JP2007527245A - レギュラトリーｔ細胞並びに免疫療法及び自己免疫応答の抑制におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

レギュラトリーT細胞(Treg細胞)と細胞傷害性T細胞応答の抑制又は予防の間の強力な相関関係を基に、宿主、特にヒト宿主における、自己免疫応答を含む、免疫応答の予防又は抑制のために、ex vivo活性化され及び培養-増量され単離されたCD4⁺CD25⁺サプレッサーTreg細胞を作出する方法が提供される。得られるex vivo培養-増量されたTreg細胞は、ヒト又は他の動物宿主における移植された組織の拒絶反応の予防、抑制、ブロックもしくは阻害、又は移植片対宿主疾患に対する予防を含む、治療的使用を可能にするための長期間のサプレッサー能を有する、そうでなければ数が少ないそのような細胞の十分量を提供する。ヒト治療においてex vivo培養-増量されたTreg細胞を利用する、治療法及び免疫抑制法、並びに研究的用途のための高効率の方法も提供される。

Description

発明の技術分野
本発明は、レギュラトリーT細胞、並びにそれの長期間の培養-増量（culture-expanding)法、活性化法、免疫療法及びGVHDを含む自己免疫応答の抑制における使用法に関する。

発明の背景
サプレッサー細胞は、癌の進行において役割を果たすと長い間考えられている(Dyeら、J. Exp. Med., 154:1033-1042 (1981))。実際、レギュラトリーT細胞による能動的抑制は、外来及び自己-抗原に対するT細胞反応のダウン-レギュレーションにおいて重要な役割を果たす。
T細胞は、リンパ球のクラスであり、遺伝子再構成の結果として産生される特異的T細胞レセプター(TCR)を有する。T細胞は、多様な役割を有し、これは遺伝子発現の個別のパターンにより認識可能である、T細胞の別個のサブセットの分化により実現される。いくつかの主要なT細胞サブセットは、TCR-α/β、及びTCRγ/Δ及びインバリアントナチュラルキラー細胞などの、レセプター発現を基に認識される。他のT細胞サブセットは、表面分子及びそこから分泌されるサイトカインにより定義される。例えば、ヘルパーT細胞(CD4細胞)は、サイトカインを分泌し、並びにB細胞及び細胞傷害性T細胞を生存させ、エフェクター機能を実行することを補助する。細胞傷害性T細胞(CTL)は一般に、CD8細胞であり、これらは感染細胞又は腫瘍細胞のような標的細胞を殺傷するために特化される。ナチュラルキラー(NK)細胞は、T細胞に関連するが、TCRを有さず、より短い寿命を有するが、これらは一部の機能をT細胞と共有し、サイトカイン分泌及びある種の標的細胞の殺傷を行うことができる。

ヒト及びマウス末梢血は、レギュラトリーTの表現型("Treg")を発現する、すなわちCD4及びCD25両抗原について陽性であるT細胞リンパ球の小集団(すなわち、CD25についても明確に陽性であるCD4⁺ T細胞)を含む。リンパ節及び脾臓CD4⁺ T細胞集団の6〜10％を構成すると最初にマウスにおいて特徴付けられた、このCD4⁺CD25⁺細胞の集団は、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)のわずかに約5〜10％、又はCD4⁺ T細胞の2〜7％であるが、一部のドナーは、CD4⁺及びCD25⁺細胞のより明確な集団を示す。ヒト末梢血PBMCの約1〜2％は、CD4陽性(CD4⁺)及びCD25明らかに陽性(CD25⁺)の両方共陽性の細胞である。

Treg細胞のいくつかのサブセットが存在する(Bluestoneら、Nature Rev. Immunol., 3:253 (2003))。調節細胞のひとつのサブセットは、胸腺において発生する。胸腺由来のTreg細胞は、サイトカイン-依存型機構により機能し、これは細胞の細胞との接触に関連している(Shevach, Nature Rev. Immunol, 2:389 (2002))。これらは、自己寛容の誘導及び維持並びに自己免疫の防止において必須である(Shevach, Annu. Rev. Immunol., 18:423-449 (2000)；Stephensら、2001；Taamsら、2001；Thorntonら、1998；Salomonら、Immunity, 12:431-440 (2000)；Sakaguchiら、Immunol. Rev., 182:18-32 (2001))。これらのプロフェッショナル調節細胞は、胸腺欠損から逃れるか又は胸腺外抗原を認識する自己反応性のT細胞の活性化及び増殖を防止し、その結果これらはホメオスタシス及び免疫調節、更には自己免疫発生に対する宿主の保護に関して重要である(Suri-Payerら、J. Immunol., 157:1799-1805 (1996)；Asanoら、J. Exp. Med., 184:387-396 (1996)；Bonomoら、J. Immunol., 154:6602-6611 (1995)；Willerfordら、Immunity, 3:521-530 (1995)；Takahashiら、Int. Immunol., 10:1969-1980 (1998)；Salomonら、Immunity, 12:431-440 (2000)；Readら、J. Exp. Med., 192:295-302 (2000))。従って免疫調節CD4⁺CD25⁺T細胞は、「プロフェッショナルサプレッサー細胞」と称されることが多い。

しかしTreg細胞は、成熟型末梢CD4⁺T細胞の活性化によっても作出することができる。研究は、末梢由来のTreg細胞は、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)及びIL-10のような、免疫抑制性のサイトカインの産生により、それらの阻害活性を媒介することを示している(Kingsleyら、J. Immunol., 168:1080 (2002)；Nakamuraら、J. Exp. Med., 194:629-644 (2001))。抗原-特異的活性化後に、これらのTreg細胞は、CD4⁺又はCD25⁺のいずれかのT細胞の増殖を非-特異的に抑制することができる(低投与量での固定された抗-CD3 mAb-ベースの同時-培養サプレッサーアッセイにおけるFACS選別により明らかにされた、Baecher-Allanら、J. Immunol., 167(3):1245-1253 (2001))。

研究は、CD4⁺CD25⁺細胞は、自家抗原提示細胞(APC)と共培養される場合に、直接接触を介してのみ、T細胞の抗-CD3刺激を阻害することができることを示している(Stephensら、Eur. J. Immunol., 31:1247-1254 (2001)；Taamsら、Eur. J. Immunol., 31:1122-1131 (2001)；Thorntonら、J. Exp. Med., 188:287-296 (1998))。しかしマウスにおいて、この阻害作用は、固定された抗-CD3又は抗-CD3/CD28による直接T細胞刺激に打ち勝つことができない(Thorntonら、1998)。先の報告において、末梢血から単離されたヒトCD4⁺CD25⁺T細胞は、それらの抑制性の特性を明らかにするためには、予備活性化が必要であり、その理由はこれらの調節細胞の直接培養は抑制性の作用を媒介するには一般に不充分であるからである(Dieckmannら、J. Exp. Med., 193:1303-1310 (2001))。他の研究者も、ヒトCD4⁺CD25⁺T細胞の阻害特性は、活性-依存型であるが、抗原-非特異性であることを発見し(Jonuleitら、J. Exp. Med., 193: 1285-1294 (2001)；Levingsら、J. Exp. Med., 193(11): 1295-1302 (2001)；Yamagiwaら、J. Immunol., 166: 7282-7289 (2001))、並びに細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4)の細胞内貯蔵庫の構成的発現を明らかにした(Jonuleitら、2001；Readら、J. Exp. Med., 192: 295-302 (2000)；Yamagiwaら、2001；Takahashiら、J. Exp. Med., 192: 303-310 (2000))。更にT細胞レセプター(TCR)-媒介した刺激後、CD4⁺CD25⁺T細胞は、アロ抗原及びマイトジェンにより活性化されたナイーブCD4⁺CD25⁺T細胞の活性化を抑制する(Jonuleitら、2001)。

マウス及びヒトの両Treg細胞は、CTLA-4を発現するが、しかし、寛容誘導におけるCTLA-4の役割及びCD4⁺CD25⁺T細胞を調節するために阻害機能を付与するその能力は、議論の的である。CTLA-4(CD152としても公知)は、CD28のホモログであり、CD80及びCD86リガンドのレセプターである。CTLA-4は、抗原及びTCR-依存した様式でT細胞応答を阻害する。損なわれたCTLA-4機能を有するT細胞は、増強されたT細胞増殖及びサイトカイン産生を有する。対照的に、増強されたCTLA-4機能は、in vitro及びin vivoの両方での阻害されたサイトカイン分泌並びに損なわれた細胞周期進行につながる。マウスにおいて、CTLA-4は、Treg細胞の抑制機能に必要とされず、これはヒトにおいてそれが必要とされることとは対照的である。このことは一部、CTLA-4の複数型が存在すること、及びこれはマウス系統又はヒトの間でいろいろであるという、最近の発見により説明される。

最近の研究は、Treg細胞は、in vivoにおいて大規模に増殖することを示している(Tang, J. Immunol., 171: 3348 (2003))が、他の研究者は、マウスにおける治療用癌ワクチンの有効性は、CD4⁺CD25⁺T細胞の除去により増強することができることを示唆している(Sutmullerら、J. Exp. Med., 194: 823-832 (2001))。研究は、調節細胞の枯渇は、増大した腫瘍-特異的免疫応答及びその他は非-応答性の動物における腫瘍の根絶につながることも示している(Onizukaら、Cancer Res., 59: 3128-3133 (1999)；Shimizuら、J. Immunol., 163: 5211-5218 (1999))。新生仔の胸腺切除術によりCD4⁺CD25⁺欠損を生じた感受性のあるマウス系統は、10〜14日齢までに、CD4⁺CD25⁺T細胞の注入により、予防し得る臓器-特異性自己免疫の広いスペクトルを提示することが示された(Suri-Payerら、J. Immunol., 160: 1212-1218 (1998))。この研究は、CD4⁺CD25⁺T細胞は、自己抗原-特異性T細胞クローンにより誘導された自己免疫を阻害することも認めた。ヌードマウスへのCD4⁺CD25^-T細胞の移入も自己免疫疾患の発生につながり、これはCD25⁺細胞が最初に枯渇されたリンパ球を使用するCD4⁺CD25⁺T細胞の同時-移入により予防することができることが報告されている(Sakaguchiら、J. Immunol., 155: 1151-1164 (1995))。しかしデータは、CD4⁺CD25⁺細胞の役割は、自己寛容及び自己免疫の予防に限定されないことも示している。アロ反応又は移植におけるCD4⁺CD25⁺T細胞の役割を説明する研究はほとんどないが、CD4⁺CD25⁺T細胞は、in vitro及びin vivoの両方において、同種移植片拒絶反応を防止することが報告されている(Haraら、J. Immunol., 166: 3789-3796 (2001)；Taylorら、J. Exp. Med., 193: 1311-1318 (2001))。ヒトT細胞増殖の同種異系性刺激も、CD4⁺CD25⁺T細胞によりブロックされるが(Yamagiwaら、2001)、Woodの研究室は、アロ抗原が直接的ではなく間接的に非自己認識経路に提示された場合にのみ、CD4⁺CD25⁺T細胞は、混合リンパ球反応(MLR)を抑制することを示した(Haraら、2001)。選別されたCD4⁺CD25⁺細胞はプロフェッショナルAPCを高度に枯渇しているので、直接的抗原提示は、レギュラトリーT細胞と抗-CD3/28刺激された反応T細胞の間で生じる可能性があるであろう。

本発明者らは、CD4⁺CD25⁺T細胞が、非-小細胞肺癌(NSCLC)患者の腫瘍浸潤リンパ球中に高い割合で存在すること(Wooら、Cancer Res., 61: 4766-4772 (2001))、及びCD4⁺CD25⁺細胞は、同時-刺激遮断を介したアロ抗原に対する寛容のex vivo誘導に本質的に必要であることを示した(Taylorら、J. Exp. Med., 193: 1311-1318 (2001))。しかしほとんどの文献が、免疫系は、末梢の固形腫瘍に対し無知の状態であり、従ってこれはアネルギーであることを述べている(Ochsenbeinら、Nature, 411: 1058-1064 (2001)；Staveley-O'Carrollら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1178-1183 (1998))。自家及び同種異系性T細胞増殖を抑制するCD4⁺CD25⁺T細胞の示差的能力の説明は、おそらく最も複雑であろう。結果として、ヒト腫瘍におけるCD4⁺CD25⁺T細胞の役割、又はそれらが宿主が腫瘍抗原のような自己抗原に対する免疫応答を搭載する(mounting)ことを防ぐいずれかの作用は、今日まで不明なままである。

Tregは、in vitroにおいて低増殖性であるとして文献において説明されている(Sakaguchi, Ann. Rev. Immunol., 22: 531 (2004))。Trenadoらは、in vivoでの疾患動物モデルにおける、ex vivo活性化され及び増量されたCD4⁺CD25⁺調節細胞の治療有効性の最初の評価を提供した(Trenadoら、J. Clin. Invest., 112(11): 1688-1696 (2002))。その状況において、ex vivo活性化され及び増量されたドナーCD4⁺CD25⁺細胞の注入は、急激な-致命的GVHDを有意に阻害することが示されたが、これらのデータは、マウスについてのみ示され、ヒトにおいては示されていない。更に、試験した条件に関するマウスの試験において、新たに単離されるか又は培養されたTreg細胞はGVHDを抑制することができるが、免疫再構成(Trenadoら、2002)のために、移植片-対-白血病作用(GVL活性)はもたらされた(Trenadoら、2002；Jonesら、Biol. Blood Marrow Transplant, 9(4): 243-256 (2003)；Edingerら、Nat. Med., 9(9): 1144-1150 (2003))。

しかしヒト血液は組成が、マウス血液とは組成が非常に異なり、このことは、過度の実験をすることなく、マウスの試験をヒト細胞における同等の反応に翻訳することはできないことを意味している。ヒト血液はメモリー細胞(〜50％)を含み、これはCD25 dimであり、及びCD4⁺CD25⁺サプレッサー細胞集団と重複し、このことはヒトTreg細胞を精製することを非常に困難にしている。比べて、CD25 dim細胞は、齧歯類においてごくわずかに存在するか、又は若い非病原性マウス(ほとんどのマウス試験において利用される状態)には完全に存在しない。ヒトにおいて、CD25-選択(CTLA-4は新鮮な細胞の表面上に存在しないので、循環サプレッサー細胞の唯一公知の表面マーカー)を基にしたTregの精製は、Treg細胞の濃厚化を生じるが、これは完全な精製には十分ではない。部分的に純粋なサプレッサー集団は、短期間培養/活性化後の抑制を簡単に立証するが、これらは通常のT細胞の夾雑により、迅速に過増殖する。

結果的に、Trenadoらと同等の知見が、ヒト細胞について報告された。CD4⁺CD25⁺細胞の増殖を示すそれらの公表された報告は、サプレッサー機能を認めることには失敗しており、本発明まで、同時にGMP条件を遵守するヒトTreg細胞の過度のin vitro又はex vivo増量を誰も得ることができないでいる。ただひとつの先行する論文が、ヒトCD4⁺CD25⁺細胞の増量を説明している(Levingsら、2001)。しかいこの論文において、ただひとつの図が、サプレッサー機能を説明し、これはごく控えめな作用を有することを示している。サプレッサー細胞対反応細胞比1:1で、増殖のわずかに約60％〜65％阻害が認められ、これはマウスTreg細胞において典型的に認められるものよりも低かった。従って報告された抑制の大きさは、そのように小さく、これは非-特異的作用(例えば、増殖因子の消費、超過密、抗原提示細胞からの置換など)から生じる。更にこの培養物は、Levingsらによりごく短期間(わずかに14日間)維持され、これらの細胞は、おそらくは調節細胞及び通常のT細胞の混合された培養物を示している。

Treg細胞を培養するために、Leavingsらは、同種異系性PBMCの支持細胞混合物の存在下で、可溶性抗-CD3(1μg/ml)と共に培養されたJYリンパ芽球細胞(EBVウイルスにより形質転換されたリンパ芽球細胞株)を使用した。これらの執筆者らにより、CD4⁺CD25⁺細胞の精製には、二段階磁気マイクロビーズプロトコールを使用することが報告され、ここでは最初に細胞は、ヒトにおける治療的用途に適していない得られる生成物を作出する、CD8、CD11b、CD16、CD19、CD36、及びCD56に対する抗体の使用により、非-T細胞及びT細胞のCD8型を枯渇する。その後、これらの細胞は、CD25陽性について選択された。

更にLeavingsらは、純度90％のTreg細胞について報告したが、ストリンジェンシーに関しては明らかにしなかった。サプレッサー細胞株作出に関して十分な純度のヒト細胞(CD25⁺)の単離には、非常に高レベルのストリンジェンシーが、絶対重要であるので、このことは問題が多く、本発明までの知見は、先行技術において考察も認知もされていない。しかし以下に示したように、サプレッサー細胞株の作出に他の研究者が使用した単離法及び増量法の不適切さは、ヒトTreg細胞に関する研究における利点を著しく妨害している。結果的に、治療目的で有効なTreg細胞をここまで使用することは可能ではなかった。

従って、これらのTreg細胞の特徴決定を可能にし、及びヒト患者における安全かつ有効な治療的使用を提供するのに十分な数作出する方法が必要である。CD4⁺CD25⁺T細胞、並びに腫瘍免疫-サーベイランス及び癌、特に肺癌などの固形腫瘍癌の免疫療法又は免疫-抑制におけるそれらの機能をより大きく理解することも依然必要である。移植片-対-宿主疾患(GVHD)などであるが、これらに限定されるものではないin vivoアロ反応及び自己免疫応答を抑制し、並びにCD4⁺CD25⁺細胞療法の役割について説明し及び増量し、並びにCD4⁺CD25⁺サプレッサー細胞の単離又は作出の方法を定義することも、同等に重要である。

発明の概要
前述の当該技術分野における必要性を考慮し、本発明は、肺癌のような固形癌腫瘍の癌免疫療法の重要な要素としてのための、並びにアロ反応及び自己免疫応答の抑制、阻害及び予防のための、レギュラトリーT細胞(Treg細胞)の亜集団、CD4⁺CD25⁺T細胞を操作し及び変調する方法を提供する。CD4⁺CD25⁺T細胞は、自家T細胞増殖の強力な阻害を媒介することがわかった；一方で、患者腫瘍由来のレギュラトリーT細胞は、同種異系性T細胞の増殖の阻害に失敗し、及び肺癌患者における腫瘍への寛容を誘導又は維持するように見える。結果的に、腫瘍免疫サーベイランスの失敗及び増強された腫瘍増殖に繋がり得るin vivoにおけるTreg細胞の発達を修飾及び調節する方法を提供することが目的である。

加えて、本願明細書に示されたデータは、CD4⁺CD25⁺細胞は、in vivoアロ反応、特に移植片-対-宿主疾患(GVHD)発生において重要な役割を果たすことを示している。ドナーT細胞接種材料由来のCD4⁺CD25⁺細胞のex vivo枯渇、又は移植前レシピエントのin vivo CD25-枯渇は、増大したGVHD反応を生じた。これらの知見は、系統(strain)の組合せ又は体への総照射線量(TBI)の条件決定レジメとは関わりなく、並びにGVHDが、CD4⁺T細胞によるか、又はCD4⁺及びCD8⁺の両T細胞により媒介されるかどうかには関わりなく、認められた。

結果的に、本発明の目的は、特にin vivoで投与された活性化され及びex vivo培養で増強されたTreg細胞の集団により、GVHDを抑制、阻害、ブロック又は予防することによる、血液又は骨髄移植の全集団又は選択された集団を含む、ヒトの移植された組織の生着を促進する方法を提供することでもある。有利なことに、このような方法は、低下した強度のレジメにより更に実現され、及び免疫抑制はほとんど又は全くない。従ってこのような生着促進作用は、条件付けレジメの必要性が減少するかもしくは必要性なしで、薬剤-非使用の寛容を実現する手段として固形臓器移植患者へ適用するか、又は免疫系を再設定する手段として同種異系性骨髄又は自家もしくは同種異系性骨髄を伴う自己免疫患者へ適用することができる。

活性化され及び培養-増量された細胞を宿主へ注入し、免疫療法的応答を作出するために、CD4⁺CD25⁺レギュラトリーT細胞のex vivo治療の方法を提供することも本発明の目的である。その最も簡略化された形において、本発明は、増強された抑制活性を維持しつつ、ヒトCD4⁺CD25⁺調節細胞を好ましいex vivoの長期間培養-増量する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：a)レギュラトリーT細胞を、患者又は同種異系性ドナーから得る工程；b) ストリンジェントなマイクロビーズ精製により、得られた細胞からCD4⁺CD25⁺ Treg細胞の集団を単離する工程、それに続くc)培養されたCD4⁺CD25⁺細胞を活性化及び長期間培養-増強し、これにより培養物中の修飾されたCD4⁺CD25⁺サプレッサー細胞の数を増す工程。

好ましい細胞単離法は、CD25⁺細胞単離のために高度にストリンジェントであるようにデザインされ、一旦本発明者らは、CD25 dim細胞はサプレッサーではないと決定した。結果的にCD25 dim細胞は、慎重に選択されなければならない。従って非常に高レベルのストリンジェンシーは、サプレッサー細胞株作出のための十分な純度の細胞(CD25⁺)の単離のために絶対重要であり、その理由は、CD25 dim細胞はCD25⁺細胞よりも迅速に増殖し、及び出発集団内に含まれる場合は、これはCD25⁺細胞を過増殖し、及びサプレッサー機能の表出(manifestation)を排除するからである。ストリンジェントな方法が存在しない場合、強力な抑制、及び長期間の増殖に十分な純度を有するサプレッサー集団の単離は不可能である。

有利なことに、開示された精製法は、CD25細胞のサブセットの評価を可能にする。CD45RAサブセットは、わずかに〜15％のCD25⁺細胞を含む小さいサブセットであるが、これは、細胞株を形成することが可能な大部分のサプレッサー細胞を含むように見える。この本発明の新規知見は、全ての被験ドナー(12/12)においてサプレッサー細胞株の作出を可能にしたのに対し、当該技術分野の先行するプロトコールは(例え極めてストリンジェントなCD25精製及び／又は系統枯渇によっても)、一貫して10〜20％の失敗率を明らかにしている。

選択的精製単独の代わりに、選択培養法も、強力なサプレッサー細胞株作出を可能にする。従って本発明は、増強された抑制活性を有する治療的ヒトTreg細胞を作出するための、好ましいex vivoでの長期間のヒトCD4⁺CD25⁺細胞の培養-増量法を更に提供する。この方法は、高度にストリンジェントな単離法と共に使用されることが好ましいが、必ずしもではない。独自の培養-増量法は、二工程及び切断可能なマイクロビーズを使用する、第二世代の系統枯渇(second-generation lineage depletion)プロトコールを含む。CD3及びCD28に対する抗体で被覆された、特別な細胞-サイズのビーズ(磁鉄-デキストランビーズ-Dynabead)が使用される。抗-CD28は、低増殖性のTreg細胞の増大された活性化及び増殖に関する重要なシグナルを提供する。極めて驚くべきことに、本発明者らは、異なる比のCD3/CD28は、いくつかの選択培養作用を有することを発見した。低い比(抗-CD28に比べ低い抗-CD3)のビーズにより増殖されたCD4⁺CD25⁺細胞株は、はるかにより安定性であり、通常のT細胞により過増殖される可能性は低い。これらのビーズは、培養された細胞を磁気カラムを通過させることにより、容易に除去することができる。細胞選別は不要である。具体化されるように、好ましい方法は、自家CD4⁺T細胞も支持細胞として使用する。従って形質転換された腫瘍株の増殖を促進する必要はない。

更にこの好ましい方法で作出された細胞株は、表現型のフローサイトメトリー特徴決定により証明されるように、均質であり、並びにこれらは2ヶ月間又はそれよりも長く培養することができる。追加の利点として、培養-増量された細胞は、強力な機能性サプレッサー活性を維持する(＞95％阻害、抑制に関する可能性のある非-特異的原因は除外するため、サプレッサー細胞を反応細胞に対し1:10の比で希釈したとしても)。力価決定実験は、得られるサプレッサー細胞は、1:16と低い比(“サプレッサー:反応細胞の比”)で力価決定することができ、依然90％抑制を実現することを明らかにしている。

アッセイされる場合、本発明の培養-増量されたヒトサプレッサー細胞は、反応T細胞として新鮮なCD4⁺細胞又は培養されたCD4⁺CD25^-細胞のいずれかにより、MLRの95％抑制が可能である。更にこれらのCD25 dim干渉細胞は、CD45RO⁺メモリー細胞である(若い病原体非含有マウスにおいてはそれらの不在が説明されている)。CD45RA(未感作細胞マーカー)の使用により、CD4⁺CD25⁺CD45RA⁺細胞のクリーン(clean)な集団を単離することが可能であり、これは＞90％ドナー(n＝20)で、強力なサプレッサー細胞株を均一に形成する。更に機能データは、反応T細胞活性化の遮断及び結果の培養-増量された細胞によるサイトカイン産生の防止を示す。ひとつの態様において、活性化され及び増量されたCD4⁺CD25⁺細胞は、末梢血細胞の自家増殖を阻害する。別の態様において、活性化され及び増量されたCD4⁺CD25⁺細胞は、GVHDをブロックもしくは防止するか、又は既に進行している場合はこの疾患を阻害もしくは逆行する。更に別の態様において、活性化され及び増強された細胞は、異なる宿主へ導入されるのに対し；更に別の態様においては、これらの細胞は、連続的治療用途のための細胞株として確立される。

更に抗-CD3/28ビーズ＋IL-2を使用するような、必ずしも支持細胞に頼らない、代替増量戦略を用いる培養-増量法も提供される。更に抗-CD3/28ビーズ＋IL-2としてそのような代替法が使用される場合、培養-増量は、宿主APC及び／又はDCを伴い又は伴わずに、実現することができる。好ましくは、宿主はヒト宿主であり、及び培養-増量された細胞はヒトであるが、ヒト病態の動物モデルを含む動物も、本発明に含まれ、そのような動物の治療的処置が本願明細書において企図されている。

本発明のex vivo刺激法は、決定的利点を有する。例えば：1)活性化及び増強は、CD4⁺CD25⁺細胞特異的であり；2)長期間培養の刺激は、宿主の細胞へ再導入される前に、刺激抗原の除去を可能にし；並びに、3)活性化及び増強する抗原に対する全身のin vivo曝露の欠如は、天然の又は誘導された免疫原性応答との有意な干渉を除外する。更にex vivo活性化及び増強技術を用いることは、宿主毒性が最低である成功をもたらし、並びにこのサプレッサー細胞組成物は、GMP条件に従い全体が調製され、このことはex vivoで培養-増強されたCD4⁺CD25⁺細胞はヒト注入に関して迅速に承認されることを意味する。

臨床適用に関して、この細胞生成物は、望ましい有益な作用を得るために、invivoにおいてあるエフェクター対標的比を実現しなければならない。多くの場合、細胞培養開始時の投入細胞は、抑制性の前駆細胞の希薄さ、又は限定量の臨床物質のために制限される。提供された方法は、臨床用途のために10⁹の桁で培養-増強された細胞を作出するようにデザインされる。更に臨床的に関連のある組織培養プロセスのために、これは大規模に拡張可能でなければならず、FDA承認された手法及び試薬に準拠しなければならない。従って、特にこれらの必要要件に特異的に合致するようにデザインされた本発明の方法は、都合の良いことに、患者における免疫抑制性の作用又は予防的治療作用を実現することが不可能である天然のTreg細胞を使用し生じるであろう容積に関連した問題点を克服するために十分に特異的である増強されたCD4⁺CD25⁺サプレッサー細胞注入物を作製し、及びこれらの方法は、ヒト治療に関してそれまでに承認された条件を利用する。

本発明の長期間の培養-増量法により作出された培養-増量された細胞は、活性化され及び増強された(修飾された)CD4⁺CD25⁺細胞を含む、GVHDを治療するために本発明により提供される試薬として認めることができる。好ましくは、T細胞は、生理的緩衝された溶液を含有する培地のような、ヒト移植又は癌患者への静脈内投与に適した媒体中に懸濁される。いずれかの機構に限定されるものではないが、提唱された方法での細胞の長期培養は、強力なサブセットの濃厚化及び活性化を生じ、これにより治療的恩恵を患者に実現するのに十分な細胞集団を作出すると考えられる。

宿主CD4⁺CD25⁺細胞を、活性化及び／又は増強する組成物とex vivoで接触すること、並びにこうして活性化及び／又は増強されたCD4⁺CD25⁺細胞を、移植片レシピエントにおいてGVHD反応を生じるか又は既に反応開始しているような同種異系性移植を有するか又は受けるであろう自家宿主へ注入することを含む、抗-GVHD反応を誘導する方法を提供することは、本発明の更に別の目的である。これらの細胞は、典型的には末梢血リンパ球、脾細胞、腫瘍-浸潤リンパ球又はリンパ節細胞などの、造血細胞である。

従って本発明により提供されるようなヒト治療の好ましい方法は：a)レギュラトリーT細胞を患者又は同種異系性ドナーから得る工程；b)得られた細胞からCD4⁺CD25⁺細胞集団を単離する工程、それに続くc)培養されたCD4⁺CD25⁺細胞を活性化及び長期間培養-増強する工程であり、ここで培地において修飾されたCD4⁺CD25⁺細胞を作出するための培養-増強及び活性化の方法は、ヒトIL-2、IL-15もしくは他の明らかにされたインターロイキン又は更に細胞増殖を増強する化合物の存在を含み、これにより培養物中の修飾されたCD4⁺CD25⁺サプレッサー細胞の数が増加する工程；並びに、d)in vivo治療的反応を誘導するために、修飾されたCD4⁺CD25⁺サプレッサーT細胞の少なくとも一部を、宿主患者へ再導入する工程；を含む。このような反応は、GVHD又は他の自己免疫応答、又は癌患者における末梢血細胞増殖を防止、ブロック、抑制、阻害又は逆行する。

更に別の態様において、この方法は、本願明細書に提供された培養法を使用し作出される、ex vivoで長期間培養増強されたCD4⁺CD25⁺細胞を利用する。更に別の態様において、この方法は、末梢血に関して本願明細書に提供された培養法を使用し、骨髄に由来したex vivoで長期間培養増強されたCD4⁺CD25⁺ Treg細胞を使用するが、この場合を除き、骨髄吸引液がTreg細胞集団を獲得するために使用される。

更なる目的は、癌の発症前に、癌-非罹患宿主からリンパ球を得、及びこの細胞を、常法を用い疾患の発症時に必要となるまで貯蔵し、この時点で細胞を、宿主への再注入のために、本願明細書において先に説明されたように解凍し、培養し並びに活性化及び増強することである。あるいは確立された細胞株は、癌-非罹患宿主(同種異系性又は自家)から作出することができる。この細胞株は必要になるまで、前述のように貯蔵され、活性化及び培養-増強される。同様に、同種異系性移植の前に、移植レシピエントからリンパ球を得、及びこれらの細胞を常法を用い、移植が完了するまで貯蔵し、その時点でこれらの細胞を解凍し、宿主再注入するために、本願明細書に先に説明されたようにCD25⁺枯渇し及び／又は培養-増強し及び活性化し、GVHDをブロック、抑制、阻害又は予防するか、又は既にGVHDが開始されている場合はこれを逆行することが目的である。あるいは確立された細胞株を、移植前に宿主から調製し、必要になるまで、先のように貯蔵されるか、又は先のようにCD25⁺枯渇され及び／又は培養-増強され及び活性化される。

ひとつの態様において、この方法は、修飾されたCD4⁺CD25⁺細胞の再導入後、ヒトIL-2、IL-15又は他の明らかにされた物質を、宿主患者へin vivoで投与する工程を更に含む。従って自家的に再導入されたex vivo修飾された細胞は、細胞移植片と考えられる。別の態様において、修飾されたCD4⁺CD25⁺ドナー細胞がレシピエントへ同種異系的に導入された後に、宿主は同様に処置される。

本発明の追加の目的、利点及び新規特徴は、一部、以下の説明、実施例及び図面に説明され、これらは全て例証することのみを目的とし、本発明を制限することはいかなる意味においても意図せず、一部は、当業者には以下の実験を基に明らかになるか、又は本発明の実践により学習されるであろう。

本発明の前述の概要、更には下記の詳細な説明は、添付図面と共に読む場合により良く理解されるであろう。しかし本発明は、示された詳細な設定及び道具に限定されないことは理解されなければならない。

発明の好ましい態様の説明
本発明において、初期肺癌患者から得た原発性肺腫瘍標本は、レギュラトリーT細胞("Treg細胞")とこれまでされてきた表現型を伴う多数のT細胞を収容することがわかった。レギュラトリーT細胞の先の説明とは対照的に、腫瘍中のCD4⁺CD25⁺リンパ球は、CTLA-4の際だって高い表面発現を有し、及びこれらは自家T細胞の増殖を直接阻害するが、同種異系T細胞は阻害しない。この腫瘍常在性のCD4⁺CD25⁺T細胞の抑制作用は強力であり、及び反応性T細胞の激しい活性化後であっても生じ、Treg細胞と活性化の抑制及び細胞傷害性細胞の反応の間に強力な相関関係を確立する。従って本発明は、Treg細胞をex vivo活性化する方法並びに特に長期間培養し及び増強する方法、活性化及び増強されたTreg細胞それら自身、並びに免疫療法及びGVHDを含む自己免疫応答の抑制のために活性化及び増強されたTreg細胞を使用する方法を提供する。

本願明細書において使用される「同種異系細胞」(アロジェニック性)は、ある個体(ドナー)から単離され、及び他者(レシピエント又は宿主)へ注入されるものであるのに対し；「自家細胞」(自家性)は、同じ個体(レシピエント又は宿主)から単離され及び戻し注入されるそのような細胞を意味する。従って同種異系性T細胞増殖は、別の個体由来の抗原提示細胞("APC")により刺激される一方、自家T細胞増殖は自己-APCにより刺激される。従って特定されない限り、本発明のAPCは、当該技術分野において公知の任意の型であることができる。

「抗原」は、免疫応答を開始する実体である。「アロ抗原」は、ふたつが一緒に混合された場合に、別の個体の細胞を認識し及び破壊するために、ひとつの個体において免疫系を引き起こす物質を意味する。「マイトジェン」は、抗原非-特異的様式で全てのT細胞に分裂(proliferade)を誘起する物質である。

「混合リンパ球反応」、「混合リンパ球培養」、「MLR」及び「MLC」は、互換的に使用され、アロタイプが異なる最低2種の異なる細胞集団を含有する混合物を意味する。少なくとも1種のアロタイプが異なる細胞は、リンパ球である。これらの細胞は、一時、適当な条件下で一緒に培養され、リンパ球の刺激を生じ、これは特に本発明においてTreg細胞である。MLCの目的の多くは、Treg細胞の増殖を開始するような同種異系刺激を提供することであるが；特に指定しない限りは、培養時の増殖は不要である。あるいは適当な状況においては、これらの用語は、そのような培養物由来の細胞の混合物を意味することがある。MLC由来の細胞がボーラス注射としてヒトへ投与される場合、これは「細胞移植片」と称される。

CD4⁺CD25⁺免疫調節細胞は、in vivoホメオスタシスの重要なレギュレーターであるが、これらは自己免疫の防止に必要であり、アロ反応におけるこれらのプロフェッショナルサプレッサー細胞の役割は余り研究されていない。Treg細胞は細胞傷害性T細胞の活性化を抑制するという知見を基に、本発明の好ましい態様は、プロフェッショナルサプレッサー細胞を実際に利用し、アロ抗原に対するT細胞応答を調節し、及び移植片-対-宿主疾患(GVHD)の発生を調べる。これは、GVHDの促進により、及び／又は本態様において生じる致死性の増加により明らかにされ、ここでCD25⁺細胞は、ドナーT細胞接種材料からex vivoで枯渇されるか、又はレシピエントは、抗-CD25モノクローナル抗体(mAb)注入の移植前投与により、in vivoにおいて条件付けされる。CD25⁺細胞の枯渇は、ドナーの抗-宿主応答は、CD4⁺T細胞並びにCD4⁺及びCD8⁺両T細胞により媒介されるかどうかとは関わりなく、GVHDの増加を生じる。

これは、他の研究者のデータと一致する(例えば、Piccirilloら、J. Immunol., 167: 1137-1140 (2001)；Gao ら、Transplantation, 68: 1891-1897 (1999))。加えて、CD25⁺細胞枯渇は、条件付けの強度に関わりなく、いくつかの系統の組合せにおいてGVHDを促進することがわかり、このことは高度にプロ炎症性サイトカイン環境においてさえも、CD25⁺細胞は、アロ反応のサプレッサーとして機能することを示している。従って本発明の枯渇データは、アロ反応の阻害におけるCD25⁺細胞の役割を示し、及びCD25⁺細胞の注入は、GVHDを予防又は改善することができることを示し、ここで先のデータは、新鮮なナイーブCD4⁺CD25⁺細胞は、GVHD致死性を単独で媒介せず、GVHD-誘導するT細胞の1:1比での注入時に、わずかに中等度の予防作用を有することを示した(Taylorら、2001)。

CD25陽性細胞のふたつの集団が存在するが、CD25⁺細胞は概して、全ヒト末梢血単核細胞(PBMC)の総CD4⁺T細胞集団の5〜10％を構成する。しかしCD25⁺細胞のわずかに1〜2％が、非常に高レベルのCD25を発現し、真の(bona fide)Treg細胞、又は増強された機能を伴う最低Tregであると考えられる。結果的に、精製された調節細胞を有意な治療的恩恵をもたらすのに十分な数注入することは困難であろう。

Thornton及びShevachのデータは、Treg細胞を活性化するために抗-CD3及びIL-2に結合されたAPCを使用し、マウスにおいて、CD4⁺CD25⁺細胞は、ex vivo活性化した場合により強力なサプレッサー細胞となり始めることを示した(Thorntonら、J Immunol., 164: 183-190 (2000))。残念ながら、Thornton注入は、ヒトに治療的恩恵をもたらさず、その理由は、この方法は、FDAにより承認されず、細胞を増量する方法も示さなかったからである。先に記したように、マウスT細胞の増殖は、ヒトT細胞の増殖の必要要件とは著しく異なる(Mestas, J. Immunol., 172: 2731 (2004)参照)。更に抗-CD40L(CD154)又は抗-B7(抗-CD80及びCD86)mAbは、in vitro反応は完全に「ブロック」したが、in vivo GVHDは効果的に防止しない。

興味深いことに、ある高度に有効な初期の方法は、抗-CD3/28ビーズを利用した(Takahashiら、Int. Immunol., 10: 1969-80 (1998))が、Takahashiは、可溶性抗-CD28 mAbの抗-CD3 mAbとの封入(inclusion)は、抑制を「ブロックする」ことを示した。CD4⁺CD25⁺細胞は、抗-CD3＋IL-2を除き、複数の刺激に対しin vitroにおいて反応しないことが示されている。しかし激しく増量される非-反応性細胞は、反応性となり始める。従ってこの文献は、サプレッサー細胞活性の保持を犠牲にして、強固な増量が生じることを示唆し、低レベルの増量のみを報告した。従って本方法の、抑制性の活性を喪失することなく、CD4⁺CD25⁺細胞を増量することができることは、先行する技術により予測されておらず、及びサプレッサー細胞機能の「増大」を伴い、本発明に示されたような強固な増量を提供することは、予測されていない。

しかしGVHDを抑制及び予防するための患者の治療に関する効果的治療法の必要性が認められ、本発明は、Treg細胞の活性化及び増量の両方のために、GMPを遵守する培養システムを利用する。本発明の好ましい態様は、抗-CD3/28 mAbで被覆されたビーズを、IL-2及び照射された支持細胞と組合せて使用し、(i)＞100倍の強固な増量、及び(ii)サプレッサー細胞活性の「増加」；の両方を誘導する。更に本願明細書において明らかにされた強固な増量速度は、先に文献に報告されたもの(Godfreyら、Blood, 印刷中2004、電子ジャーナル、2004年3月18日参照)よりもより強力なサプレッサー細胞活性に関連している。

「細胞株」又は「細胞培養」は、in vitroにおいて増殖又は維持された高等真核細胞を意味する。細胞の子孫は、親細胞と完全に同じ(形態、遺伝子型、又は表現型のいずれかにおいて)ではなくてもよいことが理解される。骨髄移植(BMT)マウスモデルにおける最初の研究は、CD4⁺CD25⁺細胞は、主要組織適合性(MHC)障壁を越えて、GVHDを予防することができることを示した(Taylorら、Blood, 99(10): 3493-3499 (2002)、Hoffmanら、J. Exp. Med., 196(3): 389-399 (2002)、Cohenら、J. Exp. Med., 196(3): 401-406 (2002))。しかし本態様は、CD4⁺CD25⁺細胞は、これまで可能であったものよりもより長い培養期間("長期間の")で、更により大きい程度まで、増量することができることを明らかにしている。従って本発明の好ましい態様は、"長期間の培養で増量された"CD4⁺CD25⁺細胞又はTreg細胞又はCD25⁺細胞を説明している。

「長期間の」は、培養期間が、細胞の機能レベルが、特にサプレッサー活性が保持される限りは、1週間より長い、好ましくは≧10日間、より好ましくは≧2週間、より好ましくは≧3〜4週間、より好ましくは≧1ヶ月、より好ましくは≧6〜8週間、より好ましくは≧2ヶ月間、より好ましくは≧3ヶ月間、より好ましくは≧6ヶ月間、及び最も好ましくは1年又はそれよりも長いことを意味する。従って本発明に提示されたデータは、様々なex vivo活性化プロトコールは、CD4⁺CD25⁺細胞の回収又は増量の変動に繋がるが、これらのプロトコールは全て、GVHDを著しく抑制した又は阻害した細胞を生じたことを示している。

これらの研究で調べられたex vivo活性化プロトコールは、実践者に例示され、及びこの原理の有効性の証拠を提供することが意図されている。しかし提供されたプロトコールは、増量及び活性化の可能性のある戦略の網羅的なリストを決して意味するものではなく、その理由は、例えば米国特許第6,251,385号；第6,203,787号；第6,051,227号；第5,962,318号；第5,728,388号；第5,472,867号；第5,399,493号において使用されるものなど適用することができる、血液をex vivoで処理する多くの方法が既に公知であるためであるが、しかし本願明細書で説明された原理を改善することができる新規方法が、依然発見されるべきである。

本願明細書において使用される「処置」又は「治療」は、処理される個体又は細胞の自然の経過を変更する試みでの臨床的介入を意味し、及び予防のために又は臨床病理の経過のいずれかで行うことができる。望ましい作用は、疾患の発生又は再発を防止すること、症状を緩和すること、疾患の直接又は間接の病理学的結果を抑制、消散もしくは阻害すること、転移を予防すること、疾患の進行速度を遅延すること、病態を改善もしくは緩和すること、及び寛解又は改善された予後を引き起こすことを含むが、これらに限定されるものではない。病態に関連した「病理」は、罹患した個人の健康(well-being)、正常な生理、又は生活の質(QOL)を危うくするものである。これは、未だ罹患していない区域への罹患組織の破壊的侵襲、正常組織機能を犠牲にする増殖、不規則な又は抑制された生物学的活性、炎症又は免疫学的応答の増悪又は抑制、他の病原性微生物又は物質への増大した易罹患性、並びに望ましくない臨床症状、例えば頭痛、発熱、悪心、疲労、気分の変容、及び主治医により決定されるそのような他の特徴に関連することができる(しかし、これらに限定されるものではない。)。

「有効量」は、恩恵のある又は所望の臨床結果、特に免疫応答の成立、又は注目に値する臨床状態の改善を実現するのに十分な量である。「免疫学的量」は、処置又は試験される(疾患であるか否かのいずれか)対象群において、体液性応答、細胞性応答のいずれか、又は両方を含む免疫学的応答を誘起するのに十分であることが示された量である。好ましくは本発明に従い、抑制は、本願明細書で明らかにされた培養-増量法の実践を伴わずに生じるものを上回り、＞30％実現される。より好ましくは、抑制は、細胞のex vivo培養が長期間持続可能である限りは、≧40％で実現され、より好ましくは≧50％で、より好ましくは≧70％で、より好ましくは＞85％で、より好ましくは≧90％で、より好ましくは≧95％で、より好ましくは≧99で、及び最も好ましくは≧100％で実現される。

用語「抑制」、「阻害」及び「予防」は、受入れられた定義に従い本願明細書において使用され、すなわち「抑制」は、本発明による処理が存在しない場合の免疫応答レベルと比べ、進行している免疫応答が、ブロック又は有意に低下される場合に生じる。同様に「阻害」は、免疫応答の発生をブロックすること、又は本発明による処理が存在しない場合の免疫応答レベルと比べ、そのような応答を低下することを意味する。予防のために投与される場合、そのようなブロックは、標的化された免疫応答が生じないように完了され、典型的には発生前の免疫応答の完全なブロックに関して「予防」と称され；又は、本発明において、この処置は、通常の未処置の状態と比べ、作用が有利に低下し、典型的には抑制又は阻害と称される。

新生物性疾患の対象に関する臨床反応に関して、有効量は、その疾患を緩和、改善、安定化、逆行又は進行を遅延するか、そうでなければ疾患の病的結果を軽減するのに十分な量である。同様に、GVHDの発生を経験している移植患者、又はGVHD易罹患性患者において、有効量は、その発生をブロック又は予防するのに十分な量であるか；又は、GVHD病理が開始した場合に、その疾患の緩和、改善、安定化、逆行又は進行の遅延をするか、そうでなければ疾患の病的結果を軽減するのに十分な量である。いずれの場合においても、有効量は、単回投与量又は分割投与量で投与され得る。有効量で使用するための好ましい量及び細胞比は、本説明の別所に記されている。

CD4⁺CD25⁺免疫調節細胞は、非常に不均質な集団であるので、おそらく活性化及び増量の様々な方法が、可能性のある異なるサプレッサー/エフェクター機能を伴う細胞の異なる集団を生じることができるように見える。CD4⁺CD25⁺免疫調節の不均質性は、依然明らかではない。現在これらは、ふたつの主要なクラスに分類することができる：適応及び自然。これらの細胞型は、Bluestoneら(2003、前掲)により定義され、下記表にまとめている(表1)。

表1. 自然及び適応調節細胞の比較

例えばレギュラトリーT細胞の一部の型は、サプレッサー細胞活性の増殖及び発生に関して外来性TGF-β又はIL-10及びTGF-βの組合せに依存しているのに対し、本発明の細胞集団は、そのような外因性増殖因子に依存していない。このことは、ヒトCD4⁺CD25⁺細胞と動物モデル(マウス)の対応物の間の別の差異を指摘している。マウス細胞は、IL-10試験において示されたように、ヒトTreg細胞により産生されるものよりも少ないTGF-βを産生する。このことは、ウシ胎仔血清ロットなどは様々なレベルのTGF-βを含有するので、培養されたマウス細胞の使用から得た報告された知見において、説明できない変動性を追加している。

抗-CD3/28ビーズ＋IL-2は、全てのCD4⁺CD25⁺亜集団を増量するように見えるので、本発明の利点は、CD4⁺CD25⁺細胞は、より強力な機能を伴うCD4⁺CD25⁺細胞の不均質な集団又はサブセットから増量され得ることである。このようなことは、低レベルのL-セレクチン(CD62L)を発現するサブセットよりも、GVHDのより強力なサプレッサーであることが近年わかった、ホーミングレセプターである高レベルのL-セレクチンを発現するCD4⁺CD25⁺細胞の場合である(下記実施例参照)。

ヒトCD4 ⁺ CD25 ⁺ 細胞の培養及び増強。サプレッサー細胞培養物を作出する最初の手段は、培養のための固定された抗-CD3＋IL-2及びTGF-βを含んだ(例えば、CD3抗体クローンOKT3に関しては、Kungら、Science, 206(4416): 347-349参照)。細胞は、1〜5μg/mlが最適である(固定濃度)ような、様々な濃度でプレート上に抗-CD3が予め固定されたプラスチックプレートにおいて増殖された。下記実施例に説明されたように、早い段階で、本発明者らは、TGF-βは機能には不要である(図5)が、これはサプレッサー能をわずかに増大するように見えたことがわかった。しかし条件を変動するので、TGF-βの必要性/恩恵は変化し得る。例えば、実施例において説明されたようにCD62L(L-セレクチン高(hi))細胞を使用すると、これは非-分画CD4⁺25⁺細胞よりもGVHDのより強力なサプレッサーであるので、TGF-βは不要であった。

抗-CD3/抗-CD28ビーズの使用は、サプレッサー細胞の強固な増殖を誘導し、これはプラスチック-結合した抗体の作用を有した。CD28刺激も、Treg細胞の活性化を増強し、かつ本態様は、抗-CD3及び抗-CD28(抗-CD3/CD28)抗体により被覆されたビーズで、Treg細胞と1:10比で混合されたものは、Treg機能を最適に増量及び保存することを示している。CD28は、ジスルフィド結合したホモ二量体であり、ほとんどのT細胞の表面に発現される(Juneら、Immunol Today, 11:211 (1990))。CD28は、当業者に公知であるように、多くの市販のCD28モノクローナル抗体により同定することができる。

同時-刺激は抑制を無効にする(これは短期間アッセイにおいて生じる)という最初の懸念は、認められないことが証明された。興味深いことに、ビーズ上の抗-CD3-のみの被覆は、増殖の貧弱な誘導者であった。実際細胞は、同等の固定された-CD3培養物におけるものよりも5〜10倍増殖し、これらはサプレッサー機能を保持した。IL-2又はIL-15による培養は、同等の増殖及びサプレッサー機能を誘導した(図11及び12)。

一旦サプレッサー細胞の理論的に再現可能な単離及び培養及びアッセイの作業可能なシステムが本発明において開発されたならば、本発明者らは、改善された細胞単離及び培養の方法を確定するために、体系的にパラメータを変動することが可能であった。よりストリンジェントな精製戦略を実行することにより、より強力で再現可能なサプレッサー細胞株が単離された。このことは、抗-CD25マイクロビーズ力価決定実験(力価1:6)、及び二重カラム精製プロトコールの開発につながり、これは次に強力なサプレッサー細胞株の一貫した生成につながる(成功率≧80％)。CD25は、IL-2Rα分子であり(例えば、Waldmann, Immunol Today, 14: 264 (1993)参照)、多くの市販のモノクローナル抗体(本願明細書において使用されるようなAb又はmAb)によるか、又は標識したIL-2のCD25への結合により同定可能である。

本発明において、CD25 Abを使用し、CD4⁺CD25⁺の細胞集団をそれらのCD25発現を基に、濃厚化した。刺激前にこれを行い、強力な抑制性の活性を有するそれらのTreg細胞を増量する能力を増強した。実際、マイクロビーズ上の抗-CD3の抗-CD28に対する様々な比を試験した場合(各々、20:1、5:1、1:1、1:5、1:20)、より高い比の抗-CD28ビーズは、サプレッサーT細胞の選択的増殖(outgrowth)を誘導した。抗-CD3/抗-CD28ビーズの比1:5及び1:20は、非-サプレッサーT細胞の夾雑が少ない細胞株を作出した。少ない量の抗-CD3の使用に由来した細胞株は、より強力であり、及びはるかに増加したCD27及びCD62L発現を保持し、このことはこれらの細胞のナイーブT細胞表現型が維持されることを示している。これらは、ナイーブT細胞、対、メモリーT細胞を識別するために通常使用される細胞表面マーカーである(例えば、DeRosa, Nat. Med., 7: 245 (2001)参照)。CD27は、エフェクター細胞分化時に喪失されたレセプターであり、並びにCD62L及びCCR7は、リンパ系組織への細胞遊走に重要である。従ってin vivoにおいてこれらのサプレッサー細胞は、通常リンパ系臓器へ論理的にホーミングし(home)、GVHD誘導に重要なパイエル板を含む、これらの部位でアロ反応性細胞の活性化及び増量を制限する。

ヒトのシステムにおいて、抗体-ベースの同時-培養アッセイにおいてサプレッサー活性(新たに単離された細胞による)を検出するために、CD4⁺CD25⁺細胞のCD25⁺brightサブセットを単離することは必要であることが報告されている(Baecher-Allanら、2001)。このことは、最もストリンジェントに精製されたCD4⁺CD25⁺細胞が最良のサプレッサー細胞株前駆体を形成する本発明の好ましい培養システムにおいてもわかっている。CD25⁺画分中のCD25^-dim細胞の夾雑は、より迅速かつ過増殖したCD25⁺bright細胞を生じることができ、これによりサプレッサー細胞機能の完全な表出を排除する。従って本発明の好ましい態様において、「ストリンジェント精製」が強調される(好ましくは2サイクルの選択、及び過度の洗浄)。純度を最適化するためには、例えより低い細胞収量を犠牲にしても、「高レベルのストリンジェンシー」が好ましい。このような高ストリンジェント技術は、当業者には公知であり理解されている。

抗-CD25磁気マイクロビーズのより低い力価(製造業者の推奨の1/5)及び第二カラム上の再精製は、強力な抑制能を伴うTreg細胞株の作出を大きく促進する。比較のための、より低い力価の抗-CD25 mAb-被覆された磁気マイクロビーズの使用又は精製のための第三のカラム工程の追加は、この好ましい培養システムのもの以上に結果を著しく改善せず(実施例8参照)、実際不利なことに収量を低下した。

CD4⁺CD25⁺ T細胞の精製のストリンジェンシーを増強することにより、最終的には単離されたCD25bright細胞は、抗-CD3/抗-CD28ビーズと一緒であっても、最早増殖しない。しかし様々なアクセサリー細胞集団を試した後、照射されたCD4⁺ T細胞(「支持細胞」として使用)は、本発明の増殖促進に関して最も良いことがわかった。これらの細胞は、IL-2を含むが、これらに限定されるものではないサプレッサー細胞増殖因子を分泌するように見える。しかし馴化培地(抗-CD3/抗-CD28刺激したCD4⁺ T細胞由来の上清)は、サプレッサー細胞の増殖を大きく促進し、それはIL-2補充の結果から得るものよりもはるかに大きくさえある。

それにもかかわらず、当業者に公知であるような、支持細胞集団の添加を必要としないような、別の培養-増量戦略も企図されている。例えば、抗-CD3/28ビーズ＋IL-2が使用され、この場合、宿主APC及び／又は樹状細胞は、有益又は必要とされてもよく、されなくてもよい。

改善されたサプレッサー細胞株作出。これらの実験過程において、このサプレッサー細胞株は、CD8⁺非-サプレッサー細胞による過増殖を受けやすいことがわかった。従ってCD8⁺ T細胞を枯渇するために、二工程精製プロトコールが開発された。これは、マルチ-選別磁気マイクロビーズ法を含み、ここでは細胞は、認知された方法により、最初に抗-CD25 FITC (フルオレセイン-5-イソチオシアネート)で染色され、その後再度公知の方法を用い、抗-FITCマイクロビーズで単離される。次にこれらのビーズは、調製物から切断され、引き続き二工程により、抗-CD8マイクロビーズを使用し、CD8⁺ T細胞を枯渇する。抗-CD19、抗-CD20、抗-CD14、及び抗-CD56を添加し、同時にB細胞、単球、及びNK細胞を調製物から枯渇した。この精製戦略で作出された細胞株は、他の方法よりもより大きい再現性で作出され(＞90％)、長期培養時間にわたりより安定した。

この二工程精製プロトコールを使用し、新たに単離されたサプレッサー細胞集団上のCD4⁺CD25⁺サブセットを調べることが可能であった。CD4⁺CD25⁺細胞の小さいサブセットは、インテグリンβ7及びCD200を含み(CD4⁺CD25⁺細胞の〜10％)、大きいサブセットは、LAIR(白血球-関連免疫グロブリン-様レセプター-1、例えばMeyaardら、Immunity, (2): 283-90参照)CD101細胞を含むことがわかった(CD4⁺CD25⁺細胞の〜80％を占める、例えばAllezら、Gastroenterology, 123(5): 1516-1526 (2002)参照)。これらの細胞株は、マウスCD4⁺CD25⁺細胞の強力なサブセット上では高レベルで発現される、CD103(インテグリン-α-E)を発現しなかった。加えて約20％のCD4⁺CD25⁺細胞は、CD45RAを発現する。この抗原は、サプレッサー細胞上では発現されるとは考えられず、その理由は、これらはいくつかの報告において、CD45RO陽性である(一般に相互排他的発現、ナイーブ細胞の活性化時の一過性のものを除く)ことが説明されているからである。しかしこれらの細胞の単離は、サプレッサー細胞株作出に関して、CD45RA^-細胞よりもはるかに良かった(今日まで、この方法で単離された12細胞株中12が、強力なサプレッサーであることがわかった)。ナイーブT細胞において、CD45RAスプライシング変種が、T細胞表面に発現された。一旦T細胞がメモリー細胞へ分化すると、これは通常、CD45ROアイソフォームを発現する(例えば、DeRosa, 2001；Tchilianら、Arch. Immunol. Ther. Exp., (Warsz) 50(2): 85-93 (2002)参照)。

最良の防御(注入された細胞が少ない数であるにもかかわらず)は、最低の回収を生じる培養方法により媒介されたが(同種異系脾細胞、低投与量のIL-2及び増殖因子(TGF-β)、下記実施例に示される)、培養プロトコールは、本願明細書に提供された情報並びに増量及びサプレッサー機能の両方を最適化する公知の原理を鑑み、修飾することができる。同種異系脾細胞は、例えマウスモデルでの知見を基にヒトにおいて臨床で推奨されるこれらの条件下、高投与量IL-2が存在したとしても、CD25⁺細胞の十分な増量を生じなかった。しかし、活性化された単球-由来の樹状細胞(DC)のようなより強力な抗原提示細胞は、下記実施例に示されるように、細胞生存も補助する複数の生理的シグナルの送達を介して、より多くの増量及び優れた機能を生じることは予測される。

しかしCD4⁺CD25⁺細胞は、アロ抗原-反応性CD25^-T細胞(すなわち、CD25⁺細胞の枯渇されたTreg細胞の集団)を阻害するために、アロ抗原それ自身を介した活性化を必要としないので、TCRシグナル伝達のポリクローナル性インデューサーにより最大活性化(及び増量)を達成することは、活性化-誘導された細胞死が有益な作用を完全に低下しない限りは、望ましい。「活性化」は、当初の細胞集団から子孫細胞を作出するために必要な細胞増殖及び細胞分裂の刺激又は増強を意味する。固定された抗-CD3 mAb及び高投与量IL-2と共に培養されたCD25⁺細胞によるGVHDの有意な阻害が存在するが、本願明細書に示したデータは、TGF-βはCD25⁺調節細胞の増殖因子であること、更にはこれらを活性化-誘導された細胞死に対しより抵抗性とすることを指摘している(Yamagiwaら、2001；Nakamuraら、2001)ので、あらゆる活性化プロトコールにおけるTGF-βの含有は保証されてもよい。

驚くべきことに、樹状細胞(DC)の活性化又は成熟は、抑制の迂回には繋がらなかった。「成熟」は、APCの形態及び機能の未熟型から活性化された成熟型状態への転換である。活性化されたDCは、最も強力なAPCである。樹状細胞は、未熟型＞成熟型＞活性化状態となる。ちなみに「活性化」は、未熟型又は成熟型細胞における細胞表面分子及び生物学的特性の獲得である。従ってAPC/DC細胞は、免疫応答を支援することが可能である。一連のシグナル及びサイトカインは、分化の引金を引く。TNF、PGE₂、及びインターフェロンは、DCを未熟型から成熟型へと移行するのに対し；CD40Lシグナル伝達又はLPSは、DCを成熟型から活性化型へと移行する。

従ってヒト細胞において、本知見は、脾臓-由来のDCのLPS又はCpG-含有DNAオリゴデオキシヌクレオチド-媒介したシグナル伝達は、抑制の迂回に繋がるという、新たに単離されたマウスのTreg細胞に関する最新の報告されたこと(Pasareら、Science, 299(5609): 1033-1036 (2003))とは顕著な対比を示す。しかしこのシステムにおいて、Treg細胞は、培養-活性化も、培養-増量もされなかった。

対照的に本発明の好ましい態様において、活性化され増量されたヒトTreg細胞は、活性化されたDCにより発現されたサイトカイン及び同時-刺激性分子を無効にし、更にMLR応答をブロックすることができる。培養後のサプレッサー機能の増大した強度の知見は、マウスTreg細胞の活性化により示されたものと一致する。サプレッサー機能は、活性化依存型であり(Shevachら、2002、前掲)、並びに抗-CD3及びIL2と一緒の短期間培養は、抑制能を増大する(Thorntonら、2000)。これは、長期間培養されたTreg細胞は、TCRを再活性化するようにプライミングされ(より感受性)、その結果TCR誘導したサプレッサー機能は、より迅速に発現されることを意味すると解釈される。

別の態様において、CD4⁺CD25⁺細胞収量を増加するために、従って抗-GVHD作用が増強されることを可能にするために、例えばT細胞生存を増加することが示されているIL-4及びIL-7(Vellaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 3810-3815 (1998))、T細胞調節の作出に寄与することが示されているIL-10(Grouxら、Nature, 389: 737-42 (1997))、並びに低投与量IL-2と相乗作用し、ヒトCD4⁺CD25⁺細胞の激しい増殖を誘導することが示されているIL-15(Dieckmannら、2001)などのサイトカインが、培養物に添加された。

活性化及び増量プロトコールの治療有効性。本発明の重要な貢献は、このモデルは、関連する動物モデルでのCD4⁺CD25⁺細胞の活性化及び増量プロトコールのin vivo治療有効性の評価を可能にすることである。活性化された培養細胞のin vivoにおけるホーミング、遊走、生存及び機能の欠損の可能性はわかっているので、ex vivo活性化及び増量された調節細胞の調節機能を、in vitroに加え、in vivo適用について考察することは重要である。

外来抗原又はアロ抗原に対する免疫応答におけるCD4⁺CD25⁺細胞の調節の役割、CD25^-枯渇から生じるGVHD致死性の増大に加え、抗-CD25 mAbが自己免疫のレシピエントに投与された場合のin vivo枯渇データは、臨床的に関連のある療法を示唆している。GVHD時の活性化マーカーとしてのCD25をアップレギュレーションする宿主-反応性ドナーT細胞の枯渇を避けるために、移植前のレシピエントに投与された抗-CD25 mAbは、促進されたGVHDを生じる。先行技術のみでは、このシナリオはGVHDを改善すると予想される(Anasettiら、Bone Marrow Transplant, 7: 375-381 (1991)；Harrisら、Bone Marrow Transplant, 23: 137-144 (1999)；Cahnら、Transplantation, 60: 939-942 (1995)；Blaiseら、Bone Marrow Transplant, 8: 105-111 (1991))ので、このことは驚きに値する。しかしGVHDは移植前の抗-CD25 mAbの注入により増悪するので、抵抗性のある(resistant)宿主CD25⁺細胞も、宿主の抗-ドナー抵抗機構を介し、ドナーT細胞接種によるGVHDの作出を阻害し得ることは明らかである。

下記実施例に示したように、ex vivo増量及び活性化された免疫調節CD4⁺CD25⁺細胞は、in vivoにおいて致命的GVHDを有意に迅速に阻害した。前述のように、多くの細胞型を使用することができる。リンパ節由来の細胞が使用される場合、リンパ節の全ての型(例えば、鼠径部、腸間膜、浅遠位(superficial distal)腋窩など)が企図され、望ましい転帰に応じ健常者又は罹患した患者から入手することができる。例えば腫瘍-ドレーンリンパ節細胞は、本願明細書に記した方法を用い、単離、精製及び培養-増量することができる。十分に大量のそのような細胞(すなわち、自家宿主への再注入又は同種異系レシピエントへの注入時に、望ましい抑制又は予防反応を示すのに適した数)は、高レベルのストリンジェンシーで精製され、合成培養培地(例えば、典型的補充物を伴うRPMI 1640)中に、明らかにされた条件下で、適当な期間希釈される。いくつかの標準培養技術を使用することができる(例えば、例えば5％CO₂大気中37℃の、培養器内のマルチ-ウェルプレート)。Ex vivo刺激のために、これらの細胞は、宿主から無菌的に採取され、及び単独の細胞浮遊液が、無菌条件下で調製される。細胞調製物は、濾過され(例えば、ナイロンメッシュ層を通り)、遠心され、及び必要ならば穏やかな溶解手技が施される。

Ex vivo培養-増量された細胞は、多くの方法により宿主又は別の患者へ、再導入される。好ましくはこれらは、静脈内注射される。任意に宿主は、刺激された細胞のin vivo機能及び生存を促進する物質(例えば、IL-2又はIL-15)により処置される。当然、培養-増量された細胞は、様々な医薬製剤により再導入されてもよい。これらは、結合剤、充填剤、担体、保存剤、安定化剤、乳化剤、及び緩衝剤などの通常使用される添加剤を含有してもよい。適当な希釈剤及び賦形剤は、以下に説明された方法により使用されるような、例えば水、生理食塩水、及びデキストロースである。

従ってドナー(同種異系)又は宿主-型CD25⁺(自家)細胞のいずれかが、GVHD反応を阻害するために有用であり、更に宿主CD25⁺細胞の維持は、臨床的に望ましいことを示唆している。ヒトCD4⁺CD25⁺調節細胞は、ナイーブ及びメモリーCD4⁺ T細胞の両方のin vitroアロ反応を阻害し、及びサプレッサー機能の保持を伴いin vitroにおいて増量されることが示されている(Dieckmannら、2001；Levingsら、2001；Jonuleitら、2001)ので、これらの原理は本発明に適用可能である。Levingsの論文のみが、支持細胞として可溶性抗-CD3、及びリンパ芽球細胞及びPBMC＋IL-2を使用し、ヒトCD4⁺CD25⁺ポリクローナル性に増量することを明らかにしている。しかしLevingsらにより注目された抑制性の機能は、サプレッサー/反応細胞比1:1で、増殖をわずかに65％低下し、これはマウスTreg細胞において典型的に観察された割合よりも低かった。従ってLevingsらの論文は、本願明細書において使用されるこの長期間ex vivo培養増量法に関して十分であるとは考えられない。

治療法。本発明の方法は、ヒトに特に有用であるが、獣医学対象に実践することもできる。本願明細書で称される「個体」、「対象」、「患者」、又は「宿主」は、脊椎動物であり、好ましくは哺乳類である。より好ましくはこのような個体はヒトであり、及び培養-増量された細胞はヒトであるが、ヒト病態の動物モデルを含む動物も、本発明において含まれ、そのような動物の治療的処置が本願明細書において企図される。このような動物モデルを使用し、望ましいならば、本発明の組成物及び方法を試験及び調節することができる。あるモデルは、確立された同系細胞株を近交動物へ注射することを含む。米国特許第5,663,481号、第5,602,305号及び第5,476,993号；欧州特許出願第379,554号；並びに、国際公開公報第91/01760号に開示されたような、キメラ動物モデルも有用である。非-ヒト哺乳類は、獣医学又は家畜用動物、競技用動物及びペットを含むが、これらに限定されるものではない。従って動物モデルとは対照的に、このような動物は、選択された治療的処置を受けることができる。

レシピエント又は宿主の免疫状態は、以下のいずれかであってよい。個体は、この組成物中に存在するある抗原提示細胞(APC)又は腫瘍-関連抗原(TAA)に関して、免疫学的に未感作であってよい。個体は、その時点で抗-腫瘍免疫を発現していなくともよいが、特定抗原に関する免疫学的メモリー、特にT細胞メモリーを有するのがよい。

本修飾された並びに／もしくは活性化され及び増強された細胞集団、又はそれらのカクテルを含有する組成物は、予防的及び／又は治療的処置のために投与することができる。治療的適用において、組成物は、患者へ、GVHDの発症前又はGVHD反応時及びその完了時に生じるような免疫応答に対し予防、抑制、ブロックもしくは阻害、又は少なくとも部分的に抵抗するのに十分な量で投与される。これを実現するのに適した量は、「治療的有効量」と定義される。この使用のための有効量は、疾患の重症度及び患者自身の免疫系の全身状態に応じて決まるが、一般には約0.05mg/kg体重〜約5mg/kg体重の範囲であり、好ましくは約0.2mg/kg体重〜約1.5mg/kg体重の範囲である。

予防的適用において、本修飾された並びに/もしくは活性化され及び増強された細胞集団、又はそれらのカクテルを含有する組成物は、患者の抵抗性を増強するために、既に病態ではない患者へ投与される。そのような量は、「予防的有効量」と定義される。この場合も正確な量は、宿主の健康状態及び免疫の全身レベルに応じて決まるが、一般には先に説明した範囲である。これらの組成物の単回又は反復投与は、担当医により選択された投与量レベル及びパターンで実行することができる。いずれの事象においても、医薬製剤は、患者を効果的に治療するのに十分な量の本発明の修飾されたCD25細胞を提供しなければならない。

本願明細書において使用される用語「免疫原」又は「免疫原性組成物」又は「ワクチン」は、適宜、以下のいずれかが可能である化合物又は組成物を意味する：a)未感作の個体における抗原に対する免疫応答の成立；又は、b)個体における免疫応答の再構成、追加(boost)、又は維持。免疫応答は、抗体、免疫反応性細胞(例えばヘルパー/インデューサー細胞又は細胞傷害性細胞)、又はそれらの組合せを含む。

本願明細書において使用される細胞の「不活化」は、細胞が、子孫を形成するための細胞分裂が不可能とされることを意味する。これらの細胞は、刺激への反応、又はサイトカインのような細胞生成物の生合成及び／もしくは分泌が決して可能ではない。不活化の方法は当該技術分野において公知である。不活化の好ましい方法は、マイトマイシンCなどの毒素、又は放射線照射による処理である。固定された又は透過性とされ及び分裂が不可能である細胞も、不活化された細胞の例である。

概して、具体的本発明の方法の実践は、特に記さない限りは、当該技術分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の常法を使用する。そのような技術及び必要な定義は、文献、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版(Sambrookら、1989)；Oligonucleotide Synthesis (Gait編集、1984)；Animal Cell Culture, (Freshney編集, 1987)；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (Weir及びBlackwell編集)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller及びCalos編集, 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら編集、1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullisら編集、1994)；Current Protocols in Immunology (Coliganら編集、1991)に完全に説明されている。医薬組成物の調製及び投与の全般的手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版(1990)、Martin編集、Mack Publishing Co., Paに概説されている。

治療された個体は、能動自己免疫応答(体液性又は細胞性免疫のいずれか、又は両方)又はGVHDを示すことがある。しかしこの対象は、病理学的範囲でGVHD反応を最小化するために、少なくとも部分的に免疫応答性でなければならない。しかし癌患者又は自己免疫もしくは他の免疫疾患に罹患した患者は、ある程度の免疫抑制を示すことが多く、これは本発明の組成物が安全かつ有効に投与される限りは、この組成物の使用を必ずしも妨害しないことは認められる。本発明に従い治療することができる癌の例は、免疫特権とされたと考えられる部位、例えば脳、並びに免疫特権とされない部位、例えば肺、結腸、乳房、肝臓、子宮又は卵巣、膵臓、前立腺、皮膚及び血液、更にはヒトもしくは動物の体の多くの他の特異的もしくは非-特異的部位の腫瘍を含むが、これらに限定されるものではない。このような腫瘍の例は、当業者に周知であり、及び小細胞肺癌を含む。

投与法及び投与量。本発明の組成物は、全身又は局所的部位のいずれかで認められた方法で、対象へ投与することができる。移植患者又は癌患者におけるGVHDを予防するためにアロ活性化された細胞を投与するのに最も都合の良い時点は、手術中である。細胞を手術手技が完了するまでその位置に維持するために、これらの細胞を、医薬として適合可能な人工ゲル内、又は凝固血漿内で、又は他の公知の徐放機構を利用し、投与することが都合がよい。

より侵襲性が低い手技が望ましい場合、これらの組成物は、針を通り所望の位置に注入することができる。より深部のためには、針は、内視鏡超音波技術、ラジオシンチグラフィー、又は他の造影技術の一部を、単独で又は適当なスコープもしくはカニューレの使用と組合せて使用し、配置することができる。このような適用のために、細胞集団は、容積約10mlの等張生理食塩水又は中性緩衝液中に懸濁され、都合良く投与される。

同様に、同種異系移植の前又はそれと同時に、有効量の単離されたCD4⁺CD25⁺細胞、好ましくはそれらの抑制作用を改善もしくは培養-増強するように修飾されたものが、移植レシピエント(宿主)へ、GVHDの発生を予防又はブロックに十分な量、細胞移植片として投与される。あるいはこの細胞移植片は、同種異系移植後に、既に始まっているGVHDをブロック、阻害又は逆行するために投与される。与えられる投与量は、望ましい治療的応答をもたらす上で、免疫応答を刺激するのに「有効」な量、又は本願明細書の別所に定義された癌治療において「有効」な量である。本発明の医薬組成物に関して、有効量は典型的には、同種異系性刺激細胞及び反応細胞を含み、約10⁶〜10¹²個細胞、より好ましくは10⁸〜10¹¹個細胞の範囲に収まる。好ましくは約1x10⁹〜5x10¹⁰個細胞が使用され；より好ましくは約2x10⁹〜2x10¹⁰個である。平均して1x10⁹個と多い培養-増量されたTreg細胞が、ヒトの臨床試験には必要である。所望の作用の実現のために組合せられる場合の反復用量は、この有効量の定義内に収まる。

移植された又は注射された組成物の様々な成分は、「効果的組合せ」で存在し、これは組成物について各成分が有効であるのに十分な量存在することを意味する。好ましくは、少なくとも約1x10⁸個、より好ましくは約1x10⁹〜5x10¹⁰個、及び更に好ましくは約2x10⁹〜2x10¹⁰個の反応細胞が存在する。好ましくは、少なくとも約1x10⁷個、より好ましくは約5x10⁷〜5x10⁹個、並びに；更に好ましくは約1x10⁸〜2x10⁹個のサプレッサー細胞が存在する。同種異系リンパ球対サプレッサー白血球の比は、本願明細書の具体的実施例において詳述されるように、一般に1:1〜100:1であり、通常約5:1〜約25:1、典型的には約10:1である。しかし、この組成物が全体として有効である限りは、いくつかの細胞成分及び他の構成要素を使用してもよい。これは、調製時の培養条件及び他の要因に左右されるであろう。

本発明の医薬組成物は、対象における免疫応答の成立もしくは癌の治療又はGVHDの作用を低下する他の療法に続けて、それよりも先に、その代わりに又は組合せて与えることができる。例えば対象は、化学療法、放射線治療、又は他の免疫療法及び養子移入の形による治療プロセスを先に受けるか又は同時に受けることができる。

このような治療様式が使用される場合、これらは、本発明の組成物の免疫原性を妨害しない方式又は時点で使用されることが好ましい。対象は、免疫応答を刺激するために、ワクチンのような別の組成物を投与されてもよい。このような代替組成物は、腫瘍抗原ワクチン、腫瘍抗原をコードしている核酸ワクチン、抗-イディオタイプワクチン、及びサイトカイン-発現腫瘍細胞株を含む他の種類の細胞ワクチンであることができる。培養-増量されたTreg細胞が特異的起源、例えば癌又は癌細胞などに由来する場合、この用語は、例えば、原発性癌細胞のみではなく、癌細胞先祖由来の細胞、転移した癌細胞、及びin vitro培養物及び癌細胞由来の細胞株も含むことが意図される。

本発明のある態様は、併用療法に関連している。ひとつの併用療法において、生着を促進し、及びGVDH反応を抑制もしくは防止するために、対象には、ex vivo培養-増量された自家又は同種異系CD4⁺CD25⁺ T細胞が、組織移植の前、同時又は後のいずれかで注入される。単回注入のみが明らかにされているが、このような注入は、宿主における抑制反応の程度又は治療有効性を増強するために、細胞移植後一定期間(4〜6週間など)毎週投与することができる。注入は、この反応を補充するために(replenish)、数ヶ月間を空けた後に与えることもできる。従って本発明のある態様は、細胞移植片の投与、それに続く、ex vivoで処理された患者の自家又は同種異系のアロ活性化されたヒトCD4⁺CD25⁺ T細胞を含有する組成物の、患者への投与による、治療的作用又は免疫学的応答のブーストに関連している。ある態様は更に、患者が癌患者又は子孫である場合、腫瘍細胞の不活化された細胞集団又はそれらの子孫も含むことができる。

好ましい態様において、同種異系細胞移植片も、望ましい結果を生じるが、これは自家細胞が使用される場合よりもより多くの細胞を使う。更にこの方法は、患者における治療的作用を実現するため及び細胞移植片の有効性を増強するために必要な細胞の容積を低下するために、細胞が高レベルのストリンジェンシーで精製され、及びCD25-枯渇される場合に、より高い成功の確率を有する。

本発明の組成物の投与時期は、主治医の判断内であり、患者の臨床状態、治療目的、及び同じく投与される併用療法に応じて決まる。適当な免疫学的モニタリング手段は、反応細胞として患者のPBL及び刺激細胞として原発性腫瘍細胞を使用する、リンパ球混合培養反応(one-way MLR)を含む。免疫学的反応は、注射部位の遅延型炎症反応によっても出現することがある。Treg細胞治療の有効性をモニタリングする適当な手段は、MLRのようなin vitroアッセイ、又はin vivo追跡、例えばCTスキャン、磁気共鳴画像診断(MRI)、適当な造影剤を使用するラジオシンチグラフィー、循環血中腫瘍マーカー抗原のモニタリング、及び対象の臨床反応を含むことができる。毎月又は毎週を基準に、望ましい作用が達成されるまで、追加の投与量が投与されてもよい。その後、及び特に免疫学的又は臨床的恩恵が弱まったことが明らかになった場合は、追加のブースター量又は維持量を必要に応じ与えることができる。

複数の細胞移植片又は移植片と細胞ワクチンの組合せが同一患者へ投与される場合、ワクチン内の同種異系リンパ球が、抗-アロタイプ反応を作出する可能性に注意を払わなければならない。各投与における複数のドナー由来の同種異系細胞の混合物の使用及び様々な同種異系細胞集団の使用は、両方とも、抗-アロタイプ反応の発生の最小化を補助する戦略である。
治療過程において、対象は、発熱反応のような全身の副作用が定期的に評価される。副作用は、適当な支援的臨床看護により管理される。

別の態様。腫瘍リンパ球は、in vivo腫瘍成長の過程において、アネルギーとなり始め、及び活性化又は増量に対し抵抗性となり始めることがある。様々なサイトカイン、すなわちIL-2、IL-4、IL-15、又はIL-1＋IL-6が、メモリーT細胞アネルギーを、部分的に逆行することができる。これらのサイトカインは、T細胞増殖を促進することができ、及び典型的には抗原提示細胞により提供される必須の「二次シグナル」を表す。従って腫瘍感作されたリンパ球の反応性は、様々なサイトカイン及びマイトジェン、例えば抗-CD3抗体又はコンカナバリンAとの同時培養により回復されることがある。

本発明は更に、実施例により説明される。これらの実施例は、単に例証目的のために提供され、特に指定されない限りは限定を意図しない。様々なシナリオが、多くの実践的状況から明らかであるが、これらは単に当業者に例示することが意図されている。これらの実施例は、添付された「特許請求の範囲」に限定するものとして解釈されず、むしろ「特許請求の範囲」は、本願明細書に提示された内容の結果として明らかになる任意の及び全ての変動を包含するように構築されるはずである。

実施例
実施例1に説明された材料及び方法は、実施例2-5においても一般に使用され、実施例6に説明されたものは実施例7において使用されるものと共通であった。
実施例1−NSCLC患者における増加した割合のCD4 ⁺ CD25 ⁺ 細胞
末梢血及び腫瘍を、病期I又はIIのいずれかの非-小細胞肺癌(NSCLC)患者から、施設内治験審査委員会(IRB)の承認したプロトコールに従い、適切なインフォームドコンセントを得た後、手術時に採取した。8名のNSCLC患者から得た新鮮な腫瘍標本を、Wooらの論文(2001)に記載されたように、滅菌した機械による切開により処理し、その後酵素消化した。細胞は、Percoll(Pharmacia Biotech AB, スウェーデン)密度勾配により分離した。末梢血を、腫瘍採取と同時に入手し、Wooらの論文(2001)に記載されたように処理し、凍結した。

サイトカイン産生を、70,000個のCD3⁺CD4⁺CD25^-細胞、又はCD3⁺(-CD4⁺CD25⁺)細胞を、96-ウェルプレート(Falcon, フランクリンレーク, NJ)に配置し、総容量200μlで2日間培養することにより決定した。その後上清を収集し、サイトカイン産生について、QuantikineヒトTGF-β、IL-2、及びIL-10 ELISAキット(R&D Systems, ミネアポリス, MN)を使用し試験した。

各CD25集団を消化し、腫瘍浸潤リンパ球を、フローサイトメトリーにより分析した(図1)。増殖アッセイのために、96-ウェルプレートを、1μg/mLの抗-CD3抗体(Kungら、Science, 206: 347-349 (1979))又は1μg/mLの抗-CD3及び抗-CD28抗体(Hansenら、Immunogenetics, 10: 247-260 (1980))で、一晩37℃で被覆した。患者又は健常ドナーから得た末梢血リンパ球を解凍し、5x10⁴個細胞(200μl)/ウェルで、RPMI 10％FCS(Hyclone, ローガン, UT)中で、3つ組、37℃で、5％CO₂下で培養した。精製したCD3⁺CD4⁺CD25^-、又はCD3⁺(-CD4⁺CD25⁺)T細胞を、様々な数(実施例に応じて0〜20,000個)添加した。ブロック実験は、10μg/mL抗-TGF-β抗体(R&D Systems)により行った。増殖は、[³H]チミジン取込みの測定によりアッセイした(Stephensら、2001)。CD3⁺CD4⁺CD25⁺、CD3⁺CD4⁺CD25^-、又はCD3⁺(-CD4⁺CD25⁺)細胞の濃厚化は、Cytomation(フォートコリンズ, CO)MoFloセルソーター(リンパ球、CD3⁺CD4⁺ T細胞をゲーティング)上で行った。

従って、肺癌患者の末梢血リンパ球(PBL)と比較した、肺癌腫瘍標本から単離された総CD4⁺細胞集団中に存在するCD4⁺CD25⁺リンパ球の頻度(％)をフローサイトメトリーにより決定する場合、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の33％はCD4⁺CD25⁺であることが決定された。これは、レギュラトリーT細胞の活性化された表現型と一致した。図1において、分布及び平均は、健常ドナー(n＝7)のPBL；NSCLC患者(n＝8)由来の未刺激腫瘍浸潤リンパ球(TIL)；又は、NSCLC患者(n＝9)由来の未刺激PBLとして示した。注目すべきことに、NSCLC患者の末梢血は、CD4⁺CD25⁺細胞の割合(％)が同様に増加した。

対照的に、健常ドナーのPBLの15％未満が、このCD4⁺CD25⁺細胞表現型を有し、これは先の報告と一致した(Shimizuら、J. Immunol., 163: 5211-5218 (1999)；Jonuleitら、2001)；Levingsら、2001；Dieckmannら、2001)。

実施例2−腫瘍浸潤リンパ球上のCD152(CTLA-4)のbright構成的表面発現
最近の研究は、CTLA-4は、マウス及びヒト調節細胞上でアップレギュレーションされることを示した(Jonuleitら、2001；Dieckmannら、2001；Readら、2000)。従って健常ドナー及びNSCLC患者由来のリンパ球を、フローサイトメトリーにより、CD4、CD25及びCTLA-4の発現について分析した。

CTLA-4の通常観察される(CTLA-4発現を検出するために細胞を透過性とすることが必要であることが多い)予想されるCTLA4のdim又は検出不可能な発現よりもむしろ、CD4及びCD8発現レベルと同等のレベルのbright表面発現が、腫瘍標本由来の静止リンパ球上で検出された(図2)のに対し、健常ドナー由来の静止T細胞においては、T細胞の1％未満が、CTLA-4発現について陽性であった(データは示さず)。従って、CD4⁺CD25^-及びCD4⁺CD25⁺ TIL及び末梢血単核細胞(PBMC)においてCTLA-4発現を示している2名の代表的患者の評価から、フローヒストグラムを図2Aに示し、他方で図2Bでは、5例の継続的(consecutive)NSCLC患者からの、CD4⁺CD25^-腫瘍浸潤リンパ球(左)、CD4⁺CD25⁺ TIL(中央)、及びCD4⁺CD25⁺ PBMC(右)におけるCTLA-4を発現している細胞の平均(±S.E.)百分率を示す。腫瘍標本由来のCD4⁺CD25⁺細胞の中で、80％は、CTLA-4発現について陽性であり、増加したCTLA-4発現を示した。対照的に、腫瘍標本中のCD4⁺CD25^-リンパ球の10％未満が、CTLA-4について陽性であった。

流出したCTLA-4の活性化されたヒトT細胞上に発現されるB7分子(Greenfieldら、J. Immunol., 158: 2025-2034 (1997))への結合を排除するために、CTLA-4 mRNAを、定量的PCRにより測定した。CD4⁺CD25⁺細胞よりも、CD4⁺CD25⁺細胞において、実質的により高いレベルのCTLA-4 mRNA(2〜7倍；患者n＝3)を観察した(データは示さず)。腫瘍標本中のCD4⁺CD25⁺細胞上のCTLA-4のほぼ均一な発現とは対照的に、肺癌患者由来の末梢CD4⁺CD25⁺細胞のわずかに30％が、CTLA-4陽性に染色された(図2)。

実施例3−腫瘍浸潤CD4 ⁺ CD25 ⁺ 細胞は自家末梢血T細胞の増殖を阻害する
肺癌患者のCD4⁺CD25⁺ CTLA-4⁺細胞の機能を評価するために、CD4⁺CD25⁺細胞を、高速細胞選別により、残りの腫瘍浸潤リンパ球から分離し、及びそれらの増殖能及びT細胞増殖に対する作用を決定した。レギュラトリーT細胞は典型的には、マイトジェン刺激に反応し増殖に失敗する(Shevachら、J. Exp. Med., 193: F41-F46 (2001))。これを確認するために、50,000個のCD4⁺CD25⁺細胞又はCD4⁺CD25⁺細胞を枯渇したCD3⁺腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を、固定された抗-CD3及び抗-CD28で刺激した。CD4⁺CD25⁺細胞を枯渇したCD3⁺細胞は増殖したが、CD4⁺CD25⁺細胞は増殖しなかった(データは示さず)。

次に、自家末梢血リンパ球を、漸増数の推定される調節細胞の存在下、次善又は最善の条件下で刺激した。自家PBLを、単独で、又は肺癌標本由来の漸増数の選別精製したCD4⁺CD25⁺もしくはCD4⁺CD25^-腫瘍浸潤リンパ球(TIL)と共に培養した。CD4⁺CD25⁺ TILを対照培養物に添加した。次善の増殖は、可溶性抗-CD3又は固定された抗-CD3により誘導され、最善の増殖は、固定された抗-CD3及び抗-CD28で誘導された。[³H]チミジン取込みは、4日間培養の最後の18時間に測定した。結果は単独培養されたPBL反応に対する割合(％)として表した。CD25^-プロットの100％増殖は、37081±4094cpmであり、及びCD25⁺プロットについて29465±1007cpmであった。

予想されたように、可溶性抗-CD3は、低レベルで増殖を刺激し、可溶性抗-CD3で刺激された増殖の直接阻害は、腫瘍浸潤CD4⁺CD25⁺ T細胞の添加により認められた(図3A)。しかし固定された(プレート結合した)抗-CD3は、より激しい増殖を誘導し、そこには、CD4⁺CD25⁺細胞の添加によるT細胞増殖の投与量依存した減少が存在した。

しかし、マウスT細胞における先の報告(Thorntonら、 1998)とは対照的に、抗-CD3及び抗-CD28(プラスチック固定された抗-CD3/CD28)で刺激された最適増殖も、肺癌標本に由来したCD4⁺CD25⁺リンパ球のわずかに10〜20％の添加により抑制された(図3B)。この阻害は強力であった。5例の継続的患者において、10,000個のCD4⁺CD25⁺ T細胞の、50,000個の自家PBLへの添加は、自家PBLの抗-CD3/CD28刺激された増殖の60％の平均阻害を生じた。対照的に、反応細胞と共に培養された、CD4⁺CD25⁺細胞枯渇されたCD3⁺腫瘍浸潤リンパ球(図3B)も、照射されたPBL(データは示さず)も、自家PBLの増殖を抑制せず、このことはこれらの作用が空間又は栄養の欠損によるものではないことを明らかにした。

実施例4−CD4 ⁺ CD25 ⁺ 腫瘍浸潤リンパ球は同種異系PBLの抑制に失敗した
新たに単離された腫瘍浸潤CD4⁺CD25⁺ T細胞の、末梢血T細胞の増殖を阻害する能力を決定するために、健常ドナー由来の同種異系末梢T細胞又は無関係の肺癌(NSCLC)患者由来の自家PBLを、この癌患者由来の腫瘍浸潤CD4⁺CD25⁺細胞と共に培養した(使用した細胞の量は、各々、図4A及び4Bに示している。)。本実施例における全ての細胞培養物は、プレート結合した抗-CD3/CD28により刺激した。[³H]チミジン取込みは、4日間培養の最後の18時間に測定した。

CD4⁺CD25⁺ T細胞は、健常ドナー由来のPBLの抗-CD3/抗-CD28刺激された増殖を阻害することができず(図4A)；及び、CD4⁺CD25⁺ T細胞の数の増加により、実際に増強された増殖作用が存在した。共(companion)培養において、腫瘍由来のCD4⁺CD25⁺ T細胞は、自家PBLの抗-CD3/28誘導した増殖を効果的に阻害し(図4B)、これは腫瘍由来のCD4⁺CD25⁺ T細胞の集団の阻害機能を確認している。結果は、図4Aは各々同様の結果を示した3種の独立した実験のひとつについて、又は図4Bはふたつの独立した実験のひとつについて、3つ組の培養の平均(±S.E.)で表した。

次に健常ドナー由来の末梢血T細胞を、自家選別精製した末梢血CD4⁺CD25⁺ドナーT細胞と共に培養し、図4Cに示した。腫瘍-由来のCD4⁺CD25⁺ T細胞の場合のように、健常ドナー反応細胞PBLの増殖は、漸増数の末梢血から単離された自家CD4⁺CD25⁺ T細胞と一緒のそれらの培養により抑制された(図4C)。結果は図4Cにおいて、各々同様の結果を示したふたつの独立した実験のひとつについて、3つ組の培養の平均(±S.E.)で表した。

次に腫瘍浸潤CD4⁺CD25⁺又はCD4⁺CD25^-細胞を、NSCLC患者由来の同種異系PBLと共に培養した。しかし図4Dに示したように、患者Aの腫瘍由来のCD4⁺CD25⁺細胞は、無関係のNSCLC患者である患者B由来のPBLの増殖を阻害しなかった。結果は結果は図4Dにおいて、各々同様の結果を示した4回の独立した実験のひとつについて、3つ組の培養の平均(±S.E.)で表した。

まとめると、これらの実験は、腫瘍に浸潤するレギュラトリーT細胞は、自家T細胞のマイトジェン-誘導した増殖を強力に抑制するが、これらは同種異系PBLの増殖は抑制することができないことを示している。

実施例5−TGF-βは増殖阻害に不要である
腫瘍から単離されたレギュラトリーT細胞によるTGF-β分泌は、それらの抑制機能に寄与するかどうかを決定するために、肺癌標本由来のCD4⁺CD25⁺細胞及びCD4⁺CD25⁺細胞枯渇したCD3⁺細胞を、2日間培養した。上清を、TGF-βについてELISAで試験した。6名患者中の代表1名(3つ組ウェルに関する±S.E)で表す結果において、刺激されない選別精製されたCD4⁺CD25⁺ T細胞は、有意な量のTGF-βを構成的に生成した(図5A)が、IL-2及びIL-10の産生はELISAにより検出されなかった(データは示さず)。

自家PBLは、単独、又は変動数のCD4⁺CD25⁺細胞と共に培養し、及びプレート結合した抗-CD3/CD28で刺激した。抗-TGF-β中和抗体を0μg/mL及び10μg/mlで添加した。[³H]チミジン取込みを、4日間培養の最後の18時間測定した。結果は、同様の結果を得た2回の個別の実験の一方について、3つ組培養の平均(±S.E.)で表した。10μg/mLの抗-TGF-β抗体(50ng/mL TGF-βの作用を中和するのに十分であることがわかっている)の添加は、CD4⁺CD25⁺ T細胞の抗-CD3/28誘導した自家PBL増殖に対する抑制作用を無効にしなかった(図5B)。従って図5A及び5Bは、腫瘍浸潤CD4⁺CD25⁺細胞による構成的TGF-β分泌は、自家PBL増殖の阻害には不要であることを示している。

実施例6−免疫調節CD4 ⁺ CD25 ⁺ 細胞の枯渇はin vivoにおけるGVHD 死亡率の加速を生じる
先行する研究において、CD4⁺CD25⁺免疫調節細胞は、同時-刺激の遮断を介したアロ抗原に対する寛容のex vivo誘導に必要であることが明らかにされている(Taylorら、2001)。更に新たに精製されたB6 CD4⁺CD25⁺細胞の段階的数の添加は、B6 CD4⁺CD25^-反応細胞及び照射されたbm12刺激細胞で構成されたMLRにおけるアロ反応の投与量-依存型の抑制を生じたのに対し、CD4⁺T細胞のCD25-枯渇は、増強された応答を生じた(Taylorら、2001)。結果的に、これらのプロフェッショナルサプレッサー細胞の可能性のある役割を、アロ抗原に対するT細胞応答の調節及び移植片-対-宿主疾患(GVHD)の形成において研究した。

本実施例及び以下の実施例7及び8において、マウス由来のT細胞を用い、全T細胞又はCD4⁺T細胞を精製するために、腋窩、腸間膜、及び鼠径部リンパ節をすりつぶし、及び単独細胞浮遊液を、ワイヤメッシュを通過させ、2％ウシ胎仔血清(FBS)(HyClone, ローガン, UT)を含有するPBS中に収集した。細胞調製物を、モノクローナル抗体(mAb)とのインキュベーションにより、NK細胞(ハイブリドーマPK136、ラットIgG2a)及びCD8⁺T細胞(CD4⁺細胞精製のため)(ハイブリドーマ2.43、ラットIgG2b)を枯渇し、引き続きヤギ抗-マウス及びヤギ抗-ラットIg-被覆したカラム(Cellect Cell Enrichment Immunocolumns, Cedarlane, Hornby, オンタリオ州, カナダ)を通した。精製したT細胞の最終組成は、フロー-サイトメトリー分析により、全又はCD4⁺T細胞が＞94％であると決定した。

示したように、CD25⁺免疫調節細胞は、抗-CD25 mAb(ハイブリドーマ3C7、ラットIgG2b、BD PharMingen(サンディエゴ, CA)及びヒツジ抗-ラットDynabeads (Dynal, レークサクセス, NY)とのインキュベーションにより枯渇し、＞95％が枯渇されたと決定した。CD4⁺CD25⁺細胞を濃厚化するために、精製したCD4⁺細胞を、抗-CD25ビオチン(ハイブリドーマ7D4、ラットIgM)、引き続きストレプトアビジン-PE(両方ともBD PharMingen)と共にインキュベーションした。MACS抗-PEマイクロビーズとのインキュベーション後、細胞を、MS又はVS MACS分離カラム(両方ともMiltenyi Biotec, オーバーン, CA)上で陽性選択した。細胞は、＞90％がCD4⁺CD25⁺であると決定した(簡単に「CD25⁺細胞」とも称される)。

ドナー由来のCD25 ⁺ 細胞の放射線照射レベル及び枯渇の作用。T細胞ドナー接種材料中のCD25⁺細胞の枯渇が、in vivoにおいて促進又は増加したGVHD死亡率を生じるかどうか、又はGVHD死亡率は、単に致死量以下の全身放射線照射(TBI)条件下で作動するかどうかを決定するために、Jackson Laboratory (バーハーバー, ME)から入手した8〜12週齢のB6.C-H2^bm12/KhEg (bm12)(H2^b)マウスを使用した。全てのマウスは、特定病原体-非汚染施設において、マイクロアイソレーターケージ内で飼育した。このマウスを¹³⁷セシウム源からの6.0Gy TBIに線量85cGy/分で細胞注入前に4時間曝露することにより、bm12レシピエントを致死量以下で照射した(この特定実験及び本実施例を通じて)。致死量以下に照射されたbm12マウスは、最初の実験で1x10⁵クラスII非対応(disparate)の全B6 CD4⁺ T細胞又はCD25-枯渇したB6 CD4⁺ T細胞が与えられ(図6A)、第二の実験においては、同じ全B6 CD4⁺ T細胞又はCD25-枯渇したB6 CD4⁺ T細胞の0.5x10⁵が与えられた(図6B)。これらの細胞は、静脈内投与した。

これらのマウスは、毎日生存についてモニタリングし、2週間に1回体重を量り、更にGVHDの臨床像を観察した。生存データを、生命表法で解析し、実際の生存率を示した。対数-順位(log-rank)検定統計により、群比較を行った。P≦0.05を有意とみなした。高投与量で、全てのマウスはGVHDにより死亡した(図6A)；しかし、減量した投与量で、生存率は、長期間で20％であった(図6B；p＝0.0068)。

CD25-枯渇されたCD4⁺T細胞のレシピエントは、GVHD後1週間〜10日間の間に死亡し、これは全CD4⁺細胞のレシピエントよりも早かった(p＝0.024)。10⁵個細胞は、迅速かつ高い致死的GVHDを生じたので、生存の差異を拡大するために、より低い細胞投与量(0.5x10⁵)で、この実験を繰り返した(図6B)。0.5x10⁵個のCD25-枯渇したCD4+T細胞を受け取った全てのレシピエントは、細胞注入後19日までに、GVHDに対し負けた。従って、ドナーT細胞接種材料中のCD25⁺細胞は、GVHD反応をダウンレギュレーションし、及びドナーT細胞接種材料中のCD25⁺細胞の枯渇は、GVHDを加速した。GVHDの発生は、全CD4⁺T細胞のレシピエントにおいて遅れたが、このレシピエントのin vivo移植前のCD25⁺細胞の枯渇は、GVHDを加速した。

異なる系統由来のT細胞-枯渇した骨髄又は脾細胞を使用するGVHDに対する作用。別の一連の実験において、BALB/cレシピエントに、同種異系T細胞-枯渇した骨髄及び(i)2x10⁶個の全脾臓又は精製した全リンパ節のCD4⁺T細胞、又は(ii)2x10⁶個のCD25-枯渇したCD4⁺細胞のいずれかの移植前日に、x-線により致命的に放射線照射した(図7参照)。CD25-枯渇したCD4⁺T細胞の全レシピエントは、移植後63日目までに死亡した(平均生存日数＝35日)。対照的に、2x10⁶個の全CD4⁺T細胞を受け取ったマウスの25％は、100日目まで生存した(8匹マウス/群；平均生存日数＝91日)(図7、p＝0.016)。

GVHD形成に対するCD25枯渇の作用を、GVHDが、CD4⁺及びCD8⁺の両T細胞により媒介された、3種の異なる系統の組合せにおいて試験した。BALB/c重症複合免疫不全症(SCID)マウス(National Institutes of Health, ベセスタ, MDから購入)には放射線照射しなかったが、同種異系T細胞移入前2及び4日に、抗-アシアロGM1(Wako Chemicals USA, Inc. リッチモンド, VA)25μlの腹腔内注射によりNK-枯渇した(NK-枯渇したBALB/c SCIDマウス)。指摘した場合は、ドナー-型CD25⁺細胞を、個別の静脈内注射により注入した。

第一のGVHDモデルにおいて、非-照射NK-枯渇BALB/c SCIDマウスは、全T細胞又はCD25-枯渇T細胞のいずれかを受け取った(図8)。T細胞のCD25-枯渇は、GVHD死亡率の促進を生じ(図8、p＝0.021)、これはCD4⁺CD25⁺細胞は、TBI条件付けの非存在下で、CD4⁺及びCD8⁺の両T細胞により媒介されたGVHDにおいて役割を果たすことを示している。

第二の系統の組合せにおいて、The Jackson Laboratory(バーハーバー, ME)から入手した、致死的に照射したB10.BRマウス(B10.BR (H2^k))は、B6 BM及び15x10⁶個の全脾臓又はCD25-枯渇された脾臓のいずれかを受け取った(図9)。(B6及びbm12の両方(両方ともH2^b)は、クラスII IA領域の変異により、3個のアミノ酸が異なることに注意)。CD25-枯渇された脾細胞のレシピエントは、全脾細胞のレシピエントよりも10日より早くGVHD死亡した(p＝0.055)。

第三の系統の組合せにおいて、B6レシピエントマウスは、移植後のドナーBM由来のCD4⁺CD25⁺免疫調節細胞の出現を防止するために、移植前に胸腺切除術を受けた。加えて、in vivoの宿主CD4⁺CD25⁺調節細胞を枯渇するために移植前に成体-胸腺切除したレシピエントへ、抗-CD25 mAb(ハイブリドーマ7D4)を、移植日の-10、-7及び-4日目に、投与量0.5mg/注射で静脈内投与した(0.5mg抗体/注射)。抗-CD25 mAbは、ヌードマウスにより生成された腹水の硫酸アンモニウム沈殿により、部分的に精製した。抗-CD25 mAb-処置した又は対照mAb-処置した胸腺切除術を受けたB6マウスに、致死的に照射し、BALB/c BM及び15x10⁶個全脾細胞を移植し、生存をモニタリングした(図10)。In vivoにおいて移植直前に抗-CD25 mAbで処置したマウスは、対照と比べ、有意に低い平均生存率を有した(22対44日間)。全ての抗-CD25 mAb-処置したレシピエントは、移植後28日までにGVHDで死亡し、これは対照抗体のレシピエントよりも58日間早かった(図10、p＝0.0063)。
まとめると、これらのデータは、CD4⁺CD25⁺免疫調節細胞は、系統の組合せ又はGVHDがCD4⁺T細胞もしくはCD4⁺及びCD8⁺の両T細胞により媒介されるかどうかとは関わりなく、GVHD形成を有意に阻害する役割を果たす。

実施例7−ex vivo活性化及び増量されたCD4+CD25+免疫調節細胞の注入はGVHDを改善する
先のデータは、新たに精製したCD4⁺CD25⁺細胞は、全CD4⁺細胞と1:1の比で投与した場合GVHDに対する非常にわずかな予防作用のみを有したことを示した(Taylorら、2001)が、CD4⁺CD25⁺細胞のGVHD予防作用は、GVHD致死性の阻害に関して臨床用に開発可能であると仮定された。CD4⁺CD25⁺細胞はマウス及びヒトの両方の総CD4⁺集団のわずかに約5〜10％を占めるので、著しく治療的に恩恵のある十分な数の新たに精製した免疫調節細胞の投与は、臨床において実践することはできないないであろう。しかしデータは、CD4⁺CD25⁺細胞は、活性化時により強力なサプレッサー細胞となり始めることを示しているので、CD4⁺CD25⁺細胞のex vivo活性化及び増量は、臨床的に実行可能な免疫調節細胞療法をもたらすと仮定された。従って最初に最適培養条件を決定するために、4種の異なる条件を、CD25⁺細胞の活性化について試験し(すなわち、条件1-4)、及び各評価された作用及び結果を、実験の残りに適用した。

Treg細胞の培養及びex vivo活性化の条件
条件1：最初の試みは、Thorntonら(2000)により報告されたような、精製したCD4⁺CD25⁺細胞の、可溶性抗-CD3 mAb、相乗的抗原提示細胞(APC)及び高投与量IL-2(100U/ml)と一緒のex vivoインキュベーションを利用した。濃厚化したCD25⁺細胞を、24-ウェルプレート(Costar, アクトン, MA)中で最終濃度0.5x10⁶個細胞/mlで懸濁し、1週間培養した。この培養培地は、10％FBS(HyClone)、50mM 2-ME(Sigma, セントルイス, MO)、10mM HEPES緩衝液、1mMピルビン酸ナトリウム(Life Technologies, グランドアイランド, NY)及びアミノ酸補充物(1.5mM L-グルタミン、L-アルギニン、及びL-アスパラギン)(Sigma)並びに抗生物質(ペニシリン、100U/ml；ストレプトマイシン、100mg/ml)(Sigma)を補充した、DMEM (BioWhittaker, ウォーカービル, MD)であった。最初に、可溶性抗-CD3(0.5μg/ml)(ハイブリドーマ145-2C11、ハムスターIgG)(BD PharMingen)及び組換えヒトIL-2(5.0ng/ml) (Amgen, サザンオークス, CA)を用い、これらの細胞を活性化した("条件1")。

しかしこれらの活性化された細胞は、このプロトコールでは10〜15倍増量されたが、それらのサプレッサー機能は、著しく損なわれた。増量された活性化されたCD4⁺CD25⁺細胞は、同数の新鮮なGVHD-誘導するCD4⁺T細胞と一緒にした場合に、GVHDを抑制しなかった(データは示さず)。加えて、新たに単離されたCD4⁺T細胞とは対照的に、同じex vivo活性化プロトコール下で増量された対照CD4⁺CD25^-細胞は、同種異系レシピエントへ注入した場合に、致死性を媒介することに失敗し、このことは、この増量及び活性化プロトコールは、in vivoにおける機能の全般的喪失を生じたことを示している(データは示さず)。

条件2：次に、先に説明されたものと同じ培養条件を用いるCD25⁺ ex vivo活性化プロトコールを改変し、改変されたプロトコールは、可溶性抗-CD3 mAbではなく、固定された抗-CD3(5.0μg/ml及びIL-2(100U/ml))を使用した("条件2")。3日後、これらの細胞を、抗体-被覆したプレートから除去し、新たなプレートへ移し、IL-2-含有培地を供給し、T細胞レセプター-(TCR-)を再発現させた。次にこれらを、IL-2-含有培地において更に4日間増量した。このプロトコールは、CD4⁺CD25⁺細胞の15〜20倍の増量をもたらした。

増量されたCD25⁺細胞を、C57BL/6 (B6) (H2^b)、BALB/c (H2^d)、及びBALB/c重症複合免疫不全症(SCID)マウス(NIH)で、それらのGVHD形成阻害能について、in vivoにおいて評価した。200万個の新たに精製したB6 CD4⁺ T細胞を、非-照射のNK-枯渇されたBALB/c SCIDレシピエントへ注入した。マウスのコホートは、2x10⁶個の活性化されたCD4⁺CD25⁺細胞又はCD4⁺CD25^-細胞の個別の注射を受け取った。細胞は、固定された抗-CD3 mAb及び高投与量IL-2により1週間活性化され及び増量され、生存率及び体重をモニタリングした(図11及びデータは示さず)。Ex vivoで増量されたCD25⁺細胞の注入は、生存時間の中央値を10日間から72日間へ有意に延長した(図11、p＝0.022)。補充的に増量されたCD25^-細胞を受け取ったマウスの生存は、新鮮なCD4⁺ T細胞のみを受け取った対照マウスと有意に異ならず(図11、p＝0.285)、これは予防的作用がCD25⁺集団に特異的であることを示している。

活性化及び増量されたCD25⁺細胞の投与は、生存を有意に延長したが、マウスはGVHDの実質的徴候を有し(20％の体重減少、下痢、背中を丸める姿勢、粗く薄い毛並み、及び全身の紅斑)、並びに最終的にはGVHDで死亡した。これらのデータは、CD25⁺細胞は、GVHDを著しく阻害するのに十分数を得るために、ex vivoにおいてかなり増量されたが、活性化及び増量プロトコールにおける追加の改善が、抗-GVHD作用を増大するために必要であることを示した。

比較実験：B6 CD25⁺細胞を活性化及び培養する方法を最適化するために、3種の異なる方法を比較した。比較標準は、条件2の活性化プロトコールであり、先に説明したような、(i)固定された抗-CD3、及び(ii)高投与量IL-2(100U/ml)による活性化を意味した。全ての培養は、＞95％生存した。

条件3：固定された抗体は強力なTCRシグナル伝達及び活性化-誘導した細胞死を生じるので(Lenardo, Nature, 353: 858-861 (1991)；Wesselborgら、J. Immunol., 150: 4338-4345 (1993)；Lissyら、Immunity, 8: 57-65 (1998)；Carpenterら、J. Immunol., 165: 6205-6213 (2000))、あまり強力でなく及び全体的な活性化の手段を試験する必要性が存在した。従って"条件3"において、より生理的レベルでのTCRシグナル伝達及び活性化を誘導するために、照射されたBALB/c脾臓刺激細胞を、精製したB6 CD25⁺細胞に添加し(比2:1)、並びにこれらの細胞を、高投与量のIL-2(100U/ml)の存在下で培養した。

この方法の臨床の実行可能性は、十分数の活性化されたCD25⁺調節細胞の注入ができることに左右されるので、この培養条件の評価の重要な部分は、回収データであった。固定された抗-CD3及び高投与量IL-2を利用する条件3の培養プロトコールは、1週間で細胞の12倍の増量を生じたのに対し、T細胞レセプターの活性化の引金を引くための放射線照射された同種異系宿主-型脾臓刺激細胞及び高-投与量IL-2は、細胞のわずかに1.5倍の増量につながった。

条件4：比較的高投与量のIL-2は最適増量に必要であるが、高投与量IL-2の中断は、in vivoにおける移入時の貧弱な細胞生存に寄与し、これによりより少ない最適GVHD予防を生じる可能性があるということを認識し、"条件4"を試験する更なる理由が存在した(Lenardo, 1991)。条件4は、照射されたBALB/c脾刺激細胞及び低投与量IL-2(10U/mlに減量)を使用し、及び組換えヒトトランスフォーミング増殖因子-β₂(TGF-β₂；1.0ng/ml) (R&D Systems)を、CD4⁺CD25⁺の追加の増殖因子として添加した。

同種異系脾臓刺激細胞、低投与量IL-2及びTGF-βを使用する条件4の方法は、最低の回復を生じ、投入細胞のわずかに31％を1週目に回収した。培養されたCD25⁺細胞の3型全て(CD4⁺；CD4⁺＋活性化されたCD25^-；CD4⁺＋活性化されたCD25⁺)を、CD4⁺及びCD8⁺の両方のT細胞により媒介されたGVHDを阻害するそれらの能力について評価した(図12)。6匹のBALB/c SCIDマウスは、GVHDを誘導するために、10⁶個のCD25-枯渇された全T細胞を受け取った。マウスのふたつの個別のコホート(6匹マウス/群)も、各々最初の2つの条件下で培養された10⁶個のCD25⁺細胞(抗-CD3/IL-2(条件2、図12で□で示した)又はアロ-APCs/IL-2(条件3、図12で△で示した))を受け取った。第三のコホート(6匹マウス/群)は、照射されたBALB/c非細胞、低投与量IL-2及びTGF-βと共に培養された10⁶個CD25-枯渇された全T細胞及び0.5x10⁶個CD25+細胞(条件4、図12において☆で示した)であった；が、10⁶個のCD25⁺細胞を完全に注入することはできなかったので、この群は不充分に回復した。

CD25^- T細胞の全てのレシピエントは、細胞の移入後8日以内に死亡した(図12)。対照的に、培養されたCD25⁺細胞の注入は、培養プロトコールとは無関係に、GVHD死亡を有意に阻害した。固定された抗-CD3 mAb及び高投与量IL-2により増量した新鮮なCD25^- T細胞及びCD25⁺細胞のレシピエントの50％(3/6)は、細胞の移入後2ヶ月間生存した。生存は、CD25^- T細胞並びにBALB/c脾細胞及び高投与量IL-2と共に培養されたCD25⁺細胞のレシピエントにおいて延長されたが、全てのマウスは、54日目にGVHDのために死亡した(生存期間の中央値は31日)(図12)。対照群(図12に●で示した)と比較した全てのp値≦0.016。

少ない細胞数の注入にもかかわらず、このプロトコール下で培養されたCD25⁺細胞は、GVHD致死性に対し6匹のレシピエント中5匹を少なくとも2ヶ月間予防した。これらのデータをまとめると、CD4⁺CD25⁺細胞は、急激な致死性GVHDに対する有意な予防を提供するのに十分な数に、ex vivoにおいて容易に増量することができることを明らかにしている。

GVHD症状の発生後のGVHD治療：活性化及び増量されたCD25⁺ Treg細胞注入を使用し、GVHDを治療することができるかどうかを決定するために、致命的に放射線照射されたB10.BRレシピエントに、C57BL/6 BM単独又はBM及び脾細胞を0日目に投与した。BMT後6日目には、活動的及び進行中のGVHDの指標である、脾細胞を受け取った群でのGVHD-誘導した体重減少を含むGVHD症状の明らかな発生はなかったが、この時点で、活性化及び増量された(抗-CD3/IL-2/TGF-β)C57BL/6 CD4⁺CD25⁺細胞の単回注入を、静脈内投与した。1群9〜10匹のマウスを移植し、分析した。対照群の51日目までに一様の致死性と比べ、活性化及び増量されたCD4⁺CD25⁺細胞の注入は、マウスの40％を長期間(152日間)救済することができた(脾臓＋CD4/25対脾臓単独でP＝0.002)(図13参照)。

結果的に、今日までに試験した抗-GVHD療法の、ex vivio活性化及び増量されたCD25⁺ Treg細胞注入を利用する方法は、本モデルシステムにおける評価として最も有望であるように見える。

GVHD予防のための反復細胞注入：同種異系ドナーT細胞の照射されないSCIDレシピエントへ注入された活性化及び増量されたCD4⁺CD25⁺細胞の注入により示された抗-GVHD作用に加え、強力な抗-GVHD致死作用が、C57BL/6 T細胞枯渇された骨髄(BM)と共に、完全な主要組織適合性-不対応(MHC-不対応)C57BL/6脾細胞(15x10⁶)の、致命的に放射線照射されたB10.BRレシピエントにおいて認められた。活性化及び培養された(抗-CD3/IL-2/TGF-β)CD4⁺CD25⁺細胞を、このモデルシステム(脾臓＋CD4/25細胞)においてBMT後0及び4日目に(10⁷/日)に、示したように、マウスコホートへ注入した。対照は、CD4/CD25細胞注入を伴わないBM単独又はBMと補充的脾細胞からなった。1群につき8匹のマウスを移植した。一様のGVHD致死性が対照動物において認められたのに対し、CD4⁺CD25⁺細胞2回注入のレシピエントは、低い死亡率を有し、88％が長期間生存した(図14参照)。従ってこれらのデータは、複数回の細胞注入は、無毒であり、GVHDを引き起こさず、実際に完全MHC-不対応ドナー移植片の致命的に放射線照射されたレシピエントにおけるGVHD死亡率の予防において高い有効性があることを示している。

結果的に、CD4⁺CD25⁺細胞は、増量し及び反復注入として投与することができるので、これらのデータは、反復細胞注入が、単独ドナーCD4⁺CD25⁺細胞の単離手法から、比較的低い頻度でヒトに存在するこの細胞集団のex vivoでの活性化及び培養により認められる顕著な増量まで、患者へ与える急性及び慢性GVHD治療のｐ試験に関する概念の検証(proof-of-principle)を提供する。

生着作用：増量されたC57BL/6 CD4⁺CD25⁺細胞の生着促進能を試験するために、抗-CD3/IL-2/TGFβを、単独で又は生存因子(IL-4；IL-7)と共にのいずれかで使用した。BALB/cレシピエントには、4.25Gy TBI、及びC57BL/6 T細胞枯渇したBM(10⁷個細胞/レシピエント)を、CD4⁺CD25⁺細胞なし又は活性化され増量されたCD4⁺CD25⁺細胞(5x10⁶)と共にのいずれかで投与した。平均ドナー細胞は、CD4⁺CD25⁺細胞と比較して、対照(41％)：2種の増量培養について、各々、89％(P＝0.0003)又は83％(P＝0.009)であった。生着は、多系統であり経時的に安定していた(反復試験を、82日目及び139日目に行い、結果は類似していた。)。レシピエントは、副作用(GVHDを含む)の証拠を有さず、全ての群において生存は同等であった(〜75％が長期間)。従って、増量された培養物は、生着を促進する。

活性化及び増量されたCD4 ⁺ CD25 ⁺ 細胞の使用はL-セレクチンを濃厚化した：Thortonらの論文(2000)は、L-セレクチンが高い細胞は、L-セレクチンが低い細胞よりもより強力でないことを示し、最近になってFuらは(Amer. J. Transplant 4:65-78, 2004)、in vivoにおける養子移入時に、自己免疫胃炎の予防において、新たに単離されたCD4/25 L-セレクチンの高い細胞、対、低い細胞の生物学的有効性にin vivoでの差異が存在しないことを報告した。

しかしながら、ホーミングレセプター発現が、活性化及び増量されたCD4⁺CD25⁺細胞の抗-GVHD作用に影響を及ぼしたかどうかを決定するために、C57BL/6 CD4⁺CD25⁺細胞を、抗-CD3＋抗-CD28 mAb被覆されたビーズ(2日間)＋IL-2(100U/ml)を用い培養した。7日後、活性化及び増量された細胞は、カラム精製によりL-セレクチン(CD62L)高(hi)又は低(lo)レベル発現に濃厚化した。致命的に放射線照射されたbm12マウス(C.H2bm12 (B10.BR (H2^k))に、MHCクラスII不対応C57BL/6 T細胞枯渇されたBM単独(BM)、又は補充的C57BL/6 CD4⁺CD25^- T細胞を投与した(10⁶個細胞/レシピエント)。ドナーT細胞を受け取ったレシピエントの一部のコホートは、ex vivo活性化及び増量されたCD4⁺CD25⁺CD62L-hi細胞又はCD4⁺CD25⁺CD62L-lo細胞を受け取った(3x10⁶個細胞/レシピエント)。対照は、BM単独(BM)、又はBMとC57BL/6 CD4⁺CD25^-細胞のみ(BM＋CD4⁺CD25^-細胞)からなった。1群8匹のマウスに移植した。BMT後35日目に、CD4⁺CD25⁺細胞を伴わないドナーCD4⁺CD25^-T細胞を受け取る対照は、わずかに25％の生存率であった。CD4⁺CD25⁺CD62L-lo細胞を受け取ったレシピエントは、38％の生存率を有し、これは、この補充的細胞集団を受け取らなかったものとは有意差がなかった(P＝0.35)。

著しい対照において、ex vivo活性化及び培養後に単離されたCD4⁺CD25⁺CD62L-hi細胞を受け取ったレシピエントは、補充的CD4⁺CD25⁺細胞を受け取らなかったもの(P＝0.0016)又はCD4⁺CD25⁺CD62L-lo細胞を受け取ったもの(P ＝ 0.005)と比較し、有意に高い生存率を有した(100％)。従って、CD3/28ビーズ＋IL-2と共に増量されたCD4/25 L-セレクチンの高細胞対低細胞のin vivo注入は、GVHD致死性の抑制において、大きい恩恵がある。これらのデータは更に、ex vivo活性化及び培養された細胞は、齧歯類において強力な抗-GVHD作用を有する細胞サブセットに分類することができること、並びにex vivo活性化及び増量後に実行されるこの手法は、BMTモデルのこの細胞集団の生物学的特性を更に改善することができることを確認する。CD62L発現レベルは、この目標を達成するためのそのような方法のひとつを提供するが、他のものも当該技術分野において知られているか又は定義されている。

本発明のデータは、活性化及び増量されたCD4⁺CD25⁺細胞は、様々なモデルを用い、同種異系レシピエントへの注入時に、強力なGVHD抑制及び／又は阻害並びに生着の促進作用の両方を提供することを証明した。ヒト細胞での研究は、CD4⁺CD25⁺細胞は、活性化され及び増量されるが、同時にアロ抗原に対する抑制能を維持するというin vitro現象を明らかにしている。

実施例8−ストリンジェントに単離されたTreg細胞のex vivo培養-増量法、並びにこれにより提供された細胞のヒト免疫抑制療法における使用
前述のマウスの研究及びTaylorら(2002, 前掲)のような先行する研究を基に、抗-CD3＋IL-2(10日間)により、ex vivoポリクローナル性に増量されたTreg細胞は、GVHDの予防において有効であることが示された。他の研究者による研究は、Treg細胞の照射された同種異系APC＋外来性IL-2によるex vivo増量は、GVHDを抑制することができることを示している(Cohenら、2002、前掲；Trenadoら、2002、前掲)一方で、その後の研究は、Treg細胞はGVHDを予防することができるが、動物モデルにおいてこれらは依然、抗-腫瘍又は移植片-対-白血病(GVL)作用をもたらすことを示している(Trenadoら、2002；Jonesら、2003；Edingerら、2003、前掲)。しかしながら、ヒト移植時の臨床免疫抑制療法におけるヒトTreg細胞の明らかに可能性のある役割は、「ヒト」Treg細胞が、単離され並びにin vivo注入に十分な数の細胞を提供するのに十分な長期間にわたり培養-増量される方法が開発されない限り、及び開発されるまでは、限定的であった。

この必要性に合致するように、免疫応答のダウンレギュレーションの天然の生理的機構を利用し、本発明者らは、免疫抑制療法、特に移植関連の免疫応答を予防するために活性化されたヒトCD25⁺サプレッサーT細胞を提供する、独自の精製法及びex vivo培養-増量技術を開発した。ヒトサプレッサー細胞株は、下記の実験において作出し、これは少なくとも3〜6週間機能を維持した。場合によっては、培養物中の細胞株は、最大3ヶ月間機能を維持し、依然強力に抑制性であった。しかしCD4⁺CD25⁺ Treg細胞機能をより良く特徴付けるために、これらの重要な細胞を単離及び培養-増量するために、改善され修飾されたMACS精製法を開発した。下記の成分及び方法を、以下に説明した実験において使用し、治療目的のために顕著な抑制作用を提供することが可能である、強力な培養-増量されたTreg細胞を得た。

CD4 ⁺ T細胞サブセットのMACS精製。T細胞は、正常な健常志願者ドナーの全血由来のバッフィーコート調製物(Memorial Blood Centers, ミネアポリス, MN)から単離した(初期実験においては、白血球泳動産物も使用した)。白血球が豊富なバッフィーコート細胞を、Ficoll-hypaque層上で遠心し、PBMCを収集した。CD25⁺ bright細胞を、PBMCから直接複合された抗-CD25磁気マイクロビーズ(2μl/10⁷個細胞) (Miltenyi Biotec, オーバーン, CA)による陽性選択により単離し、LS⁺カラム(LS⁺分離カラム及びMidiMACS Separationユニット装置は、Miltenyi Biotecから入手した)上で精製した。その後細胞を、第二の磁気カラムに負荷し、洗浄し、再溶離した。この二重カラム手法の後、細胞は、FACS分析により、日常的に純度＞93％(CD25について)であった(わずかなB細胞(4〜8％)及びCD8⁺ T細胞(〜1％)が残りを構成した)。

あるいは、細胞は、抗-CD25-FITC、クローン2A3(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, サンノゼ, CA)で間接的に染色し、洗浄し、抗-FITCマルチ-ソートマイクロビーズ(3μl/10⁷個細胞、Miltenyi Biotec)へ結合し、陽性選択した。直接マイクロビーズシステムのように、細胞は、第二カラムに再負荷した。カラム精製後、マルチソートビーズを脱着し、CD25⁺細胞を、系統枯渇のためのmAb-被覆されたマイクロビーズカクテルにより、CD8、CD14、CD19、CD20及びCD56発現している細胞を枯渇した。

PBMCの非-CD25画分は、より多くの抗-CD25マイクロビーズ(10μl/10⁷個細胞)で更にCD25⁺細胞を枯渇した。その後CD4⁺ T細胞を、CD25-画分から、抗-CD4 mAb-被覆した磁気マイクロビーズ(10μl/10⁷個細胞)(Miltenyi Biotec)での陽性選択により単離した。細胞は、FACS分析により、日常的にCD4⁺CD25^-純度96〜98％であった。

T細胞培養。単離されたCD4⁺CD25⁺細胞又は対照CD4⁺CD25^-細胞を、抗-CD3/CD28 mAb-被覆したDynabeads(ペンシルバニア大学)と共に、(2:1)ビーズ/総細胞比で培養した(Levineら、J. Immunol., 159(12): 5921-5930 (1997), Laportら、Blood, 102(6): 2004-2013 (2003))。CD4⁺CD25^--支持細胞は、30Gy照射し、1:1の比でCD4⁺CD25⁺細胞に添加した。細胞は、24ウェルプレート中100万個(非-照射)細胞/mlで培養した。IL-2を、3日目に50IU/mlで添加した(Chiron, エメリービル, CA)。細胞は、急速増殖相の間は3日毎におよそ1:3で、必要に応じ分離した。培養培地は、10％FCS(Gibco)、L-グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したRPMI-1640(Gibco)であった。

MLR培養のための刺激細胞。未熟型ヒト樹状細胞(DC)を、CD14⁺単球から作出し(Sallustoら、J. Exp. Med., 179(4): 1109-1118 (1994), Banchereauら、Annu. Rev. Immunol., 18: 767-811 (2000))、PBMCから磁気ビーズベースの精製(Miltenyi-Biotec)により単離し、GMCSF(最終50ng/ml)及びIL4(最終20ng/ml)サイトカイン(R&D Systems, ミネアポリス, MN)を補充したX-Vivo-15 (BioWhittaker, ウォーカーズビル, MD)培地において、10⁶個細胞/mlで培養した。細胞は、5〜10日間培養し、その後MLRにおいて刺激細胞として使用した。

一部の実験について、DCは、TNF-α(最終20ng/ml)及びPolyI:C、Toll-様レセプター(TLR)-3物質アゴニストリガンド(最終20μg/ml)(Sigma, セントルイス, MO)で、2日間成熟した(Cellaら、J. Exp. Med., 189(5): 821-829 (1999), Spisekら、Cancer Immunol. Immunother., 50(8): 417-427 (2001), Godfreyら、Blood, 103: 1158-1165 (2004))。別の実験において、TNF及びPolyI:C(同じ濃度)、又はLPS(Sigma-Aldrich) (10-100-1000ng/ml)を、MLRへ直接添加した。DC刺激細胞は、30Gyで照射した。

MLRアッセイ培養。1ウェルにつき5x10⁴個の反応性CD4⁺CD25^- T細胞及び5x10³個のDC刺激細胞APCを、96 ウェルU-底プレートにおいて培養した。試験培養したサプレッサー又は通常のT細胞株を、標準アッセイのため、2.5x10⁴個/ウェルで、又は力価決定実験のため段階的数で添加した。抗体ブロック実験のために、1x10⁴個サプレッサー細胞を使用した。培養培地は、10％FCS(Gibco)、L-グルタミン、ペニシリン、及びストレプトマイシンを補充したRPMI-1640(Gibco-Life Technologies, グランドアイランド, NY)であった。ウェルは、3、5、6及び7日目に、³H-チミジンで、培養の最後の16時間パルスした。全ての時点で6つ組で行った。結果は、カウント/分(cpm)として表した。しかしデータは、直接ベータ線カウンターで収集し、そのため報告されたcpmは、液体シンチレーション増幅で通常報告される値よりも低かった。従ってカウントの絶対的大きさは低かったが、実験試料間の相対差は、依然絶対的なものであった。

サイトカイン分析。培養物上清を、細胞非含有に遠心し、アリコートを-80℃で凍結した。上清を、ラテックスビーズ-ベースの多被検体システム(R&D Systems, ミネアポリス, MN)により、Luminexアッセイシステムで評価した。

細胞傷害性。4-時間⁵¹Cr放出アッセイにおいて、培養されたサプレッサー細胞株を、同種異系DC又はNK感受性細胞株K562に対する細胞傷害性について試験した。エフェクター対標的の比は、20:1〜0.6:1の範囲であった。標的細胞を、200μCiクロム酸ナトリウム-⁵¹Cr(DuPont, ウィルミントン, DE)で60分間標識した。全ての測定を、3つ組で行い、溶解の割合(％)を決定した。陽性対照の溶解したNK92細胞は、ATCC(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, ロックビル, MD)から得、500U/ml組換えヒトIL-2(Chiron)の存在下で維持した。

モノクローナル抗体(Mab)。精製後に、細胞を、抗-CD25-マイクロビーズでブロックされない抗-CD25-PE、クローンM-A251(BD Pharmingen)で染色した。フローサイトメトリーのための他の抗体は、抗-CD4-PerCP(クローンSK3)、抗-CD8-PerCP (SK1)、抗-CD19-APC (4G7)(これらはBecton Dickinson Immunocytometry Systemsから入手)；抗-CD27-FITC (MT271)、抗-CD62L-PE (Dreg 56)、抗-CD69-FITC (FN50)、抗-CD152-PE (BNI3)、抗-CD122-PE (Mik-b2)、抗-CD132-PE (AG184)、及び抗-CD134 (ACT35)(これらはBD Pharmingenから入手)；並びに、抗-CCR7-PE (#150503)、及び抗-GITR-PE (#110416)(これらはR&D Systemsから入手)であった。抑制のブロックを目的とした機能実験において、中和抗体を、最大20μg/mlまで力価決定した量で使用した。抗体は、抗-IL-10 (23738)、抗-IL-10-レセプター-α(37607)、及び抗-TGFβ-1,2,3 (1D11)を含み、これらはR&D Systemsから入手した。

フローサイトメトリー。免疫蛍光染色のために、細胞を、力価決定した量の各抗体で、30分間4℃で染色した。細胞は再度洗浄し、FACS Caliburサイトメーター(BD Immunocytometry systems)上で分析した。細胞株サブセットを、FACS Vantage上で選別した。データは、FloJoソフトウェアver.4.4 (Treestar, アッシュランド, OR)で解析した。細胞内染色は、ホルムアルデヒドで固定した細胞を用い、2％で室温で30分間行い、引き続き透過性とし、1時間染色し、0.1％サポニン含有緩衝液PBS＋5％FCS-5％ヒトAB血清中で洗浄した。

統計解析。図15-21の全てのエラーバーは、平均を上回る及び下回る1標準偏差を示している。対のある両側スチューデントt-検定を用い、増殖反応間の差異の統計学的有意性を決定した。p値＜0.05を、有意性ありとみなした。

実験結果。本修飾したMACS精製において低力価の抗-CD25 mAb-被覆したマイクロビーズを用い、CD25発現のより高い平均チャネル蛍光強度を伴う細胞の単離につながった。加えて磁気的に単離された細胞の追加精製のための第二カラムへの再負荷は、CD25⁺細胞の濃厚化を更に増大した。切断可能なマイクロビーズの使用は、CD25精製後のビーズの除去を可能にし、これは引き続きの系統枯渇(CD8、CD14、CD19、及びCD56細胞)が可能であった。この戦略は、高度の精製されたCD4⁺CD25⁺細胞集団の作出につながった(図15C)。この細胞のCD25陰性画分は更に、CD25⁺細胞を枯渇し、通常のT細胞対照の単離のための、CD4⁺CD25^-細胞の精製の源として使用した(図15D)。

抗-CD3/CD28ビーズ及びIL-2はTreg細胞増量を促進する。ヒトCD4⁺CD25⁺ Treg細胞は、抗-CD3 mAb又はDCによる刺激に対し過反応性である。しかしこれらは、これらの刺激＋IL-2又はIL-15が与えられた場合には、増殖することができるが、CD4⁺CD25^- T細胞よりもはるかに低い程度である(Jonuleitら、 2001, 前掲, Dieckmannら、2001, 前掲)。従って最初の実験において、精製したCD4⁺CD25⁺細胞を、固定された抗-CD3＋IL-2で増量し、これは2週間で5〜10倍の増量を可能にした。

更に拡大された可能性のある増量のために、同時刺激分子をベースにした刺激を調べた。これを実行するために、抗-CD3及び抗-CD28 mAbが共有結合した細胞-サイズのDynabeadsを使用した(3/28ビーズ)。この試薬は、免疫療法の治験のために通常のT細胞の臨床スケールの増量にうまく使用されており(Levineら、1997, Laportら、2003)、100万倍よりもより大きいT細胞増量が可能であった。しかし極めて劇的なことに、ストリンジェントに精製したCD25⁺Treg細胞は、3/28ビーズ単独の刺激により貧弱に増殖されることが発見された。このことは、CD4⁺CD25^-細胞により作製された激しい反応とは対照的である(図16A)。しかしCD4⁺CD25⁺細胞の弱い反応は、IL-2補充により有意に増大され、この組合せは、ほとんどのドナー由来の軽度のTreg増量に十分であった(図16B)。しかしながらCD4⁺CD25⁺細胞がよりストリンジェントに精製されると、培養物中での増殖は、例え3/28ビーズ及びIL-2による刺激であっても、より不良となる。

CD4⁺CD25⁺ T細胞は、サイトカイン産生欠損を有するように見えるので、通常のT細胞は、この欠損を補償し、増大された増量を提供することが結論付けられた。結果的に、放射線照射されたCD4⁺CD25^--支持細胞が、3/28ビーズ-刺激したTreg培養物に最初に添加され(1:1比)、増殖反応の持続性の増加を提供することがわかった(図16B)。この増加は、100IU/mlのIL-2単独よりも有意に大きかった。興味深いことに、馴化培地(20％v/v)によるTreg培養の補充物(3/28ビーズ刺激の5日後の活性化された通常のCD4⁺CD25^-T細胞に由来)は、支持細胞の作用を大きく(しかし完全ではなく)再現した。このことは、活性化された通常のT細胞は、CD4⁺CD25⁺細胞増量のための可溶性増殖因子を生成することを示唆している(主にIL-2、しかし他の因子の可能性も)。重要なことはこれらの支持細胞を補充した細胞株は、強力なサプレッサー機能を維持したことである。従って3/28ビーズ、IL-2、及びCD4⁺CD25^--支持細胞の使用により、CD4⁺CD25⁺由来の細胞株は、有意な増殖を示し、100倍を超える増量が容易に得られた。

この増量は、古典的S字増殖曲線として生じ、始まりは遅く、1〜2週間にわたり迅速に増量し、その後プラトー相に達する(図16C)。増殖プラトー相に達した後、細胞株はIL-2中に維持され、サプレッサー機能を3〜6週間は保持した。場合によっては、培養物中の細胞株は最大3ヶ月間、強力な抑制活性を有したが、典型的にはサプレッサー機能は経時的に消滅した(示さず)。

MLRアッセイにおけるCD4 ⁺ CD25 ⁺ サプレッサー細胞株の機能評価。全ての細胞株を最初に、2〜3週間の培養後、MLRにおいてサプレッサー活性についてスクリーニングし、その後次の3〜4週間経時的に分析した。サプレッサー機能の評価のために、HLA-ミスマッチのアロ-MLRアッセイを、機能の読み値として使用した。精製し新たに単離されたCD4⁺CD25^-応答性T細胞を、無関係のドナー由来の照射された未熟型DCと反応した。被験細胞(培養したCD4⁺CD25⁺及びCD4⁺CD25^-由来の細胞株)を、0日目に、MLRにレギュレーター/反応細胞比(1:2)で添加した。抑制は、増殖の減少により反映され、対照MLRのピークで、6〜7日目に最も明らかであった。これらのアッセイは、ドナー間で非常に強固かつ一貫しており、その結果この抑制の標準測定として使用した。

CD4⁺CD25⁺細胞由来の大半の細胞株(25中19、76％)は、サプレッサー/反応細胞比1:2で、明らかな抑制機能を有した(＞65％増殖の阻害)(図17A)。対照的に、CD4⁺CD25^-細胞由来の細胞株は、MLRをインバリアントに増大することがわかった(図17A)。残りのCD4⁺CD25⁺由来の細胞株(25中6、24％)は、弱い抑制機能を有した(20〜65％の増殖阻害)。しかしどれもMLRを増大しなかった(図17B)。先の知見と同じく(Jonuleitら、2001, 前掲)、新たに単離されたMACS精製したCD4⁺CD25⁺細胞は、これらのMLRアッセイにおいて、軽度の抑制活性のみを有し、弱いサプレッサー細胞株(20〜65％の増殖阻害)と同等であった(図17B)。重要なことは、抑制性の細胞株の多く(19中9、47％)は、強力なサプレッサー活性を有し、これらの細胞株はMLR培養をほとんど完全に阻害することである(＞90％増殖の阻害)(図3C)。抑制活性のレベルは、各ラインが固有の特徴を有し、弱い又強力な抑制性の細胞株は、複数の独立したMLR実験で試験した場合、数週間の分析にわたり、一貫して同様の活性を有した(下記参照)。

CD4 ⁺ CD25 ⁺ 及びCD4 ⁺ CD25 ^- 細胞株の特徴決定。強力なサプレッサー細胞株を、同じ個体からのCD4⁺CD25^-由来の細胞株と平行して培養し、後者は通常のT細胞対照として利用した。弱い抑制性の細胞株も、特徴決定しかつ比較し、強力な抑制性の細胞株に対し識別する特徴を決定した。興味深いことに、単純に培養における増殖特徴を基にしてサプレッサー機能を予測することはしばしば可能であり、この場合最も迅速に増殖するCD4⁺CD25⁺株は一般に、最低の抑制機能を有した(示さず)。

全ての細胞株は最初に、3/28ビーズによる刺激後、若干典型的な活性化されたT細胞表現型を発現した。これらの細胞株は比較的同等量の活性化抗原を一過性に発現し、これは活性化後2〜3週間かけて迅速に消滅した。これらは、CD122、CD132、GITR(糖質コルチコイド-誘導したTNFレセプター)、OX40(CD134)、及び細胞表面CTLA4 (CD152)を含んだ。しかし培養の数週間後、細胞が比較的静止した場合(IL-2中に維持される)、これらの表現型は明らかに多様になってきた。CD25^-細胞由来のT細胞株と比較し、強力に抑制性のTreg細胞株は、高レベルのCD25を発現し、上昇した発現が維持された。3週間培養後のレベル(MFI 22、対、210)を示した(図18A、18B)。MFIは、平均蛍光強度を意味する。加えてCTLA4の細胞内染色は、サプレッサー細胞株における増強された発現を明らかにした(MFI 8、対、64)(図18D、18E)。CD25及び細胞内CTLA4発現の差異は、本発明者らのCD25⁺由来の細胞株に対する通常細胞を識別した研究において同定された最も明確な表現型特徴であった。弱い抑制性の細胞株は、これらふたつの重要な説明的抗原の中間量を発現した(図18C、18F)。

更に弱い及び強い抑制性の細胞株間の差異を決定するために、追加の細胞表面抗原分析を行った。弱い株と比較して、強力なサプレッサー細胞株においてより高い割合の細胞で発現された3抗原(CD62L、CCR7、及びCD27)の相関関係を記録した(図18G、18H、18I)。機能的関係を更に評価するために、磁気ビーズを使用し、CD62L⁺又はCD27⁺細胞を単離し(最も明るい2抗原)、両方の陽性サブセットにおいてサプレッサー活性について濃厚化されたことを認めた(示さず)。これらの細胞株サブセットの機能をより厳密に決定するために、細胞株を、CD62L⁺/CD27⁺、CD62L⁺/CD27^-、及びCD62L^-/CD27⁺細胞について選別し(図18J)、各集団を、MLRにおいてサプレッサー活性について試験した。

サプレッサー機能は、CD62L⁺/CD27⁺サブセット内のみであった。対照的に、他のサブセットは、MLRを増大することがわかった(図18K)。従ってCD4⁺CD25⁺細胞株は、抑制性及び非-抑制性の細胞の混合物を含むことができ、並びに抑制性の作用は、非-サプレッサーの増強作用を支配することができる。CD62L及びCD27同時-発現を使用し、これらのサブセットを識別し、強力な抑制能のある細胞株(又は細胞株サブセット)の選択を促進することができる。

MLRアッセイにおけるサプレッサー細胞機能の特徴決定。MLRアッセイにおいて抑制の細胞機構を決定するために、強力な細胞株(＞90％の6日目のMLR抑制)を更なる分析のために選択した。これらは最初に、一貫した抑制性であることを示し、その後力価決定し、強力な抑制に必要な最低数を決定した。培養されたTreg細胞がどのくらい広範に反応性であるかを決定するために、いくつかの独立した株を、8種の個別のHLAミスマッチのMLR培養において抑制について試験した。全ての場合において、培養されたTreg細胞は、分析された全てのMLR培養物を顕著に抑制した(図19A)。抑制の大きさには若干の変動が存在したが(平均92％、範囲81〜98％、n＝16)、強力なTreg細胞株は、ほとんど全てのMLR培養の阻害において有効であった。

強力な阻害に必要なサプレッサー細胞の最低数を定量化するために、サプレッサー細胞の力価決定した数を、指標MLR培養物に加えた。力価決定曲線(図19B)は、1:10未満(5,000個サプレッサー対50,000個反応細胞)という、サプレッサー-対-反応細胞比のおおよそのブレークポイントを明らかにしている。この力価決定曲線は、非-線形であることが認められ、低Treg細胞投与量で抑制を無効にする協力作用を示すことが可能である。抑制されたMLRにおいて全ての時点で、増殖はほぼ完全に損なわれ、このことは、サプレッサー作用は最初の3日以内に生じる、すなわち、MLRにおいて増殖がバーストする前に生じることを示している。より早期の作用を評価し、及び免疫応答の質の変動を可能性のある調節細胞について調べるために、MLR上清を、サイトカイン含量について調べた。そこには、サイトカイン蓄積の明らかな抑制が存在した。抑制されたMLRは、IL-2の最小の検出可能な小さい早期の波を作り(アッセイ感度の閾値で)、検出可能な遅い産生は伴わなかった(図19C)。対照MLRは、上清中のIL-2蓄積を顕在化したので、培養開始後例え1日であっても、サプレッサー作用は、検出可能であり、抑制されたMLRの1日目と同様に早くに既に際だっていた。加えて、例えばTNF-α、IFN-γ、GM-CSF、及びIL-6のような、後期サイトカインの蓄積(典型的には5〜7日目にピーク)は、培養を通じてほぼ完全に妨げられた(図19D)。サイトカイン上清が、少量(50〜100μl)で複数のサイトカインを同時に試験するために十分なLuminex装置で分析される場合、IL-4又はIL-10の誘導は生じず、これはTH2又はT-調節1型(Tr1:IL-10産生)分化の逸脱(deviation)を示している。実際、IL-10蓄積は、十分に防止された。

MLRにおいて反応性T細胞の早期反応性を試験するために、細胞を、活性化マーカー発現についてフローサイトメトリーによりアッセイした。HLAA2陽性ドナー由来の反応細胞、及びHLA-A2陰性ドナー由来のサプレッサー細胞を使用し、反応する細胞は、同時-培養時に識別することができた。対照及び抑制されたMLR細胞は、培養開始後24又は48時間でCD69、CD25、及びOX40 (CD134)の誘導について評価した。対照MLRにおいて、反応性T細胞の2〜4％が、これらの活性化抗原の発現を示し(図20A-C)、HLA-ミスマッチMLRの予想されたアロ反応性T細胞頻度と一致した。注目すべきことに、抑制されたMLRにおいて、ごくわずかな反応性T細胞が、これらの活性化抗原の発現を示した(図20D-F)。これらのデータは更に、Treg細胞作用の機序としての、T細胞活性化の非常に初期のブロックを示している。

抑制の効力は、MLR刺激するDCが活性化又は成熟型である場合、明らかに維持された。DCのリポポリ多糖(LPS)、TLR4リガンド、又は腫瘍壊死因子/ポリCの組合せ、二本鎖RNAアナログ-TLR 3リガンドによる成熟化/活性化(Spisekら、2001, 前掲；Godfreyら、2004, 前掲)は、抑制の迂回には繋がらなかった(図20G)。MLR培養物中のLPS又はTNF/ポリICの含有も、抑制を迂回しなかった。従って培養されたヒトTreg細胞は、非常に強力な活性化されたDCであり、これは豊富な共刺激分子及びサイトカインを発現し、それらの抑制作用を迂回することができない。

MLRの強力かつ早期の阻害は、APC不活化又は可能性のある抑制の機能としての除去(elimination)を示唆している。しかし鏡検評価では、DCは培養期間中は持続するように見える。加えてこのサプレッサー細胞株は、クロム放出アッセイにおいて、同種異系DCへの細胞傷害性(図21A)又はNK/LAK感受性のある標的(K562)(図21B)を有さなかった。

公知の免疫抑制因子が培養されたTreg細胞の作用を媒介するかどうかを決定するために、IL-10又はTGF-βを中和することが可能な抗体を、対照及び抑制されたMLR培養物に添加した。抑制作用の効力のために、より少ない数のサプレッサーを添加し、抑制の逆行に対しより感度の良いアッセイを作製した。この低下にもかかわらず、IL-10、IL-10R-α、又はTGF-β₁₂₃に反応性の抗体は、抑制を逆行することに失敗し、3種全ての抗体を一緒にしたものは非常に弱い作用を有した(図21C)。投与量1、10、又は20μg/mlを試験し、最高投与量レベルでのみ作用が注目された。

加えてトランス-ウェル試験を行い、Treg細胞により放出された可溶性因子が、抑制を運搬する(convey)ことができるかどうかを決定した。インジケーターMLR細胞は、0.4μm細孔を持つメンブレンで分離された、静止もしくは活性化されたTreg細胞又は抑制されたMLR培養物上で培養した。このメンブレンを通過する抑制作用は、認められなかった(示さず)。重要なことに、培養されたTreg細胞が、サプレッサーとして同一ドナーに由来したが依然反応性T細胞に対し同種異系であるAPCにより駆動されたアロ-MLRへ添加された時は、最低の抑制が認められた(図21D)。従ってドナーAに由来した培養されたTregが同じドナーA由来のDCにより駆動されたアロ-MLRへ添加された場合、最低の抑制が存在した。しかしこれらの同じTreg細胞が、ドナーB由来のDCにより駆動されたMLRへ添加される場合、これは抑制を生じる。これらの結果は、培養されたTreg細胞は、全てのMLRで構成的に抑制性ではないことを示している。培養されたTregは、アロ-DCにより提供され得る特異的に追加された刺激のいくつかの形が必要である(自家DCによらない)。

まとめると、この実施例は、サプレッサー細胞は、ヒト血液から単離し及び培養増量することができることを明らかにしている。重要なことに、これらの培養されたTreg細胞は、100倍を超えて増量することができ、純粋な場合、増強されかつ強力な抑制活性を発現する。事実、MLRアッセイにおけるこれらの細胞の抑制性の機能は、HLAミスマッチのMLRをほぼ完全にブロックすることが示された。更にこれらの培養-増量されたサプレッサー細胞は、新たに単離されたCD4⁺CD25⁺ Treg細胞の代表的特徴の多くを有する。これらは、CD25及び細胞質CTLA4を高度に発現し、それらの活性は、細胞-細胞接触に依存し、並びに抑制は、細胞溶解活性又は免疫抑制性のサイトカインであるIL-10もしくはTGF-βに左右されるようには見えない。

加えて、これらのデータは、Treg細胞の活性化及び増量に関する抗-CD3/28 mAb被覆されたビーズ-ベースの方法の実行可能性を最初に明らかにしたものである。サプレッサー細胞株は、DCとの直接同時-培養において増殖性に反応しない。抗-CD28が抗-CD3 mAbと組合せられる場合、より効果的な増量戦略が生じる。抗-CD3/CD28 mAb-被覆したビーズ-ベースの及びIL-2を補充した活性化にもかかわらず、ストリンジェントで精製したCD4⁺CD25⁺細胞(又はFACS選別されたCD4⁺CD25⁺ bright細胞)は、十分に増殖しなかった。増殖は、IL-2及び他の増殖因子を提供する、CD4⁺CD25^-支持細胞の添加により改善された。CD4⁺CD25⁺細胞株の増殖及びサプレッサー機能は、変動性でありかつ反比例し、これはおそらく貧弱なサプレッサー機能を伴う細胞株が、CD4⁺CD25⁺培養物中の少数の通常のT細胞の包含から生じたためであろう。よりストリンジェントに精製した細胞由来の細胞株は、十分に増殖しなかったが、より強力なサプレッサーであった。加えて、弱い抑制性の細胞株の免疫表現型(CD25中等度(moderate)、及び分割(split)CD62L又はCD27)は、通常の細胞と抑制性の細胞の混合集団と一致した。しかし培養後に、機能活性のあるサプレッサー細胞は、専らCD62L及びCD27発現集団内にあり、及び強力なサプレッサー細胞株はこれらの抗原をほぼ均一に発現したことが認められることは興味深い。

重要なことに、CD4⁺CD25⁺細胞のサプレッサーエフェクター機能は、MHC-制限されず、及びこれらのサプレッサー細胞は、事実上あらゆるドナー組合せからの応答を損なうであろう。このHLA拘束の喪失も、サプレッサー細胞の作出に第三の組(同種異系)のドナーを使用する可能性を開く。現在明らかにされた概念及び機構をヒト疾患の病因に適用し、ex vivo処置のためのTreg細胞の単離し、及びTreg細胞を本発明に従い長期間培養-拡大し、引き続き得られた培養されたTreg細胞を患者へ注入することは、自己免疫応答を治療する方法又は骨髄もしくは他の移植の転帰を改善する方法をもたらす。多数の培養されたTreg細胞の利用可能性は、これらの重要な細胞のより詳細な免疫学的、生化学的、及び分子上の特徴決定を可能にするであろう。しかしおそらくより重要なことに、本方法は、GMP条件に適合可能であるので、臨床試験がまもなく実行され、培養されたTreg細胞は免疫抑制治療の新規形態として許可されるであろう。

本願明細書において引用又は説明された特許、特許出願、公開の各々の開示は、それらの全体が本願明細書に参照として組入れられている。
前記明細書は、ある好ましい態様に関して説明されているが、多くの詳細は、例示することを目的として示されており、当業者には、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限りは、本発明は様々な修飾及び追加の態様を施すことができ、かつ本願明細書に説明されたある詳細は、本発明の基本原理から逸脱しない限りは変動することができることは明らかであろう。このような修飾及び追加の態様も、添付された「特許請求の範囲」内であることが意図されている。

図1は、フローサイトメトリーにより決定された、肺癌腫瘍標本から単離された総CD4⁺細胞中に存在するCD4⁺CD25⁺リンパ球の頻度(％)を、肺癌患者の末梢血リンパ球(PBL)と比較し、図示している。分布及び平均を示している：健常ドナーのPBL、n＝7[左]；NSCLC患者由来の未刺激の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、n＝8[中央]；又は、NSCLC患者由来の未刺激のPBL、n＝9[右]。P値は、スチューデント両側t検定を用いて算出した。 図2A-2Bは、腫瘍浸潤CD4⁺CD25⁺細胞において認められた増加したCTLA-4発現を図示している。図2Aは、CD4⁺CD25^-及びCD4⁺CD25⁺ TIL及びPBMCにおいてCTLA-4発現を示している2名の代表的患者由来のフローヒストグラムである。図2Bは、5例の継続的NSCLC患者からのCD4⁺CD25^-腫瘍浸潤リンパ球(左)、CD4⁺CD25⁺腫瘍浸潤リンパ球(中央)、及びCD4⁺CD25⁺末梢血単核細胞(PBMC)(右)におけるCTLA-4を発現している細胞の平均(±S.E.)百分率を示す。 図3A-3Bは、腫瘍浸潤CD4⁺CD25⁺細胞による、抗-CD3又は抗-CD3/CD28誘導した自家T細胞増殖の直接阻害を図示する。自家PBLを、単独で、又は肺癌標本由来の漸増数の選別精製したCD4⁺CD25⁺もしくはCD4⁺CD25^-腫瘍浸潤リンパ球(TIL)と共に培養し、これらの細胞を、可溶性又はプレート結合した抗-CD3(図3A)又はプラスチック固定された抗-CD3/CD28(図3B)で刺激し、及び[³H]チミジン取込みを測定した。結果は、PBL単独培養されたものの％反応として表した；CD25^-プロットの100％増殖＝37081±4094cpm、及びCD25⁺プロットの100％増殖＝29465±1007cpm。 図4A-4Dは、腫瘍浸潤CD4+CD25+細胞が、同種異系性健常ドナー又は肺癌患者由来のT細胞の抑制に失敗したことを示している。健常ドナー由来の同種異系性末梢T細胞(図4A)又はNSCLC患者由来の自家PBL(図4B)を、指定された数の癌患者由来の腫瘍浸潤CD4⁺CD25⁺細胞と共に培養した。図4Cにおいて、健常ドナー由来の末梢血T細胞を、自家選別精製した末梢血CD4⁺CD25⁺ドナーT細胞と共に培養した。図4Dにおいて、腫瘍浸潤CD4⁺CD25⁺又はCD4⁺CD25^-細胞を、NSCLC患者由来の同種異系性PBLと共に培養した。全ての細胞培養は、プレート結合した抗-CD3/CD28で刺激し、及び[³H]チミジン取込みを測定した。結果は、各実験が同様の結果を示した、3回(図4A)、2回(図4B)、2回(図4C)、又は4回(図4D)の独立した実験のひとつについて、3つ組の培養の平均(±S.E.)で表している。 図5A及び5Bは、腫瘍浸潤CD4⁺CD25⁺細胞による構成的TGF-β分泌は、自家PBL増殖の阻害には不要であることを示している。図5Aは、TGF-βについて試験した肺癌患者由来のCD4⁺CD25⁺細胞及びCD4⁺CD25⁺細胞の枯渇されたCD3⁺細胞の培養物からの上清のELISAである。結果は、6名患者中の代表1名(3つ組ウェルに関する±S.E)である。図5Bにおいて、自家PBLは、単独で、又は変動数のCD4⁺CD25⁺細胞と共に培養し、及びプレート結合した抗-CD3/CD28で刺激した。抗-TGF-β中和抗体を添加し、及び[³H]チミジン取込みを測定した。結果は、同様の結果を得た2回の個別の実験の一方について、3つ組培養の平均(±S.E.)で表した。 図6A及び6Bは、CD4⁺CD25⁺細胞の枯渇は、GVHD致死性を促進することを図示している。全CD4⁺又はCD25-枯渇されたCD4⁺B6 T細胞を、致死量以下で照射されたbm12レシピエントへ移入した(図6Aにおいて、1x10⁵個細胞を動物1匹に投与した；図6Bにおいて、5x10⁴個細胞を動物1匹に投与した)。x-軸＝細胞移入後の日数；y-軸＝レシピエント生存率。n＝8/群。図6A、p＝0.024；図6B、p＝0.0068。 図7は、CD4⁺CD25⁺細胞の枯渇は、異なる系統の組合せでGVHD致死性を促進することを図示している。B6 BM及び全CD4⁺ T細胞又はCD25-枯渇され(CD25^-)CD4⁺ T細胞のいずれかを、致死的に照射されたBALB/cマウスに移植した。x-軸＝移植後の日数；y-軸＝レシピエントの割合。n＝8/群。p＝0.016。 図8は、非-照射SCID GVHDモデルにおいて、全T細胞接種材料由来のCD25⁺細胞の枯渇は、GVHDを促進することを図示している。全又はCD25^-枯渇されたB6 T細胞を、抗-アシアロGM1で先にNK-枯渇された非-照射BALB/c SCIDマウスに注入した。x-軸＝細胞移入後の日数；y-軸＝レシピエント生存率。n＝4/群。p＝0.021。 図9は、全脾臓由来のCD25⁺細胞の枯渇は、GVHD死亡率の促進を生じることを図示している。致死的に照射されたB10.BRマウスに、B6 BM及び15x10⁶個の全脾臓又はCD25-枯渇された脾臓のいずれかを移植した。x-軸＝細胞移入後の日数；y-軸＝レシピエント生存率。n＝8/群。p＝0.055。 図10は、CD25⁺細胞の移植前in vivo枯渇は、GVHDを促進することを図示している。抗-CD25モノクローナル抗体(mAb)-処置した又は対照mAb-処置した胸腺切除術を受けたB6マウスに、致死的に照射しBALB/c BM及び15x10⁶個脾細胞を移植した。抗-CD25 mAbを、移植日に対し-10、-7及び-4日目に投与した。x-軸＝細胞移入後の日数；y-軸＝レシピエント生存率。n＝8/群。p＝0.0063。 図11は、ex vivo増量された及び活性化されたCD25⁺細胞は、GVHDを阻害することを図示している。ナイーブB6 CD4⁺T細胞を、非-照射のNK-枯渇されたBALB/c SCIDレシピエントへ注入した。マウスのコホートは、活性化されたCD4⁺CD25⁺細胞又はCD4⁺CD25^-細胞の個別の注射を受け取った。細胞は、固定された抗-CD3 mAb及び高投与量IL-2により、活性化され及び増量された。x-軸＝細胞移入後の日数；y-軸＝レシピエント生存率。n＝8/群。p＝CD4⁺、対、CD4⁺＋CD25⁺について0.022。 図12は、異なる条件下で培養されたCD25⁺細胞は、GVHDを阻害することを図示している。CD25-枯渇された(CD25^-)B6 T細胞を、非-照射のNK-枯渇されたBALB/c SCIDレシピエントへ注入した。マウス第二群は、固定された抗-CD3 mAb及び高投与量IL-2と共に、図11のように増量されたCD25⁺細胞の個別の注射を受け取った(□)。マウス第三群は、照射したBALB/c脾細胞及び高投与量IL-2と共に、培養されたCD25⁺細胞の個別の注射を受け取った(△)。マウス第四群は、照射したBALB/c脾細胞、低投与量IL-2及びTGF-βと共に、培養されたCD25⁺細胞注射を受け取った(☆)。x-軸＝細胞移入後の日数；y-軸＝レシピエント生存率。n＝6/群。全てのp値≦0.016(対照群(●)と比較)。 図13は、活性化され増量されたCD4⁺CD25⁺細胞の反復注入は、完全なMHC-不対応(disparate)ドナー移植片の致死的に照射されたレシピエントにおいて、GVHD死亡率を抑制することを図示している。 図14は、GVHD発症後の、活性化され及び増量されたCD4⁺CD25⁺細胞の単回注入は、致死的に照射されたレシピエントの40％を、長期間(対照群よりも少なくとも3倍長い期間)GVHD死亡から救済することを図示している。 図15A-15Dは、PBMC及び精製されたCD4⁺CD25⁺及びCD4⁺CD25^-細胞の代表的2色FACSプロットを用い、末梢血からのCD4⁺CD25⁺細胞の精製を示している。図15Aは、末梢血の試験の結果が、CD4⁺CD25⁺細胞は、PBMCの1〜3％を構成することを明らかにすることを示している。一般に低い強度の発現である、CD25を発現する非-CD4+細胞が様々な数存在する(ほとんどB細胞)。図15Bは、一部のドナーはより明確なCD4⁺CD25⁺集団を証明することを示している。図15Cは、抗-CD25-FITC及び抗-FITC切断可能なマイクロビーズにより精製され、引き続き系統枯渇されたCD4⁺CD25⁺細胞を示す。CD25-PE染色の強度は、抗-CD25-FITCによる染色前に、わずかに低下した。図15Dは、PBMCのCD25枯渇、引き続きのCD4+陽性選択により精製された、CD4⁺CD25^-細胞を示している。データは、20種のドナー評価、及び10回の細胞精製実験の代表である。 図16A-16Cは、短期間アッセイにおけるCD4⁺CD25⁺細胞の増殖に関連した、CD4⁺CD25⁺サプレッサー細胞株の増量、及び長期間の培養における蓄積を図示している。図16Aは、短期間96ウェル³H-チミジン取込みアッセイにおける、高度に精製されたCD4⁺CD25^-細胞(△)及び二重カラム-系統陰性CD4⁺CD25⁺細胞(■)の増殖を示している。CD4⁺CD25^-細胞は顕著に増殖したが、CD4⁺CD25⁺細胞は最低かつ一過性に増殖したのみであった。図16Bは、短期間96ウェル³H-チミジン取込みアッセイにおける、高度に精製された二重カラム-系統陰性CD4⁺CD25⁺細胞(■)の増殖の増加を示している。100IU/mlのIL-2は、増量を増加する(◆)。しかし照射したCD4⁺CD25^-支持細胞補充(1:1比)(●)は、増加した増量を提供し、これはより持続した。4回の実験の代表。図16Cは、CD4⁺CD25⁺細胞株の長期間培養の蓄積を示している。細胞株は、1回抗-CD3/抗-CD28 mAb-被覆したビーズ(□)、又は固定された抗-CD3(■)で刺激し、両方とも支持細胞を補充した。細胞は、必要に応じ、3〜4日毎に分離し、IL2を供給した。データは、細胞数の数倍の増量を報告しており、これは抗-CD3/CD28 mAb-被覆したビーズについては22培養の及びプラスチック-固定された抗-CD3 mAbについては3培養の代表である。 図17A-17Cは、MLRを顕著に抑制する精製され培養されたCD4⁺CD25⁺細胞を示している。MLR培養物は、(1:2)サプレッサー/反応細胞比で、様々な被験細胞集団を含む。1週間のMLRについて、増殖速度曲線を示した。培養物には、毎日(³H)-チミジンで、培養の最後の16時間パルスした。図17Aは、CD4⁺CD25⁺細胞由来の代表的細胞株(二重カラム-系統枯渇精製)は良好なサプレッサーであることを示す(●)。対照的に、CD25^-細胞由来の細胞株(△)は、対照MLR培養(□)に比べ、MLRを増加した。結果は、22回の実験の代表である。図17Bは、MLRに添加した、新鮮な標準MACS精製されたCD4⁺CD25⁺細胞(◆)を、代表的な弱い抑制性の弱いCD4+CD25+細胞株(●)、対対照MLR(□)と比較して、示している。結果は、4回の実験の代表である。図17Cは、MLR反応は、強力な抑制性の培養されたCD4⁺CD25⁺細胞(●)の添加により、対照MLR(□)と比べ、ほぼ完全にブロックされたことを示している。14回のMLRで試験した、7種の強力なサプレッサー細胞株の代表。 図18A-18Kは、3〜4 週間の培養増量後の、CD25⁺、対、CD25^-細胞株のフローサイトメトリー比較を提示している。抗原発現は、FACS分析によりプロファイリングした。CD25^-由来の細胞株の代表的プロットが、強力なサプレッサー細胞株、及び抑制性の弱い細胞株と比較して示された(図18A-18C)。図18Aは、CD25^-細胞由来の細胞株は、より静止した状態へ戻るにつれ、低レベルのCD25を発現することを示している。図18Bは、強力なサプレッサー細胞株は、高レベルのCD25発現を維持することを示している。図18Cは、弱いサプレッサー機能を有するCD4⁺CD25⁺細胞由来の細胞株は、中間レベルのCD25を発現することを示している。(図18D-18F)。図18Dは、CD4⁺CD25^-由来の細胞株は、最低の細胞内CTLA4を発現することを示している。図18Eは、強力なサプレッサー細胞株は、CTLA4の高い細胞内発現を維持することを示している。図18Fは、弱いサプレッサー株は、中間レベルを発現することを示している。(図18G-18I)図18Gは、CD25^-由来の細胞株は、様々なレベルのCD62Lを発現し、及びCD27を減らすことを示している。図18Hは、強力なサプレッサー細胞株は、CD62L及びCD27の両方を発現する細胞をより高い割合で含むことを示している。図18Iは、弱いサプレッサー細胞株は、CD62L及びCD27を発現する細胞をより低い割合で含むことを示している。図18J-18Kは、サプレッサー細胞株サブセットの細胞選別が、強力なサプレッサー細胞は、CD62L及びCD27を発現することを明らかにすることを示している。図18Jは、CD62L及びCD27サブセットの選別ゲートを示す、FACSプロットである。図18Kは、MLRの機能分析を提示し、CD62L及びCD27二重陽性サブセット内にのみサプレッサー活性を明らかにしている(ストライプバー)。対照MLR培養(灰色バー)及び抑制されたMLR(黒色バー)。図示されたように、CD62L+/CD27-サブセット(レンガ状バー)、及びCD62L^-/CD27^-サブセット(編み目状バー)は両方とも、MLRを増加する。 図19A-19Dは、培養されたCD4⁺CD25⁺細胞は、一貫しかつ顕著にMLR増殖及びサイトカイン分泌を抑制することを図示している。強力なCD25⁺サプレッサー細胞株は、様々な無関係のドナー由来の複数のMLRで試験した。図19Aは、対照及び抑制された増殖の分散を示す、8種の個別のMLRを示している。ほとんど全てのドナー組合せにおいて、これは著しく損なわれた。対照MLR培養(灰色バー)及び抑制されたMLR(黒色バー)。結果は、7種の異なる強力なサプレッサー細胞株による、20を超える実験の代表である。図19Bは、阻害に必要な最低数を決定するために、強力な培養されたサプレッサー細胞の段階的数がMLR反応に加えられた場合の作用を示している。最も強力なサプレッサー細胞株を使用した場合、最大1:16希釈(おおまかに3,125サプレッサー)は、依然MLRを著しく損なった。6種の強力なサプレッサー細胞株の代表である3種のプロットを示した。図19Cは、培養上清中のIL-2レベルの毎日の評価を提示し、これは対照MLR培養物(□)と比べ、抑制されたMLR培養物(●)におけるIL2蓄積の顕著なブロックを明らかにしている。4回のMLR分析の代表。図19Dは、活性化されたT細胞により産生された他のサイトカインの評価を示しており、これは蓄積の著しい欠損を明らかにしている。TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-6又はIL-10の有意水準は、得られなかった。対照MLR培養物(明色バー)、対、抑制されたMLR培養物(暗色バー)の蓄積のピークである、6日目のレベルを示した。4回のMLR分析の代表である。 図20A-20Gは、反応性T細胞の活性化を損ない、かつ成熟型DCにより駆動されたMLRを抑制することができる、培養されたTreg細胞を示す。MLRは、培養の1日後に、活性化抗原の発現について評価した。図20AはCD69で、図20BはCD25で、及び図20CはOX40(CD134)で染色した対照MLRを示している。抑制されたMLRにおいて、反応性T細胞は、最初にHLA-A2上でゲートされ、それらを、HLA-A2陰性サプレッサー細胞から識別した。図20DにおいてCD69で、図20EにおいてCD25で、及び図20FにおいてOX40(CD134)で染色された抑制されたMLRから反応細胞を個別に示した。結果は、3回の実験の代表である。図20Gは、LPS又はTNF/ポリIC組合せによるMLR前の、DCの成熟、又はMLRにおいてこれらの刺激因子の封入体は、抑制を迂回することに失敗したことを示している。対照MLR培養物(灰色バー)及び抑制されたMLR(暗色バー)。 図21A-21Dは、MLRにおける抑制の機能分析の結果を図示している。図21Aは、クロム放出アッセイにおいて、サプレッサー細胞株はDCに関する有意な細胞傷害性を欠いていることをことを示している(●)。NK細胞株NK92により媒介された対照溶解液(□)。図21Bは、サプレッサー細胞株は、ナチュラルキラー(NK)又はリンホカイン活性化されたキラー(LAK)型活性を欠いており、及びクロム放出アッセイにおいて、K562に対する溶解活性を示さない(●)ことを示している。NK細胞株NK92により媒介された対照溶解液(□)。5,000個の標識された標的を、図21A及び21Bの両方において使用し、各々において最大20:1エフェクター/標的比であった。図21Cは、MLRアッセイにおいて、免疫抑制性因子IL-10及びTGF-βに対する中和抗体、更には抗-IL-10R、又はこれら3種全ての組合せを使用し、各々培養されたサプレッサー細胞株により媒介された抑制に逆行することに失敗したことを示す。図21Dは、サプレッサーに対し自家である(及び応答に対し同種異系である)DCにより駆動されたMLRに加えられた、強力なサプレッサー細胞株は、最低の阻害活性を有することを示す。サプレッサー細胞株Ts-A(クロス-ハッチバー)は、DC-A(サプレッサーと同じドナー由来)又はDC-B(サプレッサーと異なるドナー由来)により駆動されたMLR培養を抑制するために使用した。サプレッサー細胞株Ts-B(チェッカーバー)も、DC-A及びDC-Bに対して試験した。4回の実験の代表。

Claims (22)

1. 増強された抑制活性を有する治療用ヒトレギュラトリーT細胞(Treg細胞)を調製する方法であって、
   CD4⁺ T細胞の試料を選択する工程、並びに、
   該試料からヒトCD4⁺CD25⁺サプレッサーT細胞集団を単離し、及びGMP-承認された方法によりCD4⁺CD25⁺細胞をex vivoにおいて長期間培養-増量し、これにより単離された培養-増量された細胞における強力な長期間のサプレッサー活性を活性化する工程、
   を含み、増量前には、CD4⁺CD25⁺サプレッサー細胞の天然の集団が、全ての単離されたCD4⁺ T細胞集団で低い割合を示すことを特徴とする方法。
2. CD4⁺CD25⁺細胞の単離が、高レベルのストリンジェンシーを含む、請求項1記載の方法。
3. 前記CD4⁺CD25⁺細胞の単離が、集団内のCD4⁺CD25^bright細胞を実質的に増強する一方で、集団中のCD25^dim細胞を実質的に枯渇することにより、単離体を精製する工程を更に含む、請求項2記載の方法。
4. 前記精製法が、単離体を、複合された抗-CD25磁気マイクロビーズと、予め決定されたビーズ/細胞比で接触させる工程、並びにビーズ-結合した細胞を分離するためにビーズ/細胞組成物を磁気カラム上を流し、洗浄し、及び第二の磁気カラム上で再溶出し、及び非サプレッサー細胞の＜1〜2％が精製された単離体中に残存するまで再洗浄することにより精製する工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
5. CD4⁺CD25⁺細胞の培養-増量が、二工程及び切断可能な細胞-サイズの抗体-被覆された磁気マイクロビーズを使用する第二世代の系統枯渇プロトコールにより、単離された細胞を活性化し、これにより培養-増量されたTregサプレッサー細胞を、ヒトにおける免疫応答又は自己免疫応答の治療的抑制を実現するのに有効量のサプレッサー細胞が細胞培養物中に存在するまで、十分な期間増幅する工程を含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
6. マイクロビーズが、CD3及びCD28に対する抗体により被覆され、これにより低増殖性のサプレッサーTreg細胞の活性化及び増殖を増強する、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
7. IL-2による細胞の培養-増量のための培地を補充することを更に含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
8. 培養の14日以内に細胞の少なくとも10〜20倍の増量を実現することを更に含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
9. 更に1〜2週間細胞を培養することにより、細胞の少なくとも100倍の増量を実現することを更に含む、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
10. 長期(log term)ダウンレギュレーションするサプレッサー機能を保持するサプレッサー細胞株を作出することを更に含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
11. 試料が、末梢血単核細胞、末梢血リンパ球、脾細胞、腫瘍-浸潤リンパ球及びリンパ節細胞、並びに骨髄及び末梢骨髄細胞からなる群より選択される、全て又は部分的に精製された血液又は造血細胞からなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
12. 請求項1〜11のいずれか1項記載の方法により作出された、活性化され及びex vivo培養-増強されたサプレッサーTreg細胞の集団であって、サプレッサー機能が長期間保持され、及び増量された細胞数がヒトにおける効果的治療に十分である、集団。
13. 請求項1〜12のいずれか1項記載の方法により製造された、活性化され及びex vivo培養-増強されたサプレッサーTreg細胞の集団であって、サプレッサー細胞が最初に高レベルストリンジェンシーで精製され、並びにサプレッサー機能が長期間保持され、及び増量された細胞数がヒトにおける効果的治療に十分である、集団。
14. アロ反応性T細胞増量及びサイトカイン産生を阻害する方法であり、該アロ反応性T細胞を、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法により作出された活性化された長期間ex vivo培養-増量されたTreg細胞と接触する工程を含む、方法。
15. CTL活性を阻害する方法であり、該細胞を、請求項1〜13のいずれか1項記載の方法により製造された活性化された長期間ex vivo培養-増量されたTreg細胞と接触する工程を含む、方法。
16. 患者において免疫抑制性の作用を実現する方法であって、アロ反応又は自己免疫応答を有する該患者へ、請求項1〜13のいずれか1項記載の方法により製造された活性化された長期間ex vivo培養-増量されたTreg細胞を有効量投与し、該応答の治療的抑制を実現する工程を含む、方法。
17. 患者におけるin vivoアロ反応又は自己免疫応答を抑制、ブロック又は阻害することを更に含む、請求項14〜16のいずれか1項記載の方法であって、該アロ反応又は自己免疫応答を有する該患者へ、活性化された長期間ex vivo培養-増量されたTreg細胞を有効量投与する工程を含む、方法。
18. 患者の応答が、組織移植後であり、前記方法が、患者における移植片-対-宿主疾患を抑制、ブロック又は阻害することを更に含む、請求項14〜16のいずれか1項記載の方法。
19. 患者において予防治療的作用を実現する方法であって、該患者へ、アロ反応又は自己免疫応答の開始前に、請求項1〜13のいずれか1項記載の方法により製造された活性化された長期間ex vivo培養-増量されたTreg細胞の有効量を投与し、該応答を防止する工程を含む、方法。
20. 患者においてin vivoアロ反応又は自己免疫応答を防止することを更に含む、請求項19記載の方法であって、該患者へ該応答の開始前に、活性化された長期間ex vivo培養-増量されたTreg細胞の有効量を投与する工程を含む方法。
21. 患者が、組織移植の前、途中、又は直後に治療され、前記方法が、患者における移植片-対-宿主疾患の開始を防止することを更に含む、請求項19記載の方法。
22. 患者が、組織移植の前、途中、又は直後に治療され、前記方法が、患者における移植された組織の拒絶反応をブロックすることを更に含む、請求項19記載の方法。

Images