JPWO2004016774A1 - 抑制性nk細胞受容体陽性細胞の増幅方法 - Google Patents
抑制性nk細胞受容体陽性細胞の増幅方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2004016774A1 JPWO2004016774A1 JP2004528869A JP2004528869A JPWO2004016774A1 JP WO2004016774 A1 JPWO2004016774 A1 JP WO2004016774A1 JP 2004528869 A JP2004528869 A JP 2004528869A JP 2004528869 A JP2004528869 A JP 2004528869A JP WO2004016774 A1 JPWO2004016774 A1 JP WO2004016774A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- pbmc
- inhibitory
- cell receptor
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 277
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 108091008877 NK cell receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 102000010648 Natural Killer Cell Receptors Human genes 0.000 title abstract description 22
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 19
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 16
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 102100021462 Natural killer cells antigen CD94 Human genes 0.000 claims description 149
- 101000971513 Homo sapiens Natural killer cells antigen CD94 Proteins 0.000 claims description 116
- 102100022682 NKG2-A/NKG2-B type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 62
- 101150069255 KLRC1 gene Proteins 0.000 claims description 61
- 101100404845 Macaca mulatta NKG2A gene Proteins 0.000 claims description 61
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims description 44
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims description 44
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 28
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 17
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 24
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 23
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 20
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 19
- 108010077854 Natural Killer Cell Receptors Proteins 0.000 description 19
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 102100028970 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Human genes 0.000 description 8
- 101000986085 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Proteins 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 5
- 108010070768 HLA-C*03 antigen Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 5
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 4
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 4
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 4
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 3
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 3
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000007898 magnetic cell sorting Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 101001055157 Homo sapiens Interleukin-15 Proteins 0.000 description 2
- -1 IL- 5 Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102100033762 Proheparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 2
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 229940127174 UCHT1 Drugs 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 238000011129 allogeneic cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 102000056003 human IL15 Human genes 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 208000032800 BCR-ABL1 positive blast phase chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000004860 Blast Crisis Diseases 0.000 description 1
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 102400001329 Epiregulin Human genes 0.000 description 1
- 101800000155 Epiregulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 101001109508 Homo sapiens NKG2-A/NKG2-B type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 102100026818 Inhibin beta E chain Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108050009288 Interleukin-19 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 108010092801 Midkine Proteins 0.000 description 1
- 102000016776 Midkine Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 1
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 102100033663 Transforming growth factor beta receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 208000024340 acute graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 108010079292 betaglycan Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 108090000681 interleukin 20 Proteins 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
ドナーから得た末梢血から抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法の提供。G−CSF動員末梢血単核細胞(G−PBMC)、G−CSFを投与せずに採取した正常末梢血もしくは移植患者末梢血から採取した末梢血単核細胞(PBMC)、または臍帯血から採取した臍帯血単核細胞(CBMC)等の血液由来単核細胞を抗CD3抗体およびIL−15場合によってはさらに他のサイトカインの存在下で培養することを含む、抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
Description
本発明は、ドナーから得た末梢血から抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法に関する。
ナチュラルキラー(NK)細胞上およびT細胞の抑制性ナチュラルキラー細胞受容体(NKR)はMHCクラスI分子への結合を通して細胞障害作用を負に調節することが報告されている(Ljunggren,H.G.et al.,Immunol.Today.11,237−244(1990)、Moretta,A.et al.,Immunol.Rev.155,105−117(1997)、Bakker,A.B.H.et al.,J.Immunol.160,5239−5245(1998))。
移植片対宿主病(GVDH)および移植片対白血病反応(GVL)効果は同種幹細胞移植(allo SCT)において最も重要な問題である。顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)で動員された末梢血単核球(G−PBMC)移植片は通常の骨髄移植片の少なくとも10倍のT細胞を含んでいるが、同種末梢血幹細胞移植(PBSCT)後の急性移植片対宿主病の発生と重篤度は同種骨髄で認められるものとほぼ同等である(Blaise,D et al.,J.Clin.Oncol.,18,537−546(2000)、Powles,R.et al.,Lancet 355,1231−1237(2000)、Bensinger,W.I.et al,N.Engl.J.Med,344,175−181(2001))。G−CSF動員後のアフェレシス産物は多数のCD14陽性細胞を含んでおり、該CD14+細胞は用量依存的にドナーT細胞の増幅を抑制することが報告されている(Mielcarek,M.et al.,Blood 89,1629−1634(1997)、Mielcarek,M.et al.,Blood 92,215−222(1998))。また、本発明者らはCD4+細胞中の共刺激性(costimulatory)分子CD28反応性複合体の誘導はG−PBMC中のCD14+細胞の存在により抑制されることを見出している(Tanaka,J.et al.,Bllod 91,347−352(1998))。
CD94/NKG2ヘテロダイマーはHLA−E nonclassical HLA−I分子の受容体として作用する(Braud,V.M.et al.,Nature 391,795−799(1998))。細胞内部分に二つの特徴的なチロシン残基を有する免疫抑制性モチーフ(ITIM)を有するNKG2Aは抑制性シグナルを伝達しうる。抑制性NKRを発現するCTL(cytotoxicT lymphocyte)のNK様活性およびTCR(T細胞受容体)誘導性障害活性はNKRによるクラスI認識により抑制される(Philips,J.H.et al.,Science 268,403−405(1995)、Mingari,M.C.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93,12433−12438(1996))。RuggeriらはAML(急性骨髄性白血病)患者に対するHLAハプロタイプ不一致移植において、GVH方向にNKRリガンド不適合が存在した場合には再発、拒絶、急性GVHDも認められないという驚くほどの良好な臨床的結果を示した(Ruggeri,L.et al.,Science 295,1097−2100(2002))。そのデータは同種細胞上のNKRリガンドの発現喪失は抑制性NKR発現細胞の同種反応性をトリガーしうることを示す。
本発明者等は、CD8+T細胞上でのHLA−Cの特異的受容体であるCD158bの発現は慢性GVHD(cGVHD)患者において増大することを示した。数人の患者においてT細胞におけるCD158bの発現増大と臨床症状の改善には相関が認められた。また、T細胞上でのCD94/NKG2Aの発現は予後の良好なcGVHD患者で予後の悪いcGVHD患者よりも高かった(Tanaka,J.et al.,Br.J.Haematol.108,778−783(2000)、Tanaka,J.et al.,Bone Marrow Transplant.26,287−290(2000)、Tanaka,J.et al.,Br.J.Haematol 117,751−754,(2002))。従って、NK細胞だけでなくNKR発現T細胞もallo SCT後のGVHDおよびGVL効果の調節に関与していると考えられた(Mingari,M.C.et al.,Nature,403,325−328(2000))。
移植片対宿主病(GVDH)および移植片対白血病反応(GVL)効果は同種幹細胞移植(allo SCT)において最も重要な問題である。顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)で動員された末梢血単核球(G−PBMC)移植片は通常の骨髄移植片の少なくとも10倍のT細胞を含んでいるが、同種末梢血幹細胞移植(PBSCT)後の急性移植片対宿主病の発生と重篤度は同種骨髄で認められるものとほぼ同等である(Blaise,D et al.,J.Clin.Oncol.,18,537−546(2000)、Powles,R.et al.,Lancet 355,1231−1237(2000)、Bensinger,W.I.et al,N.Engl.J.Med,344,175−181(2001))。G−CSF動員後のアフェレシス産物は多数のCD14陽性細胞を含んでおり、該CD14+細胞は用量依存的にドナーT細胞の増幅を抑制することが報告されている(Mielcarek,M.et al.,Blood 89,1629−1634(1997)、Mielcarek,M.et al.,Blood 92,215−222(1998))。また、本発明者らはCD4+細胞中の共刺激性(costimulatory)分子CD28反応性複合体の誘導はG−PBMC中のCD14+細胞の存在により抑制されることを見出している(Tanaka,J.et al.,Bllod 91,347−352(1998))。
CD94/NKG2ヘテロダイマーはHLA−E nonclassical HLA−I分子の受容体として作用する(Braud,V.M.et al.,Nature 391,795−799(1998))。細胞内部分に二つの特徴的なチロシン残基を有する免疫抑制性モチーフ(ITIM)を有するNKG2Aは抑制性シグナルを伝達しうる。抑制性NKRを発現するCTL(cytotoxicT lymphocyte)のNK様活性およびTCR(T細胞受容体)誘導性障害活性はNKRによるクラスI認識により抑制される(Philips,J.H.et al.,Science 268,403−405(1995)、Mingari,M.C.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93,12433−12438(1996))。RuggeriらはAML(急性骨髄性白血病)患者に対するHLAハプロタイプ不一致移植において、GVH方向にNKRリガンド不適合が存在した場合には再発、拒絶、急性GVHDも認められないという驚くほどの良好な臨床的結果を示した(Ruggeri,L.et al.,Science 295,1097−2100(2002))。そのデータは同種細胞上のNKRリガンドの発現喪失は抑制性NKR発現細胞の同種反応性をトリガーしうることを示す。
本発明者等は、CD8+T細胞上でのHLA−Cの特異的受容体であるCD158bの発現は慢性GVHD(cGVHD)患者において増大することを示した。数人の患者においてT細胞におけるCD158bの発現増大と臨床症状の改善には相関が認められた。また、T細胞上でのCD94/NKG2Aの発現は予後の良好なcGVHD患者で予後の悪いcGVHD患者よりも高かった(Tanaka,J.et al.,Br.J.Haematol.108,778−783(2000)、Tanaka,J.et al.,Bone Marrow Transplant.26,287−290(2000)、Tanaka,J.et al.,Br.J.Haematol 117,751−754,(2002))。従って、NK細胞だけでなくNKR発現T細胞もallo SCT後のGVHDおよびGVL効果の調節に関与していると考えられた(Mingari,M.C.et al.,Nature,403,325−328(2000))。
本発明は、レシピエント中でGVLを引き起こすが、GVHDを引き起こさない抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅する方法を提供し、白血病および腫瘍の治療に役立てることを課題とする。
本発明者らは、ドナーにG−CSFを投与して動員した末梢血(G−PBMC)由来の抑制性NK細胞受容体陽性細胞であるCD94発現細胞を抗CD3モノクローナル抗体およびIL−15と共に培養し増幅させると、培養白血病細胞および患者の白血病細胞に対する細胞障害作用を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、増幅したCD94発現細胞がNOD/SCIDマウスに移植したK562白血病細胞の増殖を抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
(1) 血液由来の単核細胞を抗CD3抗体およびIL−15の存在下で培養することを含む、抑制性NK細胞受容体腸性細胞を増幅させる方法、
(2) 末梢血単核細胞を抗CD3抗体およびIL−15の存在下で培養することを含む、(1)の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
(3) G−CSF動員末梢血単核細胞(G−PBMC)、G−CSFを投与せずに採取した正常末梢血もしくは移植患者末梢血から採取した末梢血単核細胞(PBMC)、または臍帯血から採取した臍帯血単核細胞(CBMC)を抗CD3抗体およびIL−15の存在下で培養することを含む、(1)の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
(4) CD8+細胞にCD14+細胞を混合し、抗CD3抗体およびIL−15の存在下で培養することを含む、抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
(5) 細胞を抗CD3抗体およびIL−15に加えて、IL−21の存在下で培養する(1)から(3)のいずれかの方法、
(6) 抗CD3抗体とIL−15で刺激培養の際に同時に、または抗CD3抗体とIL−15で刺激培養した後に、IL−21を添加する、(5)の方法、
(7) 抑制性NK細胞受容体陽性細胞がCD94+あるいはNKG2A+細胞である、(1)から(6)のいずれかの抑制性NK細胞受容体腸性細胞を増幅させる方法、
(8) 少なくとも抗CD3抗体およびIL−15が存在する条件下での培養が5日以上行われる(1)から(7)のいずれかの抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
(9) 少なくとも抗CD3抗体およびIL−15が存在する条件下での培養が10日以上行われる(8)の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
(10) 培養前に比べ、G−PBMC、PBMCまたはCBMC中のCD94+あるいはNKG2A+細胞が10倍以上増幅される(1)から(9)のいずれかの抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
(11) 培養前に比べ、G−PBMC、PBMCまたはCBMC中のCD94+あるいはNKG2A+細胞が20倍以上増幅される(10)の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、および
(12) (1)から(11)のいずれかの増幅方法により抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させたG−PBMC、PBMCまたはCBMCより抑制性NK細胞受容体陽性細胞を単離することを含む、抑制性NK細胞受容体陽性細胞の製造方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抑制性NK細胞受容体陽性細胞は、健常人である移植ドナーにG−CSFを投与して幹細胞を動員した末梢血単核細胞(G−PBMC)を採取し、抗CD3抗体およびIL−15、場合によってはさらに他のサイトカインと共に培養することにより増幅させることができる。ここで、幹細胞の動員(mobilization)とは末梢血中の造血幹細胞の数を増大させることをいい、「末梢化(peripherallzation)」ともいう。また、用いる細胞はG−PBMCに限定されず、ヒト血液から採取した血液由来の単核細胞ならばいずれも用いることができ、G−CSFを投与せずに採取した正常末梢血または移植患者末梢血から採取した末梢血単核細胞(PBMC:Peripheral Blood Mononuclear cell))等の末梢血単核細胞、あるいは臍帯血から採取した臍帯血単核細胞(CBMC:Cord Blood Mononuclear cell)を用いることもできる。ここで、正常末梢血とは移植を受けていないヒトから採取した末梢血をいい、移植患者末梢血とは、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞等の移植を受けたヒトから採取した末梢血をいう。
抑制性NK細胞受容体陽性細胞は、表面にCD94あるいはNKG2Aを発現しており、本発明の抑制性NK細胞受容体陽性細胞の増幅はCD94あるいはNKG2A発現細胞が増幅したか否かで確認することができる。
ドナーの末梢血への幹細胞の動員は、ドナーにヒトG−CSF(granulocyte colony−stimulating factor)を投与することにより行う。この際、リコンビナントヒトG−CSFを投与すればよい。ヒトG−CSFは市販のものを用いることができる。投与は皮下注射により行えばよく、数日間、毎日ドナーの体重1kg当たり、約10μgのG−CSFを投与する。採取した末梢血は凍結により用時まで保存することができる。
G−CSF投与後4日目あるいは5日目にCS3000などの血球分離装置を用いてドナーからG−PBMCを採取する。
このようにして得たG−CSFで動員したドナー末梢血単核細胞(G−PBMC)または正常末梢血もしくは移植患者末梢血(PBMC)、あるいは臍帯血から採取した単核細胞(CBMC)を抗CD3抗体およびIL−15存在下、場合によってはさらに他のサイトカインの存在下で培養することにより、CD94あるいはNKG2A発現細胞を増幅させることができる。培養は通常の組織培養用フラスコ等を用いて行う。培養の際の培地は、RPMI、AIM−V等のヒト造血細胞の培養に用いられる培地を用いればよく、必要に応じてヒト血清、アルブミン等の補足物質を添加する。抗CD3抗体は、公知のマウスモノクローナル抗体作製法により作製したモノクローナル抗体を用いてもよいし、市販の抗体を用いてもよい。例えば、市販のものとしてUCHT−1やOKT3がある。この際、抗CD3抗体は培養用容器に固相化して用いるのが望ましい。例えばあらかじめ適当な緩衝液で抗CD3抗体を0.1〜1.0μg/mLの濃度に調整し、0.05Lの培養容器に前記調製した抗CD3抗体5〜10mLを入れ、好ましくは4℃で12〜24時間インキュベートし、固相化する。抗CD3抗体を固相化した容器内でIL−15を添加した前記培地を用いてG−PBMC、PBMCまたはCBMCを培養する。培養時のG−PBMCの密度は0.5〜2.0×106/mL、好ましくは1×106/mLである。IL−15はリコンビナントヒトIL−15を用いればよく、市販のものを用いればよい。IL−15の添加濃度は1〜10ng/mL、好ましくは5ng/mLである。培養は、数日間、好ましくは3〜5日間、あるいは5日間以上、好ましくは10日間以上37℃で行う。
上述のように、培養工程において抗CD3抗体およびIL−15の他に他のサイトカインが存在していてもよい。抗CD3抗体およびIL−15の他に添加し得るサイトカインは限定されず、塩基性繊維芽細胞成長因子、IL−1(インターロイキン1)、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、GM−CSF(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)、G−CSF(顆粒球コロニー刺激因子)、エリスロポエチン、CSF−1(コロニー刺激因子)、SCF(幹細胞因子)、トロンボポエチン、EGF(上皮増殖因子)、TGF−α(トランスフォーミング増殖因子−α)、HB−EGF(ヘパリン結合性EGF様増殖因子)、エピレグリン、ニューレグリン1,2,3、PDGF(血小板由来増殖因子)、インスリン、HGF(肝細胞増殖因子)、VEGF(血管内皮増殖因子)、NGF(神経成長因子)、GDNF(グリア細胞株由来神経栄養因子)、ミッドカイン、TGF−β(トランスフォーミング増殖因子−β)、ベータグリカン、アクチビン、BMP(骨形成因子)、TNF(腫瘍壊死因子)、IFN−α/β(インターフェロン−α/β)、IFN−γ(インターフェロン−γ)、フィブロネクチン、ラミニン、カドヘリン、インテグリン、セレクチンなどを用いることができるが、IL−21、IL−2、IL−7が好ましく、このうちIL−21が特に好ましい。これらのサイトカインは、天然物でもリコンビナントのものでもよく、いずれも市販のものを用いることができる。添加するサイトカインの濃度は、1〜25ng/mLが好ましく、12.5ng/mLが特に好ましい。他のサイトカインは、抗CD3抗体およびIL−15と同時に添加してもよいし、抗CD3抗体およびIL−15による刺激培養の後に添加してもよい。抗CD3抗体、IL−15および他のサイトカインを同時に添加して培養する場合は、数日間、好ましくは3〜5日間、あるいは5日間以上、好ましくは10日間以上培養すればよい。抗CD3抗体およびIL−15による刺激培養の後に添加する場合、抗CD3抗体およびIL−15により数日間、好ましくは3〜5日間、あるいは5日間以上、好ましくは10日間以上刺激培養した後に他のサイトカインを追加添加してもよいし、培地を他のサイトカインを含む培地に交換してもよい。
CD94あるいはNKG2A発現細胞が増幅しているか否かは、蛍光標識抗CD94抗体あるいはNKG2A抗体で免疫蛍光染色を行い、FACS(Fluorescence activated cell sorter)またはフローサイトメトリーで解析することにより決定できる。G−PBMC、PBMCまたはCBMCを本発明の抑制性NK受容体陽性細胞の増幅方法により増幅することにより、G−PBMC、PBMCまたはCBMC中の15%以上、好ましくは20%以上、さらに好ましくは25%以上、特に好ましくは30%以上の細胞がCD94+細胞となり、G−PBMC、PBMCまたはCBMC中の5%以上、好ましくは10%以上、さらに好ましくは15%以上の細胞がNKG2A+細胞となる。本発明の方法により増幅する前のG−PBMCに比べ、CD94+あるいはNKG2A+細胞は10倍以上、好ましくは20倍以上、特に好ましくは100倍以上に増幅されている。
また、G−PBMC、PBMCまたはCBMCからCD8+細胞をFACSまたは抗CD8抗体を結合させた免疫磁気ビーズを用いて、単離精製し抗CD3抗体およびIL−15、場合によってはさらに他のサイトカインで刺激してもよい。この際抗CD3抗体およびIL−15による刺激のほか、CD14+細胞の存在が必要であり、G−PBMC等から別途CD14+細胞を単離精製して混合する。
本発明の方法によりドナーG−PBMC、PBMCまたはCBMC細胞から増幅したCD94+あるいはNKG2A+細胞は、セルソーターまたは抗CD94抗体結合免疫磁気ビーズを用いて単離精製することができる。本発明は、G−PBMC、PBMCまたはCBMCからCD94+あるいはNKG2A+細胞を増幅し、該CD94+あるいはNKG2A+細胞を単離精製することを含むCD94+あるいはNKG2A+細胞の製造方法をも包含する。
このようにして増幅したCD94+あるいはNKG2A+細胞は、表面にHLAクラスI分子の発現がないか、発現量が低いか、またはHLAクラスI分子が非適合である腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有する一方で、適合したHLAクラスIの発現量が高い正常細胞に対しては細胞障害活性を有さない。すなわち、ドナー由来のCD94+あるいはNKG2A+増幅細胞を白血病や腫瘍患者に投与した場合、正常な細胞に対してGVHDをもたらさず白血病細胞および腫瘍細胞に対してのみ細胞障害活性を示し、例えば白血病患者においてはGVL(移植片対白血病)効果を、腫瘍患者においてはGVT(移植片対腫瘍)効果をもたらすので、本発明の方法により増幅したCD94+あるいはNKG2A+細胞を癌の治療に用いることができる。癌の種類は問わず、HLAクラスI分子の発現が低下した癌細胞ならばどんな癌細胞でも本発明の方法で増幅したCD94+あるいはNKG2A+細胞による治療の対象となる。
治療には、本発明の方法によりG−PBMC、PBMCまたはCBMCから増幅したCD94+あるいはNKG2A+細胞を上記のように単離精製して用いるのが望ましい。単離精製したCD94+あるいはNKG2A+細胞を患者体重1kg当たり106〜108個患者に投与すればよい。投与は、例えば点滴静注により行う。細胞の投与によりCD94+あるいはNKG2A+細胞が、患者の白血病細胞または腫瘍細胞を障害し、治療効果を発揮することができる。
従って、本発明の方法により増幅したCD94+あるいはNKG2A+細胞を被検体に投与することを含む癌の治療方法も本発明に包含される。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2002−235601号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本発明者らは、ドナーにG−CSFを投与して動員した末梢血(G−PBMC)由来の抑制性NK細胞受容体陽性細胞であるCD94発現細胞を抗CD3モノクローナル抗体およびIL−15と共に培養し増幅させると、培養白血病細胞および患者の白血病細胞に対する細胞障害作用を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、増幅したCD94発現細胞がNOD/SCIDマウスに移植したK562白血病細胞の増殖を抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
(1) 血液由来の単核細胞を抗CD3抗体およびIL−15の存在下で培養することを含む、抑制性NK細胞受容体腸性細胞を増幅させる方法、
(2) 末梢血単核細胞を抗CD3抗体およびIL−15の存在下で培養することを含む、(1)の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
(3) G−CSF動員末梢血単核細胞(G−PBMC)、G−CSFを投与せずに採取した正常末梢血もしくは移植患者末梢血から採取した末梢血単核細胞(PBMC)、または臍帯血から採取した臍帯血単核細胞(CBMC)を抗CD3抗体およびIL−15の存在下で培養することを含む、(1)の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
(4) CD8+細胞にCD14+細胞を混合し、抗CD3抗体およびIL−15の存在下で培養することを含む、抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
(5) 細胞を抗CD3抗体およびIL−15に加えて、IL−21の存在下で培養する(1)から(3)のいずれかの方法、
(6) 抗CD3抗体とIL−15で刺激培養の際に同時に、または抗CD3抗体とIL−15で刺激培養した後に、IL−21を添加する、(5)の方法、
(7) 抑制性NK細胞受容体陽性細胞がCD94+あるいはNKG2A+細胞である、(1)から(6)のいずれかの抑制性NK細胞受容体腸性細胞を増幅させる方法、
(8) 少なくとも抗CD3抗体およびIL−15が存在する条件下での培養が5日以上行われる(1)から(7)のいずれかの抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
(9) 少なくとも抗CD3抗体およびIL−15が存在する条件下での培養が10日以上行われる(8)の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
(10) 培養前に比べ、G−PBMC、PBMCまたはCBMC中のCD94+あるいはNKG2A+細胞が10倍以上増幅される(1)から(9)のいずれかの抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、
(11) 培養前に比べ、G−PBMC、PBMCまたはCBMC中のCD94+あるいはNKG2A+細胞が20倍以上増幅される(10)の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法、および
(12) (1)から(11)のいずれかの増幅方法により抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させたG−PBMC、PBMCまたはCBMCより抑制性NK細胞受容体陽性細胞を単離することを含む、抑制性NK細胞受容体陽性細胞の製造方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抑制性NK細胞受容体陽性細胞は、健常人である移植ドナーにG−CSFを投与して幹細胞を動員した末梢血単核細胞(G−PBMC)を採取し、抗CD3抗体およびIL−15、場合によってはさらに他のサイトカインと共に培養することにより増幅させることができる。ここで、幹細胞の動員(mobilization)とは末梢血中の造血幹細胞の数を増大させることをいい、「末梢化(peripherallzation)」ともいう。また、用いる細胞はG−PBMCに限定されず、ヒト血液から採取した血液由来の単核細胞ならばいずれも用いることができ、G−CSFを投与せずに採取した正常末梢血または移植患者末梢血から採取した末梢血単核細胞(PBMC:Peripheral Blood Mononuclear cell))等の末梢血単核細胞、あるいは臍帯血から採取した臍帯血単核細胞(CBMC:Cord Blood Mononuclear cell)を用いることもできる。ここで、正常末梢血とは移植を受けていないヒトから採取した末梢血をいい、移植患者末梢血とは、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞等の移植を受けたヒトから採取した末梢血をいう。
抑制性NK細胞受容体陽性細胞は、表面にCD94あるいはNKG2Aを発現しており、本発明の抑制性NK細胞受容体陽性細胞の増幅はCD94あるいはNKG2A発現細胞が増幅したか否かで確認することができる。
ドナーの末梢血への幹細胞の動員は、ドナーにヒトG−CSF(granulocyte colony−stimulating factor)を投与することにより行う。この際、リコンビナントヒトG−CSFを投与すればよい。ヒトG−CSFは市販のものを用いることができる。投与は皮下注射により行えばよく、数日間、毎日ドナーの体重1kg当たり、約10μgのG−CSFを投与する。採取した末梢血は凍結により用時まで保存することができる。
G−CSF投与後4日目あるいは5日目にCS3000などの血球分離装置を用いてドナーからG−PBMCを採取する。
このようにして得たG−CSFで動員したドナー末梢血単核細胞(G−PBMC)または正常末梢血もしくは移植患者末梢血(PBMC)、あるいは臍帯血から採取した単核細胞(CBMC)を抗CD3抗体およびIL−15存在下、場合によってはさらに他のサイトカインの存在下で培養することにより、CD94あるいはNKG2A発現細胞を増幅させることができる。培養は通常の組織培養用フラスコ等を用いて行う。培養の際の培地は、RPMI、AIM−V等のヒト造血細胞の培養に用いられる培地を用いればよく、必要に応じてヒト血清、アルブミン等の補足物質を添加する。抗CD3抗体は、公知のマウスモノクローナル抗体作製法により作製したモノクローナル抗体を用いてもよいし、市販の抗体を用いてもよい。例えば、市販のものとしてUCHT−1やOKT3がある。この際、抗CD3抗体は培養用容器に固相化して用いるのが望ましい。例えばあらかじめ適当な緩衝液で抗CD3抗体を0.1〜1.0μg/mLの濃度に調整し、0.05Lの培養容器に前記調製した抗CD3抗体5〜10mLを入れ、好ましくは4℃で12〜24時間インキュベートし、固相化する。抗CD3抗体を固相化した容器内でIL−15を添加した前記培地を用いてG−PBMC、PBMCまたはCBMCを培養する。培養時のG−PBMCの密度は0.5〜2.0×106/mL、好ましくは1×106/mLである。IL−15はリコンビナントヒトIL−15を用いればよく、市販のものを用いればよい。IL−15の添加濃度は1〜10ng/mL、好ましくは5ng/mLである。培養は、数日間、好ましくは3〜5日間、あるいは5日間以上、好ましくは10日間以上37℃で行う。
上述のように、培養工程において抗CD3抗体およびIL−15の他に他のサイトカインが存在していてもよい。抗CD3抗体およびIL−15の他に添加し得るサイトカインは限定されず、塩基性繊維芽細胞成長因子、IL−1(インターロイキン1)、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、GM−CSF(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)、G−CSF(顆粒球コロニー刺激因子)、エリスロポエチン、CSF−1(コロニー刺激因子)、SCF(幹細胞因子)、トロンボポエチン、EGF(上皮増殖因子)、TGF−α(トランスフォーミング増殖因子−α)、HB−EGF(ヘパリン結合性EGF様増殖因子)、エピレグリン、ニューレグリン1,2,3、PDGF(血小板由来増殖因子)、インスリン、HGF(肝細胞増殖因子)、VEGF(血管内皮増殖因子)、NGF(神経成長因子)、GDNF(グリア細胞株由来神経栄養因子)、ミッドカイン、TGF−β(トランスフォーミング増殖因子−β)、ベータグリカン、アクチビン、BMP(骨形成因子)、TNF(腫瘍壊死因子)、IFN−α/β(インターフェロン−α/β)、IFN−γ(インターフェロン−γ)、フィブロネクチン、ラミニン、カドヘリン、インテグリン、セレクチンなどを用いることができるが、IL−21、IL−2、IL−7が好ましく、このうちIL−21が特に好ましい。これらのサイトカインは、天然物でもリコンビナントのものでもよく、いずれも市販のものを用いることができる。添加するサイトカインの濃度は、1〜25ng/mLが好ましく、12.5ng/mLが特に好ましい。他のサイトカインは、抗CD3抗体およびIL−15と同時に添加してもよいし、抗CD3抗体およびIL−15による刺激培養の後に添加してもよい。抗CD3抗体、IL−15および他のサイトカインを同時に添加して培養する場合は、数日間、好ましくは3〜5日間、あるいは5日間以上、好ましくは10日間以上培養すればよい。抗CD3抗体およびIL−15による刺激培養の後に添加する場合、抗CD3抗体およびIL−15により数日間、好ましくは3〜5日間、あるいは5日間以上、好ましくは10日間以上刺激培養した後に他のサイトカインを追加添加してもよいし、培地を他のサイトカインを含む培地に交換してもよい。
CD94あるいはNKG2A発現細胞が増幅しているか否かは、蛍光標識抗CD94抗体あるいはNKG2A抗体で免疫蛍光染色を行い、FACS(Fluorescence activated cell sorter)またはフローサイトメトリーで解析することにより決定できる。G−PBMC、PBMCまたはCBMCを本発明の抑制性NK受容体陽性細胞の増幅方法により増幅することにより、G−PBMC、PBMCまたはCBMC中の15%以上、好ましくは20%以上、さらに好ましくは25%以上、特に好ましくは30%以上の細胞がCD94+細胞となり、G−PBMC、PBMCまたはCBMC中の5%以上、好ましくは10%以上、さらに好ましくは15%以上の細胞がNKG2A+細胞となる。本発明の方法により増幅する前のG−PBMCに比べ、CD94+あるいはNKG2A+細胞は10倍以上、好ましくは20倍以上、特に好ましくは100倍以上に増幅されている。
また、G−PBMC、PBMCまたはCBMCからCD8+細胞をFACSまたは抗CD8抗体を結合させた免疫磁気ビーズを用いて、単離精製し抗CD3抗体およびIL−15、場合によってはさらに他のサイトカインで刺激してもよい。この際抗CD3抗体およびIL−15による刺激のほか、CD14+細胞の存在が必要であり、G−PBMC等から別途CD14+細胞を単離精製して混合する。
本発明の方法によりドナーG−PBMC、PBMCまたはCBMC細胞から増幅したCD94+あるいはNKG2A+細胞は、セルソーターまたは抗CD94抗体結合免疫磁気ビーズを用いて単離精製することができる。本発明は、G−PBMC、PBMCまたはCBMCからCD94+あるいはNKG2A+細胞を増幅し、該CD94+あるいはNKG2A+細胞を単離精製することを含むCD94+あるいはNKG2A+細胞の製造方法をも包含する。
このようにして増幅したCD94+あるいはNKG2A+細胞は、表面にHLAクラスI分子の発現がないか、発現量が低いか、またはHLAクラスI分子が非適合である腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有する一方で、適合したHLAクラスIの発現量が高い正常細胞に対しては細胞障害活性を有さない。すなわち、ドナー由来のCD94+あるいはNKG2A+増幅細胞を白血病や腫瘍患者に投与した場合、正常な細胞に対してGVHDをもたらさず白血病細胞および腫瘍細胞に対してのみ細胞障害活性を示し、例えば白血病患者においてはGVL(移植片対白血病)効果を、腫瘍患者においてはGVT(移植片対腫瘍)効果をもたらすので、本発明の方法により増幅したCD94+あるいはNKG2A+細胞を癌の治療に用いることができる。癌の種類は問わず、HLAクラスI分子の発現が低下した癌細胞ならばどんな癌細胞でも本発明の方法で増幅したCD94+あるいはNKG2A+細胞による治療の対象となる。
治療には、本発明の方法によりG−PBMC、PBMCまたはCBMCから増幅したCD94+あるいはNKG2A+細胞を上記のように単離精製して用いるのが望ましい。単離精製したCD94+あるいはNKG2A+細胞を患者体重1kg当たり106〜108個患者に投与すればよい。投与は、例えば点滴静注により行う。細胞の投与によりCD94+あるいはNKG2A+細胞が、患者の白血病細胞または腫瘍細胞を障害し、治療効果を発揮することができる。
従って、本発明の方法により増幅したCD94+あるいはNKG2A+細胞を被検体に投与することを含む癌の治療方法も本発明に包含される。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2002−235601号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図1は、ドナーpre−GおよびドナーG−PBMCからのCD94/NKG2A発現細胞の誘導と増幅を示す図である。
図2は、ドナーG−PBMCからのCD94/NKG2A発現細胞の誘導と増幅を示す図である。
図3は、ドナーG−PBMCより精製したCD8+細胞からのCD94/NKG2A発現細胞の誘導と増幅を示す図である。
図4は、ドナーG−PBMCからのCD94/NKG2A発現細胞の増幅倍率を示す図である。
図5は、ドナーG−PBMC由来のCD94発現細胞のK562細胞および自家PHA芽球に対する細胞障害活性を示す図である。
図6は、ドナーG−PBMC由来のCD94発現細胞のK562細胞、自家PHA芽球、CML−CP患者由来細胞およびCML−BC患者由来細胞に対する細胞障害活性を示す図である。
図7は、K562細胞におけるHLAクラスI抗原の発現を示す図である。
図8は、K562細胞におけるHLA−Eの発現を示す写真である。
図9は、ドナーG−PBMC由来のCD94発現細胞の処理K562細胞および非処理K562細胞に対する細胞障害活性を示す図である。
図10は、ドナーG−PBMC由来のCD94発現細胞の処理K562細胞および非処理K562細胞に対する細胞障害活性を示す図である。
図11は、K562細胞を移植したNOD/SCIDマウスでのCD94発現細胞投与の効果を示す写真である。
図12は、NOD/SCIDマウスでのK562細胞の増殖のCD94発現細胞による抑制を示す図である。
図13は、NOD/SCIDマウスでのK562細胞の増殖のCD94発現細胞による抑制を示す図である。
図2は、ドナーG−PBMCからのCD94/NKG2A発現細胞の誘導と増幅を示す図である。
図3は、ドナーG−PBMCより精製したCD8+細胞からのCD94/NKG2A発現細胞の誘導と増幅を示す図である。
図4は、ドナーG−PBMCからのCD94/NKG2A発現細胞の増幅倍率を示す図である。
図5は、ドナーG−PBMC由来のCD94発現細胞のK562細胞および自家PHA芽球に対する細胞障害活性を示す図である。
図6は、ドナーG−PBMC由来のCD94発現細胞のK562細胞、自家PHA芽球、CML−CP患者由来細胞およびCML−BC患者由来細胞に対する細胞障害活性を示す図である。
図7は、K562細胞におけるHLAクラスI抗原の発現を示す図である。
図8は、K562細胞におけるHLA−Eの発現を示す写真である。
図9は、ドナーG−PBMC由来のCD94発現細胞の処理K562細胞および非処理K562細胞に対する細胞障害活性を示す図である。
図10は、ドナーG−PBMC由来のCD94発現細胞の処理K562細胞および非処理K562細胞に対する細胞障害活性を示す図である。
図11は、K562細胞を移植したNOD/SCIDマウスでのCD94発現細胞投与の効果を示す写真である。
図12は、NOD/SCIDマウスでのK562細胞の増殖のCD94発現細胞による抑制を示す図である。
図13は、NOD/SCIDマウスでのK562細胞の増殖のCD94発現細胞による抑制を示す図である。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
実施例1は、以下のようにして行った。
(ドナーおよびG−CSF動員)
末梢血幹細胞ドナーにrhG−CSF(キリンビール社)を4、5日間毎日一回10μg/kgの用量で皮下注射した。白血球アフェレシスはrhG−CSF投与の4日目から行い、原則としてG−PBMC検体は最初の白血球アフェレシスから得た。すべてのサンプルは同時に試験するために凍結保存した。
(フローサイトメーター分析のための免疫蛍光染色およびモノクローナル抗体の入手)
フィコエリトリン(PE)結合モノクローナル抗体(mAb)HP−3D9(抗CD94)はAncell社(米国)より、z199(抗NKG2A)はImmunotec社(フランス)より、LueM3(抗CD14)はBecton Dickinson社(米国)より入手した。FITC結合抗CD3、抗CD8mAbおよび抗HLA−A,B,C mAbは、Pharmingen社(米国)から入手した。抗CD3mAb UCHT−1はImmunotec社よりOKT3はOrtho Biotech社(米国)から入手した。細胞の蛍光強度はFACS Calibur(Becton Dickinson)を用いて分析した。統計分析はStudent’s t−testを用いて行った。
(CD14+細胞、CD8+細胞およびCD94+細胞の免疫磁気細胞ソーティング)精製CD14+細胞(フローサイトメーター分析によればCD14+の割合が95%を超える)、CD14+細胞除去分画(CD14+細胞の割合は、3%未満)、CD8+細胞(CD8+の割合は90%を超える)およびCD94+細胞(CD94+の割合は90%を超える)は磁気微粒子を用いた磁気細胞ソーティング(MACS)により入手した。方法は、製造元(Miltenyi Biotec GmbH社、ドイツ)の指示書に従った。
(固相化抗CD3モノクローナル抗体の刺激によるCD94発現細胞の誘導)
抗CD3mAbでコーティングするために、24ウェル平底プレートまたは組織培養フラスコを抗CD3モノクローナル抗体、UCHT1またはOKT3を添加して前培養した。実施例1の図2および図3に結果を示す実験においては、UCHT1を用い、他の実験においてはOKT3を用いた。コーティングは100mM Tris−HClバッファー中1μg/mLの抗体濃度で4℃で16時間行った。G−PBMC(1×106/mL)またはG−PBMC由来のCD8+細胞(500×103/mL)をこれらのプレート中で5ng/mLの組換えヒトIL−15(R&D system、米国)存在下または非存在下で37℃で培養した。G−PBMC培養は24ウェルプレートで0.45μm微孔膜(FALCON)を用いるかまたは用いないで行った。G−PBMC由来の精製CD14+細胞(300×103)は培養物に直接添加するかまたは前記膜を介して添加した。
(G−PBMCからのCD94発現細胞の増幅)
5人の異なるドナー由来のG−PBMCを固相化抗CD3mAb(1μg/mL)およびIL−15(5ng/mL)を用いた条件で10日間培養した。この際、培地はRPMI1640を用い、37℃で培養を行った。5日間の培養後、新鮮培地およびIL−15を添加し、細胞密度を1×106/mlに調整した。
(1) G−PBMC由来のT細胞上のCD94/NKG2A発現の誘導
上記の手法を用いてG−PBMC由来のT細胞上のCD94/NKG2Aの誘導を行った。
図1に抗CD3mAbとIL−15での7日間の刺激前および刺激後のPBMC(それぞれpre−G若しくはpre−GPBMCおよびG−PBMCと称する)中のCD94/NKG2A発現細胞の割合を示した。白抜きのバーはpre−Gの結果を、黒塗りのバーは、G−PBMCの結果を示す。1、2および3はCD94+/3+の細胞の割合を、4、5および6はCD94+/8+
4+/8+の細胞の割合を、7、8および9はNKG2A+/CD3+細胞の割合を、10、11および12はNKG2A+/CD8+細胞の割合を示す。図中1、4、7および10は抗CD3mABおよびIL−15による刺激前の結果を、3、6、9および12は、抗CD3mABおよびIL−15による刺激後の結果を、2、5、8および11は抗CD3mABのみで刺激した結果を示す。図に示すように、G−CSFの投与前および投与後に7名のドナーから得たPBMC間でT細胞上のCD94/NKG2A発現に差はなかった。しかしながら、IL−15の存在下または不存在下で固相化抗CD3モノクローナル抗体(mAb)で7日間刺激したG−PBMCから採取したT細胞上のCD94/NKG2AはpreG−PBMCよりも高かった。
図2は、G−PBMC、CD14除去G−PBMC、CD14除去G−PBMCに3×105の精製CD14+細胞を添加した場合およびCD14除去G−PBMCに膜を介して3×105の精製CD14+細胞を添加した場合の抗CD3mAbとIL−15での7日間の刺激前および刺激後のpre−GとG−PBMC中のCD94/NKG2A発現細胞の割合を示す。白抜きのバーが抗CD3mAbとIL−15による刺激前の結果を、黒塗りのバーが抗CD3mAbとIL−15による刺激後の結果を、斜め線のバーがCD14除去G−PBMCの結果を、チェックのバーがCD14除去G−PBMCに3×105の精製CD14+細胞を添加した場合の結果を、ドットが付されたバーはCD14除去G−PBMCに膜を介して3×105の精製CD14+細胞を添加した場合の結果を示す。グラフ上の94+/3+、94+/8+、NKG2A+/3+およびNKG2A+/8+の意味は図1と同じである。図に示すように、CD14除去G−PBMCに3×105の精製CD14+細胞を添加するとCD3+/CD8+T細胞上のCD94およびNKG2A発現を誘導した。この精製CD14+細胞の効果はCD14+細胞とレスポンダー細胞との接触を膜を用いて阻止すると抑制された。これらの結果はCD14+細胞がT細胞におけるCD94/NKG2A発現の誘導に重要な役割を果たしており、この効果はCD14+細胞とレスポンダー細胞の少なくとも部分的な接触を要することを示唆する。CD14+細胞はG−PBMC中のTCRを介した第1のシグナルの伝達を妨げずに、CD28/B7共刺激を抑制する(Tanaka,J.et al.,Bllod 91,347−352(1998))。このTCRの関与はCD8+T細胞上の抑制性NKRの誘導に重要な役割を果たすことが報告されている(Huard,B.et al.,Nature,403,325−328(2000))。
図3は、3×105の精製CD14+細胞を添加した場合およびCD14除去G−PBMCに膜を介して3×105の精製CD14+細胞を添加した場合の抗CD3mAbとIL−15での刺激前および刺激後のG−PBMC由来の精製CD8+細胞中のCD94/NKG2A発現細胞の割合をしめす。各バーの意味は図2と同じである。値は、pre−GおよびG−PBMC中のCD94またはNKG2A発現細胞の割合(平均±SD)を示す。以下の条件間に有意の差が認められた。Pre−GおよびG−PBMC間の値、刺激前と刺激後の間、G−PBMCとCD14除去G−PBMCの間、精製CD14+細胞を添加したCD14除去G−PBMCと精製CD14+細胞を添加しなかったCD14除去G−PBMCの間、膜を介してCD14+細胞を添加したCD14除去G−PBMCおよび膜を介さないでCD14+細胞を添加したCD14除去G−PBMCの間、ならびにG−PBMCから精製したCD8+細胞であって刺激前と刺激後の間、精製CD14+細胞を添加した精製CD8細胞と添加しないCD8+細胞の間、膜を介してCD14+細胞を添加した精製CD8+細胞と膜を介さないでCD14+細胞を添加した精製CD8+細胞の間。図1〜3に示すaはP<0.01、bはP<0.05、cはP<0.1なる有意差を示している。図に示すように、固相化抗CD3mAbおよびIL−15で刺激するとG−PBMC由来の精製CD8+T細胞におけるCD94/NKG2A発現の増大が認められた。3×105の精製CD14細胞を精製CD8+T細胞に添加するとこれらの精製CD8+T細胞におけるCD94/NKG2A発現を誘導した。さらに、この精製CD14+細胞効果は膜により阻止される傾向を示した。IL−15はCD94/NKG2A誘導性サイトカインの一つとして知られている。従って、本実施例の結果はIL−15が固相化抗CD3mAbによるT細胞活性化の間G−PBMC由来の精製CD8+T細胞上の抑制性NKRの誘導に重要な役割を果たしていることを示している。
(2)G−PBMCからのCD94発現細胞の増幅
図4は、5人の異なるドナー由来のG−PBMCを用いた刺激前と比較した刺激5日後および10日後のCD94/NKG2A発現細胞の増幅倍率を示す。図に示すように、10日間の培養後5人のドナーから得たG−PBMCからCD94+/8+細胞およびNKG2A+/CD8+細胞は刺激前と比較してそれぞれ22.1〜410.0倍、121.7〜2348.2倍に増えた。
(G−PBMCからのCD94発現細胞の増幅2 IL−15およびIL−21による刺激)
上記の方法でG−PBMCを抗CD3抗体とIL−15で刺激培養の際に同時に、または抗CD3抗体とIL−15で4〜5日間刺激培養した後、IL−21(SIGMA)を12.5ng/ml加えて培養することによりさらに効率良く抑制性NKレセプターCD94/NKG2A陽性細胞を増幅することができた。
CD94発現は40%以上、NKG2A発現は30%以上となり、CD8陽性細胞におけるその増幅率はCD94で400から1,400倍、さらにNKG2Aで500から2,600倍に達した(表1)。
〔実施例2〕 K562白血病細胞および患者からの白血病細胞に対するドナーCD94発現細胞の細胞障害活性
実施例2において細胞障害活性の評価およびRT−PCRは以下のようにして行った。(4時間の51Crリリースアッセイを用いた細胞障害活性の評価)
7〜10日間の固相化抗CD3mAbおよびIL−15による刺激後、CD94発現細胞を磁気細胞分離(MACS)により精製した。80%を超えるCD94発現細胞が、CD8を共発現していた。51Cr標識ヒト白血病細胞株K562、allo SCT前の患者白血病細胞および自家PHA芽球(5×103)に対するCD94発現細胞の細胞障害活性を試験した。K562細胞をIFN−γ(0.2μg/mL)と共に2日間培養した。HLA−Cw3シグナルペプチド(VMAPRTLIL;配列番号1)およびB15ペプチド(VTAPRTVLL;配列番号2)はKURABO社(日本)が合成したものを用いた(純度95%)。
(PCR反応)
第1鎖cDNA合成は60ngRNA、5mM MgCl2、1mmol/L DNTP、2.5μMランダム9マーおよび0.25U/μL AMV逆転写酵素(Takara RNA PCR Kit、日本)を用いて行った。次いで、cDNAのPCR増幅をHLA−Eのエキソン4用のセンスプライマー5’−CAGCATGAGGGGCTACCCG−3’(配列番号3)およびアンチセンスプライマー5’−GTGTGAGGAAGGGGGTCATG−3’(配列番号4)を用いて行い、βアクチン用のセンスプライマー5’−TTCGAGCAAGAGATGGCCACGGCT−3’(配列番号5)およびアンチセンスプライマー5’−ATACTCCTGCTTGCTGATCCACAT−3’(配列番号6)を内部標準として用いた。
ドナーCD94発現細胞の細胞障害活性
図5は、CD94発現細胞のK562細胞および自家PHA芽球に対する細胞障害活性を示す。白抜きのバーは、K562細胞の結果を、黒塗りのバーはPHA芽球の結果を示す。図に示すように、標準的な4時間の51Crリリースにより検出したK562に対するG−PBMC由来の精製CD94発現細胞の細胞障害活性は自家のPHA芽球に対するよりも常に高かった。
次いで、慢性相における同種SCT前の骨髄細胞である患者由来の慢性骨髄性白血病(CML)細胞およびCMLの急性転化(CML myeloid blastic crisis、CML−BC)の患者の白血病芽球に対するドナー由来のCD94発現細胞の細胞障害活性を調べた。図6は、ドナーG−PBMCから増幅したCD94発現細胞のK562細胞、患者白血病細胞および自家PHA芽球に対する細胞障害活性を示す。白抜きのバーはK562細胞の結果を、斜め線のバーは患者の白血病細胞の結果を、チェックのバーは自家PHA芽球の結果を示す。エフェクター/ターゲット比は5:1および10:1であり、それぞれ2本一組のバーのうち、左が5:1で右が10:1の結果を示す。図に示すように、ドナー由来のCD94発現細胞は患者の白血病細胞を攻撃したが、自家PHA芽球は攻撃しなかった。K562細胞、CML−CPおよびCML−BCの患者の白血病細胞、PHA芽球1、PHA芽球2ならびに健常人のPBMCを用いてFACSで検出したHLAクラスI分子の平均の蛍光はそれぞれ、21.6、101.8、108.5、394.4、347.8および171.1であった。従って、CD94発現細胞の細胞障害活性は標的細胞上のHLAクラスI分子の発現に逆比例していることがわかった。
次に、CD94発現細胞の細胞障害活性の特徴を調べた。図7にK562細胞をIFN−γ(0.2μg/ml)と共に、またはIFN−γなしに2日間培養した後に抗HLAクラスI mAbおよびアイソタイプ対照マウスIg G1−FITCで染色した結果を示す。上図がIFN−γなしで、下図がIFN−γを添加して培養した結果である。HLAクラスI発現はIFN−γによりK562細胞上で誘導される。IFN−γ処理K562上のHLAクラスI分子の平均の蛍光は109.0であった。
図8は、K562細胞中のβ−アクチンおよびHLA−E mRNAをIFN−γと培養する前、培養1日後、および2日後にRT−PCRにより検出した結果を示す。レーン1、2および3がβアクチンの結果を、レーン4、5および6がHLA−Eの結果を示し、レーン1および4がIFN−γとの培養前、レーン2および5がIFN−γとの培養1日後、レーン3および6がIFN−γとの培養2日後の結果を示す。このRT−PCR実験により、IFN−γによりK562細胞におけるHLA−E mRNAが誘導されることが示された(Ulbrecht,M.et al.,J.Immunol.149,2945−2953(1992))。
図9は、未処理K562、IFN−γ処理K562細胞、IFN−γおよびHLA−Cw3ペプチド(0.3mM)処理K562細胞ならびに自家PHA芽球に対するCD94発現細胞の細胞障害活性を示す。それぞれ、◆、■、▲および●で表す。CD94発現細胞のIFN−γ処理K562細胞に対する細胞障害活性は、未処理K562に対するものに比較して弱かった。さらに、HLA−Cのシグナル配列でありHLA−EとともにCD94のリガンドとして複合体を作るHLA−Cw3ペプチド(0.3mM)は、CD94発現細胞のこれらのHLAクラスI発現K562細胞に対する細胞障害活性を抑制する(Borrego,F.et al.,J.Exp.Med.187,813−818(1998))。しかし、CD94/NKG2Aと相互作用しないと報告されているB15ペプチドは、そのような抑制性効果を奏しなかった(B15ペプチドに関する結果は図に示していない)。
図10は、IFN−γ処理K562細胞、HLA−Cw3ペプチド(0.3mM)およびIFN−γ処理K562細胞ならびにHLA−Cw3ペプチド、抗NKG2A mAb(10μg/mL)およびIFN−γ処理K562細胞に対するCD94発現細胞の細胞障害活性を示す。それぞれ、◆、■および▲で示す。図に示すように、抗NKG2A mAb(10μg/ml)はCD94発現細胞の細胞障害活性に対するHLAクラスI防護効果を解除した。従って、これらのCD94発現細胞はHLAクラスI分子を有さないK562を攻撃し得、しかしこの障害活性はK562細胞におけるHLAクラスI分子の発現およびHLAクラスIシグナルペプチドにより阻止された。
〔実施例3〕 NOD/SCIDマウスにおけるCD94発現細胞によるK562白血病細胞増幅の抑制
5〜8週齢の雌NOD/SCIDマウスはCLEA社(日本)から入手した。飼育維持は無菌条件下でマイクロアイソレーターを用いて行った。K562細胞をG−PBMCから増幅させた精製CD94発現細胞とともにまたは単独で0.5mL PBSに懸濁させ、NOD/SCIDマウスの右脇に皮下注射した。CML急性転化白血球細胞もNOD/SCIDに移植しようと試みたが、K562細胞のようには腫瘍を形成しなかった。
NOD/SCIDマウスにK562細胞をG−PBMC由来の精製CD94発現細胞と共に同時に皮下注射した。図11は、注射後8週間でのNOD/SCIDマウス中でのK562細胞の増殖を示す。図12及び図13は、マウスにK562細胞を単独でまたはCD94発現細胞と皮下注射した場合の腫瘍の大きさを示す。図12において、◆および▲は5×107のK562細胞のみを注射した場合、■は1×107のCD94発現細胞と共に注射した場合、●は、2.5×107のCD94発現細胞と共に注射した場合を示す。図13において、◆および●は、2.5×107のK562細胞のみを注射した場合、■および△は、1×107CD94発現細胞と共に注射した場合を示す。CD94発現細胞はNOD/SCIDマウスにおけるK562細胞の増幅を細胞数依存的に、CD94発現細胞:K562細胞比が1×107:2×107および2.5×107:5×107のとき完全に、同比が1×107:5×107のとき部分的に阻害した。
さらに、実施例1から3の結果から以下の事項がわかった。
本発明において、G−CSFで動員されたPBMC(G−PBMC)中のIL−15と固相化抗CD3モノクローナル抗体で刺激したCD3+/CD8+T細胞上のCD94/NKG2Aの増大した発現が示された。また、CD14+細胞が精製CD8+T細胞上のCD94/NKG2A発現の誘導に重要な役割を果たしていることが示された。従って、G−PBMC由来のCD8+T細胞は刺激後にCD94/NKG2Aを発現できた。さらに、ドナーG−PBMCからCD94発現細胞を約100倍増幅させることができた。これらの増幅したドナーCD94発現細胞はHLAクラスI分子を欠失しているK562白血病細胞とHLAクラスI分子が健常人由来PBMCおよび自家PHA芽球に比較して減少している患者白血病細胞を攻撃するが、HLAクラスI分子の発現が非常に増大している自家PHA芽球は攻撃しない。in vivo分析でこれらのCD94発現細胞はNOD/SCIDマウスにおいてK562細胞の増幅を阻止し得ることが示された。従って、CD94抑制性NKR発現細胞は移植片対白血病効果を活性化する。
部分的にHLAが適合したBMT(Bone marrow transplantation、骨髄移植)はCD158b抑制性NKRを発現するドナー由来のCTLを大きく増幅させ、GVHDを抑制するがそれとは区別できるGVL反応は抑制しない(Albi,N.et al.,Blood 87,3993−4000(1996))。抑制性NKR陽性細胞はクラスI陰性標的細胞を攻撃するが同一のクラスI陽性細胞は攻撃しない(Mingari,M.C.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A.95,1172−1177(1998))。また、GVLエフェクターは NKRの非適合の原則に基づいてHLA非適合造血細胞移植において重要である(Ruggeri,L.et al.,Blood 94,333−339(1999))。CD158b抑制性NKRのトランスジェニック発現は、H−2非適合骨髄移植のin vivoでの拒絶を抑制する(Cambiaggi,A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94,8088−8092(1997))。混合リンパ球反応および抗CD3mAbにより活性化された細胞障害活性はCD158bトランスジェニックマウスにおけるトランスジェニックCD158b分子の働きにより抑制され得る(Cambiaggi,A.et al.,Blood 94,2396−2402(1999))。最近、Ruggeriらは、特にレシピエントのAPC(抗原提示細胞)に対するドナー対宿主ナチュラルキラー(NK)細胞同種反応性が特に急性GVHDを抑制することを示した(Ruggeri,L et al.,Science 295,2097−2100(2002))。
予後の良好な慢性GVHD患者におけるT細胞上でのCD158およびCD94/NKG2Aの増大した発現について報告され、これらの抑制性のNKR発現細胞がMLCの同種反応に対する抑制性効果を有することが示された(Tanaka,J.et al.,Br.J.Haematol.108,778−783(2000)、Tanaka,J.et al.,Bone Marrow Transplant,26,287−290(2000)、Tanaka,J.et al.,Br.J.Haematol 117,751−754,(2002))。従って、allo SCT後の同種刺激の間のこれらの抑制性NKR発現はGVHDおよびGVLの調節に重要な役割を果たす。CD8+T細胞上のCD94/NKG2A発現がG−PBMC由来のCD14+細胞により誘導されるという本発明者らの知見はallo PBSCT後の急性GVHDの予想外の低い発生および増大し得るGVL効果を説明し得る。CD94/NKG2Aリガンド、HLA−EはほとんどのHLA−A、B、CおよびGのシグナル配列由来のペプチドに特異的に結合しこれらのペプチドによりアップレギュレートされる(Braud,V.M.et al.,Nature 391,795−799(1998))。IFN−γにより誘導されたHLAクラスI分子発現K562細胞を用いてCD94発現細胞の細胞障害特性を調べた。HLA−CシグナルペプチドはCD94発現細胞のIFN−γに誘導されHLAクラスI分子を発現しているK562細胞に対する細胞障害活性を抑制することがわかった。また、抗NKG2A mAbはHLAクラスI分子に防護されたK562細胞に対するCD94発現細胞の細胞障害活性を復活させる。しかし、これらのCD94発現細胞によるHLAクラスI分子依存性細胞障害活性はall or nothing様式では評価できなかった。これは、これらのG−PBMCから増幅したCD94発現細胞がクローン化T細胞と同一ではなく、26TCR−Vβプライマーを用いたRT−PCR分析が示すように、様々なTCR−Vベータファミリーを有することによる。抗NKG2A mAbを用いても自家PHA芽球に対するCD94発現細胞の細胞障害活性の復活はできなかった。これはHLAクラスI分子の非常に増大した発現およびCD94発現細胞の細胞障害作用を刺激する他の異なる抗原の減少による。一方、CD94/NKG2Aは種々の血液細胞および組織細胞で広いHLAクラスI分子をモニターし得る。従って、CD94発現細胞は種々のHLAクラスIタイプを有する多くの患者においてGVHDおよびGVLを調節するのに役立つ。抑制性NKR発現細胞の細胞障害特性はGVHDとGVL間の微妙なバランスを如何にして調節するかという問いかけを説く鍵になる。これらのドナーG−PBMCからの増幅したCD94発現細胞はGVHDを促進せずに単純なドナーリンパ球注入の代わりにGVL効果を誘導するための同種細胞治療に役立つ。ドナーG−PBMCは同種細胞治療のためのCD94+あるいはNKG2A+細胞などの抑制性NKR発現細胞の増幅のための供給源となると考えられる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
(ドナーおよびG−CSF動員)
末梢血幹細胞ドナーにrhG−CSF(キリンビール社)を4、5日間毎日一回10μg/kgの用量で皮下注射した。白血球アフェレシスはrhG−CSF投与の4日目から行い、原則としてG−PBMC検体は最初の白血球アフェレシスから得た。すべてのサンプルは同時に試験するために凍結保存した。
(フローサイトメーター分析のための免疫蛍光染色およびモノクローナル抗体の入手)
フィコエリトリン(PE)結合モノクローナル抗体(mAb)HP−3D9(抗CD94)はAncell社(米国)より、z199(抗NKG2A)はImmunotec社(フランス)より、LueM3(抗CD14)はBecton Dickinson社(米国)より入手した。FITC結合抗CD3、抗CD8mAbおよび抗HLA−A,B,C mAbは、Pharmingen社(米国)から入手した。抗CD3mAb UCHT−1はImmunotec社よりOKT3はOrtho Biotech社(米国)から入手した。細胞の蛍光強度はFACS Calibur(Becton Dickinson)を用いて分析した。統計分析はStudent’s t−testを用いて行った。
(CD14+細胞、CD8+細胞およびCD94+細胞の免疫磁気細胞ソーティング)精製CD14+細胞(フローサイトメーター分析によればCD14+の割合が95%を超える)、CD14+細胞除去分画(CD14+細胞の割合は、3%未満)、CD8+細胞(CD8+の割合は90%を超える)およびCD94+細胞(CD94+の割合は90%を超える)は磁気微粒子を用いた磁気細胞ソーティング(MACS)により入手した。方法は、製造元(Miltenyi Biotec GmbH社、ドイツ)の指示書に従った。
(固相化抗CD3モノクローナル抗体の刺激によるCD94発現細胞の誘導)
抗CD3mAbでコーティングするために、24ウェル平底プレートまたは組織培養フラスコを抗CD3モノクローナル抗体、UCHT1またはOKT3を添加して前培養した。実施例1の図2および図3に結果を示す実験においては、UCHT1を用い、他の実験においてはOKT3を用いた。コーティングは100mM Tris−HClバッファー中1μg/mLの抗体濃度で4℃で16時間行った。G−PBMC(1×106/mL)またはG−PBMC由来のCD8+細胞(500×103/mL)をこれらのプレート中で5ng/mLの組換えヒトIL−15(R&D system、米国)存在下または非存在下で37℃で培養した。G−PBMC培養は24ウェルプレートで0.45μm微孔膜(FALCON)を用いるかまたは用いないで行った。G−PBMC由来の精製CD14+細胞(300×103)は培養物に直接添加するかまたは前記膜を介して添加した。
(G−PBMCからのCD94発現細胞の増幅)
5人の異なるドナー由来のG−PBMCを固相化抗CD3mAb(1μg/mL)およびIL−15(5ng/mL)を用いた条件で10日間培養した。この際、培地はRPMI1640を用い、37℃で培養を行った。5日間の培養後、新鮮培地およびIL−15を添加し、細胞密度を1×106/mlに調整した。
(1) G−PBMC由来のT細胞上のCD94/NKG2A発現の誘導
上記の手法を用いてG−PBMC由来のT細胞上のCD94/NKG2Aの誘導を行った。
図1に抗CD3mAbとIL−15での7日間の刺激前および刺激後のPBMC(それぞれpre−G若しくはpre−GPBMCおよびG−PBMCと称する)中のCD94/NKG2A発現細胞の割合を示した。白抜きのバーはpre−Gの結果を、黒塗りのバーは、G−PBMCの結果を示す。1、2および3はCD94+/3+の細胞の割合を、4、5および6はCD94+/8+
4+/8+の細胞の割合を、7、8および9はNKG2A+/CD3+細胞の割合を、10、11および12はNKG2A+/CD8+細胞の割合を示す。図中1、4、7および10は抗CD3mABおよびIL−15による刺激前の結果を、3、6、9および12は、抗CD3mABおよびIL−15による刺激後の結果を、2、5、8および11は抗CD3mABのみで刺激した結果を示す。図に示すように、G−CSFの投与前および投与後に7名のドナーから得たPBMC間でT細胞上のCD94/NKG2A発現に差はなかった。しかしながら、IL−15の存在下または不存在下で固相化抗CD3モノクローナル抗体(mAb)で7日間刺激したG−PBMCから採取したT細胞上のCD94/NKG2AはpreG−PBMCよりも高かった。
図2は、G−PBMC、CD14除去G−PBMC、CD14除去G−PBMCに3×105の精製CD14+細胞を添加した場合およびCD14除去G−PBMCに膜を介して3×105の精製CD14+細胞を添加した場合の抗CD3mAbとIL−15での7日間の刺激前および刺激後のpre−GとG−PBMC中のCD94/NKG2A発現細胞の割合を示す。白抜きのバーが抗CD3mAbとIL−15による刺激前の結果を、黒塗りのバーが抗CD3mAbとIL−15による刺激後の結果を、斜め線のバーがCD14除去G−PBMCの結果を、チェックのバーがCD14除去G−PBMCに3×105の精製CD14+細胞を添加した場合の結果を、ドットが付されたバーはCD14除去G−PBMCに膜を介して3×105の精製CD14+細胞を添加した場合の結果を示す。グラフ上の94+/3+、94+/8+、NKG2A+/3+およびNKG2A+/8+の意味は図1と同じである。図に示すように、CD14除去G−PBMCに3×105の精製CD14+細胞を添加するとCD3+/CD8+T細胞上のCD94およびNKG2A発現を誘導した。この精製CD14+細胞の効果はCD14+細胞とレスポンダー細胞との接触を膜を用いて阻止すると抑制された。これらの結果はCD14+細胞がT細胞におけるCD94/NKG2A発現の誘導に重要な役割を果たしており、この効果はCD14+細胞とレスポンダー細胞の少なくとも部分的な接触を要することを示唆する。CD14+細胞はG−PBMC中のTCRを介した第1のシグナルの伝達を妨げずに、CD28/B7共刺激を抑制する(Tanaka,J.et al.,Bllod 91,347−352(1998))。このTCRの関与はCD8+T細胞上の抑制性NKRの誘導に重要な役割を果たすことが報告されている(Huard,B.et al.,Nature,403,325−328(2000))。
図3は、3×105の精製CD14+細胞を添加した場合およびCD14除去G−PBMCに膜を介して3×105の精製CD14+細胞を添加した場合の抗CD3mAbとIL−15での刺激前および刺激後のG−PBMC由来の精製CD8+細胞中のCD94/NKG2A発現細胞の割合をしめす。各バーの意味は図2と同じである。値は、pre−GおよびG−PBMC中のCD94またはNKG2A発現細胞の割合(平均±SD)を示す。以下の条件間に有意の差が認められた。Pre−GおよびG−PBMC間の値、刺激前と刺激後の間、G−PBMCとCD14除去G−PBMCの間、精製CD14+細胞を添加したCD14除去G−PBMCと精製CD14+細胞を添加しなかったCD14除去G−PBMCの間、膜を介してCD14+細胞を添加したCD14除去G−PBMCおよび膜を介さないでCD14+細胞を添加したCD14除去G−PBMCの間、ならびにG−PBMCから精製したCD8+細胞であって刺激前と刺激後の間、精製CD14+細胞を添加した精製CD8細胞と添加しないCD8+細胞の間、膜を介してCD14+細胞を添加した精製CD8+細胞と膜を介さないでCD14+細胞を添加した精製CD8+細胞の間。図1〜3に示すaはP<0.01、bはP<0.05、cはP<0.1なる有意差を示している。図に示すように、固相化抗CD3mAbおよびIL−15で刺激するとG−PBMC由来の精製CD8+T細胞におけるCD94/NKG2A発現の増大が認められた。3×105の精製CD14細胞を精製CD8+T細胞に添加するとこれらの精製CD8+T細胞におけるCD94/NKG2A発現を誘導した。さらに、この精製CD14+細胞効果は膜により阻止される傾向を示した。IL−15はCD94/NKG2A誘導性サイトカインの一つとして知られている。従って、本実施例の結果はIL−15が固相化抗CD3mAbによるT細胞活性化の間G−PBMC由来の精製CD8+T細胞上の抑制性NKRの誘導に重要な役割を果たしていることを示している。
(2)G−PBMCからのCD94発現細胞の増幅
図4は、5人の異なるドナー由来のG−PBMCを用いた刺激前と比較した刺激5日後および10日後のCD94/NKG2A発現細胞の増幅倍率を示す。図に示すように、10日間の培養後5人のドナーから得たG−PBMCからCD94+/8+細胞およびNKG2A+/CD8+細胞は刺激前と比較してそれぞれ22.1〜410.0倍、121.7〜2348.2倍に増えた。
(G−PBMCからのCD94発現細胞の増幅2 IL−15およびIL−21による刺激)
上記の方法でG−PBMCを抗CD3抗体とIL−15で刺激培養の際に同時に、または抗CD3抗体とIL−15で4〜5日間刺激培養した後、IL−21(SIGMA)を12.5ng/ml加えて培養することによりさらに効率良く抑制性NKレセプターCD94/NKG2A陽性細胞を増幅することができた。
CD94発現は40%以上、NKG2A発現は30%以上となり、CD8陽性細胞におけるその増幅率はCD94で400から1,400倍、さらにNKG2Aで500から2,600倍に達した(表1)。
〔実施例2〕 K562白血病細胞および患者からの白血病細胞に対するドナーCD94発現細胞の細胞障害活性
実施例2において細胞障害活性の評価およびRT−PCRは以下のようにして行った。(4時間の51Crリリースアッセイを用いた細胞障害活性の評価)
7〜10日間の固相化抗CD3mAbおよびIL−15による刺激後、CD94発現細胞を磁気細胞分離(MACS)により精製した。80%を超えるCD94発現細胞が、CD8を共発現していた。51Cr標識ヒト白血病細胞株K562、allo SCT前の患者白血病細胞および自家PHA芽球(5×103)に対するCD94発現細胞の細胞障害活性を試験した。K562細胞をIFN−γ(0.2μg/mL)と共に2日間培養した。HLA−Cw3シグナルペプチド(VMAPRTLIL;配列番号1)およびB15ペプチド(VTAPRTVLL;配列番号2)はKURABO社(日本)が合成したものを用いた(純度95%)。
(PCR反応)
第1鎖cDNA合成は60ngRNA、5mM MgCl2、1mmol/L DNTP、2.5μMランダム9マーおよび0.25U/μL AMV逆転写酵素(Takara RNA PCR Kit、日本)を用いて行った。次いで、cDNAのPCR増幅をHLA−Eのエキソン4用のセンスプライマー5’−CAGCATGAGGGGCTACCCG−3’(配列番号3)およびアンチセンスプライマー5’−GTGTGAGGAAGGGGGTCATG−3’(配列番号4)を用いて行い、βアクチン用のセンスプライマー5’−TTCGAGCAAGAGATGGCCACGGCT−3’(配列番号5)およびアンチセンスプライマー5’−ATACTCCTGCTTGCTGATCCACAT−3’(配列番号6)を内部標準として用いた。
ドナーCD94発現細胞の細胞障害活性
図5は、CD94発現細胞のK562細胞および自家PHA芽球に対する細胞障害活性を示す。白抜きのバーは、K562細胞の結果を、黒塗りのバーはPHA芽球の結果を示す。図に示すように、標準的な4時間の51Crリリースにより検出したK562に対するG−PBMC由来の精製CD94発現細胞の細胞障害活性は自家のPHA芽球に対するよりも常に高かった。
次いで、慢性相における同種SCT前の骨髄細胞である患者由来の慢性骨髄性白血病(CML)細胞およびCMLの急性転化(CML myeloid blastic crisis、CML−BC)の患者の白血病芽球に対するドナー由来のCD94発現細胞の細胞障害活性を調べた。図6は、ドナーG−PBMCから増幅したCD94発現細胞のK562細胞、患者白血病細胞および自家PHA芽球に対する細胞障害活性を示す。白抜きのバーはK562細胞の結果を、斜め線のバーは患者の白血病細胞の結果を、チェックのバーは自家PHA芽球の結果を示す。エフェクター/ターゲット比は5:1および10:1であり、それぞれ2本一組のバーのうち、左が5:1で右が10:1の結果を示す。図に示すように、ドナー由来のCD94発現細胞は患者の白血病細胞を攻撃したが、自家PHA芽球は攻撃しなかった。K562細胞、CML−CPおよびCML−BCの患者の白血病細胞、PHA芽球1、PHA芽球2ならびに健常人のPBMCを用いてFACSで検出したHLAクラスI分子の平均の蛍光はそれぞれ、21.6、101.8、108.5、394.4、347.8および171.1であった。従って、CD94発現細胞の細胞障害活性は標的細胞上のHLAクラスI分子の発現に逆比例していることがわかった。
次に、CD94発現細胞の細胞障害活性の特徴を調べた。図7にK562細胞をIFN−γ(0.2μg/ml)と共に、またはIFN−γなしに2日間培養した後に抗HLAクラスI mAbおよびアイソタイプ対照マウスIg G1−FITCで染色した結果を示す。上図がIFN−γなしで、下図がIFN−γを添加して培養した結果である。HLAクラスI発現はIFN−γによりK562細胞上で誘導される。IFN−γ処理K562上のHLAクラスI分子の平均の蛍光は109.0であった。
図8は、K562細胞中のβ−アクチンおよびHLA−E mRNAをIFN−γと培養する前、培養1日後、および2日後にRT−PCRにより検出した結果を示す。レーン1、2および3がβアクチンの結果を、レーン4、5および6がHLA−Eの結果を示し、レーン1および4がIFN−γとの培養前、レーン2および5がIFN−γとの培養1日後、レーン3および6がIFN−γとの培養2日後の結果を示す。このRT−PCR実験により、IFN−γによりK562細胞におけるHLA−E mRNAが誘導されることが示された(Ulbrecht,M.et al.,J.Immunol.149,2945−2953(1992))。
図9は、未処理K562、IFN−γ処理K562細胞、IFN−γおよびHLA−Cw3ペプチド(0.3mM)処理K562細胞ならびに自家PHA芽球に対するCD94発現細胞の細胞障害活性を示す。それぞれ、◆、■、▲および●で表す。CD94発現細胞のIFN−γ処理K562細胞に対する細胞障害活性は、未処理K562に対するものに比較して弱かった。さらに、HLA−Cのシグナル配列でありHLA−EとともにCD94のリガンドとして複合体を作るHLA−Cw3ペプチド(0.3mM)は、CD94発現細胞のこれらのHLAクラスI発現K562細胞に対する細胞障害活性を抑制する(Borrego,F.et al.,J.Exp.Med.187,813−818(1998))。しかし、CD94/NKG2Aと相互作用しないと報告されているB15ペプチドは、そのような抑制性効果を奏しなかった(B15ペプチドに関する結果は図に示していない)。
図10は、IFN−γ処理K562細胞、HLA−Cw3ペプチド(0.3mM)およびIFN−γ処理K562細胞ならびにHLA−Cw3ペプチド、抗NKG2A mAb(10μg/mL)およびIFN−γ処理K562細胞に対するCD94発現細胞の細胞障害活性を示す。それぞれ、◆、■および▲で示す。図に示すように、抗NKG2A mAb(10μg/ml)はCD94発現細胞の細胞障害活性に対するHLAクラスI防護効果を解除した。従って、これらのCD94発現細胞はHLAクラスI分子を有さないK562を攻撃し得、しかしこの障害活性はK562細胞におけるHLAクラスI分子の発現およびHLAクラスIシグナルペプチドにより阻止された。
〔実施例3〕 NOD/SCIDマウスにおけるCD94発現細胞によるK562白血病細胞増幅の抑制
5〜8週齢の雌NOD/SCIDマウスはCLEA社(日本)から入手した。飼育維持は無菌条件下でマイクロアイソレーターを用いて行った。K562細胞をG−PBMCから増幅させた精製CD94発現細胞とともにまたは単独で0.5mL PBSに懸濁させ、NOD/SCIDマウスの右脇に皮下注射した。CML急性転化白血球細胞もNOD/SCIDに移植しようと試みたが、K562細胞のようには腫瘍を形成しなかった。
NOD/SCIDマウスにK562細胞をG−PBMC由来の精製CD94発現細胞と共に同時に皮下注射した。図11は、注射後8週間でのNOD/SCIDマウス中でのK562細胞の増殖を示す。図12及び図13は、マウスにK562細胞を単独でまたはCD94発現細胞と皮下注射した場合の腫瘍の大きさを示す。図12において、◆および▲は5×107のK562細胞のみを注射した場合、■は1×107のCD94発現細胞と共に注射した場合、●は、2.5×107のCD94発現細胞と共に注射した場合を示す。図13において、◆および●は、2.5×107のK562細胞のみを注射した場合、■および△は、1×107CD94発現細胞と共に注射した場合を示す。CD94発現細胞はNOD/SCIDマウスにおけるK562細胞の増幅を細胞数依存的に、CD94発現細胞:K562細胞比が1×107:2×107および2.5×107:5×107のとき完全に、同比が1×107:5×107のとき部分的に阻害した。
さらに、実施例1から3の結果から以下の事項がわかった。
本発明において、G−CSFで動員されたPBMC(G−PBMC)中のIL−15と固相化抗CD3モノクローナル抗体で刺激したCD3+/CD8+T細胞上のCD94/NKG2Aの増大した発現が示された。また、CD14+細胞が精製CD8+T細胞上のCD94/NKG2A発現の誘導に重要な役割を果たしていることが示された。従って、G−PBMC由来のCD8+T細胞は刺激後にCD94/NKG2Aを発現できた。さらに、ドナーG−PBMCからCD94発現細胞を約100倍増幅させることができた。これらの増幅したドナーCD94発現細胞はHLAクラスI分子を欠失しているK562白血病細胞とHLAクラスI分子が健常人由来PBMCおよび自家PHA芽球に比較して減少している患者白血病細胞を攻撃するが、HLAクラスI分子の発現が非常に増大している自家PHA芽球は攻撃しない。in vivo分析でこれらのCD94発現細胞はNOD/SCIDマウスにおいてK562細胞の増幅を阻止し得ることが示された。従って、CD94抑制性NKR発現細胞は移植片対白血病効果を活性化する。
部分的にHLAが適合したBMT(Bone marrow transplantation、骨髄移植)はCD158b抑制性NKRを発現するドナー由来のCTLを大きく増幅させ、GVHDを抑制するがそれとは区別できるGVL反応は抑制しない(Albi,N.et al.,Blood 87,3993−4000(1996))。抑制性NKR陽性細胞はクラスI陰性標的細胞を攻撃するが同一のクラスI陽性細胞は攻撃しない(Mingari,M.C.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A.95,1172−1177(1998))。また、GVLエフェクターは NKRの非適合の原則に基づいてHLA非適合造血細胞移植において重要である(Ruggeri,L.et al.,Blood 94,333−339(1999))。CD158b抑制性NKRのトランスジェニック発現は、H−2非適合骨髄移植のin vivoでの拒絶を抑制する(Cambiaggi,A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94,8088−8092(1997))。混合リンパ球反応および抗CD3mAbにより活性化された細胞障害活性はCD158bトランスジェニックマウスにおけるトランスジェニックCD158b分子の働きにより抑制され得る(Cambiaggi,A.et al.,Blood 94,2396−2402(1999))。最近、Ruggeriらは、特にレシピエントのAPC(抗原提示細胞)に対するドナー対宿主ナチュラルキラー(NK)細胞同種反応性が特に急性GVHDを抑制することを示した(Ruggeri,L et al.,Science 295,2097−2100(2002))。
予後の良好な慢性GVHD患者におけるT細胞上でのCD158およびCD94/NKG2Aの増大した発現について報告され、これらの抑制性のNKR発現細胞がMLCの同種反応に対する抑制性効果を有することが示された(Tanaka,J.et al.,Br.J.Haematol.108,778−783(2000)、Tanaka,J.et al.,Bone Marrow Transplant,26,287−290(2000)、Tanaka,J.et al.,Br.J.Haematol 117,751−754,(2002))。従って、allo SCT後の同種刺激の間のこれらの抑制性NKR発現はGVHDおよびGVLの調節に重要な役割を果たす。CD8+T細胞上のCD94/NKG2A発現がG−PBMC由来のCD14+細胞により誘導されるという本発明者らの知見はallo PBSCT後の急性GVHDの予想外の低い発生および増大し得るGVL効果を説明し得る。CD94/NKG2Aリガンド、HLA−EはほとんどのHLA−A、B、CおよびGのシグナル配列由来のペプチドに特異的に結合しこれらのペプチドによりアップレギュレートされる(Braud,V.M.et al.,Nature 391,795−799(1998))。IFN−γにより誘導されたHLAクラスI分子発現K562細胞を用いてCD94発現細胞の細胞障害特性を調べた。HLA−CシグナルペプチドはCD94発現細胞のIFN−γに誘導されHLAクラスI分子を発現しているK562細胞に対する細胞障害活性を抑制することがわかった。また、抗NKG2A mAbはHLAクラスI分子に防護されたK562細胞に対するCD94発現細胞の細胞障害活性を復活させる。しかし、これらのCD94発現細胞によるHLAクラスI分子依存性細胞障害活性はall or nothing様式では評価できなかった。これは、これらのG−PBMCから増幅したCD94発現細胞がクローン化T細胞と同一ではなく、26TCR−Vβプライマーを用いたRT−PCR分析が示すように、様々なTCR−Vベータファミリーを有することによる。抗NKG2A mAbを用いても自家PHA芽球に対するCD94発現細胞の細胞障害活性の復活はできなかった。これはHLAクラスI分子の非常に増大した発現およびCD94発現細胞の細胞障害作用を刺激する他の異なる抗原の減少による。一方、CD94/NKG2Aは種々の血液細胞および組織細胞で広いHLAクラスI分子をモニターし得る。従って、CD94発現細胞は種々のHLAクラスIタイプを有する多くの患者においてGVHDおよびGVLを調節するのに役立つ。抑制性NKR発現細胞の細胞障害特性はGVHDとGVL間の微妙なバランスを如何にして調節するかという問いかけを説く鍵になる。これらのドナーG−PBMCからの増幅したCD94発現細胞はGVHDを促進せずに単純なドナーリンパ球注入の代わりにGVL効果を誘導するための同種細胞治療に役立つ。ドナーG−PBMCは同種細胞治療のためのCD94+あるいはNKG2A+細胞などの抑制性NKR発現細胞の増幅のための供給源となると考えられる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
実施例1に示すように、本発明の方法によりドナー由来のG−PMBC中で抑制性NK細胞受容体腸性細胞であるCD94発現細胞を著しく増幅することができる。CD94発現細胞は、実施例2に示すようにHLAクラスI分子が発現していないかまたは発現量が低い細胞に対して細胞障害活性を有し、実施例3に示すように、in vivoでの白血病および腫瘍治療に用いることができる。
Claims (12)
- 血液由来の単核細胞を抗CD3抗体およびIL−15の存在下で培養することを含む、抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
- 末梢血単核細胞を抗CD3抗体およびIL−15の存在下で培養することを含む、請求項1記載の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
- G−CSF動員末梢血単核細胞(G−PBMC)、G−CSFを投与せずに採取した正常末梢血もしくは移植患者末梢血から採取した末梢血単核細胞(PBMC)、または臍帯血から採取した臍帯血単核細胞(CBMC)を抗CD3抗体およびIL−15の存在下で培養することを含む、請求項1記載の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
- CD8+細胞にCD14+細胞を混合し、抗CD3抗体およびIL−15の存在下で培養することを含む、抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
- 細胞を抗CD3抗体およびIL−15に加えて、IL−21の存在下で培養する請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 抗CD3抗体とIL−15で刺激培養の際に同時に、または抗CD3抗体とIL−15で刺激培養した後に、IL−21を添加する、請求項5記載の方法。
- 抑制性NK細胞受容体陽性細胞がCD94+あるいはNKG2A+細胞である、請求項1から6のいずれか1項に記載の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
- 少なくとも抗CD3抗体およびIL−15が存在する条件下での培養が5日以上行われる請求項1から7のいずれか1項に記載の抑制性NK細胞受容体腸性細胞を増幅させる方法。
- 少なくとも抗CD3抗体およびIL−15が存在する条件下での培養が10日以上行われる請求項8記載の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
- 培養前に比べ、G−PBMC、PBMCまたはCBMC中のCD94+あるいはNKG2A+細胞が10倍以上増幅される請求項1から9のいずれか1項に記載の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
- 培養前に比べ、G−PBMC、PBMCまたはCBMC中のCD94+あるいはNKG2A+細胞が20倍以上増幅される請求項10記載の抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させる方法。
- 請求項1から11のいずれか1項に記載の増幅方法により抑制性NK細胞受容体陽性細胞を増幅させたG−PBMC、PBMCまたはCBMCより抑制性NK細胞受容体陽性細胞を単離することを含む、抑制性NK細胞受容体陽性細胞の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002235601 | 2002-08-13 | ||
JP2002235601 | 2002-08-13 | ||
PCT/JP2003/010291 WO2004016774A1 (ja) | 2002-08-13 | 2003-08-13 | 抑制性nk細胞受容体陽性細胞の増幅方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2004016774A1 true JPWO2004016774A1 (ja) | 2005-12-02 |
Family
ID=31884384
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004528869A Pending JPWO2004016774A1 (ja) | 2002-08-13 | 2003-08-13 | 抑制性nk細胞受容体陽性細胞の増幅方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2004016774A1 (ja) |
AU (1) | AU2003255024A1 (ja) |
WO (1) | WO2004016774A1 (ja) |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002516103A (ja) * | 1998-05-29 | 2002-06-04 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | インターロイキン21およびインターロイキン22 |
-
2003
- 2003-08-13 WO PCT/JP2003/010291 patent/WO2004016774A1/ja active Application Filing
- 2003-08-13 JP JP2004528869A patent/JPWO2004016774A1/ja active Pending
- 2003-08-13 AU AU2003255024A patent/AU2003255024A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2004016774A1 (ja) | 2004-02-26 |
AU2003255024A1 (en) | 2004-03-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11395835B2 (en) | Use of common gamma chain cytokines for the visualization, isolation and genetic modification of memory T lymphocytes | |
US20190359938A1 (en) | Adoptive transfer of cd8+ t cell clones derived from central memory cells | |
JP6086904B2 (ja) | γδT細胞を含むリンパ球の細胞株、その組成物、及びその製造方法 | |
JP2007527245A (ja) | レギュラトリーt細胞並びに免疫療法及び自己免疫応答の抑制におけるそれらの使用 | |
JP2022065022A (ja) | 改変ヒト初代血液樹状細胞株を生成するための方法 | |
US20170081637A1 (en) | Development Of Natural Killer Cells And Functional Natural Killer Cell Lines | |
EP3362569B1 (en) | Cxcr6-transduced t cells for targeted tumor therapy | |
JP2018531022A6 (ja) | 改変ヒト初代血液樹状細胞株を生成するための方法 | |
JP2022523052A (ja) | 変異型rasを標的とするための組成物および方法 | |
US20100035282A1 (en) | Use of common gamma chain cytokines for the visualization, isolation and genetic modification of memory t lymphocytes | |
Van Caeneghem et al. | Antigen receptor-redirected T cells derived from hematopoietic precursor cells lack expression of the endogenous TCR/CD3 receptor and exhibit specific antitumor capacities | |
JP2018531016A6 (ja) | 腫瘍標的療法のためのcxcr6形質導入t細胞 | |
Maeda | Immune reconstitution after T-cell replete HLA haploidentical hematopoietic stem cell transplantation using high-dose post-transplant cyclophosphamide | |
US20070128670A1 (en) | Methods for the identification and preparation of regulator/suppressor t lymphocytes, compositions and use thereof | |
Prasad et al. | Propagation and characterisation of dendritic cells from G-CSF mobilised peripheral blood monocytes and stem cells in common marmoset monkeys | |
JPWO2004016774A1 (ja) | 抑制性nk細胞受容体陽性細胞の増幅方法 | |
US20240117309A1 (en) | Methods for expanding t cell populations | |
Vivien et al. | The doubling potential of T lymphocytes allows clinical-grade production of a bank of genetically modified monoclonal T-cell populations | |
Zanon | Stem cell-like properties of memory T cells in human immune reconstitution | |
KR20210141599A (ko) | Cd28 t 세포의 배양액, 조성물 및 그 사용 방법 | |
Class et al. | Patent application title: Development Of Natural Killer Cells And Functional Natural Killer Cell Lines Inventors: Schickwann Tsai (Salt Lake City, UT, US) | |
Patterson | Graft-versus-myeloid leukemia responses in murine bone marrow transplantations |