PL206976B1

PL206976B1 - Sposoby wytwarzania zawiesiny CD8⁺ do stosowania w leczeniu podmiotu z rakiem lub czerniakiem, sposób produkcji nie występującej naturalnie komórki i nie występująca naturalnie linia komórkowa

Info

Publication number: PL206976B1
Application number: PL369971A
Authority: PL
Inventors: Juli Degraw; Ann Moriarty; Didier J. Leturcq; Michael R. Jackson; Par A. Peterson; Marja Heiskala
Original assignee: Ortho Mcneil Pharm Inc
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-19
Publication date: 2010-10-29
Also published as: CA2438754C; NZ527683A; DK2016930T3; MXPA03007503A; WO2002065992A3; CN1571834B; ATE396691T1; IL157366A; EA013944B1; ZA200307327B; CA2698079A1; EA200300815A1; ES2306771T3; WO2002065992A2; CA2698079C; KR100971266B1; PT1377251E; NO20033674L; NO334885B1; KR20090061081A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są sposoby wytwarzania zawiesiny CD8⁺ do stosowania w leczeniu podmiotu z rakiem lub czerniakiem, sposób produkcji nie występującej naturalnie komórki i nie występująca naturalnie linia komórkowa.

Tło wynalazku

Pomimo znacznego postępu dokonanego w dziedzinie leczenia rak wciąż stanowi główny problem zdrowotny. Standardowe schematy leczenia chemioterapią, radioterapią, poprzez interwencję chirurgiczną oraz kombinację tych trzech, często zawodzą jeśli chodzi o osiągnięcie długotrwałego wyleczenia. W wielu wypadkach, u pacjentów z rakiem, którzy przeszli leczenie, często po pewnym okresie czasu następuje nawrót choroby, a dotkliwość tych schematów leczenia dodatkowo zaostrza ten problem dla pacjenta.

Innym czynnikiem komplikującym postęp w leczeniu raka jest to, że jak się okazało, raki nie są wywoływane przez pojedynczy czynnik biologiczny, lecz raczej przez kombinację różnych czynników. Inaczej niż w większości stosowanych terapii, gdzie leczenie skupia się na pojedynczym czynniku lub zdarzeniu sprawczym, terapia nowotworu wymaga zajęcia się wieloma czynnikami biologicznymi.

W ostatnich latach, badania ukierunkowano na rozwój terapii nowotworu, która wykorzystuje własny układ odpornościowy pacjenta. Jednym z takich podejść jest immunoterapia adoptywna. Immunoterapia adoptywna wymaga stosowania własnych komórek pacjenta do wytworzenia cytotoksycznych limfocytów T (CTL) do wyleczenia nowotworu albo komórek rakowatych. Jednakże technika ta pozostaje w większości niepoparta dowodami jako wykonalny tryb leczenia klinicznego pacjentów będących ludźmi. Obok problemu identyfikacji prawidłowych epitopów, którymi należy immunizować CTL, aktualna technologia nie zapewnia metody prezentowania wystarczającej liczby różnych epitopów dla APC, w celu odpowiedniego nakierowania wielu antygenów, prowadzącego do skutecznego leczenia nowotworu. Niniejszy wynalazek spełnia te potrzeby, jak również daje inne korzyści.

Streszczenie wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania zawiesiny CD8⁺ do stosowania do leczenia podmiotu z rakiem, polegają cy na tym, ż e

a. wytwarza się nie występującą naturalnie linię komórkową prezentującą antygen (nnAPC), przy czym nnAPC prezentuje jednocześnie od czterech do dziesięciu różnych cząsteczek peptydowych związanych z nowotworem, i przy czym każda cząsteczka wymienionego peptydu ma sześć do dwunastu aminokwasów długości,

b. stymuluje się, za pomocą linii komórkowej nnAPC, wymienione komórki CD8⁺ zebrane od wymienionego podmiotu albo odpowiedniego dawcy;

c. dodaje się komórki CD8⁺ do pożywki, która zawiera cytokinę, wybraną z grupy obejmującej IL-2, IL-7 albo do kondycjonowanej pożywki wzrostowej, (CGM), przy czym cytokiny można stosować indywidualnie albo w kombinacji;

d. miesza się nie zawieszone monocyty z krwi obwodowej albo monocyty krwi obwodowej pozbawione CD8, zebrane od wymienionego podmiotu lub odpowiedniego dawcy z 1 do 50 μg/ml jednego z wymienionych peptydów, jakie może prezentować jednocześnie wymieniona nnAPC;

e. napromieniowuje się zawiesinę monocytów krwi obwodowej wystarczającą dawką promieniowania γ konieczną do wyjałowienia wszystkich składników w zawiesinie, z wyjątkiem pożądanych monocytów krwi obwodowej;

f. izoluje się przylegających monocyty krwi obwodowej;

g. załadowuje się wymienione przylegające monocyty krwi obwodowej od 1 μg/ml do 50 μg/ml wymienionego każdego peptydu; i

h. dokonuje się połączenia wymienionych komórek CD8⁺ z przylegającymi monocytami krwi obwodowej w stosunku wynoszącym dziesięć komórek CD8⁺ na jeden monocyt krwi obwodowej.

W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku cząsteczki peptydowe mają długość od ośmiu do dziesięciu aminokwasów.

Także korzystnie, w sposobie według wynalazku cząsteczki peptydowe występują w stężeniu w zakresie wynoszącym od 10 nM do 100 μM. Korzystnym wymienionym składnikiem cytokinowym jest IL-2, lub ewentualnie wymienionym składnikiem cytokinowym jest IL-2 i IL-7 w połączeniu.

Dawka promieniowania w sposobie według wynalazku jest korzystnie dawką promieniowania γ wynoszącą 3000 do 7000 radów, lub także korzystnie wynoszącą 5000 radów.

PL 206 976 B1

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania zawiesiny CD8⁺ do stosowania w leczeniu podmiotu z rakiem, który to sposób obejmuje następujące etapy:

a. wytworzenie nie występującej naturalnie linii komórkowej prezentującej antygen (nnAPC), przy czym wymieniona nnAPC prezentuje jednocześnie od czterech do dziesięciu różnych cząsteczek peptydowych związanych z nowotworem,

b. stymulowanie komórek CD8⁺ zebranych od wymienionego podmiotu linią komórkową nnAPC przez sześć do siedmiu dni;

c. stymulowanie wymienionych komórek CD8⁺ za pomocą IL-2 i IL-7 w pożywkach;

d. wymieszanie niezawieszonych monocytów z krwi obwodowej lub pozbawionych CD8⁺ monocytów krwi obwodowej zebranych od podmiotu z 20 μg/ml każdego peptydu;

e. napromieniowanie monocytów krwi obwodowej dawką promieniowania γ wynoszącą 5000 radów;

f. izolację przylegających monocytów krwi obwodowej;

g. załadowanie przylegających monocytów krwi obwodowej 1 μg/ml do 50 μg/ml każdego z wymienionych peptydów;

h. połączenie wymienionych komórek CD8⁺ z przylegającymi monocytami krwi obwodowej w stosunku wynoszącym dziesięć komórek CD8⁺ na jeden monocyt krwi obwodowej;

i. stymulowanie połączonej zawiesiny komórek CD8⁺ i monocytów krwi obwodowej przez sześciu do siedmiu dni;

j. stymulowanie wymienionej zawiesiny komórek CD8⁺ i monocytów krwi obwodowej za pomocą IL-2 i IL-7 w pożywkach; i

k. testowanie zawiesiny CD8⁺ pod względem odpowiedniej aktywności CTL, czystości, jałowości i zawartości endotoksyny.

W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku każdy peptyd ma osiem do dziesięciu aminokwasów długości.

Następnie, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zawiesiny CD8⁺ do stosowania w leczeniu podmiotu z czerniakiem, obejmujący etapy:

a. wytworzenie nie występującej naturalnie linii komórkowej prezentującej antygen (nnAPC), przy czym wymieniona nnAPC prezentuje jednocześnie od czterech do dziesięciu różnych cząsteczek peptydowych związanych z wymienionym czerniakiem, przy czym każdy peptyd ma osiem do dziesięciu aminokwasów długości;

b. stymulowanie wymienionych komórek CD8⁺ wymienioną linią komórkową nnAPC zebraną od wymienionego podmiotu przez sześć do siedmiu dni.

d. wymieszanie monocytów z krwi obwodowej zebranych od wymienionego podmiotu z 20 μg/ml każdego peptydu jakie wymieniona nnAPC może prezentować;

f. izolację przylegających monocytów krwi obwodowej;

g. załadowanie wymienionych przylegających monocytów krwi obwodowej 1 μg/ml do 50 μg/ml każdego z peptydów;

h. połączenie komórek CD8⁺ z przylegającymi monocytami krwi obwodowej w stosunku wynoszącym dziesięć komórek CD8⁺ na jeden monocyt krwi obwodowej;

i. stymulowanie połączonej zawiesiny komórek CD8⁺ i monocytów krwi obwodowej, przez sześć do siedmiu dni;

j. stymulowanie zawiesiny komórek CD8⁺ i monocytów krwi obwodowej za pomocą IL-2 i IL-7 w pożywkach;

W tym sposobie według wynalazku, korzystnie wymieniona nnAPC prezentuje peptydy którymi są tyrozynaza369-377, tyrozynaza207-216, gp100209-217, gp100154-162, MART-127-35, HER-2/neu789-797, HER-2/^neu369-377^{, C-lektyna}8-16^{, Pec60}20-29^{, i Pec60}25-33^.

Także korzystnie, wymienione cząsteczki peptydowe z etapu (a) wybiera się spośród peptydów mających sekwencję aminokwasową przedłożoną w SEQ ID Nr: 1 do 42.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób produkcji nie występującej naturalnie komórki prezentującej antygen (nnAPC) zdolnej do prezentowania do dziesięciu różnych cząsteczek peptydowych jednocześnie, przy czym wymieniony sposób obejmuje etap:

PL 206 976 B1

a. wytworzenia owadziej linii komórkowej z jaj Drosophila melanogaster;

b. hodowli wymienionych komórek owadzich w pożywkach, korzystnie pożywce Schneider™'s

Drosophila Medium;

c. wykonania plazmidu pRmHa-3 z wektora ekspresji pRmHa-1, przy czym wymieniony plazmid pRmHa-3 obejmuje promotor metalotioneiny, konsensusowe sekwencje odpowiedzi na metal oraz gen dehydrogenazy alkoholowej niosący sygnał poliadenylacji wyizolowany od Drosophila melanogaster;

d. wprowadzenia do wymienionego plazmidu pRmHa-3 komplementarnego DNA dla ludzkich HLA A2.1 klasy I, B7.1, B7.2, ICAM-1, mikroglobuliny β-2 oraz LFA-3, przy czym A2.1 można podstawić każdą ludzką sekwencją DNA klasy I;

e. transfekcji wymienionych komórek owadów plazmidem phshneo oraz wymienionym plazmidem pRmHa-3 zawierającym komplementarnym DNA; i

f. utworzenia nnAPC przez zetknięcie wymienionych komórek owadów z CUSO4 indukując ekspresję transfekowanych genów w komórkach owadów.

W sposobie tym, korzystnie wymieniona linia komórek owadzich jest wytworzona przez hodowlę komórek przez dwanaście dni, selekcję pożądanych komórek z peptydami, które są zdolne do identyfikacji wymienionych pożądanych komórek, i namnożenie wymienionych pożądanych komórek za pomocą IL-2. Wymienione peptydy do identyfikacji wymienionych pożądanych komórek, korzystnie są tetramerami.

Przedmiotem wynalazku jest także nie występująca naturalnie linia komórkowa prezentująca antygen (nnAPC) pochodząca z komórek Drosophila melanogaster transfekowanych kwasem nukleinowym z ekspresją ludzkich cząsteczek HLA klasy I, cząsteczek wiążących i cząsteczek kostymulatorowych, przy czym wspomniana nnAPC prezentuje jednocześnie dziesięć różnych następujących cząsteczek peptydowych, tyrozynaza369-377, tyrozynaza207-216, gp100209-217, gp100154-162, MART-127-35, HER-2/neu789-797, HER-2/neu369-377, C-lektyna8-16, Pec6020-29, i Pec6025-33.

Krótki opis rycin

Fig. 1: Ta fig. jest graficznym opisem interakcji między komórkami CD8+, znanymi także jako cytotoksyczne limfocyty T, a komórkami prezentującymi antygen albo komórkami docelowymi, w tym przypadku komórkami nowotworowymi.

Fig. 2, panele A i B:

Ta fig. jest dwupanelowym opisem graficznym mechanizmu cytozy za pośrednictwem limfocytu.

Fig. 3: Ta fig. ukazuje wynik doświadczenia, w którym testowano kilka różnych peptydów w teście kompetycyjnym do identyfikacji peptydów wiążących, które można by wykorzystać do załadowania wielu peptydów na komórki Drosophila wykazujące ekspresję pustych, ludzkich cząsteczek klasy I.

Fig. 4, panele A, B i C:

Ta fig. ukazuje wynik doświadczenia, w którym testowano trzy peptydy czerniaka pod względem zdolności do wzbudzania CTL, po dodaniu w postaci pojedynczego epitopu na komórkach Drosophila. U pojedynczego dawcy, aktywno ść CTL był a wywoł ana wobec każ dego peptydu dodanego pojedynczo do trzech różnych preparatów Drosophila. Swoistość odpowiedzi porównano z kontrolnym peptydem HBc, wiążącym z wysokim powinowactwem.

Fig. 5, panele A, B i C:

Ta fig. ukazuje wynik serii doświadczeń, w których do pojedynczych komórek Drosophila dodano do czterech różnych peptydów. Aktywność CTL dla każdego z przedstawionych peptydów była widoczna po trzech tygodniach protokołu stymulacyjnego i jest graficznie opisana w tej fig.

Fig. 6, panele A, B i C:

Ta fig. ukazuje aktywność CTL po trzech różnych pierwotnych protokołach stymulacji in vitro.

Fig. 7, panele A i B:

Ta fig. porównuje zdolność komórek Drosophila wobec komórek dendrytycznych, do wzbudzania odpowiedzi CTL wobec pojedynczego peptydu epitopu, w następstwie standardowych protokołów stymulacji.

Fig. 8: Ta fig. ukazuje, że komórki dendrytyczne wykazujące fenotyp albo dojrzały albo niedojrzały, nie wzbudzały odpowiedzi CTL tak skutecznie jak komórki Drosophila, gdy do stymulacji komórek użyto określonych peptydów.

Fig. 9, panele A, B i C:

Ta fig. ukazuje aktywność CTL generowaną przez pojedynczego dawcę wobec trzech różnych protokołów stymulacji in vitro, prezentujących cztery peptydy.

PL 206 976 B1

Fig. 10: Ta fig. ukazuje aktywność CTL generowaną wobec dziesięciu (10) peptydów załadowanych, w kombinacji, na komórki Drosophila.

Fig. 11: Ta fig. ukazuje zdolność wiązania peptydu peptydów HER-2 (826, 835, 861 i 863) na komórkach Drosophila transfekowanych ludzką cząsteczką HLA-A2.1 klasy I.

Fig. 12: Ta fig. demonstruje odpowiedź przeciwpeptydową i przeciwnowotworową wobec komórek efektorowych swoistych wobec MART-1. Komórki T2 załadowano peptydem MART-1 albo kontrolą negatywną (HBc). Malme3M oznacza linię czerniaka, Malme3 oznacza nienowotworową linię komórkową.

Fig. 13, panele A i B:

Ta fig. ukazuje tetrameryczne barwienie komórek efektorowych CD8 swoistych wobec HER-2, od dwóch różnych dawców.

Fig. 14: Ta fig. ukazuje odpowiedź przeciwpeptydową wobec komórek efektorowych HER-2, ocenianych na komórkach T2 załadowanych peptydem.

Fig. 15, panele A, B, C, D:

Ta fig. pokazuje wzmocnienie zabijania linii komórkowej nowotworu jajnika (HTB-77) po transfekcji HLA-A2.1.

Fig. 16: Ta fig. ukazuje wzmocnienie zabijania linii komórkowej raka piersi (HTB-133) po transfekcji HLA-A2.1.

Fig. 17: Ta fig. ukazuje, że wstępne traktowanie IFNy jest konieczne do zademonstrowania lizy linii komórkowej nowotworu HTB-77/A2.1.

Fig. 18, panele A i B:

Ten wykres pokazuje, że ekspresja powierzchniowa HLA-A2 i HER-2 nie ulega wpływowi indukcji IFNy, w dwóch liniach komórkowych (HTB-77 i HTB-77/A2.1).

Fig. 19: Ten wykres ukazuje, który poziom białek mRNA jest podwyższony w komórkach HTB77/A2.1, po indukcji IFNy.

Niniejszy wynalazek można stosować w metodzie leczenia podmiotu z nowotworem, obejmującej:

a. wytworzenie nie występującej naturalnie linii komórkowej prezentującej antygen (nnAPC), przy czym wymieniona nnAPC jest zdolna do prezentowania do około piętnastu różnych cząsteczek peptydowych, które są związane z nowotworem, korzystnie około dziesięciu różnych cząsteczek peptydowych, przy czym jednocześnie każdy peptyd ma około sześciu do dwunastu aminokwasów długości, korzystnie około ośmiu do dziesięciu aminokwasów długości, i w stężeniu w zakresie około 10 nM do 100 pM;

b. zebranie komórek CD8⁺ od wymienionego podmiotu albo odpowiedniego dawcy;

c. stymulację wymienionych komórek CD8⁺ wymienioną linią komórkową nnAPC;

d. dodanie wymienionych komórek CD8⁺ do pożywek, które zawierają cytokinę, taką jak IL-2, IL-7 albo kondycjonowaną pożywkę wzrostową, (CGM), korzystnie IL-2 albo IL-2 i IL7 w kombinacji;

e. wymieszanie niezawieszonych monocytów z krwi obwodowej albo alternatywnie, monocytów krwi obwodowej pozbawionych CD-8, zebranych od wymienionego podmiotu lub odpowiedniego dawcy, z około 10 do 50 μg/ml peptydu;

f. napromieniowanie wymienionej zawiesiny monocytów krwi obwodowej wystarczającą dawką promieniowania γ konieczną do zapobieżenia proliferacji tych komórek w zawiesinie, taką jak dawka w zakresie około 3000 do 7000 radów, korzystnie około 5000 radów, alternatywnie, zawiesinę limfocytów krwi obwodowej można traktować środkami cytostatycznymi, włączając, lecz bez ograniczania, mitomycynę C;

g. izolację przylegających monocytów krwi obwodowej;

h. załadowanie wymienionych przylegających monocytów krwi obwodowej około 10 ng/ml do 10 ng/ml wymienionego każdego peptydu;

i. połączenie wymienionych komórek CD8⁺ z wymienionymi przylegającymi monocytami krwi obwodowej w stosunku wynoszącym około dziesięć komórek CD8⁺ do jednego monocytu krwi obwodowej;

j. ewentualne stymulowanie wymienionej połączonej zawiesiny komórek CD8⁺ i monocytów krwi obwodowej, przez około sześć do siedmiu dni;

k. ewentualne stymulowanie wymienionej zawiesiny komórek CD8⁺ i monocytów krwi obwodowej za pomocą IL-2 i IL-7 w pożywkach;

l. ewentualne testowanie zawiesiny CD8⁺ pod względem odpowiedniej aktywności CTL i ewentualne testowanie pod względem czystości CTL, jałowości i zawartości endotoksyny; oraz

m. szczepienie wymienionego podmiotu zawiesiną CD8⁺.

PL 206 976 B1

Wynalazek można stosować także do leczenia podmiotu z nowotworem, które to leczenie obejmuje:

a. wytworzenie nie występującej naturalnie linii komórkowej prezentującej antygen (nnAPC), przy czym wymieniona nnAPC jest zdolna do prezentowania do około piętnastu różnych cząsteczek peptydowych, które są związane z nowotworem, korzystnie około dziesięciu różnych cząsteczek peptydowych, przy czym jednocześnie każdy peptyd ma osiem do dziesięciu aminokwasów długości;

b. zebranie komórek CD8⁺ od wymienionego podmiotu;

c. stymulację wymienionych komórek CD8⁺ wymienioną linią komórkową nnAPC przez około sześć do siedmiu dni;

d. stymulowanie wymienionych komórek CD8⁺ IL-2 i IL-7 w pożywkach;

e. wymieszanie niezawieszonych monocytów z krwi obwodowej zebranych od wymienionego podmiotu z około 20 μg/ml każdego peptydu;

f. napromieniowanie wymienionej zawiesiny monocytów krwi obwodowej pozbawionej CD8 dawką promieniowania γ około 5000 radów;

g. izolację przylegających monocytów krwi obwodowej;

h. załadowanie wymienionych przylegających monocytów krwi obwodowej około 10 μg/ml wymienionego każdego epitopu;

j. stymulowanie wymienionej połączonej zawiesiny komórek CD8⁺ i monocytów krwi obwodowej, przez około sześciu do siedmiu dni;

k. stymulowanie wymienionej zawiesiny komórek CD8⁺ i monocytów krwi obwodowej za pomocą IL-2 i IL-7 w pożywkach;

l. testowanie zawiesiny CD8⁺ pod względem odpowiedniej aktywności CTL, czystości, jałowości i zawartości endotoksyny; oraz

m. szczepienie wymienionego podmiotu zawiesiną CD8⁺.

W oparciu o wynalazek można dokonać leczenia podmiotu z czerniakiem, obejmujący:

a. wytworzenie nie występującej naturalnie linii komórkowej prezentującej antygen (nnAPC), przy czym wymieniona nnAPC jest zdolna do prezentowania do około piętnastu różnych cząsteczek peptydowych, które są związane z czerniakiem, korzystnie około dziesięciu różnych cząsteczek peptydowych, przy czym jednocześnie każdy peptyd ma osiem do dziesięciu aminokwasów długości;

b. zebranie komórek CD8⁺ od wymienionego podmiotu;

d. stymulowanie wymienionych komórek CD8⁺ IL-2 i IL-7 w pożywkach;

e. wymieszanie monocytów z krwi obwodowej zebranych od wymienionego podmiotu z około 20 pg/ml każdego peptydu jakie wymieniona nnAPC może prezentować;

g. izolację przylegających monocytów krwi obwodowej;

h. załadowanie wymienionych przylegających monocytów krwi obwodowej około 10 pg/ml wymienionego epitopu;

j. stymulowanie wymienionej połączonej zawiesiny komórek CD8⁺ i monocytów krwi obwodowej, przez około sześć do siedmiu dni;

m. szczepienie wymienionego podmiotu zawiesiną CD8⁺.

Korzystając z kolejnej postaci realizacji wynalazku możliwe jest przeprowadzenie leczenia czerniaka, w którym nnAPC prezentuje następujące peptydy, tyrozynaza369-377, tyrozynaza207-216, gp100209-217, gp100154-162, MART-127-35, HER-2/neu789-797, HER-2/neu369-377, C-lektyna8-16, Pec6020-29, i Pec6025-33.

PL 206 976 B1

Niniejszy wynalazek opisuje nie występującą naturalnie komórkę prezentującą antygen (nnAPC) otrzymaną z komórek Drosophila melanogaster transfekowanych DNA kodującym ludzkie HLA klasy I, cząsteczki wiążące i kostymulatorowe dla ekspresji, przy czym nnAPC jest zdolna do prezentowania do piętnastu różnych cząsteczek peptydów, korzystnie dziesięciu cząsteczek peptydów.

Inna postać realizacji niniejszego wynalazku opisuje nnAPC, która prezentuje peptydy, które są związane z różnymi pożądanymi funkcjami, jakie wzmacniają leczenie podmiotu. Przykładowo, oprócz peptydów związanych z leczoną chorobą albo stanem chorobowym, nnAPC może prezentować peptydy związane z cząsteczkami pomocniczymi, takimi jak antygeny funkcji limfocytów (LFA-1, LFA-2 i LFA-3), czą steczki przylegania mię dzykomórkowego 1 (ICAM-1), czynniki kostymulatorowe komórek T (CD2, CD28, B7), które wzmacniają adhezję komórka-komórka albo przenoszą dodatkowe sygnały aktywacji komórki.

Następna postać realizacji niniejszego wynalazku opisuje nnAPC, która prezentuje peptydy związane z kilkoma rodzajami nowotworów. Przykładowo, peptydy związane albo pochodzące od polipeptydu spokrewnionego z rakiem piersi, takim jak HER-2/neu, mogą być prezentowane z peptydami związanymi albo spokrewnionymi z polipeptydem spokrewnionym z czerniakiem, takim jak MART-1 albo MAGE.

Inna postać niniejszego wynalazku opisuje sposób produkcji nie występującej naturalnie komórki prezentującej antygen (nnAPC) zdolnej do prezentowania do dziesięciu różnych cząsteczek peptydowych jednocześnie, przy czym wymieniony sposób obejmuje etap:

a. wytworzenia owadziej linii komórkowej z jaj Drosophila melanogaster; alternatywnie wytworzenia owadziej linii komórkowej dla ekspresji ludzkich cząsteczek MHC klasy I oraz kostymulatorowych cząsteczek adhezyjnych;

b. hodowli wymienionych komórek owadzich w pożywkach, które są odpowiednie do hodowli komórek owadów, korzystnie pożywki Schneider™'s Drosophila Medium;

e. transfekcji wymienionych komórek owadów plazmidem phsneo oraz wymienionym plazmidem pRmHa-3 zawierającym komplementarnym DNA; oraz

f. utworzenia nnAPC przez zetknięcie wymienionych komórek owadów z CUSO4 indukując ekspresję transfekowanych genów w wymienionych komórkach owadów.

Komórki owadzie według niniejszego wynalazku hoduje się w pożywce odpowiedniej do hodowli komórek owadzich, przytaczanej w niniejszym później jako „pożywki do hodowli owadów. Pożywki do hodowli owadów są dostępne na rynku od licznych sprzedawców, takie jak Schneider™'s Drosophila Medium, Grace's Insect Media i TC-100 Insect Media. Alternatywnie, pożywki do hodowli owadów może sporządzić fachowiec. Zwykle pożywki będą obejmować składniki konieczne do pobudzenia i utrzymania wzrostu komórek owadzich, takie jak sole nieorganiczne (np. chlorek wapnia, chlorek sodu i fosforan sodu), aminokwasy, różne węglowodany i rodzaje chemiczne (Imogene Schneider, Exp. Zool. (1964) 156(1): strona 91). Alternatywnie, pożywki mogą także obejmować witaminy, składniki mineralne i inne składniki pomocne przy hodowli komórek owadów.

W niniejszym opisie stosuje się nastę pują c ą listę skrótów i definicji.

Skróty
APC	komórki prezentujące antygen
CD8⁺	komórki T CD8⁺
CTL	cytotoksyczny limfocyt T
E	efektor
Fas	znany także jako CD95, epitop na komórkach T
ICAM	cząsteczka przylegania międzykomórkowego
IL	Interleukina
LAK	komórki zabójcy, aktywowane limfokiną
LFA	antygeny funkcji limfocytów
MHC	główny kompleks zgodności tkankowej

PL 206 976 B1 nnAPC nie występująca naturalnie komórka prezentująca antygen

NP białko jądrowe

PBMC komórka jednojądrowa z krwi obwodowej

PBS roztwór soli buforowanej fosforanem

PCR reakcja łańcuchowa polimerazy

RPMI Roswell Park Memorial Institute

RWJPRI The R.W. Johnson Pharmaceuticla Research Institute

T cel

TCR receptor antygenu komórki T

TIL limfocyty naciekające nowotwór

Następującą listę skrótów stosuje się w niniejszym opisie dla różnych epitopów peptydowych. Poszczególne reszty aminokwasowe są zidentyfikowane zgodnie z kodem jednoliterowym, który jest znany i stosowany przez fachowców.

Aminokwas	Skróty
3-literowy	1-literowy
alanina	ala	A
walina	val	V
leucyna	leu	L
izoleucyna	ile	I
prolina	pro	P
fenyloalanina	phe	F
tryptofan	tyr	W
metionina	met	M
glicyna	gly	G
seryna	ser	S
treonina	thr	T
cysteina	cys	C
tyrozyna	tyr	Y
asparagina	asn	N
glutamina	gln	Q
kwas asparaginowy	asp	D
kwas glutaminowy	glu	E
lizyna	lys	K
arginina	arg	R
histydyna	his	H

Skróty epitopów peptydowych

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „tyrozynaza 369-377 albo „tyrozynaza369-377 odnosi się do sekwencji aminokwasowej YMNGTMSQV (SEQ ID Nr:1). W tej definicji zawiera się także pepPL 206 976 B1 tyd o sekwencji YMDGTMSQV (SEQ ID Nr:2), która wynika ze zdarzenia potranslacyjnego modyfikującego resztę aminokwasową „N z sekwencji YMNGTMSQV (SEQ ID Nr:1) na „D co daje sekwencję aminokwasową YMDGTMSQV (SEQ ID Nr:2)(Skipper i inni, J.Exp.Med. (1996) 183:527-534).

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „tyrozynaza 207-216 albo „tyrozynaza207-216 odnosi się do sekwencji aminokwasowej FLPWHRLFLL (SEQ ID Nr:3).

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „gp100 209-217 albo „gp100209-217 odnosi się do sekwencji aminokwasowej ITDQVPFSV (SEQ ID Nr:4).

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „gp100 154-162 albo „gp100154-162 odnosi się do sekwencji aminokwasowej KTWGQYWQV (SEQ ID Nr:5).

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „MART-127-35 albo „MART-127-35 odnosi się do sekwencji aminokwasowej AAGIGILTY (SEQ ID Nr:6).

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „HER-2/neu 789-797 albo HER-2/neu789-797 odnosi się do sekwencji aminokwasowej CLTSTCQLV (SEQ ID Nr:7).

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „HER-2/neu 369-377 albo HER-2/neu369-377 odnosi się do sekwencji aminokwasowej KIFGSLAFL (SEQ ID Nr:8).

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „C-lektyna 8-16 albo „C-lektyna8-16 odnosi się do sekwencji aminokwasowej KMASRSMRL (SEQ ID Nr:9).

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „Pec60 20-29 albo Pec6020-29 odnosi się do sekwencji aminokwasowej ALALAALLVV (SEQ ID Nr:10).

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „Pec60 25-33 albo Pec6025-33 odnosi się do sekwencji aminokwasowej ALLVVDREV (SEQ ID Nr:11).

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „peptyd CD8 59-70 albo peptyd CD859-70 odnosi się do sekwencji aminokwasowej AAEGLDTQRFSG (SEQ ID Nr:12).

Określenia i definicje

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „immunoterapia adoptywna odnosi się do podawania donorowych albo autologicznych limfocytów T do leczenia choroby albo stanu chorobowego, przy czym choroba albo stan chorobowy powoduje niewystarczającą albo nieadekwatną odpowiedź odpornościową, która normalnie towarzyszy cząsteczkom HLA klasy I. Immunoterapia adoptywna jest odpowiednim leczeniem dla jakiejkolwiek choroby albo stanu chorobowego, w której eliminacja zakażonych lub transformowanych komórek została wykazana jako uzyskana za pomocą CTL. Przykładowo, choroba albo stan chorobowy obejmuje, lecz bez ograniczania, raka i/lub nowotwór, taki jak czerniak, rak prostaty, piersi, okrężniczo-odbytniczy, żołądka, gardła i szyi, trzustki, szyjki macicy, jajników, kości, białaczka oraz rak płuc; infekcje wirusowe takie jak zapalenie wątroby typu B, zapalenie wątroby typu C, ludzki wirus niedoboru odporności; infekcje bakteryjne, takie jak gruźlica, trąd i listerioza oraz infekcje pierwotniakowe takie jak malaria.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „BCNU odnosi się do karmustyny, znanej także jako 1,3-bis (2-chloroetylo)-1-nitrozomocznik.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „BSE odnosi się do gąbczastego zapalenia mózgu bydła.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „CD odnosi się do kompleksu różnicowania, limfocytów T (początkowo), limfocytów B, monocytów, makrofagów i granulocytów zgrupowanych przez epitop i funkcję antygenu.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „DTIC odnosi się do dakarbazyny, 5-(3,3-dimetylo-1-triazeno)imidazolo-4-karboksyamidu.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „ex vivo albo „terapia ex vivo odnosi się do terapii, w której materiały biologiczne, zwykle komórki, otrzymuje się od pacjenta albo odpowiedniego innego źródła, takiego jak odpowiedni dawca, i modyfikuje się tak, że zmodyfikowane komórki można wykorzystać do leczenia stanu patologicznego, który będzie ulegał poprawie w wyniku długoterminowego albo stałego dostarczania korzyści terapeutycznych płynących ze zmodyfikowanych komórek. Leczenie obejmuje ponowne wprowadzenie do pacjenta zmodyfikowanego materiału biologicznego, uzyskanego albo od pacjenta albo z innego źródła. Zaletą terapii ex vivo jest możliwość zapewnienia pacjentowi korzyści z leczenia, bez wystawienia pacjenta na niepożądane skutki ubocznych terapii. Przykładowo, pacjentom z rakiem lub infekcjami wirusowymi podaje się często cytokiny w celu stymulacji ekspansji CTL pacjenta. Jednak cytokiny często powodują u pacjenta wystąpienie objawów podobnych do grypy. Przy procedurze ex vivo, cytokiny stosuje się do stymulacji ekspansji CTL poza organizmem pacjenta i pacjentowi oszczędza się ekspozycji i w konsekwencji skutków ubocznych

PL 206 976 B1 cytokin. Alternatywnie w odpowiednich sytuacjach albo stanach, jeśli jest to odpowiednie i jeśli podmiot może odnieść korzyść, podmiot można leczyć jednocześnie niskimi dawkami interferonu γ, interferonu α i/lub IL-2. Oczekiwanym skutkiem interferonów jest prawdopodobne uwrażliwienie komórek nowotworowych na lizę przez CTL swoiste wobec antygenu, a możliwym skutkiem IL-2 jest wzmocnienie uporczywości CTL swoistej wobec antygenu.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „HEPES odnosi się do buforu kwasu N-2-hydroksyetylopiperazynyno-N'2-etanosulfenowego.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „HLA-A2.1 odnosi się do cząsteczki HLA klasy I występujących u około 45% ludzi rasy białej.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie MART-1 albo „antygen czerniaka rozpoznawany przez komórki T-1 odnosi się do antygenu związanego z czerniakiem. Sekwencje aminokwasowe oraz kwasu nukleinowego, jak również różne cechy tego antygenu są opisane w opisie patentowym nr US 5 994 523, przyznanym 30 listopada 1999, zatytułowanym „Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods; opisie patentowym nr US 5 874 560, przyznanym 23 lutego 1999, zatytułowanym „Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods; oraz opisie patentowym nr US 5 844 075, przyznanym 1 grudnia 1998, zatytułowanym „Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods. W szczególności, opis patentowy 5 994 523 opisuje pełnej długości sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową MART-1 w fig. 1 jako SEQ ID Nr:1 i SEQ ID nr: 2 odpowiednio.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „MAGE odnosi się do antygenu związanego z czerniakiem. Sekwencje aminokwasowe oraz kwasu nukleinowego, jak również różne cechy tego antygenu są opisane w opisie patentowym nr US 6 140 050, przyznanym 31 października 2000, zatytułowanym „Methods for Determining Breast Cancer and Melanoma by Assaying fog a Plurality of Antygens Associated Therewith; opisie patentowym nr US 5 759 783, przyznanym 2 czerwca 1998, zatytułowanym „Methods of Screening for Cancer by Detecting Messenger RNA for MAGEXP Gene; oraz opisie patentowym nr US 5 662 907, przyznanym 2 września 1997, zatytułowanym „Induction of Anti-Tumor Cytotoxic T Lymphocytes in Humans Using Synthetic Peptide Epitopes.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „MPC-10 odnosi się do magnetycznego koncentratora cząstek.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „komórki NK odnosi się do komórek naturalnych zabójców.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „OKT3 odnosi się do ORTHOCLONE OKT3, muromonab-CD3, przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD3.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „TAP-1,2 odnosi się do transportera związanego z obrabianiem antygenu-1, 2.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „komórki Th odnosi się do pomocniczych komórek T, CD4+.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „tyrozynaza odnosi się do białka związanego z czerniakiem (Brichard i inni, J. Exp. Med (1993) 178:489-495; Robbins i inni, Cancer Res. (1994) 54:3124-3126). Opis patentowy nr US 5 843 648, przyznany 1 grudnia 1998, zatytułowany „P15 and Tyrosinase Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods opisuje peptydy antygenowe i związane kwasy polinukleinowe spokrewnione z tyrozynazą w fig. 7, panele A do D. Opis patentowy nr US 5 487 974, przyznany 30 stycznia 1996, zatytułowany „Method for Detetcing Complexes Containing Human Leukocyte Antigen A2 (HLA-A2) Molecules and a Tyrosinase Derived Peptide on Abnormal Cells opisuje dodatkowy peptyd, który jest związany z tyrozynazą i czerniakiem w przykładzie 9, w tablicy 3.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „gp100 odnosi się do antygenu czerniaka rozpoznawanego przez limfocyty naciekające nowotwór (TIL). TIL, który rozpoznaje gp100 jest związany z odrzuceniem nowotworu in vivo (Bakker i inni, J. Exp. Med (1994) 179:1005-1009; Kawakami i inni, J. Immunol (1995) 154:3961-3968). Peptydy antygenowe spokrewnione z gp100 są opisane w opisie patentowym nr US 5 994 523, przyznanym 30 listopada 1999, zatytułowanym „Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods; opisie patentowym nr US 5 874 560, przyznanym 23 lutego 1999, zatytułowanym „Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods; oraz opisie patentowym nr US 5 844 075, przyznanym 1 grudnia 1998, zatytułowanym „Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods. W szczególności, opis patentowy 5 994 523 opisuje pełnej długości sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową spoPL 206 976 B1 krewnione z GP100, w fig. 4 i 5 odpowiednio. Opisane są także peptydy antygenowe otrzymane od sekwencji aminokwasowych, włącznie z tymi zidentyfikowanymi jako SEQ ID nr: 27, 33, 34, 35, 36, 37,

38, 39, 40 i 41.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „czerniak odnosi się, lecz bez ograniczenia, do czerniaków, czerniaków przerzutowych, czerniaków pochodzących albo od melanocytów albo komórek znamion spokrewnionych z melanocytami, czerniakomięsaków, czerniakoraków, czerniakonabłoniaków, czerniaka w miejscu, czerniaka rozprzestrzeniającego się powierzchniowo, czerniaka guzowatego, czerniaka w postaci złośliwej plamy soczewicowatej, czerniaka soczewicowatego części zewnętrznych ciała, czerniaka inwazyjnego albo zespołu rodzinnego znamienia atypowego i czerniaka (FAM-M). Takie czerniaki u ssaków mogą być wywołane przez nieprawidłowości chromosomowe, degeneracyjne schorzenia wzrostu i rozwoju, środki mitogenne, promieniowanie ultrafioletowe (UV), infekcje wirusowe, nieprawidłową ekspresję genu w tkance, zmiany w ekspresji genu oraz prezentację na komórce, lub środki rakotwórcze. Wyżej wymienione czerniaki można diagnozować, szacować lub leczyć sposobami opisanymi w niniejszym zgłoszeniu.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „C-lektyna odnosi się do peptydu o sekwencji, która jak odkryto, towarzyszy rakowi jajnika.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „główny kompleks zgodności tkankowej albo „MHC oznacza ogólne oznaczenie obejmujące w zamierzeniu układy antygenowe zgodności tkankowej opisywane u różnych gatunków, łącznie z ludzkimi antygenami leukocytowymi (HLA).

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „epitop, „peptyd epitopu, „peptyd antygenowy oraz „peptyd immunogeniczny odnoszą się do peptydu otrzymanego od antygenu zdolnego do wywoływania komórkowej odpowiedzi odpornościowej u ssaka. Takie peptydy mogą być także reaktywne z przeciwciałami od zwierzęcia immunizowanego tymi peptydami. Takie peptydy mogą mieć około pięciu do dwudziestu aminokwasów długości, korzystnie około ośmiu do piętnastu aminokwasów długości, a najkorzystniej około dziewięciu do dziesięciu aminokwasów długości.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „Pec60 odnosi się do peptydu o sekwencji, która, jak odkryto, towarzyszy rakowi jajnika i piersi.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „analog obejmuje każdy polipeptyd mający sekwencję reszt aminokwasowych zasadniczo identyczną z sekwencjami według niniejszego wynalazku, konkretnie pokazanych w niniejszym, w których jedna lub więcej reszt została konserwatywnie podstawiona funkcjonalnie podobną resztą i która wykazuje aspekty funkcjonalne według niniejszego wynalazku, jakie opisano w niniejszym. Przykładami substytucji konserwatywnych są substytucje reszt nie polarnych (hydrofobowych), takich jak izoleucyna, walina, leucyna lub metionina, na inną, substytucja jednej reszty polarnej (hydrofilowej) na inną, tak jak między argininą i lizyną, między glutaminą i asparaginą, między glicyną i seryną, substytucja jednej reszty zasadowej, takiej jak lizyna, arginina albo histydyna, na inną, albo substytucja jednej reszty kwasowej, takiej jak kwas asparaginowy albo kwas glutaminowy, na inną.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „substytucja konserwatywna obejmuje także stosowanie reszty chemicznie derywatyzowanej w miejsce reszty niederywatyzowanej.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „pochodna chemiczna odnosi się do podmiotowego polipeptydu mającego jedną lub więcej reszt derywatyzowanych chemicznie przez reakcję funkcyjnej grupy bocznej. Przykłady takich cząsteczek derywatyzowanych obejmują np. te cząsteczki, w których wolne grupy aminowe zostały derywatyzowane z utworzeniem chlorowodorku aminy, grup p-toluenosulfonylowych, grup karbobenzoksylowych, grup tert-butoksykarbonylowych, grup chloroacetylowych lub grup formylowych. Wolne grupy karboksylowe można derywatyzować z utworzeniem soli, estrów metylowych i etylowych albo innych rodzajów estrów albo hydrazyn. Wolne grupy hydroksylowe mogą być derywatyzowane z utworzeniem pochodnych O-acylowych albo O-alkilowych. Imidazolowy atom azotu histydyny można derywatyzować z utworzeniem N-imbenzylohistydyny. Do pochodnych chemicznych należą także te białka lub peptydy, które zawierają jedną albo więcej naturalnie występujących pochodnych aminokwasowych z dwudziestu standardowych aminokwasów. Przykładowo: 4-hydroksyproliną można podstawić prolinę; 5-hydrokylizyną można podstawić lizynę; 3-metylohistydyną można podstawić histydynę; homoseryną można podstawić serynę; oraz ornityną można podstawić lizynę. Białka lub polipeptydy według niniejszego wynalazku obejmują także każdy polipeptyd mający jedną lub więcej addycji i/lub delecji reszt w stosunku do sekwencji polipeptydu, którego sekwencja jest kodowana i jest odpowiednią sekwencją nukleinową według niniejszego wynalazku, tak długo jak utrzymana jest konieczna aktywność.

PL 206 976 B1

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „HER-2/neu odnosi się do onkogenu, który wykazuje ekspresję lub nadekspresję jednego lub więcej białek onkogenicznych podobnych do receptora, związanych z błoną. Wśród raków, i które zgodnie z odkryciem, są związane z ekspresją lub nadekspresją HER-2/neu są pewne raki piersi, żołądka, jajnika, okrężnicy i gruczołu ślinowego. Onkogen HER-2/neu jest członkiem rodziny onkogenów białek kinazy tyrozynowej i dzieli wysoki stopień homologii z receptorem czynnika wzrostu naskórka (EGER). Okazało się, że HER-2/neu pełni rolę we wzroście i/lub różnicowaniu się komórek. HER-2/neu indukuje nowotworzenie poprzez ilościowy mechanizm, który wynika ze zwiększonej lub rozregulowanej ekspresji zasadniczo normalnego produktu genowego. Opis patentowy nr US 6 075 122 przyznany 13 czerwca 2000, zatytułowany „Immune Reactivity to HER-2/neu Protein fog Diagnosis and Treatment of Malignancies in Which the HER-2/neu Oncogene is Associated opisuje peptydy, które wzbudzają odpowiedź komórek T CD8⁺ w kolumnie 12, wierszu 31, do kolumny 13, wiersza 7, zidentyfikowane zgodnie z liczbami SEQ ID.

HER-2/neu (p185) jest produktem białkowym onkogenu HER-2/neu. Gen HER-2/neu jest amplifikowany i białko HER-2/neu ulega nadekspresji w rozmaitych nowotworach, włączając raka piersi, jajnika, okrężnicy, płuc i prostaty. HER-2/neu ma związek z transformacją nowotworową. Jest znajdowany w 50% do 60% raków przewodowych in situ i 20% do 40% wszystkich raków piersi, jak również w postaci zasadniczej frakcji gruczolakoraków powstających w jajnikach, prostacie, okrężnicy i płucach.

HER-2/neu jest wewnętrznie związany nie tylko z fenotypem nowotworowym, lecz także z agresywnością nowotworu znajdowaną w jednej czwartej wszystkich inwazyjnych raków piersi. Nadekspresja HER-2/neu jest skorelowana ze złym prognozowaniem zarówno przy raku piersi jak i jajnika. HER-2/neu jest białkiem transbłonowym o względnej masie cząsteczkowej wynoszącej 185 kD, mającym około 1255 aminokwasów (aa) długości. Posiada zewnątrzkomórkową domenę wiążącą (ECD) wielkości około 645 aa, z 40% homologii z receptorem czynnika wzrostu naskórka (EGER), wysoce hydrofobową transbłonową domenę kotwiczącą (TMD) oraz karboksyterminalną domenę cytoplazmatyczną (CD) długości około 580 aminokwasów, w 80% homologiczną z EGFR.

Podjęte badania dotyczące onkogenów zidentyfikowały co najmniej czterdzieści onkogenów działających w komórkach nowotworowych i odpowiedzialnych, albo związanych z transformacją. Onkogeny poklasyfikowano w różne grupy na podstawie przypuszczalnej funkcji albo położenia ich produktów genowych (tak jak białko powstałe w wyniku ekspresji onkogenu). Onkogeny uważa się za zasadnicze dla pewnych aspektów normalnej fizjologii komórki.

Rak stanowi ciągle główny problem zdrowotny, mimo znacznego postępu w dziedzinie leczenia. Standardowe schematy leczenia chemioterapią, radioterapią, poprzez operacje chirurgiczne i kombinacje tych trzech, często zawodzą jeśli chodzi o długotrwałe wyleczenie. W wielu przypadkach, u pacjentów z rakiem którzy przeszli leczenie często, po pewnym okresie czasu następuje nawrót choroby, a dodatkowym problemem staje się ciężkość tych schematów leczenia dla pacjenta. W przypadku czerniaka, nie osiągnięto wyleczenia przerzutowego czerniaka przy użyciu konwencjonalnej chemioterapii. Współczynniki odpowiedzi wynoszące 35-50% opisywano przy trybie Dartmouth, kombinacji chemioterapii (DTIC, cis-platyna, BCNU i tamoksyfen), lecz czas przeżycia pozostał na poziomie sześciu do dziesięciu miesięcy. Wysokie współczynniki remisji opisywano przy agresywnej chemioterapii „wysokodawkowej intensywności i przywróceniu hematopoezy za pomocą przeszczepów autologicznego szpiku kostnego. Niemniej jednak, mediana czasu przeżycia była mała, około czterech miesięcy.

Rosenberg i koledzy podjęli próbę stosowania infuzji aktywowanych limfocytów jako leczenia różnych raków. Początkowo stosowano komórki zabójcze aktywowane limfokinami (LAK), a potem limfocyty naciekające nowotwór (TIL) aktywowane ex vivo IL-2, lecz skuteczność jest wątpliwa. W istocie, kontrolowane próby kliniczne zawiodły jeśli chodzi o wykazanie korzyści stosowania komórek aktywowanych ex vivo w stosunku do bezpośredniego podawania IL-2 pacjentom. Tak więc, korzyści terapii LAK i TIL są marginalne, a skutki uboczne są zwykle tak ciężkie, że wiele prób przerwano przedwcześnie.

Badania w mysich modelach nowotworu pokazały, że immunoterapia adoptywna, immunizacji in vivo komórek T swoistych dla antygenu (antygenów) nowotworowych, jest bardzo skuteczna przy minimalnej toksyczności. Główną przeszkodą stosowania tej strategii w leczenia ludzkich nowotworów jest identyfikacja immunogenicznych antygenów, które czynią komórki nowotworowe wrażliwymi na zniszczenie przez cytotoksyczne limfocyty T (CTL). Izolacja komórek T reaktywnych wobec nowotworu od pacjentów z czerniakiem doprowadziła do identyfikacji niektórych antygenów nowotworowych (epitopów), przeciwko którym skierowane są CTL. Obejmują one tyrozynazę (Brichard i inni, J. Exp.

PL 206 976 B1

Med. (1993) 178:489-495; Robbins i inni, Cancer Res. (1994) 54:3124-3126), MART 1/Melan A (Kawakami i inni, J. Exp. Med. (1994) 180:347-352), gp100 (Bakker i inni, J. Exp. Med (1994) 179:1005-1009; i Kawakami i inni, J. Immunol. (1995) 154:3961-3968) i MAGE (Gaugler i inni, J. Exp. Med. (1994) 179:921-930). Z nich, tyrozynaza i MART-1 ulegają prawie uniwersalnej ekspresji na czerniakach, a więc są logicznym wyborem dla immunoterapii adoptywnej.

W ostatnich latach, zanotowano znaczny postęp jeśli chodzi o przeżycie rzędu kilku lat, u małego procentu pacjentów z czerniakiem, którzy przeszli terapię immunologiczną. Obejmuje ona aktywną, swoistą immunoterapię za pomocą „szczepionek rakowych, jak również stosowanie nieswoistych wzmacniaczy układu odpornościowego, takich jak cytokiny IL-2, α-interferon oraz γ-interferon. Jednak korzyść z cytokin jest zmniejszona przez skutki uboczne, które często towarzyszą ich stosowaniu, takie jak nudności i gorączka.

Cytolityczne komórki T (CD8⁺) są główną linią obrony przeciwko infekcjom wirusowym. Limfocyty CD8⁺ swoiście rozpoznają i zabijają komórki gospodarza, które są zakażone wirusem. Teoretycznie, powinno być możliwe zaprzęgnięcie układu odpornościowego do zwalczania innych rodzajów chorób, łącznie z nowotworem. Jednak do swoistego aktywowania CTL dostępnych jest zaledwie parę procedur in vitro/ex vivo. Identyfikacja kluczowych antygenów czerniaka wymienionych powyżej, oraz metody swoistej aktywacji CTL in vitro, opisanej poniżej, pozwalają na testowanie koncepcji immunoterapii adoptywnej czerniaka przerzutowego.

Wszystkie nie pobudzone komórki T, aby wywołać odpowiedź odpornościową, wymagają dwóch sygnałów dla aktywacji. Dla limfocytów CD8⁺ (CTL), pierwszy sygnał, który nadaje swoistość, składa się z prezentacji komórkom CD8⁺ immunogenicznego fragmentu peptydu (epitopu) antygenu związanego z kompleksem MHC (HLA) klasy I występującym na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC). Ten kompleks jest rozpoznawany swoiście przez receptor antygenowy komórki T (TCR), który przenosi sygnał wewnątrzkomórkowe.

Wiązanie z receptorem komórki T jest konieczne lecz nie wystarcza do indukcji aktywacji komórki T i zwykle nie będzie prowadzić do proliferacji komórkowej czy wydzielania cytokin. Pełna aktywacja wymaga drugiego sygnału (sygnałów) kostymulatorowego, przy czym sygnały te służą do dodatkowego wzmocnienia kaskady aktywacji. Wśród cząsteczek kostymulatorowych na komórkach prezentujących antygen, w procesie tym uczestniczą cząsteczki B7 i przylegania komórkowego (integryny), takie jak ICAM-1, poprzez wiązanie odpowiednio z CD28 i LFA-1 na komórce T. Gdy komórka CD8⁺ ulega interakcji z komórką prezentującą antygen niosącą peptyd immunogeniczny (epitop) związany przez cząsteczkę MHC klasy I, w obecności odpowiednich interakcji z cząsteczkami kostymulatorowymi, komórka CD8⁺ staje się w pełni aktywowaną, cytolityczną komórką T.

Zabijanie komórek za pośrednictwem limfocytów obejmuje sekwencję zdarzeń biologicznych zaczynającą się od związania CTL CD8⁺ z docelową (nowotworową) komórką niosącą antygen, za pomocą procesu rozpoznawania opisanego powyżej dla aktywacji komórki T.

Interakcja między komórkami CD8⁺ i komórkami prezentującymi antygen albo komórkami docelowymi (nowotworowymi), jak opisano powyżej, jest omówiony w fig. 1. Interakcja rozpoczyna się związaniem antygenu z udziałem cząsteczki MHC klasy I na APC albo komórce docelowej, z receptorem antygenowym komórki T (TCR). Cząsteczki pomocnicze, takie jak antygeny funkcji limfocytów (LFA-1, LFA-2 i LFA-3), cząsteczka adhezji międzykomórkowej 1 (ICAM-1), czynniki kostymulatorowe komórek T (CD2, CD28, B7) wzmacniają adhezję komórka-komórka albo przenoszą dodatkowe sygnały aktywacji komórkowej.

Po interakcji komórka-komórka, CTL zabija komórkę docelową poprzez działanie rozpuszczalnych, cytolitycznych mediatorów (perforyna i granzymy przechowywane w ziarnach cytoplazmy komórki T) oraz cząsteczki powierzchniowej CTL (ligand Fas). Po ataku cytolitycznym, komórka docelowa umiera przez nekrozę (perforacja błony i rozpad organelli) albo apoptozę (kondensacja chromatyny, fragmentacja DNA i utworzenie pęcherzyków w błonie).

Mechanizm cytolizy za pośrednictwem limfocytu jest graficznie przedstawiony w fig. 2. W panelu A fig. 2, po związaniu z komórką docelową, ziarna cytoplazmatyczne w CTL przeorientowują się gwałtownie w kierunku komórki docelowej w celu uwolnienia ziaren zawierających perforynę i granzymy do przestrzeni międzykomórkowej. Te enzymy proteolityczne tworzą pory w błonie plazmatycznej komórki docelowej, prowadząc na koniec do nekrozy komórki. W panelu B, po związaniu z komórką docelową, wzrasta poziom ekspresji liganda Fas na CTL. Interakcja liganda Fas oraz receptora Fas na komórce docelowej prowadzi do apoptozy. Z indukcją apoptozy zostały powiązane proteazy, takie jak CPP32 i inne spokrewnione z enzymem przekształcającym IL-1b (ICE). Możliwe jest stosowanie naturalnie

PL 206 976 B1 występujących komórek prezentujących antygen, np. komórek dendrytycznych, makrofagów, autologicznych komórek nowotworowych do aktywacji CD8⁺ in vitro. Jednak skuteczność aktywacji w wyniku tego podejścia jest niska. Powodem jest to, że cząsteczka klasy I natywnych APC zawiera wiele innych rodzajów epitopów peptydowych poza epitopami nowotworowymi. Większość peptydów pochodzi od normalnych, nieszkodliwych białek komórkowych, wywołujących rozcieńczenie licznych aktywnych natywnych APC, które właściwie byłyby skuteczne przeciwko nowotworowi (Allison i inni, Curr. Op. Immunol. (1995) 7:682-686).

Bardziej bezpośrednim i skutecznym podejściem do tego problemu jest swoista aktywacja komórek CD8⁺ tylko z tymi epitopami istotnymi do zwalczania konkretnej choroby (takiej jak rak) albo antygenami swoistymi dla nowotworu (takimi jak antygenu swoiste dla czerniaka). W tym celu tworzy się sztuczną komórkę prezentującą antygen, przez ekspresję cząsteczek MHC klasy I w komórkach Drosophila melanogaster (muszki owocowej). Ponieważ Drosophila nie posiada układu odpornościowego, transportery peptydu TAP-1,2 zaangażowane w ładowanie epitopów peptydowych na cząsteczki klasy I, nie występują. W efekcie, cząsteczki klasy I pojawiają się na powierzchni komórki Drosophila w postaci pustych naczyń. Inkubując te transfekowane komórki Drosophila z egzogenicznymi peptydami, które wiążą się z cząsteczkami klasy I, takimi jak epitopy swoiste dla raka lub nowotworu, włączając, lecz bez ograniczenia, epitopy swoiste wobec czerniaka, możliwe jest zajęcie każdej cząsteczki klasy I tym samym peptydem. Wysokiej gęstości ekspresja cząsteczek klasy I zawierających pojedynczy peptyd w tych APC Drosophila pozwalają na tworzenie cytotoksycznych komórek T CD8⁺in vitro, które są w pełni swoiste wobec peptydu antygenu. Metody i procedury wytwarzania komórek Drosophila są opisane w opisie patentowym nr US 5 529 921, przyznanym 25 czerwca 1996, zatytułowanym „In Vitro Activation of Cytotoxic T-Cells Using Insect Cells Expressing Human Class I MHC and e2-Microglobulin oraz opisie patentowym nr US 5 314 813, przyznanym 24 maja 1994, zatytułowanym „Drosophila Cell Lines Expressing Genes Encoding MHC Class I Antigens And e2-Microglobulin and Capable of Assembling Empty Complexes and Methods of Making Sald Cell Lines. W szczególności opis patentowy nr US 5 529 921 opisuje w kolumnie 26, wiersz 56 do kolumny 28, wiersz 22 różne metody rozdzielania i/lub wzbogacania hodowli komórek prekursorowych.

Dodatkowo, cecha ta eliminuje potrzebę stymulacji in vivo układu odpornościowego za pomocą wysokich dawek różnych cytokin. Uzyskuje się przez to leczenie, które omija skutki uboczne powodowane przez cytokiny. Alternatywnie, w stosownych sytuacjach albo warunkach, jeśli jest to odpowiednie i jeśli podmiot może odnieść korzyść, podmiot można leczyć równocześnie niskimi dawkami α-interferonu, γ-interferonu i/lub IL-2.

Eliminacja potrzeby stymulacji in vivo cytokinami zapewnia poprawę jakości opieki nad pacjentem. Schematy leczenia, które obejmują podawanie pacjentom cytokin często wywołują u pacjentów rozwój objawów podobnych do grypy, takich jak nudności, wymioty i gorączka. Te uboczne reakcje generalnie nie zagrażają życiu, choć szczególnie ciężka reakcja występująca u pacjenta, który już jest osłabiony, mogłaby wywołać sytuację niebezpieczną dla życia. Inną okolicznością jest szkodliwy wpływ takich ubocznych reakcji na akceptację przez pacjenta i zgodę na korzystny, z drugiej strony, tryb leczenia. Usunięcie potrzeby stymulacji cytokinami in vivo, daje w efekcie tryb leczenia, który poprawia komfort pacjenta i zapewnia klinicyście skuteczną metodę leczenia, na którą pacjent chętniej się zgodzi.

Wykorzystanie tego sposobu do immunoterapii adoptywnej nowotworów zademonstrowano u myszy przy użyciu transfekowanych komórek Drosophila, jako komórek APC i CD8⁺ z linii myszy transgenicznych 2C receptora komórki T (TCR). W tym układzie, oczyszczone komórki CD8⁺ 2C odpowiadają w dużym stopniu na peptydy in vitro, prezentowane przez komórki Drosophila transfekowane MHC klasy I (L^d), niosące także cząsteczki kostymulatorowe B7-1 i ICAM-1. Transfekowane komórki Drosophila jako sonda do określania minimalnych wymagań dla stymulacji niepobudzanych komórek T CD8⁺ (Cai i inni, P.N.A.S. USA (1996) 93:1473-14741). Alternatywnie, gdy stosuje się nieoddzielone komórki śledziony myszy jako komórki odpowiadające, zamiast oczyszczonych komórek 2C, potrzeba cząsteczek kostymulatorowych nie ma zastosowania. W tym przypadku, komórki CD8⁺w populacji śledziony otrzymują kostymulację „czuwania ze strony aktywowanych komórek B. Wykorzystując to odkrycie, możliwe było wykazanie, że komórki Drosophila transfekowane MHC klasy I (L^d) są zdolne do indukcji normalnych komórek śledziony myszy DBA/2, aby odpowiadały na jednorodne peptydy swoiste dla nowotworu komórek tucznych P815 in vitro, przy braku dodanych limfokin. Wstrzyknięcie tych CTL do myszy DBA/2 niosących nowotwór komórek tucznych P815 prowadziło do szybkiej regresji guza (Sun i inni, Immunity (1996) 4:555-564).

PL 206 976 B1

Od strony proceduralnej, normalne komórki śledziony myszy DBA/2 hodowano z komórkami Drosophila transfekowanymi MHC klasy I (L^d), załadowanych peptydem P1A.35-43, epitopem swoistym dla nowotworu z linii komórkowej guza komórek tucznych P815, otrzymanej od DBA/2. Limfocyty zebrane z hodowli po pięciu dniach wykazywały silną aktywność cytotoksyczną limfocytów T (CTL) w kierunku komórek nowotworu P815 in vitro, lecz nie zdołały przeprowadzić lizy P1024, zmutowanej linii komórkowej P815, która nie wykazuje ekspresji P1A.35-43, jak ukazano w fig. 3, panel A. Gdy te CTL wstrzyknięto myszom DBA/2 wcześniej zaszczepionych komórkami P815 trzy dni wcześniej, guzy rosły w sposób niezakłócony przez pierwszy tydzień, lecz były następnie eliminowane w ciągu następnego tygodnia, jak ukazano w fig. 3, panel B. Swoistość zademonstrowano przez brak jakiegokolwiek wpływu na wzrost P815 gdy CTL immunizowano in vitro przeciwko nieistotnemu antygenowi, takiemu jak peptyd nukleoproteiny wirusowej, jak ukazano w fig. 3, panel B. Podsumowując, komórki Drosophila zakażone głównym kompleksem zgodności tkankowej klasy I (L^d) indukowały normalne komórki śledziony myszy DBA/2 aby odpowiadały na jednorodne peptydy swoiste wobec nowotworu komórek tucznych P815 in vitro, przy braku dodanych limfokin. Wstrzyknięcie tych CTL myszom DBA/2 niosącym nowotwór komórek tucznych P815, prowadziło do gwałtownej regresji guza (Wolfel i inni, J. Exp. Med (1993) 17 8:489-495).

Badania człowieka in vitro

Ludzkie CTL od zdrowych podmiotów immunizowano in vitro przeciwko tyrozynazie. Po pierwotnej stymulacji tylko komórkami Drosophila, swoista liza komórek JY niosących tyrozynazę była ewidentna we wszystkich testowanych stosunkach efektora CTL do celu JY. CTL swoiste dla tyrozynazy do zdrowych podmiotów były indukowane przy użyciu pełnego protokołu stymulacji/restymulacji i testowane pod względem zdolności do zabijania linii komórek czerniaka Malme 3M. Z jednym lub dwoma możliwymi wyjątkami, swoista aktywność CTL przeciwko Malme 3M była indukowana u wszystkich dawców, w zmiennym stopniu. Dla większości, reaktywność w kierunku kontrolnych komórek nowotworu Malme 3 była minimalna. Komórki od pacjentów z czerniakiem były także immunizowane in vitro przeciwko epitopowi tyrozynazy w celu wytworzenia CTL o podobnej aktywności i swoistości do tych otrzymanych od zdrowych ochotników.

Stosowanie jakiegokolwiek układu naturalnej lub sztucznej komórki prezentującej antygen (APC) do tworzenia cytotoksycznych limfocytów T in vitro, jest ograniczony przez swoistość antygenową jakie te układy są zdolne wytworzyć.

Wykorzystano następujące układy APC do wytwarzania CTL swoistych dla antygenu, wobec pojedynczych epitopów: 1) ludzkie komórki dendrytyczne (DC) poddane impulsom określonych peptydów; 2) komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), które skierowano na limfoblasty i poddano impulsom peptydów; 3) linie komórkowe limfoblastoidu (LCL), gdzie naturalne peptydy są potraktowane kwasem i załadowane z omawianymi peptydami; 4) komórki Drosophila zbudowane do ekspresji pustych cząsteczek klasy I; oraz mysie komórki 3T3 transfekowane ludzkimi cząsteczkami klasy I i kostymulatorowymi (J.B. Latouche i M. Sadelain, Nature Biotech (2000) 18:405-409).

Komórki dendrytyczne (DC) są uważane za układ komórek prezentujących pierwotny antygen u ludzi, z powodu ich szerokiego stosowania w komórkach prezentujących antygen pierwotny. Swoje lub obce białka są poddawane obróbce wewnątrz DC. Jednak odkryto, że DC nie wytwarzałyby zgodnie CTL skierowanych przeciwko czterem różnym peptydom in vitro. Zapewniłoby to CTL mające aktywność odpowiadającą każdemu z czterech peptydów. Oprócz tego odkryto, że fenotyp DC w czasie poddawania impulsom peptydami, dojrzały czy niedojrzały, nie miał wpływu na wynik.

Alternatywnie, stymulacja komórek Drosophila zwykle dawał CTL skierowane przeciwko dziesięciu różnych rodzajów peptydów. Zapewnia to, że CTL są aktywne wobec każdego z dziesięciu peptydów.

Oceniano zdolność komórek Drosophila i DC do wywoływania odpowiedzi CTL, początkowo wobec pojedynczego peptydu epitopowego, postępując zgodnie ze standardowymi protokołami stymulacji dla każdego. Aby porównać DC i transfekowane komórki Drosophila, utworzono niedojrzałe DC przez hodowlę przez jeden tydzień autologicznych monocytów w obecności IL-4 i GM-CSF. Dojrzałe DC otrzymano z niedojrzałych DC przez dodanie TNFa do pożywki hodowlanej, dwadzieścia cztery godziny przed zbiorem. DC (niedojrzałe i dojrzałe) zebrano, poddano impulsom peptydami i wymieszano z oczyszczonymi komórkami CD8 postępując zgodnie z procedurą stosowaną dla stymulacji komórek CD8 i komórek Drosophila poddanych impulsom peptydami. Jak się okazało, komórki Drosophila były lepszymi stymulatorami niż DC gdy oceniano je pod względem epitopu peptydowego 689 tyrozynazy, jak ukazano w fig. 7. Dodatkowo, DC wykazujące fenotyp albo niedojrzały albo doj16

PL 206 976 B1 rzały (fig. 8) nie były tak skuteczne jak komórki Drosophila jeśli chodzi o wzbudzanie swoistych odpowiedzi CTL gdy stosowano określone peptydy do impulsów APC. Jest to szczególnie zaskakujące, z powodu dominującej roli odgrywanej przez DC w układzie odpornościowym. Przeprowadzono badanie porównawcze z jednym dawcą, jak ukazano w fig. 9. Wygenerowano swoiste zabijanie w stosunku do czterech różnych peptydów, gdy użyto komórek muszki jako stymulatorów, podczas gdy niedojrzałe DC powodowały marginalne swoiste zabijanie, a dojrzałe DC powodowały swoiste zabijanie tylko jednego z czterech peptydów stosowanych do stymulacji.

Wytwarzanie cytotoksycznych limfocytów

Komórki CD8⁺ wyizolowane z próbek leukaferezy przez pozytywną selekcję z przeciwciałem anty-CD8, stymuluje się przeciwko czterem różnym peptydom związanym z czerniakiem, prezentowanym przez komórki Drosophila wykazujące ekspresję ludzkich cząsteczek klasy I (HLA-A2.1), B7.1, ICAM-1, LFA-3 i B7.2. Komórki CD8⁺ ponownie stymuluje się przez dwa okrążenia z autologicznymi monocytami załadowanymi peptydem epitopu w obecności IL-2 i IL-7. CTL rozprzestrzenia się nieswoiście z OKT3 i IL-2. Mierzy się aktywność CTL przeciwko komórkom Malme 3M i ocenia czystość komórek T CD8⁺ za pomocą cytometrii przepływowej.

Procesy produkcyjne i protokoły wykonuje się zgodnie z Good Laboratory Practices i Good Manufacturing Practices. „Good Laboratory Practices i „Good Manufacturing Practices są standardami praktyk laboratoryjnych i produkcyjnych, które są ustanowione przez Food and Drug Administration Stanów Zjednoczonych i są dobrze znane specjalistom. CTL są monitorowane pod względem identyczności, żywotności, aktywności CTL, jałowości i zawartości endotoksyny.

Listę epitopów odpowiednich do stosowania w sposobach według niniejszego wynalazku, do leczenia raków piersi i jajnika, są ukazane w następującej tablicy 1. Fachowiec łatwo zobaczy, że rozmaite epitopy peptydowe oprócz tych wymienionych w następującej tablicy 1, będą także odpowiednie do stosowania w sposobach według niniejszego wynalazku, do leczenia raków piersi i jajnika, pod warunkiem, że takie peptydy są epitopami komórek T.

T a b l i c a 1

Zidentyfikowane ograniczone epitopy HLA-A2.1 dla antygenów związanych z nowotworem, jako celem dla raka piersi i jajnika.

Cel (reszty)	Nazwa	# PRI	AKA	Sekwencja (SEQ ID nr)	Przewidywanie wiązania peptydu HLA
1	2	3	4	5	6
HER-2/neu
789-797		826	E90	CLTSTVQLV (SEQ ID nr 7)	160
48-56		827	D113	HLYQGCQVV (SEQ ID nr 13)	481
369-377		835	E75	KIFGSLAFL (SEQ ID nr 8)
654-662		837	GP2	IISAVVGIL (SEQ ID nr 14)
650-658		838	GP1	PLTSIISAV (SEQ ID nr 15)
773-782		861		VMAGVGSPYV (SEQ ID nr:16)
851-859		862	E89	VLVKSPNHV 118 (SEQ ID nr:17)
971-979		863	C85	ELVSEFSRM (SEQ ID nr:18)

AES	wzmacniacz aminowy podziału Notch
G128-135		893	G76	GPLTPLPV (SEQ ID nr:19)

MUC-1	Mucyna
950-958		908	1.1	STAPVHNV (SEQ ID nr 20)

PL 206 976 B1 cd. tablicy 1

1	2	3 4 5	6
CEA	Antygen rakowozarodkowy
571-579		879 CAP-1 YLSGAVNTLNL (SEQ ID nr 21)

FBP	Białko wiążące folan
191-199	914	E39	EIWTHSYKV (SEQ ID nr 22)

C-lektyna	MESM, RELP
8-16		C8	KMASRSMRL (SEQ ID nr:9) Aktywność CTL
77-86		C77	SILSLKEAST (SEQ ID nr:23) Aktywność CTL

NY-ESO-1
157-165C	894		SLLMWITQC (SEQ ID nr:24) natywne
157-165V	906		SLLMWITQV (SEQ ID nr:25) zmodyfikowane
155-163	913		OLSLLMWIT (SEQ ID nr:26)

Pec60
20		P20	ALALAALLVV (SEQ ID nr:10) Aktywność CTL
25		P25	ALLVVDREV (SEQ ID Nr:11) Aktywność CTL

CA-125
157-165	900		YLETFREQV (SEQ ID nr:27) 38
255-263	902		VLLKLRRPV (SEQ ID nr:28) 88
337-345	901		GLQSPKSPL (SEQ ID nr:29) 21
546-554	903		ELYIPSBDL (SEQ ID nr:30) 5
898-906	899		KALFAGPPV (SEQ ID nr:31) 13
414-422	910		FMWGNLTLA (SEQ ID nr:32) 315

MAGE-3
271-279	909		FLWGPRALV (SEQ ID nr 33)
Telomeraza hTRT
540-548	907		ILAKFLHWL (SEQ ID nr 34)
865-873	911		RLVDDFLLV (SEQ ID nr 36)

g250
245-262	912		HLSTAFARV (SEQ ID nr 36)

PL 206 976 B1

Następujące przykłady są podane w celu zilustrowania niniejszego wynalazku, lecz nie ograniczają niniejszego wynalazku do zawartości przykładów.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie komórek prezentujących antygen Drosophila

Wytworzono linię komórkową Schneider S2 z jaj Drosophila melanogaster (Oregon-R), zgodnie z opublikowanymi procedurami i zł o ż ono w American Type Culture Collection (CRL 10974). Komórki S2 hoduje się w handlowej pożywce Schneider's Drosophila uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą.

Wektor plazmidowy pRmHa-3 do ekspresji MHC klasy I i białek kostymulatorowych w komórkach S2 otrzymano z wektora ekspresji pRmHa-1 skonstruowanego zgodnie z opisem w literaturze. Zawiera promotor metalotioneiny, sekwencje konsensusowe odpowiedzi na metal oraz gen dehydrogenazy alkoholowej niosący sygnał poliadenylacji wyizolowany z Drosophila melanogaster.

Komplementarny DNA do transfekcji sporządzono w następujący sposób:

HLA-A2.1 i mikroglobulina β-2: PCR z odwrotną transkrypcją z komórek K562 przy użyciu starterów otrzymanych z opublikowanych sekwencji

B7.1: PCR z odwrotną transkrypcją z komórek K562 przy użyciu starterów otrzymanych z opublikowanych sekwencji

ICAM-1: PCR z odwrotną transkrypcją z komórek K562 przy użyciu starterów otrzymanych z opublikowanych sekwencji

B7.2: PCR z odwrotną transkrypcją z komórek HL-60 (ATCC CCL-240) przy użyciu starterów otrzymanych z opublikowanych sekwencji

LFA-3: PCR z odwrotną transkrypcją z komórek HL-60 (ATCC CCL-240) przy użyciu starterów otrzymanych z opublikowanych sekwencji

Komplementarne DNA indywidualnie wprowadzono do wektora pRmHa-3. Komórki S2 transfekowano z mieszaniną plazmidowego DNA HLA-A2.1, B7.1 i ICAM-1 oraz plazmidu phshneo przy użyciu metody wytrącania fosforanem wapnia. Stabilnie transfekowane komórki selekcjonowano przez hodowlę w pożywce Schneider zawierającej genetycynę. Dwadzieścia cztery godziny przed użyciem, indukowano ekspresję transfekowanych genów przez dodanie CUSO4. Poziom ekspresji oszacowano za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu przeciwciała anty-HLA-A2.1, anty-B7.1 i anty-ICAm-1. Ekspresja HLA więcej niż 30% komórek jest konieczna dla skutecznej aktywacji in vitro limfocytów CD8⁺.

Izolacja ludzkich komórek CD8⁺

Komórki CD8⁺ izoluje się z próbek leukaferezy przez pozytywną selekcję przy użyciu procedury izolacyjnej Dynabeads™ (Dynal). Do komórek przemytych w Dulbecco's PBS uzupełnionego 1% albuminy surowicy ludzkiej (Baxter-Hyland) i 0,2% cytrynianu Na dodaje się mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD8 (50 μg/ml w ludzkiej gamma globulinie [Gammagard®]). Po inkubacji w temperaturze 4°C przez czterdzieści pięć minut przy delikatnym mieszaniu, komórki przemywa się i ponownie zawiesza w tym samym buforze zawierającym kulki magnetyczne Dynal (Dynabeads™) opłaszczone owczą IgG przeciwko myszy, przy stosunku kulek do komórek wynoszącym 1:1. Komórki i paciorki umieszcza się w jałowej rurce i delikatnie miesza w temperaturze 4°C przez czterdzieści pięć minut. Pod koniec tego czasu, komórki związane z przeciwciałem usuwa się magnetycznie z użyciem separatora MPC-1® zgodnie z instrukcjami producenta (Dynal). Dysocjację kompleksu komórka CD8-kulka uzyskuje się przez inkubację w temperaturze 37°C przez czterdzieści pięć minut w obecności peptydu CD859-70 (AAEGLDTQRFSGL (SEQ ID nr: 12). Wolne kulki usuwa się magnetycznie i komórki CD8 zlicza się i analizuje przez cytometrię przepływową aby ocenić czystość. Odzysk komórek CD8+ jest zwykle większy od 80%. Tablica 1 omawia skład komórkowy czternastu oddzielonych preparatów CD8+ z normalnych, ludzkich preparatów PBMC, przez pozytywną selekcję z przeciwciałem anty-CD8.

T a b l i c a 2

Oczyszczanie komórek CD8+ przez pozytywną selekcję analizowaną za pomocą cytometrii przepływowej

Rodzaj komórki	PBMC Średni %	Zakres	Średni %	Po selekcji	(Zakres)
1	2	3
Komórki T CD8	15%	(7-24)	82%		(56-95)
Komórki T CD4	35%	(14-52)	2%		(0,1-10)

PL 206 976 B1 cd. tablicy 2

1	2	3
Monocyty CD14	15%	(7-26)	0,8%	(0,2-2)
Neutrofile CD15	12%	(8-21)	0,6%	(0,1-3)
Komórki B CD19	2%	(0,4-7)	3%	(0,5-9)
Komórki NK CD56	6%	(2-17)	6%	(0,1-20)

Immunizacja in vitro oczyszczonych, ludzkich komórek CD8⁺

Stymulacja pierwotna

Transfekowane komórki S2 Drosophila inkubuje się w pożywce Schneider (10⁶ komórek/ml) uzupełnionej 10% płodowej surowicy cielęca i CUSO4 w temperaturze 27°C przez dwadzieścia cztery godziny. Komórki zbiera się, przemywa i ponownie zawiesza w pożywce Insect X-press (BioWhittaker) zawierającej 100 pg/ml ludzkiej tyrozynazy369-377. Po inkubacji w temperaturze 27°C przez trzy godziny, komórki S2 miesza się z komórkami CD8⁺ w stosunku 1:10 w pożywce RPMI (Gibco) uzupełnionej 10% surowicy autologicznej. Mieszaninę komórkową inkubuje się przez cztery dni w temperaturze 37°C, w czasie których komórki Drosophila wymierają. W dniu piątym dodaje się IL-2 (20 U/ml) i IL-7 (30 U/ml) w celu selektywnej ekspansji populacji CTL swoistej dla tyrozynazy.

Ponowna stymulacja

Zamrożone, autologiczne, pozbawione CD8 PBMC, otrzymane w czasie leukaferezy, topi się, przemywa i ponownie zawiesza w ilości 10⁶ komórek/ml w pożywce RPMI zawierającej 10% autologicznej surowicy (jako źródło mikroglobuliny β2) i 20 pg/ml tyrozynazy369-377. Po napromieniowaniu promieniami γ (5000 radów) komórki inkubuje się w temperaturze 37°C przez dwie godziny. Komórki nie przylegające usuwa się przez przemycie Dulbecco's PBS. Przylegające monocyty ładuje się epitopem tyrozynazy przez inkubację przez 90 minut w pożywce RPMI buforowanej Hepes, zawierającej 10% autologicznej surowicy i 10 pg/ml tyrozynazy369-377. Supernatant usuwa się i zawiesinę komórek CD8⁺ aktywowanych Drosophila (3 x 10⁶ komórek/ml w pożywce RPMI z 10% autologicznej surowicy) dodaje się w stosunku 10 komórek CD8⁺ do 1 przylegającego monocytu. Po trzech do czterech dni hodowli w temperaturze 37°C dodaje się IL-2 (20 U/ml) i IL-7 (30 U/ml) wraz z wymianą pożywki, aby selektywnie rozprzestrzenić populację CTL swoistą dla tyrozynazy.

Ekspansja nieswoista

Komórki efektorowe rozprzestrzenia się przez hodowlę w pożywce RPMI uzupełnionej autologiczną surowicą, przeciwciałem monoklonalnym anty-CD3 (OKT®3), IL-2 i napromieniowanymi γ, autologicznymi PBMC.

Testy aktywności i czystości

Test CTL

6

W teście uwalniania ⁵¹Cr jako komórki docelowe wykorzystuje się komórki Malme 3M. 5 x 10⁶komórek Malme 3M w pożywce RPMI zawierającej 4% płodową surowicę cielęcą, 1% buforu HEPES i 0,25% gentamycyny, znakuje się w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, stosując 0,1 mCi ⁵¹Cr. Komórki przemywa się czterokrotnie i rozcieńcza do 10⁶ komórek/ml w RPMI z 10% płodowej surowicy bydlęcej (HyClone). W płytce do mikromianowania, 100 pl efektorowych CTL i 100 pl załadowanych peptydem, wyznakowanych ⁵¹Cr docelowych komórek Malme 3M łączy się w stosunkach 100:1, 20:1 i 4:1 (efektor:cel). Komórki K562 dodaje się w stosunku 20:1 (K562:Malme 3M) aby zredukować lizę tła naturalnych zabójców. Nieswoistą lizę ocenia się przy użyciu linii komórkowej fibroblastów nienowotworowych HLA-A2.1, Malme 3. Kontrole do mierzenia spontanicznego uwalniania i maksymalnego uwalniania ⁵¹Cr występują podwójnie. Po inkubacji w temperaturze 37°C przez sześć godzin, płytki odwirowuje się i supernatanty zlicza w celu zmierzenia uwalniania ⁵¹Cr.

Procent swoistej lizy oblicza się stosując następujące równanie:

cpm próbki - cpm spontanicznego uwalniania —————————————————————————————— x 100 cpm maksymalnego uwalniania - cpm spontanicznego uwalniania

PL 206 976 B1

Cytometria przepływowa

Komórki CD8⁺ przed i po aktywacji in vitro, analizowano pod względem liczby markerów powierzchni komórkowej, z użyciem fluorescencyjnych przeciwciał monoklonalnych oraz analizy FACS. Wyniki z typowego protokołu aktywacji przy użyciu komórek od zdrowego dawcy, są ukazane w tablicy 2.

T a b l i c a 3

Analiza cytometrii przepływowej komórek CD8⁺ aktywowanych in vitro

MARKER/RODZAJ KOMÓRKI	AKTYWACJA WSTĘPNA średni %	PO AKTYWACJI średni%
Komórka T CD8	98	99
Receptor komórki T TCRae	98	92
Receptor bytujący w węźle chłonnym CD4 4	91	99
Komórka T pamięci CD45RO	58	88
CD45RA	41	31
Receptor bytujący HEV CD26L	24	38
Komórka NK CD56	1	11
Komórka T aktywowana CD25	0,1	29

Oprócz aktywności i czystości, preparaty CTL będą oceniane pod względem jałowości i zawartości endotoksyn.

Odczynniki

ODCZYNNIK	DOSTAWCA	STOPIEŃ	UWAGI
rhIL-2	Chiron	USP	jałowy roztwór
rh IL-7	Genzyme	Badawczy	liofilizowany, jałowy roztwór
ludzka tyrozynaza369-377		Badawczy
Dynabeads® M-450	Dynal	GMP	owcza, anty-mysia IgG z kulkami magnetycznymi
ludzka albumina surowicy	Baxter	USP	jałowy, niepirogenny, pozbawiony wirusa zapalenia wątroby, 25% roztwór
płodowa surowica bydlęca	Gemini	Badawczy	jałowy, pozbawiony BSE, endotoksyn, mikoplazm
Gammagard®	Baxter	USP	jałowy roztwór do wstrzyknięć ludzkiej immunoglobuliny
przeciwciało anty-CD8		Badawczy	mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD8
peptyd CD859-70		Badawczy	uwalnianie komórek CD8⁺ z kulek magnetycznych
W6/32	ATCC	Badawczy	mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej HLA-A-A,B,C

PL 206 976 B1

Linie komórkowe

LINIA KOMÓRKOWA	DOSTAWCA	UWAGI
Drosophila S2	ATCC	CRL10974
M3	UCSD	Ludzki czerniak nie HLA-A2.1
MaIme 3	ATCC	Normalne fibroblasty skóry od pacjenta z czerniakiem
Malme 3M	ATCC	Przerzutowy czerniak płuc (ten sam pacjent co Malme 3)
M14	UCSD	Ludzki czerniak HLA-A2.1
K562	ATCC	Ludzka linia komórkowa choroby di Gugliemo; cel dla komórek NK
Komórki JY	ATCC	Transformowana EBV, ludzka linia komórek B z ekspresją HLAA2.1 i B7
P815 i P1024	ATCC	Mysia linia komórkowa guza komórek tucznych DBA/2
Jurkat A2.1	ATCC	Ostra białaczka komórek T transfekowana ludzkimi HLA-A2.1

ATCC: American Type Culture Collection

P r z y k ł a d 2

Próba infuzji cytotoksycznych komórek T przeciwko czerniakowi

Cel próby

Przykład ten pokazuje skuteczność infuzji cytotoksycznych komórek T w leczeniu czerniaka, ocenioną) zgodnie z następującymi czynnikami:

1. Bezpieczeństwo i tolerancja ponownie wlewanych, autologicznych CTL po immunizacji in vitro;

2. Kinetyka wlewów CTL przy określaniu czynników krążenia układowego, w analizie ograniczającego rozcieńczenia;

3. Dyspozycja całego organizmu wobec CTL, za pomocą radioscyntygrafii;

4. Skład komórkowy biopsji węzłów, w immunohistologii (CTL, TH, NK, komórki B); oraz

5. Regresja możliwych do zmierzenia zmian i trwanie odpowiedzi przez dwa miesiące.

Populacje pacjentów

Przydatność do leczenia wymagała pacjentów mających udokumentowany histologicznie, niezdatny do resekcji, złośliwy czerniak, który można zmierzyć lub ocenić, oraz haplotyp HLA-A2. Ocena leczenia wstępnego obejmowała ocenę radiologiczną mózgu za pomocą MRI lub skan CT, skanowanie CT piersi i brzucha oraz badanie fizyczne, zwłaszcza skóry i węzłów chłonnych. Całkowita liczba leczonych pacjentów wynosiła piętnaście (dziewięciu mężczyzn i sześć kobiet). Zakres wieku wynosił od 33 do 75 lat, przy średniej 58 lat. Średni czas trwania choroby przerzutowej wynosił 1,5 roku. U 14/15 pacjentów przeprowadzono wstępny test skórny aby określić, czy istniał stan anergii, przy czym 5/14 miało wynik negatywny dla wszystkich siedmiu wspólnych, ocenianych antygenów. Pacjentów poddano przesiewowi pod względem haplotypu HLA-A2 za pomocą analizy FACS, z użyciem swoistego przeciwciała monoklonalnego HLA-A2 (BB7.2). Subtyping przeprowadzono za pomocą analizy PCR. Wszyscy, z wyjątkiem jednego pacjenta, byli HLA-A2*0201, wyjątek (pacjent 08) był HLA-A*0205.

Leczenie autologicznymi CTL wytworzonymi ex vivo

Piętnastu pacjentów leczono w ramach tego protokołu klinicznego. Wszyscy pacjenci otrzymywali co najmniej pojedynczą infuzję autologicznych CTL. Liczba cykli i dawka podawana każdemu pacjentowi, są omówione w tablicy 1. Liczba komórek wytworzonych in vitro zależała od czynników związanych z pacjentem, takich jak liczba wyizolowanych PBMC za pomocą procedury aferezy, oraz liczba komórek T CD8⁺ występująca w każdym preparacie PBMC. Ponieważ wszystkie komórki wytworzone in vitro ponownie poddawano wlewowi do dawcy, dawki podawane każdemu pacjentowi były z konieczności zmienne. W próbie normalizacji dawek między pacjentami, dla każdej dawki zapisywano obliczony wynik „siły. Wartość tę otrzymywano przez pomnożenie całkowitej liczby komórek przez aktywność lityczną uzyskaną dla docelowych komórek załadowanych peptydem. Zakres wlewanych komórek T wynosił od minimum 4x10⁷ (pacjent 08) do maksimum 3,2x10⁹ (pacjent 13). Pacjentów

PL 206 976 B1 wprowadzano w drugi, trzeci lub czwarty cykl leczenia na podstawie ich stanu klinicznego na końcu każdego cyklu. Liczba PBMC uzyskanych z próbek aferezy miała tendencję do obniżania u pacjentów przechodzących dodatkowe cykle, zwłaszcza jeśli początek kolejnego cyklu był blisko końca poprzedniego. Przypisuje się to uporczywej limfopenii wywołanej podawaniem IFNa-2b podczas poprzedniego cyklu. Całkowita liczba wyizolowanych, nieaktywowanych komórek T CD8⁺ była zależna od ich udziału procentowego w każdym preparacie PBMC. Procent komórek T CD8⁺ zmieniał się wśród pacjentów w zakresie między 8% do 31%. Otrzymany współczynnik ekspansji także przypisywano końcowej liczbie komórek i miał wartość w zakresie od 0,1-6,0-krotnego. Procedura wytwarzania CTL ex vivo jest omówiona w wykazie i przykładzie 1.

Regulacja w górę klasy I oraz antygenów związanych z czerniakiem, w odpowiedzi na IFNa-2b

W próbie zwiększenia zdolności CTL swoistych wobec antygenu do lizy komórek czerniaka in vivo, podawano niskie dawki IFNa-2b przez pięć kolejnych dni przed infuzją CTL, trzy razy w tygodniu przez dodatkowe cztery tygodnie. Jednym ze sposobów zmierzenia odpowiedzi na cytokinę in vivo jest ocena biopsji otrzymanych w kolejnych punktach czasowych, przez analizę immunochistochemiczną pod względem pozytywnego barwienia swoistymi przeciwciałami. Serię biopsji otrzymano u jednego pacjenta z wieloma zmianami skórnymi (pacjent 04), do oceny zarówno klasy I jak i ekspresji antygenu. Biopsje, które wykazywały klasę I i ekspresję MART-1 były bardzo słabo pozytywne przed jakimkolwiek leczeniem (biopsja A). Po pięciu dniach podskórnych wstrzyknięć 10 MU/m², zanotowano dramatyczny wzrost tych dwóch markerów (biopsja B). Pod względem tyrozynazy i gp100, barwienie immunohistochemiczne było negatywne do słabo pozytywnego, odpowiednio w próbkach leczenia wstępnego (biopsja A). Po początkowych pięciu dniach dawki IFNa oraz trzynastu dodatkowych podań, ekspresja tych ostatnich antygenów zwiększyła się w wybarwionych próbkach tkankowych (biopsja C).

Swoistość antygeniczna CTL wytworzonych ex vivo

CTL wytworzone od wszystkich pacjentów oceniano w dniu uwolnienia przeciwko celom T2 załadowanym peptydami, linią komórkową czerniaka HLA-A2 (MalmeSM) i autologiczną linią czerniaka, jeśli dostępny był materiał biopsji do ustalenia linii. Każda sporządzona dawka komórek była oceniana pod względem aktywności cytolitycznej. Komórki T2 załadowane peptydami, prezentujące albo każdy peptyd pojedynczo, albo wszystkie cztery peptydy jednocześnie, wykorzystano do określenia swoistości odpowiedzi CTL, generowanej dla każdego pacjenta. Zdolność do lizy komórek z endogeniczną ekspresją, niosących antygen związany z czerniakiem, szacowano z użyciem dopasowanej linii HLAA2 albo autologicznej linii nowotworowej. Oprócz aktywności cytolitycznej oceniano swoistość antygenową za pomocą ustalonej metody wykrywania wewnątrzkomórkowej produkcji gamma interferonu, zachodzącej w odpowiedzi na swoisty bodziec peptydowy. CTL wytworzone na końcu protokołu ex vivo oceniano tą metodą. Procent komórek swoistych dla każdego z peptydów zapisywano oddzielnie. Całkowitą liczbę swoistych komórek w każdej zbiorczej hodowli CD8 od pacjenta 13 obliczano przez dodanie każdej swoistości peptydowej wykrytej w tej populacji komórek T. Zwiększenie całkowitej liczby swoistych komórek było możliwe do wykrycia z każdym kolejnym cyklem leczenia.

Wykrywanie komórek CD8 i CD4 naciekających biopsje nowotworowe po terapii CTL

Próbki biopsji od wszystkich pacjentów przed, w trakcie i po leczeniu byłyby idealne. Jednak warunki doświadczenia pozwalały na próbki biopsji tylko od ograniczonej liczby pacjentów. Tkankę nowotworową otrzymano od pięciu z piętnastu pacjentów zakwalifikowanych do badania. U dwóch pacjentów (pacjent 08 i 13) próbki biopsji były dostępne na pięć i sześć tygodni po terapii komórkami T, odpowiednio. Badanie próbek tkankowych ujawniły obecność naciekających komórek zarówno CD8 jak i CD4. Jedną z próbek nowotworu pobrano ze zmiany skórnej w regionie potylicznym skóry głowy, która zwiększyła rozmiar do czasu następnego badania, cztery tygodnie po drugiej infuzji komórek T. Biopsja ujawniła nekrozę tkanki, w której widać było silny naciek limfocytów. Inna biopsja pochodziła z głowy kości udowej, usuniętej podczas operacji zastąpienia stawu biodrowego. Zmiana skórna od pacjenta 08 była silnie pozytywna (4+) zarówno pod względem ogólnej klasy I jak i swoistego markera HLA-A2. Tyrozynaza i gp100 były słabo pozytywne (1+ i 2+ odpowiedni), podczas gdy wynik MART-1 był negatywny w tej próbce. Regiony biopsji od pacjenta 13 były także nekrotyczne, z bardziej heterogenicznym zabarwieniem; różne populacje komórek nowotworowych bez ekspresji cząsteczki HLA-A2.1 oraz jedna lub więcej MAA. Jednak nieuszkodzone regiony tkanki ujawniły silnie klasę I (4+) i wszystkie antygeny związane z czerniakiem. Naciek limfocytów w tej ostatniej próbce otaczał jak się okazało, raczej węzły nowotworowe niż głęboko je naciekał. Jednak najwyższym procentem komórek bezpośrednio związanych z nowotworem, były komórki CD8. Brak próbek biopsji

PL 206 976 B1 wstępnego leczenia od obu tych pacjentów uniemożliwił potwierdzenie podobnych typów naciekających komórek w próbkach tkankowych przed leczeniem.

Skany CT po terapii komórkami T potwierdzają obiektywną odpowiedź

Skany CT były częścią kryteriów przesiewu leczenia wstępnego i następnego badania po leczeniu. Pacjent 10 otrzymał pojedynczą infuzję 8x10⁸ CTL (7/27/99) pięć tygodni po skanie leczenia wstępnego (6/23/99). Gdy skan CT klatki piersiowej powtórzono miesiąc po infuzji (8/27/99), zauważono dramatyczny spadek wielkości zmian płucnych. Podobnie, pacjent 14 przeszedł skan CT klatki piersiowej jako część procesu kwalifikacji (9/10/99), trzy i pół tygodnia przed pierwszą infuzją 6,6x10⁸ komórek (10/5/99). Następny skan CT (1/7/99) jeden miesiąc po drugiej infuzji 11,5x10⁸ komórek, ujawnił dramatyczne skurczenie się trzech oddzielnych zmian. Pacjent 13 miał także obiektywną odpowiedź zmierzoną w skanach CT przed i po leczeniu. Adenopatia okołotchawiczna zmniejszyła się z 7,8 cm²(przed badaniem) do 4,4 cm² po cyklu I i zanikła po cyklu II.

Obecność stanu energicznego nie wykluczyła zdolności do generowania CTL ani nie uniemożliwiała odpowiedzi klinicznej

Większość pacjentów leczonych w tym protokole otrzymała wcześniejszą interwencję medyczną. Przeprowadzono testy skórne przed leczeniem, aby określić, czy odpowiedź anergiczna wobec zespołu siedmiu powszechnych antygenów korelowała albo z niezdolnością do wytwarzania CTL ex vivo, albo uniemożliwieniem udokumentowanej odpowiedzi klinicznej. Zdolność do wytwarzania CTL ex vivo nie korelowała a wynikami testu skórnego przed leczeniem pacjenta. Należy zauważyć, że pacjent 03 i 04 (u obu mieszana odpowiedź) powtarzał testy skórne przed początkiem drugiego cyklu i pozostał anergiczny.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie CTL swoistych wobec HER-2/neu zdolnych do lizy komórek nowotworu piersi i jajników.

Interesowało nas stosowanie naszej technologii tworzenia CTL na inne rodzaje nowotworu, aby określić, czy wszystkie postacie raka mogą być celem w tym podejściu. HER-2/neu jest protoonkogenem z homologią do EGER, który ulega amplifikacji i nadekspresji w wielu ludzkich rakach, w większości gruczolakoraków piersi, jajnika i okrężnicy. Jest często związany z agresywną chorobą i może być wskaźnikiem słabej prognozy. Był badany w kilku próbach klinicznych jako możliwy cel dla tych typów raków.

We wczesnych latach 1990 zidentyfikowano epitopy peptydowe HER-2/neu ograniczone HLAA2.1, albo za pomocą komputerowego algorytmu wiązania peptydów albo przez mapowanie CTL wyizolowanych z płynów puchlinowych pacjentów z rakiem jajnika (tablica 3).

T a b l i c a 3

Peptydy HER-2/neu ograniczone HLA-A2.1

Peptydy HER2/neu	PRI #	Inne ID #	Położenie	Sekwencja (SEQ ID Nr)	Odniesienie
48-56	827	D113	EC	HLYQGCQVV (SEQ ID nr:13)	Disis i inni, 1994
369-377	835	E75	EC	KIFGSLAFL (SEQ ID nr:8)	Fisk i inni, 1995
650-658	838	GP1	TM	PLTSIISAV (SEQ ID nr:15)	Fisk i inni, 1995
654-662	837	GP2	TM	IISAVVGIL (SEQ ID nr:14)	Peoples i inni, 1995
773-782	861	N/A	IC	VMAGVGSPYV (SEQ ID nr:16)	Lustgarten i inni, 1997
789-797	826	E90	IC	CLTSTVQLV (SEQ ID nr:7)	Disis i inni, 1994
851-859	862	E89	IC	VLVKSPNHV (SEQ ID nr:17)	Disis i inni, 1994
971-979	863	C85	IC	ELVSEFSRM (SEQ ID nr:18)	Fisk i inni, 1995

Wszystkie peptydy syntetyzowano, nadając numer identyfikacyjny (PRI#) i oceniono pod względem zdolności do wytwarzania CTL ex vivo z wykorzystaniem tej samej metody, jaką wykorzystaliśmy dla epitopów peptydowych komórek T, zawiązanych z czerniakiem. Komórki CD8 wyizolowano od

PL 206 976 B1 normalnych dawców aby określić zdolność do rutynowego wytwarzania CTL ex vivo, z użyciem komórek Drosophila załadowanych znanymi epitopami peptydowymi CTL. Peptydy 826, 835, 861 i 863 miały najwyższą częstotliwość wytwarzania CTL (tablica 4).

T a b l i c a 4

Częstotliwość wytwarzania CTL HER-2/neu u normalnych dawców

Dawca	826	827	835	837	838	861	862	863
193	+		+
194	+	-	+	-	-	+	-	+
195	+		+			+		+
196	+	-	+	-	-	+
197	+	-	+	-	+	+	-	+
198	-	-	+	-	+	+	-	+
207	+		+			+		+
212	+		+			+		+
218	+		+			+		+
232	-		+			+		-
233	+		+			+		+
241		+				+
243		+				+

Chociaż transfekowane komórki Drosophila mają unikalną zdolność do prezentowania do dziesięciu różnych epitopów (fig. 10), wybraliśmy cztery peptydy HER-2, 826, 835, 861 i 863 z powodu częstotliwości generowania CTL wobec tych peptydów ex vivo. Te cztery różne peptydy HER-2 reprezentują słabe do średnich substancji wiążących cząsteczkę HLA-A2.1 prezentowaną na powierzchni transfekowanych komórek Drosophila. Mamy zamiar wziąć substancje wiążące A2, które są słabe, jak nasze doświadczenie z peptydami związanymi z czerniakiem podpowiada, że słabo wiążące substancje klasy I generalnie wytwarzają silne CTL, które rozpoznają komórki nowotworowe, jeśli rzeczywiście reprezentują one natywne epitopy komórek T. Większość białek związanych z nowotworem, które są naszym celem, są samo-antygenami i jako takie posiadają jak się oczekuje, wysokie powinowactwo do cząsteczek klasy I, co widać z peptydami wirusowymi. Słabe do średnich substancje wiążące generalnie generują CTL, które rozkładają komórki nowotworu bardzo skutecznie. Zademonstrowano to dla peptydu MART-1, który jest peptydem wiążącym z niskim powinowactwem na komórkach Drosophila (fig. 3), mimo to reprezentują epitop, który rutynowo generuje silne CTL zdolne do lizy obu docelowych komórek załadowanych peptydami (T2) albo co ważniejsze, komórek czerniaka (Malme3M) (fig. 12).

HER-2/neu jest członkiem rodziny EGF-R i funkcjonuje jako receptor czynnika wzrostu. Białko HER-2 ulega ekspresji podczas rozwoju płodowego człowieka. U dorosłych, białko jest słabo wykrywalne w komórkach naskórka wielu normalnych tkanek. W normalnych komórkach gen HER-2 występuje w postaci pojedynczej kopii. Amplifikacja genu i/lub nadekspresja związanego białka została zidentyfikowana w wielu ludzkich rakach, łącznie z rakiem piersi, jajnika, macicy, żołądka i gruczolakoraku płuc. Różnice sekwencji między receptorem HER-2 i EGF-R są zanotowane w tablicy 5. Trzy z czterech peptydów HER-2 oceniliśmy jako mające trzy lub więcej zmian aminokwasowych między dwoma białkami. Pojedyncza zmiana aminokwasowa wystarczy do rozróżnienia między dwoma białkami.

PL 206 976 B1

T a b l i c a 5

HER-2/neu przeciwko ECF-R

BIAŁKO	PEPTYD #	SEKWENCJA (SEQ ID Nr:)	# zmian
HER-2/neu EGFR	835	KIFGSLAFL (SEQ ID nr:8) SISGDLHII (SEQ ID nr:37)	5
HER-2/neu EGFR	861	VMAGVGSPYV (SEQ ID nr:16) VAASVDNPHV (SEQ ID nr:38)	5
HER-2/neu EGFR	863	ELVSEFSRM (SEQ ID nr:18) ELIIEFSKM (SEQ ID nr:39)	3
HER-2/neu EGFR	826	CLTSTVQLV (SEQ ID nr:7) CLTSTVQLI (SEQ ID nr:40)	1
HER-2/neu EGFR	689-697	RLLQETELV (SEQ ID nr:41) RLLQERELV (SEQ ID nr:42)	1

Po wytworzeniu CTL po upływie czterech tygodni protokołu stymulacji ex vivo, oceniliśmy, czy występowały komórki swoiste wobec peptydu, stosując tetrameryczne cząsteczki HLA-A2.1 wytworzone z immunizującymi peptydami. Jak zademonstrowano w fig. 13, zdolność do generowania swoistych wobec peptydu CTL była zależna od dawcy. W panelu A (dawca 261), u dawcy wystąpiła silna odpowiedź CTL wobec peptydu 835 (37,55%). W panelu B (dawca 262), CTL swoiste wobec peptydu można było wykryć zarówno z tetrameryczną cząsteczką 835 jak i 861 (odpowiednio 3,6% i 15,1%). Potwierdza to stosowanie wielu peptydów aby zagwarantować CTL swoiste wobec peptydu na końcu protokołu stymulacji. Ten protokół ex vivo pozwala stosunkowo łatwo wygenerować CTL o wielorakiej swoistości.

Odpowiedzi przeciwpeptydowe i przeciwnowotworowe

Po zakończeniu pełnego protokołu ex vivo, wytworzone CTL oceniono pod względem swoistości antygenowej. Aby wytworzyć CTL, w dniu O załadowano komórki Drosophila kombinacją czterech peptydów HER-2. Na końcu czterotygodniowego protokołu stymulacji ex vivo, masę hodowli CD8 wykorzystano jako komórki docelowe. W fig. 14 opisana jest typowa odpowiedź. Masa hodowlana zawiera swoistość dla każdego z czterech peptydów HER-2. Odpowiedź przeciwnowotworową szacowano na linii komórkowej nowotworu jajnika (ATCC; HTB-77). Gdy docelowa linia komórkowa nie jest ograniczona HLA-A2.1, transfekowaliśmy linię komórkową tak aby mieć układ testowy +/-. Gdy HLA-A2.1 były transfekowano do linii HTB-77, zanotowano wzmożone zabijanie przez efektorowe komórki CD8 (fig. 15, panele A do D). Efektory swoiste wobec HER-2, reprezentujące poszczególne peptydy oceniano aby potwierdzić prezentację każdego epitopu peptydowego na tej linii komórkowej nowotworu.

Linię komórkową gruczolakoraka piersi (ATCC; HTB-131) transfekowaną HLA-A2.1 oceniano także pod względem zdolności do wykazania lizy nowotworu z efektorami peptydowymi swoistymi wobec HER-2. CTL swoiste wobec peptydu 861 mogły przeprowadzić lizę tej linii komórkowej nowotworu po transfekcji HLA-A2.1 (fig. 16).

Traktowanie IFNy wymagane dla lizy komórek nowotworu

Linia komórek HTB-77/A2.1 wymaga wstępnego traktowania IFNy aby wykazać lizę swoistą wobec peptydu. Komórki traktowano 500 U/ml IFNy (aktywność swoista wynosząca 25 ng/ml) na dwa51 dzieścia cztery godziny przed początkiem testu uwalniania Cr. W fig. 17, dodanie IFNy spowodowało wzmożoną lizę linii komórkowej transfekowanej HLA-A2.1. Aby określić wpływ tej dawki IFNy na ekspresję powierzchniową zarówno HLA-A2.1 jak i HER-2, przeprowadzono analizę FACS aby określić poziom tych cząsteczek zarówno po dwudziestu czterech jak i czterdziestu ośmiu godzinach indukcji/ Fig. 18, panele A i B opisują wyniki analizy FACS. W panelu A, nie było wzmocnienia cząsteczki HER-2 na powierzchni komórek HTB-77 na dwadzieścia cztery i czterdzieści osiem godzin po indukcji IFNy. W komórkach transfekowanych HLA-A2.1, ani HER-2 ani HLA-A2.1 nie wykazały zwiększenia poziomu ekspresji powierzchniowej w wyniku podobnego protokołu traktowania. Zauważono za to podniesienie poziomu ekspresji TAP-1, jak również HLA-DM i -DR, Cathepsin S i D oraz Caspase 5, gdy poziom mRNA oceniano przez analizę zespolonej płytki („chipu) mikromacierzy DNA (fig. 19). Tłumaczyłoby to dlaczego nie ma wzmocnienia zabijania komórek HTB-77/A2.1 w obecności IFNy. Regulacja w górę tej szczególnej cząsteczki powodowałaby skuteczniejszą obróbkę cząsteczki HER-2, pozwalając na lepszą prezentację omawianych peptydów.

Peptydy

Wykonano syntetyczne peptydy, za pomocą chemii Fmoc, przy użyciu syntetyzera peptydów (Gilson Company, Inc.) Wszystkie peptydy oczyszczono do >95% czystości przez HPLC z odwrotną

PL 206 976 B1 fazą, na kolumnie C-8. Czystość i identyczność ustalono przy użyciu spektrometru masowego z jonizacją elektrospraju. Peptydy związane z czerniakiem obejmowały: peptyd 819 był swoisty wobec MART-1 (AAGIGILTV SEQ ID Nr: 6), 817 i 853 były peptydami swoistymi wobec gp100 (ITDQVPFSV SEQ ID Nr: 4 i KTWGQYWQV SEQ ID Nr: 5, odpowiednio), swoiste wobec tyrozynazy były 689 i 792, przy czym 792 reprezentuje wersję zmodyfikowaną potranslacyjnie (YMDGTMSQV SEQ ID Nr:2) natywnej sekwencji (YMNGTMSQV SEQ ID Nr:1) reprezentowanej przez peptyd 689. Peptydy 826 (CLTSTVQLV SEQ ID nr: 7) i 835 (KIFGSLAFL SEQ ID Nr:8) reprezentowały sekwencje HER-2/neu z domen wewnątrzkomórkowej i zewnątrzkomórkowej, odpowiednio białka p185. Pec60 (ALALAALLVV SEQ ID Nr:10), Pec6025 (ALLVVDREV SEQ ID Nr:11) były nakładającymi się sekwencjami reprezentującymi śluzowate białko wykrywane w liniach nowotworu jajnika. C-lektyna była także białkiem wykrywanym w liniach komórek nowotworu jajnika a peptyd z jego sekwencji (C-lektyna8) jest reprezentowany przez KMASRSMRL SEQ ID Nr:9).

Test cytotoksyczności in vitro

Przeprowadzono standardowe testy uwalniania ⁵¹Cr, aby określić rozpoznawanie przez komórki efektorowe CTL, epitopów peptydowych związanych z czerniakiem, załadowanych na komórki T2. Zbiór 3x106 komórek hodowano w RPMI+10% FBS (pożywki). Dodano 0,1 mCi ⁵¹Cr i inkubowano w temperaturze 37°C w łaźni wodnej. Wyznakowane komórki dodano do 10 ml 4% płynu myjącego (RPMI + 4% FBS) i grudkę przemyto dodatkowe dwa razy i ponownie zawieszono w pożywkach do końcowego stężenia wynoszącego 0,2x106 /ml aby zapisać radioaktywność spontanicznej lizy komórek, w stosunku do detergentowej. Komórki poddano impulsom odpowiedniego peptydu (peptydów) w ilości 20 μg/ml przez trzydzieści minut. Do każdej 96-studzienkowej płytki dodano 50 gl, przy czym każda zawierała komórki efektorowe CD8 w ilości 10,2,0,4 i 0,08 x 10⁶/ml, które inkubowano w temperaturze 37°C przez sześć godzin, odwirowano i zebrano do supernatantu.

Cytometria przepływowa i barwienie tetrameru

Komórki wyznakowano przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z FITC albo PE przez inkubację w temperaturze 4°C przez 30 minut w buforze FACS (1% BSA, 0,02% NaN3 w PBS), po czym przemyto w tym samym buforze. Komórki utrwalono w 0,5% formaledhydzie przed zgromadzeniem danych i analizą na cytometrze przepływowym FACScan (Becton Dickinson), za pomocą dołączonego programu CellQuest. Nieswoiste barwienie mierzono z tym samym wtórnym przeciwciałem stosowanym do znakowania oczyszczonych przeciwciał pierwotnych, albo dopasowaną izotypowo kontrolą, gdy przeciwciała pierwotne wyznakowano bezpośrednio. Tetrameryczne barwienie przeprowadzono z tetramerycznymi cząsteczkami HIVgag swoistymi wobec HLA-A2.1 (Beckman Coulter) posiadającymi sekwencję SLYVTVATL SEQ ID Nr: 43, jako kontrolą negatywną. Tetramery swoiste dla HER-2 wykonano z sekwencjami peptydowymi CLTSTVQLV (826 SEQ ID nr:7), KIFGSLAFL (835 SEQ ID nr:8) albo VMAGVGFPYY 861 SEQ ID Nr:16). Wyznakowane PE, tetrameryczne kompleksy peptydowe HLA-A2.1 wykorzystano w połączeniu z przeciwciałami monoklonalnymi przeciw ludzkiemu CD8 (BD PharMagin), znakowanymi izotiocyjanianem fouresceiny (FITC), do wybarwienia komórek T CD8⁺swoistych dla epitopu, jak opisano w ulotce w opakowaniu. Próbki analizowano za pomocą dwubarwnej cytometrii przepływowej na FACScan Becton Dickonsona i wychwycone komórki T CD8⁺ badano pod kątem wybarwienia z tetramerycznymi kompleksami HLA-A2.1-peptyd.

P r z y k ł a d 4

Tworzenie dodatkowych CTL swoistych wobec raka piersi i jajnika, za pomocą tego protokołu stymulacji ex vivo

Zademonstrowaliśmy zdolność do generowania odpowiedzi CTL wobec wszystkich znanych epitopów peptydowych ograniczonych HLA-A2.1, dla kilku antygenów nowotworowych różnego pochodzenia nowotworów. Nasze początkowe badania skupiły się na czerniaku, gdzie byliśmy w stanie pokazać obiektywne kliniczne odpowiedzi u pacjentów leczonych CTL swoistymi dla czterech różnych epitopów peptydowych swoistych dla białek związanych z czerniakiem MART-1, gp100 i tyrozynazy [Richards i inni, Amer. Soc. Clin. Oncol., San Francisco, California (maj 2001)].

Aby rozszerzyć zdolność do wzbudzania CTL wobec innych antygenów nowotworowych występujących w rozmaitych innych rakach, wybraliśmy opublikowane i nowe sekwencje wobec antygenów nowotworowych wspólnych dla kilku różnych rodzajów nowotworów. Obejmują one AES, MUC-1, CEA, RBP, C-Lektynę, NY-ESo-1, Pec60, CA-125, MAGE-S, telomerazę i G250. Tablica 7 opisuje te antygeny, częstotliwość ekspresji i raki, które wykazują ich ekspresję. Częstotliwość odpowiedzi na te peptydy za pomocą naszego protokołu stymulacji ex vivo jest wymieniona w tablicy 6.

PL 206 976 B1

T a b l i c a 6

Częstotliwość odpowiedzi na epitopy peptydowe raka piersi i jajnika u normalnych dawców

Dawca	879	893	894	899	900	901	902	903	906	907	908	909	910	911	912	913	913
248	+	+	+
249	+	+	+
250	+	^_	+
251	-	^_	+
252	+	^_	+
253	^_	^_	+	+
254	+	^_	+	+
255					-	+	+	-	+	+	+	+
256					+	-	+	+	+	+	-	+
257													+	+	+
259													+	-	-
260					-	-	-	-								+
261									+	+	+	+
262									+	+	-	+					-
265					-	-	-	-	+				+	+		-

T a b l i c a 6

Opisy antygenów nowotworowych

Antygen	Opis
1	2
CA-125	Antygen rakowy 125 jest markerem komórek nabłonka o ekspresji w nowotworach jajników i niektórych liniach komórek jajnika. Około 85% pacjentów z rakiem jajnika ma podwyższony CA125 w surowicy i jest on zatem powszechnie wykorzystywany jako marker nowotworowy surowicy. (Cancer Letters (październik 1999) 154(1-2) str. 133-141)
MUC-1	Mucyna jest transbłonową glikoproteiną o ekspresji zarówno na normalnym jak i złośliwym nabłonku. Postać podglikozylowana MUC-1 ulegająca nadekspresji na powierzchni komórkowej wielu ludzkich gruczolakoraków, takich jak rak piersi i jajnika, jak również nowotworów hematologicznych łącznie z czerniakiem mnogim i chłoniakiem komórek B. (Blood (czerwiec 1999) 93(12) str. 4309-4317)
G250	Antygen związany z rakiem komórek nerkowych o ekspresji w 85% RCC, lecz nie w normalnej tkance nerki. Jest identyczny jak antygen związany z nowotworem MN/CAIX, którego ekspresja zachodzi w około 50% inwazyjnych raków piersi. (Cancer Research (listopad 1999); 59(21) str. 5554-5559)
FBP	Białko wiążące folan jest receptorem związanym z transportem folanu. Jego nadekspresja zachodzi w 90% nowotworów jajnika i 20-50% raków piersi. (Anticancer Research lipiec-sierpień 1999) 19(4B) str. 2907-2916)

PL 206 976 B1 cd

1	2
HER-2/neu	Protoonkogen (HER-2) kodujący białko transbłonowe podobne w sekwencji i strukturze do EGFR. Nadekspresja HER-2/neu tak duża jak 200-krotna ponad normalne tkanki zachodzi w nowotworach piersi i jajnika. Został także zidentyfikowany w rakach komórek nerkowych i płuc. (J.Exp.Med. (czerwiec 1999) tom 181, str. 2109-2117)
NY-ESO-1	Antygen raka jądra znajdujący się w 30% raków piersi, prostaty i jajnika, w raku płuc, raku pęcherza, raku głowy i szyi i czerniaku. Pacjenci, którzy mają raka z nowotworami o ekspresji tego antygenu, zwykle mają również krążące przeciwciała przeciwko niemu. (J.Immunology (2000) tom 165 str. 948-955)
CEA	Antygen rakowozarodkowy jest antygenem związanym z nowotworem o częstej ekspresji w nowotworach nabłonkowych (okrężnicy, piersi, płuca). Poziom CEA w surowicy może korelować ze stadium choroby i jest wykorzystywany do monitorowania leczenia i odnawiania się choroby. (Human Immunology (1998) tom 59 str. 1-14)
MAGE-3	Antygen raka jądra o ekspresji na 70-80% zmian czerniaka przerzutowego i liniach komórkowych. Jest członkiem rodziny białek związanych z czerniakiem albo MAGE. Poza tym, MAGE-3 został znaleziony w 20-60% nowotworów nabłonkowych (raków okrężnicy, piersi, płuca, żołądka). (Human Immunology (1998) tom 59 str. 1-14)
AES	Wzmacniacz aminowy białek podziału jest częścią zbioru represorów transkrypcji kodowanych przez wzmacniacz genów podziału. Ten antygen nowotworowy zidentyfikowano w limfocytach związanych z nowotworem guzów jajnika i piersi. (Molecular Immunology (1998) 35(17) str. 1121-1133)
HTR	Telomeraza (hTR) jest wyspecjalizowanym rodzajem odwrotnej transkryptazy (hTR albo hTERT), która katalizuje syntezę i wydłużanie telomerycznego DNA. Aktywność tego enzymu jest podwyższona w około 90% wszystkich nowotworów człowieka, łącznie z rakami piersi, tarczycy, pęcherza, szyjki, prostaty, okrężnicy, trzustki i żołądka. (Cancer Research (grudzień 2001) 61(23) str. 8366-8370)

PL 206 976 B1

LISTA SEKWENCJI <110> Moriarty, Ann Leturcq, Di dier Degraw, Juli Heiskala, Marja Peterson, Per Jackson, Michael <120> SPOSÓB TERAPII KOMÓRKOWEJ DO LECZENIA NOWOTWORÓW <130> ORT-1557 <160> 42 <170> Patentin version 3.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Tyr Met Asn Gly Thr Met ser Gin Val

5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gin val

PL 206 976 B1

1
<210>	3
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	3

Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe Leu Leu

1	5
<210>	4
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	4
Ile Asp Thr	Gin val Pro Phe Ser val 5
<210>	5
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	5
Lys Thr Trp	Gly Gin Tyr Trp Gin val
<210>	6
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Homo	sapi ens
<400>	6

PL 206 976 B1

Ala Ala Gly Ile Gly Leu Thr
1	5
<210>	7
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	7
cys Leu Thr ser Thr val Gin
1	5
<210>	8
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	8

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu 1 5 <210> 9 <2U> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Lys Met Ala Ser Arg Ser Met Arg Leu 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

PL 206 976 B1

Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Val val 15 10 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11

Ala Leu Leu val val Asp Arg Glu val

<210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13

His Leu Tyr Gin Gly Cys Gin Val Val <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapi ens

PL 206 976 B1 <400> 14

Ile ile ser Ala val val Gly Ile Leu 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15

Pro Leu Thr ser ile ile ser Ala val 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 val Met Ala Gly val Gly Ser Pro Tyr val 15 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 val Leu val Lys Ser Pro Asn His val <210>

<211>

<212> PRT <213> Homo sapi ens

PL 206 976 B1

<400> 18 Glu Leu val ser Glu Phe Ser Arg Met
1	5
<210>	19
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	19
Gly Pro Leu 1	Thr Pro 5	Leu	Pro	val
<210>	20
<213>	8
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	20
Ser Thr Ala 1	pro val 5	His	Asn	Val
<210>	21
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapi ens
<400>	21
Tyr Leu ser 1	Gly Ala 5	Asn	Leu	Asn Leu
<210>	22
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapi ens

PL 206 976 B1 <400> 22

Glu He Trp Thr His Ser Tyr Lys val 1 5

<210>	23
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	23

Ser ile Leu Ser Leu Lys Glu Ala ser Thr 15 10

<210>	24
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	24

ser Leu Leu Met Trp ile Thr Gin Cys 1 5

<210>	25
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	25

ser Leu Leu Met Trp ile Thr Gin val 1 5

<210>	26
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens

PL 206 976 B1 <400> 26

Gin Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr 1 5

<210>	27
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo

sapi ens <400> 27

Tyr Leu Glu Thr Phe Arg Glu Gin val 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 val Leu Leu Lys Leu Arg Arg Pro val

1
<210>	29
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	29

Gly Leu Gin ser Pro Lys ser Pro Leu <210> 30 <211> 9 <212> PRT

PL 206 976 B1 <213> Homo sapiens <400> 30

Glu Leu Tyr Ile Pro ser Val Asp Leu

1
<210>	31
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	31

Lys Ala Leu Phe Ala Gly Pro Pro val 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapi ens <400> 32

Phe Met Trp Gly Asn Leu Thr Leu Ala 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33

Phe Leu Trp Gly pro Arg Ala Leu val 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT

PL 206 976 B1 <213> Homo sapiens <400> 34

ile Leu Ala 1	Lys Phe 5	Leu	His	Trp	Leu
<210>	35
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapi ens
<400>	35
Arg Leu Val 1	Asp Asp 5	phe	Leu	Leu	val
<210>	36
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	36
His Leu Ser 1	Thr Ala 5	Phe	Ala	Arg	val
<210>	37
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	37
ser Ile	i Ser	Gly Asp	Leu	His	Ile	Ile

5 <210> 38 <211> 10

PL 206 976 B1 <212> PRT <213> Homo sapi ens <400> 38 val Ala Ala ser val Asp Asn Pro His val 15 10

<210>	39
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo

sapi ens <400> 39

Glu Leu Ile Ile Glu Phe ser Lys Met

1	5
<210>	40
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapi ens
<400>	40
Arg Leu Leu 1	Gin Glu Thr Glu Leu val 5
<210>	41
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapi ens

<400> 41

Arg Leu Leu Gin Glu Thr Glu Leu Val 1 5 <210> 42 <211> 9

PL 206 976 B1 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42

Arg Leu Leu Gin Glu Arg Glu Leu Va1

Claims

1. Sposób wytwarzania zawiesiny CD8⁺ do stosowania w leczeniu podmiotu z rakiem, znamienny tym, że

b. stymuluje się za pomocą linii komórkowej nnAPC, wymienione komórki CD8⁺ zebrane od wymienionego podmiotu albo odpowiedniego dawcy;

f. izoluje się przylegające monocyty krwi obwodowej;

h. łączy się wymienione komórki CD8⁺ z przylegającymi monocytami krwi obwodowej w stosunku wynoszącym dziesięć komórek CD8⁺ na jeden monocyt krwi obwodowej.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że cząsteczki peptydowe są o długości od ośmiu do dziesięciu aminokwasów.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że cząsteczki peptydowe występują w stężeniu w zakresie wynoszącym 10 nM do 100 μM.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymienionym składnikiem cytokinowym jest IL-2.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymienionym składnikiem cytokinowym jest IL-2 i IL-7 w połączeniu.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dawką promieniowania γ jest 3000 do 7000 radów.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dawką promieniowania γ jest 5000 radów.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymienione cząsteczki peptydowe z etapu (a) wybiera się spośród peptydów mających sekwencję aminokwasową przedłożoną w SEQ ID Nr: 1 do 42.

9. Sposób wytwarzania zawiesiny CD8⁺ do stosowania w leczeniu podmiotu z rakiem, znamienny tym, że:

a. wytwarza się nie występującą naturalnie linię komórkową prezentującą antygen (nnAPC), przy czym wymieniona nnAPC prezentuje jednocześnie od czterech do dziesięciu różnych cząsteczek peptydowych związanych z nowotworem,

b. stymuluje się komórki CD8⁺ zebrane od wymienionego podmiotu linią komórkową nnAPC przez sześć do siedmiu dni;

c. stymuluje się wymienione komórki CD8⁺ za pomocą IL-2 i IL-7 w pożywkach;

d. miesza się niezawieszone monocyty z krwi obwodowej lub pozbawione CD8⁺ monocyty krwi obwodowej zebrane od podmiotu z 20 μg/ml każdego peptydu;

e. napromieniowuje się monocyty krwi obwodowej dawką promieniowania γ wynoszącą 5000 radów;

PL 206 976 B1

f. izoluje się przylegające monocyty krwi obwodowej;

g. załadowuje się przylegające monocyty krwi obwodowej 1 μg/ml do 50 μg/ml każdego z wymienionych peptydów;

h. łączy się wymienione komórki CD8⁺ z przylegającymi monocytami krwi obwodowej w stosunku wynoszącym dziesięć komórek CD8⁺ na jeden monocyt krwi obwodowej;

i. stymuluje się połączoną zawiesinę komórek CD8⁺ i monocytów krwi obwodowej przez sześć do siedmiu dni;

10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że każdy peptyd ma osiem do dziesięciu aminokwasów długości.

11. Sposób wytwarzania zawiesiny CD8⁺ do stosowania w leczeniu podmiotu z czerniakiem, obejmujący:

f. izolację przylegających monocytów krwi obwodowej;

12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że wymieniona nnAPC prezentuje peptydy któ^{rymi są tyrozynaza}369-377^{, tyrozynaza}207-216^{, gp100}209-217^{, gp100}154-162^{, MART-1}27-35^{, HER-2/neu}789-797^,HER-2/neu369-377, C-lektyna8-16, Pec6020-29, i Pec6025-33.

13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że wymienione cząsteczki peptydowe z etapu (a) wybiera się spośród peptydów mających sekwencję aminokwasową przedłożoną w SEQ ID Nr: 1 do 42.

14. Sposób produkcji nie występującej naturalnie komórki prezentującej antygen (nnAPC) zdolnej do prezentowania do dziesięciu różnych cząsteczek peptydowych jednocześnie, znamienny tym, że

a. wytwarza się owadzią linię komórkową z jaj Drosophila melanogaster;

b. hoduje się wymienione komórki owadzie w pożywkach, korzystnie w pożywce Schneider™'s Drosophila Medium;

c. wykonuje się plazmid pRmHa-3 z wektora ekspresji pRmHa-1, przy czym wymieniony plazmid pRmHa-3 obejmuje promotor metalotioneiny, konsensusowe sekwencje odpowiedzi na metal oraz gen dehydrogenazy alkoholowej niosący sygnał poliadenylacji wyizolowany od Drosophila melanogaster;

d. wprowadza się do wymienionego plazmidu pRmHa-3 komplementarny DNA dla ludzkich HLA A2.1 klasy I, B7.1, B7.2, ICAM-1, mikroglobuliny β-2 oraz LFA-3, przy czym A2.1 można podstawić każdą ludzką sekwencją DNA klasy I;

e. transfekuje się wymienione komórki owadów plazmidem phshneo oraz wymienionym plazmidem pRmHa-3 zawierającym komplementarnym DNA; i

PL 206 976 B1

f. wytwarza się nnAPC przez zetknięcie wymienionych komórek owadów z CUSO4 indukując ekspresję transfekowanych genów w komórkach owadów.

15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że wymieniona linia komórek owadzich jest wytworzona przez hodowlę komórek przez dwanaście dni, selekcję pożądanych komórek z peptydami, które są zdolne do identyfikacji wymienionych pożądanych komórek, i namnożenie wymienionych pożądanych komórek za pomocą IL-2.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że wymienione peptydy do identyfikacji wymienionych pożądanych komórek, są tetramerami.

17. Nie występująca naturalnie linia komórkowa prezentująca antygen (nnAPC) pochodząca z komórek Drosophila melanogaster transfekowanych kwasem nukleinowym z ekspresją ludzkich cząsteczek HLA klasy I, cząsteczek wiążących i cząsteczek kostymulatorowych, przy czym wspomniana nnAPC prezentuje jednocześnie dziesięć różnych następujących cząsteczek peptydowych, tyrozynaza369-377, tyrozynaza207-216, gp100209-217, gp100154-162, MART-127-35, HER-2/neu789-797, HER-2/neu369-377, C-lektyna8-16, Pec6025-29, i Pec6025-33.