EA013944B1 - Способ получения неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии и применение линии для лечения опухолей - Google Patents

Способ получения неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии и применение линии для лечения опухолей Download PDF

Info

Publication number
EA013944B1
EA013944B1 EA200300815A EA200300815A EA013944B1 EA 013944 B1 EA013944 B1 EA 013944B1 EA 200300815 A EA200300815 A EA 200300815A EA 200300815 A EA200300815 A EA 200300815A EA 013944 B1 EA013944 B1 EA 013944B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
peptides
peripheral blood
cell line
peptide
Prior art date
Application number
EA200300815A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200300815A1 (ru
Inventor
Джули Дегро
Энн Мориарти
Дидье Дж. Летюрк
Майкл Р. Джексон
Пер А. Питерсон
Марджа Хейскала
Original Assignee
Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. filed Critical Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк.
Publication of EA200300815A1 publication Critical patent/EA200300815A1/ru
Publication of EA013944B1 publication Critical patent/EA013944B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A61K39/464491—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0601—Invertebrate cells or tissues, e.g. insect cells; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55538—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Т-Клеточные реакции часто снижаются у людей с ослабленной иммунной системой. Авторы разработали способ выделения, стимуляции и размножения "наивных" цитотоксических Т-лимфоцитарных (ЦТЛ) предшественников антигенспецифичных эффекторов, способных лизировать опухолевые клетки in vivo. Такая ex vivo процедура дает полностью функциональные эффекторы. Искусственные антигенпрезентирующие клетки (нпАПК; Drosophila melanogaster) трансфицировали HLA класса I человека и определили вспомогательные молекулы, которые используются для стимуляции CD8+ Т-клеток у нормальных доноров и у раковых больных. Молекулы класса I, экспрессируемые с высокой плотностью на поверхности клеток Drosophila, являются пустыми, это позволяет эффективно нагрузить их множеством пептидов, что приводит к генерированию поликлональных ответов, распознающих опухолевые клетки, эндогенно экспрессирующие специфические пептиды. Генерируемые ответы являются сильными, антигенспецифичными и воспроизводимыми, если пептидный эпитоп представляет собой идентифицированный иммуноген. Такая искусственная система экспрессии антигена может быть адаптирована для лечения большинства видов рака у значительной части населения.

Description

Рак продолжает оставаться основной проблемой здравоохранения, несмотря на значительный прогресс, сделанный в области его лечения. Стандартные приемы лечения - химиотерапия, лучевая терапия, хирургическое вмешательство - и сочетание указанных трех направлений лечения зачастую не могут привести к длительному излечиванию. Во многих случаях проходивший лечение раковый больной через некоторый период времени испытывает рецидивы болезни, проблему усложняет также тяжесть для пациента указанных выше методов лечения.
Другой фактор, усложняющий разработку способов лечения рака, заключается в том, что, как было показано, рак вызывается не каким-то одним биологическим агентом или фактором, но скорее сочетанием таких агентов или факторов. В отличие от большинства стратегий медицинского воздействия, при которых в центре внимания при лечении находится одна единственная причина в виде одного агента или явления, вызывающих состояние болезни, терапия рака требует принимать во внимание множество биологических факторов.
В последние годы исследования были направлены на разработку методов лечения рака, при которых задействуется собственная иммунная система пациента. Один такой подход включает адоптивную иммунотерапию. Адоптивная иммунотерапия направлена на использование собственных клеток пациента с целью генерирования цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) для лечения опухолевых или раковых клеток. Однако указанная методика остается в большей части недоказанной как жизнеспособная клиническая стратегия для лечения больных людей. Кроме проблем идентификации соответствующих эпитопов для иммунизации ЦТЛ, современные методики не дают способа презентации достаточного числа различных эпитопов на АПК, с тем чтобы адекватно нацеливать множество антигенов на эффективное лечение рака.
Настоящее изобретение отвечает на насущные потребности, а также дает другие благоприятные эффекты.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к неприродным антигенпрезентирующим клеткам (нпАПК), способным к презентации одновременно до десяти или более различных пептидов, способам получения нпАПК и к способам использования указанных нпАПК для лечения рака.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: на фигуре графически представлено взаимодействие СЭ8+ клеток, известных также как цитотоксические Т-лимфоциты, с антигенпрезентирующими или клетками-мишенями, в данном случае опухолевыми клетками.
Фиг. 2, планы А и В: указанная фигура представляет собой двухплановое графическое изображение механизмов цитоза, опосредованного лимфоцитами.
Фиг. 3: на данной фигуре показаны результаты эксперимента, в котором испытывалось несколько различных пептидов в конкурентном анализе для идентификации соединений, связывающих пептиды, которые могли бы использоваться для введения множества пептидов в клетки Эгозорййа. экспрессирующие пустые молекулы класса I человека.
Фиг. 4, планы А-С: на данной фигуре показан результат эксперимента, в котором три меланомных пептида исследуют на способность повышать уровень ЦТЛ при добавлении их в качестве единственных эпитопов в клетки Эгозорййа. У одного донора активность ЦТЛ проявилась к каждому из пептидов, в случае их добавления к трем разным препаратам Эгозорйба. Специфичность ответа сравнивается с контрольным НВс пептидом, представляющим собой высокоаффинный связывающий фактор.
Фиг. 5, планы А-С: на данной фигуре показан результат серии экспериментов, в которых к каждой клетке Эгозорйба добавляют до четырех разных пептидов. ЦТЛ активность для каждого из представленных пептидов отмечается после трехнедельной стимуляции и графически изображена на данном чертеже.
Фиг. 6, планы А-С: на фигуре показана активность ЦТЛ после проведения трех различных процедур первичной стимуляции ίη уйго.
Фиг. 7, планы А и В: на фигуре показана сравнительная способность клеток ЭгозорйПа и дендритных клеток вырабатывать ЦТЛ ответ на единичный пептидный эпитоп в результате осуществления процедур стимуляции.
Фиг. 8: на данной фигуре показано, что дендритные клетки, проявляющие либо зрелый, либо незрелый фенотип, не столь эффективны, как клетки ОгозорйЛа с точки зрения вырабатывания специфических ЦТЛ ответов в случае использования определенных пептидов для стимуляции клеток.
Фиг. 9, планы А-С: на данной фигуре показана ЦТЛ активность, вызываемая единственным донором в трех разных процедурах стимуляции ίη уйго, в случае презентации четырех пептидов.
Фиг. 10: на данной фигуре показана ЦТЛ активность, вырабатываемая к десяти пептидам, введенным в клетки ЭгозорйПа.
Фиг. 11: на данной фигуре показана пептидсвязывающая способность НЕВ-2 пептидов (826, 835, 861 и 863) в клетках ОгозорйПа, трансфицированных человеческой молекулой НЙА-А2.1 класса I.
Фиг. 12: на данной фигуре показаны противопептидный и противоопухолевый ответ в случае
- 1 013944
МАК.Т-1 специфичных эффекторных клеток. В Т2 клетки был введен МАКТ-1 пептид или отрицательный контроль (НВс). Ма1те3М представляет собой линию меланомы, а Ма1те3 представляет собой неопухолевую клеточную линию.
Фиг. 13, планы А и В: на данной фигуре показано тетрамерное окрашивание ΗΕΚ.-2-специфичных ί.Ό8 эффекторных клеток от двух разных доноров.
Фиг. 14: на данной фигуре показан ответ на пептид ΗΕΚ.-2 эффекторных клеток, оцениваемый в Т2 клетках, несущих пептид.
Фиг. 15, планы А-Ό: на данной фигуре показана повышенная гибель клеток клеточной линии опухоли яичника (НТВ-77) при трансфекции НБА-А2.1.
Фиг. 16: на данной фигуре показана повышенная гибель клеток клеточной линии рака молочной железы (НТВ-133) при трансфекции НБА-А2.1.
Фиг. 17: на данной фигуре показана необходимость предварительной обработки γ-интерфероном для достижения лизиса клеток опухолевой клеточной линии НТВ-77/А2.1.
Фиг. 18, планы А и В: на данном графике показано, что поверхностная экспрессия НБА-А2 и ΗΕΚ.-2 не затрагивается индукцией γ-интерфероном в двух клеточных линиях (НТВ-77 и НТВ-77/А2.1).
Фиг. 19: на данном графике показано, для какого белка повышается уровень мРНК в клетках НТВ77/А2.1 после индукции γ-интерфероном.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, включающему:
a) получение неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК), которая способна презентировать примерно до пятнадцати различных пептидных молекул, ассоциированных с раком, предпочтительно примерно десять разных пептидных молекул одновременно, причем каждый пептид составляет примерно шесть-двенадцать аминокислот в длину, предпочтительно от восьми до десяти аминокислот в длину, и присутствует в диапазоне концентраций примерно от 10 нМ до примерно 100 мкМ;
b) сбор СЭ8+ клеток у указанного субъекта или подходящего донора;
c) стимуляцию указанных ί.Ό8+ клеток указанной клеточной линией нпАПК;
б) добавление указанных СЭ8+ клеток в среду, которая содержит цитокин, такой как ИЛ-2, ИЛ-7, или в подходящую ростовую среду (СОМ), содержащую предпочтительно ИЛ-2 или сочетание ИЛ-2 и ИЛ-7;
е) смешивание несуспендированных моноцитов периферической крови или, альтернативно, моноцитов периферической крови, истощенных по СЭ8+. собранных у указанного субъекта или подходящего донора, с примерно 10-50 мкг/мл пептида;
I) облучение указанной суспензии моноцитов периферической крови достаточной дозой гаммаизлучения, необходимой для предупреждения пролиферации указанных клеток в суспензии, такой как доза в диапазоне примерно 3000-7000 рад, предпочтительно примерно 5000 рад, и альтернативно, суспензия моноцитов периферической крови может быть обработана цитостатическими средствами, включающими митомицин С, но которые не ограничиваются им;
д) выделение прилипших моноцитов периферической крови;
II) внесение к указанным прилипшим моноцитам периферической крови примерно 10 нг/мл10 мкг/мл каждого из указанных пептидов;
ί) объединение указанных СЭ8+ клеток с указанными прилипшими моноцитами периферической крови в соотношении примерно десять СЭ8+ клеток к одному моноциту периферической крови;
_]) необязательную стимуляцию указанной объединенной суспензии СЭ8+ клеток и моноцитов периферической крови в течение примерно шести-семи дней;
k) необязательную стимуляцию указанной суспензии СЭ8+ клеток и моноцитов периферической крови с использованием ИЛ-2 и ИЛ-7 в среде;
l) необязательное тестирование суспензии СЭ8+ клеток на соответствующую ЦТЛ активность и необязательную оценку ЦТЛ на чистоту, стерильность и содержание эндотоксина; и
т) прививание СЭ8+ суспензии указанному субъекту.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака у субъекта, включающему:
a) получение неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК), которая способна презентировать примерно до пятнадцати различных пептидных молекул, ассоциированных с раком, предпочтительно примерно десять пептидов одновременно, причем каждый пептид составляет примерно от восьми до десяти аминокислот в длину;
b) сбор СЭ8+ клеток у указанного субъекта;
c) стимуляцию указанных СЭ8+ клеток указанной клеточной линией нпАПК в течение шести-семи дней;
б) стимуляцию указанных СЭ8+ клеток с использованием ИЛ-2 и ИЛ-7 в среде;
е) смешивание моноцитов периферической крови, собранных у указанного субъекта, примерно с
- 2 013944 мкг/мл каждого пептида;
I) облучение указанной суспензии моноцитов периферической крови, истощенных по СЭ8+. гаммаизлучением в 5000 рад;
д) выделение прилипших моноцитов периферической крови;
II) введение в указанные прилипшие моноциты периферической крови примерно 10 мкг/мл указанного эпитопа;
ί) объединение указанных СЭ8+ клеток с указанными прилипшими моноцитами периферической крови в соотношении примерно десять СЭ8+ клеток к одному моноциту периферической крови;
_)) стимуляцию указанной объединенной суспензии СЭ8+ клеток и моноцитов периферической крови в течение примерно шести-семи дней;
k) стимуляцию указанной суспензии СЭ8+ клеток и моноцитов периферической крови с использованием ИЛ-2 и ИЛ-7 в среде;
l) тестирование суспензии СИ8+ клеток на подходящую ЦТЛ активность. чистоту. стерильность и содержание эндотоксина и
т) прививание СИ8+ суспензии указанному субъекту.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения меланомы у субъекта. включающему:
a) получение неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК), которая способна презентировать примерно до пятнадцати различных пептидных молекул. ассоциированных с меланомой. предпочтительно примерно десять пептидов одновременно. причем каждый пептид составляет примерно от восьми до десяти аминокислот в длину;
b) сбор СИ8+ клеток у указанного субъекта;
c) стимуляцию указанных СИ8+ клеток указанной нпАПК клеточной линии в течение примерно шести-семи дней;
6) стимуляцию указанных СИ8+ клеток с использованием ИЛ-2 и ИЛ-7 в среде;
е) смешивание моноцитов периферической крови. собранных у указанного пациента. примерно с 20 мкг/мл каждого из указанных пептидов. которые указанная нпАПК может презентировать;
1) облучение указанной суспензии моноцитов периферической крови. истощенных по СИ8+. гаммаизлучением в дозе примерно 5000 рад;
д) выделение прилипших моноцитов периферической крови;
1) введение в указанные прилипшие моноциты периферической крови примерно 10 мкг/мл указанного эпитопа;
ί) объединение указанных СИ8+ клеток с указанными прилипшими моноцитами периферической крови в соотношении примерно десять СИ8+ клеток к одному моноциту периферической крови;
Ц стимуляцию указанной объединенной суспензии СИ8+ клеток и моноцитов периферической крови в течение шести-семи дней;
k) стимуляцию указанной суспензии СИ8+ клеток и моноцитов периферической крови с использованием ИЛ-2 и ИЛ-7 в среде;
l) тестирование суспензии СИ8+ клеток на соответствующую ЦТЛ активность. чистоту. стерильность и содержание эндотоксина и
т) прививание СИ8+ суспензии указанному субъекту.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения меланомы при том. что нпАПК презентирует следующие пептиды: тирозиназа369-377. тирозиназа207-216. др100209-217. др100154-162. МЛКТ-127-35. НЕК-2/иеи789-797. НЕК-2/иеи369-377. С-лектин8-16. Рес6020-29 и Рес6025-33.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения заболевания или болезненного состояния. которые приводят к развитию недостаточности или неадекватности иммунной реакции. что в норме связано с НЬЛ молекулами класса I. при котором в результате указанного лечения удаляются инфицированные или трансформированные клетки. что достигается под действием ЦТЛ.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения заболевания или болезненного состояния; которые проводят к развитию недостаточности или неадекватности иммунной реакции. что в норме связано с НЬЛ молекулами класса I. при котором инфицированные или трансформированные клетки. которые. как было показано. подвергаются удалению под действием ЦТЛ. обрабатывают способом. включающим:
a) получение неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК). которая способна презентировать примерно до пятнадцати различных пептидных молекул. ассоциированных с указанным заболеванием или болезненным состоянием. предпочтительно примерно десять разных пептидных молекул одновременно. причем каждый пептид составляет примерно от шести до двенадцати аминокислот в длину. предпочтительно примерно от восьми до десяти аминокислот в длину и присутствует в диапазоне концентраций примерно от 10 нМ до 100 мкМ;
b) сбор СИ8+ клеток у указанного субъекта или подходящего донора;
c) стимуляцию указанных СИ8+ клеток указанной нпАПК клеточной линией;
- 3 013944
б) добавление указанных СЭ8+ клеток в среду, которая содержит цитокин, такой как ИЛ-2, ИЛ-7, или в СОМ, содержащую предпочтительно ИЛ-2 или сочетание ИЛ-2 и ИЛ-7;
е) смешивание несуспендированных моноцитов периферической крови или, альтернативно, моноцитов периферической крови, истощенных по СЭ8+, собранных у указанного субъекта или подходящего донора, примерно с 10-50 мкг/мл пептида;
I) облучение указанной суспензии моноцитов периферической крови достаточной дозой гаммаизлучения, необходимой для стерилизации компонентов суспензии, за исключением желательных моноцитов периферической крови, такой, как доза в диапазоне от примерно 3000 до примерно 7000 рад, предпочтительно примерно 5000 рад;
д) выделение прилипших моноцитов периферической крови;
II) введение в указанные прилипшие моноциты периферической крови примерно 10 нг/мл-10 мкг/мл каждого из указанных пептидов;
ί) объединение указанных СЭ8+ клеток с указанными прилипшими моноцитами периферической крови в соотношении примерно десять СЭ8+ клеток к одному моноциту периферической крови;
_)) необязательную стимуляцию указанной объединенной суспензии СЭ8+ клеток и моноцитов периферической крови в течение примерно шести-семи дней;
k) необязательную стимуляцию указанной суспензии СЭ8+ клеток и моноцитов периферической крови и использование ИЛ-2 и ИЛ-7 в среде;
l) необязательное тестирование суспензии СЭ8+ клеток на подходящую ЦТЛ активность, и необязательное тестирование на ЦТЛ чистоту, стерильность и содержание эндотоксина; и
т) прививание СЭ8+ суспензии указанному субъекту.
Настоящее изобретение также относится к неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК), полученной из клеток ОтокорЫ1а те1аиодак1ет, трансфицированных ДНК, кодирующей человеческие НЬА-антигены класса I, связывающие и совместно стимулирующие молекулы для их экспрессии, причем указанная нпАПК способна к презентации до пятнадцати различных пептидных молекул, предпочтительно десяти пептидных молекул.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к нпАПК, которая презентирует пептиды, ассоциированные с различными желательными функциями, которые повышают эффективность лечения субъекта. Так, например, в дополнение к пептидам, ассоциированным с заболевание или болезненным состоянием, которое предстоит лечить, нпАПК может презентировать пептиды, ассоциированные с дополнительными молекулами, такими как антигены, связанные с функцией лимфоцитов (ЬЕА-1, ЬЕА-2 и ЬЕА-3), фактор межклеточной адгезии-1 (1САМ-1), Т-клеточные совместно стимулирующие факторы (СЭ2, СО28, В7), которые повышают межклеточную адгезию или передают дополнительные сигналы клеточной активации.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к нпАПК, которая презентирует пептиды, ассоциированные с несколькими типами рака. Так, например, пептиды, ассоциированные с полипептидом, связанным с раком молочной железы, таким как НЕК.-2/иеи, или полученные из него, могут быть презентированы с пептидами, ассоциированными с полипептидом, связанным с меланомой, таким как МАКТ-1 или МАСЕ, или полученными из него.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу производства неприродной антигенпрезентирующей клетки (нпАПК), способной презентировать до десяти разных пептидных молекул одновременно, включающему стадии:
a) получение клеточной линии насекомых из яиц ЬгокорНба те1аиодак1ег; альтернативно получение клеточной линии насекомых для экспрессии молекул МНС человека класса I и совместно стимулирующих молекул адгезии;
b) выращивание указанных клеток насекомых в среде, подходящей для роста клеток насекомых, предпочтительно на среде Шнейдера™ для дрозофил (8сйие1бег™ ОтокорЫ1а Мебшт);
c) создание плазмиды рКтНа-3 на основе вектора экспрессии рК.тНа-1, где указанная плазмида рК.тНа-3 включает промотор металлотионеина, консенсусные последовательности реакции на металл и ген алкогольдегидрогеназы, несущий сигнал полиаденилирования, выделенный из ЬгокорНба те1аиодак1ет;
б) встраивание в указанную плазмиду рК.тНа-3 комплементарной ДНК НЬА человека класса I: А2.1, В7.1, В7.2, 1САМ-1, β-2-микроглобулин и ЬЕА-3, где А2.1 может быть замещен любой последовательностью ДНК класса I человека;
е) трансфекцию указанных клеток насекомых плазмидой рйкйиео и указанной плазмидой рКтНа-3, содержащей комплементарную ДНК, и
1) создание нпАПК путем контактирования указанных клеток насекомых с Си8О4 для индукции экспрессии трансфицированных генов в указанных клетках насекомых.
Клетки насекомых согласно настоящему изобретению выращивают в среде, подходящей для культивирования клеток насекомых, которая будет ниже называться среда для выращивания насекомых. Такая среда для выращивания насекомых коммерчески доступна от множества производителей и вклю
- 4 013944 чает такие, как среда Шнейдера для культивирования дрозофил (8сйпе1бет™ Эго5орЫ1а МеФит), среда Грейса для культивирования насекомых (Огасе'8 1п5ес1 Меб1а) и среда ТС-100 для культивирования насекомых (ТС-100 1п5ес1 МеФа). Альтернативно, среды для выращивания насекомых могут быть приготовлены любым специалистом в данной области. В типичном случае среды включают компоненты, необходимые для стимулирования и поддержания роста клеток насекомых, такие как неорганические соли (например, хлорид кальция, сульфат магния, хлорид калия, фосфат калия, бикарбонат натрия, хлорид натрия и фосфат натрия), аминокислоты, различные углеводы и иные химические компоненты (1тодепе 8сйие1бет, Εχρ. Ζοοί. (1964) 156(1): рд. 91). Альтернативно, среды могут также включать витамины, минералы и другие компоненты, которые способствуют росту клеток насекомых.
Ниже приведен перечень сокращений и определений, используемых в настоящем описании. Сокращения
АПК антигенпрезентирующие клетки
СО8 +
СР8+ Т-клетки
ЦТЛ цитотоксические Т-лимфоциты
Газ
Эффектор известный также как С095, эпитоп на Т1САМ клетках фактор межклеточной адгезии-1
ИЛ
Интерлейкин
ЛАК-клетки
ЬГА главный комплекс гистосовместимости
МНС лимфокинактивированные клетки-киллеры антигены функции лимфоцитов
НПАПК неприродная антигенпрезентирующая клетка
ЯБ ядерный белок
МКПК мононуклеарные клетки периферической крови
ФБР фосфатно-буферный раствор
ПЦР полимеразно-цепьевая реакция
ΡΡΜΙ Мемориальный Институт Росвелла Парка
КИДРК1 Исследовательский Фармацевтический Институт Р.В. Джонсона
Т Мишень
ТКР Т-клеточный антигенный рецептор
ОИЕ опухолеинфильтрующие лимфоциты
Ниже приводится перечень сокращений, используемых в настоящем описании для обозначения различных пептидных эпитопов. Индивидуальные аминокислотные остатки идентифицируются в соответствии с однобуквенным кодом, который хорошо известен и используется специалистами в данной области.
Аминокислота Сокращение
3-буквенное 1-буквенное
аланин а!а А
валин уа1 V
лейцин 1еи Ь
изолейцин Не I
пролин рго Р
фенилаланин рНе г
триптофан бгр и
метионин те б м
глицин д1у с
серин зег 5
треонин рНг т
- 5 013944
цистеин суз С
тирозин Ъуг Υ
аспарагин азп N
глутамин . дкп 0
аспарагиновая кислота азр ϋ
глутаминовая кислота . д1и Е
лизин 1уз К
аргинин агд К
гистидин 613 н
Сокращения, используемые для обозначение пептидных эпитопов.
В контексте настоящего описания термин тирозиназа 369-377 или тирозиназа369-377 относится к аминокислотной последовательности ΥΜΝΟΤΜδρν (8Е0 ΙΌ N0: 1). Указанное определение также включает пептид с последовательностью ΥΜΌΟΤΜδφν (8Еф ΙΌ N0: 2), который образуется в результате посттрансляционного процесса, модифицирующего аминокислотный остаток Ν в последовательности ΥΜΝΟΤΜδρν (8Е0 ΙΌ N0: 1) на Ό, что дает аминокислотную последовательность ΥΜΌΟΤΜδφν (8ЕС ΙΌ N0: 2) (8к1ррет е1 а1., I. Ехр. Меб. (1996) 183:527-534).
Используемый также в настоящем описании термин тирозиназа 207-216 или тирозиназа2о7-216 относится к аминокислотной последовательности ЕЬР^НВЕЕЕЕ (8Еф ΙΌ N0: 3).
Используемый также в настоящем описании термин др100 209-217 или цр1002о9-2|- относится к аминокислотной последовательности ΙΤΌφνΡΕδν (8Еф ΙΌ N0: 4).
Используемый также в настоящем описании термин др100 154-162 или др100154-162'' относится к аминокислотной последовательности Ι<Τ\νθΟΥ\νθν (8Еф ΙΌ N0: 5).
В контексте настоящего описания термин ΜΆΚ.Τ-1 27-35 или ΜΑΚ.Τ-127-35 относится к аминокислотной последовательности ΑΑΟΙΟΙΌΤν (8Еф ΙΌ N0: 6).
В контексте настоящего описания термин НЕВ-2/иеи 789-797 или НЕР-2/пеи-89--9- относится к аминокислотной последовательности ΟΈΤδΤνΟΕν (8Еф ΙΌ N0: 7).
В контексте настоящего описания термин НЕВ-2/иеи 369-377 или НЕР-2/пеи369-3-- относится к аминокислотной последовательности ΚΙΕΟδΌΛΕΌ (8Еф ΙΌ N0: 8).
В контексте настоящего описания термин С-лектин 8-16 или С-лектин8-16 относится к аминокислотной последовательности ΚΜΆ8Κ.8ΜΚΕ (8Еф ΙΌ N0: 9).
В контексте настоящего описания термин Рес60 20-29 или Рес6020-29 относится к аминокислотной последовательности ΛΕΛΕΆΛΕΕνν (8Еф ΙΌ N0: 10).
В контексте настоящего описания термин Рес60 25-33 или Рес6025-33 относится к аминокислотной последовательности ЛЕЕ’УУОВЕУ (8Еф ΙΌ N0: 11).
В контексте настоящего описания термин С08 пептид 59-70 или С08 пептид59-70 относится к аминокислотной последовательности ΑΑЕС^^Τ^ΚΕ8С (8Еф ΙΌ N0: 12).
Термины и определения
В контексте настоящего описания термин адоптивная иммунотерапия относится к введению донорных или аутологичных Т-лимфоцитов для лечения заболевания или болезненного состояния, которые возникают в результате недостаточности или неадекватности иммунного ответа, который в норме ассоциирован с молекулами НЬА класса Ι. Адоптивная иммунотерапия представляет собой подходящее лечение для любого заболевания или болезненного состояния, при котором устранение инфицированных или трансформированных клеток достигается под действием ЦТЛ. Рассматриваемые заболевания или болезненные состояния включают, например, не ограничиваясь приведенным списком, рак и/или опухоли, такие как меланома, рак предстательной железы, молочной железы, колоректальный, желудка, горла и шеи, поджелудочной железы, шейки матки, яичников, костей, лейкоз, а также рак легкого; вирусные инфекции, такие как гепатит В, гепатит С, вирус иммунодефицита человека; бактериальные инфекции, такие как туберкулез, лепра и листериоз; и паразитические инфекции, такие как малярия.
В контексте настоящего описания термин В7.1 относится к совместно стимулирующей молекуле, ассоциированной с антигенпрезентирующими клетками.
В контексте настоящего описания термин ВС'^и относится к кармустину, также известному как 1,3-бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина.
В контексте настоящего описания термин В8Е относится к спонгиформному энцефалиту быка.
В контексте настоящего описания термин СО относится к кластерам дифференциации Тлимфоцитов (в исходном варианте), В-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и гранулоцитов, объединенным на основании антигенных эпитопов и функций.
В контексте настоящего описания термин ΌΤΙΟ относится к дакарбазину 5-(3,3-диметил-1триазено)имидазол-4-карбоксамиду.
В контексте настоящего описания термин ех νίνο или терапия ех νίνο относится к способу терапии, при которой биологический материал, обычно клетки, получают от пациента или соответствующего альтернативного источника, такого как подходящий донор, и модифицируется таким образом, что полу
- 6 013944 чаемые модифицированные клетки могут использоваться для лечения патологического состояния, которое может быть улучшено в ходе длительного или постоянного сохранения терапевтического воздействия модифицированных клеток. Лечение включает повторное введение модифицированного биологического материала пациенту, полученного либо от пациента, либо из альтернативного источника. Польза терапии ех νίνο состоит в реализации полезного потенциала лечения пациента без необходимости подвергать указанного пациента нежелательному побочному эффекту лечения. Так, например, цитокины зачастую вводят пациентам, больным раком или вирусными инфекциями, для стимуляции распространения ЦТЛ у пациента. Однако цитокины часто вызывают развитие гриппоподобных симптомов у пациентов. В рамках процедуры ех νίνο цитокины используют для стимуляции распространения ЦТЛ за пределами организма пациентов, и пациент лишь в незначительной степени подвергается воздействию побочных эффектов цитокинов. Альтернативно, в соответствующих ситуациях или состояниях, когда это приемлемо и когда рассматриваемый субъект может получить при этом пользу, такого субъекта подвергают лечению одновременно низкими малыми дозами γ-интерферона, α-интерферона и/или ИЛ-2. Ожидаемый эффект интерферонов состоит в возможной сенсибилизации раковых клеток к лизису антигенспецифичными ЦТЛ, а эффект ИЛ-2 имеет отношение к возможному повышению персистенции антигенспецифических ЦТЛ.
В контексте настоящего описания термин НЕРЕ8 относится к буферу на основе N-2гидроксиэтилпиперазин-Ы'2-этансульфоновой кислоты.
В контексте настоящего описания термин НЬА-А2.1 относится к молекулам НЬА класса I, обнаруженным примерно у 45% представителей белой расы.
В контексте настоящего описания термин МАК.Т-1 или меланомный антиген, распознаваемый Тклетками-1 относится к антигену, ассоциированному с меланомой. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты, как и различные характеристики данного антигена, описаны в патенте США № 5994523, опубликованном 30 ноября 1999 г. и озаглавленном Ме1апота Ап11деп5 апб ТЬей Ике ίη И1адпокбс апб ТЬегареиЕс Ме!1обк, в патенте США № 5874560, опубликованном 23 февраля 1999 г. и озаглавленном Ме1апота АпЦдепк апб ТЬей Ике 1п О1адпокбс апб ТЬетареибс Ме111обк, и в патенте США № 5844075, опубликованном 1 декабря 1998 г. и озаглавленном Ме1апота Ап(1депк апб ТЬей Ике ш И1адпокбс апб ТЬетареибс Ме!1обк. В частности, в патенте США № 5994523 раскрывается полноразмерная последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность МАРТ-1, показанные на фиг. 1 как последовательность 8ЕС Ш N0: 1 и последовательность 8ЕС Ш N0: 2 соответственно. Указанная фиг. 1 включена в настоящее описание в качестве ссылки.
В контексте настоящего описания термин МАСЕ относится к антигену, ассоциированному с меланомой. Аминокислотная последовательность и последовательность нуклеиновой кислоты, а также характеристики данного антигена описаны в патенте США № 6140050, опубликованном 31 октября 2000 г. и озаглавленном Мебюбк Гог ОеЮгтйнпд Вгеак! Сапсег апб Ме1апота Ьу Аккаутд Гот а Р1ига111у о! Ап11деп АккоааЮб ТНегехуИП, в патенте США № 5759783, опубликованном 2 июня 1998 г. и озаглавленном Ме!1об оГ 8стеешпд Гог Сапсег Ьу Эе1ес11пд Меккепдег РХА Гог а МАСЕ-ХР Сепе, и в патенте США № 5662907, опубликованном 2 сентября 1997 г. и озаглавленном 'Тпбисбоп оГ АпЦ-Титог СуЮЮхю Т ЬутрЬосу!ек ш Нитапк Иктд 8уп1Пе(1с РерИбе Ерйорек.
В контексте настоящего описания термин МРС-10 относится к концентратору магнитных частиц.
В контексте настоящего описания термин ΝΚ клетки относится к естественным киллерным клеткам.
В контексте настоящего описания термин 0КТ3 относится к ОРТНОСБОХЕ 0КТ3, тиготопаЬСО3, моноклональному антителу против СО3.
В контексте настоящего описания термин ТАР-1,2 относится к переносчику, ассоциированному с процессингом антигеном-1,2.
В контексте настоящего описания термин ТЬ клетки относится к хелперным Т-клеткам, СО4+.
В контексте настоящего описания термин тирозиназа относится к белку, ассоциированному с меланомой (ВпсЬагб е! а1., 1. Ехр. Меб. (1993), 178:489-495; РоЬЬтк е! а1., Сапсег Рек. (1994), 54: 3124-3126). В патенте США № 5843648, опубликованном 1 декабря 1998 г. и озаглавленном Р15 апб Тутоктаке Ме1апота Ап11деп апб ТЬей Ике т И1адпокбс апб ТЬегареибс Ме!Ьобк, раскрываются антигенные пептиды и ассоциированные с ними полинуклеиновые кислоты, родственные тирозиназе, приведенные на фиг. 7, планы А-О, и указанный выше рисунок также включен в настоящее описание в качестве иллюстративного материала. В патенте США № 5487974, опубликованном 30 января 1996 г. и озаглавленном Ме!1об Гог ЭеЮсЬпд Сотр1ехек СогИайнпд Нитап БеикосуЮ АпЦдеп А2 (НБА-А2) Мо1еси1ек апб а Тугокшаке Эепуеб Рерббе оп АЬпогта1 Се11к, в примере 9, табл. 3 описан дополнительный пептид, ассоциированный с тирозиназой и меланомой, и указанные пример и таблица включены в настоящее описание в качестве ссылки.
В контексте настоящего описания термин др100 относится к меланомному антигену, распознаваемому опухолеинфильтрующими лимфоцитами (ОИЛ). ОИЛ, распознающий др100, ассоциирован с отторжением опухоли 1п νί\Ό (Ваккег е! а1., 1. Ехр. Меб. (1994) 179: 1005-1009; Каиакат! е! а1., 1. 1ттипо1. (1995) 154: 3961-3968). Антигенные пептиды, родственные др100, раскрыты в патенте США
- 7 013944 № 5994523, опубликованном 30 ноября 1999 г. и озаглавленном Ме1апота Апбдепк апб ТНсй Ике ίη Όίадпокбс апб ТйегареиНс Мебюбк; в патенте США № 5874560, опубликованном 23 февраля 1999 г. и озаглавленном Ме1апота Лпбдепк апб ТНей Ике ш И1адпок11с апб ТйегареиНс Мебюбк. и в патенте США № 5844075, опубликованном 1 декабря 1998 г. и озаглавленном Ме1апота Апбдепк апб ТНей Ике ш Όίадпокбс апб Тйегареибс Мебюбк. В частности, в патенте США № 5994523 раскрываются родственные др100 последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность, приведенные на фиг. 4 и 5 соответственно. Описаны также антигенные пептиды, полученные из аминокислотных последовательностей, включая те последовательности, которые идентифицированы как 8ЕС Ш N0: 27, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 и 41. Все указанные выше результаты, показанные как фиг. 4 и 5, и пептиды, идентифицированные под соответствующими номерами 8ЕС Ш N0, включены в настоящее описание в качестве ссылки.
В контексте настоящего описания термин меланома относится, не ограничиваясь приведенным списком, к меланомам, метастазирующим меланомам, меланомам, полученным из меланоцитов либо из родственным меланоцитам невусных клеток, меланосаркомам, меланокарциномам, меланоэпителиомам, 1п кйи поверхностно распространяющейся меланоме, узелковой меланоме, меланоме, протекающей по типу злокачественного лентиго, акральной лентигинозной меланоме, инвазивной меланоме или семейному атипичному пигментному невусу и меланомному синдрому (РАМ-М). Такие меланомы у млекопитающих могут быть вызваны хромосомными аномалиями, дегенеративными нарушениями роста и развития, митогенными средствами, ультрафиолетовым облучением (ИУ), вирусными инфекциями, несоответствующей экспрессией гена в тканях, изменением экспрессии гена и презентации на клетке или канцерогенными агентами. Указанные выше меланомы могут быть диагностированы, оценены или подвергнуты лечению с использованием способов, описанных в настоящем изобретении.
В контексте настоящего описания термин С-лектин относится к пептиду с последовательностью, которая, как было обнаружено, ассоциирована с раком яичников.
В контексте настоящего описания термин главный комплекс гистосовместимости или МНС представляет собой родовое обозначение, относящееся к системе гистосовместимости антигенов, описанной у разных видов и включающей систему общих антигенов лейкоцитов человека (НЬА).
В контексте настоящего описания термины эпитоп, пептидный эпитоп, антигенный пептид и иммунногенный пептид относятся к пептиду, полученному из антигена, способного вызывать клеточную иммунную реакцию у млекопитающего. Такие пептиды могут также реагировать с антителами животных, иммунизированных пептидами. Указанные пептиды могут составлять от пяти до двадцати аминокислот в длину, предпочтительно восемь-пятнадцать аминокислот в длину и наиболее предпочтительно примерно девять-десять аминокислот в длину.
В контексте настоящего описания термин Рес60 относится к пептиду с последовательностью, которая, как было показано, ассоциирована с раком яичника и молочной железы.
В контексте настоящего описания термин аналог включает любой полипептид, имеющий последовательность аминокислотных остатков, по существу, идентичную последовательностям согласно настоящему изобретению, показанным в настоящем описании, но в которых по одному или большему числу остатков произведено консервативное замещение функционально близким остатком и которые демонстрируют те соответствующие настоящему изобретению функциональные особенности, которые описаны в данном изобретении. Примеры консервативных замещений включают замещения неполярного (гидрофобного) остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другим остатком, замещение одного полярного (гидрофильного) остатка другим остатком, такого, например, остатка, как остаток, расположенный между аргинином и лизином, между глутамином и аспарагином, между глицином и серином, замещение одного основного остатка, такого как лизин, аргинин или гистидин другим остатком, или замещение одного кислого остатка, такого как аспарагеновая кислота или глутаминовая кислота или др.
В контексте настоящего описания термин консервативное замещение включает также использование химического производного остатка вместо недериватизированного остатка.
В контексте настоящего описания термин химическое производное относится к полипептиду по настоящему изобретению, который содержит один или более производных входящих в него остатков, полученных путем химической реакции функциональной боковой группы. Примеры таких производных молекул включают, например, те молекулы, в которых свободные аминогруппы были дериватизированы с образованием гидрохлоридов амина, п-толуолсульфоновых групп, карбобензоксигрупп, тбутилоксикарбонильных групп, хлорацетильных групп или формильных групп. Свободные карбоксильные группы могут быть дериватизированы с образованием солей, метиловых и этиловых эфиров или других типов сложных эфиров или гидразидов. Свободные гидроксильные группы могут быть дериватизированы с образованием О-ацильных или О-алкильных производных. Имидазольный азот в гистидине может быть дериватизирован с образованием Ν-им-бензилгистидина. Настоящее описание включает также в качестве химических производных такие белки или пептиды, которые содержат одно или более производных природных аминокислот из числа двадцати стандартных аминокислот. Так, например, 4гидроксипролин может быть замещен пролином; 5-гидроксилизин может быть замещен лизином; 3метилгистидин может быть замещен гистидином; гомосерин может быть замещен серином и орнитин
- 8 013944 может быть замещен лизином. Белки или полипептиды согласно настоящему изобретению также включают любой полипептид, содержащий одну или более вставок и/или делеций или несущий остатки, родственные последовательности полипептида, последовательность которого кодируется соответствующей нуклеиновой последовательностью согласно настоящему изобретению, при условии, что поддерживается необходимая активность.
В контексте настоящего описания термин ΉΕΚ.-2/пеи относится к онкогену, который экспрессирует или сверхэкспрессирует один или более связанных с мембраной рецептор-подобных онкогенных белков. В число тех видов рака, которые, как было показано, ассоциированы с экспрессией или сверхэкспрессией ΗΕΚ.-2/пеи, входят некоторые виды рака молочной железы, желудка, яичников, толстого кишечника и слюнной железы. Онкоген ΗΕΚ.-2/пеи является членом тирозинпротеинкиназного семейства онкогенов и характеризуется высокой степенью гомологии с рецептором эпидермального фактора роста (Ε6ΕΚ.). Было показано, что ΗΕΚ.-2/пеи играет определенную роль в росте и/или дифференциации клеток. Оказалось, что ΗΕΚ.-2/пеи индуцирует злокачественность посредством количественных механизмов, которые связаны с повышением или дерегуляцией экспрессии, по существу, нормального генного продукта. В патенте США № 6075122, опубликованном 13 июня 2000 г. и озаглавленном 1ттипе ВеасИуНу 1о ΗΕΚ-2/пеи Рго1еш £ог Όίαβποδίδ апй Тгеа1теп1 о£ Майдпапаех ш \У1ис11 1йе ΗΕΚ-2/пеи Опсодепе ίδ Аззос1а1ей, раскрываются пептиды, которые демонстрируют Т-клеточный ответ по типу СЭ8+ (колонка 12, строка 31 - колонка 13, строка 7), идентифицированные номерами 8Ε0 ΙΌ, и указанная работа включена в настоящее описание в качестве ссылки.
ΗΕΚ.-2/пеи (р185) представляет собой белковый продукт онкогена ΗΕΚ.-2/пеи. Ген ΗΕΚ.-2/пеи амплифицируется и белок ΗΕΚ.-2/пеи сверхэкспрессируется при многих видах рака, включая рак молочной железы, яичников, толстого кишечника, легкого и предстательной железы. ΗΕΚ.-2/пеи связан со злокачественной трансформацией. Он обнаружен в 50-60% карцином протоков ш 8Йи и в 20-40% всех видов рака молочной железы, а также значительной части аденокарцином, возникающих в яичниках, предстательной железе, толстом кишечнике и легком. ΗΕΚ.-2/пеи тесно связан не только со злокачественным фенотипом, но также с агрессивностью злокачественного роста и обнаруживается в одной четверти всех инвазивных видов рака молочной железы. Сверхэкспрессия ΗΕΚ.-2/пеи коррелирует с плохим прогнозом, как в случае рака молочной железы, так и в случае рака яичников. ΗΕΚ.-2/пеи представляет собой трансмембранный белок с относительной молекулярной массой 185 кДа, который составляет примерно 1255 аминокислот в длину. Он имеет домен внеклеточного связывания (ДВС) размером примерно 645 аминокислот при наличии 40% гомологии с рецептором эпидермального фактора роста (ΕΟΕΒ), высоко гидрофобным трансмембранным якорным доменом (ТМД), и цитоплазматический домен (ЦД) на карбоксильном конце размером примерно 580 аминокислот при наличии 80% гомологии с ΕΟΚΕ.
Проводимые исследования с включением в них онкогенов позволили идентифицировать по меньшей мере сорок онкогенов, действующих в злокачественных клетках и ответственных за трансформацию или связанных с трансформацией. Онкогены были классифицированы по различным группам на основании предполагаемой функции или локализации их генных продуктов (таких как белки, экспрессируемые онкогеном). Считается, что онкогены являются необходимыми также для некоторых аспектов нормальной физиологии клеток.
Рак продолжает оставаться основной проблемой здравоохранения, несмотря на значительный прогресс, сделанный в области его лечения. Стандартные режимы лечения, такие как химиотерапия, лучевая терапия, хирургическое вмешательство и объединение указанных трех форм, зачастую не способны привести к длительному излечиванию. Во многих случаях раковый больной подвергается лечению, которое часто по истечении некоторого периода времени дает рецидивы болезненного состояния и дополнительным усложнением проблемы является тяжесть таких методов лечения для пациента. В случае меланомы при использовании традиционной химиотерапии не удается достичь излечивания метастазирующей меланомы. При использовании комбинированной химиотерапии по Дартмоуту (ОаПшоШН) (ОТ1С, цисплатина, ВСХС и тамоксифен) отмечается ответная реакция у 35-50%, но длительность выживания остается лишь от шести до десяти месяцев. В случае активной химиотерапии дозой высокой интенсивности отмечается высокий уровень ремиссии, а в случае трансплантации аутологичного костного мозга - истощение гемапоэза. И тем не менее, средняя длительность выживания сохраняется короткой, примерно четыре месяца.
Розенберг (ВозепЬегд) и сотрудники попытались использовать инфузию активированных лимфоцитов в качестве варианта лечения различных видов рака. Вначале используют лимфокинактивированные клетки-киллеры (ЛАК-клетки) и затем опухолеинфильтрующие лимфоциты (ОИЛ), активированные ех У1уо ИЛ-2, но при этом не было получено четких доказательств достигаемой эффективности. Фактически, контролируемые клинические испытания не выявили преимуществ использования ех у1уо активированных клеток в сравнении с прямым введением ИЛ-2 пациенту. Таким образом, эффект терапии ЛАКклетками и ОИЛ был незначительным, а побочные эффекты в типичном случае были столь тяжелыми, что во многих испытаниях пришлось прекратить лечение преждевременно.
Исследования на моделях опухоли мышей показали, что адоптивная иммунотерапия путем иммунизации Т-клетками ш у1уо, специфичными к опухолевому(ым) антигену(ам), очень эффективна и характе
- 9 013944 ризуется минимальной токсичностью. Основным препятствием в применении указанной стратегии для лечения опухолей человека является идентификация иммуногенных антигенов, которые придают опухолевым клеткам подверженность к разрушению, опосредованную цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). Выделение опухолереактивных Т-клеток от пациентов с меланомой позволило идентифицировать некоторые опухолевые антигены (эпитопы), против которых нацеливаются ЦТЛ. Они включают тирозиназу (Впсйагб е! а1., 1. Ехр. Меб. (1993), 178:489-495; ВоЬЬшк е! а1., Сапсег Век. (1994), 54: 3124-3126), МАКТ/1 Ме1ап А (Ка^акаш1 е! а1., 1. Ехр Меб. (1994) 180: 347-352), др100 (Ваккег е! а1., 1. Ехр. Меб. (1994) 179:1005-1009; и Ка^акаш1 е! а1., 1. 1ттипо1. (1995) 154: 3961-3968) и МАСЕ (Оаид1ег е! а1., 1. Ехр. Меб. (1994), 179:921-930). Из приведенного перечня тирозиназа и МАВТ-1 почти повсеместно экспрессируются при меланомах и таким образом могут стать логическим выбором для проведения адоптивной иммунотерапии.
В последние годы у небольшого процента пациентов с меланомой, подвергавшихся иммунологическому лечению, отмечается значительное улучшение выживания, порядка нескольких лет. Такие достижения связаны с активной специфической иммунотерапией с использованием раковых вакцин, а также неспецифических усилителей иммунной системы, таких как цитокины, например ИЛ-2, α-интерферон и γ-интерферон. Однако благоприятный эффект цитокинов снижается за счет побочных эффектов, которые сопровождают их использование, таких как тошнота и лихорадочное состояние.
Цитолитические Т-клетки (СИ8+) представляют собой основную линию защиты против вирусных инфекций. СИ8+ лимфоциты специфически распознают и уничтожают клетки-хозяев, которые инфицированы вирусом. Теоретически в этом может заключаться возможность стимулировать иммунную систему для борьбы с другими видами заболеваний, включая рак. Однако доступно лишь несколько ίη уйго/ех νίνο процедур для специфической активации ЦТЛ. Идентификация указанных выше ключевых меланомных антигенов и наличие способа специфической активации ЦТЛ ίη νίίτο, который будет описан далее, позволяют рассмотреть концепцию адоптивной иммунотерапии метастазирующей меланомы.
Все наивные Т-клетки требуют двух сигналов для активации и проявления иммунного ответа. В случае СИ8+ лимфоцитов (ЦТЛ) первый сигнал, который определяет специфичность, включает презентацию СИ8+ клетки иммуногенного пептидного фрагмента (эпитопа) антигена, связанного с комплексом МНС класса I (НЬА), представленным на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК). Указанный комплекс специфически распознается рецептором Т-клеточного антигена (ТКР), который передает сигнал внутри клетки.
Связывание с Т-клеточным рецептором необходимо, но недостаточно для индуцирования активации Т-клеток и обычно не ведет к клеточной пролиферации или секреции цитокина. Для полной активации требуется второй костимулирующий(е) сигнал(ы), и такие сигналы служат для дальнейшего усиления активирующего каскада. В число действующих на антигенпрезентирующих клетках костимулирующих молекул входят В7 и молекулы клеточной адгезии (интегрины), такие как 1САМ-1, которые способствуют протеканию указанного процесса за счет связывания с СИ28 или ЬЕА-1, соответственно, на Тклетке. Когда СИ8+ взаимодействуют с антигенпрезентирующей клеткой, несущей иммуногенный пептид (эпитоп), связанный с молекулой МНС класса I при наличии взаимодействия с костимулирующей молекулой, СИ8+ также становится полностью активированной цитолитической Т-клеткой.
Опосредованное лимфоцитами уничтожение клеток включает последовательность биологических явлений, начинающихся со связывания ЦТЛ СИ8+ с несущей антиген (опухолевой) клеткой в ходе процесса распознавания, описанного выше для случая Т-клеточной активации.
Описанное выше взаимодействие между СИ8+ клетками и антигенпрезентирующими клетками или (опухолевыми) клетками-мишенями проиллюстрировано на фиг. 1. Взаимодействие начинается со связывания антигена, находящегося в ассоциированном состоянии с молекулой МНС класса I на АПК или клетке-мишени, к рецептору Т-клеточного антигена (ТКР). Вспомогательные молекулы, такие как антигены функции лимфоцитов (ЬЕА-1, ЬЕА-2 и ЬЕА-3), молекула межклеточной адгезии-1 (1САМ-1), а также совместно стимулирующие Т-клеточные факторы (СИ2, СИ28, В7) повышают межклеточную адгезию или переносят дополнительные сигналы активации клетки.
После межклеточного взаимодействия ЦТЛ уничтожает клетку-мишень за счет действия растворимых цитолитических медиаторов (перфорин и гранзимы, хранящиеся в цитоплазматических гранулах Тклетки) и молекулы на поверхности ЦТЛ (Еак-лиганд). После цитолиточеского воздействия клеткимишени погибают вследствие некроза (перфорация мембраны и разрушения органелл) или апоптоза (конденсация хроматина, фрагментация ДНК и образование пузырьков на мембране).
Механизмы опосредованного лимфоцитами цитолиза графически представлены на фиг. 2. На плане А фиг. 2 видно, что после связывания с клеткой-мишенью цитоплазматические гранулы в ЦТЛ быстро переориентируются в направлении клетки-мишени для высвобождения гранул, содержащих перфорин и гранзимы, в межклеточное пространство. Указанные протеолитические ферменты образуют поры в плазматической мембране клетки-мишени, что постепенно приводит к некрозу клетки. На плане В видно, что после связывания с клеткой-мишенью уровень экспрессии Еак-лиганда на ЦТЛ повышается. Взаимодействие Еак-лиганда и Еак-рецептора в клетке-мишени ведет к апоптозу. В индукцию апоптоза включа
- 10 013944 ются протеазы, такие как СРР32 и другие близкие ИЛ-1Ь-конвертирующему ферменту (1СЕ). Можно использовать природные антигенпрезентирующие клетки, например дендритные клетки, макрофаги, аутологичные опухолевые клетки, для активации СЭ8+ ίη νίίτο. Однако эффективность активации при таком подходе низка. Это связано с тем, что молекулы АПК класса I содержат многие другие типы пептидных эпитопов, кроме опухолевых эпитопов. Большинство пептидов происходит из нормальных безвредных клеточных белков, что приводит к разбавлению числа активных нативных АПК, которые должны бы фактически быть эффективными против опухоли (А111коп с1 а1., Сигг. Ор. 1ттипо1. (1995) 7:682-686).
Более прямой и эффективный подход к решению данной проблемы связан со специфической активацией СЭ8+ клеток с использованием только тех эпитопов, которые релевантны для борьбы с конкретным заболеванием (таким как рак), или опухолеспецифических антигенов (таких как антигены, специфичные для меланомы). В данном случае создается искусственная антигенпрезентирующая клетка путем экспрессии молекулы МНС класса I в клетках Эгокорйба те1аподак1ег (фруктовая мушка). Поскольку ЭгокорйПа не имеет иммунной системы, переносчики ТАР-1,2 пептида, нагружающие пептидные эпитопы молекул класса I, отсутствуют. В результате молекулы класса I появляются на поверхности клеток ЭгокорШа как пустые сосуды. При инкубировании таких трансфицированных клеток Эгокорййа с экзогенными пептидами, которые связываются с молекулами класса I, такими как раковые или опухолеспецифичные эпитопы, включающими, без ограничения, специфичные к меланоме эпитопы, возможно заполнить каждую молекулу класса I указанным пептидом. Высокая плотность экспрессии молекул класса I, содержащих единичный пептид в указанных АПК Эго5ор1и1а. позволяет генерировать ίη уйго цитотоксические Т-клетки СЭ8+, которые полностью специфичны к антигенному пептиду. Способы и процедуры получения клеток Эгокорййа описаны в патенте США № 5529921, опубликованном 25 июня 1996 г. и озаглавленном 'Ίη Уйго Асбхабоп о£ СуЮЮх1с Т-Сс118 Иктд [пкес! Се11к Ехргеккшд Нитап С1акк I МНС апб в2-М1сгод1оЬи1т, и в патенте США № 5314813, опубликованном 24 мая 1994 г. и озаглавленном ЭгокорйПа Се11 Ьтек Ехргеккшд Оепек Епсобищ МНС С1акк I Апбдепк Апб в2-М1сгод1оЬи1т апб СараЬ1е о£ АккетЫшд Етр1у Сотр1ехек апб Ме1йобк о£ Мактд 8а1б Се11 Ешек. В частности, в патенте США № 5529921, в разделе от колонки 26, строка 56 до колонки 28, строка 22, описываются разные методы отделения и/или обогащения культур клеток предшественников.
Указанная особенность дополнительно устраняет необходимость стимуляции иммунной системы ίη νί\Ό высокими дозами различных цитокинов. При этом результат лечения достигается раньше, чем побочные эффекты, вызываемые цитокином.
Альтернативно, в соответствующих ситуациях или при условиях, когда это приемлемо и когда субъект может получить пользу, указанный субъект может быть подвергнут лечению одновременно дозами α-интерферона, γ-интерферона и/или ИЛ-2 на низком уровне.
Устранение необходимости стимуляции ίη νί\Ό цитокинами дает улучшение качества лечения пациента. Методы лечения, которые включают введение пациенту цитокинов, зачастую приводят к развитию у пациентов гриппоподобных симптомов, таких как тошнота, рвота и лихорадочное состояние. Указанные побочные реакции обычно не является жизнеугрожающими, хотя у пациентов, которые уже находились в ослабленном состоянии, развивается особенно тяжелая реакция, что может привести к ситуации, опасной для жизни. Другой аспект связан с неблагоприятным воздействием таких побочных реакций на восприятие и приемлемость метода лечения, который оказывал бы в ином случае полезное воздействие. Устранение необходимости стимуляции ίη νί\Ό цитокинами приводит к такому варианту метода лечения, который улучшает комфортность для пациента и предлагает клиницисту эффективный способ лечения, который более подходит пациенту.
Применимость данного способа адоптивной иммунотерапии опухоли была продемонстрирована на мышах с использованием клеток ОгокорШа, трансфицированных АПК и СЭ8+ клетками из 2С линии Тклеточного рецептора (ТКР) трансгенных мышей. В данной системе очищенные СЭ8+ из 2С клеток являются высоко реакционноспособными ίη уйго на пептиды, презентируемые МНС класса I в (Ьб)трансфицированных клетках ЭгокорШа, также несущими костимулирующие молекулы В7-1 и ГСАМ-1. Трансфицированные клетки ЭгокорйПа используют в качестве зонда для определения минимальных потребностей с целью стимуляции не примированными СЭ8+ Т-клетками (Са1 е1 а1., Ρ.Ν.Α.8. И8А (1996) 93:14736-14741). Альтернативно, в том случае, когда неотделенные клетки селезенки мышей используют в качестве клеток-респондеров вместо очищенных 2С клеток, потребность в костимулирующих молекулах отпадает. В данном случае СЭ8+ в популяции клеток селезенки получают стимул костимуляции от активированных В-клеток. Использование данного факта позволило показать, что клетки Огокорйба, (Ьб)-трансфицированные МНС класса I, способны индуцировать нормальные клетки селезенки мышей ЭВА/2 для ответа на сингенные опухолеспецифичные пептиды мастоцитомы Р815 ίη уйго в отсутствие добавляемых лимфокинов. Инъекция указанных ЦТЛ в мышей линии ЭВА/2, имеющих мастоцитому Р815, ведет к быстрой регрессии опухоли (8ип е1 а1. Iттишίу (1996) 4:555-564).
Методика состоит в том, что нормальные клетки селезенки мышей ЭВА/2 культивируют ίη уйго с клетками Огокорййа, (Еб)-трансфицированными МНС класса I, содержащим пептид РТА.35-43, опухолеспецифичный эпитоп клеточной линии мастоцитомы Р815, полученной из ЭВА/2. Как видно из фиг. 3,
- 11 013944 план А, лимфоциты, собранные из пятидневной культуры, демонстрируют мощную цитотоксическую Тлимфоцитарную (ЦТЛ) активность (ЦТЛ) в отношении опухолевых клеток Р815 ίη νίίτο, но не способны лизировать Р1024, мутантную клеточную линию Р815, которая не экспрессирует ΡΙΑ.35-43. Когда указанные ЦТЛ инъецируют мышам ΌΒΆ/2, которым за три дня до этого были инокулированы клетки Р815, опухоли растут беспрепятственно в течение первой недели, но уничтожаются впоследствии в течение следующей недели, как показано на фиг. 3, план В. Специфичность была продемонстрирована по отсутствию какого-либо воздействия на рост р815, когда ЦТЛ были иммунизированы ίη νίίτο против нерелевантного антигена, такого как нуклепротеиновый пептид вируса, как показано на фиг. 3, план В. В целом, следует отметить, что главный комплекс гистосовместимости класса I из (Ьб)-трансфицированных клеток ΟΐΌ5ορ1ιί1;·ι индуцирует ίη νίίτο ответ нормальных клеток селезенки мышей линии ИВА/2 на сингенные опухолеспецифичные пептиды мастоцитомы Р815 в отсутствие добавленных лимфокинов. Инъекции указанных ЦТЛ мышам линии ΌΒΑ/2, несущих мастоцитому Р815, ведут к быстрой регрессии опухоли (Αο1ίο1 е1 а1., I. Ехр.Меб. (1993) 178; 489-495).
Испытание на людях ίη νίίτο
Человеческие ЦТЛ от здоровых субъектов были иммунизированы ίη νίίτο против тирозиназы. После первичной стимуляции только клетками ОгоюрйПа четко выявляется специфический лизис клеток ΊΥ, содержащих тирозиназу, при всех значениях соотношений ЦТЛ эффектора к ЧУ мишени. Специфичные к тирозиназе ЦТЛ от здоровых субъектов были индуцированы с использованием полного протокола стимуляции/повторной стимуляции и исследованы на способность уничтожать клетки в клеточной линии меланомы Ма1те 3М. При наличии одного или двух возможных исключений, специфическая активность ЦТЛ против Ма1те 3М индуцируется у всех доноров в различной степени. В большей части реакционная способность в отношении контрольных опухолевых клеток Ма1те 3 была минимальна. Клетки от пациента с меланомой были также иммунизированы ίη νίίτο против тирозиназного эпитопа для генерирования ЦТЛ со сходной активностью и специфичностью относительно ЦТЛ, полученных от здоровых добровольцев.
Использование ίη νίίτο любых натуральных или искусственных систем антигенпрезентирующих клеток (АПК) для генерирования цитотоксических Т-лимфоцитов ограничено той антигенной специфичностью, которую указанные системы могут генерировать.
Приведенные ниже системы АПК были использованы для генерирования антигенспецифичных ЦТЛ к единственному для них эпитопу: 1) дендритные клетки (ДК) человека, подвергшиеся пульсовой обработке определенными пептидами; 2) мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), которые были подведены к лимфобластам и подвергнуты пульсовой обработке пептидами; 3) лимфобластоидные клеточные линии (ЛКЛ), в которых естественные пептиды подвергнуты кислотной обработке и нагружены интересующими пептидами; 4) полученные генно-инженерными методами клетки ΟΐΌ5ορ1ιί1α. с тем чтобы экспрессировать пустые молекулы класса I, и клетки 3Т3 мышей, трансфицированные молекулами класса I человека и костимулирующими молекулами (ЕВ. БаЮисйе аиб М.8абе1ат, ИаШге Вю1ес11 (2000) 18:405-409).
Дендритные клетки (ДК) считаются основной системой антигенпрезентирующих клеток у человека в связи с их широким применением для презентации первичных антигенных клеток. Собственные или чужеродные белки подвергаются процессингу внутри ДК. Полученные пептидные эпитопы презентируются молекулами НЬА и транспортируются на поверхность ДК. Однако было показано, что ДК не будут соответствующим образом генерировать ίη νίίτο ЦТЛ, направленные против четырех различных пептидов. Такой эффект может быть достигнут с помощью ЦТЛ, имеющих активность, соответствующую каждому из четырех пептидов. Кроме того, было также показано, что фенотип ДК в момент пульсовой обработки пептидом, зрелым или незрелым, не влияет на получаемый результат.
Альтернативно, стимуляция клетки ϋΓο8ορΗΐ1Η обычно приводит к появлению ЦТЛ, направленных против десяти разных типов пептидов. И при этом образуются ЦТЛ, которые обладают активностью против каждого из десяти пептидов.
По методу стандартной стимуляции была оценена способность клеток ОгоюрйПа и ДК демонстрировать реакции ЦТЛ вначале к одному пептидному эпитопу и, при последующем проведении стандартной процедуры стимуляции, к каждому. Проводят сравнение ДК и трансфицированных клеток ΌτοβοрЫ1а. Незрелые ДК получают при культивировании в течение одной недели аутологичных моноцитов в присутствии ИЛ-4 и СМ-С8Е. Зрелые ДК получают из незрелых ДК при добавлении ΤΝΡα к культуральной среде за 24 ч до сбора клеток. ДК (незрелые и зрелые) собирают, проводят пульсовую обработку пептидом, смешивают с СИ8 клетками с последующим проведением процедуры стимуляции СИ8 клеток и пульсовой обработки пептидами клеток ОгоюрйПа. Как показано на фиг. 7, в случае оценки с использованием тирозиназного пептидного эпитопа 689, клетки ОгоюрйПа в основном являются лучшими стимуляторами, чем ДК. Кроме того, ДК, проявляющие либо незрелый, либо зрелый фенотип (фиг. 8), были не столь эффективны, как клетки □[Ό^ορΜΕ-Γ в плане проявления специфичных для ЦТЛ реакций в случае использования определенных пептидов для пульсовой обработки АПК. Это представляется особенно удивительным в связи с известной доминирующей ролью, которую играют ДК в иммунной системе. Было проведено сравнительное исследование с одним донором, как показано на фиг. 9. Достигается специ
- 12 013944 фическое уничтожение четырех различных пептидов при использовании клеток плодовых мушек в качестве стимуляторов, в то время как незрелые ДК приводили лишь к незначительному специфическому уничтожению, а зрелые ДК приводили к специфическому уничтожению только одного из четырех пептидов, использованных для стимуляции.
Получение цитотоксических лимфоцитов
СЭ8+ клетки, выделенные из лейкаферезных образцов путем позитивной селекции с антителами к СИ8, стимулируют против четырех различных пептидов, ассоциированными с меланомой, презентируемых клетками ΌϊΌδορΙιίΙα. которые экспрессируют антигенные молекулы человека класса I (НЬА-А2.1), В7.1, 1САМ-1, ЬРА-3 и В7.2. СЭ8+ клетки повторно стимулируют в течение двух курсов аутологичными моноцитами, несущими пептидный эпитоп, в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-7. ЦТЛ неспецифически размножают с использованием ОКТ3 и ИЛ-2. Активность ЦТЛ измеряют относительно клеток Ма1те 3М, а чистоту СИ8+ Т-клеток оценивают методом проточной цитометрии.
Процесс получения и используемые процедуры основаны на принципах правильной лабораторной практики (Сооб ЬаЬога(огу Ргасйсез) и практики правильного производства (Сооб МаииГасШгшд Ргасйсез). Принципы правильной лабораторной практики (Сооб ЬаЬога(огу Ргасйсез) и правильной практики производства (Сооб МаииГасГОгтд Ргасйсез) представляют собой стандарты лабораторной и производственной деятельности, которые установлены Управлением США по контролю за продуктами и лекарствами и известны специалистам в данной области. ЦТЛ оценивают с точки зрения их идентичности, жизнеспособности, ЦТЛ активности, стерильности и содержания эндотоксина.
Перечень пептидных эпитопов, пригодных для использования в способах настоящего изобретения для лечения рака молочной железы и яичников, приведен в табл. 1. Для специалистов в данной области вполне очевидно, что кроме перечисленных в табл. 1, для использования в способах настоящего изобретения с целью лечения рака молочной железы и яичников будет пригодно также множество других пептидных эпитопов, при условии, что такие пептиды представляют собой Т-клеточные эпитопы.
Таблица 1 Идентифицированные ограниченные по НЬА-А2.1 эпитопы ассоциированных с опухолью антигенов в качестве мишени при лечении рака молочной железы и яичников
Мишень ΡΚΙ # АКА Последовательность Предполагаемое связывание НЕ А‘Пептид
(остатки) (ЗЕО ΙΌ ΝΟ:)
Нег-Улеи
784-797 826 Е90 СЬТЗТУОЬУ (5Е<2 Ю N0:7) 160
48-М 827 0113 НЪУОССОУУ (ЗЕО ГО N0:13)
369-377 835 £75 КГЕСЗЬАИ, (ЗЕО Ю ΝΟ: 8) 481
654-662 837 СР2 ПЗАУУОЬ (ЗЕО ГО ΝΟ: 14)
650-658 838 СР1 РЕТЗП5АУ (ЗЕО ГО N0:15)
773-782 861 УМАСУСЗРУУ (ЗЕО ГО ΝΟ: 16)
351-859 862 Е89 УЪУКЗРЫНУ (ЗЕО ГО ΝΟ: 17) 118
971-979 863 С85 ЕЬУЗЕРЗКМ (ЗЕО ГО ΝΟ: 18)
АЕ5 Аминоконец энхансера расщепленного Мо1сЬ
С128-135 893 С76 СРТТРЬРУ (ЗЕО ГО ΝΟ: 19)
мис-1 Муцин
950-958 908 1.1 ЗТАРУНЫУ (ЗЕО ГО N0:20)
СЕА Карциноэморионныи Ад
571-579 879 САР-1 (ЗЕО ГО N0:21)
ГВР Фолят-связывающий белок
191-199 914 Е39 ЕПУТНЗУКУ (ЗЕО ГО ΝΟ: 22)
С-лектин МЕ5М, КЕЬР
8-16 СВ ΚΜΛ5Β5ΜΚΓ (ЗЕО ГО ΝΟ: 9) ЦТЛ активность
77-86 С77 5ΙΕ51ΚΕΑ5Τ (ЗЕО ГО ΝΟ: 23) ЦТЛ активность
- 13 013944
Приведенные ниже примеры даны для иллюстрации настоящего изобретения и никоим образом не ограничивают изобретение содержанием приведенных примеров.
Пример 1. Получение антигенпрезентирующих клеток ОгозорйПа.
Клеточную линию 8сйпе1бег 82 получают из яиц Ьгозорйба те1аподаз!ег (Огедоп-К) по опубликованным методикам и депонируют в Американской коллекции типовых культур (Атепсап Туре СиЙиге Со11есбоп) (СКЬ 10974)). 82 клетки растят на коммерческой среде Шнейдера для дрозофил с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка.
Плазмидный вектор рКтНа-3 для экспрессии МНС класса I и костимулирующих белков в 82 клетках получают из вектора экспрессии рКтНа-1, сконструированного по методике, описанной в литературе. Он содержит промотор металлотионеина, консенсусные последовательности реакции на металл и ген алкогольдегидрогеназы, несущий сигнал полиаденилирования, выделенный из ЬгозорйПа те1аподаз!ег.
Комплементарные ДНК для трансфекции получают следующим образом.
НЬА-А2.1 и β-2 микроглобулин: методом ПЦР с обратной транскрипцией из К562 клеток с использованием праймеров, полученных из опубликованной последовательности.
В7.1: методом ПЦР с обратной транскрипцией из К562 клеток с использованием праймеров, полученных из опубликованной последовательности.
1САМ-1: методом ПЦР с обратной транскрипцией из К562 клеток с использованием праймеров, полученных из опубликованной последовательности.
В7.2: методом ПЦР с обратной транскрипцией из НЬ-60 клеток (АТСС ССЬ-240) с использованием праймеров, полученных из опубликованной последовательности.
ЬЕА-3: методом ПЦР с обратной транскрипцией из НЬ-60 клеток (АТСС ССЬ-240) с использованием праймеров, полученных из опубликованной последовательности.
Комплементарные ДНК вставляют по отдельности в вектор рКтНа-3. 82 клетки трансфицируют смесью плазмидных ДНК, кодирующих НЬА-А2.1, В7.1 и 1САМ-1, и плазмиды рйзйпео с использованием метода осаждения фосфатом кальция. Стабильно трансфицированные клетки отбирают путем культивирования на среде Шнейдера, содержащей генетицин. За 24 ч до использования индуцируют экспрессию трансфицированных генов путем добавления Си8О4. Уровень экспрессии оценивают методом проточной цитометрии с использованием антител против НЬА-А2.1, В7.1 и 1САМ-1. Для эффективной активации 1п уйго СЭ8+ лимфоцитов необходима экспрессия НЬА более чем в 30% клеток.
- 14 013944
Выделение СЭ8+ клеток человека
СЭ8+ клетки человека выделяют из лейкаферезных образцов путем позитивной селекции с использованием процедуры выделения от ЭупаЬеабк™ (Эупа1). Моноклональное антитело мыши против СЭ8 человека (50 мкг/мл в человеческом гамма-глобулине [Сашшадагб®]) добавляют к промытым клеткам в ФБР Дульбекко, содержащем 1% сывороточного альбумина человека (Вах1ег-Ну1апб) и 0,2% цитрата натрия. После инкубирования при 4°С в течение 45 мин при осторожном перемешивании клетки промывают и ресуспендируют в том же буфере, содержащем магнитные шарики Эупа1 (ЭупаЬеабб™). на которые наслоен овечий антимышиный 1дС с соотношением количества шариков и клеток, равным 1:1. Клетки и шарики помещают в стерильную пробирку и осторожно перемешивают при 4°С в течение 45 мин. В конце указанного периода времени клетки, связанные с антителами, удаляют магнитным методом с использованием сепаратора МРС-1® по инструкции производителя (Эупа1). Диссоциация комплекса клетка СЭ8 - шарик достигается путем инкубирования при 37°С в течение 45 мин в присутствии СЭ8 пептида59-70 (ААЕСЕПТОРЕ8С: 8ЕО ΙΌ N0: 12). Свободные шарики удаляют магнитным методом, подсчитывают количество СЭ8 клеток и проводят анализ методом проточной цитометрии с целью оценки их чистоты. Восстановление СЭ8+ клеток обычно превышает 80%. В табл. 2 приведены данные по составу клеток в четырнадцати отдельных препаратах СЭ8+ из нормальных препаратов человеческих МКПК путем позитивной селекции с антителом к СЭ8.
Таблица 2
Очистка СЭ8+ клеток путем позитивной селекции при проведении анализа методом проточной цитометрии
Тип клеток МКПК После селекции
Среднее значениеу % Диапазон Среднее значение, 5 Диапазон
СО8 Т-клетки 15% (7-24) 82 % (56-95)
СО4 Т-клетки 36% (14-52) 2% (0,1-10)
СЮ14 моноциты 15% (7-26) 0,8% (0,2-2)
СО15 нейтрофилы 12% (8-21) 0, 6% (0,1-3)
СЭ19 В-клетки 2% (0,4-7) 3% (0,5-9)
СЭ56 ΝΚ клетки 6% (2-17) 6% (0, 1-20)
Иммунизация ίη νίίτο очищенных человеческих клеток СИ8+ Первичная стимуляция
Трансфицированные 82 клетки Иго8орЫ1а инкубируют в среде Шнейдера (106 клеток/мл), с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка и Си804, при 27°С в течение 24 ч. Клетки собирают, промывают и ресуспендируют в среде для насекомых Х-ргекк (Вю^Ыйакег), содержащей 100 мкг/мл человеческой тирозиназы369-377. После инкубации при 27°С в течение 3 ч 82 клетки смешивают с СИ8+ клетками в соотношении 1:10 в среде ΚΡΜΙ (О1Ьео) с добавкой 10% аутологичной сыворотки. Клеточную смесь инкубируют в течение четырех дней при 37°С, в течение которых клетки Иго§орЫ1а отмирают. На пятый день добавляют ИЛ-2 (20 Ед./мл) и ИЛ-7 (30 Ед./мл) для селективного размножения популяции ЦТЛ, специфичных к тирозиназе.
Повторная стимуляция
Замороженные аутологичные МКПК, истощенные по СИ8, полученные во время лейкафереза, оттаивают, промывают и ресуспендируют в количестве 106 клеток/мл в ΚΡΜΙ среде, содержащей 10% аутологичной сыворотки (в качестве источника β-2-микроглобулина) и 20 мкг/мл тирозиназы369-377. После γ-облучения (5000 рад) клетки инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Не прилипшие клетки удаляют промыванием ФБР Дульбекко. К прилипшим моноцитам добавляют тирозиназный эпитоп путем инкубирования в течение 90 мин в Нерек-ΚΡΜΙ буфере, содержащем 10% аутологичной сыворотки и 10 мкг/мл тирозиназы369-377. Удаляют супернатант и суспензию ИгокорШа-активированные СИ8+ клетки (3х106 клеток/мл в ΚΡΜΙ среде с добавкой 10% аутологичной сыворотки) добавляют в соотношении 10 СИ8+ клеток к 1 прилипшему моноциту. После трех-четырех дней культивирования при 37°С добавляют ИЛ-2 (20 Ед./мл) и ИЛ-7 (30 Ед./мл) и меняют среду для селективного размножения популяции ЦТЛ, специфичных к тирозиназе.
Неспецифическое размножение
Эффекторные клетки неспецифически размножают путем культивирования их в среде ΚΡΜΙ с добавкой аутологичной сыворотки, моноклонального антитела к СИ3 (0КТ®3), ИЛ-2 и γ-облученных аутологичных МКПК.
Тестирование на активность и чистоту
Тестирование ЦТЛ
Клетки Μа1те 3Μ используют в качестве клеток-мишеней в тесте высвобождения 51Сг. 5х106 кле
- 15 013944 ток Ма1те 3М в КРМ1 среде. содержащей 4% фетальной сыворотки теленка. 1% буфера Нерек и 0.25% гентамицина. метят при 37°С в течение 1 ч с использованием 1 тС1 51Сг. Клетки промывают четыре раза и разбавляют до концентрации 105 клеток/мл в среде КРМ1 с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка (НуС1оие). Объединяют на 96-луночных микротитрационных планшетах 100 мкл эффекторных ЦТЛ и 100 мкл несущих пептид 51Сг-меченых клеток-мишеней Ма1те 3М в соотношениях 100:1. 20:1 и 4:1 (эффектор: клетка-мишень). Добавляют клетки К562 в соотношении 20:1 (К562: Ма1те 3М) для снижения фонового лизиса естественных киллерных клеток. Неспецифичный лизис оценивают с использованием неопухолевой клеточной линии фибробластов НЬА-А2.1 - Ма1те 3М. Включают в двойном повторе контрольные варианты для оценки спонтанного высвобождения и максимального высвобождения 51Сг. После инкубации при 37°С в течение 6 ч планшеты центрифугируют и подсчитывают уровень радиоактивности супернатантов для определения высвобождения 51Сг.
Процент специфического лизиса вычисляется с использованием следующего уравнения:
имп/мин образца - имп/мин спонтанного высвобождения х 100 имп/мин максим, высвобождения - имп/мин спонтан. высвобождения
Проточная цитометрия
СЭ8+ клетки до и после инкубации ίη νίΐΓΟ анализируют с целью определения количества маркеров клеточной поверхности с использованием флуоресцентных моноклональных антител и РАС8-анализа. Результаты типичной процедуры активации с использованием клеток от здорового донора приведены в табл. 3.
Таблица 3
Анализ методом проточной цитометрии активированных ίη νίΐΓΟ СЭ8+ клеток
Маркер/клеточный тип До активации (среднее значение,%) После активации (среднее значение,%)
СО8 Т-клетки 98 99
ΤΚΡαβ Т-клеточный рецептор 98 92
СЭ44 хоминг-рецептор лимфатического узла 91 99
СЭ45КО Т-клетка памяти 58 88
СО45КА 41 31
СО62Ь НЕУ хоминг-рецептор 24 38
6Ρ56ΝΚ клетка 1 11
СР25 активированная Т-клетка 0, 1 29
Препараты ЦТЛ анализируют помимо теста на активность и чистоту. на стерильность и содержание эндотоксина.
Реагенты
Реагент Поставщик Степень Примечания
гл ИЛ-2 СЫгоп Американская Фармакопея Стерильный раствор
гН ИЛ-7 Сепгуше Чистый для анализа Лиофилизированный стерильный раствор
Человеческая тирозиназаз 69-377 Чистый для анализа
ОупаЬеайз® М-450 Оупа1 СИР Магнитные шарики, содержащие овечий антимышиный 1дС
Сывороточный альбумин человека ВахЬег Американская Фармакопея Стерильный, непирогенный, свободный от вируса гепатита 25% раствор
Фетальная сыворотка теленка Сетгит Чистый для анализа Стерильный, не содержащий БСЭ, эндотоксин и микоплазму
- 16 013944
Саттадагй® ВахРег Американская Фармакопея Стерильный раствор человеческого иммуноглобулина для инъекций
Антитело к СЦ8 Чистый для анализа Моноклональное антитело мыши против человеческого СЭ8
СО8 пептид59_70 Чистый для анализа Высвобождение 0Ό8 + клеток из магнитных шариков
И6/32 АТСС Чистый для анализа Моноклональное антитело мыши против человеческих НЬА- А,В,С,
Клеточные линии
Клеточная линия Поставщик Примечания
ОгозорЪИа 32 АТСС СЙЬ 10974
М3 исзэ Меланома человека, не связанная с НИА-А2.1
Ма1ше 3 АТСС Фибробласты нормальной кожи от пациента с меланомой
Ма1те ЗМ АТСС Метастазирующая меланома из легкого (тот же пациент, что и в случае отбора Ма1те 3)
М14 □ΟΞϋ Человеческая меланома с ΗΒΑ-Ά2.1
К562 АТСС Эритролейкозная клеточная линия человека; мишень для ΝΚ-клеток
ДУ клетки АТСС ΕΒν-трансформированная линия Вклеток человека, экспрессирующая НБА-А2.1 и В7
Р815 и Р1024 АТСС Клеточная линия мастоцитомы мышей ВВА/2
ДигкаЪ А2.1 АТСС Острый Т-клеточный лейкоз, трансфицированный человеческими ΗΣΑ-Α2.1
АТСС: Американская коллекция типовых культур.
Пример 2. Испытание с инфузиями цитотоксических Т-клеток против меланомы.
Цель испытания
Данный пример описывает эффективность инфузий цитотоксических Т-клеток при лечении меланомы на основе оценки следующих факторов:
1) безопасность и толерантность повторно инфузируемых аутологичных ЦТЛ, полученных после иммунизации ίη νίίΓο;
2) кинетика инфузированных ЦТЛ в системе кровообращения при оценке методом ограниченного разведения;
3) распределение ЦТЛ по организму при оценке по методу радиосцинтографии;
4) клеточный состав отобранных для биопсии узелков, определяемый иммуногистологически (ЦТЛ, ТН, ΝΚ, В-клетки), и
5) регрессия измеряемых поражений и длительность реакции, отслеживаемые в течение двух месяцев.
Группы пациентов
Для включения пациентов в указанный режим лечения требовалось наличие гистологически подтвержденной нерезектабельной злокачественной меланомы, которую можно измерить или оценить каким-либо другим способом, и наличие гаплотипа НБА-А2. Оценка до лечения включала радиологическое исследование мозга методами ЯМР-томографии или КТ-сканирования, КТ-сканирования грудной клетки и брюшной полости и физического обследования, в особенности кожи и лимфатических узлов. Общее число пациентов, подвергшихся данному курсу лечения, составило пятнадцать человек (девять мужчин и шесть женщин). Возраст варьировал от 33 до 75 лет и в среднем составлял 58 лет. Средняя продолжительность метастазирующего заболевания составляла 1,5 года. Кожный предварительный тест для выявления наличия состояния анергии проводился у 14/15 пациентов, при этом у 5/14 получен негативный результат в тесте на все семь общих оцениваемых антигенов. Пациентов подвергли скринингу на анализаторе клеток по интенсивности флуоресценции с использованием НкА-А2-специфичного моноклонального антитела (ВВ7.2) на наличие гаплотипа НБА-А2. Субтипирование проводили методом ПЦР анализа. Все пациенты, за исключением одного, представляли собой гаплотип НЬА-А*0201. за исключением пациента 08, который представлял собой гаплотип НБА-А*0205.
- 17 013944
Лечение полученными ех νί\Ό аутологичными ЦТЛ
Пятнадцать пациентов подвергают лечению в рамках данного клинического протокола. Всем пациентам проводят по меньшей мере одну инфузию аутологичных ЦТЛ. Данные по количеству циклов и дозе вводимых каждому пациенту клеток суммированы в табл. 1.
Количество клеток, полученных ίη νίϋΌ, зависит от присущих пациенту факторов, таких как количество МКПК, выделенных по методике афереза, и количество СЭ8+ клеток, имеющихся в каждом препарате МКПК. Поскольку все генерированные ίη νίΙΐΌ клетки подвергаются повторной инфузии донору, вводимые каждому пациенту дозы обязательно варьируют. С целью нормализации доз от пациента к пациенту для каждой дозы подсчитывается балл мощности. Указанное значение получают при умножении общего числа клеток на литическую активность, полученную на клетках-мишенях, несущих пептид. Дозы введенных инфузией Т-клеток варьируют от минимального числа 4х107 (пациент 08) до максимального числа 3,2х109 (пациент 13). Пациентов допускают на второй, третий или четвертый циклы лечения с учетом их клинического состояния в конце каждого цикла. Количество МКПК, получаемых из аферезных образцов, снижается у пациентов, подвергшихся дополнительным циклам, особенно если начало последующего цикла следует достаточно близко за окончанием предыдущего. Это объясняют персистирующей лимфопенией, определяемой введением во время предшествующего цикла ШЫа-2Ь. Общее число выделенных нативных СЭ8+ клеток зависит от их процента в каждом из препаратов МКПК. Процент СЭ8+ Т-клеток варьирует от 8 до 31% в группах пациентов. Полученный фактор экспансии также вносит свой вклад в окончательное количество клеток и варьирует от 0,1 до 6,0 раз. Процедура получения ЦТЛ ех νί\Ό приведена в описании и в примере 1 выше.
Позитивная регуляция антигенов класса I и антигенов, ассоциированных с меланомой, введением ШЫа-2Ь
С целью усиления способности антигенспецифичных ЦТЛ лизировать клетки меланомы ίη νί\Ό вводят низкие дозы ШЫа-2Ь в течение пяти последовательных дней перед инфузией ЦТЛ и три раза в неделю еще в течение четырех недель. Одним из способов оценки реакции ίη νί\Ό на цитокин является иммуногистохимический анализ биопсийных образцов, полученных в серии временных точек, на положительное окрашивание специфичными антителами. Серию биопсийных образцов получают от одного пациента с множественными поражениями кожи (пациент 04) для оценки класса I и экспрессии антигена. Исследование биопсийных образцов показывает, что класс I и экспрессия МАКТ-1 являются слабо положительными до начала любого лечения (биопсия А). После пятидневного подкожного введения 10 МЕ/м2 отмечается резкое увеличение обоих маркеров (биопсия В). На тирозиназу и др100 иммуногистохимическое окрашивание дает результаты от отрицательного до слабо положительного, соответственно, в образцах до лечения (биопсия А). После введения начальной дозы α-интерферона в течение пяти дней и 13 дополнительных дней лечения экспрессия указанных поздних антигенов повышается, что отмечается по окраске образцов ткани (биопсия С).
Антигенная специфичность ЦТЛ, полученных ех νί\Ό
ЦТЛ, полученные от всех пациентов, оценивают на день высвобождения против клеток-мишеней Т2, несущих пептид, клеточной линии меланомы с НБА-А2 (Ма1те 3М) и аутологичной линии меланомы, если биопсийный материал возможно установить в виде клеточной линии. Каждую подготовленную дозу клеток оценивают на цитолитическую активность. Для определения специфичности ЦТЛ реакции, полученной для каждого пациента, используют Т2 клетки, который несут пептид, презентируя либо каждый пептид в отдельности, либо все четыре пептида одновременно. Способность лизировать эндогенно экспрессирующие, ассоциированные с меланомой и несущие антиген клетки оценивают с использованием маркированной по НБА-А2 линии или аутологичной опухолевой линии. В дополнение к цитолитической активности, антигенную специфичность оценивают по установленному методу обнаружения внутриклеточной продукции гамма-интерферона на основании ответа на специфический пептидный стимул. ЦТЛ, генерируемые в конце протокола ех νίνΌ, оценивают по данному методу. Отмечают процент клеток, специфичных для каждого из пептидов. Общее число специфичных клеток в каждой культуре СЭ8 от пациента 13 подсчитывают путем сложения значения каждого из факторов, определяющих пептидную специфичность, обнаруженную в популяции Т-клеток. Увеличение общего числа специфичных клеток может быть обнаружено в каждом из последовательных циклов лечения.
Обнаружение СЭ8 и СЭ4 клеток, инфильтрующих биопсийные образцы опухоли после ЦТЛ терапии
Биопсийные образцы, отбираемые от всех пациентов до, во время и после лечения, должны быть идеальными. Однако экспериментальные условия позволили отобрать биопсийные образцы только у ограниченного числа пациентов. Опухолевая ткань была получена от пяти из пятнадцати пациентов, включенных в исследование. У двух пациентов (пациенты 08 и 13) биопсийные образцы были доступны на пятую и шестую недели соответственно после проведения Т-клеточной терапии. Обследование тканевых образцов выявило наличие инфильтрующих СЭ8 и СЭ4 клеток. Один из опухолевых образцов был взят из кожного поражения в участке кожи затылочной области, которая увеличилась в размере ко времени повторного обследования, через четыре недели после второй инфузии Т-клеток. Биопсия выявила некроз ткани, которая подверглась усиленной инфильтрации лимфоцитами. Другой биопсийный образец был
- 18 013944 взят из головки бедренной кости, удаленной в ходе заместительной хирургии бедра. Кожные поражения у пациента 08 были очень положительными (4+) как на общий класс I, так и на специфический НЬА-А2 маркер. Тест на тирозиназу и др 100 был слабо положительным (1+ и 2+, соответственно), тогда как тест на МАКТ-1 в том же образце был отрицательным. Участки отбора биопсийных образцов у пациента 13 были также некротизированы, с более гетерогенным окрашиванием; отмечались четкие популяции опухолевых клеток, не экспрессирующих НЬА-А2.1 молекулы и одна или более МАА. Однако интактные тканевые области демонстрируют выраженный показатель класса I (4+) и наличие всех ассоциированных с меланомой антигенов. Оказалось, что лимфоцитарная инфильтрация в последнем образце сосредоточена вокруг опухолевых узелков, а не проникает вглубь. Однако наибольший процент клеток, непосредственно ассоциированных с опухолями, составляют 0Ό8 клетки. Отсутствие у обоих пациентов биопсийных образцов, отобранных до лечения, не позволило получить подтверждения сходства типов инфильтрующих клеток в образцах тканей, имевших место до лечения.
КТ сканограммы после проведения Т-клеточной терапии подтверждают объективный характер реакции
КТ сканограммы представляют собой часть критериев, используемых при скрининге до лечения и при оценке результатов после лечения. Пациент 10 получал однократную инфузию 8χ108 ЦТЛ (7/27/99) через пять недель после проведения сканирования перед лечением (6/23/99). При повторении КТсканирования грудной клетки через месяц после инфузии (8/27/99) отмечается резкое уменьшение размеров поражения легкого. Аналогично, пациент 14 подвергался КТ-сканированию грудной клетки, в качестве составной части процесса подбора пациентов в испытание (9/10/99), за три недели и полнедели перед проведением первой инфузии с использованием 6,6χ108 клеток (10/5/99). Последующий мониторинг с использованием КТ-сканирования (1/7/99), через месяц после второй инфузии с использованием 11,5 χ 108 клеток выявил резкое сокращение трех отдельных поражений. Пациент 13 также продемонстрировал объективную реакцию, измеряемую по параметрам КТ-сканирования до и после лечения. Паратрахеальная аденопатия изменялась от 7,8 см2 (до исследования) до 4,4 см2 после цикла I и исчезала после цикла II.
Наличие анергического состояния не предотвращает способности генерировать ЦТЛ или не препятствует развитию клинической реакции
Большинство пациентов, проходивших лечение по данной методике, подвергались предварительному медицинскому вмешательству. Проводят кожный тест перед лечением для определения того, коррелирует ли анергическая реакция на группу семи общих антигенов с неспособностью генерировать ех νίνο ЦТЛ или является препятствием для развития клинической реакции. Способность генерировать ЦТЛ ех νίνο не коррелирует с результатами кожного теста, проведенного у пациентов перед лечением. Следует отметить, что у пациентов 03 и 04 (оба смешанных респондера) сделали повторные кожные тесты перед началом второго цикла, результаты которых остались анергическими.
Пример 3. Генерирование НЕК-2/пеи-специфичных ЦТЛ, способных лизировать раковые клетки молочной железы и яичников.
Авторов интересовала возможность использования разработанной ими технологии генерирования ЦТЛ в случае других типов опухоли, и следовало определить, могут ли все формы рака служить мишенями для лечения по такому методу. НЕК-2/пеи представляет собой протоонкоген, имеющий гомологию с ЕСРК, который амплифицируется и подвергается сверхэкспрессии в очень многих видах рака человека, в особенности аденокарцином молочной железы, яичников и толстого кишечника. Он зачастую ассоциируется с агрессивной формой заболевания и может быть индикатором плохого прогноза. Он был исследован в нескольких клинических испытаниях в качестве возможной мишени для лечения указанных видов рака.
В начале 90-х гг. ограниченные по НЬА-А2.1 пептидные эпитопы НЕК-2/пеи были идентифицированы либо путем компьютерного определения связывания пептида, либо путем картирования ЦТЛ, выделенных из асцитов пациентов с раком яичника (табл. 3 а).
- 19 013944
Таблица 3 а
Ограниченные по НЬЛ-Л2.1 пептиды ΗΕΒ-2/иеи
ПЕПТИДЫ ΗΕΚ-2/пеи РКЦ Другие идентифи- Местополо- Последовательность (ΒΕΟΙϋΝΟ) Ссылки
жение
матовы
48-56 827 Ц113 ЕС НЬУОССОУУ (ЗЕО ГО N0:13) Р1Я5е1а1.1994
369-377 835 Е75 ЕС КЖЗЬАЕЬ (ЗЕО ГО N0 8) Г^кйа!.. 1995
650-658 838 СР1 ТМ РЕТЗПЗАУ (ЗЕО ГО N0.15) Язкйа!.. 1995
654-662 837 СР2 ТМ ПЗАУУСЦ. (ЗЕО ГО N0:14) Реор1ее й а1., 1995
773-782 861 Ν/Α 1С ΫΜΑΟνΟΒΡΥν (ЗЕО ПЗ N016) Ьийиагйп й а!. 1997
789-797 826 Е90 1С сьтетуоьу (ЗЕО ГО МО: 7) Рйййа!.. 1994
851-859 862 Е89 1С УЕУКЗРМНУ (ЗЕО ГО N0:17) 31515 й а1„ 1994
971-979 863 С85 1С ЕЬУЙЕЕЗКМ (ЗЕО Ю N0:18) Пакйа!.. 1995
Все пептиды были синтезированы, им был присвоен идентификационный номер (РК4#) и далее они были исследованы на способность генерировать ЦТЛ ех νίνο с использованием того же метода, который авторы разработали для оценки ассоциированных с меланомой Т-клеточных пептидных эпитопов. СЭ8 клетки были выделены от нормальных доноров для определения их способности генерировать ЦТЛ ех νίνο с клетками Эго5орЬ11а, несущими известные пептидные эпитопы ЦТЛ. Пептиды 826, 835, 861 и 863 характеризовались наивысшей частотой генерирования ЦТЛ (табл. 4).
Таблица 4
Частота генерирования ΗΕΒ-2/иеи ЦТЛ у нормальных доноров
Донор 826 827 835 837 838 861 862 863
+
194 - + - - -
195 + +
196 + - * - -
127 + - + - + - +
Ж - - + - + + - +
207 ·» 4- + +
212 + + +
218 + + 4- +
- + -
233 + + +
211 +
242 +
Поскольку трансфицированные клетки ЭгоюрНПа обладают уникальной способностью презентировать до десяти различных пептидных эпитопов (фиг. 10), авторы на основании частоты генерирования ех νίνο ЦТЛ к указанным пептидам отобрали четыре ΗΕΚ.-2 пептида 826, 835, 861 и 863. Четыре различных ΗΕΚ.-2 пептида демонстрируют от слабой до умеренной способности связываться с НЬЛ-А2.1 молекулой, презентированной на поверхности трансфицированных клеток ЭгоюрНПа. Авторы решили включить А2 связывающие соединения, обладающие слабой способностью, поскольку опыт работы с ассоциированными с меланомой пептидами дает основание полагать, что слабые связывающие соединения класса I в основном способны генерировать мощные ЦТЛ, которые распознают опухолевые клетки, если в действительности они репрезентируют нативные эпитопы Т-клеток. Большинство белков, ассоциированных с опухолями, которые авторы использовали в качестве мишеней, являются собственными антигенами и в качестве таковых, как можно ожидать, обладают высокой афинностью к молекуле класса I, что отмечается в случае вирусных пептидов. Связывающие соединения со способностью от низкой до умеренной обычно генерируют ЦТЛ, которые очень эффективно лизируют опухолевые клетки. Это было показано с пептидом МАКТ-1, который является связывающим соединением с низкой аффинностью на клетках Эго§орЫ1а (фиг. 3), презентируя эпитоп, который обычно генерирует мощные ЦТЛ, способные лизировать клетки-мишени, несущие пептид (Т2) или, что важнее, меланомные клетки (Ма1те 3М) (фиг. 12).
ΗΕΒ-2/иеи является представителем семейства ΕΟΕ-Κ. и функционирует как рецептор фактора роста. Белок ΗΕΚ.-2 экспрессируется во время эмбрионального развития у человека. У взрослых указанный белок слабо выявляется в эпителиальных клетках многих нормальных тканей. В нормальных клетках ген ΗΕΚ.-2 представлен в виде единственной копии. Амплификация гена и/или сверхэкспрессия ассоциированного белка идентифицируется в случае многих видов рака человека, включая рак молочной железы, яичников, матки, желудка и аденокарциному легкого. Различия в последовательностях между ΗΕΚ.-2 и
- 20 013944 рецептором ЕСЕ-К показаны в табл. 5. Были исследованы три из четырех пептидов НЕК-2, из которых два белка несут три или более аминокислотных изменения. Уже одного изменения аминокислоты достаточно для того, чтобы оба белка различались.
Таблица 5
Сравнение НЕК-2/пеи и ЕСЕ-К
Белок Пептид # Последовател ыюсть Число изменений
(ВЕС !□ НО)
НЕЕ -2/ пей ЕСЕК «35 югеялн. (ЗЕО ГО N0 8) 515СОШП (БВЭГОМОЗТ) 5
НЕК-2/пт ЕСЕК 861 νΜΑσνοδΡίν (ЗЕОГОМОИ) νΑΑδνΟΝΡΗν (ЗЕО ГО N0 38) 5
НЕК-2/пей ЕСРК «63 {Ж2ГОЫО18) ишракм ®Ε0Π3ΝΟ39) 3
НЕЙ-2/пеи ЕСЕК 826 сьтзтуоьу (5Ε0Ι0ΝΟ7) сизгуои (5ВД ГО N040) 1
НЕК-2/пей ЕСРК 689-697 Μ.ίΟΕΓ£Ι.ν (ЗЕО 10 N0 41) ЕШЭЕКЕЬУ (ЗЕО ГО N0 42) 1
Определив, что ЦТЛ генерируется после проведения четырехнедельного протокола стимуляции ех У1уо, авторы оценили наличие пептидспецифичных клеток с использованием для этого тетрамерных молекул НБА-А2.1, полученных с помощью иммунизированных пептидов. Как показано на фиг. 13, способность генерировать пептидспецифичные ЦТЛ зависит от донора. На плане А (донор 261) показан донор, демонстрирующий мощную реакцию ЦТЛ на пептид 835 (37,55%). На плане В (донор 262) пептидспецифичные ЦТЛ могут быть обнаружены с использованием тетрамерных молекул как 835, так и 861 (3,6% и 15,1 %, соответственно). Такие результаты подтверждают полезность применения множества пептидов для гарантированного получения пептидспецифичных ЦТЛ в конце протокола стимулирования. Указанная процедура ех у1уо позволяет получать относительно легко ЦТЛ со множественной специфичностью.
Реакция против пептида и против опухоли
После завершения полной процедуры ех у1уо полученные ЦТЛ оценивают на их антигенную специфичность. Для генерирования ЦТЛ на день 0 в клетки Эгозорйба вносят сочетание четырех пептидов НЕК-2. В конце четырехнедельного протокола стимуляции ех у1уо всю культуру СЭ8 оценивают на антигенную специфичность. В качестве клеток-мишеней используют Т2 клетки, несущие каждый из иммунизирующих пептидов. На фиг. 14 показана типичная реакция. Полная культура демонстрирует специфичность к каждому из четырех НЕК-2 пептидов. Противоопухолевый ответ оценивают с использованием клеточной линии опухоли яичника (АТСС; НТВ-77). В том случае, когда клеточная линия-мишень не ограничена НБА-А2.1, авторы трансфицируют клеточную линию с получением системы +/- тестирования. Когда НБА-А2.1 трансфицируют в линию НТВ-77, отмечается усиленное уничтожение СЭ8 эффекторными клетками (фиг. 15, планы А-Ό). Оценивают НЕК-2-специфичные эффекторы, репрезентирующие индивидуальные пептиды, для подтверждения презентации каждого из пептидных эпитопов в данной клеточной линии опухоли.
Клеточную линию аденокарциномы молочной железы (АТСС; НТВ-131), трансфицированную НБА-А2.1, также оценивают на способность лизировать опухоль с использованием НЕК-2-специфичных пептидных эффекторов. ЦТЛ, специфичные к пептиду 861, могут лизировать указанную клеточную линию опухоли при трансфекции вместе с НБА-А2.1 (фиг. 16).
Лечение с использованием γ-интерферона, требуемого для лизиса опухолевой клетки
Клеточная линия НТВ-77/А2.1 для проявления пептидспецифичного лизиса требует предварительной обработки γ-интерфероном. Клетки обрабатывают 500 Ед/мл γ-интерферона (удельная активность 25 нг/мл) за 24 ч до проведения теста на высвобождение 51Сг. На фиг. 17 показано, что добавление γинтерферона приводит к усилению лизиса НЕА-А2.1-трансфицированной клеточной линии. Для определения эффекта указанной дозы γ-интерферона на поверхностную экспрессию НБА-А2.1 и НЕК-2 проводят ЕАС8-анализ для определения уровня молекул по истечении 24 и 48 ч после индукции. На фиг. 18, планы А и В, показаны результаты ЕАС8-анализа. На плане А видно отсутствие повышение уровня молекул НЕК-2 на поверхности НТВ-77 клеток по истечении 24 и 48 ч после индукции γ-интерфероном. В НЬА-А2.1-трансфицированных клетках ни НЕК-2, ни НБА-А2.1 не приводят к повышению уровня поверхностной экспрессии после проведения обработки по аналогичной процедуре. Отмечается лишь повышение уровня экспрессии ТАР-1, а также НЬА-ЭМ и НЬА-ЭК, катепсина 8 и Ό и каспазы 5, когда уровни мРНК оценивают по микротесту ДНК-чипа (фиг. 19). Получаемые при этом результаты должны
- 21 013944 объяснить, почему имеется усиление гибели НТВ-77/А2.1 клеток в присутствии γ-интерферона. Позитивная регуляция данной молекулы проводит к более эффективному процессингу молекулы НЕК-2, создавая лучшие условия для презентации интересующих пептидов.
Пептиды
Синтетические пептиды получают по стандартной технологии Ртос-химии с использованием пептидного синтезатора (С11коп Сотрапу, ΙΝΟ.). Все пептиды очищают до уровня >95% чистоты методом ВЭЖХ с обращением фазы на С-8 колонке. Чистоту и идентичность устанавливают на ионизационном масс-спектрометре с электронапылением. Ассоциированные с меланомой пептиды включают пептид 819, специфичный для МАКТ-1 (ААС1С1ЬТУ 8ЕЦ ΙΌ N0: 6), 817 и 853, которые оба являются др100 пептидами (ΙΊΌρνΡΡδν 8ЕЦ ΙΌ N0: 4 и КТАСРУАЦУ 8ЕЦ ΙΌ N0: 5 соответственно), пептиды, специфичные к тирозиназе, включают 689 и 792, при этом 792 представляет пост-трансляционный модифицированный вариант (УМЭСТМ^ЦУ 8ЕЦ ΙΌ N0: 2) нативной последовательности (ΥМNСТМ8^V 8ЕЦ ΙΌ N0: 1), представленной пептидом 689. Пептиды 826 (СБТ^ТУОБУ 8ЕЦ ΙΌ N0: 7) и 835 (КШСЗЕАРЬ 8ЕЦ ΙΌ N0: 8) представляют последовательности НЕК-2/пеи из внутриклеточного и внеклеточного доменов соответственно белка р185. Рес6020 (АЬАЬААЬЬУУ 8ЕЦ ΙΌ N0: 10) и Рес6025 (АЬЬУУЭКЕУ 8ЕЦ ΙΌ N0: 11) содержат перекрывающиеся последовательности, представляющие мукоидный белок, обнаруженный в опухолевых линиях яичников. С-лектин также является белком, обнаруженным в опухолевых клеточных линиях яичников, а пептид, получаемый на основе его последовательности (С-лектин8), имеет вид КМА8К8МКЬ 8ЕЦ ΙΌ N0: 9.
Тест на цитотоксичность ш νίΙΐΌ
Проводят стандартный анализ на высвобождение 51 Сг с целью определения способности эффекторной клетки ЦТЛ распознавать ассоциированные с меланомой пептидные эпитопы на Т2 клетках. Собирают 3х106 Т2 клеток, растущих в КΡМI +10% ФБР (среда). Добавляют 0,1 тС1 51Сг и инкубируют при 37°С в водяной бане. Меченые клетки добавляют к 10 мл 4% промытой среды (КΡМI + 4% ФБР) и осадок, промытый еще два раза и ресуспендированный в среде до конечной концентрации 0,2х106/мл, используют для определения спонтанной радиоактивности против лизированных детергентом клеток. Клетки подвергают пульсовой обработке соответствующим(ими) пептидом(ами) в дозе 20 мкг/мл в течение 30 мин. Добавляют по 50 мкл к каждой ячейке 96-луночного планшета, содержащей СЭ8 эффекторные клетки в количестве 10, 2, 0,4 и 0,08х106/мл, и далее инкубируют при 37°С в течение 6 ч, откручивают и отбирают супернатант.
Проточная цитометрия и окрашивание тетрамером
Клетки метят моноклональными антителами, конъюгированными с флюоресцеин-изотиоцианатом или ПЭ путем инкубирования при 4°С в течение 30 мин в РАС8 буфере (1% БСА, 0,02% №^3 в ФБР) и затем промывают тем же буфером. Клетки фиксируют в 0,5% формальдегиде до подсчета на проточном цитрометре для флуоресцентного анализа клеток на РАС8ксап (ВесЮп Эюкшкоп) с использованием программного обеспечивания С.'е110иек1.
Неспецифическое окрашивание измеряют с помощью того же вторичного антитела, что применялось для мечения очищенных первичных антител или для изотипного контроля, когда первичные антитела подвергались мечению непосредственно. Окрашивание тетрамерами проводят с использованием НЬАА2.1-специфичных тетрамерных молекул ШУдад (Весктап Сои11ег), содержащих последовательность 8ЬУУТУАТЬ 8ЕЦ ΙΌ N0: 43 в качестве отрицательного контроля. НЕК-2-специфичные тетрамеры получают с использованием пептидных последовательностей СБТ^ТУОБУ (826, 8ЕЦ ΙΌ N0: 7), КШСЗБАРЬ (835, 5ЕО ΙΌ N0: 8) или УМАСУСР8РУУ (861, 5ЕО ΙΌ N0: 16). ПЭ-меченые тетрамерные комплексы НЬА-А2.1-пептида используют в сочетании с моноклональными антителами, меченными изотицианат-флуоресцеином (ПТС-меченые). против человеческого СЭ8а (ΒΌ РйагтМадт) для окрашивания эпитоп-специфичных СЭ8+ Т-клеток, в соответствии с описанием в инструкции-вкладыше. Образцы анализируют на двухцветном проточном цитрометре на приборе ВескЮп Э|кскепкоп РАС8сап, и СЭ8+ Т-клетки осматривают с точки зрения их окрашивания тетрамерными НЬА-А2.1-пептидными комплексами.
Пример 4. Генерирование дополнительных ЦТЛ, специфичных к молочной железе и яичникам, с использованием процедуры стимуляции ех у1уо.
Авторы продемонстрировали способность генерировать ЦТЛ реакции ко всем известным ограниченным по НЬА-А2.1 пептидным эпитопам нескольких опухолевых антигенов при опухолях разного происхождения. При этом первые исследования были сконцентрированы на меланоме, где авторы смогли показать объективные клинические реакции у пациентов, подвергавшихся лечению ЦТЛ, специфичными для четырех различных пептидных эпитопов, которые специфичны для белков МАКТ-1, др100 и тирозиназы, ассоциированных с меланомой [Кюйагбк е1 а1., Атег. 8ос. С1т. 0псо1., 8ап РгапсЦсо, Са1йогта (2001, Мау)].
Для усиления способности повышать образование ЦТЛ к другим опухолевым антигенам, представленным в случае многих других видов рака, авторы выбрали опубликованные и новые последовательности для опухолевых антигенов, которые являются общими для нескольких различных видов рака. Они
- 22 013944 включают АЕ8, Μϋ^1, СЕА, ЕВР, С-лектин, NΥ-Е§0-1, Рес60, СА-125, ΜАСЕ-3, теломеразу и 6250. В табл. 7 описаны указанные антигены, частота их экспрессии и виды рака, которые экспрессируют их. Данные по частоте реакции на рассматриваемые пептиды при использовании описанной процедуры стимуляции ех νίνο указаны в табл. 6.
Таблица 6
Частота реакции на пептидные эпитопы для молочной железы и яичников у нормальных доноров
Донор 87? 693 894 899 900 901 902 903 906 907 908 909 910 911 1 912 913 914
Ж 4-
Ж + + +
250 + - +
251 - - +
252 + - +
253 - +
254 + - +
255 - + + - 4- + +
256 + - 4- +
257 4- + +
259 - -
260 - - - - +
261 + +
262 + + - + -
265 + + + - - - + 4· + -
Таблица 7
Описание опухолевых антигенов
Описание эпителиальном яичников и некоторыми клеточными линиями яичников.
Примерно пациентов широко маркер опухоли.
Муцин гликопротеин нормальном злокачественному форма клеточной аденокарцином яичников лимфому. (Βίοοά (1993 ассоциированный таким заболеванием 'ГКсШИ опухолью молочной примерно инвазивных
5664-5559) в нормальной отсутств ующим экспрессируемым в 85¾ случаев больных пациентов включая множественную миелому и В-клеточную крови антигену ΜΝ/ΌΑΙΧ который экспрессируется экспрессируемый опухолями раком яичников имеют идентичен ассоциированному
- 23 013944
ЕВР Фолят-связывающий белок представляет собой рецептор, участвующий в транспорте фолята. Он подвергается сверэкспрессии более, чем в 90% опухолей яичников и в 20-50% рака молочной железы. (Апбьсапсег КезеагсЬ (1999, <Ти1-Ацд) 19 (4В) рд. 2907-2916)
НЕК-2/пей Протоонкоген (НЕК-2), кодирующий трансмембранный белок, сходен по последовательности и структуре с ЕСЕ-Р. При опухолях молочной железы и яичников ΗΕΒ-2/пеи подвергается сверхэкспрессии более, чем 200 раз, в сравнении с нормальными тканями. Он также был идентифицирован при раке почек и легкого. (З.Ехр.МеФ. (1995, Дцпе) νοί, 181 рд. 2109-2117)
ΝΥ-Ξ30-1 Антиген рака яичек, обнаруженный в 30% рака молочной железы, предстательной железы и яичников, рака легкого, рака мочевого пузыря, рака головы и шеи и меланомы. Пациенты, имеющие виды рака, при которых опухоли экспрессируют указанный антиген, обычно содержат также циркулирующие в крови антитела. (И.1ттипо1оду (2000) νοί. 165 рд. 948955)
СЕА Карциноэмбрионный антиген представляет собой
ассоциированный с опухолью антиген, часто экспрессируемый в опухолях эпителиальных клеток (ободочная кишка, молочная железа, легкое). Уровни СЕА в сыворотке крови коррелируют со стадией заболевания и используются для мониторинга лечения и рецидива заболевания. (Нитап 1тшипо1оду (1998) νοί. 59 рд.1-14)
МАЗЕ-3 Антиген рака яичек, экспрессируемый в 70-80% метастазных поражений при меланоме и в клеточных линиях, 'Он является представителем семейства ассоциированных с меланомой, или МАСЕ, белков. Кроме того, МАСЕ-3 был обнаружен в 20-60% опухолей эпителиальных клеток (рак ободочной кишки, молочной железы, легкого, желудка). (Нитап 1ттипо1оду (1998) νοί. 59 рд.1-14)
АЕЗ Энхансер аминоконца расщепленного белка представляет собой часть группы репрессоров транскрипции, кодируемых генами энхансера расщепления. Указанный опухолевый антиген был идентифицирован в лимфоцитах, ассоциированных с опухолями яичников и молочной железы. (Мо1еси1аг 1штипо1оду (1998) 35 (17) рд, 1121-1133)
НТК Теломераза (НТК) представляет собой специализированный тип обратной транскриптазы (НТКТ или ЬТЕКТ), которая катализирует синтез и удлинение теломерной ДНК. Активность данного фермента повышается примерно на 90% при всех опухолях человека, включая рак молочной железы, щитовидной железы, мочевого пузыря, шейки матки, предстательной железы, ободочной кишки, поджелудочной железы и желудка. (Сапсед НезеагсЬ (2001, Эес) 61(23) рд, 8366-8370)
- 24 013944 < 110>
Перечень последовательностей
ОгТНо-МсИеН РИагтасеиЫса!
< 120>
СПОСОБ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ
ДЛЯ
ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ <130>
ОКТ-1557-РСТ < 140>
<1412
РСТ/С302/05748
2002-02-19 <160>
.42 <170>
РаСепрЬп версия 3.1 <210>
<211>
<212>
<213>
Белок
Человек (Ното заррепз) <400>
Туг Мер Азп С1у ТНг Мер Зег <31п 1
Уа1 <210> <211>
<212>
<2 13>
Белок
Человек (Ното зараепз) <400>
Туг Мер Азр С1у
ТНг МеР Зег 61п
Уа1 <210>
<211>
<212>
<213>
Белок
Человек (Ното зарТепз) <400>
РНе Ьеи Рго Тгр
Н1з Агд Ьеи РНе
Ьеи
Ьеи <210>
<211>
<212>
<213>
Белок
Человек (Ното зараепз) <400>
Не ТНг Азр ΰΐη
7а1 Рго РНе Зег
Уа1 <210> <211>
<212>
<213>
Белок
Человек (Ното зархепз)
- 25 013944 <400> 5
Ьуз ТЬг Тгр С1у 61л Туг Тгр 61п Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 6 9 Белок Человек (Ното зарЬепз)
<40О> 6
А1а А1а С1у Не. С1у 11е Ьеи ТЬг Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 7 9 Белок Человек (Ното зарЬепз)
<400> 7
Суз Ьеи ТЬг Зег ТЬг Уа1 С1п Ьеи Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 8 9 Белок Человек (Ното зар!епз)
<400> 8
Ьуз 11е РЬе С1у Зег Ьеи А1а РЬе Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 9 9 Белок Человек (Ното заргепз)
<400> 9
Ьуз Мер А1а Зег Агд Зег МеЬ Агд Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 10 10 Белок Человек (Ното зар1епз)
<4 00> 10
А1а Ьеи А1а Ьеи А1а А1а Ьеи Ьеи Уа1 Уа1
1 5 10
<210> <211> <212> 11 9 Белок
- 26 013944
<213> Человек (Ното зар!епз)
<400> 11
А1а Ьеи Ьеи 7а1 Уа1 Азр Агд С1и Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 12 12 Белок Человек (Ното зархепз)
<400> 12
А1а А1а С1и С1у Ьеи Азр ТЬг С1п Агд РЬе Зег 61у
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 13 9 Белок Человек (Ното зар!епз)
<4 00> 13
Н1з Ьеи Туг С1п С1у Суз С1п Уа1 Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 14 9 Белок Человек (Ното зархепз)
<400> 14
Не Це Зег А1а Уа1 Уа1 61у Не Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 15 9 Белок Человек (Ното зарЬепз)
<400> 15
Рго Ьеи ТЬг Зег 11е 11е Зег А1а Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 16 10 Белок Человек (Ното заргепз)
<400> 16
Уа! Меб А1а С1у Уа1 С1у Зег Рго Туг Уа!
1 5 10
<210> 17
- 27 013944 <211>9 <212> Белок <213> Человек (Ното зарЬепз) <400>17
Уа1 Ьеи νβΐ Ьуз Зег Рго Азп НЬз Уа1 <210> 18 <211>9 <212> Белок <213> Человек (Ното зарЬепз) <40018
С1и Ьеи Уа1 Зег 61и РЬе Зег Агд Мес <210>19 <211> 8 <212> Белок <213> Человек (Ното зарЬепз!
<400>19
61у Рго Ьеи ТЬг Рго Ьеи Рго Уа1 <210> 20 <211>3 <212> Белок <213> Человек (Ното зарЬепз) <40020
Зег ТЬг А1а Рго Уа1 НЬз Азп Уа1 <210> 21 <211>9 <212> Белок <213> Человек (Ното зарЬепз) <400>21
Туг Ьеи Зег 61у А1а Азп Ьеи Азп Ьеи <210? 22 <211>9 <212> Белок <213> Человек (Ното зарЬепз) <400>22
С1и Не Тгр ТЬг НЬз Зег Туг Ьуз Уа1
- 28 013944
<210> <211> <212> <213> 23 10 Белок Человек (Ното зархепз)
<400> 23
Зег Не Ьеи Зег Ьеи Ьуз С1и А1а Зег ТЬг
1 5 ' 10
<210> <211> <212> <213> 24 9 Белок Человек (Ното зархепз;
<400 24
Зег Ьеи Ьеи Мер Тгр 11е ТЬг 61п Суз
1 5
<210 <211> <212> <213> 25 9 Белок Человек (Ното зархепз)
<400 25
Зег Ьеи Ьеи Мер Тгр Не ТЬг С1п Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 26 9 Белок Человек (Ното заргепз)
<4 00> 26
61п Ьеи Зег Ьеи Ьеи Мег Тгр Не ТЬг
1 5
<210 <2Н> <212> <213> 27 9 Белок Человек (Ното зартепз)
<400> 27
Туг Ьеи С1и ТЬг РЬе Агд С1и С1п Уа1
1 5
<210 <211> <212> <213> 28 9 Белок Человек (Ното зар1епз)
<400> 28
Уа1 Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Агд Агд Рго Уа1
- 29 013944
<210> <211> <212> <213> 29 9 Белок Человек (Ното зарЬепз)
<400> 29
61у Ьеи 61п Зег Рго Ьуз Зег Рго Ьеи . 5
<210> <211> <212> <213> 30 9 Белок Человек (Ното зар1епз)
<400> 30
61и Ьеи Туг Не Рго Зег Уа1 Азр Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 31 9 Белок Человек (Ното зарЬепз)
< 40 0 > 31
Ьуз А1а Ьеи РЬе А1а 61у Рго Рго Уа1
5
<210> <211> <212> <213> 32 9 Белок Человек (Ното зарЬепз)
<400> 32
РЬе МеС Тгр С1у Азп Ьеи ТЬг Ьеи А1а
1 5
<210> <211> <212> <213> 33 9 Белок Человек (Ното зарЬепз)
<400> 33
РЬе Ьеи Тгр 61у Рго Агд А1а Ьеи Уа1
1 5
<210> <211> <212> <213> 34 9 Белок Человек (Ното зарЬепз)
<400> 34
- 30 013944
Не Ьеи А!а Ьуз РЬе Ьеи Н1з Тгр Ьеи
1 5
<210> <211> <212> <213> 35 9 Белок Человек (Ното зарЬепз)
<4 00> 35 '
Агд Ьеи Уа1 Азр Азр РЬе Ьеи Ьеи Уа!
1 5
<210> <211> <212> <213> 36 9 Белок Человек (Ното зариепз}
<400> 36
Н1з Ьеи Зег ТЬг А!а РЬе А!а Агд Уа!
1 5
<210> <211> <212> <213> 37 9 Белок Человек (Ното зархепз)
<400> 37
Зег 11е Зег 61у Азр Ьеи Н1з 11е !1е
1 5
<210> <211> <212> <213> 38 10 Белок Человек (Ното зархепз)
<400> 38
Уа! А1а А1а Зег Уа! Азр Азп Рго Н1з Уа!
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 39 9 Белок Человек {Ното зарйепа)
<400> 39
С1и Ьеи Не 11е С1и РЬе Зег Ьуз Мер
1 5
<2 Ю> <211> <212> <213> 40 9 Белок Человек (Ното зариепз)

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК), способной одновременно презентировать до пятнадцати пептидных молекул, включающий:
    a) получение клеточной линии насекомых из яиц ЭгокорНба те1апо§ак1ег:
    b) создание плазмиды рКтНа-3 на основе вектора экспрессии рКтНа-1, где указанная плазмида рКтНа-3 включает промотор металлотионеина, консенсусные последовательности реакции на металл и ген алкогольдегидрогеназы, несущий сигнал полиаденилирования, выделенный из ЭгокорНба те1апода81ег;
    c) встраивание в указанную плазмиду рКтНа-3 комплементарной ДНК, кодирующей А2.1 НЬА класса Ι, β-2-микроглобулин и связывающие и костимулирующие молекулы, в частности В7.1, В7.2, Ι0ΆΜ-1 и ЬЕА-3, где А2.1 может быть замещен любой молекулой НЬА класса Ι;
    б) трансфекцию указанных клеток насекомых стадии (а) плазмидой рЬкЬпео и указанной плазмидой рКтНа-3, содержащей комплементарную ДНК;
    е) получение нпАПК путем контактирования клеток насекомых стадии (б) с Си804 для индукции экспрессии трансфицированных генов в указанных клетках насекомых.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная нпАПК способна одновременно презентировать примерно до десяти пептидных молекул.
  3. 3. Неприродная антигенпрезентирующая клеточная линия (нпАПК), полученная способом, охарактеризованным в любом из пп.1, 2, из клеток ЭгокорЬба те1апода81ег, трансфицированных нуклеиновой кислотой, которая экспрессирует НЬА молекулы класса Ι человека, связывающие и костимулирующие молекулы, причем указанная нпАПК способна презентировать до пятнадцати различных пептидных молекул.
  4. 4. Неприродная антигенпрезентирующая клеточная линия по п.3, отличающаяся тем, что указанная нпАПК способна одновременно презентировать до десяти различных пептидных молекул.
  5. 5. Неприродная антигенпрезентирующая клеточная линия по п.4, отличающаяся тем, что указанная нпАПК одновременно презентирует одну или несколько из следующих десяти пептидных молекул: тирозиназу369-377, тирозиназу207-216, §рЮ0209-217, ёр100154-162, ΜАКТ-127-35, НЕК-2/пеИ789-797, НЕК-2/пеИ369-377, Слектин8-16, Рес6020-29 и Рес6025-33.
  6. 6. Способ лечения ракового заболевания у субъекта, включающий:
    a) получение неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК), которая одновременно презентирует до пятнадцати пептидных молекул, ассоциированных с указанным раковым заболеванием, в соответствии со способом по п.1, причем каждая из указанных пептидных молекул составляет примерно шесть-двенадцать аминокислот в длину:
    b) сбор моноцитов периферической крови у указанного субъекта или подходящего донора и выделение из них ΟΌ8+ клеток;
    c) стимуляцию указанных ΟΌ8+ клеток указанной клеточной линией нпАПК;
    б) добавление указанных ΟΌ8+ клеток в среду, которая содержит цитокин, выбранный из группы, состоящей из ИЛ-2, ИЛ-7, или в кондиционированную ростовую среду (ΟΟΜ), причем указанные цито
    - 32 013944 кины могут быть использованы индивидуально или в сочетании;
    е) смешивание несуспендированных моноцитов периферической крови подпункта (Ъ) или истощенных по 0Ό8 моноцитов периферической крови, оставшихся после стадии выделения подпункта (Ъ), собранных у указанного субъекта или подходящего донора, примерно с 1-50 мкг/мл одного из указанных пептидов, которые одновременно могут быть презентированы указанной нпАПК;
    I) облучение указанной суспензии моноцитов периферической крови достаточной дозой γизлучения, необходимой для стерилизации всех компонентов суспензии, за исключением желательных моноцитов периферической крови;
    д) выделение прилипающих моноцитов периферической крови из облученной суспензии моноцитов периферической крови стадии (1);
    II) добавление к указанным прилипающим моноцитам периферической крови примерно 1-50 мкг/мл каждого из указанных пептидов;
    ί) объединение указанных 0Ό8+ клеток подпункта (б) с указанными прилипающими моноцитами периферической крови в соотношении примерно десять 0Ό8+ клеток к одному моноциту периферической крови;
    _)) введение субъекту 0Ό8+ клеток подпункта (1).
  7. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный цитокиновый компонент представляет собой ИЛ-2 или сочетание ИЛ-2 и ИЛ-7.
  8. 8. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная доза γ-излучения составляет примерно 30007000 рад, предпочтительно примерно 5000 рад.
  9. 9. Способ по п.6, отличающийся тем, что стадия добавления (б) включает добавление указанных 0Ό8+ клеток в среду, содержащую ИЛ-2 и ИЛ-7.
  10. 10. Способ по п.6 или 9, отличающийся тем, что указанные пептидные молекулы составляют примерно от восьми до десяти аминокислот в длину.
  11. 11. Способ по п.6 или 9, отличающийся тем, что раковое заболевание представляет собой меланому.
  12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанная нпАПК презентирует десять пептидов.
  13. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанные пептиды представляют собой тирозиназу369-
    377, тирозиназу207-2^ дρ100209-217, дρ100154-162, НΕΚ.-2/ηеи789-797, НΕΚ.-2/ηеиз69-377, С-лектИн8-16, Рес6020-29 и Рес6025-33.
EA200300815A 2001-02-20 2002-02-19 Способ получения неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии и применение линии для лечения опухолей EA013944B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27025201P 2001-02-20 2001-02-20
PCT/US2002/005748 WO2002065992A2 (en) 2001-02-20 2002-02-19 A cell therapy method for the treatment of tumors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200300815A1 EA200300815A1 (ru) 2004-06-24
EA013944B1 true EA013944B1 (ru) 2010-08-30

Family

ID=23030546

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300815A EA013944B1 (ru) 2001-02-20 2002-02-19 Способ получения неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии и применение линии для лечения опухолей

Country Status (22)

Country Link
US (2) US20030077248A1 (ru)
EP (3) EP1377251B1 (ru)
JP (3) JP2006510567A (ru)
KR (2) KR100971266B1 (ru)
CN (1) CN1571834B (ru)
AT (1) ATE396691T1 (ru)
BR (1) BR0207399A (ru)
CA (2) CA2698079C (ru)
DE (1) DE60226853D1 (ru)
DK (1) DK2016930T3 (ru)
EA (1) EA013944B1 (ru)
ES (2) ES2643582T3 (ru)
HK (2) HK1058485A1 (ru)
HU (1) HUP0402656A3 (ru)
IL (3) IL157366A0 (ru)
MX (1) MXPA03007503A (ru)
NO (1) NO334885B1 (ru)
NZ (1) NZ527683A (ru)
PL (1) PL206976B1 (ru)
PT (1) PT1377251E (ru)
WO (1) WO2002065992A2 (ru)
ZA (1) ZA200307327B (ru)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7973137B1 (en) 1996-03-28 2011-07-05 Johns Hopkins University Cell compositions comprising molecular complexes that modify immune responses
ES2643582T3 (es) 2001-02-20 2017-11-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Antígeno de Drosophila artificial que presenta célula para preparar suspensión de células CD8 para su uso en el tratamiento del cáncer
US20040071671A1 (en) 2001-02-20 2004-04-15 Leturcq Didier J. Cell therapy method for the treatment of tumors
CA2440610C (en) * 2001-03-09 2011-07-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Induction of tumor immunity by variants of folate binding protein
WO2003076585A2 (en) * 2002-03-08 2003-09-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Controlled modulation of amino acid side chain length of peptide antigens
WO2004006951A1 (en) * 2002-07-12 2004-01-22 The Johns Hopkins University Reagents and methods for engaging unique clonotypic lymphocyte receptors
EP1558723A4 (en) * 2002-11-07 2006-02-15 Johnson & Johnson Res Pty Ltd MEANS FOR THE PREPARATION AND USE OF A POPULATION OF DISEASE-SPECIFIC CYTOTOXIC T-LYMPHOCYTES
EP1645183B1 (en) * 2003-06-16 2013-03-13 Kyushu University, National University Corporation Process for producing human-origin immunocompetent cell
JP2005139118A (ja) * 2003-11-07 2005-06-02 Ortho Mcneil Pharmaceut Inc 腫瘍の治療のための細胞治療方法
US20100094560A1 (en) * 2006-08-15 2010-04-15 Prometheus Laboratories Inc. Methods for diagnosing irritable bowel syndrome
WO2008039874A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Cedars-Sinai Medical Center Cancer stem cell antigen vaccines and methods
WO2008039969A2 (en) 2006-09-28 2008-04-03 Cedars-Sinai Medical Center Cancer vaccines and vaccination methods
CA2665568C (en) 2006-10-04 2018-01-09 Janssen Pharmaceutica, N.V. Preparation of inactivated artificial antigen presenting cells and their use in cell therapies
PL2328923T3 (pl) 2008-09-02 2016-06-30 Cedars Sinai Medical Center Epitopy CD133
JP2010235611A (ja) * 2010-05-10 2010-10-21 Ortho Mcneil Pharmaceut Inc 腫瘍の治療のための細胞治療方法
WO2012087943A2 (en) * 2010-12-20 2012-06-28 The Regents Of The University Of Michigan Inhibitors of the epidermal growth factor receptor-heat shock protein 90 binding interaction
CA2898474A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Immunocellular Therapeutics, Ltd. Cancer vaccines and vaccination methods
CN103667189B (zh) * 2013-09-24 2015-10-28 上海宇研生物技术有限公司 用于治疗肺癌的cd8毒性t淋巴细胞及其制备方法
MX2017003625A (es) * 2014-09-17 2017-10-11 Univ Johns Hopkins Reactivos y metodos para identificar, enriquecer y/o expander celulas t especificas de antigeno.
US9993538B2 (en) 2015-05-29 2018-06-12 Galena Biopharma, Inc. Peptide vaccine therapy for treatment of FRα-expressing tumors
WO2017210255A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 Galena Biopharma, Inc. Vaccine therapy for treatment of endometrial and ovarian cancer
WO2017216768A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies And Therapies - A4Tec Dendrimer-derived artificial antigen, methods and uses thereof
AU2017305396A1 (en) * 2016-08-02 2019-02-21 Nant Holdings Ip, Llc Transfection of dendritic cells and methods therefor

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4530901A (en) * 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4401756A (en) * 1981-04-14 1983-08-30 Immunex Corporation Process for preparing human interleukin 2
US4473642A (en) * 1981-04-29 1984-09-25 Immunex Corporation Constitutive production of interleukin 2 by a T cell hybridoma
US4407945A (en) * 1981-04-29 1983-10-04 Immunex Corporation Constitutive production of interleukin 2 by a T cell hybridoma
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4992367A (en) * 1986-05-12 1991-02-12 Hoffmann-La Roche Inc. Enhanced expression of human interleukin-2 in mammalian cells
US5229115A (en) * 1990-07-26 1993-07-20 Immunex Corporation Adoptive immunotherapy with interleukin-7
US5637483A (en) * 1991-10-04 1997-06-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Irradiated tumor cell vaccine engineered to express GM-CSF
US5583031A (en) * 1992-02-06 1996-12-10 President And Fellows Of Harvard College Empty major histocompatibility class II heterodimers
US5314813A (en) 1992-02-19 1994-05-24 Scripps Research Institute Drosophila cell lines expressing genes encoding MHC class I antigens and B2-microglobulin and capable of assembling empty complexes and methods of making said cell lines
US5731160A (en) 1992-05-26 1998-03-24 Rijksuniversiteit Leiden Induction of antigen specific T-lymphocyte responses by stimulation with peptide loaded MHC class I molecules on antigen processing defective mammalian cell lines
US5397703A (en) * 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5662907A (en) * 1992-08-07 1997-09-02 Cytel Corporation Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in humans using synthetic peptide epitopes
US5487974A (en) 1992-12-22 1996-01-30 Ludwig Institute For Cancer-Research Method for detecting complexes containing human leukocyte antigen A2 (HLA-A2) molecules and a tyrosinase drived peptide on abnormal cells
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US5820866A (en) * 1994-03-04 1998-10-13 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for T cell regulation
US5585461A (en) * 1994-03-24 1996-12-17 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated, MAGE-3 derived peptides which complex with HLA-A2 molecules and uses thereof
US5874560A (en) 1994-04-22 1999-02-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods
US5968753A (en) 1994-06-14 1999-10-19 Nexell Therapeutics, Inc. Positive and positive/negative cell selection mediated by peptide release
US5595881A (en) 1994-08-09 1997-01-21 Anergen, Inc. Method for the detection of antigen presenting cells
US5827642A (en) * 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US5843648A (en) * 1995-01-10 1998-12-01 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services P15 and tyrosinase melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods
US5645837A (en) * 1995-01-17 1997-07-08 Thomas Jefferson University Peptides that inhibit T cell activation and methods of using the same
DE69628154T2 (de) * 1995-03-08 2004-03-18 The Scripps Research Institute, La Jolla Antigen präsentierendes system und aktivierung von t-zellen
US5759783A (en) 1995-03-14 1998-06-02 Ludwig Institute For Cancer Research Method of screening for cancer by detecting messenger RNA for a MAGE-XP gene
US5587289A (en) * 1995-03-14 1996-12-24 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules which are members of the MAGE-Xp family and uses thereof
US5695760A (en) 1995-04-24 1997-12-09 Boehringer Inglehiem Pharmaceuticals, Inc. Modified anti-ICAM-1 antibodies and their use in the treatment of inflammation
US5985270A (en) 1995-09-13 1999-11-16 Fordham University Adoptive immunotherapy using macrophages sensitized with heat shock protein-epitope complexes
CA2247131A1 (en) 1996-03-04 1997-09-12 Targeted Genetics Corporation Modified rapid expansion methods ("modified-rem") for in vitro propagation of t lymphocytes
ATE347588T1 (de) * 1996-05-23 2006-12-15 Scripps Research Inst Systeme zur präsentation von mhc-antigenen der klasse ii und verfahren zur aktivierung von cd4?+-t-lymphozyten
WO2001059073A2 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cytotoxic t lymphocytes activated by dendritic cell hybrids
EP1071436A4 (en) * 1998-01-26 2003-08-27 Dana Farber Cancer Inst Inc IMMUNE EFFECTOR CELL HYBRIDS
WO1999054345A1 (en) 1998-04-21 1999-10-28 Thomas Jefferson University Cd8 antagonists
US6140050A (en) * 1998-06-26 2000-10-31 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for determining breast cancer and melanoma by assaying for a plurality of antigens associated therewith
US6913749B2 (en) 1998-11-02 2005-07-05 Resistentia Pharmaceuticals Ab Immunogenic polypeptides for inducing anti-self IgE responses
WO2000063690A1 (en) * 1999-04-16 2000-10-26 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Enriched antigen-specific t-cells, and related therapeutic and prophylactic compositions and methods
JP2001089389A (ja) 1999-07-22 2001-04-03 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 抗原特異的ｔ細胞の誘導剤
WO2001057068A1 (en) * 2000-02-01 2001-08-09 The Austin Research Institute Mucin-1 derived antigens and their use in immunotherapy
WO2002004603A2 (de) * 2000-07-10 2002-01-17 Eppendorf Ag Verfahren zur modifizierung von biologischen zellen
ES2643582T3 (es) 2001-02-20 2017-11-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Antígeno de Drosophila artificial que presenta célula para preparar suspensión de células CD8 para su uso en el tratamiento del cáncer

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUELLY, C. et al. Activation, requirements of circulating antigen-specific human CD8+ memory T cells probed with insect cell-based artificial antigen-presenting cells. Eur. J. Immunol. January 2002, Vol. 32, pages 182-192, see entire docuement. *
LATOUCHE, J. et al. Induction of human cytotoxic T lymphocytes by artificial antigen-presenting cells. Nat. Biotech. April 2000, Vol. 18, pages 405-409, see entire document. SCHULTZE, J.L. et al. Autologous tumor infiltrating T cells cytotoxic for follicular lymphoma cells can be expanded in vitro. Blood. May 1997, Vol. 89, No. 10, pages 3806-3816, see entire document *

Also Published As

Publication number Publication date
IL219223A0 (en) 2012-06-28
CA2438754A1 (en) 2002-08-29
KR20090061081A (ko) 2009-06-15
ZA200307327B (en) 2005-03-30
US20030077248A1 (en) 2003-04-24
US20090305418A1 (en) 2009-12-10
EA200300815A1 (ru) 2004-06-24
US9222071B2 (en) 2015-12-29
DE60226853D1 (de) 2008-07-10
IL219223B (en) 2018-05-31
EP2848255A1 (en) 2015-03-18
PL206976B1 (pl) 2010-10-29
NZ527683A (en) 2006-06-30
KR100962544B1 (ko) 2010-06-14
ES2643582T3 (es) 2017-11-23
ES2306771T3 (es) 2008-11-16
EP2848255B1 (en) 2017-08-23
JP2012097117A (ja) 2012-05-24
NO20033674L (no) 2003-10-17
HK1058485A1 (en) 2004-05-21
EP1377251A2 (en) 2004-01-07
PT1377251E (pt) 2008-08-05
WO2002065992A2 (en) 2002-08-29
HUP0402656A2 (hu) 2005-03-29
HUP0402656A3 (en) 2012-03-28
BR0207399A (pt) 2004-10-26
DK2016930T3 (en) 2014-12-08
CN1571834A (zh) 2005-01-26
EP1377251B1 (en) 2008-05-28
CA2438754C (en) 2014-10-07
NO334885B1 (no) 2014-06-30
ATE396691T1 (de) 2008-06-15
EP2016930A2 (en) 2009-01-21
JP5634415B2 (ja) 2014-12-03
EP2016930A3 (en) 2009-09-02
KR100971266B1 (ko) 2010-07-20
JP2006510567A (ja) 2006-03-30
EP1377251A4 (en) 2006-01-11
PL369971A1 (en) 2005-05-02
EP2016930B1 (en) 2014-10-15
KR20030077029A (ko) 2003-09-29
NO20033674D0 (no) 2003-08-19
MXPA03007503A (es) 2004-10-15
WO2002065992A3 (en) 2003-02-13
CN1571834B (zh) 2013-03-20
CA2698079A1 (en) 2002-08-29
JP2010222352A (ja) 2010-10-07
HK1208376A1 (en) 2016-03-04
IL157366A (en) 2013-04-30
IL157366A0 (en) 2004-02-19
CA2698079C (en) 2015-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5634415B2 (ja) 腫瘍の治療のための細胞治療方法
US9222070B2 (en) Cell therapy method for the treatment of tumors
JP2005139118A (ja) 腫瘍の治療のための細胞治療方法
JP2010235611A (ja) 腫瘍の治療のための細胞治療方法
AU2008200524B2 (en) A cell therapy method for the treatment of tumors
AU2002306587A1 (en) A cell therapy method for the treatment of tumors
WO2022184824A2 (en) Cancer therapy involving car-engineered t-cells and parvovirus h-1
JPWO2004016774A1 (ja) 抑制性ｎｋ細胞受容体陽性細胞の増幅方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU