ES2261197T3 - Metodo para la deteccion de celulas t especificas de antigeno. - Google Patents

Abstract

Un método para la detección de células T específicas de antígeno que comprende: a. proporcionar una células recombinante que expresa una molécula de fusión proteína MHC de clase I-proteína fluorescente o una proteína MHC de clase I radiomarcada sobre una superficie de la célula recombinante; b. presentar un antígeno asociado con la molécula MHC de clase I de la parte (a) a una población de células T; c. incubar la molécula de fusión o la proteína MHC de clase I radiomarcada unida al antígeno específico junto con la población de células T, durante un período de 2 minutos a 6 horas, para que las células T internalicen la molécula de fusión o la proteína MHC de clase I radiomarcada de la superficie de la célula T; d. identificar las células T que adquieren el marcador detectable.

Description

Método para la detección de células T específicas de antígeno.

Antecedentes de la invención

La activación de células T requiere interacciones moleculares entre TCR y complejos MHC/péptido en células presentadoras de antígeno (APC). Aunque se sabe que el contacto con estos ligando viene seguido por la regulación negativa de TCR (1) y la interacción de células T/APC puede causar que las moléculas MHC derivadas de APC se adhieran a la superficie de células T (2, 3), el destino de los complejos MHC/péptido en las APC no está claro. Existe la hipótesis de que el reciclado de moléculas MHC permite que un único complejo MHC/péptido active varios cientos de moléculas TCR (4). En dichas circunstancias se cree que hay una asociación transitoria de MHC/péptido y TCR y el destino de MHC en las APC no está determinado por el acoplamiento de TCR. Sin embargo, la formación de conjuntos de activación supramolecular estables (SMAC) en la superficie de contacto de células T/APC (5) plantea la pregunta de cómo se disocian estos complejos.

Sumario de la invención

La internalización de los complejos MHC de clase I/antígeno por células T específicas de antígeno se ha utilizado en la presente invención para proporcionar un método para el enriquecimiento de células T específicas de antígeno a partir de una población heterogénea de células T. El método de la presente invención proporciona un medio para purificar células T específicas de antígeno individuales, o para obtener un conjunto más homogéneo de células T específicas para un antígeno particular a partir de una mezcla de células T específicas para una multitud de antígenos. Además, el método de la presente invención proporciona un medio para detectar la presencia de, y cuantificar, células T específicas para un antígeno particular presente en una población mixta de células T específicas para una multitud de antígenos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Las moléculas MHC de clase I forman conjuntos en los sitios de contacto de células T/APC. Las células T CD8^{+} 2C en reposo (A) o activadas (B) se cultivaron con APC de Drosophila que expresan L^{d-}GFP, B7-1 e ICAM-1 más péptidos QL9 o P1A 10 \muM a temperatura ambiente. Se analizó la fluorescencia GFP inmediatamente después de añadir células T a las APC en una placa de cultivo \DeltaTC3 (Bioptechs) usando un sistema de microscopía confocal (Fluoview, Olympus). Recuadros de la izquierda: fluorescencia L^{d}-GPF. Recuadros centrales: imágenes DIC (Contraste de Interferencia Diferencial) de pares células T/APC. Paneles de la derecha: superposición de la fluorescencia L^{d}-GFP e imágenes DIC. (C) Células T CD8^{+} 2C en reposo que adquieren L^{d}-GFP de APC de Drosophila (+QL9). Se realizó cada 30 segundos formación de imágenes en el tiempo después de fluorescencia L^{d}-GFP en un par célula T/APC. Las imágenes de fluorescencia L^{d}-GFP tomadas a los 5, 20 y 30 minutos respectivamente se muestran en los recuadros de la izquierda y las imágenes superpuestas de L^{d}-GFP/DIC se muestran en los recuadros de la derecha. (D) Células T CD8^{+} 2C activadas que adquieren L^{d}-GFP de una APC de Drosophila. Las células T CD8^{+} 2C activadas se pre-tiñeron con Dil 5 \muM (rojo) (Molecular Probes) antes de la incubación con APC de Drosophila (+QL9). Se muestran las imágenes de un par célula T/APC representativo. (E) Adquisición de L^{d}-GFP a partir de células RMA.S (+QL9) por células T CD8^{+} 2C activadas.

Figura 2. Adquisición mediada por TCR de moléculas MHC de clase I derivadas de APC por células T CD8^{+} 2C. Se cultivaron células T 2C en reposo con células de Drosophila que expresan L^{d}-GFP, B7-1 e ICAM-1 cargadas con péptido QL9 o P1A a 37ºC durante el tiempo indicado. La cantidad total de L^{d}-GFP y el nivel en superficie de TCR en células T CD8^{+} 2C se analizó por FACS. (A) Expresión de L^{d}-GFP y TCR en células T 2C a los 0 y 30 minutos de cultivo. (B) Cinética de la expresión de L^{d}-GFP y TCR en células T 2C. La intensidad de fluorescencia media (MFI) de L^{d}-GFP y la expresión de TCR en células T 2C se analizó en los momentos indicados con FACS. (C) Inmunoprecipitación de moléculas L^{d} de clase I derivadas de APC a partir de células T 2C. Se cultivó una cantidad titulada de células 2C (carril 1: sin células T, carril 2: 2 x 10^{7} y carril 3: 4 x 10^{7}) con 3 x 10^{6} células L marcadas con ^{35}S-metionina que expresan L^{d} (12). Después del cultivo durante 4 horas, las células T 2C se purificaron de las células L (L-L^{d}) y el lisado celular de las células 2C purificadas se inmunoprecipitó con un mAb anti-H-2^{k} o un mAb anti-L^{d} (28-14-8) (PharMingen), respectivamente. (D) La adquisición de moléculas L^{d} por células T es independiente de la interacción TCR/MHC/péptido. Se cultivaron células T 2C con células L-L^{d} más péptido QL9 durante 4 horas en presencia o ausencia de mAb según se indique. Se usó un mAb anti-TCR, 1B2 que reconoce las dos cadenas del TCR 2C y se realizó inmunoprecipitación de L^{d} como se ha descrito anteriormente.

Figura 3. Internalización de moléculas MHC de clase I derivadas de APC por células T. (A) Imágenes confocales en serie a lo largo del eje Z de una célula T 2C activada que interacciona con APC de Drosophila. Se marcaron células T CD8^{+} 2C con Dil 5 \muM (rojo) y se cultivaron con APC de Drosophila que expresan L^{d}-GFP (verde) con péptidos QL9 durante 30 minutos. (B) Co-localización de L^{d}-GFP con vesículas de membrana marcada con Dil. Se incubaron células T 2C con células RMA.S cargadas con QL9 que expresan L^{d}-GFP a 37ºC durante 2 horas. (C) L^{d}-GFP adquirida por células T 2C está en el citoplasma. Se pretrataron células T CD8^{+} 2C activadas con inhibidores de proteasa lisosomal (Cloroquina 100 \muM y E64 50 \muM) y se cultivaron con APC de Drosophila que expresaban L^{d}-GFP más los péptidos indicados durante 1 hora. Después se tiñeron con anticuerpo biotinilado específico para el receptor de transferrina, seguido por Estreptavidina-Cyt3 (PharMingen). (D) Co-localización intracelular de TCR y L^{d}-GFP en células T 2C. Después de cultivarse con APC de Drosophila que expresaban L^{d}-GFP más péptido QL9 o P1A durante 1 hora, las células 2C se tiñeron intracelularmente con un cóctel de mAb biotinilado para TCR (anti-CD3?, anti-TCR? y un mAb clonal típico, 1B2) y posteriormente con Estreptavidina-Rojo Texas.

Figura 4. Endocitosis y degradación de moléculas MHC de clase I derivadas de APC por células T. (A) Co-localización de L^{d}-GFP con transferrina (marcado como tf) y lysoTracker (marcado como ly) en células T 2C. Imágenes del recuadro de la izquierda: se cargaron células T CD8^{+} 2C activadas con transferrina conjugada con rojo Texas (5 \mug/ml) y se incubaron con APC de Drosophila cargadas con péptido QL9 (L^{d}-GFP) a 37ºC durante una hora. Imágenes del recuadro de la derecha: se incubaron células T CD8^{+} 2C activadas con células RMA.S cargadas con QL9 que expresaban L^{d}-GFP, se tiñeron con lysoTracker Red DND-99 5 nM (Molecular Probes). (B) Inhibición de L^{d}-GFP en células 2C por inhibidores lisosomales. Se cultivaron células T CD8^{+} 2C en reposo con APC de Drosophila que expresaban L^{d}-GFP más péptidos QL9 en presencia o ausencia de un cóctel de inhibidores lisosomales (NH_{4}Cl 25 mM, Cloroquina 10 mM y E64 10 \muM): Después del cultivo durante el tiempo indicado, se analizó la intensidad de fluorescencia L^{d}-GFP en células CD8^{+} 2C por FACS. (C) Degradación de moléculas MHC de clase I derivadas de APC en células 2CT. Se cultivaron células T 2C con células L transfectadas con L^{d} marcada con ^{35}S-metionina durante los tiempos indicados en ausencia o presencia de NH_{4}Cl y E64. Se realizó inmunoprecipitación de L^{d} como se ha descrito en la Figura 2. La cantidad de L^{d} restante se cuantificó por densitometría.

Figura 5. La separación por FACS de células T CD8^{+} 2C que han captado específicamente las moléculas MHC de clase I marcadas con GFP cargadas con antígeno QL9 se muestra usando diversas proporciones de células T 2C mezcladas con células T no específicas.

Descripción detallada de la invención

Se iniciaron respuestas de células T mediante el contacto con complejos MHC de clase I/péptido en células presentadoras de antígeno (APC). El destino de estos complejos, sin embargo, es desconocido. En este documento, usando APC vivas que expresan moléculas MHC de clase I fusionadas con proteína fluorescente verde, se muestra que la interacción de células T específicas de péptido/APC induce que se congreguen grupos de moléculas MHC de clase I en minutos en el sitio de contacto; después de esto, estos grupos de MHC de clase I se adquieren por células T en pequeños agregados. Se demuestra adicionalmente que la adquisición de MHC de clase I por células T está correlacionada con la regulación negativa de TCR, y que las moléculas MHC de clase I derivadas de APC se endocitan y degradan por células T. Estos datos también muestran un nuevo mecanismo por el que puede conseguirse el reconocimiento por el TCR de complejos MHC/péptido por internalización de moléculas MHC por células T.

Para investigar el destino de los complejos MHC/péptido en APC después del acoplamiento de células T, se han generado líneas celulares de mamífero y Drosophila estables que expresan moléculas de fusión L^{d} MHC de clase I-proteína fluorescente verde (L^{d}-GFP). Se construyó un vector de expresión de células de Drosophila que contenía L^{d}-GFP (JH 102) del siguiente modo: se generaron sitios de clonación Xho I y Sal I delante y detrás del codón de parada de L^{d} en el vector MJ262 (22) respectivamente por mutagénesis por PCR. Después, el fragmento de ADN de EGFP (Xho I/Not 1) se aisló del vector pEGFP-N3 (Clontech) y se subclonó en el extremo 3' de L^{d} en el vector en el vector MJ262 mutado. La secuencia de la nueva construcción (JH102) se verificó por secuenciación de ADN. Contiene la secuencia de longitud completa de L^{d} y EGFP. Se generó una secuencia de unión que codificaba 22 aminoácidos, que se obtuvo de los sitios de clonación múltiple de los vectores, entre las secuencias de L^{d} y EGFP. Se generaron líneas celulares de Drosophila estables que expresaban L^{d}-GFP con o sin moléculas B7-1 e ICAM-1 como se ha descrito previamente (9). La construcción del vector de expresión de células de mamífero L^{d}-GFP fue del siguiente modo, se aisló el fragmento de ADN Bam HI que contiene L^{d} del vector JH102 y se subclonó en el vector pEGFP-N3 (Clontech). El plásmido resultante (JH103) se transfectó en células RMA.S por electroporación, y se generó una línea celular estable que expresa L^{d}-GFP por selección con G418 (1 mg/ml). Es fácilmente evidente para los especialistas en la técnica que es adecuado cualquier medio para la producción de moléculas MHC clase I asociadas a antígeno para su uso en la presente invención. Ejemplos de métodos conocidos en la técnica incluyen, aunque sin limitación, los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.595.881, Patente de Estados Unidos Nº 5.827.737 y Patente de Estados Unidos Nº 5.731.160. También es fácilmente evidente para los especialistas en la técnica que puede fusionarse una diversidad de marcadores detectables, distintos de la proteína fluorescente verde, con la molécula MHC de clase I, y son adecuados para su uso en los métodos de la presente invención y pueden unirse a la molécula MHC de clase I por una amplia diversidad de medios. Ejemplos de marcadores detectables que pueden usarse en el método de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, radioisótopos incorporados en o unidos a la proteína MHC de clase I, o cualquier compuesto o proteína colorimétrica o fluorescente que pueda unirse a la proteína MHC de clase I, por ejemplo creando una proteína de fusión recombinante, por unión química de los compuestos o proteínas después de la traducción, o utilizando cualquier par de compañeros de unión tales como los pares de unión antígeno-anticuerpo o estreptavidina-biotina o avidina-biotina para unir el marcador detectable con la proteína.

Las líneas celulares que expresan L^{d}-GFP se usaron como células presentadoras de antígeno (APC) para presentar el péptido QL9 (7) específico a células T CD8^{+} de la línea de ratón transgénica 2C TCR (células T 2C), que reconocen específicamente el antígeno QL9 de células T (8). Como se ha presentado previamente para células de Drosophila que expresan L^{d} (9), las células de Drosophila que expresan L^{d}-GFP más dos moléculas co-estimuladoras, B7-1 e ICAM-1, indujeron la regulación negativa de TCR específico de péptido y respuestas proliferativas fuertes de células 2C, lo que indica que las moléculas L^{d}-GFP son funcionales. Salvo que se indique otra cosa, las células de Drosophila co-transfectadas con L^{d}-GFP, B7-1 e ICAM-1 (L^{d}-GFP.B7.ICAM) se usaron como APC. El péptido P1A (10), que se une fuertemente a L^{d} pero que no se reconoce por el TCR 2C (9), se usó como control de especificidad. Es fácilmente evidente para un especialista en la técnica que es adecuado cualquier medio para la presentación de antígeno a las células T para su uso en los métodos de la presente invención. Se conoce una amplia diversidad de sistemas presentadores de antígenos, incluyendo aunque sin limitación los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.595.881, la Patente de Estados Unidos Nº 5.827.737 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.731.160. También es fácilmente evidente para los especialistas en la técnica que es útil un antígeno de células T en los métodos de la presente invención. Es adecuado cualquier antígeno de células T que pueda asociarse con la proteína MHC de clase I y presentarse a células T para su uso en la presente invención. Es adecuada cualquier fuente de dichos antígenos para su uso en la presente invención, esté el antígeno sintetizado químicamente u obtenido de una fuente natural. Los antígenos pueden obtenerse de cualquier fuente y no se limitan a ningún tipo particular, con la condición de que el antígeno pueda asociarse a la proteína MHC de clase I y presentar el antígeno a las células T.

Se purificaron células T CD8^{+} 2C en reposo y se cultivaron con APC de Drosophila cargadas con péptido QL9 durante diversos períodos; después se investigó la interacción dinámica de células T y APC con un microscopio confocal (FluoView, Olympus). En unos pocos minutos de interacción de las células T 2C con APC, las moléculas L^{d}-GFP formaron grandes grupos en el sitio de contacto de células T (Figura 1A). Por el contrario, con la adición de péptido P1A de control, L^{d}-GFP permaneció homogéneamente distribuida en las APC después del contacto con células T (Figura 1A). En situaciones en las que interaccionaba una única célula T unida a más de una APC, o una APC con varias células T, se formaron grupos de L^{d}-GFP provocados por péptido QL9 específico en cada uno de los sitios de contacto de células T/APC. Se obtuvieron resultados similares con células T 2C pre-activadas (Figura 1B). La formación de grupos de L^{d}-GFP inducidos por QL9 no fue exclusivo para APC de Drosophila ya que se encontraron grupos similares cuando se usaron como APC células RMA.S transfectadas con L^{d}-GFP (11), una línea celular de ratón. Es interesante observar que la formación de grupos L^{d}-GFP dependientes de QL9 también se observó con APC de Drosophila transfectadas únicamente con L^{d}-GFP (sin B7-1 o ICAM-1). Por tanto, la formación de grupos de MHC en los sitios de contacto de células T/APC principalmente depende de la interacción TCR/MHC/péptido.

Los estudios en el tiempo de conjugados de células T/APC mostraron que los grupos de L^{d}-GFP en la superficie de contacto disminuyeron gradualmente en tamaño y finalmente desaparecieron de la APC en un período de una hora. Sorprendentemente, de forma concomitante con la reducción del tamaño de los grupos de L^{d}-GFP, aparecieron agregados puntuales pequeños de L^{d}-GFP asociados con las células T 2C tan pronto como en 15 minutos después del acoplamiento con APC. En 2 minutos de acoplamiento de las células T 2C en reposo con APC de Drosophila más péptido QL9 (Figura 1C), apareció un gran grupo de L^{d}-GFP en el sitio de contacto. Sin embargo, después de 20 minutos adicionales de cultivo, fue evidente un pequeño agregado de L^{d}-GFP en la célula T 2C; aparecieron más agregados de L^{d}-GFP en la célula T 2C después de 30 minutos de cultivo (Figura 1C). La presencia de L^{d}-GFP en células T también se investigó con células T 2C preactivadas (Figuro 1D, E). Cuando se cultivaron células T 2C activadas durante 30 minutos con APC de Drosophila transfectadas con L^{d}-GFP (Figura 1D) o células RMA.S (Figura 1E) más péptidos QL9, se observaron múltiples agregados pequeños de L^{d}-GFP en las células T 2C activadas. También aparecieron agregados de L^{d}-GFP en células T 2C activadas por un péptido de afinidad inferior, p2Ca (7), y no se observaron agregados de L^{d}-GFP en células T con el péptido P1A de control. Por tanto, la adquisición de L^{d}-GFP parece ser específica del péptido.

La adquisición específica de péptido de L^{d}-GFP por células T se estudió adicionalmente por análisis FACS. Como se muestra en la Figura 2A, se detectó L^{d}-GFP en la mayoría de las células T 2C en reposo después de cultivarse con APC de Drosophila más péptido QL9 durante 30 minutos. Por el contrario, no se observó L^{d}-GFP en células T 2C cultivadas con APC cargadas con péptido P1A de control (Figura 2A). Los estudios de cinética mostraron que, con péptido QL9, la cantidad de L^{d}-GFP adquirida por células 2C fue máxima a los 30 minutos y después disminuyó gradualmente en varias horas (Figura 2B). En 16 horas, la mayoría de L^{d}-GFP en las células T había desaparecido. La adquisición de L^{d} por células T 2C también se confirmó por análisis FACS de la expresión de L^{d} en células T 2C cultivadas con APC de Drosophila que expresaban L^{d}. Los estudios de titulación de péptidos mostraron que la adquisición de L^{d}-GFP por células T fue más prominente con una alta concentración de péptido QL9 y fue menos marcada, aunque significativa, con un péptido de afinidad inferior por células 2C, péptido p2Ca (7). La expresión de moléculas co-estimuladoras (B7-1 e ICAM-1) por APC no potenció la adquisición de moléculas L^{d}-GFP por células T 2C.

Los resultados de un análisis FACS adicional de células T después de incubación con APC y MHC marcado con GFP se muestra en la Figura 5. Se cultivó una mezcla de células T con porcentajes indicados de células T específicas de antígeno (2C) y células T no específicas de antígeno (B6) con APC de Drosophila que expresan MHC-GFP (L^{d}-GFP). Después de cultivar con el péptido antigénico (QL9) o un péptido de control (P1A) durante 1 hora a 37ºC, se analizaron las células T L^{d}-GFP^{+} por FACS. El porcentaje de células T L^{d}-GFP^{+} en cada muestra (eje Y) se trazó en un gráfico frente al porcentaje indicado de células T específicas de antígeno (2C) en esa muestra (eje X). Los datos muestran claramente la separación de células T que habían captado el marcador GFP presentado por las APC, en la proporción correcta a la cantidad de células T específicas de antígeno en la mezcla de células T.

La captación de moléculas L^{d} derivadas de APC por células T 2C se demostró adicionalmente por la adquisición de moléculas MHC 1 derivadas de APC marcadas con ^{35}S, por células T en estudios de inmunoprecipitación (Figura 2C). Se usaron fibroblastos (célula L) que expresaban L^{d} (12) como APC para estos estudios ya que a diferencia de las células de Drosophila, son adherentes, una propiedad que ayuda enormemente al aislamiento de una población pura de células T a partir de una mezcla de APC/células T. Después de cultivar las células 2C con células L transfectadas con L^{d} (L-L^{d} más péptido QL9) pudo inmunoprecipitarse L^{d} a partir de células 2C, alcanzando un pico a las 4 horas de cultivo. La cantidad de L^{d} precipitada de células 2C se correlaciona estrechamente con la cantidad de células T 2C en cultivo (Figura 2C). En presencia de un péptido de control (P1A), sin embargo, la precipitación de L^{d} fue muy limitada. No se detectaron otras moléculas de clase I expresadas en células L (D^{k} y K^{k}) en células T 2C por inmunoprecipitación (Figura 2C). Es importante observar que la adquisición dependiente de péptido de moléculas L^{d} por células T, podría bloquearse añadiendo mAb anti-TCR o anti-L^{d} al cultivo, indicando que la adquisición de L^{d} por células T requiere una interacción específica entre TCR y MHC/péptido (Figura 2D).

Es destacable que la rápida adquisición de moléculas L^{d} por células T se correlaciona con la regulación negativa igualmente rápida de TCR 2C (Figura 2B). Como la regulación negativa de TCR refleja la internalización por células T (13), las moléculas L^{d} también podrían internalizarse. Para abordar esta cuestión, se usó un colorante liposoluble de fluorescencia (Dil) (Molecular Probes) (14) para marcar la membrana de células 2C activadas. Como se muestra en la Figura 3A, después de cultivar las células T con APC que expresan L^{d}-GFP más péptido QL9 durante 30 minutos, se detectaron cantidades sustanciales de pequeños agregados L^{d}-GFP en células T activadas. Algunos de los agregados L^{d}-GFP estaban claramente en el interior de las células T mientras que otros permanecían en el sitio de contacto de células T/APC (Figura 3A). El cultivo adicional de las células T 2C marcadas con Dil con APC durante 2 horas provocó agregados visibles de L^{d}-GFP en el interior de células T 2C y estos agregados se co-localizaron con vesículas de membrana marcada con Dil (Figura 3B).

La localización intracelular de L^{d}-GFP en células T 2C se confirmó adicionalmente por tinción superficial de células T 2C con un anticuerpo monoclonal específico para el receptor de transferrina (Figura 3C). Cuando se cultivaban células T 2C activadas con APC que expresaban L^{d}-GFP durante 1 hora en presencia de péptido QL9, se detectaron agregados L^{d}-GFP en el interior de células T y mostraron una distribución perinuclear (Figura 3C). Por el contrario, no se observaron agregados L^{d}-GFP en células T 2C cuando se usaba péptido P1A (Figura 3C).

La observación anterior de que las moléculas L^{d} adquiridas por células T de APC pueden internalizarse plantea la pregunta de cómo sucede este proceso. Se sabe que los ligandos solubles se internalizan a través de endocitosis mediante hundimientos recubiertos de clatrina (15). Como la internalización de L^{d}-GFP por células T dependía de la interacción de TCR y MHC/péptido, y L^{d}-GFP se co-localizaba con TCR (Figura 3D), es posible que las moléculas MHC de APC se internalicen a través de endocitosis mediada por TCR.

Como la transferrina se internaliza por las células a través de endocitosis mediada por receptor (13), se usó transferrina conjugada con Rojo Texas como marcador para seguir el destino intracelular de L^{d}-GFP en células T 2C. Como se muestra en la Figura 4A, la transferrina se internalizó por células T y se asoció con múltiples vesículas de membrana. Los agregados L^{d}-GFP internalizados por células T presentaron un patrón similar de distribución intracelular (Figura 4A). Las imágenes superpuestas de transferrina y L^{d}-GFP indicaron que los agregados L^{d}-GFP internalizados por células T se co-localizan con las vesículas que contienen transferrina (Figura 4A). Estos datos sugieren fuertemente que, después de la interacción con TCR, las moléculas MHC derivadas de APC se internalizan por células T a través de endocitosis.

LysoTracker, un colorante fluorescente rojo que se acumula específicamente en compartimientos de pH bajo de las células (16), se usó como marcador para liposomas para rastrear el destino intracelular de L^{d}-GFP. Como se muestra en la Figura 4A, después de cultivar células T 2C con APC durante 1 hora, apareció L^{d}-GFP en los compartimientos ácidos de células T, como se indica por el colorante lysoTracker. La presencia de L^{d} en lisosomas se confirmó adicionalmente por tinción inmune de células T 2C fijadas con un mAb específico por LAMP-1, una molécula de membrana asociada con lisosomas.

La co-localización de L^{d}-GFP con lysoTracker y LAMP-1 sugiere que L^{d}-GFP endocitada por células T 2C se sometió a degradación lisosomal. Para examinar esta posibilidad, se cultivaron células 2C con APC de Drosophila L^{d}-GFP más péptido QL9 en presencia o ausencia de inhibidores lisosomales (NH_{4}Cl, Cloroquina y E64) durante hasta 6 horas y después se analizaron por FACS para la cantidad total de L^{d}-GFP. Como se muestra en la Figura 4B, la desaparición de L^{d}-GFP en células 2C se inhibió claramente por la adición de inhibidores lisosomales.

Se observaron descubrimientos similares con la inmunoprecipitación de L^{d} (Figura 4C). En el experimento mostrado, primero se cultivaron células 2C durante 4 horas con células L transfectadas con L^{d} marcada con ^{35}S más péptido QL9; para evitar la captación adicional de L^{d}, las células 2C después se separaron de las APC y se cultivaron durante 2-4 horas en presencia o ausencia de inhibidores lisosomales (NH_{4}Cl y E64). En estas condiciones libres de APC, las moléculas L^{d} en células 2C desaparecieron más rápidamente para células cultivadas en medio solo que para células cultivadas con los inhibidores.

Varios estudios han mostrado que la interacción de células T/APC puede provocar que varias moléculas de APC se adhieran a la superficie de células T (2, 3). La presente descripción demuestra que, para células CD8^{+} 2C, las moléculas MHC de clase I (L^{d}) en APC se adquieren por células T después de formar grupos de activación supramolecular (SMAC) en el sitio de interacción de células T/APC (3); la aparición de moléculas MHC de clase I derivadas de APC en SMAC es dependiente del péptido y sucede rápidamente. Además, se muestra que después de la unión a TCR, las moléculas MHC de clase I derivadas de APC se endocitan por células T y posteriormente se degradan a través de una vía lisosomal. Es interesante observar que las células T también pueden internalizar moléculas B7 de APC (3). No queda claro si B7 se degrada después de la internalización.

La interacción específica de antígeno de células T y APC induce la internalización de TCR y la degradación en lisosomas de un modo dependiente de la dosis de antígeno y del tiempo (17). En este documento se ha demostrado que los requisitos y la cinética para la internalización y degradación de moléculas MHC 1 derivadas de APC son similares a los de la internalización y degradación de TCR y que MHC derivado de APC se co-localiza con TCR en células T. Estos descubrimientos sugieren fuertemente que las moléculas MHC I y TCR se internalizan y degradan juntos por células T. De acuerdo con el modelo de desencadenamiento en serie para la activación de células T, la asociación transitoria de MHC/péptido con TCR es necesaria para la activación consecutiva de múltiples TCR (1, 4). Sin embargo, el descubrimiento de que después de la interacción específica con TCR, las moléculas MHC forman grupos estables y posteriormente se internalizan con TCR sugiere que la interacción TCR/MHC/péptido no es transitoria. Esto plantea una pregunta con respecto al papel de la co-internalización de MHC y TCR en la activación de células
T.

En el caso de ligandos solubles tales como factores de crecimiento y hormonas, se sabe que la interacción está implicada en la transducción de señales (18). Por tanto, la internalización de moléculas MHC por células T puede contribuir a la transducción de señales intracelulares mediada por TCR (19) y la co-localización de TCR y MHC en células T puede ser necesaria para la señalización por TCR sostenida (20). Se proporciona una observación similar, pero no relacionada, por el descubrimiento de que la internalización de un ligando de siete dominios transmembrana (boss) mediante un receptor específico en células T adyacentes es importante para el desarrollo del ojo en insectos (21).

Una posibilidad alternativa es que la internalización de moléculas MHC durante la interacción célula T/APC sea un dispositivo para proteger las células T respondedoras de la estimulación excesiva de APC. En este documento, es importante que la unión de moléculas MHC de clase I con células T se correlaciona estrechamente con la regulación negativa de TCR: ambos procesos tienen cinética similar, son independientes de las moléculas de co-estimulación y son mucho menos prominentes con bajas concentraciones de péptidos unidos a MHC. Por tanto, para la interacción de células T con APC que expresan altas concentraciones de péptidos, la internalización rápida de complejos TCR/MHC/péptido puede servir para reducir la intensidad de la señalización por TCR y por tanto para disminuir el riesgo de inducción a la tolerancia.

Referencias

1. S. Valitutti, S. Mueller, M. Cella, E. Padovan, A. Lanzavecchia, Nature (London) 375, 148-50 (1995); Z. Cai, et al., J. Exp. Med. 185, 641-651 (1997). T. R Preckel, M.S. Grimm, H. U. Weltzier, J. Exp. Med. 185, 1803-1813 (1997).

2. M. K. Saizawa, S. Suzuko, J. Cell Biochem. 16D'' 54 (1992).

3. M. I. Lorber, M. R. Loken, A. M. Stall, F. W. Fitch, Journal of Immunology 128, 2798-2803 (1982).

4. S. Valitutti, A. Lanzavecchia, Immunologist 3, 122-4 (1995); S. Valitutti, A. Lanzavecchia, Immunol. Today 18, 299-304 (1997).

5. C. R. F. Monks, B. A. Freiberg, H. Kupfer, N. Sciaky, A. Kupfer, Nature (London) 395, 82-86 (1998).

6. reservado

7. Y. Sykulev, et al., Immunity 1, 15-22 (1994).

8. W. C. Sha, et al., Nature 335, 271-274 (1988).

9. Z. Cai, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14736-14741 (1996).

10. B. van den Eynde, B. Lethe, A. van Pel, E. De Plaen, T. Boon, J. Exp. Med. 173, 1373-1384 (1991).

11. Townsend, et al. Cell 62, 285-95 (1990).

12. J. K. Pullen, H.D. Hunt, L. R. Pease, J. Immunol. 146, 2145-51 (1991).

13. S. Valitutti, S. Muller, M. Salio, A. Lanzavecchia, J. Exp. Med. 185, 1859-1864 (1997).

14. M.G. Honig, R.I. Hume, J. Cell Biol 103, 171-187 (1986).

15. S. Mukherjee, R. N. Ghosh, F. R Maxfield, Physiol. Rev. 77, 759-803 (1997).

16. R. Wubbolts, et al., J. Cell Biol. 135, 611-622 (1996).

17. S. Valitutti, S. Muller, M. Salio, A. Lanzavecchia, J. Exp. Med. 185, 1859-1864 (1997).

18. L. Xue. J. Lucocq, Cell. Signalling 10(5), 339-348 (1998); B.P. Ceresa, et al., Mol. Cell. Biol. 18 (7), 3862-3870 (1998); J.C. Chow, G. Condorelli, R. J. Smith, J. Biol. Chem. 273(8), 4672-4680 (1998).

19. A. Weiss, D. R Littman, Cell 76, 263-274 (1994); C. R. F. Monks, H. Kupfer, I. Tamir, A. Barlow, A. Kupfer, Nature (London) 385, 83-86 (1997); R. N. Gernain, Current Biology 7, -R644A (1997); J. J. Boniface et al. Immunity 9, 459-466 (1998).

20. A. Lanzavecchia, J. Exp. Med. 185, 1717-1719 (1997).

21. H. Kramer, R. L. Cagan, S.L. Zipursky, Nature (London) 352, 207-12 (1991): R. L. Cagan, H. Kramer, A.C. Hart, L. S. Zipursky, Cell 69, 393-399 (1992); H. Kramer, M. Phistry, J. Cell. Biol. 133, 1205-1215 (1996).

22. M. R. Jackson, E. S. Song, Y. Yang, P. A. Peterson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 12117-12121 (1992).

Claims (5)

1. Un método para la detección de células T específicas de antígeno que comprende:

a. proporcionar una células recombinante que expresa una molécula de fusión proteína MHC de clase I-proteína fluorescente o una proteína MHC de clase I radiomarcada sobre una superficie de la célula recombinante;

b. presentar un antígeno asociado con la molécula MHC de clase I de la parte (a) a una población de células T;

c. incubar la molécula de fusión o la proteína MHC de clase I radiomarcada unida al antígeno específico junto con la población de células T, durante un período de 2 minutos a 6 horas, para que las células T internalicen la molécula de fusión o la proteína MHC de clase I radiomarcada de la superficie de la célula T;

d. identificar las células T que adquieren el marcador detectable.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha proteína fluorescente es la proteína fluorescente verde.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la identificación de las células T que han adquirido la molécula de fusión proteína MHC de clase I-proteína fluorescente se hace detectando la emisión fluorescente de la molécula de fusión de proteína fluorescente.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la identificación de las células T que han internalizado la molécula de fusión proteína MHC de clase I-proteína fluorescente se hace detectando la emisión fluorescente de la molécula de fusión de proteína fluorescente en un clasificador de células activadas por fluorescencia.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicha célula recombinante es una célula de Drosophila.