JP5543207B2

JP5543207B2 - 不活性化された人工抗原提示細胞の調製および細胞治療におけるそれらの使用

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Publication number: JP5543207B2
Application number: JP2009531452A
Authority: JP
Inventors: カイ，ゼリング; モリアーテイ，アン; デグロー，ジユリ; レテユルク，デイデイエ; シー，ウエイ−シング; ステグマン，カレン・カバト; ユー，シリアン
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2006-10-04
Filing date: 2007-10-04
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2027-10-04
Also published as: BRPI0720342A2; NZ575571A; EP2079830B1; WO2008045286A3; US8124408B2; IL197845A; CN101548008A; JP2010505845A; US20120115223A1; CA2665568A1; US8357533B2; WO2008045286A2; EP2079830A2; IL223376A; AU2007307206A1; ES2603418T3; AU2007307206B2; CA2665568C; IL197845A0; KR20090060450A

Description

発明の分野
本発明は一般に、ガンのような疾患、障害または医学的状態を、架橋結合による人工ＡＰＣの不活性化を介して処置するための細胞治療の処理法に関する。

発明の背景
本発明の真価の認識を容易にするために、この章では一定の発明者にとって独自となり得る考察、結論および観点を初めとして、本発明の開発を導いた歴史的および技術的背景を考察する。したがって本明細書での背景という言い方は従来技術の内容に関する承認と解釈されるべきではない。

多数の治療法が種々のガンを処置するために開発されてきた。これら多くの努力は化学療法に中心がおかれてきた。転移性黒色腫の処置として設計された３５〜５０％の応答率の１つの特定の組み合わせ化学療法の処方が、「ダートマス処方（Ｄａｒｔｍｏｕｔｈｒｅｇｉｍｅｎ）」（ＤＴＩＣ、シスプラチン、ＢＣＮＵおよびタモキシフェンの組み合わせ）で報告されたが、生存期間は６〜１０カ月に留まった。また高率の寛解が積極的な高い用量強度の化学療法（非特許文献１）、および自家骨髄移植を用いた造血多血（ｒｅｐｌｅｔｉｏｎｏｆｈｅｍａｔｏｐｏｅｉｓｉｓ）について報告された。それにもかかわらず、生存期間の中間値は短く、約４カ月であった（非特許文献２）。

およそ数年といった生存における有意な改善が、特定の免疫療法を受けている黒色腫患者のわずかな割合で記録された。免疫療法にはガンワクチンを用いた能動的な特異的免疫療法、ならびにインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）のような免疫系の非特異的追加免疫の使用を含んだ（非特許文献３：非特許文献４）。特許文献１も参照にされたい。

黒色腫におけるＴ−細胞規定腫瘍抗原の同定は、抗原特異的な細胞性免疫応答を増大しようとする試みによりガン細胞を標的とする臨床試験に導いた。この取り組みは効力のあるＴ細胞応答をインビボで誘導する試みにおいて、抗原が免疫原的な状況で送達される多くの予防免疫接種で追跡された。ワクチン試験でいくらかの臨床的応答が観察されたが、誘導されたＴ−細胞応答の規模は一般に低いか、または検出できず、そして臨床的応答との相関が良くなかった。ガン抗原を用いた黒色腫患者の免疫感作は、循環するＣＴＬ前駆体の数を増すことができるが、これは臨床的な腫瘍の寛解とは相関せず、インビボでの機能または活性化の欠失を示唆していた。

マウスの腫瘍モデルを対象とした実験では、１もしくは複数の腫瘍抗原に特異的なＴ細胞のインビトロ免疫感作が関与する養子免疫療法が、最少の毒性で効果的となり得ることが証明された。この方法をヒト腫瘍の処置に応用する障害は、ＣＴＬ−媒介型の破壊を受けやすい腫瘍細胞にする免疫原性抗原の同定であった。黒色腫患者から腫瘍反応性Ｔ細胞の単離は、ＣＴＬが向かう幾つかの腫瘍抗原（エピトープ）の同定を導いた。これらにはチロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００およびＭＡＧＥがある。これらの中でチロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１は、黒色腫でほぼ例外なく発現し、したがって養子免疫療法に望ましい標的の選択を表す（非特許文献５：非特許文献６：非特許文献７：非特許文献８：非特許文献９：非特許文献１０：非特許文献１１および非特許文献１２）。

養子Ｔ細胞治療には、ガン患者のインビボで免疫寛容メカニズムが活性であり、しかもこの患者集団で示される非効力的応答に寄与する宿主環境からＴ細胞を取り出すことが包含される。ＣＤ８^＋Ｔ細胞はエクスビボで刺激されて抗原特異的なＣＴＬを生成することができる（例えば特許文献２を参照にされたい）。初期の養子免疫療法の取り組みでは、様々なガンの処置として活性化リンパ球を使用した（非特許文献１３）。初期にはリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、そして後期にはＩＬ−２によりエクスビボで活性化された腫瘍−浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が使用されたが、効力の証明は不確かであった（ｅｑｕｉｖｏｃａｌ）。これらの初期の管理された臨床試験では、エクスビボで活性化された細胞の使用が、ＩＬ−２の黒色腫患者への直接投与に優る利点を示すことができなかった。フレッドハッチンソンガン研究センター（ＦｒｅｄＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）のＹｅｅｅｔａｌ（非特許文献１４）およびＮＣＩでのＤｕｄｌｅｙ（非特許文献１５）によるさらに最近の試験では、特定の養子Ｔ−細胞治療の取り組みについての可能性が示された。これらの試験には、ＭＡＲＴ−１もしくはｇｐ１００に特異的なＴ−細胞クローンおよび低用量のＩＬ−２、あるいは同種異系の支持細胞を用いてエクスビボで増幅した（ｅｘｐａｎｄｅｄ）ＴＩＬおよび高用量のＩＬ−２のいずれかの使用が包含される。これらの試験では養子免疫療法がガンの処置として有望であることが確認されたが、その完全な開発は治療的数の抗原特異的ＣＤ８^＋ＣＴＬの再現性のあるエクスビボ生成法が無かったことにより妨げられた（非特許文献１６）。

細胞溶解性、すなわち細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ウイルス感染に対する主要な防衛線である。ＣＤ８^＋リンパ球はウイルスに感染した宿主細胞を特異的に認識し、そして溶解する。ＣＴＬの細胞傷害活性を役立てることが望ましいが、ＣＴＬを特異的に活性化するため利用できたインビトロ／エクスビボの方法はほとんどない。鍵となる黒色腫関連抗原の同定およびＣＴＬの特異的なインビトロ活性化法が、転移性黒色腫の養子免疫療法の効率的評価を可能とする（非特許文献１４、１５および１６同上に加えて、非特許文献１７を参照にされたい）。

天然の抗原提示細胞（ＡＰＣ）をインビトロでナイーブＴ細胞の活性化に使用することは可能であるが（例えば樹状細胞、マクロファージ、Ｂ−細胞または自己由来腫瘍細胞）、活性化の効力は生来のＡＰＣのＭＨＣ分子が多くの他のペプチドエピトープを含む可能性があり、これにより選択したエピトープの提示は最少となるので低くなる。これら提示されたペプチドのほとんどは正常な無害な内因性タンパク質を表す。この問題に対してより直接的な取り組みは、疾患を克服することに関連するエピトープに対してＣＤ８^＋Ｔ細胞を特異的に活性化することになる。

ｘＡＰＣである１つの人工ＡＰＣが、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）の胎児性細胞株を使用して開発され、これは主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を発現する（非特許文献１７；非特許文献１８；また特許文献２および特許文献３も参照にされたい）。ショウジョウバエは進化した免疫系を欠いているので、ヒトＭＨＣ分子にペプチドエピトープを負荷することに関与するヒトＴＡＰ−１および２ペプチドトランスポーターのショウジョウバエ相同体は存在しない。したがってトランスフェクトしたクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子は、空の容器としてショウジョウバエの細胞表面上に現れる。ＭＨＣクラスＩ−もしくはＭＨＣクラスＩＩ−をコードする発現ベクターでトランスフェクトしたショウジョウバエの細胞を、特異的ＭＨＣ分子に結合する外因性合成ペプチド（すなわち腫瘍抗原Ｔ−細胞ペプチドエピトープ）とインキュベーションすることにより、利用できるすべてのＭＨＣ分子がＭＨＣ−拘束性特異的ペプチドエピトープ（複数）に占有され得る。特に、単一もしくは多数のエピトープを提示しているＭＨＣクラスＩ分子の高密度発現、およびこれらショウジョウバエＡＰＣ上に鍵となる共刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子Ｂ７−１（ＣＤ８０）、ＣＤ７０、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の負荷は、選択したペプチドに特異的な有力な自己細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞のインビトロ生成を可能にすることができる（非特許文献１９）。

細胞治療における様々な改善が開発された。例えば以下の特許公報を参照にされたい：特許文献４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４：１５および１６；および１７。例えば進行した悪性黒色種患者を対象として、患者から自己のＣＤ８^＋Ｔ細胞が単離され、エクスビボで刺激、そして増幅された後、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）として患者に戻される３つの臨床試験（ＣＴＬ−０１、ＣＴＬ−０２およびＣＴＬ−０３と呼ぶ）が行われた。再現性高く効力的な抗原特異的ＣＴＬをエクスビボで生成する能力には、最適なＴ細胞活性化のために重要なヒトＨＬＡクラスＩ、共刺激および接着分子でトランスフェクトされた胎児性ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞株（ＳＣ２）での初回刺激が関与する。トランスフェクトされた細胞は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激してそれらを標的細胞に対する細胞傷害活性を持つエフェクター細胞へ誘導し（ｄｒｉｖｅ）、人工抗原提示細胞として使用され、この標的細胞はインビトロでＣＴＬが免疫感作されたタンパク質を発現する。２つの異なる人工ＡＰＣ系がこれらの臨床試験で使用された。１つはＨＬＡ−Ａ２、Ｂ７．１およびＩＣＡＭを発現し（クローン６６６）、もう１つはこれらと同じ３つの分子に加えてＢ７．２およびＬＦＡ−３を発現する（クローン６６８）。

臨床的に研究されているＣＴＬ−０４と命名されている細胞治療生成物は、ショウジョウバエに基づくＡＰＣを用いて開発された。細胞治療生成物は、配列番号５、６、７、８、９および７０に列挙する配列により同定される黒色腫関連抗原に由来する最高６個の選択したＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ペプチドにペプチド特異性を現すエクスビボで活性化された自己のＣＤ８^＋ＣＴＬを用いて調製された自己の免疫治療生成物である。細胞治療生成物の活性成分は患者自身のＣＤ８^＋細胞であり、これは上に提供した配列番号に列挙した６つのＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ペプチドの少なくとも１つに対する特異性を有する、選択したペプチド負荷ａＡＰＣに対して暴露することによりエクスビボで活性化された。これらＣＴＬは：臨床の現場で回収したリンパ球フェレーシスサンプルから単離された自己のナイーブＴ細胞に由来し；ＡＰＣとして人工的な不活性化ショウジョウバエ細胞を用いて、黒色腫抗原ペプチドエピトープに対してエクスビボで感作し（ｐｒｉｍｅｄ）；インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターロイキン−７（ＩＬ−７）の存在下で黒色腫抗原性エピトープを負荷した自己の単球を用いた再刺激により増幅し、続いてＯＫＴ（商標）３を使用して非特異的に増幅し；回収、洗浄、そして注入するための最終製剤に再懸濁し；そして患者に注入する。再注入のための最終生成物は、１〜１０ｘ１０^９のＣＴＬ細胞を３００ｍＬの乳酸加リンゲル注射液（７６容量／容量％）、生理食塩水（Ｄ５ＮＳ）中の５％デキストロース（４容量／容量％）、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（２０容量／容量％）中に含む。

もちろんいかなる薬剤を用いても、治療用生成物の安全性および効力を確実にすることは重要である。すなわちＣＴＬ−０４のような細胞治療生成物が臨床的使用に放出される前、典型的には様々な品質確認試験にかけられる。例えば細胞治療生成物はＰＣＲに基づく技術によりショウジョウバエのＤＮＡの不存在を確認するために試験を行うことができる。さらに生成物はＲＴ／ＰＣＲにかけられて既知の内因性の昆虫特異的ＲＮＡウイルス、例えばショウジョウバエのノダウイルス（Ｎｏｄａｖｉｒｕｓ）（ＤｒＮＶ）、ショウジョウバエのＸウイルス（ＤＸＶ）およびショウジョウバエのＨＰＳ−１−様ウイルスの不存在を確認することができる。さらにＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ（商標）を使用して、工程内および最終生成物の無菌性を試験することができる。真菌、細菌およびエンドトキシン含量に関するＮＩＨの血液製剤部門（ＮＩＨＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅ）による細胞生成物の無菌試験は、特許文献１８に述べられている。

そのような細胞治療の安全性および効力にもかかわらず、特にＦＤＡがそのような細胞療法を異種移植生成物として再分類する観点に照らして、安全かつ有効であることをさらに保証する細胞療法をさらに開発することが望まれている。この分類には別の組のガイドラインが必要であり、これには異種移植生成物としての薬剤の具体的言及、受容者および近接した物理的接触の両方に対する人獣共通感染病の感染のリスクの可能性、処置を受けた後の臓器または血液供与の防止、および治療の結果として後に毒性が発生するかどうかを測定する長期監視プログラムの確立を含む。

米国特許出願第ＵＳ２００３／００２２８２０号明細書米国特許第６，２２５，０４２号明細書米国特許第６，３５５，４７９号明細書米国特許第５，３１４，８１３号明細書米国特許第５，５２９，９２１号明細書米国特許第５，８２７，７３７号明細書米国特許第６，００１，３６５号明細書米国特許第６，２２５，０４２号明細書米国特許第６，２５１，６２７号明細書米国特許第６，２５５，０７３号明細書米国特許第６，３６２，００１号明細書米国特許第６，４６１，８６７号明細書米国特許第６，７９０，６６２号明細書米国特許第６，８２８，１５０号明細書国際公開第２００２／０６５９９２号パンフレット国際公開第２００２／０９２７７３号パンフレット欧州特許第８１４，８３８号明細書米国特許出願第ＵＳ２００６／０１５９６６７号明細書

Ｈｒｙｎｉｕｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．Ｖｏｌ．４，ｐｐ．１１６２−１１７０（１９８６）Ｈｅｒｚｉｇ，Ｈｉｇｈ−ＤｏｓｅＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｎｓ，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ（ＡｒｍｉｔａｇｅａｎｄＡｎｔｍａｎ，ｅｄｓ．），ＷｉｌｌｉａｍｓａｎｄＷｉｌｋｉｎｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ），ｐｐ．７５０−７５４（１９９２）Ｓａｕｎｄｅｒｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ），ｐｐ．５７−６９（１９９５）Ｍｉｔｃｈｅｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．４０２−４１１（１９９４）ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２５４，ｐｐ．１６４３−１６４７（１９９１）Ｇａｕｇｌｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．１７９，ｐｐ．９２１−９３０（１９９４）Ｋａｗａｋａｍｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１８０，３４７−３５２（１９９４）Ｂｒｉｃｈａｒｄｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１７８：４８９−４９５，１９９３Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５４：３１２４−３１２６，１９９４Ｂａｋｋｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．１７９，ｐｐ．１００５−１００９（１９９４）Ｗｏｌｆｅｌｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．Ｖｏｌ．２４，ｐｐ．７５９−７６４（１９９４）Ｖｉｓｓｅｒｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１５４，ｐｐ．３９９１−３９９８（１９９５）Ｒｕｂｉｎｅｔａｌ．，ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｉｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ｅｄ．），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（ＮｅｗＹｏｒｋ），ｐｐ．３７９−４１０（１９９３）Ｙｅｅｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９９，ｐｐ．１６１６８−１６１７３，（２００２）Ｄｕｄｌｅｙｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９８，ｐｐ．８５０−８５４（２００２）Ｏｅｌｋｅｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．９：６１９−６２４（２００３）Ｌｅｔｕｒｃｑｅｔａｌ．，"ＥｘＶｉｖｏＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＰｏｔｅｎｔＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｆｏｒｔｈｅＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＣａｎｃｅｒ：ＡＮｏｖｅｌＡｎｔｉｇｅｎＰｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ"，ＳｏｃｉｅｔｙｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｈｅｒａｐｙ１７ｔｈＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ＃４０（２００２）Ｊａｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９，ｐｐ．１２１１７−１２１２１（１９９２）Ｃａｉｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．１６５，ｐｐ，２４９−２６５（１９９８）．

発明の要約
１つの態様では、本発明は患者に投与するための活性化Ｔリンパ球をエクスビボで作成する方法に関し、この方法は：人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を核酸架橋剤で不活性化し；疾患または障害が診断された患者から単離したＴリンパ球を該不活性化された人工抗原提示細胞と接触させ；そして患者に戻し投与するためにＴリンパ球を集める工程を含んでなる。この態様の１つの観点では、架橋剤がソラレン誘導体であり、そして上記の不活性化工程がソラレン誘導体で処理した人工抗原提示細胞を光活性化用量のＵＶＡ照射に暴露することを含んでなる。好ましくはソラレン誘導体がソラレン、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰＳ）、４’−（アミノメチル）−４，５’，８−ソラレン（ＡＭＴ）またはアモトサレン（Ｓ５９）である。また好ましくは架橋剤がソラレン誘導体であり、不活性化工程が１〜１００μｇ／ｍｌ濃度のソラレン誘導体で処理した人工抗原提示細胞を、１〜１００ジュール／ｃｍ^２用量のＵＶＡ照射に１〜６０分の期間、暴露することを含んでなる。

この態様の方法は、ガンおよび本発明の範囲内で企図される代表的なガンを処置するエクスビボの方法に有用であり、そしてこれらの方法はさらに少なくとも１つのガン関連ペプチド抗原を人工抗原提示細胞に負荷する工程を含む。さらに活性化Ｔリンパ球は好ましくはペプチドを発現している標的細胞に対して細胞障害性であり、そしてペプチドが黒色腫ガン関連ペプチド抗原、卵巣ガン関連ペプチド抗原、乳癌関連ペプチド抗原、肺ガン関連ペプチド抗原、白血病−、多発性骨髄腫−およびリンパ腫−関連ペプチド抗原および前立腺ガン関連ペプチド抗原からなる群より選択される。

好適なペプチドは、ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＵＣ−１、ＣＡ−１２５、Ｈｅｒ−２、サーバイビン、テロメラーゼ、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、リビン（ｌｉｖｉｎ）、ＳＡＲＴ−１、ＳＣＰ−１、ＳＳＸ−２、ＰＲＡＭＥ、Ｃ−レクチン、Ｐｅｃ６０、ＡＥＳ、ＭＡＧＥ−３、Ｇ２５０、ＦＢＰ、ＳＳＸ−４、ＳＰ１７、ｈＴＲＴ、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−１、トポイソメラーゼＩＩ、インテグリンβ８サブユニット前駆体、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＳＴＡＴ１、γ−カテニンまたはＨ−ＲＹＫのアミノ酸配列の少なくとも８個の連続する抗原性アミノ酸を含んでなる。より一層好適な態様は：ＳＩＬＳＬＫＥＡＳＴ（配列番号：１），ＫＭＡＳＲＳＭＲＬ（配列番号：２），ＡＬＡＬＡＡＬＬＶＶ（配列番号：３），ＡＬＬＶＶＤＲＥＶ（配列番号：４），ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号：５），ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号：６），ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号：７），ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（配列番号：８），ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：９），ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：１０），ＣＬＴＳＴＶＱＬＶ（配列番号：１１），ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（配列番号：１２），ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：１３），ＩＩＳＡＶＶＧＩＬ（配列番号：１４），ＰＬＴＳＩＩＳＡＶ（配列番号：１５），ＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶ（配列番号：１６），ＶＬＶＫＳＰＮＨＶ（配列番号：１７），ＥＬＶＳＥＦＳＲＭ（配列番号：１８），ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ（配列番号：１９），ＧＰＬＴＰＬＰＶ（配列番号：２０），ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号：２１），ＫＡＬＦＡＧＰＰＶ（配列番号：２２），ＹＬＥＴＦＲＥＱＶ（配列番号：２３），ＧＬＱＳＰＫＳＰＬ（配列番号：２４），ＶＬＬＫＬＲＲＰＶ（配列番号：２５），ＥＬＹＩＰＳＶＤＬ（配列番号：２６），ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号：２７），ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号：２８），ＳＴＡＰＰＶＨＮＶ（配列番号：２９），ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号：３０），ＦＭＷＧＮＬＴＬＡ（配列番号：３１），ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（配列番号：３２），ＨＬＳＴＡＦＡＲＶ（配列番号：３３），ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ（配列番号：３４），ＥＬＷＴＨＳＹＫＶ（配列番号：３５），ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ（配列番号：３６），ＹＩＦＡＴＣＬＧＬ（配列番号：３７），ＨＬＹＩＦＡＴＣＬ（配列番号：３８），ＭＬＭＡＱＥＡＬＡＦＬ（配列番号：３９），ＳＴＬＥＫＩＮＫＴ（配列番号：４０），ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号：４１），ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（配列番号：４２），ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号：４３），ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号：４４），ＳＬＬＥＫＲＥＫＴ（配列番号：４５），ＴＬＧＥＤＤＰＷＬ（配列番号：４６），ＫＬＧＬＫＰＬＥＶ（配列番号：４７），ＹＬＷＴＳＡＫＮＴ（配列番号：４８），ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ（配列番号：４９），ＧＭＧＳＥＥＬＲＬ（配列番号：５０），ＳＬＧＳＰＶＬＧＬ（配列番号：５１），ＹＬＦＦＹＲＫＳＶ（配列番号：５２），ＣＱＱＥＥＴＦＬＬ（配列番号：５３），ＴＬＡＫＦＳＰＹＬ（配列番号：５４），ＮＬＴＨＶＬＹＰＶ（配列番号：５５），ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号：５６），ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号：５７），ＦＬＤＱＲＶＦＦＶ（配列番号：５８），ＦＬＤＱＲＶＦＶＶ（配列番号：５９），ＦＬＤＱＶＡＦＶＶ（配列番号：６０），ＧＬＤＲＥＱＬＹＬ（配列番号：６１），ＶＭＱＨＬＬＳＰＬ（配列番号：６２），ＱＱＴＨＧＩＴＲＬ（配列番号：６３），ＬＱＰＬＳＧＰＧＬ（配列番号：６４），ＴＬＤＲＤＳＬＹＶ（配列番号：６５），ＱＬＹＬＥＬＳＱＬ（配列番号：６６），ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（配列番号：６７），ＫＶＡＤＬＶＧＦＬ（配列番号：６８），ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号：７０）及びＶＬＤＧＬＤＶＬＬ（配列番号：７１）からなる群より選択される１もしくは複数のペプチドの使用である。

本発明の方法に使用するために好適なペプチド混合物は、ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号：５），ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号：７），ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：９），ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：１０），ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号：２７），
ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号：３０），ＴＬＡＫＦＳＰＹＬ（ＰＲＡＭＥ；配列番号：５４）およびＶＬＤＧＬＤＶＬＬ（配列番号：７１）からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む。

この態様のさらに好適な方法では、該方法は上記接触工程に使用するために、患者からの白血球フェレーシスサンプル（さもなければフェレーシスサンプルとして知られている）からＴ細胞を単離し；そして該回収工程で集めた有効量のＴリンパ球を個体に投与することを含んでなる。さらにまた該方法は、上記活性化Ｔリンパ球を上記投与工程を行う前に再刺激することを含んでなり、該再刺激手順は：活性化Ｔリンパ球を少なくとも１つのサイトカインと接触させ、これにより活性化Ｔ細胞の増殖を促進させ；そして活性化Ｔ細胞を、照射した自己非−ＣＤ８＋細胞、接着非ＣＤ８^＋細胞またはソラレン／ＵＶＡ処理人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とインキュベーションし、これにより再刺激した活性化Ｔリンパ球を生成することを含んでなる。好適なサイトカインにはＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−７，ＩＬ−１２，ＩＬ−１５，ＩＬ−１７，ＩＬ−２１，ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αからなる群より選択されるものを含み、そして上記活性化Ｔリンパ球が活性化細胞障害性Ｔリンパ球を含んでなる。活性化Ｔリンパ球は、上記生成工程を行う前にさらに少なくとも１回の再刺激手順の反復にかけることができ、該再刺激手順は：活性化Ｔリンパ球を、ＩＬ−２および：ＩＬ−７，ＩＬ−１５もしくはＩＬ−２１からなる群より選択される少なくとも１つの他のサイトカインとの組み合わせと接触させ、これにより活性化Ｔ細胞の成長、増殖または分化を促進させ；そして活性化Ｔ細胞を、照射した自己の非−ＣＤ８＋細胞または接着非ＣＤ８^＋細胞またはソラレン／ＵＶＡ処理ａＡＰＣとインキュベーションして再刺激したＴリンパ球を生成することを含んでなる。好ましくは再刺激手順が、活性化Ｔリンパ球をショウジョウバエのａＡＰＣと、１〜１００Ｕ／ｍｌの濃度のＩＬ−２；１〜１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−７、１〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５および１〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１の存在下で接触させることを含んでなる。この方法の１つの観点では、照射した自己の接着非ＣＤ８^＋細胞が、照射した自己の接着ＣＤ１４＋細胞を含んでなり、そしてこの態様の別の観点では照射した自己の非ＣＤ８＋細胞が、照射した自己のＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでなる。

この方法のさらに別の観点では、該方法は上記人工抗原提示細胞を、上記不活性化工程の前、その後またはそれと同時に、しかも上記接触工程前に凍結および解凍することを含んでなる。好ましくはこれら方法のすべての観点で、不活性化された人工抗原提示細胞は、増殖できず、そして本質的に混入物を含まない。

本発明の好適な方法では、人工抗原提示細胞がヒト白血球ＭＨＣ抗原分子、β−２ミクログロブリン、およびヒトＣＤ８０（Ｂ７−１），ＬＦＡ−３（ＣＤ５８），ＣＤ８３，ＣＤ８６（Ｂ７−２）からなる群より選択される共刺激分子、またはＣＤ７０，ＴＮＦα，ＬＴ，４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０Ｌからなる群より選択されるＴＮＦファミリーのメンバー、またはＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２，ＩＣＡＭ−３およびＬＦＡ−３からなる群より選択される接着分子を含んでなる補助する分子（ａｓｓｉｓｔｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅ）を発現する。さらにより好ましくは、人工抗原提示細胞がヒトＨＬＡクラスＩＭＨＣ抗原分子ＨＬＡ２．１を発現する。クラスＩＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ａ２．１であり、そして補助する分子が好ましくはＢ７−１（ＣＤ８０），ＬＦＡ−３（ＣＤ５８），ＣＤ７０およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）である。また好ましくは人工抗原提示細胞が、ＨＬＡ分子および共刺激分子でトランスフェクトしたソラレン／ＵＶＡ処理したショウジョウバエ細胞である。

上で述べたように、この方法の好適な使用は悪性黒色種、多発性骨髄腫、前立腺ガン、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫、甲状腺ガン、子宮ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、肺ガン、乳癌、肝臓ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、結腸ガン、皮膚ガン、胃ガン、子宮頚ガン、頭頸部ガン、神経膠腫および脳のガンを含む種々のガンに関する。

本発明の別の態様では、本発明は人工抗原提示細胞に関する。好適なソラレン不活性化人工抗原提示細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１，Ｂ７−１（ＣＤ８０），ＬＦＡ−３（ＣＤ５８），ＣＤ７０およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）細胞表面タンパク質を発現するものである。人工抗原提示細胞と組み合わされる１組の好適なペプチド混合物にはＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号：５），ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号：７），ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：９），ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：１０），ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号：２７），ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号：３０），ＴＬＡＫＦＳＰＹＬ（ＰＲＡＭＥ；配列番号：５４）およびＶＬＤＧＬＤＶＬＬ（配列番号：７１）を含む。人工抗原提示細胞と組み合わせた時、これらのペプチドはＭＨＣタンパク質と会合し、そして人工抗原提示細胞に「負荷される（ｌｏａｄｅｄ）」と言われ、次いでこれは好適なペプチドの組み合わせを提示する。

他の人工抗原提示細胞には、表面タンパク質ＨＬＡ−Ａ２．１，Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１を発現するものを含む。他の人工抗原提示細胞にはＨＬＡ−Ａ２．１，Ｂ＆−１，ＦＬＡ−３，ＣＤ７０およびＩＣＡＭ−１を発現する細胞；ＨＬＡ−Ａ２．１，Ｂ＆−１，Ｂ＆−２，ＦＬＡ−３およびＩＣＡＭ−１を発現するものを含む。

バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞のＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理後のバキュロウイルス力価を具体的に説明する。Ｓｆ９細胞を滴定した用量のバキュロウイルスで感染させ、そして感染した細胞を５μｇ／ｍｌのＵＶＡＤＥＸで４℃にて３０分間処理し、続いてそれぞれ示すようにＵＶＡ処理を０，２，１０，または２０分間行った。次いで処理した細胞を２８℃で４日間培養した。培養上清を集め、そして９６ウェルプレートに播種したＳｆ９細胞の新しい非感染カルチャーを感染させるために使用した。これらＳｆ９カルチャーに存在するバキュロウイルスを、ｇｐ６４−特異的抗体を使用した迅速なマイクロタイターアッセイ（インビトロジェン：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により検出し、そしてバキュロウイルス力価を算出した。未処理の外因性ＡＰＣ（ｘＡＰＣ）対ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理したショウジョウバエｘＡＰＣの細胞増殖の分析を具体的に説明する。ショウジョウバエのｘＡＰＣは未処理またはＵＶＡＤＥＸ（５μｇ／ｍｌ）で４℃にて３０分間処理し、続いてそれぞれ示すようにＵＶＡで０，２，１０もしくは２０分間処理した。処理した細胞を完全に洗浄して残存するＵＶＡＤＥＸを除去し、次いで６−ウェルプレートに１ｘ１０^６細胞／ｍｌで播種し、そして１６日間、連続培養した。生育可能な（すなわち生きている）ｘＡＰＣは処理後１日、５日、９日、１４日および１６日に各カルチャーのトリパンブルー染色によりカウントした。未処理、γ−照射処理またはＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理のいずれかを行ったショウジョウバエａＡＰＣと会合した外因性核酸（クローンＢ）の転写の程度の分析を表す。ショウジョウバエｘＡＰＣ（クローンＢ）のカルチャーは未処理、５０分間のγ−照射（約１６，０００ラドを送る）による処理、またはＵＶＡＤＥＸ（５μｇ／ｍｌ）／ＵＶＡ処理のいすれかであった。ｘＡＰＣの各カルチャーを洗浄し、そしてＨＬＡＡ２．１、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはβ２ｍをコードする外因性核酸を含まないフィーダーのショウジョウバエ細胞株（クローンＤ）と１０週間、共存培養した。次いでＨＬＡＡ２．１、Ｂ７−１、Ｂ７−２およびβ２ｍ転写産物に特異的なプライマーを使用した逆転写酵素（ＲＴ−ＰＣＲ）反応を、未処理、ＵＶＡＤＥＸ（５μｇ／ｍｌ）／ＵＶＡ処理およびγ−照射したｘＡＰＣの各々と共存培養した指標細胞株由来の抽出物について行った。次いでＲＴ−ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により視覚化した。レーン１、分子量マーカー；レーン２、未処理クローンＢのｘＡＰＣ（陽性対照）からのＲＴ−ＰＣＲ産物；レーン３、γ−照射したクローンＢのｘＡＰＣからのＲＴ−ＰＣＲ産物；レーン４、５および６、示したようにそれぞれ５、１５または３０分間、ＵＶＡ照射したＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理クローンＢｘＡＰＣに由来するＲＴ−ＰＣＲ産物。図４Ａから４Ｃは、ショウジョウバエのｘＡＰＣに随伴し、そして未処理またはＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理にかけた外因性核酸に関連する溶解性ウイルスおよび微生物活性の感染性の分析を示す（図４Ａ、未処理ｘＡＰＣウイルスストックで処理していないアリコートとインキュベーションしたクローンＤ指標細胞の溶解の顕微鏡分析；図４Ｂ：ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理したｘＡＰＣウイルスストックのアリコートとインキュベーションしたクローンＤ指標細胞の溶解の顕微鏡分析；図４Ｃ、未処理ｘＡＰＣウイルスストックまたはＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡｘＡＰＣウイルスストックの示した連続希釈物とインキュベーションしたクローンＤ指標細胞の細胞生存の分析。黒丸、未処理ウイルスストックとインキュベーションしたクローンＤ細胞；白丸、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理ウイルスストックとインキュベーションしたクローンＤ細胞。未処理、γ−照射処理またはＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理のいずれかを行ったショウジョウバエｘＡＰＣ／ショウジョウバエのクローンＤ指標共存培養物に由来する細胞上の外因性分子の表面発現のＦＡＣＳ分析を表す。ＦＡＣＳ分析を、示したようにヒトＨＬＡヒトＢ７．１およびＩＣＡＭ−１に特異的な抗体を使用して独立して行った。示したように５または１５分間のＵＶＡに暴露した、未処理およびＵＶＡＤＥＸ処理のいずれかを行ったショウジョウバエｘＡＰＣ上の外因性分子の表面発現のＦＡＣＳ分析を表す。ＦＡＣＳ分析を、示したようにヒトＨＬＡヒトＢ７．１およびＩＣＡＭ−１に特異的な抗体を使用して独立して行った。未処理、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理またはＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡに加えて凍結解凍処理したｘＡＰＣを用いたＭＡＲＴ−１特異的ＣＴＬの生成を示す。黒丸、処理せず；白丸、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ；黒三角、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡに加えて凍結解凍処理。図８Ａおよび８Ｂは、未処理ｘＡＰＣに比べてＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理したｘＡＰＣによる抗原特異的ＣＴＬの活性化のＭｙＤ８８依存的強化を示す。図８Ａは、ＯＶＡ８ペプチドを負荷したＫ^ｂ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１分子を発現するＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理したｘＡＰＣ、または同じ分子を発現する未処理ｘＡＰＣのいずれかで活性化した後、ＯＶＡ８ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；配列番号：７０）−結合ＭＨＣ四量体で染色したＣ５７ＢＬ／６（野生型）マウスから単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合の比較を表す（レーン２対レーン１）。図８Ｂは図８Ａについて記載したように、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理したｘＡＰＣ、または未処理ｘＡＰＣのいずれかで活性化した後、ＯＶＡ８ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；配列番号：７０）−結合ＭＨＣ四量体で染色したＭｙＤ８８ノック−アウト（ＭｙＤ８８^−／−）マウスから単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合の比較を表す（レーン４対レーン３）。図８Ａに記載するように（陽性対照として行った）レーン１および２は、染色されたＣＤ８^＋Ｔ細胞単離形および野生型マウス（Ｂ６）からの活性化の割合。図９Ａ〜９Ｆは本発明による細胞治療の特に好適な態様の工程を説明する流れ図を提供する。ＨＬＡ−Ａ２、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１，ＬＦＡ−３およびＣＤ７０でトランスフェクトしたショウジョウバエｘＡＰＣ（１１２０）上の外因性分子の表面発現の、ソラレン／ＵＶＡ処理前および後のＦＡＣＳ分析を示す。ショウジョウバエのｘＡＰＣはＣｕＳｏ４（１ｍＭ）と室温にて４８時間培養して外因性分子の発現を誘導した。誘導したショウジョウバエｘＡＰＣは最初にＵＶＡＤＥＸ（５ｕｇ／ｍｌで４℃にて３０分間）と培養し、そしてＵＶＡに１０分間暴露した。細胞を培養基で徹底的に洗浄し、そしてヒトＨＬＡ−ＡＢＣ、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＣＤ７０にそれぞれ特異的な抗体で染色し、そしてＦＡＣｓｃａｎで分析した。ソラレン処理したショウジョウバエｘＡＰＣ（ＦＦＦ）または同じ供与体のＰＢＭＣに由来する非ＣＤ８接着細胞（ＦＡＡ）で再刺激したエクスビボで生成した黒色腫特異的ＣＴＬのＣＴＬ活性の比較を示す。ＨＬＡ−Ａ２陽性供与体から精製したヒトＣＤ８Ｔ細胞は、６種の黒色腫ペプチド（６８９，７９２，８１７，８１８，８１９，８５３）の混合物を、予め負荷したソラレン／ＵＶＡ処理したショウジョウバエのｘＡＰＣと３７℃で培養した。４日目に、ヒトＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍｌ）を加えた。活性化ＣＤ８Ｔ細胞を６日目および１４日目に２回、同じ供与体のＰＢＭＣからの非−ＣＤ８接着細胞（ＦＡＡ）またはソラレン／ＵＶＡ処理したショウジョウバエのＡＰＣ（ＦＦＦ）のいずれかで、上記抗原性ペプチドの存在下、さらなるペプチド９５２（ｍＭＡＲＴ−１）を用いて再刺激した。抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞は５１Ｃｒアッセイにより評価した。簡単に説明すると、５１Ｃｒ標識化Ｍ１４細胞またはペプチドを負荷したＴ２細胞を標的として使用し、そしてＣＴＬを０．４、２、１０、５０のエフェクター／標的比で加えた。上清を培養から４時間後に集め、そして標的から５１Ｃｒの放出をγ−カウンターで測定した。ソラレン処理したショウジョウバエｘＡＰＣ（ＦＦＦ）またはＰＢＭＣ非ＣＤ８接着細胞（ＦＡＡ）で再刺激したエクスビボで生成した黒色腫特異的ＣＴＬのＣＴＬ能力（増幅ｘ溶解単位）の比較を示す。ＨＬＡ−Ａ２陽性供与体から精製したヒトＣＤ８Ｔ細胞は、６種の黒色腫ペプチドの混合物を予め負荷したソラレン／ＵＶＡ処理したショウジョウバエのＡＰＣと３７℃で最初に培養した。４日目に、ヒトＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍｌ）を加えた。活性化ＣＤ８Ｔ細胞を６日目および１４日目に２回、同じ供与体のＰＢＭＣからの非−ＣＤ８接着細胞（ＦＡＡ）またはショウジョウバエのｘＡＰＣ（ＦＦＦ）のいずれかで、抗原性ペプチドの存在下にて再刺激した。２２日目にＣＴＬを回収し、そしてＣＤ８Ｔ細胞の増幅倍数を算出した。抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞は５１Ｃｒアッセイにより評価した。簡単に説明すると、５１Ｃｒ標識化Ｍ１４（黒色腫細胞株）細胞またはペプチドを負荷したＴ２細胞を標的として使用した。溶解単位（ＬＵ）は、３０％の溶解があるＥ／Ｔ比で１００を割った場合とし、そして能力はＬＵと増幅倍数を掛けて算出した。ＨＬＡ−Ａ２／Ｍａｒｔ−１四量体を用いた抗原特異的ＣＴＬのＦＡＣＳ分析を示す。ＨＬＡ−Ａ２陽性供与体から精製したヒトＣＤ８Ｔ細胞を、最初に６種の黒色腫ペプチド混合物を予め負荷したソラレン／ＵＶＡ処理したショウジョウバエｘＡＰＣと３７℃で培養した（Ｆ）。４日目に、ヒトＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍｌ）を加えた。６日目および１４日目にＣＤ８Ｔ細胞を、ソラレン／ＵＶＡ処理したショウジョウバエｘＡＰＣで１回（ＦＦ）もしくは２回（ＦＦＦ）、または同じ供与体のＰＢＭＣからの非−ＣＤ８接着細胞と１回（ＦＡ）もしくは２回（ＦＡＡ）のいずれかで再刺激した。抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、抗ＣＤ８抗体（Ｘ軸）およびＭａｒｔ−１／Ａ２四量体（Ｙ軸）で細胞を染色することにより評価し、そしてＦＡＣＳＣａｎｔｏにより分析した。種々のサイトカインの組み合わせの存在下、ショウジョウバエのｘＡＰＣを用いてエクスビボで生成したＣＴＬの特異性および表現型の比較を表す。２つのＨＬＡ−Ａ２陽性供与体から精製したヒトＣＤ８Ｔ細胞を、６種の黒色腫ペプチド混合物を予め負荷したソラレン／ＵＶ処理したショウジョウバエｘＡＰＣと３７℃で培養した。４日目に、ヒトＩＬ−７（３０Ｕ／ｍｌ）に加えてＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）、またはＩＬ−７、ＩＬ−２に加えてＩＬ−１５（２５ｎｇ／ｍｌ）、またはＩＬ−７、ＩＬ−２に加えてＩＬ−２１（２５ｎｇ／ｍｌ）、またはＩＬ−７、ＩＬ−１５に加えてＩＬ−２１を加えた。活性化ＣＤ８Ｔ細胞は６日目および１４日目に、抗原性ペプチドおよび示したサイトカインの存在下でショウジョウバエのＡＰＣ（ＦＦＦ）で２回、再刺激した。抗原特異的ＣＴＬおよびＣＤ８Ｔ細胞の表面マーカーは、細胞を抗ＣＤ８抗体および四量体または示した抗体で染色することにより評価した。データはＦＡＣＳＣａｎｔｏにより分析した。示した図面は２種の供与体からのデータの平均であった。

発明の詳細な説明およびその好適な態様
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は本明細書ではそれらの広い、非限定的意味で使用する。

本発明の一般的観点に従い、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は架橋剤に暴露され、これによりａＡＰＣを生育不能とする。また好ましくはａＡＰＣは架橋化を通す不活性化を介して微生物の混入を本質的に含まないようにする。そのような不活性化ａＡＰＣは、選択したペプチドを負荷した時でも、ナイーブＴ細胞を活性化して選択したペプチドに特異的な活性化Ｔ細胞にすることができる（例えば分化した（ＣＤ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化クラスターまたは活性化ＣＤ８^＋細胞Ｔのいずれか、これらはそれぞれ活性化ヘルパーＴ細胞またはＣＴＬである）。不活性化ａＡＰＣは治療用組成物、およびペプチドを負荷した不活性化ａＡＰＣと接触させることにより生成された活性化Ｔ細胞を含んでなる細胞治療生成物の調製に有用である。外来種に基づくものを含め、抗原提示系の調製に関する一般的指針は、例えば米国特許第５，９６２，３２０号明細書；米国特許出願第２００３／００７２７９６，２００３／００７７２４８，２００４／００７１６７１，２００５／０１５２９１６および２００６／０１３４１２５号明細書、および国際公開第ＷＯ００／６３６９０，ＷＯ０２／０６５９９２およびＷＯ０２／０９２７７３号パンフレット；Ｏｅｌｋｅｅｔａｌ．，ＴＲＥＮＤＳｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１１（９），ｐｐ．４１２−４２０（２００５）；Ｓｕｎｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｖｏｌ．４，ｐｐ．５５５−５６４（１９９６）；およびＫｉｍｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２（４），ｐｐ．４０３−４１０（２００４）を参照にされたい。

不活性化ａＡＰＣにより活性化される特異的なナイーブＴ細胞系統は、ａＡＰＣの表面上に発現されるＭＨＣ分子の性質に依存する。したがってＭＨＣクラスＩ分子のみを発現するａＡＰＣは選択したペプチドを提示し、そしてナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化することができ、そしてＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するａＡＰＣは選択したペプチドを提示し、そしてナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化することができる。同様にＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方を発現するａＡＰＣは選択したペプチドを提示し、そしてナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の両方を活性化することができる。

細胞治療生成物を生産するために、個体から取り出されたフェレーシスサンプルから得られた自己のナイーブＴ細胞を、ヒトＡＭＬタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含んでなるペプチドのような選択したペプチドを負荷した不活性化ａＡＰＣと接触させる。その結果、接触したナイーブＴ細胞は活性化されることになって、その場合それらはナイーブＴ細胞が活性化された選択ペプチドに対応する、少なくとも
１つのエピトープを発現する細胞を標的とするように感作（ｐｒｉｍｅ）される。活性化Ｔ細胞に遭遇した時、そのような標的とされた細胞は、活性化Ｔ細胞が特異的な標的細胞の細胞傷害性を現す能力により活性化Ｔ細胞により殺され得る（すなわち特異的な殺細胞：ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｅｌｌｋｉｌｌｉｎｇ）。

フェレーシスサンプルは当該技術分野で現在知られているか、または利用できるようになる多くの適切なリンパ球フェレーシス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔａｐｈｅｒｅｓｉｓ）、リンパ球フェレーシス（ｌｙｍｐｈａｐｈｅｒｅｓｉｓ）および白血球フェレーシス（ｌｅｕｋａｐｈｏｒｅｓｉｓ）法により個体から集めることができ、これらは集めた末梢血から末梢血白血球（ＰＢＬ）の回収を提供し、そしてそれらから白血球はサンプルの他の血漿成分より分離され得る。例示的手法は例えば米国特許第２００４／０１７３７７８およびＵＳ２００／４０１４７０２１号明細書、ならびに米国特許第４，６９０，９１５，５，１２６，１３２，６，２５５，０７３，５，８４６，８２７，６，２５１，３８５，６，２２５，０４４，６，２１０，９６３，６，１９４，２０７，５，４４３，９８３，６，０４０，１７７，５，７６６，９２０，６，２１０，６６２，６，２０４，０５８，および６，２２７，３６８号明細書に具体的に説明されている。フェレーシスサンプルから、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、またはナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞とナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞であり得るナイーブＴ細胞は他のＰＢＬ、例えば非Ｔ細胞から実質的に分離される。好ましくはナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞が分離され、そして次いで治療用組成物または自己細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含有する細胞治療生成物を生成するために使用され、この生成物は細胞治療生成物を誘導するために使用したフェレーシスサンプルを得た個体に再注入もしくは戻して輸注される。使用することができる再注入法には、例えば米国特許第４，８４４，８９３および４，６９０，９１５号明細書に開示されているそれら手法を含む。

ナイーブＴ細胞を含んでなるフェレーシス生成物を得ることができる個体は、好ましくは処置が必要な哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ラット、ウサギ、マウス、ヒト以外の霊長類またはヒトである。より好ましくは個体は異常な免疫系の機能に関連する疾患、障害または医学的状態の処置が必要なヒト患者である。あるいは適切な状況では、処置する個体に由来しないが、免疫細胞供与体のような他の適合性がある供給源に由来するナイーブＴ細胞のような、またはさらに不死化もしくは形質転換した免疫細胞株のような免疫細胞を使用して細胞治療生成物を本発明に従い調製することができる。

ＰＢＬの選択法には、Ｆｉｃｏｌｌ勾配、免疫精製を利用する技術（例えばＣＤ分子のような細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体、および抗体が吸着できるＳｅｐｈａｒｏｓｅ−、ＰｒｏｔｅｉｎＡ−およびＰｒｏｔｅｉｎＧ−結合ビーズのようなビーズ、および抗体が吸着できる磁気ビーズ）、フローサイトメトリー、および蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析がある。

選択したナイーブＴ細胞は好ましくは非選択フェレーシスサンプル成分から実質的に分離されている。より好ましくは選択したナイーブＴ細胞は、当該技術分野で利用できるよう磁気ビーズ精製システム、例えばＦＡＣＳに基づく手法のような細胞ソーティング法と組み合わせたＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ（ミルテニーバイオテック：ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）およびＤｙｎａｂｅａｄシステム（ダイナルバイオテック：ＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃ）、あるいは他の適切な細胞ソーティングデバイスおよび方法により実質的に精製される。次いでこのように選択されたナイーブＴ細胞は、不活性化され、そして選択したペプチドを負荷したａＡＰＣと混合され、そして活性化ヘルパーＴ細胞、そして好ましくはＣＴＬもしくはＣＤ８^＋記憶Ｔ細胞のような所望する活性化Ｔ細胞集団を活性化し、そして濃縮するために十分な時間、インキュベーションされる。そのような活性化Ｔ細胞は好ましくはペプチド特異的様式で活性化される。

実質的に分離されたナイーブＴ細胞対ａＡＰＣの比率は、例えば個体のリンパ球の培養条件に対する柔順性（ａｍｅｎａｂｉｌｉｔｙ）、および処置する疾患または他の状態の性質および重篤度のような個体の特性を考慮して、特定の個体に関して至適化することができる。例示的な分離されたナイーブＴ細胞対不活性化ａＡＰＣ比は、約３０：１から３００：１である。例えば３ｘ１０^７のヒトＰＢＬおよび１ｘ１０^６ａＡＰＣｓを混合し、そしてＲＰＭＩ１６４０培養基を含んでなる培地中で維持することができる。

したがってナイーブＴ細胞は、選択したペプチドを負荷したａＡＰＣで感作されなかったＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋細胞を含んでなる。ナイーブＴ細胞は、細胞の成長および増殖状態、細胞の表現型および細胞の活性に関連するような日常的に選択される１もしくは複数の特性に基づいて実験的に同定することができる。細胞の成長および増殖状態に関して、ナイーブＴ細胞は好ましくは静止しているＴ細胞（すなわちそれらは細胞周期のＧ_０部分にある傾向がある）集団を含んでなる。活性化Ｔ細胞はしばしば細胞周期のＧ_１もしくはＳ期である。記憶Ｔ細胞は、一時ナイーブであったが、活性化され、そして続いて静止状態に再び入ったＴ細胞を含んでなるか、または恒常性維持増幅（ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の結果として記憶表現型を獲得したナイーブＴ細胞を含んでなる（Ｏｐｆｅｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８３，ｐｐ．１７４５＿１７４８（１９９９）；Ｗｈｅｒｒｙｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．２２５＿２３４（２００３）；Ｋａｅｃｈｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１１１，ｐｐ．８３７＿８５１（２００２）；Ｋｉｅｐｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９６，ｐｐ．１３３０６＿１３３１１（１９９９）；Ｇｏｌｄｒａｔｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１９２，ｐｐ．５５７＿５６４（２０００）；Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６５，ｐｐ．１７３３＿１７３７（２０００））を参照にされたい）。そのような記憶Ｔ細胞は例えば感作する抗原（ｐｒｉｍｉｎｇａｎｔｉｇｅｎ）への再暴露、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞からの補助、および／または適切なサイトカインへの暴露で再活性化され得る。このように記憶Ｔ細胞および活性化Ｔに比べて、ナイーブＴ細胞はナイーブＴ細胞のプール（抗原に対する応答でＴ細胞のしっかりとした活性化中に生じるような）の消費が、ナイーブＴ細胞の数を再び満たすために比較的ゆっくりとした恒常性維持増殖の期間を必要としなければ、インビボで比較的非増殖的である（例えばＫｉｅｐｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐｐ．３１５７−３１６３（２００５），およびＢａｃｃａｌａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐｐ．４６０６−４６１２（２００５）を参照にされたい）。表現型に関して、ナイーブＴ細胞は、ナイーブＴ細胞ではない細胞について観察される発現のレベルに比べて、ＣＤ１１ａ ^ｌｏｗ／ＬＦＡ−１^ｌｏｗ（または^ｄｉｍ），ＣＤ２５^ｌｏｗ，ＣＤ２７^＋（または^ｈｉ），ＣＤ４４^ｌｏｗまたはＣＤ４４^ｉｎｔ，ＣＤ４５ＲＡ^＋（または^ｐｏｓ），ＣＤ４５ＲＯ⁻（または^ｎｅｇ），ＣＤ９５^ｌｏｗ（または^ｄｉｍ），ＣＤ５７⁻（または^ｎｅｇ），およびＣＤ６２Ｌ^ｈｉ（または^{ｂｒｉｇｈｔ}）を含むことができるナイーブＴ細胞関連ＣＤ分子のプロファイルの存在および相対的発現レベルにより、ナイーブＴ細胞ではない細胞（例えばＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、およびエフェクターＴ細胞（例えばＣＴＬ））から識別することができる。ナイーブＴ細胞は、ナイーブＴ細胞ではない細胞で観察される発現レベルに比べて、比較的高レベルのケモカイン受容体ＣＣＲ７（ＣＣＲ７^ｈｉ）の発現により識別することもできる（例えば、ＭｃＦａｒｌａｎｄｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９７（８），ｐｐ．４２１５−４２２０（２０００）；Ｉｓｈｉｍａｒｕｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＩｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．７（７），ｐｐ．７６３−７７２（２００６）；およびＫｅｒｎｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ．２９０８−２９１５（１９９９）を参照にされたい）。対照的に例えば記憶細胞は、ＣＤ２７^ｌｏｗ，ＣＤ４４^ｈｉ，ＣＤ４５ＲＡ⁻，ＣＤ４５ＲＯ^＋，ＣＤ５７^＋（またはｈｉ），ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ，および／またはＣＣＲ７^ｌｏｗ表現型（例えばＫｅｒｎｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ．２９０８−２９１５（１９９９），およびＢａｃｃａｌａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７４：４６０６−４６１２（２００５）を参照にされたい）により特徴付けることができる。細胞の活性に関して、ナイーブＴ細胞はインターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ、インターロイキン（ＩＬ）１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、および／または顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ（例えばＣｅｒｗｅｎｋａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．，１６１，ｐｐ．９７−１０５（１９９８）；Ｗａｌｚｅｒｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２０６，ｐｐ．１６−２５（２０００）；Ｔｉｚａｒｄ，Ｉ．，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＡＮＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，３^ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１２９−１４３（１９９２）；米国特許出願第２００２／０１１９１２１号明細書；および国際公開第ＷＯ２００２／０２２６４８号パンフレットを参照にされたい）を効率的に生産または分泌できないことにより特徴付けることができる。またナイーブＴ細胞は仮定の標的細胞に対して実質的な細胞傷害性または特異的な殺細胞活性を現さない。

感作され、そして刺激された、したがって上記のように活性化されたナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでなることができるナイーブＴ細胞、またはＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の組み合わせは、場合により所望する表現型および数の活性化Ｔ細胞を含んでなる治療用組成物および細胞治療生成物を生産するために、再刺激し、かつ／または増幅させることができる。例となる再刺激手順には、活性化Ｔ細胞の成長、増殖および／または分化を促進する１もしくは複数の選択したサイトカインを加え、そして活性化Ｔ細胞を、選択したペプチドを負荷した非ＣＤ８^＋細胞、例えばＣＤ１４^＋細胞とインキュベーションすることを含む。適切なサイトカインの選択は、治療用組成物または細胞治療生成物を最終的に含んでなる活性化Ｔ細胞の所望する表現型に依存する。すなわちナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞は活性化され、そして場合により再刺激かつ／または増幅されて、ＣＤ４^＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）１細胞またはＣＤ４^＋Ｔｈ２細胞になり、そしてナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞は活性化され、そして場合により再刺激かつ／または増幅されて、当該技術分野の指針を考えて技術者により所望されるようにＴｃ１様の表現型を有するＣＴＬ、Ｔｃ２様の表現型を有するＣＴＬ、記憶Ｔ細胞、またはそのような組み合わせとなることができる（例えばＣｅｒｗｅｎｋａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６３（１０），ｐｐ．５５３５−５５４３（１９９９）；Ｍｏｓｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，Ｖｏｌ．１７（３），ｐｐ．１３８−１４６（１９９６）；Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．８（３），ｐｐ．３３６−３４２（１９９６）；Ｃｒｏｆｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１８０，ｐｐ．１７１５−１７２８（１９９４）；Ｆｕｊｉｈａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．３６１３−３６１８（１９９６）；米国特許第６，３５５，４７９号明細書および国際公開第ＷＯ９７／４６２５６号パンフレットを参照にされたい）。好適なサイトカインにはＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−７，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−１２，ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αがある。例となるＴ細胞の増幅手順は、活性化Ｔ細胞を照射した非ＣＤ８^＋細胞と選択したサイトカインおよびＯＫＴ（商標）３のような抗ＣＤ３抗体調製物の存在下にてインキュベーションして非特異的な活性化Ｔ細胞の増幅を促進することを含む。採用するそのような再刺激および増幅プロトコールの数、順序および組み合わせの選択は技術者の関心の範囲内にあり、そして当該技術分野の指針により容易になり得る。例えばＣｅｒｗｅｎｋａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６１，ｐｐ．９７−１０５（１９９８）；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．２４（４），ｐｐ．６１９−６２９（１９９５）；Ｓａｄｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．２７１−２７９（１９９５）；米国特許出願第２００３／０１７０２１２号明細書；および国際公開第ＷＯ０２／０９２７７３号パンフレットを参照にされたい。

好適な態様では、刺激されたＴ細胞は続いて、刺激されたＴ細胞を活性化Ｔ細胞の成長、増殖および／または分化を促進するために十分な量のＩＬ−２およびＩＬ−７と接触させ、次いでそのように接触させたＴ細胞を、照射した自己の接着非ＣＤ８^＋細胞（例えばＣＤ１４^＋細胞）および追加の十分量のＩＬ−２およびＩＬ−７とインキュベーションさせるこを含んでなる少なくとも１反復の再刺激手順にかけられる。再刺激手順が１回より多く行われる態様では、活性化Ｔ細胞は各再刺激手順を反復する間に追加量のＩＬ−２およびＩＬ−７と接触させる。他の好適な態様では、活性化Ｔ細胞は少なくとも１回の再刺激反復手順に引き続いて、少なくとも１回の増幅手順にかけられ、ここで増幅手順は活性化Ｔ細胞を照射した非ＣＤ８^＋細胞と、そのように接触させたＴ細胞の成長、増殖および／または分化を促進するために十分な量のＩＬ−２、および好ましくはＯＫＴ（商標）３のような抗ＣＤ３抗体調製物の存在下にてインキュベーションすることを含む。

好適な態様では、ナイーブＴ細胞はＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでなり、これは活性化され、そして場合により再刺激かつ／または増幅された時、例えばそれらが標的とする細胞に対する細胞傷害活性を現し、あるいは免疫刺激または細胞傷害性に関連するサイトカインを生産することができる。好ましくはそれらはこれらの特性の組み合わせを現す。感作され、そして活性化されたナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を、上記のような再刺激および／または増幅手順にかけることができ、これはそのように活性化されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の分化および／または極性化（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を特異的なＣＴＬ細胞系統の表現型、例えばＣＤ８^＋Ｔｃ１およびＣＤ８^＋Ｔｃ２表現型に向ける。ペプチドを負荷したａＡＰＣで活性化したＣＤ８^＋Ｔ細胞も、選択したペプチドのみ、または特定のサイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１２、およびインターフェロンガンマと、または活性化Ｔ細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共刺激分子に対するような抗体と一緒に、数回の再刺激にインビボまたはインビトロでかけることができる。好適な態様では、活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞はさらにこのように再刺激され、これは少なくとも約４もしくは５世代にわたり標的細胞に関する免疫原性および細胞傷害性を維持し、記憶ＣＤ８^＋Ｔ細胞を生じる。記憶ＣＤ８^＋Ｔ細胞の同定、特性決定、免疫原性の維持および増幅に関する方法は、例えばＣｅｒｗｅｎｋａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．，１６１，ｐｐ．９７−１０５（１９９８）；Ｃｅｒｗｅｎｋａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６３，ｐｐ．５５３５−５５４３（１９９９）；特許出願公開第２００２／０１１９１２１号明細書；および国際公開第ＷＯ２００２／０２２６４８号パンフレットを参照にされたい。

細胞治療生成物の調製法に使用されるａＡＰＣは、不活性化ｘＡＰＣを含んでなることができ、これはそれらの表面上に外因性分子を発現することができるヒト以外の種、およびｘＡＰＣ培養基に由来する修飾された宿主細胞である。またａＡＰＣはＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子から選択される外因性ＭＨＣ分子を含んでなる。ａＡＰＣ系は場合により、ナイーブＴ細胞の活性化で補助する少なくとも１つの外因性の補助する分子をさらに含んでもよい。好ましくは外因性分子は宿主細胞に導入された異種核酸によりコードされる。

好ましくはａＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子に加えて少なくとも１つの共刺激分子を含んでなる。より好ましくはａＡＰＣはＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子に加えて、少なくとも１つの共刺激分子および少なくとも１つの接着分子を含んでなる（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２２（４），ｐｐ．４０３−４１０；Ｃａｉｅｔａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．１４７３６−１４７４１；Ｊａｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９，ｐｐ．１２１１７−１２１２１；Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，１９９８，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，Ｖｏｌ．５８，ｐｐ．３０９４−３１００；およびＬａｔｏｕｃｈｅｅｔａｌ．，２０００，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．４０５−４０９を参照にされたい）。共刺激分子および接着分子を含む例となる補助する分子の選択、クローニング、調製および発現に有用な技術、方法および試薬は、例えば米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号および同第６，３６２，００１号明細書に例示されている。好適ＨＬＡクラスＩＭＨＣ抗原分子には、限定するわけではないがＨＬＡ２．１（ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１）、ならびにＨＬＡ−Ａ^＊０１０１、ＨＬＡ−Ａ^＊０３０１、ＨＬＡ−Ａ^＊１１０１、ＨＬＡ−Ａ^＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ^＊３３０３、ＨＬＡ−Ｃ^＊０７０１、ＨＬＡ−Ｃ^＊０７０２、ＨＬＡ−Ｃ^＊０４０１、ＨＬＡ−Ｂ^＊０７０２、ＨＬＡ−Ｂ^＊４４０２、ＨＬＡ−Ｂ^＊３５０１がある。

好適なＭＨＣクラスＩ分子には重鎖（例えばアルファ鎖）およびβ２−ミクログロビンがある。そのようなＭＨＣクラスＩ分子は完全長分子、あるいは完全な膜貫通もしくは細胞質ドメインを欠くか、または完全な膜貫通および細胞質ドメインの両方を欠く細胞外部分のような完全長分子の細胞外部分のどちらかであることができる。ＭＨＣクラスＩ分子は、好ましくは選択したペプチドに結合することができる。本発明に使用することができる例示的なＭＨＣクラスＩ分子には、例えばヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ，ＨＬＡ−Ｅ，ＨＬＡ−ＦまたはＨＬＡ−Ｇ座にコードされる分子を含む。好ましくはＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ座によりコードされる分子から選択される。β２−ミクログロビン分子、ＨＬＡ分子のようなＭＨＣクラスＩ分子、およびそれらの部分の選択、クローニング、調製および発現に有用な技術、方法および試薬は、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号および同第６，３６２，００１号明細書に例示されている。

好適なＭＨＣクラスＩＩ分子には、一緒に会合してＭＨＣクラスＩＩヘテロ二量体を形成するアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖を含む。そのようなＭＨＣクラスＩＩヘテロ二量体は、完全長分子、または完全長α鎖の細胞外部分、完全長β鎖の細胞外部分、またはαおよびβ両方の細胞外部分のいずれかであることができ、そのような細胞外部分（１もしくは複数）は、完全な膜貫通もしくは細胞質ドメインを欠いている。本発明に使用することができる例示的なＭＨＣクラスＩＩ分子には、ＨＬＡ−ＤＰ，ＨＬＡ−ＤＱＨＬＡ−ＤＲ，ＨＬＡ−ＤＯ，ＨＬＡ−ＤＮまたはＨＬＡ−ＤＺ座によりコードされる分子を含む。ＭＨＣクラスＩＩα鎖、β鎖およびαβヘテロ二量体およびそれらの細胞外部分の選択、クローニング、調製および発現に有用な技術、方法および試薬は、米国特許第５，５８３，０３１号および同第６，３５５，４７９号明細書に例示されている。

補助する分子は、抗原もしくは免疫原であるか、または抗原および免疫原の両方である選択したペプチドが結合するＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子にナイーブＴ細胞が提示される時、そのようなナイーブＴ細胞の活性化を促進する。補助する分子は例えば：（ｉ）共刺激分子、これはとりわけＴ細胞の表面上のＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４分子に結合し、これにより例えばインターロイキン（ＩＬ）−２のようなサイトカイン、分泌、Ｔ−細胞増幅、Ｔｈ１分化および短期Ｔ細胞生存のような影響を及ぼすＢ７．１（以前はＢ７として知られ、そしてまたＣＤ８０としても知られている）およびＢ７．２（ＣＤ８６としても知られている）、およびＣＤ７０のような抗原提示細胞により発現されるタンパク質である（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２２（４），ｐｐ．４０３−４１０を参照にされたい）；および（ｉｉ）接着分子、例えば細胞対細胞、または細胞対マトリックスの接触を促進するセレクチンのような炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンのような膜貫通結合糖タンパク質、カドヘリンのようなカルシウム依存性タンパク質、および細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）のような１回膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーフィミリータンパク質のような補助する分子でよい。好適な接着分子にはＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２，ＩＣＡＭ−３およびＬＦＡ−３のようなＩＣＡＭを含む。補助する分子の任意の適切な数および組み合わせを使用することができる。

宿主細胞を修飾してナイーブＴ細胞を活性化するために使用するａＡＰＣ株にすることができる。外因性分子を発現するように操作することができるカルチャー中で連続成長することができる任意の型の細胞を宿主細胞源として選択できる（例えば種々の細胞株を培養および使用するための要約および手順に関しては、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）を参照にされたい）。したがって宿主細胞は、細菌種のような原核種、または酵母、昆虫、植物、マイコプラズマおよび哺乳動物のような真核種を含む任意の様々な種から生じることができる。

好適な態様では、宿主細胞は生物、好ましくは動物から集め、そして単離した初代細胞を含み、そして抗原提示系の調製に直接使用されるか、または初代細胞が培養された後にそのように使用されるか、あるいは制限された世代数、例えば１〜５０回の継代が行われる。あるいはそのような初代細胞株は、祖先の初代細胞株からの子孫である不死化細胞株の生成を可能とする条件下で培養することができ、これは日常的に選択され得る。そのような不死化は、分岐期間（ｃｒｉｓｉｓｐｅｒｉｏｄ）に達する十分な数の継代を経て、その間に培養中のほとんどの初代細胞は死ぬが、比較的少数の迅速に分裂するバリアントが持続するように初代細胞の培養を限定する（ｅｎｔａｉｌ）ことができる。そのような持続するバリアントにより創始されたカルチャーは、持続的な繁殖を可能とするために、細胞が適切な倍数および適切な希釈因子で希釈され、しかも適切な栄養および培地が補充されれば、理論的には任意の数の継代を行うことができる。また形質転換した細胞株は、抗原提示系の調製に使用することができる真核宿主細胞の供給源として役立つことができる。そのような形質転換細胞系は、動物に潜む腫瘍のようなものから取った腫瘍細胞に由来することができる。種々の型の不死化または形質転換細胞株が、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）のような任意の数の細胞株の貯蔵所から得ることができ、または当該技術分野で既知の、もしくはいずれ利用できるようになる日常的技術を使用して調製することができる。

所望する宿主細胞の組およびａＡＰＣの成長および培養条件を得るために操作することができるパラメーターの例には、温度、通気の程度、酸素飽和率、二酸化炭素飽和率、栄養組成および濃度、ならびに静置成長対撹拌（すなわち振盪）成長がある。シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）２細胞のような選択した宿主細胞の調製、成長および培養に関する説明的方法は、米国特許第６，２２５，０４２，６，３５５，４７９，および６，３６２，００１号明細書；Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（ｅｄｓ．），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎｄＪｏｈｎＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２；およびＦｒａｎｋ，“ＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｏｎＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ”，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ１９９８，ＯＭＲＦＲｅｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＦｏｒｕｍに提供されている。

ａＡＰＣになるための修飾に選択され宿主細胞は、好ましくは細胞内の抗原プロセッシング、細胞内のペプチドトラフィッキング、および／または細胞内のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子−ペプチド負荷が欠失しているか、または変温性（すなわち温度攻撃に対して哺乳動物細胞株より感受性が低い）であるか、または欠失と変温特性の両方を有する（例えば（ＤｅＳｉｌｖａｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６３（８），ｐｐ．４４１３−４４２０；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒｅｔａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６２（３），ｐｐ．５６３−５６７；Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎｅｔａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４６（６２８３），ｐｐ．４７６−４８０を参照にされたい）。好ましくは選択した宿主細胞は、そのような宿主細胞に導入される外因性のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子および補助する分子成分に対する少なくとも１つの内因性の対（例えば上記のような内因性ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子および／または内因性の補助する分子）を発現する能力も欠いている。さらにａＡＰＣは好ましくは、ａＡＰＣを生成するためのそれらの修飾以前に、選択した宿主細胞が保有した欠失および変温的特徴を保持している。好適な態様では、選択した宿主細胞は、昆虫細胞株のような抗原プロセッシング（ＴＡＰ）欠失細胞株に会合するトランスポーターを構成するか、またはそれから誘導されるかのどちらかである。

好適な選択された宿主細胞は、変温昆虫細胞である。選択する宿主細胞を選択できる昆虫細胞の例には、例えばガ（ＡＴＣＣＣＣＬ８０）、アワヨトウの幼虫（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）、蚊の幼虫（ＡＴＣＣ株ＣＣＬ１２５，ＣＣＬ１２６，ＣＲＬ１６６０，ＣＲＬ１５９１，ＣＲＬ６５８５，ＣＲＬ６５８６）およびカイコ（ＡＴＣＣＣＲＬ８８５１）に由来するものである。特に好適な態様では、細胞株はショウジョウバエの細胞株、例えばシュナイダー２細胞株（例えばＳｃｈｎｅｉｄｅｒ，１９７２、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．，ｖｏｌ２７，ｐｐ３５３−３６５）、ＳＦ−９細胞またはＳＦ−２１細胞のようなスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）に由来する細胞株、あるいはＴｎ５細胞、Ｈ５細胞のようなトリコプラシア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）に由来する細胞株、およびＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ（商標）（インビトロジェン：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞である。

選択された宿主細胞は、外因性ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子、および好ましくは１より多くの上記の外因性の補助する分子を発現するために、異種核酸の宿主細胞への導入を含んでなる方法により修飾され、これによりａＡＰＣを生成する。このようにａＡＰＣはいったん選択した宿主細胞の修飾により生成されれば、所望する細胞治療に適するように、上記のＨＬＡ分子から選択される外因性のＭＨＣクラスＩ分子もしくは外因性のＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかを、共刺激および接着分子から選択される１〜１５以上の外因性の補助する分子に加えて発現することができる。特定の好適な態様では、宿主細胞は修飾されて外因性のＨＬＡ−Ａ２分子を外因性のＢ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）に加えて発現する。他の好適な態様では、宿主細胞は修飾されて外因性のＨＬＡ−Ａ２分子を外因性のＢ７．１（ＣＤ８０），ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４），ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）およびＣＤ７０に加えて発現する。

異種核酸はＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列でよく、あるいはＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列の両方を含んでなることができる。好ましくは異種核酸はＤＮＡ配列である。

異種核酸は好ましくは、選択した宿主細胞に好ましくはトランスフェクションにより導入するために適する１もしくは複数のベクターに組み込まれる。ベクターは、外因性分子の少なくとも１つの部分をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含んでなる適切な核酸配列であることができ、これは連結された異種核酸配列の発現を促進するベクター配列に操作可能に連結されている。ベクター配列に操作可能に連結されている異種核酸配列は、哺乳動物ＭＨＣ分子の少なくとも一部をコードする。好ましくはＭＨＣ分子の全タンパク質をコードする配列がベクターに挿入され、そして発現される。細胞外部分のようなＭＨＣ分子の一部が利用される態様では、そのような部分は例えば細胞外部分をコードする配列の末端で翻訳の終結を支配する配列（すなわち終止コドン）の挿入により調製することができる。そのような態様では、そのような細胞がいったん細胞外部分を発現すれば、修飾された細胞の膜内に細胞外部分が少なくとも部分的に保持されるように細胞外部分が改変されることが好ましい。好適な態様では、使用されるＭＨＣ部分は完全長ＭＨＣクラスＩ分子である。

ＭＨＣクラスＩ分子をコードするベクターが使用される好適な態様では、第２のベクターに操作可能に連結された哺乳動物β２ミクログロブリン分子の少なくとも一部をコードする第２のベクターを、β２ミクログロブリン分子またはその部分を発現するために使用することができる。あるいはクラスＩＭＨＣ分子およびβ−２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む単一ベクターを使用することができる。

さらに好適な態様では、ＭＨＣ分子をコードするベクターおよびβ２ミクログロブリンをコードするベクターに加えて、少なくとも１つのさらなるベクターが使用され、このベクターはベクターに操作可能に連結される補助する分子の少なくとも一部をコードする。さらに一層好適な態様では、複数の追加ベクターが使用され、各ベクターは、Ｂ７−１（以前はＢ７として知られ、そしてまたＣＤ８０としても知られている）およびＢ７−２（ＣＤ８６としても知られている）ような共刺激分子、およびＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２，ＩＣＡＭ−３およびＬＦＡ−３のようなＩＣＡＭ分子を含む接着分子から選択される補助する分子をコードする。共刺激および接着分子の任意の適切な組み合わせを、ａＡＰＣの生成に使用することができる。

さらに特定の好適な態様では、β２−ミクログロブリン分子はβ２−ミクログロブリン宿主細胞から得られ、この細胞はａＡＰＣになるように修飾される宿主細胞とは区別される。そのような態様では、β２−ミクログロブリン分子をコードするベクターがβ２−ミクログロブリン宿主細胞に導入、そして発現され、そして発現したβ２−ミクログロブリン分子のサンプルが集められる。あるいはβ２−ミクログロブリン分子のサンプルは内因性のβ２−ミクログロブリンを発現する生物から誘導され得る。次いで外因性ＭＨＣクラスＩ分子を発現するａＡＰＣをβ２−ミクログロブリン分子のサンプルとインキュベーションすることができる。

核酸配列の所望する発現レベルを得るために、核酸配列は転写、転写／翻訳終結、およびタンパク質をコードする核酸配列については、翻訳開始のためのリボゾーム結合部位を支配するプロモーターを含有するベクターに挿入される。例となる細菌プロモーターはＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，同上；およびＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，同上に記載されている。構成的タンパク質を発現するための例となる細菌発現系には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（Ｐａｌｖａｅｔａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ２２：２２９−２３５；Ｍｏｓｂａｃｈｅｔａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ３０２：５４３−５４５）がある。そのような発現系のキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞に適切な真核発現系は当該技術分野で知られ、または入手することが可能である。

プロモーターに加えて、各ベクターは好ましくは宿主細胞中で異種核酸の発現に必要なさらにすべての要素を含む転写単位または発現カセットを含む。例となるベクターは、異種核酸に操作可能に連結されたプロモーター、および転写産物の効率的なポリアデニル化に必要なシグナル、リボゾーム結合部位および翻訳終結を含む。異種核酸は、トランスフェクトされた細胞によるコードされたタンパク質の分泌を促進するために、開裂できるペプチド配列に連結することができる。そのようなシグナルペプチドの例には、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インスリンおよび神経成長因子、およびオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の幼若ホルモンエステラーゼに由来するシグナルペプチドを含む。追加の、または代替的要素、例えばエンハンサー要素、内因性プロモーター要素、機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位を含む、もしくは含まないイントロン、翻訳終止要素、またはポリアデニル化シグナル（これらのすべてまたは幾つかは選択した異種核酸の内因性要素であることができる）を、カセットまたはベクターに含めることができる。

細菌、哺乳動物および／または昆虫の宿主細胞中での異種核酸の発現に適するベクターの例には：ｐＲｍＨａ−１，ｐＲｍＨａ−２およびｐＲｍＨａ−３を含むｐＲｍＨａベクター（例えば国際公開第ＷＯ９６／２７３９２号パンフレットおよび米国特許第６，２２５，０４２号および第６，３５５，４７９号明細書を参照にされたい）；ｐＢＲ３２２に基づくベクター、ｐＳＫＦ，ｐＥＴ２３Ｄ，ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２９，ｐｇ．８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｉｎａｎｅｔａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯＪ，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．１８７−１９５），ｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン），ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ，ｐＸＴ１（ストラタジーン），ｐＳＧ５（ストラタジーン），ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０），ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４），ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９），ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８），ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６），ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０），ｐＭＳＣＶ，およびｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５），ｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＵＣ１８，ｐＢＲ３２２，およびｐＢＲ３２９（バイオラッドラボラトリーズ：ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（ファルマシア：Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ａｎｄｐＢＳ（ストラタジーン）およびＭ１３ｍｐ１９（ストラタジーン）がある。ａＡＰＣの調製に使用するための好適なベクターは、ＳＶ４０ベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスのような真核ウイルスに由来する調節要素を含有するベクター、およびエプスタイン−バーウイルスに由来するベクターがある。そのようなベクターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞での発現に効果的な他のプロモーターの指令下で、挿入した異種核酸の発現を可能とする。

種々の組換えバキュロウイルス発現ベクターが、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）およびイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）のような数種の昆虫種に由来する宿主細胞への感染のために開発された（例えば国際公開第ＷＯ８９／０４６６９９号パンフレット；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌｅｔａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｖｏｌ．５６，ｐｇ．１５３；Ｗｒｉｇｈｔ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１，ｐｇ．７１８；Ｓｍｉｔｈｅｌａｌ．，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．３，ｐｇ．２１５６；およびＦｒａｓｅｒ，ｅｔａｌ．，１９８９，Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２５，ｐｇ．２２５を参照にされたい）。好適なウイルス由来のベクターにはバキュロウイルスに基づくベクター、例えばＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）（ＢＤバイオサンエンス：Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢａｃＰＡＫ６（ＢＤバイオサイエンス）、ＰｒｏＥａｓｙ（商標）（ＢＤバイオサイエンス）およびｐＤＳＶＥがある。

ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、共刺激分子、もしくは補助する分子、またはこれらの組み合わせをコードする異種核酸を含んでなるベクターを使用するために、当該技術分野で利用可能な種々の宿主発現ベクター系を利用することができる。そのような宿主発現系は、目的のコード配列を生産し、そして続いて精製することができるコード配列による媒介物を表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた時に、分子を発現することができる細胞も表す。これらには例えばＭＨＣコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；ＭＨＣコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））；ＭＨＣコード配列を含有する組換え細菌発現ベクターで感染させた昆虫細胞系；ＭＨＣコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス；ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させた、あるいは組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルス（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、セムリキ森林ウイルスプロモーター）に由来するプロモーターを含有する組換え発現ベクターを宿す哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ，ＣＨＯ，ＢＨＫ，ＨＥＫ２９３，３Ｔ３細胞）がある。さらにそれらから発現された外因性ポリペプチドが、単離および／または検出のために都合が良い方法を可能とするコードされたポリペプチドタグを含むように、ポリペプチドタグをコードする核酸配列も選択したベクターに挿入することができる。タグの例にはｃ−ｍｙｃタグ、ヘモグルチニン（ＨＡ）−タグ、６ｘ−Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＦＬＡＧタグおよびＶ５タグがある。

外因性タンパク質の発現に好適な発現系は、ｐＲｍＨａ−１，ｐＲｍＨａ−２およびｐＲｍＨａ−３（Ｂｕｎｃｈｅｔａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．１０４３−１０６１）のようなｐＲｍＨａベクターの使用を含んでなる発現系であり、これらは昆虫細胞、好ましくはショウジョウバエの細胞のような宿主細胞に導入される。

特に好適な態様では、発現ベクターは誘導性ベクターである。そのような誘導性発現ベクターを含んでなるａＡＰＣは最初に、適切な外因性タンパク質発現を行うために予め定めた期間、ＣｕＳＯ_４のような誘導剤による刺激を必要とするかもしれない。好ましくはＭＨＣ分子の発現は、そのようなＭＨＣ分子をコードする誘導性発現ベクターにより駆動される。適切な誘導期間、例えば約１２〜４８時間の後、選択したペプチド（これは以下に検討するように調製することができる）を予め定めた濃度（例えば約１００μｇ／ｍｌ）で加えることができる。追加のインキュベーション期間後（例えば２７℃で約１２時間）、カルチャーはＣＤ８^＋細胞の活性化に直ちに使用できる。この追加のインキュベーション期間は、短くしてもまたは恐らく省略してもよく、カルチャーは好ましくは温度攻撃への反発を強化するために、ナイーブＴ細胞を加える前のある期間、インキュベーションされる。例えば選択したペプチドが加えられたカルチャーは３７℃で延長した時間インキュベーションした時でも、有意な量の選択したペプチドを負荷したクラスＩＭＨＣ分子を発現することができる。

異種核酸を選択した宿主細胞に導入するために使用することができる外来ヌクレオチド配列の宿主細胞への導入手順の例には、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（キアゲン：Ｑｉａｇｅｎ）のような試薬、リポソーム、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、マイクロインジェクション、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バイオリスティックパーティクルアクセラレーション（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｐａｒｔｉｃｌｅａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、遺伝子銃）、またはクローン化したゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための任意の他の適切な方法の使用を含む（例えばＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８９）を参照にされたい）。宿主細胞の安定なトランスフェクションには、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のわずかな画分のみが外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込めればよいことが明らかである。これらの組込み体を同定し、そして選択するために、選択可能なマーカーをコードする遺伝子（例えば抗生物質に対する耐性）を目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入することができる。好適な選択可能マーカーには、ジェネティシン（Ｇ４１８）、ピューロマイシン、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を付与するものを含む。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死ぬ）。

ａＡＰＣに付随する異種核酸の少なくとも一部、そして好適な態様では、ａＡＰＣが誘導する宿主細胞に対して異種の核酸および内因性の核酸は、そのような外因性分子の発現に続いて、またはそれと同時に架橋化により不活性化されるので、不活性化後に細胞の成長、核酸の複製または発現は本質的にはない。好ましくは、不活性化が核酸のさらにかなりの複製または発現を不可能にするが、不活性化前にａＡＰＣの表面上に発現した外因性タンパク質の活性には認知できる影響を及ぼさない。

ａＡＰＣは、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）を架橋するように薬剤で不活性化される。例となる架橋剤は米国特許出願第２００５／００５４５７２号明細書；Ｂｉｏｄｒｕｇｓ，Ｖｏｌ．１７（１），ｐｐ．６６−６８（２００３）（アモトサレンおよび光；ＩＮＴＥＲＣＥＰＴ系）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｅｔａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．６７（３），ｐｐ．３５０−３５７（１９９８）（メチレンブルーおよび光）；および米国特許第７，０６７，２５１号明細書（ソラレンおよびＵＶＡ）に記載されている。当該技術分野で利用できる、または利用できるようになる架橋剤は、本発明に従いａＡＰＣに随伴する核酸を不活性化するための日常的な実験を通して当業者により所望されるように選択され得る。例えば適切な架橋剤を選択するために、当業者は特定の架橋剤により生成される架橋の性質、その相対的毒性、効力、安定性、反応性および他の類似特性といった特定の架橋剤に関連する特定の性質を考慮することができる。さらに複数の架橋剤を使用してａＡＰＣを不活性化してもよい。さらに架橋剤を用いた処理は外因性分子の発現およびＡＰＣ細胞表面上での提示と同時またはその後でよい。好適な架橋剤は核酸（例えばＤＮＡおよびＲＮＡ）または核酸およびポリペプチドの両方に対して高い親和性を有し、付加物が選択した架橋剤と核酸または核酸とポリペプチドとの間に形成できるようにそのような分子と反応する。そのような架橋剤は鎖内または鎖間付加物のいずれかの形成に参加することができる。鎖間付加物の形成の場合、付加物の核酸成分は２本のＤＮＡ鎖、２本のＲＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖とポリペプチド、またはＲＮＡ鎖とポリペプチドを含んでなる。鎖内付加物の形成の場合、付加物の核酸成分は１本のＤＮＡ鎖または１本のＲＮＡ鎖を含んでなる。好ましくは付加物の核酸成分はＤＮＡを含んでなる。

架橋剤の具体例には、ソラレンファミリーのメンバーの分子およびそれらの誘導体（例えばＬｉｎｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，Ｖｏｌ．３７（４），ｐｐ．４２３−４３５（１９９７））；アントラキノンおよびアントラキノン誘導体（例えばＫａｎｇｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，Ｖｏｌ．，２４（２０），ｐｐ．３８９６−３９０２（１９９６））；マイトマイシンＣおよびマイトマイシンＤのようなマイトマイシン（例えばＴｏｍａｓｚ，“Ｔｈｅｍｉｔｏｍｙｃｉｎｓ：ｎａｔｕｒａｌｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓｏｆＤＮＡ．”ＩｎＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＡＳＰＥＣＴＳＯＦＡＮＴＩＣＡＮＣＥＲＤＲＵＧ−ＤＮＡＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮＳ．ＶＯＬＵＭＥ２（ＮｅｉｄｌｅＳａｎｄＷａｒｉｎｇＭ，ｅｄｓ．），ｐｐ．３１３−３４９（１９９４）およびＷａｒｒｅｎｅｔａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｏｌ．Ｍｕｔａｇｅｎ．，Ｖｏｌ．３１（１），ｐｐ．７０−８１（１９９８））；メルファランおよびクロラムブシルのようなナイトロジェンマスタード（例えばＤｒｏｎｋｅｒｔｅｔａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４８６（４），ｐｐ．２１７−２４７（２００１）およびＳａｎｃａｒｅｔａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７３，ｐｐ．３９−８５（２００４））；アドリアマイシン、ダウノマイシン、エピルビシンおよびイダルビシンのようなアントラサイクリン（例えばＣｕｔｔｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．２（７），ｐｐ．６６１−６７０（２００３）およびＳａｎｃａｒｅｔａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７３，ｐｐ．３９−８５（２００４）を参照にされたい）；シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチンおよびオキサリプラチンのような白金含有配位化合物（例えばＲｅｅｄｉｊｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１００（７），ｐｐ．３６１１−３６１６（２００３），Ｆｒａｎｋｅｎｂｅｒｇ−Ｓｃｈｗａｇｅｒｅｔａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１２，ｐｐ．１７５−１８４（２００５），およびＤｒｏｎｋｅｒｔｅｔａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４８６（４），ｐｐ．２１７−２４７（２００１）を参照にされたい）リボフラビン；チアゾールオレンジ染料、メチルグリーン染料、エチジウムブロミドおよびエチジウムダイマーのような他の芳香族化合物または染料（例えばＴｕｉｔｅｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２４３（１−２），ｐｐ．４８２−４９２（１９９７），Ｆａｒｉｄｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．，Ｖｏｌ．１５（２），ｐｐ．３２１−３３２（１９９７），およびＳａｎｃａｒｅｔａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７３，ｐｐ．３９−８５（２００４））；等を含む。

好ましくは架橋剤は光活性化性（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ）である。したがって好適な態様では、架橋はａＡＰＣを光活性化性架橋剤とインキュベーションし、そしてインキュベーションしたａＡＰＣを光活性化用量の適切な波長の照射に、例えば架橋剤がａＡＰＣに付随する核酸との付加物の形成を引き起こすことによりａＡＰＣを不活性化するために十分な時間暴露することにより行われる。好適な態様では、架橋は異種核酸およびａＡＰＣに付随する内因性核酸の両方の不活性化を達成するので、それらは殺されるか、またはさらなる複製または増殖が本質的にできないようにされる。好ましくは架橋はａＡＰＣの抗原提示細胞機能を実質的に下げることなく、不活性化され、そして本質的に細菌およびウイルスのような微生物の混入が無いＡＰＣをもたらす。このようにいったん不活性化されれば、ａＡＰＣは本質的に代謝的に不活性であるが、それらの表面上に機能的な外因性分子を提示する能力を保持し（これは不活性化前に発現そして提示された）、選択したペプチドをナイーブＴ細胞に提示し、そしてペプチドが提示されたナイーブＴ細胞を活性化する。

不活性化および無菌性は、例えば感染した細胞の生育能アッセイ；ウイルスの感染性アッセイ；ウイルス活性アッセイ；内因性ウイルスタンパク質検出アッセイ；内因性ウイルス核酸検出アッセイ；ＰＣＲに基づくアッセイまたは逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲに基づくアッセイ；異種核酸検出アッセイ；フローサイトメトリー；および／またはＦＡＣＳ分析により確認することができる（例えばＢｅｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ４０：１５０３，２０００を参照にされたい）。例えば培養基中に随伴するウイルス核酸および他の微生物の核酸を含む可能性がある昆虫細胞を、異種核酸をコードする外因性分子でトランスフェクトし、次いで架橋に供することができる。そのように供した細胞から得た上清は、次いで当該技術分野で知られている方法を使用してアッセイして、ウイルス核酸活性の直接的指標であるプラーク形成単位（ＰＦＵ）の量を測定することができる。類似の方法を使用して他の非ウイルス性微生物核酸の活性を測定することができる。本発明の不活性化ａＡＰＣは好ましくはＰＦＵを本質的に提示しない。ウイルスコートタンパク質の存在を検出するためのイムノアッセイのような当該技術分野で知られ、または利用可能な適切な他のアッセイを使用してウイルス複製およびウイルスタンパク質生成物の移植の不存在を確認することもできる。

特に好適な態様では、培養基、血液もしくは血液産物等のようなａＡＰＣの他の成分に随伴するか、またはそれに由来する異種核酸は、光活性化性架橋剤への暴露で不活性化される。光反応は、穏やかな生理学的条件下で微生物産物の殺菌に広く安全な境界を作ることができる。

さらに好ましくは、光活性化可能な架橋剤は国際公開第ＷＯ９１／０６６６５号および同第ＷＯ９６／３９８２０号パンフレット、Ｌｉｎｅｔａｌ．，１９９７，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，Ｖｏｌ．３７（４），ｐｐ．４２３−４３５，およびＢｅｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ４０：１５０３，２０００に具体的に説明されているようなソラレンファミリーの分子のメンバーである。そのような架橋剤は、それらを光活性化用量の照射に暴露することにより光活性化することができる。架橋剤の量および濃度および照射強度および期間のようなパラメーターを試験し、操作し、そして至適化する方法は、当該技術分野の指針に照らして日常的に選択することができる（例えば国際公開第ＷＯ９６／３９８２０号および同第ＷＯ９１／０６６６５号パンフレットを参照にされたい）。ソラレンの光反応は、活性生成物中の既知および未知の両ウイルスを不活性化するために有利である。ソラレン不活性化ウイルスは、免疫アッセイおよび実験用ワクチンでの使用に非感染性抗原として有用であるとすでに証明された（Ｈａｎｓｏｎ，ＢｌｏｏｄＣｅｌｌｓ１８：７，１９９２）。

光活性化用量の照射を送達し、そしてそれにより架橋を達成するために使用できる適切なデバイスは、例えば国際公開第ＷＯ９６／３９８２０号および同第ＷＯ９１／０６６６５号パンフレットに例示されているように、当該技術分野の教示に基づき選択または設計することができる。そのような具体的に説明されたデバイスは、それらが本発明の特定の態様のニーズに合うように適切に修飾することができる。例えば光活性化ユニットに組み込まれる電磁気照射の供給源を有するデバイスは：適切な波長の電磁気照射を提供して少なくとも１つの架橋剤に光活性化を生じる手段：ａＡＰＣを含んでなる少なくとも１つのサンプル、好ましくはそのような複数のサンプルを、光活性化中、照射を提供する手段と固定された関係に支持する手段；および光活性化中に所望の温度範囲内にサンプルの温度を維持する手段を含んでなることができる。このように例示的態様では架橋化は：各々がａＡＰＣ組成物および光活性化可能な架橋剤を含有する複数のサンプル容器を、電磁気照射の蛍光源と固定された関係に支持し；複数のサンプル容器を電磁気照射と同時に照射して架橋剤の光活性化を引き起こし；そして各容器中の組成物の温度を、光活性化中に所望する温度範囲に維持することを含んでなる工程により行うことができる。

特に好適な態様では、架橋剤はソラレン誘導体である。長波ＵＶ照射により光活性化されるソラレン誘導体は様々な応用に使用され、デオキシリボ核酸およびリボ核酸ウイルスを不活性化し（例えばＢｒｏｃｋｓｔｅｄｔｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１１（８），ｐｐ．８５３−８６０（２００５）；Ｌｕｂａｋｉｅｔａｌ．，ＡＩＤＳＲｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｕｓ，Ｖｏｌ．１０（１１），ｐｐ．１４２７−１４３１（１９９４）を参照にされたい）、そしてソラレンはＵＶＡ光の照射でＤＮＡおよびＲＮＡのピリミジン塩基と共有結合した一付加物および架橋を形成すると記載された（Ｒｅｄｆｉｅｌｄｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．３２（３），ｐｐ．１２１６−１２２６）。さらにＴｈｅｒａｋｏｓはリンパ腫患者についてソラレン／ＵＶ処置を臨床的に試験した。ソラレンコアまたはモチーフを含んでなる化学
構造を有する化合物であるソラレン誘導体の例を以下に示す：

好ましくは臨床用の、もしくは類似の高純度ソラレン誘導体がａＡＰＣに随伴する核酸を架橋するために使用される。ソラレン誘導体はａＡＰＣと適切な濃度、例えば約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１，５，１０，１５，２０，３０，４０もしくは５５μｇ／ｍｌのような１μｇ／ｍｌ〜５５μｇ／ｍｌで接触させられる。ソラレン処理したａＡＰＣ組成物は続いて長波（約３２０ｎｍ〜約４００ｎｍ）の紫外線照射であるＵＶＡに、所望の程度の不活性化を達成するために十分な時間、暴露（を照射）される。例えば１，３，４，５，１０，１５，２０，３０，４５，６０分のような約１分〜約６０分のＵＶＡ暴露を選択することができる。この暴露中のＵＶＡ強度は、所望する程度の不活性化を達成するために選択した暴露期間の観点から、例えば約０．１〜約１００ジュール／ｃｍ^２（Ｊ／ｃｍ^２）から、そして好ましくは例えば１，５，１０，１５，もしくは２０，４０，５０もしくは１００Ｊ／ｃｍ^２が選択される。８−ＭＯＰｓに加えて１ジュール／ｃｍ^２で２分間の架橋処理がショウジョウバエの細胞を不活性化するために十分であるが、好ましくは架橋化はいかなるウイルス混入物も不活性化すると同時に、ＡＰＣ機能（未処理ＡＰＣと比較して）を維持または強化するためにも行われる。例示的態様では、ソラレン誘導体の用量（５ｍｃｇ／ｍｌ；８−ＭＯＰｓ）およびＵＶＡ暴露（３２０−３８０ｎｍで５分間の照射）は、ＨＩＶ−１−感染細胞を不活性化するために使用される条件に類似する（Ｗａｔｓｏｎｅｔａｌ．，ＡＩＤＳＲｅｓＨｕｍＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ６：５０３，１９９０を参照にされたい）。この光反応は、感染後にソラレン／ＵＶで処理した感染Ｓｆ９細胞から単離したバキュロウイルスを不活性化するために十分である。上清から得たウイルスストックには感染性ウイルスを含まず、ここで対照ウイルスに感染したＳｆ９細胞は１サイクルの感染後、有意な量のＰＦＵを含む（８ｘ１０^８ＰＦＵ／ｍｌ）。光反応は、ウイルスが指標細胞株中で複製し、そして核酸を含有する感染性粒子の生産を妨げる。別の例示的態様では、２ｍｃｇ／ｍｌの臨床級ＵＶＡＤＥＸ（商標）（８−ＭＯＰｓ）および５ジュール／ｃｍ^２で１０分間のＵＶＡ照射が１０^８ｐｆｕの昆虫ウイルスを不活性化するために使用される。

ウイルスコートタンパク質の存在に関するイムノアッセイは、好ましくはウイルス複製およびウイルスタンパク質産物の翻訳の不存在を確認するために行われる。試験は、２７℃で培養したショウジョウバエの細胞のソラレン／ＵＶ処理が、複製せず、しかも細胞カウントは１４日後のカルチャー中で無視できることを確認するために行われる。この処理はショウジョウバエの細胞のその後の複製を妨ぎ、細胞はそれらの成長の欠失から溶解するまで不活性なままである。

３２０−４００ｎｍ範囲に紫外線照射を発する様々なＵＶＡデバイスを利用でき、あるいは適切なＵＶＡ−発生源または広範囲の紫外線照射源と、フィルターまたはＵＶＡ範囲内に照射波長を制限する他の手段とを使用して容易に構成することができる。そのようなデバイスは低値（ｌｏｗｅｎｄ）および高値（ｈｉｇｈｅｎｄ）波長の「遮断（ｃｕｔｏｆｆ）」を有すると言われ、これはソラレン処理したａＡＰＣを照射するためにそのような波長の遮断値よりも下または上の波長を可能としない。またそのようなデバイスは好ましくは実質的に正確な照射波長を送達することができ、これは約１０ｎｍ、より好ましくは約８ｎｍ、より好ましくは約６ｎｍ、より好ましくは５ｎｍ以下の半バンド幅距離（ｈａｌｆ−ｂａｎｄｗｉｄｔｈｄｉｓｔａｎｃｅ）を有する。架橋剤を光活性化するために使用する照射の好適な波長は約３６５ｎｍで５ｎｍの半バンド幅である。例となるデバイスは、マーキュリーフラッドバルブ（ｍｅｒｃｕｒｙｆｌｏｏｄｂｕｌｂ）を備えた高強度長波長ＵＶランプを含んでなる放射線発生源を含んでなる。そのようなデバイスの放射線発生源の位置または方向は適切に選択することができるが、好ましくはＵＶＡ源は照射されるサンプルの上に配置される。ＵＶＡデバイスの他の例には、バクスターバイオテック（ＢａｘｔｅｒＢｉｏｔｅｃｈ）からのモデル４Ｒ４４４０（Ｌｉｎｅｔａｌ．，１９９７，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，Ｖｏｌ．３７（４），ｐｐ．４２３−４３５も参照にされたい）のような修飾された照射システム、および国際公開第ＷＯ９６／３９８２０号パンフレットに開示されているものを含む。

ａＡＰＣおよび架橋剤は光活性化工程の前または最中に混合することが望ましく、これは例えばａＡＰＣ組成物および架橋剤が完全に混合され得るように配置されたシェーカーで行うことができる。さらに光活性化を本質的に嫌気的条件下で行うことが望ましいかもしれない。本質的に嫌気的な光活性化を行うために採用できる方法の例は、Ｌｉｎｅｔａｌ．，１９８９，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．７４，ｐｐ．５１７−５２５，およびＬｉｎｅｔａｌ．１９９７，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，Ｖｏｌ．３７，ｐｐ．４２３−４３５により例示されている。

１つの好適な態様では、凍結−解凍サイクルが架橋の前、最中または後に行われる。例となる凍結−解凍サイクルでは、ａＡＰＣはａＡＰＣを含有する適切な容器を適切な量の液体窒素、固体の二酸化炭素（すなわちドライアイス）、または類似の低温物質と、凍結が迅速に起こるように接触させることにより凍結することができる。次いで凍結したａＡＰＣは、ａＡＰＣを低温物質から取り出し、そして周囲の室温条件に晒すか、あるいは解凍時間を短縮するためにぬるま湯もしくは暖かい手を使用して解凍工程を促進するいずれかにより解凍される。さらにａＡＰＣは解凍前、長期間凍結そして保存されてもよい。また凍結したａＡＰＣは解凍され、そして次いでさらに使用する前に凍結乾燥される。好ましくは凍結−解凍手順に有害な影響を及ぼす可能性がある保存剤、例えばジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および他の保存剤は、ａＡＰＣをそのような保存剤を本質的に含まない媒質に移すことなどにより、凍結−解凍サイクルを行うａＡＰＣ含有媒質には存在させないか、または本質的に除去する。

本発明の実施を通して様々な利点を達成することができる。例えばソラレン／ＵＶで処理した細胞、およびソラレン／ＵＶで処理し、そして２サイクル凍結および解凍したそれら細胞の能力は、生育可能な生きている未処理のショウジョウバエ細胞よりも良いａＡＰＣである。ソラレン／ＵＶおよびソラレン／ＵＶ／凍結／解凍プロトコールにより、ショウジョウバエの細胞株６６８のＡＰＣ機能を維持し、またはさらに強化する能力は、ショウジョウバエの細胞が不活性化され、そしてヒトＣＤ８細胞に暴露される前に溶解することを確実にするために役立つ。これはａＡＰＣの独特な刺激特性を減じることなく重要な安定性という特徴を加える。ソラレン／ＵＶおよびソラレン／ＵＶ／凍結／解凍細胞により特異的に刺激されたＣＤ８細胞は、生育能のある生きているショウジョウバエの細胞で刺激された細胞のように効率的に成長する。またエクスビボでの培養サイクルの終わりに生じるＣＤ８ＣＴＬの抗原特異的性質は、未処理ＡＰＣ細胞で検出される性質よりも大きい。ウイルスおよび宿主細胞の核酸を不活性化するための本発明の方法は、処理した細胞中での細胞成長およびウイルス複製を妨げる。細胞治療生成物の安全性を確保しながら、ショウジョウバエの細胞の重要なＡＰＣ機能を維持する能力は大変望ましい結果であり、そしてその安全性をより確実にすることにより心配事を軽減するために役立つので、細胞治療は今では異種移植生成物よりも「死んだ」ヒト以外の細胞になると考えることができる。

好適な態様では、異種核酸によりコードされるＭＨＣ分子は、空分子としてａＡＰＣにより発現される。そのような空分子は結合した抗原性ペプチドもしくは免疫原性ペプチドもしくはそのようなペプチドのフラグメントを本質的に欠いている。このようにａＡＰＣは負荷するために選択された１もしくは複数のペプチド種を負荷することができ、この「選択したペプチド」は１もしくは複数の抗原性ペプチド種、免疫原性ペプチド種またはそのようなペプチドのフラグメントを含んでなることができある。幾つかの態様では、ａＡＰＣの表面上に発現した空のＭＨＣ分子に１つのペプチド種が負荷される。別の好適な態様では、２から６以上の種のような複数の種を含んでなる選択したペプチドが空のＭＨＣ分子に負荷するために使用される。ＭＨＣ分子へ選択したペプチドを負荷することは、ａＡＰＣの表面上に外因性タンパク質の発現が生じた後、適切な時期に行うことができる。またＭＨＣ分子へ選択したペプチドを負荷することは、上記のように異種核酸の不活性化の前、それと同時またはその後に行ってもよい。

上述のように、ａＡＰＣには選択したペプチドが負荷される。ａＡＰＣの選択したペプチドへの暴露は、修飾した細胞の表面上に上記外因性分子の発現と同時またはその後に行うことができる。この暴露の結果、ａＡＰＣには選択したペプチドが負荷され、そのため好ましくは選択したペプチドがａＡＰＣの表面上に発現したＭＨＣ分子の抗原もしくは免疫原結合部位を占有し、この結合部位には選択したペプチドへの暴露前に結合しているペプチドは無かった。いったん負荷されれば、選択したペプチドはナイーブＴ細胞の活性化を誘導する様式でナイーブＴ細胞に提示されることができる。

空の外因性ＭＨＣ分子に負荷するために使用される選択されたペプチドは、ａＡＰＣにより発現されるそのようなＭＨＣ分子（１もしくは複数）の特定のクラスに関連して選択される。すなわち、ａＡＰＣが空のＭＨＣクラスＩ分子を発現することを望む態様では、そのような空のＭＨＣクラスＩ分子に結合する選択したペプチドを、そのようなａＡＰＣと接触させるので、クラスＩ分子にそのような選択したペプチドが負荷される。ａＡＰＣが空のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することを望む態様では、そのような空のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する選択したペプチドを、そのようなａＡＰＣと接触させるので、クラスＩＩ分子にそのような選択したペプチドが負荷される。ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方がａＡＰＣにより発現される態様では、クラスＩに結合する選択したペプチドおよびクラスＩＩに結合する選択したペプチドの両方がＡＰＣと接触するために使用されるので、クラスＩおよびクラス分子の両方に選択したペプチドが負荷される。１つのペプチド種が選択される態様では、その選択されたペプチド種は複数のペプチド分子を含んでなるので、その各々が他とアミノ酸組成および配列が同一である。２以上のペプチド配列が選択される態様では、２以上の選択したペプチド種の各々が独立して複数のペプチド分子を含んでなり、その各々が他とアミノ酸組成および配列が同一である。これらの２以上の種は各々がａＡＰＣと同時に、または異なる段階のいずれかで接触させるために使用される。これらの態様の各々で、多抗原性または多免疫原性ＭＨＣ−ペプチド複合体がａＡＰＣ上に生成される。空のＭＨＣ分子への選択したペプチドの負荷は、好ましくは、インビトロ、エクスビボまたはインビボで近似するほぼ生物学的結合条件下で起こる。

選択できるペプチド種の例には以下を含み、ここでこのタンパク質から各ペプチドが誘導され、そして各ペプチドに割り当てられた配列の識別名前を括弧内に示す：ＳＩＬＳＬＫＥＡＳＴ（Ｃ−レクチン；配列番号：１），ＫＭＡＳＲＳＭＲＬ（Ｃ−レクチン；配列番号：２），ＡＬＡＬＡＡＬＬＶＶ（Ｐｅｃ６０；配列番号：３），ＡＬＬＶＶＤＲＥＶ（Ｐｅｃ６０；配列番号：４），ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（チロシナーゼ；配列番号：５），ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（チロシナーゼ；配列番号：６），ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（ｇｐ１００；配列番号：７），ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（ｇｐ１００；配列番号：８），ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＭＡＲＴ−１；配列番号：９），ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＭＡＲＴ−１；配列番号：１０），ＣＬＴＳＴＶＱＬＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号：１１），ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号：１２），ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号：１３），ＩＩＳＡＶＶＧＩＬ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号：１４），ＰＬＴＳＩＩＳＡＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号：１５），ＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号：１６），ＶＬＶＫＳＰＮＨＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号：１７），ＥＬＶＳＥＦＳＲＭ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号：１８），ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ（ＣＥＡ；配列番号：１９），ＧＰＬＴＰＬＰＶ（ＡＥＳ；配列番号：２０），ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（ＮＹ−ＥＳＯ−１；配列番号：２１），ＫＡＬＦＡＧＰＰＶ（ＣＡ−１２５；配列番号：２２），ＹＬＥＴＦＲＥＱＶ（ＣＡ−１２５；配列番号：２３），ＧＬＱＳＰＫＳＰＬ（ＣＡ−１２５；配列番号：２４），ＶＬＬＫＬＲＲＰＶ（ＣＡ−１２５；配列番号：２５），ＥＬＹＩＰＳＶＤＬ（ＣＡ−１２５；配列番号：２６），ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（ＮＹ−ＥＳＯ−１；配列番号：２７），ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（テロメラーゼ；配列番号：２８），ＳＴＡＰＰＶＨＮＶ（ＭＵＣ−１；配列番号：２９），ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（ＭＡＧＥ−３；配列番号：３０），ＦＭＷＧＮＬＴＬＡ（ＣＡ−１２５；配列番号：３１），ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（テロメラーゼ；配列番号：３２），ＨＬＳＴＡＦＡＲＶ（Ｇ２５０；配列番号：３３），ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ（ＮＹ−ＥＳＯ−１；配列番号：３４），ＥＬＷＴＨＳＹＫＶ（ＦＢＰ；配列番号：３５），ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ（ＭＡＧＥ−３；配列番号：３６），ＹＩＦＡＴＣＬＧＬ（ＭＡＧＥ−３；配列番号：３７），ＨＬＹＩＦＡＴＣＬ（ＭＡＧＥ−３；配列番号：３８），ＭＬＭＡＱＥＡＬＡＦＬ（ＣＡＭＥＬ；配列番号：３９），ＳＴＬＥＫＩＮＫＴ（ＳＳＸ−４；配列番号：４０），ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（ＳＳＸ−２；配列番号：４１），ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（ＮＹ−ＥＳＯ−１；配列番号：４２），ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（サーバイビン；配列番号：４３），ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（サーバイビン；配列番号：４４），ＳＬＬＥＫＲＥＫＴ（ＳＰ１７；配列番号：４５），ＴＬＧＥＤＤＰＷＬ（ＳＡＲＴ−１；配列番号：４６），ＫＬＧＬＫＰＬＥＶ（ＳＡＲＴ−１；配列番号：４７），ＹＬＷＴＳＡＫＮＴ（ＳＣＰ−１；配列番号：４８），ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ（ＭＵＣ−１；配列番号：４９），ＧＭＧＳＥＥＬＲＬ（ＬＩＶＩＮ；配列番号：５０），ＳＬＧＳＰＶＬＧＬ（ＬＩＶＩＮ；配列番号：５１），ＹＬＦＦＹＲＫＳＶ（ｈＴＲＴ；配列番号：５２），ＣＱＱＥＥＴＦＬＬ（ＣＡ−１２５；配列番号：５３），ＴＬＡＫＦＳＰＹＬ（ＰＲＡＭＥ；配列番号：５４），ＮＬＴＨＶＬＹＰＶ（ＰＲＡＭＥ；配列番号：５５），ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（サーバイビン；配列番号：５６），ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（ＰＲＡＭＥ；配列番号：５７），ＦＬＤＱＲＶＦＦＶ（ｇｐ１００；配列番号：５８），ＦＬＤＱＲＶＦＶＶ（ｇｐ１００；配列番号：５９），ＦＬＤＱＶＡＦＶＶ（ｇｐ１００；配列番号：６０），ＧＬＤＲＥＱＬＹＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号：６１），ＶＭＱＨＬＬＳＰＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号：６２），ＱＱＴＨＧＩＴＲＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号：６３），ＬＱＰＬＳＧＰＧＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号：６４），ＴＬＤＲＤＳＬＹＶ（ＭＵＣ−１６；配列番号：６５），ＱＬＹＬＥＬＳＱＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号：６６），ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（ＭＡＧＥ−１；配列番号：６７），ＫＶＡＤＬＶＧＦＬ（ＭＡＧＥ−１；配列番号：６８），ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号：７０）およびＶＬＤＧＬＤＶＬＬ（配列番号：７１
）。好適なペプチドにはトポイソメラーゼＩＩ、インテグリンβ８サブユニット前駆体、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＳＴＡＴ１、γ−カテニンおよびＨ−ＲＹＫ（ＲＴＫ６）を含む。他の適切なペプチドは日常的に選択される。例えば幾つかの具体的説明のペプチド種に関しては米国特許出願第２００３／００２２８２０号明細書を参照にされたい。

選択したペプチド種は当該技術分野で現在知られているか、または利用できるようになる様々な手段および技術を介して細胞に提示され、そしてａＡＰＣに負荷することができる。ペプチドはそれらをペプチドの細胞内プールに入ることができる様式で提示することができる。例えばペプチドは浸透圧的負荷（ｏｓｍｏｔｉｃｌｏａｄｉｎｇ）を介して提示することができる。好ましくはペプチドはａＡＰＣ系の培養基に加えられる。ペプチドは完全なポリペプチドまたはタンパク質の状態で培養基に加えられ、これらは引き続き酵素的分解のような細胞のプロセスを介して分解される。あるいは完全なポリペプチドまたはタンパク質は化学的消化（例えば臭化シアン）またはプロテアーゼ（例えばトリプシンおよびキモトリプシン）のような幾つかの他の手段を介して、ａＡＰＣ系の培養基に加える前に分解することができる。あるいは全タンパク質またはポリペプチド配列を適切なベクターにクローン化し、そして原核細胞に挿入し、これにより細胞が有意な量の抗原性ポリペプチドを生成し、これらは次いで回収、精製、そしてペプチドに消化され、次いでａＡＰＣ系の培養基に加えられる。タンパク質またはペプチドの精製は、イムノアフィニティクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、タンパク質沈殿、バッファー交換、イオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーのような当該技術分野で知られているか、または利用できるようになる様々な適切な技術を介して達成することができる。

好適な態様では、ａＡＰＣは外因性ＭＨＣおよび補助する分子の発現、そのような分子のａＡＰＣ表面上の提示、および提示されたＭＨＣ分子に選択したペプチドを負荷した後の時点で不活性化される。したがってそのような不活性化され、そして選択したペプチドを負荷したａＡＰＣは、本質的に増殖または複製することはできないが、選択したペプチドの提示機能を保持し、そして好ましくはナイーブＴ細胞の活性化機能も保持している。さらに完全な細胞膜または細胞膜のフラグメントのようなａＡＰＣフラグメント（これは選択したペプチドを負荷したＭＨＣおよび補助する分子を含む）のフラグメントが場合により使用されてナイーブＴ細胞を活性化することができる。そのようなａＡＰＣフラグメントを調製し、単離し、そして操作するために、当該技術分野で既知の、または利用可能な適切な方法を使用することができる。

上記のように調製そして不活性化されたａＡＰＣは、外因性の空のＭＨＣ分子を提示するので、高密度の選択したペプチド−ＭＨＣ複合体がａＡＰＣ表面に達成されるように十分な量の選択したペプチドをａＡＰＣに加えることができる点が有利であり、この高密度は野生型の哺乳動物のａＡＰＣで観察される密度よりも実質的に高い。ナイーブＴ細胞／不活性化ａＡＰＣカルチャーは、治療に有効なＣＴＬ集団を活性化し、そして濃縮するために適切な期間まで長期に維持できる。例えばナイーブＴ細胞／不活性化ａＡＰＣカルチャーの持続期間は、２日から９日、３日から８日、または４日から６日のように約１日から約１０日である。

好適な態様では、上記のように調製そして不活性化されたａＡＰＣまたはａＡＰＣフラグメントは、そのように不活性化されなかったＡＰＣが有するＡＰＣ機能に比べて強化されたＡＰＣ機能を有する。強化されたＡＰＣ機能は、不活性化されていないＡＰＣと接触することにより活性化されたＣＴＬのＣＴＬ活性の程度（ｍｅａｓｕｒｅ）よりも大きい、不活性化されたａＡＰＣと接触させることにより活性化されるＣＴＬのＣＴＬ活性により反映され得る。ＣＴＬ活性は、ＣＴＬ細胞活性化の指標である１もしくは複数のタンパク質による細胞表面タンパク質の発現の程度（ＣＤ６９細胞表面発現のような）、分化の程度、特異的な細胞傷害殺能力（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｋｉｌｌｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）の程度、特異的な細胞溶解の程度またはＣＴＬに関連するサイトカイン生産の程度のような１もしくは複数のＣＴＬ活性化のパラメーターにより測定することができる。さらに活性化Ｔ細胞は、ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）四量体染色により検出または分離され、ここで検出される活性化Ｔ細胞はａＡＰＣにより提示される選択したペプチドに特異的である。好適な態様では、不活性化はａＡＰＣをソラレン誘導体と複合化し、そして強化したＣＤ６９発現を達成するために複合体をＵＶＡに暴露することにより達成される。

活性化Ｔ細胞は、当該技術分野で既知の、または利用可能な適切な技術を使用してａＡＰＣから分離することができる。例えばａＡＰＣに、ａＡＰＣに負荷したペプチドに、または活性化Ｔ細胞に（またはそのフラグメント）特異的なモノクローナル抗体を使用して、適切な相補的リガンドを結合することができる。次いで抗体で標識した（ｔａｇｇｅｄ）細胞はａＡＰＣ／活性化Ｔ細胞混合物から免疫沈降またはイムノアッセイ法のような適切な技術により抽出することができる。あるいは分離工程を完全に省略し、そして不活性化ａＡＰＣを活性化Ｔ細胞と共にカルチャー中に残してもよい。

好適な態様では、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化のために選択され、そして望ましい量の生じたＣＴＬを使用して治療的投与のための細胞治療生成物を調製する。好ましくは投与前に、１もしくは複数の品質保証試験を活性化Ｔリンパ球または細胞治療について行う。好適な態様では、品質保証試験は１もしくは複数の試験を行って：患者とＴリンパ球との間のＨＬＡマッチ：フローサイトメトリー分析（ＣＤ８^＋、ＴＣＲ^＋）；無菌性（細菌または菌・カビの成長が無い）；細菌についてグラム染色陰性；ＰＣＲ／ＥＬＩＳＡに関してマイコプラズマ陰性；残存するショウジョウバエのＤＮＡが無い；昆虫のウイルスｃＤＮＡの不存在；生育能（＞７２％生存できる）；およびＣＴＬアッセイによる細胞溶解活性を確認することを含んでなる。

個体を処置するために、本発明による有効量の細胞治療生成物がそのような疾患、障害または状態に罹患しているか、またはそれを有すると診断された個体に投与される。「有効量」は、一般にそのような処置が必要な患者に望ましい治療的または予防的利益をもたらすために十分な量または用量である。本発明の細胞治療生成物の有効量または用量は、モデリング、用量漸増実験または臨床試験のような日常的な方法により、および日常的な因子、例えば投与もしくは生成物送達の様式もしくは経路、細胞治療生成物の薬物動態学、疾患、障害もしくは状態の重篤度および経過、個体の以前の、もしくは進行中の治療、個体の健康状態および薬剤に対する応答、および処置する医師の判断を考慮することにより確認され得る。例示的な投薬用量として、細胞集団は成人のヒトについて１ｘ１０^８〜１ｘ１０^１１または１ｘ１０^９〜１ｘ１０^１０の活性化Ｔ細胞のような約１ｘ１０^６〜約１ｘ１０^１２の活性化Ｔ細胞を含んでなることができる。

細胞治療生成物は、活性化Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞が個体に注入されるまでそれを維持するために適する賦形剤、例えば製薬学的に許容され得る希釈剤または溶媒を含んでなる治療用組成物として調製される。好適な態様では、細胞治療生成物は、乳酸加リンゲル注射液、ＵＳＰ（７６％（容量／容量）、５％デキストロース生理食塩水（Ｄ５ＮＳ；４％（容量／容量））、および２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；２０％（容量／容量））を含んでなる溶液に約１ｘ１０^９〜約１０ｘ１０^９のＣＴＬを含んでなる。

細胞成分を含んでなる組成物を個体に投与するための適切な技術を使用することができる。例えば静脈内注入を介する活性化ＣＴＬ細胞の投与を使用することができる。多回注入が必要または示される可能性があり、そしてこれらの注入は数週間またはそれ以上の期間にわたり行うことができる。例となる技法は、例えば米国特許第４，８４４，８９３号および同第４，６９０，９１５号明細書に記載されている。

場合により細胞治療生成物または調製物は、選択したペプチドを負荷したａＡＰＣに加えて他の免疫調節物質、好ましくは免疫刺激成分を含むように補充することができる。そのような追加の成分は、ナイーブＴ細胞とペプチドを負荷したａＡＰＣとの接触前、それと同時、またはその後に加えることができる。そのような補助的免疫調節物質、好ましくは免疫刺激成分が加えられる望ましい時点および用量濃度および頻度の選択は、所望する増殖速度、増幅率、細胞数、寿命または免疫原性のような関連する考察に従い選択することができる。補充のまたは免疫刺激成分は、例えばナイーブではないＴ細胞以外の１もしくは複数の白血球、サイトカイン、リンホカイン、ケモカインおよび抗体であることができる。選択できる白血球の例には、非ＣＤ８接着細胞、ＣＤ１４^＋接着細胞のような接着細胞、単球、マクロファージ、ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、および免疫調節、好ましくは免疫刺激、効果もしくは刺激を付与できる他の白血球を含む。そのような白血球は自己または異種起源でよい。好適な態様では、選択される白血球は自己起源である。サイトカインの例には、ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＩＬ−１５，ＩＬ−１７，ＩＬ−２１のようなインターロイキン、γ−インターフェロンのようなインターフェロン、ＴＮＦ−α（例えばＴｉｚａｒｄＩ．，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＡＮＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，３^ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１２９−１４３，（１９９２）を参照にされたい）のような腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、またはＣＤ７０（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ０８０９６およびＮＣＢＩ寄託番号ＮＭ＿００１２５２を参照にされたい）、ＬＴ、４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０Ｌ；米国特許出願第２００２／０１１９１２１号明細書；および国際公開第ＷＯ２００２／０２２６４８号明細書パンフレット）がある。サイトカインは組換えまたは天然起源でよい。好適な態様では、選択されるサイトカインは組換え起源である。抗体の例にはＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥＯＫＴ（商標）３（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）で市販されているモノクローナル抗−ＣＤ３抗体がある。

特に好適な態様では、自己の非ＣＤ８、ＣＤ１４^＋接着細胞、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびモノクローナル抗−ＣＤ３抗体調製物（ＯＫＴ（商標）３）が、細胞治療調製物法で追加の免疫刺激成分として使用される。そのような態様では、選択したペプチドを負荷したａＡＰＣでの初回刺激に供されたナイーブＴ細胞が、それらを有効量の組換えＩＬ−２および組換えＩＬ−７（例えば約１−１００単位／ｍｌのＩＬ−２、そして好ましくは１，１０，１５，２０，５０または１００単位／ｍｌのＩＬ−２、そして約１−１００単位／ｍｌのＩＬ−７、そして好ましくは１，１０，１５，２０，または５０単位／ｍｌのＩＬ−７）と接触させることにより再刺激に供し、そして次いでそれらを有効量の自己の、選択したペプチドを負荷した非ＣＤ８、ＣＤ１４^＋接着細胞（例えば４個の初回刺激したナイーブＴ細胞毎に約１個の非ＣＤ８、ＣＤ１４^＋接着細胞）と接触させる。好ましくはＩＬ−２／ＩＬ−７およびＣＤ１４^＋接着細胞接触の期間はそれぞれ約２日および約３〜約４日であり、そして各再刺激は少なくとも１回、続いて繰り返される。少なくとも２回の再刺激処方の後、非特異的Ｔ細胞増幅計画は、約２から約５日のＩＬ−２および抗−ＣＤ３（例えばＯＫＴ（商標）３）との接触を含んでなる。

他の好適な態様では、自己のＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞およびＩＬ−２，ＩＬ−７，ＩＬ−１２，ＩＬ−１５，ＩＬ−１７またはＩＬ−２１は、初回刺激または再刺激の前、それと同時またはその後にナイーブＴ細胞と接触させられる。好ましくはＩＬ−２はＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１の少なくとも１つと組み合わせて使用される。ＩＬ−１５が使用される場合、ＩＬ−１５の好ましい有効量は、約１−１００ｎｇ／ｍｌそして好ましくは１，１０，２０，２５，４０または５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５である。同様に、ＩＬ−２１が使用される場合、ＩＬ−１５の好ましい有効量は約１−１００ｎｇ／ｍｌ、そして好ましくは１，１０，２０，２５，４０または５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１である。そのような好適な態様では、ナイーブＴ細胞は記憶Ｔ細胞になるように向けることができる。そのようなＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞の処方は、上記の再刺激または非特異的Ｔ細胞増幅手順に加えて、またはそれに代えて採用されて、エクスビボで多回の再刺激に耐え得る記憶Ｔ細胞とする。さらにそのような記憶Ｔ細胞を含んでなる細胞治療生成物は、個体に投与された時、選択したペプチドおよび他の活性化する合図（ｃｕｅ）と遭遇した時にインビボで増幅され、そして刺激されることができる。一般にヘルパーＴ細胞の調製、およびそれらのＩＬ−２，ＩＬ−７，ＩＬ−１２，ＩＬ−１５，ＩＬ−１７および／またはＩＬ−２１への取り込みが援助するナイーブＴ細胞の刺激または増幅が記憶Ｔ細胞またはＣＴＬになるための方法は、例えば米国特許出願第２００２／０１１９１２１号明細書および国際公開第ＷＯ２００２／０２２６４８号パンフレットに見いだすことができる。

個体を処置するために、細胞治療生成物は好ましくは細胞治療生成物を調製するために使用したフェレーシス生成物が元々得られた個体に投与される。したがって、細胞治療生成物で処置する個体には、好ましくは自己の活性化Ｔ細胞、そしてより好ましくはＣＴＬを含んでなる細胞治療生成物が投与される。

本発明に従い細胞治療生成物で処置できる疾患、障害または状態の例には、例えば免疫不全障害、自己免疫障害、および機能が低下した（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）、不十分な、または非効率的な免疫系もしくは免疫系の反応が関与する障害のような免疫障害；ウイルス感染、細菌感染、マイコプラズマ感染、菌・カビ感染および寄生虫感染のような感染；および悪性黒色種、多発性骨髄腫、前立腺ガン、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫、甲状腺ガン、子宮ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、肺ガン、乳癌、肝臓ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、結腸ガン、皮膚ガン、胃ガン、子宮頚ガン、頭頸部ガン、神経膠腫および脳のガンのようなガンがある。

本発明による細胞治療生成物での疾患、障害または状態の処置は、他の治療用生成物または処方での処置の前、それと同時または後に行うことができる。本発明の細胞治療生成物の投与と一緒に使用できる例となるさらなる処方、成分またはモダリティには例えば：免疫刺激、免疫抑制およびサイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、インターロイキンまたはインターフェロン投与のような他の免疫療法的処方；デニロイキンディフチトクス（ＤＡＢ−ＩＬ２）またはクラドリビン投与のようなリンパ球枯渇およびミエロブラティブ（ｍｙｅｌｏｂｌａｔｉｖｅ）処方：および従来からの化学療法および照射処置がある。好適な態様では、米国特許出願第６０／７７８，５１６号明細書に開示されているようなリンパ球枯渇処方が細胞治療生成物での処置と一緒に使用される。

したがってナイーブＴ細胞は、ナイーブＴ細胞の活性化を妨害し、弱め、または制限することができる他の処置または療法を開始する前に、本発明の細胞治療生成物で処置できる状態または疾患に罹患している個体から都合よく得ることができる。例えば新形成または腫瘍がある個体の処置に、ナイーブＴ細胞を含んでなるリンパ球フェレーシス法の生成物を化学療法または照射処置の開始前に得て、そして培養で維持することができる。次いでナイーブＴ細胞は本発明に従い活性化され、これにより細胞治療生成物を提供することができ、これは他の処置計画の前、それと同時、またはその後に個体に注入することができる。

本発明の他の態様、特徴および利点は、以下の実施例を参照にすることによりさらに具体的に説明される。

材料
チロシナーゼペプチドＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号：５）
ヒトチロシナーゼのアミノ酸３６９〜３７７に対応するチロシナーゼペプチド（ｔｙｒ３６９〜３７７）を、ＧＬＰコンプライアンス標準を使用して製造そして精製される（シンペップコーポレーション：ＳｙｎｐｅｐＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。製造元（シンペップコーポレーションから受け取ったペプチド粉末を、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１０ｍｇ／ｍＬ濃度のストックペプチド溶液を作成し、そしてこれを使用前に−７２℃から−８８℃で保存する。このストックペプチド溶液を等部の他のペプチドストック溶液（これも１０ｍｇ／ｍｌ濃度で）と混合して、ｘＡＰＣに負荷するために使用する組み合わせペプチド溶液を生成する。組み合わせペプチド溶液は、クラス１０，０００クリーンルーム中で、クラスＩＩバイオセイフティキャビネット中の無菌条件下で滅菌バイアルに等分する。

チロシナーゼペプチド−ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号：６）
ペプチドの３位にアスパラギン残基の代わりにアスパラギン酸残基を含む上記ｔｙｒ３６９〜３７７ペプチドの脱アミド化形は、ＧＬＰコンプライアンス標準を使用して製造そして精製される（シンペップコーポレーション）。この脱アミド化形は、ｔｙｒ３６９〜３７７ｄと呼ばれる。製造元から受け取ったペプチド粉末を、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１０ｍｇ／ｍＬ濃度のストックペプチド溶液を作成し、そして使用前に−７２℃から−８８℃で保存する。

ＭＡＲＴ−１ペプチド−ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：９）
ヒトＭＡＲＴ−１のアミノ酸２７〜３５に対応するＭＡＲＴ−１ペプチド（ＭＡＲＴ−１２７−３５）は、ＧＬＰコンプライアンスを使用して製造そして精製される（シンペップコーポレーション）。ペプチド粉末をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１０ｍｇ／ｍＬ濃度のストックペプチド溶液を作成し、そして使用前に−７２℃から−８８℃で保存する。

ｇｐ１００ペプチド−ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号：７）
ヒトｇｐ１００のアミノ酸２０９〜２１７に対応するｇｐ１００ペプチド（ｇｐ１００２０９〜２１７）は、ＧＬＰコンプライアンス標準を使用して製造そして精製される（シンペップコーポレーション）。このペプチド粉末をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１０ｍｇ／ｍＬ濃度のストックペプチド溶液を作成し、そして使用前に−７２℃から−８８℃で保存する。

ｇｐ１００ペプチド−ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号：７０）
ヒトｇｐ１００のアミノ酸１５４〜１６２に対応するｇｐ１００ペプチド（ｇｐ１００１５４〜１６２）は、ＧＬＰコンプライアンス標準を使用して製造そして精製される。このシンペップコーポレーションから得たペプチド粉末をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１０ｍｇ／ｍＬ濃度のストックペプチド溶液を作成し、そして使用前に−７２℃から−８８℃で保存する。

ｇｐ１００ペプチド−ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（配列番号：８）
ヒトｇｐ１００のアミノ酸２８０〜２８８に対応するｇｐ１００ペプチド（ｇｐ１００
２８０〜２８８）は、シンペップコーポレーションによりＧＬＰコンプライアンス標準を使用して製造そして精製される。ペプチド粉末をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１０ｍｇ／ｍＬ濃度のストックペプチド溶液を作成し、そして使用前に−７２℃から−８８℃で保存する。

上記の各ペプチド、ならびに以下に記載するＣＤ８アルファ鎖ペプチド（ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ；配列番号：７１）は、メリーフィールドの方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ，Ｖｏｌ．８５，ｐｐ．２１４９−２１５４（１９６３））に従い、ＢＯＣ−化学を使用してＡＢＩ＃４３０（ＨＯＢｔ−ＤＣＣ化学）またはＡＢＩ＃４３１（ＨＢＴＶ化学）ペプチド合成器で生成された。保護されたペプチドの樹脂からの開裂は、９０％弗化水素１０％アニソールを用いて−４℃で１時間行った。ペプチドはＣ１８逆相ＨＰＬＣによりＨ_２Ｏ中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡの混合物を使用して精製した。精製したペプチドは分析用ＨＰＬＣをエレクトロスプレ−質量分析と組み合わせて、およびアミノ酸分析により分析した。これらのペプチドをトリフルオロ酢酸塩として使用した。

アイソレックス（Ｉｓｏｌｅｘ）３００ｉ使い捨てチュービングセット
アイソレックス３００ｉディスポーザブルチュービングセットは、アイソレックス３００ｉ磁気細胞選択システム（ＭａｇｎｅｔｉｃＣｅｌｌＳｅｌｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）と一緒に使用する１回使用の、無菌性の、発熱物質を含まない閉鎖流路系（バクスター：Ｂａｘｔｅｒ）であり、使用前に室温（ＲＴ）で保管されている。これはスピニング膜アッセンブリー、トランスファーバッグ、チュービングマニホルド、回収バッグ、および１次および２次分離容器および無菌的連結のためのチュービングコネクターを含む。アイソレックスディスポーザブルチュービングセットはガンマ線照射により殺菌されている。

ＣＤ８アルファ鎖ペプチド−ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ（配列番号：７１）
ＣＤ８アルファ軽鎖ペプチド（ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ；配列番号：７１）は、ＧＬＰコンプライアンス標準下で精製そして製造される。ＣＤ８アルファ鎖ペプチドは、抗ＣＤ８（３７Ｂ１Ａ）抗体およびアイソレックス３００ｉ磁気細胞選択システムを使用して捕捉されるＣＤ８^＋Ｔ細胞を放出するために、ＣＤ８^＋Ｔ細胞分離法で使用される。ペプチドの各ロットは、製薬等級に合うようにシンペップコーポレーションにより製造され、そしてペプチド配列、純度、分子量および外観が検査される。粉末で受け取ったＣＤ８アルファ鎖ペプチドをさらに処理して１０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を作成する。このストック溶液をＤＰＢＳで希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過し、そして滅菌バイアル中に等分され、そして使用前に−７２℃から−８８℃で保存される。ペプチド試薬をバイアルに入れることは、クラス１０，０００クリーンルーム中で、クラスＩＩバイオセイフティキャビネット中の無菌条件下で行われる。

ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）、１Ｘ濃度
滅菌され、発熱物質を含まないダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）溶液（インビトロジェンコーポレーション）は、使用前にＲＴで保存する。ＤＰＢＳは以下の手順で使用される：ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ８⁻ Ｔ細胞の選択中、アイソレックス３００ｉ磁気細胞選択システムに流す；再刺激工程中に非接着細胞を洗浄し、そして非特異的増幅中に非結合ＯＫＴ３モノクローナル抗体を洗浄し；そしてヒトβ２ミクログロブリン、ＩＬ−７、ＣＤ８ペプチドおよびＯＫＴ３を希釈する。

抗凝固剤クエン酸ナトリウム溶液
滅菌され、発熱物質を含まない抗凝固剤であるクエン酸ナトリウム溶液、ＵＳＰ（バクスターフェンバル：ＢａｘｔｅｒＦｅｎｗａｌ）は、使用前に室温（ＲＴ）で保存される。クエン酸ナトリウム溶液は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ８⁻ Ｔ細胞を選択するために、アイソレックス３００ｉ磁気細胞選択システムに流すためにバッファー添加剤として使用される。

通気孔がないＴ−７５フラスコ
通気孔がない（ｎｏｎ−ｖｅｎｔｅｄ）Ｔ−７５フラスコを使用して宿主細胞およびｘＡＰＣを成長させる。処理した細胞カルチャーのフラスコは７５ｃｍ^２の表面積を有し、そして滅菌され、発熱物質を含まず、そして透明のポリスチレン材料で作られている。Ｔ−７５フラスコはガンマ線照射により殺菌され、そして１０^−５の滅菌性および発熱物質の存在＜０．５ＥＵ／ｍＬを満たすことが証明されている。Ｔ７５フラスコは使用しない時はＲＴで保管される。

シュナイダーの（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ）ショウジョウバエ培地（１Ｘ濃度）
シュナイダーのショウジョウバエ培地は、ショウジョウバエの細胞を培養するために使用する。各ロットの培地は、供給元（インビトロジェンコーポレーション）により容量オスモル濃度、ｐＨ、無菌性およびショウジョウバエの細胞の成長を維持する能力について検査される。シュナイダーのショウジョウバエ培地は使用前に２℃から６℃で保存される。

ジェネティシン（Ｇ４１８）（５０ｍｇ／ｍＬ）
ジェネティシン（インビトロジェンコーポレーション）は、異種核酸によりコードされる外因性分子の発現を維持するために、ショウジョウバエの細胞を培養する際に使用する選択的抗生物質である。ジェネティシンは無菌のストック溶液で供給され、そして使用前に２〜６℃で保存される。

ＨＹＱＳＦＸ昆虫培地（１Ｘ濃度）
ハイクローンの（Ｈｙｃｌｏｎｅ’ｓ）ＳＦＸ昆虫培地（ハイクローンコーポレーション：ＨｙｃｌｏｎｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、ｘＡＰＣのペプチド負荷中に使用する無血清培養基であり、使用前に２℃から６℃で保存される。この培地はウシ起源の生成物を含まない。

硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ _４）
硫酸銅５水和物は、修飾した宿主細胞のヒトＨＬＡ、共刺激および接着分子の発現を誘導するために使用する。この試薬は結晶粉末として受け取る。ストック溶液はクラスＩＩバイオセイフティキャビネット中にてＣｕＳＯ_４をエンドトキシンを含まない滅菌水に溶解して２００ｍＭ濃度を達成することにより調合し、そして溶液を０．２μｍのフィルターを通して無菌的に濾過して滅菌容器に入れる。濾過したストック溶液は使用前に２℃から６℃で保存する。

塩化カルシウム水和物（１Ｍ）
塩化カルシウム水和物は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の単離または活性化工程で使用する自己血清を生成するために、リンパ球フェレーシス生成物から得た自己血漿の凝固に使用する。塩化カルシウム水和物は結晶粉末として受け取り、ストック溶液に配合し、そして使用前に２℃から６℃で保存する。ストック溶液はクラスＩＩバイオセイフティキャビネット中にて塩化カルシウムをエンドトキシンを含まない滅菌水に溶解することにより調合され、そして０．２μｍのフィルターを通して無菌的に濾過して滅菌容器に入れる。

蒸留水
膜で濾過し、そしてエンドトキシンのスクリーニング（インビトロジェンコーポレーション）により得た細胞培養級の蒸留水を、硫酸銅、塩化カルシウムおよびインターロイキン−２（ＩＬ−２）のストック溶液の調製に溶媒として使用し、使用前にＲＴで保存する。

酢酸（１７．４Ｍ）
ＩＬ−２のストック溶液の調製に使用した酢酸は、シグマコーポレーション（ＳｉｇｍａＣｏｒｐｏｒａｔｉｐｎ）から得、そして使用前にＲＴで保存する。

ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（商標）プラス（１Ｘ濃度）
アイソレックス３００ｉ磁気細胞選択システムでＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ８⁻Ｔ細胞の単離後、非−ＣＤ８^＋画分からの単核細胞を、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（商標）プラス（動物成分を含まないＦｉｃｏｌｌ試薬、アマシャムファルマシアバイオテック：ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈから入手可能）を使用してさらに分画して、死んだ細胞、好中球および赤血球を除去する。試薬は使用前にＲＴで保存する。

ＰＥＮＴＡＳＰＡＮ（商標）（１Ｘ濃度）
ＰＥＮＴＡＳＰＡＮ（商標）（Ｂ．Ｂｒａｕｎメディカル社：ＭｅｄｉｃａｌＩｎｃ）は、医療用の０．９％塩化ナトリウム中１０％ペンタスターチ（ｐｅｎｔａｓｔａｒｃｈ）の滅菌溶液（ＮＤＣ０２６４−１９７２−１０）であり、使用前にＲＴで保存する。これは単離されたＣＤ８⁻ Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の低温保存法に低温保護剤として使用する。

ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、１Ｘ濃度
ＤＭＳＯは単離されたＣＤ８⁻ Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の低温保存法に低温保護剤として使用する。シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手可能なＤＭＳＯ溶液は、使用前にＲＴで保存する。

ＲＰＭＩ培養基（１Ｘ濃度）
血清および抗生物質を含まないＲＰＭＩ培養基（インビトロジェンコーポレーション）は、Ｔ細胞を成長させるために使用する。ＲＰＭＩ培養基は使用前、２〜６℃で保存する。

Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ；１００Ｘ濃度）
インビトロジェンコーポレーションから入手可能なＬ−グルタミン（ＵＳＰ）、２００ｍＭは、ＲＰＭＩ培養基補充物として使用し、そして使用前−８０℃に保存する。

ＭＥＭピルビン酸ナトリウム溶液（１００ｍＭ；１００Ｘ濃度）
インビトロジェンコーポレーションから入手可能なＭＥＭピルビン酸ナトリウム溶液（１００ｍＭ）は、ＲＰＭＩ培地を補充するために使用し、そして使用前、２〜６℃で保存する。

非必須アミノ酸（１０ｍＭ；１００Ｘ濃度）
ＲＰＭＩ培地を補充するために使用するインビトロジェンコーポレーションからの非必須アミノ酸は、使用前、２〜６℃に保存する。

ＨＥＰＥＳバッファー溶液（１Ｍ；２００Ｘ濃度）
ＲＰＭＩ培地を補充するために使用するＨＥＰＥＳバッファー溶液（インビトロジェンコーポレーション）は、使用前、２〜６℃に保存する。

Ｔ−７５フラスコ−通気型
通気型のＴ−７５フラスコをＣＤ８^＋Ｔ細胞の刺激および再刺激に使用する。処理した細胞培養フラスコは７５ｃｍ^２の表面積を有し、滅菌され、発熱物質を含まず、そして透明のポリスチレン材料で作られている。フラスコは使用前、ＲＴで保管される。各フラスコはＰＴＦＥの０．２μｍ疎水性通気孔を持つ通気性ポリエチレンキャップを有した。Ｔ−７５フラスコはガンマ線照射により殺菌されている。

Ｘ−ビボでの１０−細胞培地（１Ｘ濃度）
バイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）により供給されるＸ−ビボでの１０−細胞培養基を、使用前、２℃〜６℃で保存する。血清、フェノールレッドおよび抗生物質を含まないこの培地は、ペプチドを負荷したｘＡＰＣに暴露することにより活性化されるＴ細胞の非特異的増幅期中に使用する。

グルタミンを含まないライボビッツの（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ）Ｌ−１５培地（１Ｘ濃度）
シグマ−アルドリッチから入手可能な細胞培養基であるライボビッツのＬ−１５培地（Ｌ−グルタミンを含まない）は２〜６℃で保存した後、Ｔ細胞活性化法のペプチド負荷工程に使用する。

Ｔ−２２５フラスコ−通気型
通気型のＴ−２２５フラスコは、Ｔ細胞の非特異的細胞増幅中にＴ細胞のＯＫＴ（商標）３−刺激に使用する。処理した細胞培養フラスコは２２５ｃｍ^２の表面積を有し、ガンマ線照射により滅菌された透明のポリスチレン材料で作られている。各フラスコはＰＴＦＥの０．２μｍ疎水性通気孔を持つ通気性ポリエチレンキャップを有する。フラスコは使用前、ＲＴで保管される。

３−リットルのライフセル組織培養バッグ（ＬｉｆｅｃｅｌｌＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＢａｇｓ）
滅菌された１回使用の３０００ｍＬ容量のライフセルバッグは、使用前、ＲＴで保存する。

０．９％塩化ナトリウム注射
バクスターフェンバルラボラトリーカラ入手可能なバクスター０．９％の塩化ナトリウム溶液、ＵＳＰはＴ細胞の回収中の細胞洗浄法に使用する。滅菌され、発熱物質を含まず、そして動物成分を含まないこの溶液は、使用前にＲＴで保存する。

５％デキストロースおよび０．９％塩化ナトリウム溶液
５％デキストロースおよび０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰ（バクスターフェンバルラボラトリー）の注射用溶液は、滅菌され、動物成分を含まない発熱物質なしの溶液で得られる。活性化Ｔ細胞の保存バッファーとして使用されるこの溶液は、使用前、ＲＴで保存される。

０．９％乳酸加リンゲル溶液
塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよび乳酸ナトリウムの滅菌された低エンドトキシン溶液（水中）である注射用の（動物成分を含まない）０．９％の乳酸加リンゲル液、ＵＳＰ（バクスターヘルスケアラボラトリー）は、Ｔ細胞を回収し、そして懸濁するために使用する前、室温で保存する。

最終生成物のバッグ
活性化し、そして処理したＴ細胞を含むために使用する最終生成物のバッグは、生物適合性プラスチックからなる１０００ｍＬの容量の１回使用の滅菌注入用バッグである。バッグは使用前にＲＴで保管し、そしてバクスターフェンバルラボラトリーから入手可能である。

１．８−ｍＬＮＵＮＣ（商標）低温用チューブ
ＮＵＮＣ（商標）低温用チューブ（１．８ｍＬ）は、宿主細胞、ｘＡＰＣおよび活性化工程中に生成した余分なＣＤ８^＋Ｔ細胞を凍結するために使用できる。

ヒト末梢血リンパ球
リンパ球フェレーシス生成物は、黒色腫と診断されたヒト個体から集め、そして自己の患者特異的細胞生成物の作成に使用する前、室温で保存する。

自己のヒト血清
自己のヒト血清は単離されたＴ細胞を培養するタンパク質供給源として使用する。自己のヒト血漿は、リンパ球フェレーシス生成物からフィブリン凝固を達成するために塩化カルシウムを加え、次いで液体血清相を集めることにより調製する。集めた液体血清相は４℃で短期間保存し、そして−８０℃で長期間保存する。

ショウジョウバエのマスター細胞バンク
異種のショウジョウバエのクローンＢに由来するショウジョウバエｘＡＰＣ株（これは連続的にショウジョウバエのｘＡＰＣカルチャーを作成するための種ストックとして使用する）は、以下に記載するように得る。

ウシ胎児血清
宿主細胞またはｘＡＰＣ細胞の成長のためのタンパク質源として使用するウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、−８０℃で保存する。ジェミニバイオプロダクツ（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）から入手可能なＦＢＳは、米国起源の動物のウシ胎児血液から処理される。採血される母親の動物は、感染しておらず、そして接触伝染病ではなく、そして傷害性の寄生生物がいない。

抗−ＣＤ８モノクローナル抗体（３７Ｂ１Ａ）、１０．０ｍｇ／ｍＬ
抗−ＣＤ８（３７Ｂ１Ａ）は、Ｔ細胞のＣＤ８抗原に対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、これはＣＤ８^＋Ｔ細胞をアイソレックス３００ｉ磁気細胞選択システムで選択するために使用される。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の単離または活性化工程で使用するために、濃縮溶液を滅菌ＤＰＢＳで希釈する。バルク溶液は０．２μｍのフィルターを通し、次いでクラス１０，０００クリーンルーム中、１回使用のバイアルにクラスＩＩバイオセイフティキャビネット中の無菌条件下で等分する。アリコートは使用前に−８０℃で保存する。

抗−ＣＤ８（３７Ｂ１Ａ）ｍＡｂは、ＣＤ８アルファ軽鎖ペプチド（ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ；配列番号：７１）で免疫感作した病原体を含まないＨａｒｌｅｎＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙＢａｌｂ／ｃマウスの脾細胞を、非分泌ミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（アメリカンタイプカルチャーコレクションＣＲＬ−１５８０）と融合することにより生成した。アンメッド／バイオセイフ社（Ａｎｍｅｄ／Ｂｉｏｓａｆｅ，Ｉｎｃ）からの報告では、細胞株ＣＲＬ−１５８０が生来の（ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ）マウスのウイルスおよびマイコプラズマの存在に関して陰性であることが示された。ハイブリドーマは、細菌、菌・カビ、ウイルスおよびマイコプラズに陰性の１０％の熱−不活性化された明確なウシ胎児血清（ＤｅｆｉｎｅｄＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）（ハイクローン：ＨｙｃｌｏｎｅのＳＨ３００７０，ｌｏｔＡＪＡ９５３０）を補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で成長させた。クローン３７Ｂ１はヒトＣＤ８^＋細胞を染める抗体を生産するその能力について選択された（フローサイトメトリーにより評価した）。このハイブリドーマは後に限定希釈法によりサブクローン化された。サブクローン３７Ｂ１Ａを増幅し、凍結し、そして−１４０℃で保存した。

精製された３７Ｂ１ＡｍＡｂを生成するために、凍結した細胞のアリコートを解凍し、そして１０％の明確なウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地で増幅した。培地中の血清の割合は進行するにつれて減少させ、そして細胞を無血清培地（ギブコ：Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ１２０４５−０７６）での培養に順応させた。細胞のスケールアップは中空ファイバーデバイス（セルマックス：Ｃｅｌｌｍａｘ）中で製造元の使用説明に従い行った。細胞の成長は、順応に使用したものと同じ無血清培地（ギブコ−ＢＲＬ１２０４５−０７６，ｌｏｔ１０６６３８８）を使用して達成した。コンディショニング培地を集め、そしてモノクローナル抗体をプロテインＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗカラム（ファルマシア：Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でクロマトグラフィーにより製造元の使用説明に従い精製した。スケールアップに使用した細胞は、ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ法（ベーリンガー−マンハイム：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍｃａｔ．Ｎｏ．１６６３９２５）により試験した時、マイコプラズマ陰性となることが確認された。抗体はプロテインＧカラムから低ｐＨバッファー（０．１Ｍクエン酸塩、ｐＨ３．０）を用いて溶出し、そしてＴｒｉｓ塩基を加えることにより中和した。次いでプロテインＧで精製した抗体は、５６℃で３０分間、熱で不活性化した。

凝集した抗体のような高分子量の混入物は、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（ファルマシア）で製造元の使用説明に従いゲル濾過により除去した。３７Ｂ１ＡｍＡｂはさらにＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラム（ファルマシア）で製造元の使用説明に従いイオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製した。イオン交換カラムクロマトグラフィーの後、精製した３７Ｂ１ＡｍＡｂをダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）に対して透析し、膜濾過（０．２μｍフィルター）により滅菌し、１０．０ｍｇ／ｍｌの濃度に滅菌ＤＰＢＳを加えることにより調整し、そしてアリコートで凍結し、−８０℃にて保存した。

ストック３７Ｂ１Ａハイブリドーマ細胞は、レトロウイルス感染源に関して試験し、そして陰性であることが分かった。さらにマイコプラズマ、細菌、およびエンドトキシンの不存在を確認するため、臨床用調製物で使用するマウス抗−ＣＤ８モノクローナル抗体の各バッチについて試験を行う。精製した３７Ｂ１ＡｍＡｂバッチは、純度（ＳＤＳＰＡＧＥ）、無菌性、エンドトキシン含量（発色性ＬＡＬ）、マイコプラズマ混入（ＰＣＲＥＬＩＳＡ）およびヒトＣＤ８＋細胞親和性（フローサイトメトリー）について試験する。

ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ−４５０ヒツジ抗−マウス（ＳＡＭ）ＩｇＧ
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ−４５０（ＳＡＭ）ＩｇＧは、１次マウスＩｇＧに結合するポリクローナルヒツジ抗−マウスＩｇＧを被覆した滅菌された常磁性ビーズである。バクスターオンコロジー社（ＢａｘｔｅｒＯｎｃｏｌｏｇｙＩｎｃ．）から入手できるＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）は、アイソレックス３００ｉ磁気細胞選択システムを使用してＴ細胞の単離に使用する前、４℃で保存する。

組換えヒトベータ−２ミクログロブリン（β２Ｍ）
ヒトベータ−２ミクログロブリン（β２Ｍ）は組換えＤＮＡ技術により生産されたヒト血漿タンパク質であり、これは濃縮物として受け取り、次いで滅菌ＤＰＢＳで希釈して１．０ｍｇ／ｍＬの濃度とする。次いでバルク溶液は０．２μｍのフィルターを通して濾過し、滅菌バイアルに等分し、そしてｘＡＰＣの調製そしてペプチド負荷、および接着細胞のペプチド負荷中に使用する前、−８０℃で保存する。

組換えヒトインターロイキン−７（ＩＬ−７）、３０，０００Ｕ／ｍＬ（１，０００Ｘ濃度）
組換えヒトインターロイキン−７（ＩＬ−７）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）により生産されるリンホカインであり、そして抗体ではなく高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して供給元（ペプロテック：ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）により精製される。粉末で受け取ったＩＬ−７を、１％のヒト血清アルブミンを含有する滅菌ＤＰＢＳで希釈する。バルク溶液を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、滅菌バイアルに等分し、そして使用前、−８０℃で保存する。

組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（商標）、２０，０００Ｕ／ｍＬ（１，０００Ｘ濃度）
組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）は、キロンコーポレーション（ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により組換えＤＮＡ技法で生産され、そして供給される臨床的使用に認可されたリンホカインである。粉末で受け取ったＩＬ−２をＩＬ−２希釈剤（５０ｍＭ酢酸中、０．５％のヒト血清アルブミで希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過し、滅菌バイアルに等分し、そして使用前、−８０℃で保存する。

ＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅＯＫＴ（商標）３滅菌溶液、１．０ｍｇ／ｍＬ（ＯＫＴ３）
臨床的使用に認可された滅菌溶液としてアンプルで供給されるＴ細胞のＣＤ３抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体であるＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅＯＫＴ（商標）３（オルトバイオテック：ＯｒｔｈｏＢｉｏｔｅｃｈから入手可能）を、滅菌条件下で１回使用のバイアルに等分し、そしてＴ細胞の活性化に使用する前−８０℃で凍結保存する。投薬用量および投与および調製法に関する参照を含むＯＫＴ３の製品情報は、例えばＲｅｉｎｈｅｒｚｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９（４）：８２１−８２７（１９８０）；Ｃｈａｔｅｎｏｕｄｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３７（３）：８３０−８３８（１９８６）；ａｎｄＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｐ．１５５３−１５５４（１９９０）に与えられている。

２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
２５％ＨＡＳ、ＵＳＰ（バクスターフェンバルラボラトリーズ；試験した各ロットの血漿源はＨＩＶ−１ＨＩＶ−２，ＨＣＶおよびＨＢＶについて陰性であった）を、以下のＴ細胞調製および活性化工程；ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ８⁻ Ｔ細胞の精製；接着細胞のペプチド負荷；および活性化Ｔ細胞の最終配合の最中に緩衝化タンパク質の供給源として使用する前、ＲＴで保存する。

ａＡＰＣｓの調製
ａＡＰＣが由来する細胞株
異種ＡＰＣ株は、シュナイダーＳＣ２細胞（ＳＣ２細胞）から生成し、これは元々１９６９年に、数百の２０から２４時間生育したＯｒｅｇｏｎ−Ｒ（野生型）ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（Ｏｒｅｇｏｎ−Ｒ）の胚（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）ＣＲＬ−１９６３）から、公開されている手順に従い樹立し（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｍｏｒｐｈ．２７：３５３−３６５，１９７２）、そしてＡＴＣＣ（ＣＲＬ１０９７４）に寄託した。ｘＡＰＣを生成するために、ＳＣ２細胞はプラスミドベクターｐＲＭＨａ−３に由来するベクターでトランスフェクトした（ｐＲＭＨａプラスミドベクターの構築および使用に関しては米国特許第６，２２５，０４２号明細書を参照にされたい）。本明細書でクローンＡと命名する１つのｘＡＰＣ株は、ＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１をコードするベクターでトランスフェクトした。本明細書でクローンＢと命名する第２のｘＡＰＣ株は、ＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３をコードするベクターでトランスフェクトした。本明細書でクローンＣと命名する第３のｘＡＰＣ細胞株は、ＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＣＤ７０をコードするベクターでトランスフェクトした。このようにクローンＡはＨＬＡ−Ａ２、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１を発現し、クローンＢはＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３を発現し、そしてクローンＣはＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＣ
Ｄ７０．Ｂ７．２およびＬＦＡ−３を発現する。

ａＡＰＣ細胞株の維持、導入およびペプチドの負荷
クローンＡ−およびクローンＢ−の子孫細胞の独立した連続培養は、１０％ウシ胎児血清および５００μｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８）を補充したシュナイダー培地で維持し、そして１週間に２回、約１ｘ１０^６細胞／ｍＬの細胞密度に調整するために、各分割（ｓｐｌｉｔ）中に新しい培地を加えることにより分割した。誘導からおよそ１日前（２〜４日；ここで０日は細胞の外因性分子の発現を試験し、そしてペプチドを負荷する日と定める）、３ｘＴ７５フラスコには、１．５ｘ１０^７細胞／フラスコに等価のストックカルチャーを維持する容量の細胞懸濁液を接種した。Ｇ４１８を含まない完全ショウジョウバエ−ＳＦＭ培地を加えて容量を１５ｍｌ／フラスコに増やした。次いでフラスコを約２７℃でチャンバー内でインキュベーションした。およそ１〜３日に、細胞を１．０ｍＭの最終濃度の硫酸銅（ＣｕＳＯ_４）（２００ｍＭのＣｕＳＯ_４ストックの１：２００希釈；１５ｍｌの細胞懸濁液を含有する各Ｔ７５フラスコに７５μｌのＣｕＳＯ_４）の添加により誘導し、そして２７℃のチャンバーに戻した。誘導時間は約２４〜７２時間持続した。

０日に、誘導した細胞カルチャーを含有するフラスコを目および顕微鏡で混入の証拠についてチェックした。非混入フラスコをプールし、そして生きている細胞をカウントした。約６ｘ１０^６細胞のプールした細胞カルチャーのサンプルは、フローサイトメトリーにより蛍光補助セルソーター（ＦＡＣＳ）分析を使用して外因性分子の発現レベルを測定した。次いで細胞カルチャー（約１ｘ１０^７細胞／ｍＬ）は、外因性ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１（クローンＡ細胞について）またはＨＬＡ−Ａ２．１，Ｂ７．１，Ｂ７．２，ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３（クローンＢ細胞について）の発現を立証するために試験した後、ペプチドを負荷した。いったん外因性分子の発現が立証されれば、各細胞カルチャーは各カルチャーを２つの滅菌された５０−ｍｌコニカル試験管に分割することにより洗浄した。ついで各試験管にＨＹＱＳＦＸ−昆虫培地を充填し、そして１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で約７分間遠心して細胞をペレットにした。上清を捨て、そして細胞ペレットを含有する試験管を１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で約１分間、再遠心した。上清を細い先端のピペットで取り出した。各分割細胞カルチャーからのペレットは次いで再度、合わせられ、そして８ｍＬのＳＦＸ昆虫培地に再懸濁されて、約１ｘ１０^７細胞／ｍＬの細胞密度とした。約４０μＬのβ２ミクログロブリンストック溶液を１．０ｍｇ／ｍＬで、および各ペプチドについて２４μＬの１：５０希釈のストックペプチドコンボ（ｃｏｍｂｏ）溶液を１．６７ｍｇ／ｍＬで各再懸濁カルチャーに加えた。このようにして、各細胞カルチャー懸濁液はβ２ミクログロブリンを約５μｇ／ｍＬの最終濃度で含有し、そして各選択したペプチドはペプチドあたり約０．１μｇ／ｍＬの最終濃度でｘＡＰＣに負荷された。細胞カルチャーはβ２ミクログロブリンおよびペプチドを含有する懸濁液中で、少なくとも４時間、そして８時間未満、３０分毎に旋回させながら室温でインキュベーションされた。ペプチドのインキュベーション期間後、各細胞カルチャーの約１ｍＬのアリコートを別個に８本のポリプロピレン試験管（Ｆａｌｃｏｎ２００６）に分配した。残存する細胞カルチャー懸濁液は捨てた。

手順
実施例１：ショウジョウバエのａＡＰＣの特性決定
マイコプラズマおよび付随ウイルスに関する検査
検査はマイコプラズマおよび随伴ウイルスの混入についてバイオリライアンス（ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ）により行われた。ショウジョウバエのｘＡＰＣマスター細胞バンクは、表Ｉに概略するようにマイコプラズマおよび随伴ウイルスが存在しないことが標準的な安全性試験パネルに従い決定された：本明細書で使用するように用語「本質的に混入が無い」とは、核酸、細菌、ウイルスおよびマイコプラズマ、特に生きている細菌、感染性ウ
イルスおよびマイコプラズマを含む混入源が本質的に無い細胞カルチャーを称する。

随伴ウイルスの混入は、ショウジョウバエのｘＡＰＣ細胞株が指標細胞に接種された時、および細胞が細胞病理学的効果、血球吸着および血球凝集について１４日間観察された時に検出されなかった。アッセイのインキュベーション時間を全部で４２日に延ばしたので、以下に記載する細胞治療生成物の製造中、ＣＤ８^＋エフェクター細胞のエクスビボでの培養時間は３１日より長かった。随伴ウイルスの混入はこの延長したアッセイインキュベーション期間中にショウジョウバエのｘＡＰＣでは検出されなかった。

ショウジョウバエのｘＡＰＣと昆虫指標株との共存培養（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）およびヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ））は、ショウジョウバエの株へのショウジョウバエｘＡＰＣに存在するショウジョウバエＸおよびＨＰＳ−１−様ウイルスの両方の伝播を生じるが、使用した蚊の株には伝播しなかった。指標細胞として使用したショウジョウバエおよび蚊の両株は、ノダウイルスについて陽性であり、使用するショウジョウバエｘＡＰＣから使用する指標細胞株へのノダウイルスの伝播のアクセスを不可能にした。

レトロウイルス逆転写酵素に関する試験
レトロウイルス逆転写酵素（ＲＲＴ）活性の不存在を確認するための試験は、バイオリライアンスでショウジョウバエのｘＡＰＣについて行った。ｘＡＰＣ株はＭｎ^＋＋−およびＭｇ^＋＋−依存的レトロウイルス逆転写酵素の存在について試験した。これらレトロウイルス逆転写酵素の存在の証明は検出されなかった。

サービスラボラトリーにより行ったショウジョウバエのｘＡＰＣに関する透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）では、ウイルス様の粒子（ＶＬＰｓ）の存在が、細胞の核（２０／１００細胞、直径４０−４５ｎｍ、パポバウイルスに似ている）および細胞質（１／１００，〜３０ｎｍノダウイルスに似ている）で明らかとなった。別のサービスラボで引き続いてショウジョウバエｘＡＰＣのＴＥＭ分析では、同定可能なレトロウイルス様の粒子は検出されなかった；しかしレオウイルスと一致する特徴を有するＶＬＰが細胞に観察されたものの、陽性とは同定できなかった。２つのラボにより同定されたウイルス粒子の型の矛盾により、ショウジョウバエｘＡＰＣおよびシュナイダーＳ２（ＳＣ２）親細胞株の両サンプルを使用して試験を繰り返した。また細胞は第３のサービスラボへ送った。この第３の評価の結果は、すべて３つの株が２またはおそらく３つの型の同じ型のウイルス粒子を含むことを示した：
１）＜５粒子／区画から結晶配列を形成する大変大きな粒子の蓄積までの範囲の量で核に９０％の細胞で見いだされる３０ｎｍの大きい粒子。粒子はパルボウイルスファミリー、昆虫細胞株に感染することが知られているデンソウイルス属由来のウイルスとほぼ一致した；
２）細胞質に排他的に見いだされる５０ｎｍの大きい粒子。検出することは一層困難だが、これらの粒子は最初のものより頻度が低い。それらは電子密度が高く、そしてまた細胞質で結晶配列を形成する。それらは細胞質で複製するレオウイルス粒子のようであり、そして昆虫細胞株に感染することが知られている：および
３）観察した細胞のいくつかの細胞質にある１５〜２０ｎｍの大きさの電子密度が高い粒子で、ウイルスタンパク質またはおそらくノダウイルス様粒子の蓄積の細胞構造のいずれかを表す。

ＡＴＣＣから得た親の株で同じＶＬＰの存在は、それらがｘＡＰＣ株の樹立前に存在していたことを示した。ＴＥＭ分析では、ショウジョウバエの細胞株２の核および細胞質の両方でＶＬＰを示した。粒子はほとんどの細胞の区画に存在したが、見える数は１個の粒子から大きな凝集物まで変動し、クローンＳＣ２およびショウジョウバエｘＡＰＣ株について上に報告した知見に類似した。細胞は粒子の存在にかかわらず激しく成長し、そして細胞に対する粒子の関係の性質はその時点で未知のままであった。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の親株ＳＣ２、および２つのショウジョウバエｘＡＰＣ株の試験および分析で得た結果を表ＩＩにまとめる：

ショウジョウバエのｘＡＰＣ株Ａはさらなる特性決定、および残りの実施例にｘＡＰＣとして使用するために選択した。したがってショウジョウバエのｘＡＰＣ株Ａは以下でショウジョウバエｘＡＰＣまたは以下にｘＡＰＣと呼ぶ。

ショウジョウバエｘＡＰＣ株Ａからウイルス様粒子の単離および特性決定
ＶＬＰはショウジョウバエｘＡＰＣ溶解物からペレット化し、そしてＣｓＣｌ密度勾配での平衡遠心により精製した。ＶＬＰは１．３０ｇ／ｍＬ、１．３６ｇ／ｍＬおよび１．４１ｇ／ｍＬの密度にバンドを形成した。精製した粒子は電子顕微鏡、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、核酸抽出およびシークエンシングにより分析した。これら画分の陰性染色、続いて透過型電子顕微鏡により、これら画分中の３つの型の粒子の考察が導かれた：
１）密度１．４１の画分は、エンベロップを含まない直径約４２ｎｍの二十面体粒子からなった。これらの粒子は細胞の核で観察される粒子と一致し、そしてデンソウイルス様であると考えられた；
２）密度１．３６の画分は、エンベロップを含まない直径約３０ｎｍの粒子からなり、そして幾つかの細胞の細胞質で観察される構造はウイルスタンパク質の蓄積ではなく、むしろおそらくノダウイルスファミリーに由来すると思われる粒子の蓄積であることが確認された；および
３）密度１．３０の画分は、密度１．４１の粒子と同一で、エンベロップを含まない直径約４２ｎｍの二十面体粒子からなった。さらに幾つかの大きなサイズ（６０ｎｍ）の二十面体粒子がこの画分で見いだされ、そして細胞の細胞質で観察される粒子と一致し、レオウイルス様であると考えられた。

ＶＬＰ分析の結果を表ＩＩＩにまとめる：

密度１．４１の粒子
タンパク質および核酸の分析に基づき、密度１．４１の粒子は、４から６ｋｂの間のｄｓＤＮＡおよび４０〜９０ｋｄの範囲に少なくとも３つの構造タンパク質を特徴とするデンソウイルス属には属さないようであった。１００ｋｄのポリペプチドのＮ−末端シークエンシングを行い、そしてアミノ酸配列を使用してウイルスゲノムの相同的なＮ−末端配列をクローン化するために使用した。配列分析はこのタンパク質が新規であり、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに２８％の相同性を有することを示した。質量分光測光法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）による分析で、このタンパク質の新規性も確認した。１００ｋｄのタンパク質から精製したペプチドのトリプシン消化およびエドマンシークエンシングにより、核酸のデータを確認した。精製したウイルス核酸のＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ分析に基づき、ゲノムは実際にｄｓＤＮＡではなくｄｓＲＮＡであることが確認され、これにより３つの昆虫ウイルスの１つとしてデンソウイルスを排除した。これらの考察はＳｃｏｔｔｅｔａｌ（ｓｅｅ，ｅ．ｇ．，Ｓｃｏｔｔｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．３３（３），ｐｐ．９２９−９４１（１９８０））により記載されたショウジョウバエのＳＣ２細胞のＨＰＳ−１ウイルスと最も一致した。このウイルスは直径３６−ｎｍのエンベロップに包まれていないビリオンが感染した細胞のほとんどの核に存在すると記載されていた。精製した粒子は密度１．４１に見いだされ、そしてウイルスコートタンパク質と思われる主要タンパク質（１２０ｋｄ）を会合した約６ｋｂ長の単一セグメントのｄｓＲＮＡを、微量なタンパク質（２００ｋｄ）と一緒に含んだ。

リアルタイムの定量的ＲＴ／ＰＣＲアッセイを開始して、細胞中のＨＰＳ−１様ウイルスの存在を検出した。この手法では２４１塩基長のウイルス特異的配列の増幅を生じる。ＨＰＳ−１様の特異的なウイルス鋳型を、ＣＤ８^＋細胞から調製したｃＤＮＡへスパイキングする（ｓｐｉｋｉｎｇ）実験で、ウイルス検出の感度が１μｇのＤＮＡあたり１０〜１００コピーの間になることが確認された。

密度１．３６の粒子
精製した密度１．３６粒子からのタンパク質および核酸の分析により、このウイルスがノダウイルス属に由来することが確認された。ＲＮＡ１（３．０ｋｂ）を表すＤＮＡ配列が完了し、そしてノダウイルスファミリーの昆虫ウイルスであるＦｌｏｃｋＨｏｕｓｅウイルスに約９０％相同的であることが見いだされた。ＲＮＡ２セグメントの完全長クローニングおよびシークエンシングも完了し、そして４３−ｋｄのコートタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列は、以下に示すようにショウジョウバエのノダウイルス（ＤｒＮＶ）から単離されたコートタンパク質ＤＮＡおよびＦｌｏｃｋＨｏｕｓｅウイルスに相同的であった：
ＤｒＮＶＤＮＡ：ＭＶＮＮＩＫＰＲＲＱＲＳＱＲＶ（配列番号：８０）
４３ｋｄタンパク質：ＶＮＮＩＫＰＫＲＱＲＰＱ＿Ｖ（配列番号：８１）
ＦｌｏｃｋウイルスＤＮＡ：ＭＶＮＮＩＫＰＲＲＱＲＡＱＲＶ（配列番号：８２）

リアルタイムの定量的ＲＴ／ＰＣＲアッセイを開発して細胞中のショウジョウバエのノダウイルス属のウイルスの存在を検出した。この手法では１３３塩基長のウイルス特異的配列の増幅を生じた。ノダウイルス属の特異的ウイルス鋳型を、ＣＤ８＋細胞から調製したｃＤＮＡへスパイキングする実験で、ウイルス検出の感度が１μｇのＤＮＡあたり１０〜１００コピーの間になることが確認された。

密度１．３０の粒子
密度１．３０の粒子からの核酸抽出は、ＤＮＡもＲＮＡも得ることができなかった。この調製物のＳＤＳ／ｐａｇｅプロファイルは、密度１．４１での調製物について得たものと同一であった。電子顕微鏡の観察と共に、これらの結果からこの調製物が主に空のＨＰＳ−１ウイルス粒子を、さらに特性決定するには不十分な数のいくらか大きい粒子（６０ｎｍ）と一緒に含んでなることが示唆された。

レオウイルス属からのウイルス数（この第３のウイルスに適合する特性：位置、結晶配列の形成、およびサイズを持つ）は、ショウジョウバエを含む昆虫細胞を感染すると報告された（例えばＨａａｒｓｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０１（１），ｐｐ．１２４−１３０（１９８０）を参照されたい）。昆虫のレオウイルス間で保存された配列に基づき多数のＰＣＲプライマーを生成し、そしてショウジョウバエｘＡＰＣから調製したｃＤＮＡをスクリーニングするために使用した。これらの細胞から調製されたｃＤＮＡから増幅されたレオウイルスの配列はなかった。

ショウジョウバエＸウイルス（ＤＸＶ）はビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）のファミリーのｄｓＲＮＡウイルスであり、そして幾つかのショウジョウバエ細胞株を感染することが知られている（例えばＳｈｗｅｄｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９６（２），ｐｐ．２４１−２５０（２００２）を参照にされたい）。６０−ｎｍのビリオンは浮揚性のある密度１．３４を有し、１．２９の密度で沈降する空のキャプシドを有する。ゲノムは２つのセグメント、セグメントＡ（３３６０ｂｐ）およびセグメントＢ（３１００ｂｐ）からなる。ＤＸＶに特異的なＰＣＲプライマーの組を設計し、そしてショウジョウバエのｘＡＰＣ中のＤＸＶの存在を釣り上げるために使用した。ＰＣＲで増幅したバンドで予想された分子量が得られ、そして増幅したフラグメント（６８２ｂｐ）配列は公開されたＤＸＶ配列と同一であった。

さらに幾つかのＤＸＶ配列を、密度１．３６の精製画分からノダウイルス科のほとんどの配列と一緒にクローン化した。これらの結果は、１．２９の空の粒子を含み、１．３３〜１．３４の密度で浮遊する感染性粒子を記載する公開された文献と合致する。結果として、ＴＥＭで密度１．３０画分に観察された６０−ｎｍの粒子は、サイズおよび形に基づき考えられたレオウイルス科ではなく、空のＤＸＶ粒子であった。これはこれらＶＬＰからＤＮＡまたはＲＮＡが抽出できないことを説明していた。

リアルタイムの定量的ＲＴ／ＰＣＲアッセイを開発して細胞中のショウジョウバエＸウイルスの存在を検出した。この手法では１７８塩基長のウイルスポリプロテインから始まるウイルス特異的配列の増幅を生じる。ＤＸＶ特異的ウイルス鋳型を、ＣＤ８^＋細胞から調製したｃＤＮＡへスパイキングする実験で、ウイルス検出の感度が１μｇのＤＮＡあたり１０〜１００コピーの間になることが確認された。

実施例２：ｘＡＰＣの不活性化
グルタルアルデヒド固定
ショウジョウバエの細胞の不活性化は、最初に保存剤の不存在下でのグルタルアルデヒド固定により試みた。０．３％のグルタルアルデヒドで固定したショウジョウバエのｘＡＰＣは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の抗原特異的増殖（非固定細胞よりも２．５−から６−倍少ない）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化（非固定細胞よりも２−倍少ない）および標的細胞を溶解できるＣＤ８^＋Ｔ細胞の生成（非固定細胞よりも少ない程度まで）を行うことができた。すなわちこの不活性化法は、グルタルアルデヒド固定プロトコールにより不活性化されなかった細胞に比べて、ＡＰＣ機能が減じたショウジョウバエのｘＡＰＣを生じることがわかった。

凍結−解凍サイクル
ｘＡＰＣ機能を減じることなくショウジョウバエのｘＡＰＣを不活性化する２番目の試みでは、一連の凍結解凍サイクルを行った。凍結サイクルはｘＡＰＣを液体窒素またはドライアイス（固体ＣＯ_２）のいずれかにｘＡＰＣが完全に凍結するまで置き（例えば約１分間）、次いでｘＡＰＣを液体窒素またはドライアイスから取り出し、そしてｘＡＰＣを室温にすることが必要である。凍結−解凍サイクルは、保存剤であるジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含まない培地中のｘＡＰＣを用いて行った。この方法は２回の凍結−解凍サイクル後にトリパンブルー染色により評価した時、１００％生育不能（すなわち死んだ）細胞を生じた。これらの生育不能な細胞はＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激し、凍結−解凍サイクルにかけないショウジョウバエのｘＡＰＣで刺激したＣＤ８^＋Ｔ細胞で観察される細胞溶解活性に匹敵する抗原特異的な細胞溶解活性を持つＣＴＬを生成することができた。加えて凍結−解凍実験は、ショウジョウバエのｘＡＰＣが誘導され、ペプチドが負荷され、そして凍結−解凍され、次いで引き続きナイーブＴ細胞を刺激するために使用され得ることを証明した：このようにショウジョウバエのｘＡＰＣはｘＡＰＣ機能を保存するために培養を連続的に行う必要はない。

ソラレン／ＵＶＡ処理
凍結−解凍法は、実質的に生育不能とされたショウジョウバエのｘＡＰＣがナイーブＴ細胞を活性化する能力を保持することを示した。しかしｘＡＰＣに随伴する異種核酸が凍結−解凍サイクル後に細菌またはウイルス混入のいくらかの活性またはいくらかの程度を有する可能性が残る心配もある。ＤＮＡ、ＲＮＡ、細菌もしくはウイルス混入が本質的に無い高度に機能的な抗原提示系を生じるために、ｘＡＰＣに随伴する異種核酸の不活性化を望んで、ｘＡＰＣをソラレンファミリーの分子のメンバーに暴露し、続いて長波長の紫外線照射（ＵＶＡ）に対する暴露が関与する不活性化計画が試験された。ソラレン（７−Ｈ−フロ［３，２−ｇ］−ベンゾピラン−７−オン、シグマから入手可能）および臨床的等級のソラレン誘導体である９−メトキシ−７Ｈ−フロ［３，２−ｇ］−１−ベンゾピラン−７−オン（メトキサレン、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）としても知られており、そしてＵＶＡＤＥＸ（商標）という名で市販されている）を含む種々のソラレンファミリーのメンバーを使用して、幾つかの実験を行った。

バキュロウイルス／Ｓｆ９の感染性アッセイは、ソラレン誘導体／ＵＶＡ処理がウイルスに感染した昆虫細胞に随伴するウイルスを不活性化するために十分かどうかを決定するために使用した。Ｓｆ９昆虫細胞をＢａｃＰＡＫ６ウイルスストックで感染させ、そして室温で１時間インキュベーションした（ＢａｃＰＡＫ６バキュロウイルス迅速滴定キット；ＢＤバイオサイエンスクロンテック（ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｌｏｎｔｅｃｈ））。感染した細胞は未処置または（５μｇ／ｍｌ）ＵＶＡＤＥＸ（商標）のいずれかで処置し、そして容器の上の光源および容器の下の光源から長波紫外線（３２０ｎｍ〜３８０ｎｍ、ＵＶＡ）を約５分間照射（１０−１５ｍＷ／ｃｍ^２）した。照射から５日後、培養上清を集めた。これらから新しいウイルスストックをそれぞれ１０^−３，１０^−４および１０^−５の連続希釈を介して調製した。これらの連続希釈したストック希釈物は、それぞれ第２組の新しい（すなわちこれまで感染していない）Ｓｆ９細胞カルチャーを感染させるために使用した。この第２組のカルチャーをメチルセルロースに乗せ、そして約４８時間成長させた。この第２組のカルチャーの培養上清を捨て、そしてマウスモノクローナル抗−ｇｐ６４（バキュロウイルス特異的）タンパク質抗体（インビトロジェン）を加えた。インキュベーション期間および非結合抗−ｇｐ６４抗体を除去するために数回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗−マウスポリクローナル抗体（すなわちインビトロジェンから得た２次抗体）を加えた。非結合２次抗体を数回の洗浄により除去し、そしてペルオキシダーゼを加えた。染色されたフォーカスをカウントし、そしてウイルス力価（ｐｆｕ／ｍｌ）を製造元の使用説明に従い計算した。

以下の表ＩＶに示すように、５分のＵＶＡ（３５０−４００ｎｍ）照射時間でＳｆ９指標細胞カルチャー中のバキュロウイルスの複製を防止するために十分であったが、対照の未処理細胞は８ｘ１０^８のプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌのウイルス力価のバキュロウイルスを含んだ。

類似の実験では、Ｓｆ９細胞に上記の力価用量のバキュロウイルスを感染させた。次い
で感染細胞を５μｇ／ｍｌのＵＶＡＤＥＸ（商標）を用いて４℃で３０分間、続いてＵＶＡ照射で０分、２分、１０分または２０分間、それぞれ処理した。次いで処理した細胞を２８℃で４日間培養した。培養上清を集め、そして９６ウェルプレートに播種したＳｆ９細胞の新しいカルチャー感染させるために使用した。Ｓｆ９細胞中のバキュロウイルスは、迅速マイクロタイターアッセイ（インビトロジェン）により検出された。培養プレートにメチルセルロースを重層し、そして４８時間培養した。バキュロウイルスはｇｐ６４−特異的抗体（インビトロジェン）を用いたイムノアッセイにより検出された。各ウェル中のフォーカスの数を数え、そして感染細胞上清のウイルス力価（ｐｆｕ／ｍｌ）を製造元の使用説明に従い算出した。図１に示す結果は、ＵＶＡＤＥＸ（商標）処理に続いて２分間のＵＶＡに対する暴露が、集めた培養上清中のバキュロウイルス力価を、未処理／暴露細胞で見られるバキュロウイルス力価の１０％未満にまで減少させた。ＵＶＡＤＥＸ処理に続いてそれぞれ１０および２０分のＵＶＡ暴露時間で、バキュロウイルス力価は検出できなかった。

ソラレン／ＵＶＡ処理がｘＡＰＣの増殖を阻害する可能性があるかどうかを決定するために、ショウジョウバエのクローンＢのｘＡＰＣを未処理、または５μｇ／ｍｌのＵＶＡＤＥＸ（商標）で４℃にて３０分間、続いてＵＶＡ処理を０、２、１０または２０分間行った。処理したｘＡＰＣは、残るＵＶＡＤＥＸを除去するために完全に洗浄し、そして未処理および処理したｘＡＰＣの両方を６−ウェルプレートに１ｘ１０^６細胞／ｍｌで播種し、そして１６日間、連続培養した。生育能力がある（すなわち生きている）ｘＡＰＣを処置から１日、５日、９日、１４日および１６日後に各カルチャーのトリパンブルー染色によりカウントした。

図２に示すように、ショウジョウバエのｘＡＰＣ増殖は、試験した各ＵＶＡ暴露期間により効果的に阻害され、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理から約９日後のすべてのＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理カルチャーの生育能の約５０％阻害をもたらした。さらにＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理から約２週間後までに、いかなる処理カルチャー中にも生育能のある細胞はほぼ検出されなかった。逆に非ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理ｘＡＰＣは、確固たる生存能を表し、培養の１４日以内にほぼ３倍の細胞カウントになった。したがってＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理はたとえ試験した最低のＵＶＡ時間（２分間）でもｘＡＰＣの増殖を効果的に弱めるという結論に至った。

ｘＡＰＣに導入された異種核酸は、たとえｘＡＰＣ自体が非増殖的にされても活性を維持できた可能性があった。ソラレン／ＵＶＡ処理がｘＡＰＣに導入された異種核酸を不活性化するかどうかを決定するために、γ−照射またはＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処置のいずれか後に、ショウジョウバエのクローンＢのｘＡＰＣの異種核酸転写の分析を行った。ショウジョウバエのクローンＢのｘＡＰＣは、未処理、ＵＶＡＤＥＸ（商標）（５μｇ／ｍｌ）／ＵＶＡで処理、またはγ−照射で５０分間（約１６，００００ラドを送達）の処理のいずれかを行った。ｘＡＰＣの各カルチャーを洗浄し、そして本明細書でクローンＤと命名したショウジョウバエの指標細胞株（これは異種核酸の導入により修飾されなかった細胞株である）と１０週間共存培養した。異種のＨＬＡＡ２．１，Ｂ７−１，Ｂ７−２およびβ２ｍ転写産物に特異的なプライマーを使用した逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ反応を、共存培養の抽出物で行った。図３に示す結果は、異種のＨＬＡＡ２．１，Ｂ７−１，Ｂ７−２およびβ２ｍ転写産物（それぞれレーン２および３）の検出により示されるように、未処理およびγ−処理したｘＡＰＣの両方が活性な異種核酸を含有することが示される。逆に、ＵＶＡＤＥＸ（商標）（５μｇ／ｍｌ）およびＵＶＡで処理したｘＡＰＣ細胞のいずれも、ＵＶＡ処理期間にかかわらず、異種のＨＬＡＡ２．１，Ｂ７−１，Ｂ７−２およびβ２ｍ転写産物が検出可能なレベルで存在しないことにより明らかであるように活性な外因性の核酸を含まなかった。したがってｘＡＰＣのＵＶＡＤＥＸ（５μｇ／ｍｌ）／ＵＶＡ処置は、ｘＡＰＣに導入された異種核酸を不活性化すると結論づけられた。

ある種の随伴性細胞溶解ウイルス、マイコプラズマおよび他の微生物が、ｘＡＰＣに導入された外因性核酸に加えてｘＡＰＣに随伴する可能性があるので、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理計画がｘＡＰＣのこれら有力な混入物を不活性化するこどうかを決定することが望ましかった。すなわち約６ｘ１０^８のショウジョウバエｘＡＰＣ（クローンＢ）を含有するｘＡＰＣカルチャーを集め、氷上で０．６ｍｌのシュナイダー培地に懸濁し、そして３０秒間、超音波処理した。細胞屑を遠心によりペレットとし、そして上清を集め、そして密度１．２（２０％重量／重量のＣｓＣｌ）の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）のクッション上に、１容量のＣｓＣｌあたり３容量の上清を重層した。次いで上清を乗せたＣｓＣｌクッションを、２５，０００ｒｐｍで４時間、超遠心した。ウイルス画分を集め、そして画分の密度を測定した。密度１．０から１．２で３ミリリットルの画分をプールし、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、ウイルスストックを生成し、そしてウイルスストックを使用するまで−８０℃で保存した。約１ｘ１０^８ｘＡＰＣからの溶解物に等価のウイルスストックのアリコートを、ＵＶＡＤＥＸ（商標）／ＵＶＡ処理（５μｇ／ｍｌで１０分間）にかけるか、または未処理のままとした。ショウジョウバエのクローンＤ指標細胞株の独立したカルチャー（１ｘ１０^６細胞／カルチャー）を、２８℃で処置および未処理ウイルスアリコーとのいずれかとインキュベーションした。３日間のインキュベーション後、指標細胞カルチャーを回収し、そしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ／１ｘ１０^６細胞）を用いて４℃で１０分間染色した。生きている、および溶解した細胞はＦＡＣＳで分析し、その結果を図４Ａ−４Ｃに表す。

指標細胞株で感染させたｘＡＰＣ未処理から単離した、約１ｘ１０^８のプラーク形成単位（ｐｆｕ）に等価の未処理ウイルスストックのアリコートは、顕微鏡により観察されるカルチャーサンプルのように、指標細胞株カルチャー中の本質的にすべての細胞に溶解をもたらした（代表的な顕微鏡の場の画像、図４Ａ）。逆にＵＶＡＤＥＸ（商標）／ＵＶＡ（５μｇ／ｍｌで１０分間）にかけたｘＡＰＣから単離されたウイルスストックアリコートは、観察できる指標細胞のいかなる感染または溶解も生じることができなかった（代表的な顕微鏡の場の画像、図４Ｂ）。

類似の実験で、１０^−１，１０^−２，１０^−３，１０^−４，１０^−５，１０^−６，１０^−７，１０^−８および１０^−９希釈からなる１組のｘＡＰＣウイルスストックの連続希釈物組を処理しないか、またはＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ（５μｇ／ｍｌで１０分間）処理した後、ショウジョウバエのクローンＤ指標細胞カルチャーとインキュベーションした。３日間のインキュベーション後、生育可能な細胞の割合を各指標細胞株カルチャーで定量した。図４Ｃに反映される結果は、試験した最低の希釈物を除いて、処理したウイルス画分がほとんど完全に指標細胞カルチャーを感染および溶解することができなかった。しかし未処理のウイルス画分は１０^−５のウイルス画分の希釈で指標細胞カルチャーの約８０％の溶解を行うことができた。

ＵＶＡＤＥＸ（商標）／ＵＶＡ処理ｘＡＰＣに随伴する異種核酸がクローンＤ指標細胞に対して一時的に感染性ではなく、そして一時的に発現されないことを確認するために、ショウジョウバエのｘＡＰＣクローンＢ／クローンＤ共存培養物の蛍光で活性化したセルソーター（ＦＡＣＳ）分析を行った。比較のため、γ−照射処理したｘＡＰＣクローンＢ／クローンＤ共存培養物および未処理ｘＡＰＣクローンＢ／クローンＤ共存培養物もＦＡＣＳにより分析した。

ショウジョウバエのｘＡＰＣカルチャー（クローンＢ）を処理しないか、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ（５μｇ／ｍｌ）で処理するか、またはγ−照射で５０分間（約１６，０００ラドを送達）処理した。各カルチャーからの細胞を洗浄し、次いでクローンＤ指標細胞と１０週間共存培養した。共存培養した細胞を集め、そしてアリコートに分け、そして各アリ
コートをＨＬＡ−Ａ２，Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）のうちの１つでそれぞれ染色した。染色した共存培養物をＦＡＣＳにより分析した。図５に示すように、未処理ｘＡＰＣを含有する共存培養物はＨＬＡ−Ａ２，Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１を発現した；γ−照射処理したｘＡＰＣを含有する共存培養物はＨＬＡ−Ａ２，Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１の控えめではあるが有意な発現を示した；そしてＵＶＡＤＥＸ^ＴＭ／ＵＶＡ−処理ｘＡＰＣを含有する共培養物には、ＨＬＡ−Ａ２，Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１のレベルを検出できなかった。

類似の実験では、ショウジョウバエのｘＡＰＣカルチャーを誘導して組換えベクターによりコードされる外因性分子を発現し、次いでＵＶＡＤＥＸ^ＴＭ（５μｇ／ｍｌ）とインキュベーションし、そしてＵＶＡで０、５または１５分間処理した。ｘＡＰＣカルチャーを洗浄し、そしてＨＬＡ−Ａ２，Ｂ７−１またはＩＣＡＭ−１に特異的なモノクローナル抗体で染色し、そしてＦＡＣＳにより分析した。図６に示すように、３つの外因性分子の各々の表面発現レベルは、試験したすべてのＵＶＡ時間について本質的に同じであった。

まとめると、これらの結果はソラレン／ＵＶＡ処理で不活性化されたショウジョウバエのｘＡＰＣは、本質的に生育不能とされ、そして本質的に非感染性とされることが証明された。さらにソラレン／ＵＶＡが媒介する不活性化の前にコードされたタンパク質がｘＡＰＣ細胞表面上に発現するように、外因性核酸を発現するように導入されたｘＡＰＣは、不活性化の後に外因性タンパク質の不活性化前の発現レベルを保持した。

不活性化されたショウジョウバエのｘＡＰＣとのインキュベーションでのナイーブＴ細胞の選択したペプチドに特異的な増幅および活性化
ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞はＨＬＡ−Ａ２陽性供与体の末梢血単核白血球（ＰＢＭＣ）から精製し、そして３７℃でＵＶＡＤＥＸ（商標）／ＵＶＡ−処理したｘＡＰＣまたはＵＶＡＤＥＸ（商標）／ＵＶＡに加えて凍結−解凍処理したｘＡＰＣと、ヒトＭＡＲＴ−１のアミノ酸２７−３５に対応する１０μｇ／ｍｌのＭＡＲＴ−１ペプチド（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号：９）の存在下で培養した。ヒト組換え（ｒ）ＩＬ−２（２０単位／ｍｌ）およびｒＩＬ−７（３０単位／ｍｌ）をそれぞれ培養期間の５日後に加えた。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は培養期間の７および１５日目に２回、同じ供与体からのＰＢＭＣ中の非−ＣＤ８接着細胞を用いて、ＭＡＲＴ−１ペプチドの存在下で再刺激した。拡大したＣＤ８^＋
Ｔ細胞はトリパンブルー染色により培養の２１日後にカウントした。以下の表Ｖにまとめる結果は、ｘＡＰＣが未処理、ＵＶＡＤＥＸ（商標）／ＵＶＡ−処理またはＵＶＡＤＥＸ（商標）／ＵＶＡに加えて凍結−解凍処理した時、刺激したＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖（すなわち増幅）を類似の率で示す。

ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞はＨＬＡ−Ａ２陽性供与体のＰＢＭＣから精製し、そしてＵＶＡＤＥＸ（商標）／ＵＶＡ−処理ｘＡＰＣまたは凍結−解凍処理し、そしてＵＶＡＤＥＸ（商標）／ＵＶＡ処理したｘＡＰＣと、３７℃で１０μｇ／ｍｌのＭＡＲＴ−１ペプチド（アミノ酸配列ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：９））の存在下で培養した。ヒトｒＩＬ−２（２０単位／ｍｌ）およびｒＩＬ−７（３０単位／ｍｌ）をそれぞれ５日にカルチャーに加えた。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は培養期間の７および１５日目に２回、同じ供与体からのＰＢＭＣ中の非−ＣＤ８接着細胞を用いて、ＭＡＲＴ−１ペプチドの存在下で再刺激した。増幅したＣＤ８^＋Ｔ細胞は、蛍光タンパク質に結合したＭＡＲＴ−１ペプチドに結合した４つのＭＨＣ分子からなるＭＡＲＴ−１四量体（ベックマンコールター）で染色し、そしてＦＡＣＳにより分析した。以下の表Ｖにまとめる結果は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と処理したｘＡＰＣとのインキュベーションが、試験したすべての供与体から、より高い割合のペプチド／ＭＨＣ四量体（ｐＭＨＣ）−陽性ＣＴＬを生じたことを示す。さらにナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡに加えて凍結−解凍処理したｘＡＰＣとのインキュベーションは試験した４つの供与体のうちの３つで、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理しただけのｘＡＰＣよりも高い割合のｐＭＨＣ四量体−陽性ＣＴＬを生じたことを示す（供与体１，２，および３）。

選択したペプチドを負荷した時、不活性化ｘＡＰＣがナイーブＴ細胞がＣＴＬになることを活性化する程度をさらに調査するために、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２陽性供与体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製し、そして３７℃で未処理のショウジョウバエｘＡＰＣ、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ−処理したショウジョウバエｘＡＰＣまたはＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理に加えて凍結−解凍処理したショウジョウバエｘＡＰＣと、１０μｇ／ｍｌのＭＡＲＴ−１ペプチド（ヒトＭＡＲＴ−１タンパク質のアミノ酸２７〜３５に対応する、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：９））の存在下で培養した。ヒト組換えインターロイキン（ｒＩＬ）−２（２０単位／ｍｌ）およびｒＩＬ−７（３０単位／ｍｌ）をそれぞれ培養期間の５日目に加えた。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は培養期間の７および１５日目に２回づつ、同じ供与体のＰＢＭＣからの非−ＣＤ８接着細胞を用いて、ＭＡＲＴ−１ペプチド（配列番号９）の存在下で再刺激した。培養したＣＤ８^＋Ｔ細胞は培養期間の２１日目に集め、そしてＣＴＬ活性を標準的な^５１Ｃｒ放出アッセイにより測定し、これは特異的な殺細胞の直接的尺度を提供する（すなわち細胞溶解活性）。

図７にまとめる結果はこれら４つの供与体の３つ（供与体１、３および４）からのＣＴＬが、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ−処理したｘＡＰＣまたはＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡに加えて凍結−解凍処理したｘＡＰＣのいずれかにより活性化された時、未処理ｘＡＰＣにより活性化されたＣＴＬより高い特異的な殺細胞（ｓｐｅｃｉｆｉｃｋｉｌｌｉｎｇ）％を表したことを示す。供与体２からのＣＴＬは、未処理ｘＡＰＣに比べてＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ−処理したｘＡＰＣにより活性化された時、より低い特異的殺細胞％を表したが、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡに加えて凍結−解凍処理したｘＡＰＣにより活性化された時、より高い特異的殺細胞％を表した。さらに４つの供与体の３つで（供与体１、２および３）、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡに加えて凍結−解凍処理したｘＡＰＣにより活性化されたＣＴＬは、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡだけで活性化されたＣＴＬよりも高い特異的殺細胞％を表した。

まとめると、これらの実験はソラレン／ＵＶＡまたはソラレン／ＵＶＡに加えて凍結−解凍処置のいずれかに供したｘＡＰＣは本質的に生育不能および非感染性とされ、そしてこれらの不活性化処置にかけられなかったｘＡＰＣが有する特性に比べて、本質的に均等または強化された外因性タンパク質発現、選択したペプチド負荷および提示、ならびにナイーブＴ細胞の活性化特性を有することを示した。

ソラレン／ＵＶＡ処理ｘＡＰＣで観察される強化されたＡＰＣ機能の分子学的基礎を調査するために、Ｋ^ｂ，Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１分子を発現するショウジョウバエｘＡＰＣに、ＯＶＡ８ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；配列番号：６９）を負荷し、そしてＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡを用いてまたは用いずに処理した。ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスまたはＭｙＤ８８ノックアウト（ＭｙＤ８８^−／−）マウスから精製し、そしてＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理または未処理のＯＶＡ８ペプチドを負荷したショウジョウバエｘＡＰＣと培養した。ＩＬ−２はｘＡＰＣ／ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞の共存培養の３日および５日目に加えた。共存培養物を共存培養期間の７日目に分割し、そして９日目に培養したＣＤ８^＋Ｔ細胞を集めた。ＯＶＡ８／ＭＨＣ四量体（ベックマンコールター）調製物を調製し、そして１０μｌを１ｘ１０^６ＣＤ８^＋Ｔ細胞細胞／１００μｌのＦＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡ，０．２％ＮａＮ_３、ＰＢＳ中）と混合した。Ｋ^ｂ／ＯＶＡ８四量体はＯＶＡ８ペプチドに結合した４つのＭＨＣ分子からなり、これは蛍光タンパク質に連結された。混合物を室温で３０分間インキュベーションし、そしてＰＢＳ中で洗浄し、次いで４００ｘｇにて５分間遠心して落とした。細胞ペレットをＦＡＣＳバッファー（５００μｌ）に再懸濁し、そして直ちにＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー機で４８６ｎｍ〜５８０ｎｍの励起波長、および５８６ｎｍ〜５９０ｎｍの発光波長で読んだ。結果は、非処理細胞のショウジョウバエｘＡＰＣにより活性化された時に染色されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合と比べて、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理したショウジョウバエｘＡＰＣで活性化された時に、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６））マウスから単離したより高い割合のＣＤ８^＋Ｔ細胞が、Ｋ^ｂ／ＯＶＡ四量体で染色されたことを示した（図８Ａ、レーン２対レーン１）。しかし非処理細胞のショウジョウバエｘＡＰＣにより活性化された時に染色されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合と比べて、ＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理したショウジョウバエｘＡＰＣで活性化された時に、Ｋ^ｂ／ＯＶＡ四量体で染色されたＭｙＤ８８ノックアウト（ＭｙＤ８８^−／−）マウスから単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合に増加はないことが観察された（図８Ｂ、レーン４対レーン３）。すなわち、Ｔ細胞がＵＶＡＤＥＸ／ＵＶＡ処理したｘＡＰＣとインキュベーションされた時に起こる観察される強化された活性化は、ＭｙＤ８８タンパク質の存在に依存すると結論づけられた。

実施例３：ヒト黒色腫抗原に向けられた細胞治療用の細胞傷害性Ｔリンパ球の調製
上記の実施例は、自己のナイーブＴ細胞をエクスビボで活性化するための方法で、選択したペプチドを負荷したｘＡＰＣの特性決定、不活性化およびその後の使用を記載する。生じた活性化Ｔ細胞は、標的細胞に対して選択した抗原特異的様式で細胞傷害性となる。この実施例では臨床的設定で、黒色腫患者を処置するための細胞治療計画で使用するために設計された好適なＣＴＬ治療生成物の調製を記載する。図９Ａ〜９ＦはｘＡＰＣおよびＣＴＬの特性決定法および製品の品質管理法を含め、この方法の工程を概略する流れ図を提供する。

ショウジョウバエｘＡＰＣの培養、誘導およびペプチド負荷
ショウジョウバエの細胞は２７℃で、１０％ウシ胎児血清およびＧ４１８（ジェネティシン）を補充したシュナイダーのショウジョウバエ培地で連続培養により成長させる。ショウジョウバエの細胞の連続培養物は１週間に２回分割し、そして新しい培地を１ｘ１０^６／ｍＬの細胞密度に調整するために加える。２または３日に、ショウジョウバエの細胞を１ｘ１０^６／ｍＬに分割し、そしてＧ４１８を含まない培地で成長させる。１または２日に、ショウジョウバエの細胞は、１ｍＭのＣｕＳＯ_４を加えることによりｘＡＰＣとなるように誘導され、そして０日にＨＬＡ−Ａ２，ＣＤ８０（Ｂ７．１），ＣＤ８６（Ｂ７．２），ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）およびＣＤ５８（ＬＦＡ−３）の発現をＦＡＣＳ分析により確認した後、ペプチドを負荷する。好ましくは＞８０％のｘＡＰＣが共刺激分子ＣＤ５４（ＩＣＡＭ１），ＣＤ５８（ＬＦＡ３），ＣＤ８０（Ｂ７．１），ＣＤ８６（Ｂ７．２）およびＨＬＡ−Ａ２．１（クラスＩ）をいかなる所定の時点でも発現する。細胞の使用はＨＬＡ−Ａ２．１または他のヒト分子の発現が＜３０％に下がった時に止める。

次いでショウジョウバエのｘＡＰＣおよび随伴するウイルスを、ソラレン／ＵＶＡ処方により上記のように不活性化する。ｘＡＰＣの不活性化および無菌性は、上記のようなありとあらゆるｘＡＰＣの特性決定法を行うことにより評価することができる。０日に、誘導され、不活性化されたショウジョウバエのｘＡＰＣ（１ｘ１０^７／ｍＬ）に以下の黒色腫関連ペプチドをペプチドあたり０．１μｇ／ｍＬで負荷する：ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号：５）；ＴＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号：６）；ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：９）；ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号：７）；ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号：７０）；およびＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（配列番号：８）。ペプチドの負荷は、５μｇ／ｍＬのベータ−２−ミクログロビンを補充したＨＹＱＳＦＸ昆虫培地中で室温にて最低４時間行う。次いでペプチドを負荷したショウジョウバエの細胞を、精製したＣＤ８^＋細胞と以下に記載するように混合する。

フェレーシスサンプルの回収および処理
個体から得た白血球を含んでなるリンパ球フェレーシス生成物を臨床現場の患者から集める。集めた後、リンパ球フェレーシス生成物および採血液（それぞれ自己の血漿に再懸濁された細胞の１つのガス透過性バッグ、そして血液の５つの１０ｍｌのレッドトップチューブ（ｒｅｄｔｏｐｔｕｂｅ））を、同日に周囲温度で温度データ自記計測器を含む標準的な血液輸送コンテナで輸送する。輸送は追跡され、そして翌日に受け取られる。リンパ球フェレーシス生成物は採取後、周囲温度で４８時間まで保持される。

血液のレッドトップチューブから熱不活性化血清調製物を生成するために、チューブをアルコールで拭き、そしてバイオセーフティキャビネットに移す。５ｍｌのピペットを用いて、液体画分を１５ｍｌのコニカル管に移し、そして１０分間、３，０００ｒｐｍ（１，８００ｘｇ）で遠心する。ついで上清（血清）を５０ｍｌのコニカル管に移し、赤血球細胞ペレットを捨て、そして上清を３０分間、５６℃の水浴でインキュベーションすることにより上清を熱不活性化する。次いで熱で不活性化した血清を１５ｍｌのコニカル管に等分し、そして４℃で保存する、この熱不活性化血清は、ＣＤ８細胞培養を開始するために使用する。

リンパ球フェレーシス生成物から集めた血漿から熱不活性化血清調製物を生成するために、リンパ球フェレーシス生成物の血漿部分に存在するクエン酸ナトリウムを中和するために十分な量のＣａＣｌ_２を決定する。この決定はリンパ球フェレーシス生成物から６つのポリスチレン管へ血漿の６つの１ｍｌアリコートを分配することにより作成される。１０，１５，２０，２５，３０，または３５μｌの滅菌１ＭＣａＣｌ_２を６つの各管に独立して加えるので、各管は１０，１５，２０，２５，３０，または３５ｍｌのＣａＣｌ_２を含む。管および残る血漿（これは５００ｍｌのナルジーンボトルに入れられている）を、３７℃の水浴に入れ、そして３０分間インキュベーションする。３７℃でのインキュベーション後の凝固が柔らかい場合、インキュベーションを室温でさらに１５分間延長して、完全な凝固を達成する。生成物の完全な凝固を生じるために必要な最少量のＣａＣｌ_２は、ナルジーンボトルに残る血漿の完全な凝固を生じるために必要なＣａＣｌ_２の最低濃度を決定するために使用する。ナルジーンボトルの血漿容量に加える時、この濃度に達するために十分なＣａＣｌ_２量を、ナルジーンボトルに加える。次いで６００ｍｌのトンスファーバッグからのチューブを、スクリュークランプで挟む。次いで血漿はバッグを血漿移動セット（チャーターメディカル：ＣｈａｒｔｅｒＭｅｄｉｃａｌ）で刺し、そして６０ｍｌのスリップ−チップシリンジを連結することにより６００ｍｌのとらに移す。シリンジに付けられたチューブは、血漿がバッグに移された後に締める。

再構成した血漿は、３７℃で３０分間、水浴中でインキュベーションされ、水浴の外側のバッグのチューブを残し、次いで凝固が収縮し始めるまで室温に置く。凝固した血漿バッグから血清をバッグに付いているチューブを使用して２つの２５０ｍｌボトルに排出する（ナルジーン：カタログ２０１９−２５０）。

熱−不活性化の前、２つの１．５ｍｌの血清サンプルを等分し、ウィートン（Ｗｈｅａｔｏｎ）管に入れ、そして−８０℃とする。２つの２５０ｍｌのナルジーンボトル中に残る血清は、それらを５６℃の水浴中で４０分間インキュベーションすることにより熱−不活性化する。熱−不活性化後、血清を５０ｍｌの滅菌遠心管に分配し、そして３，０００ｒｐｍ（１，８００ｘｇ）で１０分間遠心して不溶性物質をペレットとする。残る不溶性物質はそれらを０．４５μｍのフィルターで濾過することにより上清から取り出す。次いで濾液を１２５ｍｌの滅菌ボトル（ナルジーン：カタログｎｏ．２０１９−１２５）に分配し、そして−８０℃で保存する。不溶性ペレットを含む管は捨てる。

ＣＤ８^＋細胞の陽性選択および非−ＣＤ８細胞の単離
０日に、ＣＤ８^＋および非−ＣＤ８細胞を、アイソレックス３００ｉ磁気細胞選択システムを使用して、使い捨てのチュービングセット、抗−ＣＤ８モノクローナル抗体、イムノマグネティクビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ（商標）およびＣＤ８溶出ペプチド、ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ（配列番号：７１）を用いて単離する。ＣＤ８^＋細胞選択法は自動化され、そして以下の工程からなる：細胞濃縮および血小板洗浄；抗−ＣＤ８抗体とのインキュベーション；ヒツジ抗−マウス（ＳＡＭ）ＩｇＧに結合したＤｙｎａＢｅａｄｓ（商標）を使用したロゼット形成工程；ＣＤ８^＋細胞の捕捉；そして非−ＣＤ８^＋細胞の除去。

ＣＤ８^＋細胞の陽性選択法の細胞濃縮および血小板洗浄工程を行うために、２リットルのとらンスファーバッグ（フェンバル：カタログ番号４Ｒ２０４１）を得、これに約１７４０ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸塩洗浄バッファーを、血漿移動セット（チャーターメディカル）を用いてバッグを刺し、そして６０ｍｌのスリップ−チップシリンジにつなげることにより移す。移した後、管を閉じる。

アイソレックスの設定
アイソレックス３００ｉ磁気細胞選択システムの設定および試験手順は、個体の細胞が到着することが予想される最大１時間前に行う。アイソレックス３００ｉのメインスイッチを点け、そしてネクセル確認ソフトウェアバージョンスクリーン（ＮｅｘｅｌｌＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅＶｅｒｓｉｏｎＳｃｒｅｅｎ）が表示される前に、内部のセルフチェックが行われたことを確認する。「システムストップ確認（ＳｙｓｔｅｍＳｔｏｐＶｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」スクリーンが現れたら、「ストップ」ボタンを押し、次いで「デバイス状態」スクリーンからの重量規模および圧力値が記録される。システムの初期化を行うために、スクリーン上の使用説明にしたがってデバイス要素を消す。初期化試験が完了した後、細胞処理および品質管理ログに関する「デバイス状態」スクリーンから（「初期化後」）の重量規模および圧力値が記録される。「方法を選択する」スクリーン上で、「陽性選択のみ」を選択する。

アイソレックスのディスポーザブルセットのインストール
ディスポーザブルセットを含むトレイをパッケージングから取り出す。アイソレックス３００ｉディスポーザブルセットはポンプドアを開け、そして２つの連結している２０００ｍｌの廃棄バッグ（それぞれバッグＢおよびＣ）を装置の右側のホルダーに掛けることにより設置する。チュービングはディスプレイの下のスピナーハウジング上に下げる。１つの２０００ｍｌバッグ（バッグＡ）をベンチトップ上に配置する。紙テープをチャンバチュービングから取り出し、そしてチャンバーにロッカーモジュールを設置する。両方の再循環洗浄バッグ（ｎｏ．５）は濾過した洗浄バッグを前に配置してウェイトスケール５に掛ける。最終生成物バッグ（ｎｏ．４）をウェイトスケール４に掛ける。抗体バッグ（ｎｏ．３）をウェイトスケール３に掛ける。最後に放出剤バッグ（ｎｏ．２）をウェイトスケール２に掛ける。トレイに残るすべてのディスポーザブルセット部品をほどき、そしてトレイを取り出す。次いでスピニング膜アッセンブリーをスピナーモジュールに設置し、サポートアームが正しい位置にあることを確かめ、そしてスピニングデバイスを正しく密閉する。次いで各マニホールドの後ろの適切なチュービングの配置を確認し、上の２つのクランプマニホールドおよび下の３つのクランプマニホールドを正しい位置でロックし、そしてポンプオーガナイザーを正しい位置にはめる。オーガナイザー内のすべてのチュービングがポンプローラーの真ん中にあるか、またはポンプモジュールカバーの溝面にあることを確認する。次いでポンプドアを閉める。Ｐ１チュービングおよびスピニングデバイスのチュービングがドアに挟まれていないことを確認し、そして第２の磁石分離バッグはチュービングガイドを使用して第２磁石上に設定する。磁石ドアを閉める。

青い点を合わせ、流体検出器１および２のチュービングを設置し、そしてチュービングの配置を「デバイス状況」のスクリーンで確認する。ルーアーフィッティングを圧変換器１および２にしっかりと付ける。青い点を合わせ、次いでチュービングを流体検出器３に設置する。次いでチャンバーのチュービングを、ロッカーアームの底のロッカーチュービングガイドに設置する。バッファーバッグおよびウェイトスケール５のバッグチュービングを保持している紙テープを取り除き、そして細胞源バッグおよびバッファーバッグのチュービングをそれらが計器上のバッグのチュービングを妨害しないように下げる。バッグはそれらがウェイトスケール上に真っすぐ掛けられていることをチェックし、そしてディスポーザブルセットのチュービングは捩れやつまみについてチェックする。次に１つの２０００ｍｌバッグ（バッグＡ）に対するチュービング上のクランプを閉め；バッグＢおよびＣへのチュービングが開いていることを確認する。ディスポーザブルセットが正しくインストールされた後、「インストールセット」スクリーン上の「ＯＫ」を選択する。２０の試験が内部で行われて、正しいディスポーザブルセットの設定が確認される。

バッファー設定およびディスポーザブルセットの始動
ＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸バッファーバッグを、ディスポーザブルセットのバッファーラインスパイクに連結する。バッファーバッグを上向きに維持しながら、バッグを打ってラインにつながれた口から空気を排出する。１ｋｇの重量をウェイトスケール６に付け、そしてバッファーバッグに１ｋｇの重量を掛ける。合わせた重量は３２５０ｇ〜７０００ｇの間となる。「デバイス状態」スクリーンからウェイトスケールおよび圧力値が記録され、そして「ＯＫ」を選択する。そこでアイソレックス３００ｉ磁気細胞選択システムはディスポーザブルセットにバッファーを注入する。「デバイス状態」スクリーンから、ウェイトスケールおよび圧力値が始動設定が完了した後に記録される。アイソレックス３００ｉは患者の細胞を受け、そして加える準備ができるまで保持される。ディスポーザブルセットのインストールおよび始動は、患者の細胞が到着すると予想される１時間前までに開始されるので、細胞の処理は受領後に直ちに始めることができる。

患者のリンパ球フェレーシス物輸送バッグを受けた後、拭きとった輸送バッグの口を滅菌布および７０％イソプロピルアルコールで拭き、次いで清潔なバイオセイフティキャビネットに移す。スパイク−スパイク輸送ラインを使用して、バッグの内容物を５００ｍｌの滅菌ボトル（ナルジーン；カタログ番号２０１９−０５００）に移す。次いで細胞の１：５０希釈物は、０．０２ｍｌの細胞懸濁液を０．９８ｍｌの２％酢酸と混合することにより調製する。次いで細胞をカウントしてＰＢＭＣ細胞カウントを決定する。

リンパ球フェレーシス生成物の細胞カウント
５０ｍｌのピペットを使用して、血漿中に懸濁した細胞を５０ｍｌのコニカル遠心管（４５ｍｌ／管）に分配する。細胞を１０分間、１，０００ｒｐｍ（２００ｘｇ）でブレーキをかけずに遠心することによりペレットとする。ＰＢＭＣｓの数は細胞濃度に全容量を掛けることにより算出する。次いで血漿上清（４０ｍｌ／管）は、以下に記載する血漿処理で使用するために５００ｍｌの滅菌ボトル（ナルジーン；カタログ番号２０１９−０５００）にプールする。ペレットは５０ｍｌの管に残る血漿に再懸濁し、そして滅菌された２５０ｍｌのボトル（ナルジーン；カタログ番号２０１９−０２５０）にプールする。次いで容量を測定する。約１５０ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸を加え、そして総容量は全細胞数を新しい細胞容量で割ることにより算出する。

ＣＤ８^＋細胞の単離
表現型およびＣＤ８純度の試験は、蛍光標識したモノクローナル抗体での細胞表面の染色およびフローサイトメトリーによる分析で測定する。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターでの２色の分析を以下に掲げるモノクローナル抗体のパネルに従い行う。生成物の特性決定に関するマーカーには：ＣＤ３（Ｔリンパ球）、ＣＤ４（Ｔヘルパー細胞）、ＣＤ８（Ｔ細胞傷害性細胞）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ１６（ＮＫ細胞）およびＣＤ１５（顆粒球）。フローサイトメトリー試験に使用する細胞はＦＡＣＳバッファー（ＢＳＡおよびアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）で洗浄し、そして適切な蛍光標識したモノクローナル抗体と４℃で１５〜３０分間インキュベーションし、光を遮断する。インキュベーション後、染色された細胞を洗浄し、そしてＦＡＣＳバッファーに再懸濁する。染色された細胞は氷上に保存し、光を遮り、そして染色から２時間以内にフローサイトメトリーに流す。あるいはサンプルを２時間以内に分析できない場合、サンプルは０．５％パラホルムアルデヒド溶液（ＤＰＢＳ中）を使用してで固定し、そして最高１週間まで、暗中４℃で保存する。各サンプルについて全部で１０，０００のイベントを集める。データを分析し、そして各マーカーについて陽性の細胞の割合が報告される。

ＨＬＡタイピング／ＦＡＣＳ分析のために全部で１ｘ１０^８細胞をピペットで滅菌された５０ｍｌのコニカル管に入れる。細胞濃度（細胞／ｍｌ）を管に記録する。約６ｘ１０^７細胞を滅菌した１５ｍｌの管に取り分けて、患者のリンパ球を保管するために凍結する。細胞を遠心し、そして非−ＣＤ８細胞を凍結すると同時に凍結する（非−ＣＤ８細胞の単離および処理には以下を参照のこと）。ＣＤ８^＋細胞のアイソレックス３００ｉ−媒介陽性選択の前に、ＦＡＣＳ分析用に約１ｘ１０^７細胞を滅菌した１５ｍｌの管に取り分ける。

試薬をアイソレックス３００ｉに加え、そしてデータを以下の工程に従い記録し、そして患者の細胞が遠心している間に加えることができる。いったん「放出剤を加える」スクリーンが現れたら、バッグ２の隔壁（ｓｅｐｔｕｍ）を滅菌アルコール布で拭く。針およびシリンジを使用して２０ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸バッファーをバッグ２に加える。放出剤がＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸バッファーと置き換えられ、次いで「ＯＫ」を押す。いったん「抗体を加える」スクリーンが現れたら、バッグ３の隔壁を滅菌アルコール布で拭く。抗−ＣＤ８モノクローナル抗体３７Ｂ１Ａ溶液は、０．２００ｍｌの３７Ｂ１Ａストックを１０ｍｇ／ｍｌで２．３０ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸と混合することにより調製する。針およびシリンジを使用して、希釈した３７Ｂ１Ａ抗−ＣＤ８ｍＡｂをバッグ３に加え、そして「ＯＫ」を押す。いったん「ビーズを加える」スクリーンが現れたら、チャンバーの隔壁を滅菌アルコール布で拭く。磁気ビーズ（ネクセル（Ｎｅｘｅｌｌ）４Ｒ９９５０または等価物）は、１バイアル（１０ｍｌ）の内容物を５０ｍｌの管に移し、そして１０ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸塩を加えることにより洗浄される。ビーズは管を磁石上に置くことによりＭＰＣ−１磁石上で２分間で分離される。上清をピペットで除去すると同時に、ビーズは管の側面に引き寄せられる。ビーズの管を磁石から取り出し、そしてビーズは気泡の発生を回避するように１０ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸塩に穏やかに再懸濁する。針および２０ｍｌのシリンジを使用して、ビーズをチャンバーに加え、次いで「ＯＫ」を押す。

次いで３００ｍＬの移動パック容器（ＴｒａｎｓｆｅｒＰａｃｋｃｏｎｔａｉｎｅｒ）（バクスター−フェンバル；カタログ番号４Ｒ２０１４）のチュービングを密閉する。バイオセイフティキャビネット中で、２５０ｍＬボトルからの細胞懸濁液を３００ｍＬの移動パックに、血液成分注入セット（ＢｌｏｏｄＩｎｆｕｓｉｏｎＳｅｔ）に連結された６０ｍｌのシリンジ（プランジャーを外す）を使用して移す。次いでこの注入セットのチュービングを密閉する。次いで細胞懸濁液は、移動パック容器からディスポーザブルセット（ネクセル：カタログ番号４Ｒ９８５０）に含まれる１０００ｍｌのアイソレックス３００ｉバッグに、細胞の凝集塊を排除するためにスパイク（ｓｐｉｋｅ）およびイン−ライン血液フィルターを使用して移す。次いで細胞懸濁液を含有するバッグのチュービングを密閉する。

ＣＤ８^＋細胞の選択
アイソレックス３００ｉ細胞バッグは、アイソレックスディスポーザブルセットでのスパイクを使用することにより連結し、そしてウェイトスケール番号１に掛け、そして細胞プロセッサー上の「デバイス状態」スクリーンのウェイトスケールおよび圧力値を記録する。「ＯＫ」を押し、そして廃棄バッグＡ（非−ＣＤ８回収バッグ）のクランプが閉じていることを確認する。廃棄バッグＢおよびＣのクランプは、陽性選択の順番が始まる前に開ける。アイソレックスは細胞を抗−ＣＤ８ｍＡｂ（３７Ｂ１Ａ）とインキュベーションする前に、１５分間、血小板を除去する洗浄を進める。血小板の洗浄が完了した後、そして抗体のインキュベーション中に、細胞バッグの重量（ウェイトスケール番号５）が記録される。抗体とのインキュベーション後、アイソレックスは過剰な抗体の洗浄を進め、次いで細胞を磁気ビーズ含有チャンバーに移し、ここで３０分の混合が起こってリセットを生じる。細胞のロゼット形成中（アイソレックスがすべてのチュービングをすすぎ終わった後）、廃棄バッグＡのクランプが開き、そして廃棄バッグＢおよびＣのクランプが閉じる。チャンバー容量はリセット中に記録される。ロゼット形成が完了した後、ロゼットをチャンバーの側面に対して磁気的に集め、そして非−ＣＤ８細胞を廃棄バッグＡに排出する。アイソレックスシステムはロゼットを３回、約１００ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸バッファーで洗浄するように進行する。第３および最終洗浄後、アイソレックスキーパッドの「停止」停止を押し、そしてチャンバーを密閉する。ロゼット形成したＣＤ８^＋細胞を含有するチャンバーをアイソレックス機から取り出す。次いでチャンバーおよびチュービングに滅菌アルコールを噴霧し、そしてバイオセイフティキャビネット（例えばフード）中に置き、そして１５ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸を、滅菌アルコール布で清浄化したチャンバー隔壁を通して加える。次いでチャンバーはロゼットを再懸濁するために前後に傾け、そして懸濁液を５０ｍｌの管に１６ゲージの針を付けた３０ｍｌのシリンジを使用して移す。この移動は２回繰り返し、そして移した懸濁液をプールする。次いでロゼットはＭＰＣ−１磁石上で５分間分離し、そして上清を捨てる。

ＣＤ８溶出ペプチドを用いたＣＤ８^＋細胞の溶出
洗浄したロゼットは６ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸塩に再懸濁し、そして１５ｍｌの滅菌コニカル管に移し、これに０．９ｍｌのＣＤ８溶出ペプチド（ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ；配列番号：７１）を１０．０ｍｇ／ｍｌ（最終ペプチド濃度：１．５ｍｇ／ｍｌ）で加える。ロゼット／ペプチド溶液を３７℃で３０分間、ダイナル（Ｄｙｎａｌ）ミキサーで２０ｒｐｍで回転することによりインキュベーションする。インキュベーションした溶液は５ｍｌのピペットを用いて激しく混合する。ピペットは２回、２ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸塩ですすぎ、そしてすすいだ容量を１５ｍｌ管に加える。ビーズはＭＰＣ−６磁石上で３分間、細胞から分離し、そしてＣＤ８^＋細胞を含む上清を５０ｍｌのコニカル管に集める。ビーズを３回、１０ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸塩で洗浄し、そして磁石上での分離工程を繰り返す。放出されたＣＤ８^＋細胞を含む上清を、最初の上清と一緒にプールする。散らばったビーズは、ＭＰＣ−１磁石上で５分間分離することによりプールした細胞懸濁液から除去する。プールした上清は５０ｍｌのコニカル管に移し、そしてその容量を測定する。トリパンブルーで１：２０に希釈した後（２０μｌの細胞懸濁液＋３８０μｌのトリパンブルー）、細胞（生きている、および死んだ）を血球計によりカウントする。パーセントで算出される全細胞（染色された、および染色されない細胞）に対してに生きている細胞（トリパンブルーで染色されない）の比を細胞の生育能と定める。約４．０ｘ１０^７はＦＡＣＳ分析、細胞の特性決定およびウイルス試験により即座に試験するために取り出される細胞であり、２つの滅菌された１５ｍｌのコニカル管に等しく分割される。残るＣＤ８^＋は７分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で遠心することによりペレットとする。上清は２５ｍｌのピペットで吸引し、そして１分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で遠心して細胞をペレットとする。過剰な上清は細い先端のピペットを使用して除去する。細胞ペレットは１４ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸塩で再懸濁し、１５ｍｌの滅菌コニカル管に移し、そして再度７分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で遠心する。次いで上清を再度、１０ｍｌのピペットで吸引し、１分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で再遠心して細胞をペレットとし、そして過剰な上清は細い先端のピペットを使用して除去する。次いで細胞ペレットはＴ７５フラスコに３．３ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で、上記のように調製した１０％の熱不活性化された自己血清（ＨＩＡＳ）を補充した完全ＲＰＭＩ培地を使用して再懸濁する。細胞サンプルのＦＡＣＳ分析を行い、そして結果を記録する。

非−ＣＤ８細胞の回収
上記のようにロゼットの洗浄が完了した後、廃棄バッグＡを密閉し、滅菌アルコールで拭き、そしてバイオセイフティキャビネット（例えばフード）内に移す。廃棄バッグは滅菌スパイクおよびスパイクコネクターで叩き、そして細胞懸濁液は予め重量を測定した滅菌５００ｍｌボトル（ナルジーン；カタログ番号２０１９−０５００）に集める。集めた後、ボトルの重量を再測定して、１ｇ＝１ｍｌの見積りに基づき非−ＣＤ８細胞懸濁液の容量を予想する。次いで残るアイソレックスセットのッバッグおよびチュービングは捨てる。次いでＤＰＢＳを加えて非−ｃＣＤ８細胞懸濁液の容量を４８０ｍｌとし、そして混合する。非−ＣＤ８細胞懸濁液の容量がＤＰＢＳを加える前に４８０ｍｌより多くなった場合は、以下を参照にされたい。

非−ＣＤ８細胞の分離および回収
非−ＣＤ８細胞を分離するために、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ（ファルマシア：Ｐｈａｒｍａｃｉａ：カタログ番号１７−１４４０−０３）を１６本の各５０ｍｌ遠心管にピペットで入れる。上記のように集めた非−ＣＤ８細胞懸濁液の容量が４８０ｍｌより多い場合、各５０ｍｌの遠心管に入れる容量を算出するために非−ＣＤ８懸濁液の容量を１６で割る。約３０ｍｌ（または上記の総容量の１／１６）の非−ＣＤ８細胞懸濁液を慎重にＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳの上に重層する。管を遠心バケットに配置し、バケットに水を加えることにより慎重にバランスを取る。バランスを取ったバケットは２，０００ｒｐｍ（８００ｘｇ）で２０分間、ブレーキをかけずに室温で遠心する。１０ｍｌピペットで非−ＣＤ８細胞をＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ層（例えば、１３と１５ｍｌ／界面の間）の上から集め、そして物質を１２本の５０ｍｌコニカル管に移す（管あたり最大で約２０ｍｌの細胞懸濁液）。各管に５０ｍｌのＤＰＢＳを満たす。次いで管を１０分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）でブレーキをかけて遠心する。次いで上清を吸引し、そして捨て、細胞ペレットを全部で２００ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸バッファーに再懸濁し、そして再懸濁した細胞を４ｘ５０ｍｌの滅菌管に移し、そして７分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で遠心する。上清を再度吸引し、そして捨てる。次いで細胞ペレットを５０ｍｌのＤＰＢＳ／ＨＳＡ／クエン酸バッファーに再懸濁し、そして均一化する。均一物は細胞凝集塊を除くために滅菌されたＦａｌｃｏｎ２３５０細胞濾過器に通す。

細胞サンプルの調製
上記のように調製した非−ＣＤ８細胞均一物は、残る赤血球細胞を溶解するために２％酢酸で１：１００の比に希釈する（１０μｌの細胞懸濁液＋９９０μｌの酢酸）。次いで細胞を血球計でカウントする。ＦＡＣＳ分析用には約２ｘ１０^６細胞。分析は２時間以内に行うか、または固定する。細胞サンプルについていったんＦＡＣＳ分析をおこなったら、データを記録する。残る非−ＣＤ８細胞は７分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で遠心することによりペレットとし、上清を吸引し、そしてペレットを１ｘ１０^８細胞／ｍｌの密度に凍結媒質で再懸濁し、これは５％ＤＭＳＯ、４７％Ｐｅｎｔａｓｐａｎおよび４８％熱−不活性化自己血清（上記のように調製する）である。温度調節（ｐｒｏｂｅ）として使用するのために約２ｍｌの余分な凍結媒質を調製する。次いで凍結媒質を使用できるようになるまで氷上に置く。次いで細胞懸濁液をヌンク（Ｎｕｎｃ）凍結バイアルに約１．０ｍｌのアリコートで入れ（約１０バイアル相当）、そして残る細胞を４．０ｍｌのアリコートに分配する。１．０ｍｌの凍結媒質を含有する余分なバイアルを、凍結系の温度調節として使用するために調製する。温度調製バイアルを含むすべてのバイアルを氷上に配置する。上記のように取り分けた６ｘ１０^７のリンパ球は７分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で遠心することによりペレットとし、そして上清を吸引する。次いで細胞ペレットを６ｍｌの凍結媒質に再懸濁する。ヌンク凍結バイアルはプロトコール番号および患者情報で標識し、そして細胞懸濁液をバイアルに約１．０ｍｌのアリコートで分配する（約６バイアル相当）。次いでバイアルを氷上に置く。

ショウジョウバエｘＡＰＣを用いたＣＤ８^＋細胞の初回刺激
ＣＤ８^＋細胞の刺激は、上記ＣＤ８^＋細胞の選択法が完了した後、直ちに行う。上記のように調製したＣＤ８^＋細胞懸濁液は、Ｌ−グルタミン、非−必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびＨＥＰＥＳ溶液を補充し、１０％自己血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中の３．３ｘ１０^６細胞／ｍｌを、上記のように調製し、そしてペプチドを負荷したペプチド負荷ショウジョウバエｘＡＰＣの懸濁液と、ｘＡＰＣ１対ＣＤ８^＋細胞１０の比で混合する。これは３．０ｍｌのＣＤ８^＋細胞懸濁液あたり約０．１ｍｌのｘＡＰＣ懸濁液に相当する（１：３０の希釈率）。次いで必要なフラスコ数を、ｘＡＰＣ−ＣＤ８^＋細胞混合懸濁液の容量を（ｍｌで）１５ｍｌで割ることにより決定する。色でコード化したラベルをＴ７５フラスコ（コースター（Ｃｏｓｔａｒ）３３７６）に張り付け、そして患者番号、日付および容量を明記する。次いでｘＡＰＣおよびＣＤ８^＋細胞を含有するｘＡＰＣ−ＣＤ８^＋細胞混合懸濁液は旋回により均一化し、そして均一物をフラスコに等しく分配する。１５ｍｌ未満の細胞懸濁液は各フラスコに加えない。次いでフラスコを、特定用途の加湿され、５％ＣＯ_２を含む３７℃のインキュベーターに上向きで設置し、４日間インキュベーションする。

この方法の４日目に、細胞のカルチャーをガンマＩＦＮ照射のためにサンプルとして採取し、そしてＩＬ−２およびＩＬ−７をそれぞれ２０ＩＵ／ｍｌおよび３０Ｕ／ｍｌの最終濃度で加える。最初に３ｍｌの細胞上清が３つのフラスコから取り出され（全部で０．９ｍｌ）、そしてエッペンドルフ管に入れられる。エッペンドルフ管を２分間、ミクロ遠心で遠心する。上清を新しいエッペンドルフ管に移し、そして−８０℃で保存する。次いで必要な各サイトカインストックの量を算出する：サイトカインを１：１，０００のストックの濃度に希釈し、そして適切な容量のこの希釈したストックを、血清を含まないＲＰＭＩ中の細胞に加える（０．５ｍｌ／フラスコ）。いったん計算が完了したら、サイトカインのストックを−８０℃のフリーザーから取り出し、そして３７℃で急速に解凍する。サイトカインはいったん解凍したら氷上に保持し、そして最初の解凍から２時間以内に使用する。残るサイトカイン管は−８０℃に置く。サイトカインは１回の凍結／解凍サイクル後には捨てる。培地で希釈したサイトカインは各フラスコに分配し、そして各フラスコをインキュベーターに戻す。

感作したＣＤ^＋８細胞の非−ＣＤ８接着細胞での最初の再刺激
エフェクター細胞であるペプチドを負荷したｘＡＰＣ感作ＣＤ８^＋細胞は、ペプチドを負荷した接着細胞（非−ＣＤ８細胞）で６または７日に１〜２の接着細胞対１０のエフェクター細胞の比率で再刺激する。最初に細胞を工程の６日目の再刺激のためにプールする。エフェクター細胞のＴ７５フラスコをインキュベーターから取り出し、そして目で、そして顕微鏡で混入の可能性を確認する。混入が確認されたフラスコは、細胞を再刺激のためにプールする前に捨てる。非混入のエフェクター細胞は、通気キャップを付けたＴ２２５フラスコにピペットで入れ、そして細胞はそれらを１：４にトリパンブルー（５０μｌの細胞サンプル＋１５０μｌのトリパンブルー）に希釈した後に血球計でカウントする。マイコプラズマ試験に使用する約１５ｘ１０^６のエフェクター細胞に等価の細胞懸濁液容量（２８日間の培養法：以下に記載する）。残る細胞を含有するフラスコは、さらなる工程が準備されるまでインキュベーターに上向で戻される。

再刺激のための感作したエフェクター細胞の調製
最高４ｘ１０^８のＣＤ８^＋感作エフェクター細胞を再刺激する。２ｘ１０^６細胞／ｍｌで再刺激するために、必要な感作されたエフェクター細胞の容量を算出する。算出された細胞懸濁液容量は、接着細胞を含むどのくらいのＴ７５フラスコが再刺激法に調製されるべきかを確認するために、１５ｍｌ〜１８ｍｌのアリコートを表す１５〜１８により割る。ＣＤ８^＋感作エフェクター細胞は、以下に記載するように接着または接着細胞に関するペプチド−パルス法のいずれかの最中に回収する。余分なエフェクター細胞懸濁液は、さらなる使用のために１，７００ｒｐｍで７分間遠心し、上清を除き、そして細胞ペレットを１ｘ１０^８細胞／ｍｌの濃度に凍結溶液（１０％ＤＭＳＯおよび５％ＨＡＳを含有するＤＰＢＳ、これは細胞ペレットに加える前に氷上で予め冷却する）で再懸濁することに凍結することができる。いったん細胞を前冷却した凍結溶液に再懸濁すれば、再懸濁液を適切な数の凍結バイアルに分け、次いで凍結バイアルは前もって４℃に冷却したストラットクーラークリオプリザベーションモジュール（ＳｔｒａｔＣｏｏｌｅｒＣｒｙｏＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎＭｏｄｕｌｅ）に配置する。次いでストラットクーラークリオプリザベーションモジュールを−８０℃のフリーザーに移し、そして一晩置く。翌日、バイアルを−１４０℃のフリーザーに移す。

再刺激のためのＣＤ^１４＋非−ＣＤ８細胞の調製
再刺激法に必要なＣＤ１４^＋非−ＣＤ８細胞の数の範囲は、約１〜２のＣＤ１４^＋非−ＣＤ８細胞対１０のＣＤ８^＋感作エフェクター細胞となるように、再刺激するためのＣＤ８^＋感作エフェクター細胞の数に０．１および０．２を掛けることにより決定する。次いで解凍する非−ＣＤ８細胞の数の範囲は、上記のフローサイトメトリーにより決定される非ＣＤ８画分中に存在するＣＤ１４^＋非−ＣＤ８細胞の割合により、必要とされる両ＣＤ１４^＋非−ＣＤ８細胞数で割ることにより算出される。この数はほぼ１ｘ１０^８個の細胞に近くなる。事前に１ｘ１０^８細胞／バイアル（上記参照）で凍結した自己の非−ＣＤ８細胞を３７℃の水浴中で素早く解凍する。解凍した細胞は最高５個のバイアルを５０ｍｌのコニカル管に移し、そして凍結細胞１ｍｌあたり９．０ｍｌの完全ＲＰＭＩをゆっくりと加えることにより洗浄する。１つの管から２０μｌの細胞懸濁液サンプルを１８０μｌのトリパンブルーで希釈し（すなわち１：１０希釈）、そして生育可能な細胞のカウントを測定する。次いで生育可能な解凍した非−ＣＤ８細胞の総数は、解凍した非−ＣＤ８細胞懸濁液の全容量に、２０μｌのサンプルについて測定された細胞カウントを掛けることにより決定する。回収割合も、生育可能な細胞数を解凍した細胞の理論的数で割ることにより決定する。この回収％は以下に記載する後の再刺激および非特異的増幅法で使用する。回収した生育可能な非−ＣＤ８細胞数は、上記に定めたように必要な非−ＣＤ８細胞の範囲内にあることを確認する。必要ならば、さらに非−ＣＤ８細胞のバイアルを解凍し、そしてこの必要量を達成するためにカウントする。細胞懸濁液は滅菌した５０ｍｌのコニカル管に移し、そして７分間、１，５００ｒｐｍ（４５０ｘｇ）で遠心することによりペレットとする。上清を吸引し、そして捨てる。１０％熱不活性化自己血清（ＨＩＡＳ）およびβ２ミクログロブリンを５．０μｇ／ｍｌ（１．０ｍｇ／ｍｌストックの１：２００希釈）で補充した完全ＲＰＭＩの容量（再刺激されるＣＤ８^＋エフェクター細胞のフラスコあたり３．５ｍｌを加えることで十分であり、それに余分な１．０〜１．５ｍｌを加えた）を調製する。非−ＣＤ８細胞ペレットをこの培地に再懸濁し、そして１つの滅菌された５０ｍｌのコニカル管にプールする。非−ＣＤ８細胞懸濁液を含有する５０ｍｌのコニカル管をジップ−ロックバッグに入れ、そして５，０００ラドでガンマ−照射する。照射後、非−ＣＤ８細胞をバイオセイフティキャビネットに戻す。

非−ＣＤ８細胞の黒色腫ペプチドとの接着および負荷
ＣＤ８^＋細胞の初回刺激に使用する黒色腫ペプチドを、照射した細胞に３０μｇ／ｍｌの最終濃度（１０．０ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ中のストックの１：３３３希釈）で加える。細胞懸濁液−ペプチド混合物（３．５ｍｌ／フラスコ）を次いで通気キャップを付けたＴ７５フラスコ（コースター３３７６）に分配し、そして接着細胞がプラスチック面に付くように、上向きで２時間、３７℃で５％ＣＯ_２中にてインキュベーションする。

非−接着細胞は、上清を５．０ｍｌのピペットを用いて接着細胞層に対して穏やかにピペッティングすることにより除き、そして除いた細胞は捨てる。

残る接着細胞は、５ｍｌのＤＰＢＳを各フラスコにピペットで入れ、次いで捨てることにより洗浄する。フラスコあたり３．５ｍｌの接着細胞を送達するために十分である、１％ＨＳＡ（２５％のストックで１：２５希釈）、５．０μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリン（１．０ｍｇ／ｍｌのストックで１：２００希釈）および３０．０μｇ／ｍｌの黒色腫ペプチド組み合わせ混合物（１０．０ｍｇ／ｍｌのストックで１：３３３希釈）を補充したライボビッツのＬ１５培地を調製する。次いで各フラスコに３．５ｍｌの培地を加え、そしてフラスコをバイオセイフティキャビネット中、上向きで９０分間、室温でインキュベーションする。

感作したＣＤ８^＋エフェクター細胞と接着ペプチド負荷非−ＣＤ８細胞とのインキュベーション
上記のように調製した初回刺激ＣＤ８^＋エフェクター細胞は、最初にＴ２２５フラスコ中に残るＣＤ８^＋エフェクター細胞を２．０ｘ１０^６細胞／ｍｌに調整するために必要な総容量を算出することにより、非−ＣＤ８^＋接着細胞による再刺激のために回収される。次いでＣＤ８^＋エフェクター細胞を含有するＴ２２５フラスコがインキュベーターから取り出され、そしてバイオセイフティキャビネット（例えばフード）中に配置される。ピペットを用いて、Ｔ２２５フラスコ中にプールした細胞から、２．０ｘ１０^６細胞／ｍｌに調整される総容量の１／３を残すために、十分な細胞懸濁液を除去する。残りの細胞懸濁液を適切な数の５０ｍｌのコニカル遠心管に入れる。５０ｍｌのコニカル管中の細胞懸濁液は７分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で遠心し、そして上清をピペットで取り出す。コンディショニングされた培地であるこの上清は、以下に記載するマイコプラズマ試験のために保持する。余分なエフェクター細胞懸濁液は、１，７００ｒｐｍで７分間、遠心し、上清を除き、細胞ペレットを凍結溶液（１０％ＤＭＳＯおよび５％ＨＳＡを含有するＤＰＢＳ、これは細胞ペレットに加える前に氷上で予め冷却した）中で１ｘ１０^８細胞／ｍｌの濃度に再懸濁することによりさらなる使用のために凍結することができる。いったん細胞が前冷却された凍結溶液で再懸濁されれば、再懸濁物を適切な数の凍結バイアルに等分し、次いで凍結バイアルを４℃に前冷却したストラットクーラークリオプリザベーションモジュール（ＳｔｒａｔＣｏｏｌｅｒＣｒｙｏＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎＭｏｄｕｌｅ）に配置する。次いでストラットクーラークリオプリザベーションモジュールを−８０℃のフリーザーに移し、そして一晩置く。翌日、バイアルを−１４０℃のフリーザーに移す。

最終容量の２／３に等しい培地容量を使用して、ペレット化したエフェクター細胞を、１０％ＨＩＡＳ、ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌで、そしてＩＬ−７を３０Ｕ／ｍｌで補充した新しい完全１０％ＲＰＭＩに再懸濁し、そしてＴ２２５フラスコのコンディショニングした培地に残した細胞に加える。ペプチドを適用した自己接着細胞を覆ったＴ７５フラスコからの培地をバイオセイフティキャビネット（例えばフード）中で吸引する。次いでエフェクター細胞懸濁液を、上で算出したように１５〜１８ｍｌ／フラスコで被覆したフラスコにピペットで入れる。次いでフラスコをインキュベーターに戻し、そして３７℃、５％ＣＯ_２で、ｘＡＰＣ刺激がそれぞれ水曜日または木曜日に行われたかどうかにより、３〜４日インキュベーションする。

上記のようにマイコプラズマ試験のために取り分けたサンプルを、次いで最初にマイコプラズマ試験サンプルを０．５ｘ１０^６細胞／ｍｌ（３０ｍｌの最終容量）に、マイコプラズマ試験用に取っておいたコンディショコニングした培地である上清を戻すことにより調整する。次いで混合物をそれぞれ、２つは２ｍｌのアリコートそして１つは２６ｍｌに分ける。各アリコートをドライアイス／イソプロパノールもしくは液体窒素のいずれかに置くにとより凍結し、Ｐａｒａｆｉｌｍ（商標）で密閉し、ジップ−ロックバッグに入れ、そしてマイコプラズマ試験のためにバイオリライアンスへ送るまでドライアイス上で−８０℃で保存する。

最初の再刺激後、エフェクター細胞の細胞密度調整および培地交換
細胞密度調整および培地交換は、細胞治療生成物法の９±１および１２±１日に行う。これらの調整および培地交換を行う手順は、各日とも同じであり、そして以下に提示する。最初に接着細胞を被覆した、エフェクター細胞を含有するＴ７５フラスコをインキュベーターから取り出し、そして１つのフラスコから細胞をカウントして、トリパンブルーによる１／４希釈を調製することにより生育可能な細胞カウントを測定する（５０μｌの細胞サンプル＋１５０μｌのトリパンブルー）。得られた生育可能な細胞のカウントから、細胞密度を２ｘ１０^６細胞／ｍｌに調整するために必要な総容量を算出する。ピペットで十分な細胞懸濁液を取り出してフラスコに総容量の１／３を残す。取り出した懸濁液は１５ｍｌのコニカル遠心管に配置し（Ｔ７５フラスコあたり１管）、７分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で遠心し、そして上清を取り出す。次いで細胞ペレットは、１０％自己血清およびサイトカインを補充した総容量の２／３に相当する新しい完全ＲＰＭＩに再懸濁する。次いで再懸濁した細胞はＴ７５フラスコ中のコンディショニングした培地に残した細胞に加え戻す。次いでＴ７５フラスコをインキュベーターに戻し、そして３７℃で５％ＣＯ_２で３日間インキュベーションする。

感作したＣＤ８^＋エフェクター細胞の接着ペプチド負荷非−ＣＤ８細胞での２回目の再刺激
非−ＣＤ８接着細胞で１回目の再刺激を受けた感作ＣＤ８^＋エフェクター細胞を、細胞治療物生産法の１５±１日の２回目の再刺激のために調製する。２回目のエフェクター細胞の再刺激のための非−ＣＤ８接着細胞のカウント、調製、照射、接着および黒色腫ペプチド負荷に関する手順は、上記の１回目の再刺激について記載した手順と同じである。ＣＤ８^＋エフェクター細胞の回収は、細胞の接着インキュベーション中に回収されなかったならば、９０分間のペプチド負荷インキュベーション期間に行う。ＣＤ８＋プールしたエフェクター細胞のＴ２２５フラスコをインキュベーターから取り出し、そしてバイオセイフティキャビネット（例えばフード）中に置く。ピペットで最高５ｘ１０^８細胞に等しい容量の細胞懸濁液をプールした細胞からに取り出す。取り出した容量を適切な量の５０ｍｌコニカル遠心管に入れる。管中の細胞懸濁液を７分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で遠心し、そして上清を取り出し、捨てる。次にペレット化したエフェクター細胞を新しい完全ＲＰＭＩ中（１０％ＨＩＡＳ、ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌで、およびＩＬ−７を３０Ｕ／ｍｌで補充した）で２．０ｘ１０^６細胞／ｍｌに再懸濁するために必要とされる全容量。余分な細胞は溶液を１回目の再刺激法で上に記載したように凍結溶液中で凍結する。ペプチド負荷自己接着細胞で被覆したＴ７５フラスコからの培地を、バイオセイフティキャビネット（例えばフード）中で吸引する。エフェクター細胞の再懸濁液は、フラスコあたり１５ｍｌ〜１８ｍｌでＴ７５フラスコにピペットで入れる。次いでＴ７５フラスコはインキュベーターに戻し、そして２日間、３７℃で５％ＣＯ_２でインキュベーションする。

２回目の再刺激後、エフェクター細胞の細胞密度調整および培地交換
細胞密度調整および培地交換は、細胞治療物生産法の１７±１および２０±１日に行う。１７±１日の細胞密度調整および培地交換は、接着細胞を被覆した、エフェクター細胞を含有するＴ７５フラスコをインキュベーターから取り出し、そして１つのフラスコから細胞をカウントして、トリパンブルーによる１：４希釈を調製することにより生育可能な細胞カウントを測定する（５０μｌの細胞サンプル＋１５０μｌのトリパンブルー）。得られた生育可能な細胞のカウントから、細胞密度を１．５ｘ１０^６細胞／ｍｌに調整するために必要な総容量を算出する。ピペットでフラスコに総容量の１／３を残すのに十分な細胞懸濁液を取り出す。取り出した懸濁液は１５ｍｌのコニカル遠心管に入れ（Ｔ７５フラスコあたり１管）、７分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で遠心し、そして上清を取り出す。次いで細胞ペレットは、１０％自己血清およびサイトカインを補充した総容量の２／３に相当する新しい完全ＲＰＭＩに再懸濁する。次いで再懸濁した細胞はＴ７５フラスコ中のコンディショニングした培地に残した細胞に加え戻す。次いでＴ７５フラスコをインキュベーターに戻し、そして３７℃にて５％ＣＯ_２で３日間インキュベーションする。２０±１日の細胞密度調整および培地交換手順は、細胞密度を調整するために必な総容量が、１．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの代わりに２ｘ１０^６細胞／ｍｌの最終細胞密度になるように算出されることを除き、１７±１日に使用した手順と同一である。

ＯＫＴ３刺激による非−特異的ＣＤ８^＋エフェクター細胞の増幅
細胞治療物生産法の２１±１日（非−特異的細胞増幅の１日前）に、４つのＴ２２５フラスコはＤＰＢＳ中で４．０μｇ／ｍｌに希釈された３０ｍｌのＯＫＴ３ｍＡｂ（３０ｍｌのＤＰＢＳ中に１．０ｍｇ／ｍｌの１２０μｌのＯＫＴ３滅菌溶液ストック）を各フラスコに加えることによりＯＫＴ３で被覆する。次いでフラスコの通気孔をＰａｒａｆｉｌｍで密閉し、そして水平にして一晩、４℃で保存する。各Ｔ２２５フラスコは全部で８〜１０ｘ１０^７のエフェクター細胞の刺激に使用する。

翌日（２２±１日）、ＣＤ８^＋エフェクター細胞をＯＫＴ３ｍＡｂでの刺激のために調製する。ＣＤ８^＋エフェクター細胞を含有するフラスコをインキュベーターから取り出し、そして視覚および顕微鏡で混入の可能性を調べる。混入が確認されたフラスコは捨てる。非混入細胞を滅菌された５００ｍｌの滅菌ナルジーンボトルにプールし、そしてトリパンブルーによる１：４希釈後にカウントする（５０μｌの細胞サンプル＋１５０μｌのトリパンブルー）。次いで生育可能な細胞カウントを測定する。約５〜１０ｘ１０^６の生育可能な細胞は四量体の染色に取り分け、そして別の４０〜６０ｘ１０^６の生育可能な細胞をショウジョウバエのウイルス試験のために取り分ける。ＯＫＴ３での刺激のために集めたエフェクター細胞懸濁液の容量は、抗−ＣＤ３抗体を被覆したフラスコの数、および８〜１０ｘ１０^７のエフェクター細胞がＯＫＴ３−被覆フラスコあたりの標的とする生育可能な細胞のカウントに基づき算出する。余分な細胞は上記の凍結法を使用して凍結する。次いでナルジーンボトルをインキュベーターに戻す。

非−特異的な細胞増幅中に支持細胞として使用するため解凍する非−ＣＤ８細胞の数は、１つのＣＤ８^＋エフェクター細胞を刺激するために４つの非−ＣＤ８支持細胞の比率を使用して算出される。凍結した非−ＣＤ８バイアルあたり生育可能な細胞の回収が上記の１回目の再刺激手順で決定した回収と同じと仮定して、必要な非−ＣＤ８細胞の数を生育可能な細胞の回収率で割る。この数は凍結した非−ＣＤ８細胞の各バイアルが約４ｘ１０^８細胞を含むのでほぼ４ｘ１０^８細胞に近づく。いったん必要な非−ＣＤ８細胞数が決まれば、自己の非−ＣＤ８細胞を３７℃の水浴中で迅速に解凍する。次いで解凍した細胞を、適当数の滅菌された５０ｍｌコニカル管に移し、これに１ｍｌの解凍細胞あたり９ｍｌの血清を含まない完全ＲＰＭＩ培地を加える。解凍した細胞は７分間、１，５００ｒｐｍ（４５０ｘｇ）で遠心することによりペレットとし、そして上清を吸引し、そして捨てる。次いでペレットを約１．５ｘ１０^７細胞／ｍｌに完全ＲＰＭＩ中（１０％熱不活性化自己血清（ＨＩＡＳ）を補充した）で再懸濁し、そして細胞懸濁液を滅菌した２５０ｍｌの遠心管に移す。非−ＣＤ８細胞懸濁液を含有する遠心管をジップ−ロックバッグに入れ、そして３，５００ラドでガンマ照射する。照射後、非−ＣＤ８細胞をバイオセイフティキャビネットに戻す。次いで照射した非−ＣＤ８細胞を、５００ｍｌのナルジーンボトル中のＣＤ８^＋エフェクター細胞のプールに加える。

１２５ｍｌの非−ＣＤ８／ＣＤ８^＋細胞懸濁液を各ＯＫＴ３−被覆フラスコに加えるために要する全容量を決定し、そしてこの全容量と非−ＣＤ８／ＣＤ８^＋細胞懸濁液のナルジーンボトルの現在の容量との間の差異を、新しい培地（１０％の熱不活性化自己血清を補充した完全ＲＰＭＩ）をナルジーンボトルに加えることにより埋め合わせる。次いで新しいＩＬ−２を２０ＩＵ／ｍｌ（１００ＩＵ／μｌのストックを１：５，０００に希釈）に希釈する。この点からカルチャーにＩＬ−７は加えない。

次いでＯＫＴ３−被覆フラスコを冷蔵庫から取り出し、ＯＫＴ３溶液をピペットでフラスコから取り除き、そして各フラスコを４回、各３０ｍｌのＤＰＢＳで洗浄する。次いで非−ＣＤ８／ＣＤ８^＋細胞懸濁液をＯＫＴ３−被覆フラスコに分配し（１２５ｍｌ／フラスコ）、そして水平で２日間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーションする。２日後（２４±１日）、フラスコをインキュベーターから取り出し、そしてそれぞれのフラスコを別々に扱いながら細胞懸濁液は長い柄の滅菌細胞スクレーパーを使用して各フラスコから集める。各フラスコは１２５ｍｌの細胞懸濁液を含む。

３リットルのＬｉｆｅｃｅｌｌ（商標）バッグ（ネキセル：カタログ番号Ｒ４Ｒ２１１３）のルーアーを取り付けた口を、６０ｍｌ滅菌シリンジ（プランジャーなし）に付け、そして別の口のクランプを閉じる。細胞懸濁液を満たしたＬｉｆｅｃｅｌｌバッグの数が、細胞が誘導されるＯＫＴ３−被覆フラスコの数と等しくなるように、各フラスコの内容物を別のバッグに移す。次いで各Ｌｉｆｅｃｅｌｌバッグに３７５ｍｌのＸ−Ｖｉｖｏ１０培地（バイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）；カタログ番号０４−７４３Ｑ）および１００μｌの新しいＩＬ−２ストックを１００ＩＵ／μｌ（２０ＩＵ／ｍｌの最終濃度を達成するために）で加える。各Ｌｉｆｅｃｅｌｌバッグ中の各細胞懸濁液の総容量はその時、約５００ｍｌである。次いでＬｉｆｅｃｅｌｌ（商標）バッグをインキュベーターに戻し、そしてワイヤーラック上において十分なガス交換を可能とする。バッグは３日間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーションする。

３日間のインキュベーション期間の後（２７±１日）に、５００ｍｌのＸ−Ｖｉｖｏ１０培地（バイオウィッタカー；カタログ番号０４−７４３Ｑ）を各Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（商標）バッグに加える。新しいＩＬ−２を２０ＩＵ／ｍｌ（１００ＩＵ／μｌのストックの１：５，０００希釈）で加える。新しい培地を加えた後、各バッグの各ルーアー口上のクランプを閉じ、バッグは細胞懸濁液を均一化するために旋回させ、そして細胞懸濁液の５ｍｌサンプルを以下に記載するように無菌性を試験するためにシリンジで引き出す。各サンプルは別個に試験する。サンプルは採取されてから２時間以内に試験する。サンプリング後、ルーアー口上のクランプを再度閉じ、そしてルーアー連結を３ｍｌシリンジでキャップする。次いでＬｉｆｅｃｅｌｌ（商標）バッグをインキュベーターに戻し、そしてワイヤーラック上において十分なガス交換を可能とする。バッグは３日間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーションする。３日間のインキュベーション期間の終わりに（３０±１日）に、５００ｍｌのＸ−Ｖｉｖｏ１０培地（バイオウィッタカー；カタログ番号０４−７４３Ｑ）を各Ｌｉｆｅｃｅｌｌバッグに加える。新しいＩＬ−２を２０ＩＵ／ｍｌ（１００ＩＵ／μｌのストックの１：５，０００希釈）で加える。各バッグの容量はこの時、約１，５００ｍｌである。新しい培地を加えた後、細胞懸濁液を均一化するために各バッグを旋回させ、そして２ｍｌサンプルをバッグの１つからシリングで引き出して生育可能な細胞カウントを測定する。次いで生育可能な細胞カウントは、トリパンブルーでの１：４希釈後に２ｍｌのサンプルで測定する（５０μｌの細胞サンプル＋１５０μｌのトリパンブルー）。

細胞治療生成物の回収および放出前のサンプル試験
細胞治療生成物の回収および放出前に、細胞治療生成物はＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ無菌性試験、ＨＬＡタイピング、ＰＣＲによるマイコプラズマ試験、エンドトキシン試験、グラム染色試験、ショウジョウバエＤＮＡの検出、ＰＣＲによるウイルスＲＮＡの検出、および細胞治療生成物の表現型および活性試験（細胞数および生育能力測定、表現決定およびＣＤ８^＋純度を含む）のためにサンプル採取する。これらの試験は上に述べ、そして図９Ａ〜９Ｆに示すように細胞治療物製造法の様々な他の工程中で行われる。

３０±１日に測定する生育可能な細胞カウントを使用して、各Ｌｉｆｃｅｌｌ（商標）バッグからサンプリングされる５ｘ１０^７細胞に等しい細胞懸濁液容量を算出する。各バッグに別々のシリンジを使用して、算出された５ｘ１０^７細胞に等しい容量を取り出し、そして別個のＴ７５フラスコに入れる。フラスコ中の細胞は、異常な色または曇りについて目で調べ、そして混入の可能性の兆候について顕微鏡で検査する。混入細胞が検出されたＬｉｆｃｅｌｌバッグは捨てる。各Ｔ７５フラスコから５ｍｌサンプルを取り出して、以下に記載するＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔにより無菌性試験を開始する。各サンプルは別個に試験する。サンプルは採取されてから２時間以内に接種する。残る細胞懸濁液はＴ７５フラスコ中にプールする。プールしたサンプル中の生育可能な細胞のカウントは、トリパンブルーでの１：４希釈後に測定する（５０μｌの細胞サンプル＋１５０μｌのトリパンブルー）。全部で１ｘ１０^８細胞に相当する算出された容量を、以下に記載するようにＤＮＡおよびＲＮＡ調製およびマイコプラズマＰＣＲＥＬＩＳＡに使用する。全部で１．９５ｘ１０^７細胞に相当する算出された容量を、以下のようにＣＴＬアッセイに使用する。全部で５〜１０ｘ１０^７細胞に相当する算出された容量を、以下に記載するように四量体染色のために取り分ける。サンプリング後、Ｌｉｆｃｅｌｌバッグはインキュベーターに戻し、そして細胞を回収する準備ができるまでインキュベーションする。

細胞治療生成物の無菌性を試験するＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ
工程中にＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ（商標）（ビオメリュー社（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．）の無菌性性試験をおよそ２７日目に（細胞の回収の１週間前）およびおよそ３０日目（最後の培地をカルチャーに加えた後）に開始する。放出試験用のサンプリングも上記のように最後の培地をカルチャーに加えた後、３０日に行う。

ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ（商標）の迅速な無菌性試験法を使用して、工程中および最終生成物の無菌性を試験する。ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ（商標）はＦＤＡが認可した診断デバイスである。これは完全に自動化された、非侵襲性の微生物検出システムであり、微生物の成長の検出に二酸化炭素生産の比色的検出を利用する。ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ（商標）システムは、カルチャーを連続してインキュベーションし、撹拌し、そしてモニターする。ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔは製造元の使用説明に従い使用する。いったんサンプルを含む試験サンプルを含有するボトルを装置に入れれば、陽性が検出されるか、または７日のインキュベーション期間が完了するまで操作者がさらに介入する必要ではない。システムは一体型の比色計センサーを持つ検出装置、コンピューターシステムおよび通気および嫌気的培養ボトルからなる。

試験サンプルを含有するボトルが装置のセルに配置された時、小さい発光ダイオード（ＬＥＤ）が各ボトルの底に位置するセンサーに赤色光線を暴露する。反射光は各セルに内蔵されたフォトダイオードにより１０分毎に集められ、ここで反射光は変換され、増幅され、そして解釈するためにコンピューターシステムに伝達される。コンピューターのソフトウェアは各ボトルの成長曲線を作成し、そして検出アルゴリズムの使用を介して、一定のＣＯ_２生産と微生物の成長により引き起こされるＣＯ_２生産の加速度との間を識別する。このソフトウェアのアルゴリズムはボトルが最初に装置に配置された時、高いＣＯ_２レべルを感知することができ、または高速のＣＯ_２生産を感知することができ、またはＣＯ_２生産の速度における加速を測定することができる。最初の２つの測定は装置に入る前に増殖したか、または増殖している微生物を検出することができる。培養ボトル内でさらにＣＯ_２が生成されるにつれて、内蔵されたセンサーが暗い灰色から黄色に変わる。各サンプルは現在の閾値よりもむしろそれ自体の過去の成果に対して比較されるので、疑陽性の増加無く真の陽性が迅速に検出される。

細胞治療生成物は、細胞注入の日に工程中のＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ試験がすべて陰性であるならば、条件付きで放出される。細胞治療生成物は調剤後４２時間は安定であり、これは無菌性試験から最後の試験結果を得る前に臨床の現場に即座に輸送されることを必要とする。ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔは最終生成物の接種後１８±２時間で読まれる。最終生成物の１８±２時間の無菌性の読み取りが陰性であった通知が臨床の現場に提供される。この通知は細胞注入前に細胞治療生成物の暫定的な放出を文書で証明するために受け取られる。完全な放出は細胞治療生成物のサンプルが７日間の全インキュベーション後に陰性と見なされた後に文書で証明される。

細胞治療生成物のＨＬＡタイピング
ＰＣＲ−に基づくＨＬＡタイピングは、細胞治療生成物の回収４日前に細胞治療生成物から得たリンパ球フェレーシス生成物（ＰＢＭＣｓ）のサンプルおよびＣＤ８^＋エフェクター細胞サンプルについて行う。ゲノムＤＮＡはＰＢＭＣｓまたはＣＤ８^＋エフェクター細胞から、キアゲンのＢｌｏｏｄＡｍｐＤＮＡキット（キアゲン）を使用して製造元の使用説明に従い調製する。ゲノビジョン（Ｇｅｎｏｖｉｓｉｏｎ）タイピングキット（ゲノビジョン）からＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−ＤＲの鋳型をＰＣＲ用に調製する。キットに含まれるＰＣＲマスターミックスを、精製したゲノムＤＮＡと一緒に各鋳型のウェルに加える。各ウェルに蓋をし、そして鋳型を熱循環器に乗せる。ＰＣＲのパラメーターは組み合わせた１０／２０の循環プログラムを含む。サンプルは臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルで流し、そして結果はＵＶ写真記録（ｐｈｏｔｏｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）ステーションを使用して写真を取る。ＨＬＡタイピングの結果は、ゲノビジョンキットにより提供されるロットに特異的な説明および特異性の表を使用して決定される。放出前の細胞治療生成物のＨＬＡタイピングの結果は、初期のリンパ球フェレーシス生成物の結果との同一性が確認される。入ってくる患者の細胞と合うＨＬＡを細胞治療生成物の放出前に確認する。

細胞治療生成物のマイコプラズマ試験
細胞治療生成物のサンプルは、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）のマイコプラズマＰＣＲ−ＥＬＩＳＡキット（ロッシュ）を使用してマイコプラズマについて試験する。ＣＤ８^＋の培養上清および細胞治療生成物から調製したゲノムＤＮＡをこのアッセイで試験する。細胞治療生成物は上記のようにサンプリングし、そして細胞および／または屑を低速遠心によりペレットとする。試験は製造元の使用説明に従い行う。上清を取り出し、そして高速で遠心してマイコプラズマをペレットとする。上清を取り出し、そして各ペレットを１０μｌの溶解バッファーおよび１０μｌの滅菌水に再懸濁する。陽性対照ＤＮＡ（１０μｌ）をミクロ遠心管に１０μｌの溶解バッファーと共に加える。二重の陰性対照には、１０μｌの水および１０μｌの溶解バッファーを２つの各ミクロ遠心管に加える。すべてのサンプルを３７℃で１時間インキュベーションする。各サンプルに中和バッファーを加えた後、各１０μｌを４０μｌのＰＣＲミックスに加える。ＰＣＲは陽性および陰性対照と一緒にＣＤ８^＋上清の二重サンプルについて、製造元のプロトコールに従い行う。変性試薬（４０μｌ）を室温で１０分間、１０μｌの各ＰＣＲ反応生成物とインキュベーションする。ビオチン標識化捕捉プローブを含有するハイブリダイゼーション反応を各サンプルに加え、そして混合物はストレプトアビジン−被覆ＭＴＰを含有するマイクロタイタープレートの適切なウェルに移される。プレートを３７℃で３時間、３００ｒｐｍで軌道振盪しながらインキュベーションする。洗浄後、抗−ＤＩＧ−ＰＯＤ作業溶液を加え、そしてプレートを室温で３０分間、３００ｒｐｍでインキュベーションする。次いでプレートを５回洗浄し、そしてＴＭＢ基質をプレート上で室温にて２０分間、３００ｒｐｍでインキュベーションする。停止溶液を加え、そして吸収をマイクロタイタープレートリーダーを使用して４５０ｎｍで測定する。試験サンプルは４５０ｎｍで測定される吸収が陰性対照の２倍であれば陽性と考える。アッセイは陰性対照の光学密度が０．２５未満であり、そして陽性対照が＞１．２であれば有効と考える。試験サンプルは、陰性対照と試験サンプルとの間の吸収の差異が０．２未満であれば陰性と考える。放出には、細胞治療生成物はマイコプラズマに関してＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ試験陰性である。

エンドトキシン試験
エンドトキシン試験はバイオウィッタカーのＱＣＬ−１０００エンドトキシンアッセイキットを使用して製造元の使用説明に従い動力学的測光学技術により行う。サンプル中のエンドトキシンの存在で、リムルス属（Ｌｉｍｕｌｕｓ）の変形細胞溶解（ＬＡＬ）調製物中に存在する酵素が活性化される。酵素活性はペプチド基質を加えることにより検出する。このペプチド基質の開裂は、比色的に定量される着色されたフラグメントの放出を導く。

静脈内経路により投与される生成物のエンドトキシン含量は、＜５．０ＥＵ／ｋｇ／ｈとなることが必要である。平均７０ｋｇの個体について、これは全部で最大３５０ＥＵの用量に等しくなる。細胞治療生成物は、０．９％塩化ナトリウム／２５％ヒト血清アルブミン中、乳酸加リンゲル注射液ＵＳＰ／５％デキストロースの３００ｍｌの最終容量中に配合され、３０分にわたり投与される。したがってこのエンドトキシンの上限は１．１７ＥＵ／ｍＬの細胞治療生成物に相当する。細胞治療生成物中のエンドトキシンレベルは生成物の放出には１．０ＥＵ／ｍＬ未満となる。

グラム染色試験
グラム染色はこのアッセイの標準的な試験キットを使用して行う。各試験（３枚のスライド）は、細胞治療生成物の試験サンプルに加えて対照として前固定されたグラム陽性およびグラム陰性微生物を含む。放出するためには、細胞治療生成物の試験サンプルを含有するスライド上でグラム染色による微生物は検出されない。

ｘＡＰＣおよび細胞治療生成物のショウジョウバエｘＡＰＣＤＮＡのスクリーニング
リンパ球フェレーシス生成物に由来するＣＤ８^＋細胞は、製造法の始めにショウジョウバエのｘＡＰＣに暴露される。ショウジョウバエのｘＡＰＣは温度感受性であり（培養を２５〜２７℃で維持する）、そして３７℃で培養した場合、４８時間以内に死ぬ。ＰＣＲ法を使用して放出前の最終的な細胞治療生成物中にショウジョウバエｘＡＰＣのＤＮＡが存在しないことを確認する。ショウジョウバエｘＡＰＣのＤＮＡは、上記のようにショウジョウバエのｘＡＰＣを作成するためにショウジョウバエの細胞をトランスフェクトするために使用したｐＲＭＨａ−３プラスミドベクターに特異的なプライマーを使用してＰＣＲにより検出する。

プラスミドｐＲＭＨａ−３ベクターの配列は、高いコピー数でショウジョウバエｘＡＰＣに存在し、そして細胞中に安定に留まり、細胞治療生成物中のショウジョウバエｘＡＰＣのＤＮＡの存在の適切なマーカーを提供する。このベクターの不存在は組換え抗原発現の損失を生じ、これは常に初回刺激の日にフローサイトメトリーにより評価される。プラスミドｐＲＭＨａ−３プラスミドベクターは、トランスフェクトされた異種核酸（例えばヒト共刺激および接着分子）を発現するショウジョウバエｘＡＰＣに存在する。ｐＲＭＨａ−３の検出に使用するプライマー配列は以下の通り：
ｐＲＭＨａ−３５’プライマー：５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＴ−３’（配列番号：７２）
ｐＲＭＨａ−３３’プライマー：５’−ＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＧＴＧＴＧＣ−３’（配列番号：７３）

ショウジョウバエのベクター特異的ＤＮＡ配列の検出に使用するＰＣＲ法は、ＰＣＲの増幅を２５サイクルに制限することにより二本鎖ＤＮＡの疑陽性の発生を減らす１段階のポリメラーゼ連鎖反応である。４００ｎｇの試験細胞治療生成物サンプルＤＮＡを５μＬ容量で含有する個々のＰＣＲ管は、白金Ｔａｑポリメラーゼ（インビトロジェン）および２５０ｎｇの各ベクター特異的プライマーを含有する４５μＬのＰＣＲマスターミックスと混合する。試験および対照サンプルをＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム９７００熱循環器（アプライドバイオシステムズ：ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に配置し、そしてＰＣＲ反応を２５サイクル行う。陽性対照は全ショウジョウバエｘＡＰＣＤＮＡであり、そして陰性対照はショウジョウバエｘＡＰＣ刺激前のリンパ球フェレーシス生成物に由来する精製したナイーブＣＤ８^＋細胞からの全ＤＮＡである。陽性対照ＰＣＲフラグメントのサイズは以下の通り：ヒトベータ−２−ミクログロブリン（４７９塩基対）、ヒトＬＦＡ−３（８１７ｂｐ）、ヒトＢ７．１（ＣＤ８０，９６５ｂｐ）、ヒトＢ７．２（ＣＤ８６，１０９８ｂｐ）、ヒトＡ２．１（１２０７ｂｐ）およびヒトＩＣＡＭ−Ｉ（ＣＤ５４，１６９６ｂｐ）（図１０Ａ、レーン２）。ＰＣＲ反応が完了すると、サンプルを２％アガロースゲルに流し、そして結果をＵＶ写真記録ステーションを使用して写真を取る。細胞治療生成物の試験サンプルは、ベクター挿入物に相当するショウジョウバエｘＡＰＣのＤＮＡ特異的バンドが観察されれば、陽性と考える（例えば図１０Ａ、レーン２を参照）。細胞治療生成物の仕様では、ショウジョウバエ特異的ＤＮＡバンドが検出されず、そして結果はこのアッセイの陰性対照に類似する。

ショウジョウバエｘＡＰＣＤＮＡの検出感度は、既知の量の全ショウジョウバエｘＡＰＣのＤＮＡの２倍の連続希釈物を、４００ｎｇのＣＤ８^＋ＤＮＡにスパイクすることにより測定した。プラスミドｐＲＭＨａ−３ベクターに特異的なプライマー（各２５０ｎｇ）および白金Ｔａｑポリメラーゼ（インビトロジェン）を加え、そして容量を滅菌水で５０μＬとした。２５サイクルのＰＣＲ反応を行った後、５ｕＬの１０Ｘゲル添加バッファーを２５ｕｌの各反応に加え、そして１％低融点アガロース／ＴＡＥゲルで５０Ｖにて１時間流す。ショウジョウバエＤＮＡの検出下限レベルを＜５０ｐｇと定めた（図１０Ｂ、レーン２〜１５）；したがって検出感度はピコグラム範囲である。

細胞治療生成物中のショウジョウバエｘＡＰＣ随伴ウイルスのスクリーニング
実施例１に記載するように、３種の内因性の昆虫特異的ＲＮＡウイルスがショウジョウバエのｘＡＰＣに随伴することが測定された：１）ショウジョウバエのノダウイルス（ＤｒＮＶ）、２）ショウジョウバエＸウイルス（ＤＸＶ）、および３）ショウジョウバエＨＰＳ−１−様ウイルス。ショウジョウバエｘＡＰＣはＣＤ８^＋細胞を刺激するためにエクスビボの培養サイクルの開始で試験される。したがってサンプルのＣＤ８^＋細胞はこれらのウイルスが最終的な細胞治療生成物中に存在しないことを確認するために試験される。キアゲンのＲＮＡｅａｓｙキット（キアゲン）を使用して細胞治療生成物の細胞サンプルから精製した全ＲＮＡにオリゴｄＴを付け、そしてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素を使用して４２℃で５０分間逆転写する。酵素の不活性化後、生じた細胞サンプルのｃＤＮＡ産物をＲＮａｓｅＨで３７℃にて２０分間処理する。反応生成物を氷上に置く。ＣＤ８^＋ｃＤＮＡ濃度は２６０ｎｍでの光学密度により測定する。陽性対照には、ウイルス特異的配列をプラスミドｐＣＲ２．１にクローン化し、そしてプラスミドＤＮＡを線状化してＰＣＲの準備ができたウイルス特異的鋳型を得る。既知のコピー数（２０および１００ウイルスコピー）のウイルス鋳型を含有するこれらのプラスミドは、陽性対照として使用する細胞治療生成物のサンプルに由来するＣＤ８^＋ｃＤＮＡをスパイクするためにも使用する（以下参照）。ウイルス配列の検出に使用するプライマー配列は以下の通りである：
ＤＸＶ：フォワード５’−ＡＴＣＧＧＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＧＧＧ−３’（配
列番号：７４）
リバース５’−ＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＡＴＴＣＴＣＧＴＴＴＧＧＣ
−３’（配列番号：７５）
アンプリコン：１７８ｂｐ
ＤｒＮＶ：フォワード５’−ＧＡＧＣＣＧＴＡＣＧＴＧＡＴＧＣＣＧ−３’（配
列番号：７６）
リバース：５’ ＴＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＡＡＧＴＧＧ３’（配
列番号：７７）
アンプリコン：１３３ｂｐ
ＨＰＳ−１フォワード：５’−ＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＴＴＴ−３’
（配列番号：７８）
リバース：５’−ＡＴＴＴＧＣＡＡＣＣＧＣＡＴＡＣＣＴＴＣ−３’
（配列番号：７９）
アンプリコン：２４１ｂｐ

ＣＤ８^＋サンプルのｃＤＮＡ調製物中のウイルス配列を検出する感受性レベル（スパイキング実験）を最初に以下のように決定する。全ＲＮＡはＣＤ８^＋Ｔ細胞から精製する。ＲＮＡをオリゴｄＴおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素を用いて逆転写してＣＤ８−特異的ｃＤＮＡを得る。ウイルスの鋳型（ＤＸＶ，ＨＰＳ−１およびＤｒＮＶ）を含有するプラスミドを線状化し、そして２６０ｎｍでの光学密度により定量する。ウイルスの鋳型を含有する１μｇのプラスミドあたりのウイルスコピー数を、各ウイルスについて測定する。上記のようなウイルスに特異的なプライマーを標準的なＳＭＡＲＴＰＣＲアッセイに、ＳｙＢｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ１、ＨｏｔＳｔａｒｔＴａｋａｒａＤＮＡポリメラーゼおよび１μｇのＣＤ８^＋ｃＤＮＡを用いて使用する。１０，１００または１０００コピーの範囲のウイルス鋳型を反応ミックス中に二連でスパイクする。ウイルス特異的鋳型の希釈（２０，０００コピーから２コピーまで）を使用して、リアルタイム定量ＰＣＲの標準曲線を作成する。ウイルス特異的なＰＣＲプライマーをＳＭＡＲＴＰＣＲアッセイミックスでＳｙＢｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ１およびＨｏｔＳｔａｒｔＴａｋａｒａＤＮＡポリメラーゼ（タカラ：Ｔａｋａｒａ）を使用して調製する。陰性対照にはＣＤ８^＋ｃＤＮＡのみおよびプライマーミックスのみを含有する。サンプルはＣｅｐｈｅｉｄＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒＰＣＲシステムで流す。融解曲線分析および増幅曲線分析を行い、そして検出される結果はＳｙＢｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ１（ＳｙＧ）の単位で記録する。ＳｙＧ単位は各ウイルス力価に関する標準曲線に基づく（表ＶＩＩ）。

細胞治療生成物の放出アッセイには、試験サンプルは３連で、０日の２００ｎｇのＣＤ８^＋ｃＤＮＡおよび細胞治療生成物試験サンプルに由来する２００ｎｇのＣＤ８^＋ｃＤＮＡを含む。陽性対照サンプルは３連で、２０および１００コピーのウイルス鋳型でスパイクした２００ｎｇのＣＤ８^＋ｃＤＮＡを含む。陰性対照サンプルは、ＰＣＲミックスのみを含む（鋳型なし）。すべてのサンプルはＣｅｐｈｅｉｄＳＭＡＲＴＣｙｃｌｅｒシステムで流す。融解曲線分析および増幅曲線分析は、３つの各ウイルスＰＣＲアッセイについて行う。陽性対照は特異的な融解曲線およびバッググラウンドより上のＳｙＢｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ１の値（０日のＣＤ８^＋ｃＤＮＡ）を与える。細胞治療生成物放出の仕様では、ｋｉｎ陰性対照で観察されるより上のショウジョウバエのウイルスに特異的な増幅は検出されない。

表ＶＩＩＩは、ナイーブ（すなわち上記のようなｘＡＰＣでの活性化前）および４名の患者供与体（ＰＤ１，ＰＤ２，ＰＤ３およびＰＤ４）からの細胞治療生成物サンプル中で同定される付随するウイルスに関するリアル−タイムの定量的ＰＣＲアッセイから得た３連で行ったアッセイの代表的結果を表す。この結果は、試験した各細胞治療生成物（最終用量）が、アッセイした各ウイルスについて陰性と試験されたことを示す（すなわち各最終用量中のＳｙＧ単位は、それぞれ対応するナイーブなサンプルに関するＳｙＧ単位よりも低かった）。

表ＩＸおよびＸは、正常な供与体１（ＮＤ１）から得たサンプルについて、２連のアッセイから代表的結果を表す。表ＩＸでは、０．２μｇのＣＤ８^＋ｃＤＮＡをアッセイした。表Ｘでは、３．０μｇのＣＤ８^＋ｃＤＮＡをアッセイした。表ＩＸおよびＸに示す結果は、試験した各細胞治療生成物（ＮＤ１投与ＣＤ８^＋）が、アッセイした各ウイルスについて陰性と試験された（すなわち各最終用量中のＳｙＧ単位は、それぞれ対応するナイーブなサンプルに関するＳｙＧ単位よりも低かった）。ＨＰＳに関するデータは、表Ｘで示すアッセイで唯一、ＣＤ８^＋ｃＤＮＡの供給源としてこの１回のアッセイで消費されたことを示した。しかしこの濃度での細胞治療生成物のｃＤＮＡサンプルの日常的なスクリーニングは、すべてのサンプルを消費し、そして恐らくはすべての必要とされる試験の完了を妨げ、そしてアッセイを繰り返すことをできなくする。

上記ＰＣＲ反応を使用して、将来、細胞治療生成物のロットを放出するために、エクスビボで培養する方法の最後に、ショウジョウバエのウイルスに特異的なプライマーを使用して細胞治療生成物サンプルからのＣＤ８^＋調製物をスクリーニングする。各ウイルスＰＣＲ反応は、新しいショウジョウバエの細胞から単離したｃＤＮＡ（陽性対照）、ショウジョウバエの細胞に暴露されたことがないＣＤ８^＋サンプルから調製したｃＤＮＡ（陰性対照）、および細胞治療生成物用量の放出試験中に評価される最終ＣＤ８^＋製品について行う。陽性対照中の検出可能なウイルス特異的生成物は、ショウジョウバエの細胞に暴露される前に集めたＣＤ８^＋サンプル中および細胞治療生成物が放出されるための細胞治療製品中には不存在である。

細胞治療生成物の表現型および活性のアッセイ
細胞治療生成物の生物学的特性決定は、総細胞数、生育能、表現型および効力の測定により評価される。さらに細胞治療生成物の製造プロセス全般を通して生育細胞数、表現型、ＣＤ８^＋および非−ＣＤ８^＋選択細胞組成のプロセス中の評価も行う。

生育可能な有核細胞数
生育可能な細胞数は、細胞治療生成物の製造プロセスの数箇所の時点でモニタリングし、それらには細胞治療生成物の放出前の時点を含む。生育可能な細胞カウントは細胞をトリパンブルーで希釈し、そして血球計に乗せて数えることにより測定する（例えば上記参照）。最小１００個の細胞を顕微鏡下で数える。表ＸＩはＰＤ５，ＰＤ６およびＰＤ７と名付けられた３名の黒色腫患者供与体から得たリンパ球フェレーシス生成物、および細胞治療生成物の製造の様々な段階および放出試験プロセスで随伴する細胞性物質について記録した細胞数をまとめる。

放出のための細胞治療生成物の全有核細胞数は９^９から１０^１０細胞の間である。

細胞生育能
細胞の生育能は、トリパンブルー溶液で希釈した細胞を上記のように血球計でカウントすることにより評価する。存在する全細胞に対して生きている細胞の比に基づく生育可能な細胞の割合を算出する。表ＸＩＩはＰＤ８，ＰＤ６，ＰＤ９，ＰＤ５，ＰＤ７およびＰＤ１０と命名された６名の黒色腫患者供与体から得たリンパ球フェレーシス生成物から調製した６種の細胞治療生成物のロットの生育能を表す。平均生育能は７６．２％であり、標準偏差は±２．６（ｎ＝６）である。現在製造されている細胞治療生成物は日常的に＞７０％の収率を有する。細胞治療生成物は、細胞治療生成物が放出されるために、このアッセイ法に基づき７０％より高い生育能を有する。

細胞治療生成物の表現型
細胞の表現型およびＣＤ８^＋純度は、細胞表面を蛍光標識したモノクローナル抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーで分析することにより決定する。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターでの２色分析を、以下に列挙するモノクローナル抗体のパネルに従い行う。生成物の特性決定のためのマーカーには：ＣＤ３（Ｔリンパ球）、ＣＤ４（Ｔヘルパー細胞）、ＣＤ８（Ｔ細胞傷害性細胞）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ１６（ＮＫ細胞）およびＣＤ１５（顆粒球）。フローサイトメトリー試験に使用する細胞は、ＦＡＣＳバッファー（ＢＳＡおよびアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）で洗浄し、そして適切に蛍光標識されたモノクローナル抗体と、４℃で１５〜３０分間インキュベーションし、遮光する。インキュベーション後、染色された細胞を洗浄し、そしてＦＡＣＳバッファーに再懸濁する。染色された細胞を氷上で保存し、遮光し、そして染色から２時間以内にフローサイトメトリーで流す。あるいはサンプルが２時間以内に分析できない場合、サンプルはＤＰＢＳ中０．５％パラホルムアルデヒド溶液中で固定し、そして暗中４℃で１週間保存する。各サンプルについて全部で１０，０００イベントを集める。データを分析し、そして各マーカーについて陽性の細胞の割合を決定する。表ＸＩＩＩは、黒色腫患者供与体ＰＤ８，ＰＤ６，ＰＤ９，ＰＤ５，ＰＤ７およびＰＤ１０から得たリンパ球フェレーシス生成物に由来する６種の細胞治療生成物ロットに存在するＣＤ３^＋およびＣＤ８^＋細胞の割合を表す。ＣＤ３^＋およびＣＤ８^＋で染色されない細胞画分は、生存できない細胞と考える。これらのデータは、異なる細胞治療生成物のロット中、ＣＤ３^＋およびＣＤ８^＋表現型の相対的割合が、比較的一定であることを示唆している（例えば表ＸＩＩＩの平均割合および標準偏差を参照にされたい）。

アイソレックス−３００ｉ選択法の前および後に、ＣＤ８^＋細胞の純度を評価するために、蛍光標識したモノクローナル抗体での細胞表面染色を行い、そして上記のようにフローサイトメトリーで分析する。表ＸＩＶは、黒色腫患者供与体ＤＰ８，ＰＤ６およびＰＤ９に由来するリンパ球フェレーシス生成物および対応する治療生成物の表現型の分布を表
す。アイソレックスの細胞分離機を使用したＣＤ８^＋細胞の分離は、抗−ＣＤ８モノクローナル抗体３７Ｂ１Ａでの染色に基づき８２±９％（平均±ＳＤ、ｎ＝３）純度をもたらした。検出可能なレベルのＣＤ４^＋（３±１．４％）、ＣＤ１４^＋（２±１．５％）、およびＣＤ１６^＋（５±２％）細胞が存在した。この細胞集団にはＣＤ１５^＋細胞が存在しないようであった。

細胞治療生成物の効力
細胞治療の効力アッセイは、選択したペプチド（例えば上記の配列番号５、６、７、８、９および７０に従うペプチド）を負荷した標的細胞に対する細胞治療生成物の効力の尺度として、特異的溶解活性を証明するために行う。細胞治療の効力アッセイ法は、^５１Ｃｒ−放出アッセイ（例えばＴｈｏｒｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，４（２），ｐｐ．３０１−３１５（１９７４）を参照にされたい）である。標的細胞（Ｔ２細胞−ＨＬＡ−Ａ２．１^＋）は、放射性同位体^５１Ｃｒと１時間インキュベーションする。過剰な非標識^５１Ｃｒは、標的細胞から２回、洗浄媒質で洗浄する。次いで個々のクロムを負荷したＴ２細胞サンプルは、室温で３０分間（ペプチドあたり２０μｇ／ｍｌ）、６つの黒色腫ペプチドのうちの１つを負荷され（各標的ペプチドを、クロムを負荷したＴ２細胞の独立したサンプルを使用して個別に試験するために）るか、陰性対照ペプチドのペプチドを負荷されるか、またはペプチドを負荷されない。細胞治療生成物の細胞（すなわちペプチドを負荷したｘＡＰＣが誘導したＣＤ８^＋エフェクター細胞（Ｅ））は、次いで標識した標的細胞（Ｔ）と、０．４〜５０の間のＥ：Ｔ比で、非−ＨＬＡ拘束性細胞傷害性を中和するために使用される過剰なＫ５６２細胞と一緒に混合される。細胞懸濁液は３７℃／５％ＣＯ_２で４時間インキュベーションする。細胞治療生成物の細胞（Ｅ）による標識された標的細胞の溶解は、上清中へ^５１Ｃｒの放出を生じる。インキュベーション後、１００μＬの細胞上清を各ウェルから取り出し、そしてガンマカウンターへ移す。各個別のペプチドの存在下での溶解活性（Ｅ）は、以下の式に従うことにより決定される特異的溶解の割合として表す（式について：
特異的溶解の割合＝１００Ｘ（１分あたりのサンプルカウント−１分あたりの自然なカウント）／（１分あたりの最大カウント−１分あたりの自然なカウント）。

ペプチドを負荷したＴ２細胞に加えて、黒色腫および陰性対照細胞株もクロムを負荷した後の標的として使用する。このアッセイ手順は、Ｔ２標的細胞を使用した手順と同じままである。特異的溶解は放出される生成物について、Ｔ２および／または黒色腫株のいずれかで検出される。

黒色腫患者供与体ＰＤ８，ＰＤ６，ＰＤ９，ＰＤ５，ＰＤ７およびＰＤ１０から得たリンパ球フェレーシス生成物から誘導される６種の細胞治療生成物のロットについて、各配列番号５，６，７，９および７０に対する効力の結果（１０：１のＥ：Ｔ比での特異的溶解の割合）を表ＸＶにまとめる。

類似の分析では、１つのペプチド（配列番号：８；ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ）を、細胞治療生成物に殺細胞活性を生じるためにすでに使用した５つのペプチドに加えた。単独または他の黒色腫ペプチドと組み合わせて使用した配列番号：８が特異的溶解活性を生じる能力は、表ＸＶＩに記載するように３種の正常供与体で証明された。

注入用の生成物の調製
細胞治療生成物の細胞を回収し、そして細胞治療生成物の製剤を調製するために、上記のように調製した細胞懸濁液は、回収前に直ちに各バッグにより均一化される。２つのフェンバルスパイク／スパイク血漿移動キット（閉じたクランプ）は、次いで各Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（商標）バッグ上の未使用の口をスパイクする。各バッグはバイオセイフティキャビネットの表面から上がったフックにかける。血漿移動セットのクランプを開け、そして細胞懸濁液を２つの滅菌ナルジーンボトル（１０００ｍｌおよび５００ｍｌ）に排出する。各バッグは別個に操作する。細胞懸濁液を移した後、各Ｌｉｆｅｃｅｌｌバッグから５ｍｌの各細胞懸濁液を１０００ｍｌの各ナルジーンボトルからサンプリングし、そして別個のＴ２５フラスコに入れる。４つの各Ｔ２５フラスコ中の細胞を異常な色および曇りについて目で検査し、そして混入の可能性について顕微鏡で検査する。混入したサンプルに対応するＬｉｆｅｃｅｌｌ（商標）バッグからの細胞は破棄する。４つのＴ２５フラスコから非混入細胞をプールし、そしてトリパンブルーで１：４に希釈した後カウントする（５０μｌの細胞サンプル＋１５０μｌのトリパンブルー）。生育可能な細胞のカウントを決定する。ＦＡＣＳ分析用に約１０ｘ１０^６細胞を取り分ける。残る細胞懸濁液を滅菌された５００ｍｌのコニカル管に注ぐ。次いで管の重さを測り、バイオセイフティキャビネット（フード）中で細胞懸濁液を加えたり、除去することによりバランスを取り、そして細胞を１０分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で遠心することによりペレットとする。上清をデカントし、そして捨て、そしてペレットを再度２分間、２，０００ｒｐｍ（８００ｘｇ）で遠心する。残る上清は５ｍｌのピペットで取り除く。

次いでぺレット化した細胞は、滅菌された２５０ｍｌのボトルで混合された以下の洗浄バッファーで洗浄する：１９２ｍｌの注射用０．９％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ＵＳＰ、および８ｍｌのＨＳＡ（２５％溶液）Ｂｕｍｉｎａｔｅ（商標）。すべての細胞ペレットを全部で１００ｍｌの洗浄バッファー中で合わせ、そして４つの５０ｍｌコニカル管に入れ（２５ｍｌ／管）、そして１，０００ｒｐｍ（２００ｘｇ）で１０分間、遠心する。上清を吸引し、そして捨て、そして細胞ペレットを再度、２，０００ｒｐｍ（８００ｘｇ）で２分間遠心する。残る上清は細い先端のピペットを使用して除去する。次いで各細胞ペレットを２５ｍｌの洗浄バッファーに再懸濁し、そして１，０００ｒｐｍ（２００ｘｇ）で１０分間、遠心する。上清を吸引し、そして捨て、そして細胞ペレットを再度、２，０００ｒｐｍ（８００ｘｇ）で２分間遠心する。残る上清は細い先端のピペットを使用して除去する。この２回の低速遠心中、１，０００ｍｌの移動パック（バクスター；カタログ番号４Ｒ２０３２）を密閉し、そしてチュービングを捨てる。次いでトランスファーバッグに血漿移移動セット（チャーターメディカル；カタログ番号０３−２２０−９０）を取り付け、そして患者に関する確認情報をトランスファーバッグに貼る。次いで各細胞ペレットを２５ｍｌの以下の再懸濁バッファーに懸濁し（全１００ｍｌ用量）、これは以下の滅菌ボトル中に調製する：２８２ｍｌの乳酸加リンゲル媒質、１２ｍｌの５％デキストロースおよび０．９％の注射用塩化ナトリウム、および６ｍｌのＨＳＡ（２５％溶液）Ｂｕｍｉｎａｔｅ（商標）。凝集した細胞を分離するために再懸濁バッファーを徹底的にピペッティングする。７０μｍのナイロン滅菌細胞ストレーナー（ファルコン２３５０）を滅菌された１００ｍｌのナルジーンボトルの口に配置する。細胞凝集物は、細胞ストレーナーを通すことにより細胞懸濁液から除く。次いで細胞ストレーナーを捨てる。次いで生きている、および死んだ細胞をトリパンブルーで１：５０に希釈した後にカウントする（２０μｌの細胞＋９８０μｌのトリパンブルー）。

６０−ｍｌのルーアーロックを、１０００ｍｌのトランスファーバッグに付けられた血漿移動セットへのシリンジに付け、そして最大１ｘ１０^１０細胞に等しい細胞懸濁液容量をトランスファーバッグに移す。次いで再懸濁バッファーをトランスファーバッグに２４６ｍｌの全容量で移す。再懸濁バッファーのすべての未使用部分は捨てる。

次に細胞懸濁液はバッグを旋回させることにより均一化し、そして０．５ｍｌの細胞懸濁液をバッグから血漿トランスファーバッグに取り付けた３ｍｌのシリンジを用いて抜き取る。この０．５ｍｌのサンプルを上記のようにエンドトキシン試験に使用するために滅菌されたエッペンドルフ管に入れる（０．１５ｍｌ必要）。６０ｍｌのシリンジを使用して、５４ｍｌのＨＳＡ（２５％溶液）Ｂｕｍｉｎａｔｅ（商標）をバッグに血漿移動セットを介して加える。次いで新しい細胞濃度が全細胞数を新しい細胞容量で割ることにより算出される。細胞懸濁液は再度、バッグを旋回することにより均一化する。血漿移動セットに付けられた１０ｍｌのシリンジを使用して、６．５ｍｌの細胞懸濁液をバッグから抜き取る。このサンプルは放出試験および細胞の低温保存に使用される。上記のようなグラム染色のために、６．５ｍｌのサンプルから約０．１ｍｌ（２−３滴）の細胞懸濁液を滅菌されたエッペンドルフ管に入れる。ＦＡＣＳ分析用に細胞懸濁液の０．５ｍｌのアリコートを滅菌された１５ｍｌのコニカル管に移し、残る細胞サンプルは１５ｍｌのコニカル管に入れ、そして７分間、１，７００ｒｐｍ（６００ｘｇ）で遠心する。上清は直ちにＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ無菌性試験に使用し、そしてペレットはＦＡＣＳ分析および低温保存用に取っておく。ペレット中に存在する細胞数を算出し、そして細胞ペレットを６．０ｍｌの凍結溶液（９０％の自己血清［ＨＩＡＳ］＋１０％ＤＭＳＯ）に再懸濁する。次いで細胞濃度は、ペレット中の細胞数を６．０ｍｌで割ることにより算出する。次いで低温管を適切に標識し、そして凍結する。次いで低温管はストラットクーラー中、−８０℃の冷凍庫に置き、次いで翌日、−１４０℃の保存庫に移す。残る細胞懸濁液を含有するバッグは、放出（輸送）の準備ができるまで４℃に置く。

注入用の細胞治療生成物製剤は、自己ＣＴＬｓ（選択したペプチドに向けられたＣＤ８^＋エフェクター細胞）を３００ｍＬの乳酸加リンゲル注射液、ＵＳＰ（７６％容量／容量）、０．９％塩化ナトリウム５％デキストロース（４％容量／容量）および２５％ヒト血清アルブミン（２０％容量／容量）中に含む。輸送時に、デクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ）温度自動記録装置を輸送容器に配置する。細胞治療生成物を含有する注入バッグを、輸送コンテナに配置する。次いで輸送コンテナの輸送準備がなされる。注入バッグは臨床の現場で受け取られた後、デクソンの温度自動記録装置からの温度データがダウンロードされ、そしてグラフで表される。最終生成物の使用期限は４２時間である。

考察
架橋化は、ａＡＰＣのウイルス排除および抗原提示機能の維持に効果的な方法を提供する。ソラレンに続いて長波ＵＶ暴露の使用は、ＤＮＡおよびＲＮＡを架橋し、そして複製を妨げる。これはａＡＰＣ細胞株に存在する可能性があるすべての既知の、および未知のウイルスを不活性化し、そしてショウジョウバエの細胞株をその有力なＡＰＣ機能に影響を及ぼすことなく潜在的に不活性化することにより、患者に送達するための薬剤の調製に使用される細胞に基づく生成物にさらなるレベルの保護を加える。ソラレン／ＵＶ処置は、ＡＰＣに存在する核酸を不活性化し、そしてさらなる凍結／解凍処理はトリパンブルーで染色することにより証明されるように「死んだ」細胞を生じる。この不活性化／溶解プロトコールは、ショウジョウバエの細胞のＡＰＣ機能を破壊せず、そして場合によっては強化するＡＰＣとしての安全性を確認するものである。

本発明は具体的説明の実施例および好適な態様に関連して上記に詳細に説明したが、当業者は本発明の範囲が前記記載により定められず、添付する特許請求の範囲により特許法の原則に元に正しく解釈されることを理解している。

Claims

疾患または障害を有する患者に投与するための活性化Ｔリンパ球を生体外で作成する方法であって：
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣｓ）を核酸架橋剤で不活性化する工程であって、該核酸架橋剤がソラレン、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰＳ）、４’−（アミノメチル）−４，５’，８−ソラレン（ＡＭＴ）およびアモトサレン（Ｓ５９）からなる群より選択され、かつ、不活性化する工程が核酸架橋剤で処理したａＡＰＣｓを光活性化用量のＵＶＡ照射に暴露することを含む、工程；
疾患または障害が診断される患者から単離されたＴリンパ球を該不活性化されたａＡＰＣｓと接触さる工程；および
患者に戻し投与するためにＴリンパ球を集める工程、
を順に含んでなる、方法。
請求項１に記載の方法であって、該不活性化する工程が人工抗原提示細胞を、１〜１００μｇ／ｍｌ濃度の該核酸架橋剤に暴露し、そして１〜１００ジュール／ｃｍ²用量のＵＶＡ照射に１〜６０分の期間、暴露することを含む、方法。
請求項１に記載の方法であって、該疾患または障害がガンであり、そして該接触工程の前またはそれと同時に；
人工抗原提示細胞に少なくとも１つのガン関連ペプチド抗原を負荷する、
工程をさらに含む、方法。
請求項３に記載の方法であって、該活性化Ｔリンパ球がペプチドを発現している標的細胞に対して細胞傷害性であり、そして該ペプチドが黒色腫関連ペプチド抗原、卵巣ガン関連ペプチド抗原、乳癌関連ペプチド抗原、肺ガン関連ペプチド抗原、白血病−、多発性骨髄腫−およびリンパ腫−関連ペプチド抗原および前立腺ガン関連ペプチド抗原からなる群より選択される、方法。
請求項４に記載の方法であって、該ペプチドが、ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＵＣ−１、ＣＡ−１２５、Ｈｅｒ−２、サーバイビン、テロメラーゼ、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、リビン、ＳＡＲＴ−１、ＳＣＰ−１、ＳＳＸ−２、ＰＲＡＭＥ、Ｃ−レクチン、Ｐｅｃ６０、ＡＥＳ、ＭＡＧＥ−３、Ｇ２５０、ＦＢＰ、ＳＳＸ−４、ＳＰ１７、ｈＴＲＴ、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−１、トポイソメラーゼＩＩ、インテグリンβ８サブユニット前駆体、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＳＴＡＴ１、γ−カテニンまたはＨ−ＲＹＫのアミノ酸配列の少なくとも８個の連続する抗原性アミノを含む、方法。
請求項５に記載の方法であって、該ペプチドが：ＳＩＬＳＬＫＥＡＳＴ（配列番号：１），ＫＭＡＳＲＳＭＲＬ（配列番号：２），ＡＬＡＬＡＡＬＬＶＶ（配列番号：３），ＡＬＬＶＶＤＲＥＶ（配列番号：４），ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（（配列番号：５），ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号：６），ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号：７），ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（配列番号：８），ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：９），ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：１０），ＣＬＴＳＴＶＱＬＶ（配列番号：１１），ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（配列番号：１２），ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：１３），ＩＩＳＡＶＶＧＩＬ（配列番号：１４），ＰＬＴＳＩＩＳＡＶ（配列番号：１５），ＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶ（配列番号：１６），ＶＬＶＫＳＰＮＨＶ（配列番号：１７），ＥＬＶＳＥＦＳＲＭ（配列番号：１８），ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ（配列番号：１９），ＧＰＬＴＰＬＰＶ（配列番号：２０），ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号：２１），ＫＡＬＦＡＧＰＰＶ（配列番号：２２），ＹＬＥＴＦＲＥＱＶ（配列番号：２３），ＧＬＱＳＰＫＳＰＬ（配列番号：２４），ＶＬＬＫＬＲＲＰＶ（配列番号：２５），ＥＬＹＩＰＳＶＤＬ（配列番号：２６），ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号：２７），ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号：２８），ＳＴＡＰＰＶＨＮＶ（配列番号：２９），ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号：３０），ＦＭＷＧＮＬＴＬＡ（配列番号：３１），ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（配列番号：３２），ＨＬＳＴＡＦＡＲＶ（配列番号：３３），ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ（配列番号：３４），ＥＬＷＴＨＳＹＫＶ（配列番号：３５），ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ（配列番号：３６），ＹＩＦＡＴＣＬＧＬ（配列番号：３７），ＨＬＹＩＦＡＴＣＬ（配列番号：３８），ＭＬＭＡＱＥＡＬＡＦＬ（配列番号：３９），ＳＴＬＥＫＩＮＫＴ（配列番号：４０），ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号：４１），ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（配列番号：４２），ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号：４３），ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号：４４），ＳＬＬＥＫＲＥＫＴ（配列番号：４５），ＴＬＧＥＤＤＰＷＬ（配列番号：４６），ＫＬＧＬＫＰＬＥＶ（配列番号：４７），ＹＬＷＴＳＡＫＮＴ（配列番号：４８），ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ（配列番号：４９），ＧＭＧＳＥＥＬＲＬ（配列番号５０），ＳＬＧＳＰＶＬＧＬ（配列番号：５１），ＹＬＦＦＹＲＫＳＶ（配列番号：５２），ＣＱＱＥＥＴＦＬＬ（配列番号：５３），ＴＬＡＫＦＳＰＹＬ（配列番号：５４），ＮＬＴＨＶＬＹＰＶ（配列番号：５５），ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号：５６），ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号：５７），ＦＬＤＱＲＶＦＦＶ（配列番号：５８），ＦＬＤＱＲＶＦＶＶ（配列番号：５９），ＦＬＤＱＶＡＦＶＶ（配列番号：６０），ＧＬＤＲＥＱＬＹＬ（配列番号：６１），ＶＭＱＨＬＬＳＰＬ（配列番号：６２），ＱＱＴＨＧＩＴＲＬ（配列番号：６３），ＬＱＰＬＳＧＰＧＬ（配列番号：６４），ＴＬＤＲＤＳＬＹＶ（配列番号：６５），ＱＬＹＬＥＬＳＱＬ（配列番号：６６），ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（配列番号：６７），ＫＶＡＤＬＶＧＦＬ（配列番号：６８），ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号：７０）およびＶＬＤＧＬＤＶＬＬ（配列番号：７１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
請求項６に記載の方法であって、該少なくとも１つのペプチドがペプチドの混合物であり、混合物が：ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号：５），ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号：７），ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：９），ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：１０），ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号：２７），ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号：３０），ＴＬＡＫＦＳＰＹＬ（ＰＲＡＭＥ；配列番号：５４）およびＶＬＤＧＬＤＶＬＬ（配列番号：７１）を含んでなる、方法。
請求項１に記載の方法であって、該活性化Ｔリンパ球を患者に戻し投与するためにＴリンパ球を集める前に再刺激する工程をさらに含んでなり、該再刺激手順が、
活性化Ｔリンパ球を少なくとも１つのサイトカインと接触させ、これにより活性化Ｔ細胞の増殖を促進させ；そして
活性化Ｔ細胞を、照射した自己非−ＣＤ８＋細胞、接着非ＣＤ８⁺細胞または不活性化されたａＡＰＣｓとインキュベーションし、これにより再刺激された活性化Ｔリンパ球を生成することを含む、方法。
請求項８に記載の方法であって、該少なくとも１つのサイトカインがＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−７，ＩＬ−１２，ＩＬ−１５，ＩＬ−１７，ＩＬ−２１，ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αからなる群より選択され、そして該活性化Ｔリンパ球が活性化細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、方法。
請求項１に記載の方法であって、該活性化Ｔリンパ球を、患者に戻し投与するためのＴリンパ球を集める前に少なくとも１回の再刺激手順の反復に供する工程をさらに含んでなり、該再刺激手順が、
活性化Ｔリンパ球を、ＩＬ−２と、ＩＬ−７，ＩＬ−１５およびＩＬ−２１からなる群より選択される少なくとも１つの他のサイトカインの組み合わせと接触させ、これにより活性化Ｔ細胞の成長、増殖または分化を促進させ；そして
活性化Ｔ細胞を、照射した自己非−ＣＤ８＋細胞または接着非ＣＤ８⁺細胞または不活性化されたａＡＰＣｓとインキュベーションして再刺激されたＴリンパ球を生成する、
ことを含む、方法。
請求項１０に記載の方法であって、該再刺激手順が、活性化Ｔリンパ球をショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のａＡＰＣｓと１〜１００Ｕ／ｍｌの濃度のＩＬ−２；１〜１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−７、１〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５および１〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１の存在下で接触させることを含む、方法。
請求項１０に記載の方法であって、該照射した自己接着非ＣＤ８⁺細胞が、照射した自己接着ＣＤ１４＋細胞を含む、方法。
請求項１０に記載の方法であって、該照射した自己非ＣＤ８＋細胞が、照射した自己ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、方法。
請求項１に記載の方法であって、該人工抗原提示細胞を、該不活性化する工程の前、その後またはそれと同時に、しかも前記接触工程前に凍結および解凍する工程をさらに含む、方法。
請求項１に記載の方法であって、該不活性化された人工抗原提示細胞が、増殖できず、そして混入物を含まない、方法。
請求項１に記載の方法であって、該人工抗原提示細胞がヒト白血球ＭＨＣ抗原分子、β−２ミクログロブリン、ならびにヒトＣＤ８０（Ｂ７−１），ＬＦＡ−３（ＣＤ５８），ＣＤ８３，ＣＤ８６（Ｂ７−２）からなる群より選択される共刺激分子、またはＣＤ７０，ＴＮＦα，ＬＴ，４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０Ｌからなる群より選択されるＴＮＦファミリーのメンバー、またはＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２，ＩＣＡＭ−３およびＬＦＡ−３からなる群より選択される接着分子を含む補助する分子を発現する、方法。
請求項１６に記載の方法であって、該人工抗原提示細胞がヒトＨＬＡクラスＩＭＨＣ抗原分子ＨＬＡ２．１を発現する、方法。
請求項１７に記載の方法であって、クラスＩＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ａ２．１であり、そして補助する分子がＢ７−１（ＣＤ８０），ＬＦＡ−３（ＣＤ５８），ＣＤ７０およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）である、方法。
請求項１６に記載の方法であって、該不活性化されたａＡＰＣｓが、ＨＬＡ分子および共刺激分子でトランスフェクトしたショウジョウバエの細胞を含む、方法。
請求項１に記載の方法であって、該疾患または障害が、悪性黒色種、多発性骨髄腫、前立腺ガン、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫、甲状腺ガン、子宮ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、肺ガン、乳癌、肝臓ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、結腸ガン、皮膚ガン、胃ガン、子宮頚ガン、頭頸部ガン、神経膠腫および脳のガンからなる群より選択されるガンである、方法。
ＨＬＡ−Ａ２．１，Ｂ７−１（ＣＤ８０），ＬＦＡ−３（ＣＤ５８），ＣＤ７０およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）細胞表面タンパク質を発現し、そして以下のペプチドＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号：５），ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号：７），ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：９），ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：１０），ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号：２７），ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号：３０），ＴＬＡＫＦＳＰＹＬ（ＰＲＡＭＥ；配列番号：５４）およびＶＬＤＧＬＤＶＬＬ（配列番号：７１）を提示する不活性化された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、かつ、ａＡＰＣをソラレン、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰＳ）、４’−（アミノメチル）−４，５’，８−ソラレン（ＡＭＴ）およびアモトサレン（Ｓ５９）からなる群より選択される核酸架橋剤での処理後に光活性化用量のＵＶＡ照射に暴露することにより不活性化されたことを特徴とする、不活性化された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。