KR100962544B1 - 종양 치료를 위한 세포 요법 - Google Patents

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Abstract

T 세포 반응은 손상된 면역계를 갖는 인간에서 종종 소실된다. 우리는 항원-특이적 이펙터에 대해, 생체 내에서 종양 세포를 용해할 수 있는 네이브 세포독성 T 림프구 전구체(CTLp)를 분리, 자극 및 확장하는 방법을 개발하였다. 이 생체내 프로토콜은 완전한 가능을 갖는 이펙터를 생성한다. 인간 HLA 클래스 I 및 정의된 보조 분자로 형질감염된 인위적인 항원 제시 세포(AAPCs: 노랑 초파리)는 정상 도너 및 암 환자 모두로부터의 CD8+ T 세포를 자극하는데 사용된다. 초파리 세포의 표면상에서 고 농도로 발현되는 클래스 I 분자는 비어있어, 특이적 펩티드를 내부적으로 발현시키는 종양 세포를 인식하는 다중클론 반응을 발생시키는 다중 펩티드를 효과적으로 로딩하는 것을 가능하게 한다. 생성된 반응은 강력하고, 항원-특이적이고 펩티드 에피토프가 정의된 면역원인 경우 재생가능하다. 이 인위적 항원 발현 시스템은 상당한 다수의 집단에서 대부분이 암을 치료하는데 적용될 수 있다.
종양, 세포 요법

Description

종양 치료를 위한 세포 요법{A CELL THERAPY METHOD FOR THE TREATMENT OF TUMORS}
암치료 분야의 상당한 발전에도 불구하고, 암은 계속해서 주요한 건강 문제이다. 화학 요법, 방사선 요법, 외과적 절개 및 이들 세 가지의 조합의 표준적 치료 계획은 종종 장기적으로 지속적인 치료를 하는데 실패한다. 많은 경우, 치료를 받은 암 환자가 일정 시간이 지난 후 질병 이전 상태로 재발하고, 더욱 문제를 악화시키는 것은 환자에 대한 이들 치료 계획의 가혹성이다.
암 치료를 어렵게 하는 또다른 요인은 암이 단지 하나의 생물학적 물질 또는 인자에 의해 발생하는 것이라기보다는 여러 물질 및 인자의 조합에 의해 발생한다는 것으로 알려졌기 때문이다. 단일 원인 물질 및 사건이 치료의 중심인 대부분의 의료적 치료와 달리, 암 요법은 다수개의 생물학적 인자를 처리하는 것이 요구된다.
최근, 연구 방향은 환자 자신의 면역계를 이용하는 암 치료법을 개발하는 것이다. 그러한 접근법은 입양 면역요법(adoptive immunotherapy)이다. 입양 면역요법은 종양 또는 암세포의 치료를 위해 세포독성 T 림프구(CTLs)를 발생시키기 위해 환자 자신의 세포를 이용할 것을 요구한다. 그렇지만, 이 기술은 인간 환자에 대한 필수적인 임상적 치료 계획으로서 크게 입증되지 않은 상태로 남아있다. CTL을 면역화 시키기 위한 적절한 에피토프를 확인하는 문제와는 별도로, 현재의 기술은 암을 효과적으로 치료하기 위해 여러 항원을 충분히 표적화하기 위해 APCs에 대한 충분한 수의 서로 다른 에피토프를 제시하는 방법을 제공하지 않는다. 본 발명은 다른 장점을 제공함과 더불어 충족되지 않는 필요성을 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 서로 다른 열 개 이상까지의 펩티드를 동시에 제시할 수 있는 비-자연발생적 항원-제시 세포(nnAPC), nnACP를 제조하는 방법, 암 치료를 위해 상기 nnACP을 사용하는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1: 도 1은 세포독성 T 림프구로도 알려진 CD8+세포와 항원-제시 세포 또는 표적 세포, 이 경우 종양 세포와의 상호작용의 그래프적 도시이다.
도 2, 패널 A 및 B:
도 2는 림프구-매개된 시토시스의 매카니즘의 두 개 패널의 그래프적 도시이다.
도 3: 이 도면은 다수개의 펩티드를 인간 빈 클래스 I 분자를 발현하는 초파리 세포상으로 로드하는데 사용될 수 있는 펩티드 바인더를 확인하기 위해 몇 개의 서로 다른 펩티드가 경쟁 어세이에서 테스트되는 실험의 결과를 보여준다.
도 4, 패널 A, B 및 C:
이 도면은 초파리 세포 상의 단일 에피토프로서 부가될 때 CTL을 키우는 능력에 대해 세 개의 멜라노마 펩티드가 테스트되는 시험의 결과를 보여준다. 단일 도너에서, CTL 활성은 서로 다른 세 개의 초파리 제조에 대해 단독으로 부가될 때 각 펩티드에 대해 설명되었다. 반응의 특이성은 대조구 HBc 펩티드, 고친화성 바인더와 비교되었다.
도 5, 패널 A, B 및 C:
이 도면은 네 개까지의 서로 다른 펩티드가 단일 초파리 세포에 부가된 일련의 실험의 결과를 보여준다. 각 제시된 펩티드에서의 CTL 활성은 3주의 자극 프로토콜 후에 되어졌고 이 도면에서 그래프적으로 도시되었다.
도 6, 패널 A, B 및 C:
이 도면은 세 개의 서로 다른 1차 인 비트로 자극 프로토콜 후의 CTL 활성을 보여준다.
도 7, 패널 A 및 B:
이 도면은 표준 자극 프로토콜에 따라 단일 펩티드 에피토프에 대한 CTL 반응을 규명하기 위해 수상 세포 대 초파리 세포의 능력을 비교한다.
도 8: 이 도면은 특이적 CTL 반응의 규명에서 알려진 펩티드가 수상 세포를 펄스시키는데 사용된 경우 성숙 또는 미성숙 표현형을 나타내는 수상세포가 초파리 세포만큼 효율적이지 않음을 보여준다.
도 9, 패널 A, B 및 C:
이 도면은 네 개의 펩티드를 제시하는 세 개의 서로 다른 인 비트로 자극 프로토콜에 대해 단일 도너에 의해 발생된 CTL 활성을 나타낸다.
도 10: 이 도면은 초파리 세포에 대해 결합하여 로딩된 10 펩티드에 대해 발생된 CTL 활성을 나타낸다.
도 11:이 도면은 인간 HLA-A2.1 클래스 I 분자로 형질전환된 초파리 세포 상의 HER-2 펩티드(826, 835, 861 및 863)의 펩티드 결합 능력을 보여준다.
도 12: 이 도면은 MART-1 특이적 주효 세포(effector cell)에 대한 항-펩티드 및 항-종양 반응을 예시한다. T2 세포는 MART-1 펩티드 또는 음성 대조구 (HBc)로 로딩되었다. Malme3M은 멜라노마 세포주이고, Malme3는 비-종양 세포주이다.
도 13, 패널 A 및 B:
이 도면은 서로 다른 두 개의 도너로부터의 HER-2 특이적 CD8 주효 세포의 테트라머 염색을 보여준다.
도 14: 이 도면은 펩티드-로딩된 T2 세포 상에서 평가된 HER-2 주효 세포에 대한 항-펩티드 반응을 규명한다.
도 15, 패널 A, B, C, D:
이 도면은 HLA-A2.1로 형질감염된 때 난소 종양 세포주(HTB-77)의 향상된 사망을 예시한다.
도 16: 이 도면은 HLA-A2.1로 형질전환된 때 유방암 세포주(HTB-133)의 향상된 사망을 보여준다.
도 17: 이 도면은 종양 세포주 HTB-77/A2.1의 세포용해를 입증하는데 IFNγ 예비-처리가 필요함을 보여준다.
도 18, 패널 A 및 B:
이 도면은 HLA-A2 및 HER-2의 표면 발현이 두 개의 세포주(HTB-77 및 HTB-77/A2.1)에서 IFNγ 유도에 의해 영향을 받지 않음을 보여준다.
도 19: 이 도면은 단백질 mRNA 수준이 IFNγ로 유도된 후 HTB-77/A2.1 세포 내에서 증가됨을 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 암을 가진 개체의 치료방법으로서:
a. 암과 결합하는 약 15개 까지, 바람직하게는 약 10개 까지의, 약 6 내지 12 아미노산, 바람직하게는 약 8 내지 10 아미노산 길이이고 약 10nM 내지 100μM 범위의 농도인 서로 다른 펩티드 분자를 동시에 제시할 수 있는 비-자연 발생적 항원-제시 세포주(nnAPC)를 제조하는 단계;
b. 상기 개체 또는 적절한 도너로부터 CD8+ 세포를 수확하는 단계;
c. 상기 nnAPC 세포주로 상기 CD8+세포를 자극하는 단계;
d. 상기 CD8+세포를, IL-2, IL-7 같은 시토킨 함유 배지, 또는 조건 성장 배지(CGM), 바람직하게는 IL-2 또는 IL-2 및 IL-7 조합을 함유한 배지에 부가하는 단계;
e. 상기 개체 또는 적절한 도너로부터 수집한 비현탁된 말초 혈액 단구, 또는 택일적으로 CD-8 제거된 말초혈액 단구를 약 10 내지 50 μg/ml의 펩티드와 혼합하는 단계;
f. 약 3,000 내지 7,000 rad, 바람직하게는 약 5,000 rad 범위의 용량과 같이, 현탁액 내에서 이들 세포의 증식을 방지하는데 필요한 충분한 용량의 γ-선으로 상기 말초 혈액 단구 현탁액을 조사시키거나, 또는 택일적으로 말초 혈액림프구 현탁액을 미토마이신 C를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포성장 억제제로 처리되는 단계;
g. 부착성 말초 혈액 단구를 분리하는 단계;
h. 상기 부착성 말초 혈액 단구를 약 10ng/ml 내지 10μg/ml의 상기 각 펩티드와 함께 로드하는 단계;
i. 상기 CD8+ 세포를 상기 부착성 말초 혈액 단구와 약 10 CD8+ 세포 대 1 말초혈액단구의 비로 조합시키는 단계;
j. 임의로, CD8+ 세포 및 말초 혈액 단구의 상기 조합된 현탁액을 약 6 내지 7일간 자극하는 단계;
k. 임의로, CD8+ 세포 및 말초 혈액 단구의 상기 조합된 현탁액을 배지 내의 IL-2 및 IL-7로 자극시키는 단계;
l. 임의로, 적절한 CTL 활성에 대해 CD8+ 현탁액을 어세이하는 단계, 및 임의로, CTL 순도, 살균도 및 엔도톡신 함량에 대해 어세이하는 단계; 및
m. CD8+ 현탁액으로 상기 개체를 접종시키는 단계
를 포함하는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 구체예는 암을 가진 개체의 치료방법으로서:
a. 암과 결합하는 약 15개 까지, 바람직하게는 10개까지의, 약 8 내지 10 아미노산 길이를 갖는 서로 다른 펩티드 분자를 동시에 제시할 수 있는 비-자연 발생적 항원-제시 세포주(nnAPC)를 제조하는 단계;
b. 암을 가진 개체로부터 CD8+ 세포를 수확하는 단계;
c. 약 6 내지 약 7일 동안 상기 nnAPC 세포주로 상기 CD8+세포를 자극하는 단계;
d. 상기 CD8+ 세포를 배지 내의 IL-2 및 IL-7로 자극하는 단계;
e. 상기 개체로부터 수집한 말초혈액 단구를 약 20 μg/ml의 각 펩티드와 혼합하는 단계;
f. 약 5,000 rad 의 γ-선으로 상기 CD8-결핍된 말초 혈액 단구 현탁액을 조사시키는 단계;
g. 부착성 말초 혈액 단구를 분리하는 단계;
h. 상기 부착성 말초 혈액 단구를 약 10μg/ml의 상기 에피토프와 함께 로드하는 단계;
i. 상기 CD8+ 세포를 상기 부착성 말초 혈액 단구와 약 10 CD8+ 세포 대 1 말초혈액단구의 비로 조합시키는 단계;
j. CD8+ 세포 및 말초 혈액 단구의 상기 조합된 현탁액을 약 6 내지 7일간 자극하는 단계;
k. CD8+ 세포 및 말초 혈액 단구의 상기 조합된 현탁액을 배지 내의 IL-2 및 IL-7로 자극시키는 단계;
l. 적절한 CTL 활성, 순도, 살균도 및 엔도톡신 함량에 대해 CD8+ 현탁액을 어세이하는 단계; 및
m. CD8+ 현탁액으로 상기 개체를 접종시키는 단계
를 포함하는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 구체예는 멜라노마를 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데 이 방법은:
a. 암과 결합하는 약 15개 까지, 바람직하게는 10개까지의, 약 8 내지 10 아미노산 길이를 갖는 서로 다른 펩티드 분자를 동시에 제시할 수 있는 비-자연 발생적 항원-제시 세포주(nnAPC)를 제조하는 단계;
b. 상기 개체로부터 CD8+ 세포를 수확하는 단계;
c. 약 6 내지 약 7일 동안 상기 nnAPC 세포주로 상기 CD8+세포를 자극하는 단계;
d. 상기 CD8+ 세포를 배지 내의 IL-2 및 IL-7로 자극하는 단계;
e. 상기 개체로부터 수집한 말초혈액 단구를 약 20 μg/ml의 상기 nnAPC가 제시할 수 있는 각 펩티드와 혼합하는 단계;
f. 약 5,000 rad 의 γ-선으로 상기 CD8-고갈된 말초 혈액 단구 현탁액을 조사시키는 단계;
g. 부착성 말초 혈액 단구를 분리하는 단계;
h. 상기 부착성 말초 혈액 단구를 약 10μg/ml의 상기 에피토프와 함께 로드하는 단계;
i. 상기 CD8+ 세포를 상기 부착성 말초 혈액 단구와 약 10 CD8+ 세포 대 1 말초혈액단구의 비로 조합시키는 단계;
j. CD8+ 세포 및 말초 혈액 단구의 상기 조합된 현탁액을 약 6 내지 7일간 자극하는 단계;
k. CD8+ 세포 및 말초 혈액 단구의 상기 조합된 현탁액을 배지 내의 IL-2 및 IL-7로 자극시키는 단계;
l. 적절한 CTL 활성, 순도, 살균도 및 엔도톡신 함량에 대해 CD8+ 현탁액을 어세이하는 단계; 및
m. CD8+ 현탁액으로 상기 개체를 접종시키는 단계
를 포함하는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 구체예는 상기에서 nnAPC가 하기의 펩티드, 티로시나제369-377, 티로시나제207-216, gp100209-217, gp100154-162, MART-127-35, HER-2/neu789-797, HER-2/neu369-377, C-lectin8-16, Pec6020-29, 및 Pec6025-33를 제시하는 멜라노마 치료 방법이다.
본 발명의 또다른 구체예는 클래스 I HLA 분자와 정상적으로 관련된 불충분한 면역 반응을 유발하는 질병 또는 질병 이상을 치료하는 방법인데, 여기서 이 치료는 CTL에 의해 이루어지는 것으로 입증된 감염된 또는 형질전환된 세포를 제거한다.
본 발명의 또다른 구체예는 클래스 I HLA 분자와 정상적으로는 관련된 불충분한 면역 반응을 유발하는 질병 또는 이상을 치료하는 방법인데, CTL에 의한 제거에 민감한 것으로 입증된 감염된 또는 형질전환된 세포는 다음을 포함하는 방법에 의해 치료된다:
a. 상기 질병 또는 이상과 결합하는 약 15개 까지, 바람직하게는 약 10개 까지의, 약 6 내지 12 아미노산, 바람직하게는 약 8 내지 10 아미노산 길이이고 약 10nM 내지 100μM 범위의 농도인 서로 다른 펩티드 분자를 동시에 제시할 수 있는 비-자연 발생적 항원-제시 세포주(nnAPC)를 제조하는 단계;
b. 상기 개체 또는 적절한 도너로부터 CD8+ 세포를 수확하는 단계;
c. 상기 nnAPC 세포주로 상기 CD8+세포를 자극하는 단계;
d. 상기 CD8+세포를, IL-2, IL-7 같은 시토킨 함유 배지, 또는 CGM, 바람직하게는 IL-2 또는 IL-2 및 IL-7 조합을 함유한 배지에 부가하는 단계;
e. 상기 개체 또는 적절한 도너로부터 수집한 비현탁된 말초 혈액 단구, 또는 택일적으로 CD-8 제거된 말초혈액 단구를 약 10 내지 50 μg/ml의 펩티드와 혼합하는 단계;
f. 약 3,000 내지 7,000 rad, 바람직하게는 약 5,000 rad 범위의 용량과 같이, 현탁액 내에서 모든 성분을 살균시키는데 필요한 충분한 용량의 γ-선으로 상기 말초 혈액 단구 현탁액을 조사시키는 단계;
g. 부착성 말초 혈액 단구를 분리하는 단계;
h. 상기 부착성 말초 혈액 단구를 약 10ng/ml 내지 10μg/ml의 상기 각 펩티드와 함께 로드하는 단계;
i. 상기 CD8+ 세포를 상기 부착성 말초 혈액 단구와 약 10 CD8+ 세포 대 1 말초혈액단구의 비로 조합시키는 단계;
j. 임의로, CD8+ 세포 및 말초 혈액 단구의 상기 조합된 현탁액을 약 6 내지 7일간 자극하는 단계;
k. 임의로, CD8+ 세포 및 말초 혈액 단구의 상기 조합된 현탁액을 배지 내의 IL-2 및 IL-7로 자극시키는 단계;
l. 임의로, 적절한 CTL 활성에 대해 CD8+ 현탁액을 어세이하는 단계, 및 임의로, CTL 순도, 살균도 및 엔도톡신 함량에 대해 어세이하는 단계; 및
m. CD8+ 현탁액으로 상기 개체를 접종시키는 단계.
본 발명은 인간 클래스 I HLA을 엔코드하는 DNA, 결합 분자 및 발현을 위한 공동-자극 분자로 형질전환된 초파리 세포로부터 유래하고 약 15개 까지, 바람직하게는 약 10개까지의 서로 다른 펩티드 분자를 동시에 제시할 수 있는 비-자연 발생적 항원-제시 세포주(nnAPC)를 제공한다.
본 발명의 또다른 구체예는 개체의 치료를 향상시키는 다양한 바람직한 기능과 연관된 펩티드를 제시하는 nnAPC를 제공한다. 예를 들면, 질병 또는 질병이상의 치료와 연관된 펩티드에 부가하여, nnAPC는 림프구 기능 항원(LFA-1, LFA-2 및 LFA-3), 세포간 부착 분자 1(ICAM-1), T-세포 공동-자극 인자(CD2, CD28, B7)와 같은 보조 분자와 연관된 펩티드를 제시할 수 있고, 세포-세포 부착을 향상시키거나 또는 부가적 세포 활성화 신호를 변환시킨다.
본 발명의 또다른 구체예는 여러 타입의 암과 연관된 펩티드를 제시할 수 있는 nnAPC를 제공한다. 예를 들면, HER-2/neu와 같은 유방암 관련 폴리펩티드로부터 유래하거나 관련된 펩티드는 MART-1, MAGE와 같은 멜라노마 관련 폴리펩티드로부터 유래하거나 연관된 펩티드와 함께 제시될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예는 동시에 10개까지의 서로 다른 펩티드 분자를 제시할 수 있는 비-자연 발생적 항원-제시 세포(nnAPC)에 대한 제조방법을 제공하는데, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 노랑 초파리 알로부터 곤충 세포주를 제조하는 단계; 택일적으로 인간 MHC 클래스 I 분자 및 공동-자극 부착 분자를 발현시키기 위한 곤충 세포주를 제조하는 단계;
b. 곤충 세포를 발육시키기에 적합한 배지, 바람직하게는 SchneiderTM초파리 배지에서 상기 곤충 세포를 발육시키는 단계;
c. pRmHa-1 발현 벡터로부터 메탈로티오네인 프로모터, 금속 반응 보존 서열 및 노랑 초파리로부터 분리된 폴리아데닐화 신호를 보유한 알콜 디하이드로게나제 유전자를 포함하는 pRmHa-3 플라스미드를 제조하는 단계;
d. A2.1이 인간 클래스 I DNA 서열로 대체될 수 있는 인간 클래스 I HLA A2.1, B7.1, B7.2, ICAM-1, β-2 마이크로글로불린 및 LFA-3에 대한 상보적 DNA를 상기 pRmHa-3 플라스미드 내로 삽입하는 단계;
e. 상기 곤충 세포를 phshneo 플라스미드 및 상기 상보적 DNA를 함유하는 pRmHa-3 플라스미드로 형질감염시키는 단계; 및
f. 상기 곤충 세포를 CuSO4와 접촉시켜 nnAPC를 만들어 상기 곤충 세포 내에서 형질감염된 유전자 발현을 유도하는 단계.
본 발명의 곤충 세포는 곤충 세포 성장에 적합한 배지 내에서 성장되는데, 이후 "곤충 성장 배지"로서 언급된다. 곤충 성장 배지는 Schneider의 초파리 배지, Grace 곤충 배지, 및 TC-100 곤충 배지와 같은 다양한 판매자로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 택일적으로, 곤충 성장 배지는 당업계 숙련자에 의해 제조될 수 있다. 대표적으로 배지는 무기염(예를 들면, 염화 칼슘, 황산 마그네슘, 염화칼륨, 인산칼륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨 및 인산나트륨), 아미노산 다양한 탄산염 및 화학종과 같은 곤충 세포의 성장을 촉진 및 유지하는데 필요한 성분을 포함할 수 있다(Imogene Schneider, Exp. Zool, (1964) 156(1):pg. 91). 택일적으로, 배지는 비타민, 미네랄 및 곤충 세포의 성장을 돕는 기타 성분을 포함할 수 있다.
다음은 본 명세서에서 사용되는 약자 및 정의의 목록이다.
약자
APC 항원-제시 세포
CD8+ CD8+ T 세포
CTL 세포독성 T 림프구
E 이펙터
Fas CD95로도 공지됨, T 세포 상의 에피토프
ICAM 세포간 부착 분자
IL 인터루킨
LAK 림포킨-활성화된 킬러 세포
LFA 림프구 기능 항원
MHC 주요 조직적합성 복합체
nnAPC 비-자연 발생적 항원-제시 세포
NP 핵 단백질
PBMC 말초 혈액 단핵 세포
PBS 인산-완충된 식염수
PCR 폴리머라제 연쇄 반응
RPMI Roswell Park Memorial Institute
RWJPRI The R.W.Johnson Pharmaceutical Research Institute
T 표적
TCR T 세포 항원 수용체
TIL 종양-침윤성 림프구
다음은 다양한 펩티드 에피토프에 대해 본명세서에서 사용된 약자의 목록이다. 각 아미노산 잔기는 당업자에게 이미 공지되어 사용되고 있는 단일 문자 코드 에 따라 표시된다.
Figure 112003030550189-pct00001

펩티트 에피토프 약자
본명세서에서, 용어 "티로시나제 369-377" 또는 "티로시나제369-377"은 아미노산 서열 YMNGTMSQV (SEQ ID NO:1)을 언급한다. 또한, 서열 YMNGTMSQV (SEQ ID NO:1)의 아미노산 잔기 "N"를 "D"로 변형시켜 YMDGTMSQV (SEQ ID NO:2)가 생기게 하는 후-번역 이벤트로 인한 YMDGTMSQV (SEQ ID NO:2)도 이 정의에 포함된다(Skipper 등, J. Exp. Med. (1996) 183:527-534).
본 명세서에서 용어 "티로시나제207-216" 또는 "티로시나제207-216"는 아미노산 서열 FLPWHRLFLL(SEQ ID NO:3)을 언급한다.
본명세서에서 용어 "gp100 209-217" 또는 "gp100209-217"는 아미노산 서열 ITDQVPFSV (SEQ ID NO:4)를 언급한다.
본명세서에서 용어 "gp100 154-162" 또는 "gp100154-162"는 아미노산 서열 KTWGQYWQV (SEQ ID NO:5)를 언급한다.
본명세서에서 용어 "MART-1 27-35" 또는 "MART-127-35"는 아미노산 서열 AAGIGILTV (SEQ ID NO:6)를 언급한다.
본명세서에서 용어 "HER-2/neu 789-797" 또는 "HER-2/neu789-797"는 아미노산 서열 CLTSTVQLV(SEQ ID NO:7)를 언급한다.
본명세서에서 용어 "HER-2/neu 369-377" 또는 "HER-2/neu369-377"는 아미노산 서열 KIFGSLAFL(SEQ ID NO:8)를 언급한다.
본명세서에서 용어 "C-lectin8-16" 또는 "C-lectin8-16"는 아미노산 서열 KMASRSMRL (SEQ ID NO:9)를 언급한다.
본명세서에서 용어 "Pec60 20-29" 또는 "Pec6020-29"는 아미노산 서열 ALALAALLVV(SEQ ID NO:10)를 언급한다.
본명세서에서 용어 "Pec60 25-33" 또는 "Pec6025-33"는 아미노산 서열 ALLVVDREV(SEQ ID NO:11)를 언급한다.
본명세서에서 용어 "CD8 펩티드 59-70" 또는 "CD8 펩티드59-70"는 아미노산 서열 AAEGLDTQRFSG(SEQ ID NO:12)를 언급한다.
용어 및 정의
본 명세서에서, 용어 "입양 면역요법"은 질병 또는 질병 이상의 치료를위해 도너 또는 자가 T 림프구를 투여하는 것을 언급하는데, 여기서 질병 또는 질병 이상은 클래스 I HLA 분자와 정상적으로 연관된 불충분한 반응을 유발한다. 입양 면역요법은 감염된 또는 형질전환된 세포의 제거가 CTL에 의해 입증된 질병 또는 질병 이상의 치료에 적절하다. 예를 들면, 질병 또는 질병 이상은 멜라노마, 전립선, 유방, 대장-지장, 위, 후두 및 목, 췌장, 경추, 난소, 골격, 백혈병 및 폐암과 같은 암 및/또는 종양; B형 간염, C 형 간염, 인간 면역결핍 바이러스와 같은 바이러스 감염; 결핵, 나병 및 리스테리아증과 같은 박테리아 감염, 및 말라리아와 같은 기생충 감염을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본명세서에서, 용어 "B7.1"은 항원-제시 세포와 연관된 공동-자극 분자를 언급한다.
본명세서에서, 용어 "BCNU"는 1,3-비스(2-클로로에틸)-1-니트로소우레아로도 알려진 카르무스틴을 언급힌다.
본명세서에서, 용어 "BSE"는 광우병을 언급한다.
본명세서에서, 용어 "CD"는 분화 클러스터, 항원 에피토프 및 기능에 의해 분류된 T 림프구(원래), B 림프구, 단구, 대식세포 및 과립구를 언급한다.
본명세서에서, 용어 "DTIC"는 데카바진, 5-(3,3-디메틸-1-트리아제노)-이미다졸-4-카복사미드를 언급한다.
본명세서에서, 용어 "생체 외" 또는 "생체 외 요법"은 생물학적 재료, 대표적으로 세포가 환자 또는 적절한 도너와 같이 대체 공급원으로부터 얻어지고 변형되어 변형된 세포가 변형된 세포에 의해 생성되는 장기적 또는 계속적 치료 효과 전달에 의해 향상된 병리학적 이상을 치료하는데 사용될 수 있다. 치료는 환자 또는 대체 공급원으로부터 얻어진 변형된 생물학적 물질을 환자 내로 재도입하는 것을 포함한다. 생체 외 요법의 장점은 환자를 치료의 바람직하지 못한 부작용에 노출시키지 않으면서 치료의 장점을 환자에게 제공하는 능력이다. 예를 들면, 시토킨은 환자 CTL 확장을 자극하기 위해 암 또는 바이러스 감염을 가진 환자에게 종종 투여된다. 그렇지만, 시토킨은 종종 환자에서 감기 유사 증상을 유발한다. 생체 외 절차에서, 시토킨은 환자 체외에서 CTL 의 확장을 자극하는데 사용되고, 환자는 시토킨에 대한 노출 및 그로 인한 부작용을 덜 수 있다. 택일적으로 환자가 치료의 효과를 취할 수 있는 적절한 상황 또는 조건에서, 환자는 저용량의 γ 인터페론, α 인터페론 및/또는 IL-2로 동시에 치료받을 수 있다. 인터페론의 기대되는 효과는 항원 특이적 CTL에 의해 세포용해에 대한 종양 세포를 감작시키는 것이고, IL-2의 효과는 항원 특이적 CTL 지속성을 향상시키는 것이다.
본명세서에서, 용어 "HEPES"는 N-2-히드록시에틸피페라진-N'2-에탄설폰산 버퍼를 언급한다.
본명세서에서, 용어 "HLA-A2.1"은 대략 45%의 카프카스인에서 발견되는 클래스 I HLA 분자를 언급한다.
본명세서에서, "MART-1" 또는 "T-세포-1에 의해 인식되는 멜라노마 항원"은 멜라노마-관련 항원을 언급한다. 아미노산 및 핵산 서열은 이 항원의 다양한 특성과 더불어 1999년 11월 30일 특허허여된 "Melamona Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods"라는 명칭의 미국특허 제 5,994,523호; 1999년 2월 23일에 특허허여된 "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods"라는 명칭의 미국특허 제 5,874,560호; 1998년 12월 1일에 특허허여된 "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods"라는 명칭의 미국특허 제 5,844,075호에 개시되어 있다. 특히 미국특허 5,994,523호는 도 1에서 MART-1의 전장 핵산 및 아미노산 서열을 각각 SEQ ID NO:1, 및 SEQ ID NO:2로서 개시한다. 상기에서 언급된 도 1은 참고문헌으로서 포함된다.
본명세서에서, 용어 "MAGE"는 멜라노마-연관된 항원을 언급한다. 아미노산 및 핵산 서열은 이 항원의 다양한 특성과 더불어 2000년 10월 31일에 특허허여된 "Methods for Determining Breast Cancer and Melanoma by Assaying for a Plurality of Antigens Associated Therewith" 명칭의 미국특허 제 6,140,050호; 1998년 6월 2일에 특허허된 "Method of Screening for Cancer by Detecting Messenger RNA for a MAGE-XP Gene" 명칭의 미국특허 제 5,759,783호; 및 1997년 9월 2일에 특허허여된 "Induction of 항-Tumor Cytotoxic T Lymphocyte in Humans Using Synthetic Peptide - Epitopes" 명칭의 미국특허 제 5,662,907호에 개시되어 있다.
본명세서에서, 용어 "MPC-10"은 자기 입자 농축기를 언급한다.
본명세서에서, 용어 "NK 세포"는 자연 킬러 세포를 언급한다.
본명세서에서, 용어 "OKT3"는 ORTHOCLONE OKT3, muromonab-CD3, 항-CD3 단클론 항체를 언급한다.
본명세서에서, 용어 "TAP-1,2"는 항원 처리와 연관된 수송자-1,2를 언급한다.
본명세서에서, 용어 "Th 세포"는 헬퍼 T 세포, CD4+를 언급한다.
본명세서에서, 용어 "티로시나제" 는 멜라노마 연관된 단백질을 언급한다. (Brichard et al., J. Exp. Med. (1993) 178: 489-495; Robbins et al., Cancer Res. (1994) 54: 31243126). 1998년 12월 1일에 특허허여된 "P15 and Tyrosinase Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods"라는 명칭의 미국특허 5,843,648호는 도 7, 패널 A 내지 D에서 항원 펩티드 및 티로시나제 관련된 결합 폴리핵산을 개시하는데 이 문헌은 참고문헌으로서 포함된다. 1996년 1월 30일에 특허허여된 "Method for Detecting Complexes Containing human Leukocyte Antigen A2 (HLA-A2) Molecules and a Tyrosinase Derived Peptide on Abnormal Cell"명칭의 미국특허 제 5,487,974호는 실시예 9, 표3에서 티로시나제 및 멜라노마와 결합된 부가적 펩티드를 개시하는데, 이 문헌은 참고문헌으로서 포함된다.
본명세서에서, 용어 "gplO0"은 종양 침윤성 림프구 (TIL)에 의해 인식되는 멜라노마 항원을 언급한다. gap100를 인식하는 TIL은 생체내 종양 거부와 관련되어 있다 (Bakker et al., J. Exp. Med. (1994) 179 : 1005-1009; Kawakami et al., J.Immunol. (1995) 154: 3961-3968). gp100에 관한 항원성 펩티드는 1999년 11월 30일에 특허허여된 "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods" 명칭의 미국특허 제 5,994,523호; 1999년 2월 23일에 특허허여된, "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods" 명칭의 미국특허 제 5,874,560호; 및 1998년 12월 1일에 특허허여된 "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods" 명칭의 미국특허 제 5,844,075호에 개시되어 있다. 특히, 미국특허 제 5,994,523호는 gp100에 관한 핵산 및 아미노산 서열을 도 4 및 5에서 각각 개시한다. 또한 SEQ ID NOs: 27, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 및 41로서 확인된 것들을 포함하는, 아미노산으로부터 유래한 항원 펩티드를 개시한다. 상기한 모든 도 4 및 5, SEQ ID NOs에 의해 표시된 펩티드는 참고문헌으로서 포함된다.
본명세서에서, 용어 "멜라노마"는 멜라노마, 전이성 멜라노마, 멜라닌세포 또는 멜라닌 세포 관련 모반 세포로부터 유래한 멜라노마, 멜라노육종, 멜라노암종, 멜라노상피종, 멜라노 원위치 표면 확산 멜라노마, 결절성 멜라노마,악성 흑자(lentigo maligna) 멜라노마, 멜라노마, 말단 흑자형(acral lentiginous) 흑색종, 침투성 멜라노마 또는 가족형 비전형 몰(familial atypical mole) 및 멜라노마(FAM-M) 증후군을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 포유동물에서의 이러한 멜라노마는 염색체 이상, 퇴행성 성장 및 발육 장애, 유사분열 자극제, 자외선 조사(UV), 바이러스 감염, 유전자의 부적합한 조직 발현, 유전자 발현의 변형, 및 세포상의 제시, 또는 발암성 물질에 의해 야기될 수 있다. 상기한 멜라노마는 본 출원에 개시된 방법에 의해 진단, 평가 및 치료될 수 있다.
본명세서에서, 용어 "C-lectin"은 난소암과 관련된 것으로 밝혀진 펩티드 서열을 언급한다.
본명세서에서, 용어 "주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)" 또는 "MHC"는 인간 백혈구 항원 (HLA)을 포함하는 서로 다른 종에서 기술된 조직-적합성 항원계를 포괄하는 것을 의미하는 일반적인 명칭이다.
본명세서에서, 용어 "에피토프", "펩티드 에피토프", "항원성 펩티드" 및 "면역원 펩티드"는 포유동물에서 세포 면역 반응을 유발할 수 있는 항원으로부터 유래한 펩티드를 언급한다. 그러한 펩티드는 펩티드로 면역화된 동물로부터의 항체에 반응성일 수 있다. 그러한 펩티드는 약 5 내지 20 아미노산 길이 바람직하게는 약 8 내지 15 아미노산 길이, 가장 바람직하게는 9 내지 10 아미노산 길이일 수 있다.
본명세서에서, 용어 "Pec60"은 난소 및 유방암과 연관되는 것으로 밝혀진 펩티드 서열을 언급한다.
본명세서에서, 용어 "유사체"는 본 발명의 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 잔기 서열을 갖고, 특히 본명세서에 도시된 것으로서 하나 이상의 잔기는 기능적으로 유사한 잔기로 보존적으로 치환되고 본명세서에서 기술된 본 발명의 기능적 양상을 나타내는 어떠한 폴리펩티드를 포함한다. 보존적 치환의 예는 하나의 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 비-극성(소수성) 잔기의 치환, 아르기닌 및 리신 사이, 글루타민 및 아스파라긴 사이, 글리신 및 세린 사이와 같이 극성(친수성)잔기의 치환, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔기의 치환, 또는 아스파르트산 또는 글루타민산과 같은 산성 잔기의 치환을 포함한다.
본명세서에서, 용어 "보존적 치환"은 또한 화학적으로 유도된 잔기를 비-유도된 잔기 대신 사용하는 것도 포함한다.
본명세서에서, 용어 "화학적 유도체"는 관능적 측기의 반응에 의해 화학적으로 유도된 하나 이상의 잔기를 갖는 목적 폴리펩티드를 언급한다. 그러한 유도된 분자의 예는 유리 아미노기가 아민 염산, p-톨루엔 설폰기, 카보벤족시기, t-부틸옥시카보닐기, 클로로아세틸기 또는 포르밀기를 형성하도록 유도된 분자를 포함한다. 유리 카복시기는 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 기타 형태의 에스테르 또는 히드라지드를 형성하도록 유도된다. 유리 히드록시기는 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성하도록 유도될 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 질소는 N-im-벤질히스티딘을 형성하도록 유도될 수 있다. 또한 화학적 유도체로서 20개 표준 아미노산의 하나 이상의 자연-발생성 아미노산 유도체가 포함된다. 예를 들면: 4-히드록시프롤린이 프롤린에 대해 치환될 수 있다; 5-히드록시리신은 리신에 대해 치환될 수 있다; 3-메틸히스티딘은 히스티딘에 대해 치환될 수 있다; 호모세린은 세린에 대해 치환될 수 있다; 및 오르니틴은 리신에 대해 치환될 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 부가 및/또는 결실을 갖는 어떠한 폴리펩티드 또는, 엔코드되는 서열의 폴리펩티드에 상대적인 잔기가 요구 활성이 유지되는 한 본 발명의 상응하는 핵산 서열인 잔기를 또한 포함한다.
본명세서에서, 용어"HER-2/neu"은 하나 이상의 막-관련 수용체-유사 암유전자 단백질을 발현 또는 과다발현시키는 암유전자를 언급한다. HER-2/neu의 발현 또는 과다-발현과 연관되는 것으로 발견된 암 중에는 유방, 위, 난소 대장 및 침샘암이 있다. HER-2/neu 암유전자는 암유전자의 티로신 단백질 키나제 군의 일부이고 상피 성장 인자 수용체(EGFR)과 높은 상동성을 가진다. HER-2/neu은 세포 성장 및/또는 분화에 역할을 하는 것으로 나타났다. HER2/neu은 본질적으로 정상인 유전자 산물의 증가된 또는 비조절된 발현으로 인한 양적 매카니즘을 통해 악성 종양을 유도하는 것으로 보인다. 2000년 6월 13일자로 특허허여된 "Immune Reactivity to HER-2/neu Protein for Diagnosis and Treatment of Malignancies in Which the HER-2/neu Oncogene is Associated" 명칭의 미국특허 제 6,075,122호는 12 칼럼 31줄부터 13 칼럼 7줄에서 CD8+ T 세포 반응을 설명하는 펩티드를 개시하는데, 이들 펩티드는 SEQ ID 번호에 따라 확인되고 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
HER-2/neu (pl85)은 HER-2/neu 암유전자의 단백질 산물이다. HER-2/neu 유전자는 증폭되고 HER-2/neu 단백질은 유방, 난소, 대장, 폐 및 전립선 암을 포함하는 다양한 암에서 과다 발현된다. HER-2/neu은 악성 형질전환과 관련되어 있다. 이것은 50% 내지 60%의 원위치 유선암 및 20% 내지 40%의 유방암뿐만 아니라, 난소, 전립선, 대장 및 폐 내에서 발생하는 선암종의 상당부분에서 발견되고 있다. HER-2/neu는 악성 표현형뿐만 아니라 악성의 공격성과도 밀접한 연관이 있고 모든 침윤성 유방암의 4분의 1에서 발견된다. HER-2/neu 과다 발현은 유방 및 난소암 모두에서 나쁜 예후와 상관관계가 있다. HER-2/neu은 대략 1255 아미노산 (aa) 길이인 185 kd의 상대적 분자량을 갖는 막통과 단백질이다. 이는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대해 40%의 상동성을 갖는 대략 645 aa의 세포외 결합 도메인(ECD), 고 소수성 막통과 앵커 도메인(TMD), 및 EGFR에 대해 80%의 상동성을 갖는 대략 580 아미노산의 카복시말단 세포질 도메인(CD)을 갖는다.
암유전자를 수반하는 현재의 연구는 악성 세포에서 작용하고 형질전환을 일으키거나 연관있는 최소한 40 개 암유전자가 확인되었다. 암유전자는 추정되는 기능 및 그 유전자 산물(암유전자에 의해 발현되는 단백질과 같은)의 위치에 기초하여 서로 다른 그룹으로 분류된다. 암유전자는 정상 세포 생리의 특정 양상에 대해 필수적인 것으로 생각된다.
치료 분야의 상당한 발전에도 불구하고, 암은 계속하여 주요한 건강상 문제이다. 화학 요법, 방사선 요법, 외과적 절개 및 이들 세 가지의 조합의 표준적 치료 계획은 종종 장기적으로 지속적인 치료를 하는데 실패한다. 많은 경우, 치료를 받은 암 환자가 일정 시간이 지난 후 질병 이전 상태로 재발하고, 더 나아가 문제가 더 커지는 것은 환자에 대한 이들 치료 계획의 심각성이다. 멜라노마의 경우, 전이성 멜라노마에 대한 치료는 종래의 화학요법을 사용하여 이루어지고 있다. 35% 내지 50%의 반응율이 병용 화학요법의 Datmouth 투약계획(DTIC, 시스플라틴, BCNU 및 타목시펜)에서 보고되고 있지만, 생존 기간은 6 내지 10개월에 머물고 있다. 공격적 "고용량 강도" 화학요법 및 자가 골수 이식으로 인한 조혈 과다증에 대해 높은 회복율이 보고되었다. 그럼에도 불구하고, 평균 생존 기간은 짧아서 대략 4개월이다.
Rosenberg 및 그의 동료들은 활성화된 림프구의 주입을 다양한 암치료로서 사용하는 것을 시도해오고 있다. 초기에, 림포킨-활성화된 킬러 세포(LAK) 및 이후 IL-2로 생체외에서 활성화된 종양-침입 림프구(TIL)가 사용되었지만, 효능에 대한 입증은 불확실하다. 사실, 제어된 임상 시험은 환자에 대한 직접적인 IL-2 투여에 대해 생체외-활성화된 세포의 사용의 장점을 입증하는데 실패하였다. 그러므로, LAK 및 TIL 치료의 장점은 불충분하고 부작용은 전형적으로 심각하여 많은 시험이 중도에 중단되었다.
마우스 종양 모델에서의 연구는 입양 면역 요법, 종양 항원에 대해 특이적인 T 세포의 생체내 면역화가 최소한의 독성으로 매우 효과적임을 입증하였다. 이러한 전략을 인간 종양의 치료에 적용하는데 주요 장애는 종양 세포가 세포독성 T 림프구(CTL)-매개된 파괴에 민감하도록 하는 면역원성 항원의 규명이다. 멜라노마 환자로부터의 종양-반응성 T 세포의 분리는 CTL에 대한 일부 종양 항원(에피토프)을 확인하게 만들었다. 이들은 티로시나제(Brichard et al., J. Exp. Med. (1993) 178 : 489-495; Robbins et al., Cancer Res. (1994) 54: 31243126), MART 1/Melan A (Kawakami et al., J. Exp. Med. (1994) 180: 347-352), gp 100 (Bakker et al., J. Exp. Med. (1994) 179 : 1005-1009; 및 Kawakami et al., J. Immunol . (1995) 154: 3961-3968) 및 MAGE (Gaugler et al., J. Exp. Med. (1994) 179: 921-930)를 포함한다. 이들 중 티로시나제 및 MART-1은 거의 보편적으로 멜라노마 상에서 발현되고 그러므로 입양 면역요법에 대한 논리적 선택이다.
최근, 수년 동안 상당한 생존율 향상이 면역학적 치료를 받는 멜라노마 환자의 일부에서 보고되었다. 이는 활성 특이적 면역요법을 IL-2, α-인터페론 및 γ-인터페론과 같은 시토킨과 같은 면역계 비-특이적 강화제와 더불어 "암 백신"과 함께 포함한다. 그렇지만, 시토킨의 장점은 구역질 및 열과 같은 통상 그 사용에 동반되는 부작용에 의해 감소된다.
세포용해성 T 세포(CD8+)는 바이러스 감염에 대한 주요 방어선이다. CD8+ 림프구는 바이러스에 의해 감염된 숙주 세포를 특이적으로 인식하고 죽인다. 이론적으로, 암을 포함하는 다른 형태의 질병에 저항하는 면역계를 이용하는 것이 가능해야 한다. 그렇지만, 인 비트로/생체 외 절차는 특이적으로 CTL을 활성화하는데 거의 이용가능하지 않다. 상기에서 기술된 핵심 멜라노마 항원의 동정 및 아래에서 기술되는 CTL에 대한 특이적 인 비트로 활성화 방법은 전이성 멜라노마의 입양 면역요법의 개념을 테스트하는 것을 가능하게 한다.
모든 네이브 T 세포는 면역 반응을 유도하는 활성화를 위해 두 개의 신호를 요구한다. CD8+ 림프구(CTLs)에 대해 제 1 신호는 특이성을 부여하고, 항원 제시 세포(APCs)의 표면에 존재하는 클래스 I MHC(HLA) 복합체에 결합된 항원의 면역원성 펩티드 단편(에피토프)의 CD8+ 세포에 대한 제시로 구성된다. 이 복합체는 T 세포 항원 수용체(TCR)에 의해 특이적으로 인식되고, TCR은 세포내적으로 신호를 전달한다.
T 세포 수용체에 대한 결합은 필수적이지만 T 세포 활성화를 유도하는데 충분하지는 않고, 통상 세포 증식 또는 시토킨 분비를 유도하지는 않는다. 완전한 활성화는 제 2 공동-자극 신호를 필요로 하는데, 이들 신호는 활성화 연쇄반응을 향상시키는 역할을 한다. 항원-제시 세포 상의 공동-자극 분자 중에서, B7 및 ICAM-1과 같은 세포 부착 분자(엔테그린)는 T 세포 상에서 각각 CD28 및 LFA-1에 결합함으로써 이 과정을 보조한다. CD8+ 세포가 적절한 공동-자극 분자 상호작용의 존재 하에서 클래스 I MHC 분자에 의해 결합된 면역원성 펩티드(에피토프)를 보유한 항원-제시 세포와 상호작용할 때, CD8+ 세포는 완전 활성화된 세포용해성 T 세포가 된다.
림프구-매개된 세포 사망은 CD8+ CTLs이 T 세포 활성화에 대해 상기에서 기술된 인식 과정에 의해 항원-보유 표적(종양) 세포에 대해 결합하는 것을 시작으로 일련의 생물학적 사건들을 수반한다.
상기한 CD8+ 세포 및 항원-제시 세포 또는 표적(종양) 세포 사이의 상호작용은 도 1에 도시된다. 상호작용은 항원이 APC 또는 표적 세포 상의 MHC 클래스 I 분자와 함께 T 세포 항원 수용체(TCR)에 결합하는 것으로 시작한다. 림프구 기능 항원(LFA-1, LFA-2 및 LFA-3), 세포내 부착 분자 1 (ICAM-1), T 세포 공동-자극 인자 (CD2, CD28, B7)와 같은 보조 분자는 세포-세포 부착을 향상시키거나 또는 추가적인 세포 활성화 신호를 전환시킨다.
세포-세포 상호작용 후, CTL은 가용성 세포용해성 매개자(T 세포 내 세포질 과립 내에 저장된 퍼포린 및 그랜자임) 및 CTL 표면 분자(Fas 리간드)의 작용을 통해 표적 세포를 죽인다. 세포용해성 공격 후, 표적세포는 괴사(막 천공 및 세포 기관 파괴) 또는 아포토시스(크로마틴 축합, DNA 단편화 및 막팽윤)에 의해 사망한다.
림프구-매개된 세포용해의 매카니즘은 도 2에 그래프적으로 도시되어 있다. 도 2의 패널 A에서, 표적 세포에 결합한 후, CTL 내의 세포질 과립은 퍼포린 및 그랜자임을 함유한 과립을 세포내 공간으로 방출하기 위해 표적 세포로 재빠르게 재배치된다. 이들 단백분해 효소는 표적 세포의 원형질 막 내에 구멍을 형성하여 마침내 세포 괴사를 유도한다. 패널 B에서, 표적 세포에 결합한 후, CTL 상의 Fas 리간드 발현의 수준은 증가한다. 표적 세포 상의 Fas 리간드 및 Fas 수용체의 상호작용은 아포토시스를 유발한다. CPP32 및 IL-1b-전환 요소(ICE)와 관련된 기타 효소 같은 프로티아제는 아토포시스에 유도에 관련되어 있다. 자연 발생적 항원-제시 세포, 예를 들면 수상 세포, 대식 세포,자가 종양 세포를 인 비트로 CD8+ 활성화를 위해 사용하는 것이 가능하다. 그렇지만, 이러한 접근법에 따른 활성화의 효율은 낮다. 이는 네이브 APC의 클래스 I 분자는 종양 에피토프 외에도 많은 다른 형태의 펩티드 에피토프를 함유하고 있기 때문이다. 대부분의 펩티드는 정상 무독성 세포 단백질로부터 유도되고, 종양에 실질적으로 효과적인 활성 비-항원노출 APC의 수를 희석시키는 결과를 유발한다(Allison et al., Curr. : Op. Immunol.(1995) 7 : 682-686).
이 문제에 대한 보다 직접적이고 효과적인 접근법은 특이적 질병(암과 같은)의 치료에 관한 에피토프 또는 종양 특이적 항원(멜라노마-특이적 항원)으로 CD8+ 세포를 특이적으로 활성화시키는 것이다. 이를 위해, 인위적인 항원 제시 세포가 초파리(과일 초파리) 세포 내에서 MHC 클래스 I 분자를 발현시킴으로써 창조된다. 초파리는 면역계를 가지고 있지 않기 때문에, 클래스 I 분자 상으로 펩티드 에피토프를 로딩하는데 수반되는 TAP-1,2 펩티드 수송자가 없다. 결과적으로, 클래스 I 분자는 빈 용기로서 초파리 세포 표면 상에 보인다. 이들 형질감염된 초파리 세포를 암 또는 종양 특이적 에피토프, 멜라노마 특이적 에피토프를 포함하지만 이에 제한되지 않는 클래스 I 분자와 결합하는 외인성 펩티드와 함께 인큐베이션시킴으로써, 모든 클래스 I 분자를 동일한 펩티드로 채우는 것이 가능하다. 이들 초파리 APCs 내에 단일 펩티드를 함유한 클래스 I 분자의 고밀도 발현은 항원 펩티드에 대해 완전히 특이적인 세포독성 CD8+ T 세포를 인 비트로에서 발생시키는 것을 허용한다. 초파리 세포를 제조하는 방법 및 절차는 다음에 교시되어 있다: 1996년 6월 25일에 특허허여된,"In vitro Activation of Cytotoxic T-Cells Using Insect 세포Expressing Human Class I MHC and, β2-Microglobulin" 명칭의 미국특허 제5,529,921 호, 1994년 5월 24일에 특허허여된, "Drosophila Cell Lines Expressing Genes Encoding MHC Class I Antigens And, β2-Microglobulin and Capable of Assembling Empty Complexes and Methods of Making Said Cell Lines" 명칭의 미국특허 제 5,314,813호. 특히, 미국특허 제 5,529,921호는 칼럼 26, 56줄부터 칼럼 28, 22줄에서 전구체 세포를 분리하고 및/또는 배양물을 재배시키는 다양한 방법을 개시한다.
부가적으로, 이 특징은 고용량의 다양한 시토킨을 이용한 면역계의 생체내 자극에 대한 필요성을 없앤다. 이로 인해 시토킨에 의해 야기된 부작용을 능가하는 치료를 유도한다. 택일적으로 환자가 장점을 취할 수 있는 적절한 상황 또는 조건 하에서, 환자가 저용량의 α 인터페론, γ-인터페론 및/또는 IL-2와 동시에 치료될 수 있다.
시토킨으로 생체내 자극시키는 필요성을 없앰으로써, 환자 치료의 질을 향상시킬 수 있다. 환자에게 시토킨을 투여하는 것을 포함하는 치료 계획은 구역질, 구토, 및 열과 같은 감기-유사 증상을 가진 환자가 종종 발생하게 한다. 이들 부작용은 일반적으로 생명을 위협하는 것은 아니지만, 이미 약해진 상태의 환자에서 발생하는 특히 심각한 반응은 생명을 위협할 수 있다. 또다른 고려사항은 환자 순응도 및 다른 유용한 치료 계획에 대한 복약 순응도에 대해 그러한 부작용이 나쁜 영향을 미친다는 것이다. 시토킨을 이용한 생체내 자극의 필요성을 제거하는 것은 환자의 편안함을 향상시키고, 환자가 더욱 잘 따를 수 있는 효과적인 치료 방법을 의사에게 제공하는 치료 계획을 유도한다.
종양 입양 면역치료에 대한 이 방법의 유용성은 형질감염된 초파리 세포를 T 세포 수용체(TCR) 형질전환유전자 마우스의 2C 세포주로부터의 APCs 및 CD8+ 세포로서 사용함으로써 마우스에서 입증되었다. 이 시스템에서, 정제된 CD8+ 2C 세포는 역시 공동-자극 분자 B7-1 및 ICAM-1을 보유한 MHC 클래스 I(Ld)-형질감염된 초파리 세포에 의해 제시된 인 비트로 펩티드에 대해 고도로 반응성이다. 자극에 대한 최소 요구조건을 정의하는 프로브로서의 형질감염된 초파리 세포는 CD8+ T 세포를 언프라임하였다(Cai et al., P. N. A. S. USA (1996) 93: 14736-14741). 택일적으로, 비분리된 마우스 비장 세포가 정제된 2C 세포 대신 리스폰더(responder)로서 사용된 경우, 공동-자극 분자에 대한 필요가 없다. 이 경우, 비장 내의 CD8+ 세포는 활성화된 B 세포로부터 "방관자(bystander)" 공동-자극을 받는다. 이 발견을 이용하여, MHC 클래스 I(Ld)-형질감염된 초파리 세포가 정상 DBA/2 마우스 비장 세포가 부가된 림포킨 부재하에 인 비트로에서 상승적 P815 비만육종 종양-특이적 펩티드에 반응하도록 유도할 수 있다. 이들 CTLs을 P815 비만육종을 보유한 DBA/2 마우스 내로 주입하는 것은 빠른 종양 경감을 유도하였다(Sun et al., Immunity (1996) 4: 555-564).
절차적으로, 정상 DBA/2 마우스 비장 세포는 P1A.35-43 펩티드, DBA/2-유래 P815 비만육종 세포주로부터의 종양-특이적 에피토프로 로딩된 MHC 클래스 I(Ld)-형질감염된 초파리 세포와 함께 배양시켰다. 배지로부터 5일후 성숙된 림프구는 인 비트로에서 P815 종양 세포에 대해 강한 세포독성 T 림프구(CTL) 활성을 나타내었지만, P1A. 35-43을 발현하지 않는 P815의 돌연변이 세포주인 P1024를 세포용해하는 데는 실패하였는데 도 3, 패널 A에 나타낸 바와 같다. 이들 CTL을 3일 이전에 P815 세포로 미리 접종된 DBA/2 마우스 내로 주입시키면, 종양은 첫 주 동안 방해없이 자라지만, 다음 주 내에 제거되었고, 도3 패널 B에 도시된 바와 같다. 특이성은 CTL이 바이러스 누클레오단백질 펩티드와 같은 관계없는 항원에 대해 인 비트로에서 면역화된 때 P815 성장에 대한 어떤 영향도 없음에 의해 입증되었는데, 도 3, 패널 B에 나타낸 바와 같다. 요약하면, 주요 조직적합성 복합체 클래스 I(Ld)-형질전화된 초파리 세포는 정상 DBA/2 마우스 비장 세포가 부가된 림포킨 부재하에 인 비트로에서 상승적 P815 비만육종 종양-특이적 펩티드에 반응하도록 유도할 수 있다. 이들 CTLs을 P815 비만육종을 보유한 DBA/2 마우스 내로 주입하는 것은 빠른 종양 경감을 유도하였다 (Wolfel et al., J. Exp. Med. (1993) 178 : 489-495).
인 비트로에서 인간 연구
건강한 개체로부터의 인간 CTLs는 인 비트로에서 티로시나제에 대해 면역화되었다. 초파리 세포만으로 1차 자극시킨 후, 티로시나제-보유 JY 세포의 특이적 세포용해가 테스트된 모든 CTL 이펙터 대 JY 표적 비에서 분명하였다. 건강한 개체로부터의 티로시나제-특이적 CTL은 완전 자극/재-자극 프로토콜을 사용하여 유도되었고 Malme 3M 멜라노마 세포주를 죽이는 그 능력에 대해 테스트되었다. 한두 개의 가능한 예외를 제외하고는 Malme 3M에 대한 특이적 CTL 활성이 다양한 정도로 모든 도너에서 유도되었다. 모든 부분에서, 대조 Malme 3 종양 세포에 대한 반응성은 최소였다. 멜라노마 환자로부터의 세포는 유사한 활성 및 건강한 지원자로부터 유래한 세포에 대한 특이성을 갖는 CTL을 발생시키도록 티로시나제 에피토프에 대해 인 비트로에서 면역화되었다.
인비트로에서 세포독성 T 림프구를 발생시키기 위해 자연, 또는 인위적, 항원 제시 세포(APC) 계를 사용하는 것은 이들 계가 발생시킬 수 있는 항원 특이성에 의해 제한된다.
다음 APC 계는 단일 에피토프에 대해 항원-특이적 CTL을 발생시키는데 이용된다: 1) 정의된 펩티드로 펄스된 인간 수상 세포(DC); 2) 림프아구로 성장할 수 있고 펩티드로 펄스된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC); 3) 자연 펩티드가 산-제거되고 대상 펩티드로 로딩된 림프아구 세포주(LCL); 4) 빈 클래스 I 분자를 발현하도록 설계된 초파리 세포; 및 인간 클래스 I 및 공동-자극 분자로 형질전환된 마우스 3T3 세포(J. B. Latouche and M. Sadelain, Nature Biotech (2000) 18: 405-409).
수상 세포(DC)는 인간에서 주요 항원 제시 세포계로 생각되는데 왜냐하면 주요 항원 세포를 제시하는데 넓게 응용되기 때문이다. 자가 또는 외래 단백질은 DC 내에 포함된다. 결과의 펩티드 에피토프는 HLA 분자에 의해 제시되고 DC의 표면으로 수송된다. 그렇지만, DC는 서로 다른 네가지 펩티드에 대한 CTL을 인비트로에서 지속적으로 발생시키지 않는다는 것이 발견되었다. 부가적으로, DC의 표현형은 펩티드 펄스 시에 성숙 또는 미성숙이 결과에 영향을 미치지 않는 것으로 발견되었다.
택일적으로, 초파리 세포 자극은 10개까지의 서로 다른 형태의 펩티드에 대한 CTL을 통한 발생시킨다. 이는 각 10개 펩티드에 대해 활성인 CTL을 제공한다.
DC 및 형질감염된 초파리 세포를 비교하기 위해, CTL 반응을 유도하는 초파리 세포 및 DC의 능력을 초기에 단일 펩티드 에피토프에 대해 각각에 대한 표준 자극 프로토콜에 따라서 평가되었다. 미성숙 DC는 IL-4 및 GM-CSF 존재 하에 1주일간 자가 단구를 배양함으로써 발생되었다. 성숙 DC는 TNFα를 수확 24시간 이전에 배양 배지에 부가함으로써 미성숙 DC로부터 얻어졌다. DC(성숙 및 미성숙)이 수확되었고, 펩티드로 펄스되었고 CD8 세포 및 펩티드-펄스된 초파리 세포의 자극에 사용되는 절차에 따라서 정제된 CD8 세포와 혼합되었다. 초파리 세포는 도 7에 나타낸 바와 같이, 티로시나제 펩티드 에피토프 689에 대해 평가될 때 DC 보다 일반적으로 더 나은 자극제인 것으로 발견되었다. 또한, 미성숙 또는 성숙 표현형(도 8)을 나타내는 DC는 정의된 펩티드가 APC를 펄스시키는데 사용된 때 특이적 CTL 반응을 유도하는 데에 있어서 초파리만큼 효율적이지 않았다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 한 명의 도너와의 대조 연구가 수행되었다. 특이적 사망은 파리 세포를 사용할 때 네 가지 서로 다른 펩티드에 대해 발생된 반면 미성숙 DC는 불충분한 특이적 사실을 유도하였고 성숙한 DC는 자극을 위해 사용된 네 개 펩티드 중 단지 하나에 대해서만 특이적 사망을 유도하였다.
세포독성 림프구의 제조
항-CD8 항체로 양성 선택된 백혈구채혈 샘플로부터 분리된 CD8+ 세포는 인간 클래스 I 분자(HLA-A2.1), B7.1, ICAM-1, LFA3 및 B7.2를 발현시키는 초파리 세포에 의해 제시된 서로 다른 네 개의 멜라노마 관련된 펩티드에 대해 자극되었다. CD8+ 세포는 IL-2 및 IL-7 존재 하에 펩티드 에피토프로 로딩된 자가 단구로 두 번 재자극되었다. CTL은 OKT3 및 IL-2로 비-특이적으로 확장된다. CTL 활성은 Malme 3M 세포에 대해 측정되고 CD8+ T 세포의 순도는 유세포 분석법(flow cytometry)에 의해 평가된다.
제조 방법 및 프로토콜은 우수 실험실 기준(Good Laboratory Practices) 및 우수 제조 기준(Good Manufacturing Practices)에 따라 수행된다. "Good Laboratory Practices" 및"Good Manufacturing Practices"는 미국 식품의약안전청에 의해 규정된 실험실 및 제조 기준의 표준이고 당업자에게는 이미 공지되어 있다. CTL은 물질확인, 생존율, CTL 활성, 무균도, 및 엔도톡신 함량에 대해 모니터 링된다.
유방 및 난소암 치료를 위한 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 펩티드 에피토프의 리스트는 다음 표 1에 도시되어 있다. 다음 표 1에 열거된 것에 부가하여 다양한 펩티드 에피토프가, T 세포 에피토프인 한, 유방 및 난소암 치료를 위한 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합하다.
표 1
유방 및 난소암 표적으로서 종양 관련 항원에 대해 확인된 HLA-A2.1 제한된 에피토프
Figure 112003030550189-pct00002
Figure 112003030550189-pct00003
다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 제공되지만, 본 발명이 실시예의 내용으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
초파리 항원 제시 세포의 제조
Schneider S2 세포주를 공개된 절차에 따라서 노랑 초파리(Oregon-R)로부터 제조하였고 American Type Culture Collection (CRL 10974)에 기탁되었다. S2 세포는 10% 소태아혈청이 보충된 시판되는 Schneider 초파리 배지에서 성숙시킨다.
S2 세포 내 MHC Class I 및 공동-자극 단백질의 발현을 위한 pRmHa-3 플라스미드 벡터가 문헌 내에 기술된 바와 같이 축조된 pRmHa-1 발현 벡터로부터 유래되었다. 이는 메탈로티오네인 프로모터, 금속 반응 보존 서열 및 노랑 초파리로부터 분리된 폴리아데닐화 신호를 보유한 알콜 디하이드로게나제 유전자를 함유한다.
형질감염을 위한 상보적 DNA는 다음과 같이 제조되었다.
HLA-A2.1 및 β-2 마이크로글로불린 : 공개된 서열로부터 유래한 프라이머를 사용하여 K562 세포로부터 역전사-PCR
B7.1: 공개된 서열로부터 유래한 프라이머를 사용하여 K562 세포로부터 역전사-PCR
ICAM-1: 공개된 서열로부터 유래한 프라이머를 사용하여 K562 세포로부터 역전사-PCR
B7.2 : 공개된 서열로부터 유래한 프라이머를 사용하여 HL-60 세포(ATCC CCL-240)로부터 역전사-PCR
LFA-3 : 공개된 서열로부터 유래한 프라이머를 사용하여 HL-60 세포(ATCC CCL-240)로부터 역전사-PCR
상보적 DNA는 pRmHa-3 벡터 내로 개별적으로 삽입되었다. S2 세포는 칼슘 포스페이트 침전법을 사용하여 HLA-A2.1, B7. 1 및 ICAM-1 플라스미드 DNAs 및 phshneo 플라스미드의 혼합물로 형질감염되었다. 안정하게 형질감염된 세포는 제 네티신을 함유한 Schneider 배지를 배양하여 선택되었다. 사용 24시간 전에, 형질감염된 세포가 CuSO4를 부가하여 유도되었다. 발현 수준은 항-HLA-A2.1, 항-B7. 1 및 항-ICAM-1 항체를 사용하여 유세포 분석법에 의해 측정되었다. 30% 이상의 세포에 의한 HLA 발현은 CD8+ 림프구의 효과적인 인 비트로 활성화에 필요하다.
인간 CD8+ 세포의 분리
CD8+ 세포는 DynabeadsTM 분리 절차 (Dynal)를 사용하여 양성 선택에 의해 백혈구성분채집술(leukapheresis) 샘플로부터 분리되었다. 항-인간 CD8 마우스 단클론 항체 (인간 γ 글로불린 내 50 μg/ml [GammagardTM])를 1% 인간 혈청 알부민 (Baxter-Hyland) 및 0.2% Na 시트레이트로 보충된 Dulbecco's PBS 내의 세척된 세포 내에 부가시킨다. 4 ℃에서 45분간 부드럽게 혼합시키면서 인큐베이션한 후, 세포를 비드 대 세포 비가 1:1 비율인, 양 항-마우스 IgG 코팅된 Dynal 자기 비드 (DynabeadsTM)를 함유한 동일 버퍼 내에서 세척하고 재현탁시킨다. 세포 및 비드를 살균 튜브 내에 두고 4 ℃에서 45분간 부드럽게 혼합시킨다. 이 시간이 끝날 쯤에, 항체-결합 세포를 제조자 지시(Dynal)에 따라 MPC-1® 분리기를 사용하여 자기적으로 제거된다. CD8 세포-비드 복합체의 분리는 CD8 펩티드59-70 (AAEGLDTQRFSG; SEQ ID NO: 12)의 존재 하에 45분간 37 ℃에서 인큐베이션하여 이루어진다. 유리 비드는 자기적으로 제거되고 CD8+ 세포는 순도를 측정하기 위해 유세포 분석법에 의해 카운트하고 분석되었다. CD8+ 세포로부터의 회복은 보통 80%이상이다. 표 1은 항-CD8 항체로 양성 선택에 의한 정상 인간 PBMC 프레퍼레이션으로부터의 14개 분리된 CD8+ 프레퍼레이션의 세포 조성을 요약한다.
표 2
유세포분석법에 의해 분석된 양성 선택에 의한 CD8+ 세포의 정제
세포 타입 PBMC
평균% (범위)		 후 선택
평균% (범위)
CD8 T 세포 15% (7-24) 82% (56-95)
CD4 T 세포 36% (14-52) 2% (0.1-10)
CD 14 단구 15% (7-26) 0.8% (0.2-2)
CD15 호중구 12% (8-21) 0.6% (0.1-3)
CD19 B 세포 2% (0.4-7) 3% (0.5-9)
CD56 NK 세포 6% (2-17) 6% (0.1-20)
정제된 인간 CD8+ 세포의 인 비트로 면역화
1차 자극
형질감염된 초파리 S2 세포를 10 % 소태아 혈청 및 CuSO4 로 보충된 Schneider 배지 (106 세포/ml) 내에서 27 ℃에서 24시간동안 배양시킨다. 세포를 수확하고, 세척하고 100 μg/ml 인간 티로시나제369-377를 함유한 Insect X-press 배지 (BioWhittaker) 내에 재현탁한다. 27 ℃에서 3시간 인큐베이션에 연이어, S2 세포를 CD8+ 세포와 1:10의 비로 10% 자가 혈청으로 보충된 RPMI 배지 (Gibco) 내에서 혼합시킨다. 세포 혼합물을 4일간 37 ℃에서 인큐베이션시켜 초파리 세포를 제거한다. 5일째에, IL-2 (20 U/ml) 및 IL-7 (30 U/ml)를 부가하여 티로시나제-특이적 CTL 집단을 선택적으로 확장시킨다.
재-자극
백혈구성분채집술 시에 얻어진 동결, 자가, CD8-고갈된 PBMC를 녹이고, 세척하고 10% 자가 혈청 (β2 마이크로글로불린의 공급원으로서) 및 20 μg/ml 티로시나제369-377를 함유한 RPMI 배지 내에서 106 세포/ml로 재현탁한다. γ-조사(5,000 rads)에 이어, 세포를 37 ℃에서 두 시간 배양시킨다. 비-부착 세포는 Dulbecco's PBS로 세척시켜 제거한다. 부착 단구는 10% 자가 혈청 및 10 μg/ml 티로시나제369-377를 함유한 Hepes-완충된 RPMI 배지 내에서 90분간 인큐베이션시켜 티로시나제 에피토프로 로딩시킨다. 상청액을 제거하고 초파리-활성화된 CD8+ 세포 현탁액 (10% 자가 혈청을 갖는 RPMI 배지 내의 3 x 106 세포/ml)을 10 CD8+ 세포 대 1 부착 단구의 비율로 부가시킨다. 37 ℃에서 삼사일 배양한 후, IL-2 (20 U/ml) 및 IL-7 (30 U/ml)를 배지 변경과 함께 부가하여 티로시나제-특이적 CTL 집단을 선택적으로 확장시킨다.
비-특이적 확장
주효 세포는 자가 혈청, 항-CD3 단클론 항체 (OKT® 3), IL-2 및 γ 조사된 자가 PBMCs로 보충된 RPMI 배지 내에서 배양시킴으로써 비특이적으로 확장시킨다.
활성 및 순도에 대한 어세이
CTL 어세이
Malme 3M 세포는 5lCr 방출 어세이에서 표적 세포로서 사용된다. 4% 소태아 혈청, 1% HEPES 완충액 및 0.25% 젠타마이신를 함유한 RPMI 배지 내의 5 x 106 Malme 3M 세포를 0.1 mCi5lCr로 37 ℃에서 1시간 동안 표지화시킨다. 세포를 네 번 세척하고 10% 소태아 혈청 (HyClone)을 가진 RPMI 내의 105 세포/ml로 희석시킨다. 96-웰 마이크로적정 플레이트 내에서, 100 μl 이펙터 CTL 및 100 μl 펩티드-로딩된, 5lCr-표지된 Malme 3M 표적 세포를 100:1, 20:1 및 4:1 (이펙터 : 표적)의 비로 조합시킨다. K562 세포는 20: 1 (K562: Malme 3M)의 비로 부가되어 자연 킬러 세포 배경 용해를 감소시킨다. 비특이적 세포용해는 비종양 HLA-A2.1 섬유아세포주, Malme 3를 사용하여 평가된다. 5lCr의 자연발생 방출 및 최대 방출을 측정하기 위한 대조구가 두 개 포함된다. 37 ℃에서 6시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 원심분리하고 51Cr 방출을 측정하기 위해 상청액을 카운트한다.
특이적 세포용해%는 다음 식을 사용하여 계산된다:
(cpm 샘플 - cpm 자연발생 방출)/(cpm 최대 방출- cpm 자연발생 방출) x 100
유세포 분석법
CD8+ 세포는, 인 비트로 활성화 전후, 형광 단클론 항체 및 FACS 분석을 사용하여 다수개의 세포 표면 마커에 대해 분석되었다. 건강한 도너로부터의 세포를 사용하여 대표적인 활성화 프로토콜의 결과는 도 2에 보여진다.
표 3
인 비트로 활성화된 CD8+ 세포 유세포 분석
마커/세포 타입 활성화-전
평균%		 활성화-후
평균%
CD8 T 세포 98 99
TCRαβ T 세포 수용체 98 92
CD44 림프 노드 호밍 수용체 91 99
CD45RO 메모리 T 세포 58 88
CD45RA 41 31
CD56 62L HEV 호밍 수용체 24 38
CD56 NK 세포 1 11
CD25 활성화된 T 세포 0.1 29
활성 및 순도에 부가하여, CTL 프레파레이션이 살균도 및 엔도톡신 함량에 대해 어세이된다.
시약
시약 공급자 등급 비고
rh IL-2 Chiron USP 살균 용액
rh IL-7 Genzyme 연구용 동결, 살균 용액
인간 티로시나제369-377 연구용
DynabeadsTM M-450 Dynal GMP 양 항-마우스 IgG 자기 비드
인간 혈청 알부민 Baxter USP 살균, 비-발열성 간염 바이러스-없는, 25% 용액
소태아 혈청 Gemini 연구용 살균, BSE-, 엔도톡신-, 마이코플라스마- 없음
GammagardTM Baxdter USP 주사용 살균, 인간 면역 글로불린 용액
항-CD8 항체 연구용 마우스 항-인간 CD8 단클론 항체
CDS 펩티드59-70 연구용 자기 비드로부터 CD8+ 세포 방출
W6/32 ATCC 연구용 마우스 항-인간 HLA-A, B, C 단클론 항체
세포주
세포주 공급자 비고
초파리 S2 ATCC CRL 10974
M3 UCSD 비-HLA-A2.1 인간 멜라노마
Malme 3 ATCC 멜라노마 환자로부터의 정상피부 섬유아세포
Malme 3M ATCC 폐로부터의 전이성 멜라노마(Malme 3에서와 동일한 환자)
M14 UCSD HLA-A2.1 인간 멜라노마
K562 ATCC 인간 적혈백혈(erythroleukemic) 세포주; NK 세포에 대한 표적
JY 세포 ATCC HLA-A2.1 및 B7을 발현하는, EBV-형질전환된 인간 B 세포주
P815 및 P1024 ATCC DBA/2 마우스 비만육종 세포주
Jurkat A2.1 ATCC 인간 HLA-A2.1로 형질감염된 급성 T 세포 백혈병
ATCC: American Type Culture Collection
실시예 2
멜라노마에 대한 세포독성 T 세포 주입 시험
시험의 목적
이 실시예는 다음 인자에 의해 평가될 때 멜라노마 치료에서의 세포독성 T 세포 주입의 효과를 교시한다:
1. 인 비트로 면역화 후 재-주입 자가 CTLs의 안전성 및 내성
2. 제한 희석 분석에서 전신 순환 인자에서의 주입된 CTLs의 동력학
3. 라디오신토그래피에 의한 전체적인 신체 분포
4. 면역조직학에 의한 생체검사 결절의 세포 조성(CTLs, TH,NK, B 세포); 및
5. 두달에 걸친 측정가능한 상처 회복 및 반응 지속시간
환자 집단
치료 적격성은 조직학적으로-기록된, 외과절제될 수 없는 측정 또는 평가가능한 멜라노머를 갖고, HLA-A2 하플로타입을 갖는 환자를 요구한다. 예비치료 평가는 MRI 또는 CT 스캔에 의한 뇌의 방사학적 평가, 가슴 및 배의 CT 스캐닝, 및 특히 피부 및 림프절의 물리적 검사를 포함한다. 치료받은 총 환자수는 15명(9명의 남자 및 6명의 여자)이었다. 나이는 33 내지 75세의 범위이고 평균 58세이다. 전이성 질병의 평균 지속기간은 1.5년이었다. 면역성 결여가 존재하지 않는지를 결정하는 예비치료 피부 테스트는 평가된 모든 7개 공통 항원에 대해 음성인 5/14 테스트이면서 14/15 환자에 대해 수행되었다. 환자는 HLA-A2 하플로타입에 대해 FACS 분석에 의해 HLA-A2 특이적 단클론 항체 (BB7.2)로 선별되었다. 하위분류는 PCR 분석에 의해 수행되었다. 한명을 제외한 모든 환자는 HLA-A*0201이고, 그 예외는(환자 08) HLA-A*0205이었다.
생체외 발생된 자가 CTLs을 이용한 치료
15명의 환자를 이 임상 프로토콜 하에서 치료시켰다. 모든 환자는 자가 CTLs의 최소한 한번의 주입을 받았다. 사이클 수 및 각 환자에 투여된 세포 용량은 표 1에 요약된다. 인 비트로에서 발생된 세포 수는 aphaeresis 절차로부터 분리된 PBMCs의 수 및 각 PBMC 프레파레이션 내에 존재하는 CD8+ T 세포의 수와 같은 환자-관련 인자에 의존한다. 인 비트로에서 발생된 모든 세포는 도너에게 재주입되기 때문에, 각 환자에 투여되는 용량은 필수적으로 가변적이다. 환자 사이의 용량을 표준화하기 위해, 계산된 "강도" 점수가 각 용량에 대해 기록되었다. 이 값은 세포의 총수를 펩티드-로드된 표적 세포로 얻어진 세포용해 활성을 곱하여 얻어졌다. 주입된 T 세포의 용량은 최소 4x107 (환자 08)부터 최대 3.2x109 (환자 13)까지의 범위였다. 환자들을 각 사이클 말단의 임상적 상태에 기초하여 2회, 3회 또는 4회의 치료 사이클로 진입시켰다. aphaeresis 샘플로부터 얻어진 PBMC의 수는 추가적인 사이클을 격는 환자에서 낮아지는 경향이 있고, 특히 연속하는 사이클의 시작이 전 사이클의 끝부분과 가까운 경우에 그러하다. 이것은 전 사이클 도중 투여된 IFNα-2b로 인한 지속적인 림프구감소에 기인한다. 분리된 네이브 CD8+ T 세포의 총수는 각 PBMC 프레파레이션 내의 그 퍼센트에 의존한다. CD8+ T 세포의 퍼센트는 환자들 사이에서 8% 내지 31 % 사이이다. 얻어진 확장 인자는 최종 세포 수에도 기여하고 0.1 내지 6.0 배의 범위이다. 생체외 CTLs 발생을 위한 절차는 상기한 명세서 및 실시예 1에 설명된다.
IFNα-2b에 대한 반응에서 클래스 I 및 멜라노마-관련 항원의 상승 조절
생체내 멜라노마 세포를 용해하는 항원-특이적 CTLs의 능력을 향상시키기 위한 시도로서, 저용량 IFNα-2b를 CTL 주입 이전에 5일 동안 연속하여 투여하고, 추가 4주 동안 1주에 두 번씩 투여하였다. 시토킨에 대한 생체 내 반응을 측정하는 방법 중 하나는 특정 항체를 이용한 양성 염색에 대한 면역조직화학적 분석에 의해 일련의 시점에서 얻어지는 조직검사를 평가하는 것이다. 일련의 조직검사는 클래스 I 및 항원 발현의 평가를 위해 다수개 피부 상처를 갖는 한 환자(환자 04)에게서 얻어졌다. 클래스 I 및 MART-1 발현을 나타난 조직검사는 어떠한 치료이전에 약하게 양성이었다(조직검사 A). 10MU/m2의 피하 주사 5일 후, 이들 두 개의 마커에서 큰 증가가 발견되었다(조직검사 B). 티로사나제 및 gp100에 대해, 면역조직 화학적염색은 예비처리 샘플(조직검사 A)에서 음성부터 약한 양성이었다. 초기 5일의 IFNα 투여 및, 13개 추가적 처리 후, 이들 후 항원의 발현이 염색된 조직 샘플에서 증가되었다(조직검사 C).
생체외-발생된 CTLs의 항원 특이성
모든 환자로부터 발생된 CTLs은 조직검사 재료가 세포주 확인을 위해 이용가능한 경우, 펩티드-로드된 T2 표적, HLA-A2 멜라노마 세포주(Malme3M) 및자가 멜라노마 세포주에 대해 방출된 날 평가되었다. 각각 제조된 용량의 세포는 세포분해 활성에 대해 평가되었다. 팹티드-로드된 T2 세포는 각 펩티드를 단독으로 제시하거나 모든 네 개의 펩티드를 통시에 제시하고, 각 환자에 대해 발생된 CTL 반응의 특이성을 결정하기 위해 사용되었다. 내적으로-발현된, 멜라노마-관련, 항원-보유 세포를 용해하는 능력은 HLA-A2 적합 세포주 또는 자가 종양 세포주로 평가되었다. 세포용해 활성에 부가하여, 항원-특이성이 특이적 펩티드 자극에 반응하여 행해지는 세포내 γ 엔터페론 생성 검출을 위한 확립된 방법에 의해 평가되었다. 생체 외 프로토콜의 말미에 발생하는 CTLs는 이 방법에 의해 평가되었다. 각 펩티드에 특이적인 세포의 퍼센트는 각각 기록되었다. 환자 13으로부터의 각 벌크 CD8 배양물 내의 특이적 세포의 총수는 T 세포 집단에서 검출되는 각각의 펩티드 특이성을 부가함으로써 계산되었다. 특이적 세포의 총수의 증가는 각 연속적 치료 사이클로 검출될 수 있다.
CTL 요법 후 종양 조직검사에 침투하는 CD8 및 CD4 세포의 검출
치료 이전, 도중 및 후 모든 환자로부터의 조직검사 샘플이 이상적일 수 있다. 그렇지만, 실험 조건은 단지 하나의 제한된 수의 환자로부터의 조직검사 샘플에 대해서만 허용되었다. 종양 조직은 연구에 등록된 15 환자 중 5명으로부터 얻어졌다. 두 환자에서(환자 08 및 13) 조직검사 샘플이 각각 T 세포 요법 5 및 5주 후에 얻어졌다. 조직 샘플 검사 결과 모두 침윤성 CD8 및 CD4 세포가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 종양 샘플 중 하나는 머리 후부부의 피부 손상으로부터 얻어졌고, 이는 세포의 제 2 주입 4주 후, 팔로우 업 검사에 의해 크기가 증가하였다. 조직검사결과 림프구로 심하게 침윤된 조직의 괴사가 나타났다. 다른 조직검사는, 힙 교체 수술 도중 제거된 대퇴골 머리로부터 얻어졌다. 환자 08로부터의 피부 손상부는 일반 클래스 I, 및 특이적 HLA-A2 마커 모두에 대해 모두 약한 양성(4+)이었다. 티로시나제 및 gp100은 약한 양성(1+ 및 2+, 각각)이고, 반면MART-1은 동일 샘플 내에서 음성이었다. 환자 13으로부터의 조직검사 영역은 또한 더욱 이질적 염색으로 괴사를 일으켰고; 별개의 종양 세포 집단은 HLA-A2.1 분자 및 하나 이상의 MAA 발현이 결여되었다. 그렇지만, 손상되지 않은 조직 영역은 강한 클래스 I(4+) 및 모든 멜라노마-관련 항원인 것으로 나타났다. 후자인 샘플 내의 림프구 침윤은 종양 결절을 깊게 침윤한다기 보다는 그것을 둘러싸는 것으로 보였다. 그렇지만, 종양과 직접 관련된 세포의 많은 퍼센트는 CD8 세포였다. 이들 환자 모두로부터의 예비처리 조직검사 샘플의 결여는 치료 이전 조직 샘플 내에서 유사한 타입의 침윤 세포의 확인을 방지하였다.
T-세포 요법 후 CT 스캔은 목적하는 반응을 확인한다
CT 스캔은 예비처리 선별 기준 및 후 치료 팔로우-업 검사의 일부이다. 환자 10은 예비처리 스캔(6/23/99) 5주 후 8 X 108 CTLs을 단일 주입받았다(7/27/99). 가슴 CT 스캔이 주입 한달 후 반복될 때(8/27/99), 폐 상처의 크기가 극적으로 증가하는 것으로 나타났다. 유사하게, 환자 14는 등록 절차의 일부로서, 6.6 X 108 세포의 첫 번째 주입(10/5/99) 전 3.5주 전에 가슴 CT 스캔을 받았다(9/10/99). 팔로우-업 CT 스캔(1/7/99)이, 11.5 X 108 세포로 제 2 주입한 한달 후에 행해졌고, 세 개의 별도 상처부위에서 극적인 감소가 나타났다. 환자 13은 전 및 후 CT 스캔에서 측정된 바와 같이 목적하는 반응을 가졌다. 기관주위 선병증은 사이클 I 후 7.8cm2(연구 이전)에서 4.4 cm2로 되었고, 사이클 II 후 사라졌다.
면역결핍 상태의 존재는 CTLs을 발생시키는 능력을 방해하거나 임상적 반응을 방해하지 않는다
이 프로토콜에 따라 치료받은 대부분의 환자는 미리 의료적 중재를 받았다. 7개 공통 항원의 패널에 대한 면역결핍 반응이 생체외 CTLs를 발생시키는 능력 결핍 또는 확립된 임상 반응을 방해하는 것과 상관관계가 있는 지를 결정하기 위해 전처리 피부 테스트가 수행되었다. 생체외 CTLs 발생 능력은 환자 전처리 피부 테스트 결과와 상관관계가 없다. 환자 03 및 04(모두 혼합 응답자)는 제 2 사이클 시작전 면역결핍상태로 남아있을 때 반복 피부 테스트를 하였다.
실시예 3
유방 및 난소 종양 세포를 세포용해할 수 있는 HER 2/neu 특이적 CTLs 의 발생
본 발명자들은 모든 형태의 암이 본 방법으로 표적화될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 다른 종양 타입에 대해서도 CTL-발생 기술을 적용할 수 있는지에 관심을 가졌다. HER-2/neu는 많은 인간 암, 주로 유방, 난소 및 대장의 선암종에서 증폭되고 과다-발현되는 EGFR에 대해 상동성을 갖는 프로토-암유전자이다. 이것은 공격적 질병과 종종 연관되어 있고 나쁜 예후의 표시가 될 수 있다. 이들 타입의 암에 대한 가능한 표적으로서 여러 임상 시험에서 연구되어 오고 있다.
1990년대 초, HER-2/neu HLA-A2.1 제한된 펩티드 에피토프는 컴퓨터-보조된 펩티드 결합 알고리즘 또는 자궁암 환자 복수로부터 분리한 CTL을 맵핑하여 확인되었다(표 3).
표 3
HLA-A2.1-제한된 HER-2/neu 펩티드
Figure 112003030550189-pct00004
모든 펩티드는 합성되고, 식별 번호가 주어지고(PRI#), 멜라노마-관련하여 T 세포 펩티드 에피토프에 대해 사용한 것과 동일한 방법을 이용하여 생체외 CTLs을 발생시키는 능력에 대해 평가되었다. CD8 세포는 CTL 펩티드 에피토프로 로드된 초파리 세포로 일상적으로 생체외 CTLs를 발생시키는 능력을 결정하기 위해 정상 도너로부터 분리되었다. 펩티드 826, 835, 861 및 863은 CTL 발생의 가장 높은 빈도를 가졌다 (표 4).
표 4
정상 도너에서 HER-2/neu CTL 발생의 빈도
Figure 112003030550189-pct00005
형질감염된 초파리 세포가 10개 까지의 서로 다른 펩티드 에피토프를 제시하는 고유한 능력을 가졌지만(도 10), 우리는 이들 펩티드에 대해 생체외에서 CTL을 발생시키는 빈도로 인해 네 개의 HER-2 펩티드 826, 835, 861 및 863를 선택하였다. 이들 서로 다른 네 개의 HER2 펩티드는 형질감염된 초파리 세포의 표면상에 제시된 HLA-A2.1 분자에 대해 약하거나 보통의 바인더를 나타낸다. 우리는 멜라노마-관련 펩티드에 대한 경험상 클래스 I 바인더가 네이브 T 세포 에피토프를 실제로 제시한다면, 종양 세포를 인식하는 강력한 CTLs를 일반적으로 발생시키는 것을 암시한다는 경험으로부터, 약한 A2 바인더를 포함하도록 의도한다. 우리가 표적화한 종양-관련 단백질의 대부분은 자기-항원이고 바이러스 펩티드로 보여지는 클래스 I 분자에 대해 강한 친화성을 갖는 것으로 기대된다. 낮은 것 내지 보통의 바인더는 일반적으로 가장 효율적으로 종양 세포를 세포용해하는 CTLs를 발생시킨다. 이는 초파리 세포에 낮은 친화성 바인더이면서, 펩티드-로드된 표적 세포(T2) 모두, 또는 더욱 중요하게는 멜라노마 세포(Malme3M)(도 12)를 용해할 수 있는 강력한 CTLs를 일상적으로 발생시키는 에피토프를 제시하는 MART-1 펩티드로 입증되었다(도 3).
HER-2/neu는 EGF-R군의 일종이며 성장 인자 수용체로서 작용한다.
HER-2 단백질은 사람에서 태아 발육 동안 발현된다. 성인에서는, 이 단백질이 많은 정상 조직의 상피 세포에서 약하게 검출가능하다. 정상 세포에서 HER-2 유전자는 단일 복제본으로서 존재한다. 유전자의 증폭 및/또는 관련 단백질의 과다발현은 유방, 난소, 자궁, 위 및 폐의 선암종을 포함하는 수많은 인간 암에서 확인되었다. HER-2 및 EGF-R 수용체 사이의 서열 차이는 표 5에 표시된다. 평가된 넷 중의 세 개의 HER-2 펩티드는 두 단백질 상에 3개 이상의 아미노산 변경이 있었다. 단일 아미노산 변경은 두 단백질을 구별하는데 충분하다.
표 5
HER-2/neu 대 EGF-R
Figure 112003030550189-pct00006
생체외 자극 프로토콜 4주후 일단 CTLs이 발생되면, 면역화 펩티드로 제조된 HLA-A2.1 테트라머 분자를 사용하여 펩티드 특이적 세포가 존재하는지 여부를 평가하였다. 도 13에서 입증된 바와 같이, 펩티드-특이적 CTLs을 발생시키는 능력은 도너-의존적이다. 패널 A에서(도너 261), 도너는 펩티드 835에 대해 강한 CTL 반응을 나타내었다(37.55%), 패널 B에서(도너 262), 펩티드-특이적 CTLs는 835 및 861 테트라머 분자(각각 3.6% 및 15.1%)로 검출될 수 있다. 이는 자극 프로토콜의 말미에 펩티드-특이적 CTLs를 보장하기 위해 다중 펩티드의 사용을 지지한다. 이는 비교적 쉽게 다중-특이적 CTLs를 발생시키는 것을 가능하게 한다.
항-펩티드 및 항-종양 반응
완전 생체 외 프로토콜 완료 후, 발생된 CTLs는 항원-특이성에 대해 평가되었다. CTLs를 발생시키기 위해, 0 일에 초파리 세포를 네 개의 HER-2 펩티드 조합으로 로드시켰다. 4주의 생체 외 자극 프로토콜의 말미에, 벌크 CD8 배양물을 항원-특이성에 대해 평가하였다. 각각의 면역성 펩티드로 로딩된 T2 세포는 표적 세포로서 사용되었다. 도 14에서, 전형적인 반응이 도시된다. 벌크 배양물은 각 네 개의 HER-2 펩티드에 대한 특이성을 함유한다. 항-종양 반응은 난소 종양 세포주(ATCC;HTB-77)에 대해 평가되었다. 표적 세포주가 HLA-A2.1-제한된 것이 아니면 이 세포주를 +/- 어세이 시스템을 가지도록 형질전환시켰다. HLA-A2.1가 HTB-77 세포주로 형질감염될 때, CD8 주효 세포에 의한 증가된 사망이 관찰되었다(도 15, 패널 A 내지 D). 각 펩티드를 제시하는 HER-2 특이적 이펙터는 이 종양 세포주 상의 각 펩티드 에피토프의 제시를 확인하도록 평가된다.
HLA-A2.1로 형질감염된 유방 선암종 세포주 (ATCC; HTB-131)은 또한 HER-2 특이적 펩티드 이펙터를 이용하여 종양 용해를 나타내는 능력에 대해 평가되었다. 펩티드 861에 대해 특이적인 CTLs은 HLA-A2.1 로 형질감염될 때 이 종양 세포주를 용해할 수 있었다(도 16).
종양 세포에 요구되는 IFNγ 치료
HTB-77/A2.1 세포주는 펩티드-특이적 세포용해를 입증하기 위해 IFNγ로 예비처리하는 것이 필요하다. 이 세포는 5lCr-방출 어세이 이전에 24시간 동안 500U/ml의 IFNγ (25ng/ml 특이적 활성)로 처리시켰다. 도 17에서, IFNγ의 부가는 HLA-A2.1 형질감염된 세포주의 세포용해가 증가하는 것을 유발하였다. HLA-A2.1 및 HER-2 모두의 표면 발현에 대한 IFNg의 이 용량의 효과를 결정하기 위해, FACS 분석이 유도 24시간 및 48시간 후 이들 분자의 수준을 결정하도록 수행되었다. 도 18에서, 패널 A 및 B는 FACS 분석 결과를 도시한다. 패널 A에서, IFNg로 유도후 24시간 및 48시간에 HTB-77 세포의 표면상에 HER-2분자가 증가하지 않았다. HLA-A2.1 형질감염된 세포에서, HER-2도 HLA-A2.1도 유사한 처리 프로토콜 후 발현의 표면수준이 증가하지 않았다. 주목할 만한 것은 mRNA 수준이 마이크로어레이 DNA 칩 분석에 의해 평가될 때, HLA-DM 및 -DR, Cathepsin S 및 D 및 Caspase 5뿐만 아니라 TAP-1 발현 수준도 증가한 것이다 (도 19). 이는 IFNγ 존재 하에서 HTB-77/A21 세포의 사망이 왜 증가했는지를 설명한다. 이 특정 분자의 증가는 더욱 효과적인 HER-2 분자의 처리를 유도하여 대상 펩티드의 제시를 더욱 우수하게 만든다.
펩티드
합성 펩티드가 펩티드 제조기(Gilson Company, Inc.)를 사용하여 표준 Fmoc 화학에 의해 제조되었다. 모든 펩티드는 C-8 칼럼 상의 역상 HPLC 에 의해 >95%으로 정제되었다. 순도 및 동정은 전기분무 이온화를 구비한 질량 분광분석기를 사용하여 확인되었다. 멜라노마-관련 펩티드는 다음을 포함한다: 펩티드 819는 MART-1 특이적이고 (AAGIGILTV SEQ ID NO : 6), 817 및 853는 모두 gplO0 펩티드 (각각 ITDQVPFSV SEQ ID NO : 4 및 KTWGQYWQV SEQ ID NO : 5), 티로시나제-특이적 펩티드는 689 및 792이고, 792는 펩티드 689에 의해 제시된 네이브 서열 (YMNGTMSQV SEQ ID NO : 1)의 번역후 변형 버젼 (YMDGTMSQV SEQ ID NO : 2)을 제시한다. 펩티드 826 (CLTSTVQLV SEQ ID NO : 7) 및 835 (KIFGSLAFL SEQ ID NO : 8)는 pl85 단백질의 각각 세포내 및 세포외 도메인으로부터 HER-2/neu 서열을 나타낸다. Pec6020 (ALALAALLW SEQ ID NO : 10) Pec6025 (ALLWDREV SEQ ID NO : 11)은 난소 종양 세포주에서 검출된 뮤신 단백질을 나타내는 겹침 서열이다. C-렉틴은 난소 종양 세포주에서 검출되는 단백질이고 그 서열(C-lectin8)로부터의 펩티드는 KMASRSMRL SEQ ID NO : 9에 의해 나타난다.
인 비트로 세포독성 어세이
표준 51Cr-방출 어세이가 T2 세포 상으로 로드된 멜라노마-관련 펩티드 에피토프의 CTL 주효 세포 인식 여부를 결정하기 위해 수행되었다. 3 X 106 T2 세포 수확물을 RPMI +10% FBS (배지) 내에서 성장시켰다. 0.1 mCi 의 51Cr을 부가시키고 수욕 내에서 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 표지된 세포를 10ml의 4% 세척물 (RPMI + 4% FBS) 및 펠릿 내에 부가시키고, 두 번 추가로 세척하고, 배지 내에 재현탁시켜 최종 농도가 0.2xlO6/mL가 되게 하여 자연발생 대 세제 용해된 세포의 방사활성을 기록하였다. 세포들을 20μg/mL에서 적절한 펩티드로 30분간 펄스시켰다. 50 μl를 10, 2, 0.4, 및 0.08 x 106/mL에서 CD8 주효 세포를 각각 함유한 각 플레이트로 부가시키고, 37C에서 6시간 인큐베이션시키고, 상청액을 회전시키고 수확하였다.
유세포 분석법 및 테트라머 염색
이 세포들을 FACS 버퍼 (PBS 내 1% BSA, 0.02% NaN3) 내에서 30분간 4℃에서 인큐베이션 시켜 FITC- 또는 PE 컨쥬케이트된 단클론 항체로 표지시키고, 동일 버퍼 내에서 세척시켰다. 세포를 데이터 취득 전에 0.5% 포름알데히드 내에서 고정시키고 FACScan 유세포 분석기(Becton Dickinson) 상에서 그 CellQuest 소프트웨어로 분석하였다. 비특이적 염색은 정제된 1차 항체를 표지하는데 사용된 동일한 2차 항체를 이용하여, 또는 1차 항체가 직접적으로 표지된 경우 동위원소-매칭된 대조구를 이용하여 측정되었다. 테트라머 염색은 서열 SLYVTVATL SEQ ID NO : 43을 포함하는 HLA-A2.1 특이적 HIVgag 테트라머 분자(Beckman Coulter)를 음성 대조구로서 사용하여 수행되었다. HER-2 특이적 테트라머는 서열 CLTSTVQLV (826 SEQ ID NO : 7), KIFGSLAFL (835 SEQ ID NO : 8), VMAGVGFSPYV (861 SEQ ID NO : 16) 펩티드로 제조되었다. PE-표지된 테트라머 HLA-A2. 1-펩티드 복합체는 형광 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 항-인간 CD8a (BD PharMagin) 단클론 항체와 결합되어 에피토프-특이적 CD8+ T 세포를 패키지 삽입물에 설명된 바와 같이 염색시키는데 사용되었다. 샘플은 Becton Disckenson FACScan 상에서 2색 유세포 분석에 의해 분석되고, 게이트된 CD8+ T 세포는 테트라머 HLA-A2.1-펩티드 복합체와 함께 염색에 대해 검사되어졌다.
실시예 4
이 생체 외 자극 프로토콜을 이용하여 부가적인 유방 및 난소 특이적 CTLs 발생시키기
우리는 서로 다른 종양에서 유래한 몇가지 종양 항원에 대해 모든 공지된 HLA-A2.1 제한된 펩티드 에피토프에 대한 CTL 반응을 발생시키는 능력을 입증하였다. 초기 연구는 MART-1, gp100 및 티로시나제 멜라노마-관련 단백질에 특이적인 서로다른 네가지 펩티드 에프토프에 특이적인 CTLs로 치료받은 환자에게서 목적하는 임상적 반응을 입증할 수 있는 멜라노마에 중점을 두었다[Richards et al., Amer. Soc. Clin. OncoL., San Francisco, California (2001, May)].
다양한 종류의 기타 암에 존재하는 다른 종양 항원에 대한 CTLs를 증가시키는 능력을 확대하기 위해 우리는 서로 다른 몇 가지 종양 타입에 흔한 종양 항원에 대한 공개된 신규한 서열을 선택하였다. 이들은 AES, MUC-1, CEA, FBP, C-Lectin, NY-ESO-1, Pec60, CA-125, MAGE-3, 텔로머라제 및 G250을 포함한다. 표 7은 이들을 발현시키는 이들 항원, 발현 및 암 빈도를 기술한다. 생체외 자극 포로토콜을 이용한 이들 펩티드에 대한 반응 빈도는 표 6에 열거된다.
표 6
정상 도너에서 유방 및 난소 펩티드 에피토프에 대한 반응 빈도
Figure 112003030550189-pct00007
표 7
종양 항원 설명
항원 설명
CA-125 암 항원 125는 난소 종양 및 일부 난소 세포주에 의해 발현되는 상피 세포 마커이다. 약 85%의 난소암 환자는 증가된 혈청 CA125를 갖고 그러므로 혈청 종양 마커로서 종종 사용된다(Cancer Letters (1999, Oct.) 145 (1-2) pg. 133-141).
MUC-1 뮤신은 정상 및 악성 상피 상에서 발현되는 막통과 당단백이다. 저글리코실화된 형태의 MUC-1이 유방 및 난소암과 같은 수많은 인간 선암종의 세포 표면뿐만 아니라 다발성 골수종 및 B-세포 림프종을 포함하는 혈액학적 악성종 상에서 과다 발현된다(Blood (1999, June) 93 (12) pg. 4309-4317).
G250 RCC's의 85%의 신장 세포 암종에서 발현되지만 정상 신장 조직에서는 발현되지 않는 신장세포 암종 관련 항원이다. 약 50%의 침윤성 유방암에서 발현되는 종양-관련 항원 MN/CAIX와 동일하다(Cancer Research (1999, Nov.) ; 59 (21) pg. 5554-5559).
FBP 폴레이트 결합 단백질은 폴레이트 수송에 수반되는 수용체이다. 90%이상의 난소암 및 20-50%의 유방암에서 과다-발현된다(Anticancer Research (1999 Jul-Aug( 19(4B) g. 2907-2916).
HER-2/neu EGF-R과 서열 및 구조에서 유사한 막통과 단백을 엔코드하는 프로토-암유전자(HER-2). HER-2/neu는 유방 및 난소암에서 200배 이상 과다-발현된다. 이는 신장 세포 및 폐 암종에서도 확인된다
(J. Exp. Med. (1995, June) Vol. 181, pg. 2109-2117).
NY-ESO-1 30%의 유암, 전립선 및 난소암, 폐암, 방광암, 뇌 및 경부암 및 멜라노마에서 발견되는 암-고환 항원. 이 항원을 발현하는 종양을 갖는 환자는 그에 대한 항체도 통상 가지고 있다
(J. Immunology (2000) vol. 165 pg. 948-955).
CEA 태아암 항원은 상피 종양(대장, 유방, 폐)에서 자주 발현되는 종양-관련 항원이다. 혈청 내 CEA 수준은 질병 단계와 상관관계가 있고 질병 치료 및 재발을 모니터하는데 사용된다
(Human Immunology (1998) vol. 59 pg. 1-14)
MAGE-3 70-80%의 전이성 멜라노마 환부 및 세포주에서 발현되는 항-고환 항원. 멜라노마 또는 MAGE 단백질 관련 군의 일종이다. 부가적으로, MAGE-3는 20-60%의 상피 종양(대장, 유방, 폐, 위 암종)에서 발견된다
(Human Immimology (1998) vol. 59 pg. 1-14)
AES 분리된 단백질의 아미노 인헨서는 분리된 유전자의 인헨서에 의해 엔코드된 한 세트의 전사 리프레서의 일부이다. 이 종양 항원은 난소 및 유방 종양의 종양-관련 림프구에서 확인된다.
(Molecular Immunology (1998) 35 (17) pg. 1121-1133)
HTR 텔로머라제(hTR)는 텔로머 DNA의 합성 및 확장을 촉매하는 특별한 타입의 역전사효소(hTRT 또는 hTERT)이다. 이 효소의 활성은 유방, 갑상성, 방광, 경부,전립선, 대장, 췌장 및 위암을 포함하는 모든 인간 종양의 90%에서 상승된다.
(Cancer Research (2001, Dec) 61 (23) pg. 8366-8370)
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SEQUENCE LISTING <110> Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. <120> A Cell Therapy Method For The Treatment Of Tumors <130> ORT-1557-PCT <140> PCT/US02/05748 <141> 2002-02-19 <160> 42 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe Leu Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Lys Met Ala Ser Arg Ser Met Arg Leu 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Val Val 1 5 10 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Leu Leu Val Val Asp Arg Glu Val 1 5 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val 1 5 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser Arg Met 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Pro Leu Thr Pro Leu Pro Val 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Thr Ala Pro Val His Asn Val 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ser Ile Leu Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr 1 5 10 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Tyr Leu Glu Thr Phe Arg Glu Gln Val 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Val Leu Leu Lys Leu Arg Arg Pro Val 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gly Leu Gln Ser Pro Lys Ser Pro Leu 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Leu Tyr Ile Pro Ser Val Asp Leu 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Lys Ala Leu Phe Ala Gly Pro Pro Val 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Phe Met Trp Gly Asn Leu Thr Leu Ala 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 His Leu Ser Thr Ala Phe Ala Arg Val 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Ile 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Val Ala Ala Ser Val Asp Asn Pro His Val 1 5 10 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Val 1 5

Claims (25)

  1. a. 암과 관련된 10개까지의, 6 내지 12 아미노산 길이인 서로 다른 펩티드 분자를 동시에 제시할 수 있는 비-자연 발생적 항원-제시 세포주(nnAPC)를 제조하는 단계;
    b. 암을 가진 개체 또는 도너로부터 CD8+ 세포를 수확하는 단계;
    c. 상기 nnAPC 세포주로 상기 CD8+ 세포를 자극하는 단계;
    d. 상기 CD8+ 세포를 IL-2, IL-7 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 시토킨을 함유한 배지, 또는 조건 성장 배지(CGM)에 첨가하는 단계;
    e. 상기 개체 또는 도너로부터 수집한 비현탁된 말초 혈액 단구, 또는 CD8- 결여된 말초 혈액 단구를 1 내지 50 ㎍/ml의 상기 nnAPC가 동시에 제시할 수 있는 상기 펩티드 중 하나와 혼합하는 단계;
    f. 3,000 내지 7,000 rads의 γ-선으로 상기 말초 혈액 단구 현탁액을 조사시키는 단계;
    g. 비-부착성 세포를 세척하여 제거함으로써 부착성 말초 혈액 단구를 분리하는 단계;
    h. 상기 부착성 말초 혈액 단구를 1㎍/ml 내지 50㎍/ml의 상기 각 펩티드와 로딩하는 단계; 및
    i. 상기 CD8+ 세포를 상기 부착성 말초 혈액 단구와 10 CD8+ 세포 대 1 말초 혈액 단구의 비로 조합시키는 단계
    를 포함하는 암을 가진 개체 치료용 CD8+ 현탁액의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드 분자는 8 내지 10 아미노산 길이인 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드 분자는 10nM 내지 100μM 범위의 농도인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 시토킨 성분이 IL-2인 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 시토킨 성분이 IL-2 및 IL-7의 조합인 방법.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, γ-선의 양이 5,000 rads인 방법.
  9. a. 암과 관련된 10개까지의 서로 다른 펩티드 분자를 동시에 제시할 수 있는 비-자연 발생적 항원-제시 세포주(nnAPC)를 제조하는 단계;
    b. 암을 가진 개체로부터 CD8+ 세포를 수확하는 단계;
    c. 상기 nnAPC 세포주로 6 내지 7일 동안 상기 CD8+세포를 자극하는 단계;
    d. 상기 CD8+ 세포를 배지 내의 IL-2 및 IL-7으로 자극하는 단계;
    e. 상기 개체로부터 수집한 말초 혈액 단구를 20 ㎍/ml의 상기 각 펩티드와 혼합하는 단계;
    f. 5,000 rads의 γ-선으로 상기 CD8-결여된 말초 혈액 단구 현탁액을 조사시키는 단계;
    g. 비-부착성 세포를 세척하여 제거함으로써 부착성 말초 혈액 단구를 분리하는 단계;
    h. 상기 부착성 말초 혈액 단구를 1 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml의 상기 펩티드와 로딩하는 단계;
    i. 상기 CD8+ 세포를 상기 부착성 말초 혈액 단구와 10 CD8+ 세포 대 1 말초 혈액 단구의 비로 조합시키는 단계;
    j. CD8+ 세포 및 말초 혈액 단구의 상기 조합된 현탁액을 6 내지 7일간 자극하는 단계;
    k. CD8+ 세포 및 말초 혈액 단구의 상기 조합된 현탁액을 배지 내의 IL-2 및 IL-7로 자극시키는 단계; 및
    l. CTL 활성, 순도, 살균도 및 엔도톡신 함량에 대해 CD8+ 현탁액을 어세이하는 단계
    를 포함하는 암을 가진 개체 치료용 CD8+ 현탁액의 제조 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 각 펩티드는 8 내지 10 아미노산 길이인 방법.
  11. a. 멜라노마와 관련된 10개까지의, 8 내지 10 아미노산 길이인 서로 다른 펩티드 분자를 동시에 제시할 수 있는 비-자연 발생적 항원-제시 세포주(nnAPC)를 제조하는 단계;
    b. 멜라노마를 겪는 개체로부터 CD8+ 세포를 수확하는 단계;
    c. 상기 nnAPC 세포주로 6 내지 7일 동안 상기 CD8+ 세포를 자극하는 단계;
    d. 상기 CD8+ 세포를 배지 내의 IL-2 및 IL-7으로 자극하는 단계;
    e. 상기 개체로부터 수집한 말초 혈액 단구를 상기 nnAPC가 제시할 수 있는 20 ㎍/ml의 각 펩티드와 혼합하는 단계;
    f. 5,000 rads의 γ-선으로 상기 CD8-결여된 말초 혈액 단구 현탁액을 조사시키는 단계;
    g. 비-부착성 세포를 세척하여 제거함으로써 부착성 말초 혈액 단구를 분리하는 단계;
    h. 상기 부착성 말초 혈액 단구를 1 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml의 상기 펩티드와 로딩하는 단계;
    i. 상기 CD8+ 세포를 상기 부착성 말초 혈액 단구와 10 CD8+ 세포 대 1 말초 혈액 단구의 비로 조합시키는 단계;
    j. CD8+ 세포 및 말초 혈액 단구의 상기 조합된 현탁액을 6 내지 7일간 자극하는 단계;
    k. CD8+ 세포 및 말초 혈액 단구의 상기 조합된 현탁액을 배지 내의 IL-2 및 IL-7로 자극시키는 단계; 및
    l. CTL 활성, 순도, 살균도 및 엔도톡신 함량에 대해 CD8+ 현탁액을 어세이하는 단계
    를 포함하는 멜라노마를 가진 개체 치료용 CD8+ 현탁액의 제조 방법.
  12. 삭제
  13. 제 11항에 있어서, 상기 펩티드는 SEQ ID NO:1의 티로시나제369-377, SEQ ID NO:3의 티로시나제207-216, SEQ ID NO:4의 gp100209-217, SEQ ID NO:5의 gp100154-162, SEQ ID NO:6의 MART-127-35, SEQ ID NO:7의 HER-2/neu789-797, SEQ ID NO:8의 HER-2/neu369-377, SEQ ID NO:9의 C-lectin8-16, SEQ ID NO:10의 Pec6020-29, 및 SEQ ID NO:11의 Pec6025-33인 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. a. 노랑 초파리(Drosophila melanogaster) 알로부터 곤충 세포주를 제조하는 단계;
    b. 곤충 세포를 발육시키기 위한 배지에서 상기 곤충 세포를 발육시키는 단계;
    c. pRmHa-1 발현 벡터로부터 메탈로티오네인 프로모터, 금속 반응 보존 서열 및 노랑 초파리로부터 분리된 폴리아데닐화 신호를 보유한 알콜 디하이드로게나제 유전자를 포함하는 pRmHa-3 플라스미드를 제조하는 단계;
    d. A2.1이 인간 클래스 I DNA 서열로 대체될 수 있는 인간 클래스 I HLA A2.1, B7.1, B7.2, ICAM-1, β-2 마이크로글로불린 및 LFA-3에 대한 상보적 DNA를 상기 pRmHa-3 플라스미드 내로 삽입하는 단계;
    e. 상기 곤충 세포를 phshneo 플라스미드 및 상기 상보적 DNA를 함유하는 pRmHa-3 플라스미드로 형질감염시키는 단계; 및
    f. 상기 곤충 세포를 CuSO4와 접촉시켜 상기 곤충 세포 내에서 형질감염된 유전자 발현을 유도하여 nnAPC를 만드는 단계
    를 포함하고, 여기에서 상기 곤충 세포주는 세포를 12일간 성장시키고, 목적 세포를 동정할 수 있는 펩티드로 세포를 선택하며, 상기 선택된 세포를 항-CD3 단클론 항체(ORTHOCLONE OKT3, muromonab-3) 및 IL-2로 확장하는 것에 의해 제조되는, 동시에 10개까지의 펩티드 분자를 제시할 수 있는 비-자연 발생적 항원-제시 세포(nnAPC)의 제조 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 목적 세포를 동정할 수 있는 상기 펩티드가 테트라머인 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 곤충 세포를 발육시키기 위한 배지가 Schneider™ 초파리 배지인 방법.
  23. 제 1항에 있어서, 단계(a)의 상기 펩티드 분자가 SEQ ID NO:1 내지 42에 규정된 아미노산 서열을 갖는 펩티드로부터 선택되는 방법.
  24. 제 9항에 있어서, 단계(a)의 상기 펩티드 분자가 SEQ ID NO:1 내지 42에 규정된 아미노산 서열을 갖는 펩티드로부터 선택되는 방법.
  25. 제 11항에 있어서, 단계(a)의 상기 펩티드 분자가 SEQ ID NO:1 내지 42에 규정된 아미노산 서열을 갖는 펩티드로부터 선택되는 방법.
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