ES2603418T3

ES2603418T3 - Preparación de células presentadoras de antígeno artificial inactivado y su uso en terapias celulares

Info

Publication number: ES2603418T3
Application number: ES07852532.6T
Authority: ES
Inventors: Zeling Cai; Ann Moriarty; Juli Degraw; Didier Leturcq; Wei-Xing Shi; Karen Kabat Stegman; Xilian Yue
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2006-10-04
Filing date: 2007-10-04
Publication date: 2017-02-27
Anticipated expiration: 2027-10-04
Also published as: IL223376A; CA2665568C; CN101548008B; US20090017000A1; AU2007307206B2; KR20090060450A; EP2079830A2; US8357533B2; BRPI0720342A2; WO2008045286A3; CA2665568A1; IL197845A0; WO2008045286A2; US8124408B2; US20120115223A1; JP5543207B2; IL197845A; CN101548008A; IL223376A0; JP2010505845A

Abstract

La invención provee un método in vitro para crear linfocitos T activados adecuados para administrar al paciente, comprendiendo las etapas de: inactivación de células presentadoras de antígeno artificial (CPAAs) mediante el tratamiento de las CPAAs con un derivado de psoraleno y exponiendo las CPAA tratadas con el derivado de psoraleno a una dosis de fotoactivación de irradiación UVA; poniendo en contacto a los linfocitos T aislados de un paciente diagnosticado con una enfermedad, trastorno o condición médica con dichas CPAAs, donde antes de o concomitante con dicha etapa de contacto las CPAAs inactivadas se cargan con al menos un antígeno peptídico; y recolectando los linfocitos T.

Description

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Preparacion de celulas presentadoras de antfgeno artificial inactivado y su uso en terapias celulares

DESCRIPCION

ARCHIVO DE DIVULGACION:

[0001] La presente divulgacion en general se refiere a los metodos para el procesamiento de terapia celular para tratar enfermedades, desordenes o condiciones medicas tales como el cancer, mediante la inactivacion artificial de CPA a traves de la reticulacion.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0002] Para facilitar una apreciacion de esta invencion, en esta seccion se discutiran los antecedentes historicos y tecnicos destacados para el desarrollo de esta invencion, se incluyen observaciones, conclusiones y los puntos de vista que podrfan ser unicos para un inventor. Por lo tanto, las declaraciones de los antecedentes en el presente documento no deben interpretarse como un reconocimiento con respecto al contenido de la tecnica mencionada.

[0003] Numerosas terapias han sido desarrolladas para tratar diversos tipos de cancer. Muchas de estos esfuerzos se ha centrado en regfmenes quimioterapeuticos. En la combinacion particular de regimen de quimioterapia designado como tratamiento para el melanoma metastico, la tasa de respuesta de 35-50% fue reportada con el "Regimen de Dartmouth" (una combinacion de dacarbazina (DTIC), cisplatino, carmustina (BCNU), y tamoxifeno), sin embargo la duracion de supervivencia se ha mantenido de 6 a 10 meses. Asf mismo se han reportado altas tasas de remision en altas dosis agresivas de quimioterapia (Hryniuk et al., J. Clin Oncol. Vol. 4, pp. 1162-1170 (1986)) y la replecion de la hematopoyesis con los trasplantes autologos de medula osea. Sin embargo, la duracion media de supervivencia fue baja, aproximadamente de cuatro meses (Herzig, High-Dose Cancer Therapy: Pharmacology, Hemat- opoietins, Stem Cells (Armitage and Antman, eds.), Williams and Wilkins (Baltimore), pp. 750-754(1992)).

[0004] En el transcurso de varios anos, se han observado mejoras significativas de supervivencia en un pequeno porcentaje de pacientes con melanoma que se han sometido a ciertas inmunoterapias. Inmonoterapias que han incluido la inmunoterapia especifica activa con vacunas contra el cancer, asf mismo con el uso de re-vacunacion no especifica del sistema inmune, tal como interleucina-2 (IL-2) e interferon-alfa (IFN- l) Saunders (Philadelphia), pp. 57-69 (1995); Mitchell et al., J. Clin. Oncol., Vol. 12, pp. 402-411 (1994)). Vease tambien publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos No. US 2003/0022820.

[0005] La identificacion de antfgenos tumorales definidos de celulas T en el melanoma, ha llevado a ensayos clfnicos que se enfocan en las celulas cancerosas intentando aumentar la respuesta inmune celular especifica del antfgeno. Este enfoque se ha adoptado en numerosas estrategias de vacunacion en el cual los antfgenos son entregados en un contexto inmunogenico intentando inducir respuestas de potente

30 celulas T in vivo. Aunque algunas respuestas clfnicas han sido observadas en ensayos de vacunas, la magnitud de la respuesta de las celulas T inducidas, ha sido generalmente baja o indetectable y poco correlacionada con las respuestas clfnicas. La inmunizacion de pacientes con melanoma con antfgenos del cancer pueden aumentar el numero de precursores de CTL en la circulacion; sin embargo, no se ha correlacionado con la regresion tumoral clfnica, sugiriendo un defecto en la funcion o activacion in vivo.

[0006] Los estudios en ratones de modelos tumorales han demostrado que la inmunoterapia adoptiva, que implica la inmunizacion in vitro 35 de celulas T especfficas para uno o mas antfgenos tumorales, puede ser eficaz con una toxicidad minima. Un obstaculo en la aplicacion de esta estrategia al tratamiento de los tumores en humanos, ha sido la idetificacion de los antfgenos inmunogenicos que hacen las celulas tumorales suceptibles a la destruccion mediada por CTL. El aislamiento de las celulas T reactivas a tumores de pacientes con melanoma ha llevado a la identificacion de algunos de los antfgenos tumorales (epftopos) que dirigen a los CTL. Estos incluyen tirosinasa, MART-1/Melan A, gp100, y MAGE. De estas, tirosinasa y MART-1 casi se manifiestan universalmente en melanoma y por lo tanto representan una eleccion de objetivo deseado para la inmunoterapia adoptiva Med. Vol. 179, pp. 921930 (1994); Kawakami et al., J. Exp. Med., Vol. 180, 347-352 (1994); Brichard et al., J. Exp. Med., Vol. 178:489-495, 1993; Robbins et al., Cancer Res. 54:3124-3126, 1994; Bakker et al., J. Exp. Med. Vol. 179, pp. 1005-1009 (1994); Wolfel et al., Eur. J. Immnol. Vol. 24, pp. 759-764 (1994); and Visseren et al., J. Immunol. Vol. 154, pp. 3991-3998 (1995)).

[0007] La terapia adoptiva de celulas T involucra la extraccion de las celulas T del ambiente huesped en donde los mecanismos tolerogenicos estan activos in vivo en pacientes con cancer y contribuyen a las respuestas ineficaces demostradas en esta poblacion de pacientes. Las celulas T CD8+ pueden ser estimuladas ex vivo para generar en los CTL antfgeno-especffico (vease p. ej. Patente U.S. No. 6,225,042). Los enfoques de inmunoterapia adoptiva temprana emplearon linfocitos activados como tratamiento para varios tipos de cancer (Rubin et al., Biological Approaches to Cancer Treatment. Biomodulation (Mitchell, ed.), McGraw-Hill (New York), pp. 379-410 (1993)).

Se usaron inicialmente, celulas asesinas activadas por linfocinas (LAK), y despues linfocitos infiltrantes del tumor (TIL), activados ex vivo con IL-2, pero la demostracion de la eficacia fue equfvoca. Estos prematuros ensayos clfnicos controlados no demostraron una ventaja para el uso de las celulas activadas ex vivo en la administracion

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directa de IL-2 en los pacientes con melanoma. Los estudios mas recientes hechos por Yee et al. at Fred Hutchinson Cancer Research Center (Yee et al., PNAS, Vol. 99, pp. 16168-16173, (2002)) y Dudley et al. at NCI (Dudley et al., Science, Vol. 298, pp. 850-854 (2002)) han demostrado el potencial para ciertos enfoques de terapia adoptiva de celulas T. Estos estudios implican ya sea el uso de clones de celulas T especfficas MART-1 o gp100 y dosis bajas de IL-2, o TIL expandidos ex vivo con celulas alimentadoras alogenicas y altas dosis de IL-2. Estos estudios confirman que la terapia de inmunoterapia adoptiva promete ser una terapia contra el cancer, aunque su pleno desarrollo se ha visto obstaculizado por la falta de metodos reproducibles para la generacion ex vivo de numeros terapeuticos del antfgeno-especffico CD8+ de los CTL (Oelke et al., Nat. Med., Vol. 9:619-624(2003)).

[0008] Las celulas T CD8+, citolftico, citotoxico son un importante mecanismo de defensa contra las infecciones virales. Los linfocitos T CD8+ especfficamente reconocen y rompen la membrana celular del huesped que esta infectadas con un virus. Aunque serfa deseable potenciar la actividad citotoxica de los CTL, muy pocos procedimientos in vitrolex vivo han estado disponibles para activar especfficamente a los CTL. La identificacion de la clave para los antfgenos asociados al melanoma y un metodo especffico de activacion in vitro de los CTL, permite una evaluacion eficaz de la inmunoterapia adoptiva para el melanoma metastasico (vease, ademas de Yee et al., Dudley et al., y Oelke et al., supra, and Leturcq et al., "Ex Vivo Generation of Potent Cytotoxic T Lymphocytes for the Treatment of Cancer: A Novel Antigen Presentation System", Society of Biological Therapy 17th Annual Meeting, Abstract #40 (2002))

[0009] Si bien es posible utilizar naturalmente celulas que presentan antfgeno (CPAs) para la activacion de celulas T naive in vitro (p. ej. las celulas dendrfticas, macrofagos, celulas B, o celulas tumorales autologas), la eficiencia de la activacion es baja ya que las moleculas de CMH de las CPA naives contienen muchos otros epitopes de peptidos, permitiendo de este modo la presentacion minima de los epitopes seleccionados. La mayorfa de estos peptidos presentados, representan protefnas endogenas normales inofensivas. Un enfoque mas directo a este problema, serfa activar las celulas T CD8+ concretamente en aquellos epitopes relacionados a la lucha contra esta enfermedad.

[0010] Una CPA artificial es una xCPA que se ha desarrollado utilizando la linea celular embrionaria de la Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) la cual expresa el complejo de mayor histocompatibilidad (CMH) de moleulas clase I (Leturcq et al., supra; Jackson et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp. 12117-12121(1992); vease tambien U.S. Patent Nos. 6,225,042 y 6,355,479). Dado que Drosophila carece de un sistema inmune avanzado, homologos al humano de Drosophila TAP-1 y transportadores peptfdicos 2, los cuales estan implicados en la carga de epftopos de peptidos en las moleculas CMH humana, estos estan ausentes. Por tanto, moleculas transfectadas de clase I y de clase II aparecen en la superficie de celulas de Drosophila como recipientes vacfos. Incubando celulas transfectadas de Drosophila con CMH de clase I o CMH de clase II codificando los vectores de expresion con peptidos sinteticos exogenos que se unen a las moleculas especfficas CMH (es decir, los epftopos de peptido antigenico tumoral de celulas T), todas las moleculas de CMH disponibles pueden estar ocupadas con CMH- restringido, epftopo peptido especffico (s). En particular, la alta densidad de expresion de moleculas CMH de clase I que presentan uno o multiples epitopes, y la incorporacion moleculas clave coestimuladoras B7-1 (CD80), CD70, LFA-3 (CD58), y ICAM-1 (CD54) en estos CPAs de Drosophila, pueden permitir la generacion in vitro de potentes celulas T CD8+ autologas citotoxicas que son especfficos para los peptidos seleccionados (Cai et al., Immunol. Rev., Vol. 165, pp, 249-265 (1998).

[0011] Se han desarrollado numerosas mejoras en la terapia celular. Vease, p. ej. las siguientes publicaciones de

patentes: U.S. Patent Numeros: 5,314,813, 5,529,921, 5,827,737, 6,001,365, 6,225,042, 6,251,627,

6,255,073, 6,362,001, 6,461,867, 6,790,662, y 6,828,150; WO 2002/065992 y 2002/092773; y EP 814,838. Por ejemplo, se han realizado tres estudios clfnicos (haciendo referencia a CTL-01, CTL-02 y CTL-03) en pacientes con melanomas malignos avanzados, en donde se aislaron celulas T CD8+ autologas de los pacientes, estimuladas y expandidas ex vivo, antes de ser devueltos a los pacientes como linfocitos T citotoxicos de antfgeno-especffico (CTLs). La capacidad de generar de forma reproducible potente antfgeno-especffico CTLs ex vivo implica una estimulacion primaria con una linea celular embrionaria de Drosophila melanogaster (SC2) que se transfecta con HLA humana clase I, moleculas coestimuladoras y moleculas de adhesion las cuales son importantes para la optima activacion de celulas T. El celulas transfectadas son utilizadas como celulas presentadoras de antfgeno artificial para estimular a las celulas T naive CD8+ para conducirlas a celulas efectoras con actividad citotoxica en contra de celulas blanco que expresan la protefna a la que los CTL fueron inmunizados en contra las in vitro. Dos diferentes lineas artificiales CPA han sido usadas en estos estudios clfnicos. Una expresando HLA-A2, B7.1 y ICAM (clone 666) y la otra expresando estas tres moleculas, mas B7.2 y LFA-3 (clone 668).

[0012] Una producto de terapia celular designada CTL-04, que esta siendo experimentada por la investigacion clfnica, ha sido desrrollada con el Drosophila-basada en las CPAs. El producto de terapia celular es un producto inmunoterapeutico autologo preparado con ex vivoCTLs CD8+ autologos activados que exhiben especificidad de peptido de hasta seis HLA-A2.1 de petidos restringidos seleccionados de antfgenos asociados al melanoma identificados por secuencias, enumeradas en SEQ ID Numeros:5, 6, 7, 8, 9, y 70. El componente activo del producto de terapia celular son las propias celulas CD8+ del paciente, las cuales han sido activadas ex vivo por exposicion para seleccionar a las CPAs cargado de peptido teniendo especificidad para al menos uno de los seis peptidos

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restingidos HLA-A2.1 listados en la Numeros de SEQ ID proporcionados anteriormente. Estos CTL son: derivadas de las celulas naive autologas aisladas de muestras de aferesis linfatica recolectadas en un centro clfnico; preparados ex vivo frente a los epftopos de peptidos antigenicos usando melanoma artificial, inactivado de celulas de Drosophila como las CPAs ; expandido por reestimulacion con monocitos autologos cargados con los epftopos antigenicos de melanoma en la presencia de Interleucina-2 (IL-2) y la Interleucina-7 (IL-7), seguido por la expansion no-especffica usando OKT®3; recolectado, lavado y re-suspendido en formulacion final para infusion; e infundido en el paciente. El producto final para la re-infusion contiene 1-10 x 109 celulas CTL en 300 mL de Lactato de Ringer solucion inyectable (76% v/v), 5% de dextrosa en solucion salina normal (D5NS) (4% v/v), y albumina de suero humano (HSA) (20% v/v).

[0013] Por supuesto, como con cualquier farmaco, es importante garantizar la seguridad y eficacia del producto terapeutico. Por tanto, antes de que un producto de terapia celular tal como CTL-04 se libere para su uso clfnico, normalmente es sometido a diversas pruebas de garantfa de calidad. Por ejemplo, el producto de terapia celular puede ser analizado para confirmar la ausencia de ADN de Drosophila por la tecnica basada en PRC. Adicionalmente, el producto puede ser sometido al RT/PCR para confirmar la ausencia de ARN de virus conocidos por insectos endogenos especfficos, tales como Drosophila Nodavirus (DrNV); virus X de Drosophila (DXV), y como el virus de la Drosophila HPS-1. Ademas, el BacT/Alert® puede ser utilizado para poner a prueba el proceso y la esterilidad del producto final. La prueba de esterilidad de los productos de celulas NIH por el Departamento de Medicina de Transfusion de hongos, bacterias, y el contenido de endotoxinas se menciona en la patente de U.S. Publicacion de la solicitud No. US 2006/0159667. WO 96/27393 se refiere a la activacion de los linfocitos T usando CPAs, y el uso de linfocitos T activados. WO 00/54802 describe el uso de agentes fotosensibilizantes tales como AlPcS2a (aluminio ftalocianina disulfonato) en un proceso llamado internalizacion fotoqufmica para la mejora de la captacion de antfgenos y el procesamiento por las celulas presentadoras de antfgenos. US6355479 se refiere a matrices presentadoras de antfgeno sinteticas, a sus metodos de fabricacion y a sus metodos de uso.

[0014] A pesar de la seguridad y la eficacia de este tipo de terapias celulares, sigue existiendo el deseo de desarrollar terapias celulares que garanticen ser ademas de seguras, potentes, especialmente en funcion de la FDA, reclasificar tal terapia celular como un producto de los xenotrasplantes. Esta clasificacion requiere un conjunto separado de reglas generales, que incluye una mencion especffica de la droga como un producto de los xenotrasplantes, posible riesgo de infecciones zoonoticas tanto el receptor como contactos ffsicos cercanos, prevencion de organos o de donaciones de sangre despues de recibir el tratamiento, y el establecimiento de un programa de seguimiento a largo plazo para determinar si la toxicidad tardfa se produce como resultado de la terapia.

RESUMEN DE LA INVENCION

[0015] La invencion provee un metodo in vitro para crear linfocitos T activados adecuados para administrar al paciente, comprende las etapas de:

inactivacion de celulas presentadoras de antfgeno artificial (CPAAs) mediante el tratamiento de las CPAAs con un derivado de psoraleno y exponiendo las CPAA tratadas con el derivado de psoraleno a una dosis de fotoactivacion de irradiacion UVA;

poniendo en contacto a los linfocitos T aislados de un paciente diagnosticado con una enfermedad, trastorno o condicion medica con dichas CPAAs, donde antes de o concomitante con dicha etapa de contacto las CPAAs inactivadas se cargan con al menos un antfgeno peptfdico; y recolectando los linfocitos T.

[0016] Aquf tambien se describe un metodo para la creacion de linfocitos T activados ex vivo para la administracion a un paciente, que comprende las etapas de: inactivacion de las celulas presentadoras de antfgeno artificial (CPAAs) con un agente de reticulacion de acido nucleico; poniendo en contacto los linfocitos T aislados de un paciente diagnosticado con una enfermedad o trastorno con dichas celulas presentadoras de antfgeno artificial inactivado; y recolectando los linfocitos T para administrar de nuevo al paciente. En un aspecto de esta realizacion, el agente de reticulacion es un derivado de psoraleno y dicha etapa de inactivacion comprende exponer el antfgeno artificial que presenta las celulas tratadas con el derivado de psoraleno a una dosis de fotoactivacion de la irradiacion UVA.

[0017] Preferentemente el derivado de psoraleno utilizado en esta invencion es psoraleno, 8-metoxipsoraleno (8- MOP), 4'-(aminomentil)-4,5', 8-psoraleno (AMT), o amotosalen (S59). Asf mismo preferiblemente cuando el agente de reticulacion es un derivado del psoraleno, la etapa de inactivacion comprende la exposicion del antfgeno artificial de celulas presentadoras tratadas con derivado de psoraleno a una concentracion de 1 a 100 pg/ml a la irradiacion UVA a una dosis de 1 to 100 Julios/cm2 de irradiacion UVA por un periodo de 1 a 60 minutos.

[0018] Los metodos de esta investigacion son utiles en los metodos ex vivo para tratar el cancer y canceres ejemplares contemplados dentro del alcance de esta divulgacion y ademas estos metodos incluyen las etapas de cargar el antfgeno artificial de celulas presentadoras con al menos un antfgeno de peptido asociado al cancer.

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Ademas, los linfocitos T activados son preferiblemente citotoxicos hacia las celulas blanco que expresan el peptido, y el peptido seleccionado del grupo que consiste en antigenos peptfdicos al melanoma asociados con el cancer, antigenos peptfdicos asociados con el cancer de ovario, antigenos peptfdicos asociados con el cancer de mama, cancer de pulmon, leucemia, mieloma multiple, antigenos peptfdicos asociados al linfoma y antfgenos peptfdicos asociados al cancer de prostata. Los petidos para el uso en los metodos descritos en este documento, son aquellos que comprenden al menos ocho aminoacidos antigenicos contiguos de la secuencia de aminoacidos de MART-1, tirosinasa, gp100, NY-ESO-1, MUC-1, CA-125, Her-2 , survivina, telomerasa, CAMEL, CEA, livin, SART-1, SCP-1, SSX-2, PRAME, C-Lectin, Pec60, AES, MAGE-3, G250, FBP, SSX-4, SP17, hTRT, MUC-16, MAGE-1, Topoisomerase II, Integrin p8 precursor de la subunidad, MUC-1, MAGE-B2, STAT 1, Y-Catenin, or H-RYK. Para la invencion es preferible el uso de uno o mas de los peptidos seleccionados del grupo consiste en: SILSLKEAST (SEQ ID NO.1), KMASRSMRL (SEQ ID NO.2), ALALAALLVV (SEQ ID NO.3), ALLVVDREV (SEQ ID NO. 4), YMNGTMSQV (SEQ ID NO.5), YMDGTMSQV (SEQ ID NO.6), ITDQVPFSV (SEQ ID NO.7), YLEPGPVTA (SEQ ID NO.8), AAGIGILTV (SEQ ID NO.9), ELAGIGILTV (SEQ ID NO.10), CLTSTVQLV (SEQ ID NO.11), HLYQGCQVV (SEQ ID NO.12), KIFGSLAFL (SEQ ID NO.13), IISAVVGIL (SEQ ID NO.14), PLTSIISAV (SEQ ID NO.15), VMAGVGSPYV (SEQ ID NO.16), VLVKSPNHV (SEQ ID NO.17), ELVSEFSRM (SEQ ID NO.18), YLSGANLNL (SEQ ID NO.19), GPLTPLPV (SEQ ID NO.20), SLLMWITQC (SEQ ID NO.21), KALF- AGPPV (SEQ ID NO.22), YLETFREQV (SEQ ID NO.23), GLQSPKSPL (SEQ ID NO.24), VLLKLRRPV (SEQ ID NO.25), ELYIPSVDL (SEQ ID NO.26), SLLMWITQV (SEQ ID NO.27), ILAKFLHWL (SEQ ID NO.28), STAPPVHNV (SEQ ID NO.29), FLWGPRALV (SEQ ID NO.30), FMWGNLTLA (SEQ ID NO.31), RLVDDFLLV (SEQ ID NO.32), HLSTAFARV (SEQ ID NO.33), QLSLLMWIT (SEQ ID NO.34), NO.65), QLYLELSQL (SEQ ID NO.66), KVLEYVIKV (SEQ ID NO.67), KVADLVGFL (SEQ ID NO.68), KTWGQYWQV (SEQ ID NO.70) y VLDGLDVLL (SEQ ID NO.71).

[0019] Se prefiere usar una mezcla de peptidos en los metodos de la presente invencion que incluyen al menos un peptido seleccionado del grupo consiste en: YMNGTMSQV (SEQ ID NO.5), ITDQVPFSV (SEQ ID NO.7), AAGIGILTV (SEQ ID NO.9), ELAGIGILTV (SEQ ID NO.10), SLLMWITQV (SEQ ID NO.27), FLWGPRALV (SEQ ID NO.30), TLAKFSPYL (PRAME; SEQ ID NO.54) y VLDGLDVLL (SEQ ID NO.71).

[0020] En un metodo preferido adicional de esta realizacion, el metodo comprende aislar celulas T de una muestra de leucoferesis (tambien conocido como una muestra aferesis) de un paciente para su uso en dicha etapa de contacto; y administrar al sujeto una cantidad eficaz de los linfocitos T recogidos en dicha etapa de recoleccion. Ademas, el metodo puede comprender tambien la reestimulacion de dichos linfocitos T activados antes de llevar a cabo dicha etapa de administracion, comprendiendo dicho procedimiento de reestimulacion de esta manera: poniendo en contacto a los linfocitos T activados con al menos una citocina, promoviendo de este modo la proliferacion de celulas T activadas; y la incubacion de celulas T activadas con celulas autologas irradiadas no- CD8+, celulas adherentes nonCD8+ o celulas presentadoras de antigenos artificiales (CAAPs) tratadas con psoraleno/UVA, generando de este modo linfocitos T activados reestimulados. Las citocinas preferidas incluyen esta seleccion del grupo consisten en: IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL- 17, IL-21, IFN-y, y TNF-a,y en el que dichas celulas activadas linfocitos T comprenden linfocitos T citotoxicos activados.. Ademas los linfocitos T activados, pueden ser sometidos a al menos una iteracion del procedimiento de reestimulacion antes de realizar dicha etapa de generacion, comprendiendo dicho procedimiento de reestimulacion de esta manera: poniendo en contacto a los linfocitos T activados con una combinacion de IL-2 y al menos otra de citocina seleccionada del grupo que consiste en: IL-7, IL-15 o IL-21 promoviendo de este modo el crecimiento de celulas T activadas, la proliferacion, o diferenciacion; y la incubacion de las celulas T activadas con celulas autologas irradiadas no-CD8+ , celulas adherentes nonCD8+ o celulas tradadas con las CPAA para generar de este modo linfocitos T activados reestimulados. Preferentemente el procedimiento de reestimulacion comprende el contacto de los linfocitos T activados con las CPAA de Drosophila en presencia de IL-2 en una concentracion de 1 a 100 U/ml; IL-7 de 1 a 100 U/ml, IL-15 de 1 a 100 ng/ml y IL-21 de 1 a 100 ng/ml. En un aspecto de este metodo , las celulas autologas irradiadas adherentes no-CD8+ comprenden celulas autologas irradiadas adherentes CD14+ y en otro aspecto de la etapa de generacion, dicho procedimiento de reestimulacion comprende: poner en contacto a los linfocitos T activados con una combinacion de IL-2 y al menos otra de citocina seleccionada del grupo, que consiste en: IL-7, IL- 15 o IL-21 promoviendo de este modo el crecimiento de celulas T activadas, la proliferacion, o diferenciacion; y la incubacion de las celulas T activadas con celulas autologas irradiadas no-CD8+, celulas adherentes nonCD8+ o celulas con los CPAA tradadas con psoraleno/UVA para generar de este modo linfocitos T activados reestimulados Preferentemente el procedimiento de reestimulacion comprende el contacto de los linfocitos T activados con los CPAA de Drosophila en presencia de IL-2 en una concentracion de 1 a 100 U/ml; IL-7 de 1 a 100 U/ml, IL-15 de 1 a 100 ng/ml y IL-21 de 1 a 100 ng/ml. En un aspecto de este metodo, las celulas autologas irradiadas adherentes nonCD8+ comprenden celulas autologas irradiadas adherentes CD14+ y en otro aspecto de esta realizacion, las celulas autologas irradiadas no-CD8+ comprenden celulas T autologas irradiadas CD14+.

[0021] En otro aspecto de este metodo, este comprende ademas, la congelacion y descongelacion de dichas celulas presentadoras de antfgeno artificial antes, despues o concomitante con dicha etapa de inactivacion y antes de dicha etapa de contacto. Preferentemente, en todos los aspectos de estos metodos, la inactivacion de celulas presentadoras de antfgeno artificial son incapaces de proliferarse y estan escencialmente libres de cotaminacion.

[0022] En los metodos preferidos de esta invencion las celulas presentadoras de antfgeno artificial expresan un leucocito humano CMH molecula de antfgeno humano, p-2 microglobulina y una molecula auxiliar que comprende

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una molecula co-estimuladora humana seleccionada del grupo que consiste en CD80 (B7-1), LFA-3 (CD58), CD83, CD86 (B7-2) o un miembro de la familia de TNF seleccionado de entre el grupo que consiste en CD70, TNF,L LT, 4- 1BBL y OX40L o una molecula de adhesion seleccionada del grupo que consiste de ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 y LFA-3. Aun mas preferiblemente las celulas presentadoras de antfgenos artificiales expresan el HLA humana clase I antfgeno CMH molecula HLA 2.1. Donde la molecula CMH de clase I es HLA-A2.1, las moleculas auxiliares son preferiblemente B7-1 (CD80), LFA-3 (CD58), CD70 y ICAM-1 (CD54). Preferiblemente tambien, las celulas presentadoras de antfgeno artificial son tradadas con psoralen/UVA celulas Drosophila transfectadas con moleculas de HLA y moleculas coestimuladoras.

[0023] Como se menciono anteriormente, un uso preferido de este metodo se refiere a una variedad de canceres, incluyendo melanoma maligno, mieloma multiple, cancer de prostata, linfoma, linfoma no-Hodgkin, leucemia, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocftica cronica, leucemia mieloide cronica, linfoma de Burkitt, cancer de tiroides, cancer de utero, cancer de rinon, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de hfgado, cancer de pancreas, cancer de prostata, cancer de colon, cancer de piel, cancer de estomago, cancer cervical, cancer de cabeza y cuello, glioma, y cancer de cerebro.

[0024] Otro aspecto de esta realizacion en este invento, se refiere a las celulas presentadoras de antfgeno artificial de Drosophila. La invencion provee celulas presentadoras de antfgeno artificial de las CPAA inactivadas de (Drosophila aAPCs) con acido nucleico reticulado, en el que las CPAA de Drosophila estan inactivadas por un tratamiento de derivado de psoraleno y expuestas a una dosis de fotoactivacion de irradiacion UVA, en donde las CPAA inactivadas de Drosophila pueden activar a los linfocitos T cuando las CPAA inactivadas se cargan con uno o mas antfgenos peptidos antes o concomitantes con la activacion de linfocitos T.

[0025] Las celulas presentadoras de antfgeno artificial de psolareno inactivado preferidas son las que expresan HLA-A2.1, B7-1 (cD80), LFA-3(CD58), CD70 y la protefna ICAM-1(CD54) de superficie celular. Un conjunto de mezcla de peptidos preferido para ser combinado con las celulas presentadoras de antfgeno artificial incluye: YMNGTMSQV (SEQ ID NO.5), ITDQVPFSV (SEQ ID NO.7), AAGIGILTV (SEQ ID NO.9), ELAGIGILTV (SEQ ID NO.10), SLLMWITQV (SEQ ID NO.27), FLWGPRALV (SEQ ID NO.30), TLAKFSPYL (PRAME; SEQ ID NO.54) y VLDGLDVLL (SEQ ID NO.71). Cuando se combinan con las celulas presentadoras de antfgeno artificial, estos peptidos se asocian con las proteinas CMH y se dice que estan "cargadas", antfgeno artificial de celulas presentadoras las cuales presentan despues la combinacion preferida de petido.

Otras celulas presentadoras de antfgenos artificiales incluyen aquellas que expresan las proteinas de superficie HLA-A2.1, B7-1 y ICAM-1. Otras celulas presentadoras de antfgenos artificiales incluyen celulas que expresan HLA-A2.1, B&-1, FLA-3, CD70 y ICAM-1;aquellas que expresan HLA-A2.1, B&-1, B&-2, FLA-3 y ICAM-1.

BREVE DESCRIPCION DE LOS CUADROS

[0027]

Figura 1 ilustra los tftulos de baculovirus tras el tratamiento UVADEX/UV de las celulas Sf9 infectadas con baculovirus. Las celulas Sf9 se infectaron con una dosis titulada de baculovirus, y las celulas infectadas se trataron con 5m g/ml de UVADEX a 4°C durante 30 minutos, seguido de tratamiento UVA por 0, 2, 10, o 20 minutos, respectivamente, como se indica. Las celulas tratadas fueron cultivadas a 28°C durante 4 dfas. Se recogio sobrenadante del cultivo y se utilizo para infectar cultivos frescos, cultivos no infectados de celulas Sf9 sembradas en placas de 96 pocillos. Baculovirus presentes en estos cultivos Sf9 fueron detectados mediante un ensayo rapido de microtitulacion (Invitrogen) usando un anticuerpo de gp64 especffico, y se calcularon los tftulos de baculovirus.

La Figura 2 ilustra un analisis de la proliferacion celular de las CPA (xAPCs) xenogenicas no tratadas versus las xCPA de Drosophila tradada con UVADEX/UVA. Las xCPA deDrosophila no se trataron o se trataron con UVADEX (5pg/ml) a 4°C durante 30 minutos, seguido de un tratamiento UVA por 0, 2, 10, o 20 minutos, respectivamente, como se indica. Las celulas tratadas fueron lavadas completamente para remover el residuo UVADEX y despues sembradas en placas de 6 pocillos a 1 x 106 celulas/ml y cultivadas de forma continua durante 16 dfas. Las xCPAs viables (es decir, en vivo) se contaron en el dfa 1, dfa 5, dfa 9, dfa 14, y el dfa 16 post-tratamiento mediante tincion con azul de tripano en cada cultivo.

La Figura 3 muestra un analisis del grado de transcripcion del acido nucleico xenogenico asociado con Drosophila CPAA (clon B) que se dejaron sin tratar, Y-irradiacion tratada, o UVADEX/UVA tratada. Cultivos de las xCPA de Drosophila (clon B) se dejaron sin tratar, se trataron con Y-Irradiacion durante 50 minutos (entrega de aproximadamente 16.000 rads), o tratados con UVADEX (5pg/ml)/UVA. Cada cultivo de las xCPA se lavo y se cocultivo durante 10 semanas con una lfnea celular de alimentacion de Drosophila (clon D) que no contenfa acido nucleico xenogenico codificado HLA A2.1, B7-1, B7-2, y p2m. La transcriptasa inversa (RT-PCR) utilizo cebadores especfficos de reacciones para HLA A2.1, B7-1, B7-2, y transcripciones p2m despues fueron realizadas en los extractos de las lfneas celulares del indicador que se cocultivaron con cada uno de los no tratados, UVADEX (5pg/ml)/UVA-tratada, y las xAPC Yirradiadas. Los productos de RT-PCR se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa. Carril 1, marcadores de peso molecular; carril 2, los productos de RT-PCR de

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las xAPC clon B no tratada (control positivo); carril 3, productos de RT-PCR de las xCPA clon B Y-irradiada; carriles 4, 5 y 6, los productos de RT-PCR de UVADEX-tratado las xAPC clon B en donde fueron irradiados rayos UVA durante 5, 15 o 30 minutos, respectivamente, como se indica.

Las figuras 4A a 4C muestran un analisis de la infectividad del virus lftico y la actividad microbiana asociada con las xCPA de Drosophila y acido nucleico xenogenico asociado que estaban sin tratar o fueron sometidos a un tratamiento UVADEX/UVA. (Figura 4A, analisis de microscopfa de lisis de celulas indicadoras clon D incubadas con una alfcuota de reserva viral xAPC sin tratar; Figura 4B, analisis de microscopfa de lisis de celulas indicadoras clon D incubadas con una alfcuota de UVADEX/UVA-tratada de suministro viral xCPA; Figura 4C, analisis de la supervivencia celular de celulas indicadoras clon D incubadas con las diluciones seriadas indicadas de suministro viral xCPA no tratada o de suministro viral xCPA de UVADEX/UVA. Cfrculos cerrados, celulas incubadas con el clon D reserva viral no tradada; cfrculos abiertos, celulas clonadas incubadas con UVADEX/UVA reserva viral tratada.

La Figura 5 muestra un analisis de FACS (citometros) de la expresion de superficie de moleculas exogenas en celulas de Drosophila xAPC/Drosophila cocultivos indicador clon D, que se dejaron sin tratar, se trato con Y-irradiacion tratada o UVADEX/UVA-tratada. El analisis de FACS se llevo a cabo de forma independiente usando anticuerpos especfficos para HLA humano, B7.1 humano, y ICAM-1, como se indica.

La Figura 6 muestra un analisis de FACS de la expresion de superficie de moleculas exogenas en no tratado y UVADEX-tradado xAPC de Drosophila que fueron expuestos a 5 o 15 minutos de UVA, como se indica. El analisis de FACS se llevo a cabo de forma independiente usando anticuerpos especfficos para HLA humano, B7.1 humano, y ICAM-1, como se indica.

La Figura 7 muestra la generacion de MART-1 con los CTL especfficos sin tratamiento, UVADEX/UVA-tratado, o UVADEX/UVA mas congelacion-descongelacion de las xCPA tratadas. Cfrculos solidos, no tratados; cfrculos abiertos, UVADEX/UVA; triangulos abiertos, UVA-DEX/UVA mas congelacion-descongelacion tratada.

Las figuras 8A y 8B muestran la mejorfa dependiente de MYD88 de la activacion de los CTL de antfgeno especffico por UVADEX/UVA-tratados en comparacion con las xCPA no tratadas. La Figura 8A muestra una comparacion del porcentaje de celulas T CD8+ aisladas de ratones C57BL/6 (tipo silvestre) que fueron tenidos con el peptido OVA8 (SIINFEKL; SEQ ID NO.70)-unido CMH tetrameros despues de la activacion, ya sea con UVADEX/UVA-tratada xAPCs expresando Kb, B7-1, y de ICAM-1 moleculas cargadas con el peptido OVA8 o xAPC no tratadas expresando las mismas moleculas (carril 2 vs. carril 1). Figura 8B muestra una comparacion del porcentaje de celulas T CD8+ aisladas de MyD88 ratones (MyD88 -/-) knock-out que fueron tenidos con el peptido OVA8 (SIINFEKL; SEQ ID NO.70)-unido tetrameros CMH despues de la activacion, ya sea con las xCPA UVADEX/UVA-tratadas o con las xCPA no tratadas (carril 4 vs. carril 3) tal como se describe para la Figura 8A. Los carriles 1 y 2, porcentaje de celulas tenidas T CD8+ de forma aislada y activadas de ratones de tipo salvaje (B6), como se describe en la Figura 8A (realizado como un control positivo).

Las Figuras 9A-9F proporcionan un diagrama de flujo que describe los pasos de la realizacion especialmente preferida del metodo de terapia de celulas de acuerdo con la divulgacion.

La Figura 10 muestra el analisis de FACS de la expresion de la superficie de moleculas exogenas en los xAPC de Drosophila (1120) que se transfectan con hLa-A2, B7-1, ICAM-1, LFA-3 y CD70 antes y despues del tratamiento de psoraleno/UVA. Las xCPA de Drosophila fueron cultivadas con CuSO4 (1 mM) durante 48 horas a temperatura ambiente para inducir la expresion de moleculas exogenas. Las xCPA inducidas de Drosophila primero fueron cultivadas con UVADEX (5ug/ml durante 30 min a 4°C) y luego fueron expuestas a UVA durante 10 minutos. Las celulas fueron lavadas extensamente por medio de cultivo y se tineron con anticuerpos especfficos humano HLA-ABC, B7-1, ICAM-1, LFA-3 y CD 70, respectivamente, y se analizaron con un escaner de FACS.

Figura 11 muestra la comparacion de las actividades de CTL ex vivo generados de los CTL especfficos de melanoma reestimuladas con las xCPA de Drosophila tratadas con psoraleno (FFF) o con celulas adherentes no CD8 de PBMC del mismo donante (FAA). Celulas humanas purificadas CD8 T de donantes HLA-A2 positivos fueron cultivados con las xCPA de Drosophila psoraleno/UVA tratado precargado con una mezcla de 6 peptidos de melanoma (689, 792, 817, 818, 819, 853) a 37°C. Al dfa 4 se anadieron IL-2 humana (20U/ml) y IL-7 (30U/ml). Las celulas T CD8 activadas fueron reestimuladas dos veces en el dfa 6 y el dfa 14, ya sea con celulas adherentes no CD8 de PBMC del mismo donante (FAA) o con psoraleno/UVA tratado de las CPA de Drosophila (FFF) en presencia de peptidos antigenicos anteriores con un peptido adicional 952 (mMART-1). Las celulas T CD8 de antfgeno especffico fueron evaluadas mediante el ensayo de 51Cr. En resumen, las celulas M14 etiquetadas 51Cr o celulas T2 cargadas con peptido fueron utilizadas como blancos y los CTL fueron anadidos a 0,4, 2,10, 50 ratio efector/blanco. El sobrenadante fue recogido 4 horas despues del cultivo y el 51Cr liberado de los blancos fue medido con un Y-contador.

La Figura 12 muestra la comparacion de la potencia de CTL (expansion x de unidades lfticas) de ex vivo de

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los CTL especfficos de melanoma generados reestimuladas de las xCPA de Drosophila con psoraleno-tratado (FFF) o con celulas adherentes no CD8 de PBMC (FAA). Celulas humanas purificadas CD8 T de donantes HLA-A2 positivos primero fueron cultivadas con las CPA de Drosophila tratado con psoraleno/UVA fueron precargadas con una mezcla de 6 peptidos de melanoma a 37 °C. Al dfa 4, se anadieron IL-2 humana (20U/ml) y IL-7 (30U/ml). Las celulas T CD8 activadas fueron reestimuladas dos veces en el dfa 6 y el dfa 14, ya sea con celulas adherentes no CD8 en PBMC del mismo donante (FAA) o las CPA de Drosophila (FFF) en presencia de peptidos antigenicos. En el dfa 22 los CTL fueron recolectados y fue calculado el pliegue de expansion de las celulas T CD8. Las celulas T CD8 de antfgeno especffico fueron evaluadas mediante el ensayo de 51Cr. En resumen, las celulas M14 etiquetadas 51Cr (lfnea celular de melanoma) o celulas T2 cargadas con peptido fueron utilizadas como blancos. Las unidades lfticas (LU) fueron calculadas por 100 divididas entre el ratio E/T en el que hay 30% de lisis, y la potencia fue calculada multiplicando LU y pliegue de expansion.

La figura 13 muestra el analisis de FACS de los CTL especfficos de antfgeno con tetramero HLA-A2/Mart-1. Celulas humanas purificadas CD8 T de donantes HLA-A2 positivos primero fueron cultivadas con las xCPA de Drosophila tratado con psoraleno/UVA precargadas con una mezcla de 6 peptidos de melanoma a 37 °C (F). En el dfa 4, se anadieron IL-2 humana (20u/ml) y IL-7 (30u/ml). Las celulas T CD8 fueron reestimuladas el dfa 6 y el dfa 14, ya sea con las xCPA de Drosophila tratado con psoraleno/UVA una (FF) o dos veces (FFF) con celulas adherentes no CD8 de PBMC del mismo donante una (FA) o dos veces (FAA.) Las celulas T CD8 de antfgeno especffico fueron evaluadas tiniendo las celulas con anticuerpos anti-CD8 (X-axis) y Mart-1/A2 tetramero (Y-axis) y analizadas por un FACScanto.

La Figura 14 muestra la comparacion de fenotipos de los CTL de las celulas especfficas generadas ex vivo de las xCPA de Drosophila en presencia de la combinacion de diferentes citoquinas. Celulas humanas purificadas CD8 T de donantes HLA-A2 positivos fueron cultivadas con las xCPA de Drosophila psoraleno/UVA tratado precargado con una mezcla de 6 peptidos de melanoma (689, 4, 817, 818, 819, 853) a 37°C. En el dfa 4 se anadieron IL-7humana (30U/ml) mas IL-2 (20U/ml), o IL-7, IL-2 mas IL-15 (25ng/ml) o IL- 7, IL-2 mas IL-21 (25ng/ml) or IL-7, IL-15 plus IL-21. Las celulas T CD8 activadas fueron reestimuladas dos veces en el dfa 6 y en el dfa 14, con las CPA (FFF) en presencia de peptidos antigenicos y citoquinas indicadas. Los CTL de antfgeno especffico y los marcadores de la superficie de celulas T CD8 fueron evaluados por tincion de las celulas con anticuerpos anti-CD8 y tetrameros o anticuerpos indicados. Los datos fueron analizados por un FACSCanto. Los valores mostrados ha sido la media de los datos de dos donantes.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Y SUS FORMAS DE REALIZACION PREFERIDAS

[0028] Los terminos "incluyendo" , "comprende" y "contiene" se utilizan en este documento en su sentido abierto, no limitante.

[0029] De acuerdo con un aspecto general de la presente invencion, las celulas presentadoras de antfgeno artificial (aAPC) se exponen a un agente de reticulacion de derivado de psoraleno, haciendo de ese modo a las CPAA no viables. Preferentemente, las CPAA tambien se presentan esencialmente libres de microorganismos contaminantes mediante la inactivacion a traves de la reticulacion. Tales CPAAs inactivadas, cuando estan cargadas con el peptido seleccionado, todavfa son capaces de activar las celulas T naive para convertirse en celulas T activadas (por ejemplo,

ya sea en racimo o de diferenciacion las celulas (CD) T CD4+ T o las celulas T CD8+ activadas, que son celulas T auxiliares activadas o los CTL, especfficos respectivamente) para el peptido seleccionado. Las CPAA inactivados son utiles en la preparacion de composiciones terapeuticas y en los productos de terapia celular que contienen celulas T activadas que se han generado por el contacto de las CPAA inactivadas cargadas con peptido. Para una gufa general en cuanto a la preparacion de sistemas que presentan antfgenos, incluyendo los basados en especies xenogenicos, vease p.ej. U.S. Patente No. 5,962,320; U.S solicitud de patente Numeros de publicacion 2003/0072796, 2003/0077248, 2004/0071671, 2005/0152916, y 2006/0134125; .Publicacion Internacional N° WO 00/63690, WO 02/065992 y WO 02/092773; Oelke et al., Trends in Molecular Medicine, vol. 11 (9), pp 412-420 (2005).; Sun et al., Immunity, vol. 4, pp 555-564 (1996); y Kim et al., Nature Biotechnology, Vol. 22 (4), pp. 403-410 (2004).

[0030] El linaje especffico de celulas T naive que es activado por las CPA desactivadas depende de la naturaleza de las moleculas de CMH que se expresan en la superficie de las CPAA. En consecuencia, llas CPAA que se expresan solo en las moleculas CMH de clase I pueden presentar un peptido seleccionado y activar las celulas T cD8+ naive, y las CPAA que expresan moleculas CMH de clase II pueden presentar un peptido seleccionado y activar las celulas T CD4+ naive. Del mismo modo, las CPAA que expresan moleculas de CMH de clase I tanto como CMH de clase II pueden presentar un peptido seleccionado y activar ambas celulas naive T CD8+ y T CD4+.

[0031] De acuerdo con la divulgacion, para elaborar un producto de terapia celular, las celulas T naive autologas obtenidas a partir de una muestra aferesis retirada de un sujeto, se ponen en contacto con las CPAA inactivadas que han sido cargados con el peptido seleccionado, como un peptido que contenga al menos ocho aminoacidos contiguos de la secuencia de aminoacidos de una protefna de aMl humano. Como resultado, las celulas T naive

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en contacto se vuelven activas, cuando estan preparadas para dirigirse a las celulas que expresan al menos un epftopo que corresponde al peptido seleccionado con el fueron activadas las celulas T naive. Cuando se encuentran las celulas T activadas con las celulas blanco, estas pueden ser eliminadas por las celulas T activadas, eso se debe a la capacidad de expocision de citotoxicidad de las celulas T activadas (es decir, la muerte celular especffica).

[0032] La muestra de aferesis puede ser recogida del sujeto, mediante cualquier serie de procedimientos adecuados: aferesis de linfocitos, aferesis de linfa y aferesis de linfa conocidos actualmente o en la tecnica que este disponible, la cual prevee la recoleccion de los leucocitos de sangre periferica (PBL) a partir dela sangre periferica extraida, y de la cual se pueden serapar los leucocitos de otros componentes del plasma de la muestra. Los modelos de los procedimientos se ilustran p. ej. en: U.S. solicitud de patente numeros US 2004/0173778 y US 200/40147021, y U.S. Patent Nos. 4,690,915, 5,126,132, 6,255,073, 5,846,827, 6,251,385, 6,225,044, 6,210,963, 6,194,207, 5,443,983, 6,040,177, 5,766,920, 6,210,662, 6,204,058, y 6,227,368. De la muestra de aferesis, las celulas T naive, las cuales pueden ser celulas T naive CD4+, celulas T naive CD8+, o celulas T naive CD4+ y celulas T naive CD8+, estan separadas sustancialmente de otros PBL, por ejemplo, las celulas no-T. Preferiblemente, las celulas T naive CD8+ se separan y luego se emplean para producir una composicion terapeutica o un producto de terapia celular que contiene celulas T citotoxicas autologas (CTL), cuyo producto es adecuado para ser reinfundidas o transfundidas de nuevo en el sujeto de quien fue la muestra de aferesis utilizada para derivar el producto de terapia celular que se obtuvo. Los procedimientos de reinfusion que pueden ser empleados incluyen aquellos procedimientos descritos p. ej. en: U.S. Patent Nos. 4,844,893 and 4,690,915.

[0033] Un sujeto del que se puede obtener un producto de aferesis que contenga celulas T naive es preferiblemente un mamffero en necesidad de tratamiento, tal como un perro, un gato, un caballo, una rata, conejo, raton, un primate no humano, o un ser humano. Mas preferiblemente, el sujeto es un paciente humano en necesidad de tratamiento para una enfermedad, trastorno o condicion medica asociada con la funcion del sistema inmune anormal. Otra alternativa, en circunstancias apropiadas celulas inmunes, tales como celulas T naive, que no se deriven de un sujeto a tratar, pero que se deriven de otra fuente compatible, ya sea de un donante de celula inmune, o incluso de una lfnea celular inmune inmortalizada o transformada, estas pueden emplearse para preparar productos de terapia celular de acuerdo con la invencion.

[0034] Los metodos para la seleccion de los PBL incluyen procedimientos que emplean gradientes de Ficoll, tecnica que emplea inmunopurificacion (por ejemplo, anticuerpos monoclonales dirigidos contra los marcadores de superficie celular, tales como las moleculas de CD, y las cuentas, tales como Sefarosa-, protefna-A, y la protefna- G cuentas combinadas en los que los anticuerpos pueden ser adsorbidos, y cuentas magneticas en los que los anticuerpos pueden ser adsorbidos), citometrfa de flujo, y el analisis de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS).

[0035] Preferentemente las celulas T naive seleccionadas son sustancialmente separadas de los componentes no seleccionados de la muestra de aferesis. Mas preferiblemente, las celulas T naive seleccionadas son sustancialmente purificadas por sistemas de purificacion de cuentas magneticas tales como los disponibles en la tecnica, por ejemplo, cuentas Miltenyi (Myltenyi Biotec) y sistemas de Dynabead (Dynal Biotech) combinados con los procedimientos de clasificacion de celulas, tales como los metodos basados en FACS , u otros dispositivos y metodologfas de clasificacion de celulas apropiadas. De este modo las celulas T naive seleccionadas luego se mezclan y se incuban con un peptido-inactivado y seleccionado cargado a las CPAA durante un tiempo suficiente para activar y enriquecer a una poblacion deseada de celulas T activadas, tales como celulas T auxiliares activadas, preferiblemente a las celulas T naive CD8+ o a los CTL. Tales celulas T activadas se activan preferiblemente en una manera especffica de peptido.

[0036] La proporcion sustancialmente separada de las celulas T naive a las CPAA puede ser optimizado para el individuo particular, por ejemplo, a la luz de las caracterfsticas individuales como la docilidad de los linfocitos del individuo, a las condiciones de cultivo, a la naturaleza y gravedad de la enfermedad u otra condicion que este siendo tratada. Un ejemplo de celulas T naive separadas a la proporcion de las CPAA inactivados es de aproximadamente 30: 1 a 300: 1. Por ejemplo, 3 x 107 PBL humana y 1 x 106 aAPCs pueden ser incorporados y mantenidos en la media que comprende RPMI 1640 el medio de cultivo.

[0037] Por lo tanto, las celulas T naive que contienen CD4+ o CD8+ no han sido preparadas con el peptido- cargado de las CPAA seleccionado. Las celulas T naive se pueden identificar experimentalmente basadas en una o mas caracterfsticas adecuadas seleccionadas de forma rutinaria, como aquellas asociadas con el crecimiento celular y el estado de proliferacion, fenotipo de celulas, y actividad celular. Con respecto al crecimiento celular y al estado de proliferacion, las celulas T naive preferiblemente contienen una poblacion de celulas T en reposo, es decir, tienden a residir en la porcion G0 del ciclo celular. Las celulas T activadas estan a menudo en la fase G1 o S del ciclo celular. Las celulas T de memoria comprenden las celulas T que alguna vez fueron naive pero se han activado y posteriormente ha vuelto a entrar en un estado de reposo, o comprenden celulas T naive que adquirieron un fenotipo de memoria como resultado de la expansion homeostatica (vease Opferman et al., Science, Vol. 283, pp. 1745-1748 (1999); Wherry et al., Nat. Immunol., Vol. 4, pp. 225-234 (2003); Kaech et al., Cell, 15

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Vol.111, pp. 837-851 (2002); Kieper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 13306-13311 (1999); Goldrath et al., J. Exp. Med., Vol. 192, pp. 557-564 (2000); Murali-Krishna et al., J. Immunol., Vol. 165, pp. 1733-1737 (2000)). Por ejemplo tales celulas T de memoria pueden ser reactivadas tras la re-exposicion al antfgeno de cebado, la asistencia de celulas T auxiliares CD4 +, y/o la exposicion a citocinas apropiadas. Por lo tanto, en comparacion con las celulas T de memoria y T activadas, las celulas T naive son relativamente no-proliferativas in vivo, a menos que la disminucion de la reserva de celulas T naive (como ocurre durante una fuerte activacion de las celulas T en respuesta al antfgeno) requiere un perfodo de proliferacion homeostatica relativamente lenta a fin de reponer el numero de celulas T naive (vease p. ej. Kieper et al., J. Immunol., Vol. 174, pp. 3157-3.163 (2005), y Baccala et al., J. Immunol., Vol. 174, pp. 4606-4612 (2005)). Con respecto al fenotipo, las celulas T naive pueden distinguirse de las celulas T no-naive (por ejemplo, las celulas T auxiliares CD4+, celulas T de memoria, y las celulas T efectoras (por ejemplo, los CTL)) por la existencia y el nivel relativo de expresion del perfil molecular de CD asociado a la celula T naive, que puede incluir CD11alow/LFA-1low (o dim), CD25low, CD27+ (or hi), CD44low or CD44int, CD45RA+ (o pos), CD45RO- (o neg), CD95low (o dim), CD57- (o neg), y CD62L hi (o bright), en comparacion con el nivel de expresion observado para celulas T no naive. Las celulas T naive tambien pueden distinguirse por un alto nivel de expresion relativo del receptor de quimioquinas, CCR7 (CCR7hi) en comparacion con el nivel de expresion observado para celulas T no-naive (vease p. ej. McFarland et al., PNAS, Vol. 97(8), pp. 4215-4220 (2000); Ishimaru et al., Nature Immunol., Vol. 7(7), pp. 763-772 (2006); y Kern et al., Eur. J. Immunol., Vol. 29, pp. 2908-2915 (1999)). En contraste, las celulas de memoria, por ejemplo, pueden caracterizarse por un fenotipo CD27low, CD44hi, CD45RA-, CD45RO+, CD57+ (or hi), CD62Llow, y/o CCR7low (vease p. ej.: Kern et al., Eur. J. Immunol., Vol. 29, pp. 2908-2915 (1999), y Baccala et al., J. Immunol., Vol. 174:4606-4612 (2005)). Con respecto a la actividad celular, las celulas T naive pueden caracterizarse por una incapacidad para producir de manera eficiente o secretar interferon alfa, interferon gamma, interleucina (IL)1, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), y/o de factor estimulante GM-CSF de granulocitos y colonia de macrofagos (vease p. ej. Cerwenka et al., J. Immunol., Vol., 161, pp. 97-105 (1998); Walzer et al., Cell. Immunol., Vol. 206, pp. 16-25 (2000); Tizard, I., IMMUNOLOGY: AN INTRODUCTION, 3rd Edition, pp. 129-143 (1992); U.S. Patent Application Publication No. US 2002/0119121; and International Publication No. WO 2002/022648) Las celulas T naive no presentan tambien citotoxicidad sustantiva o actividad especffica de destruccion celular frente a las presusntas celulas diana.

[0038] Las celulas T naive, que pueden contener celulas naive T CD8+, celulas T naive CD4+, o combinaciones de celulas T CD8+ celulas T CD4+ que estan preparadas y estimuladas, y por lo tanto activadas, como se ha descrito anteriormente, opcionalmente pueden ser restimuladas y/o expandidas para producir composiciones terapeuticas y productos de terapia celular conteniendo celulas T activadas del fenotipo y numero deseado. Los modelos de los procedimientos de reestimulacion incluyen la adicion de una o mas citocinas seleccionadas que promueven el crecimiento de celulas T activadas, la proliferacion y/o la diferenciacion y las celulas T activadas incubadas con celulas nonCD8+ cargadas con peptido seleccionado, tales como celulas CD14+. La seleccion de las citocinas adecuadas dependera del fenotipo deseado de las celulas T activadas que en ultima instancia contienen la composicion terapeutica o el producto de terapia celular. Por lo tanto, las celulas T CD4 + naive pueden ser activadas y opcionalmente ser restimuladas y/o expandidas para convertirse en celulas T auxiliares CD4+ (Th)1 o en las celulas CD4+ Th2, y las celulas T naive CD8+ pueden ser activadas y opcionalmente restimuladas y/o expandidas para convertirse en CTLs que poseen un fenotipo Tc1, CTLs que poseen un fenotipo Tc2 similar, las celulas T de memoria, o una combinacion de los mismos, segun lo deseado por el artesano teniendo en cuenta la orientacion en la tecnica (vease p. ej. Cerwenka et al., J. Immunol., Vol. 163(10), pp. 55355543 (1999); Mosmann et al., Immunol. Today, Vol. 17(3), pp. 138-146 (1996); Carter et al., Curr. Opin. Immunol., Vol. 8(3), pp. 336-342 (1996); Croft et al., J. Exp. Med., Vol. 180, pp. 1715-1728 (1994); Fujihashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 3613-3618 (1996); U.S. Patent No. 6,355,479 and International Publication No. WO 97/46256. Citocinas preferidas incluidas IL-1, IL-2, IL-7, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IFN-y, y TNF-d. Un modelo de los procedimientos de expancion de las celulas T incluye la incubacion de celulas T activadas con celulas irradiadas no-CD8+ en presencia de citocinas seleccionadas y una preparacion de anticuerpos anti-CD3, tal como OKT®3, para promover la expansion de celulas T activadas no- especfficas. La seleccion del numero, la secuencia y combinacion de tales protocolos de estimulacion y expansion para ser empleados estan dentro del ambito del experto y puede ser facilitado por la orientacion en la tecnica. Vease p. ej. Cerwenka et al., J. Immunol., Vol., 161, pp. 97-105 (1998); Livingston et al., Immunol. Invest., Vol. 24(4), pp. 619-629 (1995); Sad et al., Immunity, Vol. 2, pp. 271-279 (1995); U.S. Patent Application Publication No. uS 2003/0170212; and International Publication No. WO 02/092773.

[0039] En realizaciones preferidas, las celulas T que han sido estimuladas se someten posteriormente a al menos una iteracion de un procedimiento de re-estimulacion, que comprende poner en contacto a las celulas T estimuladas con cantidades de IL-2 e IL-7 suficientes para promover el crecimiento, la proliferacion y/o la diferenciacion de celulas T activas, y despues la incubacion de celulas T en contacto con celulas no-CD8+ adherentes autologas irradiadas, (por ejemplo, celulas CD14+) y cantidades suficientes adicionales de IL-2 e IL-7. En realizaciones en las que el procedimiento de reestimulacion se realiza mas de una vez, las celulas T activadas se ponen en contacto con cantidades adicionales de IL-2 e IL-7 entre cada iteracion del procedimiento de reestimulacion. En otras realizaciones preferidas, las celulas T activadas se someten a al menos un procedimiento de expansion posterior a al menos una iteracion de un procedimiento de reestimulacion, en el que el procedimiento

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de expansion comprende la incubacion de celulas T activadas con celulas nonCD8+ irradiadas en presencia de una cantidad de IL-2 suficiente para promover el crecimiento, la proliferacion y/o la diferenciacion de las celulas T contactadas, y una preparacion de anticuerpos anti-CD3, de preferencia OKT®3.

[0040] En realizaciones preferidas, las celulas T naive contienen celulas T CD8+, que cuando se activan y opcionalmente se re-estimulan y/o amplian, pueden presentar, por ejemplo, actividad citotoxica frente a las celulas a los que van dirigidas o producen citocinas inmunoestimulantes o citotoxicidad asociada . Preferiblemente, presentan una combinacion de estas caracterfsticas. Las celulas T CD8+ naive que han sido cebadas y activadas pueden ser sometidas a los protocolos de re-estimulacion y/o de expansion como se describe anteriormente, las cuales conducen la diferenciacion y/o la polarizacion de las celulas T CD8+ en activacion hacia los fenotipos de linaje celular del CTL especffico, tales como CD8+ Tc1 y a los fenotipos CD8+ TC2. Las celulas T CD8+ cargadas con peptido aAPC-activado tambien pueden ser sometidas a varias rondas de re-estimulaci6n, in vivo o in vitro, solo con el peptido seleccionado o en conjunto con ciertas citocinas, tales como IL-2, IL-7, IL- y 12, y el interferon gamma o con anticuerpos, tales como aquellos dirigidos contra el receptor (TCR) de celula T y las moleculas coestimuladoras en la superficie de las celulas T activadas. En realizaciones preferidas, de esta manera las celulas T CD8+ activadas se volvieron a re-estimular aun mas, lo que mantiene la inmunogenicidad y la citotoxicidad de las celulas blanco durante al menos aproximadamente cuatro o cinco generaciones, produciendo celulas T de memoria CD8+. Los metodos para la identificacion, caracterizacion, mantenimiento de inmunogenicidad, y la expansion de las celulas T de memoria CD8+ se pueden encontrar, por ejemplo en: Cerwenka et al., J. Immunol., Vol., 161, pp. 97-105 (1998); Cerwenka et al., J. Immunol., Vol. 163, pp. 5535-5543 (1999); Patent Application Publication No. 2002/0119121; and International Publication No. WO 2002/022648.

[0041] Las CPAA que se emplean en los metodos de preparacion de productos de terapia celular pueden contener las xCPA inactivadas, que modifican a las celulas huesped de una especie no humana que son capaces de expresar moleculas exogenas en su superficie, y medio de cultivo xCPA. Las CPAA tambien contienen una molecula de CMH exogeno seleccionado de moleculas de CMH de clase I y moleculas de CMH de clase II. Los sistemas de las CPAA ademas contienen opcionalmente al menos una molecula exogena auxiliar que ayuda a la activacion de las celulas T naive. Las moleculas exogenas de preferencia son codificadas por el acido nucleico xenogenico que se ha introducido en las celulas huesped.

[0042] Las CPAA de preferencia contienen al menos una molecula coestimuladora sumado a la molecula de CMH de clase I o a la molecula CMH de clase II. Preferiblemente las CPAA contienen al menos una molecula coestimuladora y al menos una molecula de adhesion sumado a la molecula de CMH de clase I o a la molecula CMH de clase II (vease Kim et al., 2004, Nature, Vol. 22(4), pp.403-410; Cai et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 14736-14741; Jackson et al., 1992, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp. 12117-12121; Schoenberger et al., 1998, Cancer Res., Vol. 58, pp. 3094-3100; and Latouche et al., 2000, Nat. Biotechnol., Vol. 18, pp. 405-409). Las tecnicas, metodos y reactivos utiles para la seleccion, la clonacion, la preparacion y la expresion de moleculas auxiliares a modo de ejemplo, incluyendo moleculas coestimuladoras y moleculas de adhesion, se ejemplifican p. ej. en: U.S. Patent Nos. 6,225,042, 6,355,479, and 6,362,001. Molecula de antfgeno preferida CMH clase I HLA, pero no se limitan a HLA 2.1 (HLA-A*0201), asf como HLA-A*0101, HLA-A*0301, HLA- A*1101, HLA-A*2402, HLA-A*3303, HLA-C*0701, HLA-C*0702, HLA-C*0401, HLA-B*0702, HLA-B*4402, HLA- B*3501.

[0043] Las Moleculas CMH clase I preferidas incluyen una cadena pesada (ejemplo: cadena alfa) y una p2- microglobulina. Tal molecula de CMH de clase I puede ser una molecula de extension completa o una porcion extracelular de una molecula de extension completa, tal porcion extracelular carece de transmembrana completa o dominios citoplasmicos, o carece tanto de transmembrana completa como de dominios citoplasmicos. La molecula de CMH de clase I preferiblemente es capaz de unirse a un peptido seleccionado. Los modelos de moleculas CMH de clase I que se pueden emplear en la presente invencion incluyen, por ejemplo, moleculas que estan codificadas por el antfgeno de leucocitos humanos (HLA)-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HlA-F, or HLA-G loci. De preferencia, la molecula de CMH clase I se selecciona a partir de moleculas codificadas por HLA-A, HLA-B, and HLA-C loci. Tecnicas, metodos y reactivos utiles para la seleccion, la clonacion, la preparacion y la expresion de moleculas de p2-microglobina, moleculas de CMH de clase I, tales como moleculas de HLA, y porciones de los mismos, se ejemplifican en U.S. Patent Nos. 6,225,042,6,355,479, and 6,362,001.

[0044] Las moleculas CMH de clase II preferidas incluyen una cadena alfa (a) y una cadena beta (p) que se asocian entre si para formar un heterodfmero CMH de clase II. Tal heterodfmero CMH de clase II puede ser una molecula de extension completa o una porcion extracelular de una cadena de extension acompleta, una porcion extracelular de una cadena de extension pcompleta, o porciones extracelulares de ambas ay cadenas P, tal porcion extracelular o porciones completas carecen de transmembrana o dominios citoplasmicos. Los modelos de moleculas CMH de clase II que se pueden emplear en la presente invencion incluyen, por ejemplo, moleculas que estan codificadas por HLA-Dp, HLA-DQ HLA-DR, HLA-Do, HLA-DN, or HLA-DZ loci. Las tecnicas, metodos y reactivos utiles para la seleccion, la clonacion, la preparacion y la expresion de las cadenas de CMH de clase II acadenas, pcadenas, y apheterodfmeros, y las porciones extracelulares de los mismos, se ejemplifican en U.S. Patent Nos. 5,583,031, and 6,355,479.

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[0045] La molecula auxiliar facilita la activacion de celulas T naive, cuando se presentan tales celulas T naive con una molecula CMH de clase I o de clase II, en el que el peptido seleccionado esta ligado a un antfgeno o a un inmunogeno, o a ambos. La molecula auxiliar puede asistir a tales moleculas como: (i) moleculas co-estimuladoras, que son protefnas expresadas por las celulas presentadoras de antfgeno tales como B7.1 (conocida previamente como B7 y tambien como CD80) y B7.2 (conocida como CD86), y CD70, la cual, entre otras cosas, se une a CD28 y/o a las moleculas en la superficie de las celulas T CTLA-4, teniendo efecto de este modo, por ejemplo, en la secrecion de citoquinas, tales como interleucina (IL)-2, en la expansion de celulas T, en la diferenciacion Th1, y en la supervivencia de celulas T a corto plazo (vease Kim et al., 2004, Nature, Vol. 22(4), pp.403-410); y (ii) en las moleculas de adhesion, por ejemplo, glicoprotefnas de union a carbohidratos, tales como selectinas, glicoprotefnas de union transmembranal, tales como las integrales, protefnas dependientes de calcio tales como cadherinas, y de protefnas de la superfamilia de inmunoglobulina transmembranal unipaso (Ig), como moleculas de adhesion intercelular (ICAM), que promueven, por ejemplo, celula a celula o por celulas de contacto a la matriz. Las moleculas de adhesion preferidas incluyen ICAMs, tales como ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 and LFA-3. Se pueden emplear cualquier numero y combinacion adecuado de moleculas auxiliares.

[0046] Las celulas huesped pueden ser modificadas para convertirse en lfneas CPAA para uso en la activacion de celulas T naive. Cualquier tipo de celulas capaces del crecimiento continuo en cultivo que pueden ser manipuladas para expresar las moleculas exogenas puede seleccionarse como una fuente de celulas huesped (vease p. ej. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1991), para resumenes y procedimientos para el cultivo y el uso de una variedad de lfneas celulares). Por consiguiente, las celulas huesped pueden proceder de cualquier variedad de especies, incluyendo especies de procariotes, tales como especies de bacterias, o especies eucariotes, tales como, levaduras, insectos, plantas, micoplasmas, y mamfferos.

[0047] En realizaciones preferidas, las celulas huesped incluyen celulas primarias que se cosechadas y aisladas de un organismo, preferiblemente de un animal, o bien directamente son empleados en la preparacion del sistema de presentacion de antfgenos o son utilizados despues del cultivo de celulas primarias, o pasan, a traves de un numero limitado de generaciones, por ejemplo: de uno a cincuenta. Alternativamente, tales lfneas celulares primarias pueden cultivarse bajo condiciones que permitan la generacion de una lfnea celular inmortalizada que es descendiente de la lfnea celular primaria ancestral, que puede ser seleccionada de forma rutinaria. Tal inmortalizacion puede implicar el cultivo de celulas primarias a traves de un numero suficiente de generaciones de tal manera que se alcance un perfodo de crisis, durante el cual la mayorfa de las celulas primarias en el cultuvo mueren mientras que un numero relativamente pequeno de variantes que se dividen rapidamente continua. Un cultivo que esta basado por una variante tan persistente puede teoricamente pasar a traves de cualquier numero de generaciones, a condicion de que las celulas se diluyan en el momento adecuado y por un factor de dilucion apropiada, que los nutrientes y los medios adecuados se repongan, para permitir la propagacion sostenida. Las lfneas de celulas transformadas tambien pueden servir como una fuente de celulas huesped eucariotas que se pueden emplear en la preparacion del sistema de presentacion de antfgenos. Tales lfneas celulares transformadas pueden derivar de celulas tumorales tomadas de un animal que alberga tal tumor. Varios tipos de lfneas celulares inmortalizadas o transformadas pueden ser adquiridas a parti r de cualquier numero de repositorios de lfnea celular, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), o pueden prepararse por el experto usando tecnicas rutinarias ya conocidas o que esten disponibles en la tecnica.

[0048] Los parametros ejemplares pueden ser manipulados para obtener un conjunto deseado de celula huesped y el crecimiento y condiciones de cultivo de las CPAA incluyen temperatura, grado de aireacion, porcentaje de saturacion de oxfgeno, porcentaje de saturacion de dioxido de carbono, composicion y concentracion de nutrientes, y crecimiento estatico versus agitado (es decir, agitacion ) crecimiento. Los procedimientos ilustrativos para la preparacion, el crecimiento y cultivo de celulas huesped seleccionadas, tales como celulas de Schneider 2, se proporcionan en U.S. Patent Nos. 6,225,042, 6,355,479, and 6,362,001; Sambrook et al., MOLECULAR CLONING:

A LABORATORY MAN- UAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989); Ausubel et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, New York, 1992; y Frank, "Perspectives on Baculovirus Expression Systems", November 1998, OMRF Research Technology Forum.

[0049] Las celulas huesped seleccionadas para la modificacion para convertirse en CPAA son preferentemente deficientes en el procesamiento de antfgeno intracelular, trafico intracelular de peptidos, y/o en la carga molecular de peptido intracelular de CMH de clase I o de clase II, o son poiquilotermos (es decir, menos sensibles a la exposicion termica que las lfneas celulares de mamffero), o poseen ambas deficiencias y propiedad poiquilotermia (vease por ejemplo: DeSilva et al., 1999, J. Immunol., Vol. 163(8), pp. 4413-4420; Schumacher et al., 1990, Cell, Vol. 62(3), pp. 563-567; Ljunggren et al., 1990, Nature, Vol. 346(6283), pp. 476-480). Preferiblemente, las celulas huesped seleccionadas tambien carecen de la capacidad de expresar al menos una contraparte endogena (por ejemplo: una molecula endogena de MHC de clase I o una molecula endogena de clase II y/o moleculas endogenas auxiliares como se describio anteriormente) a la molecula exogena CMH de clase I o de clase II y a los componenetes de la molecula auxiliar que se introducen en dichas celulas huesped. Ademas, las CPAA preferentemente retienen aquellas propiedades de deficiencia y poiquilotermia que fueron posefdos por las celulas huesped seleccionadas antes de su modificacion para generar los aAPC. En realizaciones preferidas, las celulas huesped seleccionadas constituyen o son derivadas de un transportador asociado al procesamiento de antfgenos

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de linea celular (TAP) deficiente, como una linea celular de insecto.

[0050] Las celulas huesped seleccionadas preferidas son celulas de insectos poiquilotermos. Ejemplares de las lfneas celulares de insectos aquellas seleccionadas de celulas huesped incluyen, por ejemplo, aquellos derivados de polilla (ATCC CCL 80), cogollero (ATCC CRL 1711), larva de mosquito (lfneas ATCC CCL 125, CCL 126, CRL 1660, CRL 1591, CRL 6585, CRL 6586) y gusano de seda (ATCC CRL 8851). En especial, en realizaciones preferidas, la linea celular es una linea celular de Drosophila, tal como una linea celular de Schneider 2 (vease p. ej. Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph., Vol 27, pp. 353-365), una linea celular derivada de Spodoptera, tales como celulas SF-9 o celulas SF21, o una linea celular derivada de Trichoplusia, como las celulas Tn5, celulas H5 y celulas High- Five ™ (Invitrogen).

[0051] Las celulas huesped seleccionadas se modifican con el fin de expresar moleculas exogenas de CMH de

clase I o CMH de clase II , y preferentemente mas de una de las moleculas exogenas auxiliares antes descritas, por metodos que comprenden la introduccion de acido nucleico xenogenico en las celulas huesped, generando de este modo los aAPC. Por lo tanto, una vez generadas las CPAA, mediante la modificacion de las celulas huesped seleccionadas, pueden expresar cualquiera de las moleculas exogenas de CMH de clase I o moleculas exogenas CMH de clase II seleccionadas a partir de las moleculas de HLA descritos anteriormente, ademas a partir de uno a quince o mas moleculas exogenas auxiliares seleccionadas de moleculas co-estimuladoras y moleculas de adhesion, adecuadas para la terapia de celulas deseada. En ciertas realizaciones preferidas, las celulas huesped se modifican para expresar moleculas exogenas HLA-A2, ademas de B7.1 exogeno (CD80), B7.2 (CD86), ICAM-1 (CD54), y LFA-3 (CD58). En otras realizaciones preferidas, las celulas huesped se modifican para expresar moleculas exogenas HLA-A2, ademas de B7.1 exogeno (CD80), ICAM-1 (CD54), LFA-3 (cD58) y CD70. ELWTHSYKV (SEQ ID NO.35), KVAELVHFL (SEQ ID NO.36), YIFATCLGL (SEQ ID NO.37), HLYIFATCL (SEQ ID NO.38), MLMAQEALAFL (SEQ ID NO.39), STLEKINKT (SEQ ID NO.40), KASEKIFYV (SEQ ID NO.41), SLLM- WITQCFL (SEQ ID NO.42), ELTLGEFLKL (SEQ ID NO.43), LTLGEFLKL (SEQ ID NO.44), SLLEKREKT (SEQ ID NO.45), TLGEDDPWL (SEQ ID NO.46), KLGLKPLEV (SEQ ID NO.47), YLWTSAKNT (SEQ ID NO.48), STAPPAHGV (SEQ ID NO.49), GMGSEELRL (SEQ ID NO.50), SLGSPVLGL (SEQ ID NO.51), YLFFYRKSV (SEQ ID NO.52), CQQEETFLL (SEQ ID NO.53), TLAKFSPYL (SEQ ID NO.54), NLTHVLYPV (SEQ ID NO.55), STFKNWPFL (SEQ ID NO.56), SLLQHLIGL (SEQ ID NO.57), FLDQRVFFV (SEQ ID NO.58), FLDQRVFVV (SEQ ID NO.59), FLDQVAFVV (SEQ ID NO.60), GLDREQLYL (SEQ ID NO.61), VMQHLLSPL (SEQ ID NO.62), QQTHGITRL (SEQ ID NO.63), LQ-20 PLSGPGL (SEQ ID NO.64), TLDRDSLYV (SEQ ID NO.65), QLYLELSQL

(SEQ ID NO.66), KVLEYVIKV (SEQ ID NO.67), KVADLVGFL (SEQ ID NO.68), KTWGQYWQV (SEQ ID NO.70) y VLDGLDVLL (SEQ ID NO.71).

[0052] Una mezcla de peptidos preferido para uso en los metodos de la presente invencion incluyen al menos un peptido seleccionado del grupo que consiste en YMNGTMSQV (SEQ ID NO.5), ITDQVPFSV (SEQ ID NO.7), AAGIGILTV (SEQ ID NO.9), ELAGIGILTV (SEQ ID NO.10), SLLMWITQV (SEQ ID NO.27), FLWGPRALV (SEQ ID NO.30), TLAKFSPYL (PRAME; SEQ ID NO.54) y VLDGLDVLL (SEQ ID NO.71).

[0053] Ademas un metodo preferido adicional en esta realizacion, el metodo comprende aislar celulas T de una muestra de leucoferesis (tambien conocido como una muestra aferesis) obtenidas para su uso de un paciente en dicha etapa de contacto. Ademas, el metodo puede comprender tambien la re-estimulacion de dichos linfocitos T activados antes de llevar a cabo la etapa de administracion, comprendiendo dicho procedimiento de re- estimulacion de esta manera: poniendo en contacto a los linfocitos T activados con al menos una citocina, promoviendo de este modo la proliferacion de celulas T activadas; y la incubacion de celulas T activadas con celulas autologas irradiadas no-CD8+, celulas adherentes nonCD8+ 10 o celulas tradadas con psoraleno/UVA presentadoras de antfgenos artificiales (aAPC), generando de este modo linfocitos T activados re-estimulados. Las citocinas preferidas incluyen aquellas seleccionadas del grupo que consisten en: IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL- 17, IL-21, IFN-y, y TNF-a,y en el que dichos linfocitos T activados contienen linfocitos T citotoxicos activados. Ademas los linfocitos T activados, pueden ser sometidos a al menos una iteracion del procedimiento de re- estimulacion antes de realizar lo dicho y LFA-3. Cualquier combinacion adecuada de moleculas co-estimuladoras y de adhesion se puede emplear en la generacion de las CPAA.

[0054] Ademas, en ciertas realizaciones preferidas, las moleculas de microglobulina p2 se obtienen de celulas huesped microglobulina p-2, que son distintas de las celulas huesped que se modifican para convertirse en las CPAAs. En tales formas de realizacion, un vector que codifica la molecula de microglobulina p-2 es introducida y expresada en las celulas huesped microglobulina p-2, y una muestra es recolectada de las moleculas de microglobulina p-2 expresadas. Alternativamente, una muestra de moleculas de microglobulina p-2 se puede derivar de un organismo que expresa un endogeno microglobulina p-2. Las CPAA que expresan moleculas exogenas CMH de clase I pueden ser entonces incubadas con la muestra de moleculas de microglobulina p-2.

[0055] Para obtener un nivel deseado de expresion de la secuencia de acido nucleico, la secuencia de acido nucleico se inserta en un vector que contiene un promotor para dirigir la transcripcion, un terminador de transcripcion/traduccion, y, si es para una secuencia de acido nucleico que codifica una protefna, un sitio de union al ribosoma para iniciacion traslacional. Ejemplares de promotores bacterianos se describen en Sambrook et al., supra; and Ausubel et al., supra. Ilustrativos de sistemas de expresion bacterianos para expresar protefnas

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constituyentes incluyen E. coli, Bacillus sp., and Salmonella (Palva et al., 1983, Gene 22:229-235; Mosbach et al., 1983, Nature 302:543-545). Los kits para tales sistemas de expresion estan disponibles comercialmente. Sistemas de expresion adecuados de eucariotes adecuados para celulas de mamffero, levaduras, y celulas de insectos tambien ya conocidos o disponibles en la tecnica.

[0056] Ademas de un promotor, cada vector contiene preferiblemente una unidad de transcripcion o cassette de expresion que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresion de acido nucleico xenogenico en celulas huesped. Un ejemplo de vector contiene un promotor unido operativamente al acido nucleico xenogenico, y senales requeridas para la poliadenilacion eficiente de la transcripcion, sitios de union a ribosomas y terminacion de la traduccion. EL acido nucleico xenogenico puede estar ligado a una secuencia de peptido senal escindible para promover la secrecion de la protefna codificada por la celula transfectada. Ejemplares de tal senal incluyen a los peptidos senal de activador del plasminogeno tisular, insulina, y factor de crecimiento neuronal, y la esterasa de la hormona juvenil de Heliothis virescens. Elementos adicionales o alternativos, por ejemplo: elementos potenciadores, elementos endogenos promotores, intrones con o sin splice funcional en los sitios donador y aceptor, elementos de terminacion de la traduccion, o senales de poliadenilacion, todos o algunos de los cuales pueden ser elementos endogenos de un acido nucleico xenogenico seleccionado, pueden ser incluidos en el cassette o en el vector.

[0057] Ejemplares de vectores adecuados para la expresion de acido nucleico xenogenico en celulas huesped bacterianas, de mamffero y/o de insectos incluyen: vectores pRmHa, incluyendo pRmHa-1, pRmHa - 2, y pRmHa - 3 (vease p. ej. International Publication No. WO 96/27392 y U.S. Patent Nos. 6,225,042 and 6,355,479); vectores pBR322-basados, pSKF, pET23D, pCDM8 (Seed, 1987, Nature, Vol. 329, pg. 840) y pMT2PC (Kaufinan et al., 1987, EMBO J, Vol. 6, pp. 187-195), pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pCMVSPORT, pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSV- neo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), pMSCV, y lZD35 (ATCC 37565), pUC8, pUC9, pUC18, pBR322, y pBR329 (BioRad Laboratories), pPL y pKK223 (Pharmacia), y pBS (Stratagene) y M13mp19 (Stratagene). Los vectores preferidos para su uso en la preparacion de las CPAA incluyen vectores que contienen elementos reguladores de virus en eucariotas, tales como vectores de SV40, vectores de virus papiloma, vectores de virus vaccinia, baculovirus, y vectores derivados de virus de Epstein-Barr. Tales vectores permiten la expresion del acido nucleico xenogenico insertado bajo la direccion del promotor de CMV, promotor temprano de SV40, promotor tardfo de SV40, promotor de metalotionefna, promotor del virus del tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de polihedrina, u otro promotor eficaz para la expresion en celulas eucariotas.

[0058] Han sido desarrollados una variedad de vectores de expresion de baculovirus recombinantes para la infeccion en celulas huesped derivadas de varias especies de insectos, tales como Aedes aegypti, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera fru- giperda, and Trichoplusia ni (vease p. ej. International Publication No. WO 89/046699; Carbonell et al., 1985, J. Virol. Vol. 56, pg.153; Wright, 1986, Nature, Vol. 321, pg. 718; Smith el al., 1983, Mol. Cell. Biol., Vol. 3, pg. 2156; and Fraser, et al., 1989, Cell. Dev. Biol., Vol. 25, pg. 225). Vectores derivados de virus preferidos incluyen vectores basados en baculovirus, tales como: BaculoGold™ (BD Biosciences), BacPAK6 (BD Biosciences), ProEasy™ (BD Biosciences), y pDSVE.

[0059] Para emplear un vector que contiene acido nucleico xenogenico que codifica las moleculas de CMH de clase I, moleculas CMH de clase II, moleculas coestimuladoras, o moleculas auxiliares, o una combinacion de estas, pueden ser utilizados una variedad de sistemas de vectores de expresion en huesped disponibles en la tecnica. Tales sistemas de expresion en huesped representan vehfculos por los cuales las secuencias codificantes de interes pueden producirse y posteriormente purificarse, pero tambien representan celulas que pueden expresar las moleculas cuando estan transformadas o transfectadas con las secuencias codificantes de nucleotidos apropiadas. Estos incluyen, por ejemplo, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo: E. coli, B. subtilis) transformadas con ADN de bacteriofago recombinante, ADN de plasmido o vectores de expresion de ADN cosmido que contienen secuencias de codificacion de CMH; levadura (por ejemplo: Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresion de levadura recombinantes que contienen secuencias de codificacion de CMH; sistemas de celulas de insecto infectadas con vectores de expresion bacterianos recombinantes que contienen secuencias de codificacion de CMH; sistemas de celulas vegetales infectadas con vectores de expresion de virus recombinante (por ejemplo: virus mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresion de plasmidos recombinantes (por ejemplo, plasmido Ti) que contienen secuencias que codifican al CMH; o sistemas de celulas de mamfferos (por ejemplo: celulas COS, CHO, BHK, HEK 293, 3T3) que albergan vectores de expresion recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de celulas de mamffero (por ejemplo: promotor de metalotionefna) o de virus de mamfferos (por ejemplo: el promotor tardfo de adenovirus; el promotor 7,5 K del virus vaccinia, el promotor del virus del bosque Semliki). Ademas, la secuencia de acido nucleico que codifica las etiquetas del polipeptido tambien se pueden insertar en vectores seleccionados de tal manera que los polipeptidos exogenos expresados de la misma contienen la etiqueta polipeptido codificado, lo que permite metodos convenientes de aislamiento y/o deteccion. Ejemplares de etiquetas incluyen c-myc, hemaglutinina (HA)-tag, 6x-His-tag, etiqueta de la protefna de union a maltosa, etiqueta VSV-G, etiqueta FLAG, y la etiqueta V5.

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[0060] Los sistemas de expresion preferidos para la expresion de protefnas exogenas son sistemas de expresion que comprenden el uso de vectores de pRmHa, como pRmHa-1, pRmHa-2 y pRmHa-3 (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res., Vol. 16, pp. 1043-1061), que son introducidas en celulas huesped, tales como celulas de insectos, preferiblemente celulas de Drosophila.

[0061] En formas de realizacion particularmente preferidas, los vectores de expresion son vectores inducibles. Los aAPC que contienen tales vectores de expresion inducibles primero pueden requerir de estimulacion por un agente inductor, tal como CuSO4, durante un perfodo predeterminado de tiempo para efectuar la expresion de la protefna exogena apreciable. Preferiblemente, la expresion de molecula CMH es accionada por un vector de expresion inducible codificando tal molecula de CMH. Despues de un periodo de induccion adecuado, por ejemplo, alrededor de 12 a 48 horas, el peptido seleccionado (que puede prepararse como se discute a continuacion) pueden anadirse a una concentracion predeterminada (por ejemplo, aproximadamente 100 mg/ml). Despues de un perfodo de incubacion mas extenso, por ejemplo, durante aproximadamente 12 horas a 27°C, el cultivo esta listo para su uso en la activacion de celulas CD8+. Aunque este periodo de incubacion adicional puede acortarse o quizas omitirse, preferentemente el cultivo se deja incubar durante un tiempo previo a la adicion de las celulas T naive para mejorar su resistencia frente al desaffo de la temperatura. Por ejemplo, se ha anadido a los cultivos que seleccionan peptido capaces de expresar cantidades significativas de moleculas de CMH de clase I cargadas con peptido seleccionado incluso cuando se incuban durante perfodos de tiempo prolongados a 37°C.

[0062] Ejemplares de procedimientos para introducir secuencias de nucleotidos extranos en las celulas huesped pueden ser utilizados para introducir el acido nucleico xenogenico en celulas huesped seleccionadas incluye el uso de reactivos tales como Superfect (Qiagen), liposomas, transfeccion con fosfato de calcio, polibreno, fusion de protoplastos, electroporacion , microinyeccion, vectores plasmfdicos, vectores virales, aceleracion de partfculas biolfstico (p. ej. la pistola de genes), o cualquier otro metodo apropiado para la introduccion de ADN genomico clonado, ADNc, ADN sintetico, ARN u otro material genetico extrano en una celula huesped (vease por ejemplo: Sambrook et al., MOLEC- ULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)). Para la transfeccion estable de celulas huesped, sera evidente que, dependiendo de la tecnica de vector de expresion y la tecnica de transfeccion utilizada, solo una pequena fraccion de celulas puede integrar el ADN extrano en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para la resistencia a los antibioticos) se puede introducir en las celulas huesped junto con el gen de interes. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a farmacos, tales como la geneticina (G418), puromicina, higromicina, y metotrexato. Las celulas transfectadas de forma estable con el acido nucleico introducido pueden ser identificadas por la seleccion de farmacos (p. ej. celulas que han incorporado el gen marcador seleccionable sobreviviran, mientras que las otras celulas moriran).

[0063] Al menos una porcion de acido nucleico xenogenico asociado con las CPAA, y en realizaciones preferidas, el acido nucleico xenogenico y el acido nucleico endogeno a las celulas huesped de las que se derivan las CPAA, se inactivan por reticulacion posterior a, o concomitante con, la expresion de tales moleculas exogenas, de modo que esencialmente no hay crecimiento celular, la replicacion o la expresion de acido nucleico se produce despues de la inactivacion. Preferiblemente, la inactivacion, mientras que la extraccion de acido nucleico incapaz de replicacion adicional apreciable o expresion, no afecta considerablemente la actividad de la protefna exogena que se expresa en la superficie de las CPAA antes de la inactivacion.

[0064] Las CPAA se inactivan con un agente a fin de efectuar el acido nucleico (ADN o ARN) de reticulacion. Ejemplares de agentes de reticulacion se describen en U.S. Patent Application Publication No. US 2005/0054572; Biodrugs, Vol. 17(1), pp. 66-68 (2003) (amotosalen and light; INTERCEPT system); Schneider et al., Photochem. Photobiol., Vol. 67(3), pp. 350-357 (1998) (methylene blue and light); and U.S. Patent No. 7,067,251 (psoralen and UVA). Los agentes de reticulacion que son o se hacen disponibles en la tecnica puede ser seleccionado como se desee por el experto a traves de la experimentacion de rutina para inactivar el acido nucleico asociado con las CPAA de acuerdo con la divulgacion. Por ejemplo, para seleccionar un agente de reticulacion adecuado el experto puede tener en cuenta ciertas propiedades asociadas con un agente de reticulacion en particular, como la naturaleza de reticulaciones producidas por un agente de reticulacion en particular, su relativa toxicidad, potencia, estabilidad, reactividad, y otras propiedades similares. Ademas, los agentes de reticulacion plurales se pueden emplear para inactivar las CPAA. Adicionalmente, el tratamiento con el agente de reticulacion puede ser concomitante con o despues de la expresion de la molecula exogena y presentacion en la superficie celular de la CPA. Los agentes reticulantes preferidos poseen una alta afinidad para el acido nucleico (p. ej. ADN y ARN) o ambos acidos nucleicos y el polipeptido interaction con dichas moleculas de esta manera un aducto puede ser producido entre el agente seleccionado de reticulacion y el acido nucleico o el acido nucleico y polipeptido. Tal agente de reticulacion puede participar en cualquier formacion de aductos intracatenarios o intercatenarios. En el caso de la formacion de aductos intercatenarios, el componente de acido nucleico del producto de adicion contiene dos hebras de ADN, dos hebras de ARN, una hebra de ADN y una hebra de ARN, una hebra de ADN y un polipeptido, o un soporte de ARN y un polipeptido. En el caso de la formacion de aductos intracatenarios, el componente de acido nucleico del producto de adicion comprende una hebra de ADN o una hebra de ARN. Preferiblemente, el componente de acido nucleico del producto de adicion comprende ADN.

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[0065] La invencion utiliza miembros de la familia de moleculas de psoraleno y derivados de los mismos (p. ej. Lin et al., Trans- fusion, Vol. 37(4), pp. 423-435 (1997)). Otros agentes de reticulacion incluyen antraquinonas y derivados de antraquinona (p. ej. Kang et al., Nucleic Acids Res., Vol., 24(20), pp. 3896-3902 (1996)); mitomicina, tales como mitomicina C y mitomicina D (ejemplo: Tomasz, "The mitomycins: natural cross-linkers of DNA." In MOLECULAR ASPECTS OF ANTICANCER DRUG-DNA INTERACTIONS. VOLUME 2 (Neidle S and Waring M, eds.), pp. 313-349 (1994) and Warren et al., Environ. Mol. Mutagen., Vol. 31(1), pp. 70-81 (1998)); mostazas nitrogenadas, tales como melfalan y clorambucilo (p. ej. Dronkert et al., Mutat. Res., Vol. 486(4), pp. 217-247 (2001) and Sancar et al., Annu. Rev. Biochem., Vol. 73, pp. 39-85 (2004)); antraciclinas, tales como adriamicina, daunomicina, epirubicina, idarubicina y (p. ej. Cutts et al., Mol. Cancer. Their., Vol. 2(7), pp. 661-670 (2003) and Sancar et al., Annu. Rev. Biochem., Vol. 73, pp. 39-85 (2004)); compuestos de coordinacion con platino, tales como cisplatino, carboplatino, nedaplatino, y oxaliplatino (p. ej. Reedijk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 100(7), pp. 36113616 (2003), Frankenberg-Schwager et al., Toxicology, Vol. 212, pp. 175-184 (2005), and Dronkert et al., Mutat. Res., Vol. 486(4), pp. 217-247 (2001)) riboflavinas; otros compuestos o colorantes aromaticos, tales como tiazol tintes naranja, metilo colorantes verdes, bromuro de etidio, y dfmero de etidio (vease p. ej. Tuite et al., Eur. J. Clin.J. Biochem., Vol. 243(1-2), pp. 482-492 (1997), Faridi et al., J. Biomol. Struct. Dyn., Vol. 15(2), pp. 321-332 (1997), y Sancar et al., Annu J. Clin.J. Biochem., Vol. 243(173), pp. 39-85 (2004), y similares.

[0066] Preferiblemente, el agente de reticulacion es fotoactivable. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la divulgacion la reticulacion se lleva a cabo mediante la incubacion de las CPAA con un agente reticulante fotoactivable y la exposicion de las CPAA incubadas a una dosis de fotoactivacion de una longitud de onda adecuada de radiacion durante un tiempo suficiente para inactivar las CPAA, por ejemplo: haciendo que el agente de reticulacion forme un aducto con un acido nucleico asociado con las CPAA. En realizaciones preferidas, la reticulacion logra la inactivacion tanto del acido nucleico xenogenico y del acido nucleico endogeno asociado con las CPAA, esencialmente incapaces de replicacion adicional o proliferacion, de ese modo son eliminandos o presentados. Preferiblemente, las cochechas de reticulacion de las CPAA que son inactivadas y esencialmente libres de contaminacion de microorganismos, como bacterias y virus, sin disminuir sustancialmente la funcion de la celula presentadora de antfgeno de las CPAA. Una vez inactivadas las CPAA esencialmente son metabolicamente inactivas pero conservan la capacidad de presentar moleculas exogenas funcionales - las cuales fueron expresadas y presentadas antes de la inactivacion - en su superficie, presentan el peptido seleccionado a las celulas T naive, y activan las celulas T naive a las que se han presentado los peptidos.

[0067] La inactivacion y la esterilidad se pueden confirmar mediante, por ejemplo, ensayos de viabilidad de celulas infectadas; ensayos de infectividad viral; ensayos de actividad viral; ensayos de deteccion de protefnas virales endogenas; ensayos nucleicos virales endogenos de deteccion de acidos; ensayos a base de PCR o ensayos a base de transcriptasa inversa (RT) PCR; ensayos de deteccion de acidos nucleicos xenogenicos; citometrfa de flujo; y/o analisis FACS (vease, p. ej. Belanger et al., 2000, Transfusion 40:1503, 2000). Por ejemplo, celulas de insectos, que contengan acido nucleico viral y otro acido nucleico microbiano en medios de cultivo asociados, pueden ser transfectadas con moleculas exogenas codificadas de acido nucleico xenogico y despues sometidas a reticulacion. El sobrenadante obtenido a partir de las celulas sometidas puede entonces ser ensayada mediante metodos conocidos o disponibles en la tecnica para determinar la cantidad de unidades formadoras de placas (UFP), que es una indicacion directa de la actividad del acido nucleico viral. Pueden emplearse metodos similares para determinar la actividad de otro acido nucleico microbiano no-viral. Esencialmente, de preferencia las CPAA inactivadas de la invencion no muestran ninguna UFP. Otros ensayos adecuados conocidos o disponibles en la tecnica, tales como inmunoensayos para detectar la presencia de una cubierta de protefna viral, tambien se pueden utilizar para confirmar la ausencia de la replicacion del virus y el trasplante de los productos de protefna viral.

[0068] En realizaciones especialmente preferidas, el acido nucleico xenogenico que esta asociado con o deriva de otros componentes de las CPAA, tales como medios de cultivo, sangre o productos de sangre, y similares, se inactiva por exposicion a un agente de reticulacion fotoactivable. La fotorreaccion es capaz de generar amplios margenes de seguridad en la desinfeccion de productos microbianos en condiciones fisiologicas suaves.

[0069] Mas preferiblemente, el agente reticulante fotoactivable es un miembro de la familia de moleculas de psoraleno, tales como aquellos ilustrados en International Publication numeros: WO 91/06665 y WO 96/39820, Lin et al., 1997, Transfusion, Vol. 37(4), pp. 423-435, and Belanger et al., Transfusion 40:1503, 2000. Tales agentes de reticulacion pueden ser fotoactivados exponiendolos a una dosis de fotoactivacion de radiacion. Metodos de prueba, manipulacion y optimizacion, parametros como la cantidad de agente de reticulacion y la concentracion, intensidad de la radiacion y duracion de tiempo, se pueden seleccionar de forma rutinaria en la orientacion de la tecnica (vease p. ej. International Publication Numeros: WO 96/39820 y WO 91/06665). La fotorreaccion de psoraleno es ventajosa para la inactivacion de virus conocidos y desconocidos en los productos activos. La inactivacion de virus con psoraleno ya ha demostrado su utilidad como antfgenos no infecciosos para su uso en inmunoensayos y vacunas experimentales (Hanson, Blood Cells 18:7, 1992).

[0070] Los dispositivos adecuados que se pueden emplear para administrar una dosis de fotoactivacion de radiacion, y de este modo conseguir la reticulacion, pueden ser seleccionados o disenados en base a las ensenanzas en la tecnica, p. ej. como se ejemplifica en International Publication Numeros: WO 96/39820 y WO 91/06665. Tales dispositivos ilustrados pueden ser modificados adecuadamente de modo que se adapten a las

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necesidades de una forma de realizacion particular de la invencion. Por ejemplo, los dispositivos que tienen una fuente de radiacion electromagnetica que esta integrado en una unidad de fotoactivacion puede comprender: medios para proporcionar longitudes de onda apropiadas de radiacion electromagnetica para causar la fotoactivacion de al menos un agente de reticulacion; medios para soporte de al menos una muestra que contenga las CPAA, preferiblemente una pluralidad de tales muestras, en una relacion fija con los medios de radiacion proporcionados durante la fotoactivacion; y medios para mantener la temperatura de las muestras dentro de un intervalo de temperaturas deseado durante la fotoactivacion. De este modo, un ejemplo de realizacion de reticulacion se puede realizar por etapas que comprenden: soporte de una pluralidad de recipientes de muestra, conteniendo cada uno una composicion de CPAA y un agente reticulante fotoactivable, en una relacion fija con una fuente fluorescente de radiacion electromagnetica; irradiacion de la pluralidad de contenedores de muestras de forma simultanea con la radiacion electromagnetica para causar la fotoactivacion del agente de reticulacion; y manteniendo la temperatura de la composicion en cada recipiente dentro de un intervalo de temperaturas deseado durante la fotoactivacion.

[0071] En la invencion, el agente de reticulacion es un derivado de psoraleno. Un derivado de psoraleno fotoactivado por irradiacion UV de onda larga se ha utilizado en diversas aplicaciones para inactivar el acido desoxirribonucleico y los virus de acido ribonucleico (vease p. ej. Brockstedt et al., Nat. Med., Vol. 11(8), pp. 853860 (2005); Lubaki et al., AIDS Res. Hum. Retrovirusus, Vol. 10(1l), pp. 1427-1431 (1994)) y los psoralenos se han descrito como la formacion de monoaductos covalentes y enlaces cruzados con bases de pirimidina de ADN y ARN en iluminacion con luz UVA (Redfield et al., Infect. Immun., Vol. 32(3), pp. 1216-1226). Ademas, Therakos ha probado clfnicamente un tratamiento con psoraleno/UV para pacientes con linfoma. Derivados de psoraleno a modo de ejemplo, los cuales son compuestos que tienen una estructura qufmica que comprende el nucleo del psoraleno o motif, se muestran a continuacion:

imagen1

4 ’ -(a m i nometi I )-4+5f ,8- a m otos a I en o (S -5 9)

psoraleno

[0072] Preferiblemente, se emplea un grado de alta pureza clfnica o similar de un derivado de psoraleno para la reticulacion de acido nucleico asociadas con las CPAA. El derivado de psoraleno se pone en contacto con las CPAA a una concentracion adecuada, p. ej. de aproximadamente 0,1mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml , de preferencia de 1 mg/ml a 55 mg/ml, como 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40 o 55 mg/ml. La composicion de las CPAA con psoraleno-tratado se expone posteriormente a UVA (irradiado con), que es de onda larga (de aproximadamente 320 nm a aproximadamente 400 nm) radiacion ultravioleta, durante un tiempo suficiente para lograr el grado deseado de inactivacion. Por ejemplo, una exposicion UVA de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 60 minutos, como 1, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60 minutos, puede ser seleccionado. La intensidad UVA durante esta exposicion se selecciona en vista del perfodo de tiempo de exposicion elegido para alcanzar el grado deseado de inactivacion, por ejemplo, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 Julios/cm2 (J/cm2) y preferiblemente, como 1, 5, 10, 15, o 20, 40, 50 o 100 J/cm2. Aunque el tratamiento de reticulacion con 8-MOPs mas 1 Juio/cm2 durante 2 minutos es suficiente para inactivar las celulas de Drosophila, preferiblemente tambien se realiza la reticulacioncon el fin de inactivar cualquier contaminante viral y mantener o mejorar la funcion del CPA (en comparacion con las CPAA no tratadas). En una realizacion a modo de ejemplo, la dosis de un derivado de psoraleno (5 mcg/ml; 8-MOPs) y la exposicion UVA (irradiacion a 320-380 nm durante 5 minutos) es similar a la utilizada para inactivar las celulas infectadas por VIH-1 (vease Watson et al., AIDS Res Hum Retroviruses 6:503, 1990). Esta fotorreaccion es suficiente para inactivar Baculovirus aislado de las celulas Sf9 infectadas tratadas con psoraleno/UV despues de la infeccion. La suministro viral obtenido en el sobrenadante no contiene virus infeccioso, donde el control viral de celulas Sf9 infectadas contienen cantidades significativas de UFP despues de un solo ciclo

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de infeccion (8 x 108 PFU/ml). La fotorreaccion evita la replicacion del virus en el indicador de la linea celular y la produccion de partfculas infecciosas que contienen el acido nucleico. En otro ejemplo de realizacion, 2 mcg/ml UVADEX® (8-MOPs) de grado clfnico e irradiacion UVA a 5 Julios/cm2 durante 10 minutos se utilizan para inactivar virus de insecto 108 pfu.

[0073] Un inmunoensayo para detectar la presencia de una cubierta de protefna viral de preferencia se realiza para confirmar la ausencia de replicacion del virus y la traduccion de los productos de protefna viral. Las pruebas se pueden realizar para confirmar que el tratamiento con psoraleno/UV de celulas de Drosophila cultivadas a 27° C no se replican, y que los recuentos de celulas son insignificantes despues de 14 dfas de cultivo. El tratamiento impide la replicacion posterior de las celulas de Drosophila las cuales permanecen inactivas hasta que se lisan por la falta de crecimiento.

[0074] Varios dispositivos de UVA que emiten radiacion ultravioleta en el intervalo de 320-400 nm estan disponibles o se pueden construir facilmente usando una fuente de emisores-UVA adecuado o una fuente mas amplia de radiacion ultravioleta-gama con filtro u otros medios para restringir la longitud de onda de la radiacion dentro de la gama UVA. Se dice que tales dispositivos tienen gama baja y gama alta de longitud de onda "puntos de corte", que no permiten longitudes de onda por debajo o por encima de estos puntos de corte para irradiar a las CPAA tratadas con psoraleno. Tales dispositivos son tambien preferiblemente capaces de proporcionar longitudes de onda sustancialmente precisas de radiacion, las cuales tienen un medio de ancho de banda de aproximadamente 10 nm de distancia, preferiblemente de aproximadamente 8 nm, preferiblemente de aproximadamente 6 nm, preferiblemente no mayor que 5 nm. Una longitud de onda preferida de radiacion utilizada para fotoactivar un agente de reticulacion es de aproximadamente 365 nm con 5 nm medio de ancho de banda. Un ejemplo de dispositivo comprende una fuente de emision que contiene una lampara UV de longitud de onda larga de alta intensidad equipada con una bombilla de inundacion de mercurio. Mientras que la posicion o la orientacion de la fuente de emision de radiacion de un dispositivo de este tipo se pueden seleccionar adecuadamente, preferiblemente la fuente de UVA se coloca encima de la muestra a irradiar. Otro ejemplo de dispositivos UVA incluyen sistemas de irradiacion modificados como el modelo 4R4440 de Baxter Biotech (vease tambien, Lin et al., 1997, Transfusion, Vol. 37(4), pp. 423-435) y aquellos descritos en International Publication No. WO 96/39820.

[0075] Puede ser conveniente mezclar las CPAA y el agente de reticulacion antes o durante el proceso de fotoactivacion, el cual puede realizarse con, por ejemplo, un agitador que se coloca de modo que la composicion de CPAA y el agente de reticulacion se puedan mezclar a fondo. Ademas, puede ser conveniente llevar a cabo la fotoactivacion en condiciones esencialmente anaerobias. Los metodos ejemplares que pueden emplearse para efectuar la fotoactivacion esencialmente anaerobica se ejemplifican por Lin et al.,1989, Blood, Vol. 74, pp. 517-525, and Lin et al. 1997, Transfusion, Vol. 37, pp. 423-435.

[0076] En una realizacion preferida, un ciclo de congelacion-descongelacion se lleva a cabo antes, durante, o despues de la reticulacion. En un ejemplar de ciclo de congelacion-descongelacion, las CPAA pueden congelarse por contacto de un recipiente adecuado que contenga las CPAA con una cantidad apropiada de nitrogeno lfquido, dioxido de carbono solido (es decir, el hielo seco), o un material de baja temperatura similar, de manera que se produzca la congelacion rapidamente. Las CPAA congeladas a continuacion se descongelan, ya sea por eliminacion de las CPAA a partir del material de baja temperatura y la exposicion a condiciones de temperatura ambiente, o por un proceso de descongelacion facilitado en el que se emplea un bano de agua tibia o la mano tibia para facilitar un tiempo de descongelacion mas corto. Ademas, las CPAA pueden ser congeladas y almacenadas durante un perfodo de tiempo prolongado antes de la descongelacion. Las CPAA congeladas tambien puede ser descongeladas y luego liofilizadas antes de seguir usandolos. Preferiblemente, los conservantes los cuales pueden afectar negativamente los procedimientos de congelacion-descongelacion, tales como dimetil sulfoxido (DMSO), polietilenglicoles (PEG), y otros conservantes, estan ausentes de los medios que contienen las CPAA que experimentan el ciclo de congelacion-descongelacion, o esencialmente se eliminan, mediante la transferencia de las CPAA a medios de comunicacion que esencialmente estan carentes de tales conservantes.

[0077] Varias ventajas se pueden conseguir a traves de la practica de la invencion. Por ejemplo, la capacidad de las celulas tratadas con UV/psoraleno, y esas celulas tratadas con UV/psoraleno, congeladas y descongeladas por 2 ciclos, son mejores que las CPAA viables, las celulas de Drosophila no-tratadas viven. La capacidad de mantener o incluso mejorar la funcion CPA de la linea celular de Drosophila 668 con el protocolo psoraleno/UV y psoraleno/UV/congelacion/descongelacion ayuda a asegurar que las celulas de Drosophila se inactiven y se lisen antes de la exposicion a las celulas CD8 humanas. Esto anade una caracterfstica de seguridad importante, sin disminuir la capacidad de estimulacion unica de las CPAA. Las celulas CD8 que son estimuladas especfficamente por el psoraleno/UV y las celulas estimuladas por psoraleno/UV/congeladas/descongeladas crecen tan eficientemente como las estimuladas con viable, las celulas de Drosophila viven. Ademas, la naturaleza especffica de antfgeno de los CTL CD8 generados al final del ciclo de cultivo ex vivo es mayor que la detectada con las celulas CPA no tratadas. El metodo de la invencion para la inactivacion viral y el acido nucleico de la celula huesped impide el crecimiento celular y la replicacion viral en las celulas tratadas. La capacidad para mantener la funcion importante de la CPA de las celulas de Drosophila al tiempo que garantiza la seguridad del producto de terapia celular es un resultado muy conveniente y deberfa ayudar a aliviar las preocupaciones, aumentando la calidad de su seguridad,

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de manera que la terapia de celulas ahora se puede considerar una celula no-humana "muerta" en lugar de un producto xenotrasplantes.

[0078] En realizaciones preferidas, las moleculas de CMH codificadas por el acido nucleico xenogenico se expresan mediante las CPAA como moleculas vacfas. Tales moleculas vacfas son esencialmente desprovistas de cualquier peptido antigenico unido o peptido inmunogenico o fragmentos de tales peptidos. Como tal, las CPAA se pueden cargar con una o mas especies de peptidos seleccionados para la carga, con "peptido seleccionado" se entiende una o mas especies de peptidos antigenicos, especies de peptidos inmunogenicos, o fragmentos de tales especies de peptidos. En algunas formas de realizacion, las moleculas vacfas de CMH expresadas en la superficie de los CPAA se cargan con una sola especie de peptidos. En otras realizaciones preferidas, el peptido seleccionado comprende una pluralidad de especies, tales como de dos a seis o mas especies, se utilizan para cargar moleculas vacfas de cMh. La carga de la molecula CMH con el peptido seleccionado puede ser realizada en un momento adecuado despues que se ha producido la expresion de la protefna exogena en la superficie de las CPAA. La carga de la molecula CMH con peptido seleccionado tambien se puede realizar antes de, concomitante con, o despues de la inactivacion de acido nucleico xenogenico como se describe anteriormente.

[0079] Como se menciono anteriormente, las CPAA se cargan con el peptido seleccionado. La exposicion de las CPAA al peptido seleccionado puede realizarse concomitante con, o despues de, la expresion de las moleculas exogenas descritos anteriormente en la superficie de las celulas modificadas. Como resultado de esta exposicion, las CPAA se cargan con el peptido seleccionado, preferiblemente de modo que el peptido seleccionado ocupe los sitios de union de antfgeno o inmunogeno en las moleculas CMH expresadas en la superficie de las CPAA, donde los sitios de union estaban desprovistos de peptido unido antes de la exposicion al peptido seleccionado. Una vez cargado, el peptido seleccionado es capaz de ser presentado a las celulas T naive de una manera que provoca la activacion de las celulas T naive.

[0080] El peptido seleccionado empleado para cargar las moleculas CMH exogenas vacfas se selecciona de acuerdo con la clase particular de tal molecula(s) CMH para ser expresado por las CPAA. Por lo tanto, en realizaciones en las que se desee que las CPAA expresen moleculas de CMH de clase I vacfas, el peptido seleccionado que se une a dichas moleculas vacfas CMH de clase I se pone en contacto con tales cPaA de manera que las moleculas de clase I se carguen con dicho peptido seleccionado. En realizaciones en las que se desee que las CPAA expresen moleculas vacfas CMH de clase II, el peptido seleccionado que se une a dichas moleculas CMH de clase II vacfas se pone en contacto con tales CPAA de manera que las moleculas de clase II se carguen con dicho peptido seleccionado. En realizaciones en las que tanto las moleculas CMH de clase I como las moleculas CMH de clase II deben ser expresadas por las CPAA, tanto a la union en la clase I al peptido seleccionado como a la union en la clase II al peptido seleccionado puede ser utilizados para contactar a las CPAA de manera que tanto las moleculas de clase I y clase II esten cargadas de peptido seleccionado. En realizaciones en las que se selecciona una especie de peptidos, la seleccion de especie de peptidos comprende una pluralidad de moleculas de peptidos, de los cuales cada uno es identico al otro en la composicion de aminoacidos y en la secuencia. En realizaciones en las que se seleccionan dos o mas especies de peptidos, cada uno de los dos o mas especies de peptidos seleccionados comprende independientemente una pluralidad de moleculas de peptidos, de los cuales cada uno es identico al otro en la composicion de aminoacidos y la secuencia. De estas dos o mas especies, cada una se utiliza para contactar a las CPAA, ya sea simultaneamente o en distintos casos. En cada una de estas realizaciones, en las CPAA se producen complejos multi-antigenicos o peptido-CMH multi- inmunogenico. La carga de peptido seleccionado en moleculas del CMH vacfas se produce preferiblemente bajo condiciones de union biologica aproximada, las cuales puede ser aproximadas in vitro, ex vivo, o in vivo.

[0081] Especies de peptidos a modo de ejemplo que se pueden seleccionar incluyen los siguientes, en donde la protefna de la que deriva cada peptido y el identificador de secuencia asignado a cada peptido se indican entre parentesis: SILSLKEAST (C- Lectin; SEQ ID NO.1), KMASRSMRL (C-Lectin; SEQ ID NO.2), ALALAALLVV (Pec 60; SEQ ID NO. 3), ALLVVDREV (Pec60; SEQ ID NO. 4), YMNGTMSQV (Tyrosinase; SEQ ID NO.5), YMDGTMSQV (Tyrosinase; SEQ ID NO.6), IT- DQVPFSV (gp100; SEQ ID NO.7), YLEPGPVTA (gp100; SEQ ID NO.8), AAGIGILTV (MART-1; SEQ ID NO.9), ELA- GIGILTV (MART-1; SEQ ID NO.10), CLTSTVQLV (Her-2/neu; SEQ ID NO.11), HLYQGCQVV (Her-2/neu; SEQ NO.12), KIFGSLAFL (Her-2/neu; SEQ ID NO.13), IISAVVGIL (Her-2/neu; SEQ ID NO.14), PLTSIISAV (Her-2/neu; SEQ ID NO.15), VMAGVGSPYV (Her-2/neu; SEQ ID NO.16), VLVKSPNHV (Her-2/neu; SEQ ID NO.17), ELVSEFSRM (Her- 2/neu; SEQ ID NO.18), YLSGANLNL (CEA; SEQ ID NO.19), GPLTPLPV (AES; SEQ ID NO.20), SLLMWITQC (NY- ESO-1; SEQ ID NO.21), KALFAGPPV (CA- 125; SEQ ID NO.22), YLETFREQV (CA-125; SEQ ID NO.23), GLQSPKSPL

(CA-125; SEQ ID NO.24), VLLKLRRPV (CA-125; SEQ ID NO.25), ELYIPSVDL (CA-125; SEQ ID NO.26), SLLMWITQV (NY-ESO-1; SEQ ID NO.27), ILAKFLHWL (Telomerase; SEQ ID NO.28), STAPPVHNV (MUC-1; SEQ ID NO.29), FLWG- PRALV (MAGE-3; SEQ ID NO.30), FMWGNLTLA (CA-125; SEQ ID NO.31), RLVDDFLLV (Telomerase; SEQ ID NO.32), HLSTAFARV (G250; SEQ ID NO.33), QLSLLMWIT (NY-ESO-1; SEQ ID NO.34), ELWTHSYKV (FBP; SEQ ID NO.35), KVAELVHFL (MAGE-3; SEQ ID NO.36), YIFATCLGL (MAGE-3; SEQ ID NO.37), HLYIFATCL (MAGE-3; SEQ ID NO.38),

MLMAQEALAFL (CAMEL; SEQ ID NO.39), STLEKINKT (SSX-4; SEQ ID NO.40), KASEKIFYV (SSX-2; SEQ ID NO.41), SLLMWITQCFL (NY-ESO-1; SEQ ID NO.42), ELTLGEFLKL (Survivin; SEQ ID NO.43), LTLGEFLKL (Survivin; SEQ ID NO.44), SLLEKREKT (SP17; SEQ ID NO.45), TLGEDDPWL (SART-1; SEQ ID NO.46),

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KLGLKPLEV (SART-1; SEQ ID NO.47), YLWTSAKNT (SCP-1; SEQ ID NO.48), STAPPAHGV (MUC-1; SEQ ID NO.49), GMGSEELRL (LIVIN; SEQ ID NO.50), SLGSPVLGL (LIVIN; SEQ ID NO.51), YLFFYRKSV (hTRT; SEQ ID NO.52), CQQEETFLL (CA-125; SEQ ID NO.53), TLAKFSPYL (CEBADOR; SEQ ID NO.54), NLTHVLYPV (CEBADOR; SEQ ID NO.55), STFKNWPFL (Survivin; SEQ ID NO.56), SLLQHLIGL (CEBADOR; SEQ ID NO.57), FLDQRVFFV (gp100; SEQ ID NO.58), FLDQRVFVV (gp100; SEQ ID NO.59), FLDQVAFVV (gp100; SEQ ID NO.60), GLDREQLYL (MUC-16; SEQ ID NO.61), VMQHLLSPL (MUC- 16; SEQ ID NO.62), QQTHGITRL (MUC-16; SEQ ID NO.63), LQPLSGPGL (MUC-16; SEQ ID NO.64), TLDRDSLYV (MUC-16; SEQ ID NO.65), QLYLELSQL (MUC-16; SEQ ID NO.66), KVLEYVIKV (MAGE-1; SEQ ID NO.67), KVADLVG-FL (MAGE-1; SEQ ID NO.68), KTWGQYWQV (SEQ ID NO.70) y VLDGLDVLL (SEQ ID NO. 71). Los peptidos preferidos incluyen la topoisomerasa II, la integrina p8 precursor de la subunidad, MUC-1, MAGE-B2, STaT 1, Y-Catenina, y H-RyK (RTK 6). Otros peptidos adecuados se pueden seleccionar de forma rutinaria. Vease p. ej. U.S. Patent Application Publication No. 2003/0022820 para algunas especies de peptidos ilustrativos.

[0082] Las especies de peptidos seleccionados pueden ser presentados a las celulas y cargados en las CPAAs a traves de una variedad de medios y tecnicas conocidas o que se vuelvan disponibles en la tecnica. Los peptidos pueden presentarse de una manera que les permita entrar en una piscina intracelular de peptidos. Por ejemplo, los peptidos pueden presentarse mediante carga osmotica. Preferiblemente, los peptidos se anaden al medio de cultivo del sistema de las CPAA. Los peptidos pueden anadirse al medio de cultivo en forma de un polipeptido o protefna intacto que se degrade subsiguientemente mediante procesos celulares, tales como la degradacion enzimatica. Alternativamente, el polipeptido o protefna intacto puede degradarse a traves de algunos otros medios, tales como la digestion qufmica (p. ej. bromuro de cianogeno) o proteasas (p. ej. tripsina y quimotripsina) antes de la adicion al medio de cultivo del sistema de las CPAA. Alternativamente, toda una secuencia de la protefna o polipeptido se puede clonar en un vector apropiado e insertarse en una celula procariotica, de tal manera que la celula genere cantidades significativas del polipeptido antigenico que luego se coseche, se purifique y se digiera en peptidos que luego se anaden al medio de cultivo del sistema de las CPAA. La purificacion de las protefnas o peptidos se puede lograr a traves de diversas tecnicas adecuadas que son conocidas o se vuelven disponibles en la tecnica, tales como cromatograffa de inmunoafinidad, cromatograffa de afinidad, precipitacion de protefnas, intercambios de tampon, intercambio ionico, cromatograffa, cromatograffa de interaccion hidrofobica o cromatograffa de exclusion por tamano.

[0083] En realizaciones preferidas, las CPAA estan inactivadas en un punto posterior a la expresion de CMH exogena y de moleculas auxiliares, tales moleculas se presentan en la superficie de las CPAA, y en la carga de moleculas CMH presentadas con el peptido seleccionado. En consecuencia, tales CPAA inactivadas y cargadas con peptidos seleccionados, se vuelven esencialmente incapaces de proliferar o replicar, retienen la funcion de presentacion de peptidos seleccionados, y preferiblemente tambien conservan la funcion de activacion de las celulas T naive. Ademas, los fragmentos de fragmentos de las CPAA, como las membranas celulares intactas y fragmentos de las membranas celulares, que contienen CMH cargado con peptido seleccionado y moleculas auxiliares, se pueden emplear opcionalmente para activar las celulas T naive. Cualquier metodo adecuado conocido o disponible en la tecnica se puede emplear para preparar, aislar y manipular tales fragmentos de CPAA.

[0084] Como se describe anteriormente las CPAA preparadas e inactivadas presentan moleculas vacfas de CMH exogenas, de manera que se consigue una cantidad suficiente de peptido seleccionado, ventajosamente puede anadirse en la superficie de las CPAA una alta densidad de complejos CMH de peptido seleccionados, esta alta densidad es sustancialmente mayor que la densidad observada en cPa de mamfferos de tipo salvaje. Una celula T naive/cultivo inactivado de CPAA puede ser mantenido durante todo el tiempo que sea adecuado para activar y enriquecer una poblacion terapeuticamente efectiva de los CTL. Por ejemplo, la duracion del tiempo de cultivo de celulas T naive /CPAA inactivada es de aproximadamente un dfa a aproximadamente diez dfas, tal como de dos a nueve dfas, de tres a ocho dfas, o de cuatro a seis dfas.

[0085] En una realizacion preferida, las CPAA o fragmentos de CPAA preparadas e inactivadas como se describe anteriormente poseen una mayor funcion de CPA con respecto a la funcion de CPA posefda por las CPAA que no han sido tan inactivadas. La funcion de la CPA puede ser reflejada en mayor medida por la actividad del CTL en los CTL que estan activados por contacto con las CPAA inactivadas con respecto a la medida de la actividad del CTL en los CTL que se activan por contacto con las CPAA que no estan inactivados. La actividad del CTL puede ser medido por uno o mas parametros de la activacion de cTl, tales como un grado de expresion de la protefna de la superficie celular por una o mas protefnas indicativas de la activacion de celulas del CTL (tal como la expresion de la superficie celular CD69), un grado de diferenciacion, un grado de la capacidad especffica de eliminacion citotoxica, un grado de lisis celular especffica, o un grado de la produccion de citosinas asociadas al CTL. Ademas, las celulas T activadas pueden ser detectadas o aisladas por tincion de tetramero peptido- CMH (pMHC), en el que las celulas T activadas detectadas son especfficas para el peptido seleccionado presentado por las CPAA. En una realizacion preferida, la inactivacion se logra mediante la formacion de compuestos de las CPAA con un derivado de psoraleno y exponiendo el complejo a UVA a fin de lograr la expresion mejorada de CD69.

[0086] Las celulas T activadas pueden ser separados de las CPAA utilizando una tecnica adecuada conocida o disponible. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales especfficos para las CPAA, para los peptidos cargados en las CPAA, o para las celulas T activadas (o una porcione de las mismas) pueden emplearse para unirse a un ligando complementario apropiado. Los anticuerpos para el etiquetado de celulas pueden entonces ser extrafdos

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con una tecnica adecuada de la mezcla de celulas T y CPAA/activadas, tal como un metodo de inmunoprecipitacion o inmunoensayo. Alternativamente, una etapa de separacion puede ser omitida por completo y los CPAA inactivadas pueden dejarse en cultivo con las celulas T activadas.

[0087] En una realizacion preferida, las celulas T CD8+ naive se seleccionan para la activacion, y las cantidades deseadas de los CTL resultante son empleadas para preparar producto de terapia celular para administracion terapeutica. Preferiblemente, antes de la administracion de una o mas pruebas de control de calidad, se realizan pruebas en los linfocitos T activados o en la terapia celular. En realizaciones preferidas, las pruebas de control de calidad comprenden la realizacion de una o mas pruebas para confirmar: compatibilidad de HLA entre el paciente y los linfocitos T; analisis de citometrfa de flujo (CD8+, TCR+); esterilidad (sin crecimiento bacteriano o fungico); gramstain negativo para bacterias; micoplasma negativo para PCR / ELISA; no ADN de Drosophila residual; ausencia de cDNA de virus de insectos; viabilidad (> 72% viable); y la actividad citolftica mediante el ensayo de CTL.

[0088] Para tratar a un sujeto, segun la invencion es administrada una cantidad eficaz de un producto de terapia celular a un sujeto que padece o es diagnosticado de una enfermedad, trastorno o condicion. Una "cantidad eficaz" es una cantidad o dosis suficiente para producir generalmente un beneficio terapeutico o profilactico deseado en pacientes en necesidad de tal tratamiento. Las cantidades o dosis eficaces de los productos de terapia celular de la presente invencion pueden determinarse mediante metodos rutinarios tales como modelado, estudios de escalado de dosis o pruebas clfnicas, y tomando en cuenta los factores de rutina, p. ej., el modo o via de administracion, la entrega del producto, la farmacocinetica del producto de terapia celular, la gravedad y curso de la enfermedad, trastorno, o afeccion, la terapia previa o en curso del sujeto, el estado de salud del sujeto y la respuesta a los farmacos, y el juicio del medico tratante. A modo de ejemplo de cantidades de dosificacion, las poblaciones de celulas pueden contener de 1 x 106 a 1 x 1012 celulas T activadas, tales como 1 x 108 a 1 x 1011 o 1 x 109 a 1 x 1010 celulas T activadas para un humano adulto aproximadamente.

[0089] El producto de terapia celular se prepara como una composicion terapeutica que comprende celulas T activadas y un vehfculo adecuado para el mantenimiento de las mismas hasta que se infunden en el sujeto, tal como un diluyente farmaceuticamente aceptable o un disolvente. En una realizacion preferida, el producto de terapia celular contiene de 1 x 109 a aproximadamente 10 x 109 CTLs en una solucion de inyeccion de lactato de Ringer, USP (76% (v/v), 5% de solucion salina normal, dextrosa USP (76% (v/v)), y albumina de suero humano al 25% (HSA; 20% (v/v)).

[0090] Puede emplearse cualquier tecnica adecuada para la administracion de composiciones que contienen componentes celulares en un sujeto. Por ejemplo, puede emplearse la administracion de celulas de los CTL activados mediante infusion intravenosa. Multiples infusiones pueden ser necesarias o indicadas, y estas infusiones pueden ocurrir durante un perfodo de varias semanas o mas. Tecnicas ejemplares se describen, por ejemplo en U.S. Patent Numeros 4,844,893 y 4,690,915.

[0091] Opcionalmente, los productos o preparaciones de terapia celular pueden complementarse para incluir otro inmunomodulador, preferiblemente inmunoestimulante, componentes en adicion con las CPAA cargadas con peptido seleccionado. Tales componentes adicionales se pueden anadir antes de, concomitante con, o despues de poner en contacto a las celulas T naive con las CPAA cargadas con peptido. La seleccion de los puntos de tiempo deseados, las concentraciones de dosis y frecuencias en los que tales componentes immunomoduladores suplementarios, preferentemente inmunoestimulante, son anadidos pueden seleccionarse de acuerdo con las consideraciones pertinentes, tales como la velocidad deseada de proliferacion, la tasa de expansion, el numero de celulas, la longevidad, o inmunogenicidad. Los componentes suplementarios o inmunoduladores pueden ser, por ejemplo, uno o mas leucocitos distintos de celulas T no tratadas previamente, citocinas, linfocinas, quimiocinas y anticuerpos. Ejemplares de leucocitos que pueden seleccionarse incluyen celulas adherentes, tales como: celulas no-adherentes CD8, CD14+, monocitos, macrofagos, celulas T auxiliares, celulas T de memoria, y otros leucocitos que pueden impartir un inmunomodulador, preferiblemente inmunoestimulante, efecto o estfmulo. Tales leucocitos pueden ser de origen autologo o heterologo. En una realizacion preferida, los leucocitos seleccionados son de origen autologo. Ejemeplares de citocinas incluyen las interleucinas, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, interferones, tales como y-interferon, y factores de necrosis tumoral (TNFs), tales como TNF-L L(vease, p. ej. Tizard I., IMMUNOLOGY:AN INTRODUCTION, 3rd Edition, pp. 129-143, (1992) o CD70 (vease, p. ej. Gen Bank accession number L08096 and NCBI accession number NM_001252), LT, 4-1 BBL y OX40L; U.S. Patent Application Publication No. 2002/0119121; and International Publication No. WO 2002/022648). Las citocinas pueden ser de origen recombinante o natural. En una realizacion preferida, las citocinas seleccionados son de origen recombinante. Ejemplares de anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales anti-CD3, como el marcado como ORTHOCLONE OKT®3 (muromonab-CD3).

[0092] En una realizacion especialmente preferida, celulas autologas no-CD8, celulas adherentes CD14+, IL-2, IL- 7, y la preparacion de anticuerpos anti-CD3 monoclonal (OKT®3) se emplean como componentes inmunoestimuladores adicionales en los metodos de preparacion de terapia celular. En tales realizaciones, las celulas T naive que han sido sometidas a la estimulacion primaria con las CPAA cargadas con peptido seleccionado

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son sometidas a reestimulacion poniendolas en contacto con cantidades eficaces de IL-2 recombinante e IL-7 recombinante (p. ej. aproximadamente 1-100 Units/ml IL-2 y preferentemente 1, 10, 15, 20, 50 or 100 Units/ml IL-2 y alrededor de 1-100 Units/ml IL-7, y preferiblemente 1, 10, 15, 20, or 50 Units/ml IL-7) y despues poniendolas en contacto con una cantidad eficaz de autologos, celulas adherentes no-CD8, CD14+ cargadas con peptido seleccionado, (p. ej. alrededor de una celula adherente no-CD8, CD14+ por cada cuatro celulas T naive estimulada- primaria). Preferiblemente, el tiempo de duracion de IL-2/IL-7 y el contacto de la celula adherente CD14+ es de aproximadamente dos dfas y de aproximadamente tres a cuatro dfas, respectivamente, y cada reestimulacion se repite en secuencia al menos una vez. Despues de al menos dos regfmenes de reestimulacion, un regimen de expansion de celulas T no-especffica comprende el contacto con IL-2 y anti-CD3 (p. ej. OKT®3) durante aproximadamente dos a cinco dfas.

[0093] En otras realizaciones preferidas, las celulas T autologas CD4+ auxiliares e IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, o IL-21 se ponen en contacto con las celulas T naive antes de, concomitante con, o despues de la estimulacion primaria o la re-estimulacion. Preferiblemente IL-2 se utiliza en combinacion con al menos una de IL-7, IL-15 o IL- 21. Cuando se utiliza IL-15, se prefieren cantidades eficaces de IL-15 son aproximadamente 1-100 ng/ml y preferentemente, 1, 10, 20, 25, 40, or 50 ng/ml IL-15. Similarmente cuando se utiliza IL-21, se prefieren cantidades eficaces de IL-15 son aproximadamente 1-100 ng/ml y preferentemente, 1, 10, 20, 25, 40, or 50 ng/ml IL-21. En tales formas de realizacion preferidas, las celulas T naive se pueden dirigir para convertirse en celulas T de memoria. Tal regimen de la celula T CD4+ auxiliar puede emplearse en adicion de o en lugar de cualquiera de los procedimientos de expansion o de reestimulacion de la celula T no-especfficas descritas anteriormente, haciendo que las celulas T de memoria pueda tolerar multiples rondas de re-estimulacion ex vivo. Ademas, un producto de terapia celular que contiene tales celulas T de memoria, cuando es administrada a un sujeto, puede entonces ser expandida y estimulada in vivo cuando se encuentra con el peptido seleccionado y otras senales de activacion. Procesos en general en relacion con la preparacion de celulas T auxiliares y su incorporacion en IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, y/o IL-21 estimulacion o expansion de las celulas T naive asistida para convertirse en celulas T de memoria o en los CTL pueden encontrarse en p. ej. U.S. Patent Application Publication No. 2002/0119121 and International Publication No. WO 2002/022648.

[0094] Con el fin de tratar a un sujeto, un producto de terapia celular se administra preferiblemente al sujeto del que se obtuvo originalmente el producto de aferesis usado para preparar el producto de terapia celular. Por lo tanto, un sujeto que es tratado con un producto de terapia celular se le administra preferiblemente un producto de terapia celular que contiene celulas T autologas activadas, y mas preferiblemente que contenga los CTL.

[0095] Los ejemplos de enfermedades, trastornos o condiciones que pueden ser tratadas con un producto de terapia celular incluyen, por ejemplo, trastornos del sistema inmune, tales como trastornos de inmunodeficiencia, trastornos autoinmunes, trastornos relacionados con el sistema inmune comprometido, insuficiente o ineficaz o respuesta inmune del sistema; infecciones, tales como infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones por micoplasma, infecciones por hongos y las infecciones parasitarias; y canceres, tales como melanoma maligno, mieloma multiple, cancer de prostata, linfoma, linfoma no-Hodgkin, leucemia, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocftica cronica, leucemia mieloide cronica, el linfoma de Burkitt, cancer de tiroides, cancer de utero, cancer de rinon, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de hfgado, cancer de pancreas, cancer de prostata, cancer de colon, cancer de piel, cancer de estomago, cancer cervical, cancer de cabeza y cuello, glioma, y tumor cerebral.

[0096] El tratamiento de una enfermedad, trastorno, o condicion con un producto de terapia celular puede ocurrir antes, concomitante con, o despues de otro tratamiento con otros productos terapeuticos o regfmenes. Ejemplares adicionales de regfmenes, componentes o modalidades que pueden ser usados en conjuncion con la administracion del producto de terapia celular de la invencion incluyen, por ejemplo: inmunoestimulador, inmunosupresores y otros regfmenes de inmunoterapia, tales como citocinas, linfocinas, quimioquinas, interleuquina, o la administracion de interferon; lymphodepleting y mieloablativo regfmenes, como Diftitox Denileukin (DAB- IL2) o la administracion de cladribina; y tratamientos tradicionales de quimioterapia y radiacion. En realizaciones preferidas, un regimen de tratamiento lymphodepleting, tal como el descrito en U.S. Provisional Application No. 60/778,516, se emplea en conjuncion con el tratamiento del producto de terapia celular.

[0097] De acuerdo con ello, las celulas T naive ventajosamente pueden obtenerse de un sujeto que padece una afeccion o enfermedad tratable con el producto de terapia celular antes de la iniciacion de otro tratamiento o terapia que pueda interferir con, atenuar, o limitar la activacion de las celulas T naive. Por ejemplo, en el tratamiento de un individuo con una neoplasia o tumor, un producto de aferesis linfatica que comprende celulas T naive puede obtenerse antes de la iniciacion de la quimioterapia o tratamiento de radiacion y se mantenerse en cultivo. Las celulas T naive pueden entonces activarse de acuerdo con la presente invencion, proporcionando con ello un producto de terapia celular, que puede ser infundido en el sujeto antes de, concomitante con, o despues de otros regfmenes de tratamiento.

[0098] Otras realizaciones, caracterfsticas y ventajas de la invencion se ilustran adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos.

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EJEMPLOS

MATERIALES

Petido tirosinasa - YMNGTMSQV (SEQ ID NO.5).

[0099] Un peptido tirosinasa (tyr 369-377), correspondiente a los aminoacidos 369-377 de la tirosinasa humana, es fabricada y purificada utilizando los estandares de cumplimiento GLP (Synpep Corporation). El polvo de peptido tal como se recibio del fabricante (Synpep Corporation) se disuelve en dimetilsulfoxido (DMSO) para lograr una solucion stock de peptido a una concentracion de 10 mg/mL y se almacena de -72 °C a -88 °C antes de su uso. Esta solucion stock de peptido se mezcla en partes iguales con otras soluciones stock de peptido (tambien a una concentracion de 10 mg/ml) para generar soluciones de peptidos combinados para usar en la carga de las xCPA. Las soluciones de peptidos combinados se dividen en partes alfcuotas en viales esteriles en una sala limpia clase 10.000 en condiciones asepticas en una cabina de bioseguridad de clase II.

Petido tirosinasa - YMDGTMSQV(SEO ID NO.6)

[0100] Una forma desamidada del peptido tyr 369-377 se describe anteriormente, el cual contiene un residuo de acido aspartico en lugar de un residuo de asparagina en la posicion tres del peptido, se fabrica y se purifica utilizando las normas de cumplimiento GLP (Synpep Corporation). Esta forma se llama desaminacion Tyr 369- 377d. El polvo de peptido recibido del fabricante se disuelve en dimetilsulfoxido (DMSO) para lograr una solucion stock de peptido a una concentracion de 10 mg/mL, y se almacena de -72 °C a -88 °C antes de su uso.

MART-1 Peptido - AAGIGILTV (SEQ ID NO.9)

[0101] Un peptido de MART-1 (MART-1 27-35), correspondiente a los aminoacidos 27- 35 de MART-1 humano, es purificada y fabricada utilizando los estandares de cumplimiento GLP (Synpep Corporation). El polvo de peptido se disuelve en dimetilsulfoxido (DMSO) para lograr una solucion de peptido a una concentracion de 10 mg/mL, y se almacena de -72 °C a -88 °C antes de su uso. gp100 Peptido- ItDqVPFSV (SEQ ID NO.7)

[0102] Un peptido gp100 (gp100 209-217), correspondiente a los aminoacidos 209-217 de humano gp-100, es fabricada

y purificada utilizando los estandares de cumplimiento GLP (Synpep Corporation). El polvo de peptido se disuelve en dimetilsulfoxido (DMSO) para lograr una solucion stock de peptido a una concentracion de 10 mg/mL, y se almacena de -72 °C a -88 °C antes de su uso.

gp100 Peptido - KTWGQYWQV (SEQ ID NO.70)

[0103] Un peptido gp100 (gp100 154-162), correspondiente a los aminoacidos 154-162 de humano gp100, es purificada y fabricada utilizando los estandares de cumplimiento GLP. El polvo de peptido tal como se recibio de Synpep Corporacion se disuelve en dimetilsulfoxido (DMSO) para lograr una solucion stock de peptido a una concentracion de 10 mg/mL, y se almacena de -72 °C a -88 ° C antes de su uso.

gp100 Peptido - YLEPGPVTA (SEQ ID NO.8)

[0104] Un peptido gp100 (gp100 280-288), correspondiente a los aminoacidos 280-288 de gp100 humana, es purificada y fabricada utilizando los estandares de cumplimiento GLP por Synpep Corporation. El polvo de peptido se disuelve en dimetilsulfoxido (DMSO) para lograr una solucion de peptido a una concentracion de 10 mg/mL, y se almacena de -72 °C a -88 °C antes de su uso.

[0105] Cada uno de los peptidos antes mencionados, asf como el peptido CD8 cadena alfa (AAEGLDTQRFSG; SEQ ID NO.83) descritos arriba fueron generados de acuerdo con el metodo de Merrifield (Merrifield, J. American Chemical Society, Vol 85, pp 2149- 2154 (1963)) usando BOC-chemistry en ABI # 430 (HOBt-DCC chemistry) o ABI # 431 (HBTv chemistry) sintetizadores de peptidos. La escision de peptidos protegidos de la resina fue realizado con 90% de fluoruro de hidrogeno y 10% anisol a -4 °C durante una hora. Los peptidos fueron purificados por HPLC C18 de fase inversa usando una mezcla de acido trifluoroacetico al 0,1% (TFA) en H2O y 0,1% de TFA en acetonitrilo. Los peptidos purificados fueron analizados por HPLC analftica junto con electrospray espectrometrfa de masas y por analisis de aminoacidos. Estos peptidos fueron utilizados como sales de trifluoroacetato.

Set de tubos desechables Isolex 300i

El Set de tubos desechables Isolex 300i es de un solo uso, esteril, no pirogenica, sistema cerrado de via de fluido (Baxter) se utiliza con el sistema magnetico de seleccion de celulas (Isolex 300i), y es almacenado a temperatura ambiente (RT) antes de su uso. Contiene un conjunto de membrana de hilado, bolsas de transferencia, colectores de tubos, bolsas de recogida, contenedores de separacion primaria y secundaria, y tubos para permitir conexiones

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asepticas. El set de tubos desechables ISOLEX se esterilizan por irradiacion gama.

Cadena Alfa Peptido CD8 - AAEGLDTQRFSG (SEQ ID NO.83)

[0107] La cadena ligera alfa de peptido CD8 (AAEGLDTQRFSG; SEC ID NO.83) es purificada y fabricada bajo los estandares de cumplimiento GLP. La cadena ligera alfa de peptido CD8 se utiliza en los procesos de aislamiento de celulas T CD8+ para liberar celulas T CD8+ capturadas usando un anticuerpo anti-CD8 (37B1A) y el Sistema Magnetico de Seleccion de Celulas Isolex 300i . Cada lote de peptido es fabricado por Synpep Corporation para cumplir con los estandares de calidad farmaceutica, y es probado para la secuencia, la pureza, el peso molecular, y la apariencia del peptido. La cadena ligera alfa de peptido CD8, recibido como un polvo, se procesa adicionalmente para crear una solucion stock de 10 mg/ml. Esta solucion stock es diluida en DPBS, es filtrada a traves de un filtro de 0.2-mm, es dividido en alfcuotas viales esteriles y es almacenada de -72 ° C a -88 °C antes de su uso. La colocacion de un vial de reactivo peptfdico es realizada en una sala limpia clase 10.000 en condiciones asepticas en una cabina de bioseguridad de clase II.

Tampon Fosfato Salino Dulbecco (DPBS), 1X concentration

[0108] Se almacena una solucion tampon fosfato salino de Dulbecco, esteril, no-pirogenico (DPBS) (Invitrogen Corporation)

a temperatura ambiente antes de su uso. DPBS se utiliza para los siguientes procedimientos: funcionamiento del sistema de seleccion celular magnetica Isolex 300i durante la seleccion de las celulas T CD8+ y celulas T CD8; el lavado de las celulas no-adherentes durante las etapas de reestimulacion y el lavado del anticuerpo monoclonal no unido OKT3 durante la expansion no especffica; y la dilusion de p2 microglobulina humana, IL-7, peptido CD8, y OKT3.

Solucion anticoagulante citrato de sodio

[0109] Se almacena una solucion anticoagulante de citrato de sodio esteril, no pirogenica, USP (Baxter Fenwal), a temperatura ambiente (RT) antes de su uso. La solucion de citrato de sodio se utiliza como un tampon aditivo para ejecutar el Sistema de Seleccion Magnetica Isolex 300i para la seleccion de las celulas T CD8+ y celulas T CD8.

Frascos T-75 sin airear

[0110] Se utilizan frascos T-75 sin airear para el cultivo de celulas huesped y de las xCPA. Los frascos de cultivo de celulas tratadas tienen un area de superficie de 75 cm2 y son esteriles, no pirogenico, y hechos de un material de poliestireno claro. Los frascos T-75 se esterilizan mediante radiacion gamma y se certifican para cumplir con la garantfa de esterilidad de 10-5 y la presencia de pirogenos a < 0,5 EU/mL. Los frascos T-75 se almacenan a temperatura ambiente cuando no estan en uso.

Medio Drosophila de Schneider (concentracion 1X)

[0111] Medio Drosophila de Schneider es un medio de cultivo utilizado para el cultivo de celulas de Drosophila Cada lote de medio se prueba por el proveedor (Invitrogen Corporation) molaridad, pH, esterilidad, y la capacidad de sostener el crecimiento de celulas de Drosophila El medio Drosophila de Schneider se almacena de 2 °C a 6 °C antes de su uso.

Geneticina (G418) (50 mg/mL)

[0112] Geneticina (Invitrogen Corporation) es un antibiotico selectivo utilizado en el cultivo de celulas de Drosophila para el mantenimiento de la expresion de moleculas exogenas codificadas por el acido nucleico xenogenico Geneticina se suministra como una solucion madre esteril, y se almacena de 2 a 6 °C antes de su uso.

HYQ SFX Medio de insecto (1X concentracion)

[0113] Medio para insecto Hyclone SFX (Hyclone Corporation) es un medio de cultivo libre de suero utilizado durante la carga de peptido de los xCPA, y se almacena a 2 ° C a 6 ° C antes de su uso. Este medio no contiene productos de origen bovino.

Cobre (II) pentahidratado de sulfato (CuSO4)

[0114] El sulfato de cobre pentahidrato se usa para la induccion de celulas huesped modificadas para expresar HLA humano, co-estimuladoras, y moleculas de adhesion. El reactivo se recibe como un polvo cristalino. La solucion stock se formula mediante la disolucion de CuSO4 en la endotoxina libre agua esteril para conseguir una concentracion de 200 mM y filtrar la solucion asepticamente a traves de un filtro de 0,2-mm en

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un recipiente esteril en una cabina de bioseguridad de clase II. La solucion stock filtrada se almacena de 2 °C a 6 °C antes de su uso.

Cloruro de calcio hidratado (1M)

[0115] El cloruro de calcio hidratado se utiliza para la coagulacion de plasma autologo obtenido a partir del producto aferesis linfatica para generar suero autologo utilizado en los procesos de aislamiento o de activacion de celulas T CD8+. Se recibe el cloruro de calcio hidratado como un polvo cristalino, se agrava en una solucion stock, y es almacenada de 2 °C a 6 °C antes de su uso. La solucion stock es formulada mediante la disolucion de cloruro de calcio en agua asepticamente esteril libre de endotoxinas y filtrada a traves de un filtro 0,2-mm en un recipiente esteril en una cabina de bioseguridad de clase II.

Agua destilada

[0116] EL agua destilada del cultivo de celulas, el cual se obtiene por la membrana de filtrado y la endotoxina de deteccion (Invitrogen Corporation), se utiliza como disolvente para la preparacion de soluciones stock de sulfato de cobre, cloruro de calcio, y la interleucina-2 (IL- 2) y es almacenada a temperatura ambiente antes de su uso.

Acido acetico (17.4M)

[0117] El acido acetico utilizado para la preparacion de soluciones stock de IL-2 se obtiene de Sigma Corporation y se almacena a temperatura ambiente antes de su uso.

FICOLL-PAQUE ® Plus (1X concentracion)

[0118] Despues del aislamiento de las celulas T CD8 + y celulas CD8 T con el sistema de seleccion celular

magnetica Isolex 300i, la fraccion de las celulas mononucleares de la no-CD8 + son fraccionadas adicionalmente utilizando Ficoll-Paque ® Plus, un reactivo de Ficoll sin componentes de origen animal disponible de Amersham Pharmacia Biotech utilizado para eliminar las celulas muertas, neutrofilos, y celulas rojas de la sangre. El reactivo se almacena a temperatura ambiente antes de su uso. PENTASPAN® (1X concentracion) PENTASPAN® (B. Braun Medical Inc) es una solucion esteril de 10% de pentastarch en cloruro de sodio al 0,9% para uso

clfnico (NDC 0264-1972-10), y se almacena a temperatura ambiente antes de su uso. Se utiliza como un crioprotector en la criopreservacion de las celulas CD8 T aisladas y celulas T CD8+.

Sulfoxido de dimetilo (DMSO), 1X concentracion

[0120] DMSO se usa como crioprotector en la criopreservacion de las celulas CD8 T aisladas y celulas T CD8+. La solucion de DMSO, disponible de Sigma-Aldrich, se almacena a temperatura ambiente antes de su uso.

Medio de cultivo RPMI (1X concentracion)

[0121] El medio de cultivo RPMI (Invitrogen Corporation), el cual es un suero y libre de antibiotico, se utiliza para cultivar celulas T. El medio de cultivo RPMI se almacena de 2 a 6 C antes de su uso.

L-Glutamina (200mM: 100X concentration)

[0122] L-Glutamina (USP), 200 mM, disponible de Invitrogen Corporation, se utiliza como suplemento de medio de cultivo RPMI, y se almacena a -80 °C antes de su uso.

Solucion de piruvato sodico MEN (100 mM: 100X concentracion)

[0123] Solucion piruvato de sodio MEM (100 mM), disponible de Invitrogen Corporation, se utiliza para complementar medio RPMI, y se almacena de 2 a 6 °C antes de su uso.

Aminoacidos no- escenciales (10mM: 100X concentracion)

[0124] Aminoacidos no-esenciales de Invitrogen Corporation utilizados para complementar medio RPMI se almacenan de 2 a 6 °C antes de su uso.

Solucion tampon HEPES, (1M: 200X concentracion)

[0125] Solucion tampon HEPES (Invitrogen Corporation), utilizado para complementar medio RPMI, se almacena de 2 °C a 6 °C antes de su uso.

Frascos T-75 - Aireados

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[0126] Frascos T-75 aireados se utilizan en la estimulacion y la re-estimulacion de celulas T CD8+.

Los frascos de cultivo de celulas tratadas tienen una superficie de 75 cm2, son esteriles, no pirogenicos, y hechos de un material de poliestireno claro. Los frascos se almacenan a temperature ambiente antes de su uso. Cada frasco tenia un tapon de polietileno aireado con un orificio de ventilacion de aire hidrofobo PTFE 0.2-mm. Los frascos T-75 son esterilizados por irradiacion gama.

Medio celular X-Vivo 10 (1X concentracion)

[0127] El medio de cultivo de celulas X-vivo 10, suministrado por BioWhittaker, se almacena de 2 °C a 6 °C antes de su uso. Este medio, que es un suero, al rojo fenol y libre de antibioticos, se utiliza durante la fase de expansion no especifica de las celulas T activadas por la exposicion a los xCPA cargadas con peptido.

Medio de Leibovitz L-15 sin glutamina(1X concentracion)

[0128] Medio de Leibovitz L-15 (sin L-glutamina), un medio de cultivo celular disponible de Sigma-Aldrich, se almacena de 2 °C a 6 °C antes de su uso durante los pasos de carga de peptido en el proceso de activacion de celulas T.

Frascos T-225 - Aireados

[0129] Frascos T-225 aireados se utilizan en estimulacion OKT®3 de celulas T durante la expansion celular de las celulas T no-especificas. Los frascos de cultivo de celulas tratadas tienen una superficie de 225 cm2, estan hechos de un material de poliestireno claro, esterilizados por irradiacion gama. Cada frasco tiene un tapon de polietileno aireado con un orificio de ventilacion de aire hidrofobo PTFE 0,2-mm. Los frascos se almacenan a temperatura ambiente antes de su uso.

Bolsas de cultivo de tejido LifeCell 3-litros

[0130] Bolsas esteriles de un solo uso LifeCell con capacidad de 3000mL se almacenan a temperatura ambiente antes de su uso.

Inyeccion de Cloruro Sodico 0,9%

[0131] Solucion de cloruro sodico 0,9%, USP, disponible de Baxter Fenwal Laboratories, se utiliza para procedimientos de lavado de celulas durante la recoleccion de las celulas T. La solucion, que es esteril, no pirogenico, y libre de componentes animales, se almacena a temperatura ambiente antes de su uso.

Dextrosa 5% y solucion de cloruro sodico 0,9%

[0132] Solucion inyectable de dextrosa de 5% y cloruro sodico de 0,9%, USP (Baxter Fenwal Laboratories), se obtiene como una solucion esteril, no pirogeno libre de componentes animales. La solucion, la cual es utilizada como un tampon de almacenamiento para las celulas T activadas, se almacena a temperatura ambiente antes de su uso. Solucion lactica de

Ringer 0,9%

[0133] Solucion lactica de Ringer 0,9%, USP (Baxter Healthcare Laboratories), que es una solucion esteril, endotoxina-baja

de cloruro de calcio, cloruro de potasio, cloruro de sodio y lactina de sodio en agua para inyeccion (libre de componentes de origen animal), se almacena a temperatura ambiente antes de su uso en la cosecha y suspension de celulas T.

Bolsa de producto final

[0134] Las bolsas de productos finales utilizados para contener las celulas T activadas y procesadas son de un solo uso, las bolsas de infusion esteriles con una capacidad de 1000 mL compuestas de plastico biocompatible. Las bolsas se almacenan a temperatura ambiente antes de su uso y disponible de los laboratorios Baxter Fenwal.

Cryotubes NUNC® 1,8 mL

[0135] Los criotubos NUNC® (1,8 mL) puede ser usados para congelar las celulas huesped, las xCPA, y las celulas excedentes T CD8+ generadas durante el proceso de activacion.

Linfocitos humanos de sangre periferica

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[0136] Los productos de aferesis linfatica se recogen de sujetos humanos diagnosticados con melanoma y se almacenan a temperatura ambiente antes de su uso para generar un producto celular especffica del paciente, autologos.

Suero autologo humano

[0137] El suero autologo humano se utiliza como una fuente de protefna para el cultivo de celulas T aisladas. El plasma autologo humano se prepara a partir del producto de aferesis linfatica mediante la adicion de cloruro de calcio para lograr la coagulacion de la fibrina y luego recoger la fase de suero lfquido. La fase de suero lfquido recogido se almacena a 4 °C para un corto plazo y a -80 °C para el almacenamiento a largo plazo.

Banco maestro de celulas Drosophila

[0138] Una lfnea de las xCPA de Drosophila derivada del clon B xenogenico de Drosophila, el cual se utiliza como stock de semillas para crear un cultivo continuo de XCPA de Drosophila, se obtiene como se describe a continuacion.

Suero fetal bovino

[0139] El suero bovino fetal (FBS), el cual se utiliza como fuente de protefnas para el crecimiento de celulas huesped o celulas xCPA, se almacena a -80 °C. El FBS, disponible en Gemini Bioproducts, se procesa a partir de la sangre fetal bovina procedente de animales de origen estadounidense. Los animales maternos de los que deriva la sangre estan libres de enfermedades infecciosas y contagiosas, y parasitos perjudiciales.

Anticuerpo monoclal Anti-CD8 (37B1A), 10.0mg/mL

[0140] Anti-CD8(37B1A) es un anticuerpo monoclonal murino (mAb) dirigido contra el antfgeno CD8 de las celulas T, es utilizado para seleccionar las celulas T CD8+ con el Sistema de Seleccion Celular Magnetica Isolex 300i. La solucion concentrada se diluye en DPBS esteriles para usar en procesos de aislamiento de celulas o de activacion T CD8+. La solucion a granel se filtra a traves de un filtro de 0,2-hm y luego se divide en alfcuotas en viales de un solo uso en una sala limpia clase 10.000 en condiciones asepticas en una cabina de bioseguridad de clase II. Las alfcuotas se almacenaron a -80 °C antes de su uso.

[0141] El anti-CD8 (37B1A) mAb se genero mediante la fusion de los esplenocitos de raton libres de patogenos Harlan Sprague Dawley Balb/c inmunizado con un peptido de cadena ligera alpha CD8 (AAEGLDTQRFSG; SEQ ID NO.83) con fnea celular no-secretora de mieloma P3x63Ag8.653 (American Type Culture Collection CRL-1580). Un informe de Anmed/Bi-osafe, Inc. indico que la lfnea de celulas CRL-1580 dio negativo para la predencia de virus murinos indfgenas y micoplasma. Los hibridomas se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal definido inactivado por calor (Hyclone SH 30070, lote AJA9530) el cual fue negativo para bacterias, hongos, virus y micoplasma. El clon 37B1 fue seleccionado por su capacidad de producir un anticuerpo que tine las celulas CD8+ humanas (evaluada por citometrfa de flujo). Este hibridoma fue posteriormente subclonado mediante una tecnica de dilucion limitante. Un subclon, 37B1 A, fue ampliado, congelado y almacenado a -140 °C.

[0142] Para generar el 37B1 A mAb purificado, una parte alfcuota de celulas congeladas se descongelo y expandio en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal. definido. El porcentaje de suero en el medio se redujo progresivamente y las celulas se adaptaron al cultivo en el medio libre de suero (Gibco-BRL 12045-076). La escalada de celulas se logro en un dispositivo de fibra hueca (Cellmax), siguiendo las instrucciones del fabricante. El crecimiento de las celulas se consigue utilizando el mismo medio libre de suero (Gibco-BRL 12045-076, lote 1066388) que se utiliza para la adaptacion. El medio acondicionado se recogio y el anticuerpo monoclonal se purifico por cromatograffa columna de flujo rapido en una protefna G con Sepharosa 4 (Pharmacia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las celulas utilizadas para la escalada confirmaron que eran micoplasma negativo cuando fueron probadas por el metodo de PCR-ELISA (Boehringer-Mannheim cat. No. 1 663 925). El anticuerpo se eluyo de la columna de la protefna G con un tampon de pH bajo (0,1 M citrato, pH 3,0) y despues se neutralizo mediante la adicion de Tris base. El anticuerpo purificado con protefna G despues fue inactivado por calor a 56 °C durante 30 minutos.

[0143] Contaminantes de alto peso molecular, tales como anticuerpos agregados, se eliminaron por filtracion en gel en Sephacryl S300 de alta resolucion (Pharmacia) siguiendo las instrucciones del fabricante. 37B1A mAb se purifico adicionalmente por cromatograffa de intercambio de iones en una columna de flujo rapido Q Sepharose (Pharmacia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Despues de la cromatograffa de intercambio ionico, 37B1A mAb prurificada, se dializo contra el tampon fosfato salino de Dulbecco (DPBS), se esterilizo por filtracion de membrana (filtro 0.2 mm), se ajusto a una concentracion de 10,0 mg/ml mediante la adicion de DPBS esteriles, y se congelo en alfcuotas almacenadas a - 80 °C.

[0144] El stock de celulas de hibridoma 37B1A fueron probadas y resultaron negativas para los agentes

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retrovirales. Ademas, para asegurar la ausencia de micoplasmas, bacterias y endotoxinas, la prueba se llevo a cabo en cada lote de anticuerpos monoclonal murino anti-CD8 utilizado en preparaciones clfnicas. Los lotes 37B1A mAb prurificados se prueban para la pureza (SDS-PAGE), la esterilidad, contenido de endotoxinas (LAL cromogenico), la contaminacion por micoplasmas (PCR ELISA) y afinidad celular CD8+ humanos (citometrfa de flujo).

DYNABEADS® M-450 Oveja Anti-IgG de raton (SAM) IgG

[0145] DYNABEADS® M-450 (SAM) IgG son perlas paramagneticas esteriles recubiertas con anti-IgG de raton policlonal de oveja que se unen al IgG principal del raton. DYNABEADS® disponible en Baxter Oncology Inc, se almacenan a 4 °C antes de su uso en el aislamiento de celulas T mediante el Sistema de Seleccion Celular Magnetica Isolex 300i.

Beta-2 Microglobulina humana recombinante (B2M)

[0146] Beta-2 microglobulina humana (p2M) es una protefna plasmatica humana producida mediante tecnologfa de ADN recombinante que se recibe como un concentrado y despues se diluye en DPBS esteriles para alcanzar una concentracion de 1,0 mg/mL. La solucion a granel se filtra a traves de un filtro de 0.2-mm, se divide en alfcuotas en viales esteriles y se almacenan a - 80 °C antes de usar durante la preparacion y la carga de peptido de las xCPA y la carga de peptido de celulas adherentes.

Interleucina-7 (IL-7) humana recombinante, 30,000 U/mL (1.000X concentracion)

[0147] La interleucina-7 (IL-7) humana recombinante es una linfocina producida en E. coli y purificada por el proveedor (Pepro-Tech) mediante cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC), pero no anticuerpos. La IL-7, se recibe como un polvo, se diluye en DPBS esteriles que contienen 1% de albumina de suero humano. La solucion a granel se filtra a traves de un filtro de 0.2-mm, alfcuotas en viales esteriles y almacenadas a - 80 °C antes de su uso.

Interleucina-2 (IL-2) humana recombinante (Proleukin®), 20,000 U/mL (1,000 X concentracion)

[0148] La interleucina-2 (IL-2) humana recombinante es una linfocina aprobada para uso clfnico producido por tecnologfa de ADN recombinante y suministrado por Chiron Corporation. La IL-2, se recibe como un polvo, se diluye en IL-2 diluyente (0,5% de albumina de suero humano en 50 mM de acido acetico), es filtrado a traves de un filtro de 0,2 mm, se divide en alfcuotas en viales esteriles, y despues se almacena a - 80 °C antes de su uso.

Orthoclone OKT®3 Solucion esteril, 1,0 mg/mL(OKT3)

[0149] Orthoclone OKT®3, un anticuerpo monoclonal murino especffico para el antfgeno CD3 de celulas T suministrados en ampolletas como una solucion esteril aprobado para uso clfnico (disponible en Ortho Biotech), se divide en alfcuotas en viales de un solo uso, en condiciones esteriles y se almacenan congeladas a - 80 °C antes usar en la activacion de celulas T. Informacion sobre los productos OKT3, incluyendo dosis y administracion asf como referencias de los metodos de preparacion, se proporcionan, por ejemplo, Reinherz et al., Cell, 19(4):821-827 (1980); Chatenoud et al., J. Immunology, 137(3):830-838 (1986); and Physicians' Desk Reference, pp. 1553-1554 (1990).

25% Albumina de suero humano (HSA)

[0150] 25% HAS, USP (Baxter Fenwal Laboratories; la fuente de plasma para cada lote puesto a prueba es negativo para el VIH-1 VIH-2, VHC y VHB), se almacena a temperatura ambiente antes de su uso como fuente de protefna tamponada durante la siguiente preparacion de celulas T y la activacion de los pasos: purificacion de celulas T CD8+ y celulas CD8 T; carga de peptido de celulas adherentes; y la formulacion final de las celulas T activadas. PREPARACION DE LAS CPAA Lfneas celulares derivadas de las CPAA

[0151] Las lfneas de CPA xenogenica se generaron a partir de celulas Schneider (celulas SC2), que fueron establecidas originalmente en 1969 de varios cientos de 20 a 24 horas de edad, embriones Oregon-R (tipo salvaje) Drosophila melanogaster (Oregon-R) (American Type Culture Collection (ATCC) CRL-1963) de acuerdo con procedimientos publicados (Schneider, J. Embryol. Morph. 27: 353-365, 1972), y depositado en la ATCC (CRL10974). Con el fin de generar las xCPA, las celulas S2 fueron transfectadas con los vectores derivados del vector plasmido pRmHa-3 (vease U.S. Patent No. 6,225,042 respecto a la construccion y el uso de vectores de plasmido pRmHa). Una lfnea de xCPA, designado aquf como clon A, se transfecto con vectores que codifican HLA- A2.1 de clase I, B7.1 e ICAM-1. Una segunda lfnea de xCPA, designado aquf como clon B, se transfecto con vectores que codifican HLA-A2.1 de clase I, B7.1, B7.2, ICAM-1, y LFA-3. Una tercera lfnea celular de xCPA, designado aquf como clon C, se transfecto con vectores que codifican HLA-A2.1 de clase I, B7.1, ICAM-1, LFA-3 y CD70. Por lo tanto, el clon A expresa HLA-A2, B7.1 e IcAm-1, el clon B expresa HLA-A2.1 de clase I, B7.1, B7.2, ICAM-1 y LFA-3, y el clon C expresa HLA-A2.1 clase I, B7.1, ICAM-1, LFA-3, y CD70.B7.2 y LFA-3.

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Mantenimiento de la linea celular de la CPAA, induccion y carga de peptido

[0152] Los cultivos continuos independientes del clon A y las celulas del clon B descendiente se mantuvieron en medio de Schneider suplementado con 10% de suero fetal de ternera y 500 mg/ml de geneticina (G418), y se dividieron dos veces a la semana con medio fresco anadido durante cada division para ajustar densidad celular de aproximadamente 1 x 106 celulas/mL. Aproximadamente un dfa antes de la induccion (dfa -2- a -4; el dfa 0 se define como el dfa donde se ponen a prueba las celulas para la expresion de moleculas exogenas y se cargan con el peptido), 3 frascos x T-75 se inocularon con un volumen de suspension celular mantenidos en cultivos de stock equivalentes a 1,5 x 107 celulas/frasco. Se anadio medio completo Drosophila-SFM sin G418 para llevar el volumen hasta 15 ml/frasco. Los frascos se incubaron despues en una camara a aproximadamente 27 °C. En el dfa -1 a -3 aproximadamente, las celulas se indujeron por adicion de sulfato de cobre (CuSO4) a una concentracion final de 1,0 mM (1: 200 dilucion de stock 200 mM de CuSO4; 75 pl de CuSO4 para cada frasco T75 conteniendo 15 ml de suspension de celulas) y devuelto a la camara de 27 °C. El tiempo de induccion duro aproximadamente de 24 a 72 horas.

[0153] En el Dfa 0, los frascos que contenfan cultivos de celulas inducidas fueron comprobados visualmente y microscopicamente para la evidencia de contaminacion. Los frascos no contaminados se agruparon y las celulas viables fueron contadas. Las muestras de cultivos de celulas agrupadas de aproximadamente 6 x 106 celulas fueron evaluadas por citometrfa de flujo utilizando el analisis de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia asistida (FACS) para determinar el nivel de expresion de moleculas exogenas. Los cultivos de celulas (aproximadamente 1 x 107 celulas/mL) luego fueron probadas para verificar la expresion exogena de HLA-A2.1, b7.1 e ICAM-1 (para celulas clon A) o HLA-A2.1, B7.1, B7.2, ICAM-1 y LFA-3 (para celulas clon B) antes de la cargad del peptido. Una vez que la expresion de moleculas exogenas se verifico, cada cultivo celular se lavo mediante el fraccionamiento de cada cultivo en dos tubos conicos de 50 ml esteriles. A continuacion, cada tubo se lleno con medio HYQ SFX de insecto y se centrifugo a 1700 rpm (600 x g) durante aproximadamente siete minutos para sedimentar las celulas. Los sobrenadantes fueron descartados, y los tubos que contenfan sedimento de celulas se centrifugaron de nuevo a 1700 rpm (600 x g) durante aproximadamente un minuto. Los sobrenadantes se retiraron con una pipeta de punta fina. Los sedimentos de cada cultivo de celulas de division se recombinan y se vuelven a suspender en 8 mL de medio de insectos SFX a una densidad celular de aproximadamente 1 x107 celula/mL. Aproximadamente 40 mL de solucion stock de p2 microglobulina a 1,0 mg/mL y 24 mL de 1:50 de una solucion stock peptido combinado de 1,67 mg/mL para cada peptido fue anadido a cada cultivo que se resuspendio. Por lo tanto, cada suspension de cultivo celular contenfa p2 microglobulina a una concentracion final de aproximadamente 5 mg/mL y cada peptido seleccionado para ser cargado en las XCPA a una concentracion final de aproximadamente 0,1 mg/mL por peptido. Los cultivos celulares fueron incubados en la suspension que contiene p2 microglobulina y peptidos durante al menos cuatro horas y no mas de ocho horas, con agitacion cada 30 minutos a temperatura ambiente. Despues del perfodo de incubacion del peptido, aproximadamente de 1-mL alfcuotas de cada cultivo de celulas fueron distribuidas por separado en ocho tubos de polipropileno (Falcon 2006). Cualquier suspension de cultivo celular residual fue desechado.

PROCEDIMIENTOS

Ejemplo 1: Caracterizacion de las xCPA de Drosophila Pruebas de microplasma y virus adeventicios.

[0154] Las pruebas se realizaron por BioReliance para micoplasmas y virus contaminantes. El banco de celulas madre de Drosophila xCPA se determino que era libre de micoplasmas y virus adventicios de acuerdo con un panel de pruebas de seguridad estandar, como se indica en la Tabla I: Tal como se utiliza aquf, el termino "esencialmente libre de contaminacion" se refiere a cultivos celulares que son esencialmente libre de agentes contaminantes, incluyendo acidos nucleicos, bacterias, virus y micoplasma, particularmente bacterias vivas, virus de infecciones y micoplasmas.

Tabla I: prueba de Drosophila xAPCs.

Objetivo: Test Especificacion

Contaminacion microbiana: Micoplasmas Negativo

: In Vitro (14 dfas y 42 dfas)

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(continuado)

Objetivo: Test Especificacion

Virus adventicios: Indicador de lfneas celulares: MRC-5 Vero Negativo

in Vivo Ratones adultos y lactantes Conejillos de Indias Huevos: Negativo

Retrovirus: Microscopio electronico de Negativo

Transcriptasa inversa: Negativo

[0155] No se detectaron contaminantes virales adventicios cuando la linea celular xCPA de Drosophila se inoculo en celulas indicadoras, y las celulas fueron observadas durante 14 dfas para el efecto citopatico, hemadsorcion y hemaglutinacion. El tiempo de incubacion del ensayo se extendio a un total de 42 dfas por lo que fue mayor que el tiempo de 31 dfas de cultivo ex vivo de celulas efectoras CD8+ durante la fabricacion del producto de terapia celular que se describe a continuacion. Los contaminantes virales adventicios no se detectaron en las xCPA de Drosophila durante el tiempo en este ensayo extendido que duro la incubacion.

[0156] Co-cultivo de las xCPA de Drosophila con lfneas indicadoras de insectos (Drosophila melanogaster y Aedes albopictus) resulto en la transmision tanto de Drosophila X y HPS-1 como virus presentes en las xCPA de Drosophila a la linea de Drosophila, pero no a la linea de mosquito usado. Tanto las lfneas de Drosophila y mosquito utilizadas como celulas indicadoras fueron positivos para nodavirus, por lo que es imposible evaluar la transmision de nodavirus de las xCPA de Drosophila a las lfneas de celulas indicadoras utilizadas.

Pruebas para la transcriptasa inversa retroviral.

[0157] Pruebas para confirmar la ausencia de la actividad transcriptasa inversa retroviral (RRT) se realizo en las xCPA

Drosophila en BioReliance. La linea de xCPA se puso a prueba para detectar la presencia de Mn ++ - ++ y Mg - transcriptasa inversa retroviral dependiente. No se detecto evidencia de la presencia de estas transcriptasas inversas retrovirales.

[0158] Microscopfa electronica de transmision (TEM) realizado en las xCPA de Drosophila por un laboratorio de servicio revelado la presencia de particulas similares al virus (VLP), en ambos nucleos (20/100 celulas, 40-45 nm de diametro, que se asemejan Papovavirus) y el citoplasma (1/100, C30nm que se asemeja Nodavirus) de las celulas. Posterior al analisis TEM de los xCPA de Drosophila en otro laboratorio de servicio, no detecto particulas similares a retrovirus identificables; sin embargo, se observaron VLP con caracterfsticas consistentes con Reovirus en las celulas, pero no pudieron ser identificados positivamente. Debido a las discrepancias en los tipos de particulas virales identificadas por los dos laboratorios, las pruebas se repitieron utilizando muestras de ambos, de las xCPAs de Drosophila y de la linea celular madre Schneider S2 (SC2). Las celulas tambien fueron enviados a un tercer laboratorio de servicio. Los resultados de esta tercera evaluacion mostraron que las tres lfneas contenfan los mismos tipos de particulas virales de los dos, o posiblemente de los tres tipos:

1) 30 nm de particulas grandes encontradas en el nucleo en el 90% de las celulas con cantidades que varfan de <5 partfculas/seccion para gran acumulacion de particulas que forman las matrices cristalinas. Las particulas eran mas consistentes con un virus de la familia de parvovirus, el genero densovirus, tambien conocido para infectar lfneas de celulas de insectos;

2) 50 nm particulas grandes encontradas exclusivamente en el citoplasma. Aunque son mas diffciles de detectar, estas particulas fueron

menos frecuentes que la primera. Eran densas de electrones y tambien se formaron matrices cristalinas en el citoplasma. Eran posibles particulas Reovirus replicadas en el citoplasma, y conocidas por infectar lfneas de celulas de insectos; y 3

3) 15~20nm de particulas grandes densas de eletrones en el citoplasma de algunas de las celulas observadas, se cree represents a cualquiera de las estructuras celulares de la acumulacion de protefnas virales o particulas posiblemente Nodavirus similares.

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[0159] La presencia de los mismos VLP en la linea parental obtenido de la ATCC indico que estaban presentes antes del establecimiento de las lfneas xCPA. El analisis TEM revelo VLP tanto en el nucleo como en el citoplasma de la linea 2 de celulas de Drosophila. Las particulas estaban presentes en la mayoria de secciones de las celulas, aunque el numero visto vario de una sola particula a grandes agregados, similares a los resultados reportados anteriormente para clones SC2 y la linea de xCPA de Drosophila. Las celulas crecieron vigorosamente a pesar de la presencia de las particulas, y la naturaleza de la relacion de las particulas a la celula se mantuvo desconocida en ese momento. Un resumen de las pruebas y de los resultados obtenidos en el analisis de la linea de Drosophila melanogaster patente SC2, y dos lfneas de xAPC Drosophila se resumen en la Tabla II:

Tabla II:

Analisis de SC2, linea A xAPC,: y linea B xAPC

Test: SC2 Drosophila linea A APC Drosophila linea A APC

Micoplasmas: ND1 Negativo Negativo

TEM2: Positivo para VLPs3 Positivo para VLPs Positivo para VLPs

Actividad RRT4: ND ND Negativo

Contaminantes virales (in vitro)5 14 dias de ensayo: ND Negativo Negativo

Contaminantes virales (in vitro)5 42 dias de ensayo: ND Negativo ND

Contaminantes virales (in vivo)6: ND ND Negativo

Test: SC2 Drosophila linea A APC Drosophila linea A APC

1no determinado 2Microscopio electronico de transmision 3Particulas como-virus (identificada como densovirus y reovirus por estructura, tamano y localization) 4Actividad transcriptasa inversa retroviral 5Ensayo para la detection de contaminantes virales adventicios sobre lineas celulares indicadoras cuando los articulos de prueba son inoculados 6Ensayo para la deteccion de virus, que no provocan un efecto perceptible en sistemas de cultivo celular

[0160] La linea A de la xCPA de Drosophila se eligio para una caracterizacion adicional y usada como una xCPA en el resto de los ejemplos. Por consiguiente, la linea A de la xCPA de Drosophila se denominara mas adelante como xCPA de Drosophila , o xCPA, a continuacion.

Aislamiento y caracterizacion de particulas similares a virus de la linea A de la xCPA de Drosophila

[0161] Los VLP se sedimentaron a partir del lisado de la xCPA de Drosophila, y se purificaron por centrifugacion de equilibrio en gradientes de densidad de CsCl. Los VLP anillados en densidades de 1,30 g/mL,

1,36 g/mL, y 1,41g/mL. Particulas purificadas se analizaron por microscopfa electronica, SDS/PAGE, extraccion de acidos nucleicos y secuenciacion. Tincion negativa de estas fracciones, seguido por microscopfa electronica de transmision dirigida a la observacion de tres tipos de particulas en las fracciones:

1) La fraccion en densidad 1,41 consistfa en particulas no-envueltas, icosaedricas de aproximadamente 42 nm de diametro. Esas particulas fueron consistentes con las particulas observadas en el nucleo de las celulas y se cree que es densovirus-similar;

2) la fraccion a una densidad de 1,36 consistfa en particulas no-envueltas de aproximadamente 30 nm de diametro, y se confirmo que las estructuras observadas en el citoplasma de algunas celulas no eran resultado de la acumulacion de protefnas virales, sino mas bien de la acumulacion de particulas, muy probablemente de la familia Nodaviridae; y

3) la fraccion en densidad 1,30 consistfa en particulas no-envueltas, icosaedricas de aproximadamente 42 nm de diametro identico al de las particulas de densidad 1,41. Ademas, se encontraron unas pocas particulas icosaedricas de mayor tamano (60 nm) en esta fraccion y fueron consistentes con las particulas observadas en el citoplasma de las celulas y se cree que es reovirus-similar.

[0162] Los resultados del analisis de VLP se resumen en la Tabla III:

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Tabla III

Caracterizacion de particulas virales purificadas de Drosophila xAPC

Densidad (g/mL): Candidato virus Tamano Protefnas Acido nucleico Analisis de secuencia de ADN

1.41: como HPS-1 42nm -100 kD dsRNA (6 kb) 28% homologo a ARN polimerasa dependiente de

1.36: Drosophila Nodaviridae 30nm 43 kD ssRNA (3.0 kb + 1.2 kb) 88% homologo a FHV1, BBV2 & BV3

(continuado)

Caracterizacion de particulas virales purificadas de Drosophila xAPC

1.304: HPS-1 vacia como el virus X 42nm 60nm -100 kD No acido nucleico N/A ND

1FHV=Flock House Virus (Insect Nodavirus) 2BB= Black Beetle Virus (Insect Nodavirus) 3BV= Boolarra virus (Insect Nodavirus) 4Dos tipos de particulas identificadas; particulas de 60nm representan 1: 100 de la preparation purificada ND = no determado; N/A = no aplicable

Densidad de particulas 1,41

[0163] Basandose en el analisis de protefnas y acidos nucleicos, la densidad de particulas 1,41 no parecen pertenecer al

genero Densoviridae, que se caracteriza por dsDNA entre 4 y 6 kb y al menos tres protefnas estructurales en el intervalo de 40 a 90 kd. Fue realizada la secuenciacion N-terminal del polipeptido de 100 kd y la secuencia de amino acido utilizada para clonar la secuencia N-terminal homologa del genoma viral. El analisis de secuencia mostro esta novedosa proteina, con 28% de homologfa con ARN polimerasa dependiente - ARN viral El analisis de espectrofotometria de masas (MALDI-MS) confirmo la novedad de esta proteina tambien. Digestion trfptica y secuenciacion de Edman de peptidos purificados a partir de la proteina de 100 kd confirmaron los datos de acidos nucleicos. Analisis basado en RNasa y DNasa del acido nucleico viral purificado se confirmo que el genoma era de hecho dsRNA y no dsDNA, eliminando asf densovirus como uno de los tres virus de insectos. Estas observaciones eran mas consistentes con el virus HPS-1 de las celulas de Drosophila SC2 descrito por Scott et al (vease p.ej., Scott et al., Cell, Vol. 33 (3), pp. 929-941 (1980)). Este virus fue descrito con 36 nm de diametro viriones no- envueltos presentes principalmente en el nucleo de las celulas infectadas. Particulas purificadas se encontraron a una densidad de 1,41 y contenfan un unico segmento de dsRNA de aproximadamente 6 kb de longitud, asociado a una proteina principal (120 kd) se cree que es la cubierta de la proteina viral, junto con una proteina menor (200 kD).

[0164] Fue desarrollado un ensayo RT/PCR cuantitativo tiempo real para detectar en las celulas la presencia de HPS-1-como virus. El procedimiento da como resultado la amplificacion de una secuencia especffica de virus de 241 bases de longitud. Experimentos de adicion de plantilla viral especffico como cDNA HPS-1 preparado a partir de celulas CD8 + confirmo la sensibilidad de deteccion de virus es de entre 10-100 copias por pg de DNA.

Densidad de particulas 1,36

[0165] Analisis de las protefnas y de acidos nucleicos a partir de la densidad de particulas purificadas 1,36 confirmaron este virus es del genero Nodaviridae. Se completo la secuencia de ADN que representa ARN1 (3,0 kb) y resulto ser aproximadamente 90% homologa al virus Flock House, un virus de insecto de la familia Nodaviridae. Tambien se completo clonacion de larga duracion y secuenciacion del segmento ARN2 y la secuencia de aminoacidos N-terminal de la cubierta de proteina de 43 kd era homologa tanto con el virus de Drosophila Nodaviridae (DrNV) aislada la cubierta de proteina y el virus Flock House, tal como se indica abajo:

DrNV DNA: MVNNIKPRRQRSQRV (SEQ ID NO.80)

Proteina 43 kd: VNNIKPKRQRPQ-V (SEQ ID NO.81)

DNA Virus Flock: MVNNIKPRRQRAQRV (SEQ ID NO.82)

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[0166] Fue desarrollado un ensayo RT/PCR cuantitativo tiempo real para detectar en las celulas la presencia de virus Drosophila Nodaviridae. El procedimiento da como resultado la amplificacion de una secuencia especffica de virus de 133 bases de longitud. Experimentos de adicion de plantilla viral especffico de Nodaviridae en cDNA preparado a partir de celulas CD8+ confirmo la sensibilidad de deteccion de viruses de entre 10-100 copias por pg de ADN.

Densidad de partfculas 1,30

[0167] Extraccion de acido nucleico de partfculas en densidad de 1,30 fallo para producir ADN o ARN. El perfil de SDS/PAGE de esta preparacion era identico al obtenido para la preparacion a una densidad de 1,41. Junto con las observaciones de microscopfa electronica, estos resultados sugieren que esta preparacion se compone principalmente de partfculas virales vacfas HPS-1, con algunas partfculas de mayor tamano (60 nm) en un numero insuficiente para caracterizarse adicionalmente.

[0168] Una serie de virus del genero Reoviridae, con caracterfsticas compatibles con este tercer virus (localizacion, formacion de matrices cristalinas, y tamano) ha sido reportadas para infectar celulas de insectos, incluyendo Drosophila (vease, p. ej., Haars et al., Virology, Vol. 101(1), pp. 124-130 (1980)). Se genero un gran numero de cebadores de PCR, basada en secuencias conservadas entre los reovirus de insectos, y utilizados para cDNA preparado a partir de las xCPA de Drosophila. No se amplifico secuencia Reovirus a partir de ADNc preparado a partir de estas celulas.

[0169] Virus X Drosophila (DXV) es un virus dsRNA de la familia Birnaviridae y conocido por infectar algunas lfneas celulares de Drosophila (vease, p. ej., Shwed et al., Virology, Vol. 296 (2), pp. 241-250 ( 2002)). El virion de 60 nm tiene una densidad de flotacion de 1,34, con capsidas vacfas que sedimenta a una densidad de 1,29. El genoma consta de dos segmentos, el segmento A (3360 pb) y el segmento B (3100 pb). Un set de cebadores de PCR especfficos para DXV fue disenado y utilizado para sondear la presencia de DXV en las xCPA de Drosophila. Se obtuvo una banda de PCR amplificado de peso molecular esperado y la fraccion de secuencia amplificada (682 pb) era identica a la secuencia publicada DXV .

[0170] Ademas, algunas secuencias DXV fueron clonadas a partir de la fraccion purificada de densidad 1,36, junto con una mayorfa de secuencias de Nodaviridae. Estos resultados son consistentes con la literatura publicada, que describe partfculas infecciosas en densidades de flotacion en 1,33 a 1,34, con partfculas vacfas en 1,29. En consecuencia, las partfculas de 60 nm observadas por TEM en la fraccion de densidad de 1,30 no eran Reoviridae como cree basado en tamano y forma, pero las partfculas vacfas DVX. Esto explica la incapacidad de extraer el ADN o ARN de estas VLP.

[0171] Fue desarrollado un ensayo RT/PCR cuantitativo tiempo real para detectar en las celulas la presencia de virus Drosophila X . El procedimiento da como resultado la amplificacion de una secuencia especffica de virus originado de la poliprotefna del virus de 178 bases de longitud. Experimentos de adicion de plantilla viral especffico de DXV en cDNA preparado a partir de celulas CD8+ confirmo la sensibilidad de deteccion de virus es de entre 10100 copias por mg de DNA

Ejemplo 2: Inactivacion de las xCPAs Fijacion glutaraldehfdo

[0172] La inactivacion de celulas de Drosophila inicialmente se intento por fijacion con glutaraldehfdo en ausencia de conservante. Los xAPCs de Drosophila fijos con 0,3% de glutaraldehfdo eran capaces de proliferacion de antfgeno especffico de las celulas T CD8+ (2,5 a 6 veces menos que las celulas no fijadas), la activacion de las celulas T cD8+ (2 veces menos que las celulas no fijadas), y la generacion de celulas T CD8+ capaces de lisar las celulas diana (en menor grado que las celulas no fijadas). Por lo tanto, este procedimiento de inactivacion resulto en que las xCPAs de Drosophila habfan disminuido la funcion de la CPA con a respecto a las celulas no inactivadas por el protocolo de fijacion con glutaraldehfdo.

Ciclo de congelacion-descongelacion

[0173] En un segundo intento para inactivar a las xCPAs de Drosophila sin disminuir la funcion xCPA, se realizaron una serie de ciclos de congelacion-descongelacion. Los ciclos de congelacion conllevaron a la colocacion de las xCPAs, ya sea en nitrogeno lfquido o hielo seco (CO2 solido) hasta que las xCPAs estuvieran completamente congeladas (p. ej., durante aproximadamente un minuto), y luego eliminando las xCPAs de la forma de nitrogeno lfquido o hielo seco y permitiendo que las xCPAs regresen a temperatura ambiente. Los ciclos de congelacion- descongelacion se realizaron con las xCPAs en

medios que carecfa de conservante, dimetilsulfoxido conservante (DMSO). Este metodo dio como resultado 100% celulas no viables (es decir, muertas) despues de dos ciclos de congelacion-descongelacion tal como segun la evaluacion por tincion con azul de tripano. Estas celulas no viables fueron capaces de estimular las celulas T CD8+, generando los CTL con actividad citolftica de antfgeno-especffico comparable a la actividad citolftica

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observada con las celulas T CD8+ que fueron estimuladas con las xCPAs de Drosophila que no fueron sometidas a un ciclo de congelacion-descongelacion. Ademas, los estudios de congelacion-descongelacion demostraron que las xCPAs de Drosophilapuede ser inducidas, carga de peptido, y congelacion-descongelacion, y luego posteriormente utilizadas para estimular a las celulas T naive; por lo tanto, no sera necesario disponer de forma continua de las xCPAs de Drosophila en el cultivo con el fin de preservar la funcion xAPC.

Tratamiento Psoraleno/UVA

[0174] El metodo de congelacion-descongelacion demostr que las xCPAs de Drosophilase volvieron sustancialmente no-viables reteniendo la capacidad de activar las celulas T naive. Sin embargo, permanecio una preocupacion y esta es que el acido nucleico asociado con las xCPAs xenogenicas pueden retener alguna actividad o algun grado de contaminacion bacteriana o viral despues del ciclo de congelacion-descongelacion. Deseando inactivar el acido nucleico xenogenico asociado con las xCPAs para producir un sistema de presentacion de antfgenos altamente funcional esencialmente libre de ADN, ARN, bacteriano o contaminantes virales, fue probado un regimen de inactivacion que implica la exposicion de las xCPAs a un miembro de la familia de moleculas de psoraleno seguido de exposicion a la radiacion ultravioleta de onda larga (UVA). Se realizaron diversos estudios con varios miembros de la familia de psoraleno, que incluyen: psoraleno (7-H-furo [3,2-g] benzopiran-7- uno, disponible en Sigma) y un grado clfnico de psoraleno derivado de 9-metoxi-7H-furo[3,2-g]-1- benzopiran-7-uno (tambien conocido como methoxsalen, 8-metoxipsoraleno (8-MOP) y comercializado bajo el nombre de marca comercial UVADEX ™).

[0175] Se uso un ensayo de infectividad de un baculovirus/Sf9 para determinar si el tratamiento derivado de psoraleno/UVA fue suficiente para inactivar virus asociados a celulas de insecto infectadas por el virus. Se infectaron celulas de insecto Sf9 con BacPAK6 de stock viral y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora (kit rapido tftulo BacPAK6 baculovirus; BD Biosciences Clontech). Las celulas infectadas se dejaron sin tratar o se trataron con (5mg/ml) UVADEX™ y se irradiaron con radiacion ultravioleta de onda larga (320 nm - 380 nm, UVA) a partir de una fuente de luz por encima del recipiente y una fuente de luz debajo del recipiente durante aproximadamente 5 minutos (10-15 mW/cm2). Cinco dfas despues de la irradiacion, se recogieron los sobrenadantes del cultivo. De estos, se prepararon nuevos stocks de virus via de diluciones seriadas de 10-3, 10-4 y 10-5, respectivamente. Estas diluciones en serie de stock diluidas cada uno fue utilizado para infectar un segundo conjunto fresco de cultivos de celulas Sf9 (es decir, no infectadas previamente). Este segundo grupo de cultivos se cubrio con metilcelulosa y se cultivo durante aproximadamente 48 horas. Los sobrenadantes del cultivo de este segundo set fueron desechados y se anadio un anticuerpo de proteina monoclonal de raton anti-gp64 (especffico de baculovirus) (Invitrogen). Despues de un perfodo inbubacion y varios lavados para eliminar el anticuerpo anti- gp64 no unido, (es decir, anticuerpo secundario obtenido de Invitrogen) se anadio un anticuerpo policlonal de cabra anti-raton conjugado con peroxidasa de rabano picante. El anticuerpo secundario no unido se elimino con varios lavados, y se anadio peroxidasa. Se conto el numero de focis tenidos y el tftulo de virus (pfu/ml) se calculo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0176] Como se muestra en la Tabla IV a continuacion, cinco minutos de UVA (350-400nm) perfodo de tiempo de irradiacion fue suficiente para evitar la replicacion de baculovirus en los cultivos de indicador de celulas Sf9, mientras que el control, las celulas no tratadas contenfan un tftulo viral de 8 x 108 unidades formadoras de placa (PFU)/ml de baculovirus.

Tabla IV: UVADEX™ /UVA tratamiento de inhibicion de replicacion del virus en las celulas Sf9 infectadas de

baculovirus

Tiempo de irradiacion UVA: Virus anadido Tftulo de virus (10-4) Tftulo de virus (10-5)

0 minutos: - 0 0 0 0 0 0

0 minutos: + >500 >500 >500 232 210 198

5 minutos: + 0 0 0 0 0 0

10 minutos: + 0 0 0 0 0 0

[0177] En un experimento similar, las celulas Sf9 fueron infectadas con las dosis tituladas de baculovirus como se describio anteriormente. Las celulas infectadas fueron tratadas con 5pg/ml of UVADEX™ a 4 °C durante 30 min seguido por irradiacion UVA durante 0 minutos, 2 minutos, 10 minutos o 20 minutos, respectivamente. Las celulas tratadas fueron cultivadas a 28 °C durante cuatro dfas. Se recogio sobrenadante del cultivo y se utilizo para infectar nuevos cultivos de celulas Sf9 sembradas en placas de 96 pocillos. Se detectaron Baculovirus en celulas Sf9 mediante un ensayo rapido de microtitulacion (Invitrogen). Las placas de cultivo se cubrieron con metilcelulosa y se cultivaron durante 48 horas. El baculovirus se detecto por inmunoensayo con un anticuerpo de gp64 especffico

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(Invitrogen). Se conto el numero de focis en cada pocillo y se calculo el tftulo de virus (pfu/ml) del sobrenadante de las celulas infectadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados, presentados en la Figura 1, demuestran que el tratamiento UVADEX ™ seguido de una exposicion de dos minutos de UVA disminuyo el tftulo de baculovirus del sobrenadante de cultivo recogido a menos del 10% del tftulo de baculovirus visto en las celulas no tratadas/expuestas. El tratamiento UVADEX seguido por los tiempos de exposicion de diez y veinte minutos UVA, respectivamente, no dio lugar a ningun tftulo de baculovirus detectable.

[0178] Con el fin de determinar si el tratamiento con psoraleno/UVA podrfa inhibir la proliferacion de las xCPAs, de las xCPAs clon B de Drosophila se dejaron sin tratar o se trataron con 5pg/ml UVADEX™ a 4 °C durante 30 minutos seguido de tratamiento UVA por 0, 2, 10, o 20 minutos. Las xCPAs tratadas se lavaron completamente para eliminar UVADEX residual y entonces ambas xCPAs tratadas y no tratadas se sembraron en placas de 6 pocillos a 1 x 106 celulas/ml y cultivadas de forma continua durante 16 dfas. Las xCPAs viables (es decir, en vivo) se contaron en el dfa 1, dfa 5, dfa 9, dfa 14, y el dfa 16 post-tratamiento mediante tincion con azul de tripano en cada cultivo.

[0179] Como se muestra en la Figura 2, la proliferacion de xCPA de Drosophila se inhibio de manera efectiva por cada tiempo de duracion de la exposicion UVA probada, con una inhibicion de aproximadamente 50% de la viabilidad de todos los cultivos tratados con UVA/UVADEX en aproximadamente nueve dfas despues del tratamiento UVADEX/UVA. Por otra parte, al rededor de dos semanas despues del tratamiento UVADEX/UVA casi no se detectaron celulas viables en cualquier cultivo tratado. Por el contrario, las xCPAs no tratadas con UVADEX/UVA muestran viabilidad robusta, casi triplicando el recuento de celulas dentro de los catorce dfas en cultivo. Por lo tanto, se concluyo que el tratamiento UVADEX/UVA atenua eficazmente la proliferacion de xCPA, incluso en la duracion de tiempo probada mas baja UVA (2 minutos).

[0180] Fue posible que el acido nucleico xenogenico introducido en las xCPAs podrfa haber permanecido activo, a pesar de que las mismos xCPAs se habfan vuelto no proliferativas. Con el fin de determinar si el tratamiento con psoraleno/UVA inactiva el acido nucleico xenogenico introducido en las xCPAs, se realizo un analisis de transcripcion del acido nucleico xenogenico de las xCPAs clon B de Drosophila despues de que cualquier y- irradiacion o tratamiento UVADEX/UVA. Las xCPAs clon B deDrosophila se dejaron sin tratar, se trato con UVADEX™ (5 pg/ml)/UVA, o fueron tratados con Y-radiacion por 50 min (entrega de aproximadamente 16,000 rads). Cada cultivo de las xCPAs se lavo y se co-cultivo durante 10 semanas con un indicador de lfnea celular de Drosophila designado aquf como clon D, que es una lfnea celular que no ha sido modificada por la introduccion de acido nucleico xenogenico. La transcriptasa inversa (RT)-PCR utilizo cebadores especfficos de reacciones para HLA A2.1, B7-1, B7-2, and ptranscripciones 2m despues fueron realizadas en los extractos de los co-cultivos. Los resultados, representados en la figura 3, se muestra que tanto las no tratadas y las xCPAs tratadas con Y-radiation contenfan acido nucleico xenogenico activo, como se evidencia por la deteccion de HLA A2.1, B7-1, B7-2 xenogenico y transcripciones p2m ( carriles 2 y tres, respectivamente). Por el contrario, ninguna de las xCPAs tratadas con UVADEX™ (5mg/ml) y UVA, independientemente de la duracion del tratamiento, contenfa acido nucleico xenogenico activo, como se evidencia por la ausencia de niveles detectables de HLA A2.1, B7-1, B7-2 xenogenico y transcripciones p2m. Por lo tanto, se concluyo que el tratamiento UVADEX (5mg/ml)/UVA de las xCPAs inactiva el acido nucleico xenogenico que se introdujo en las xCPAs.

[0181] Como ciertos virus citolfticos adventicios, micoplasmas y otros organismos microbianos pueden estar asociados con las xCPAs ademas del acido nucleico xenogenico introducido en las xCPAs, era deseable determinar si el regimen de tratamiento UVADEX/UVA inactivava estos contaminantes escenciales de las xCPAs. De este modo, se recogio un cultivo xCPA que contenfa aproximadamente 6 x 108 xCPAs de Drosophila (clon B), suspendido en 0,6 ml de medio de Schneider en hielo, y se sonico durante 30 segundos. Los restos celulares se sedimentaron por centrifugacion, y el sobrenadante se recolecto y se estratifico sobre un cojfn de cloruro de cesio (CsCl), a una densidad de 1,2 (20% w/w CsCl), en una proporcion de tres volumenes de sobrenadante a un volumen de CsCl. A continuacion, el cojfn de CsCl de sobrenadante cargado se ultracentrifugo a 25.000 rpm durante cuatro horas. Fracciones virales fueron recolectadas y se midieron las densidades de fracciones. Tres fracciones de un mililitro a una densidad de 1,0 a 1,2 fueron agrupadas y se dializaron frente frente al tampon fosfato salino (PBS), generando un stock viral, y se almaceno el stock viral a - 80 °C hasta su uso. Una parte alfcuota del stock de virus, equivalente a lisado de aproximadamente 1 x 108 xAPCs, se sometio a tratamiento UVADEX ™/UVA (5 mg/ml por 10 minutos) o no fue tratada. Cultivos independientes (1 x 106 celulas/cultivo) indicador de la lfnea celular clon D de Drosophila se incubaron a 28 °C, con cualquiera de las alfcuotas virales tratadas y no tratadas. Despues de un perfodo de incubacion de tres dfas, se recogieron los cultivos d indicador de celulas y se tineron con yoduro de propidio (PI) (1 mg/l x 106 celulas) a 4 °C durante 10 minutos. Las celulas vivas y lfticas se analizaron mediante FACs, con los resultados representados en las Figuras 4A-4C.

[0182] El stock de virus sin tratar alfcuota aislada de las xCPAs infectadas en el indicador de la lfnea celular, equivalente a aproximadamente 1 x 108 unidades formadoras de placa (pfu), dio lugar a la lisis de esencialmente todas las celulas en indicador de lfnea celular del cultivo como se observa por microscopfa de muestras de cultivo (imagen del campo microscopico representativo, Figura 4A). Por el contrario, la parte alfcuota de stock de virus aislado de los xAPCs que fue sometido a UVADEX™/UVA (5 mg/ml durante 10 minutos) no resulto en cualquier

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infeccion observable en el indicador de celulas o de lisis (imagen del campo microscopico representative, figura 4B).

[0183] En un experimento similar, un set de diluciones seriadas del stock viral de xCPA que consistia de 10-1, 102, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, io-8, y io-9 diluciones las cuales se dejaron sin tratar o se trataron con UVADEX/UVA (5 mg/ml durante 10 minutos) antes de ser incubados con cultivos de celulas de Drosophila indicador clon D. Despues de un perfodo de incubacion de tres dfas, el porcentaje de celulas viables se cuantifico en cada indicador de la lfnea celular del cultivo. Los resultados, se reflejan en la figura 4C, muestran que la fraccion viral tratada fue casi completamente incapaz de infectar y lisar el indicador de la lfnea celular del cultivo en absoluto, sino la dilucion probada mas baja. Sin embargo, la fraccion viral no tratado era capaz de efectuar la lisis del 80% aproximadamente del indicador de la lfnea celular del cultivo en el 10-5 dilucion fraccion viral.

[0184] Con el fin de confirmar que el acido nucleico xenogenico asociado con las xCPAs tratadas con UVADEX ™/UVA no fue transitoriamente infecciosa, y no se expreso transitoriamente hacia y en el indicador de celulas clon D, fue realizado el analisis de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) en las xCPAs de Drosophila co-cultivos de clonB/clon D. A modo de comparacion, Y-radiation- co-cultivos de xCPA clon B/clon D tratados y co-cultivos de xCPA clon B/clon D no tratados fueron analizados mediante FACS de la misma manera.

[0185] Cultivos xCPAs (clon B) deDrosophila se dejaron sin tratar, se trataron con UVADEX/UVA (5 mg/ml), o y- radiacion-tratados durante 50 minutos (entrega de aproximadamente 16.000 rads). Las celulas de cada cultivo fiueron lavadas y luego co-cultivadas con indicador de celulas clon D durante 10 semanas. Se recogieron las celulas co-cultivadas y alfcuotas, y cada parte alfcuota se tino con una de HLA-A2, B7-1 e ICAM-1 isotiocianato de fluorescefna (FITC) conjugado con anticuerpos monoclonales (mAbs), respectivamente. Los co-cultivos tenidos despues fueron analizados por FACS. Como se muestra en la figura 5, los co-cultivos que contienen xCPAs sin tratar expresan HLA-A2, B7-1, e ICAM-1; los cocultivos que contienen xCPAs Y-radiacion tratadas muestran modesta, pero expresion significativa de HLA-A2, B7-1, e ICAM-1; y los co-cultivos que contienen xCPAs tratados con UVADEX ™/UvA muestran niveles indetectables de HLA-A2, b7-1, e ICAM-1.

[0186] En un experimento similar, se indujeron cultivos de xCPA de Drosophila para expresar moleculas exogenas codificadas por vectores recombinantes, y despues se incubaron con UVADEX™ (5 mg/ml) y se trataron con UVA durante 0, 5 o 15 minutos. Los cultivos de xCPA se lavaron y se tineron con anticuerpos monoclonales especfficos para HLA-A2, B7-1, o ICAM-1 y analizados por FACS. Como se muestra en la figura 6, el nivel de expresion en la superficie de cada una de las tres moleculas exogenas fue esencialmente la mismo para todas las duraciones de tiempo UVA probadas.

[0187] En conjunto, estos resultados demostraron que las xCPAs de Drosophila que son inactivados por tratamiento psoraleno/UVA se habfan vuelto esencialmente no viables y, esencialmente, no infecciosas. Ademas, las xCPAs inducen a expresar el acido nucleico exogeno de tal manera que las protefnas codificadas se expresaron en la superficie celular de la xAPC antes de la inactivacion mediada por psoraleno/UVA, retienen la pre- inactivacion de los niveles de expresion de las protefnas exogenas posteriores a la inactivacion.

Expansion del peptido seleccionado especffico y activacion de celulas T naive tras la incubacion con xCPAs inactivada de Drosophila

[0188] Fueron purificadas las celulas T CD8+ naive de los leucocitos mononucleares de sangre periferica (PBMC) de donantes de HLA-A2-positivo y cultivadas a 37 °C con xCPAs tratadas con UVADEX ™/ UVA tratados o con xCPAs tratadas con UVADEX ™/ UVA mas congelacion-descongelacion en presencia de 10 pg/ml de un peptido MART-1 correspondiente a los aminoacidos 27-35 de MART-1 humana (AAGIGILTV; SEQ ID NO. 9). Cada dfa se anadio recombinante humana (r) IL-2 (20 unidades/ml) y rIL-7 (30 unidades/ml) despues del quinto dfa del periodo de cultivo. Las celulas T CD8+ se volvieron a estimular dos veces en los dfas septimo y quince del periodo de cultivo con celulas adherentes no-CD8 en PBMC del mismo donante en presencia de los peptidos MART-1. Las celulas T CD8+ expandidas fueron contadas despues del dfa 21 del cultivo mediante tincion con azul de tripano Los resultados, se resumen en la Tabla V a continuacion, muestra que cuando las xCPAs estan sin tratar, UVADEX ™/UVA-tratada o UVADEX ™/UVA mas congelacion-descongelacion-tratada, las celulas T CD8+ estimuladas proliferan (es decir, se expanden) a tasas similares.

Tabla V: Numero de celulas T CD8+ despues del cultivo con peptido-cargado de los xAPC

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Experimento (dfa 21): No tratamiento (CD8+x 106) UVADEX/UVA (CD8+ x 106) UVADEX/UVA + Congelado (CD8+ x 106)

Donante 1: 38.20 42.60 52.90

Donante 2: 11.96 9.94 13.44

Donante 3: 26.04 24.24 35.04

Donante 4: 16.74 15.66 17.80

[0189] Fueron purificadas las celulas T CD8+ naive de (PBMC) de donantes de HLA-A2-positivo y cultivadas con xCPAs tratadas con UVADEX ™/ UVA tratados o con xCPAs tratadas con UVADEX ™/ UVA mas congelacion- descongelacion a 37 °C en presencia 10 mg/ml del peptido de MART- 1 (secuencia de aminoacido AAGIGILTV (SEQ ID NO;9)). Se anadio recombinante humana (r) IL-2 (20 unidades/ml) y rIL-7 (30 unidades/ml) despues del quinto dfa del periodo de cultivo. Las celulas T CD8+ se volvieron a estimular dos veces en los dfas septimo y quince del periodo de cultivo con celulas adherentes no-CD8 en PBMC del mismo donante en presencia de los peptidos MART-1. Las celulas T CD8 + expandidas fueron tenidas con MART-1 tetrameros (Beckman Coulter) que consta de cuatro moleculas de MHC unidos al peptido MART-1, que se conjuga a una protefna fluorescente, y fueron analizados por FACS. El resumen de los resultados en la Tabla V mas adelante, muestran que la incubacion de celulas T CD8+ tratadas previamente con xCPAs resulto en un mayor porcentaje de peptido/tetramero de MHC (pMHC) positivos derivado de todos los donantes puestos a prueba. Ademas, la incubacion de las celulas T CD8 + naive con UVADEX/UVA mas xCPAs tratadas con congelacion-descongelacion resulto en un mayor porcentaje de tetramero pMHC positivo de los CTLs que las xCPAs tratadas UVADEX/UVA solo en tres de los cuatro donantes (donantes 1, 2 y 3).

Tabla VI.

Porcentaje p/CMH tetrameros de celulas T CD8+ despues del cultivo con peptido-cargado de los xAPC

Experimento: No tratamiento (%Tetr + CD8+) UVADEX™ (%Tetr + CD8+) UVADEX™/Congelado (%Tetr + CD8+)

Donante 1: 0.81 0.95 1.52

Donante 2: 9.94 11.55 14.50

Donante 3: 8.71 15.07 21.35

Donante 4: 20.06 43.33 21.88

[0190] Para investigar la medida en la que las xCPAs inactivadas, cuando se cargan con el peptido seleccionado, celulas T naive activas para convertirse en los CTL, celulas T CD8+ naivef ueron purificadas a partir de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de donantes positivos de HLA-A2 y cultivadas a 37 °C con xCPAs no tratradas de Drosophilia xCPAs UVADEX/UVA tratadas de Drosophila o xCPAs de Drosophila UVADEX/UVA mas congelacion-descongelacion tratadas en presencia de 10 pg/ml de peptido MART-1 correspondiente a los aminoacidos 27-35 de la protefna de MaRt-1 humana, AAGIGILTV (sEq ID NO. 9). Se anadieron interleucina humana recombinante (RIL) -2 (20 unidades / ml) y rIL-7 (30 unidades / ml) a cada uno de los cultivos en el quinto dfa del periodo de cultivo. Las celulas T CD8+ se volvieron a estimular dos veces al dfa en los dfas septimo y quince del periodo de cultivo con las celulas no adherentes CD8 de PBMC del mismo donante en la presencia del peptido MART-1 (SEQ ID NO.9). Se recogieron las celulas T CD8+ cultivadas en el dfa 21 del periodo de cultivo, y la actividad de CTL se midio por ensayo de liberacion de 51Cr estandar, que proporciona una medida directa de la muerte celular especffica (es decir, la actividad citolftica).

[0191] Los resultados, representados en la figura 7, muestran que los CTL de tres de los cuatro donantes (donantes 1, 3, y 4) mostraron una mayor % de destruccion especffica cuando es activado por cualquiera de xCPAs UVADEX/UVA tratadas o con xCPAs UVADEX/UVA tratadas mas congelacion-descongelacion en relacion con los CTL activados por xCPAs no tratadas. Los CTL del donante 2 mostro menor % de destruccion especffica cuando fue activado por xCPAs UVADEX/UVA tratadas, pero mayor % de destruccion especffica cuando fue activado mediante con xCPAs UVADEX/UVA tratadas mas congelacion-descongelacion, en relacion con las xCPAs no tratadas. Ademas, en tres de los cuatro donantes (donantes 1, 2, y 3) los CTL activados por xCPAs UVADEX/UVA tratadas mas congelacion-descongelacion mostraron mayor % de destruccion especffica%, ademas de los CTL activados solo por UVADEX / UVA .

[0192] En conjunto, estos experimentos demostraron que las xCPAs sometidas ya sea a psoraleno/UVA o a un regimen de psoraleno/UVA mas congelacion-descongelacion se volvieron esencialmente no viables y no infecciosas, y posefan esencialmente equivalente o mejorada expresion de la protefna exogena, carga de peptidos

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seleccionado y presentacion, y las propiedades de activacion de celulas T CD8+ naive relativos a aquellas posefdas por las xCPAs que no fueron sometidas a estos regfmenes de inactivacion.

[0193] Con el fin de investigar la base molecular para la funcion mejorada de la CPA observada con xCPAs tratadas con psoraleno/LTVA, xCPAs de Drosophila expresando Kb, B7-1, y moleculas ICAM-1 fueron cargadas con un peptido OVA8 (SIINFEKL; SEQ ID NO.69) y luego se trato con o sin UVADEX/UVA. Las celulas T naive CD8+ se purificaron a partir de ratones C57BL/6 (B6) o ratones knockout MyD88 (MyD88 - / -) y se cultivaron con xCPAs de Drosophila UVADEX/UVA tratados o no tratados que se habfan cargado con el peptido OVA8. Se anadio IL-2 en el dfa tres y cinco del co-cultivo de celulas T naive cD8+ de xCPA El co-cultivo fue dividido en siete dfas del periodo de co-cultivo, y en el dfa nueve se recogieron las celulas T CD8 + cultivadas. Una preparacion de tetramero OVA8/MHC (Beckman Coulter) fue realizada, 10 pl se mezclaron con 1 x 106 celulas T CD8+ celulas/100 pl de tampon FACS (0.5% BSA, 0.2% NaN3 in PBS). Los tetrameros Kb/OVA8 consistieron en cuatro moleculas de MHC unido al peptido OVA8, que se conjuga con una protefna fluorescente. La mezcla se incubo a temperature ambiente durante 30 minutos y se lavo en PBS, y luego se centrifugo a 400 x g durante 5 minutos. El sedimento celular se re-suspendio en tampon de FACS (500 pl) y se leyo inmediatamente en el FACScan de maquina de citometrfa de flujo a una longitud de onda de excitacion de 486 nm - 580 nm y una longitud de onda de emision de 586 nm - 590 nm. Los resultados mostraron que un mayor porcentaje de celulas T CD8+ aisladas de ratones de tipo salvaje (C57BL/6 (B6) estos se tineron con el tetramero Kb/OVA cuando se activan con xCPAs de Drosophila UVADEX/UVA tratadas en comparacion con el porcentaje de celulas T CD8+ tenidas cuando se activan por celulas XCPAs no tratadas de Drosophila (Figura 8A, carril 2 vs. carril 1). Sin embargo, no se observo aumento en en el porcentaje de celulas T CD8+ aisladas de ratones MyD88 knockout (MyD88-/-) estos se tineron con el tetramero Kb/OVA cuando se activan con xCPAs de Drosophila UVADEX/UVA tratadas en comparacion con el porcentaje de celulas T CD8+ tenidas cuando se activan por celulas XCPAs no tratadas de Drosophila (Figura 8B, carril 4 vs. carril 3). Por lo tanto, se concluyo que la activacion mejorada observada se produce dependiendo de la presencia de la protefna MyD88 cuando las celulas T fueron incubadas con xCPAs de Drosophila UVADEX/UVA tratadas.

Ejemplo 3: Preparacion de antfgeno humano de melanoma dirigido a linfocitos T citotoxicos para terapia celular

[0194] Los ejemplos anteriores describen la caracterizacion, la inactivacion, y el uso posterior de las xCPAs cargadas con peptido seleccionado en los metodos para activar las celulas T naive autologas ex vivo. Las celulas T activadas resultantes son citotoxicas 35 hacia las celulas diana de una manera especffica de antfgeno seleccionado. Este ejemplo describe la preparacion de un producto de terapia preferido de CTL disenado para su uso en un regimen de terapia celular para el tratamiento de pacientes con cancer de melanoma en un entorno clfnico. Las figuras 9A-9F proporcionan un diagrama de flujo delineando los pasos del proceso, incluyendo los procedimientos de caracterizacion de xCPA y CTL asf como los procedimientos de control de calidad del producto.

Cultivo, induccion y carga de peptido de los xCPAs de Drosophila

[0195] Las celulas deDrosophila se cultivan en un cultivo continuo a 27 °C en medio de Drosophila de Schneider suplementado con suero bovino fetal al 10% y G418 (Geneticina). El cultivo continuo de celulas de Drosophila se divide dos veces a la semana y se anade medio fresco para ajustar la densidad celular de 1 x 106/mL. En el Dfa -3 o -2, celulas de Drosophila se dividen en 1 x 106 /mL y se cultivan en un medio sin G418. En el Dfa -2 o -1, se inducen las celulas de Drosophila para convertirse en xCPAs mediante la adicion de CuSO4 a 1 mM y se prueban en el dfa 0 para verificar la expresion de HLA-A2, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD54 (ICAM-1) y CD58 (LFA-3) por analisis FACS antes de la carga de peptidos. Preferiblemente, □□80% de los xCPAs expresan moleculas co- estimuladoras CD54 (ICAM1), CD58 (LFA3), CD80 (B7.1), CD86 (B7.2) y HLA-A2.1 (Clase I) en un momenta dado. El uso de celulas se interrumpe cuando la expresion de HLA-A2.1 o las otras moleculas humanas declina a E30%.

[0196] Las xCPAs de Drosophila y los virus asociados se inactivan con un regimen de psoraleno/UVA como se ha descrito anteriormente. La Inactivacion y esterilidad de la xCPAs pueden evaluarse mediante la realizacion de cualquiera o todos los procedimientos de caracterizacion xCPA como se describio anteriormente. En el Dfa 0, el inducido, xCPAs de Drosophila inactivada (1 x107/mL) se carga con los siguientes peptidos asociados al melanoma, a 0,1 mg/ml por peptido: YMNGTMSQV (SEQ ID NO.5); YMDGTMSQV (SEQ ID NO.6); AAGIGILTV (SEQ ID NO.9); ITDQVPFSV (SEQ ID NO.7); KTWGQYWQV (SEQ ID NO.70); and YLEPG-PVTA (SEQ ID NO.8). La carga de peptidos se realiza durante un mfnimo de 4 horas a temperatura ambiente en medio de insecto HYQ SFX suplementado con 5 mg/ml de beta-2 microglobulina. Las celulas de Drosophila cargadas con peptido se mezclan entonces con las celulas CD8+ purificadas como se describe a continuacion.

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Recoleccion y procesamiento de la muestra de aferesis

[0197] El producto de aferesis linfatica, que contiene leucocitos obtenidos del sujeto, se obtiene de un paciente en un centro clmico. Tras la recogida, los productos de aferesis linfatica y extraccion de sangre (una bolsa permeable a los gases de las celulas re-suspendida en plasma autologo y cinco tubos de tapa roja de 10 ml de sangre, respectivamente) se envfan el mismo dfa a temperatura ambiente en contenedores de transporte de sangre estandar que contienen un conjunto de datos de registro de temperatura. A los envfos se les da un seguimiento y se reciben al dfa siguiente. El producto de aferesis linfatica se mantiene a temperatura ambiente hasta 48 horas despues de la recogida.

[0198] Con el fin de generar una preparacion de suero inactivado por calor de los tubos de tapa roja de la sangre, los tubos se limpian con alcohol y se transfirieren a una cabina de bioseguridad. Con una pipeta de 5 ml, la fraccion lfquida se transfiere a tubos conicos de 15 ml y se centrifuga durante 10 minutos a 3.000 rpm (1800 x g). El sobrenadante (suero) se transfiere entonces a un tubo conico de 50 ml, los sedimentos de celulas rojas de la sangre se desechan, y el sobrenadante es inactivado por calor incubandolo durante 30 minutos en un bano de agua a 56 °C. El suero inactivado por calor se divide a continuacion en alfcuotas en tubos conicos de 15 ml y se almacena a 4 °C. Este suero inactivado por calor se usa para iniciar el cultivo de celulas CD8.

[0199] Con el fin de generar una preparacion de suero inactivado por calor a partir de plasma recogido de producto de aferesis linfatica, se determina una cantidad suficiente de CaCl2 para neutralizar el citrato de sodio presente en la porcion de plasma del producto de aferesis linfatica. Esta determinacion se realiza mediante la supresion de seis 1 ml de alfcuotas de plasma a partir del producto aferesis linfatica en seis tubos de poliestireno. Se anaden diez, 15, 20, 25, 30, or 35 ml de CaCl2 1 M esteril de forma independiente para cada uno de los seis tubos, de modo que cada tubo contenga diez, 15, 20, 25, 30, o 35 ml de CaCl2. Los tubos y el plasma restante, que se coloca en una botella de Nalgene 500 ml, se colocan en un bano de agua a 37 °C y se incuban durante 30 minutos. Si el coagulo es suave despues de la incubacion a 37 °C, la incubacion se extiende otros 15 minutos a temperatura ambiente para conseguir la coagulacion completa. La cantidad mas baja de CaCl2 necesaria para producir la coagulacion completa se usa para determinar la concentracion mas baja de CaCl2 necesaria para producir la coagulacion completa en el plasma que queda en la botella Nalgene. Una cantidad de CaCl2 suficiente para lograr esta concentracion cuando se anade al volumen de plasma en la botella Nalgene entoces se anade a la botella de Nalgene. El tubo de la bolsa de transferencia 600 ml se sujeta a continuacion con un tornillo de sujecion. El plasma se transfiere a la bolsa de transferencia de 600 ml perforando la bolsa con un equipo de transferencia de plasma (Carta Medica) y conectada a una jeringa de 60 ml con punta de deslizamiento. A continuacion el tubo unido a la jeringa se sujeta, despues de que el plasma ha sido transferido a la bolsa.

[0200] Se incuba el plasma reconstituido a 37 °C durante 30 minutos en el bano de agua, dejando el tubo de la bolsa fuera del bano de agua, y despues se deja reposar a temperatura ambiente hasta que el coagulo comienza a encogerse. El suero de la bolsa del plasma coagulado se drena a continuacion, en dos botellas de 250 ml (Nalgene; catalogo 2019-250), utilizando tubos conectados a la bolsa.

[0201] Antes de la inactivacion termica, dos muestras de 1,5 ml de este suero se alfcuota, se coloca en tubos de Wheaton, y se almacenan a - 80 °C. El suero que queda en los dos 250 ml botellas Nalgene es entonces inactivado por calor mediante la incubacion en un bano de agua a 56 °C durante 40 minutos. Despues de la inactivacion termica, el suero se distribuye en tubos de 50 ml de centrifuga esteriles y se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpm (1,800 x g) para sedimentar el material insoluble. El material insoluble restante se elimina de los sobrenadantes mediante el filtrado de ellos, en filtros de 0.45 mm Los filtrados se distribuyen en 125 ml botellas esteriles (Nalgene; catalogo No. 2019-125) y se almacenan a - 80 °C. Los tubos que contienen los granulos insolubles se desechan.

Seleccion poositiva de celulas CD8+ e isolacion de las celulas non-CD8

[0202] En el dfa 0, la CD8 + y las celulas no-CD8 se afslan utilizando el Sistema de Seleccion Celular Magnetica Isolex 300i. con un set desechable de tubos, anticuerpo monoclonal anti-CD8, perlas inmunomagneticas (Dynabeads®) y una elucion peptido CD8, AAEGLDTQRFSG (SEQ ID NO.83). El procedimiento de seleccion de celulas CD8+ es automatizado y consta de los siguientes pasos: la concentracion de celulas y de plaquetas se lavan; incubacion con anticuerpo anti-CD8; una etapa de formacion de rosetas utilizando Dyna Beads® conjugado con oveja anti-raton (SAM) de IgG; captura de celulas CD8+; y la eliminacion de celulas no-CD8+.

[0203] Con el fin de llevar a cabo la concentracion de celulas y plaquetas, se obtiene en la etapa de lavado del procedimiento de seleccion positiva de celulas CD8+, una bolsa de transferencia de dos litros (Fenwal; numero de catalogo 4R2041), en la que aproximadamente 1,740 ml de tampon DPBS/ HSA/ citrato de lavado se transfiere por la perforacion de la bolsa con un equipo de transferencia de plasma (Carta medica) y se conecta a un 60 ml con una jeringa con punta de deslizamiento. Despues de la transferencia se sella el tubo.

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Instalacion de Isolex

[0204] La configuracion y el procedimiento de prueba del sistema de seleccion celular magnetica Isolex 300i se lleva a cabo hasta una hora antes de que se espera la llegada de las celulas del sujeto. El interruptor principal del Isolex 300i esta encendido, y los controles internos automaticos estan verificados, se han producido antes de que aparezca la pantalla de Nexell identificacion de la version del software. Despues de que aparezca la pantalla "System Stop Verification", se presiona el boton "Stop" y luego se registran de la pantalla las escalas de peso y valores de la presion "Estado del dispositivo". Para llevar a cabo la inicializacion del sistema, se siguen las instrucciones que aparecen en pantalla para limpiar los componentes del dispositivo. Una vez realizadas las pruebas de inicializacion, se registran las escalas de peso y valores de la presion de la pantalla "Device Status" en el procesamiento de celulas y control de calidad ("After Initialization"). En la pantalla "Select a Procedure" , se selecciona "Positive Selection Only".

Instalacion del equipo desechable Isolex.

[0205] La bandeja que contiene el set desechable se retira de embalaje. El set desechable Isolex 300i se instala abriendo la puerta de la bomba y colgando las dos bolsas conectadas 2000 ml de residuos (bolsas B y C, respectivamente) en el soporte en el lado derecho del instrumento. El tubo se monta sobre la carcasa giratoria debajo de la pantalla. La unica bolsa de 2000 ml (Bolsa A) se coloca en la parte superior del banco. La cinta de papel se retira del tubo de camara y la camara se instala en el modulo de eje de balancfn. Ambas bolsas de lavado de recirculacion (no.5) se cuelgan en escala delpeso 5 con la bolsa filtrada de lavado colocada enfrente. La bolsa de producto final (N ° 4) se cuelga en escala de peso 4. La bolsa de anticuerpo (N ° 3) se cuelga en escala de peso 3. Por ultimo, la bolsa de agente de liberacion (No. 2) se cuelga en escala de peso 2. Todas las piezas restantes del set desechable en la bandeja se aflojan, y se retira la bandeja. A continuacion, el conjunto de membrana de hilado es instalado en el modulo giratorio, asegurando que el brazo de soporte este en su lugar y el dispositivo de giro este colocado correctamente. La colocacion adecuada de los tubos detras de cada colector fue verificado, los dos colectores de sujecion superiores e inferiores, los tres colectores de sujecion estan bloqueados en su lugar, y el organizador de la bomba encaja en su lugar. Despues todos los tubos en el organizador se verifico que esten centradados en los rodillos de la bomba o en la superficie ranurada de la cubierta del modulo de bomba. Entonces se cierra la puerta de la bomba. El tubo P1 y el dispositivo giratorio de los tubos es verificado de no estar apretados por la puerta, y la bolsa de separacion de iman secundaria esta instalada en el iman secundario utilizando las gufas de tuberfa. Entonces se cierra la puerta magnetica.

[0206] Coincidencia de los puntos azules, tubos detectores de fluidos 1 y 2 estan instalados, y la colocacion de los tubos se confirma en la pantalla de "Device Status". Los accesorios de montaje estan bien conectados a los transductores de presion 1 y 2. Cuando coincidan el punto azul, entonces se instala la tuberfa en el detector 3 de fluido.

Despues se instala el tubo de camara en la gufa de tubo basculante en la parte inferior del brazo basculante. La cinta de papel que sostiene la bolsa tampon y bascula 5 del tubo de la bolsa se retira, y la bolsa fuente de celulas y el tubo del tampon de la bolsa esta cubiertos de tal manera que no interfieran con el tubo de las bolsas en las escalas. Las bolsas son verificadas para asegurar que estan colgando de forma recta en escalas de peso, y el tubo del equipo desechable es comprobado en caso de haya torceduras y pellizcos. A continuacion, la pinza del tubo de la bolsa de 2.000 ml (Bolsa A) se cierra; el tubo de las Bolsas B y C se verifica que esten abiertas. Despues de que el set desechable se ha instalado correctamente, se selecciona "OK" en la pantalla "Install Set". Se llevaron a cabo 20 pruebas internamente para verificar la correcta instalacion equipo desechable.

Instalacion del set desechable del tampon y cebado.

[0207] La bolsa de cebado de DPBS/ HSA/citrato esta conectada a la lfnea de pico del tampon del set desechable. Mientras sostiene la bolsa de tampon en posicion vertical, a la bolsa se le da una palmada para eliminar el aire de la lfnea de conexion del puerto. Un peso de 1 kg se une a la escala del peso 6, y la bolsa de tampon se cuelga en el peso de 1 kg. El peso combinado ha de ser entre 3250 g a 7000 g. Las escalas de peso y valores de presion se registran en la pantalla "Device Status" , y se selecciona "OK". A continuacion se prepara el Sistema de Seleccion Celular Magnetica Isolex 300i al set desechable con tampon.

[0208] Las escalas de peso y valores de presion de la pantalla "Device Status" se registran despues de que el cebador principal esta completo. El Isolex 300i se mantiene en espera hasta que las celulas del paciente se han recibido y estan listas para ser anadidas. La instalacion de set desechable y cebado se inicia una hora antes de la llegada de las celulas del paciente, por lo que el procesamiento celular puede comenzar inmediatamente despues de recibirlas.

[0209] Despues de recibir la bolsa de envio de aferesis linfatica del paciente, limpie el puerto en la bolsa de envfo, se limpia con un pano esteril y 70% de alcohol isopropflico, y luego se traslada a una cabina limpia de bioseguridad Cuando se usa una lfnea de transferencia pico a pico, el contenido de la bolsa se transfiere a un frasco esteril de 500 ml (Nalgene, numero de catalogo 2.019 -0.500). Se prepara a continuacion una dilucion 1:50 de celulas mediante la mezcla de 0,02 ml de suspension de celulas con acido acetico 0,98 ml de 2%. A

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continuacion se cuentan las celulas para determinar el recuento de celulas PBMC.

Recuento celular del producto de aferesis linfatica.

[0210] Utilice una pipeta de 50 ml para dispensar las celulas suspendidas en el plasma en los tubos de 50 ml conicos para centrffuga (45 ml/tubo). Las celulas se sedimentan por centrifugacion durante 10 minutos a 1000 rpm (200 x g), con el freno apagado. El numero de PBMCs se calculan multiplicando la concentracion de celulas por el volumen total. Despues se agrupa el sobrenadante de plasma (40 ml/tubo) en una botella de 500 ml esteril (Nalgene; numero de catalogo 2019-0500) para ser utilizado para el procesamiento de plasma como se describe a continuacion. Los sedimentos se re-suspenden en el plasma que queda en los tubos de 50 ml, y la piscina en un botella esteril de 250 ml (Nalgene; numero de catalogo 2019-0250). Acontinuacion, se mide el volumen. Despues se anaden aproximadamente 150 ml de citrato DPBS/HSA, y el volumen total se calcula dividiendo el numero total de celulas por el nuevo volumen de la celda.

Aislamiento de celulas CD8+.

[0211] El fenotipo y la prueba de pureza de CD8 se determina mediante tincion de la superficie celular con anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia y analisis por citometrfa de flujo. Analisis de dos colores en el citometro de flujo FACScan, se lleva a cabo de acuerdo con el panel de anticuerpos monoclonales que se enumeran a continuacion. Marcadores para la caracterizacion del producto incluyen: CD3 (linfocitos T), CD4 (celulas T auxiliares), CD8 (celulas T citotoxicas), CD14 (monocitos), CD19 (celulas B), CD16 (celulas NK) y CD15 (granulocitos). Las celulas usadas para las pruebas de citometrfa de flujo se lavan en tampon FACS (PBS que contiene BSA y azida de sodio) y se incubaron con los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia apropiados a 4 °C durante 15 - 30 minutos, protegido de la luz. Posterior a la incubacion, las celulas tenidas se lavaron y se re-suspendieron en tampon FACS. Las celulas tenidas se almacenan en hielo, protegidas de la luz, y se ejecutan en el citometro de flujo dentro de las 2 horas de tincion. Alternativamente, si las muestras no se pueden analizar dentro de las 2 horas, las muestras se fijan usando una solucion de 0,5% de paraformaldehfdo en DPBS y se almacenan durante un maximo de una semana a 4 °C en la oscuridad. Un total de 10.000 eventos son recogidos para cada muestra. Los datos se analizan y se informa el porcentaje de celulas que son positivas para cada marcador.

[0212] Un total de 1x108 celulas se pipetearon para el analisis FACS de la tipificacion de HLA en un tubo conico esteril de 50 ml. La concentracion de celulas (celulas/ml) se registra en el tubo. Aproximadamente 6x107 celulas se dejan de lado en un tubo esteril de 15 ml para ser congelados para archivar los linfocitos del paciente. Las celulas se centrifugan y se congelan al mismo tiempo que se congelan las celulas no-CD8 (vease mas adelante para el aislamiento y tratamiento de las celulas no-CD8). Aproximadamente 1x107 celulas se dejan de lado en un tubo esteril de 15 ml para analisis FACS antes de la seleccion positiva de las celulas CD8 + mediada por Isolex 300i .

[0213] Los reactivos se anaden a la Isolex 300i y los datos registrados de acuerdo con los siguientes pasos, y se pueden anadir mientras que las celulas del paciente son centrifugadas. Una vez que aparezca la pantalla "Add Release Agent", el septo de la Bolsa 2 se limpia con toallitas de alcohol esteriles. Se utiliza una aguja y una jeringa para agregar 20 ml de tampon citrato DPBS/HSA a la bolsa 2. El agente de liberacion se reemplaza con tampon citrato DPBS/HSA, y luego se presiona "OK". Una vez que aparezca la pantalla "Add Antibody", el septo de la Bolsa 3 se limpia con toallitas de alcohol esteriles. La solucion 37B1A anticuerpo monoclonal anti-CD8 se prepara mezclando 0,200 ml de 37B1A de stock a 10 mg/ml con 2,30 ml de citrato DPBS/HSA. Usando una aguja y una jeringa, se anade la solucion diluida 37B1A anti-CD8 mAb a la bolsa 3, y se pulsa "OK". Una vez que aparezca la pantalla "Add Beads", el septo de la camara se limpia con toallitas de alcohol esteriles. Las perlas magneticas (Nexell 4R9950, o equivalente) se lavan mediante la transferencia del contenido de un vial (10 ml) en un tubo de 50 ml y anadiendo 10 ml de citrato DPBS/HSA. Las cuentas se separaron durante 2 minutos en un iman MPC-1 colocando el tubo en el iman. El sobrenadante se retira con una pipeta, mientras que las perlas son atrafdas hacia un lado del tubo. El tubo de perlas se retira del iman y las perlas suavemente se resuspenden en 10 ml de citrato DPBS/HSA de tal manera que la formacion de espuma se evite. Usando una aguja y una jeringa de 20 ml, las perlas se anaden a la camara, y luego se presiona "OK".

[0214] A continuacion se sella el tubo del recipiente de 300 ml Transfer Pack (Baxter Fenwal-; numero de catalogo 4R2014). En una cabina de bioseguridad, la suspension de celulas de la botella de 250 ml se transfiere en el Transfer Pack de 300 ml utilizando una jeringa de 60 ml (embolo eliminado) conectado a un equipo de infusion de componentes de la sangre. A continuacion se cierra el tubo del equipo de infusion. La suspension de celulas se transfiere entonces desde el recipiente de Transfer Pack a la bolsa de 1000 ml Isolex 300i incluido en el set desechable (Nexell; numero de catalogo 4R9850), utilizando el pico y el filtro de la sangre en lfnea para eliminar grumos de celulas. Despues se sella el tubo de la bolsa que contiene la suspension de celulas.

Seleccion de celulas CD8+.

[0215] La bolsa celular Isolex 300i se conectada usando la espiga del set desechable Isolex y se cuelga al peso

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numero 1 de la escala, se registran las escalas de peso y valores de presion en la pantalla 'Device Status' del procesador celular. Se presiona 'OK', y se confirma que la abrazadera de la bolsa de residuos A (bolsa de recoleccion de no-CD8) este cerrado. La abrazadera de bolsas de residuos B y C se abre antes de iniciar la secuencia de seleccion positiva. Se deja proceder al Isolex a lavar las plaquetas durante 15 minutos antes de la incubacion de las celulas con el mAb anti-CD8 (37B1A). Despues de la terminacion del lavado de las plaquetas y durante la incubacion de anticuerpos, el peso de las bolsas de celulas (escala de peso No.5) se registra. Despues de la incubacion del anticuerpo, se deja proceder al Isolex a lavar el exceso de anticuerpo y luego transferir las celulas en la camara que contiene las perlas magneticas, donde se produce la mezcla durante 30 minutos y hacer reiniciacion. Durante la formacion de rosetas de las celulas (despues que la Isolex acaba de enjuagar todos los tubos) se abre la pinza de bolsa de residuos A, y las abrazaderas de bolsas de desecho B y C se cierran. El volumen de la camara se graba durante la reiniciacion. Despues que la formacion de rosetas esta completa, las rosetas son recolectadas magneticamente contra el lado de la camara y las celulas non-CD8 son drenadas a la bolsa de residuos A. Se permite que el sistema Isolex proceda al lavado de las rosetas tres veces con aproximadamente 100 ml de tamon de citrato DPBS/HSA. Despues del tercer y ultimo lavado, se presiona "Stop" en el teclado Isolex y la camara se sella. La camara que contiene las celulas CD8+ en roseta se retira de la maquina Isolex. La camara y el tubo se rocean con alcohol esteril y se colocan en una cabina de bioseguridad (p. ej., una campana), y se anaden 15 ml de citrato DPBS/HSAcitrato a traves del septo de la camara limpia con alcohol esteril. La camara esta entonces inclinada hacia atras y hacia adelante para volver a suspender las rosetas, y la suspension se transfiere a un tubo de 50 ml utilizando una jeringa de 30 ml equipada con una aguja calibre 16. La transferencia se repitio dos veces y las suspensiones transferidas son agrupados. Despues se separan las cuentas durante 5 minutos en un iman MPC-1, y el sobrenadante se desecha.

Elucion de celulas CD8+ con elucion de peptido CD8.

[0216] Las rosetas lavadas se re-suspendieron con 6 ml de citrato DPBS/HSA y se transfirieron a un tubo conico de 15 ml esteril, en el que 0,9 ml de elucion de peptido CD8 (AAEGLDTQRFSG; SEQ ID NO. 83) se anade a 10,0 mg/ml (concentracion final de peptido: 1,5 mg/ml). La solucion roseta/peptido se incuba a 37 °C durante 30 minutos en un mezclador Dynal que gira a 20 rpm. La solucion incubada se mezcla vigorosamente con una pipeta de 5 ml . La pipeta se enjuaga dos veces con 2 ml de citrato DPBS/HSA, y el volumen enjuagado se anade al tubo de 15 ml. Las perlas se separan de las celulas en un iman MPC-6 durante 3 minutos y el sobrenadante recogido, el cual contiene las celulas CD8+, en un tubo conico de 50 ml. Las perlas se lavaron tres veces con 10 ml de citrato DPBS/HSA, y la etapa de separacion con el iman se repite. Los sobrenadantes que contienen las celulas CD8+ liberadas se mezclan junto con el primer sobrenadante. Las perlas perdidas se eliminan de la suspension de celulas agrupadas mediante la separacion con el iman MPC-1 durante 5 minutos. El sobrenadante combinado se transfiere a un tubo conico de 50 ml y se mide su volumen. Despues de la dilucion al 1:20 con azul de tripano (suspension de celulas de 20 ml + 380 ml de azul de tripano) las celulas (viables y muertas) se contaron usando un hemocitometro. La proporcion de celulas vivas (no-tenidas por azul de tripano) de las celulas totales (celulas tenidas mas no-tenidas) el porcentaje calculado se define como viabilidad celular. Las celulas de aproximadamente 4.0 x 107 se retiran para una prueba inmediata mediante analisis FACS, caracterizacion celular y la deteccion del virus, se dividieron en partes iguales en dos tubos esteriles de 15 ml conicos. Las restantes CD8+ se sedimentan por centrifugacion durante siete minutos a 1700 rpm (600 x g). El sobrenadante se aspiro con una pipeta de 25 ml, y luego se centrifugo durante un minuto a 1700 rpm (600 x g) para sedimentar las celulas. El exceso de sobrenadante se retiro con una pipeta de punta fina. El sedimento celular se re-suspendio con 14 ml de citrato DPBS/HSA, se transfirio a un tubo conico esteril de 15 ml, y se centrifugo de nuevo durante siete minutos a 1700 rpm (600 x g). El sobrenadante se aspiro de nuevo con una pipeta de 10 ml, se centrifugo durante un minuto a 1700 rpm (600 x g) para sedimentar las celulas y se elimino el exceso de sobrenadante utilizando una pipeta de punta fina. A continuacion se re- suspendio el sedimento celular en un frasco T75 a una concentracion de 3.3x106 celulas/ml usando medio completo RPMI suplementado con 10% de suero autologo inactivado por calor (HIAS), preparado como se ha descrito anteriormente. Se lleva a cabo el analisis FACS de una muestra de celulas y los resultados se registran.

Recoleccion de celulas no-CD8.

[0217] Despues que los lavados de roseta se completaron como se describio anteriormente, la bolsa de residuos A se sella, se limpia con alcohol esteril y se transfiere a una cabina de bioseguridad (p. ej., una campana). La bolsa de residuos se pincha con una punta esteril y conector de punta, la suspension celular se recoge en un frasco pesado y esterilizado previamente 500ml (Nalgene, numero de catalogo 2019-0500). Despues de la recoleccion, la botella se pesa de nuevo para estimar el volumen de suspension de celulas no-CD8 basado en la aproximacion de que 1 g = 1 ml. El resto de bolsas y los tubos del set Isolex se desechan. Luego se anade DPBS para que el volumen de suspension de la celula no-cCD8 llegue hasta 480 mL y se mezcla. Vease a continuacion si el volumen de la suspension de celulas no-CD8 es mayor a 480 ml antes de la adicion de DPBS.

Separacion y cosecha de celulas no-CD8.

[0218] Con el fin de separar las celulas no-CD8, se pipetean 15 ml de Ficoll-Paque PLUS (Pharmacia; numero de catalogo 17-1440-03) en cada uno de los dieciseis tubos de centrffuga de 50 ml. Si el volumen de la suspension de

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celulas no-CD8 recolectados como se describio anteriormente es mayor a 480 ml, el volumen de suspension no-CD8 se divide entre16 para calcular el volumen de entrega en cada tubo de centrffuga de 50 ml. Aproximadamente 30 ml (o 1/16a del volumen total como se describe anteriormente), de la suspension de celulas no-CD8 se pone cuidadosamente en capas en la parte superior del Ficoll-Paque PLUS Los tubos se colocan en cubos de centrffuga y se balancean cuidadosamente mediante la adicion de agua en los cubos. Los cubos balanceados se centrifugan a 2000 rpm (800 x g) durante 20 minutos a temperatura ambiente con el freno apagado. Con una pipeta de 10 ml, se recolectan las celulas no-CD8 de la parte superior en la capa Ficoll-Paque PLUS (p. ej., entre 13 y 15 ml/interfaz) y el material se translada a los doce tubos conicos de 50 ml, aproximadamente 20 ml maximo de la suspension celular por tubo. Cada tubo se llena con 50 ml con DPBS. A continuacion los tubos se centrifugan durante 10 minutos a 1700 rpm (600 x g) con el freno. El sobrenadante se aspira y se desecha, los sedimentos celulares se re-suspenden en un total de 200 ml de tampon citrato DPBS/HSA, y las celulas re-suspendidas se transfieren a 4 x 50 ml tubos esteriles y se centrifugan durante siete minutos a 1700 rpm (600 x g). Los sobrenadantes se aspiran de nuevo y se desechan. Los sedimentos celulares se re-suspendieron en 50 ml de tampon citrato DPBS/HSA y se homogeneizan. A continuacion, el homogeneizado se hace pasar a traves de un filtro esteril para celulas Falcon 2350 para eliminar los grumos de celulas.

Preparation de muestras de celulas.

[0219] El homogeneizado preparado de celulas no-CD8 como se describio anteriormente se diluye en acido acetico 2% en una proporcion de 1:100 (10 ml de suspension celular + 990 mL de acido acetico) con el fin de lisar los globulos rojos restantes. Despues se cuentan las celulas con un hemocitometro. Por analisis FACS aproximadamente 2 x 106 celulas. El analisis se lleva a cabo dentro de las dos horas, o fija. Una vez que el analisis FACS se realiza en la muestra de celulas, se registran los datos. El resto de las celulas no-CD8 se sedimentan por centrifugacion durante 7 minutos a 1.700 rpm (600 xg), el sobrenadante se aspira y el sedimento se re-suspende a una densidad de 1 x 108 celulas/ml en medio de congelacion, que es 5% de DMSO, 47% de Pentaspan y 48% de suero autologo inactivado por calor (preparado como se describio arriba). Aproximadamente se prepara 2 ml de medio de congelacion adicional para usarlo como una sensor de temperatura. El medio de congelacion se coloca entonces en hielo hasta que este listo para su uso. La suspension celular se distribuye en viales de congelacion Nuncen aproximadamente 1,0 ml alfcuotas (valor de unos 10 viales), y las celulas restantes se distribuyen en alfcuotas de 4,0 ml. Un vial adicional que contiene 1,0 ml de medio de congelacion se prepara para su uso como sensor de temperatura del sistema de congelacion. Todos los viales, incluyendo el vial sensor de temperatura, se coloca sobre hielo. Como se ha descrito anteriormente, los linfocitos 6 x 107 que se pusieron a un lado se sedimentan por centrifugacion durante siete minutos a 1700 rpm (600 x g), y el sobrenadante se aspira. Entonces el sedimento celular se re-suspendio en 6 ml de medio de congelacion. Los viales Nunc de congelacion estan etiquetados con el numero de protocolo y la informacion del paciente, y la suspension celular se distribuye en los viales en alfcuotas de 1,0 ml aproximadamente (valor de unos 6 viales). Los viales se colocan en hielo.

Estimulacion primaria de celulas CD8+ con xCPAs de DROSOPHILA

[0220] La estimulacion de las celulas CD8+ se realiza inmediatamente despues de la finalizacion del procedimiento de seleccion de celulas CD8+ descrito anteriormente. La suspension de celulas CD8+ preparadas como se describio anteriormente, se mezcla en 3.3 x 106 celulas/ml en medio RPMI 1640, que se complementa con L-glutamina, aminoacidos no-esenciales, piruvato de sodio y una solucion de HEPES, conteniendo 10% de suero autologo, con la suspension del peptido-cargado de xCPAs de Drosophila, preparado y cargado de peptido como se describio anteriormente, en una proporcion de una xCPA a diez celulas CD8+. Esto corresponde a aproximadamente 0,1 ml de suspension de xCPA por cada 3,0 ml de suspension de celulas CD8+ (1:30 factor de dilucion). Entonces, el numero de frascos necesarios se determina dividiendo el volumen (en ml) de la suspension mezclada de celulas CD8+y xCPA entre 15 ml. Se pegan etiquetas de colores con codigos a los frascos T75 (Costar 3376) y se marcan con el numero del paciente, la fecha y volumen. La suspension mezclada de celulas CD8+-xCPA, conteniendo celulas CD8+ y xCPA a continuacion se homogeneiza por agitacion, y el homogeneizado se distribuye en los frascos por igual. Se anade no menos que 15 ml de suspension celular a cada frasco. A continuacion los frascos se colocan en posicion vertical en un incubador humidificado a 37 °C con 5% de CO2 y se incubaron durante cuatro dfas.

[0221] En el cuarto dfa del proceso, el cultivo celular se muestrea para la produccion de gamma IFN, y se anaden IL-2 e IL-7 a la concentracion final 20 Ul/ml y a 30 U/ml respectivamente. En primer lugar, 3 ml del sobrenadante de suspension celular se retira de tres frascos (0,9 ml total) y se coloca en un tubo Eppendorf. El tubo Eppendorf se hace girar durante dos minutos en una microcentrffuga. El sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo Eppendorf y se almacena a - 80 °C. Se calcula a continuacion la cantidad de cada stock de citoquina requerido: las citocinas se diluyeron a 1:1.000 de la concentracion del stock, y un volumen apropiado de esta dilucion de stock se anade a las celulas en RPMI sin suero (0,5 ml / frasco). Una vez completado este calculo, los de citoquinas se retiran del congelador a - 80 °C y se descongelan rapidamente a 37 °C. Las citoquinas se mantienen en hielo una vez descongeladas, y se usan dentro de las dos horas de la descongelacion inicial. Los tubos de citoquinas restantes se colocan a - 80 °C. Las citoquinas se desechan despues de un ciclo de congelacion / descongelacion. Las citoquinas diluidas en medio se distribuyen a cada frasco, y cada frasco se devuelve a la incubadora.

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Primera re-estimulacion de celulas CD8+ cebadas con celulas adherentes non-CD8

[0222] Las xCPA cargadas con peptido cebadas con celulas CD8+, que son celulas efectoras, se volvieron a estimular con celulas adherentes (celulas no-CD8) cargadas con peptido en el dfa 6 o 7 en una proporcion de 1 a 2 celulas adherentes a 10 celulas efectoras. En primer lugar, las celulas se agruparon para la re-estimulacion en el dfa 6 del proceso. Los frascos T75 de celulas efectoras se retiraron de la incubadora y se inspeccionaron visual y microscopicamente para una posible contaminacion. Ningun frasco identificado como contaminado se descarta antes de la re-estimulacion de las celulas. Las celulas efectoras no contaminadas se pipetean en un frasco T225 con tapon aerado, y se cuentan las celulas con un hemocitometro despues de diluirlas 1: 4 en azul de tripano (muestra de celulas de 50 ml + 150 ml de azul de tripano). El volumen de suspension celular equivalente a aproximadamente 15 x 106 celulas efectoras utilizado para las pruebas de micoplasma (metodo de cultivo 28 dfas; se describe a continuacion). Frascos con las celulas restantes se devuelven a la incubadora en posicion vertical hasta que este listo para seguir procesando.

Preparacion de celulas efectoras cebadas para re-estimulacion.

[0223] Se re-estimularon hasta 4 x 108 de celulas efectoras cebadas CD8+. El volumen requerido para suspender la cantidad de celulas efectoras cebadas a ser re-estimuladas se calcula en 2 x 106 celulas/ml . El volumen de suspension celular calculado se divide entre 15 -18, lo que representa 15 ml-18 ml de alfcuotas, con el fin de determinar cuatos frascos T75 con celulas adherentes deben ser preparados para el procedimiento de re- estimulacion. Las celulas efectoras cebadas CD8+ se cosechan ya sea durante el procedimiento de adherencia o el procediemiento de peptido-pulsantes para las celulas adherentes, como se describe a continuacion. El exceso de suspension de celulas efectoras puede ser congelado para su uso posterior por centrifugacion a 1700 rpm durante siete minutos, eliminando el sobrenadante, y re-suspendiendo los sedimentos celulares a una concentracion de 1 x 108 celulas/ml en solucion de congelacion (DPBS que contiene 10% de DMSO y 5% HSA), que ha sido previamente enfriado en hielo antes de la adicion a los sedimentos celulares. Una vez que las celulas se re- suspenden con la solucion de congelacion pre-refrigerada, la re-suspension se divide en alfcuotas en un numero adecuado de viales de congelacion, y los viales de congelacion se colocan despues en un modulo de Preservacion Cryo StrataCooler que ha sido pre-enfriado a 4 °C. El modulo de Preservacion StrataCooler Cryo se transfiere a continuacion a un congelador a - 80 °C y se deja durante la noche. El dfa siguiente, los viales se transfieren a un congelador a -140 °C.

Preparation de las celulas CD14+ non-CD8 para re-estimulacion.

[0224] El rango del numero de celulas CD14+ no-CD8 necesarias en el procedimiento de re-estimulacion se determina multiplicando el numero de celulas efectoras CD8+ cebadas para re-estimular por 0.1 y 0.2, de tal manera que se lograra una relacion de aproximadamente 1 a 2 celulas CD14+ no-CD8 a 10 celulas efectoras cebadas CD8+ . El rango del numero de celulas no-CD8 a descongelar se calcula entonces dividiendo ambos numeros de celulas CD14 + no CD8 necesarias por el porcentaje de celulas CD14+ no-CD8 presentes en la fraccion no-CD8 tal determinada por citometna de flujo, como se describio arriba. Los numeros se redondean a 1 x108celulas mas cercanas. Las celulas autologas no-CD8 que anteriormente se congelaron a 1 x108 celulas/vial (vease mas arriba) se descongelan rapidamente en un bano de agua a 37 °C. Las celulas descongeladas se lavan mediante la transferencia de hasta cinco viales en un tubo conico de 50 ml y anadiendo lentamente 9,0 ml de RPMI completo por cada ml de celulas congeladas. Una muestra de 20 ml de la suspension celular a partir de uno de los tubos se diluye con 180 ml de azul de tripano (es decir, dilucion 1:10), y se determina el recuento de celulas viables. El numero total de viable, descongelado de celulas no-CD8 se determina a continuacion multiplicando el total del volumen descongelado de la suspension de celulas no-CD8 por el recuento de celulas determinado para la muestra de 20 ml. El porcentaje de recuperacion tambien se determina dividiendo el numero de celulas viables entre el numero teorico de celulas descongeladas. Esta recuperacion% se utiliza en la re-estimulacion posterior y los procedimientos de expansion no espedficos, se describen a continuacion. El numero viable de celulas no-CD8 recuperadas se confirma estar dentro del rango de celulas no-CD8 requeridas como se determino anteriormente. Si es necesario, se descongela un vial adicional de celulas no-CD8 y se cuenta con el fin de lograr esta cantidad requerida. La suspension celular se transfiere en tubos conicos esteriles de 50 ml y se sedimenta por centrifugacion durante siete minutos a 1500 rpm (450 x g). Los sobrenadantes se aspiran y se desechan. Se prepara un volumen de RPMI completo suplementado con 10% de suero autologo inactivado por calor (HlAS) y p2 microglobulina a 5,0 mg/ml (dilucion de 1: 200 de stock 1.0 mg/ml ) suficiente para anadir en 3.5 ml por frasco de celulas efectoras CD8+ para ser re-estimuladas, ademas de un extra de 1,0-1,5 ml. Los sedimentos de celulas no-CD8 se re- suspenden con este medio y se agrupan en un unico tubo conico esteril de 50 ml. El tubo conico de 50 ml que contiene la suspension celular no-CD8 se coloca en una bolsa ziploc y se irradia con gamma a 5.000 rads. Despues de la irradiacion, las celulas no-CD8 se regresan a la cabina de bioseguridad.

Adherencia y carga de celulas no-CD8 con peptidos de melanoma.

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[0225] Los peptidos de melanoma utilizados en la estimulacion primaria de las celulas CD8+ se anade a la concentracion final de celulas irradiadas a 30 mg/ml (dilucion de 1: 333 de stock 10.0 mg/ml en DMSO). La mezcla de suspension celular celular con peptido (3,5 ml/frasco) se distribuye despues en frascos T75 con tapones de ventilacion (Costar 3376) y se incuban en posicion vertical durante dos horas a 37 °C en 5% de CO2 para permitir que las celulas adherentes se peguen a la superficie de plastico . Las celulas no adherentes se desalojan pipeteando suavemente el sobrenadante contra la capa de celulas adherentes con una pipeta de 5,0 ml y las celulas desalojadas se desechan. El resto de las celulas adherentes se lavan pipeteando 5 ml de DPBS en cada frasco y luego se desecha el lavado. Se prepara un volumen de medio Leibovitz L15 suplementado con 1% HSA (dilucion de 1:25 de stock al 25%), 5,0 mg/ml de p2 microglobulina (dilucion de 1: 200 del stock al 1,0 mg/ml) y 30,0 mg/ml de mezcla de combinacion melanoma peptidos (dilucion de 1: 333 de stock al 10,0 mg/ml) suficiente para suministrar 3,5 ml por frasco de celulas adherentes. A cada frasco se anade entonces 3,5 ml del medio, y los frascos se incuban a continuacion en posicion vertical durante 90 minutos a temperatura ambiente en una cabina de bioseguridad.

Incubacion de celulas efectoras CD8+ cebadas con celulas adherentes no-CD8 cargadas con peptido.

[0226] El estimulo primario de celulas efectoras CD8+ preparadas como se describio anteriormente se cosechan para la reestimulacion con celulas adherentes no-CD8+ calculando primero el volumen total necesario para ajustar las celulas efectoras CD8+ que quedan en el frasco T225 a 2,0 x 106 celulas/ml. Los frascos T225 que contienen celulas efectoras CD8+ se retiran de la incubadora y se colocan en una cabina de bioseguridad (p. ej., una campana). Con una pipeta, se retira suficiente suspension celular de las celulas que se agruparon en el frasco T225 para dejar un tercio del volumen total, se ajusto a 2.0 x 106 celulas/ml. El resto de la suspension celular se coloca en una cantidad apropiada en tubos conicos de 50 ml para centrffuga. La suspension celular en los tubos conicos de 50 ml se centrifuga durante siete minutos a 1700 rpm (600 x g), y se retira el sobrenadante con una pipeta. Este sobrenadante, que esta en medio condicionado, se retiene para hacer pruebas de micoplasma, como se describe a continuacion. El exceso de suspension de celulas efectoras puede ser congelado para su uso posterior por centrifugacion a 1700 rpm durante siete minutos, eliminando el sobrenadante, y re-suspendiendo los sedimentos celulares a una concentracion de 1 x 108 celulas/ml en solucion de congelacion (DPBS que contiene 10% de DMSO y 5% HSA), que ha sido previamente enfriado en hielo antes de la adicion a los sedimentos celulares. Una vez que las celulas se re-suspenden con la solucion de congelacion pre-refrigerada, la resuspension se divide en alfcuotas en un numero adecuado de viales de congelacion, y los viales de congelacion se colocan despues en el Modulo de Preservacion StrataCooler que ha sido pre-enfriado a 4 °C. El Modulo de preservacion StratCooler Cryo se transfiere a continuacion a un congelador a - 80 °C y se deja durante la noche. El dfa siguiente, los viales se transfieren en un congelador a - 140 °C.

[0227] Usando un volumen de medio equivalente a 2/3 del volumen final, las celulas efectoras sedimentadas se re-suspenden en RPMI completo fresco 10% suplementado con 10% de HIAS, IL-2 a 20 U/ml e IL-7 en 30 U/ml, y se anade a las celulas que quedan en medio condicionado en el frasco T225. El medio procedente de los frascos T75 cubiertos con celulas adherentes autologas pulsadas con peptido se aspira en una cabina de bioseguridad (p. ej., una campana). La suspension de celulas efectoras luego se pipetea en los frascos cubiertos, 15 -18 ml/frasco, segun lo calculado anteriormente. Los frascos se regresan a la incubadora y se incuban a 37 °C, 5% de CO2 durante tres o cuatro dfas, dependiendo de si la estimulacion xCPA se realizo en un miercoles o un martes, respectivamente.

[0228] La muestra reservada para las pruebas de micoplasma como se ha descrito anteriormente, se prepara a continuacion, ajustando primero la muestra de prueba de micoplasma a 0.5 x 106 celulas/ml (30 ml de volumen final) anadiendo de nuevo el sobrenadante, que esta en medio condicionado, que fue guardado para las pruebas de micoplasma. A continuacion la mezcla se divide en dos alfcuotas una de 2 ml cada una y una alfcuota de 26 ml. Cada alfcuota se congela colocandola ya sea en hielo seco/isopropanol o nitrogeno lfquido, sellado con Parafilm®, colocada en una bolsa ziploc, y se almacena a - 80 °C hasta su envfo en hielo seco para BioReliance para las pruebas de micoplasma.

Ajustes de densidad celular y cambios de medio despues de la primera re-estimulacion de celulas efectoras.

[0229] El ajuste de la densidad y los cambios de medio se llevan a cabo en los dfas 9 6 1 y 126 1 del proceso de produccion de terapia celular. El procedimiento para realizar estos ajustes y cambios de medio es identico para todos los dfas, y se presenta a continuacion. En primer lugar, los frascos T75 cubiertos de celulas adherentes que contienen celulas efectoras se retiran de la incubadora y se cuentan las celulas de un frasco para determinar el recuento de celulas viables mediante la preparacion de una dilucion de 1: 4 con azul de tripano (muestra de 50 ml de celulas + 150 ml de azul de tripano). Desde el recuento de celulas viables obtenido, el volumen total necesario para ajustar la densidad celular se calcula en 2x106 celulas/ml. Con una pipeta, se retira suficiente suspension celular para dejar un tercio del volumen total en el frasco. La suspension retirada se coloca en tubos conicos de 15 ml para centrffuga (1 tubo por frasco T75), se centrifugan durante siete minutos a 1700 rpm (600 x g), y se elimina el sobrenadante. Luego los sedimentos celulares se re-suspenden con un volumen de RPMI completo fresco

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Segunda re-estimulacion de celulas efectoras CD8+ cebadas con celulas adherentes no-CD8 cargadas con peptido.

[0230] Las celulas efectoras CD8+ cebadas que se han sometido a la primera reestimulacion con celulas adherentes no-CD8 se preparan para una segunda reestimulacion en el dfa 15 6 1 del proceso de produccion terapia celular. Los procedimientos para el recuento, la preparacion, la irradiacion, la adherencia, y la carga de peptido con melanoma de celulas adherentes no-CD8 de la segunda reestimulacion de celulas efectoras son los mismos que los descritos anteriormente para la primera reestimulacion. La recoleccion de las celulas efectoras CD8+ se lleva a cabo durante el perfodo de 80 minutos de incubacion de la de carga del peptido si no se ha cosechado ya durante la incubacion de adherencia celular. El frasco T225 de celulas efectoras cD8+ agrupadas se retira de la incubadora y se coloca en una cabina de bioseguridad (p. ej., una campana). Con una pipeta, se retira un volumen de suspension celular igual de hasta 5 x 108 celulas de las celulas agrupadas. El volumen retirado se coloca en una cantidad apropiada en tubos conicos de 50 ml para centrffuga. Despues la suspension celular en los tubos conicos se centrifuga durante siete minutos a 1700 rpm (600 x g), se retira el sobrenadante y se desecha. A continuacion, el volumen total que se necesita para volver a suspender las celulas efectoras sedimentadas es de 2.0x106 celulas/ml en RPMI completo fresco (suplementado con 10% de HIAS, IL-2 a 20 U/ml e IL-7 en 30 U/ml). El exceso de celulas se congela en una solucion de congelacion como se describio anteriormente en el primer procedimiento de la reestimulacion. El medio de los frascos T75 rcubiertos con celulas adherentes autologas cargadas con peptido se aspira e una cabina de bioseguridad (p. ej., una campana). La re-suspension de celulas efectoras luego se pipetea en los frascos cubiertos T75 en 15ml, - 18 ml por frasco. Los frascos T75 se regresan a la incubadora y se incuban a 37 °C, 5% de CO2 durante dos dfas.

Ajustes de densidad celular y cambios de medio despues de la segunda re-estimulacion de celulas efectoras.

[0231] El ajuste de la densidad y los cambios de medio se llevan a cabo en los dfas 17 6 1 y 206 1 del proceso de produccion de terapia celular. Para el ajuste de la densidad celular y el cambio de medio en el dfa 17 6 1 los frascos T75 cubiertos que contienen celulas efectoras se retiran de la incubadora y se cuentan las celulas de un frasco para determinar el recuento de celulas viables mediante la preparacion de una dilucion de 1: 4 con azul de tripano (muestra de 50 ml de celulas + 150 ml de azul de tripano). A partir del recuento de celulas viables obtenido, el volumen total necesario para ajustar la densidad celular se calcula en 1.5 x 106 celulas/ml. Con una pipeta, se retira suficiente suspension celular para dejar un tercio del total del volumen del frasco. La suspension retirada se coloca en tubos conicos de 15 ml para centrffuga (1 tubo por frasco T75), se centrifugan durante siete minutos a 1700 rpm (600 x g), y se elimina el sobrenadante. Luego los sedimentos celulares se re-suspenden con un volumen de RPMI completo fresco suplementado con 10% de suero autologo y citocinas que corresponden a dos tercios del volumen total. A continuacion las celulas re-suspendidas se agregan nuevamente a las celulas que quedan en el medio condicionado en los frascos T75. Los frascos T75 se regresan a la incubadora y se incuban a 37 °C, 5% de CO2 durante tres dfas. El procedimiento para el ajuste de la densidad celular y el cambio de medio en el dfa 20 6 1 es identico al empleado en el dfa 17 6 1 exceptuando que el volumen total necesitado para ajustar la densidad celular es calculado por la densidad celular final de 2 x 106 celulas/ml en lugar de 1.5 x 106 cells/ml.

Expansion no especffica de celulas efectoras CD8+ por estimulacion OKT3

[0232] El dfa 21 6 1 del proceso de produccion de terapia celular (un dfa antes de la expansion de celulas no especffica), cuatro frascos T225 se cubren con OKT3 mediante la adicion de 30 ml de OKT3 mAb diluido a 4,0 mg/ml en DPBS (120 ml de OKT3 solucion esteril de stock coon 1,0 mg/ml en 30 ml de DPBS) a cada frasco. Los orificios de ventilacion de los frascos se sellan con Parafilm y se almacenan horizontalmente durante la noche a 4 C. Cada frasco T225 se utilizara para la estimulacion de un total de 8-10 x 107 celulas efectoras. [0233] El dfa siguiente (dfa 2261), se preparan celulas efectoras CD8+ para la estimulacion con OKT3 mAb. Los frascos que contienen celulas efectoras CD8+ se retiran de la incubadora y se inspeccionan visual y microscopicamente para una posible contaminacion. Ningun frasco identificado como contaminado se desecha. Las celulas no contaminadas se agrupan en una botella de Nalgene de 500 ml esteril y se cuentan despues de diluirlas en 1: 4 en azul de tripano (50 ml de muestra de celulas + 150 ml de azul de tripano). A continuacion, se determina el recuento de celulas viables. Aproximadamente 5 - 10 x 106 celulas viables se reservan para la tincion de tetramero, y otras 40 - 60 x 106 celulas viables se dejan de lado para las pruebas de virus de Drosophila. El volumen de suspension de celulas efectoras a recolectar para la estimulacion con OKT3, se calcula en base al numero de frascos cubiertos con anticuerpo anti-CD3 y el recuento celular viable por frasco cubierto de OKT3 de 8 -10 x 107 celulas efectoras. Cualquier extra de celulas adicionales se congelan utilizando el procedimiento de congelacion descrito anteriormente. La botella Nalgene se regresa despues a la incubadora.

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[0234] Un numero de celulas no-CD8 a descongelar para ser utilizadas como celulas alimentadoras durante la expansion celular no-espedfica se calcula usando una proporcion de cuatro celulas alimentadoras no-CD8 para estimular una celula efectora CD8+. Suponiendo que la recuperacion de celulas viables por vial no-CD8 congelado es la misma que la determinada para el primer procedimiento de re-estimulacion descrito anteriormente, el numero de celulas no-CD8 necesarias se divide entre el porcentaje de recuperacion de celulas viables. Este numero se redondea a 4 x108 celulas mas cercanas, ya que cada vial de celulas congeladas no-CD8 contiene aproximadamente 4 x108 celulas. Una vez que se determino el numero de celulas no-CD8 requeridas, las celulas autologas no-CD8 se descongelan rapidamente en un bano de agua a 37 °C. Las celulas descongeladas se transfieren en un numero apropiado de tubos conicos esteriles de 50 ml , al que se anade 9 ml de medio completo RPMI sin suero por cada 1 ml de celulas descongeladas. Las celulas se sedimentan por centrifugacion durante siete minutos a 1,500 rpm (450 x g), y el sobrenadante se apira y se desecha. Luego los sedimentos se re- suspenden a aproximadamente 1,5 x 107 celulas/ml en RPMI completo suplementado con 10% de suero autologo inactivado por calor (HIAS), y la suspension celular se transfiere a un tubo de centnfuga esteril de 250 ml. El tubo de centnfuga que contiene la suspension celular no-CD8 se coloca en una bolsa ziploc y se irradia con gamma a 3.500 rads. Despues de la irradiacion, las celulas no-CD8 se regresan a la cabina de bioseguridad. Acontinuacion, se anaden las celulas irradiadas no-CD8 al pool de celulas efectoras CD8+ en la botella Nalgene de 500 ml.

[0235] Se determina el volumen total requerido para anadir 125 ml de la suspension de celulas no-CD8/CD8+ en cada frasco cubierto con OKT3, y la diferencia entre este volumen total y el volumen actual de la suspension de celulas no-CD8/CD8+ de la botella Nalgene se hace ananiendo medio fresco (RPMI completo suplementado con 10% de suero autologo inactivado por calor) a la botella de Nalgene. A continuacion se anade IL-2 fresco a 20 IU/ml (dilucion a 1: 5000 dilucion de stock en 100 IU/ml). Desde este punto en adelante, no se anade IL-7 al cultivo de frascos cubiertos con OKT3 luego se retiran del congelador, la solucion OKT3 se retira de los frascos con una pipeta, y cada frasco se lava cuatro veces con 30 ml de DPBS en cada lavado. La suspension de celulas no-CD8/CD8+ despues es distribuida entre los frascos cubiertos con OKT3 (125 ml/frasco) e incubados horizontalmente durante dos dfas a 37 °C, 5% CO2.. Dos dfas mas tarde (Dfa 24 6 1), los frascos se retiran de la incubadora, y la suspension de celulas se recolecta de cada frasco con un rascador de celulas esteril de mango largo, manejando cada frasco por separado. Cada frasco contiene 125 ml de suspension celular.

[0236] El puerto luer-fitted de una bolsa de 3L Lifecell® (Nexell; numero de catalogo R4R2113) esta unida a una

jeringa esteril de 60 ml (sin piston), y las abrazaderas en los otros puertos estan cerrados. El contenido de cada frasco se transfirie a una bolsa separada, de modo que el numero de bolsas LifeCell llenas de suspension celular es igual al numero de frascos cubierto con OKT3 de donde se derivan las celulas. A continuacion para cada bolsa Lifecell, se anade 375 ml de medio X-Vivo10 (BioWhittaker; numero de catalogo 04-743Q) y 100 (ml de stock fresco IL-2 a 100 IU/ml para lograr una conectracion dinal de 20 IU/ml). El volumen total de cada suspension celular en cada bolsa Lifecell es ahora aproximadamente de 500 ml. Despues las bolsas Lifecell® se vuelven regresan a la incubadora y se colocan sobre una rejilla para permitir el intercambio eficiente de gases. Las bolsas se incuban durante tres dfas a 37 °C, 5% CO2. [0237Al final del periodo de incubacion de tres dfas (Dfa 2761), se anaden a

cada bolsa Lifecell® 500 ml de medio X-Vivo10 (BioWhittaker numero de catalogo 04-743Q). A continuacion se anade IL-2 fresco a 20 IU/ml (dilucion a 1: 5000 dilucion de stock en 100 IU/ml). Despues de la adicion de medio fresco, la abrazadera en el puerto luer de cada bolsa esta cerrada, la bolsa se hace girar para homogeneizar la suspension celular, y se extrae una muestra de 5 ml de suspension celular con una jeringa para pruebas de esterilidad, como se describe a continuacion. Cada muestra se analiza por separado. Las muestras son analizadas con un maximo de dos horas de haber sido tomada. Despues del muestreo, la abrazadera en el puerto luer se cierra de nuevo, y la conexion luer se tapa con una jeringa de 3 ml. Las bolsas Lifecell® se regresan a la incubadora y se colocan sobre una rejilla para permitir el intercambio eficiente de gases. Las bolsas se incuban durante 3 dfas a 37 °C, 5% CO2. Al final del periodo de incubacion de tres dfas (Dfa 306 1), se anaden 500 ml de medio X-Vivo10 (BioWhittaker numero de catalogo 04-743Q) a cada bolsa Lifecell®. A continuacion se anade IL-2 fresco a 20 IU/ml (dilucion a 1: 5000 dilucion de stock en 100 IU/ml). El volumen de cada bolsa es ahora de aproximadamente 1,500 ml. Despues de la adicion de medio fresco, cada bolsa se agita para homogeneizar la suspension de celulas y una muestra de 2 ml se extrae con una jeringa de una de las bolsas para determinar el recuento de celulas viables. El recuento de celulas viables se determina en la muestra de 2 ml despues de dilucion en 1: 4 en azul de tripano (50 ml de la muestra de celulas + 150 ml de azul de tripano).

Prueba de muestra previa a la cosecha y liberacion del producto de terapia celular

[0238] Previo a la cosecha del producto de terapia y a la liberacion, el producto de terapia celular se muestrea en las pruebas BacT/Alert prueba de esterilidad, tipificacion de HLA, pruebas de micoplasma por PCR, prueba de endotoxinas, pruebas de tincion de gram, deteccion de ADN de Drosophila, deteccion de ARN viral mediante PCR y la terapia celular fenotipo de productos asf como en pruebas de actividad (incluyendo el numero de celulas y determinacion de viabilidad, determinacion de fenotipo, y pureza de CD8+). Estas pruebas se realizan en varios otros pasos del proceso, en el proceso de fabricacion la terapia celular, como se menciono anteriormente y como se representa en las figuras 9A-9F.

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[0239] Usando el recuento de celulas viables determinado en el dfa 306 1, el volumen de suspension de celulas equivalentes a 5 x 107 celulas para incluirse en la muestreo se calcula a partir de cada bolsa Lifecell®. Usando una jeringa separada para cada bolsa, se retira el volumen calculado equivalente a 5 x 107celulas y se coloca en frascos separados T75. Las celulas en los frascos son inspeccionados visualmente para el color anormal o turbulento y se comprueban microscopicamente para detectar indicios de una posible contaminacion. Cualquier bolsa Lifecell a partir de la cual se detecten celulas contaminadas se desecha. Una muestra de 5 ml de cada uno de los frascos T75 se retira para iniciar el ensayo de esterilidad por BacT/Alert como se describe a continuacion. Cada muestra se analiza por separado. Las muestras se inocularon dentro de las 2 horas tras haber sido tomadas. Las suspensiones de celulas restantes se agrupan en un frasco T75. El recuento de celulas viables en la muestra colectiva se determina despues de la dilucion de 1: 4 en azul tripan (50 ml de muestra de celulas + 150 ml de azul de tripano). Un volumen calculado correspondiente a un total de celulas1 x 108 se utiliza para la preparacion de ADN y ARN asf como para Mycoplasma PCR ELISA como se describe a continuacion. Un volumen calculado correspondiente a un total de 1.95 x 107 celulas se utiliza para el ensayo de CTL como se describe a continuacion. Un volumen calculado que corresponde a un total de 5 -10 x 107 celulas se reserva para la tincion de tetramero como se describe a continuacion. Despues del muestreo, las bolsas LifeCell se regresan a la incubadora y se incuban hasta que esten listas para cosechar las celulas.

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Prueba BacT/Alert para esterilidad del producto de terapia celular.

[0240] En el proceso BacT/Alert® (bioMerieux, Inc.) las pruebas de esterilidad se inician aproximadamente en el dfa 27 (una semana antes de la recoleccion de celulas), y aproximadamente en el dfa 30 (despues de la ultima adicion del medio de cultivo). La toma de muestras para pruebas de liberacion tambien se realiza en el dfa 30, despues de la ultima adicion del medio del cultivo, como se describe anteriormente.

[0241] El metodo de prueba rapida de esterilidad BacT/Alert® es utilizado para poner a prueba el proceso y la esterilidad del producto final. BacT/Alert ® es un dispositivo de diagnostico aprobado por la FDA. Se trata de un sistema no invasivo de deteccion microbiana totalmente automatizado que utiliza la deteccion colorimetrica de la produccion de dioxido de carbono para la deteccion del crecimiento de microorganismos. El sistema BacT/Alert ® incuba, agita, y monitorea continuamente los cultivos. El BacT/Alert se utiliza de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez que se introduce una botella que contiene una muestra en el instrumento, no hay necesidad de ninguna otra intervencion del operador hasta que se detecte un positivo, o cuando el perfodo de incubacion de siete dfas se completa. El sistema consiste en un instrumento de deteccion, sistema informatico, y frascos de cultivo aerobios y anaerobios con sensores colorimetricos incorporados.

[0242] Cuando una botella que contiene una muestra de ensayo se coloca en una celula de instrumento, un pequeno diodo emisor de luz (LED) expone el sensor situado en la parte inferior de cada botella a un haz de luz roja. La luz reflejada se recoge cada diez minutos por un fotodiodo incorporado en cada celula, donde se transforma, se amplifica y se transmite al sistema del ordenador para la interpretacion. El software del ordenador genera una curva de crecimiento para cada botella, y mediante el uso del algoritmo de deteccion, discrimina entre la produccion de CO2 constante y velocidad acelerada de la produccion de CO2 causado por microorganismos en crecimiento. El algoritmo del software puede detectar un alto nivel de CO2 cuando una botella se carga primero en el instrumento, o puede sentir una alta tasa de produccion de CO2, o puede medir una aceleracion en la tasa de produccion de CO2. En las dos primeras mediciones detecta organismos que han crecido o estan en crecimiento antes de la entrada en el instrumento. A medida que se genera CO2 adicional dentro de la botella de cultivo, el sensor incorporado cambia de color gris oscuro a amarillo. Ya que cada muestra se compara con su propio desempeno pasado en lugar de un umbral preestablecido, verdaderos positivos se detectan rapidamente y sin aumento de falsos positivos.

[0243] El producto de terapia celular se libera condicionalmente si todas la pruebas en el proceso de BacT/Alert son negativas el dfa de infusion de celulas. El producto de terapia celular es estable durante 42 horas despues de la formulacion, lo que requiere su envfo inmediato al sitio clfnico antes de obtener resultados finales de las pruebas de esterilidad. BacT/Alert se lee 18 6 2 horas despues de la inoculacion del producto final. La notificacion de que la lectura de esterilidad de 18 6 2 hrs del producto final fue negativo se proporcionara al sitio clfnico. Esta notificacion se recibe antes de la infusion celular para documentar la liberacion provisional del producto de terapia celular. La version completa se documenta despues de que la muestra de producto de terapia celular es negativo despues de la plena incubacion de siete dfas.

Tipificacion de HLA de producto de terapia celular.

[0244] La tipificacion de HLA basado en la PCR se realiza en muestras de productos de aferesis linfatica (PBMCs) y muestras de celulas efectoras CD8+ obtenidas a partir de producto de terapia celular cuatro dfas antes de la cosecha producto de terapia celular. El ADN genomico se preparo a partir de PBMCs o celulas efectoras CD8+ utilizando el kit Qiagen Blood AmpDNA (Qiagen) segun las instrucciones del fabricante. Plantillas para HLA-A, HLA- A2 y HLA-DR a partir de kits de escritura Genovision (GenoVision) son preparados para la PCR. La mezcla maestra

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de PCR incluidos en el kit se agrega junto con el ADN genomico purificado a cada plantilla tambien. Cada pozo tiene un tope y plantillas de carga en el termociclador. Los parametros de PCR incluyen un programa de ciclo combinado 10/20. Las muestras se ejecutan en 2% geles de agarosa que contienen bromuro de etidio, y los resultados fotografiados utilizan una estacion de documentacion foto-UV. Los resultados de la tipificacion de HLA se determinan mediante el uso de lotes especfficos de interpretacion y tablas de especificidas suministrados con el kit de Genovision. Antes de la liberacion, se verifican los resultados de la tipificacion de HLA del producto de terapia celular para la 5 identidad con aquellas del producto inicial de aferesis linfatica. La compatibilidad de HLA con las celulas de nuevos pacientes se confirma antes de la liberacion del producto de terapia celular.

Prueba de microplasma de producto de terapia celular.

[0245] A las muestras de productos de terapia celular se le realizan pruebas de micoplasma utilizando el kit de Roche Mycoplasma PCR-ELISA (Roche). Tanto el sobrenadante del cultivo CD8+ como el ADN genomico preparados a partir del producto de terapia celular se prueban en este ensayo. El producto de terapia celular se muestrea tal como se describe anteriormente, y las celulas y/o restos sedimento por centrifugacion a baja velocidad. La prueba se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes se eliminan y se centrifugan a alta velocidad para sedimentar micoplasma. Los sobrenadantes se eliminan y cada sedimento se re-suspende en 10 ml de tampon de lisis y 10 ml de agua esteril Se anade ADN de control positivo (10 ml) a un tubo de microcentrffuga con 10 ml de tampon de lisis. Para los controles negativos duplicados, se anaden 10 ml de agua y 10 ml de tampon de lisis a cada uno de los dos tubos de microcentrffuga. Todas las muestras se incubaron a 37°C durante una hora. Despues de la adicion de tampon de neutralizacion, a cada muestra se anaden 10 ml de cada uno a 40 ml de mezcla de PCR. La PCR se ejecuta en muestras duplicadas de sobrenadantes CD8+ junto con controles positivos y negativos siguiendo el protocolo del fabricante. Se incuba un reactivo de desnaturalizacion (40 ml) durante 10 minutos a temperatura ambiente con 10 ml de cada uno de los productos de reaccion PCR. La reaccion de hibridacion que contiene la sonda de captura marcada con biotina se anade a cada muestra y se transfiere la mezcla al pocillo apropiado de la placa de microtitulacion que contiene MTP cubierta con estreptavidina. La placa se incuba a 37 °C durante tres horas con agitacion orbital a 300 rpm. Despues de lavar, se anade la solucion de trabajo anti-DIG-POD y la placa se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos a 300 rpm. La placa se lava cinco veces y el se incuba el sustrato TMB en la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos a 300 rpm. Se anade solucion de parada y la absorbancia es medida usando un lector de placas de microtitulacion a 450 nm. La muestra de prueba se considera positiva si la absorbancia medida a 450 nm es el doble de la de los controles negativos. El ensayo se considera valido si la densidad optica de los controles negativos es de menos de 0,25 y el control positivo es> 1,2. Las muestras de prueba se consideran negativo cuando la diferencia en la absorbancia entre los controles negativos y las muestras de ensayo es inferior a 0,2. Para su publicacion, el producto de terapia celular es negativa para micoplasma por prueba PCR-ELISA .

Prueba de endotoxinas.

[0246] Las pruebas de endotoxina se realizan por medio de la tecnica fotometrica cinetica usando el kit de ensayo de endotoxina QCL-1000 de BioWhittaker de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La presencia de endotoxina en una muestra activa las enzimas presentes en una preparacion de lisado de amebocitos de Limulus(LAL). La actividad enzimatica se detecta mediante la adicion de un sustrato peptfdico. La escision de este sustrato peptido conduce a la liberacion de un fragmento de color que se cuantifica colorimetricamente.

[0247] El contenido de endotoxina de un producto administrado por via intravenosa se requiere ser 11 5.0 EU/kg/h. Para un individuo promedio de 70 kg, esto serfa equivalente a una dosis maxima total de 350 EU. El producto de terapia celular se formula en un volumen final de 300 ml de inyeccion de lactato de Ringer USP/5% de dextrosa al 0,9% de cloruro de sodio/25% de albumina de suero humano, se administra durante 30 minutos. Por lo tanto, el lfmite de endotoxina superior corresponde a 1,17 UE/mL de producto de terapia celular. Los niveles de endotoxina en el producto de terapia celular estan por debajo de 1,0 UE/ml para la liberacion del producto.

Pruebas de tincion de Gram.

[0248] La tincion de Gram se realiza usando un kit de ensayo estandar para este ensayo. Cada prueba (3 diapositivas) contiene como controles los prefijos organismos gram-positivos y gram-negativos, ademas de la muestra de ensayo de producto de terapia celular. Para su publicacion, no hay microorganismos detectados por tincion de Gram en la diapositiva que contiene la muestra de ensayo de producto de terapia celular.

Deteccion de ADN de las xCPA de Drosophila y xCPA del producto de terapia celular

[0249] Las celulas CD8+ derivadas del producto aferesis linfatica estan expuestos a xCPAs de Drosophila desde el principio del procedimiento de fabricacion. Las xCPAs deDrosophila son sensibles a la temperatura (cultivo mantenido a 25-27 ° C) y va a muriendo dentro de las 48 horas cuando se cultivan a 37 C. Un metodo de PCR se usa para confirmar la ausencia de ADN xCPAs de Drosophila en el producto final la terapia celular antes de la liberacion. El ADN xCPA deDrosophila es detectado por PCR usando cebadores especfficos para el vector de plasmido pRmHa-3 que se utiliza para transfectar celulas de Drosophila con el fin de crear la Drosophila

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xCPAs, como se describe anteriormente.

[0250] Las secuencias de vector de plasmido pRmHa-3 estan presentes en alto numero de copias en xCPAs de Drosophila y permanecen estables dentro de las celulas, proporcionando un marcador adecuado para la presencia de ADN xCpA de Drosophila en el producto de terapia celular. La ausencia de este vector resulta en la perdida de la expresion del antfgeno recombinante, que siempre se evaluo por citometrfa de flujo en el dfa de la estimulacion primaria. El vector plasmido pRmHa-3 esta presente en xCPAs de Drosophila que expresan acido nucleico transfectado xenogenico (p. ej., moleculas co-estimuladoras humanas y de adhesion). Las secuencias de cebadores usados para la deteccion de pRmHa-3 son los siguientes:

pRMHa-3 cebador 5' : 5'- CAGCAGCAAAATCAAGT -3'

(SEQ ID NO.72) pRMHa-3 cebador 3': 5'- GAAGAATGTGAGTGTGC -3'

(SEQ ID NO.73)

[0251] El metodo PCR utilizado para la deteccion de secuencias de ADN en el vector especffico Drosophila es una reaccion en cadena de la polimerasa de una sola etapa que disminuye la incidencia de falsos positivos en el ADN de doble cadena mediante la limitacion de la amplificacion de PCR para 25 ciclos. Se mezclan tubos de PCR individuales que contienen 400 ng de la muestra de aDn producto de terapia celular de ensayo en un volumen de 5 ml con 45 ml de la mezcla maestra de PCR que contiene Platinum Taq polimerasa (Invitrogen) y 250 ng de cada uno de los cebadores con vectores especfficos. Las muestras de ensayo y de control se colocan en un sistema GeneAmp PCR 9700 Thermal Cycler (Applied Biosystems) y se ejecuta la reaccion PCR durante 25 ciclos. El control positivo es total es el ADN xCPA de Drosophila, y el control negativo total es el ADN de las celulas naive CD8+ purificadas derivadas del producto de aferesis linfatica antes de la estimulacion de xCPA Drosophila. El tamano del control positivo de fragmentos de PCR son las siguientes: beta-2-microglobulina humana (479 pares de bases), LFA-3 (817 pb) humana, B7.1 (CD80, 965 pb) humana, B7.2 (CD86 , 1098bp) humana, A2.1 (1.207 pb) humana e ICAM-I (CD54, 1696bp) humana (Figura 10A, carril 2). Al termino de la reaccion de PCR, las muestras se ejecutan en un gel de agarosa al 2% y los resultados fotografiados utilizan una estacion de foto documentacion UV. La muestra de ensayo del producto de terapia celular se considera positiva si se observan bandas especfficas de ADN xCPA de Drosophila correspondientes a los insertos del vector (vease, p. ej., la Figura 10A, carril 2). La especificacion para el producto de terapia celular es que no se detecten bandas especfficas de ADN de Drosophila y los resultados son similares a los del control negativo en este ensayo.

[0252] La sensibilidad de deteccion de ADN xCPA de Drosophila fue determinado agregando dos veces diluciones en serie de una cantidad conocida del total de ADN xCPA de Drosophila en 400 ng de ADN CD8+. Se anadieron plasmido pRmHa-3 cebadores especfficos del vector (250 ng de cada uno) y Platinum Taq polimerasa (Invitrogen) y se ajusto el volumen a 50 ml con agua esteril. Despues de realizar un ciclo 25 de reaccion PCR, fue anadido 5uL de 10X de tampon de carga de gel a 25ul de cada reaccion y se ejecuto al 1% de agarosa de bajo punto de fusion/TAE gel a 50 V durante 1 hora. Fue determinado el limite del nivel inferior de deteccion delADN de Drosophila fue de <50 pg (Figura 10B, carriles 2-15); por lo tanto, la sensibilidad de deteccion esta en el intervalo del pictograma.

Deteccion de virus xCPA de Drosophila asociado al producto de terapia celular.

[0253] Como se ha descrito en el EJEMPLO 1, se determinaron tres virus de ARN especfficos de insectos endogenos que se asocian con las xCPAs de Drosophila : 1) Drosophila Nodavirus (DrNV), 2) Virus Drosophila X (DXV), y 3) Drosophila HPS-1-como virus. Las xCPAs de Drosophila se utilizan para estimular a las celulas CD8+ en el inicio del ciclo de cultivo ex vivo. Por lo tanto, las celulas CD8+ de la muestra se probaron para confirmar la ausencia de estos virus en el producto de terapia celular final. El ARN total, purificado a partir de muestras de celulas del producto de terapia celular utilizando el kit Qiagen RNAeasy (Qiagen), se cebo con oligo dT y transcripcion inversa utilizando transcriptasa superfndice inversa durante 50 minutos a 42 °C. Despues de la inactivacion de la enzima, la muestra celular xADNc celulas resultante del producto se trata con RNaseH durante 20 minutos a 37 °C. El producto de reaccion se coloco en hielo. La concentracion de CD8 + cDNA se determina por densidad optica a 260 nm. Para los controles positivos, se clonaron secuencias especfficas de virus en el plasmido pCR2.1 y el plasmido ADN linealizado para producir plantillas especfficas de virus de PCR-listo. Estos plasmidos que contienen plantilla virus del numero de copias conocido (20 y 100 copias virales) tambien se utilizan para enriquecer CD8+ cDNA a partir de muestras de productos de terapia celular, que se utilizan como controles positivos (vease a continuacion). Las secuencias de cebadores usados para la deteccion de secuencias virales son los siguientes:

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DXV :: hacia aselante 5-ATCGGTGCTGCCGATGGG - 3’(SEQ ID NO.74)

Reverso: 5’-TCTAAGTTCTCATTCTCGTTTGGC-3’(SEQ ID NO.75)

Amplicon:: 178bp

DrNV: hacia aselante: 5’- GAGCCGTACGTGATGCCG -3’ (SEQ ID NO.76)

Reverso:: 5’ TCATTGACGGCGAAGTGG 3’ (SEQ ID NO:77)

HPS-1 hacia adelante :: 5’-ATCTTCTGCCCTCCTGGTTT- 3’ (SEQ ID NO.78)

Reverso :: 5’-ATTTGCAACCGCATACCTTC- 3’ (SEQ ID NO:79)

Ampliacion:: 221 bb

[0254] El nivel se sensibilidad de la deteccion de secuencias virales en las preparaciones de ADNc de muestras de CD8+ (experimentos con muestras enriquecidas) primero es determinado de la siguiente manera. El ARN total se purifico a partir de celulas T CD8+. El ARN se transcribio de forma inversa con oligo dT y superfndice III transcriptasa inversa para producir ADNc de CD8-especffico. Los plasmidos que contienen la plantilla viral (DXV, HPS-1 y DrNV) son linealizados y se cuantifican por densidad optica a 260 nm. El numero de copias virales por 1 mg de plasmido que contiene la plantilla viral se determina para cada virus. Los cebadores especfficos del virus descritos anteriormente se utilizan en un ensayo estandar de SMART PCR con SYBR® Green 1, Hot Start Takara ADN polimerasa y 1 mg de ADNc CD8 +. Una gama de 10, 100 o 1000 copias de plantilla de virus se enriquece con la mezcla de reaccion por duplicado. Las diluciones de las plantillas especfficas de virus (de 20.000 copias a 2 copias) se utilizan para generar curvas de calibracion estandar para PCR en tiempo real cuantitativo. Se preparan cebadores de PCR especfficos de virus en una mezcla de ensayo de SMART PCR con SYBR® Green 1 y Hot Start Takara ADN polimerasa (Takara). Los controles negativos incluyen solamente ADNc CD8+ y solo mezcla de cebadores. Las muestras se ejecutan en el sistema Cepheid SmartCycler PCR. Se llevan a cabo los analisis de curva de fusion y de curva de amplificacion, y se registran los resultados en unidades de SyBr® Green 1 (SyG) detectado. La unidad del SyBr® se basa en la curva estandar para cada titulacion del virus (Tabla VII).

Tabla VII: Spike ADN CD8+: Nivel de deteccion de secuencias especfficas de virus en 1 mg de CD8 cDNA1

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Protocolo: Muestra ID Unidad SyG (10-18 g)

DXV + CD8+ Spike:: CD8+ + 10 copias 37

: CD8+ + 100 copias 256

: CD8+ + 1000 copias 4555

: Solo CD8+ 9

: Solo agua 22

DrNV + CD8+ Spike: CD8+ + 10 copias 58

: CD8+ + 100 copias 333

: CD8+ + 1000 copias 4919

: Solo CD8+ 40

: Solo agua 54

HPS + CD8+ Spike: CD8+ + 10 copias 23

: CD8+ + 100 copias 604

: CD8+ + 1000 copias 7969

: Solo CD8+ 0 (debajo de 10 ag std)

: Solo agua 0 (debajo de 10 ag std)

A 1 mg de CD8 + ADNc (CD8 +), se anaden cantidades conocidas de plantilla viral. La deteccion de 10-100 copias de cada plantilla viral por mg de CD8 + cDNA es alcanzable para los tres virus.

[0255] Para el ensayo de liberacion del producto de terapia celular, se incluyen muestras de ensayo, por triplicado, 200 ng de ADNc CD8+ en el dfa = 0 y 2,00 ng de de ADNc CD8+ derivada de las muestras de ensayo del producto de terapia celular. Las muestras de control positivas incluyen, por triplicado, 200 ng de ADNc CD8+ enriquecida con 20 y 100 copias de plantilla virus. Las muestras de control negativo contienen solamente la mezcla de PCR (sin plantilla) Todas las muestras se ejecutan en el Sistema Cepheid SmartCycler. El analisis de la curva de fusion y la curva de amplificacion se lleva a cabo para cada uno de los tres ensayos de PCR virales. Los controles positivos daran curvas de fusion especfficas y SyBr® Green Ivalores por encima del fondo (ADNc CD8+ en el dfa = 0). La especificacion para la liberacion del producto de terapia celular es que no se detecta amplificacion especffica del virus de Drosophila por encima de la observada en los controles negativos de parentesco.

[0256] La tabla VIII representa los resultados representativos de los ensayos realizados por triplicado obtenida en tiempo real cuantitativos de ensayo PCR en busca de virus adventicios identificados en naive (es decir, antes de la activacion con xCPAs, como se describe anteriormente) y de muestras de productos de terapia celular de cuatro pacientes donantes (PD1, PD2, PD3 y PD4). Los resultados muestran que cada producto de terapia celular probado (Dosis final) dio negativo para cada virus que se ensayo (es decir, unidades de SyG en cada dosis final fue menor que las unidades SyG para cada muestra naive correspondiente).

Tabla VIII : Multiple naive (no activado) y muestras de producto de terapia celular evaluado en timepo real cuantitativo PCR (Unidades SyG)1.

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Muestra: PD1 PD2 PD3 PD4

HPS-1

H2O: 0 0 0 0

Muestra naive: 0 0 0 0

Dosis final: 0 0 0 0

Dosis final -20 copias: 35 73 88 49

Dosis final - 10 copias: 230 263 314 443

DrNV

H2O: 0 0 0 0

Muestra naive: 4 31 7 4

Dosis final: 5 3 5 6

Dosis final -20 copias: 94 112 63 120

Dosis final -100 copias: 566 349 450 431

DXV

H20: 0 0 0 0

Muestra naive: 0 0 0 0

Dosis final: 0 0 0 0

Dosis final -20 copias: 87 64 91 96

Dosis final -100 copias: 344 319 320 381

A 0.2ug de CD8 cDNA, se anaden cantidades conocidas de plantilla viral. La detecci on de 20-100 copias de cada plantilla viral por mg de CD8 cDNA es alcanzable para los tres virus.

[0257] Tablas IX y X representan los resultados representatives de los ensayos por duplicado en las muestras obtenidas de donante normal 1 (ND1). En la Tabla IX, se sometio a ensayo 0,2 mg de ADNc CD8+. En la Tabla X, se sometio a ensayo 3,0 g de ADNc CD8+. Los resultados mostrados en las tablas IX y X muestran que cada prueba de producto de terapia celular (ND1 Dosificado CD8 +) dio negativo para cada virus puesto a ensayo (es decir, unidades de SyG en cada dosis final fue menos que las unidades SyG para cada muestra naive correspondiente). Los datos para HPS que se muestran solo en el ensayo mostrado en la Tabla X, como el suministro de ADNc CD8+ se agotaron en este unico ensayo. Sin embargo, la evaluacion rutinaria de muestras de ADNc del producto de terapia celular en esta concentracion consumirfa toda la muestra y prosiblemente impedirfa la realizacion de todas las pruebas requeridas y no permitirfa ensayos repetidos.

Tabla IX. RT/PCR cuantitativo del donante normal 1 (ND1) naive y celulas CD8+ dosificadas con cebadores especfficos virales1

Muestra: HPS (SyBr) DXV (SyBr) DrNV (SyBr)

ND1 Naive CD8+: 0 9 0

ND1 Dosificado CD8+: 0 0 0

ND1 Dosificado CD8++ 20: 115 77 67

ND1 D osificado CD8++ 100: 547 286 466

Solo mezcla de cebado: 0 0 0

1Cada muestra (0,2 mg) se llevo a cabo por duplicado en un ensayo estandar de SMART/PCR con cebadores especfficos del virus.

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Tabla X. RT/PCR cuantitativo del donante normal 1 (ND1) naive y celulas CD8+ con HPS cebadores especfficos virales1

Muestra: HPS (SyBr) DXV (SyBr) DrNV (SyBr)

ND1 Naive CD8: 0 ND* ND*

ND1 Dosificado CD8: 0 ND* ND*

ND 1 Dosificado + 20 copias: 89 ND* ND*

ND1 Dosificado + 100 copias: 361 ND* ND*

Solo mezcla de cebado: 0 ND* ND*

1Cada muestra (3mg) se llevo a cabo por duplicado en un ensayo estandar de SMART/PCR con cebadores especfficos del virus HPS.

*ND: No determinado (vease arriba).

[0258] Utilizando las reacciones de PCR descritos anteriormente, los cebadores especfficos virales de la Drosophila se utilizan para detectar las preparaciones CD8+ a partir de muestras de productos de terapia celular al final del proceso de cultivo ex vivo para la liberacion de los futuros lotes de producto de terapia celular. Cada una de las reacciones de PCR virales se llevan a cabo en ADNc aislado de celulas de Drosophila frescas (control positivo), ADNc preparado a partir de CD8+ de la muestra que nunca ha sido expuesta a las celulas de Drosophila (control negativo) y el producto final CD8+ que es evaluado durante la prueba de liberacion de una dosis del producto de terapia celular. El virus especffico detectable del producto en el control positivo esta ausente en las muestras CD8+ recogidas antes de la exposicion a las celulas de Drosophila y en el producto de terapia celular para que el producto de terapia celular sea liberado.

Producto fenotipo de terapia celular y actividad de ensayos.

[0259] Las caracterfsticas biologicas del producto de terapia celular se evaluan por medio de mediciones del numero total de celulas, viabilidad, fenotipo, y potencia. Ademas, se llevan a cabo durante los procesos de evaluaciones de numero de celulas viables, fenotipo, CD8+ y no-CD8+ composicion de celulas seleccionados durante todo el proceso de fabricacion de productos de terapia celular.

Numero de celulas nucleadas viables

[0260] El numero de celulas viables se controla en varios puntos del proceso de fabricacion del producto de terapia celular, incluyendo el punto previo a la liberacion producto de terapia celular. Los recuentos de celulas viables se determinan mediante la enumeracion de celulas diluidas en azul de tripano y cargados en un hemocitometro (vease p. ej., mas arriba). Un mfnimo de 100 celulas son contadas bajo un microscopio. La tabla XI resume los numeros de celulas grabadas de los productos obtenidos a partir de donantes de aferesis linfatica de tres paciente con melanoma, designados PD5, PD6, y PD7, y materiales celulares asociados en diversas etapas de la fabricacion de productos de terapia celular asf como la liberacion de los procesos de prueba.

Tabla XI: Numero de celulas de los productos de aferesis linfatica, material celular asociado, y los productos de terapia celular derivados de donantes de pacientes PD5, PD6, y PD7

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: Numero de celulas (x 106 celulas nucleadas)

Dias de proces o: Fraccionamiento celular PD5 PD6 PD7 Media Std. Dev.

0: Producto de aferesis linfatica (recuento total de celulas nucleadas) 16,000 14,000 6,630 12,210 4,934

: Celulas CD8+ seleccionadas 510 464 313 429 103

: Procesamiento posterior de Ficoll de celulas no-CD8+ seleccionadas 5,400 11,400 4,200 7,000 3,857

: Cultivo iniciador (estimulacion de peptido especlfico), numero de CD8+ usado para fabrication 485 438 290 404 102

6: Celulas en la 1ra restimulacion 300 299 410(a) 336 64

15: Celulas en la 2da restimulacion 701(a) 306 390(a) 466 208

(continuado)

: Numero de celulas (x 106 celulas nucleadas)

Dias de proces o: Fraccionamiento celular PD5 PD6 PD7 Media Std. Dev.

2o: Expansion de celulas en OKT3 520 420 370 437 76

: Pliegue de expansion (Dla 0 iniciacion-DIa 2061) 2.50 0.96 1.74 1.73 0.77

: Cultivo iniciador (expansion no- especlfica) numero de CD8+ usado para la estimulacion OKT3 400 400 370 390 17

30: Producto de terapia celular (final) 10,000 9,600 10,300 9,966 351

: Pliegue de expansion dla 3061 recuento de celulas 4 dla 20 recuento de celulas (Dla de initiation 2061- dla 25 24 27.8 25.6 1.97

(a)Solo 300 x 106 celulas que fueron re-estimuladas.

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[0261] El numero de celulas nucleadas totales en un producto de terapia celular para la liberacion es de entre 99 y 1010 celulas.

Viabilidad celular.

[0262] La viabilidad celular se evaluo contando las celulas diluidas en solucion de azul de tripano en un hemocitometro como se describio anteriormente. Se calcula el porcentaje de celulas viables, basado en la relacion de celulas vivas al total de celulas presentes. La tabla XII presenta la viabilidad de los lotes de productos de terapia de seis celulas preparadas a partir de productos obtenidos de donantes de aferesis linfatica de pacientes con melanoma, seis designados PD8, PD6, PD9, PD5, PD7, y PD10. La viabilidad media fue de 76,2%, con una desviacion estandar de ±2.6 (n=6). El proceso de fabricacion actual de productos de terapia celular produce habitualmente el 170%. Un producto de terapia celular

posee mas de 70% de viabilidad basandose en este metodo de ensayo a fin que el producto de terapia celular sea liberado.

Tabla XII: Viabilidad celular de los lotes de producto para seis terapias celulares

Lote: Viabilidad

-PD8: 76%

PD6: 72%

PD9: 80%

PD5: 74%

PD7: 78%

PD10: 77%

Producto fenotipo de terapia celular.

[0263] El fenotipo celular y la pureza de CD8 se determina mediante tincion de la superficie celular con anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia y analizado por citometrfa de flujo. Analisis de dos colores en el citometro de flujo FACScan, se lleva a cabo de acuerdo con el panel de anticuerpos monoclonales que se enumeran a continuacion. Marcadores para la caracterizacion del producto incluyen: CD3 (linfocitos T), CD4 (celulas T auxiliares), CD8 (celulas T citotoxicas), CD14 (monocitos), Cd19 (celulas B), CD16 (celulas NK) y CD15 (granulocitos). Las celulas usadas para las pruebas de citometrfa de flujo se lavan en tampon FACS (PBS que contiene BSA y azida de sodio) y se incubaron con los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia apropiados a 4 °C durante 15 - 30 minutos, protegido de la luz. Posterior a la incubacion, las celulas tenidas se lavaron y se re-suspendieron en tampon FACS. Las celulas tenidas se almacenan en hielo, protegidas de la luz, y se ejecutan en el citometro de flujo dentro de las dos horas de tincion. Alternativamente, si las muestras no se pueden analizar dentro de las dos horas, las muestras se fijan usando una solucion de 0,5% de paraformaldehfdo en DPBS y se almacenan durante una semana a 4 °C en la oscuridad. Un total de 10.000 eventos son recogidos para cada muestra. Los datos se analizan y se determina el porcentaje de celulas que son positivas para cada marcador. Tabla XIII representa el porcentaje de celulas presentes cD3+ y CD8+ en seis lotes de producto de terapia celular, derivados de productos obtenidos de donantes de aferesis linfaticas de pacientes con melanoma PD8, PD6, PD9, PD5, PD7, y PD10. La fraccion de celulas no tenidas con CD3+ y cD8+ se cree que son las celulas no viables. Estos datos sugieren que el porcentaje relativo de fenotipos CD3+ y CD8+ en diferentes lotes de productos de terapia celular sigue siendo relativamente constante (vease, p. ej., los porcentajes de medias y desviaciones estandar en la Tabla XIII.)

Tabla XIII: Analisis de fenotipo para lotes de producto de terapia celular de pacientes donantes de melanoma

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Paciente donante: % CD3+ % CD8+

PD8: 81 89

PD6: 75 86

PD9: 77 76

PD5: 77 82

PD7: 80 82

PD10: 78 80

Media %: 78 82.5

Std. Dev.: 2.0 4.2

[0264] Para evaluar la pureza de las celulas CD8+ antes y despues del procedimiento de seleccion Isolex300i, se lleva a cabo la tincion de la superficie celular con anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia y se analizan por citometrfa de flujo como se describio anteriormente. La tabla XIV muestra la distribucion de los productos fenotipo de aferesis linfatica y los lotes de productos de terapia correspondiente derivados de donantes paciente con melanoma DP8, Pd6, y pD9. Aislamiento de celulas CD8 +, utilizando el separador de celulas Isolex, dio lugar a 82 ± 9% (media ± SD, n = 3) de pureza, basado en la tincion anticuerpo monoclonal 37B1A con anti- CD8. Hubo niveles detectables de celulas CD4+ (3 ± 1,4%), CD14+ (2 ± 1,5%) y CD16+ (5 ± 2%). Esta poblacion de celulas parecfa estar desprovistas de celulas CD15+.

Tabla XIV: Distribucion del fenotipo celular para los productos de aferesis linfatica y lotes de productos de terapia

celulacorrespondientes

derivados de pacientes donantes de melanoma PD8, PD6, and PD9

Muestra: Marcador de PD8 PD6 PD9 Media Std. Dev.

: %CD3+ 30 54 45 43 8.6

: %CD4+ 41 42 31 38 4.3

: %CD8+ 10 7 14 10 2.5

Producto de afereris linfatica: %CD314+ 22 14 17 18 2.9

: %CD19+ 7 4 10 7 2.1

: %CD15+ 5 1 3 3 1.4

: %CD16+ 7 22 16 15 5.3

: %CD3+ 95 87 80 87 5.3

: %CD4+ 5 3 1 3 1.4

Poblacion seleccionada CD8+ (Separacion Isolex): %CD8+ 94 83 69 82 10.2

%CD14+: 4 0 1 2 1.5

%CD19+: 7 2 2 4 2.0

: %CD15+ 0 1 0 0 0.4

: %CD16+ 7 6 1 5 2.3

Potencia del producto de terapia celular.

[0265] Se lleva a cabo un ensayo de potencia de terapia celular se lleva para demostrar la actividad lftica especffica como una medida de la potencia del producto de terapia celular contra celulas diana que se han cargado con peptidos seleccionados (por ejemplo, peptidos de acuerdo con SEQ ID Numeros: 5, 6, 7, 8, 9, y 70, como se describe mas arriba). El metodo de ensayo de potencia de terapia celular es un ensayo de liberacion de 51Cr (vease, p. ej., Thorn et al., J. Immunol. Methods., 4(2), pp. 301-315 (1974)). Las celulas diana (celulas T2 - HLA-A2.1 +) se incuban con el isotopo radiactivo, 51Cr, durante una hora. El exceso de 51Cr no marcado se lava dos veces a partir de las celulas diana en medio de lavado.

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Las muestras individuales de celulas T2 cargadas de cromo son entonces cargadas con peptido durante 30 minutos a temperatura ambiente (20 mg/mL por peptido) con uno de los seis peptidos de melanoma (de tal manera que cada peptido diana sea probado individualmente usando una muestra independiente de celulas T2 cargadas de cromo), peptido-cargado control negativo de peptiido, o no cargadas con peptido. El producto de terapia celular (es decir, las celulas efectoras CD8+ inducidas por xCPA cargadas con peptido (E)) se mezclan entonces con celulas diana marcadas (T) en relacion E:T entre 0,4 -50 junto con las celulas en exceso sin marcar K562 utilizadas para neutralizar la citotoxicidad restringida de no-HLA.

Se incuba la suspension celular a 37 °C/5% de CO2 en un incubador durante cuatro horas. La lisis de las celulas

diana marcadas por las celulas del producto de terapia celular (E) resultan en la liberacion de 51Cr en el sobrenadante. Se retira post incubacion 100 mL de sobrenadante de cada pocillo y se transfiere a un contador gamma. La actividad lftica (E) en presencia de cada peptido individual es expresada como el porcentaje de lisis especffica como se determina por la siguiente ecuacion (vease la ecuacion:

Porcentaje de lisis especifica = 100X (Recuentos de muestras por minuto - Recuentos espontaneos por minuto)/(Recuentos maximos por minuto - Recuentos espontaneos por minuto)

Ademas de las celulas T2 cargadas con peptido, melanoma y lfneas celulares de control negativo tambien son utilizadas como blancos despues de haber sido cargadas con cromo. El procedimiento de ensayo es el mismo que el procedimiento utilizado con celulas T2 diana. Se detecta la lisis especffica, ya sea en T2 y/o en lfneas de melanoma para que el producto sea lanzado.

[0266] Los resultados de potencia (porcentaje de lisis especffica en una relacion 10:1 E:T ) para los lotes de productos seis productos de terapia celular derivados de productos obtenidos de donantes de aferesis linfatica de pacientes con melanoma PD8, PD6, PD9, PD5, PD7, y PD10 contra cada uno de las SEQ ID Numeros: 5, 6, 7, 9, y 70 se resumen en la Tabla XV.

Tabla XV: Potencia del producto de terapia celular (51Cr-ensayo de liberacion; n=6)

Dosis: SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.9 SEQ ID NO.70 Control negativo

PD8: 15.8% 9.6% 45.7% 18.1% 25.8% 3.8%

PD6: 30.7% 3.5% 14.6% 26.6% 18.0% 0.0%

PD9: 7.0% 5.7% 10.9% 75.4% 11.9% 4.7%

PD5: 29.0% 8.5% 20.6% 21.1% 21.3% 0.2%

PD7: 39.4% 25.5% 85.6% 16.5% 47.2% 9.6%

PD10: 26.6% 17.9% 78.7% 50.1% 33.3% 0.9%

Media: 24.8% 11.8% 42.7% 34.6% 26.3% 3.2%

Std. Dev.: 10.5% 7.6% 30.1% 21.4% 11.5% 3.4%

[0267] En un analisis similar, un peptido (SEQ ID NO. 8; YLEPGPVTA) se anadio a los cinco peptidos

que ya se han utilizado para generar la actividad de eliminacion en el producto de terapia celular. La capacidad de la sEq ID NO. 8, utilizado solo o en combinacion con otros peptidos de melanoma para generar la actividad de lisis especffica, se demostro en tres donantes normales, tal como se describe en la tabla XVI.

Tabla XVI: Potencia (medida en unidades lfticas) de las celulas efectoras de tres donantes normales (ND2, ND3,

y ND4) contra peptidos de melanoma

T2+Peptido (SEQ ID NO.): ND2 ND3 ND4

5: 16.8 12.9 17.2

6: 7.5 18.3 2

7: 5.2 14.1 39.4

8: 1.6 15.7 18.3

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(continuado)

T2+Peptido (SEQ ID NO.): ND2 ND3 ND4

70: 23.3 13.5 24.7

9: 31.8 59.3 37.9

5+6+7+ 8+9+70: 93.8 122.4 103.4

8*: 75.2 61.5 72.1

* Producto generado de terapia celular contra SEQ ID NO.8 solo.

Preparacion del producto para infusion

[0268] Con el fin de cosechar las celulas de productos de terapia celular y preparar una formulacion del producto de terapia celular, la suspension de celulas preparada anteriormente se homogeneiza por cada bolsa inmediatamente antes de la cosecha. Dos equipos de Fenwal spike/spike de tranferencia de plasma (pinzas cerradas) estan entonces metidos en los puertos no utilizados en cada bolsa Lifecell®. Cada bolsa se cuelga en un gancho de elevacion de la superficie de la cabina de bioseguridad. Se abren las abrazaderas en los equipos de transferencia de plasma, y las suspensiones celulares se drenan en dos botellas Nalgene esteril (1000 ml y 500 ml). Cada bolsa es colgada por separado. Despues de transferir las suspensiones celulares, 5 ml de suspension celular en cada bolsa Lifecell, se toman muestras de cada botella Nalgene 1000 ml y se colocan en un frasco T25 por separado. Las celulas en cada uno de los cuatro frascos T25 se comprueban visualmente para el color o turbidez inusual, y son microscopicamente inspeccionados para una posible contaminacion. Las celulas de la bolsa Lifecell® de las muestras contaminadas correspondientes se desechan. Las celulas no contaminados de los cuatro matraces T25 se reagrupan y se cuentan despues de una dilucion a 1: 4 con azul de tripano (50 ml de la muestra de celulas + 150 ml de azul de tripano). A continuacion, se determina el recuento de celulas viables. Aproximadamente 10 x 106 celulas son dejadas a un lado para analisis FACS El resto de la suspension celular se vierte en tubos conicos esteriles de 500 ml. Despues los tubos son pesados y balanceados anadiendo o retirando la suspension celular en una cabina de bioseguridad (campana) y las celulas restantes se sedimentan por centrifugacion durante 10 minutos a 1,700 rpm (600 x g). El sobrenadante se decanta y se desecha, los sedimentos se vuelven a centrifugar durante dos minutos a 2,000 rpm (800 x g). Cualquier sedimento restante se retira con una pipeta de 5ml.

[0269] A continuacion las celulas sedimentadas se lavan con el siguiente tampon de lavado, que se mezcla en una botella de 250 ml esteril: 192 ml 0.9% cloruro de sodio (NaCl) para inyeccion, USP, y 8 ml HSA (25% solucion) Buminate®. Todo los sedimentos se combinan en un total de 100ml de tampon de lavado, distribuidos en cuatro tubos conicos de 50 ml (25ml/tubo) y centrifugados durante 10 minutos a 1,000 rmp (200 x g). El sobrenadante se aspira y se desecha, los sedimentos de celulas se vuelven a centrifugar durante dos minutos a 2,000 rpm (800 x g). Cualquier sobrenadante restante se retira con una pipeta de punta fina. Despues cada sedimento celular se re- suspende en 25 ml de tampon de lavado y se centrifuga durante 10 minutos a 1,000 rpm (200 x g). Los sobrenadantes se aspiran y se desechan, los sedimentos celulares se vuelven a centrifugar durante dos minutos a 2,000 rpm (800 x g). Cualquier sobrenadante restante se retira con una pipeta de punta fina. Durante esta segunda centrifugacion a baja velocidad, la transferencia de un paquete de 1.000 ml (Baxter, numero de catalogo 4R2032) se sella y el tubo se desecha. A continuacion la bolsa de transferencia se equipa con un conjunto de transferencia de plasma (Charter Medical; numero de catalogo 03-220-90), y la informacion de identificacion del paciente se fija a la bolsa de transferencia. A continuacion cada sedimento celular se re-suspende, con 25 ml del siguiente tampon de resuspension (100 ml de volumen total), que se prepara en una botella esteril de la siguiente: 282 ml de medio de lactato de Ringer,12 ml al 5% de dextrosa y 0,9% de sodio cloruro para inyeccion, y 6 ml de HSA (solucion 25%) Buminate®. El tampon de re-suspension se pipetea a fondo para separar las celulas agrupadas. A 70 mm filtro de nylon de celulas esteril (Falcon 2350) se le coloca entonces sobre la abertura de una botella Nalgene esteril de 100ml. Los agregados celulares se eliminan de la suspension celular haciendolos pasar a traves del filtro de celulas. A continuacion, se desecha el filtro de celulas. A continuacion se cuentan las celulas viables y muertas despues de la dilucion en 1:50 con azul de tripano (celulas 20 ml + 980 ml de azul de tripano).

[0270] Fue unido el luer-lock 60-ml con jeringa al set de transferencia de plasma que va a la bolsa de transferencia 1,000 ml, y un volumen equivalente de suspension celular de un maximo de celulas 1 x 1010 es transferido a la bolsa de transferencia. Despues se anade el tampon de re-suspension a la bolsa de transferencia a un volumen total de 246 ml. Todas las porciones no utilizadas de tampon de re-suspension se desechan.

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[0271] A continuacion, se homogeneiza la suspension de celulas por agitacion de la bolsa, y se retira de la bolsa 0,5 ml de suspension celular utilizando una jeringa de 3 ml unido al conjunto de transferencia de plasma. Esta muestra de 0,5 ml se coloca en un tubo Eppendorf esteril para su uso en pruebas de endotoxina (0,15 ml

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necesarios), como se describio anteriormente. Usando una jeringa de 60 ml, 54 ml HSA (solucion 25%) Buminate® se anaden a la bolsa a traves del conjunto de transferencia de plasma. La nueva concentracion de celulas se calcula entonces dividiendo el numero total de celulas entre el nuevo volumen celular. La suspension celular se

homogeneiza de nuevo por agitacion de la bolsa. Usando una jeringa de 10 ml unida al conjunto de transferencia de

plasma, se retira 6.5 ml de suspension celular de la bolsa. Esta muestra se va a utilizar para la prueba de liberacion y para la crioconservacion de celulas. Se coloca aproximadamente 0,1 ml (2-3 gotas) de suspension celular de la muestra de 6,5 ml en un tubo Eppendorf esteril para su uso en pruebas de endotoxina (0,15 ml necesarios), como se describio anteriormente. Una parte alfcuota de 0,5 ml de suspension celular se coloca en un tubo conico de 15 ml esteril para el analisis FACS. La muestra de celulas restante se transfirie a un tubo conico de 15 ml y se centrifuga durante siete minutos a 1,700 rpm (600 x g). El sobrenadante se utiliza inmediatamente para el ensayo de esterilidad BacT/Alert, y el sedimento se guarda para analisis FACS y criopreservacion. Se calcula el numero de celulas presentes en el sedimento, y el sedimento celular se re-suspende en 6,0 ml de solucion de congelacion (suero autologo 90% [HlAS] + 10% de DMSO). Entonces se calcula la nueva concentracion de celulas dividiendo el

numero total de celulas entre el nuevo volumen celular. Luego se marcan los criotubos apropiadamente y se

congelan. Los criotubos se colocan entonces en un congelador a - 80 °C en una Stratacooler y despues se

transfieren al dfa siguiente a un almacenamiento a -140 °C . Las bolsas que contienen la suspension celular restante se colocan a 4 °C hasta que esten listas para la liberacion (envfo).

[0272] • La formulacion del producto de terapia celular para infusion contiene CTLs autologos (celulas efectoras peptido dirigido CD8+ seleccionados) en inyeccion de 300 ml de lactato de Ringer, USP (76% v/v), 5% de dextrosa en 9% de cloruro de sodio (4% v/v), y 25% albumina de suero humano ( 20% v/v). En el momento del envfo, se coloca un aparato de registro de temperatura Dickson en el contenedor de transporte. La bolsa de infusion que contiene el producto de terapia celular se coloca en el contenedor de transporte. El contenedor del envfo se prepara entonces para el envfo. Despues de que fue recibida la bolsa de infusion de el sitio clfnico, los datos de temperatura de los aparatos de registro Dickson se descargan y se representan. El periodo de caducidad del producto final es de 42 horas.

DISCUSION

[0273] La reticulacion proporciona un metodo eficaz para la eliminacion de virus y mantenimiento de la funcion de presentacion de antfgenos en las CPAAs. El uso de psoraleno seguido de la exposicion UV de onda larga reticula el ADN y el ARN y evita la replicacion. Esto anade un nivel adicional de proteccion a los productos basados en celulas utilizadas en la preparacion de medicamentos para la entrega a los pacientes, mediante la posibilidad de la inactivacion de todos los virus conocidos y desconocidos que podrfan estar presentes en la lfnea celular CPAA y la inactivacion de la lfnea celular de Drosophila sin afectar a su potente funcion CPA. El tratamiento de psoraleno/UV inactiva los acidos nucleicos presentes en las CPAs y el tratamiento adicional de congelacion/descongelacion conlleva a la "muerte" celular como se evidencia por tincion con azul de tripano). Este protocolo de inactivacion/lisis garantiza la seguridad de las celulas de Drosophila como a las CPAs sin destruirlas, y en algunos casos mejorar su funcion CPA.

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1. La invencion provee un metodo in vitro para crear linfocitos T activados adecuados para administrar al paciente, comprendiendo las etapas de:

inactivacion de celulas presentadoras de antfgeno artificial (CPAAs) mediante el tratamiento de las CPAAs con un derivado de psoraleno y exponiendo las CPAA tratadas con el derivado de psoraleno a una dosis de fotoactivacion de irradiacion UVA;

poniendo en contacto a los linfocitos T aislados de un paciente diagnosticado con una enfermedad, trastorno o condicion medica con dichas CPAAs, donde antes de o concomitante con dicha etapa de contacto las CPAAs inactivadas se cargan con al menos un antfgeno peptfdico; y recolectando los linfocitos T.
2. Un metodo como se definio en la afirmacion 1 en donde dicho derivado de psoraleno es 8-metoxipsoraleno (8-MOP), 4'-(aminomentil)-4,5', 8-psoraleno (AMT), o amotosalen (S59).
3. Un metodo como se definio en la afirmacion 1 en donde dicho el agente de reticulacion comprende la exposicion de celulas presentadoras de antfgeno artificial tratadas con un derivado de psoraleno a una concentracion de 1 a 100 mg/ml a la irradiacion UVA a una dosis de 1 to 100 Julios/cm2 de irradiacion UVA por un periodo de 1 a 60 minutos.
4. Un metodo como se define en la afirmacion 1, en el que dicha enfermedad o trastorno es un cancer, y en el que dicho antfgeno de peptido al menos es un peptido antfgeno asociado al cancer.
5. Un metodo como se definio en la afirmacion 4 en donde dichos linfocitos T son citotoxicos frente a las celulas diana, y el peptido es seleccionado del grupo que consiste en melanoma asociado con el cancer, antfgenos peptfdicos asociados con el cancer de ovario, antfgenos peptfdicos asociados con el cancer de mama, cancer de pulmon, leucemia, mieloma multiple, antfgenos peptfdicos asociados al linfoma y antfgenos peptfdicos asociados al cancer de prostata.
6. Un metodo como se definio en la afirmacion 5 en donde dichos peptidos se seleccionan del grupo que consiste en: SILSLKEAST (SEQ ID NO.1), KMASRSMRL (SEQ ID NO.2), ALALAALLVV (SEQ ID NO.3), ALLVVDREV (SEQ ID NO. 3), ALLVVDREV (SEQ ID NO. 4), YMNGTMSQV (SEQ ID NO.5), YMDGTMSQV (SEQ ID NO.6), ITDQVPFSV (SEQ ID NO.7), YLEPGPVTA (SEQ ID NO.8), AAGIGILTV (SEQ ID NO.9), ELAGIGILTV (SEQ ID NO.10), CLTSTVQLV (SEQ ID NO.11), HLYQGCQVV (SEQ ID NO.12), KIFGSLAFL (SEQ ID NO.13), IISAVVGIL (SEQ ID NO.14), PLTSIISAV (SEQ ID NO.15), VMAGVG- SPYV (SEQ ID NO.16), VLVKSPNHV (SEQ ID NO.17), ELVSEFSRM (SEQ ID NO.18), YLSGANLNL (SEQ ID NO.19), GPLTPLPV (SEQ ID NO.20), SLLMWITQC (SEQ ID NO.21), KALFAGPPV (SEQ ID NO.22), YLETFREQV

(SEQ ID NO.23), GLQSPKSPL (SEQ ID NO.24), VLLKLRRPV (SEQ ID NO.25), ELYIPSVDL (SEQ ID NO.26), SLLMWITQV (SEQ ID NO.27), ILAKFLHWL (SEQ ID NO.28), STAPPVHNV (SEQ ID NO.29), FLWGPRALV (SEQ ID NO.30), FMWGNLTLA (SEQ ID NO.31), RLVDDFLLV (SEQ ID NO.32), HLSTAFARV (SEQ ID NO.33), QLSLLM- WIT (SEQ ID NO.34), ELWTHSYKV (SEQ ID NO.35), KVAELVHFL (SEQ ID NO.36), YIFATCLGL (SEQ ID NO.37), HLYIFATCL (SEQ ID NO.38), MLMAQEALAFL (SEQ ID NO.39), STLEKINKT (SEQ ID NO.40), KASEKIFYV (SEQ ID NO.41), SLLMWITQCFL (SEQ ID NO.42), ELTLGEFLKL (SEQ ID NO.43), LTLGEFLKL (SEQ ID NO.44), SLLE- KREKT (SEQ ID NO.45), TLGEDDPWL (SEQ ID NO.46), KLGLKPLEV (SEQ ID NO.47), YLWTSAKNT (SEQ ID NO.48), STAPPAHGV (SEQ ID NO.49), GMGSEELRL (SEQ ID NO.50), SLGSPVLGL (SEQ ID NO.51), YLF- FYRKSV (SEQ ID NO.52), CQQEETFLL (SEQ ID NO.53), TLAKFSPYL (SEQ ID NO.54), NLTHVLYPV (SEQ ID NO.55), STFKNWPFL (SEQ ID NO.56), SLLQHLIGL (SEQ ID NO.57), FLDQRVFFV (SEQ ID NO.58), FLDQRVFVV (SEQ ID NO.59), FLDQVAFVV (SEQ ID NO.60), GLDREQLYL (SEQ ID NO.61), VMQHLLSPL (SEQ ID NO.62), QQTHGITRL (SEQ ID NO.63), LQPLSGPGL (SEQ ID NO.64), TLDRDSLYV (SEQ ID NO.65), QLYLELSQL (SEQ ID NO.66), KVLEYVIKV (SEQ ID NO.67), KVADLVGFL (SEQ ID NO.68), KTWGQYWQV (SEQ ID NO.70) y VLDGLDVLL (SEQ ID NO.71).
7. Un metodo como se definio en la afirmacion 6 en donde al menos un peptido es una mezcla de peptidos, la mezcla consiste en: YMNGTMSQV (SEQ ID NO.5), ITDQVPFSV (SEQ ID NO.7), AAGIGILTV (SEQ ID NO.9), ELAGIGILTV (SEQ ID NO.10), SLLMWITQV (SEQ ID NO.27), FLWGPRALV (SEQ ID NO.30), TLAKFSPYL (PRAME; SEQ ID NO.54) y VLDGLDVLL (SEQ ID NO.71).
8. Un metodo como se definio en la afirmacion 1, que ademas comprende:

aislamiento de celulas T a partir de una muestra aferesis obtenida de un paciente para su uso en dicha etapa de contacto.
9. Un metodo como se definio en la afirmacion 8, que ademas comprende linfocitos T activados re- estimulados dicho proceso de re-estimulacion comprende:

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contactar a los linfocitos T activados con al menos una citocina, promoviendo de este modo la proliferacion de celulas T activadas; y

la incubacion de celulas T activadas con celulas autologas irradiadas no-CD8+, celulas adherentes no-CD8+ o celulas

presentadoras de antfgenos artificiales (CPAAs) tratadas con psoraleno/UVA , generando de este modo linfocitos T activados re-estimulados.
10. Un metodo como se definio en la afirmacion 9 en donde al menos una citocina es seleccionada del grupo que consisten en IL-2, IL- 4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, IFN-yLy TNF-DLy en donde dichos linfocitos T activados comprenden linfocitos T citotoxicos activados.
11. Un metodo como se definio en la afirmacion 9, que ademas comprenden linfocitos T activados sometidos a al menos una iteracion del procedimiento de re-estimulacion antes de realizar dicha etapa de generacion, dicho procedimiento de re-estimulacion comprende:

poner en contacto a los linfocitos T activados con una combinacion de al menos una otra citocina seleccionados del grupo que consisten en: IL-7, IL-15 o IL-21 promoviendo de este modo el crecimiento de celulas T activadas, la proliferacion o diferenciacion; e

incubacion de celulas T activadas con celulas autologas irradiadas no-CD8+, celulas adherentes no-CD8+ o celulas tratadas con psora

leno/UVA para generar de este modo linfocitos T activados reestimulados
12. Un metodo como se definio en la afirmacion 11 en donde dicho procedimiento de reestimulacion comprende el contacto de los linfocitos T activados con los CPAAs de Drosophila en presencia de IL-2 en una concentracion de 1 a 100 U/ml; IL-7 de 1 a 100 U/ml, IL-15 de 1 a 100 ng/ml y IL-21 de 1 a 100 ng/ml.
13. Un metodo como se definio en la afirmacion 11 en donde dichas celulas autologas irradiadas adherentes no-CD8+ comprenden celulas autologas irradiadas adherentes CD14+.
14. Un metodo como se definio en la afirmacion 11 en donde dichas celulas autologas irradiadas adherentes no-CD8+ comprenden celulas autologas irradiadas adherentes CD14+.
15. Un metodo como se definio en la afirmacion 1, que ademas comprende:

congelacion y descongelacion de dichas celulas presentadoras de antfgeno artificial antes, despues o concomitante con dicha etapa de inactivacion y antes de dicha etapa de contacto.
16. Un metodo como se definio en la afirmacion 1 en donde dicha inactivacion de celulas presentadoras de antfgeno artificial son incapaces de proliferarse y estan esencialmente libres de contaminacion.
17. Un metodo como se definio en la afirmacion 1 en donde dichas celulas presentadoras de antfgeno artificial expresa una molecula de antfgeno humano MHC, p-2 microglobulina, y una molecula auxiliar que comprende una molecula co-estimuladora humana seleccionada del grupo que consiste en CD80 (B7-1), LFA-3 (CD58), CD83, CD86 (B7-2) o un miembro de la familia de TNF seleccionado de entre el grupo que consiste en CD70, TNFl , LT, 4-1BBL y OX40L o una molecula de adhesion seleccionada del grupo que consiste de ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, y LFA-3.
18. Aun mas preferiblemente las celulas presentadoras de antfgenos artificiales expresan el HLA humana clase I antfgeno CMH molecula HLA 2.1.
19. Un metodo como se definio en la afirmacion 18 en donde la molecula MCH clase 1 es HLA-A-A2.1 y las moleculas auxilares son B7-1 (CD80), LFA-3(CD58), CD70 and ICAM-1 (CD54).
20. Un metodo como se definio en la afirmacion 18 en donde dichas CPAAs tratadas con psoraleno/UVA comprenden celulas de Drosophila transfectadas con moleculas de HLA y moleculas coestimuladoras.
21. Un metodo como se definio en la afirmacion 1 en donde dicha enfermedad, o condicion medica e un cancer seleccionado del grupo que consiste en melanoma maligno, mieloma multiple, cancer de prostata, linfoma, linfoma no-Hodgkin, leucemia, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocftica cronica, leucemia mieloide cronica, linfoma de Burkitt, cancer de tiroides, cancer de utero, cancer de rinon, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de hfgado, cancer de pancreas, cancer de prostata, cancer de colon, cancer de piel, cancer de estomago, cancer cervical, cancer de cabeza y cuello, glioma, y cancer de cerebro.
22. Las celulas presentadoras de antfgeno artificial de las CPAAs inactivadas de (CPAAs de Drosophilia) con acido nucleico reticulado, en donde las CPAAs de Drosophilia estan inactivadas por un tratamiento de

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derivado de psoraleno y expuestas a una dosis de fotoactivacion de irradiacion UVA, en donde las CPAAs inactivadas de Drosophila pueden activar a los linfocitos T cuando las CPAAs inactivadas se cargan con uno o mas antfgenos peptidos antes o concomitantes con la activacion de linfocitos T.
23. Las CPAAs inactivadas de Drosophilia como se definio en la afirmacion 22 en donde dichas CPAAs de Drosophilia expresan una molecula humana CMH clase I, p-2 microglobulina y una o mas moleculas auxiliares que comprende una molecula co-estimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD80 (B7-

I) , LFA-3 (CD58), CD83, CD86 (B7-2) o un miembro de la familia de TNF seleccionado de entre el grupo que consiste en CD70, o una adhesion molecular seleccionada del grupo que consiste en ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 y LFA-3.
24. Las CPAAs inactivadas de Drosophila como se definio en la afirmacion 23 en donde dicha HLA humana molecula CMH clase I es antfgeno HLA-A2.1.
25. Un metodo como se definio en la afirmacion 23 en donde la molecula MCH clase 1 es HLA-A2.1 y las moleculas auxilares son B7-1 (CD80), LFA-3(CD58), CD70 e ICAM-1.
26. Las CPAAs inactivadas de Drosophila como se definio en la afirmacion 22 en donde dichas CPAAs inactivadas de Drosophila son incapaces de proliferar y estan esencialmente libres de contaminacion.
27. Las CPAAs inactivadas de Drosophila como se definio en la afirmacion 22 en donde dicho derivado de psoraleno es es seleccionado del grupo que consiste en: 8-metoxipsoraleno (8-MOP), 4'-(aminomentil)-4,5', 8-psoraleno (AMT), o amotosalen (S59).
28. Las CPAAs inactivadas de Drosophilia como se definio en la afirmacion 22 en donde dichas CPAAs de Drosophila son inactivadas mediante tratamiento de un derivado de psoraleno en una concentracion de 1 a 100mg/ml y exponiendolas a irradiacion UVA con una dosis de 1 to 100 Julios/cm2 de irradiacion UVA por un periodo de 1 a 60 minutos.
29. Las CPAAs inactivadas de Drosophilia como se definio en la afirmacion 22 en donde uno o mas

antfgenos de peptido son seleccionados del grupo que consisten en: melanoma asociados con el cancer,

antfgenos peptfdicos asociados con el cancer de ovario, antfgenos peptfdicos asociados con el cancer de mama, cancer de pulmon, leucemia, mieloma multiple, antfgenos peptfdicos asociados al linfoma y antfgenos peptfdicos asociados al cancer de prostata.
30. Las CPAAs inactivadas de Drosophilia como se definio en la afirmacion 22 en donde uno o mas

antfgenos de peptido seleccionados del grupo que consisten en: SILSLKEAST (SEQ ID NO.1),

KMASRSMRL (SEQ ID NO.2 ), ALALAALLVV (SEQ ID NO. 3), ALLVVDREV (SEQ ID NO. 4), YMNGTMSQV (SEQ ID NO.5), YMDGTMSQV (SEQ ID NO.6), ITDQVPFSV (SEQ ID NO.7), YLEPGPVTA (SEQ ID NO.8), AAGIGILTV (SEQ ID NO.9), ELAGIGILTV (SEQ ID NO.10), CLT- STVQLV (SEQ ID NO.

II) , HLYQGCQVV (SEQ ID NO. 12), KIFGSLAFL (SEQ ID NO. 13), IISAVVGIL (SEQ ID NO.14),

PLTSIISAV (SEQ ID NO.15), VMAGVGSPYV (SEQ ID NO.16), VLVKSPNHV (SEQ ID NO.17), ELVSEF- SRM (SEQ ID NO.18), YLSGANLNL (SEQ ID NO.19), GPLTPLPV (SEQ ID NO.20), SLLMWITQC (SEQ ID NO.21), KALFAGPPV (SEQ ID NO.22), YLETFREQV (SEQ ID NO.23), GLQSPKSPL (SEQ ID

NO.24), VLLKLRRPV (SEQ ID NO.25), ELYIPSVDL (SEQ ID NO.26), SLLMWITQV (SEQ ID NO.27),

ILAKFLHWL (SEQ ID NO.28), STAPPVH- NV (SEQ ID NO.29), FLWGPRALV (SEQ ID NO.30),

FMWGNLTLA (SEQ ID NO.31), RLVDDFLLV (SEQ ID NO.32), HLSTAFARV (SEQ ID NO.33), QLSLLMWIT

(SEQ ID NO.34), ELWTHSYKV (SEQ ID NO.35), KVAELVHFL (SEQ ID NO.36), YIFATCLGL (SEQ ID

NO.37), HLYIFATCL (SEQ ID NO.38), MLMAQEALAFL (SEQ ID NO.39), STLE-KINKT (SEQ ID NO.40), KASEKIFYV (SEQ ID NO.41), SLLMWITQCFL (SEQ ID NO.42), ELTLGEFLKL (SEQ ID NO.43),

LTLGEFLKL (SEQ ID NO.44), SLLEKREKT (SEQ ID NO.45), TLGEDDPWL (SEQ ID NO.46), KLGLKPLEV (SEQ ID NO.47), YLWTSAKNT (SEQ ID NO.48), STAPPAHGV (SEQ ID NO.49), GMGSEELRL (SEQ ID

NO.50), SLGSPVLGL (SEQ ID NO.51), YLFFYRKSV (SEQ ID NO.52), CQQEETFLL (SEQ ID NO.53),

TLAKFSPYL (SEQ ID NO.54), NLTHVLYPV (SEQ ID NO.55), STFKNWPFL (SEQ ID NO.56), SLLQHLIGL (SEQ ID NO.57), FLDQRVFFV (SEQ ID NO.58), FLDQRVFVV (SEQ ID NO.59), FLDQVAFVV (SEQ ID NO.60), GLDREQLYL (SEQ ID NO.61), VMQHLLSPL (SEQ ID NO.62), QQTHGITRL (SEQ ID NO.63), LQPLSGPGL (SEQ ID NO.64), TLDRD- SLYV (SEQ ID NO.65), QLYLELSQL (SEQ ID NO.66), KVLEYVIKV (SEQ ID NO.67), KVADLVGFL (SEQ ID NO.68), KTWGQYWQV (SEQ ID NO.70 y VLDGLDVLL (SEQ ID NO.71)