＦＩＴＣ、１：２０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。表面分子をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．５％アジ化ナトリウム）中で３０分、暗所にて４℃で染色した。
定量フローサイトメトリー。Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒポリスチレンビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、インディアナ州フィッシャーズ）を使用して定量フローサイトメトリーを実施した。抗マウスＩｇＧ量が増加している、既知の抗体結合能（ＡＢＣ）を有する４集団、及びブランク集団１つ、計５集団のビーズが提供される。ＥＧＦＲ−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５９９７）を標的細胞の免疫染色と同調的に飽和濃度（希釈度１：３、製造者の推奨に従う）でビーズと共にインキュベートした。微粒子に対するＥＧＦＲ−ＰＥ結合のＭＦＩを使用して標準曲線を作成し、それに、ＱｕｉｃｋＣａｌ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（バージョン２．３、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して線形回帰をあてはめた（図３５）。標的細胞に対するＥＧＦＲ−ＰＥ結合のＭＦＩ測定値を、バックグランドの自家蛍光を引いて線形回帰に適用し、細胞あたりの発現ＥＧＦＲ分子数の平均を得た。
細胞内サイトカインの染色及びフローサイトメトリー。Ｔ細胞を、標的細胞と比１：１で４〜６時間、４０００ｘ希釈ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で共培養した。未刺激Ｔ細胞を陰性対照として使用し、１０００ｘ希釈したＰＭＡ／イオノマイシン及びブレフェルジンＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌで処理したＴ細胞を陽性対照として使用した。ＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体（クローンＬＡ１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＣＡＲとＥＧＦＲとの相互作用を遮断した。細胞内サイトカインの染色は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で２０分間、暗所にて４℃で固定／膜透過化を行うことにより表面免疫染色をした後、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３０分間、暗所にて４℃で細胞内サイトカインの染色を実施した。使用した抗体は、ＴＮＦ−α（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンｍＡｂ１１、ＰＥ希釈１：４０）及びＩＦＮ−γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン２７、ＡＰＣ希釈１：６６．７）であった。細胞内サイトカイン染色の後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで試料が得られるまで、細胞を０．５％パラホルムアルデヒド（ＣｙｔｏＦｉｘ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて固定させた。
フローサイトメトリーでリン酸化を測定する。Ｔ細胞は、特に明記しない限り標的細胞と比１：１で４５分間共培養した。活性化後、Ｔ細胞を３００ｘｇにて５分間の遠心分離にかけ、上清を捨てた。予め３７℃まで温めた、２０容量の１×ＰｈｏｓＦｌｏｗ Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えてＴ細胞を溶解させて固定し、３７℃で１０分間インキュベートした。遠心分離の後、ボルテックスで撹拌しながら氷冷ＰｈｏｓＦｌｏｗ Ｐｅｒｍ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えてＴ細胞の透過処理を行い、氷上、暗所にて２０分間インキュベートする。インキュベーション後、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を洗浄し、１００μＬ染色溶液に再懸濁させた。染色溶液は、ＣＤ４（クローンＳＫ３、ＦＩＴＣ）、ＣＤ８（クローンＳＫ１、ＰｅｒＣＰＣｙ５．５）、ｐＥｒｋ１／２（クローン２０Ａ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７）、ｐｐ３８（クローン３６／ｐ３８、ＰＥ）に対する抗体、及びＦＡＣＳ緩衝液で構成され、いずれも同比率で存在させたもので、それを２０分間、暗所にて室温でインキュベートした。細胞を０．５％パラホルムアルデヒドで固定し、２４時間以内にフローサイトメトリーで分析した。
生存率用染色。細胞生存率を測定するため、アネキシンＶ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び７−ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）用の染色を使用し、１×Ａｎｎｅｘｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液中、ＣＤ４またはＣＤ８に対する染色を用いて、２０分間、暗所、室温で実施した。生存細胞のパーセンテージを、ＣＤ４またはＣＤ８でゲーティングしたＴ細胞集団における％アネキシンＶｎｅｇ７−ＡＡＤｎｅｇとして測定した。
細胞増殖マーカーＫｉ−６７の染色。増幅マーカーＫｉ−６７を細胞内フローサイトメトリーにより測定した。Ｔ細胞を、接着標的細胞と比１：５で３６時間共培養し、次いで、上清を除去し、３００ｘｇで遠心分離にかけてＴ細胞を培養から回収した。その後、Ｔ細胞をボルテックスで高速撹拌しながら氷冷７０％エタノールを滴加して、固定及び透過処理を行った。その後、Ｔ細胞を、−２０℃で２〜２４時間保存してから染色した。細胞は、Ｋｉ−６７（クローンＢ５６、ＦＩＴＣ、１：２０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、及びＣＤ８（クローンＳＫ１）、１００μＬ ＦＡＣｓ緩衝液中で３０分間暗所にて室温で染色し、その後直ちにフローサイトメトリーで分析した。
Ｔ細胞機能解析
ＣＡＲ下方制御。ＣＡＲ＋Ｔ細胞及び標的を回収して細胞自動カウント装置（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ、Ａｕｔｏ Ｔ４ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｃｅｌｃｏｍ）を使用しトリパンブルー色素排除法で計数した後、１：１の比で１２ウェルプレートに混合し、各測定時点で個々のウェルを回収してＴ細胞上のＣＡＲの表面発現を測定した。下方制御の陰性対照は未刺激でプレーティングしたＴ細胞であった。ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８発現によるＴ細胞の染色及びＦｃによるＣＡＲの共染色をフローサイトメーターで分析した。ＣＡＲの下方制御パーセントを、［刺激後のＣＡＲ発現］／［未刺激ＣＡＲ発現］×１００として計算した。
二次活性化及びサイトカイン産生。ＣＡＲ＋Ｔ細胞及び接着標的を回収し、細胞自動カウント装置（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ、Ａｕｔｏ Ｔ４ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｃｅｌｃｏｍ）を使用してトリパンブルー色素排除法で計数した後、比１：１で１２ウェルプレートに混合した。共培養の２４時間後、上清を除去して接着細胞をＰＢＳで洗浄することによりＴ細胞を培養から回収した。Ｔ細胞を３００ｘｇにて５分間遠心にかけた後、培地に再懸濁させ、細胞自動カウント装置（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ、Ａｕｔｏ Ｔ４ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｃｅｌｃｏｍ）を使用しトリパンブルー色素排除法で計数した。Ｔ細胞を、１：１の比で用いた標的で刺激し、細胞内サイトカイン産生分析を上記のように行った。
長期細胞傷害性アッセイ。アッセイ開始の前日、接着細胞Ｕ８７及びＵ８７ｈｉｇｈを回収、計数し、完全ＤＭＥＭの６ウェルプレートの各ウェルに４０，０００標的細胞をプレーティングし、組織培養インキュベーター内で一晩インキュベートした。アッセイ当日、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を回収してトリパンブルー色素排除法で計数し、エフェクター：ターゲット比１：５でプレーティングした標的細胞に加えた。陰性対照ウェルにはＴ細胞を加えなかった。各アッセイ時点で、上清を廃棄してウェルをＰＢＳで洗浄することによりＴ細胞を除去した。接着細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）によりウェルから剥離させた。顕微鏡検査を実施し、細胞がウェルから完全に剥離していることを目視で確認した。回収した細胞を遠心にかけて１００μＬの培地に再懸濁させ、その後、血球計数器を使用してトリパンブルー色素排除法で計数した。生存細胞パーセントを、［Ｔ細胞共培養後の細胞数］／［Ｔ細胞共培養なしの細胞数］×１００として計算した。
クロム遊離アッセイ。特異的細胞傷害性を、これまでに記載があるように（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８）標準的４時間クロム遊離アッセイで評価した。標的細胞を回収し、細胞自動カウント装置（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ、Ａｕｔｏ Ｔ４ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ）を使用してトリパンブルー色素排除法で計数した。２５０，０００以上の細胞を分注した後、３００ｘｇにて５分間遠心分離にかけ、上清を廃棄した。次に、０．１μＣｉの５１Ｃｒを各標的に加え、組織培養インキュベーター内で１〜１．５時間、３７℃でインキュベートした。ウェルあたり１００，０００Ｔ細胞を３連でプレーティングし、１：２の比で段階希釈して最終的なエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比２０：１、１０：１、５：１、２．５：１及び１．２５：１を９６ウェルＶ字底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）に得、組織培養インキュベーター内に置いた。培地のみをウェルに入れ、最小クロム遊離対照とした。クロミウム標識の後、標的を１０ｍＬ ＰＢＳで３回洗浄し、その後、最終濃度１２５，０００細胞／ｍＬで再懸濁させ、完全に混合し、Ｔ細胞を含む列、最小遊離の列、及び最大遊離の列のすべてを含め、各列に１００μＬを加えた。プレートを３００ｘｇにて３分間遠心分離にかけた。遠心分離の後、１００μＬの０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を最大遊離列に加え、プレートを組織培養インキュベーター内に４時間置いた。インキュベーション後、続いて、細胞ペレットを破壊させずに上清５０μＬを慎重に除去してプレートを回収し、ＬｕｍａＰｌａｔｅ−９６（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）に移して一晩乾燥させた。翌日、プレートをＴｏｐ−Ｓｅａｌ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で密封し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）でシンチレーションを測定した。特異的溶解パーセントを、［（５１Ｃｒ遊離−最小）／（最大−最小）］×１００として計算し、最大値及び最小値は各三連測定の平均とした。
ハイスループット遺伝子発現及びＣＤＲ３配列決定
ｍＲＮＡ転写産物のダイレクトイメージングによる遺伝子発現解析。ｍＲＮＡ分子のダイレクトイメージング及び定量をこれまでに記載があるように（３１９〜３２２）実施した。増幅前後の細胞を、ＣＤ４及びＣＤ８発現についてそれぞれ、ＣＤ４及びＣＤ８の磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共にインキュベートしてポジティブ選別し、ＬＳカラムで選別した。ＣＤ４及びＣＤ８の別個の集団の純度をフローサイトメトリーを使用して確認した。１ｘ１０６Ｔ細胞を１６５μＬのＲＬＴ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）に溶解させ、−８０℃で単回解凍用に分注して凍結した。ＲＮＡ溶解液を解凍し、多重標的特異的なカラーコード化されたレポータープローブ及びビオチン化した捕捉プローブと６５℃で１２時間でハイブリダイズさせた。対象とするリンパ球特異的ｍＲＮＡ転写産物を同定し、ＲｅｆＳｅｑアクセッションから作製した２つのＣｏｄｅＳｅｔｓを使用してレポータープローブと捕捉プローブのペア、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ＣｏｄｅＳｅｔ、及びＴＣＲのＶα及びＶβ ＣｏｄｅＳｅｔを作製した。Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ＣｏｄｅＳｅｔは以下の遺伝子用プローブを含有した： ＡＢＣＢ１；ＡＢＣＧ２；ＡＣＴＢ；ＡＤＡＭ１９；ＡＧＥＲ；ＡＨＮＡＫ；ＡＩＦ１；ＡＩＭ２；ＡＩＭＰ２；ＡＫＩＰ１；ＡＫＴ１；ＡＬＤＨ１Ａ１；ＡＮＸＡ１；ＡＮＸＡ２Ｐ２；ＡＰＡＦ１；ＡＲＧ１；ＡＲＲＢ２；ＡＴＦ３；ＡＴＭ；ＡＴＰ２Ｂ４；ＡＸＩＮ２；Ｂ２Ｍ；Ｂ３ＧＡＴ１；ＢＡＣＨ２；ＢＡＤ；ＢＡＧ１；ＢＡＴＦ；ＢＡＸ；ＢＣＬ１０；ＢＣＬ１１Ｂ；ＢＣＬ２；ＢＣＬ２Ｌ１；ＢＣＬ２Ｌ１；ＢＣＬ２Ｌ１１；ＢＣＬ２Ｌ１１；ＢＣＬ６；ＢＣＬ６Ｂ；ＢＨＬＨＥ４１；ＢＩＤ；ＢＩＲＣ２；ＢＬＫ；ＢＭＩ１；ＢＮＩＰ３；ＢＴＬＡ；Ｃ２１ｏｒｆ３３；ＣＡ２；ＣＡ９；ＣＡＲＤ９；ＣＡＳＰ１；ＣＡＴ；ＣＢＬＢ；ＣＣＢＰ２；ＣＣＬ３；ＣＣＬ４；ＣＣＬ５；ＣＣＮＢ１；ＣＣＮＤ１；ＣＣＲ１；ＣＣＲ２；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５；ＣＣＲ６；ＣＣＲ７；ＣＤ１６０；ＣＤ１９；ＣＤ１９Ｒ−ｓｃｆｖ；ＣＤ１９ＲＣＤ２８；ＣＤ２；ＣＤ２０−ｓｃｆｖ ルツキシマブ（ｒｕｔｕｘｉｍａｂ）；ＣＤ２２６；ＣＤ２４４；ＣＤ２４７；ＣＤ２７；ＣＤ２７４；ＣＤ２７６；ＣＤ２８；ＣＤ３００Ａ；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｄ；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ４；ＣＤ４０ＬＧ；ＣＤ４４；ＣＤ４５Ｒ−ｓｃｆｖ；ＣＤ４７；ＣＤ５６Ｒ−ｓｃｆｖ；ＣＤ５８；ＣＤ６３；ＣＤ６９；ＣＤ７；ＣＤ８０；ＣＤ８６；ＣＤ８Ａ；ＣＤＨ１；ＣＤＫ２；ＣＤＫ４；ＣＤＫＮ１Ａ；ＣＤＫＮ１Ｂ；ＣＤＫＮ２Ａ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＥＢＰＡ；ＣＦＬＡＲ；ＣＦＬＡＲ；ＣＨＰＴ１；ＣＩＩＴＡ；ＣＩＴＥＤ２；ＣＬＩＣ１；ＣＬＮＫ；ｃ−ＭＥＴ−ｓｃｆｖ；ＣＲＥＢ１；ＣＲＥＭ；ＣＲＩＰ１；ＣＲＬＦ２；ＣＳＡＤ；ＣＳＦ２；ＣＳＮＫ２Ａ１；ＣＴＧＦ；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＡ１；ＣＴＮＮＢ１；ＣＴＮＮＢＬ１；ＣＴＳＣ；ＣＴＳＤ；ＣＸ３ＣＬ１；ＣＸ３ＣＲ１；ＣＸＣＬ１０；ＣＸＣＬ１２；ＣＸＣＬ９；ＣＸＣＲ１；ＣＸＣＲ３；ＣＸＣＲ４；ＤＡＰＬ１；ＤＥＣ１；ＤＥＣＴＩＮ−１Ｒ；ＤＧＫＡ；ＤＯＣＫ５；ＤＯＫ２；ＤＰＰ４；ＤＵＳＰ１６；ＥＧＦＲ−ｓｃｆｖ（ＮＩＭＯ ＣＡＲ）；ＥＧＬＮ１；ＥＧＬＮ３；ＥＩＦ１；ＥＬＦ４；ＥＬＯＦ１；ＥＮＴＰＤ１；ＥＯＭＥＳ；ＥＰＨＡ２；ＥＰＨＡ４；ＥＰＨＢ２；ＥＴＶ６；ＦＡＤＤ；ＦＡＭ１２９Ａ；ＦＡＮＣＣ；ＦＡＳ；ＦＡＳＬＧ；ＦＣＧＲ３Ｂ；ＦＧＬ２；ＦＬＴ１；ＦＬＴ３ＬＧ；ＦＯＳ；ＦＯＸＯ１；ＦＯＸＯ３；ＦＯＸＰ１；ＦＯＸＰ３；ＦＹＮ；ＦＺＤ１；Ｇ６ＰＤ；ＧＡＢＰＡ；ＧＡＤＤ４５Ａ；ＧＡＤＤ４５Ｂ；ＧＡＬ３ＳＴ４；ＧＡＳ２；ＧＡＴＡ２；ＧＡＴＡ３；ｇＢＡＤ−１Ｒ−ｓｃｆｖ；ＧＥＭＩＮ２；ＧＦＩ１；ＧＬＩＰＲ１；ＧＬＯ１；ＧＮＬＹ；ＧＳＫ３Ｂ；ＧＺＭＡ；ＧＺＭＢ；ＧＺＭＨ；ＨＣＳＴ；ＨＤＡＣ１；ＨＤＡＣ２；ＨＥＲ２−ｓｃｆｖ；ＨＥＲＶ−Ｋ ６Ｈ５−ｓｃｆｖ；ＨＬＡ−Ａ；ＨＭＧＢ２；ＨＯＰＸ；ＨＯＸＡ１０；ＨＯＸＡ９；ＨＯＸＢ３；ＨＯＸＢ４；ＨＰＲＴ１；ＨＲＨ１；ＨＲＨ２；ヒト ＣＤ１９Ｒ−ｓｃｆｖ；ＩＣＯＳ；ＩＣＯＳＬＧ；ＩＤ２；ＩＤ３；ＩＤＯ１；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＧ；ＩＦＮＧＲ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＫＺＦ１；ＩＫＺＦ２；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１７Ａ；ＩＬ１７Ｆ；ＩＬ１７ＲＡ；ＩＬ１８；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬ２；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ２３Ａ；ＩＬ２３Ｒ；ＩＬ２７；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ７Ｒ；ＩＬ９；ＩＲＦ１；ＩＲＦ２；ＩＲＦ４；ＩＴＣＨ；ＩＴＧＡ１；ＩＴＧＡ４；ＩＴＧＡ５；ＩＴＧＡＬ；ＩＴＧＡＭ；ＩＴＧＡＸ；ＩＴＧＢ１；ＩＴＧＢ７；ＩＴＫ；ＪＡＫ１；ＪＡＫ２；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；ＪＵＮＢ；ＫＩＲ２ＤＬ１；ＫＩＲ２ＤＬ２；ＫＩＲ２ＤＬ３；ＫＩＲ２ＤＬ４；ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ；ＫＩＲ２ＤＳ１；ＫＩＲ２ＤＳ２；ＫＩＲ２ＤＳ３；ＫＩＲ２ＤＳ４；ＫＩＲ２ＤＳ５；ＫＩＲ３ＤＬ１；ＫＩＲ３ＤＬ２；ＫＩＲ３ＤＬ３；ＫＩＲ３ＤＳ１；ＫＩＴ；ＫＬＦ１０；ＫＬＦ２；ＫＬＦ４；ＫＬＦ６；ＫＬＦ７；ＫＬＲＡＰ１；ＫＬＲＢ１；ＫＬＲＣ１；ＫＬＲＣ２；ＫＬＲＣ３；ＫＬＲＣ４；ＫＬＲＤ１；ＫＬＲＦ１；ＫＬＲＧ１；ＫＬＲＫ１；ＬＡＧ３；ＬＡＩＲ１；ＬＡＴ；ＬＡＴ２；ＬＣＫ；ＬＤＨＡ；ＬＥＦ１；ＬＧＡＬＳ１；ＬＧＡＬＳ３；ＬＩＦＲ；ＬＩＬＲＢ１；ＬＯＣ２８２９９７；ＬＲＰ５；ＬＲＰ６；ＬＲＲＣ３２；ＬＴＡ；ＬＴＢＲ；ＬＹＮ；ＭＡＤ１Ｌ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＭＡＰＫ１４；ＭＡＰＫ３；ＭＡＰＫ８；ＭＢＤ２；ＭＣＬ１；ＭＩＦ；ＭＭＰ１４；ＭＰＬ；ＭＴＯＲ；ＭＸＤ１；ＭＹＢ；ＭＹＣ；ＭＹＯ６；ＮＡＮＯＧ；ＮＢＥＡ；ＮＣＡＭ１；ＮＣＬ；ＮＣＲ１；ＮＣＲ２；ＮＣＲ３；ＮＣＲＮＡ００１８５；ＮＥＩＬ１；ＮＥＩＬ２；ＮＦＡＴ５；ＮＦＡＴＣ１；ＮＦＡＴＣ２；ＮＦＡＴＣ３；ＮＦＫＢ１；ＮＯＳ２；ＮＯＴＣＨ１；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ４Ａ１；ＮＲＥＰ；ＮＲＩＰ１；ＮＲＰ１；ＮＴ５Ｅ；ＯＡＺ１；ＯＰＴＮ；Ｐ２ＲＸ７；ＰＡＸ５；ＰＤＣＤ１；ＰＤＣＤ１ＬＧ２；ＰＤＥ３Ａ；ＰＤＥ４Ａ；ＰＤＥ７Ａ；ＰＤＫ１；ＰＤＸＫ；ＰＥＣＡＭ１；ＰＨＡＣＴＲ２；ＰＨＣ１；ＰＯＬＲ１Ｂ；ＰＯＬＲ２Ａ；ＰＯＰ５；ＰＯＵ５Ｆ１；ＰＰＡＲＡ；ＰＰＰ２Ｒ１Ａ；ＰＲＤＭ１；ＰＲＦ１；ＰＲＫＡＡ２；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＯＭ１；ＰＴＧＥＲ２；ＰＴＫ２；ＰＴＰＮ１１；ＰＴＰＮ４；ＰＴＰＮ６；ＰＴＰＲＫ；ＲＡＢ３１；ＲＡＣ１；ＲＡＣ２；ＲＡＦ１；ＲＡＰ１ＧＡＰ２；ＲＡＲＡ；ＲＢＰＭＳ；ＲＨＯＡ；ＲＮＦ１２５；ＲＯＲＡ；ＲＯＲＣ；ＲＰＬ２７；ＲＰＳ１３；ＲＵＮＸ１；ＲＵＮＸ２；ＲＵＮＸ３；Ｓ１００Ａ４；Ｓ１００Ａ６；ＳＡＴＢ１；ＳＣＭＬ１；ＳＣＭＬ２；ＳＥＬ１Ｌ；ＳＥＬＬ；ＳＥＬＰＬＧ；ＳＥＲＰＩＮＥ２；ＳＨ２Ｂ３；ＳＨ２Ｄ２Ａ；ＳＩＴ１；ＳＫＡＰ１；ＳＫＡＰ２；ＳＬＡ２；ＳＬＡＭＦ１；ＳＬＡＭＦ７；ＳＬＣ２Ａ１；ＳＭＡＤ３；ＳＭＡＤ４；ＳＮＡＩ１；ＳＯＣＳ１；ＳＯＣＳ３；ＳＯＤ１；ＳＯＸ１３；ＳＯＸ２；ＳＯＸ４；ＳＯＸ５；ＳＰＩ１；ＳＰＮ；ＳＰＲＹ２；ＳＴＡＴ１；ＳＴＡＴ３；ＳＴＡＴ４；ＳＴＡＴ５Ａ；ＳＴＡＴ５Ｂ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＭＮ１；ＳＹＫ；ＴＡＬ１；ＴＢＰ；ＴＢＸ２１；ＴＢＸＡ２Ｒ；ＴＣＦ１２；ＴＣＦ３；ＴＣＦ７；ＴＤＧＦ１；ＴＤＯ２；ＴＥＫ；ＴＥＲＦ１；ＴＥＲＴ；ＴＦ；ＴＦＲＣ；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢ１；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢＲ１；チミジンキナーゼ；ＴＩＥ１；ＴＬＲ２；ＴＬＲ８；ＴＮＦ；ＴＮＦＲＳＦ１４；ＴＮＦＲＳＦ１８；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ４；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０；ＴＮＦＳＦ１１；ＴＮＦＳＦ１４；ＴＯＸ；ＴＰ５３；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＳＣ２２Ｄ３；ＴＳＬＰ；ＴＸＫ；ＴＹＫ２；ＴＹＲＯＢＰ；ＵＢＡＳＨ３Ａ；ＶＡＸ２；ＶＥＧＦＡ；ＷＥＥ１；ＸＢＰ１；ＸＢＰ１；ＹＹ１ＡＰ１；ＺＡＰ７０；ＺＢＴＢ１６；ＺＣ２ＨＣ１Ａ；ＺＥＢ２；ＺＮＦ５１６。ＴＣＲ Ｖα及びＶβ ＣｏｄｅＳｅｔは以下の遺伝子用プローブを含有した：ＴＲＡＶ１−１；ＴＲＡＶ１−２；ＴＲＡＶ２；ＴＲＡＶ３；ＴＲＡＶ４；ＴＲＡＶ５；ＴＲＡＶ６；ＴＲＡＶ７；ＴＲＡＶ８−１；ＴＲＡＶ８−２；ＴＲＡＶ８−３；ＴＲＡＶ８−６；ＴＲＡＶ９−１；ＴＲＡＶ９−２；ＴＲＡＶ１０；ＴＲＡＶ１１；ＴＲＡＶ１２−１；ＴＲＡＶ１２−２；ＴＲＡＶ１２−３；ＴＲＡＶ１３−１；ＴＲＡＶ１３−２；ＴＲＡＶ１４；ＴＲＡＶ１６；ＴＲＡＶ１７；ＴＲＡＶ１８；ＴＲＡＶ１９；ＴＲＡＶ２０；ＴＲＡＶ２１；ＴＲＡＶ２２；ＴＲＡＶ２３；ＴＲＡＶ２４；ＴＲＡＶ２５；ＴＲＡＶ２６−１；ＴＲＡＶ２６−２；ＴＲＡＶ２７；ＴＲＡＶ２９；ＴＲＡＶ３０；ＴＲＡＶ３４；ＴＲＡＶ３５；ＴＲＡＶ３６；ＴＲＡＶ３８−１；ＴＲＡＶ３８−２；ＴＲＡＶ３９；ＴＲＡＶ４０；ＴＲＡＶ４１；ＴＲＢＶ２；ＴＲＢＶ３−１；ＴＲＢＶ４−１；ＴＲＢＶ４−２；ＴＲＢＶ４−３；ＴＲＢＶ５−１；ＴＲＢＶ５−４；ＴＲＢＶ５−５；ＴＲＢＶ５−６；ＴＲＢＶ５−８；ＴＲＢＶ６−１；ＴＲＢＶ６−２；ＴＲＢＶ６−４；ＴＲＢＶ６−５；ＴＲＢＶ６−６；ＴＲＢＶ６−８；ＴＲＢＶ６−９；ＴＲＢＶ７−２；ＴＲＢＶ７−３；ＴＲＢＶ７−４；ＴＲＢＶ７−６；ＴＲＢＶ７−７；ＴＲＢＶ７−８；ＴＲＢＶ７−９；ＴＲＢＶ９；ＴＲＢＶ１０−１；ＴＲＢＶ１０−２；ＴＲＢＶ１０−３；ＴＲＢＶ１１−１；ＴＲＢＶ１１−２；ＴＲＢＶ１１−３；ＴＲＢＶ１２−３；ＴＲＢＶ１２−５；ＴＲＢＶ１３；ＴＲＢＶ１４；ＴＲＢＶ１５；ＴＲＢＶ１６；ＴＲＢＶ１８；ＴＲＢＶ１９；ＴＲＢＶ２０−１；ＴＲＢＶ２４−１；ＴＲＢＶ２５−１；ＴＲＢＶ２７；ＴＲＢＶ２８；ＴＲＢＶ２９−１；ＴＲＢＶ３０。ハイブリダイゼーションの後、ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｐｒｅｐ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ワシントン州シアトル）で試料を処理し、ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。ＲＮＡ発現レベルが広い範囲にわたる参照遺伝子としてＡＣＴＢ、Ｇ６ＰＤ、ＯＡ２１、ＰＯＬＲ１Ｂ、ＲＰＬ２７、ＲＰＳ１３、及びＴＢＰが同定され、これらをデータの正規化に使用した。陽性遺伝子、陰性遺伝子、及びハウスキーピング遺伝子に対する正規化をｎＣｏｕｎｔｅｒ ＲＣＣ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（バージョン１．６．０、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。デジタル遺伝子発現プロファイリング用に開発された統計的検定を使用して、試料ペア間での遺伝子の差次的発現を測定した（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ａｕｄｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。正規化後、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ＣｏｄｅＳｅｔの有意に差次的な遺伝子発現を、これまでに記載があるように（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、少なくとも２／３ペアにおけるｐ＜０．０１と１．５倍を超える倍率変化との組み合わせにより同定した。差次的ＲＮＡ転写産物について正規化した値のヒートマップ化は、階層的クラスタリング及びＴｒｅｅＶｉｅｗソフトウェア、バージョン１．１（Ｅｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）によって実施した。正規化後、ＴＣＲ Ｖα及びＶβのパーセンテージを、これまでに記載があるように（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）計算データから導いた。
ハイスループットＣＤＲ３ディープシークエンシング。ＴＣＲβ ＣＤＲ３領域を増幅させ、１ｘ１０６Ｔ細胞（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）から抽出したＤＮＡで配列決定を行い、これまでに記載があるように（Ｒｏｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）、ＩｍｍｕｎｏＳＥＱプラットフォーム（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ワシントン州シアトル）で実施した。
頭蓋内神経膠腫異種移植マウスモデルにおけるＴ細胞のインビボ評価
すべての動物実験は、動物に関する承認されているプロトコルＡＣＵＦ１１−１１−１３１３１に従った、ＭＤアンダーソンがんセンター（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＡＣＵＣ）からの指針及び規制のもとに行われた。使用したマウスはすべて７〜８週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２Ｒγｔｍ１Ｗｊｌ／Ｓｚ系統（ＮＳＧ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、メイン州バーハーバー）であった。
ガイドスクリューの移植。週齢７〜８週のマウスを、ケタミン／キシラジンカクテル（１０ｍｇ／ｍＬケタミン、０．５ｍｇ／ｍＬキシラジン）を用量０．１ｍＬ／１０ｇで用いて麻酔した。これまでに記載があるように（Ｌａｌ ｅｔ ａｌ．，２０００）ガイドスクリューの移植を実施した。刺激に反応しなくなったら、剃毛し、ポビドンヨード（ポリビニルピロリドンとヨウ素の複合体）消毒液で処置して頭部の手術区画を準備した。外科的無菌手法を用いて、頭蓋の正中下方に１ｃｍ切開した。１ｍｍドリルビット（ＤＨ＃６０、Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｏｎｅ、バージニア州ロアノーク）を使用し、ドリル（ＤＨ−０、Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｏｎｅ）に安定圧力をかけて円を描くよう１ｍｍ広げ開口部を作った。中央に０．５０ｍｍの開口部と、直径１．５７ｍｍの軸とを有するガイドスクリュー（Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｏｎｅ、カタログ番号Ｃ２１２ＳＧ）をドリル部位にねじ回し（ＳＤ−８０、Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｏｎｅ）を使用して挿入した。切開部位を縫合し、マウスに、術後の鎮痛薬として０．０１ｍｇ／ｍＬブプレノルフィンを用量０．１ｍＬ／１０グラムで投与した。運動能が完全に回復するまでマウスを低電力の熱源に載せ手術から回復させた。
Ｕ８７−ｆｆＬｕｃｍ−ＫａｔｅまたはＵ８７ｍｅｄ−ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅ腫瘍細胞の移植。これまでに記載があるように（Ｌａｌ ｅｔ ａｌ．，２０００）、頭蓋内腫瘍が確立されるまで２〜３週間マウスをガイドスクリュー移植から回復させた。Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ 緩衝液、酵素不含、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）と共に室温で１０分インキュベーションした後、Ｕ８７−ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅまたはＵ８７ｍｅｄ−ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅを組織培養容器から剥離させた。細胞を血球計数器を使用してトリパンブルー色素排除法で計数し、２００ｘｇにて８分遠心分離した。遠心分離の後、細胞を滅菌ＰＢＳに再懸濁させ、最終濃度５０，０００細胞／μＬとした。マウスをイソフルラン（２−クロロ−２−（ジフルオロメトキシ）−１，１，１−トリフルオロエタン）で麻酔し、上記のように切開準備をした。マウス手術を準備している間に、２６ゲージ、１０μＬの針先が鈍型のハミルトンシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、ネバダ州リノ、カタログ番号８０３００）にシリンジ末端から２．５ｍｍの場所にプラスチック製ガードを取り付け、２５０，０００細胞を含有した細胞懸濁液５μＬを充填してシリンジを準備した。切開部位を開いた後、シリンジをガイドスクリュー開口部に挿入し、ゆっくりと一定圧力をかけて細胞を注入した。注入完了後、さらに３０秒シリンジを所定の位置に保持し、頭蓋内圧力を分散させた後、ゆっくりと抜き取った。切開を縫合し、マウスをイソフルラン曝露から外した。移植日を試験第０日とする。１日目及び４日目、前述のように、腫瘍を非侵襲的生物発光イメージングで画像診断し、腫瘍が首尾良く生着しているか確認した。その後、マウスを、相対的腫瘍フラックスが均等に分配されるよう３群に分け、次いで、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置及び未処置の各群に無作為に割り付けた。
Ｕ８７−ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅまたはＵ８７ｍｅｄ−ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅの非侵襲的生物発光イメージング。頭蓋内神経膠腫を非侵襲的かつ連続的に撮像し、相対的腫瘍量の尺度として使用した。Ｄ−ルシフェリンカリウム塩（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）２１５μｇを皮下注射してから１０分後、Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）及びＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン２．５０、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して腫瘍フラックス（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）を測定した。マウスの全頭蓋領域を含め、対象とする直線状領域の腫瘍フラックスを測定した。
頭蓋内に確立されたＵ８７−ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅまたはＵ８７ｍｅｄ−ｆｆＬｕｃ−ｍＫａｔｅ神経膠腫へのＣＡＲ＋Ｔ細胞の送達。腫瘍確立の５日目に頭蓋内神経膠腫異種移植片の処置を始め、週１回、計３回のＴ細胞注射を継続した。フローサイトメトリーにより、３回の刺激サイクルが完了したＣＡＲ＋Ｔ細胞は８５％超がＣＡＲを発現していることが確認され、その後、生存細胞を細胞自動カウント装置（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ、Ａｕｔｏ Ｔ４ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｃｅｌｃｏｍ）を使用してトリパンブルー色素排除法で計数した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞を３００ｘｇにて５分間遠心にかけ、濃度０．６ｘ１０６／μＬで滅菌ＰＢＳに再懸濁させた。上記のように、マウスに頭蓋切開の準備をし、イソフルランに曝露して麻酔をかけた。マウスを準備している間、２６ゲージ、１０μＬの針先が鈍型のハミルトンシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、カタログ番号８０３００）に、シリンジ末端から２．５ｍｍの場所にプラスチック製ガードを取り付け、３ｘ１０６Ｔ細胞を含有した細胞懸濁液５μＬを充填してシリンジを準備した。シリンジをガイドスクリューに挿入し、頭蓋内へ２．５ｍｍ伸長させ、ゆっくりと一定圧力をかけて注入した。シリンジが空になった後、所定の位置にさらに３０秒保持して頭蓋内圧力を分散させた。注射の後、切開を縫合して閉じマウスをイソフルランへの曝露から外した。
マウス生存期間の評価。マウスが、体重減少の進行（体容量の２５％超）、急速な体重減少（４８時間以内の体容量１０％超の減少）若しくは後肢麻痺、または以下の病的臨床症状、すなわち、運動失調、円背位、不規則呼吸、曝露腫瘍の潰瘍化、若しくは直径１．５ｃｍを超える触知可能な腫瘍のうち任意の２つを示した場合は、屠殺した。
統計学
統計解析はすべてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン６．０３で実施した。インビトロ細胞培養実験の統計解析は、フローサイトメトリーによるサイトカイン産生、生存率、増幅、及び表面表現型についての分析、細胞増幅動態、長期細胞傷害性、並びにクロム遊離アッセイを含め、すべて、多重比較用のドナー一致両側ＡＮＯＶＡ及びテューキーの事後検定により行った。機能と抗原密度との相関は、線形傾向について事後検定を行う片側ＡＮＯＶＡにより実施した。腫瘍インビボ生物発光イメージングの解析は、多重比較用の反復測定両側ＡＮＯＶＡ及びサイダック（登録商標）の事後検定を使用して実施した。動物生存データの統計解析は、ログランク（マンテル・コックス（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ））検定により実施した。所見の有意性を以下のとおり定義した：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
実施例２−抗ＣＤ３を搭載した人工抗原提示細胞によるＴ細胞の細胞数増幅
ＤＮＡの組込みにより達成された安定なＣＡＲ発現を介した抗原依存性の刺激を使用して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞数を臨床上実現可能な数まで増幅させることができる。ＲＮＡ移入を介したＣＡＲ発現の一過性という性質には、ＣＡＲのＲＮＡ移入を行う前にＴ細胞数を増幅させて臨床上実現可能な数を達成する必要がある。ａＡＰＣが抗原とは無関係にＴ細胞数を増幅させる能力を測定するため、高親和性Ｆｃ受容体ＣＤ６４を安定して発現させることにより抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）をＫ５６２に搭載した（図１Ａ）。Ｋ５６２は、さらなるＴ細胞共刺激のためのＣＤ８６、４１ＢＢ−Ｌ、及び膜結合型ＩＬ−１５も発現した。Ｔ細胞増幅を刺激するための共培養におけるａＡＰＣ密度の影響を測定するため、健常ヒトドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、γ照射したａＡＰＣとをＩＬ−２の存在下で共培養し、その際、Ｔ細胞：ａＡＰＣ＝１０：１（１０：１）の低密度、またはＴ細胞：ａＡＰＣ＝１：２（１：２）の高密度で行った。９日後、Ｔ細胞を再度ａＡＰＣで刺激した。ａＡＰＣ添加２サイクルの後、Ｔ細胞は、ａＡＰＣで１０：１及び１：２で刺激した場合に細胞数が増幅されたが、ａＡＰＣ高密度（１：２）のＴ細胞では、統計的に優れた細胞数増幅が達成された（１０：１＝１０８３±４２０倍増幅（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、１：２＝１８９１±３７６倍増幅（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝６）（ｐ＜０．０００１）（図１Ｂ）。
ａＡＰＣ低密度で増幅させたＴ細胞は、それより多いａＡＰＣで増幅させたＴ細胞より高い割合でＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでいた（１０：１＝５３．９±１１．６％ＣＤ８、１：２＝２８．１±１６．２％ＣＤ８、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝６）（ｐ＜０．００１）（図２Ａ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、いずれの比のａＡＰＣ刺激でも同様のＴ細胞倍増幅（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を示したが、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、少ないａＡＰＣで刺激した場合に倍増幅（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）が劣っていた（１０：１＝３６９±２２７ＣＤ４＋倍増幅（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、１：２＝１２６７±４４７ＣＤ４＋倍増幅（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝６）（ｐ＜０．０００１）（図２Ｂ）。倍増幅（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）低下が、少ないａＡＰＣを用いた培養でＣＤ４＋Ｔの細胞死が増加したことによるものなのかどうかを決定するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞をアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、細胞生存率を測定するためフローサイトメトリーで分析した。ａＡＰＣの刺激が低密度であっても高密度であっても、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の生存細胞割合に差はなかった（図２Ｃ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞の倍増幅（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）低下が、増殖率低下によるものなのかどうかを決定するため、ａＡＰＣでの刺激から９日後、細胞内のＫｉ−６７発現についてＴ細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ａＡＰＣ刺激が低密度でも高密度でも同様の増殖を示したが、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、低密度ａＡＰＣで刺激した場合、高密度ａＡＰＣの場合よりも増殖低下を示した（図２Ｄ）。これらのデータから、低密度ａＡＰＣを用いたＴ細胞の刺激では、高密度ａＡＰＣで刺激したＴ細胞よりＴ細胞増幅総数が少なくなることが示され、これは、低密度ａＡＰＣに応答したＣＤ４＋Ｔ細胞増殖が低いためにＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が増加することで特徴付けられる。
実施例３−低密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞は、高密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞よりもさらにメモリー様の表現型を示す
低密度または高密度のａＡＰＣで増幅させることがＴ細胞表現型に影響するかどうかを決定するため、ｍＲＮＡ転写産物パネル（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ特異的ＣｏｄｅＳｅｔ）の発現を、ｎＣｏｕｎｔｅｒ解析（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ワシントン州シアトル）を使用して多重デジタルプロファイリングで解析した。有意に差次的な遺伝子発現を、低密度（１０：１Ｔ細胞：ａＡＰＣ）または高密度（１：２Ｔ細胞：ａＡＰＣ）ａＡＰＣで増幅させた、選別されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞で、ｐ＜０．０１及び１．５倍を超える倍率変化により決定した。高密度ａＡＰＣと共に増幅させたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化に関連した遺伝子発現、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ３８及びグランザイムＡ並びにＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ３８及びＮＣＡＭ−１の発現増加を示した（図３）。対照的に、低密度ａＡＰＣと共に増幅させたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達経路転写因子Ｌｅｆ１及びＴｃｆ７、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、並びにＩＬ７Ｒαなどの、セントラルメモリーまたはナイーブＴ細胞に関連した遺伝子発現増加を示した（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
低密度または高密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞の差次的表現型をさらに評価するため、Ｔ細胞を表現型マーカーについてフローサイトメトリーで分析し、また、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの共発現によりサブセット評価を行い、そこでは、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋はナイーブ表現型を指し、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡｎｅｇはセントラルメモリー表現型を指し、ＣＣＲ７ｎｅｇＣＤ４５ＲＡｎｅｇはエフェクターメモリーを指し、かつＣＣＲ７ｎｅｇＣＤ４５ＲＡ＋はＣＤ４５ＲＡ＋エフェクターメモリー表現型を指す（Ｇｅｇｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，２００３）。低密度ａＡＰＣと共に増幅させたＣＤ４＋Ｔ細胞は、有意に少ないエフェクターメモリー表現型のＴ細胞を含有していたが（１０：１＝６１．９±９．１％、１：２＝９２．１±３．９％、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）（ｐ＜０．０５）、セントラルメモリー表現型のＴ細胞を多く含有していた（１０：１＝３６．５±９．４％、１：２＝１３．６±２．４％、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）（ｐ＜０．０５）（図４Ａ）。同様に、低密度ａＡＰＣと共に増幅させたＣＤ８＋Ｔ細胞は、有意に少ないエフェクターメモリー表現型のＴ細胞を含有していたが（１０：１＝６６．１±１２．５％、１：２＝８９．１±１．７％、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）（ｐ＜０．０５）、より多くセントラルメモリー表現型を含有していた（１０：１＝３２．３±１１．７％、１：２＝６．５±２．８％、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）（ｐ＜０．０５）。低密度ａＡＰＣで刺激された有意に少ないＣＤ４＋Ｔ細胞はグランザイムＢを産生し（ｐ＜０．００１）、低密度ａＡＰＣで刺激された少ないＣＤ８＋Ｔ細胞はグランザイムＢ（ｐ＜０．０５）またはパーフォリン（ｐ＜０．００１）を産生する（図４Ｂ）。ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激を与えた場合、低密度ａＡＰＣ及び高密度ａＡＰＣで増幅させたＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の同等な産生が示されたが、低密度ａＡＰＣで刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ（ｐ＜０．００１）及びＴＮＦ−α（ｐ＜０．０５）の産生は有意に少ないが、より多いＩＬ−２産生（ｐ＜０．０５）を示した（図４Ｃ）。まとめると、これらのデータから、低密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞は、高密度ａＡＰＣで増幅させたＴ細胞と比較して、セントラルメモリー表現型Ｔ細胞を高い割合で含有し、エフェクター分子のグランザイムＢ及びパーフォリンの低産生、並びにエフェクターサイトカインのＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの低産生のを含むことが示唆される。
実施例４−Ｔ細胞の細胞数増幅がもたらすＴＣＲαβ多様性の最小変化
低密度ａＡＰＣ及び高密度ａＡＰＣでの増幅前後に、多重デジタルプロファイリングｎＣｏｕｎｔｅｒ解析（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ワシントン州シアトル）を使用して、ＴＣＲα及びＴＣＲβの多様性のプロファイリングを行い、各ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の相対存在量を総Ｔ細胞集団のパーセンテージとして計算した。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、低密度ａＡＰＣ及び高密度ａＡＰＣでエキソビボ増幅させた後、ＴＣＲα及びＴＣＲβの多様な対立遺伝子を発現したが、このことは、増幅で得られた集団が、オリゴクローン性のＴＣＲα及びＴＣＲβレパトアを維持したことを示す（図５及び図６）。エキソビボの増幅がＴ細胞のクローン組成に変化をもたらすのかどうかを決定するため、低密度及び高密度のａＡＰＣでの増幅前後のＴ細胞のＴＣＲβ鎖におけるＣＤＲ３領域のハイスループット配列決定をＩｍｍｕｎｏＳＥＱプラットフォーム（Ａｄａｐｔｉｖｅ ＴＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ワシントン州シアトル）を使用して実施した。増幅前後の個々のＣＤＲ３配列の相対的カウントをプロットし、線形回帰と合わせた。増幅前後のＣＤＲ３配列の数が同一であれば、線形回帰の傾きは１．０になると予測される。低密度ａＡＰＣと共に増幅させたＴ細胞では、線形回帰の傾きは０．７５±０．００１であり、高密度ａＡＰＣと共に増幅させたＴ細胞では線形回帰の傾きは０．２９±０．００３であった（図７）。このことは、低密度ａＡＰＣと共に増幅させたＴ細胞集団は、高密度ａＡＰＣと共に増幅させたＴ細胞よりも、投入Ｔ細胞集団からのＣＤＲ３配列を多く維持することを指す。要約すると、Ｔ細胞をエキソビボで増幅させると、低密度ａＡＰＣ及び高密度ａＡＰＣで増幅させた場合にオリゴクローン性のＴ細胞集団となるが、低密度ａＡＰＣと共に増幅させたＴ細胞は、増幅後のクローン性喪失が少ない場合がある。
実施例５−ａＡＰＣで細胞数を増幅させたＴ細胞へのＲＮＡ移入
低密度ａＡＰＣ及び高密度ａＡＰＣで刺激されたＴ細胞が電気泳動転写によってＲＮＡを受け入れる能力を決定するため、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするインビトロ転写されたＲＮＡを、多様な電気穿孔プログラムを使用するＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ４Ｄトランスフェクション装置（Ｌｏｎｚａ、ドイツ、ケルン）を使用して電気泳動転写させ、そこには、ａＡＰＣ刺激から４日後の刺激Ｔ細胞用に製造者が推奨するプログラムであるＥＯ−１１５プログラムが含まれていた。ＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）とＰＩ染色により測定したＴ細胞の生存率とをプロットしたところ、ＲＮＡ移入後のＧＦＰ発現とＴ細胞生存率は逆相関することがわかった。低密度ａＡＰＣで刺激したＴ細胞と比較すると、高密度ａＡＰＣで刺激したＴ細胞は、どの被験電気穿孔プログラムに対しても応答して、ＲＮＡ移入によるＧＦＰ低発現及び低生存率の両方を示した（図８Ａ）。その結果、以降のすべての実験では低密度ａＡＰＣで刺激したＴ細胞（Ｔ細胞：ａＡＰＣ＝１０：１）を使用した。注入用に臨床上関連するＴ細胞数を達成するためにはＲＮＡ移入前にＴ細胞数を増幅させることが望ましいので、９日おきにａＡＰＣを繰り返し付加して複数回の刺激を受けたＴ細胞が電気泳動転写によるＲＮＡ転写産物を受け入れる能力を評価した。各回の刺激を重ねるごとに、ＲＮＡ電気泳動転写後のＧＦＰ発現は低下していった（図８Ｂ、左パネル）。しかし、２回の刺激後、Ｔ細胞は、１回の刺激を受けたＴ細胞または３回の刺激を受けたＴ細胞と比べて、電気泳動転写後の生存率改善を示した（図８Ｂ、右パネル）。したがって、ＲＮＡ転写産物の移入をさらに最適化するために、Ｔ細胞：ａＡＰＣ＝１０：１での刺激を２回行う刺激プロトコルを選択した。ＲＮＡはＤＮＡよりも細胞に対する毒性が少なく、多くの細胞型に容易に移入されるので（１６５）、製造者推奨のＴ細胞刺激用電気穿孔プログラムＥＯ−１１５の強度を下げることにより、Ｔ細胞生存率を低下させることなくＲＮＡ移入の有効性を改善できるであろうと考えた。ＧＦＰを発現している細胞の割合と、ＰＩ染色で測定した生存率とをプロットすることにより、電気穿孔後２４時間のＧＦＰ発現が約１００％であり、かつＴ細胞生存率が電気穿孔されないＴ細胞と同様であったプログラムは、プログラムＤＱ−１１５であることを特定した（図８Ｃ）。ＲＮＡ電気泳動転写によってＴ細胞表現型が変わるかどうかを決定するため、最適化したプロトコルで電気穿孔した後、Ｔ細胞表現型を評価した。電気穿孔にＲＮＡ転写産物を用いても用いなくても、その後のＴ細胞表現型において変化は検出されなかった（図８Ｄ）。以上のことから、Ｔ細胞生存率を低下させることなくＲＮＡ転写産物を高発現させたａＡＰＣとの共培養を介して細胞数を増幅させたＴ細胞にＲＮＡを移入するためのプラットフォームを作製した。
実施例６−ＤＮＡまたはＲＮＡ移入で修飾したＴ細胞のＣＡＲ発現及び表現型
ＲＮＡ修飾及びＤＮＡ修飾により製造した各ＣＡＲ＋Ｔ細胞のＣＡＲ発現及び機能を比較するため、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲを、臨床上利用可能な抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブのｓｃＦｖから作製した。セツキシマブのｓｃＦｖを、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、並びにＣＤ３−ζの細胞質ドメインと融合させて第２世代ＣＡＲを形成し、これをＣｅｔｕｘ−ＣＡＲとし、ＤＮＡに永久的に組込むためにＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンに発現させ、同様に、ＲＮＡ転写産物のインビトロ転写用にｐＧＥＭ／Ａ６４ベクター内のＴ７プロモーター下に発現させた。Ｔ細胞のＲＮＡ修飾は、インビトロ転写されたＣｅｔｕｘ−ＣＡＲを、ＯＫＴ３搭載Ｋ５６２ ａＡＰＣで２回刺激したＴ細胞に、第２の刺激から４日後に電気泳動転写を行うことにより達成した（図９Ａ）。電気泳動転写の２４時間後、ＣＡＲ発現を評価した。ＤＮＡを安定的に組込むため、ＳＢトランスポゾンに発現したＣｅｔｕｘ−ＣＡＲを、ＳＢ１１トランスポザーゼを有するヒト初代Ｔ細胞に電気穿孔した。ＳＢ１１トランスポザーゼは、トランスポゾンからＣＡＲを切り出し逆ＴＡリピートで宿主Ｔ細胞ゲノム内に挿入するカット・アンド・ペースト型酵素である。γ照射したＥＧＦＲ＋Ｋ５６２ ａＡＰＣで繰り返し刺激したところ、ＣＡＲを発現しているＴ細胞が時間と共に選択的に増幅され、７日おきにａＡＰＣ付加を繰り返すサイクルを５サイクル行ってから２８日後、Ｔ細胞をＣＡＲ発現について評価した（図９Ｂ）。ＣＡＲのＩｇＧ４ヒンジ領域についてのフローサイトメトリーで測定した、ＲＮＡ修飾及びＤＮＡ修飾による各Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲのＣＤ４＋及びＣＤ８＋での発現は、有意差はなかった（ｐ＞０．０５）が、ＲＮＡ修飾の方が発現強度のばらつきが大きかった（図１０Ａ）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞のうち、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合はＲＮＡ修飾Ｔ細胞とＤＮＡ修飾Ｔ細胞との間で統計的差はなかったが、ＤＮＡ修飾Ｔ細胞中に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の方が、ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞中のそれよりもばらつきが大きかった（図１０Ｂ）。
ＲＮＡ修飾またはＤＮＡ修飾によりＣｅｔｕｘ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞集団の表現型を比較するため、表現型マーカーをフローサイトメトリーで分析した。ＲＮＡ修飾をしたＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞では、ＤＮＡ修飾をしたＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりもセントラルメモリー表現型Ｔ細胞が有意に多かった（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡｎｅｇ）（ＤＮＡ修飾＝６．６±１．９％、ＲＮＡ修飾＝４９．６±３．０％、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）が、エフェクターメモリー表現型Ｔ細胞は有意に少なかった（ＣＣＲ７ｎｅｇＣＤ４５ＲＡｎｅｇ）（ＤＮＡ修飾＝８９．８±２．６％、ＲＮＡ修飾＝４８．１±３．３％、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）（図１０Ｃ）。同様に、ＲＮＡ修飾ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞では、ＤＮＡ修飾ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりもセントラルメモリー表現型Ｔ細胞が有意に多かった（ＤＮＡ修飾＝１０．４±４．９％、ＲＮＡ修飾＝３２．８±４．２％、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）（ｐ＜０．００１）が、エフェクターメモリー表現型Ｔ細胞は有意に少なかった（ＤＮＡ修飾＝８３．５±５．４％、ＲＮＡ修飾＝５１．１±６．６％、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）（ｐ＞０．０００１）。また、ＲＮＡで修飾したＣＤ４＋Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりも抑制受容体であるプログラム死受容体１（ＰＤ−１）の有意に高い発現を示した（ｐ＜０．０１）が、Ｔ細胞老化マーカーであるＣＤ５７の発現は同様に低かった（図１０Ｄ）。ＣＤ８＋Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞はＰＤ−１及びＣＤ５７を低レベルで発現し、ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞とＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞との間に感知されるほどの差はなかった。最後に、細胞傷害性分子のパーフォリン及びグランザイムＢの発現は、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲのＤＮＡ修飾またはＲＮＡ移入による修飾を行ったいずれのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞においも同様であった（図１０Ｅ）。要約すると、ＣＡＲ＋Ｔ細胞のＲＮＡ修飾もＤＮＡ修飾も、同様のＣＡＲ発現レベルをもたらしたが、ＲＮＡ移入の方がＣＡＲ発現の強度のばらつきが高かった。ＲＮＡ修飾Ｔ細胞は、ＤＮＡ修飾Ｔ細胞よりも、多くのセントラルメモリー表現型のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を発現し、少ないエフェクターメモリー表現型のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を発現し、また、ＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞上の抑制受容体ＰＤ−１の発現が高かった。
実施例７−ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞より多くサイトカインを産生し、わずかに高い細胞傷害性を示す
ＲＮＡ修飾またはＤＮＡ修飾したＣＡＲ＋Ｔ細胞のサイトカイン産生について、マウスＴ細胞性リンパ腫細胞株ＥＬ４を修飾して切断型ＥＧＦＲを発現するようにしたｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４、またはマウスＴ細胞性リンパ腫細胞株ＥＬ４を修飾して関連性のない抗原ＣＤ１９を発現するようにしたもの、並びに、ヒト膠芽腫細胞株のＵ８７、Ｔ９８Ｇ、ＬＮ１８及びヒト類表皮癌細胞株Ａ４３１などのＥＧＦＲ＋細胞株に応答させて評価した。ＲＮＡ移入により修飾したＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞では、各ＥＧＦＲ発現細胞株に応答してＩＦＮ−γを産生した細胞は少なかった（図１１Ａ、左パネル）。抗原とは無関係のＰＭＡ／イオノマイシンによる刺激に応答してＩＦＮ−γを産生したＲＮＡ修飾Ｔ細胞が少ないことから、ＩＦＮ−γ低産生は、抗原に対するＣＡＲの感受性が低いためではなく、むしろＲＮＡ修飾によりＣＡＲを発現しているＴ細胞のサイトカイン産生能が低いためであると考えられる。ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞を刺激しなかった場合にバックグランドのＩＦＮ−γ産生も高かったことに注目した。同様に、ＲＮＡ修飾ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞では、ＤＮＡ修飾ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりも、Ｔ９８Ｇ、ＬＮ１８、Ａ４３１からのＥＧＦＲ特異的な刺激及びＰＭＡ／イオノマイシンからの抗原とは無関係な刺激に応答してＴＮＦ−αを産生した細胞は少なかった（図１１Ａ、右パネル）。
ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりもサイトカイン産生能が低かったことから、ＲＮＡ修飾Ｔ細胞及びＤＮＡ修飾Ｔ細胞の細胞傷害性を比較し、ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比べたＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害の可能性を決定した。ＣＤ１９＋ＥＬ４細胞に対する応答では、ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、エフェクターとターゲットの比が高い場合でも（Ｅ：Ｔ＝２０：１）バックグランドの殺滅レベルは低く、ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりも有意に高いバックグランドでの溶解を示した（ｐ＜０．０５）（図１１Ｂ）。同様に、ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＮＡＬＭ−６に対して低い同等レベルのバックグランドでの溶解を示した。ｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４及びＡ４３１に対する応答では、ＲＮＡ修飾またはＤＮＡ修飾をしたＣＡＲ＋Ｔ細胞に仲介された細胞傷害性において、感知されるほどの差はなかった。神経膠腫細胞株Ｕ８７、Ｔ９８Ｇ、及びＬＮ１８の３株に対する応答では、ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、エフェクター：ターゲット比が低い時に限り検出された、ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりわずかに高い細胞傷害性を示した。ＲＮＡ修飾Ｔ細胞は、ＤＮＡ修飾Ｔ細胞よりもドナー間でＣＡＲ発現にばらつきがあるため、ＣＡＲ発現の蛍光強度中央値で測定したＣＡＲ発現のＡ４３１特異的溶解に対する影響を評価した。ＣＡＲ発現の蛍光強度中央値をＡ４３１特異的溶解に対してプロットしたところ、関係の線形回帰からゼロとは有意に異ならない傾きが得られ、そのため、ＣＡＲ発現と特異的溶解との間に検出された有意な傾向は示されなかった（傾き＝０．０２３７±０．０３０、ｐ＝０．４７９８）（図１１Ｃ）。要約すると、これらの知見から、ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりエフェクターサイトカインのＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生が有意に高く、低いエフェクター：ターゲット比で存在する場合にわずかに高い細胞傷害性を示すこと、及びＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のばらつきは標的特異的溶解性に有意に影響しないことが示唆される。
実施例８−Ｔ細胞のＲＮＡ修飾によるＣｅｔｕｘ−ＣＡＲの一過性発現
ＲＮＡ移入によるＣＡＲ発現の安定性を測定するため、ＣＡＲを発現するようＲＮＡ移入によりＴ細胞を修飾し、フローサイトメトリーでＣＡＲ発現を経時的に測定した。ＲＮＡ移入後、Ｔ細胞上のＣｅｔｕｘ−ＣＡＲの発現は経時的に減少し、電気泳動転写の９６時間後、ＣＡＲは低レベルで発現していた（図１２Ａ）。ＲＮＡ転写産物は、Ｔ細胞増殖中に娘細胞の間で分割されるので、Ｔ細胞増殖の刺激によりＲＮＡ修飾により発現したＣＡＲの消失が促進されるはずである。サイトカイン刺激がＣＡＲの発現レベルに与える影響を測定するため、ＲＮＡの移入から２４時間後、外因性のＩＬ−２及びＩＬ−２１をＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞培養に加え、ＣＡＲ発現をフローサイトメトリーで監視した。ＩＬ−１及びＩＬ−２１でのＣＡＲ＋Ｔ細胞の刺激により、ＣＡＲ発現の消失が促進された（図１２Ｂ）。７２時間後、ＲＮＡ修飾Ｔ細胞上のＣＡＲ発現は低く、移入から９６時間後には、Ｔ細胞はもはやＣＡＲを検出可能レベルで発現していなかった。ＲＮＡ移入から２４時間後にｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４でＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞を刺激したところ、ＣＡＲ発現の消失がより一層促進された（図１２Ｃ）。ｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４を加える前は、ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞においてＣＡＲが高レベルで検出されたが、ｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４付加から２４時間後（ＲＮＡ移入から４８時間後）、ＣＡＲ発現は低かった。まとめると、これらのデータは、ＲＮＡの移入によるＣＡＲ発現は一過性であり、ＲＮＡの移入から１２０時間後までは低レベルで検出可能であるが、サイトカインまたは抗原認識を介してＴ細胞が刺激されるとＣＡＲ発現の消失が促進されることを指している。
実施例９−ＲＮＡ修飾によるＣｅｔｕｘ−ＣＡＲの一過性発現はサイトカイン産生及びＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞傷害性を抑制する
ＲＮＡ移入によりＣｅｔｕｘ−ＣＡＲを発現するよう修飾したＴ細胞の活性を、ＲＮＡの移入から２４時間後及び１２０時間後に測定し、ＥＧＦＲ発現細胞に応答したＴ細胞の活性に及ぼすＣＡＲ発現消失の影響を決定した。ＲＮＡ修飾Ｔ細胞は、ＲＮＡ移入から２４時間後及び１２０時間後の評価では、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激によるＩＦＮ−γ産生は同等であることを示したが、ＲＮＡの移入から２４時間後にＴ細胞がｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４に応答して産生したＩＦＮ−γは、ＲＮＡの移入から１２０時間後には抑止されていた（２４時間＝１４．２±２．５％、１２０時間＝１．１±０．０３％、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）（ｐ＝０．０１２）（図１３Ａ）。対照的に、ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞では、ｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４に応答したＩＦＮ−γの産生はいずれの測定時点においても同等であった（２４時間＝４０．３±９．６％、１２０時間＝４８．６±１０．０％、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）（ｐ＝０．４９０）。同様に、ＥＧＦＲを発現する、類表皮癌細胞株Ａ４３１及びヒト正常腎臓上皮細胞（ＨＲＣＥ）に対する特異的細胞傷害性を測定した。ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、同等のＡ４３１特異的溶解性、及びＨＲＣＥに対する同様の細胞傷害性を示し、高いエフェクター：ターゲット比では統計的に同等であった（２０：１及び１０：１、ｐ＞０．０５）（図１３Ｂ）。他の細胞株での所見と同様に、ＤＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＲＮＡ修飾ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりもわずかに高いＨＲＣＥ特異的溶解性を低いエフェクター：ターゲット比において仲介した（５：１、ｐ＜０．０５；２．５：１、ｐ＜０．０１、１．２５：１、ｐ＜０．０５）。しかし、ＲＮＡの移入から１２０時間後、ＲＮＡ修飾Ｔ細胞のＣＡＲ発現は抑止され、ＤＮＡ修飾Ｔ細胞はどの被験エフェクター：ターゲット比においてもＡ４３１及びＨＲＣＥに応答して有意に高い特異的溶解性を仲介した（Ａ４３１、全エフェクター：ターゲット比、ｐ＜０．０００１；ＨＲＣＥ、全エフェクター：ターゲット比、ｐ＜０．０００１）。ＤＮＡ修飾Ｔ細胞は、各測定時点でのＨＲＣＥ特異的溶解性に変化を示さなかったが（エフェクター：ターゲット比＝１０：１、２４時間＝４５．５±８．０％、１２０時間＝５１．６±７．８％、ｐ＞０．０５、ｎ＝３）、ＲＮＡ修飾Ｔ細胞は、ＲＮＡ移入から１２０時間後までにはＨＲＣＥ特異的溶解性を有意に低下させた（エフェクター：ターゲット比＝１０：１、２４時間＝３９．５±５．９％、１２０時間＝１９．８±１０．２％、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）（図１３Ｃ）。これらのデータは、ＥＧＦＲを発現している標的に応答した、ＤＮＡ修飾ではなくＲＮＡ修飾をしたＴ細胞の活性は、ＣＡＲ発現の消失により低下することを示している。
実施例１０−Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は表現型が類似する
Ｎｉｍｏ−ＣＡＲという名称のＮｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）由来の第２世代ＣＡＲをＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンに作製し、その際、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）のｓｃＦｖと、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン並びにＣＤ２８及びＣＤ３ζの細胞内ドメインとを融合させ、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲと同一構成で作製した。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ及びＮｉｍｏ−ＣＡＲを、ＳＢ１１トランスポザーゼを有する各トランスポゾンを末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内に電気穿孔することにより、初代ヒトＴ細胞に発現させた。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲまたはＮｉｍｏ−ＣＡＲを安定的に組み込んだＴ細胞は、γ照射ｔＥＧＦＲ＋Ｋ５６２人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を用いた週１回の繰り返し刺激により選択的に増殖した（図１４Ａ）。いずれのＣＡＲも、ａＡＰＣを用いた２８日間の共培養で約１０００倍のＣＡＲ＋Ｔ細胞増幅を仲介し、Ｔ細胞のほぼすべてがＣＡＲを発現した（Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＝９０．８±６．２％、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＝９０．６±６．１％；平均±ＳＤ、ｎ＝７）（図１４Ｂ及び１４Ｃ）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋のＴ細胞が発現しているＣＡＲの割合は２８日間の細胞数増幅後において統計的に同様であった（ｐ＝０．９２、両側スチューデントｔ検定）。蛍光強度中央値で表されるＣＡＲ発現の密度をフローサイトメトリーで測定したところ、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋の各Ｔ細胞集団間で統計的に同様であった（Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＝１１８．５±２５．０Ａ．Ｕ．、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＝１１２．６±２１．２Ａ．Ｕ．；平均±ＳＤ、ｎ＝７）（ｐ＝０．７４）（図１４Ｄ）。
ＣＡＲ ｓｃＦｖがＴ細胞機能に与える影響を決定するために、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の電気穿孔及び増殖を行い、表現型が同様のＴ細胞集団にした。各ドナーでＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の比にばらつきがあったが（表１）、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞間でＣＤ４／ＣＤ８比に統計的差はなかった（ｐ＝０．４４、両側スチューデントｔ検定）（図１５Ａ）。分化マーカーＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌの発現は統計的に有意ではなく（ｐ＞０．０５）、これは不均一なＴ細胞集団であることを指している（図１８Ｂ）。同様に、老化マーカーＣＤ５７及びＫＬＲＧ１並びに抑制受容体プログラム死受容体１（ＰＤ−１）は低量であり、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋各Ｔ細胞集団間で有意差がないことがわかった（ｐ＞０．０５）（図１５Ｃ）。全体として、これらの知見は、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞間には、電気穿孔及び増殖後に、ＣＡＲ発現を含めた表現型に検出可能な相違はなく、そのまま比較が可能であることを示している。
Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞における増幅から２８日後のＣＤ４及びＣＤ８の発現をフローサイトメトリーにより測定した。独立した７ドナーからのデータ。
実施例１１−Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞はＣＡＲ依存性Ｔ細胞活性化能が同等である
Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ及びＮｉｍｏ−ＣＡＲがＥＧＦＲでの刺激に応答して機能することを確認するため、ＣＡＲ＋Ｔ細胞をＡ４３１類表皮癌細胞株とインキュベートした。Ａ４３１類表皮癌細胞株は、ＥＧＦＲを約１ｘ１０６ＥＧＦＲ分子／細胞という高いレベルで発現することが報告されている（Ｇａｒｒｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。Ｃｅｔｕｘ−及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ａ４３１との共培養中にＩＦＮ−γを産生したが、ＥＧＦＲに対する結合を遮断する抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の存在下では産生が低下した（図１６Ａ）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ及びＮｉｍｏ−ＣＡＲが同等にＴ細胞を活性化できることを確認するため、ｓｃＦｖドメインとは無関係に両方のＣＡＲによって認識され得る標的を作製した。標的作製は、ＣＡＲのＩｇＧ４領域に対して特異的な活性化抗体（ＣＡＲ−Ｌ）のｓｃＦｖ領域をマウス不死化Ｔ細胞株ＥＬ４上に発現させることによって達成した（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＣＡＲ−Ｌ＋ＥＬ４によるＴ細胞の活性化と、ｔＥＧＦＲを発現しているＥＬ４細胞株によるＴ細胞の活性化とを比較した。定量フローサイトメトリーを実施してＥＬ４上のｔＥＧＦＲ発現密度を測定した。この方法では、蛍光抗体で標識した既知の抗体結合能を有する微粒子からの蛍光の強度をフローサイトメトリーにより測定し、既知の抗体結合能と平均蛍光強度（ＭＦＩ）との間の直線関係を定義する標準曲線を導くために使用する。標準曲線はその後、同一の蛍光抗体で標識した未知試料の平均蛍光強度から平均抗原発現密度を導くために使用できる。ｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４は、ｔＥＧＦＲを約４５，０００分子／細胞という比較的低密度で発現した（図１６Ｂ）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｌ＋ＥＬ４に応答して統計的に同量のＩＦＮ−γを示し、このことはＣＡＲ依存性活性化能が同等であることを示している（ｐ＞０．０５）（図１６Ｃ）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞はＥＧＦＲ＋に応答してＩＦＮ−γを産生したが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞より顕著なＩＦＮ−γ産生はなかったことから（図１６Ｃ）、低抗原密度に応答したＴ細胞活性化に対する、ＣＡＲのｓｃＦｖの親和性による影響の場合と一致している。サイトカイン産生の測定に加え、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞活性化の下流の分子、Ｅｒｋ１／２及びｐ３８のリン酸化について分析した。ＣＡＲ−Ｌ＋ＥＬ４に応答したリン酸化はＥｒｋ１／２（ｐ＞０．０５）またはｐ３８（ｐ＞０．０５）で、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞間に統計的差はかなった（図１６Ｄ）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４に応答してＥｒｋ１／２及びｐ３８のリン酸化を示したが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞ではどちらの分子にも認め得るほどのリン酸化は起こらなかった。同様に、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ及びＮｉｍｏ−ＣＡＲはいずれもＣＡＲ−Ｌ＋ＥＬ４に対して同等の特異的溶解性を示した（エフェクター：ターゲット比＝１０：１、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＝６４．５±６．７％、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＝５７．５±１２．９％、平均±ＳＤ、ｎ＝４）（ｐ＞０．０５）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、非特異的標的ＣＤ１９＋ＥＬ４の場合に比べて、ｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４に応答した特異的溶解性を有意に示したが（ｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４＝５７．５±９．４％、ｔＣＤ１９＋ＥＬ４＝１７．３±１３．０、平均±ＳＤ、ｎ＝４）（ｐ＜０．０００１）、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞によるｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４の有意な溶解はなかった（ｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４＝２１．２±１６．９％、ＣＤ１９＋ＥＬ４＝１２．３±１３．０、平均±ＳＤ、ｎ＝４）（ｐ＞０．０５）（図１６Ｅ）。内在性の低親和性Ｔ細胞の応答には、エフェクター機能を達成するために抗原との長い相互作用を必要とする場合があるため（Ｒｏｓｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）、ＣＡＲ＋Ｔ細胞がｔＥＧＦＲ＋細胞及びＣＡＲ−Ｌ＋ＥＬ４細胞の増殖を制御する能力を、Ｔ細胞とＥＬ４とを１：１の比で混合してＥＬ４細胞に対するＴ細胞の割合を長期共培養にわたって評価することにより評価した。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、５日後の共培養中のＣＡＲ−Ｌ＋ＥＬ４細胞の割合は低かったことで実証されるように、ＣＡＲ−Ｌ＋ＥＬ４の増殖を同等に制御した（ｐ＞０．０５）（図１６Ｆ）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞はｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４の増殖を制御し、５日後の共培養中のｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４は１０％未満であった。Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞のｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４細胞増殖制御能は弱く、５日後の共培養中のｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４は８０％を占め、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞で共培養した場合より有意に高かった（ｐ＜０．０１）。したがって、ｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４上の低密度ｔＥＧＦＲに対するＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の低応答は、活性化のための時間が不十分だったためではないと考えられる。要約すると、これらのデータは、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＥＧＦＲに対する機能的特異性を有し、ＣＡＲ依存的、ｓｃＦｖ非依存的刺激によって同等に活性化され得ることを実証している。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４上の低密度ｔＥＧＦＲに応答して特異的に活性化することができたが、このＥＧＦＲ発現密度は、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞を活性化させて、サイトカイン産生、下流分子Ｅｒｋ１／２及びｐ３８リン酸化、または特異的溶解の開始をもたらすには十分ではなかった。
実施例１２−Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の活性化及び機能的応答は標的細胞上のＥＧＦＲ発現密度に影響される
Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の活性化にＥＧＦＲ発現密度が及ぼす影響を調べるため、ある範囲のＥＧＦＲ発現密度の細胞株、すなわち、ＮＡＬＭ−６、Ｕ８７、ＬＮ１８、Ｔ９８Ｇ、及びＡ４３１に対するＴ細胞機能を比較した。最初に、定量フローサイトメトリーによりＥＧＦＲ発現密度を評価した（図１７Ａ）。Ｂ細胞白血病細胞株であるＮＡＬＭ−６はＥＧＦＲを発現しなかった。ヒト膠芽腫細胞株であるＵ８７は、ＥＧＦＲを低密度で（約３０，０００分子／細胞）発現した。ヒト膠芽腫細胞株であるＬＮ１８及びＴ９８Ｇは、ＥＧＦＲを中程度の密度（それぞれ、約１６０，０００及び約２０５，０００分子／細胞）で発現し、Ａ４３１ではＥＧＦＲの高密度（約７８０，０００分子／細胞）発現が見られ、これまでの報告と同様であった（Ｇａｒｒｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＥＧＦＲ高密度のＡ４３１（ｐ＞０．０５）及びＥＧＦＲ中密度のＬＮ１８（ｐ＞．０５）に応答して、統計的に同様のＩＦＮ−γ産生を示した。しかし、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりも、ＥＧＦＲ中密度のＴ９８Ｇ（ｐ＜０．００１）及びＥＧＦＲ低密度のＵ８７（ｐ＜０．００１）に応答してＩＦＮ−γ低産生を示した（図１７Ｂ）。同様に、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、統計的に同等な溶解性をＡ４３１細胞（エフェクター：ターゲット比＝５：１、ｐ＞０．０５）及びＴ９８Ｇ細胞（エフェクター：ターゲット比＝５：１、ｐ＞０．０５）について示したが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、いくらか低いＬＮ１８細胞特異的溶解能（エフェクター：ターゲット比＝５：１、ｐ＜０．０５）及び低いＵ８７細胞特異的溶解能（エフェクター：ターゲット比＝５：１、ｐ＜０．０１）を示した（図１７Ｃ）。これらのデータは、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の活性化はＥＧＦＲ発現密度の影響を受けることを支持している。しかし、細胞株が異なると、Ｔ細胞活性化の傾向及びＴ細胞を介した溶解性に対する感受性が異なり得ることから、細胞バックグランドが異なる状況においてＥＧＦＲ密度に対して機能評価を行うことは理想的ではない。
実施例１３−Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の機能の活性化は、ＥＧＦＲ発現密度と直接的かつ正の相関を示す
ＥＧＦＲ発現密度が同系細胞のバックグランドに及ぼす影響を決定するため、密度の異なるＥＧＦＲを発現している一連のＵ８７細胞株を作製し、非修飾親Ｕ８７（ＥＧＦＲ分子約３０，０００個／細胞）、Ｕ８７ｌｏｗ（ＥＧＦＲ分子１３０，０００個／細胞）、Ｕ８７ｍｅｄ（ＥＧＦＲ分子３４０，０００個／細胞）、及びＵ８７ｈｉｇｈ（ＥＧＦＲ分子６３０，０００個／細胞）とした（図１８Ａ）。ｓｃＦｖ依存的ＣＡＲ刺激を行った後のＥｒｋ１／２及びｐ３８のリン酸化を比較するため、Ｕ８７及びＵ８７ｈｉｇｈの刺激後に、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞間でリン酸化動態に相違がないことを確認した。どちらのＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞も、相互作用４５分後にＥｒｋ１／２及びｐ３８のリン酸化ピークを示し、相互作用１２０分後までにリン酸化が低下し始めた（図１８Ｂ）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞間でリン酸化動態に目立った違いはかなったので、以降の実験では、以降のどの実験の場合も相互作用から４５分後のＥｒｋ１／２及びｐ３８のリン酸化を評価した。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｕ８７の４細胞株すべてに対する応答においてＥｒｋ１／２及びｐ３８をリン酸化し、ＥＧＦＲ発現密度との相関を示さなかった（線形傾向について事後検定を行う片側ＡＮＯＶＡ；Ｅｒｋ１／２、ｐ＝０．８８；ｐ３８、ｐ＝０．０９）（図１８Ｃ）。対照的に、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋ ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＥｒｋ１／２及びｐ３８のリン酸化は、ＥＧＦＲ発現密度と直接相関した（線形傾向について事後検定を行う片側ＡＮＯＶＡ、Ｅｒｋ１／２、ｐ＝０．００３０及びｐ３８ ｐ＝０．００４４）。Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｕ８７ｈｉｇｈ上のＥＧＦＲ高密度に応答した場合でもＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりも有意に少ないＥｒｋ１／２及びｐ３８のリン酸化ｐｆを示した（Ｅｒｋ１／２、ｐ＜０．０００１；ｐ３８、ｐ＜０．０１）。同様に、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｕ８７、Ｕ８７ｌｏｗ、Ｕ８７ｍｅｄ及びＵ８７ｈｉｇｈに応答してＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを産生し、産生とＥＧＦＲ発現密度とは相関していなかった（線形傾向について事後検定を行う片側ＡＮＯＶＡ；ＩＦＮ−γ、ｐ＝０．５７０３及びＴＮＦ−α、ｐ＝０．６１８９）（図１８Ｄ）。対照的に、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＥＧＦＲ発現密度と直接相関してＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを産生した（線形傾向について事後検定を行う片側ＡＮＯＶＡ；ＩＦＮ−γ、ｐ＝０．０１２４及びＴＮＦ−α、ｐ＝０．０００６）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋ ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも有意に多いサイトカインを、Ｕ８７（ＩＦＮ−γ、ｐ＜０．０００１；ＴＮＦα、ｐ＜０．０１）またはＵ８７ｌｏｗ（ＩＦＮ−γ、ｐ＜０．００１；ＴＮＦα、ｐ＜０．０１）での刺激に応答して産生したが、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、統計的に同様のサイトカイン産生を、Ｕ８７ｍｅｄ（ＩＦＮ−γ、ｐ＞０．０５；ＴＮＦα、ｐ＞０．０５）またはＵ８７ｈｉｇｈ（ＩＦＮ−γ、ｐ＞０．０５；ＴＮＦα、ｐ＞０．０５）での刺激に応答して示した。同様に、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりも有意に高い溶解性をＵ８７（エフェクター：ターゲット比＝１０：１、ｐ＜０．０００１）及びＵ８７ｌｏｗ（エフェクター：ターゲット比＝１０：１、ｐ＜０．０５）について示したが、統計的に同様の特異的溶解性をＵ８７ｍｅｄ（エフェクター：ターゲット比＝１０：１、ｐ＞０．０５）及びＵ８７ｈｉｇｈ（エフェクター：ターゲット比＝１０：１、ｐ＞０．０５）について示した（図１８Ｅ）。要約すると、これらのデータは、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の活性化が標的上のＥＧＦＲ発現密度と直接相関していることを示す。結果として、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＥＧＦＲ高密度に対する応答では同等なＴ細胞活性化を示すが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＥＧＦＲ低密度に対する応答で有意に低い活性化を示す。
内在性の低親和性Ｔ細胞の応答には、エフェクター機能を獲得するために抗原との長い相互作用を必要とする場合があることから（Ｒｏｓｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞間で観察されたＴ細胞活性における相違が、内在性Ｔ細胞と同様に長い相互作用をＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞が要するためではないことを確認した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞と標的との相互作用を延長してもサイトカイン産生は実質的に増加せず、また、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋のＣＤ８＋Ｔ細胞間でのサイトカイン産生関係は変わらなかった（図１９Ａ）。同様に、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞がＵ８７及びＵ８７ｈｉｇｈの増殖を経時的に制御する能力を評価したところ、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｕ８７ｈｉｇｈについて統計的に同様の増殖制御能を示し、ＣＡＲ＋Ｔ細胞非存在下で増殖させた対照群と比べて細胞数を８０％減少させることがわかった（ｐ＞０．０５）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、内因的にＥＧＦＲ発現が低いＵ８７の増殖を制御し、ＣＡＲ＋Ｔ細胞非存在下で増殖させた対照群と比べて細胞数を４０％減少させた。しかし、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、有意に少ないＵ８７増殖制御を示し、細胞数の明らかな減少は見られなかった（ｐ＜０．００１）（図１９Ｂ）。これらのデータは、Ｕ８７上の低ＥＧＦＲに応答したＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞活性は、Ｔ細胞と標的との相互作用時間を延長しても改善されないことから、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の活性低下は、Ｔ細胞活性化に長い相互作用を必要とするためではないと考えられることを示している。
ＣＡＲ依存性Ｔ細胞活性化には最小密度を超えるＣＡＲ発現が必要であり、ＣＡＲ発現の密度を増加させると、抗原に対するＣＡＲの感受性に影響を与えることが示されている（Ｗｅｉｊｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｔｕｒａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。したがって、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲを高密度で発現させることによってＥＧＦＲ低密度の認識が改善されるかどうかを決定するため、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ及びＮｉｍｏ−ＣＡＲをヒト初代Ｔ細胞に過剰発現させる試みがなされた。電気穿孔トランスフェクションでのＤＮＡ負荷は、細胞に対するＤＮＡの毒性のため制限されるが、ＲＮＡの移入は相対的に非毒性であり、送達されるＣＡＲ ＲＮＡ転写産物の増量により過剰発現させやすい。したがって、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ及びＮｉｍｏ−ＣＡＲをＲＮＡ種としてインビトロ転写し、ヒト初代Ｔ細胞に電気泳動転写した。ＲＮＡの移入により、ドナーが一致するＤＮＡ修飾Ｔ細胞と比較してＣＡＲ発現が２〜５倍増加した（図２０Ａ）。ＣＡＲを過剰発現させても、Ｕ８７上のＥＧＦＲ低密度に対するＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の感受性が高まることはなく、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ及びＮｉｍｏ−ＣＡＲともに、Ｕ８７ｈｉｇｈに応答した同様のサイトカイン産生を示した（図２０Ｂ）。このことは、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞上のＣＡＲ密度を増加させてもＥＧＦＲ低密度に対する感受性は高くならないことを指している。
実施例１４−Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、正常な腎上皮細胞の基礎ＥＧＦＲレベルに対する応答では低活性である
Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、正常細胞の低い基礎ＥＧＦＲレベルに対する応答において低活性であるかどうかを決定するため、正常なヒト腎皮質上皮細胞（ＨＲＣＥ）に対する応答においてＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の活性を評価した。ＨＲＣＥは、細胞あたり約１５，０００個のＥＧＦＲ分子を発現し、Ｕ８７などの腫瘍細胞株での発現よりも低い（図２１Ａ）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＨＲＣＥに応答してＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを産生したが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＨＲＣＥに対する応答において有意に少ないＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αを産生した（ＩＦＮ−γ、ｐ＜０．０５；ＴＮＦ−α、ｐ＜０．０１）（図２１Ｂ）。実際、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、未刺激のバックグランドの産生を超える有意なＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αの産生を示さなかった（ＩＦＮ−γ、ｐ＞０．０５；ＴＮＦ−α、ｐ＞０．０５）。Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞がＨＲＣＥに応答して示した特異的溶解の５０％未満を示し（Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＝８１．１±４．５％、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＝３０．４±１６．７％、平均±ＳＤ、ｎ＝３）、有意に低かった（エフェクター：ターゲット比＝１０：１、ｐ＜０．００１）（図２１Ｃ）。これらの知見は、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＥＧＦＲ密度が非常に低い細胞に対する応答ではＴ細胞機能が低いことを示す。
実施例１５−Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、刺激後にＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞ほどは増殖しないが、ＡＩＣＤの傾向は高くない
結合親和性及び抗原密度の影響を受ける、内在性ＴＣＲシグナルの強度は、抗原性刺激に応答してＴ細胞の増幅に影響を与え得る（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。抗原で刺激した後のＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の増殖反応を評価するため、外因性サイトカイン非存在下でＵ８７またはＵ８７ｈｉｇｈと共培養してから２日後の、Ｋｉ−６７の細胞内発現をフローサイトメトリーで測定した。Ｕ８７上のＥＧＦＲ低密度に応答して、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、統計的に同様の増殖を示した（ｐ＞０．０５）（図２２Ａ）。Ｕ８７ｈｉｇｈに応答して、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋よりも、増殖増加を示し（ｐ＜０．０１）、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋は、Ｕ８７及びＵ８７ｈｉｇｈに応答した統計的差を何ら示さなかった（ｐ＞０．０５）。
ＣＡＲの親和性または抗原密度によりＣＡＲ＋Ｔ細胞がＡＩＣＤに入る傾向が高くなるかどうかを決定するため、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞を外因性サイトカイン非存在下でＵ８７またはＵ８７ｈｉｇｈと共培養し、Ｔ細胞生存率をアネキシンＶ及び７−ＡＡＤ染色により評価した。Ｕ８７に対する応答では、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔは、未刺激のＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比べると生存率の低下を示したが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は生存率における目立った変化を示さなかった（図２２Ｂ）。Ｕ８７ｈｉｇｈに対する応答では、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、未刺激のＣＡＲ＋Ｔ細胞と比べると、統計的に同様の生存率低下を示した（ｐ＞０．０５）。Ｕ８７ｈｉｇｈで刺激したＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｕ８７で刺激したＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比べると、生存率における何ら統計的差を示さなかったことが注目された（ｐ＞０．０５）。これらのデータは、抗原密度は、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞に対してはＡＩＣＤ誘導に影響を及ぼすが、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞に対しては影響はなく、このことはＮｉｍｏ−ＣＡＲ活性が抗原密度に依存するという先のデータを支持していることを示唆している。しかしながら、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞を活性化させ得る高い抗原密度に対する応答において、ＣＡＲのｓｃＦｖドメインの親和性はＡＩＣＤ誘導に影響しないようである。
実施例１６−Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞はＣＡＲの下方制御増強を示す
内在性ＴＣＲは、抗原との相互作用に続いて下方制御され得、その下方制御の程度はＴＣＲ結合の強さに影響される（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。同様に、ＣＡＲは、抗原との相互作用に続いて下方制御され得るが、親和性がＣＡＲ下方制御に与える影響は不明である（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。したがって、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞が抗原誘導性下方制御の傾向が高いかどうかを決定する試みがなされた。これを達成するため、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞をＵ８７またはＵ８７ｈｉｇｈと共培養し、未刺激対照群に対するＣＡＲ発現を監視した。Ｕ８７上のＥＧＦＲ低密度に対する応答では、相互作用の１２時間後のＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ発現は、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲの場合よりも有意に低かった（Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＝６８．０±２７．８％、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＝１２６．５±３４．９％、平均±ＳＤ、ｎ＝３）（ｐ＜０．０５）（図２３Ａ、左パネル）。低密度ＥＧＦＲとの相互作用から４８時間までには、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲはＴ細胞表面に戻り、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ及びＮｉｍｏ−ＣＡＲは、統計的に同様の割合のＴ細胞において発現していた（Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＝９５．５±４０．７、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＝９４．４±１１．８％、平均±ＳＤ、ｎ＝３）（ｐ＞０．０５）。Ｕ８７ｈｉｇｈ上のＥＧＦＲ高密度に対する応答では、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲの発現は、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲよりも有意に低下しており、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲは、相互作用の１２時間後、目立った下方制御をまったく示さなかった（Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＝３７．４±１１．５％、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＝１２４．４±１５．３％、平均±ＳＤ、ｎ＝３）（ｐ＜０．０１）（１２時間、ｐ＜０．０１；２４時間、ｐ＜０．０１；４８時間、ｐ＜０．０５）（図２３Ａ、右パネル）。しかし、ＥＧＦＲ低密度での刺激とは対照的に、相互作用の４８時間後、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲは表面発現を回復せず、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ発現より統計的に低いままであった（Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＝４２．６±５．９％、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＝９５．７±１１．６％、平均±ＳＤ、ｎ＝３）（ｐ＜０．０５）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲがＴ細胞表面からは少なくなった場合でも、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ及びＮｉｍｏ−ＣＡＲはいずれも刺激後の細胞内で検出され、このことは、ＣＡＲ発現の低下はＣＡＲのインターナリゼーションによるものであり、遺伝子非組換えＴ細胞が増殖したためではないことを意味している、（図２３Ｂ）。ＣＡＲ−Ｌ＋ＥＬ４によるＣＡＲ依存性、ｓｃＦｖ非依存的刺激に対する応答では、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ及びＮｉｍｏ−ＣＡＲは、約２０％という弱い統計的に同様な下方制御を示した（図２３Ｃ）。先の結果と同様、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲはｔＥＧＦＲ＋ＥＬ４に応答してわずかな下方制御を示したが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲは、目立った下方制御を何ら示さなかった。要約すると、これらのデータから、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲはＮｉｍｏ−ＣＡＲよりも急速かつ持続的な下方制御を示し、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲはＣＡＲのｓｃＦｖドメインと抗原との相互作用及び抗原密度に依存することがわかる。
実施例１７−Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は抗原での再惹起に対する応答が低い
内在性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答における先行刺激の強度は、抗原で再惹起した際のＴ細胞応答と相関し得る（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００２）。したがって、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞が抗原再惹起に応答する能力を評価した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、Ｕ８７またはＵ８７ｈｉｇｈと２４時間共培養した後、ＩＦＮ−γの産生を評価するため回収してＵ８７またはＵ８７ｈｉｇｈで再惹起した。Ｕ８７及びＵ８７ｈｉｇｈでの初回惹起後、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｕ８７及びＵ８７ｈｉｇｈいずれの再惹起に対する応答においてもＩＦＮ−γ産生は低かった（図２４）。しかし、Ｕ８７またはＵ８７ｈｉｇｈでの初回惹起後、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｕ８７及びＵ８７ｈｉｇｈとの再惹起に応答してＩＦＮ−γ産生を保持した。結果として、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｕ８７に応答して統計的に同様のＩＦＮ−γ産生を示し（ｐ＞０．０５）、Ｕ８７ｈｉｇｈでの再惹起に応答して統計的に多いＩＦＮ−γを示した（Ｕ８７での初回惹起、ｐ＜０．００１；Ｕ８７ｈｉｇｈでの初回惹起ｐ＜０．０１）。これは、初回惹起に応答したＩＦＮ−γ産生とは対照的である。初回惹起では、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｕ８７に応答して少ないＩＦＮ−γを産生し（ｐ＜０．０５）、Ｕ８７ｈｉｇｈに応答して統計的に同様のＩＦＮ−γ産生を示す（ｐ＞０．０５）。したがって、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は抗原を認識して応答する能力を保持するが、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、その後の抗原との遭遇に対する応答能が低く、これは、少なくとも部分的には、ＣＡＲの下方制御によるものと考えられ、初回抗原曝露後にＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の機能疲弊の傾向が高いことを指し得る。
実施例１８−ＮＳＧマウスにおいてＵ８７細胞を使用した頭蓋内神経膠腫モデルの確立
Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の抗腫瘍効果を生体内で評価するため、生物発光（ＢＬＩ）による相対的腫瘍量の非侵襲的連続画像診断用に、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）レポーターを発現するよう修飾されたＵ８７細胞の頭蓋内神経膠腫異種移植片を作製した。腫瘍及びＴ細胞の正確な座標への誘導注入には、これまでに記載のあるガイドスクリュー法を採用した（Ｌａｌ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ガイドスクリューをＮＯＤ／Ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒｇ−／−（ＮＳＧ）マウスの頭蓋の右前頭葉に移植し、マウスを２週間回復させた（図２５Ａ）。Ｔ細胞処置によるガイドスクリュー移植からのタイムライン及びＢＬＩによる相対的腫瘍量評価を図２５Ｂに示す。内因的にＥＧＦＲ発現が低いまたはｔＥＧＦＲの強制的発現により中程度のＥＧＦＲを発現しているＵ８７細胞２５０，０００個を、ガイドスクリューの中心を通って２．５ｍｍの深さに注入した。腫瘍量を評価するため、Ｔ細胞処置に先立ちマウスの画像診断を行い、マウスを、腫瘍量が均等に分けられるようにして、未処置マウス、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置マウス、またはＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置マウスの３群に層別化した。腫瘍注入から５日後、初回投与量４ｘ１０６Ｔ細胞をガイドスクリューの中心を通して注入した。それ以降のＴ細胞用量を、ガイドスクリューを通して週１回計３用量のＴ細胞を投与した。各Ｔ細胞処置から６日後のＢＬＩ測定値を、相対的腫瘍量評価に使用した。処置に続き、マウスをエンドポイント決定基準について評価し、これには、２４時間で体容量の５％を超える急速な体重減少、体容量の２５％以上の体重減少の進行、または、運動失調、努力性呼吸、及び後肢麻痺などの病気を示す明らかな臨床徴候が含まれた。エンドポイント決定基準が満たされ、動物の死が差し迫っていることが示唆された場合はマウスを屠殺し、未処置マウスと比べたＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置マウス及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置マウスの生存期間を評価した。
実施例１９−Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞はＥＧＦＲ密度が中程度の異種移植片増殖をＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞同様に阻害するが、Ｔ細胞関連毒性はない
Ｕ８７ｍｅｄ注射から４日後、腫瘍量を評価するためマウスをＢＬＩで撮像した（図２６Ａ）。相対的腫瘍量が均等に分けられるようマウスを３群に分け、その後、未処置、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞、またはＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の３つの処置を無作為に割り付けた（図２６Ｂ）。ＣＡＲの発現並びにＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の比を決定するため、３回の刺激を受け、ＥＧＦＲ＋ａＡＰＣ上で細胞数を増幅させたＣＡＲ＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞処置当日、フローサイトメトリーにより表現型を解析した（図２６Ｃ）。ＣＡＲ発現は、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞間で同様であった（それぞれ９２％及び８５％）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ともにＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を含有していたが、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりも約２０％少ないＣＤ８＋Ｔ細胞を含有していた（それぞれ３１．８％及び５１．２％）。ＢＬＩによるアッセイでは、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞はどちらも腫瘍増殖を抑制できた（１８日目；Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ、ｐ＜０．０１及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ、ｐ＜０．０５）（図２７Ａ、Ｂ）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞間の腫瘍増殖制御能に差はかなった（ｐ＞０．０５）。ＢＬＩで評価した腫瘍量低下は、腫瘍注射後１００日経過時点で、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞で処置したマウス７匹中３匹、及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞で処置したマウス７匹中４匹において明らかであり、この時、処置を受けなかったマウスは全匹疾患の犠牲になっていた。
Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置マウスは有意な毒性を示し、２つの独立した実験で、マウス１４匹中６匹がＴ細胞処置７日以内に死亡した（ｐ＝０．０００６）（図２８Ａ）。全体として、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞による処置では、未処置マウスと比較して生存期間は統計的に改善せず、Ｔ細胞処置の直後の早期死亡によるものと考えられる（未治療群の生存期間の中央値＝８８日、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ群の生存期間の中央値＝１０５日、ｐ＝０．１９）（図２８Ｂ）。興味深いことに、生存曲線は、変曲点を描き、それより前ではＣｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置による生存期間は未処置マウスより低く、変曲点の後では初期 Ｔ細胞毒性で生き残ったマウスの生存期間改善を示している。初期Ｔ細胞関連毒性で生き残ったマウスに限って考えると、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は未処置マウスと比べ、マウス４匹中３匹で改善している（ｐ＝０．００６５）。対照的に、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、効果的な腫瘍退縮を仲介し、マウス７匹中４匹において何らの注目される毒性もなく生存期間を延長させる（未処置の生存期間の中央値＝８８日、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲの生存期間の中央値＝１５８日、ｐ＝０．０２６９）。これらの結果は、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、抗原密度が中程度の腫瘍の増殖制御において有効であるが、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞処置の直後に顕著な毒性が現われることを示している。
実施例２０−Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞はＥＧＦＲ低密度の異種移植片の増殖を阻害するが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は増殖を阻害しない
マウスにＵ８７を注入し、その４日後、相対的腫瘍量をＢＬＩにより評価した（図２９Ａ）。相対的腫瘍量を均等に３群に分け、未処置、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置、またはＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置に無作為に割り付けた（図２９Ｂ）。ＣＡＲの発現並びにＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の比を決定するため、３回の刺激を受け、ＥＧＦＲ＋ａＡＰＣ上で細胞数を増幅させたＣＡＲ＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞処置当日、フローサイトメトリーにより表現型を解析した（図２９Ｃ）。ＣＡＲ発現は、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞間で同様であった（それぞれ９２％及び８５％）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＮｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ともにＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を含有していたが、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞よりも約２０％少ないＣＤ８＋Ｔ細胞を含有していた（それぞれ３１．８％及び５１．２％）。
マウスにＴ細胞処置を施し、これまでに記載があるようにＢＬＩで腫瘍を評価した（図２５Ｂ）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞で処置したマウスは、未処置マウスよりも腫瘍量を有意に低下させた（２５日目、ｐ＜０．０１）（図３０Ａ及び３０Ｂ）。対照的に、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞による処置では、未処置マウスと比較して有意な腫瘍量の減少はなかった（Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ、ｐ＞０．０５）。Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍量減少は一過性であったが、Ｔ細胞処置を中止すると、腫瘍増殖が再開した。
Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞処置では、未処置マウスに比べ、マウス６匹中３匹で生存期間が有意に延長された（未処置の生存期間の中央値＝３８．５日、Ｃｅｔｕｘ−ＣＡＲの生存期間の中央値＝５３日、ｐ＝０．０１５０）（図３１）。対照的に、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞による処置では、生存期間は有意に改善しなかった（未処置の生存期間の中央値３８．５日、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲの生存期間の中央値４６日、ｐ＝０．０９６９）。これらのデータは、Ｃｅｔｕｘ ＣＡＲ Ｔ細胞は、低い抗原密度に対して有効であるが、Ｎｉｍｏ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は低密度のＥＧＦＲ発現を効率的に認識しないことを示している。
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参考文献
以下の参考文献は、本明細書の記載の例示的な手順または他の補足的詳細を提供する程度において、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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米国特許出願公開第２００９／０００４１４２号
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国際公開公報番号ＷＯ２００７／１０３００９
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Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ， Ｄ．， Ｓ． Ｋ． Ｎａｉｒ， Ｊ． Ｈ． Ｎａｍ， Ｈ． Ｋ． Ｌｙｅｒｌｙ， ａｎｄ Ｅ． Ｇｉｌｂｏａ． ２０００． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：１０２８−１０３４．
Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ， Ｃ．， Ｈ． Ｖｅｉｇａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ， Ａ． Ｍ． Ｊｏｒｅｔ， Ｂ． Ｒｏｃｈａ， ａｎｄ Ｃ． Ｔａｎｃｈｏｔ． ２００２． ＣＤ８ ｌｅｔｈａｒｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＣＤ４ ｈｅｌｐ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３２：２１９９−２２０７．
Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ， Ｒ． Ｊ．， Ｉ． Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｊ． Ｈ． Ｐａｒｋ， Ｍ． Ｌ． Ｄａｖｉｌａ， Ｘ． Ｗａｎｇ， Ｊ． Ｓｔｅｆａｎｓｋｉ， Ｃ． Ｔａｙｌｏｒ， Ｒ． Ｙｅｈ， Ｓ． Ｂａｒｔｉｄｏ， Ｏ． Ｂｏｒｑｕｅｚ−Ｏｊｅｄａ， Ｍ． Ｏｌｓｚｅｗｓｋａ， Ｙ． Ｂｅｒｎａｌ， Ｈ． Ｐｅｇｒａｍ， Ｍ． Ｐｒｚｙｂｙｌｏｗｓｋｉ， Ｄ． Ｈｏｌｌｙｍａｎ， Ｙ． Ｕｓａｃｈｅｎｋｏ， Ｄ． Ｐｉｒｒａｇｌｉａ， Ｊ． Ｈｏｓｅｙ， Ｅ． Ｓａｎｔｏｓ， Ｅ． Ｈａｌｔｏｎ， Ｐ． Ｍａｓｌａｋ， Ｄ． Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ， Ｊ． Ｊｕｒｃｉｃ， Ｍ． Ｈｅａｎｅｙ， Ｇ． Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ． Ｆｒａｔｔｉｎｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｓａｄｅｌａｉｎ． ２０１１． Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ． Ｂｌｏｏｄ １１８：４８１７−４８２８．
Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ， Ｒ． Ｊ．， Ｍ． Ｌ． Ｄａｖｉｌａ， Ｉ． Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｊ． Ｐａｒｋ， Ｘ． Ｗａｎｇ， Ｌ． Ｇ． Ｃｏｗｅｌｌ， Ｓ． Ｂａｒｔｉｄｏ， Ｊ． Ｓｔｅｆａｎｓｋｉ， Ｃ． Ｔａｙｌｏｒ， Ｍ． Ｏｌｓｚｅｗｓｋａ， Ｏ． Ｂｏｒｑｕｅｚ−Ｏｊｅｄａ， Ｊ． Ｑｕ， Ｔ． Ｗａｓｉｅｌｅｗｓｋａ， Ｑ． Ｈｅ， Ｙ． Ｂｅｒｎａｌ， Ｉ． Ｖ． Ｒｉｊｏ， Ｃ． Ｈｅｄｖａｔ， Ｒ． Ｋｏｂｏｓ， Ｋ． Ｃｕｒｒａｎ， Ｐ． Ｓｔｅｉｎｈｅｒｚ， Ｊ． Ｊｕｒｃｉｃ， Ｔ． Ｒｏｓｅｎｂｌａｔ， Ｐ． Ｍａｓｌａｋ， Ｍ． Ｆｒａｔｔｉｎｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｓａｄｅｌａｉｎ． ２０１３． ＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：１７７ｒａ１３８．
Ｂｒｉｄｇｅｍａｎ， Ｊ． Ｓ．， Ｒ． Ｅ． Ｈａｗｋｉｎｓ， Ｓ． Ｂａｇｌｅｙ， Ｍ． Ｂｌａｙｌｏｃｋ， Ｍ． Ｈｏｌｌａｎｄ， ａｎｄ Ｄ． Ｅ． Ｇｉｌｈａｍ． ２０１０． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ＣＤ３ｚｅｔａ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｐｏｎ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＴＣＲ／ＣＤ３ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８４：６９３８−６９４９．
Ｂｒｏｃｋｅｒ Ｔ． Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ Ｋ． Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｅａｒｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８；６８：２５７−２６９．
Ｂｕｄｄｅ， Ｌ． Ｅ．， Ｃ． Ｂｅｒｇｅｒ， Ｙ． Ｌｉｎ， Ｊ． Ｗａｎｇ， Ｘ． Ｌｉｎ， Ｓ． Ｅ． Ｆｒａｙｏ， Ｓ． Ａ． Ｂｒｏｕｎｓ， Ｄ． Ｍ． Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｂ． Ｇ． Ｔｉｌｌ， Ｍ． Ｃ． Ｊｅｎｓｅｎ， Ｓ． Ｒ． Ｒｉｄｄｅｌｌ， ａｎｄ Ｏ． Ｗ． Ｐｒｅｓｓ． ２０１３． Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ａ ＣＤ２０ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ａｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃａｓｐａｓｅ ９ Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｓｗｉｔｃｈ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｌｙｍｐｈｏｍａ． ＰｌｏＳ ｏｎｅ ８：ｅ８２７４２．
Ｃａｉ， Ｚ．， Ｈ． Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ， Ａ． Ｂｒｕｎｍａｒｋ， Ｍ． Ｒ． Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｐ． Ａ． Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， ａｎｄ Ｊ． Ｓｐｒｅｎｔ． １９９７． Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｎａｉｖｅ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８５：６４１−６５１．
Ｃｈａｎ， Ｄ． Ａ．， Ｐ． Ｄ． Ｓｕｔｐｈｉｎ， Ｓ． Ｅ． Ｙｅｎ， ａｎｄ Ａ． Ｊ． Ｇｉａｃｃｉａ． ２００５． Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｘｙｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２５：６４１５−６４２６．
Ｃｈｅｒｖｉｎ， Ａ． Ｓ．， Ｊ． Ｄ． Ｓｔｏｎｅ， Ｃ． Ｍ． Ｓｏｔｏ， Ｂ． Ｅｎｇｅｌｓ， Ｈ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｅ． Ｊ． Ｒｏｙ， ａｎｄ Ｄ． Ｍ． Ｋｒａｎｚ． ２０１３． Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｖｅｒｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２０：６３４−６４４．
Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ， Ｍ．， Ａ． Ｈｏｍｂａｃｈ， Ｃ． Ｈｅｕｓｅｒ， Ｇ． Ｐ． Ａｄａｍｓ， ａｎｄ Ｈ． Ａｂｋｅｎ． ２００４． Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ： ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｏｍａｉｎ ａｂｏｖｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３：７６４７−７６５３．
Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｃｏｒｅ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４５５：１０６１−１０６８， ２００８．
Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｏｏｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｂａｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ， Ｂｌｏｏｄ， １１９：２７００−２７０２， ２０１２．
Ｃｏｒｓｅ， Ｅ．， Ｒ． Ａ． Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ， Ｍ． Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ， ａｎｄ Ｊ． Ｐ． Ａｌｌｉｓｏｎ． ２０１０． Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ａ ｈｉｇｈ−ｐｏｔｅｎｃｙ ｌｉｇａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ． ＰＬｏＳ ｂｉｏｌｏｇｙ ８．
Ｄａｖｉｅｓ， Ｊ． Ｋ．， Ｈ． Ｓｉｎｇｈ， Ｈ． Ｈｕｌｓ， Ｄ． Ｙｕｋ， Ｄ． Ａ． Ｌｅｅ， Ｐ． Ｋｅｂｒｉａｅｉ， Ｒ． Ｅ． Ｃｈａｍｐｌｉｎ， Ｌ． Ｍ． Ｎａｄｌｅｒ， Ｅ． Ｃ． Ｇｕｉｎａｎ， ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｃｏｏｐｅｒ． ２０１０． Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ＣＤ１９ ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｌｌｏａｎｅｒｇｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｂ−ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７０：３９１５−３９２４．
Ｄｉ Ｓｔａｓｉ， Ａ．， Ｂ． Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ， Ｃ． Ｍ． Ｒｏｏｎｅｙ， Ｌ． Ｚｈａｎｇ， Ａ． Ｍａｈｅｎｄｒａｖａｄａ， Ａ． Ｅ． Ｆｏｓｔｅｒ， Ｈ． Ｅ． Ｈｅｓｌｏｐ， Ｍ． Ｋ． Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｇ． Ｄｏｔｔｉ， ａｎｄ Ｂ． Ｓａｖｏｌｄｏ． ２００９． Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＣＲ４ ａｎｄ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＤ３０ ｈａｖｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｈｏｍｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａ Ｈｏｄｇｋｉｎ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ． Ｂｌｏｏｄ １１３：６３９２−６４０２．
Ｄｉ Ｓｔａｓｉ， Ａ．， Ｓ． Ｋ． Ｔｅｙ， Ｇ． Ｄｏｔｔｉ， Ｙ． Ｆｕｊｉｔａ， Ａ． Ｋｅｎｎｅｄｙ−Ｎａｓｓｅｒ， Ｃ． Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｋ． Ｓｔｒａａｔｈｏｆ， Ｅ． Ｌｉｕ， Ａ． Ｇ． Ｄｕｒｅｔｔ， Ｂ． Ｇｒｉｌｌｅｙ， Ｈ． Ｌｉｕ， Ｃ． Ｒ． Ｃｒｕｚ， Ｂ． Ｓａｖｏｌｄｏ， Ａ． Ｐ． Ｇｅｅ， Ｊ． Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ， Ｒ． Ａ． Ｋｒａｎｃｅ， Ｈ． Ｅ． Ｈｅｓｌｏｐ， Ｄ． Ｍ． Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｃ． Ｍ． Ｒｏｏｎｅｙ， ａｎｄ Ｍ． Ｋ． Ｂｒｅｎｎｅｒ． ２０１１． Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｓ ａ ｓａｆｅｔｙ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６５：１６７３−１６８３．
Ｅｉｓｅｎ， Ｍ． Ｂ．， Ｐ． Ｔ． Ｓｐｅｌｌｍａｎ， Ｐ． Ｏ． Ｂｒｏｗｎ， ａｎｄ Ｄ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ． １９９８． Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９５：１４８６３−１４８６８．
Ｅｎｇｅｌｓ， Ｂ．， Ａ． Ｓ． Ｃｈｅｒｖｉｎ， Ａ． Ｊ． Ｓａｎｔ， Ｄ． Ｍ． Ｋｒａｎｚ， ａｎｄ Ｈ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ． ２０１２． Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ＣＤ４（＋） ｂｕｔ ｒａｐｉｄ ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ＣＤ８（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＴＣＲ ｏｆ ｎａｎｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：６５２−６６０．
Ｅｒｔｌ Ｈ．Ｃ． Ｚａｉａ Ｊ． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ： ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｈｅｌｄ Ｊｕｎｅ １５， ２０１０． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１１；７１：３１７５−３１８１．
Ｅｓｈｈａｒ Ｚ． Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｂｏｄｉｅｓ： ｔｏｗａｒｄｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． １９９７；４５：１３１−１３６．
Ｅｓｈｈａｒ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：７２０， １９９３．
Ｆｅｄｏｒｏｖ， Ｖ． Ｄ．， Ｍ． Ｔｈｅｍｅｌｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｓａｄｅｌａｉｎ． ２０１３． ＰＤ−１− ａｎｄ ＣＴＬＡ−４−Ｂａｓｅｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ （ｉＣＡＲｓ） Ｄｉｖｅｒｔ Ｏｆｆ−Ｔａｒｇｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：２１５ｒａ１７２．
Ｆｉｔｚｅｒ−Ａｔｔａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６０：１４５−１５４， １９９８．
Ｇａｌａｎｉｓ， Ｅ．， Ｊ． Ｂｕｃｋｎｅｒ， Ｄ． Ｋｉｍｍｅｌ， Ｒ． Ｊｅｎｋｉｎｓ， Ｂ． Ａｌｄｅｒｅｔｅ， Ｊ． Ｏ’Ｆａｌｌｏｎ， Ｃ． Ｈ． Ｗａｎｇ， Ｂ． Ｗ． Ｓｃｈｅｉｔｈａｕｅｒ， ａｎｄ Ｃ． Ｄ． Ｊａｍｅｓ． １９９８． Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ １３：７１７−７２４．
Ｇａｒｒｉｄｏ， Ｇ．， Ｉ． Ａ． Ｔｉｋｈｏｍｉｒｏｖ， Ａ． Ｒａｂａｓａ， Ｅ． Ｙａｎｇ， Ｅ． Ｇｒａｃｉａ， Ｎ． Ｉｚｎａｇａ， Ｌ． Ｅ． Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｔ． Ｃｒｏｍｂｅｔ， Ｒ． Ｓ． Ｋｅｒｂｅｌ， ａｎｄ Ｒ． Ｐｅｒｅｚ． ２０１１． Ｂｉｖａｌｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ： ａ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘｐｌａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｆｉｌｅ． Ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ ｔｈｅｒａｐｙ １１：３７３−３８２．
Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｌ．， Ｃ． Ａ． Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ， ａｎｄ Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ． ２０１２． Ｐａｔｈｓ ｔｏ ｓｔｅｍｎｅｓｓ： ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｈｅ ｕｌｔｉｍａｔｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ Ｔ ｃｅｌｌ． Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｃａｎｃｅｒ １２：６７１−６８４．
Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｌ．， Ｘ． Ｓ． Ｚｈｏｎｇ， Ｄ． Ｃ． Ｐａｌｍｅｒ， Ｙ． Ｊｉ， Ｃ． Ｓ． Ｈｉｎｒｉｃｈｓ， Ｚ． Ｙｕ， Ｃ． Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉ， Ａ． Ｂｏｎｉ， Ｌ． Ｃａｓｓａｒｄ， Ｌ． Ｍ． Ｇａｒｖｉｎ， Ｃ． Ｍ． Ｐａｕｌｏｓ， Ｐ． Ｍｕｒａｎｓｋｉ， ａｎｄ Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ． ２００９． Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｒｒｅｓｔｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ＣＤ８＋ ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １５：８０８−８１３．
Ｇｅｇｉｎａｔ， Ｊ．， Ａ． Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ， ａｎｄ Ｆ． Ｓａｌｌｕｓｔｏ． ２００３． Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｒ ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ． Ｂｌｏｏｄ １０１：４２６０−４２６６．
Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ， Ｒ． Ａ．， Ｅ． Ｃｏｒｓｅ， ａｎｄ Ｊ． Ｐ． Ａｌｌｉｓｏｎ． ２０１０． ＴＣＲ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｘｐ３ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０７：１７０１−１７１１．
Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ， Ｒ． Ａ．， Ｍ． Ｍ． Ｈａｔｈｏｒｎ， Ｈ． Ｂｅｕｎｅｕ， Ｅ． Ｃｏｒｓｅ， Ｍ． Ｌ． Ｄｕｓｔｉｎ， Ｇ． Ａｌｔａｎ−Ｂｏｎｎｅｔ， ａｎｄ Ｊ． Ｐ． Ａｌｌｉｓｏｎ． ２０１２． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０９：８８１−８８６．
Ｇｏｖｅｒｎ， Ｃ． Ｃ．， Ｍ． Ｋ． Ｐａｃｚｏｓａ， Ａ． Ｋ． Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ， ａｎｄ Ｅ． Ｓ． Ｈｕｓｅｂｙ． ２０１０． Ｆａｓｔ ｏｎ−ｒａｔｅｓ ａｌｌｏｗ ｓｈｏｒｔ ｄｗｅｌｌ ｔｉｍｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０７：８７２４−８７２９．
Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：３３７０， １９９２．
Ｇｒｕｐｐ， Ｓ． Ａ．， Ｍ． Ｋａｌｏｓ， Ｄ． Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｒ． Ａｐｌｅｎｃ， Ｄ． Ｌ． Ｐｏｒｔｅｒ， Ｓ． Ｒ． Ｒｈｅｉｎｇｏｌｄ， Ｄ． Ｔ． Ｔｅａｃｈｅｙ， Ａ． Ｃｈｅｗ， Ｂ． Ｈａｕｃｋ， Ｊ． Ｆ． Ｗｒｉｇｈｔ， Ｍ． Ｃ． Ｍｉｌｏｎｅ， Ｂ． Ｌ． Ｌｅｖｉｎｅ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｊｕｎｅ． ２０１３． Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６８：１５０９−１５１８．
Ｈｅｇｄｅ， Ｍ．， Ａ． Ｃｏｒｄｅｒ， Ｋ． Ｋ． Ｃｈｏｗ， Ｍ． Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ， Ａ． Ａｓｈｏｏｒｉ， Ｙ． Ｋｅｗ， Ｙ． Ｊ． Ｚｈａｎｇ， Ｄ． Ｓ． Ｂａｓｋｉｎ， Ｆ． Ａ． Ｍｅｒｃｈａｎｔ， Ｖ． Ｓ． Ｂｒａｗｌｅｙ， Ｔ． Ｔ． Ｂｙｒｄ， Ｓ． Ｋｒｅｂｓ， Ｍ． Ｆ． Ｗｕ， Ｈ． Ｌｉｕ， Ｈ． Ｅ． Ｈｅｓｌｏｐ， Ｓ． Ｇｏｔｔａｃｈａｌｋ， Ｅ． Ｙｖｏｎ， ａｎｄ Ｎ． Ａｈｍｅｄ． ２０１３． Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆｆｓｅｔｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｓｃａｐｅ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１：２０８７−２１０１．
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Ｈｅｍｍｅｒ， Ｂ．， Ｉ． Ｓｔｅｆａｎｏｖａ， Ｍ． Ｖｅｒｇｅｌｌｉ， Ｒ． Ｎ． Ｇｅｒｍａｉｎ， ａｎｄ Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ． １９９８． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ ＴＣＲ ｌｉｇａｎｄ ｐｏｔｅｎｃｙ， ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：５８０７−５８１４．
Ｈｉｒｓｃｈ， Ｆ． Ｒ．， Ｍ． Ｖａｒｅｌｌａ−Ｇａｒｃｉａ， ａｎｄ Ｆ． Ｃａｐｐｕｚｚｏ． ２００９． Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＥＧＦＲ ａｎｄ ＨＥＲ２ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２８ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ３２−３７．
Ｈｏｌｌｅｒ， Ｐ． Ｄ．， ａｎｄ Ｄ． Ｍ． Ｋｒａｎｚ． ２００３． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＲ／ｐｅｐＭＨＣ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ＣＤ８ ｔｏ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １８：２５５−２６４．
Ｈｕ， Ｘ．， Ｗ． Ｍｉａｏ， Ｙ． Ｚｏｕ， Ｗ． Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｚｈａｎｇ， ａｎｄ Ｈ． Ｌｉｕ． ２０１３． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ５３， ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， Ｋｉ−６７ ａｎｄ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ−ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａｓ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ６：１３０−１３４．
Ｈｕａｎｇ， Ｊ．， Ｖ． Ｉ． Ｚａｒｎｉｔｓｙｎａ， Ｂ． Ｌｉｕ， Ｌ． Ｊ． Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｎ． Ｊｉａｎｇ， Ｂ． Ｄ． Ｅｖａｖｏｌｄ， ａｎｄ Ｃ． Ｚｈｕ． ２０１０． Ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ＴＣＲ ａｎｄ ｐＭＨＣ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４６４：９３２−９３６．
Ｈｕｄｅｃｅｋ， Ｍ．， Ｍ． Ｔ． Ｌｕｐｏ−Ｓｔａｎｇｈｅｌｌｉｎｉ， Ｐ． Ｌ． Ｋｏｓａｓｉｈ， Ｄ． Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ， Ｍ． Ｃ． Ｊｅｎｓｅｎ， Ｃ． Ｒａｄｅｒ， ａｎｄ Ｓ． Ｒ． Ｒｉｄｄｅｌｌ． ２０１３． Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔ ｔｕｍｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＲＯＲ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ： ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：３１５３−３１６４．
Ｈｕｐｐａ， Ｊ． Ｂ．， Ｍ． Ａｘｍａｎｎ， Ｍ． Ａ． Ｍｏｒｔｅｌｍａｉｅｒ， Ｂ． Ｆ． Ｌｉｌｌｅｍｅｉｅｒ， Ｅ． Ｗ． Ｎｅｗｅｌｌ， Ｍ． Ｂｒａｍｅｓｈｕｂｅｒ， Ｌ． Ｏ． Ｋｌｅｉｎ， Ｇ． Ｊ． Ｓｃｈｕｔｚ， ａｎｄ Ｍ． Ｍ． Ｄａｖｉｓ． ２０１０． ＴＣＲ−ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓｈｏｗ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ． Ｎａｔｕｒｅ ４６３：９６３−９６７．
Ｈｕｒｔｏｎ， Ｌ． Ｖ． ２０１４． Ｔｅｔｈｅｒｅｄ ＩＬ−１５ ｔｏ ａｕｇｍｅｎｔ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ： Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｍｏｒｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ， ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ， ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ． （Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ） Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｈｏｕｓｔｏｎ．
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Ｊａｍｅｓ， Ｓ． Ｅ．， Ｐ． Ｄ． Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｍ． Ｃ． Ｊｅｎｓｅｎ， Ｙ． Ｌｉｎ， Ｊ． Ｗａｎｇ， Ｂ． Ｇ． Ｔｉｌｌ， Ａ． Ａ． Ｒａｕｂｉｔｓｃｈｅｋ， Ｓ． Ｊ． Ｆｏｒｍａｎ， ａｎｄ Ｏ． Ｗ． Ｐｒｅｓｓ． ２００８． Ａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＤ２２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＴＣＲ ｉｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔａｒｇｅｔ ｅｐｉｔｏｐｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８０：７０２８−７０３８．
Ｊａｍｅｓ， Ｓ． Ｅ．， Ｐ． Ｄ． Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｍ． Ｃ． Ｊｅｎｓｅｎ， Ｙ． Ｌｉｎ， Ｊ． Ｗａｎｇ， Ｌ． Ｅ． Ｂｕｄｄｅ， Ｂ． Ｇ． Ｔｉｌｌ， Ａ． Ａ． Ｒａｕｂｉｔｓｃｈｅｋ， Ｓ． Ｊ． Ｆｏｒｍａｎ， ａｎｄ Ｏ． Ｗ． Ｐｒｅｓｓ． ２０１０． Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＴＣＲ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｔｈｅ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｂｙ ＴＣＲ ｄｏｗｎｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８４：４２８４−４２９４．
Ｊａｎｉｃｋｉ， Ｃ． Ｎ．， Ｓ． Ｒ． Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ， Ｎ． Ａ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｍｏｒｇａｎ． ２００８． Ｌｏｓｓ ｏｆ ＣＴＬ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６８：２９９３−３０００．
Ｊｅｎａ， Ｂ．， Ｇ． Ｄｏｔｔｉ， ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｃｏｏｐｅｒ． ２０１０． Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｔ−ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｂｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ａ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｂｌｏｏｄ １１６：１０３５−１０４４．
Ｋａｌｅｒｇｉｓ， Ａ． Ｍ．， Ｎ． Ｂｏｕｃｈｅｒｏｎ， Ｍ． Ａ． Ｄｏｕｃｅｙ， Ｅ． Ｐａｌｍｉｅｒｉ， Ｅ． Ｃ． Ｇｏｙａｒｔｓ， Ｚ． Ｖｅｇｈ， Ｉ． Ｆ． Ｌｕｅｓｃｈｅｒ， ａｎｄ Ｓ． Ｇ． Ｎａｔｈｅｎｓｏｎ． ２００１． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ａｎ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｗｅｌｌ−ｔｉｍｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＴＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ｐＭＨＣ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：２２９−２３４．
Ｋａｌｏｓ， Ｍ．， Ｂ． Ｌ． Ｌｅｖｉｎｅ， Ｄ． Ｌ． Ｐｏｒｔｅｒ， Ｓ． Ｋａｔｚ， Ｓ． Ａ． Ｇｒｕｐｐ， Ａ． Ｂａｇｇ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｊｕｎｅ． ２０１１． Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｃａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：９５ｒａ７３．
Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ， Ａ． Ｏ．， ａｎｄ Ｒ． Ａｈｍｅｄ． ２０１３． ＣＤ４ Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ５：９７５−９８７．
Ｋｅｒｓｈ， Ｇ． Ｊ．， Ｅ． Ｎ． Ｋｅｒｓｈ， Ｄ． Ｈ． Ｆｒｅｍｏｎｔ， ａｎｄ Ｐ． Ｍ． Ａｌｌｅｎ． １９９８． Ｈｉｇｈ− ａｎｄ ｌｏｗ−ｐｏｔｅｎｃｙ ｌｉｇａｎｄｓ ｗｉｔｈ ｓｉｍｉｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＴＣＲ： ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：８１７−８２６．
Ｋｌｏｓｓ， Ｃ． Ｃ．， Ｍ． Ｃｏｎｄｏｍｉｎｅｓ， Ｍ． Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ， Ｍ． Ｂａｃｈｍａｎｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｓａｄｅｌａｉｎ． ２０１３． Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１：７１−７５．
Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ， Ｊ． Ｎ．， Ｍ． Ｅ． Ｄｕｄｌｅｙ， Ｓ． Ａ． Ｆｅｌｄｍａｎ， Ｗ． Ｈ． Ｗｉｌｓｏｎ， Ｄ． Ｅ． Ｓｐａｎｅｒ， Ｉ． Ｍａｒｉｃ， Ｍ． Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ， Ｇ． Ｑ． Ｐｈａｎ， Ｍ． Ｓ． Ｈｕｇｈｅｓ， Ｒ． Ｍ． Ｓｈｅｒｒｙ， Ｊ． Ｃ． Ｙａｎｇ， Ｕ． Ｓ． Ｋａｍｍｕｌａ， Ｌ． Ｄｅｖｉｌｌｉｅｒ， Ｒ． Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ， Ｄ． Ａ． Ｎａｔｈａｎ， Ｒ． Ａ． Ｍｏｒｇａｎ， Ｃ． Ｌａｕｒｅｎｃｏｔ， ａｎｄ Ｓ． Ａ． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ． ２０１２． Ｂ−ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａｎｔｉ−ＣＤ１９ ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ １１９：２７０９−２７２０．
Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ， Ｊ． Ｎ．， Ｗ． Ｈ． Ｗｉｌｓｏｎ， Ｊ． Ｅ． Ｊａｎｉｋ， Ｍ． Ｅ． Ｄｕｄｌｅｙ， Ｍ． Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ， Ｓ． Ａ． Ｆｅｌｄｍａｎ， Ｉ． Ｍａｒｉｃ， Ｍ． Ｒａｆｆｅｌｄ， Ｄ． Ａ． Ｎａｔｈａｎ， Ｂ． Ｊ． Ｌａｎｉｅｒ， Ｒ． Ａ． Ｍｏｒｇａｎ， ａｎｄ Ｓ． Ａ． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ． ２０１０． Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ−ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ＣＤ１９． Ｂｌｏｏｄ １１６：４０９９−４１０２．
Ｋｏｈｎ Ｄ．Ｂ． Ｄｏｔｔｉ Ｇ． Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ Ｒ．， ｅｔ ａｌ． ＣＡＲｓ ｏｎ ｔｒａｃｋ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２０１１；１９：４３２−４３８．
Ｋｏｗｏｌｉｋ， Ｃ． Ｍ．， Ｍ． Ｓ． Ｔｏｐｐ， Ｓ． Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｔ． Ｐｆｅｉｆｆｅｒ， Ｓ． Ｏｌｉｖａｒｅｓ， Ｎ． Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｄ． Ｄ． Ｓｍｉｔｈ， Ｓ． Ｊ． Ｆｏｒｍａｎ， Ｍ． Ｃ． Ｊｅｎｓｅｎ， ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｃｏｏｐｅｒ． ２００６． ＣＤ２８ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ＣＤ１９−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６：１０９９５−１１００４．
Ｋｕｍａｒ， Ｒ．， Ｍ． Ｆｅｒｅｚ， Ｍ． Ｓｗａｍｙ， Ｉ． Ａｒｅｃｈａｇａ， Ｍ． Ｔ． Ｒｅｊａｓ， Ｊ． Ｍ． Ｖａｌｐｕｅｓｔａ， Ｗ． Ｗ． Ｓｃｈａｍｅｌ， Ｂ． Ａｌａｒｃｏｎ， ａｎｄ Ｈ． Ｍ． ｖａｎ Ｓａｎｔｅｎ． ２０１１． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３５：３７５−３８７．
Ｌａｃｕｎｚａ， Ｅ．， Ｍ． Ｂａｕｄｉｓ， Ａ． Ｇ． Ｃｏｌｕｓｓｉ， Ａ． Ｓｅｇａｌ−Ｅｉｒａｓ， Ｍ． Ｖ． Ｃｒｏｃｅ， ａｎｄ Ｍ． Ｃ． Ａｂｂａ． ２０１０． ＭＵＣ１ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１：１０２−１１０．
Ｌａｌ， Ｓ．， Ｍ． Ｌａｃｒｏｉｘ， Ｐ． Ｔｏｆｉｌｏｎ， Ｇ． Ｎ． Ｆｕｌｌｅｒ， Ｒ． Ｓａｗａｙａ， ａｎｄ Ｆ． Ｆ． Ｌａｎｇ． ２０００． Ａｎ ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｇｕｉｄｅ−ｓｃｒｅｗ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ９２：３２６−３３３．
Ｌａｍｅｒｓ， Ｃ． Ｈ．， Ｓ． Ｓｌｅｉｊｆｅｒ， Ｓ． ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ， Ｐ． ｖａｎ Ｅｌｚａｋｋｅｒ， Ｂ． ｖａｎ Ｋｒｉｍｐｅｎ， Ｃ． Ｇｒｏｏｔ， Ａ． Ｖｕｌｔｏ， Ｍ． ｄｅｎ Ｂａｋｋｅｒ， Ｅ． Ｏｏｓｔｅｒｗｉｊｋ， Ｒ． Ｄｅｂｅｔｓ， ａｎｄ Ｊ． Ｗ． Ｇｒａｔａｍａ． ２０１３． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｉｔｈ ＣＡＩＸ ＣＡＲ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ： ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１：９０４−９１２．
Ｌａｎｉｔｉｓ， Ｅ．， Ｍ． Ｐｏｕｓｓｉｎ， Ａ． Ｗ． Ｋｌａｔｔｅｎｈｏｆｆ， Ｄ． Ｓｏｎｇ， Ｒ． Ｓａｎｄａｌｔｚｏｐｏｕｌｏｓ， Ｃ． Ｈ． Ｊｕｎｅ， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｐｏｗｅｌｌ， Ｊｒ． ２０１３． Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｆｏｃｕｓｅｄ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ １．
Ｌｉｍ， Ｄ． Ｇ．， Ｐ． Ｈｏｌｌｓｂｅｒｇ， ａｎｄ Ｄ． Ａ． Ｈａｆｌｅｒ． ２００２． Ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｏｆ ｐｒｉｏｒ ｓｔｉｍｕｌｉ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２１７：３６−４６．
Ｌｉｔｔｌｅ， Ｓ． Ｅ．， Ｓ． Ｐｏｐｏｖ， Ａ． Ｊｕｒｙ， Ｄ． Ａ． Ｂａｘ， Ｌ． Ｄｏｅｙ， Ｓ． Ａｌ−Ｓａｒｒａｊ， Ｊ． Ｍ． Ｊｕｒｇｅｎｓｍｅｉｅｒ， ａｎｄ Ｃ． Ｊｏｎｅｓ． ２０１２． Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｅｘｈｉｂｉｔ ａ ｍｕｔｕａｌ ｅｘｃｌｕｓｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｔｕｍｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７２：１６１４−１６２０．
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Ｍａｕｓ， Ｍ． Ｖ．， Ａ． Ｒ． Ｈａａｓ， Ｇ． Ｌ． Ｂｅａｔｔｙ， Ｓ． Ｍ． Ａｌｂｅｌｄａ， Ｂ． Ｌ． Ｌｅｖｉｎｅ， Ｘ． Ｌｉｕ， Ｙ． Ｚｈａｏ， Ｍ． Ｋａｌｏｓ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｊｕｎｅ． ２０１３． Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｃａｎ ｃａｕｓｅ ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ １：２６−３１．
ＭｃＫｅｉｔｈａｎ， Ｔ． Ｗ． １９９５． Ｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ ｉｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９２：５０４２−５０４６．
Ｍｏｏｎ， Ｅ． Ｋ．， Ｃ． Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ， Ｊ． Ｓｕｎ， Ｌ． Ｃ． Ｗａｎｇ， Ｖ． Ｋａｐｏｏｒ， Ｊ． Ｐｒｅｄｉｎａ， Ｄ． Ｊ． Ｐｏｗｅｌｌ， Ｊｒ．， Ｊ． Ｌ． Ｒｉｌｅｙ， Ｃ． Ｈ． Ｊｕｎｅ， ａｎｄ Ｓ． Ｍ． Ａｌｂｅｌｄａ． ２０１１． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＣＲ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｕｍｏｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ： ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：４７１９−４７３０．
Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ． Ａ．， Ｊ． Ｃ． Ｙａｎｇ， Ｍ． Ｋｉｔａｎｏ， Ｍ． Ｅ． Ｄｕｄｌｅｙ， Ｃ． Ｍ． Ｌａｕｒｅｎｃｏｔ， ａｎｄ Ｓ． Ａ． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ． ２０１０． Ｃａｓｅ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｏｕｓ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ＥＲＢＢ２． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８：８４３−８５１．
Ｍｏｒｉｔｚ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１：４３１８， １９９４．
Ｍｕｒａｎｓｋｉ， Ｐ．， ａｎｄ Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ． ２００９． Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ＣＤ４（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２１：２００−２０８．
Ｍｕｔｓａｅｒｓ， Ａ． Ｊ．， Ｇ． Ｆｒａｎｃｉａ， Ｓ． Ｍａｎ， Ｃ． Ｒ． Ｌｅｅ， Ｊ． Ｍ． Ｅｂｏｓ， Ｙ． Ｗｕ， Ｌ． Ｗｉｔｔｅ， Ｓ． Ｂｅｒｒｙ， Ｍ． Ｍｏｏｒｅ， ａｎｄ Ｒ． Ｓ． Ｋｅｒｂｅｌ． ２００９． Ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＴＧＦ−ａｌｐｈａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＥＧＦＲ ｌｉｇａｎｄｓ ａｃｔ ａｓ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｏｓｉｎｇ ｏｆ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ａｎｄ ａｒｅ ｔｕｍｏｒ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ： ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：２３９７−２４０５．
Ｎａｕｅｒｔｈ， Ｍ．， Ｂ． Ｗｅｉｓｓｂｒｉｃｈ， Ｒ． Ｋｎａｌｌ， Ｔ． Ｆｒａｎｚ， Ｇ． Ｄｏｓｓｉｎｇｅｒ， Ｊ． Ｂｅｔ， Ｐ． Ｊ． Ｐａｓｚｋｉｅｗｉｃｚ， Ｌ． Ｐｆｅｉｆｅｒ， Ｍ． Ｂｕｎｓｅ， Ｗ． Ｕｃｋｅｒｔ， Ｒ． Ｈｏｌｔａｐｐｅｌｓ， Ｄ． Ｇｉｌｌｅｒｔ−Ｍａｒｉｅｎ， Ｍ． Ｎｅｕｅｎｈａｈｎ， Ａ． Ｋｒａｃｋｈａｒｄｔ， Ｍ． Ｊ． Ｒｅｄｄｅｈａｓｅ， Ｓ． Ｒ． Ｒｉｄｄｅｌｌ， ａｎｄ Ｄ． Ｈ． Ｂｕｓｃｈ． ２０１３． ＴＣＲ−ｌｉｇａｎｄ ｋｏｆｆ ｒａｔｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：１９２ｒａ１８７．
Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ， Ｃ． Ｍ．， Ｓ． Ｓｈｅｐｐａｒｄ， Ｃ． Ａ． Ｈａｒｔｌｉｎｅ， Ｈ． Ｈｕｌｓ， Ｍ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｓ． Ｌ． Ｐａｌｌａ， Ｓ． Ｍａｉｔｉ， Ｗ． Ｍａ， Ｒ． Ｅ． Ｄａｖｉｓ， Ｓ． Ｃｒａｉｇ， Ｄ． Ａ． Ｌｅｅ， Ｒ． Ｃｈａｍｐｌｉｎ， Ｈ． Ｗｉｌｓｏｎ， ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｃｏｏｐｅｒ． ２０１２． Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｐｏｓｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ２：２４９．
Ｐａｒｓｏｎｓ， Ｄ． Ｗ．， Ｓ． Ｊｏｎｅｓ， Ｘ． Ｚｈａｎｇ， Ｊ． Ｃ． Ｌｉｎ， Ｒ． Ｊ． Ｌｅａｒｙ， Ｐ． Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ， Ｐ． Ｍａｎｋｏｏ， Ｈ． Ｃａｒｔｅｒ， Ｉ． Ｍ． Ｓｉｕ， Ｇ． Ｌ． Ｇａｌｌｉａ， Ａ． Ｏｌｉｖｉ， Ｒ． ＭｃＬｅｎｄｏｎ， Ｂ． Ａ． Ｒａｓｈｅｅｄ， Ｓ． Ｋｅｉｒ， Ｔ． Ｎｉｋｏｌｓｋａｙａ， Ｙ． Ｎｉｋｏｌｓｋｙ， Ｄ． Ａ． Ｂｕｓａｍ， Ｈ． Ｔｅｋｌｅａｂ， Ｌ． Ａ． Ｄｉａｚ， Ｊｒ．， Ｊ． Ｈａｒｔｉｇａｎ， Ｄ． Ｒ． Ｓｍｉｔｈ， Ｒ． Ｌ． Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ， Ｓ． Ｋ． Ｍａｒｉｅ， Ｓ． Ｍ． Ｓｈｉｎｊｏ， Ｈ． Ｙａｎ， Ｇ． Ｊ． Ｒｉｇｇｉｎｓ， Ｄ． Ｄ． Ｂｉｇｎｅｒ， Ｒ． Ｋａｒｃｈｉｎ， Ｎ． Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ， Ｇ． Ｐａｒｍｉｇｉａｎｉ， Ｂ． Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ｖ． Ｅ． Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ， ａｎｄ Ｋ． Ｗ． Ｋｉｎｚｌｅｒ． ２００８． Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：１８０７−１８１２．
Ｐａｕｌｏｓ， Ｃ． Ｍ．， Ｍ． Ｍ． Ｓｕｈｏｓｋｉ， Ｇ． Ｐｌｅｓａ， Ｔ． Ｊｉａｎｇ， Ｓ． Ｂａｓｕ， Ｔ． Ｎ． Ｇｏｌｏｖｉｎａ， Ｓ． Ｊｉａｎｇ， Ｎ． Ａ． Ａｑｕｉ， Ｄ． Ｊ． Ｐｏｗｅｌｌ， Ｊｒ．， Ｂ． Ｌ． Ｌｅｖｉｎｅ， Ｒ． Ｇ． Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｊ． Ｌ． Ｒｉｌｅｙ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｊｕｎｅ． ２００８． Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： ｇｏｏｄ ｈａｂｉｔｓ ｉｎｓｔｉｌｌｅｄ ａｔ ｙｏｕｔｈ ｈａｖｅ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｂｅｎｅｆｉｔｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２：１８２−１９６．
Ｐｅｎｇ， Ｗ．， Ｙ． Ｙｅ， Ｂ． Ａ． Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ， Ｃ． Ｌｉｕ， Ｙ． Ｌｏｕ， Ｍ． Ｚｈａｎｇ， Ｍ． Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎ， Ｙ． Ｙａｎｇ， Ｗ． Ｗ． Ｏｖｅｒｗｉｊｋ， Ｇ． Ｌｉｚｅｅ， ａｎｄ Ｐ． Ｈｗｕ． ２０１０． Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＣＸＣＲ２ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ： ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：５４５８−５４６８．
Ｐｏｒｔｅｒ， Ｄ． Ｌ．， Ｂ． Ｌ． Ｌｅｖｉｎｅ， Ｍ． Ｋａｌｏｓ， Ａ． Ｂａｇｇ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｊｕｎｅ． ２０１１． Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６５：７２５−７３３．
Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ， Ｐ． Ｍ．， Ｍ． Ｅ． Ｋｏｍａｒｏｖｓｋａｙａ， Ｚ． Ｊ． Ｙｅ， Ｃ． Ｉｍａｉ， Ｄ． Ｃａｍｐａｎａ， Ｅ． Ｂａｈｃｅｃｉ， ａｎｄ Ｓ． Ｍ． Ｗｅｉｓｓｍａｎ． ２００６． Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １７：１０２７−１０３５．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ Ｅｄ．， Ｍａｃｋ， ｅｄ． （１９８０）．
Ｒｏｂｂｉｎｓ， Ｐ． Ｆ．， Ｍ． Ｅ． Ｄｕｄｌｅｙ， Ｊ． Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ， Ｍ． Ｅｌ−Ｇａｍｉｌ， Ｙ． Ｆ． Ｌｉ， Ｊ． Ｚｈｏｕ， Ｊ． Ｈｕａｎｇ， Ｄ． Ｊ． Ｐｏｗｅｌｌ， Ｊｒ．， ａｎｄ Ｓ． Ａ． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ． ２００４． Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ： ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｌｏｎｏｔｙｐｅｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３：７１２５−７１３０．
Ｒｏｂｅｒｔ， Ｐ．， Ｍ． Ａｌｅｋｓｉｃ， Ｏ． Ｄｕｓｈｅｋ， Ｖ． Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ， Ｐ． Ｂｏｎｇｒａｎｄ， ａｎｄ Ｐ． Ａ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ． ２０１２． Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ ｏｆ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｌｉｇａｎｄｓ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ １０２：２４８−２５７．
Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ．， ４３：３９−４３， １９９４．
Ｒｏｂｉｎｓ， Ｈ． Ｓ．， Ｐ． Ｖ． Ｃａｍｐｒｅｇｈｅｒ， Ｓ． Ｋ． Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ａ． Ｗａｃｈｅｒ， Ｃ． Ｊ． Ｔｕｒｔｌｅ， Ｏ． Ｋａｈｓａｉ， Ｓ． Ｒ． Ｒｉｄｄｅｌｌ， Ｅ． Ｈ． Ｗａｒｒｅｎ， ａｎｄ Ｃ． Ｓ． Ｃａｒｌｓｏｎ． ２００９． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ−ｃｈａｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ａｌｐｈａｂｅｔａ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ １１４：４０９９−４１０７．
Ｒｏｓｅｔｔｅ， Ｃ．， Ｇ． Ｗｅｒｌｅｎ， Ｍ． Ａ． Ｄａｎｉｅｌｓ， Ｐ． Ｏ． Ｈｏｌｍａｎ， Ｓ． Ｍ． Ａｌａｍ， Ｐ． Ｊ． Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｎ． Ｒ． Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ， Ｅ． Ｐａｌｍｅｒ， ａｎｄ Ｓ． Ｃ． Ｊａｍｅｓｏｎ． ２００１． Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｕｓ ｅｘｔｅｎｔ ｏｆ ＴＣＲ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ： ａ ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５：５９−７０．
Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ， Ｄ． Ｊ．， Ｂ．； Ｏｌｉｖａｒｅｓ， Ｓ．； Ｍａｉｔｉ， Ｓ．； Ｂｒｉｇｇｓ， Ｎ．； Ｓｏｍａｎｃｈｉ， Ｓ．； Ｄａｉ， Ｊ．； Ｌｅｅ， Ｄ．Ａ．； Ｃｏｏｐｅｒ， Ｌ．Ｊ．Ｎ． ２０１４． Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｐｒｏｐａｇａｔｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．
Ｓｃｈａｆｔ， Ｎ．， Ｊ． Ｄｏｒｒｉｅ， Ｉ． Ｍｕｌｌｅｒ， Ｖ． Ｂｅｃｋ， Ｓ． Ｂａｕｍａｎｎ， Ｔ． Ｓｃｈｕｎｄｅｒ， Ｅ． Ｋａｍｐｇｅｎ， ａｎｄ Ｇ． Ｓｃｈｕｌｅｒ． ２００６． Ａ ｎｅｗ ｗａｙ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ： ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｏ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ： ＣＩＩ ５５：１１３２−１１４１．
Ｓｃｈａｍｅｌ， Ｗ． Ｗ．， ａｎｄ Ｂ． Ａｌａｒｃｏｎ． ２０１３． Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｔｉｎｇ ＴＣＲ ｉｎ ｎａｎｏｓｃａｌｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ２５１：１３−２０．
Ｓｃｈａｍｅｌ， Ｗ． Ｗ．， Ｉ． Ａｒｅｃｈａｇａ， Ｒ． Ｍ． Ｒｉｓｕｅｎｏ， Ｈ． Ｍ． ｖａｎ Ｓａｎｔｅｎ， Ｐ． Ｃａｂｅｚａｓ， Ｃ． Ｒｉｓｃｏ， Ｊ． Ｍ． Ｖａｌｐｕｅｓｔａ， ａｎｄ Ｂ． Ａｌａｒｃｏｎ． ２００５． Ｃｏｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ＴＣＲｓ ｅｘｐｌａｉｎｓ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｗｉｄｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０２：４９３−５０３．
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｊ． Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅｘｐ． Ｍｏｒｐｈ． １９７２ Ｖｏｌ ２７：３５３−３６５．
Ｓｉｎｇｈ， Ｈ．， Ｍ． Ｊ． Ｆｉｇｌｉｏｌａ， Ｍ． Ｊ． Ｄａｗｓｏｎ， Ｓ． Ｏｌｉｖａｒｅｓ， Ｌ． Ｚｈａｎｇ， Ｇ． Ｙａｎｇ， Ｓ． Ｍａｉｔｉ， Ｐ． Ｍａｎｕｒｉ， Ｖ． Ｓｅｎｙｕｋｏｖ， Ｂ． Ｊｅｎａ， Ｐ． Ｋｅｂｒｉａｅｉ， Ｒ． Ｅ． Ｃｈａｍｐｌｉｎ， Ｈ． Ｈｕｌｓ， ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｃｏｏｐｅｒ． ２０１３． Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｇｒａｄｅ ＣＤ１９−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｔａｂｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｕｓｉｎｇ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ． ＰｌｏＳ ｏｎｅ ８：ｅ６４１３８．
Ｓｉｎｇｈ， Ｈ．， Ｐ． Ｒ． Ｍａｎｕｒｉ， Ｓ． Ｏｌｉｖａｒｅｓ， Ｎ． Ｄａｒａ， Ｍ． Ｊ． Ｄａｗｓｏｎ， Ｈ． Ｈｕｌｓ， Ｐ． Ｂ． Ｈａｃｋｅｔｔ， Ｄ． Ｂ． Ｋｏｈｎ， Ｅ． Ｊ． Ｓｈｐａｌｌ， Ｒ． Ｅ． Ｃｈａｍｐｌｉｎ， ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｃｏｏｐｅｒ． ２００８． Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＣＤ１９ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ｓｙｓｔｅｍ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６８：２９６１−２９７１．
Ｓｍｉｔｈ， Ｊ． Ｓ．， Ｉ． Ｔａｃｈｉｂａｎａ， Ｓ． Ｍ． Ｐａｓｓｅ， Ｂ． Ｋ． Ｈｕｎｔｌｅｙ， Ｔ． Ｊ． Ｂｏｒｅｌｌ， Ｎ． Ｉｔｕｒｒｉａ， Ｊ． Ｒ． Ｏ’Ｆａｌｌｏｎ， Ｐ． Ｌ． Ｓｃｈａｅｆｅｒ， Ｂ． Ｗ． Ｓｃｈｅｉｔｈａｕｅｒ， Ｃ． Ｄ． Ｊａｍｅｓ， Ｊ． Ｃ． Ｂｕｃｋｎｅｒ， ａｎｄ Ｒ． Ｂ． Ｊｅｎｋｉｎｓ． ２００１． ＰＴＥＮ ｍｕｔａｔｉｏｎ， ＥＧＦＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ ａｎｄ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ９３：１２４６−１２５６．
Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：６５７７， １９９３．
Ｓｔｅｐｈａｎ， Ｍ． Ｔ．， Ｖ． Ｐｏｎｏｍａｒｅｖ， Ｒ． Ｊ． Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ， Ａ． Ｈ． Ｃｈａｎｇ， Ｋ． Ｖ． Ｄｏｂｒｅｎｋｏｖ， Ｇ． Ｈｅｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｍ． Ｓａｄｅｌａｉｎ． ２００７． Ｔ ｃｅｌｌ−ｅｎｃｏｄｅｄ ＣＤ８０ ａｎｄ ４−１ＢＢＬ ｉｎｄｕｃｅ ａｕｔｏ− ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ， ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｐｏｔｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３：１４４０−１４４９．
Ｓｔｏｎｅ， Ｊ． Ｄ．， Ａ． Ｓ． Ｃｈｅｒｖｉｎ， ａｎｄ Ｄ． Ｍ． Ｋｒａｎｚ． ２００９． Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ： ｉｍｐａｃｔ ｏｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２６：１６５−１７６．
Ｓｔｏｎｅ， Ｊ． Ｄ．， ａｎｄ Ｄ． Ｍ． Ｋｒａｎｚ． ２０１３． Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４：２４４．
Ｓｕｈｏｓｋｉ， Ｍ． Ｍ．， Ｔ． Ｎ． Ｇｏｌｏｖｉｎａ， Ｎ． Ａ． Ａｑｕｉ， Ｖ． Ｃ． Ｔａｉ， Ａ． Ｖａｒｅｌａ−Ｒｏｈｅｎａ， Ｍ． Ｃ． Ｍｉｌｏｎｅ， Ｒ． Ｇ． Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｊ． Ｌ． Ｒｉｌｅｙ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｊｕｎｅ． ２００７． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ａ ｄｉｖｅｒｓｅ ａｒｒａｙ ｏｆ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５：９８１−９８８．
Ｓｕｎ， Ｊ． Ｃ．， ａｎｄ Ｍ． Ｊ． Ｂｅｖａｎ． ２００３． Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｃｕｔｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ ｈｅｌｐ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００：３３９−３４２．
Ｓｚｅｒｌｉｐ， Ｎ． Ｊ．， Ａ． Ｐｅｄｒａｚａ， Ｄ． Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ， Ｍ． Ａｚｉｍ， Ｊ． ＭｃＧｕｉｒｅ， Ｙ． Ｆａｎｇ， Ｔ． Ｏｚａｗａ， Ｅ． Ｃ． Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｊ． Ｔ． Ｈｕｓｅ， Ｓ． Ｊｈａｎｗａｒ， Ｍ． Ａ． Ｌｅｖｅｒｓｈａ， Ｔ． Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ， ａｎｄ Ｃ． Ｗ． Ｂｒｅｎｎａｎ． ２０１２． Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ ＥＧＦＲ ａｎｄ ＰＤＧＦＲＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｄｅｆｉｎｅｓ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０９：３０４１−３０４６．
Ｔａｌａｖｅｒａ， Ａ．， Ｒ． Ｆｒｉｅｍａｎｎ， Ｓ． Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａ， Ｃ． Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｆｌｅｉｔｅｓ， Ｇ． Ｇａｒｒｉｄｏ， Ａ． Ｒａｂａｓａ， Ａ． Ｌｏｐｅｚ−Ｒｅｑｕｅｎａ， Ａ． Ｐｕｐｏ， Ｒ． Ｆ． Ｊｏｈａｎｓｅｎ， Ｏ． Ｓａｎｃｈｅｚ， Ｕ． Ｋｒｅｎｇｅｌ， ａｎｄ Ｅ． Ｍｏｒｅｎｏ． ２００９． Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ， ａｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ｂｌｏｃｋｓ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｗｈｉｌｅ ｐｅｒｍｉｔｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６９：５８５１−５８５９．
Ｔｉａｎ， Ｓ．， Ｒ． Ｍａｉｌｅ， Ｅ． Ｊ． Ｃｏｌｌｉｎｓ， ａｎｄ Ｊ． Ａ． Ｆｒｅｌｉｎｇｅｒ． ２００７． ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｓ ｇｏｖｅｒｎｅｄ ｂｙ ＴＣＲ−ｐｅｐｔｉｄｅ／ＭＨＣ ａｆｆｉｎｉｔｙ， ｎｏｔ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９：２９５２−２９６０．
Ｔｉｌｌ， Ｂ． Ｇ．， Ｍ． Ｃ． Ｊｅｎｓｅｎ， Ｊ． Ｗａｎｇ， Ｅ． Ｙ． Ｃｈｅｎ， Ｂ． Ｌ． Ｗｏｏｄ， Ｈ． Ａ． Ｇｒｅｉｓｍａｎ， Ｘ． Ｑｉａｎ， Ｓ． Ｅ． Ｊａｍｅｓ， Ａ． Ｒａｕｂｉｔｓｃｈｅｋ， Ｓ． Ｊ． Ｆｏｒｍａｎ， Ａ． Ｋ． Ｇｏｐａｌ， Ｊ． Ｍ． Ｐａｇｅｌ， Ｃ． Ｇ． Ｌｉｎｄｇｒｅｎ， Ｐ． Ｄ． Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ｒ． Ｒｉｄｄｅｌｌ， ａｎｄ Ｏ． Ｗ． Ｐｒｅｓｓ． ２００８． Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｉｎｄｏｌｅｎｔ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ ａｎｄ ｍａｎｔｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＣＤ２０−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ １１２：２２６１−２２７１．
Ｔｏｐａｌｉａｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．， ７８（Ｓｕｐｐｌ １）：７５−７６， １９８７．
Ｔｏｒｉｋａｉ， Ｈ．， Ａ． Ｒｅｉｋ， Ｐ． Ｑ． Ｌｉｕ， Ｙ． Ｚｈｏｕ， Ｌ． Ｚｈａｎｇ， Ｓ． Ｍａｉｔｉ， Ｈ． Ｈｕｌｓ， Ｊ． Ｃ． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｐ． Ｋｅｂｒｉａｅｉ， Ｂ． Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ， Ｄ． Ａ． Ｌｅｅ， Ｒ． Ｅ． Ｃｈａｍｐｌｉｎ， Ｃ． Ｂｏｎｉｎｉ， Ｌ． Ｎａｌｄｉｎｉ， Ｅ． Ｊ． Ｒｅｂａｒ， Ｐ． Ｄ． Ｇｒｅｇｏｒｙ， Ｍ． Ｃ． Ｈｏｌｍｅｓ， ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｃｏｏｐｅｒ． ２０１２． Ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ａ ＣＤ１９−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＴＣＲ． Ｂｌｏｏｄ １１９：５６９７−５７０５．
Ｔｕｒａｔｔｉ， Ｆ．， Ｍ． Ｆｉｇｉｎｉ， Ｅ． Ｂａｌｌａｄｏｒｅ， Ｐ． Ａｌｂｅｒｔｉ， Ｐ． Ｃａｓａｌｉｎｉ， Ｊ． Ｄ． Ｍａｒｋｓ， Ｓ． Ｃａｎｅｖａｒｉ， ａｎｄ Ｄ． Ｍｅｚｚａｎｚａｎｉｃａ． ２００７． Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｓ ｇｏｖｅｒｎｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３０：６８４−６９３．
Ｔｕｒｋｍａｎ， Ｎ．， Ａ． Ｓｈａｖｒｉｎ， Ｒ． Ａ． Ｉｖａｎｏｖ， Ｂ． Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ， Ａ． Ｖｏｌｇｉｎ， Ｊ． Ｇ． Ｇｅｌｏｖａｎｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｍ． Ａｌａｕｄｄｉｎ． ２０１１． Ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ＣＢ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄｓ： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ２−ｏｘｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ． Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９：５６９８−５７０７．
Ｖａｒｔａｎｉａｎ， Ａ．， Ｓ． Ｋ． Ｓｉｎｇｈ， Ｓ． Ａｇｎｉｈｏｔｒｉ， Ｓ． Ｊａｌａｌｉ， Ｋ． Ｂｕｒｒｅｌｌ， Ｋ． Ｄ． Ａｌｄａｐｅ， ａｎｄ Ｇ． Ｚａｄｅｈ． ２０１４． ＧＢＭ’ｓ ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ ｌａｎｄｓｃａｐｅ： ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎａｌ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ． Ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ．
Ｖｉｏｌａ， Ａ．， ａｎｄ Ａ． Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ． １９９６． Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｔｕｎａｂｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１０４−１０６．
Ｗｅｉｊｔｅｎｓ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：８３６， １９９６．
Ｗｅｉｊｔｅｎｓ， Ｍ． Ｅ．， Ｅ． Ｈ． Ｈａｒｔ， ａｎｄ Ｒ． Ｌ． Ｂｏｌｈｕｉｓ． ２０００． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｎｓｉｔｙ： ＣＴＬ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ７：３５−４２．
Ｗｉｌｋｉｅ， Ｓ．， Ｍ． Ｃ． ｖａｎ Ｓｃｈａｌｋｗｙｋ， Ｓ． Ｈｏｂｂｓ， Ｄ． Ｍ． Ｄａｖｉｅｓ， Ｓ． Ｊ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｇｅｎ， Ａ． Ｃ． Ｐｅｒｅｉｒａ， Ｓ． Ｅ． Ｂｕｒｂｒｉｄｇｅ， Ｃ． Ｂｏｘ， Ｓ． Ａ． Ｅｃｃｌｅｓ， ａｎｄ Ｊ． Ｍａｈｅｒ． ２０１２． Ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＥｒｂＢ２ ａｎｄ ＭＵＣ１ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３２：１０５９−１０７０．
Ｗｕ， Ｆ．， Ｗ． Ｚｈａｎｇ， Ｈ． Ｓｈａｏ， Ｈ． Ｂｏ， Ｈ． Ｓｈｅｎ， Ｊ． Ｌｉ， Ｙ． Ｌｉｕ， Ｔ． Ｗａｎｇ， Ｗ． Ｍａ， ａｎｄ Ｓ． Ｈｕａｎｇ． ２０１３． Ｈｕｍａｎ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ ｃｅｌｌｓ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ＣＤ８（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＣＲ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｏｓｓｅｓｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｒａｉｔｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ ３３９：１９５−２０７．
Ｙａｎｏ， Ｓ．， Ｋ． Ｋｏｎｄｏ， Ｍ． Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｇ． Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｍ． Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ， Ａ． Ｗａｋｅｌｉｎｇ， Ｓ． Ａｖｅｒｂｕｃｈ， ａｎｄ Ｐ． Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ． ２００３． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＦＲ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＥＧＦＲ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３：３６３９−３６５０．
Ｙｏｋｏｓｕｋａ， Ｔ．， ａｎｄ Ｔ． Ｓａｉｔｏ． ２０１０． Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ， ＴＣＲ ｍｉｃｒｏｃｌｕｓｔｅｒｓ， ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３４０：８１−１０７．
Ｙｏｏｎ， Ｓ． Ｈ．， Ｊ． Ｍ． Ｌｅｅ， Ｈ． Ｉ． Ｃｈｏ， Ｅ． Ｋ． Ｋｉｍ， Ｈ． Ｓ． Ｋｉｍ， Ｍ． Ｙ． Ｐａｒｋ， ａｎｄ Ｔ． Ｇ． Ｋｉｍ． ２００９． Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｗｉｔｈ ＲＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ． Ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １６：４８９−４９７．
Ｚｅｈｎ， Ｄ．， Ｓ． Ｙ． Ｌｅｅ， ａｎｄ Ｍ． Ｊ． Ｂｅｖａｎ． ２００９． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｕｔ ｃｕｒｔａｉｌｅｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｖｅｒｙ ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｎａｔｕｒｅ ４５８：２１１−２１４．
Ｚｈａｎｇ， Ｍ．， Ｓ． Ｍａｉｔｉ， Ｃ． Ｂｅｒｎａｔｃｈｅｚ， Ｈ． Ｈｕｌｓ， Ｂ． Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ， Ｒ． Ｅ． Ｃｈａｍｐｌｉｎ， Ｌ． Ｍ． Ｖｅｎｃｅ， Ｐ． Ｈｗｕ， Ｌ． Ｒａｄｖａｎｙｉ， ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｃｏｏｐｅｒ． ２０１２． Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｑｕａｎｔｉｆｙ ｂｏｔｈ ＴＣＲ ａｌｐｈａ− ａｎｄ ｂｅｔａ−ｃｈａｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｆｔｅｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ： ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：４７３３−４７４２．
Ｚｈａｏ， Ｙ．， Ｅ． Ｍｏｏｎ， Ｃ． Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ， Ｃ． Ｍ． Ｐａｕｌｏｓ， Ｘ． Ｌｉｕ， Ａ． Ｌ． Ｂｒｅｎｎａｎ， Ａ． Ｃｈｅｗ， Ｒ． Ｇ． Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｊ． Ｓｃｈｏｌｌｅｒ， Ｂ． Ｌ． Ｌｅｖｉｎｅ， Ｓ． Ｍ． Ａｌｂｅｌｄａ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｊｕｎｅ． ２０１０． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７０：９０５３−９０６１．
Ｚｈｏｎｇ， Ｓ．， Ｋ． Ｍａｌｅｃｅｋ， Ｌ． Ａ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｚ． Ｙｕ， Ｅ． Ｖｅｇａ−Ｓａｅｎｚ ｄｅ Ｍｉｅｒａ， Ｆ． Ｄａｒｖｉｓｈｉａｎ， Ｋ． ＭｃＧａｒｙ， Ｋ． Ｈｕａｎｇ， Ｊ． Ｂｏｙｅｒ， Ｅ． Ｃｏｒｓｅ， Ｙ． Ｓｈａｏ， Ｓ． Ａ． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｎ． Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｉ． Ｏｓｍａｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ． ２０１３． Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ａｖｉｄｉｔｙ ｄｅｆｉｎｅｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０：６９７３−６９７８．
Ｚｈｏｕ， Ｘ．， Ｊ． Ｌｉ， Ｚ． Ｗａｎｇ， Ｚ． Ｃｈｅｎ， Ｊ． Ｑｉｕ， Ｙ． Ｚｈａｎｇ， Ｗ． Ｗａｎｇ， Ｙ． Ｍａ， Ｎ． Ｈｕａｎｇ， Ｋ． Ｃｕｉ， ａｎｄ Ｙ． Ｑ． Ｗｅｉ． ２０１３． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＥＧＦＲ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ １５：５４４−５５３．
Ｚｕｃｋｉｅｒ， Ｌ． Ｓ．， Ｅ． Ｚ． Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ， Ｒ． Ｊ． Ｓａｔｔｅｎｂｅｒｇ， Ｑ． Ｈ． Ｚｈａｏ， Ｈ． Ｆ． Ｄｅｎｇ， ａｎｄ Ｍ． Ｄ． Ｓｃｈａｒｆｆ． ２０００． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｄｅｌ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：７００８−７０１３．

Claims (91)

  1. ある抗原を標的とする発現キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）を含む単離されたトランスジェニック細胞であって、前記ＣＡＲは、前記抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜約５００ｎＭである、前記単離されたトランスジェニック細胞。
  2. 細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の単離細胞。
  3. 抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２癌胎児性抗原、αフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１の外被糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１の外被糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒα、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３の組み合わせまたはＨＥＲ１−ＨＥＲ２の組み合わせである、請求項１に記載の単離細胞。
  4. 抗原がＧＰ２４０、５Ｔ４、ＨＥＲ１、ＣＤ−３３、ＣＤ−３８、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＥＡ、ＦＧＦＲ３、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、Ｆｎ１４、ＥＲＢＢ２またはＥＲＢＢ３である、請求項３に記載の単離細胞。
  5. 抗原が増殖因子受容体である、請求項１に記載の単離細胞。
  6. 抗原がＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２またはＥＲＢＢ３である、請求項５に記載の単離細胞。
  7. ＣＡＲが、抗原に対するＫｄが６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０ｎＭまたはそれ以上である、請求項１に記載の単離細胞。
  8. ＣＡＲが、抗原に対するＫｄが約５ｎＭから約４５０，４００，３５０、３００，２５０，２００，１５０，１００、または５０ｎＭの間である、請求項１に記載の単離細胞。
  9. ＣＡＲが、抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜５０ｎＭである、請求項１に記載の単離細胞。
  10. 抗原がＥＧＦＲである、請求項１に記載の単離細胞。
  11. ＣＡＲが、配列番号５〜１０のＣＤＲ配列を含む、請求項１に記載の単離細胞。
  12. ＣＡＲが、配列番号１及び配列番号２の抗原結合部分を含む、請求項１に記載の単離細胞。
  13. 前記ＣＡＲをコードするＤＮＡが細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１に記載の単離細胞。
  14. 前記ＣＡＲをコードするＤＮＡがトランスポゾン反復配列に隣接する、請求項１に記載の単離細胞。
  15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離細胞を薬理学的に許容される担体内に含む、医薬組成物。
  16. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞を約１ｘ１０３〜１ｘ１０８個含む、請求項１５に記載の医薬の組成物。
  17. 請求項１に記載のトランスジェニック細胞を有効量ヒト被検者に投与することを含む、疾患に罹患しているヒト被検者へのＴ細胞応答提供方法。
  18. ある抗原を標的とする発現キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）を含む単離されたトランスジェニック細胞であって、前記ＣＡＲがセツキシマブのＣＤＲ配列を含む，前記単離されたトランスジェニック細胞。
  19. ＣＡＲが配列番号３及び配列番号４の抗原結合部分を含む、請求項１８に記載の細胞。
  20. （ａ）抗原に結合するＣＡＲを発現している複数のＣＡＲ Ｔ細胞を得、ここで、前記複数の細胞は、
    （ｉ）前記抗原に対する親和性の異なるＣＡＲ、または
    （ｉｉ）前記細胞に異なるレベルで発現するＣＡＲを含み、
    （ｂ）前記抗原を発現している対照細胞上及び該対照細胞よりも高レベルの抗原を発現している標的細胞上で前記細胞の細胞傷害活性を評価し、かつ
    （ｃ）標的細胞に対して選択的に細胞傷害性であるＣＡＲ Ｔ細胞を選択することを含む、ＣＡＲ Ｔ細胞の選択方法。
  21. ＣＡＲ Ｔ細胞の作製及び増幅集団のために選択されたＣＡＲ Ｔ細胞を培養することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  22. ＥＧＦＲに対して標的化した発現キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）を含む単離されたトランスジェニックヒトＴ細胞であって、前記ＣＡＲは、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）のＣＤＲ配列を含み、ここで、ＶＬ ＣＤＲ１はＲＳＳＱＮＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＤ（配列番号５）を含み、ＶＬ ＣＤＲ２はＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号６）を含み、ＶＬ ＣＤＲ３はＦＱＹＳＨＶＰＷＴ（配列番号７）を含み、ＶＨ ＣＤＲ１はＮＹＹＩＹ（配列番号８）を含み、ＶＨ ＣＤＲ２はＧＩＮＰＴＳＧＧＳＮＦＮＥＫＦＫＴ（配列番号９）を含み、かつＶＨ ＣＤＲ３はＱＧＬＷＦＤＳＤＧＲＧＦＤＦ（配列番号１０）を含み、前記Ｔ細胞は、ＥＧＦＲを発現している癌細胞に対する細胞傷害性を示す、前記単離されたトランスジェニックヒトＴ細胞。
  23. 請求項２２に記載の単離されたトランスジェニックヒトＴ細胞を含む医薬組成物。
  24. 請求項２２に記載のトランスジェニックヒトＴ細胞をＥＧＦＲ陽性の癌に罹患している被検体に有効量投与することを含む、該被検体の治療方法。
  25. ＥＧＦＲに対して標的化した発現キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）を含む単離されたトランスジェニックヒトＴ細胞であって、前記ＣＡＲは、セツキシマブのＣＤＲ配列を含み、ここで、ＶＬ ＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号１１）を含み、ＶＬ ＣＤＲ２はＡＳＥＩＳ（配列番号１２）を含み、ＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＮＮＮＷＰＴＴ（配列番号１３）を含み、ＶＨ ＣＤＲ１はＮＹＧＶＨ（配列番号１４）を含み、ＶＨ ＣＤＲ２はＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ（配列番号１５）を含み、かつＶＨ ＣＤＲ３はＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１６）を含み、前記Ｔ細胞は、ＥＧＦＲを発現している癌細胞に対する細胞傷害性示す，前記単離されたトランスジェニックヒトＴ細胞。
  26. 請求項２５に記載の単離されたトランスジェニックヒトＴ細胞を含む医薬組成物。
  27. 請求項２５に記載のトランスジェニックヒトＴ細胞をＥＧＦＲ陽性の癌に罹患している被検体に有効量投与することを含む、該被検体の治療方法。
  28. （ａ）抗原に結合する発現ＣＡＲを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を培養し、ここで前記ＣＡＲ Ｔ細胞は、
    （ｉ）該Ｔ細胞が抗原を多価結合した時に限定された細胞傷害活性、または
    （ｉｉ）前記抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜約５００ｎＭであるＣＡＲを有し、かつ
    （ｂ）前記抗原を高発現している細胞を選択的に標的にするＴ細胞応答を与えるために、前記培養ＣＡＲ Ｔ細胞の有効量をそれを必要とする被検体に投与することを含む、前記被検体における抗原発現細胞への選択的な標的方法。
  29. （ａ）抗原に結合する発現ＣＡＲを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を選択し、ここで前記ＣＡＲ Ｔ細胞は、
    （ｉ）Ｔ細胞が抗原を多価結合した時に限定された細胞傷害活性、または
    （ｉｉ）抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜約５００ｎＭであるＣＡＲを有し、かつ
    （ｂ）前記抗原を高発現している細胞を選択的に標的にするＴ細胞応答を与えるために、前記選択ＣＡＲ Ｔ細胞の有効量をそれを必要とする被検体に投与することを含む、前記被検体における抗原発現細胞への選択的な標的方法。
  30. 抗原を高発現する癌細胞を選択的に標的とするＴ細胞応答を提供するために、前記抗原に結合する発現ＣＡＲを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を有効量含む組成物を投与することを含み、前記ＣＡＲ Ｔ細胞は、
    （ｉ）Ｔ細胞が抗原を多価結合した時に限定された細胞傷害活性、または
    （ｉｉ）抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜約５００ｎＭであるＣＡＲを有する、それを必要としている被検体の癌の治療方法。
  31. 抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２癌胎児性抗原、αフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１の外被糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１の外被糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒα、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３の組み合わせまたはＨＥＲ１−ＨＥＲ２の組み合わせである、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 抗原がＧＰ２４０、５Ｔ４、ＨＥＲ１、ＣＤ−３３、ＣＤ−３８、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＥＡ、ＦＧＦＲ３、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、Ｆｎ１４、ＥＲＢＢ２またはＥＲＢＢ３である、請求項３０に記載の方法。
  33. 抗原が増殖因子受容体である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  34. 抗原がＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２またはＥＲＢＢ３である、請求項３３に記載の方法。
  35. 抗原を発現している細胞が、該抗原を発現する非癌細胞及び該抗原を高発現している癌細胞を含む、請求項２８または２９のいずれか一項に記載の方法。
  36. ＣＡＲが、抗原に対するＫｄが６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０ｎＭまたはそれ以上である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  37. ＣＡＲが、抗原に対するＫｄが約５ｎＭから約４５０，４００，３５０、３００，２５０，２００，１５０，１００、または５０ｎＭまでの間である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  38. ＣＡＲが、抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜５０ｎＭである、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  39. 抗原がＥＧＦＲである、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  40. ＣＡＲが、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ（ニモツズマブ）のＣＤＲ配列を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. ＣＡＲが、配列番号１及び配列番号２の抗原結合部分を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 選択または培養されたＣＡＲ Ｔ細胞が、内在性Ｔ細胞受容体及び／または内在性ＨＬＡの発現について不活性化される、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  43. 選択または培養されたＣＡＲ Ｔ細胞が、膜結合型Ｃγサイトカインをコードする発現させた核酸をさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  44. 膜結合型Ｃγサイトカインが膜結合型のＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１である、請求項４３に記載の方法。
  45. 膜結合型ＣγサイトカインがＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質である、請求項４３に記載の方法。
  46. 選択または培養されたＣＡＲ Ｔ細胞が、前記ＣＡＲをコードする組み込まれたＤＮＡを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  47. 選択または培養されたＣＡＲ Ｔ細胞が、前記ＣＡＲをコードする外因性のｍＲＮＡを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記ＣＡＲをコードする組み込まれたＤＮＡがトランスポゾン反復配列に隣接する、請求項４６に記載の方法。
  49. ＣＡＲ Ｔ細胞の選択または培養が、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞に、抗原に対するＫｄが約５ｎＭ〜約５００ｎＭである選択ＣＡＲをコードするＤＮＡをトランスフェクトすることをさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  50. 細胞に、トランスポゾン反復配列に隣接する前記選択または培養されたＣＡＲをコードするＤＮＡと、前記選択または培養されたＣＡＲをコードする前記ＤＮＡを前記細胞のゲノムに組み込むために効果的なトランスポザーゼとをトランスフェクトすることをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  51. トランスポザーゼが、ｍＲＮＡとして提供される、請求項５０に記載の方法。
  52. トランスポザーゼが、ポリペプチドまたは発現可能なＲＮＡとして提供される、請求項５０に記載の方法。
  53. トランスポザーゼがサケ科のＴｃ１様トランスポザーゼ（ＳＢ）である、請求項５０に記載の方法。
  54. ＣＡＲ Ｔ細胞の培養または選択が、抗原提示細胞の存在下でＣＡＲ Ｔ細胞を培養することを含む、請求項２８に記載の方法。
  55. 抗原提示細胞が樹状細胞を含む、請求項２８に記載の方法。
  56. 抗原提示細胞が、ＣＡＲ Ｔ細胞の増幅を刺激する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む、請求項２８に記載の方法。
  57. ａＡＰＣがトランスジェニックＫ５６２細胞である、請求項５６に記載の方法。
  58. ａＡＰＣが、該ａＡＰＣの表面に発現させた、（ｉ）前記トランスジェニックＣＡＲ細胞上に発現させた前記ＣＡＲに標的にされる抗原、（ｉｉ）ＣＤ６４、（ｉｉ）ＣＤ８６、（ｉｉｉ）ＣＤ１３７Ｌ、及び／または（ｖ）膜結合型ＩＬ−１５を含む、請求項５６に記載の方法。
  59. ａＡＰＣが、該ａＡＰＣの表面に発現させたＣＡＲ結合抗体またはその断片を含む、請求項５６に記載の方法。
  60. ａＡＰＣが、Ｔ細胞を活性化するまたは共刺激するさらなる分子を含む、請求項５６に記載の方法。
  61. さらなる分子が膜結合型Ｃγサイトカインを含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 抗原提示細胞を不活性化させる、請求項５４に記載の方法。
  63. 抗原提示細胞が照射される、請求項６２に記載の方法。
  64. 抗原提示細胞を、感染性物質について試験し、また、感染性物質を含まないことを確認した、請求項５４に記載の方法。
  65. 抗原提示細胞存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞培養が、ＩＬ−２１及び／またはＩＬ−２を含む培地で前記トランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することを含む、請求項５４に記載の方法。
  66. 抗原提示細胞存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞培養が、前記細胞を約１０：１〜約１：１０（ＣＡＲ Ｔ細胞：抗原提示細胞）の比で培養することを含む、請求項５４に記載の方法。
  67. トランスジェニック細胞の培養が７、１４、２１、２８、３５または４２日以内の期間である、請求項２８に記載の方法。
  68. Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を細胞バンクから入手する、請求項４９に記載の方法。
  69. Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を被検体試料から得る、請求項４９に記載の方法。
  70. 試料が単核球画分である、請求項６９に記載の方法。
  71. 試料が凍結保存試料である、請求項６９に記載の方法。
  72. 試料が臍帯血由来である、請求項６９に記載の方法。
  73. 試料が被検体由来の末梢血試料である、請求項６９に記載の方法。
  74. 試料がＴ細胞の亜集団である、請求項６９に記載の方法。
  75. Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞のトランスフェクションが、選択されたＣＡＲをコードするＤＮＡを前記細胞に電気穿孔することを含む、請求項４９に記載の方法。
  76. Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞のトランスフェクションが、前記選択されたＣＡＲをコードするウイルスベクターを用いて前記細胞に形質導入することを含む、請求項４９に記載の方法。
  77. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の選択または培養が、前記投与前にＣＡＲ Ｔ細胞を精製または濃縮することをさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  78. 濃縮が蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 濃縮が、選択されたＣＡＲ Ｔ細胞について選別することを含む、請求項７７に記載の方法。
  80. 濃縮が、選択されたＣＡＲ Ｔ細胞について常磁性ビーズ上で選別することを含む、請求項７７に記載の方法。
  81. ＣＡＲ発現細胞についての選別がＣＡＲ結合抗体の使用を含む、請求項７９に記載の方法。
  82. 濃縮が、ＣＤ５６＋細胞の除去を含む、請求項７７に記載の方法。
  83. 前記投与前に前記ＣＡＲ Ｔ細胞試料を凍結保存することをさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  84. 被検体が細胞増殖性疾患に罹患している、請求項２８に記載の方法。
  85. 細胞増殖性疾患が自己免疫疾患であり、ここで、前記ＣＡＲは、自己免疫細胞に高レベルで発現している抗原に結合する、請求項８４に記載の方法。
  86. 細胞増殖性疾患が癌である、請求項８４に記載の方法。
  87. 被検体がそれまでに抗癌治療を受けたことがある、請求項３０に記載の方法。
  88. 被検体が寛解期にある、請求項８７に記載の方法。
  89. 被検体が、癌の症状はないが検出可能な癌細胞を含む、請求項８７に記載の方法。
  90. 癌が神経膠腫である、請求項８６に記載の方法。
  91. 神経膠腫がびまん性内在性橋膠腫である、請求項９０に記載の方法。
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