NO334885B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av en sammensetning for behandling av cancer,antigen-presenterende celle samt fremgangsmåte for fremstilling av antigen-presenterende celle - Google Patents

Fremgangsmåte for fremstilling av en sammensetning for behandling av cancer,antigen-presenterende celle samt fremgangsmåte for fremstilling av antigen-presenterende celle Download PDF

Info

Publication number
NO334885B1
NO334885B1 NO20033674A NO20033674A NO334885B1 NO 334885 B1 NO334885 B1 NO 334885B1 NO 20033674 A NO20033674 A NO 20033674A NO 20033674 A NO20033674 A NO 20033674A NO 334885 B1 NO334885 B1 NO 334885B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
seq
cells
sek
peptide
peptide molecules
Prior art date
Application number
NO20033674A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20033674L (no
NO20033674D0 (no
Inventor
Juli Degraw
Ann Moriarty
Didier J Leturcq
Michael R Jackson
Per A Peterson
Marja Heiskala
Original Assignee
Ortho Mcneil Pharm Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ortho Mcneil Pharm Inc filed Critical Ortho Mcneil Pharm Inc
Publication of NO20033674D0 publication Critical patent/NO20033674D0/no
Publication of NO20033674L publication Critical patent/NO20033674L/no
Publication of NO334885B1 publication Critical patent/NO334885B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A61K39/464491—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0601—Invertebrate cells or tissues, e.g. insect cells; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55538—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

T-celleresponser er ofte redusert hos mennesker med et kompromitert immunsystem Vi har utviklet en fremgangsmåte for å isolere, stimulere og ekspandere naive cytotoksiske T- lymfocyttforløpere (CTLp) til antigen-spesifikke effektorer, i stand til å lysere tumorceller in vivo. Denne eks vivo protokollen produserer fullstendig funksjonelle effektorer. Kunstige antigen-presenterende celler (AAPC'er; Drosophila melanogaster) transfektert med human HLA klasse I og definerte delaktige molekyler er benyttet for å stimulere CD8+ T-celler fra både normale donorer og cancerpasienter. Klasse I molekylene uttrykt ved en høy tetthet på overflaten av Drosophila-cellene er tomme, som tillater for effekting lasting av multiple peptider som resulterer i dannelsen av polyklonale responser som gjenkjenner tumorceller som endogent uttrykker de spesifikke peptidene. Responsen som genereres er robust, antigen- spesifikk og reproduserbar om peptidepitopen er et definert immunogen. Dette kunstige antigenekspresjonssystemet kan bli adaptert for å behandle de fleste cancere i et signifikant flertall av populasjonen.

Description

Cancer fortsetter å være et stort helseproblem til tross for at det er gjort signifikant utvikling i behandling. Standard behandlingskurer for kjemoterapi, strålingsterapi, kirurgisk intervensjon og kombinasjoner av disse tre, svikter ofte i å gi en langvarig helbredelse. I mange tilfeller får cancerpasienten som har gjennomgått behandlingen tilbakefall av sykdomstilstanden etter en tidsperiode, som ytterligere forverrer problemet på grunn av voldsomheten av disse behandlingskurvene for pasienten.
En annen faktor som kompliserer utvikling av en cancerbehandling er at cancere har blitt funnet ikke å være forårsaket av et enkelt biologisk middel eller faktor, men heller med en kombinasjon av midler og faktorer. Ulikt de fleste medisinske behandlinger hvor et enkelt forårsakende middel eller begivenhet er fokuset for behandlingen, krever cancerterapi å adressere et flertall av biologiske faktorer.
I de senere årene har forskning blitt rettet mot å utvikle cancerterapier som benytter pasientens eget immunsystem. En slik metode er adoptiv immunterapi. Adoptiv immunterapi benytter pasientens egne celler for å generere cytotoksiske T-lymfocytter (CTL'er) for å behandle en tumor eller kreftartede celler. Imidlertid er denne teknikken stort sett forblitt uprøvd som en levedyktig klinisk behandlingskur for humane pasienter. Bortsett fra problemet med å identifisere passende epitoper for å immunisere CTL'ene, tilveiebringer ikke den nåværende teknologien for en fremgangsmåte for å presentere et tilstrekkelig antall av ulike epitoper til APCer for å tilstrekkelig målrette multiple antigener for å effektivt behandle cancere. Den foreliggende oppfinnelsen oppfyller ikke-møtte behov, så vel som å tilveiebringe andre fordeler.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en ikke-naturlig forekommende antigen-presenterende celle (nnAPC) som simultant presenterer 4-10 forskjellige peptider samtidig, fremgangsmåter for å fremstille nnAPC samt fremgangsmåter for å fremstille en sammensetning for behandlingen av cancer.
Figur 1:
Denne figuren er en grafisk avbildning av interaksjonen mellom CD8+-celler, også kjent som cytotoksiske T-lymfocytter med antigen-presenterende celler, eller målceller, i dette tilfellet tumorceller.
Figur 2, panel A og B:
Denne figuren er en to-panel grafisk avbildning av mekanismer for lym-focyttformidlet cytose.
Figur 3:
Denne figuren viser resultatet av et eksperiment hvor flere ulike peptider ble testet i en konkurrerende test for å identifisere peptidbindere som kunne bli benyttet for å laste multiple peptider på Drosophila- celler som uttrykker humane tomme klasse I-molekyler.
Figur 4, paneler A, B og C:
Denne figuren viser resultatet av et eksperiment hvor tre melanompepti-der ble testet for evnen til å reise CTL'er når tilsatt som enkle epitoper på Drosophila- celler. I en enkel donor, var CTL-aktivitet kalt frem for hvert av peptidene når tilsatt alene til tre ulike Drosophila- preparater. Spesifi-siteten av responsen var sammenlignet med kontroll HBc-peptid, en høy-affinitetsbinder.
Figur 5, paneler A, B og C:
Denne figuren viser resultatene av en serie av eksperimenter hvor opp til fire ulike peptider var tilsatt til enkle Drosophila- celler. CTL-aktivitet i hvert av de representerte peptidene ble sett etter en tre ukers stimuleringsprotokoll og er grafisk avbildet i denne figuren.
Figur 6, paneler A, B og C:
Denne figuren viser CTL-aktivitet etter tre ulike primære in vitro stimuleringsprotokoller.
Figur 7, paneler A og B:
Denne figuren sammenligner evnen av Drosophila- celler versus dendrittceller til å frembringe CTL-responser til en enkel peptidepitop etter standard stimuleringsprotokoller.
Figur 8:
Denne figuren viser at dendrittcellene som fremviser enten moden eller umoden fenotype ikke var så effektive som Drosophila- celler i å frembringe spesifikke CTL-responser når definerte peptider ble benyttet for å pulsere cellene.
Figur 9, paneler A, B og C:
Denne figuren viser CTL-aktivitet generert ved en enkel donor til tre ulike in vitro stimuleringsprotokoller som presenterer fire peptider.
Figur 10:
Denne figuren viser CTL-aktivitet generert til ti (10) peptider lastet i kombinasjon til Drosophila- celler.
Figur 11:
Denne figuren viser peptidbindingskapasiteten av HER-2-peptidene (826, 835, 861 og 863) på Drosophila- cellene transfektert med det humane HLA-A2.1 klasse I molekylet.
Figur 12:
Denne figuren demonstrerer anti-peptid- og anti-tumorresponsen for MART-1 spesifikke effektorceller. T2-celler ble lastet med MART-1-peptid eller en negativ kontroll (HBc). Malme3M er en melanomlinje, Malme3 er en ikke-tumorcellelinje.
Figur 13, paneler A og B:
Denne figuren viser den tetramere fargingen av HER-2 spesifikke CD8-effektorcellene fra to ulike donorer.
Figur 14:
Denne figuren viser anti-peptidresponsen for HER-2 effektorcellene evaluert på peptidlastede T2-celler.
Figur 15, paneler A, B, C og D:
Denne figuren demonstrerer den forsterkede avlivningen av en ovarial tumorcellelinje (HTB-77) når transfektert med HLA-A2.1.
Figur 16:
Denne figuren viser den forsterkede avlivningen av en brystcancercelle-linje (HTB-133) når transfektert med en HLA-A2.1.
Figur 17:
Denne figuren viser at IFNy pre-behandling er nødvendig for å demonstrere lysering av tumorcellelinjen HTB-77/A2.1.
Figur 18, paneler A og B:
Denne grafen demonstrerer at overflateekspresjonen av HLA-A2 og HER-2 ikke er påvirket ved IFNy-induksjon i de to cellelinjene (HTB-77 ogHTB-77/A2.1).
Figur 19:
Denne grafen viser hvilke protein mRNA-nivåer som er forhøyet i HTB-77/A2.1-cellene etter en induksjon med IFNy.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en sammensetning som inneholder cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer) for behanding av et individ med cancer, kjennetegnet ved at den omfatter:
a. preparere ikke-naturlig forekommende antigen-presenterende celler (nnAPCer), hvor nevnte nnAPCer simultant presenterer 4 til 10 forskjellige peptidmolekyler assosiert med nevnte cancer, hvor nevnte peptidmolekyler er hver omkring 6 til 12 aminosyrer i lengde;
b. stimulere CD8+ T-celler fra et individ eller en passende donor med nevnte
nnAPCer;
c. ekspandere nevnte CD8+ T-celler ved å tilsette de stimulerte CD8+ T-cellene til medium som inneholder kondisjonert vekstmedium (CGM) eller en eller flere
cytokiner valgt fra gruppen som består av IL-2 og IL-7;
d. preparere en suspensjon av perifere blodmonocytter, eller CD-8-reduserte perifere blodmonocytter fra nevnte individ eller nevnte passende donor og omkring 1
til 50 ug/ml av nevnte 4 til 10 forskjellige peptidmolekyler;
e. bestråle nevnte suspensjon med en tilstrekkelig dose av y-stråling nødvendig for å sterilisere alle komponenter i suspensjonen, og forhindre proliferering av nevnte perifere blodmonocytter eller CD-8-reduserte perifere blodmonocytter;
f. isolere adherente perifere blodmonocytter eller adherente CD-8-reduserte perifere blodmonocytter;
g. laste nevnte adherente perifere blodmonocytter eller adherente CD-8-reduserte perifere blodmonocytter med omkring 1 ug/ml til 50 ug/ml av hvert av nevnte 4 til 10 peptidmolekyler;
h. re-stimulere nevnte ekspanderte CD8+ T-celler med nevnte peptid lastede adherente perifere blodmonocytter eller peptid lastede adherente CD-8-reduserte perifere blodmonocytter ved et forhold på omkring 10 CD8+ T-celler til en perifer
blodmonocytt eller en CD-8-redusert perifer blodmonocytt; og
i. innsamle nevnte re-stimulerte CD8+ T-celler for derved å fremstille en sammensetning som inneholder CTLer for behanding av et individ med cancer.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også en ikke-naturlig forekommende antigen-presenterende celle (nnAPC) avledet fra Drosophila melanogaster- celler transfektert med DNA som koder for humane klasse IHLA, bindende og ko-stimulerende molekyler, hvor nnAPC simultant presenterer 4 til 10 forskjellige peptidmolekyler assosiert med cancer.
I tillegg til peptider assosiert med sykdommen eller sykdomstilstanden som behandles, kan f.eks. nnAPC presentere peptider assosiert med delaktige molekyler slik som lym-focyttfunksjonantigener (LFA-1, LFA-2 og LFA-3), intracellulært adhesjonsmolekyl 1 (ICAM-1), T-celle ko-stimulatoriske faktorer (CD2, CD28, B7) forsterke celle-celleadhesjon eller omforme andre celleaktiveringssignaler.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en nnAPC som presenterer peptider som er assosiert med flere typer av cancere. For eksempel, kan peptidene assosiert eller aveldet fra et brystcancer-relatert polypeptid, slik som HER-2/neu, bli presentert med peptider assosiert eller derivert fra et melanom-relatert polypeptid, slik som MART-1 eller MAGE.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å fremstille ikke-naturlig forekommende antigen-presenterende celle (nnAPC) som simultant presenterer 4 til 10 forskjellige peptidmolekyler, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter
a. preparere en insektcellelinje fra Drosophila melanogaster- Qgg;
b. dyrke nevnte insektcellelinje i et medium som er egnet for å dyrke insektceller,
fortrinnsvis Schneider™ Drosophila- medium; c. lage et pRmHa-3-plasmid fra en pRmHa-1 -ekspresjonsvektor, hvor nevnte pRmHa-3-plasmid inkluderer en metalotioneinpromoter, metallresponskonsen-sussekvens og et alkoholdehydrogasegen som bærer et polyadenyleringssignal isolert fra Drosophila melanogaster; d. sette inn i nevnte pRmHa-3-plasmid komplementært DNA for human klasse I
HLA A2.1, B7.1, B7.2, ICAM-1, p-2 mikroglobulin og LFA-3, hvor A2.1 kan
bli substituert med enhver human klasse I DNA-sekvens;
e. transfektere nevnte insektceller med et phshneo-plasmid og nevnte pRmHa-3-plasmid som inneholder komplementært DNA;
f. lage nnAPC ved å kontakte nevnte insektceller med CUSO4for å indusere ekspresjon av de transfekterte genene i nevnte insektceller;
g. laste nnAPC med 4-10 forskejllige peptidmolekyler assosiert med kreft, slik at
nnAPC simultant presenterer 4 til 10 forskjellige peptidmolekyler.
Insektscellene er dyrket i et medium egnet for å dyrke insektsceller, heretter referert til som "insektsvekstmedium". Insektsvekstmedium er kommersielt tilgjengelig fra et antall av leverandører, slik som Schneider™'s Drosophila- medium, Grace's Insektsmedium og TC-100 insektsmedium. Alternativt kan insektsvekstmedium bli preparert av en med ordinær dyktighet innen faget. Vanligvis vil mediumet inkludere komponenter nødvendig for å fremme og opprettholde veksten av insektsceller, slik som uorganiske salter (f.eks. kalsiumklorid, magnesiumsulfat, kaliumklorid, kaliumfosfat, natriumbi-karbonat, natriumklorid og natriumfosfat), aminosyrer, ulike karbohydrat og kjemiske arter (Imogene Schneider, Exp. Zool. (1964) 156(1): s. 91). Alternativt kan mediumet også inkludere vitaminer, mineraler og andre komponenter som bistår i veksten av insektsceller.
Etterfølgende er en liste av forkortelser og definisjoner benyttet i den foreliggende spesifikasjonen.
Forkortelser
APC Antigen-presenterende celler
CD8+ CD8+ T-celler
CTL Cytotoksisk T-lymfocytt
E Effektor
Fas Også kjent som CD95, epitop på T-celler
ICAM Intracellulært adhesjonsmolekyl
IL Interleukin
LAK Lymfokin-aktiverte dreperceller
LFA Lymfocyttfunksjonsantigener
MHC Største histokompatibilitetskompleks
nnAPC Ikke-naturlig forekommende antigen-presenterende celle
NP Nukleært protein
PBMC Perifer mononukleær blodcelle
PBS Fosfat-bufret saltoppløsning
PCR Polymerasekjedereaksjon
RPMI Rosewell Park Memorial Institute
RWJPRI R. W. Johnson Pharmaceutical Research Institute
T Mål
TCR T-celleantigenreseptor
TIL Tumor-infiltrerende lymfocytter
Etterfølgende er en liste av forkortelser benyttet i den foreliggende spesifikasjonen for ulike peptidepitoper. De individuelle aminosyrerestene er identifisert i henhold til en enkel bokstavkode som er godt kjent og benyttet av dem med ordinær dyktighet innen faget.
Peptidepitopforkortelser
Som benyttet her, refererer betegnelsen "tyrosinase 369-377" eller "tyrosinase369-377" til aminosyresekvensen YMNGTMSQV (SEK ID NO. 1). Også inkludert i denne defini-sjonen er peptidet av sekvensen YMDGTMSQV (SEK ID NO. 2), som resulterer fra en posttranslasjonell begivenhet som modifiserer aminosyreresten "N" av sekvens YMNGTMSQV (SEK ID NO. 1) til "D" som resulterer i aminosyresekvensen av YMDGTMSQV (SEK ID NO. 2) ( Skipper et al., J. Exp. Med. (1969) 183:527-534).
Som benyttet her, refererer betegnelsen "tyrosinase 207-216" eller tyrosinase207-2i6" til aminosyresekvensen FLPWHRLFLL (SEK ID NO. 3).
Som benyttet her, refererer betegnelsen "gplOO 209-217" eller gpl00209-2i7" til aminosyresekvensen ITDQVPFSV (SEK ID NO. 4).
Som benyttet her, refererer betegnelsen "gplOO 154-162" eller "gp 100154-162" til aminosyresekvensen KTWGQYWQV (SEK ID NO. 5).
Som benyttet her, refererer betegnelsen "MART-1 27-35" eller "MART-127-35" til aminosyresekvensen AAGIGILTV (SEK ID NO. 6).
Som benyttet her, refererer betegnelsen "HER-2/neu 789-797" eller "HER-2/neu789-797" til aminosyresekvensen CLTSTVQLV (SEK ID NO. 7).
Som benyttet her, refererer betegnelsen "HER-2/neu 369-377" eller "HER-2/neu369-377" til aminosyresekvensen KIFGSLAFL (SEK ID NO. 8).
Som benyttet her, refererer betegnelsen "C-lektin 8-16" eller "C-lekting-ié" til aminosyresekvensen KMASRSMRL (SEK ID NO. 9).
Som benyttet her, refererer betegnelsen "Pec60 20-29" eller "Pec602o-29" til aminosyresekvensen ALALAALLW (SEK ID NO. 10).
Som benyttet her, refererer betegnelsen "Pec60 25-33" eller "Pec6025-33" til aminosyresekvensen ALLVVDREV (SEK ID NO. 11).
Som benyttet her, refererer betegnelsen "CD8 peptid 59-70" eller "CD8 peptid59-7o" til aminosyresekvensen AAEGLDTQRFSG (SEK ID NO. 12).
Betegnelser og definisjoner
Som benyttet her, refererer betegnelsen "adoptiv immunoterapi" til administrasjonen av donor eller autologe T-lymfocytter for behandlingen av en sykdom eller sykdomstilstand, hvor sykdommen eller sykdomstilstanden resulterer i en utilstrekkelig eller mangelfull immunrespons som normalt er assosiert med klasse I HLA-molekyler. Adoptiv immunoterapi er en hensiktsmessig behandling for enhver sykdom eller sykdomstilstand hvor elimineringen av infiserte eller transformerte celler har blitt demonstrert til å bli oppnådd ved CTL'er. Sykdom eller sykdomstilstand inkluderer, men er ikke begrenset til f.eks. cancer og/eller tumorer, slik som melanom, prostata, bryst, kolorek-tal, magesekk, strupe og hals, bukspyttkjertel, livmorhals, ovarial, ben, leukemi og lungecancer; virale infeksjoner, slik som hepatitt B, hepatitt C, humant immunsviktvi-rus; bakterielle infeksjoner slik som tuberkulose, spedalskhet og listeriose, og paracy-tiske infeksjoner slik som malaria.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "B7.1" til et ko-stimulatorisk molekyl assosiert med antigen-presenterende celler.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "BCNU" til karmustin, også kjent som 1,3-bis(2-kloretyl)-1 -nitrosurea.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "BSE" til bovin spongiform encefalitt.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "CD" til klynger av differensiering, T-lymfocytter (opprinnelig), B-lymfocytter, monocytter, makrofager og granulocytter gruppert ved antigenepitoper og funksjon.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "DTIC" til dakarbazin, 5-(3,3-dimetyl-l-triazeno)-imidazol-4-karboksamid.
Som benyttet her, refererer betegnelsen " ex- vivo " eller "ex-v/vø-terapi" til en terapi hvor biologiske materialer, vanligvis celler, er oppnådd fra en pasient eller en passende alter-nativ kilde, slik som en passende donor, og er modifisert slik at de modifiserte cellene kan bli benyttet for å behandle en patologisk tilstand som vil bli forbedret ved den lang-tids eller konstante leveringen av den terapeutiske fordelen produsert ved de modifiserte cellene. Behandling inkluderer reintroduksjonen av de modifiserte biologiske materiale-ne, oppnådd fra enten pasienten eller fra den alternative kilden, til pasienten. En fordel av ex-v/vø-terapi er evnen til å gi pasienten fordelen av behandlingen uten å eksponere pasienten for uønskede bieffekter fra behandlingen. For eksempel, er cytokiner ofte administrert til pasienter med cancer eller virale infeksjoner for å stimulere ekspansjon av pasientens CTL'er. Imidlertid, forårsaker cytokiner ofte begynnelsen av influensalignende symptomer hos pasientene. I en ex-v/vø-prosedyre er cytokiner benyttet for å stimulere ekspansjon av CTL'er utenfor pasientens kropp, og pasienten er spart for ekspo-neringen og de følgende bieffektene av cytokinene. Alternativt, under passende situasjoner eller tilstander hvor passende og hvor individet kan oppnå fordel, kan individet bli behandlet samtidig med lave nivådoseringer av y-interferon, a-interferon og/eller IL-2. Den forventede effekten av interferonene er å muligens sensibilisere tumorcellene til å lysere ved antigenspesifikk CTL, og effekten av IL-2 er å muligens forsterke antigenspesifikk CTL-vedholdenhet.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "HEPES" til N-2-hydroksyetylpiperazin-N'2-etansulfonsyrebuffer.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "HLA-A2.1" til et HLA klasse I-molekyl funnet hos omtrentlig 45% av Kaukasiere.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "MART-1" eller "melanom antigen gjenkjent ved T-celler-1" til et melanom-assosiert antigen. Aminosyre og nukleinsyresekvensene, så vel som ulike egenskaper av dette antigenet er angitt i U.S. patent nr. 5,994,523, utkommet 30. november 1999, ved tittel " Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods" ; U.S. patent nr 5,874,560, utkommet 23. februar 1999, ved tittel " Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods" ; og U.S. patent nr. 5,844,075, utkommet 1. desember 1998, ved tittel" Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostics and Therapeutic Methods." Nærmere bestemt angir U.S. patent nr. 5,994,523 full lengde nukleinsyre og aminosyresekvenser av MART-1 i fig. 1 som hhv. SEK ID NO. 1 og SEK ID NO. 2.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "MAGE" til en melanom-assosiert antigen. Aminosyre- og nukleinsyresekvensene, så vel som ulike egenskaper av dette antigenet
er angitt i U.S. patent nr. 6,140,050, utkommet 31. oktober 2000, ved tittel " Methods for Determining Breast Cancer and Melanoma by Assayingfor a Plurity of Antigens Associated Therewith" ; U.S. patent nr. 5,759,783, utkommet 2. juni 1998, ved tittel " Method of Screening for Cancer by Detecting Messenger RNA for a MAGE- XP Gene" ; og U.S. patent nr. 5,662,907, utkommet 2. september 1997, ved tittel " Induction of Anti- Tumor Cytotoxic TLymphocytes in Humans Using Synthetic Peptide Epitopes".
Som benyttet her, refererer betegnelsen "MPC-10" til en magnetisk partikkelkonsentra-tor.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "NK-celler" til naturlige dreperceller.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "OKT3" til ORTHOCLONE OKT3, muromo-nab-CD3, anti-CD3-monoklonalt antistoff.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "TAP-1,2" til transporter assosiert med antigen-prosessering-1,2.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "Th-celler" til hjelper T-celler, CD4+.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "tyrosinase" til et protein assosiert med melanom ( Brichard et al., J. Exp. Med. (1993) 178:489-495; Robbins et al., Cancer Res.
(1994) 54:3124-3126). U.S. patent nr. 5,843,648, utkommet 1. desember 1998, ved tittel " Pl 5 and Tyrosinase Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods" angir antigene peptider og assosierte polynukleinsyrer relatert til tyrosinase i fig. 7, paneler A til D. U.S. patent nr. 5,487,974, utkommet 30. januar 1996, ved tittel " Methods for Detecting Complexes Containing Human Leukocyte Antigen A2 ( HLA- A2) Molecules and a Tyrosinase Derived Peptide on Abnormal Cells" angir et ytterligere peptid som er assosiert med tyrosinase og melanom i eksempel 9, ved tabell 3.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "gplOO" til et melanomantigen gjenkjent ved tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL). TIL som gjenkjenner gplOO er assosiert med in vivo tumorawisning ( Bakker et al., J. Exp. Med. (1994) 179:1005-1009; Kawakami et al., J. Immunol. (1995) 154:3961-3968). Antigene peptider relatert til gplOO er angitt i U.S. patent nr. 5,994,523, utkommet 30. november 1999, ved tittel " Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods" ; U.S. patent nr. 5,874,560, utkommet 23. februar 1999, ved tittel " Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods" ; og U.S. patent nr. 5,844,075, utkommet 1. desember 1998, ved tittel " Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods." Nærmere bestemt angir U.S. patent 5,994,523 nukleinsyre og aminosyresekvenser relatert til gplOO i hhv. fig. 4 og 5. Også angitt er antigene peptider derivert fra aminosyre-sekvensene, som inkluderer dem identifisert som SEK ID NO. 27, 33,34, 35, 36,37, 38, 39,40 og 41.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "melanom" til, men er ikke begrenset til, melanomer, metastatiske melanomer, melanomer derivert fra enten melanocytter eller mela-nocyttrelatert føflekkceller, melanosarkomer, malenomkarcinomer, melanomepitelio-mer, melanom in situ overfladisk spredende melanom, nodulær melanom, lentigo malign melanom, akral lentigoaktig melanom, invasiv melanom eller familiær atypisk fø-flekk og melanom (FAM-M) syndrom. Slike melanomer hos pattedyr kan være forårsaket ved kromosomale abnormiteter, degenererende vekst og utviklingsforstyrrelser, mi-togene midler, ultrafiolett stråling (UV), virale infeksjoner, uhensiktsmessig vev-sekspresjon av et gen, forandring i ekspresjon av et gen og presentasjon på en celle, eller karcinogene midler. De tidligere nevnte melanomaene kan bli diagnostisert, testet eller behandlet ved fremgangsmåter beskrevet i den foreliggende søknaden.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "C-lektin" til et peptid av sekvensen som har blitt funnet til å være assosiert med ovarial cancer.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "største histokompatibilitetskompleks" eller "MHC" en generisk betegnelse ment til å omslutte histo-kompatibilitetsantigensystemene beskrevet i ulike arter som inkluderer de humane leu-kocyttantigenene (HLA).
Som benyttet her, refererer betegnelsen "epitop", "peptidepitop", "antigent peptid" og "immunogent peptid" til et peptid derivert fra et antigen i stand til å forårsake en cellulær immunrespons hos et pattedyr, slike peptider kan også være reaktive med antistoffer fra et dyr immunisert med peptidene. Slike peptider kan være om kring 5 til 20 aminosyrer i lengde, fortrinnsvis omkring 8 til 15 aminosyrer i lengde, og allerhelst omkring 9 til 10 aminosyrer i lengde.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "Pec60" til et peptid av sekvensen som har blitt funnet til å være assosiert med ovarialcancer og brystcancer.
Som benyttet her, inkluderer betegnelsen "analog" ethvert polypeptid som har en ami-nosyrerestsekvens hovesakelig identisk til sekvensene, spesifikt vist her hvor en eller flere rester har blitt konservativt substituert med en funksjonell lignende rest og som oppretholder de funksjonelle aspektene. Eksempler på konservative substitusjoner inkluderer substitusjonen av en ikke-polar (hydrofob) rest slik som isoleucin, valin, leucin eller metionin med en annen, substitusjonen av en polar (hydrofil) rest med en annen slik som mellom arginin og lysin, mellom glutamin og asparagin, mellon glycin og se rin, substitusjonen av en basisk rest slik som lysin, arginin eller histidin med en annen, eller substitusjonen av en sur rest, slik asparaginsyre eller glutaminsyre eller en annen.
Som benyttet her, inkluderer betegnelsen "konservativ substitusjon" også anvendelsen av en kjemisk derivatisert rest i stedet for en ikke-derivatisert rest.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "kjemisk derivat" til et polypeptid som har en eller flere rester kjemisk derivatisert ved reaksjon av en funksjonell sidegruppe. Eksempler på slike derivatiserte molekyler inkluderer f.eks. de molekylene hvor frie ami-nogrupper har blitt derivatisert for å danne aminhydroklorider, p-toluensulfonylgrupper, karbobenzoksygrupper, t-butyloksykarbonylgrupper, kloracetylgrupper eller for-mylgrupper. Frie karboksylgrupper kan være derivatisert for å danne salter, metyl- og etylestere eller andre typer av estere eller hydrazider. Frie hydroksylgrupper kan være derivatiserte for å danne O-acyl- eller O-alkylderivater. Imidazolnitrogenet hos histidin kan være derivatisert for å danne N-im-benzylhistidin. Også inkludert som kjemiske derivater er de proteinene eller peptidene som inneholder en eller flere naturlig forekommende aminosyrederivater av de 20 standard aminosyrene. For eksempel: 4-hydroksyprolin kan være substituert for prolin; 5-hydroksylysin kan være substituert for lysin; 3-metylhistidin kan være substituert for histidin; homoserin kan være substituert for serin; og ornitini kan være substituert for lysin. Proteiner eller polypeptider inkluderer også et hvert polypeptid som har en eller flere tilføyinger og/eller delesjoner eller rester relative til sekvensen av et polypeptid hvis sekvens er kodet ved den korresponde-rende nukleinsekvensen, så lenge som den påkrevede aktiviteten er opprettholdt.
Som benyttet her, refererer betegnelsen "HER-2/neu" til et onkogen, som uttrykker eller overuttrykker et eller flere membran-assosierte, reseptorlignende onkogene proteiner. Blant cancerene som har blitt funnet til å være assosiert med ekspresjon eller overekspresjon av HER-2/neu er enkelte bryst-, mage-, ovarial-, kolon- og spyttkjertel-cancere. HER-2/neu-onkogene er et medlem av tyrosinproteinkinasefamilien av onkogener og deler en høy grad av homologi med epidermal vekstfaktorreseptoren (EGFR). HER-2/neu har blitt vist til å spille en rolle i cellevekst og/eller differensiering. HER-2/neu viser seg å indusere malignitet gjennom kvantitative mekanismer som resulterer fra økt eller deregulert ekspresjon av et essensielt normalt genprodukt. U.S. patent nr. 6,075,122 utkommet 13. juni 2000, ved tittel " Immune Reactivity to HER- 2/ neu Protein for Diagnosis and Treatment of Malignancies in Which the HER- 2/ neu Oncogene is Associated" angir peptider som frembringer CD8+ T-celleresponser ved kolonne 12, linje 31 til kolonne 13, linje 7, identifisert i henhold til SEK ID NO.
HER-2/neu (pl85) er proteinproduktet av HER-2/neu-onkogenet. HER-2/neu-genet er amplifisert og HER-2/neu-proteinet er overuttrykt i et utvalg av cancere som inkluderer bryst-, ovarial-, kolon-, lunge- og prostatacancer. HER-2/neu er relatert til ondartet transformasjon. Det er funnet i 50% til 60% av duktal in situ karcinom og 20% til 40% av alle brystcancere, så vel som en stor fraksjon av adenokarcinomer som oppstår i ova-rier, prostata, kolon og lunge. HER-2/neu er inngående assosiert ikke bare med den ondartede fenotypen, men også med den aggressiviteten av maligniteten som er funnet i en fjerdedel av alle invasive brystcancere. HER-2/neu-overekspresjon er korrelert med en dårlig prognose i både bryst- og ovarialcancer. HER-2/neu er et transmembranprotein med en relativ molekylmasse på 185 kD som er omtrentlig 1255 aminosyrer (aa) i lengde. Det har et ekstracellulært bindings domene (ECD) av omtrentlig 645 aa, med 40% homologi til epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR), en sterkt hydrofob transmembran forankringsdomene (TMD), og en karboksyterminal cytoplasmisk domene (CD) av omtrentlig 580 aminosyrer med 80% homologi til EGFR.
Pågående forskning som involverer onkogener har identifisert minst 40 onkogener ope-rative i ondartede celler og ansvarlige for eller assosiert med transformasjon. Onkogener har blitt klassifisert i ulike grupper basert på den antatte funksjonen eller lokaliseringen av deres genprodukter (slik som proteinet utrykt ved onkogenet). Onkogenene er trodd til å være essensielle for enkelte aspekter av normal cellulær fysiologi.
Cancer fortsetter å være et stort helseproblem, til tross for at signifikant fremgang har blitt gjort i behandlingen. Standard behandlingskurer av kjemoterapi, strålingsterapi, kirurgisk intervensjon og kombinasjoner av de tre mislykkes ofte til å produsere en langvarig helbredelse, i mange tilfeller får cancerpasienten som har gjennomgått behandlingen ofte tilbakefall av sykdomstilstanden etter en tidsperiode. Problemet forvær-res ytterligere ved voldsomheten av disse behandlingskurene for pasienten. I tilfelle av melanom har ikke en kur for metastatisk melanom blitt oppnådd ved å benytte konven-sjonell kjemoterapi. Responsnivåer på 35 til 50% har blitt rapportert med Dartmouth-kuren av kombinasjonskjemoterapi (DTIC, cis-platin, BCNU og tamoksifen), men va-righeten av overlevelse har forblitt på 6 til 10 måneder. Høye nivåer av bedring har blitt rapportert for aggressiv "høy doseintensitet" kjemoterapi og overflod av hematopoese med autologe benmargstransplantater. Ikke desto mindre var median varighet av overlevelse kort, omtrentlig 4 måneder.
Rosenberg og kolleger har forsøkt å benytte infusjon av aktiverte lymfocytter som en behandling for ulike cancere. Til å begynne med ble lymfokin-aktiverte dreperceller
(LAK) og senere tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL) aktivert ex- vivo med IL-2 benyttet, men bevis for effektivitet er tvilsom. Kontrollerte kliniske forsøk har mislykkes i å vise en fordel ved anvendelsen av ex-vzvø-aktiverte celler over direkte administrasjon av IL-2 til pasientene. Derfor er fordelene av LAK- og TIL-terapi marginale, og bieffektene er vanligvis så alvorlige at mange forsøk har blitt avbrudt for tidlig.
Studier i musetumormodeller har demonstrert at adoptiv immunoterapi, in vivo immuni-sereing av T-celler spesifikke for et tumorantigen(er), er veldig effektiv med minimal
toksisitet. Et stort hinder for å benytte denne strategien i behandlingen av humane tumorer er identifiseringen av immunogene antigener som gjør tumorcellene mottakelige for cytotoksisk T-lymfocytt (CTL)-formidlet destruksjon. Isoleringen av tumor-reaktive T-celler for melanompasienter har ført til identifikasjonen av noen av tumorantigenene (epitoper) som CTL'ene er rettet mot. Disse inkluderer tyrosinase ( Brichard et al., J. Exp. Med. (1993) 178:489-495; Robbins et al., Cancer Res. (1994) 54:3124-3126), MART 1/Melan A (Kawakami et al., J. Exp. Med. (1994) 180:347-352), gp 100 ( Bakker et al., J. Exp. Med. (1994) 179:1005-1009; og Kawakami et al., J. Immunol. (1995) 154:3961-3968) og MAGE ( Gaugler et al., J. Exp. Med. (1994) 179:921-930). Av disse, er tyrosinase og MART-1 nesten universelt uttrykt på melanomer og er derfor det logis-ke valget for adoptiv immunoterapi.
I de senere årene har signifikante forbedringer i overlevelse i størrelsesordene av flere år blitt notert i en liten prosentandel av melanompasienter som gjennomgår immunologisk terapi. Dette inkluderer aktiv spesifikk immunoterapi med "cancervaksiner" så vel som anvendelsen av ikke-spesifikke forsterkere av immunsystemet slik som cytokiner, lignende IL-2, a-interferon og y-interferon. Imidlertid er fordelene av cytokiner redusert ved bieffekter som ofte ledsager deres anvendelse, slik som kvalme og feber.
Cytolytiske T-celler (CD8+) er den viktigste linjen for forsvar mot virale infeksjoner. CD8+-lymfocytter gjenkjenner spesifikt og dreper vertsceller som er infisert av et virus. Teoretisk burde det være mulig å utnytte immunsystemet for å bekjempe andre typer av sykdommer som inkluderer cancer. Imidlertid har få in vz7rø/ex-v/vø-prosedyrer vært tilgjengelige for å spesifikt aktivere CTL'er. Identifiseringen av viktige melanomantige-ner bemerket ovenfor og en fremgangsmåte for å spesifikt in vtfrø-aktivere CTL'er beskrevet nedenfor tillater nå å teste ut konseptet av adoptiv immunoterapi av metastatisk melanom.
Alle naive T-celler krever to signaler for aktivering for å frembringe en immunrespons. For CD8+-lymfocytter (CTL'er) består det første signalet som meddeler spesifisitet av presentasjon av CD8+-cellene av et irnmunogent peptidfragment (epitop) av antigenet bundet til klasse IMHC (HLA) komplekset tilstede på overflaten av antigen-presenterende celler (APCer). Dette komplekset er gjenkjent spesifikt ved en T-celleantigenreseptor (TCR), som overfører signalet intracellulært.
Binding til T-cellereseptoren er nødvendig, men ikke tilstrekkelig for å indusere T-celleaktivering, og vil vanligvis ikke føre til celleproliferering eller cytokinsekresjon. Fullstendig aktivering krever et andre ko-stimulatorisk signal(er), disse signalene tjener for å ytterligere forsterke aktiveringskaskaden. Blant de ko-stimulatoriske molekylene på antigen-presenterende celler assisterer B7 og celleadhesjonsmolekyler (integriner) slik som ICAM-1 i denne prosessen ved å binde til hhv. CD28 og LFA-1 på T-cellen. Når en CD8+-celle interagerer med en antigen-presenterende celle som bærer et irnmunogent peptid (epitop) bundet ved et klasse I MHC-molekyl under tilstedeværelsen av hensiktsmessige ko-stimulatoriske molekylinteraksjoner blir CD8+-cellen en fullstendig aktivert cytolytisk T-celle.
Lymfocytt-formidlet dreping av celler involverer en sekvens av biologiske begivenheter som begynner med bindingen av CD8+ CTL til en antigen-bærende mål (tumor) celle ved hjelp av gjenkjenningsprosessen beskrevet ovenfor for T-celleaktivering.
Interaksjonen mellom CD8+-celler og antigen-presenterende celler eller mål (tumor) celler som beskrevet ovenfor er avbildet i fig. 1. Interaksjonen begynner med bindingen av antigen i assosiasjon med et MHC klasse I-molekyl på APC eller målcelle til T-celleantigenreseptoren (TCR). Delaktige molekyler slik som lymfocytfunksjonsantige-ner (LFA-1, LFA-2 og LFA-3), intracellulært adhesjonsmolekyl 1 (ICAM-1), T-celle ko-stimulatoriske faktorer (CD2, CD28, B7) forsterker celle-celleadhesjon eller ytterligere celleaktiveringssignaler.
Etter celle-celleaksjon dreper CTL'en målcellen gjennom virkningen av løselige cytolytiske formidlere (perforin og granzymer lagret i cytoplasmiske granuler i T-cellen) og et CTL-overflatemolekyl (Fas-ligand). Etter det cytolytiske angrepet, dør målcellene ved nekrose (membranperforering og organelledestruksjon) eller apoptose (kromatinkon-densering, DNA-fragmentering og dannelsen av membranblemmer).
Mekanismene for lymfocytt-formidlet cytolyse er grafisk avbildet i fig. 2.1 panel A av fig. 2, er etter binding til målcellen cytoplasmiske granuler i CTL'en raskt reorientert mot målcellen for frigjøring av granuler som inneholder perforin og granzymer til det intracellulære rommet. Disse proteolyttiske enzymene danner porer i plasmamembranen hos målcellen som eventuelt fører til cellenekrose. I panel B, øker nivået av Fas-ligandekspresjon på CTL'en etter binding til målcellen. Interaksjonen av Fas-ligand og Fas-reseptoren på målcellen fører til apoptose. Proteaser slik som CPP32 og andre relatert til IL-lb-omdannende enzym (ICE) har blitt implisert i induksjonen av apoptose. Det er mulig å benytte naturlig forekommende antigen-presenterende celler, f.eks. dendrittceller, makrofager, autologe dumorceller for in vitro CD8+-aktivering. Imidlertid er effektiviteten av aktivering etter denne fremgangsmåten lav. Det er fordi klasse I-molekylene hos naturlige APCer inneholder mange andre typer av peptidepitoper i tillegg til tumorepitoper. De fleste av peptidene er derivert fra naturlige uskadelige celle-proteiner, som resulterer i en fortynning av antallet av aktive naturlige APCer som fak-tisk ville være effektive mot en tumor (Allison et al., Curr. Op. Immunol. (1995) 7:682-686).
En mer direkte og effektiv metode for dette problemet er å spesifikt aktivere CD8+-celler som kun har de epitopene som er relevante for å bekjempe en spesifikk sykdom (slik som cancer) eller tumorspesifikke antigener (slik som melanom-spesifikke antigener). I dette henseende er en kunstig antigenpresenterende celle laget ved å uttrykke MHC klasse I-molekyler i Drosophila melanogaster (bananflue) celler. Siden Drosophila ikke har et immunsystem, er TAB-l,2-peptidtransporterene involvert i å laste peptidepitoper på klasse I-molekylene fraværende. Som et resultat, viser klasse I-molekylene seg på Drosophila- celleoverHaXen som tomme beholdere. Ved å inkubere disse transfekterte Drosophila- cellene med eksogene peptider som binder til klasse I-molekylene, slik som cancer- og tumorspesifikke epitoper, som inkluderer, men ikke er begrenset til, melanomspesifikke epitoper, er det mulig å okkupere hvert klasse I-molekyl med det samme peptidet. Ekspresjon i sterk tetthet av klasse I-molekyler som inneholder et enkelt peptid i disse Drosophila APCene tillater generering av cytotoksiske CD8+ T-celler in vitro som er fullstendig spesifikke for antigenpeptider. Fremgangsmåter og prosedyrer for å preparere Drosophila- celler er beskrevet i U.S. patent nr. 5,529, 921, utkommet 25. juni 1996, ved tittelen " In Vitro Activation of Cytotoxic T-Cells Using Insect Cells Expressing Human Class I MHC and / 32- Microglobulin''', og U.S. patent nr. 5,314,813, utkommet 24. mai 1994 ved tittelen " Drosophila Cell Lines Expressing Genes Encoding MHC Class I Antigens And p2- Microglobulin and Capable of Assembling Empty Complexes and Methods of Making Said Cell Lines". Nærmere bestemt angir U.S. patent nr. 5,529,921 ved kolonne 26, linje 56 til kolonne 28, linje 22 ulike fremgangsmåter for å separere ut og/eller anrike kulturer av forløperceller.
I tillegg eliminerer dette momentet behovet for in v/vø-stimulering av immunsystemet med høye doser av ulike cytokiner. Dette resulterer i en behandling som går forut for bieffektene forårsaket av cytokiner. Alternativt ved passende situasjoner eller forhold, hvor hensiktsmessig og hvor individet kan oppnå fordeler, kan individet bli behandlet samtidig med lave doseringsnivåer av a-interferon, y-interferon og/eller IL-2.
Å eliminere behovet for in vivo stimulering med cytokiner tilveiebringer en forbedring for kvaliteten av pasientbehandling. Behandlingskurer som inkluderer administrasjonen av cytokiner til pasienter resulterer ofte i at pasienten utvikler influensalignende symptomer, slik som kvalme, oppkast og feber. Disse bireaksj onene er generelt ikke livstruende, selv om en spesielt voldsom reaksjon hos en pasient som allerede er i en svekket tilstand kan resultere i en situasjon som er livstruende. En annen betraktning er den ugunstige innvirkningen slik bireaksj oner har på pasientens mottakelse og medgjørlig-het av en ellers fordelaktig behandlingskur. Å fjerne behovet for in vivo stimulering med cytokiner resulterer i en behandlingskur som forbedrer komforten for pasienten, og til-veeibringer legen en effektiv fremgangsmåte for behandling som hans eller hennes pasient sansynligvis vil føye seg etter.
Benyttelsen av denne fremgangsmåten for adoptiv immunoterapi av tumorer har blitt demonstrert i mus ved å benytte transfekterte Drosophila- celler som APCer og CD8+celler fra 2C-linjen av T-cellereseptor (TCR) transgene mus. I dette systemet, er rensede CD8+ 2C-celler sterkt mottakelige for in vitro peptider presentert på MHC klasse I (L<d>)-transfekterte Drosophila- celler som også bærer de ko-stimulatoriske molekylene B7-1 og ICAM-1. Transfekterte Drosophila- celler er en probe for å definere de minimale kravene for å stimulere ikke-forberedte CD8+ T-celler ( Cai et al., P. N. A. S. USA (1996) 93:14736-14741). Når useparerte musemiltceller er alternativt benyttet som respondere i stedet for rensede 2C-celler pålegges ikke behovet for ko-stimulatoriske molekyler. I dette tilfellet, mottar CD8+-cellene i miltpopulasjonen "tilstedeværende" ko-stimulering fra aktiverte B-celler. Ved å benytte dette funnet, har det vært mulig å vise at MHC klasse I (L<d>)-transfekterte Drosophila- celler er i stand til å indusere normal DBA/2-musemiltceller til å respondere til syngene P815 mastocytom tumor-spesifikke peptider in vitro i fraværet av tilsatte lymfokiner. Injeksjon av disse CTL'ene til DBA/2-mus som bærer P815 mastocytom førte til rask tumorregressjon ( Sun et al., Im-munity( l996) 4:555-564).
Prosedyremessig ble normale DBA/2 -musemiltceller dyrket in vitro med MHC klasse I (L<d>)-transfekterte Drosophila- celler lastet med Pl A.353-43 peptid, en tumor-spesifikk epitop fra DBA/2-derivert P815 mastocytom cellelinje. Lymfocytter høstet fra kulturene etter fem dager viste sterk cytotoksisk T-lymfocyt (CTL)-aktivitet mot P815 tumorceller in vitro, mens mislyktes i å lysere P1024, en mutant cellelinje av P815 som ikke uttry-ker Pl A.35-43, som vist i figur 3, panel A. Når disse CTL'ene ble injisert i DBA/2-mus tidligere inokulert med P815-celler tre dager tidligere, vokste tumorene uforhindret den første uken, men ble deretter eliminert i løpet av den neste uken, som vist i fig. 3, panel B. Spesifisitet ble demonstrert ved fraværet av enhver effekt på P815-vekst når CTL'er ble immunisert in vitro mot et ikke-relevant antigen, slik som viralt nukleoproteinpep-tid, som vist i fig. 3, panel B. I oppsummering induserte største histokompatibilitetskompleks klasse I (L<d>)-transfektert Drosophila- celler normale DBA/2 - musemiltceller til å respondere til syngene P815 mastocytom tumor-spesifikke peptider in vitro i fraværet av tilsatte lymfokiner. Injeksjon av disse CTL'ene i DBA/2-mus som bærer P815 mastocytom førte til rask tumorregressjon (Wolfel et al., J. Exp. Med.
(1993) 178:489-495).
Humane studier in vitro
Humane CTL'er fra friske individer ble immunisert in vitro mot tyrosinase. Etter pri-mær stimulering med bare Drosophila- celler var spesifikk lysering av tyrosinase-bærende JY-celler lydelig ved alle CTL-effektor til JY-målforhold testet. Tyrosinase-spesifikke CTL'er fra friske individer ble indusert ved å benytte den fullstendige stimu-lerings/restimuleringsprotokollen og testet for deres evne til å drepe Malme 3M mela-nomcellelinjen. Med et eller to mulige unntak, ble spesifikk CTL-aktivitet mot Malme 3M indusert i alle donorer i en varierende grad. For det meste var reaktivitet mot kontroll Malme 3-tumorceller minimal. Celler fra melanompasienter ble også immunisert in vitro mot tyrosinaseepitopen for å generere CTL'er av lignende aktivitet og spesifisitet for dem derivert fra friske frivillige.
Anvendelsen av et hvert naturlig, eller kunstig antigenpresenterende celle (APC)-system for å generere cytotoksiske T-lymfocytter in vitro er begrenset ved antigenspesifisitete-ne disse systemene er i stand til å generere.
Følgende APC-systemer har blitt benyttet for å generere antigen-spesifikke CTL'er til enkle epitoper: 1) humane dendrittceller (DC) pulsert med definerte peptider; 2) perife-riske mononukleære blodceller (PBMCer) som har blitt drevet til lymfoblaster og pulsert med peptider; 3) lymfoblastoidceller (LCL) hvor de naturlige peptidene er syre-strippede og lastet med peptidene av interesse; 4) Drosophila- celler konstruert til å uttrykke tomme klasse I-molekyler; og muse 3T3-celler transfektert med human klasse I og ko-stimulatoriske molekyler (J.B. Latouche og M. Sadelain, Nature Biotech (2000) 18:405-409).
Dendrittceller (DC'er) er betraktet som det primære antigenpresenterende cellesystemet i mennesker på grunn av deres brede anvendelse i å presentere primære antigenceller. Egne eller fremmede proteiner er prosessert i en DC. De resulterende peptidepitopene er presentert ved HLA-molekyler, og er transportert til overflaten av DCen. Imidlertid ble det funnet at DC'er ikke konsekvent ville generere irt vitro CTL'er rettet mot fire ulike peptider. Dette ville ha tilveiebragt CTL'er som har aktivitet som korresponderer til hver av de fire peptidene. I tillegg, ble det også funnet at fenotypen av DCen ved tidspunktet av peptidpulseringen, moden eller umoden, ikke hadde noen effekt på resultatet.
Alternativt, resulterte Z)rørø/?Ma-cellestimulering vanligvis i CTL'er rettet mot opp til ti ulike typer av peptider. Dette tilveiebringer CTL'er som er aktive for hver av de ti peptidene.
Evnen av Drosophila- celler og DC til å frembringe CTL-responser ble evaluert, til å begynne med til en enkel peptidepitop ved å følge standard stimuleringsprotokoller for hver. For å sammenligne DCer og transfekterte Drosophila- celler. Umodne DCer ble laget ved å dyrke autologe monocytter i en uke under tilstedeværelsen av IL-4 og GM-CSF. Modne DCer ble oppnådd fra umodne DCer ved å tilsette TNFa til dyrk-ningsmediumet 24 timer før høstingen. DCer (umodne og modne) ble høstet, pulsert med peptider og blandet med rensede CD8-celler ved å følge prosedyren benyttet for stimuleringen av CD8-celler og peptid-pulserte Drosophila- celler. Drosophila- celler ble funnet til å generelt være bedre stimulatorer enn DC når evaluert for tyrosinasepeptide-pitop 689, som vist i fig. 7. Videre, var DCer som fremviste enten den umodne eller modne fenotypen (fig. 8) ikke så effektive som Drosophila- celler i å frembringe spesifikke CTL-responser når definerte peptider ble benyttet til å pulsere APCene. Dette er spesielt overraskende på grunn av den dominante rollen som spilles av DCer i immunsystemet. En sammenligningsstudie med en donor ble utført, som vist i fig. 9. Spesifikk avlivning ble generert mot fire ulike peptider når det ble benyttet flueceller som stimulatorer, mens umodne DCer resulterte i marginal spesifikk avlivning, og modne DCer resulterte i spesifikk avlivning mot bare et av fire peptider benyttet for stimulering.
Preparering av cytotoksiske l<y>mfoc<y>tter
CD8+-celler isolert fra leukafereseprøver med positiv seleksjon med anti-CD8-antistoff er stimulert mot fire ulike melanomassosierte peptider presentert ved Drosophila- celler som uttrykker human klasse I-molekyler (HLA-A2.1), B7.1, ICAM-1, LFA-3 og B7.2. CD8+-celler er re-stimulert i to runder med autologe monocytter lastet med peptidepitopene under tilstedeværelsen av IL-2 og IL-7. CTL'er er ikke-spesifikt ekspandert med OKT3 og IL-2. CTL-aktivitet er målt mot Malme 3M-celler og renhet av CD8+-T-celler er bestemt ved flowcytometri.
Produsentens prosesser og protokoller er fulgt i henhold til Good Laboratory Practices og Good Manufacturing Practices. "Good Laboratory Practices" og "Good Manufacturing Practices" er standarder av laboratorie- og produksjonspraksis som er fastsatt av United States Food and Drug Administration, og er vel kjent for dem med dyktighet innen faget. CTL'ene er monitorert for identitet, viabilitet, CTL-aktivitet, sterilitet og endotoksininnhold.
En liste av peptidepitoper egnet for anvendelse i fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen, hvor nevnte cancer er bryst- og ovarialcancere, er vist i etterfølgen-de tabell 1.
EKSEMPEL 1
Produksjon av JPrøsøpfø/a-antigenpresenterende celler
Schneider S2-cellelinjen ble preparert fra Drosophila melanogaster (Oregon-R) egg i henhold til publiserte prosedyrer og har blitt anbragt med American Type Culture Col-lection (CRL 10974). S2-cellene er dyrket i kommersielt Schneider's Drosophila-medium supplementert med 10% fetalt bovint serum.
pRmHa-3-plasmidvektoren for å uttrykke MHC klasse I og ko-stimulatoriske proteiner i S2-celler ble derivert fra pRmHa-1-ekspresjonsvektoren konstruert som beskrevet i lit-teraturen. Den inneholder en metallotioneinpromoter, metallresponskonsensussekvenser og et alkoholdehydrogenasegen som bærer et polyadenyleringssignal isolert fra Drosophila melanogaster.
Komplementære DNA ' er for transfeksjon ble preparert som følger:
HLA- A2. 1 og p- 2 mikro<g>lobulin: Revers transkripsjon-PCR fra K562-celler ved bruk
av primere utledet fra den publiserte sekvensen.
B7. 1: Revers transkripsjon-PCR fra K562-celler ved bruk av primere utledet fra
den publiserte sekvensen.
ICAM- 1: Revers transkripsjon-PCR fra K562-celler ved bruk av primere utledet fra
den publiserte sekvensen.
B7. 2: Revers transkripsjon-PCR fra HL-60-celler (ATCC CCL-240) ved bruk av primere utledet fra den publiserte sekvensen.
LFA- 3: Revers transkripsjon-PCR fra HL-60-celler (ATCC CCL-240) ved bruk
av primere utledet fra den publiserte sekvensen.
Komplemtære DNA'er ble individuelt satt inn i pRmHa-3-vektoren. S2-celler ble transfektert med en blanding av HLA-A2.1, B7.2 og ICAM-1-plasmid-DNA'er og phshneo-plasmidet ved å benytte kalsiumfosfatpresipitasjonsmetoden. Stabilt transfekterte celler ble valgt ut ved dyrking i Schneider's medium som inneholdt geneticin. 24 timer før anvendelse ble ekspresjon av de transfekterte genene indusert ved tilsetning av Q1SO4. Nivået av ekspresjon ble testet ved flowcytometri ved å benytte anti-HLA-A2.1, anti-B7.1 og anti-ICAM-1-antistoffer. HLA-ekspresjon ved større enn 30% av cellene er nødvendig for effektiv in vitro aktivering av CD8+-lymfocytter.
Isolering av humane CD8 +- celler
CD8+-celler er isolert fra leukafereseprøver ved positiv seleksjon ved å benytte Dyna-beads™ isolasjonsprosedyren (Dynal). Et anti-humant CD8-musemonoklonalt antistoff (50 ug/ml i humant gammaglobulin [Gammagard®]) er tilsatt til vaskede celler i Dul-becco's PBS supplementert med 1% humant serumalbulin (Baxter-Hyland) og 0,2% Na-sitrat. Etter inkubering ved 4°C i 45 minutter med forsiktig blanding, er cellene vasket og resuspendert i den samme bufferen som inneholder Dynal magnetiske kuler (Dy-nabeads™) belagt med sau anti-mus IgG ved et kule-til-celleforhold på 1:1. Cellene og kulene er plassert i et sterilt rør og forsiktig blandet ved 4°C i 45 minutter. Ved slutten av denne tidsperioden er antistoff-bundede celler fjernet magnetisk ved å benytte MPC-1 ©-separatoren i henhold til produsentens instruksjoner (Dynal). Dissosiasjon av CD8-celle-kulekomplekset er oppnådd ved inkubering ved 37°C i 45 minutter under tilstedeværelsen av CD8-peptid59-70(AAEGLDTQRFSG; SEK ID NO. 12). Frie kuler er fjernet magnetisk og CD8-cellene er tellt og analysert ved flowcytometri for å evaluere renhet. Gjenvinning av CD8+-celler er vanligvis større enn 80%. Tabell 1 oppsummerer cellesammensetningen for 14 separate CD8+-preparater fra normale humane PBMC-preparater ved positiv seleksjon med anti-CD8-antistoff.
In vitro immunisering av rensede humane CD8+-celler
Primærstimulerins
Transfekterte Drosophila S2-celler er inkubert i Schneider's medium (IO<6>celler/ml) supplementert med 10% fetalt kalveserum og CuSCUved 27°C i 24 timer. Celler er høs-tet, vasket og resuspendert i insekt X-press medium (BioWhittaker) som inneholder 100fig/ml human tyrosinase369-377. Etter inkubering ved 27°C i 3 timer, er S2-cellene blandet med CD8+-celler ved et forhold på 1:10 i RPMI-medium (Gibco) supplementert med 10% autologt serum. Celleblandingen er inkubert i 4 dager ved 37°C og Drosophi-/a-cellene vil dø i løpet av denne perioden. På dag 5, er IL-2 (20 U/ml) og IL-7 (30 U/ml) tilsatt for å selektivt ekspandere den tyrosinase-spesifikke CTL-populasjonen.
Re - stimulering
Frosne, autologe CD8-reduserte PBMCer oppnådd ved tidspunktet av leukaferese, er tint, vasket og re-suspendert med IO<6>celler/ml i RPMI-medium som inneholder 10% autologt serum (som en kilde for |52-mikroglobulin) og 20 ug/ml tyrosinase369-377- Etter y-stråling (5000 rad) er cellene inkubert ved 37°C i 2 timer. Ikke-adherente celler er fjernet ved vasket med Dulbecco's PBS. Adherente monocytter er lastet med tyrosinaseepitopen ved inkubering i 90 minutter i Hepes-bufret RPMI-medium som inneholder 10% autologt serum og 10 ug/ml tyrosinase369-377. Supernatanten er fjernet og den Drosophila- aktrverte CD8+-cellesuspensjonen (3x10<6>celler/ml i RPMI-medium med 10% autologt serum) er tilsatt ved et forhold på 10 CD8+-celler til 1 adherent monocytt. Etter 3 til 4 dagers dyrking ved 37°C, er IL-2 (20 U/ml) og IL-7 (30 U/ml) tilsatt med en end-ring av medium for selektivt å ekspandere den tyrosinase-spesifikke CTL-populasjonen.
Ikke - spesifikk ekspansjon
Effektorceller er ikke-spesifikt ekspandert ved å dyrke dem i RPMI-medium supplementert med autologt serum, anti-CD3 monoklonalt antistoff (OKT®3), IL-2 og y-bestrålte autologe PBMCer.
Test for aktivitet og renhet
CTL - test
Malme 3M-celler er benyttet som målceller i en<51>Cr-frigjøringstest. 5x10<6>Malme 3M-celler i RPMI-medium som inneholder 4% fetalt kalveserum, 1 % HEPES-buffer og 0,25% gentamycin er merket ved 37°C i 1 time med 0,1 mCi51 Cr. Celler er vasket fire ganger og fortynnet til 105 celler/ml i RPMI i 10% fetalt bovint serum (HyClone). I en 96-brønners mikrotiterplate er 100 ul effektor-CTL'er og 100 ml peptid-lastede<51>Cr-merkede Malme 3M målceller kombinert ved forhold på 100:1, 20:1 og 4:1 (effek-tonmål). K562-celler er tilsatt ved et forhold på 20:1 (K562:Malme 3M) for å redusere bakgrunnslysering ved naturlige dreperceller. Ikke-spesifikk lysering er fastsatt ved å benytte ikke-tumor HLA-A2.1 fibroblastcellelinjen, Malme 3. Kontroller for å måle spontan frigjøring og maksimal frigjøring av 51 Cr er inkludert i duplikat. Etter inkubering ved 37°C i 6 timer, er platene sentrifugert og supernatantene tellt for å måle 51 Cr-fri<g>jøring.
Prosent spesifikk lysering er kalkulert ved å benytte den følgende formelen:
Flowcytometri
CD8+-celle før og etter in vitro aktivering, ble analysert for et antall av celleoverflate-markører ved å benytte fluorescerende monoklonale antistoffer og FACS-analyse. Re-sultater fra en typisk aktiveringsprotokoll ved å benytte celler fra en frisk donor er vist i tabell 2.
I tillegg til aktivitet og renhet, vil CTL-preparater bli testet for sterilitet og endotoksininnhold.
REAGENSER
CELLELINJER
EKSEMPEL 2
Forsøk på cytotoksiske T-celleinfusjoner mot melanom
Prosedyre for forsøk
Dette eksemplet belærer effektiviteten av cytotoksiske T-celleinfusjoner i behandlingen av melanom som fastsatt i henhold til følgende faktorer: 1. sikkerhet og toleranse av re-infuserte autologe CTL'er etter in vitro immunisering; 2. kinetikk for infuserte CTL'er i den systemiske sirkulasjonsfaktoringen i å be-grense fortynningsanalyse; 3. hel kropp disposisjon av CTL'er ved radioscintografi; 4. cellesammensetning av moduler fra biopsi ved immunohistologi (CTL'er, TH,
NK, B celler); og
5. regressjon av målbare skader og varighet av respons over to måneder.
Pasientpopulasjoner
Kvalifikasjon forbehandling krevde pasienter som hadde histologisk dokumenterte ikke-opererbare malign melanom som var målbar eller evaluerbar, og HLA-A2 haplotypen. Evaluering før behandling inkluderte radiologisk evaluering av hjernen ved MRI eller CT-scan, CT-scanning av brystet og abdomen, og fysisk undersøkelse, spesielt av huden og lymfeknutene. Det totale antallet av pasienter behandlet var 15 (9 menn og 6 kvinner). Alder varierte fra 33 til 75 år med et gjennomsnitt på 58 år. Gjennomsnittlig varighet av metastatisk sykdom var 1,5 år. En hudprøve før behandling for å bestemme hvor vidt en tilstand av anergi eksisterte ble utført på 14/15 pasienter med 5/14 som testet negativt for alle syv av de alminnelige antigenene evaluert. Pasienter ble screenet for HLA-A2 haplotypen ved FACS-analyse med et HLA-A2 spesifikt monoklonalt antistoff (BB7.2). Subtyping ble utført ved PCR-analyse. Alle, med unntak av en av pasientene var HLA-A<*>0201, unntaket (pasient 08) var HLA-A<*>0205.
Behandling med ekx vivi genererte autologe CTL ' er
15 pasienter ble behandlet med denne kliniske protokollen. Alle pasienter mottok minst en enkel infusjon av autologe CTL'er. Antallet av sykluser og dosen av celler administrert til hver pasient er oppsummert i tabell 1. Antallet av celler generert in vitro var avhengig av pasient-relaterte faktorer slik som antallene av PBMCer isolert fra afare-seprosedyren og antallet av CD8+ T-celler tilstede i hvert PBMC-preparat. Siden alle av cellene generert in vitro var re-infusert til donoren, var doser administrert til hver pasient nødvendigvis varierte. I et forsøk på å normalisere dosene mellom pasienter, ble en kalkulert "potens" skåring registrert for hver dose. Verdien ble oppnådd ved å multipli-sere det totale antallet av celler med den lytiske aktiviteten oppnådd med peptid-lastede målceller. Doser av T-celler infusert varierte fra et minimum på 7xl0<7>(pasient 08) til et maksimum på 3,2xl0<9>(pasient 13). Pasienter gikk inn i en andre, tredje eller fjerde syklus av behandling basert på deres kliniske status ved slutten av hver syklus. Antallet av PBMCer oppnådd fra afareseprøvene hadde en tendens til å være lavere hos pasienter som gjennomgikk ytterligere sykluser, spesielt om begynnelsen av den påfølgende syklusen var nær slutten av den foregående. Dette er tilskrevet vedvarende lymfopeni på grunn av IFNa-2b administrert i løpet av den foregående syklusen. Det totale antallet av naive CD8+ T-celler isolert var avhengig av prosentandelen i hvert av PBMC- preparatene. Prosenten av CD8+ T-celler varierte mellom 8% til 31% blant pasientene. Den oppnådde ekspansjonsfaktoren bidro også til de endelige celleantallene og varierte fra 0,1-6,0 ganger. Prosedyren for å generere CTL'er ex- vivo er beskrevet i spesifikasjonen og eksempel 1, ovenfor.
Oppregulering av klasse I og melanom - assosierte antigener i respons til IFNa - 2b
I et forsøk på å forsterke evnen av de antigen-spesifikke CTL'ene til å lysere melanomceller in vivo ble lav dose IFNa-2b administrert i fire etterfølgende dager før CTL-infusjonen, og tre ganger ukentlig i ytterligere fire uker. En måte å måle en in vivo respons til cytokinet er å evaluere biopsier oppnådd ved tidspunkter i serie ved immunohistokjemisk analyse for positiv farging med spesifikke antistoffer. Biopsier i serie ble oppnådd hos en pasient med multiple hudskader (pasient 04) for å evaluere både klasse I og antigenekspresjon. Biopsiene som indikerte klasse I og MART-1 ekspresjon var svakt positive før noen behandling (biopsi A). Etter fem dager med subkutane injeksjo-ner av 10 MU/m<2>ble en dramatisk økning av disse to markørene notert (biopsi B). For tyrosinase og gplOO var immunohistokjemisk farging hhv. negativ til svak positiv i prø-vene før behandling (biopsi A). Etter den initielle fem dagers IFNoc-dosen og tretten ytterligere behandlinger var ekspresjon av disse sistnevnte antigenene forsterket i de fargede vevsprøvene (biopsi C).
Anti<g>enspesifisitet for ex - vivo genererte CTL ' er
CTL'er generert fra alle pasienter ble evaluert på dagen av frigjøring mot peptid-lastede T2-mål, en HLA-A2-melanomcellelinje (Malme3M) og en autolog melanomlinje, om biopsimaterialet var tilgjengelig for å etablere en linje. Hver preparerte dose av celler ble evaluert for dens cytolytiske aktivitet. Peptid-lastede T2-celler som presenterer enten hvert peptid alene, eller alle fire pepidene samtidig, ble benyttet for å bestemme spe-sifisiteten av CTL-responsen generert for hver pasient. Evnen til å lysere endogent ut-trykte, melanom-assosierte, antigen-bærende celler ble bestemt med en HLA-A2 tilpasset linje eller en autolog tumorlinje. I tillegg til cytolytisk aktivitet ble antigen-spesifisitet evaluert med en etablert fremgangsmåte for å detektere intracellulær y-interferonproduksjon, laget i respons til en spesifikk peptidstimulus. CTL'ene generert ved slutten av ex- vivo protokollen ble evaluert ved denne fremgangsmåten. Prosentandelen av celler spesifikke for hvert av peptidene ble registrert individuelt. Det totale antallet av spesifikke celler i hver bulk CD8-kultur fra pasient 13 ble kalkulert ved å tilsette hver av peptidspesifisitetene detektert i den populasjonen av T-celler. En økning i det totale antallet av spesifikke celler kunne bli detektert med hver suksessive behand-lingssyklus.
Deteksjon av CD8 os CD4 celler som infiltrerer tumorbiopsier post - CTL - terapi Biopsiprøver fra alle pasienter før, i løpet av og etter behandling, ville ha vært det ideel-le. Imidlertid, tillater de eksperimentelle forholdene bare for biopsiprøver fra et begrenset antall av pasienter. Tumorvev ble oppnådd fra fem av de femten pasientene som deltok i studien. Hos to pasienter (pasienter 08 og 13) var biopsiprøver tilgjengelig ved hhv. 5 og 6 uker etter T-celleterapi. Undersøkelse av vevsprøvene viste tilstedeværelsen av både infiltrerende CD8- og CD4-celler. En av tumorprøvene ble tatt fra en hudskade i bakhoderegionen av skallen, som økte i størrelse ved tidspunktet av oppfølgingsunder-søkelsen, 4 uker etter den andre infusjonen av T-celler. Biopsien viste nekrose av vevet som var sterkt infiltrert av lymfocytter. Den andre biopsien var fra toppen av et lårben, fjernet under kirurgi for hofteutskifting. Hudskaden fra pasient 08 var sterkt positiv (4+) for både en generelle klasse I og en spesifikk HLA-A2-markør. Tyrosinase og gplOO var svakt positiv (hhv. 1+ og 2+), mens MART-1 var negativ i den samme prøven. Re-gioner av biopsien fra pasient 13 var også nekrotiske, med mer heterogen farging; dis-tinkte populasjoner av tumorceller som manglet ekspresjon av HLA-A2.1-molekylet, og en eller flere av MAA'ene. Imidlertid viste intakte vevsregioner sterk klasse I (4+), og alle av de melanom-assosierte antigenene. De lymfocyttiske infiltreringene i denne sistnevnte prøven viste seg å heller omgi tumornodulene enn å dypt infiltrere dem. Den høyeste prosentandelen av celler direkte assosiert med tumoren var imidlertid CD8-celler. Mangelen av biopsiprøver før behandling fra begge disse pasientene, hindret en bekreftelse av lignende typer av infiltrerende celler i vevsprøver før behandling.
CT - scanninser post - T - celleterapi bekrefter en objektiv respons
CT-scanninger var del av screeningskriteriene før behandlingen og oppfølgingsunder-søkelsesbehandlingen. Pasient 10 mottok en enkel infusjon av 8x10<8>CTL'er (7/27/99) 5 uker etter scanningen før behandlingen (6/23/99). Når en CT-scanning av brystet ble repetert en måned etter infusjonen (8/27/99), ble en dramatisk nedgang i størrelsen av en lungelesjon notert. På lignende måte, gjennomgikk pasient 14 en CT-scanning av bryst som del av innrulleringsprosessen (9/10/99), 3,5 uke før en første infusjon med 6,6xl0<8>celler (10/5/99). En oppfølgings-CT-scanning (1/7/99), en måned etter den andre infusjonen med 11,5x10<8>celler viste dramatisk sammenskrumping i tre separate lesjoner. Pasient 13 hadde også en objektiv respons som målt i pre- og post-CT-scanninger. Pa-ratrakeal adenopati gikk fra 7,8 cm<2>(før studiet) til 4,4 cm<2>etter syklus I, og forsvant etter syklus II.
Tilstedeværelse av en anersisk tilstand utelukket ikke evnen til å generere CTL ' er eller hindre en klinisk respons
De fleste av pasienten behandlet under denne protokollen hadde tidligere mottatt medi-sinsk intervensjon. En hudtest før behandling ble utført for å bestemme om en anergisk respons til et panel på 7 alminnelige antigener korrelerte med enten en manglende evne til å generere CTL'er ex- vivo, eller hindre en dokumentert klinisk respons. Evnen til å generere CTL'er ex- vivo korrelerte ikke med pasientens hudtestresultater før behandling. Det burde bli bemerket at pasienter 0,3 og 04 (begge blandede respondere) hadde gjentatte hudtester før begynnelsen av den andre syklusen og forble anergiske.
EKSEMPEL 3
Generering av HER-2/neu spesifikke CTL'er i stand til å lysere bryst og ovariale tumorceller
Vi var interessert i å benytte vår CTL-genereringsteknologi på andre tumortyper for å bestemme om alle former av cancer kan bli målrettet med denne metoden. HER-2/neu er et proto-onkogen med homologi til EGFR som er amplifisert og overuttrykt i mange humane cancere, hovedsakelig adenokarcinomer i bryst, ovarie og kolon. Det er ofte assosiert med aggressiv sykdom og kan være en indikator for dårlig prognose. Det har blitt studert i flere kliniske forsøk som et mulig mål for disse typene av cancer.
I de tidlige 1990 årene ble HER-2/neu HLA-A2.1 avgrensede peptidepitoper identifisert enten ved datamaskinassistert peptidbindingsalgoritmer eller ved å kartlegge CTL'er isolert fra ascites fra pasienter med ovarialcancer (tabell 3).
Alle peptidene ble syntetisert, gitt et identifikasjonsnummer (PRI#) og evaluert for evnen til å generere CTL'er ex- vivo ved å benytte den samme fremgangsmåten vi benyttet for melanom-assosierte, T-cellepeptidepitoper. CD8-celler ble isolert fra normaldonorer for å bestemme evnen til å rutinemessig generere CTL'er ex- vivo med Drosophila- celler lastet med kjente CTL-peptidepitoper. Peptider 826, 835, 861 og 863 hadde den høyeste frekvensen av CTL-generering (tabell 4).
Mens transfekterte Drosophila- celler hadde den unike evnen til å presentere opptil 10 ulike peptidepitoper (fig. 10), valgte vi de fire HER-2-peptidene 826, 835, 861 og 863 på grunn av frekvensen til å generere CTL'er til disse peptidene ex- vivo. Disse fire ulike HER-2-peptidene representerer svake til moderate bindere til HLA-A2.1-molekylet presentert på overflaten av de transfekterte Drosophila- cellene. Vi tenderer til å inkludere A2-bindere som er svake, ettersom vår erfaring med melanom-assosierte peptider anty-der at svake klasse I-bindere generelt genererer sterke CTL'er som gjenkjenner tumorceller, om de riktignok representerer naturlige T-celleepitoper. Flesteparten av de tumor-assosierte proteinene som vi målretter er selv-antigener og slike vil være forventet til å ha den høye affiniteten for klasse I-molekylet som er sett med virale peptider. De lave til moderate binderene generere generelt CTL'er som lyserer tumorcellene svært effektivt. Dette ble demonstrert med MART-1-peptidet som er en binder av lav affinitet på Drosophila- cellene (fig. 3), enda den representerer en epitop som rutinemessig genererer sterke CTL'er i stand til å lysere både peptid-lastede målceller (T2), eller ennå viktigere melanomceller (Malme3M) (fig. 12).
HER-2/neu er et medlem av EGF-R-familien og fungerer som en vekstfaktorreseptor. HER-2-protein er uttrykt under fetal utvikling hos mennesker. Hos voksne, er proteine ne svakt påviselig i epitelceller i mange normale vev. I normale celler er HER-2-genet tilstede som en enkel kopi. Amplifisering av genet og/eller overuttrykk av det assosierte proteinet har blitt identifisert i mange humane cancere som inkluderer bryst, ovarie, livmor, mage og adenokarcinom i lunge. Forskjeller i sekvens mellom HER-2 og EGF-R-reseptor er notert i tabell 5. Tre av de fire HER-2-peptidene vi har evaluert har tre eller flere aminosyreendringer mellom de to proteinene. En enkel aminosyreendring er tilstrekkelig til å sjeldne mellom de to proteinene.
Med en gang CTL'ene hadde blitt generert etter den fire uker lange ex- vivo stimuleringsprotokollen evaluerte vi hvorvidt peptidspesifikke celler var tilstede ved å benytte HLA-A2.1 tetramere molekyler preparert med de immuniserende peptidene. Som de monstrert i fig. 13 var evnen til å generere peptid-spesifikke CTL'er donoravhengig. I panel A (donor 261), laget donoren en sterk CTL-respons til peptid 835 (37,55%). I panel 5 (donor 262), kan peptid-spesifikke CTL'er bli detektert med både 835 og 861 tetramere molekyler (hhv. 3,6% og 15,1%). Dette støtter anvendelsen av multiple peptider for å garantere peptid-spesifikke CTL'er med slutten av stimuleringsprotokollen. Denne ex- vivo protokollen tillater en å generere multippel-spesifikke CTL'er relativt enkelt.
Anti - peptid os anti - tumorresponser
Etter fullføringen av den fullstendige ex- vivo protokollen ble CTL'ene generert evaluert for antigen-spesifisitet. For å generere CTL'ene ble Drosophila- cellene på dag 0 lastet
med en kombinasjon av de fire HER-2-peptidene. Ved slutten av den fire uker lange ex-vivo stimuleringsprotokollen, ble CD8-bulkkulturen evaluert for antigen-spesifisitet. T2-celler lastet med hvert av de immuniserende peptidene ble benyttet som målceller. I fig. 14, er en typisk respons avbildet. Bulkkulturen inneholder spesifisitet for hvert av de fire HER-2-peptidene. Anti-tumorresponsen ble bestemt på en ovarial tumorcellelinje (ATCC; HTB-77). Når en målcellelinje ikke er HLA-A2.1-begrenset, transfekterte vi cellelinjen for å ha et +/- testsystem. Når HLA-A2.1 ble transfektert inn i HTB-77-linjen ble en forsterket avliving ved CD8-effektorceller notert (fig. 15, paneler A til D). HER-2-spesifikke effektorer som representerer de individuelle peptidene ble evaluert for å bekrefte presentasjonen av hvert av peptidepitopene på denne tumorcellelinjen.
En brystadenokarcinomcellelinje (ATCC; HTB-131), transfektert med HLA-A2.1 ble også evaluert for evnen til å demonstrere tumorlysering med de HER-2-spesifikke pep-tideffektorene. CTL'er spesifikke for peptid 861 kunne lysere denne tumorcellelinjen når transfektert med HLA-A2.1 (fig. 16).
IFNy - behandlins påkrevd for tumorlyserins
HTB-77/A2.1-cellelinjen krever en forhåndsbehandling med IFNy for å demonstrere peptid-spesifikk lysering. Cellene ble behandling med 500 U/ml av IFNy (spesifikk aktivitet på 25 ng/ml) i 24 timer før starten på<51>Cr-frigjøringstesten. I fig. 17, resulterte tilsetningen av IFNy i forsterket lysering av den HLA-A2.1 transfekterte cellelinjen. For å bestemme effekten av denne dosen av IFNy på overflateekspresjonen av både HLA-A2.1 og HER-2, ble en FACS analyse utført for å bestemme nivåene av disse molekylene etter både 24 og 48 timers induksjon. Figur 18, paneler A og B avbilder FACS-analyseresultatene. I panel A, var det ingen forsterking av HER-2-molekylet på overflaten til HTB-77-cellene ved 24 og 48 timer etter induksjon med IFNy. I de HLA-A2.1- transfekterte cellene demonstrerte verken HER-2 eller HLA-A2.1 en økning i overflate-nivå av ekspresjon etter en lignende behandlingsprotokoll. Det ble notert en økning i nivået av TAP-1-ekspresjon, så vel som HLA-DM og -DR, katepsin S og D og kaspase 5, når mRNA-nivåene ble evaluert ved microarray DNA chipanalyse (fig. 19). Dette vil forklare hvorfor det er forsterket avliving av HTB-77/A2.1-cellene under tilstedeværelsen av IFNy. En oppregulering av dette bestemte molekylet vil resultere i mer effektiv prosessering av HER-2-molekylet, som tillater bedre presentasjon av peptidene av interesse.
Peptider
Syntetiske peptider ble laget ved standard Fmoc-kjemi ved å benytte en peptidsyntetise-rer (Gilson Company, Inc.). Alle peptider ble renset til >95% renhet ved revers-fase HPLC på en C-8-kolonne. Renhet og identitet ble utført ved å benytte et massespektro-meter med elektrosprayionisering. Melanom-assosierte peptider inkluderte: peptid 819 var MART-1 spesifikk (AAGIGILTV SEK ID NO. 6), 817 og 853 var begge gplOO-peptider (hhv. TTDQVPFSV SEK ID NO. 4 og KTWGQYWQV SEK ID NO. 5), tyro-sinasespesifikke peptider var 689 og 792, hvor 792 representerer den post-translasjonelle modifiserte versjonen (YMDGTMSQV SEK ID NO. 2) av den naturlige sekvensen (YMNGTMSQV SEK ID NO. 1) representert ved peptid 689. Peptider 826 (CLTSTVQLV SEK ID NO. 7) og 835 (KIFGSLAFL SEK ID NO. 8) representerte HER-2/neu-sekvensene fra hhv. de intracellulære og ekstracellulære domenene av pl 85-proteinet. Pec6020(ALALAALLVV SEK ID NO. 10) Pec6025(ALLWDREV SEK ID NO. 11) var overlappende sekvenser som representerte et mucinaktig protein detektert i ovariale tumorlinjer. C-lektin var også et protein detektert i ovariale tumorcellelinjer og et peptid fra dets sekvens (C-lektin8) er representert ved KMASRSMRL SEK ID NO. 9.
In vitro cvtotoksisitetstest
Standard<51>Cr-frigjøringstester ble utført for å bestemme CTL-effektorcellegjenkjenning av melanom-assosierte peptidepitoper lastet på T2-celler. Høstede 3x10<6>T2-celler ble dyrket i RPMI + 10% FBS (medium). 0,1 mCi av<51>Cr ble tilsatt og inkubert ved 37°C i et vannbad. Merkede celler ble tilsatt til 10 ml av 4% vaskeløsning (RPMI + 4% FBS) og sentrifugert til pellet. Vasket ytterligere to ganger og resuspendert i medium til en sluttkonsentrasjon på 0,2 x 10<6>/ml for å registrere radioaktivitet hos spontant versus detergent lyserte celler. Cellene ble pulsert med hensiktsmessig peptid(er) ved 20 ug/ml i 30 minutter. 50 ul ble tilsatt til hver 96-brønners plate som hver inneholdt CD8-effektorceller ved 10,2, 0,4 og 0,08 x lOVml, som ble inkubert ved 37°C i 6 timer, sentrifugert ned og høstet for supernatant.
Flowcytometri os tetramerfarsins
Cellene ble merket med FITC- eller PE-konjugerte monoklonale antistoffer ved inkubering ved 4°C i 30 minutter i FACS-buffer (1% BSA, 0,02% NaN3i PBS), etterfulgt ved vasking i den samme bufferen. Celler ble fiksert i 0,5% formaldehyd før ervervelse av
data og analyse på et FACScan flowcytometer (Becton Dickinson) med dens CellQuest programvare. Ikke-spesifikk farging ble målt med det samme sekundære antistoffet benyttet for å merke rensede primære antistoffer, eller en isotype-tilpasset kontroll når de primære antistoffene var direkte merket. Tetramer farging ble utført med HLA-A2.1-spesifikke HIVgag-tetramere molekyler (Beckman Coulter) som inneholder sekvensen SLYVTVATL SEK ID NO. 43 som en negativ kontroll. HER-2-spesifikke tetramere ble laget med sekvensene CLTSTVQLV (826 SEK ID NO. 7), KIFGSLAFL (835 SEK ID NO. 8), eller VM AG VGF SP YV (861 SEK ID NO. 16) peptider. PE-merkede tetramere HLA-A2.1-peptidkomplekser ble benyttet i konjunksjon med fluoresceinisotio-cyanat (FITC)-merkede anti-humane CD8a (BD PharMagin) monoklonale antistoffer for å farge epitop-spesifikke CD8+ T-celler som beskrevet i pakningsvedlegget. Prøver ble analysert ved to-fargeflowcytometri på en Becton Dickenson FACScan, og slusede CD8+ T-celler ble undersøkt for farging med tetramere HLA-A2.1-peptidkomplekser.
EKSEMPEL 4
Generering av ytterligere bryst- og ovariespesifikke CTL'er med denne ex- vivo stimuleringsprotokollen
Vi har demonstrert evnen til å generere CTL-responser til alle kjente HLA-A2.1-begrensede peptidepitoper for flere tumorantigener av ulik tumoropprinnelse. Våre førs-te studier fokuserte på melanom hvor vi var i stand til å demonstrere objektive kliniske responser hos pasienter behandlet med CTL'er spesifikke for fire ulike peptidepitoper spesifikke for MART-1, gplOO og tyrosinasemelanom-assosierte proteiner [Richards et al., Amer. Soc. Clin. Oncol, San Francisco, California (2001, mai)].
For å utvide evnen til å fremkalle CTL'er for andre tumorantigener tilstede i et stort utvalg av andre cancere har vi valgt publiserte og nye sekvenser for tumorantigener alminnelige for flere ulike tumortyper. Disse inkluderer AES, MUC-1, CEA, FBP, C-lektin, NY-ESO-1, Pec60, CA-125, MAGE-3, telomerase og G250. Tabell 7 beskriver disse antigenene, frekvensen av ekspresjon og cancerene som uttrykker dem. Frekvensen av respons til disse peptidene med vår ex- vivo stimuleringsprotokoll er listet opp i tabell 6.

Claims (19)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en sammensetning som inneholder cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer) for behanding av et individ med cancer,karakterisert vedat den omfatter: a. preparere ikke-naturlig forekommende antigen-presenterende celler (nnAPCer), hvor nevnte nnAPCer simultant presenterer 4 til 10 forskjellige peptidmolekyler assosiert med nevnte cancer, hvor nevnte peptidmolekyler er hver omkring 6 til 12 aminosyrer i lengde; b. stimulere CD8+ T-celler fra et individ eller en passende donor med nevnte nnAPCer; c. ekspandere nevnte CD8+ T-celler ved å tilsette de stimulerte CD8+ T-cellene til medium som inneholder kondisjonert vekstmedium (CGM) eller en eller flere cytokiner valgt fra gruppen som består av IL-2 og IL-7; d. preparere en suspensjon av perifere blodmonocytter, eller CD-8-reduserte perifere blodmonocytter fra nevnte individ eller nevnte passende donor og omkring 1 til 50 ug/ml av nevnte 4 til 10 forskjellige peptidmolekyler; e. bestråle nevnte suspensjon med en tilstrekkelig dose av y-stråling nødvendig for å sterilisere alle komponenter i suspensjonen, og forhindre proliferering av nevnte perifere blodmonocytter eller CD-8-reduserte perifere blodmonocytter; f. isolere adherente perifere blodmonocytter eller adherente CD-8-reduserte perifere blodmonocytter; g. laste nevnte adherente perifere blodmonocytter eller adherente CD-8-reduserte perifere blodmonocytter med omkring 1 ug/ml til 50 ug/ml av hvert av nevnte 4 til 10 peptidmolekyler; h. re-stimulere nevnte ekspanderte CD8+ T-celler med nevnte peptid lastede adherente perifere blodmonocytter eller peptid lastede adherente CD-8-reduserte perifere blodmonocytter ved et forhold på omkring 10 CD8+ T-celler til en perifer blodmonocytt eller en CD-8-redusert perifer blodmonocytt; og i. innsamle nevnte re-stimulerte CD8+ T-celler for derved å fremstille en sammensetning som inneholder CTLer for behanding av et individ med cancer.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte nnAPCer presenterer 10 peptidmolekyler.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte peptidmolekyler er omkring 8 til 10 aminosyrer i lengde.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte peptidmolekyler er i et konsentrasjonsområde på omkring 10 nM til 100 uM.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte ene eller flere cytokiner er IL-2.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte ene eller flere cytokiner er en kombinasjon av IL-2 og IL-7.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat dosen av y-stråling er omkring 3000 til 7000 rad.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat dosen av y-stråling er omkring 5000 rad.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat trinn h omfatter å re-stimulere nevnte ekspanderte CD8+ T-celler i omtrent 6 til 7 dager og nevnte re-stimulerte CD8+ T-celler blir undersøkt for passende CTL aktivitet, renhet, sterilitet og innhold av endotoksiner.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat hvert peptid er omkring 8 til 10 aminosyrer i lengde.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte cancer er melanoma.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert vedat nevnte peptidmolekyler er avledet fra kreftassosierte antigener valgt fra gruppen bestående av: tyrosinase, gplOO og MART-1.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat nevnte peptidmolekyler er valgt fra gruppen bestående av: Tyrosinase369-377 YMNGTMSQV (SEK ID NO: 1), Tyrosinase369-377 YMDGTMSQV (SEK ID NO:
2), Tyrosinase207-2i6FLPWE LFLL (SEK ID NO: 3), gpl00209-2i7 ITDQVPFSV (SEK ID NO:4), gplOOi54-162KTWGQYWQV (SEK ID NO: 5) og MART-l27-35AAGIGILTV (SEK ID NO:6).
14. Ikke-naturlig forekommende antigen-presenterende celle (nnAPC),karakterisert vedat den er avledet fra Drosophila melanogaster- celler transfektert med nukleinsyrer som uttrykker human klasse I HLA-molekyler, bindings molekyler og ko-stimulatoriske molekyler, hvor nevnte nnAPC simultant presenterer 4 til 10 forskjellige peptidmolekyler assosiert med cancer.
15. Ikke-naturlig forekommende antigen-presenterende celle nnAPC ifølge krav 14,karakterisert vedat nevnte nnAPC simultant presenterer 4 til 10 forskjellige peptidmolekyler valgt fra gruppen bestående av: Tyrosinase369-377 YMNGTMSQV (SEK ID NO: 1), Tyrosinase369-377 YMDGTMSQV (SEK ID NO: 2), Tyrosinase207-2i6 FLPWE LFLL (SEK ID NO: 3), gpl00209-2i7ITDQVPFSV (SEK ID NO:4), gpl00i54-i62 KTWGQYWQV (SEK ID NO: 5), and MART-l27-35 AAGIGILTV (SEK ID NO:6), HER-2/neu789-797 CLTSTVQLV (SEK ID NO: 7), HER-2/neu369-377 KIFGSLAFL (SEK ID NO: 8), HER-2/neu48-56HLYQGCQVV (SEK ID NO: 13), HER-2/neu650-658 PLTSIISAV (SEK ID NO: 15), HER-2/neu773_782 VMAGVGSPYV (SEK ID NO: 16), HER-2/neu97i-979 ELVSEFSRM (SEK ID NO: 18), AESi28.i35GPLTPLPV (SEK ID NO: 19), MUC-l950-958STAPVHNV (SEK ID NO: 20), CEA57i-579 YLSGANLNL (SEK ID NO: 21), C- Lectin8.i6KMASRSMRL (SEK ID NO: 9), NY-ESO-li57-i65cSLLMWITQC (SEK ID NO: 24), NY-ESO-li57-i65v SLLMWITQV (SEK ID NO: 25), NY-ESO-li55-i63 QLSLLMWIT (SEK ID NO: 26), Pec6020-29AL AL AALL W (SEK ID NO: 10), Pec6025-33ALLVVDREV (SEK ID NO: 11), CA-125i57-i65YLETFREQV (SEK ID NO: 27), CA-125255-263VLLKLRRPV (SEK ID NO: 28), CA-125337-345GLQSPKSPL (SEK ID NO: 29), CA-125546-554ELYIPSVDL (SEK ID NO: 30), CA-12 5898-906 KALFAGPPV (SEK ID NO: 31), CA-1254i<M22FMWGNLTLA 315 (SEK ID NO: 32), MAGE-3271-279FLWGPRALV (SEK ID NO: 33), Telomerase54o-548ILAKFLHWL (SEK ID NO: 34), Telomerase865-873RLVDDFLLV (SEK ID NO: 35), og G25 0245-262 HL STAF AR V (SEK ID NO: 36).
16. Ikke-naturlig forekommende antigen-presenterende celle nnAPC ifølge krav 15,karakterisert vedat nevnte nnAPC simultant presenterer 4 til 10 forskjellige peptidmolekyler valgt fra gruppen bestående av: Tyrosinase369-377YMNGTMSQV (SEK ID NO: 1), Tyrosinase369-377YMDGTMSQV (SEK ID NO: 2), Tyrosinase207-2i6FLPWE LFLL (SEK ID NO: 3), gpl00209-2i7ITDQVPFSV (SEK ID NO:4), gpl00i54-i62KTWGQYWQV (SEK ID NO: 5) og MART-127.35AAGIGILTV (SEK ID NO:6).
17. Fremgangsmåte for å fremstille ikke-naturlig forekommende antigen-presenterende celle (nnAPC) som simultant presenterer 4 til 10 forskjellige peptidmolekyler,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter a. preparere en insektcellelinje fra Drosophila melanogaster- egg; b. dyrke nevnte insektcellelinje i et medium som er egnet for å dyrke insektceller, fortrinnsvis Schneider™ Drosophila- medium; c. lage et pRmHa-3-plasmid fra en pRmHa-1 -ekspresjonsvektor, hvor nevnte pRmHa-3 -plasmid inkluderer en metalotioneinpromoter, metallresponskonsen-sussekvens og et alkoholdehydrogasegen som bærer et polyadenyleringssignal isolert fra Drosophila melanogaster; d. sette inn i nevnte pRmHa-3-plasmid komplementært DNA for human klasse I HLA A2.1, B7.1, B7.2, ICAM-1, p-2 mikroglobulin og LFA-3, hvor A2.1 kan bli substituert med enhver human klasse I DNA-sekvens; e. transfektere nevnte insektceller med et phshneo-plasmid og nevnte pRmHa-3-plasmid som inneholder komplementært DNA; f. lage nnAPC ved å kontakte nevnte insektceller med C11SO4for å indusere ekspresjon av de transfekterte genene i nevnte insektceller; g. laste nnAPC med 4-10 forskejllige peptidmolekyler assosiert med kreft, slik at nnAPC simultant presenterer 4 til 10 forskjellige peptidmolekyler.
18. Fremgangsmåte ifølge krav 17,karakterisert vedat nevnte 4 til 10 peptidermolekyler er valgt fra gruppen bestående av: Tyrosinase369-377 YMNGTMSQV (SEK ID NO: 1), Tyrosinase369-377 YMDGTMSQV (SEK ID NO: 2), Tyrosinase207-2i6 FLPWE LFLL (SEK ID NO: 3), gpl00209-2i7ITDQVPFSV (SEK ID NO:4), gpl00i54-i62KTWGQYWQV (SEK ID NO: 5), and MART-l27-35 AAGIGILTV (SEK ID NO:6), HER-2/neu789-797 CLTSTVQLV (SEK ID NO: 7), HER-2/neu369-377 KIFGSLAFL (SEK ID NO: 8), HER-2/neu48-56HLYQGCQVV (SEK ID NO: 13), HER-2/neu65o-658 PLTSIISAV (SEK ID NO: 15), HER-2/neu773.782 VMAGVGSPYV (SEK ID NO: 16), HER-2/neu97i-979 ELVSEFSRM (SEK ID NO: 18), AESi28.i35 GPLTPLPV (SEK ID NO: 19), MUC-I950-958STAPVHNV (SEK ID NO: 20), CEA57i-579 YLSGANLNL (SEK ID NO: 21), C-Lectin8_i6 KMASRSMRL (SEK ID NO: 9), NY-ESO-li57-i65c SLLMWITQC (SEK ID NO: 24), NY-ESO-li57-i65v SLLMWITQV (SEK ID NO: 25), NY-ESO-li55-i63 QLSLLMWIT (SEK ID NO: 26), Pec6020-29AL AL AALL W (SEK ID NO: 10), Pec6025-33 ALLVVDREV (SEK ID NO: 11), CA-125i57-i65 YLETFREQV (SEK ID NO: 27), CA-125255-263 VLLKLRRPV (SEK ID NO: 28), CA-125337.345 GLQSPKSPL (SEK ID NO: 29), CA-125546-554 ELYIPSVDL (SEK ID NO: 30), CA-12 5898-906 KALFAGPPV (SEK ID NO: 31), CA-1254!4^22 FMWGNLTLA 315 (SEK ID NO: 32), MAGE-3271-279FLWGPRALV (SEK ID NO: 33), Telomerase54o-548ILAKFLHWL (SEK ID NO: 34), Telomerase865-873 RLVDDFLLV (SEK ID NO: 35) og G25 0245.262 HL STAF AR V (SEK ID NO: 36).
19. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte peptidmolekyler i trinn (a) er valgt fra gruppen bestående av: Tyrosinase369-377 YMNGTMSQV (SEK ID NO: 1), Tyrosinase369-377 YMDGTMSQV (SEK ID NO: 2), Tyrosinase207-2i6 FLPWE LFLL (SEK ID NO: 3), gpl00209-2i7ITDQVPFSV (SEK ID NO:4), gpl00i54-i62 KTWGQYWQV (SEK ID NO: 5), and MART-l27-35 AAGIGILTV (SEK ID NO:6), HER-2/neu789-797 CLTSTVQLV (SEK ID NO: 7), HER-2/neu369-377 KIFGSLAFL (SEK ID NO: 8), HER-2/neu48-56HLYQGCQVV (SEK ID NO: 13), HER-2/neu65o-658 PLTSIISAV (SEK ID NO: 15), HER-2/neu773-782 VMAGVGSPYV (SEK ID NO: 16), HER-2/neu971-979 ELVSEFSRM (SEK ID NO: 18), AESi28-i35 GPLTPLPV (SEK ID NO: 19), MUC-I950-958STAPVHNV (SEK ID NO: 20), CEA571-579 YLSGANLNL (SEK ID NO: 21), C-Lectin8-i6 KMASRSMRL (SEK ID NO: 9), NY-ESO-li57-i65c SLLMWITQC (SEK ID NO: 24), NY-ESO-li57-i65v SLLMWITQV (SEK ID NO: 25), NY-ESO-li55-i63QLSLLMWIT (SEK ID NO: 26), Pec6020-29 AL AL AALL W (SEK ID NO: 10), Pec6025.33 ALLVVDREV (SEK ID NO: 11), CA-125i57-i65 YLETFREQV (SEK ID NO: 27), CA-125255-263 VLLKLRRPV (SEK ID NO: 28), CA-125337-345GLQSPKSPL (SEK ID NO: 29), CA-125546-554 ELYIPSVDL (SEK ID NO: 30), CA-12 5898-906 KALFAGPPV (SEK ID NO: 31), CA-1254!4^22 FMWGNLTLA 315 (SEK ID NO: 32), MAGE-327i-279FLWGPRALV (SEK ID NO: 33), Telomerase54o-548ILAKFLHWL (SEK ID NO: 34), Telomerase865-873 RLVDDFLLV (SEK ID NO: 35) og G250245-262HL STAF AR V (SEK ID NO: 36).
NO20033674A 2001-02-20 2003-08-19 Fremgangsmåte for fremstilling av en sammensetning for behandling av cancer,antigen-presenterende celle samt fremgangsmåte for fremstilling av antigen-presenterende celle NO334885B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27025201P 2001-02-20 2001-02-20
PCT/US2002/005748 WO2002065992A2 (en) 2001-02-20 2002-02-19 A cell therapy method for the treatment of tumors

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20033674D0 NO20033674D0 (no) 2003-08-19
NO20033674L NO20033674L (no) 2003-10-17
NO334885B1 true NO334885B1 (no) 2014-06-30

Family

ID=23030546

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20033674A NO334885B1 (no) 2001-02-20 2003-08-19 Fremgangsmåte for fremstilling av en sammensetning for behandling av cancer,antigen-presenterende celle samt fremgangsmåte for fremstilling av antigen-presenterende celle

Country Status (22)

Country Link
US (2) US20030077248A1 (no)
EP (3) EP2016930B1 (no)
JP (3) JP2006510567A (no)
KR (2) KR100971266B1 (no)
CN (1) CN1571834B (no)
AT (1) ATE396691T1 (no)
BR (1) BR0207399A (no)
CA (2) CA2438754C (no)
DE (1) DE60226853D1 (no)
DK (1) DK2016930T3 (no)
EA (1) EA013944B1 (no)
ES (2) ES2306771T3 (no)
HK (2) HK1058485A1 (no)
HU (1) HUP0402656A3 (no)
IL (3) IL157366A0 (no)
MX (1) MXPA03007503A (no)
NO (1) NO334885B1 (no)
NZ (1) NZ527683A (no)
PL (1) PL206976B1 (no)
PT (1) PT1377251E (no)
WO (1) WO2002065992A2 (no)
ZA (1) ZA200307327B (no)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7973137B1 (en) 1996-03-28 2011-07-05 Johns Hopkins University Cell compositions comprising molecular complexes that modify immune responses
US20030077248A1 (en) 2001-02-20 2003-04-24 Ann Moriarty Cell therapy method for the treatment of tumors
US20040071671A1 (en) * 2001-02-20 2004-04-15 Leturcq Didier J. Cell therapy method for the treatment of tumors
CA2440610C (en) * 2001-03-09 2011-07-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Induction of tumor immunity by variants of folate binding protein
AU2003230603A1 (en) * 2002-03-08 2003-09-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Controlled modulation of amino acid side chain length of peptide antigens
AU2003256506B2 (en) * 2002-07-12 2009-06-04 The Johns Hopkins University Reagents and methods for engaging unique clonotypic lymphocyte receptors
US20060051866A1 (en) * 2002-11-07 2006-03-09 Symonds Geoffrey P Means of producing and utilising a population of disease specific cytotoxic t-lymphocytes
CN1835679A (zh) * 2003-06-16 2006-09-20 国立大学法人九州大学 人源免疫活性细胞的制备方法
JP2005139118A (ja) * 2003-11-07 2005-06-02 Ortho Mcneil Pharmaceut Inc 腫瘍の治療のための細胞治療方法
US20100094560A1 (en) * 2006-08-15 2010-04-15 Prometheus Laboratories Inc. Methods for diagnosing irritable bowel syndrome
EP2084267B1 (en) 2006-09-26 2018-04-11 Cedars-Sinai Medical Center Cancer stem cell antigen vaccines and methods
US8871211B2 (en) 2006-09-28 2014-10-28 Cedars-Sinai Medical Center Cancer vaccines and vaccination methods
AU2007307206B2 (en) 2006-10-04 2016-02-11 Janssen Pharmaceutica, N.V. Preparation of inactivated artificial antigen presenting cells and their use in cell therapies
EP2328923B1 (en) 2008-09-02 2016-01-13 Cedars-Sinai Medical Center Cd133 epitopes
JP2010235611A (ja) * 2010-05-10 2010-10-21 Ortho Mcneil Pharmaceut Inc 腫瘍の治療のための細胞治療方法
US9029502B2 (en) 2010-12-20 2015-05-12 The Regents Of The University Of Michigan Inhibitors of the epidermal growth factor receptor-heat shock protein 90 binding interaction
WO2014127296A1 (en) * 2013-02-14 2014-08-21 Immunocellular Therapeutics, Ltd Cancer vaccines and vaccination methods
CN103667189B (zh) * 2013-09-24 2015-10-28 上海宇研生物技术有限公司 用于治疗肺癌的cd8毒性t淋巴细胞及其制备方法
SG11201702191YA (en) * 2014-09-17 2017-04-27 Univ Johns Hopkins Reagents and methods for identifying, enriching, and/or expanding antigen-specific t cells
WO2016196506A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Galena Biopharma, Inc. PEPTIDE VACCINE THERAPY FOR TREATMENT OF FRα-EXPRESSING TUMORS
MA45169A (fr) 2016-05-31 2019-04-10 Sellas Life Sciences Group Inc Thérapie vaccinale pour le traitement du cancer de l'endomètre et de l'ovaire
WO2017216768A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies And Therapies - A4Tec Dendrimer-derived artificial antigen, methods and uses thereof
WO2018026914A1 (en) * 2016-08-02 2018-02-08 Nantcell, Inc. Transfection of dendritic cells and methods therefor

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4530901A (en) 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4401756A (en) 1981-04-14 1983-08-30 Immunex Corporation Process for preparing human interleukin 2
US4407945A (en) 1981-04-29 1983-10-04 Immunex Corporation Constitutive production of interleukin 2 by a T cell hybridoma
US4473642A (en) 1981-04-29 1984-09-25 Immunex Corporation Constitutive production of interleukin 2 by a T cell hybridoma
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4992367A (en) 1986-05-12 1991-02-12 Hoffmann-La Roche Inc. Enhanced expression of human interleukin-2 in mammalian cells
US5229115A (en) 1990-07-26 1993-07-20 Immunex Corporation Adoptive immunotherapy with interleukin-7
US5637483A (en) 1991-10-04 1997-06-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Irradiated tumor cell vaccine engineered to express GM-CSF
US5583031A (en) 1992-02-06 1996-12-10 President And Fellows Of Harvard College Empty major histocompatibility class II heterodimers
US5314813A (en) 1992-02-19 1994-05-24 Scripps Research Institute Drosophila cell lines expressing genes encoding MHC class I antigens and B2-microglobulin and capable of assembling empty complexes and methods of making said cell lines
CA2069541C (en) 1992-05-26 2005-02-01 Cornelis J. M. Melief Induction of an antigen-specific t-lymphocyte response
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5662907A (en) 1992-08-07 1997-09-02 Cytel Corporation Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in humans using synthetic peptide epitopes
US5487974A (en) * 1992-12-22 1996-01-30 Ludwig Institute For Cancer-Research Method for detecting complexes containing human leukocyte antigen A2 (HLA-A2) molecules and a tyrosinase drived peptide on abnormal cells
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US5820866A (en) 1994-03-04 1998-10-13 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for T cell regulation
US5585461A (en) * 1994-03-24 1996-12-17 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated, MAGE-3 derived peptides which complex with HLA-A2 molecules and uses thereof
US5874560A (en) 1994-04-22 1999-02-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods
US5968753A (en) 1994-06-14 1999-10-19 Nexell Therapeutics, Inc. Positive and positive/negative cell selection mediated by peptide release
US5595881A (en) 1994-08-09 1997-01-21 Anergen, Inc. Method for the detection of antigen presenting cells
US5827642A (en) * 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US5843648A (en) * 1995-01-10 1998-12-01 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services P15 and tyrosinase melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods
US5645837A (en) 1995-01-17 1997-07-08 Thomas Jefferson University Peptides that inhibit T cell activation and methods of using the same
ATE240119T1 (de) 1995-03-08 2003-05-15 Scripps Research Inst Antigen präsentierendes system und aktivierung von t-zellen
US5759783A (en) * 1995-03-14 1998-06-02 Ludwig Institute For Cancer Research Method of screening for cancer by detecting messenger RNA for a MAGE-XP gene
US5587289A (en) 1995-03-14 1996-12-24 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules which are members of the MAGE-Xp family and uses thereof
US5695760A (en) * 1995-04-24 1997-12-09 Boehringer Inglehiem Pharmaceuticals, Inc. Modified anti-ICAM-1 antibodies and their use in the treatment of inflammation
US5985270A (en) 1995-09-13 1999-11-16 Fordham University Adoptive immunotherapy using macrophages sensitized with heat shock protein-epitope complexes
CA2247131A1 (en) 1996-03-04 1997-09-12 Targeted Genetics Corporation Modified rapid expansion methods ("modified-rem") for in vitro propagation of t lymphocytes
US6355479B1 (en) * 1996-05-23 2002-03-12 The Scripps Research Institute MHC class II antigen-presenting systems and methods for activating CD4+ T cells
CA2318987A1 (en) * 1998-01-26 1999-07-29 Genzyme Corporation Immune effector cell hybrids
WO1999054345A1 (en) 1998-04-21 1999-10-28 Thomas Jefferson University Cd8 antagonists
US6140050A (en) 1998-06-26 2000-10-31 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for determining breast cancer and melanoma by assaying for a plurality of antigens associated therewith
US6913749B2 (en) 1998-11-02 2005-07-05 Resistentia Pharmaceuticals Ab Immunogenic polypeptides for inducing anti-self IgE responses
DK1179176T3 (da) 1999-04-16 2006-08-07 Ortho Mcneil Pharm Inc Fremgangsmåde til detektion af antigenspecifikke T-celler
JP2001089389A (ja) 1999-07-22 2001-04-03 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 抗原特異的ｔ細胞の誘導剤
WO2001057068A1 (en) * 2000-02-01 2001-08-09 The Austin Research Institute Mucin-1 derived antigens and their use in immunotherapy
AU3823601A (en) * 2000-02-11 2001-08-20 Dana Farber Cancer Inst Inc Cytotoxic t lymphocytes activated by dendritic cell hybrids
US20030165483A1 (en) * 2000-07-10 2003-09-04 Ulrich Zimmermann Method for the modification of biological cells
US20030077248A1 (en) 2001-02-20 2003-04-24 Ann Moriarty Cell therapy method for the treatment of tumors

Also Published As

Publication number Publication date
JP5634415B2 (ja) 2014-12-03
EP1377251B1 (en) 2008-05-28
PL369971A1 (en) 2005-05-02
US9222071B2 (en) 2015-12-29
JP2010222352A (ja) 2010-10-07
NO20033674L (no) 2003-10-17
JP2012097117A (ja) 2012-05-24
EP2016930A3 (en) 2009-09-02
US20030077248A1 (en) 2003-04-24
HK1058485A1 (en) 2004-05-21
EA200300815A1 (ru) 2004-06-24
IL219223A0 (en) 2012-06-28
HK1208376A1 (en) 2016-03-04
BR0207399A (pt) 2004-10-26
EP1377251A4 (en) 2006-01-11
PT1377251E (pt) 2008-08-05
EP2848255A1 (en) 2015-03-18
KR20030077029A (ko) 2003-09-29
HUP0402656A2 (hu) 2005-03-29
NO20033674D0 (no) 2003-08-19
US20090305418A1 (en) 2009-12-10
ATE396691T1 (de) 2008-06-15
EP1377251A2 (en) 2004-01-07
PL206976B1 (pl) 2010-10-29
EP2016930B1 (en) 2014-10-15
MXPA03007503A (es) 2004-10-15
WO2002065992A3 (en) 2003-02-13
JP2006510567A (ja) 2006-03-30
NZ527683A (en) 2006-06-30
KR100971266B1 (ko) 2010-07-20
CA2438754C (en) 2014-10-07
ZA200307327B (en) 2005-03-30
CN1571834B (zh) 2013-03-20
CA2438754A1 (en) 2002-08-29
EP2848255B1 (en) 2017-08-23
CN1571834A (zh) 2005-01-26
EP2016930A2 (en) 2009-01-21
KR20090061081A (ko) 2009-06-15
DK2016930T3 (en) 2014-12-08
ES2306771T3 (es) 2008-11-16
DE60226853D1 (de) 2008-07-10
EA013944B1 (ru) 2010-08-30
ES2643582T3 (es) 2017-11-23
IL219223B (en) 2018-05-31
IL157366A (en) 2013-04-30
CA2698079A1 (en) 2002-08-29
IL157366A0 (en) 2004-02-19
HUP0402656A3 (en) 2012-03-28
WO2002065992A2 (en) 2002-08-29
CA2698079C (en) 2015-01-13
KR100962544B1 (ko) 2010-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5634415B2 (ja) 腫瘍の治療のための細胞治療方法
US9222070B2 (en) Cell therapy method for the treatment of tumors
AU2003260473B2 (en) Use of dendritic cells (DCs) expressing interleukin 12 (IL-12)
JP2005139118A (ja) 腫瘍の治療のための細胞治療方法
JP2010235611A (ja) 腫瘍の治療のための細胞治療方法
AU2008200524B2 (en) A cell therapy method for the treatment of tumors
AU2002306587A1 (en) A cell therapy method for the treatment of tumors

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees