JP7084304B2 - 細胞表面シグナル及びシグナル比を変えることによる、異なるｔ細胞亜集団の選択的増殖の方法 - Google Patents

細胞表面シグナル及びシグナル比を変えることによる、異なるｔ細胞亜集団の選択的増殖の方法 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、特に、増殖されたＴ細胞集団の組成物、Ｔ細胞集団を増殖させるための方法、及びそのような細胞集団を使用するための方法に関する。いくつかの態様において、本発明は、混合Ｔ細胞集団中に存在するＴ細胞亜集団の選択的増殖のための組成物及び方法、ならびに本発明の方法によって産生されたＴ細胞亜集団に関する。
発明の背景
例えば、種々のがんまたは感染生物と関連した抗原の構造を認識するＴ細胞の能力は、α（アルファ）鎖及びβ（ベータ）鎖またはγ（ガンマ）及びδ（デルタ）鎖の両方でできたＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）によってもたらされる。これらの鎖を構成するタンパク質は、ＴＣＲの途方もない多様性を生成するための固有の機構を用いるＤＮＡによってコードされる。この多サブユニット免疫認識受容体は、ＣＤ３複合体に関連し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びＩＩタンパク質によって提示されるペプチドに結合する。ＡＰＣ上の抗原ペプチドに対するＴＣＲの結合は、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の接触の時点で免疫シナプスにおいて生じる、Ｔ細胞活性化における中心的事象である。Ｔ細胞活性化を維持するために、Ｔリンパ球は、典型的に、第２の共刺激シグナルを必要とする。共刺激は、典型的には、Ｔヘルパー細胞がクローン増殖を誘導するのに十分なサイトカインレベルを産生するために必要である。外因的に投与されたサイトカイン及び細胞表面タンパク質の刺激を利用して、Ｔ細胞は、生体外で増殖及び活性化され得る。
生体外で増殖されたＴ細胞は、翻訳研究、ならびにがん及び日和見感染の免疫療法の臨床試験において、ならびに移植後の自己免疫及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するために、広く使用されている。生体外で増殖されたＴ細胞の投与は、いくつかの良好な臨床結果を生み出したが、種々のＴ細胞生成物を大量に製造することの複雑さは、依然としてより広い用途における主な制限である。初期の生体外培養条件は、高いＴ細胞数のみを目的とし、低い生体内増殖性を有する好ましくない表現型を発現する細胞をもたらしたが、より良好な生体内での生着、増殖、及び機能性を有するＴ細胞を生成するプロトコルに焦点が移っている。
これらの初期のプロトコルのうちの一部は、Ｔ細胞の活性化及び増殖においてＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳ（商標）を使用した。この方法は、より分化されていない表現型を示すＴ細胞の集団を産生し得、かつ様々な生体内モデルにおいて、可溶性抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ－３）及びＩＬ－２を用いて増殖したＴ細胞と比較して、抗腫瘍活性の増加及び優れた持続性を示し得る。ＣＤ３及びＣＤ２８結合及び／またはシグナル伝達の組み合わせを使用した同様のプロトコルを、ポリクローナルＴ細胞の単離及び活性化に使用することができる。しかしながら、それらは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びウイルス特異的Ｔ細胞などの抗原経験メモリーＴ細胞の最適な活性化をもたらさない。
初代Ｔ細胞活性化シグナルの質及び量、ならびに共刺激性リガンド、サイトカイン、及び成長因子の存在及び種類は、Ｔ細胞に送達されシグナル全体を決定し、最終的には、活性化Ｔ細胞の運命に影響を及ぼす。かかる抗原経験Ｔ細胞の増殖の成功は、ＴＣＲ／ＣＤ３を介した刺激の適切な強度、及び最適な共刺激シグナル及びサイトカインの提供に左右される。いくつかの報告は、比較的強力なＣＤ３シグナル伝達能力の使用が、ナイーブＴ細胞を主に増殖させることを示しており、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）により抗原経験Ｔ細胞を除去すると考えられている（Ｋａｌａｍａｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２７：４０５（２００４）（非特許文献１））。抗原経験メモリーＴ細胞及びそれらの様々なサブセットは、がん、自己免疫障害、炎症性疾患、アレルギー性疾患、及び感染性疾患の治療における広い範囲にわたる治療と関連がある。したがって、抗原経験メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、及びＴｈ１７細胞等の特異的免疫亜集団を増殖させるための、信頼性が高く効率的かつ迅速な手法の必要性が長きにわたり存在する。
本発明は、一般的なＴ細胞集団からの特異的なＴ細胞亜型の亜集団の特異的増殖のためのこの必要性に対処し、さらなる利点もまた提供する。
Ｋａｌａｍａｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２７：４０５（２００４）
本発明は、特に、様々なＴ細胞亜集団の選択的増殖のための組成物、及び方法を提供する。これらのＴ細胞亜集団としては、（１）免疫応答の調節のために重要なＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の抑制サブセットであるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、（２）宿主防御を調節し、組織の炎症及び様々な自己免疫疾患に関連があるＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の炎症性サブセットである、Ｔｈ１７細胞、ならびに（３）以前曝露された抗原に対して免疫を保持する、長期間持続する細胞型であるメモリーＴ細胞、または抗原特異的Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上述のＴ細胞亜集団の各々の選択的増殖のための方法及び組成物を本明細書に開示する。本発明はまた、治療的使用（例えば、養子免疫療法、生体内注入等）に十分な数のＴ細胞亜集団を提供する。本明細書に記載される方法及び組成物を使用して、研究目的及び／または臨床使用のために異なるＴ細胞亜集団を生成することができる。結果として生じる増殖されたＴ細胞亜集団は、臨床設定において広範囲の用途がある。
いくつかの態様において、本発明は、Ｔ細胞亜集団のメンバーを選択的に増殖させるための組成物及び方法に関する。かかる方法には、Ｔ細胞の混合集団を、（ａ）Ｔ細胞亜集団のメンバーに一次活性化シグナルを提供し、それによってＴ細胞を活性化する、第１の作用物質と、（ｂ）第２の作用物質及び第３の作用物質であって、これらの各々が、Ｔ細胞亜集団のメンバー上の２つ以上の異なるアクセサリー分子を刺激し、それによって（ａ）の活性化されたＴ細胞の増殖を刺激する、第２の作用物質及び第３の作用物質と、に曝露することを含むものが含まれる。いくつかの態様において、第１の作用物質、第２の作用物質、及び第３の作用物質の比率は、他のＴ細胞亜集団のメンバーよりも、Ｔ細胞亜集団の当該メンバーを誘発して選択的に増殖させるように調節されてもよい。第１の作用物質は、抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）であってもよい。第２の作用物質もまた、抗体であってもよい。第３の作用物質は、抗体、非抗体タンパク質、または化学薬品（例えば、ラパマイシン）であってもよい。非抗体タンパク質が使用される場合、このタンパク質は、ケモカインまたはサイトカイン（例えば、インターロイキン－１α、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン－１β、インターロイキン－６、インターロイキン－１２、インターロイキン－１５、インターロイキン－１８、インターロイキン－２１、トランスフォーミング増殖因子β１等）であってもよい。
いくつかの特定の態様において、第１の作用物質、第２の作用物質、及び第３の作用物質の比率は、第２及び／または第３の作用物質と比較して、第１の作用物質の濃度がより低いように調節されてもよい。さらに、第１の作用物質のより低い濃度は、約０．０６単位、約０．１単位、約０．２単位、約０．３単位、約０．３４単位、または約０．４単位であってもよい。また、第１の作用物質は、約０．３４単位の濃度の抗ＣＤ３抗体であってもよく、第２の作用物質は、３．４単位の濃度の抗ＣＤ２８抗体であってもよい。
いくつかの態様において、抗ＣＤ３は、０．０１～４．０（例えば、約０．０１～約３．５、約０．０１～約３．４、約０．０２～約３．４、約０．０５～約３．５、約０．１～約３．４、約０．２～約３．４、約０．５～約３．０、約０．１～約２．５、約０．０１～約１．０、約０．０５～約１．０等）単位の量で使用されてもよく、抗ＣＤ２８は、１．０～５．０（例えば、約１．０～約４．８、約１．０～約４．５、約１．０～約３．５、約１．０～約３．０、約１．０～約２．９、約１．５～約３．５、約２．０～約３．５、約２．５～約３．５、約１．０～約４．８等）単位の量で使用されてもよい。さらに、抗ＣＤ３の抗ＣＤ２８に対する比率は、１：１０～１：５０（例えば、約１：１２～約１：４８、約１：１０～約１：４８、約１：１２～約１：５０、約１：１０～約１：４０、約１：１０～約１：３５、約１：１０～約１：３０等）の範囲であってもよい。
いくつかの場合において、選択的に増殖されるＴ細胞亜集団は、Ｔｒｅｇ細胞であってもよい。そのような場合（及び他の場合）において、第１の作用物質のより低い濃度は、約０．０１単位であってもよい。さらに、第１の作用物質は、約０．０１単位、約０．０６単位、約０．１単位、約０．２単位、約０．３単位、約０．３４単位、または約０．４単位の濃度の抗ＣＤ３抗体であってもよく、第２の作用物質は、は、抗ＣＤ２８抗体であってもよく、第３の作用物質は、抗ＣＤ１３７抗体であってもよい。
いくつかの場合において、選択的に増殖されるＴ細胞亜集団は、メモリーＴ細胞であってもよい。そのような場合（及び他の場合）において、第１の作用物質のより低い濃度は、約０．００５、約０．０１、または約０．０６単位であってもよい。他の場合において、選択的に増殖されるＴ細胞亜集団は、Ｔｈ１７細胞であってもよい。さらに、第１の作用物質は、約０．０１、約０．０５、約０．０６、約０．１、または約０．３４単位の濃度の抗ＣＤ３抗体であってもよく、第２の作用物質は、抗ＩＣＯＳ抗体であってもよい。
本発明には、Ｔ細胞亜集団を選択的に増殖させるための組成物及び方法も含まれる。そのような方法には、（ａ）Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７シグナルに生体外で曝露することと、（ｂ）Ｔｈ１７細胞、抗原経験Ｔ細胞、及び／または調節性Ｔ細胞の増殖を許容する様式で、Ｔ細胞を培養することと、を含むものが含まれる。いくつかの場合において、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７シグナルは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び／または抗ＣＤ１３７抗体によって媒介されてもよい。より特定の場合において、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ１３７抗体は、（例えば、メモリーＴ細胞の増殖のために）０．０１単位～１．５単位の濃度を包含する範囲で使用されてもよい。さらに、抗ＣＤ３、抗ＣＤ５、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ６、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７抗体は、（例えば、Ｔｈ１７細胞の増殖のために）０．０６単位～１．５単位の濃度を包含する範囲で使用されてもよい。また、抗ＣＤ３、抗ＣＤ５、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ６、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７抗体は、（例えば、Ｔｒｅｇ細胞の増殖のために）約０．３４単位～３．４１単位の濃度を包含する範囲で使用されてもよい。加えて、抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ５、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ６、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７抗体の濃度と比較してより低い濃度で使用されてもよい。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、ＣＤ３選択を使用して単離されてもよい。さらに、本発明の方法によって増殖されるＴｈ１７細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ８／ＣＤ４＋／であってもよく、ＩＬ－１７サイトカインを産生してもよい。そのようなＴｈ１７細胞は、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１及び／またはＩＬ－２２も産生することもできる。
本発明の方法によって増殖されるメモリーＴ細胞としては、幹細胞様メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、及びエフェクターメモリーＴ細胞からなる群から選択されるものが挙げられる。幹細胞様メモリー細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＩＬ－７Ｒα＋、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、及びＬＦＡ－１のマーカーのうちの１つ以上を有してもよい。セントラルメモリー細胞は、ＣＤ３＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２７＋、及びＣＤ２８＋のマーカーのうちの１つ以上を有してもよい。さらに、これらのセントラルメモリー細胞は、ＩＬ－２を産生することができる。本発明の方法によって増殖されるエフェクターメモリー細胞は、ＣＤ２８＋／－、ＣＤ２７＋／－、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＣＲ７－、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋のマーカーのうちの１つ以上を有してもよい。エフェクターメモリー細胞は、ＩＦＮγ及びＩＬ－４を産生することができる細胞であってもよい。本発明の方法によって増殖されるＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋、及びＣＤ１２７負／低のマーカーのうちの１つ以上を有してもよい。
本発明には、調節性Ｔ細胞を選択的に増殖させるための組成物及び方法がさらに含まれる。これらの方法は、（ａ）Ｔ細胞をＣＤ３及びＣＤ２８シグナルに生体外で曝露することと、（ｂ）Ｔ調節性細胞の増殖を可能にする様式でＴ細胞を培養することと、を含むものが含まれる。そのようなＣＤ３及びＣＤ２８シグナルは、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２８抗体によって媒介されてもよい。さらに、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２８抗体は各々、０．３４～３．４単位の濃度範囲を包含する範囲で使用されてもよい。加えて、抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ２８及び／または抗体の濃度と比較してより低い濃度で使用されてもよい。
本発明には、Ｔｈ１７細胞を選択的に増殖させる組成物及び方法も含まれる。そのような方法は、（ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、及び／またはＩＣＯＳシグナルに生体外で曝露することと、（ｂ）Ｔｈ１７細胞の増殖を可能にする様式でＣＤ３＋Ｔ細胞を培養することと、を含むものを含み、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、及び／またはＩＣＯＳの量は、同じであってもよいか、または異なっていてもよい。そのような方法において、ＣＤ３、ＣＤ２８及びＩＣＯＳシグナルは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ５、及び抗ＩＣＯＳ抗体によって媒介されてもよい。さらに、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ５、及び抗ＩＣＯＳ抗体は、Ｔｈ１７細胞の増殖のために、約０．０６～約１．５単位の濃度範囲を包含する範囲で使用されてもよい。加えて、抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ２８及び／または抗ＩＣＯＳ抗体の濃度と比較してより低い濃度で使用されてもよい。
本発明には、抗原経験Ｔ細胞を選択的に増殖させる組成物及び方法も追加で含まれる。これらの方法は、（ａ）Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２７、及び／またはＣＤ１３７シグナルに生体外で曝露することと、（ｂ）Ｔ細胞を抗原経験Ｔ細胞の増殖を可能にする様式で培養することと、を含むものが含まれる。ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ２７、ならびに／または抗ＣＤ１３７シグナルは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２７、及び／または抗ＣＤ１３７抗体によって提供されてもよい。抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２７、及び抗ＣＤ１３７抗体は、０．０１～１．５単位の濃度範囲を包含する範囲で使用されてもよい。抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ２８及び／または抗ＣＤ１３７抗体の濃度と比較してより低い濃度で使用されてもよい。
本発明には、ＣＤ３＋（１）Ｔ細胞と、（２）（ａ）抗ＣＤ３抗体及び（ｂ）Ｔ細胞亜集団を選択的に増殖することができる抗ＣＤ２８、抗ＣＤ１３７、抗ＩＣＯＳ、または抗ＣＤ５抗体を含有するビーズと、を含む組成物も含まれる。いくつかの場合において、存在する（ａ）抗ＣＤ３抗体及び（ｂ）抗ＣＤ２８、抗ＣＤ１３７、抗ＩＣＯＳ、または抗ＣＤ５抗体の量は、同じであってもよいか、または異なっていてもよい。特定の場合において、Ｔ細胞亜集団は、Ｔｈ１７細胞、抗原経験Ｔ細胞及び／または調節性Ｔ細胞からなる群から選択されてもよい。さらに、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ５、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ２７、及び抗ＣＤ１３７抗体は、（例えば、メモリーＴ細胞の増殖のために）０．０１～１．５単位の濃度範囲を包含する範囲、（例えば、Ｔｈ１７細胞の増殖のために）０．０６～１．５単位の濃度範囲を包含する範囲、または（例えば、Ｔｒｅｇ細胞の増殖のために）０．３４～３．４１単位の濃度範囲を包含する範囲で使用されてもよい。いくつかの場合において、抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ１３７抗体の濃度と比較してより低い濃度で使用されてもよい。
本発明は、（１）Ｔ細胞と、（２）Ｔｈ１７細胞を選択的に増殖することができる抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ５、及び／または抗ＣＤ１３７抗体を含有するビーズと、を含む組成物をさらに含み、Ｔｈ１７細胞は、１つ以上のエフェクターサイトカインを産生することができる。いくつかの場合において、ビーズ上に存在する抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体の量は、同じであってもよいか、または異なっていてもよい。さらに、１つ以上のエフェクターサイトカインは、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２２からなる群から選択される１つ以上のサイトカインであってもよい。
本発明には、（１）Ｔ細胞と、（２）抗原経験メモリーＴ細胞を選択的に増殖することができる抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７抗体を含有するビーズと、を含む組成物が含まれる。いくつかの場合において、Ｔ細胞は、特異的抗原を認識することができてもよく、ビーズ上に存在する抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７抗体の量は、同じであってもよいか、または異なっていてもよい。特異的抗原は、ウイルス抗原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザ、ＨＩＶ等）、細菌（例えば、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）Ｍ－タンパク質、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）線毛、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）リポタンパク質ＶｉｓＥ、類鼻疽菌（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）多糖類抗原等）、真菌または原生動物（例えば、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ガラクトマンナン、または野兎病菌（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）リポ多糖類等）、及びがん抗原からなる群から選択されてもよい。
本発明には、（１）Ｔ細胞と、（２）調節性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦＯＸＰ３＋ ＣＤ１２７低／負である調節性Ｔ細胞）を選択的に増殖させることができる抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を含有するビーズと、を含む組成物も含まれる。いくつかの場合において、ビーズ上に存在する抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体の量は、同じであってもよいか、または異なっていてもよい。調節性Ｔ細胞活性は、抑制活性を含んでいてもよい。
本発明には、（ａ）治療を必要とする個体を治療することと、（ｂ）免疫システムの再構成を必要とする個体の免疫システムを再構成することと、（ｃ）養子免疫療法を必要とする個体に、養子免疫療法を施すことと、のための組成物及び方法も含まれる。そのような方法には、該個体にＴｈ１７細胞、抗原経験Ｔ細胞、及び／または調節性Ｔ細胞を含む薬学的に許容される組成物を投与することが含まれる。治療を必要とする該個体は、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、または感染性疾患、移植関連疾患を患っていてもよい。さらに、例示的ながんとしては、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、乳がん、肝臓がん、及び皮膚がんが挙げられる。炎症性疾患は、糖尿病、関節リウマチ、炎症性腸疾患、家族性地中海熱、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、インターロイキン－１受容体拮抗分子欠損症（ＤＩＲＡ）、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎、及びベーチェット病からなる群から選択され得る。
そのような方法（及び本発明の他の方法）において、Ｔ細胞は、遺伝子組み換えされていてもよい。さらに、遺伝子組み換えは、１つ以上のキメラ抗原受容体または遺伝子組み換えされたＴ細胞受容体の存在をもたらしてもよい。
本発明には、試料中の２つのＴ細胞亜型の比率を選択的に変えるための組成物及び方法も含まれる。そのような方法には、Ｔ細胞の混合集団を含む試料を少なくとも２つの刺激剤と接触させることを含むものが含まれる。いくつかの場合において、刺激剤は、異なる量のシグナルを混合集団内のＴ細胞に提供する。特定の場合において、１つのＴ細胞亜型が、第２のＴ細胞亜型と比較して選択的に増殖されてもよい。さらに、試料は、個体に由来するバフィーコート細胞、及びバフィーコート細胞のサブセット（例えば、単核細胞）を含んでもよい。さらに、少なくとも２つの刺激シグナルが、ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激してもよい。また、少なくとも１つのＴ細胞亜型が、混合集団から選択的に除去されてもよい。いくつかの態様において、Ｔｒｅｇ Ｔ細胞が、混合集団内の全Ｔ細胞に対して比例して増加してもよい。これを行う１つの方法は、集団から非Ｔｒｅｇ細胞を排除するのに好適な量のラパマイシンに、細胞を接触させることによってである。追加の態様において、メモリーＴ細胞の総数は、試料中で減少してもよい。さらに、刺激シグナルＣＤ３の量は、ＣＤ２８刺激シグナルの半分未満であってもよい。
本発明には、ＣＤ３及びＣＤ５細胞表面受容体を刺激することによってＴｈ１７細胞を増殖するための方法も含まれる。いくつかの実施形態において、本発明には、（ａ）Ｔ細胞の集団をＣＤ３及びＣＤ５シグナルに生体外で曝露することと、（ｂ）Ｔｈ１７細胞の増殖を可能にする条件下で、Ｔ細胞の集団を培養することと、を含む、Ｔｈ１７を増殖させるための方法が含まれる。本発明の特定の実施形態において、Ｔ細胞の集団は、１つ以上のアリール炭化水素受容体アゴニスト（例えば、６－ホルミルインドロ［３，２－ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ））に曝露してもよく、かつ／または外因性インターロイキン－２３に曝露されなくてもよい。いくつかの場合において、Ｔ細胞の集団は、異なるＴ細胞型の混合集団である。さらに、本発明の方法には、Ｔ細胞の集団を、１つ以上の極性化剤（ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、インターロイキン－１β、インターロイキン－２３、腫瘍成長因子－β、インターロイキン－６、インターロイキン－２１、インターロイキン－２、抗インターロイキン－４抗体、及び／または抗インターフェロンγ抗体）と接触させることを含む方法が含まれる。
タンパク質に関して使用される場合、「外因性」という用語は、組成物中に存在するが、組成物中に存在する細胞によって産生されないタンパク質を指す。例えば、試料中に存在するＴ細胞は、ＩＬ－２を産生し得る。そのような場合において、外因的に付加されたＩＬ－２は、非細胞組成物として試料中に入れられたＩＬ－２（例えば、緩衝液中のＩＬ－２）を指す。
いくつかの実施形態において、Ｔｈ１７細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体を発現するように操作されている。１つ以上のキメラ抗原受容体のうちの少なくとも１つには、哺乳動物細胞の細胞表面抗原（例えば、抗原関連）に対して特異性を有する受容体が含まれる。
本発明は、ＣＤ３シグナル及びＣＤ５シグナルを含む組成物も含み、いくつかの場合において、本発明の組成物は、１つ以上のアリール炭化水素受容体アゴニスト（例えば、６－ホルミルインドロ［３，２－ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ））、１つ以上のサイトカイン（例えば、インターロイキン－１β、インターロイキン－２３、腫瘍成長因子－β、インターロイキン－６、インターロイキン－２１及び／またはインターロイキン－２）、ならびに／または１つ以上の抗体（例えば、抗インターロイキン－４抗体、及び／または抗インターフェロンγ抗体）を含有していてもよい。特定の場合において、本発明の組成物は、インターロイキン－１β及びインターロイキン－６を含有していてもよい。上記のもの等の組成物は、Ｔ細胞の集団をさらに含んでいてもよい。さらに、本発明の組成物中のＣＤ３シグナルは、１つ以上の抗ＣＤ３抗体であってもよい。また、本発明の組成物中のＣＤ５シグナルは、１つ以上の抗ＣＤ５抗体であってもよい。
本発明の組成物は、Ｔ細胞の集団、ＣＤ３シグナル、ＣＤ５シグナル、アリール炭化水素受容体アゴニスト、及び１つ以上のサイトカインも含んでいてもよい。特定の実施形態において、本発明の組成物は、（ａ）「バフィーコート」試料、（ｂ）８０％超の混合Ｔ細胞を含有する白血球細胞の試料、（ｃ）８０％超のＣＤ４＋Ｔ細胞を含有する試料、または（ｄ）８０％超のＴｈ１７細胞を含有する試料、を含む混合物中に存在するＴ細胞の集団を含んでもよい。
本発明は、細胞の混合集団（Ｔ細胞及びＢ細胞等の非Ｔ細胞）からのＴ細胞の分離及び活性化のための方法にさらに関する。いくつかの実施形態において、そのような方法は、（ａ）細胞の混合集団と、細胞の混合集団中に存在するＴ細胞上に位置するタンパク質に対して結合親和性を有する少なくとも第１のリガンドが結合した１つ以上の固体支持体とを、Ｔ細胞の固体支持体への結合、及び同じＴ細胞の活性化を可能にする条件下で、接触させることと、（ｂ）固体支持体に結合していない細胞から、固体支持体に結合したＴ細胞を分離して、精製されたＴ細胞集団を得ることと、を含む。１つ以上の固体支持体には、少なくとも第１のリガンド及び／または少なくとも第２のリガンドが結合していてもよく、第１のリガンド及び第２のリガンドの各々が、細胞の混合集団中に存在する個々のＴ細胞上に位置する異なるタンパク質に対して結合親和性を有する。さらに、第１のリガンド及び第２のリガンドは、同じ固体支持体または異なる固体支持体に結合していてもよい。いくつかの場合では、第１のリガンドは、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ４抗体のいずれかであってもよい。さらに、第２のリガンドは、（ａ）抗ＣＤ５抗体、（ｂ）抗ＣＤ２８抗体、（ｃ）抗ＣＤ１３７抗体、及び（ｄ）抗ＩＣＯＳ抗体からなる群から選択されるリガンドを含む、任意の数のリガンドであってもよい。さらに、本発明の方法には、ステップ（ｂ）で得られたＴ細胞を固体支持体から解放することを含む、精製されたＴ細胞集団の細胞を、固体支持体から解放することを含む方法が含まれる。加えて、本発明の方法には、固体支持体から解放されたら、解放されたＴ細胞を増殖させる方法が含まれる。多くの場合において、解放されたＴ細胞の増殖は、培養培地（例えば、１つ以上のケモカインまたはサイトカインが存在する培養培地）中で起こる。さらに、１つ以上のケモカインまたはサイトカインは、ステップ（ａ）で存在してもよい。そのような１つ以上のケモカインまたはサイトカインには、（ａ）インターロイキン－１α、（ｂ）インターロイキン－２、（ｃ）インターロイキン－４、（ｄ）インターロイキン－１β、（ｅ）インターロイキン－６、（ｆ）インターロイキン－１２、（ｇ）インターロイキン－１５、（ｈ）インターロイキン－１８、（ｉ）インターロイキン－２１、及び（ｊ）トランスフォーミング増殖因子β１からなる群から選択されるものが含まれる。
本発明の方法には、Ｔ細胞の活性化及び増殖のための方法も含まれる。そのような方法には、Ｔ細胞の混合集団を、（ａ）Ｔ細胞亜集団のメンバー上の分子を刺激することによって、Ｔ細胞亜集団のメンバー（例えば、Ｔｒｅｇ細胞、Ｔｈ１７細胞等）に一次活性化シグナルを提供する、第１の作用物質と、及び（ｂ）第１の作用物質によって刺激される分子とは異なる、Ｔ細胞亜集団のメンバー上の分子を刺激する、第２の作用物質と、接触させることを含むものが含まれる。多くの場合において、集団中のＴ細胞（例えば、Ｔ細胞亜集団のメンバー）は、活性化及び増殖される。追加の場合において、第１の作用物質及び第２の作用物質は、１つ以上の固体支持体に結合していてもよい。さらに、Ｔ細胞は、増殖（例えば、Ｔ細胞亜集団のメンバーの増殖）を可能にする条件下で維持されてもよい。固体支持体は、１２０時間未満の期間後にＴ細胞との接触から外されてもよい。換言すれば、固体支持体は、限定された期間にわたってＴ細胞と接触して配置され、次いで、Ｔ細胞との接触から外される。この期間は、約１２時間～約１２０時間（例えば、約１２時間～約１２０時間、約２４時間～約１２０時間、約３６時間～約１２０時間、約４８時間～約１２０時間、約６０時間～約１２０時間、約４８時間～約９６時間、約６０時間～約９６時間、約７２時間～約９６時間等）であってもよい。本明細書の他の箇所で論じられるように、第１の作用物質は、抗ＣＤ３抗体であってもよい。さらに、第２の作用物質は、抗体であってもよい。加えて、Ｔ細胞は、抗体または非抗体タンパク質である第３の作用物質（例えば、ケモカインまたはサイトカイン）と接触されてもよい。
本明細書に記載される態様及び実施形態の各々は、実施形態または態様の文脈から明白にまたは明確に除外されない限り、一緒に使用することができる。
図１Ａ～１Ｂは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８を用いた活性化に続く、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低／－フローサイトメトリー選別Ｔｒｅｇの増殖倍率、及びＦＯＸＰ３＋細胞の保持（約９０％のＦＯＸＰ３＋細胞）を示すラインプロットである。図１Ａは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８を用いた活性化に続く増殖倍率を示すラインプロットである。これらのデータは、数百倍の効果的な増殖を示している。 図１Ａ～１Ｂは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８を用いた活性化に続く、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低／－フローサイトメトリー選別Ｔｒｅｇの増殖倍率、及びＦＯＸＰ３＋細胞の保持（約９０％のＦＯＸＰ３＋細胞）を示すラインプロットである。図１Ｂは、ＦＯＸＰ３＋細胞保持％を示すラインプロットである。これらのデータは、これらの細胞が増殖培養液中で、１４日後に高いＦＯＸＰ３発現を保持することを示す。細胞は、９日目に同じプロトタイプビーズを使用して再び刺激される。増殖の増加は、より少ないＣＤ３の量と結合したＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を用いて達成される。 活性化後１０日目の、ＣＭＶ特異的メモリーＴ細胞の増殖倍率を示す棒グラフである。倍数増殖は、より多くの量のアゴニストＣＤ３抗体に結合したＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍｅｍｏｒｙ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒによってもたらされたシグナル強度の増加と負に相関する。 図３Ａ～３Ｄは、Ｔｈ１７極性化条件で培養され、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｈ１７ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＩＣＯＳ（１．５及び０．０６で結合した抗ＣＤ３抗体、ならびに２つの異なるＩＣＯＳクローン）またはＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて増殖されたＴ細胞におけるＩＬ－１７発現を示すグラフである。３日目から、ＩＬ－２を培養液に添加する。１０～１３日目に、ＩＬ－１７発現の評価の前に４～５時間、ＰＭＡ－イオノマイシンで刺激する。ヒストグラムは、ＩＬ－１７の細胞内発現を示す。図３Ａは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｈ１７ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＩＣＯＳ（ＩＳＡ－３）、ＣＤ３高（１．５）を用いて増殖させた細胞からのＩＬ－１７発現を示すグラフである。図３Ｂは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｈ１７ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＩＣＯＳ（ＩＳＡ－３）、ＣＤ３低（０．０６）を用いて増殖させた細胞からのＩＬ－１７発現を示すグラフである。図３Ｃは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｈ１７ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＩＣＯＳ（ｅＢｉｏｃｉｅｎｓｅｓ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから購入したＩＣＯＳクローンＣ３９８．４Ａ）、低ＣＤ３（０．０６）用いて増殖させた細胞からのＩＬ－１７発現を示すグラフである。図３Ｄは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳ（商標）を用いて増殖させた細胞からのＩＬ－１７発現を示すグラフである。活性化シグナル強度及び共刺激の性質は、Ｔｈ１７細胞の極性化及び増殖に強く影響を与える。注記：ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｈ１７ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＩＣＯＳ（中－０．３）を用いた活性化は、１：１のビーズ：細胞比率で「（高－１．５）」と類似した表現型をもたらす。 図４Ａ～４Ｃは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｈ１７ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＩＣＯＳを用いて活性化された３人のドナーからのＴ細胞を示すグラフである。図４Ａは、ドナーＡ、Ｂ、及びＣそれぞれからのＴ細胞増殖倍率の一連の折れ線グラフである。 図４Ａ～４Ｃは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｈ１７ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＩＣＯＳを用いて活性化された３人のドナーからのＴ細胞を示すグラフである。図４Ｂは、異なるビーズ：細胞比率（ＢＣとして報告）でのＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｈ１７ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＩＣＯＳを用いたドナーＡ、Ｂ、及びＣそれぞれからのＴ細胞の選択的増殖から得られた、ＩＬ－１７産生細胞のパーセンテージを示す一連の棒グラフである。 図４Ａ～４Ｃは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｈ１７ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＩＣＯＳを用いて活性化された３人のドナーからのＴ細胞を示すグラフである。図４Ｃは、異なるビーズ：細胞比率（ＢＣとして報告）を用いてドナーＡ、Ｂ、及びＣそれぞれからのＴ細胞の増殖から得られた、ＩＬ－１７産生細胞の相対数を示す一連の棒グラフである。 中和抗体の効果。ＣＤ３／ＩＣＯＳビーズまたはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、中和抗体を用いて（＋）、または中和抗体を用いずに（－）極性化したＩＬ－１７産生ＣＤ４ Ｔ細胞の平均％（ｎ＝３人のドナー）。ブロッキング抗体（ＮＳＤ、統計的に異ならない（上部パネル））によって引き起こされた変種に与えられたＰ値（対応のあるｔ検定）。個々の結果；単一ドナー（Ａ，Ｂ，Ｃ）、及びＩＣＯＳの刺激に対するＣＤ２８での刺激（下のパネル）。 サイトカイン産生における共刺激の効果。ＤｙｎａｂｅａｄｓプロトタイプＣＤ３／ＣＤ２８、ＣＤ３／ＣＤ５、またはＣＤ３／ＩＣＯＳで活性化された精製ＣＤ３＋Ｔ細胞は、異なる有効性を有するＴｈ１７サブセットを増殖させ、典型的には、ＣＤ３／ＣＤ５は、最も効率的であり、ＣＤ３／ＩＣＯＳがそれに続き、ＣＤ３／ＣＤ２８が、より効果的ではない刺激プロトタイプである。ＣＤ３／ＣＤ５刺激は、典型的に２５～５０％のＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＬ－１７Ａの産生を誘導し、高い割合は、１０～１３日目の再刺激の際の多官能性ＩＬ－１７＋ＩＮＦ－γ＋である。 表現型への、共刺激の効果。ＣＤ３／ＣＤ２８、ＣＤ３／ＣＤ５またはＣＤ３／ＩＣＯＳによって刺激されたＴ細胞は、増殖後に様々なレベルのＣＣＲ４及びＣＣＲ６を共発現し、ＣＤ３／ＣＤ５及びＣＤ３／ＩＣＯＳ刺激は、ＣＤ３／ＣＤ２８（４６％）と比較して、より高い割合のＣＣＲ４＋ＣＣＲ６＋細胞（７７及び７３％）を生成する。 Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ５（上）またはＣＤ３／ＩＣＯＳ（下）の図で活性化し、標準Ｔｈ１７極性化サイトカイン／抗体（サイトカインパッケージ）、または１００ｎＭのＦＩＣＺ及びＩＬ－１β及びＩＬ－６の存在下で増殖させた。１３日目に、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆ発現の評価の前に、培養物をＰＭＡ／イオノマイシンで４～５時間刺激した。細胞所見は、サイトカインの細胞内発現を示す。 刺激因子ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を早期に取り出すことにより、ＴＨ１７極性化が向上される。Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ５、ＣＤ３／ＩＣＯＳ、またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで、標準Ｔｈ１７極性化サイトカイン／抗体（ＴＧＦ－β、ＩＬ－２３、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、及びαＩＬ－４／α－ＩＦＮ－γ中和抗体）の存在下で活性化させた。刺激ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を、ｉ）増殖の間中、培養液中に入れたままにしておき、ｉｉ）活性化後２日目（４８時間）に取り出したか、またはｉｉｉ）活性化後３日目（７２時間）に取り出した。１３日目に、培養物を、ＣＤ４＋Ｔ細胞における細胞内ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆ発現の評価の前に、ＰＭＡ／イオノマイシンで、４～５時間刺激した。 図９Ａの凡例に記載されるように調製された細胞の活性化後１０日目の、Ｔｈ１７関連表面マーカーＣＤ１６１を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の割合及び絶対数を示す。 ＣＤ３／ＣＤ５単離Ｔ細胞は、直接極性化及び増殖され得る。Ｔ細胞を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ５を使用して、１：３、１：１、及び３：１のビーズ：細胞比で、ＰＢＭＣから単離した。単離効率を、Ｔ細胞刺激プロトコルでＴ細胞の富化のために一般的に使用されるＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳを使用して比較した。単離効率（％）を示す。 図１０Ａの単離したＴ細胞を、標準Ｔｈ１７極性化サイトカイン／抗体（ＴＧＦ－β、ＩＬ－２３、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、及びαＩＬ－４／α－ＩＦＮ－γ中和抗体）の存在下で同時に増殖させた。刺激ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を、活性化後３日目に取り出した。１３日目に培養物を、ＣＤ４＋Ｔ細胞における細胞内ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆ発現の評価の前に、ＰＭＡ／イオノマイシンで４～５時間刺激した。
詳細な説明
いくつかの態様において、本発明は、特に、特異的Ｔ細胞亜集団の選択的増殖のための方法及び組成物を提供する。これらのＴ細胞亜集団としては、Ｔｈ１７細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、及びメモリーＴ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される特異的Ｔ細胞亜集団は、様々な生理学的状態、疾患、及び／または疾患状態を治療するために使用することができる。
本発明のいくつかの態様
いくつかの態様において、本発明は、Ｔ細胞亜集団の活性化及び／または増殖のためのシグナルの種類及びシグナル強度に基づく。これらの方針に沿って、特異的Ｔ細胞亜集団が、選択的細胞表面マーカー刺激によって、混合集団中において得られ得、かつ／または増やされ得ることが認められた。Ｔ細胞受容体のシグナル強度の変化も、特異的Ｔ細胞亜集団を得るのに使用され得ることがさらに認められた。多くの場合において、Ｔ細胞亜集団は、混合Ｔ細胞集団から得られる（例えば、末梢血液から得られる全Ｔ細胞）。
Ｔ細胞受容体の刺激は、例えば（１）Ｔ細胞に影響を与えない、（２）Ｔ細胞活性化、（３）Ｔ細胞の増殖、（４）Ｔ細胞極性化、（５）Ｔ細胞分化（例えば、メモリーＴ細胞）、及び（６）Ｔ細胞におけるアポトーシスの誘導等の、いくつかの影響を特定のＴ細胞に与え得る。生じる影響は、多くの場合、特異的Ｔ細胞の存在、刺激シグナル（複数可）の性質、複数のシグナルが用いられる場合、複数の刺激シグナル（例えば、２つ、３つ、４つ等のシグナル）の強度の比率、及びＴ細胞が曝露される総シグナル強度または個々のシグナル強度等に応じる。
多くの場合において、Ｔ細胞は、受容体刺激の前に他の細胞型から分離される。これは、単一のステップまたは複数のステップで行われてもよい。例示的な方法は、次の通りである。（１）単核細胞のバフィーコートまたはアフェレーシス単離、（２）例えば、１つ以上のＣＤ４受容体が結合した作用物質を有する磁気ビーズを使用したＣＤ４＋細胞の単離、及び（３）蛍光活性化細胞選別（実施例１を参照されたい）。
本発明のいくつかの態様において、２つ以上のＴ細胞シグナルの比率は、第２の組の１つ以上のＴ細胞亜集団よりも、第１の組の１つ以上のＴ細胞亜集団の選択的増殖をもたらす様式で調節される。多くの場合において、第１の組の１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ等）のＴ細胞亜集団は、第２の組の１つ以上のＴ細胞亜集団よりも小さい。いくつかの場合において、第１の組の１つ以上のＴ細胞亜集団は、単一のＴ細胞亜集団を含んでいてもよく、及び第２の組の１つ以上のＴ細胞亜集団は、存在する他の全てのＴ細胞亜集団を含んでいてもよい。いくつかの場合において、第１のＴ細胞亜集団（例えば、抗原経験（メモリー）Ｔ細胞）は、第２のＴ細胞亜集団（例えば、ナイーブＴ細胞）よりも選択的に増殖される。さらに、１つ以上の追加のＴ細胞亜集団は、第１のＴ細胞集団とともに増殖し得る。
多くの場合において、１つのシグナルは、第１のＴ細胞受容体（例えば、ＣＤ３受容体）の刺激によって生成され、別のシグナルは、第２の、共刺激Ｔ細胞受容体（例えば、ＣＤ２８受容体、ＣＤ１３７受容体、ＣＤ２７受容体、ＣＤ５受容体、ＣＤ６受容体、ＩＣＯＳ受容体、ＣＤ１３４受容体等）の刺激によって生成される。シグナル比は、（ａ）特定のＴ細胞集団の増殖を促進するか、（ｂ）別のＴ細胞集団の除去を促進する（例えば、アポトーシスを介して、細胞成長の阻害、増殖効果がないことにより等）か、または（ａ）及び（ｂ）の両方である様式で変えられてもよい。いくつかの場合において、１つ以上の追加のＴ細胞受容体も刺激されてもよいか、または他のシグナルがＴ細胞に提供されてもよい。
第１のＴ細胞受容体の刺激シグナルに対する第２のＴ細胞受容体の刺激シグナルの例示的な比率は、得ようとするＴ細胞亜集団によって異なり、約５０：１～約１：２００（例えば、約１：５、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：４０、約５０：１～約１：４０、約５０：１～約１：３０、約４０：１～約１：４０、約３０：１～約１：４０、約４０：１～約１：２０、約４０：１～約１：１０、約５０：１～約１：１、約５０：１～約５：１、約４０：１～約５：１、約５０：１～約１０：１、約５０：１～約１５：１、約５０：１～約２０：１、約４０：１～約５：１、約３０：１～約３：１、約２０：１～約３：１、約１５：１～約３：１、約１０：１～約５：１、約１：５～約１：１０、約１：３～約１：２０、約１：８～約１：２５、約１：３～約１：４０、約１：５～約１：５０、約１：１０～約１：５０、約１：１０～約１：１００、約１：１０～約１：１５０、約１：１０～約１：２００、約１：５～約１：１５０、約１：５～約１：２００等）であってもよい。
例示の目的のため、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって提供されるシグナルは、１：１０の比率で存在し得る。一部のＴ細胞亜集団の増殖に関して、より少ない量のＣＤ３シグナルが、第２のシグナル（例えば、ＣＤ２８シグナル及び／またはＣＤ１３７シグナル）よりも望ましいことが見出された。いくつかの場合において、３つ以上のＴ細胞受容体シグナルが提供される場合、各シグナルの比率は、異なってもよいか、またはシグナルの比率のうちの２つ以上（例えば、３つ中２つ）が同じでもよい。例として、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７シグナルは、１：１０：１０の比率で存在してもよい。これらのシグナルの各々が抗体によって生成されるとき、これは一般に、１部の抗ＣＤ３抗体が、１０部の抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ１３７抗体の両方とともに存在することを意味する。これは当然、３つの受容体の各々に対する受容体刺激の量が、それらの同種抗体により、等しいことを前提とする。
留意すべき１つの問題は、本発明の方法によって生成されたＴ細胞の集団を含有する混合物の特徴付けである。多くの場合において、本発明の組成物及び方法は、混合物中の特定の亜集団のＴ細胞の比率の変更を対象とする。例えば、本発明の方法は、ある特定の種類のＴ細胞が、例として、アポトーシスまたは希釈によって、混合集団から除去されることをもたらし得る。したがって、本発明の一態様は、混合物中のＴ細胞集団の増大または枯渇の量、ならびに混合物自体に関する。例えば、混合物中に２つのＴ細胞亜集団が存在し（例えば、Ｔｈ１７ Ｔ細胞及びＴｈ１ Ｔ細胞）、これらの亜集団が、例えば１：１の比率で存在する場合、本発明には、１つのＴ細胞亜集団が他のＴ細胞亜集団に対して増加される方法が含まれる。例示の目的のために、比率は、約１：１．５～約１：１００，０００（例えば、約１：１．５～約１：１００，０００、約１：１．５～約１：８０，０００、約１：１．５～約１：５０，０００、約１：１．５～約１：１０，０００、約１：１．５～約１：５，０００、約１：２，５００～約１：２５，０００、約１：２，５００～約１：６０，０００、約１：２，５００～約１：８０，０００、約１：２，５００～約１：１００，０００、約１：５，０００～約１：１００，０００、約１：５，０００～約１：８０，０００、約１：５，０００～約１：５０，０００、約１：５，０００～約１：２５，０００等）に変えられてもよい。
さらに、本発明は、混合物中の特定の亜集団のＴ細胞の比率を変える組成物及び方法に関し、１つのＴ細胞亜集団の割合は、別のＴ細胞亜集団よりも少なくとも２００，０００倍（例えば、約１，０００倍～約２００，０００倍、約５，０００倍～約２００，０００倍、約１０，０００倍～約２００，０００倍、約２０，０００倍～約２００，０００倍、約５０，０００倍～約２００，０００倍、約７５，０００倍～約２００，０００倍、約１，０００倍～約１２０，０００倍、約５，０００倍～約１２０，０００倍、約１０，０００倍～約１２０，０００倍、約１，０００倍～約８０，０００倍、約１０，０００倍～約８０，０００倍等）に増加される。「倍」が意味する例は、以下のように例証される。２つのＴ細胞亜集団が１：２の初期比率で存在する場合、それらの比率の１：８への変更は、他方のＴ細胞亜集団に対して一方のＴ細胞亜集団の２倍増加である。
個々のＴ細胞亜集団の選択的増殖をもたらし得る別の要素は、刺激シグナル強度である。「刺激シグナル強度」は、１つのＴ細胞当たりの全シグナル強度を指す。これには、様々なシグナル（例えば、第１のＴ細胞表面受容体を刺激するシグナル、第２のＴ細胞表面受容体のシグナル刺激、第３のＴ細胞表面受容体のシグナル刺激等）、及び集団内の各Ｔ細胞が曝露される合わせたシグナルの強度が含まれる。したがって、本発明は、様々なＴ細胞亜集団の混合物中の各細胞によって受容される刺激シグナルの量にも関する。刺激シグナルは、刺激剤の濃度、それらの比率、または前記刺激剤を含む表面に対する細胞数の比率を変更することによって調節され得る。刺激剤がビーズをベースにしたものである実施形態において、ビーズ：細胞比率は、変えられてもよい。ビーズ：細胞比率としては、細胞１つ当たりのビーズ約１：５０００、約１：２５００、約１：１０００、約１：５００、約１：２５０、約１：１００、約１：９０、約１：８０、約１：７０、約１：６０、約１：５０、約１：４０、約１：３０、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、または約８：１、約１０：１、または約１５：１が挙げられる。
いくつかの場合において、１つ以上のサイトカインが、Ｔ細胞集団に付加されてもよい。多くの場合において、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＦＮ－ガンマ、及びＴＧＦ－ベータ。Ｔｈ１７極性化が所望される場合、次のサイトカインのうちの１つ以上が使用されてもよい：ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、ＴＧＦ－β、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ならびに中和抗ＩＬ－４及び抗ＩＦＮ－ガンマ抗体。さらに、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＧＦ－β、ＩＬ－２３、ならびにＩＬ－４及びＩＦＮγシグナルに対する中和抗体が、Ｔｈ１７細胞の選択的増殖のために使用されてもよい。
表１は、本発明の方法を使用して得られ得る、いくつかの異なるＴ細胞亜型を示す。表１は、特定の種類のＴ細胞を選択的に増殖するために使用され得る様々なシグナルを示す。
（表１）Ｔ細胞亜型刺激
Figure 0007084304000001
＊２つ以上の作用物質が提示されている場合には、「及び／または」
具体的には、本発明には、１つ以上のＴ細胞亜集団の選択的増殖のための方法が含まれる。そのような方法は、試料中の特異的Ｔ細胞の増大または枯渇をもたらす。一例として、ＣＤ３及びＣＤ２８受容体の、インターロイキン－２と合わせたナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、Ｔｈ１ Ｔ細胞、及び調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）刺激。全ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の調節によって、ナイーブＴ細胞が増殖され得る一方で、メモリーＴ細胞は、試料から枯渇し得ることが示されている（米国特許第８，６１７，８８４号；これの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。本発明の一態様に関連して、異なるＴ細胞亜集団は、シグナル比及び全シグナル強度を調節することによって選択的に増殖され得ることが示されている。一例として、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ３シグナルがＣＤ２８シグナルより低いときに良好に増殖する（図１Ａを参照されたい）。選択的増殖条件の特定は、様々なＴ細胞亜集団の様々な細胞が同じ刺激に応答して増殖するときでさえ、試料中の１つ以上の他のＴ細胞亜集団のメンバーよりも、一方のＴ細胞亜集団のメンバーの割合を増加させるのに使用することができる。例示の目的のために、Ｔｒｅｇ Ｔ細胞が混合集団の１％を占め、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞がそれぞれ、同じ混合集団の１．５％、３％を占めると仮定して、刺激シグナルは、メモリーＴ細胞の除去を誘導する一方で、Ｔｒｅｇ Ｔ細胞を選択的に増殖させるように調節されてもよい。最終結果は、Ｔｒｅｇ Ｔ細胞が混合集団の４０％を占め、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、及びＴｈ１ Ｔ細胞がそれぞれ、２％、０．５％、及び２．５％を占める混合集団であり得る。
１つ以上のＴ細胞亜型（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３－調節性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞等）の選択的増大または枯渇のために使用され得る追加の作用物質は、ラパマイシンである。
哺乳動物免疫システム
哺乳動物免疫システムは、２つの一般的な適応機構を使用して、環境病原体に対して体を保護する。病原体由来分子に遭遇したとき、免疫応答は、その病原菌に対する保護を確実にするために、高度に活性化される。
第１の機構は、非特異的（または自然）炎症応答である。自然免疫システムは、病原体上には存在するが、体自体の上には存在しない特異的分子を認識することができる。第２の機構は、特異的または後天性（または適応）免疫応答である。適応免疫応答は、問題の病原体に応じて作られている。適応免疫システムは、抗原と呼ばれる、病原体内に存在する多くの異なる分子に対する特異的免疫グロブリン（抗体）応答を発達させる。加えて、Ｔ細胞受容体の幅広いレパートリーは、樹状細胞（ＤＣ）等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩ及びＩＩに結合した抗原の処理された形態に結合する能力についてサンプリングされる。
免疫システムは、自己タンパク質と非自己タンパク質との間の構造的差異を認識し、それらに応答する。免疫システムが非自己と認識するタンパク質は、抗原と称される。病原体は、典型的に多数の高度に複雑な抗原を発現する。後天性免疫は、抗原構造に対して特異的記憶を有し、同じ抗原への反復曝露は、その特定の病原体に対する誘導された保護のレベルを増加させる応答を増加させる。
後天性免疫は、Ｂ及びＴリンパ球（または単純にＢ及びＴ細胞）と呼ばれる特殊化した免疫細胞によって媒介される。Ｂ細胞は、抗体の作用を通じてそれらの機能を生成し、媒介する。Ｂ細胞依存性免疫応答は、抗体が体液中で検出されるため、「体液性免疫」と称される。Ｔ細胞依存性免疫応答は、エフェクター活性がエフェクターＴ細胞の局所作用によって直接媒介されるため、「細胞媒介性免疫」と称される。エフェクターＴ細胞の局所作用は、Ｔ細胞と、活性化マクロファージ等の二次エフェクター細胞との相乗的相互作用によって増殖される。この結果は、病原体を死滅させ、疾患を引き起こすことを防止する。
免疫細胞は、活性化のために特異的刺激を必要とし得る。例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８の使用は、一部のＴ細胞集団の活性化シグナルを提供する。ナイーブＴ細胞は、活性化のために少なくとも２つのシグナルを必要とすると考えられている。シグナル１は抗原特異的であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示されるペプチド／主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）複合体によって誘発され、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を通じて受容される。いくつかのＴ細胞亜集団について、シグナル２は、抗原提示細胞によって送達され、その受容体の候補分子のうちの１つは、Ｔ細胞抗原ＣＤ２８である。ＴＣＲ／ＣＤ３及びＣＤ２８ Ｔ細胞受容体の両方が適切なリガンドによって占有された場合、Ｔ細胞は刺激されて増殖し、ＩＬ－２（Ｔ細胞増殖に必要不可欠なサイトカイン）を産生するのに対して、Ｔ細胞受容体単独での占有は、Ｔ細胞アネルギーまたはアポトーシスを促すと考えられている。
インビトロでは、Ｔ細胞の成長及びサイトカインの産生は、固相（例えば、ビーズまたは組織培養プレート）に固定化された抗ＣＤ３抗体でＴ細胞を培養し、可溶性ＣＤ２８抗体を添加することによって刺激され得ることが示されている（Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２４９８－２５０２（１９９３），Ｓｕｎｄｅｒ－Ｐｌａｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８７：５１７９－５１８４（１９９６））。より最近では、ＣＤ３及びＣＤ２８抗体の両方を同じ固相または異なる固相に固定化することによっても、Ｔ細胞増殖を誘導することができることが示されている（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５９２１３０（１９９７）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８４８－８５１（１９９９））。
本発明は、当業者が、信頼性が高く、有効かつ効率的な様式で様々なＴ細胞亜集団を産生し、治療目的及び研究／発見目的を含むがこれらに限定されない多様な目的のために、増殖されたＴ細胞亜集団を使用することを可能にする。以下にさらに記載されるように、Ｔ細胞亜集団には、調節性Ｔ細胞、Ｔｈ１７細胞、及び抗原経験メモリー細胞が含まれるが、これらに限定されない。
調節性Ｔ細胞
本発明の態様は、調節性Ｔ細胞（または「Ｔ調節性細胞」もしくは「Ｔｒｅｇ」）を効率的に生成し、例えば、免疫療法で用途を有するＴ細胞集団の生成においてこれらを使用する方法に関する。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋、ＣＤ１２７負／低等のマーカーを特徴とし得る。いくつかの場合において、本発明の組成物及び方法を使用して増殖されたＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３－である。ＦＯＸＰ３調節性Ｔ細胞を生成するための組成物及び方法は、Ａａｒｖａｋらの米国特許第９，１１９，８０７号に記載されている。
天然に存在する調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、エフェクターＴ細胞を含む他のＴ細胞、及び自然免疫システム細胞の活性化を負に調節し、自己免疫疾患に対する免疫療法で利用することができ、移植免疫寛容を提供することができる。Ｔｒｅｇ細胞の様々な集団が説明され、それらは、天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞、ならびにそれぞれＩＬ－１０及びＴＧＦを分泌する誘導されたＴｒ１及びＴｈ３細胞を含む。
Ｔｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞応答の持続抑制を特徴とする。従来または通常のＴｒｅｇ細胞は、脾臓もしくはリンパ節、または循環中に見られ得る。Ｔｒｅｇは、マウスモデルにおいてＧＶＨＤ及び自己免疫を防ぐのに極めて有効であることが証明されている。移植、ならびに糖尿病及び他の適応症の治療におけるＴｒｅｇの養子移植による臨床試験は進行中である。末梢血液中のＴｒｅｇの相対頻度は、全リンパ球の約１～２％であり、これは、大部分の臨床的適用のために、養子移植の前にＴｒｅｇを生体外で増殖する必要性を含意する。生体外での増殖により十分なＴｒｅｇを産生することは、ヒトでのＴｒｅｇ療法の応用において大きな課題である。
Ｔｈ１７細胞
Ｔヘルパー１７細胞（または「Ｔｈ１７細胞」または「Ｔｈ１７ヘルパー細胞」）は、宿主防御を調節するＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の炎症サブセットであり、組織の炎症及び様々な自己免疫疾患に関与する。Ｔｈ１７細胞は、様々なヒト腫瘍で発見されているが、がん免疫におけるそれらの機能は不明である。腫瘍を持つマウス内に養子移植されたとき、Ｔｈ１７細胞は、黒色腫の根絶においてＴｈ１または非極性化（Ｔｈ０）Ｔ細胞よりも強力であることが見出されている（Ｍｕｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１１２：３６２－３７３（２００８））。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１及びＴｈ２系譜とは発生的に異なる。Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ－１Ｒ１及びＩＬ－２３Ｒシグナル伝達に応答性であるＣＤ４＋であり、サイトカインＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１７ＡＦ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２６（ヒト）、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－３α、及びＴＮＦαを産生する。Ｔｈ１７細胞の表現型は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ１６１＋である。養子細胞移植のためのＴｈ１７細胞の使用に対する１つの障害は、Ｔｈ１７細胞サブセット、及びそれらの不安定な表現型を体内で増殖させることができる、確固とした培養条件の特定（腫瘍微小環境）である。
本発明は、部分的に、特異的Ｔ細胞亜型の生成のための組成物及び方法に関する。本発明の組成物及び方法を使用して産生され得る１つの特異的Ｔ細胞亜型は、Ｔｈ１７細胞である。したがって、いくつかの態様において、本発明は、（例えば、抗ＣＤ３抗体を介した）ＣＤ３シグナル伝達及び（例えば、抗ＣＤ５抗体を介した）ＣＤ５シグナル伝達、１つ以上のサイトカイン、ならびに中和抗体（例えば、抗ＩＬ－４抗体及び抗ＩＦＮγ抗体）を使用して、Ｔｈ１７細胞を増殖させる（例えば、選択的に増殖させる）ための組成物及び方法に関する。いくつかの場合において、Ｔｈ１７細胞の選択的増殖のための組成物及び方法は、１つ以上の中和抗体の量の減少または除去をもたらす様式で調整される。
多くのＴ細胞に関する１つの問題は、Ｔ細胞の可塑性である。換言すれば、いくつかのＴ細胞は、変化して異なる亜型になることがある。また、このＴ細胞の変化は、多くの場合、周囲環境のＴ細胞によって媒介される。例えば、いくつかのＴ細胞亜型が、ＩＬ－４及び／またはＩＦＮγを発現する。これらのタンパク質は、周囲のＴ細胞に生理学的影響を与え、いくつかの場合においては、ある種類のＴ細胞が別の種類のＴ細胞に分化するのを媒介する。
Ｔｈ１７細胞等のＴ細胞サブセットの増殖（例えば、選択的増殖）は、１つ以上のシグナルの使用、１つ以上のシグナル強度の調節、２つ以上のシグナル間の強度の比率の調節、及び１つ以上のシグナルの除去によって行われてもよい。条件は、２つのパラメータまたは３つ以上のパラメータの比率に基づいて選択されてもよい。２つの例は次の通りである。（１）ＣＤ３シグナル及びＣＤ５シグナルの比率が調節され得る、及び（２）ＣＤ３シグナル及びＣＤ５シグナルの比率が調節され得ることが、ＣＤ３シグナル及びＣＤ５シグナルの合計の調節と組み合わされ得る。例として、Ｔｈ１７細胞の増殖が望ましいとき、２つのシグナルが選択され使用され得る（例えば、ＣＤ３シグナル及びＣＤ５シグナル）。これらのシグナルは、例えば、約１：１～約１：５０（例えば、約１：１～約１：５０、約１：１～約１：３０、約１：１～約１：２０、約１：１～約１：１５、約１：５～約１：１５、約１：５～約１：２０、約１：８～約１：１２、約１：８～約１：１５、約１：８～約１：２０等）の比率で調節されてもよい。
本発明には、Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１７ Ｔ細胞）の増殖のための、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）アンタゴニストの使用も含まれる。Ｔｈ１７ Ｔ細胞は、Ｔ細胞を、ＣＤ３シグナル（例えば、アゴニスト抗ＣＤ３抗体）、ＣＤ５シグナル（例えば、アゴニスト抗ＣＤ５抗体）、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、及びＡＨＲアゴニスト（例えば、ＦＩＣＺ）に曝露することによって増殖され得ることが見出されている。
本発明の実施において使用され得る例示的なＡＨＲリガンドとしては、ＦＩＣＺ（６－ホルミルインドロ［３，２－ｂ］カルバゾール）、ｄＦＩＣＺ（６，１２－ジホルミルインドロ［３，２－ｂ］カルバゾール）、２，３，７，８－テトラクロロジベンゾ－ｐ－ダイオキシン（ＴＣＤＤ）、２－（１′Ｈ－インドール－３′－カルビル）－チアゾール－４－カルボン酸メチルエステル（ＩＴＥ）、ケルセチン、インドール－３－カルビノール、リスベラトロール、クルクミン、Ｍ５０３６７｛３－［２－（２－フェニルエチル）ベンゾイミダゾール－４－イル］－３－ヒドロキシプロパン酸、及びＶＡＦ３４７｛［４－（３－クロロ－フェニル）－ピリミジン－２－イル］｝、インディゴ染料及びインディルビン等のトリプトファン誘導体、ビリルビン等のテトラピロール、ならびにアラキドン酸代謝物リポキシンＡ４及びプロスタグランジンＧが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合において、本発明には、Ｔｈ１７細胞の増殖のための組成物及び方法が含まれ、Ｔ細胞は次の試薬に曝露される：１つ以上のアゴニスト抗ＣＤ３抗体、１つ以上のアゴニスト抗ＣＤ５抗体、及び１つ以上のＡＨＲアゴニスト（例えば、ＦＩＣＺ）。いくつかの場合において、１つ以上のサイトカインも使用されてもよい。例示的なサイトカインとしては、ＩＬ－１β及びＩＬ－６が挙げられる。したがって、いくつかの場合において、Ｔ細胞は、１つ以上のアゴニスト抗ＣＤ５抗体、１つ以上のＡＨＲアゴニスト（例えば、ＦＩＣＺ）、ＩＬ－１β、及びＩＬ－６に曝露される。
いくつかの場合において、本発明には、Ｔｈ１７細胞の増殖のための組成物及び方法が含まれ、Ｔ細胞は、次の試薬に曝露される：１つ以上のアゴニスト抗ＣＤ３抗体、１つ以上のアゴニスト抗ＣＤ５及び／または抗ＣＤ２８抗体、ならびに１つ以上のサイトカイン。例示的なサイトカインとしては、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、及びＩＬ－２３が挙げられる。したがって、いくつかの場合において、Ｔ細胞は、１つ以上のアゴニスト抗ＣＤ３抗体、１つ以上のアゴニスト抗ＣＤ５及び／または抗ＣＤ２８抗体、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ならびにＩＬ－２３に曝露される。
したがって、本発明には、Ｔｈ１７細胞の増殖のための組成物及び方法が含まれ、出発Ｔ細胞集団の細胞は、ＴＧＦ－β及び／またはＩＬ－２３に曝露されない。
本発明の実施において使用されるＴ細胞集団は、例として、（ｉ）「バフィーコート」試料、（ｉｉ）非Ｔ細胞が枯渇した白血球細胞の試料（例えば、８０％超の混合Ｔ細胞を含有する試料）、（ｉｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の試料（例えば、８０％超のＣＤ４＋Ｔ細胞を含有する試料）、または主にＴｈ１７細胞を含有する試料（例えば、８０％超のＴｈ１７細胞を含有する試料）中に存在してもよい。したがって、いくつかの場合において、本発明の方法は、１つ以上のＴ細胞亜集団の選択的増殖に関する。
Ｔｈ１７ Ｔ細胞の増殖のための特定の配合、及び関連する増殖方法に関して、典型的に、高レベルのＴｈ１７細胞増殖を達成するように条件が調節される。
調節され得る１つの要素は、ＣＤ３シグナル（例えば、アゴニスト抗ＣＤ３抗体）に対するＣＤ５シグナル（例えば、アゴニスト抗ＣＤ５抗体）の比率である。多くの場合において、ＣＤ３シグナルの量は、ＣＤ５シグナルよりも少ない。ＣＤ３に対するＣＤ５シグナルの例示的な比率としては、約１～約１．５、約１～約２、約１～約３、約１～約５、約１～約８、約１～約１０、約１～約１２、約１～約１５、約１～約２０、約１～約２５、約１～約３０、約１～約４０、約１～約５０、約１～約７５、約１～約１００等の比率が挙げられる。
本発明の実施において使用され得る例示的な抗体としては、ＢＣ３抗ＣＤ３抗体（この抗体を発現するクローンは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である（ＨＢ－１０１６６））と、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを含むいくつかの供給元から入手可能なＵＣＨＴ２抗ＣＤ５抗体と、が挙げられる。
一般的に、抗体は、同種リガンドに対する特異性及び親和性が異なる傾向がある。したがって、ＣＤ３に対するＣＤ５シグナルの比率は、ＢＣ３抗体に対するＵＣＨＴ２抗体と同等であるように調節されてもよい。換言すれば、上に示される比率は、ＢＣ３抗体及びＵＣＨＴ２抗体に由来するデータに部分的に関連し、これらの抗体の比率がＴ細胞への生理学的効果を誘導する。したがって、他のＣＤ３及びＣＤ５シグナルが使用されてもよく、これらの他のシグナルの量が、同じ生理学的効果を達成するように調節されてもよい。言い換えれば、本発明には、上記のＢＣ３抗体及びＵＣＨＴ２抗体の比率の同じ生理学的効果を達成する様々なＣＤ３及びＣＤ５シグナル伝達作用物質が含まれる。そのような生理学的効果は、本明細書の他の箇所（例えば、実施例１０、及びそれに関連するデータ）に記載される方法によって測定されてもよい。
ＣＤ３及びＣＤ５シグナル伝達作用物質に加えて、試薬が、本発明の組成物中に存在してもよく、本発明の方法で使用されてもよい。これらの追加の試薬のうちの一部としては、ＡＨＲアゴニスト（例えば、ＦＩＣＺ）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１β及びＩＬ－６）、及びより多くの中和抗体（例えば、抗αＩＬ－４及び抗α－ＩＦＮ－γ中和抗体）のうちの１つが挙げられる。試薬は、例えば、図８に示す結果を達成するように調節されてもよい。具体的には、用いられるＡＨＲアゴニスト及びサイトカインの量は、典型的には、約１ｎＭ～約１ｍＭ（例えば、約１ｎＭ～約８００ｎＭ、約１ｎＭ～約５００ｎＭ、約１ｎＭ～約２５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約１ｍＭ、約２５ｎＭ～約５００ｎＭ、約２５ｎＭ～約３００ｎＭ、約５０ｎＭ～約３００ｎＭ、約７５ｎＭ～約５００ｎＭ、約７５ｎＭ～約３００ｎＭ等）の範囲にある。
メモリーＴ細胞
メモリーＴ細胞、または抗原経験細胞は、抗原との遭遇の前に、経験される。これらのＴ細胞は長寿命であり、抗原を認識し、これらのＴ細胞が以前曝露された抗原に対する免疫応答に迅速かつ強力に影響を与えることができる。メモリーＴ細胞は、次を包含し得る：幹細胞様メモリー細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリー細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）。ＴＳＣＭ細胞は、表現型ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋ （Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、及びＩＬ－７Ｒα＋を有するが、ＴＳＣＭ細胞は、多量のＩＬ－２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、及びＬＦＡ－１も発現する。ＴＣＭ細胞は、Ｌ－セレクチン及びＣＣＲ７を発現し、ＴＣＭ細胞は、ＩＬ－２を分泌するが、ＩＦＮγまたはＩＬ－４は分泌しない。ＴＥＭ細胞は、Ｌ－セレクチンまたはＣＣＲ７を発現しないが、ＩＦＮγ及びＩＬ－４等のエフェクターサイトカインを産生する。
本発明は、上記のＴ細胞亜集団の選択的増殖のための方法及び組成物を提供する。以前の方法は、当業者が、本明細書に記載の様式で特異的Ｔ細胞亜型を選択的に増殖させることを可能にしない。ある程度までのシグナル強度が、標準ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８に対するＴ細胞の比率を変えることにより調節することができる一方で（Ｋａｌａｍａｚｓｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２７：４０５－４１８（２００４））、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）と細胞表面との間の接触領域における刺激ＣＤ３抗体の局所濃度は、このアプローチにおいて影響を受けず、依然として高い。本明細書のデータは、Ｔ細胞応答の細かい調整を可能にし、Ｔｈ１７、抗原経験Ｔ細胞、及びＴｒｅｇなどの様々な特異的Ｔ細胞サブセットの選択的活性化及び増殖をもたらす、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）の表面に結合した一次抗体及び様々な共刺激性抗体の量及び比率を開示する。
Ｉ．定義
他に本明細書で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明の方法で使用するための抗体は、任意の種、クラス、または亜型の抗体であってもよいが、但し、そのような抗体は、必要に応じて、目的の標的、例えば、ＣＤ３、ＴＣＲ、またはＣＤ２８と反応することができることを条件とする。
したがって、本発明で使用するために「抗体」には、以下が含まれる：
（ａ）免疫グロブリンの様々なクラスまたはサブクラスのいずれか（例えば、任意の動物、例えば、通常使用される動物のいずれか、例えば、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラクダ類、または卵の黄身由来のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）；
（ｂ）モノクローナルまたはポリクローナル抗体；
（ｃ）未処置の抗体または抗体の断片、モノクローナルまたはポリクローナル。該断片は、抗体の結合領域を含有するもの、例えば、Ｆｃ部分を持っていない断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ断片、または他の単一ドメイン抗体）、未処置の抗体内の重鎖構成要素を接続するジスルフィド結合の還元開裂によって得られたいわゆる「半分子」断片である。Ｆｖは、２つの鎖として発現した、軽鎖の可変領域、及び重鎖の可変領域を含有する断片と定義され得る；
（ｄ）モノクローナル抗体、抗体の断片、「ヒト化抗体」、キメラ抗体、または合成的に作製もしくは変性された抗体様構造体を含む、組み換えＤＮＡまたは他の合成技法によって産生または修飾された抗体。
抗体の機能性誘導体または「同等物」、例えば、一本鎖抗体、ＣＤＲグラフト抗体等も含まれる。一本鎖抗体（ＳＣＡ）は、融合した一本鎖分子として、好適なポリペプチドリンカーによって結合された軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子と定義され得る。一価または二価であり得るＶＨＨ抗体も含まれる。
抗体断片ならびに合成及び誘導体化された抗体の調製方法は、当該技術分野において周知であり、文献には広く記載され、本明細書には記載されない。
用語「活性化」は、本明細書で使用される場合、測定可能な形態的、表現型、及び／または機能的変化を誘導するのに十分な細胞表面部分のライゲーションの後の細胞の状態を指す。Ｔ細胞の文脈内において、そのような活性化は、細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたＴ細胞の状態であり得る。Ｔ細胞の活性化はサイトカイン産生及び／または分泌、ならびに受容体もしくは接着分子等の細胞表面分子の発現の上向き調節もしくは下向き調節、またはある特定の分子の分泌の上向き調節もしくは下向き調節、ならびに調節性または細胞傷害性エフェクター機能の能力も誘導し得る。他の細胞の文脈において、この用語は、特定の物理化学プロセスの上向きまたは下向き調節のいずれかを暗示する。
抗体に関連して本明細書で使用される場合、用語「単位」は、抗ＣＤ３媒介性の生理学的効果に制限される。具体的には、０．３４単位の抗ＣＤ３は、３．４単位の抗ＣＤ２８の存在下で混合Ｔ細胞集団と接触された場合、１４日後にＴｒｅｇ細胞の１０００倍の増殖をもたらす抗体の量である（実施例２及び図１を参照されたい）。単位は、存在する抗体の数によって定義される。したがって、上記の事例において、抗ＣＤ３分子よりも１０倍多くの抗ＣＤ２８分子が存在する。
用語「刺激」は、本明細書で使用される場合、細胞表面部分のライゲーションによって誘導される一次応答を指す。例えば、受容体の文脈において、そのような刺激は、受容体のライゲーション及び後続のシグナル伝達事象を伴う。Ｔ細胞の刺激に関して、そのような刺激は、一実施形態において、続いてＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合等のシグナル伝達事象を誘導するＴ細胞表面部分のライゲーションを指す。さらに、刺激事象は、細胞を活性化し、受容体もしくは接着分子等の細胞表面分子の発現を上向き調節もしくは下向き調節するか、または腫瘍成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）の下向き調節等の、分子の分泌の上向き調節もしくは下向き調節を行い得る。したがって、直接シグナル伝達事象がない場合でさえ、細胞表面部分のライゲーションは、細胞骨格構造の再構築、または細胞表面部分の癒合をもたらし得、これらの各々が、それに続く細胞応答を増強するか、修正するか、または変化させるのに役立ち得る。
本明細書で使用される場合、用語「作用物質」、「リガンド」、または「刺激剤」は、細胞の１つ以上の区別された集団（例えば、Ｔ細胞亜集団のメンバー）と結合し、細胞応答を誘導する分子を指す。作用物質は、受容体、抗原決定基、または標的細胞集団上に存在する他の結合部位等の任意の細胞表面部分に結合し得る。作用物質は、タンパク質、ペプチド、抗体及びその抗体断片、融合タンパク質、合成分子、有機分子（例えば、小分子）等であってもよい。Ｔ細胞胞刺激の詳述及び文脈において、抗体は、そのような作用物質のプロトタイプの例として使用される。
Ｔ細胞に関連して本明細書で使用される場合、用語「選択的増殖」及び「選択的に増殖させる」は、他のＴ細胞が、増殖しないか、またはより遅い速度で増殖するかのいずれかの条件下で増殖する、ある特定のＴ細胞の能力を指す。一例として、Ｔ細胞亜型１及び２は、存在する全Ｔ細胞の５％及び１０％のパーセンテージでそれぞれ混合集団中に存在すると仮定されたい。ある特定の条件が、Ｔ細胞亜型１が存在する全Ｔ細胞の３０％を占め、Ｔ細胞亜型２が１２％を占める結果をもたらす場合、今はＴ細胞亜型２が全Ｔ細胞集団のより大きい部分ではあるが、Ｔ細胞亜型１は、Ｔ細胞亜型２よりも選択的に増殖される。Ｔ細胞の全パーセンテージとして、Ｔ細胞亜型２は、増加した「頻度」で存在するようになったという意味で、Ｔ細胞亜型２は、Ｔ細胞の混合集団の一般のメンバーより選択的に増殖される。したがって、選択的増殖は、一般のＴ細胞の集団よりも特定のＴ細胞亜型が増殖することに関するものであり、多くの場合、Ｔ細胞亜型の増殖ももたらす。上記の例は、Ｔ細胞亜型２も増殖はしているが、Ｔ細胞亜型１の選択的増殖のための条件と称され得る。
本明細書で使用される場合、用語「曝露する」は、近接または直接的接触の状態（ｓｔａｔｅ）または状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）にすることを指す。
本明細書で使用される場合、用語「増殖」は、新しい細胞を産生することによって成長または倍増することを意味する。
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、またはヒトであり得る。哺乳動物としては、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、マウス、及びラットが挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、対象はヒトである。「対象」は、（例えば、医師にかかっている）「患者」である場合があるが、いくつかの事例において、対象は患者ではない。
本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーション等の一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞の増殖及び／または活性化及び／または極性化をもたらすシグナルを指す。
本明細書で使用される場合、「分離」には、（例えば、濾過、親和性、浮遊密度、または磁気引力によって）ある構成成分を別の構成成分から実質的に精製するあらゆる手段が含まれる。
本明細書で使用される場合、「表面」は、該表面にくっついた作用物質を有することができるあらゆる表面を指し、限定するものではないが、金属、ガラス、プラスチックコポリマー、コロイド、脂質、及び細胞表面等が挙げられる。本質的に、表面に結合またはくっついた作用物質を保持することができるあらゆる表面。
本明細書において使用される場合、単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、その文脈が明確に示さない限り、複数形の参照を含む。
本明細書で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、及び「治療」等は、それに関連する障害及び／または症状を軽減または改善することを指す。排除はしないが、障害または病態の治療が、それに関連した障害または病態もしくは症状を完全に取り除くことを必要としないことが理解される。
ＩＩ．Ｔ細胞亜集団の産生方法
本発明の方法は、１つ以上の実質的に純粋な特異的Ｔ細胞亜集団（複数可）を選択的に増殖させるために利用することができる。例示的なＴ細胞亜集団としては、Ｔｒｅｇ細胞、Ｔｈ１７細胞、及びメモリーＴ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。増殖されたＴ細胞亜集団のための例の使用が、本明細書に開示される。
Ｔ細胞の混合集団の供給源
Ｔ細胞の混合集団の出発源は、対象から単離されてもよい血液（例えば、循環血液）であってもよい。循環血液は、１単位以上の血液から、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスから得てもよい。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、及び血小板を含む、リンパ球を含有する。Ｔ細胞は、血液単核細胞、骨髄、胸腺、組織バイオプシー、腫瘍、リンパ節組織、胃腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓組織、または任意の他のリンパ組織、及び腫瘍を含むいくつかの供給源から得ることができる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞株及び臍帯血を含む自己または同種の供給源から得ることができる。Ｔ細胞は、異種の供給源、例えば、マウス、ラット、ヒトではない霊長類、及びブタからも得ることができる。
本発明のある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ分離等の、当業者に既知の任意の数の技法を使用して、対象から回収されたある単位の血液から得られ得る。Ｔ細胞は、対象の循環血液から単離されてもよい。血液は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって対象から得られてもよい。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、及び血小板を含む、リンパ球を含有する。感作組成物への曝露及びそれに続く活性化及び／または刺激の前に、Ｔ細胞の供給源は、対象から得られる。いくつかの実施形態において、アフェレーシスによって回収された細胞を洗浄し、血漿タンパク分画を除去し、該細胞を、続く処理ステップのために、適切な緩衝液または培地に入れてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを含まず、マグネシウムを含まない場合があるか、または全てではないが、多くの二価カチオンを含まない場合がある。当業者であれば容易に理解するように、洗浄ステップは、製造業者の説明書に従って、半自動「流水式」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ２９９１細胞プロセッサＢａｘｔｅｒ）の使用によって等の当業者に既知の方法によって達成されてもよい。洗浄後、細胞を、例えば、カルシウム（Ｃａ）及びマグネシウム（Ｍｇ）を含まないＰＢＳ等の様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁させてもよい。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない構成成分を除去し、細胞を培養液中に直接再懸濁させてもよい。
他の実施形態において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解または除去し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって単球を枯渇させることにより、末梢血液リンパ球から単離される。特異的なＴ細胞の亜集団は、正または負の選択技法によってさらに単離することができる。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋細胞に対して正に選択され得る。当業者に既知の任意の選択技法が、使用されてもよい。１つの非限定的な例は、フローサイトメトリー選別である。別の実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体が結合した固体支持体と一緒にインキュベートすることにより単離され得る。１つの非限定的な例は、所望のＴ細胞の正の選択に十分な期間の、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号１１１４１Ｄ）等の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８結合ビーズである。さらなる実施形態において、該期間は、３０分～３６時間以上及びそれらの間の全ての整数値の範囲にわたる。さらなる実施形態において、該期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。別の実施形態において該期間は、１０～２４時間である。一実施形態において、インキュベーション期間は、２４時間である。２４時間等のより長いインキュベーション時間は、細胞の産生量を増加させ得る。他の細胞型と比較してＴ細胞がほとんどないあらゆる状況において、より長いインキュベーション時間を使用して、Ｔ細胞を単離してもよい。本発明の一態様において、負の選択によるＴ細胞集団の富化は、負に選択された細胞に特有の表面マーカーに向けられる抗体の組み合わせにより達成され得る。１つの可能性のある方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けるモノクローナル抗体のカクテルを使用する、磁気免疫付着（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）またはフローサイトメトリーによる細胞選別及び／または選択である。いくつかの実施形態において、増殖倍率は、ドナー細胞の変異性に起因して、出発材料に基づいて異なり得る。いくつかの実施形態において、正常な出発密度は、約０．５×１０６～１．５×１０６であり得る。
加えて、Ｔ細胞亜集団は、１つ以上のマーカー（複数可）が存在するかまたは存在しないかに基づく選択により生成され得る。例えば、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７負／低、及び任意でＦＯＸＰ３＋である細胞の選択に基づいて混合集団から得られてもよい。いくつかの場合において、Ｔｒｅｇ細胞は、ＦＯＸＰ３－であってもよい。この事例において、選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）は、１つ以上の定義可能な特質に基づく細胞の「選択（ｃｈｏｏｓｉｎｇ）」を事実上指す。さらに、選択は、１つ以上の特質を有する細胞（正）または１つ以上の特質を有しない細胞（負）に関しての選択であり得る点で、正または負であり得る。
Ｔｒｅｇ細胞に関して、例示の目的で、これらの細胞は、ＣＤ４及び／またはＣＤ２５に結合する抗体が結合した表面（例えば、磁気ビーズ）に、これらの細胞が結合することと、ＣＤ１２７に結合する抗体が結合した表面（例えば、磁気ビーズ）に非Ｔｒｅｇ細胞が結合することと、により、混合集団から得られてもよい。特定の例として、ＣＤ３に結合する抗体が結合した磁気ビーズを使用して、ＣＤ３＋細胞を単離してもよい。解放されたら、得られたＣＤ３＋細胞を、ＣＤ４に結合した抗体が結合する磁気ビーズと接触させてもよい。次いで、得られたＣＤ３＋、ＣＤ４＋細胞を、ＣＤ２５と結合する抗体が結合した磁気ビーズと接触させてもよい。次いで、得られたＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞を、ＣＤ１２７に結合する抗体が結合した磁気ビーズと接触させてもよく、ここで、回収される細胞は、該ビーズに結合しない細胞である。
いくつかの場合において、複数の特質を同時に使用して、Ｔ細胞亜集団（例えば、Ｔｒｅｇ細胞）を得てもよい。例えば、２つ以上の細胞表面マーカーに結合する抗体が結合した表面も、使用されてもよい。特定の例として、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞は、混合集団から、ＣＤ４及びＣＤ２５に結合する抗体が結合した表面にこれらの細胞が結合することにより、得られてもよい。複数の特質についての同時選択は、所望の細胞型（複数可）と一緒に「共精製」する望ましくない細胞型をもたらし得る。これは、上記の特定の例を使用した場合、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞に加えて、ＣＤ４＋、ＣＤ２５－及びＣＤ４－、ＣＤ２５＋である細胞が得られ得るためである。
フローサイトメトリーは、所望の特質に基づく細胞の分離に特に有用である。細胞は、関心対象の細胞に結合する分子（例えば、ＣＤ１２７に結合するＩＬ－７、ＣＤ２５に特異的な抗体等の天然リガンド）に関連した検出可能な標識に基づいて分離されてもよい。したがって、フローサイトメトリーシステムによって検出及び／または分化され得る細胞構成成分に結合するリガンドを使用して、特定の特質を有するＴ細胞を精製／単離してもよい。さらに、複数の特質の存在、または非存在が、フローサイトメトリーによって同時に判定されてもよい。
したがって、本発明には、Ｔ細胞亜集団のメンバーは、特定の特質によって同定され、これらの特質に関して異なる細胞から分離される、１つ以上のＴ細胞亜集団のメンバーを得るための方法が含まれる。本発明の方法で使用され得る特質の例としては、次のタンパク質の存在または非存在が挙げられる：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ２７８、ＣＤ３３５、及びＦＯＸＰ３。
得ようとする細胞に関連する特質の選択は、特定の試料中に存在する細胞によって異なる。例えば、臍帯血（ＵＣＢ）は、移植片対宿主病の影響を緩和し得るＴｒｅｇ細胞を含有することが明らかになっている。しかしながら、ＵＣＢは、末梢血液中には通常見られない細胞比を含有する。ＵＣＢ中に見られる細胞の１つのカテゴリーは、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは一般に、ＣＤ３４＋であり、これは、好適なリガンドが結合した表面に結合することによって、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、及び／もしくはＣＤ３４＋のうちの１つ以上に結合する標識された分子によって、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞から分離され得る。
したがって、本発明は、混合物中の関心対象の細胞の数が、少なくとも５倍（例えば、約５倍～約５０倍、約１０倍～約５０倍、約１５倍～約５０倍、約２０倍～約５０倍、約２５倍～約５０倍、約１０倍～約４０倍、約１０倍～約３０倍等）に増加する、細胞を精製するための組成物及び方法に関する。精製の例は、ある細胞型が、精製前には混合集団中の全細胞の５％を占め、精製前には混合集団の全細胞の２５％を占める場合である。これは、５倍精製の例である。
図１０Ａ及び図１０Ｂに見られるように、ＣＤ３／ＣＤ５単離Ｔ細胞は、直接極性化及び増殖され得る。Ｔｈ１７極性化プロトコルのための１つの出発材料は、ＣＤ３またはＣＤ４富化細胞（正または負の単離）である。
上流単離は、困難かつコストがかかり、Ｔｈ１７生成のためのプロセスを複雑にする。ＣＤ３／ＣＤ５ビーズ（Ｔｈ１７極性化で使用されるのと同じ）は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳを使用したときと類似した効率で、ＣＤ３細胞（Ｔ細胞）を効率的に単離することを見出した（３：１のビーズ：細胞比率で９０％超、及び１：１のビーズ：細胞比率で８０％）（図１０Ａ）。図１０Ｂに示すように、そのような正にＣＤ３／ＣＤ５単離したＴ細胞は、直接極性化されてＴｈ１７細胞になり得る。
本発明は、Ｔ細胞の同時活性化及び精製のための組成物及び方法にも関する。そのような組成物及び方法の例には、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５抗体が結合した磁気ビーズを含有する混合物の形成が含まれ、該反応混合物にＴｈ１７ Ｔ細胞が含まれる。この事例において、Ｔｈ１７ Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５抗体による活性化、及びＣＤ３及び／またはＣＤ５表面マーカーを含有しない他の細胞からの分離の両方が行われ得る。当然、ＣＤ３及びＣＤ５以外のタンパク質、ならびにタンパク質の様々な組み合わせ（例えば、ＣＤ３及びＣＤ２８；ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７；ＣＤ３及びＣＤ１３７；ＣＤ３及びＣＤ２７８；等）が、Ｔ細胞の活性化及び精製の両方に使用されてもよい。
さらに、Ｔ細胞を同時に活性化及び精製するために磁気ビーズが使用される場合、ビーズに対する細胞の比率は、精製効率を高めるように調節することができることが見出された。例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号４０２０３Ｄ）を使用して、３：１のビーズ対細胞比率は、９０％超純粋なＴ細胞集団を得るために使用することができ、１：１のビーズ対細胞比率は、約８０％純粋なＴ細胞集団を得るために使用することができることが見出された。したがって、本発明は、ビーズに対する細胞の比率が、約２０：１～約１：５（例えば、約２０：１～約１：２、約２０：１～約１：１、約２０：１～約２：１、約２０：１～約３：１、約１０：１～約１：１、約１０：１～約２：１、約１０：１～約３：１等）である、Ｔ細胞の精製のための組成物及び方法を提供する。本発明は、ビーズに対する細胞の比率が、少なくとも８０％（例えば、約８０％～約９９％、約８３％～約９９％、約８５％～約９９％、約８８％～約９９％、約９０％～約９９％、約９３％～約９９％、約９５％～約９９％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％等）純粋な活性化Ｔ細胞集団をもたらすように調節される、Ｔ細胞の精製のための組成物及び方法も提供する。
上記の方法によって得られた精製されたＴ細胞は、種類が混ざっているか、または特定の種類（例えば、Ｔｒｅｇ細胞）であってもよい。例えば、ＣＤ３及びＣＤ２８タンパク質は、いくつかの異なるＴ細胞亜型の表面上に存在する。したがって、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を使用して精製したＴ細胞は、多くの場合、混合集団である。特異的Ｔ細胞亜型を、ケモカイン、サイトカイン、または他の作用物質（例えば、ラパマイシン、アリール炭化水素受容体アゴニスト等）等の追加の作用物質を使用して、そのような混合集団から増殖させてもよい。したがって、精製された混合Ｔ細胞の集団は、活性化及び／または増殖条件の調節によって、１つ以上の亜型のＴ細胞を生成するのに使用されてもよい。
例えば、Ｔｈ１７細胞を、以下のプロセス等のプロセスによって、精製、活性化、及び増殖させてもよい。Ｔ細胞は、固体支持体に結合した抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ４抗体のいずれかを使用して、混合細胞集団から精製されてもよい（正の単離）。固体支持体に結合した細胞を、回収し、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ５抗体を含有する固体支持体に曝露する。これらのビーズに結合したＴ細胞を、結合していない細胞から分離し、次いで、Ｔｈ１７細胞の極性化を促進する作用物質（例えば、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、アリール炭化水素受容体拮抗分子等）に曝露する。次いで、これらのＴ細胞を、Ｔｈ１７細胞の増殖を可能にする条件下で維持する。いくつかの場合において、他のＴ細胞を、使用した条件下で増殖させてもよい。条件は、通常、Ｔｈ１７細胞が他のＴ細胞亜型よりも早く増殖するように調節される。
様々なＴ細胞亜集団への増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）
対象から単離されたＴ細胞の混合集団は、一次作用物質を用いた一次活性化シグナルへのこれらのＴ細胞の曝露を様々に変えることによって、様々なＴ細胞亜集団へと増殖することができる。一次活性化シグナルは、抗ＣＤ３であり、抗ＣＤ３（例えば、抗ＣＤ３抗体またはＣＤ３に対して結合特異性を有する他の作用物質）である一次作用物質を用いて達成することができる。一次活性化シグナルは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ１３４、ＣＤ２、ＬＦＡ－１、ＣＤ４０、ＳＬＡＭ、ＧＩＴＲ、及び／またはＩＣＯＳに向けられ得る第２の作用物質及び／または第３の作用物質と組み合わせて使用することができる。
本発明の細胞は、上記及び本明細書で記載される作用物質を含む培養液中でインキュベートすることによって増殖させることができる。本発明の組成物は、ある表面に結合した、既定の比率の特異的Ｔ細胞増殖作用物質を含む。本発明のＴ細胞増殖作用物質は、１つ以上の共刺激シグナルと一緒に存在してもよい。Ｔ細胞増殖作用物質に対する共刺激シグナルの比率は、１：１０００、約１：５００、約１：１００、約１：５０、約１：４０、約１：３０、約１：２０、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、または約１：２であってもよい。いくつかの実施形態において、２つ以上の共刺激シグナルは、例えば、１：１０００：１０００、約１：５００：５００、約１：１００：１００、約１：５０：５０、約１：４０：４０、約１：３０：３０、約１：２０：２０、約１：１０：１０、約１：５：５、約１：４：４、約１：３：３、または約１：２：２の比率で存在してもよい。いくつかの実施形態において、追加の共刺激シグナルが存在してもよい。いくつかの実施形態において、個々の共刺激シグナルに対する一次シグナルの比率は、同じでなくてもよい（例えば、一次シグナルに対する共刺激シグナルの比率は、１：４：３である）。さらに、シグナルに対する細胞の比率は、選択的増殖で適用されるシグナルの総量によって制御することができる。例えば、ビーズ結合刺激シグナルにおいて、ビーズ：細胞比率は、変えられてもよい。
一実施形態において、単離されたＴ細胞を、表面作用剤を含むビーズによって増殖させる。単離されたＴ細胞は、１つの細胞当たり約１つのビーズの比率で、ビーズまたは本発明の他の組成物と一緒に生体外でインキュベートすることによって活性化及び増殖させることができる。他の実施形態において、ビーズを、約１００個の細胞／ビーズの比率、約１０個の細胞／ビーズの比率、約５個の細胞／ビーズの比率、約２個の細胞／ビーズの比率、約２個のビーズ／細胞の比率、約５個のビーズ／細胞の比率、約１０個のビーズ／細胞の比率、または約１００個のビーズ／細胞の比率で培養液中で使用して、Ｔ細胞を活性化及び増殖させ得る。
ビーズ：細胞の比率、総濃度、及び／または共刺激シグナルの相対比率を各々、最大の増殖倍率、増殖される細胞集団内での所望の細胞型の割合、または所望の細胞型の相対数を達成するように調節することができる。得られる細胞集団は、全細胞集団と比較して、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の所望の細胞型を含み得る。所望の細胞型の相対数は、所望の細胞の割合を全細胞集団の増殖倍率で乗じたものと定義される。所望の細胞型の相対数は、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３５０、約４００、または約５００を含み得る。
Ｔｒｅｇに関しては、刺激法は、他の細胞、例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞等の他のＴ細胞の存在下で行われてもよく、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞は、これら自体が本発明の方法の間により著しく増殖することができる。したがって、上述のプロトコルにおいて、Ｔ細胞の単離ステップは、ＣＤ４＋細胞のかなりの部分（すなわち、少なくとも約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０または約９０％）または全ての単離を含み得、すなわち試料からのＣＤ２５＋の両方を含む。したがって、本発明の一実施形態において、単離ステップには、ＣＤ４＋細胞の単離が含まれる。さらに、他の細胞も、Ｔｒｅｇ、Ｔｈ１７またはメモリーＴ細胞が単離ステップの前または後に、刺激法で使用される細胞の一部のみを形成するように、存在してもよい。したがって、刺激ステップにおいて、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋は、刺激に供される細胞の一部として存在してもよく、すなわち、刺激に供される全細胞を少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０または約９０％含む調製物等の、富化調製物が使用されてもよい。
いくつかの場合において、少なくとも一部のＣＤ４－、ＣＤ２５－細胞は、存在せず、例えば、出発材料中に現れたこれらの細胞の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％が、存在しない。あるいは、刺激／増殖のための出発細胞は、少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、または約９８％のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞等の、実質的に全てのＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞であってもよい。
Ｔｒｅｇ細胞を選択的に増殖させるためのＴ細胞の刺激には、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８作用物質による刺激が含まれ得る。先の抗ＣＤ３／ＣＤ２８共刺激性アプローチとは対照的に、いくつかの態様において、本発明は、抗ＣＤ３作用物質が抗ＣＤ２８作用物質よりも少ない量で存在するように、低い抗ＣＤ３対抗ＣＤ２８比率を利用する。抗ＣＤ３対抗ＣＤ２８比率は、約１：１０００、約１：５００、約１：１００、約１：５０、約１：４０、約１：３０、約１：２０、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、または約１：２であり得る。いくつかの場合において、Ｔｒｅｇ細胞の選択的増殖には、（１）抗ＣＤ３及び（２）抗ＣＤ５及び／または抗ＩＣＯＳ作用物質による刺激が含まれ得る。
Ｔｈ１７細胞を選択的に増殖させるためのＴ細胞の刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）には、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、及び／またはＩＣＯＳ受容体を用いて刺激（ｉｎｎｅｒｖａｔｅ）する刺激作用物質が含まれ得る。いくつかの実施形態において、Ｔｈ１７細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＩＣＯＳ抗体を使用することによって産生され得る。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＤ３受容体刺激のレベルは、ＩＣＯＳ刺激のレベルと比較して、より低い濃度であり得る。例として抗体を使用して、抗ＣＤ３に対する抗ＩＣＯＳの比率は、約１：１０００、約１：５００、約１：１００、約１：５０、約１：４０、約１：３０、約１：２０、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、または約１：２であり得る。
Ｔメモリー細胞を選択的に増殖させるためのＴ細胞の刺激には、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２７、もしくは抗ＣＤ２８、または抗ＣＤ１３７による刺激が含まれ得る。多くの場合において、抗ＣＤ３作用物質は、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２７、及び／または抗ＣＤ１３７作用物質と比較して、より低い濃度で存在し得る。抗ＣＤ３対抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２７対抗ＣＤ１３７の比率は、約１：１０００：１０００、約１：５００：５００、約１：１００：１００、約１：５０：５０、約１：４０：４０、約１：３０：３０、約１：２０：２０、約１：１０：１０、約１：５：５、約１：４：４、約１：３：３、または約１：２：２であり得る。
単離に続いて、Ｔ細胞を、１～５日の期間、１～４日の期間、２～３日の期間、約２日の期間、または約３日の期間、培養液中で本発明の組成物と一緒に、攪乱せずにインキュベートすることにより活性化させてもよい。攪乱せずに活性化させた後、単離されたＴ細胞を、必要に応じて新しい培養液及びサイトカインを添加することによって、増殖させる。増殖は、７～２０日の期間、８～１５日の期間、１０～１４日の期間、約１０日の期間、約１１日の期間、約１２日の期間、約１３日、または約１４日の期間起こり得る。Ｔ細胞増殖のためのサイトカインは、上に記載され、実施例を参照して下記に論じられる。
Ｔ細胞の増殖は、Ｔ細胞亜集団細胞の指定のＴ細胞数を産生することができるようなものであり得る。例えば、約１０６個の細胞、約１０７個の細胞、約１０８個の細胞、または約１０１０個の細胞（例えば、約１０６～約１０１０個の細胞、約１０７～約１０１０個の細胞、約１０８～約１０１０個の細胞、約１０９～約１０１０個の細胞、約１０６～約１０９個の細胞、約１０６～約１０９個の細胞等）を含むＴ細胞亜集団が、本発明の方法及び組成物を使用してＴ細胞を増殖させることにより、産生され得る。
本発明の方法を使用して、Ｔ細胞亜集団における活性化／増殖が、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約２０日、約３０日後等（例えば、約２時間～約３０日、約８時間～約３０日、約２０時間～約３０日、約１日～約３０日、約３日～約３０日、約５日～約３０日、約７日～約３０日後等）に達成され得る。
いくつかの場合において、１つ以上の刺激シグナル（例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、インターロイキン２等）を含有する固相（例えば、ビーズ）は、増殖後にＴ細胞集団から除去されない。他の場合において、Ｔ細胞集団が上述の必要なレベルにまで増殖されたら、次いで、この増殖された集団は、適切な手法で固相から分離されてもよい。例えば、１つ以上の刺激シグナルのうちの１つが固相に結合し、この固相が組織培養ウェル、プレート、またはビンである場合、Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞を含有する培養培地を除去することによって得られてもよい。固相が例えば磁気ビーズを備える場合、磁場を使用してビーズを容器の側部に引き付け、次いで、Ｔ細胞を含有する培養培地を注ぎ出してもよい。他の粒子固体支持体（例えば、非磁気ビーズ）を、遠心分離するか、または濾過して細胞から離してもよい。大部分のＴ細胞が典型的に、培養培地中に位置するが、一部のＴ細胞は、増殖後に固相に結合していると考えられる。所望される場合、そのようなＴ細胞を、ピペットまたは他の好適な手段を使用して、例えば再懸濁により引き離してもよい。そのような再懸濁は、通常、収率を向上させるために、Ｔ細胞を固相から分離する前に行われる。固相から分離されたら、次いで、Ｔ細胞集団は、任意の望ましい手法でさらに処理及び／または操作されてもよいか、または、例えば、以下に記載されるインビトロ実験及び研究、非治療用途、治療用途等の好適な用途のために、直接使用されてもよい。
可溶性活性化物質が用いられる場合、活性化物質は、必要に応じて、適切なリガンド、例えば、ＣＤ３またはＣＤ２８を用いて競合により除去されてもよいが、多くの場合において、Ｔ細胞が培養培地から回収され、さらに精製せずに本明細書に記載される用途のために使用される。好都合なことに、大規模な用途に関しては、適切な単離及び調製プラットフォームを使用して、刺激及び／もしくは増殖プロトコルのためのＴ細胞集団の選択を行ってもよく、かつ／または生成されたＴ細胞集団の単離を行ってもよい。この点において、例えば、増殖前に細胞単離のため、及び増殖後にＤＹＮＡＢＥＡＤ（登録商標）除去のために行われる任意の磁気細胞分離ステップのために閉鎖無菌使い捨て袋が使用されてもよい、ＤＹＮＡＬのＤＹＮＡＭＡＧ（商標）ＣＴＳプラットフォームが特に言及され得る。
必要ならば、本発明の方法に従って増殖／活性化されるＴ細胞集団は、最初の刺激と同じ手法で、該細胞をさらなる活性化物質に接触させることによって再刺激されてもよい。一般に、再刺激は、Ｔ細胞が、例えば、１０～１６日を超える長期間培養される場合にのみ必要または望ましい。
Ｔｒｅｇ細胞は、一次活性化のために使用した同じビーズと一緒にインキュベートすることにより、増殖に続いて再刺激されてもよい。Ｔｒｅｇ細胞は、一次活性化後、約１６日目、１４日目、約１１日目、約１０日目、約９日目、約８日目、約７日目、約６日目、または約１２時間後に再刺激されてもよい。
本発明の方法に従うＴ細胞亜集団における増殖は、比較的小さい数の増加をもたらし得るが、多くの場合、結果は、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、約２０倍、または約５０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、約５００倍、約１，０００倍、約２，０００倍、約５，０００倍、約１０，０００倍、約２０，０００倍、約３０，０００倍、約４０，０００倍、約５０，０００倍、約７５，０００倍、約１００，０００倍以上の細胞数の増加等の大幅な増加である。そのような数の増加は、細胞増殖プロトコルにおける任意の適切な時点で測定されてもよい。
本発明は、Ｔ細胞亜集団の１つ以上の実質的に純粋な集団（複数可）を生成するための方法を提供する。本発明の目的のため、実質的に純粋なＴ細胞亜集団の集団は、約１０％以下の望ましくない細胞（例えば、所望の亜集団細胞型ではない）を含有する。例えば、例示の目的のため、Ｔｒｅｇ細胞が所望のＴ細胞亜集団である場合、実質的に純粋なＴｒｅｇ亜集団は、約１０％以下のＴｒｅｇ細胞ではない細胞を含有する。当然、これは、他のＴ細胞亜集団にも当てはまる。いくつかの実施形態において、実質的に純粋は、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、及び／または約１％以下の所望の亜集団（複数可）のメンバーではないＴ細胞を含み得る。
標準Ｔｈ１７生成プロトコル（極性化サイトカインを含むＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地）において、刺激固体支持体（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））は、典型的に培養期間中、培養液中に保持される。特に、少量の細胞が含有され、ウイルス導入（遺伝子組み換え）のために調製される場合、培養期間の最後の前に固体支持体（例えば、ビーズ）が取り除かれ得る場合に、プロセスの単純化が起こる（例えば、活性化後４８時間または７２時間）。改善された一方向プロセスは、培養の終わり間近または終わりに、大規模固体支持体（例えば、磁気ビーズ）を除去する必要がないことである。
図９Ａ及び９Ｂに示すように、活性化支持体を早期に除去することで、Ｔｈ１７表現型に向けたＴｈ０細胞の極性化の改善がもたらされることも見出された。早期ビーズ除去を用いた実験も、ビーズの除去に影響されずに、最大２００倍の増殖を示した。
早期ビーズ除去のＴｈ１７極性化への影響は、ＣＤ５共刺激細胞においてよりもＩＣＯＳ共刺激細胞において大きく、ＣＤ２８共刺激後ではほぼ無視できるほどであったことが認められた（図９Ａ及び図９Ｂ）。
いくつかの場合において、Ｔ細胞を活性化するために使用した固体支持体（例えば、磁気ビーズ等のビーズ）を、Ｔ細胞混合物から除去することが望ましい場合がある。さらに、いくつかの場合において、かなり短い期間の後（例えば、５日以内）にそのような固体支持体を除去することが望ましい場合がある。したがって、本発明には、Ｔ細胞が、１つ以上の細胞表面マーカーを刺激する作用物質に、５日未満（例えば、約１日～約５日、約２日～約５日、約３日～約５日、約１日～約４日、約２日～約３日等）曝露される、Ｔ細胞活性化のための組成物及び方法が含まれる。
特定の実施形態において、Ｔ細胞の混合集団の複数の試料は、Ｔ細胞増殖を可能にする条件下で、（１）抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ５抗体を含有する固体表面（例えば、磁気ビーズ）、（２）ＩＬ－１β、及び（３）ＩＬ－６、（４）ＩＬ－２３、及び（５）ＴＧＦ－β（ならびに、任意で、アリール炭化水素受容体アゴニスト）に曝露される。一試料に関しては、固体表面を除去しない。第２の試料に関しては、固体表面を、１日後に除去する。第３の試料に関しては、固体表面を２日後に除去する。第４の試料に関しては、固体表面を３日後に除去する。活性化Ｔ細胞の増殖は、実施例１０に本質的に記載されるように行ってもよい。増殖プロセス（約１４日）の終わりに、増殖された細胞のＴｈ１７表現型、Ｔｈ１７細胞の数、及びＴｈ１７細胞に対する他の細胞型の比率を決定する。
ＩＩＩ．本発明の組成物
本発明の組成物は、特異的Ｔ細胞亜集団の増殖を刺激することができる量、比率、または組み合わせの固定化された作用物質を有する表面を備える。代替実施形態において、該作用物質は、溶液中に存在してもよい。
本発明で企図される作用物質としては、タンパク質リガンド、及び合成リガンドが挙げられる。細胞表面部分に結合することができ、ある特定の条件下で、シグナル伝達につながるライゲーション及び集合をもたらすことができる作用物質としては、レクチン（例えば、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）、レンチルレクチン、コンカナバリンＡ）、抗体、抗体断片、ペプチド、ポリペプチド、グリコペプチド、受容体、Ｂ細胞受容体及びＴ細胞受容体リガンド、ＭＨＣ－ペプチド二量体または四量体、細胞外マトリックス構成成分、ステロイド、ホルモン（例えば、成長ホルモン、副腎皮質ステロイド、プロスタグランジン、テトラ－ヨード甲状腺ホルモン（ｔｅｔｒａ－ｉｏｄｏ ｔｈｙｒｏｈｏｒｍｏｎｅ）、副腎皮質ステロイド、プロスタグランジン、テトラ－ヨードサイロミン（ｔｅｔｒａ－ｉｏｄｏ ｔｈｙｒｏｍｉｎｅ））、（リポ多糖類等の）細菌部分、マイトジェン、超抗原及びこれらの誘導体、成長因子、サイトカイン、（Ｌ－セレクチン、ＬＦＡ－３、ＣＤ５４、ＬＦＡ－１等の）接着分子、ケモカイン、ならびに小分子が挙げられるが、これらに限定されない。作用物質は、細胞、血液製剤、及び組織等の天然供給源から単離されてもよいか、化学合成によって、または当該技術分野において既知の他の方法によって、組み換えで調製された、インビトロで増殖された細胞から単離されてもよい。
一実施形態において、本発明の作用物質としては、抗体が挙げられる。本発明の抗体としては、抗ＣＤ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｏｒｗａｙ）；抗ＣＤ１３７（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎａｖａｒｒａ，Ｐａｍｐｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎによって供給されている６Ｂ４、またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ製の４Ｂ４－１）；抗ＣＤ２８（ＸＲ－ＣＤ２８：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｏｒｗａｙ）；抗ＩＣＯＳ（ＩＳＡ－３）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、抗ＣＤ２、抗ＣＤ５、抗ＣＤ６、抗ＣＤ１３４、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＧＩＴＲ、抗ＬＦＡ－１、抗ＳＬＡＭ、抗ＣＤ２７、抗ＨＶＥＭ、抗ＬＩＧＨＴ、抗ＤＲ３、抗ＴＩＭ１、抗ＣＤ２２６が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等の公的供給源から得ることができ、Ｔ細胞アクセサリー分子及び細胞表面タンパク質に対する抗体は、標準の技法によって産生することができる。本発明の方法で使用するための抗体を生成するための方法は、当該技術分野で既知である。抗体は、特定の所望の特性を有するように設計された、遺伝子操作された免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＩｇ断片としても産生されてもよい。非限定的例として、抗体には、第１の哺乳類種からの少なくとも１つの可変（Ｖ）領域ドメイン及び第２の別個の哺乳類種からの少なくとも１つの定常領域ドメインを有するキメラ融合タンパク質である組み換えＩｇＧが含まれ得る。最も一般的には、キメラ抗体は、マウス可変領域配列及びヒト定常領域配列を有する。そのようなマウス／ヒトキメラ免疫グロブリンは、相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフトすることによって「ヒト化」されていてもよく、該相補性決定領域は、ヒト由来のＶ領域フレームワーク領域及びヒト由来の定常領域における、マウス抗体由来の抗原に対する結合特異性を与える。異なる特異性のＣＤＲを含有する抗体は、また、多特異性（二重または三重特異性等）抗体を生成するように組み合わされてもよい。これらの分子の断片は、タンパク質消化によって、もしくは任意で、タンパク質消化、その後ジスルフィド結合の穏やかな還元及びアルキル化によって、または組み換え遺伝子操作技法によって生成されてもよい。
本発明の作用物質としては、細胞表面受容体ＣＤ３、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ（ＩＳＡ－３）、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ１３４、抗ＣＤ４０Ｌ、ＬＦＡ－１、ＬＦＡ－２、ＬＦＡ－３に特異的に結合する任意の分子がさらに上げられ得る。本発明の作用物質は、ペプチド、小有機分子、ペプチド模倣物、可溶性Ｔ細胞受容体、または抗体等を含んでもよい。本発明の作用物質は、天然に存在する細胞表面受容体リガンドであってもよい。本発明の好適な作用物質は、競合及び非競合アッセイを含む、当該技術分野で既知の、親和性及び結合の特異性を判定するためのアッセイによって同定されてもよい。関心対象のアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー等が挙げられる。
本発明で企図される作用物質としては、タンパク質リガンド、天然リガンド、及び合成リガンドがさらに挙げられ得る。細胞表面部分に結合することができ、ある特定の条件下で、シグナル伝達につながるライゲーション及び集合をもたらすことができる作用物質としては、レクチン（例えば、ＰＨＡ、レンチルレクチン、コンカナバリンＡ）、抗体、抗体断片、ペプチド、ポリペプチド、グリコペプチド、受容体、Ｂ細胞受容体及びＴ細胞受容体リガンド、細胞外マトリックス構成成分、ステロイド、ホルモン（例えば、成長ホルモン、副腎皮質ステロイド、プロスタグランジン、テトラ－ヨードサイロニン）、（リポ多糖類等の）細菌部分、マイトジェン、抗原、超抗原及びこれらの誘導体、成長因子、サイトカイン、ウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ ｇｐ－１２０）、（Ｌ－セレクチン、ＬＦＡ－３、ＣＤ５４、ＬＦＡ－１等の）接着分子、ケモカイン、ならびに小分子が挙げられるが、これらに限定されない。作用物質は、細胞、血液製剤、及び組織等の天然供給源から単離されてもよいか、もしくは組み換えで調製された、インビトロで増殖された細胞から単離されてもよいか、または当業者に既知の他の方法によって単離されてもよい。
本発明の一態様において、Ｔ細胞の刺激が所望される場合、有用な作用物質としては、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体、ＣＤ２、及び／またはＣＤ２８に結合することができ、活性化または増殖をそれぞれ開始することができるリガンドが挙げられる。その結果、リガンドという用語には、ＣＤ２８に対するＢ７分子等の細胞表面タンパク質に対する「天然」リガンドと、細胞表面タンパク質に向けられる抗体等の合成リガンドとであるタンパク質が含まれる。そのような抗体及びそれらの断片は、ハイブリドーマ法及び組み換えＤＮＡ及びタンパク質発現技法等の従来の技法に従って産生され得る。有用な抗体及び断片は、ヒトを含む任意の種由来でもよいか、または２種以上の種からの配列を用いるキメラタンパク質として形成されてもよい。
代替実施形態において、共刺激シグナルには、ラパマイシンも含まれる。ラパマイシンは、細胞を活性化物質に接触させる前、接触させると同時に、及び／または接触させた後に、細胞と接触させてもよい。ラパマイシンは、本発明に従う方法で、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）／増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）ステップの間中、ずっと存在してもよい。ラパマイシンは、１つ以上のステップで添加されてもよい。したがって例えば、本明細書の実施例に記載されるように、単離されたＣＤ４＋細胞は、活性化物質及びラパマイシンで同時に刺激されてもよい。そのような方法において、その後の成長及び継代は、ラパマイシンの存在下であるが、活性化物質の非存在下で行われてもよい。
ラパマイシンは、約０．５μＭ～約２μＭ、または約１μＭ等の、約０．０１μＭ～約１０μＭの濃度で使用されてもよい。ラパマイシンは、Ｓｉｇｍａ，Ｃａｌｂｉｏ Ｃｈｅｍ，ＬＣ Ｌａｂｓ等から入手可能なシロリムス、ラパミューン、ＡＹ－２２９８９、ＲＡＰＡ及びＮＳＣ－２２６０８０とも称される、９１４．２の分子量を有するタンパク質キナーゼ阻害剤である。ラパマイシンは、Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）等の様々な商業的供給源から入手可能である。
他のサイトカイン及び／または成長因子が、必要に応じて培養液に添加されてもよい。そのようなサイトカイン及び／または成長因子は、適切な濃度及び時点で添加される。例えば、ＩＬ－２及び／またはＩＬ－４は、Ｔ細胞の増殖を促進するために添加されてもよい。他のサイトカインは、必要であれば、特定の分化パターンを誘導するように添加されてもよい（例えば、ＴＧＦ－β及びＩＬ－１０）。例えば、ＩＬ－４は、Ｔｈ２亜集団になるようにＴ細胞集団の分化を引き起こし、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１２は、Ｔｈ１亜集団になるように分化を引き起こすことが示されている（Ｓｕｎｄｅｒ－Ｐｌａｓｓｍａｎｎｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ８７：５１７９－５１８４（１９９６））。したがって本発明のいくつかの実施形態において、サイトカイン、例えば、ＩＬ－２は、１つ以上のステップで、１０～４，０００Ｕ／ｍｌ（例えば、約１０Ｕ／ｍｌ～約３，０００Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ～約２，０００Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ～約１，５００Ｕ／ｍｌ、約１５Ｕ／ｍｌ～約４，０００Ｕ／ｍｌ、約１５Ｕ／ｍｌ～約３，０００Ｕ／ｍｌ、約１５Ｕ／ｍｌ～約１，５００Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ～約２，０００Ｕ／ｍｌ等）の外因的に添加された最終濃度で添加されてもよい。一部の特定の場合において、刺激中は２０Ｕ／ｍｌで、最初の培養期間の間は１，０００Ｕ／ｍｌで定期的に、かつ収集前の期間には、２０Ｕ／ｍｌでＩＬ－２を添加してもよい。
ＩＬ－４は、例えば、例えば、約１，０００～５，０００Ｕ／ｍｌまたは約１００～１０，０００Ｕ／ｍｌ（例えば、約１，０００Ｕ／ｍｌ～約５，０００Ｕ／ｍｌ、約５，０００Ｕ／ｍｌ～約５，０００Ｕ／ｍｌ、約２５０Ｕ／ｍｌ～約５，０００Ｕ／ｍｌ、約１００Ｕ／ｍｌ～約５，０００Ｕ／ｍｌ、約８００Ｕ／ｍｌ～約２，５００Ｕ／ｍｌ等）の最終濃度で、外因的に添加されてもよい。いくつかの場合において、約１，０００Ｕ／ｍｌで、刺激及び収集までの培養の間に添加されてもよい。適切なサイトカイン及び成長因子、ならびにＴ細胞へのこれらの影響は、当該技術分野で周知であり、説明されている。Ｔ細胞の成長のための適切な条件下でＴ細胞集団を活性化物質及び任意でラパマイシンと接触させたら、必要なＴ細胞の最終的な数及び細胞増殖の速度に従って選択された期間、成長させてもよい。細胞の継代は、この期間中に行われてもよい。そのような期間は、通常、約３～約１０日であるが、約１４～約２０日もの長さまたはさらにはより長くてもよいが、但し、Ｔ細胞の生存能及び継続した増殖が維持されることを条件とする。
本発明の組成物は、上述の作用物質を固定化する表面を含んでもよい。本発明の表面は、リガンドが結合または組み込まれ得、生体適合性、つまり、刺激される標的細胞にとって実質的に無毒である、任意の表面であってもよい。生体適合性表面は、生分解性または非生物分解性であってもよい。表面は、天然または合成であってもよい。合成表面は、ポリマーであってもよい。表面は、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖類、グリコサミノグリカン、細胞外マトリックス組成物、リポソーム、または細胞表面を含み得る。多糖類には、例として、セルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、またはアルギン酸が含まれ得る。他のポリマーには、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ酸無水物、ポリアクリルシアノアクリレート（ｐｏｌｙａｌｋｙｌｃｙａｎｏａｃｒｙｌｌａｔｅ）、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリ酢酸ビニル、ブロックコポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、またはポリウレタンが含まれ得る。該ポリマーは、乳酸またはコポリマーであってもよい。コポリマーは、乳酸及びグルコール酸（ＰＬＧＡ）を含んでもよい。非生物分解性表面には、ポリ（ジメチルシロキサン）及びポリ（エチレン－ビニルアセテート）等のポリマーが含まれ得る。生体適合性表面としては、例として、ガラス（例えば、バイオガラス）、コラーゲン、キチン、金属、ヒドロキシアパタイト、アルミン酸、バイオセラミック材料、ヒアルロン酸ポリマー、アルギン酸、アクリル酸エステルポリマー、乳酸ポリマー、グリコール酸ポリマー、乳酸／グリコール酸ポリマー、精製タンパク質、精製ペプチド、または細胞外マトリックス組成物が挙げられる。他のポリマーは、ガラス、シリカ、ケイ素、ヒドロキシアパタイト、ハイドロゲル、コラーゲン、アクロレイン、ポリアクリルアミド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、または任意の数の合成有機ポリマーのプラスチック等を含み得る表面を含む。該表面は、リポソーム等の生物学的構造体または赤血球（ＲＢＣｓ）等の細胞表面を含んでいてもよい。該表面は、脂質、プレート、バッグ、ペレット、繊維、メッシュ、または粒子の形態であってもよい。粒子には、コロイド粒子、微粒子、非粒子、ビーズ等が含まれ得る。様々な実施形態において、市販されているビーズ、または他の粒子等の表面が、有用である（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｗｅｄｅｎ；ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）、Ｄｙｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＰＵＲＡＢＥＡＤＳ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
抗体等のタンパク質は、任意の数の手法で固体支持体（例えば、ビーズ）に結合させてもよい。タンパク質を支持体に結合させる１つの手法は、ビオチン及びアビジンまたはストレプトアビジンによってである。開発されている一システムは、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）（ＩＢＡ ＧＭＢＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と称される。このシステムは、ストレプトアビジンに結合する８つのアミノ酸配列タグ（Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１））の使用を可能にする。さらに、そのようなシステムは、ビオチンとの競合結合により結合した細胞及びタンパク質の解放を可能にする。したがって、本発明には、ストレプトアビジン相互反応、及びそのような固体支持体に結合した細胞の精製によって、タンパク質（例えば、抗体）を固体支持体に結合させるための組成物及び方法が含まれる。細胞精製方法には、以下が含まれる。固体支持体と抗体との相互反応が、アビジンまたはストレプトアビジンによって形成され、ここで該抗体は、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４）に結合する。該固体支持体は、結合していない細胞から分離され、次いで、結合している細胞が解放される。解放は、抗体のタンパク質切断のような方法、または付加されたビオチンとの競合により、生じ得る。そのような支持体は、細胞精製、Ｔ細胞活性化のために使用することができる。
類似の製品が、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号１３０－０９０－４８５）から入手可能である。この製品は、ビオチン化抗体に結合するのに使用され得る抗ビオチンが結合したビーズを含む。そのようなビーズは、細胞精製及びＴ細胞活性化のためにも使用することができる。
ビーズが使用される場合、ビーズは、標的細胞刺激をもたらす任意のサイズのものであってもよい。いくつかの実施形態において、約５ｎｍ～約５００μｍのサイズのビーズが使用される。ビーズサイズの選択は、多くの場合、そのビーズが働く特定の用途に左右される。例えば、常磁性ビーズを使用する場合、該ビーズは典型的に、１μｍ未満から、約２．８μｍ～約５００μｍ、及び一般的に約２．８μｍ～約５０μｍの範囲のサイズである。最後に、約１０－５ｎｍもの小ささの超常磁性非粒子の使用を選択することができる。例示的なビーズとして、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０は、４．５μｍである。したがって、本発明の実施で使用されるビーズは、一般的に約０．００００１ｎｍ～約５００μｍ（例えば、約０．０１ｎｍ～約５００μｍ、約１ｎｍ～約５００μｍ、約５ｎｍ～約５００μｍ、約０．００００１ｎｍ～約５０μｍ、約０．１ｎｍ～約５０μｍ、約１０ｎｍ～約５０μｍ、約５０ｎｍ～約５０μｍ、約５０ｎｍ～約２５μｍ、約５０ｎｍ～約１μｍ、約１０μｍ～約５００μｍ、約１μｍ～約１０μｍ等の直径を有する。
いくつかの実施形態において、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）が使用され得る。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）は、Ｔ細胞の活性化及び分化へのこれらの影響の系統的検査のために変えられるリガンド組成物及び化学量等のパラメータを可能にする利点がある。ＤＹＮＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｉｌｌｅｓｔｒｏｍ，Ｎｏｒｗａｙ）は、特異的Ｔ細胞亜集団の増殖のために、異なる化学量で作用物質と結合させることができる。ＤＹＮＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）は、エポキシ基でコーティングされた裸のビーズに結合することにより、結合基なしでビーズに抗体または本発明の他の作用物質が結合することを可能にする。
作用物質は、当該技術分野で既知及び利用可能な様々な方法によって、表面に結合する（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）か、結合する（ａｔｔａｃｈｅｄ）か、組み込まれる（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ）か、結合する（ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ）か、または組み込まれ（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ）てもよい。該作用物質は、天然リガンド、タンパク質リガンド、または合成リガンドであってもよい。結合は、共有結合もしくは非共有結合、静電結合、または疎水結合であってもよく、例として、リガンドが細胞を刺激することができる、化学的、機械的、酵素的、静電的、または他の手段を含む様々な結合手段によって達成することができる。作用物質の結合は、直接的または間接的（例えば、繋留）であり得る。例えば、抗体は、表面に直接的に結合（すなわち、直接結合）してもよいか、または間接的結合（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン／ビオチン）を介してもよい。
細胞表面に関して、該結合は、関心対象の作用物質のコーディング領域を含む発現ベクターのトランスフェクションまたはトランスダクション等の、当該技術分野で既知の任意の数の技法を使用する、作用物質の遺伝子発現を介してであってもよい。該リガンドに対する抗体は、抗イディオタイプ抗体を介して表面に結合してもよい。別の例には、抗体を任意の適切な表面に結合させる方法として、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を含む任意の適切な表面に結合したタンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇ、または他の非特異的抗体結合分子の使用が含まれる。あるいは、リガンドは、市販の架橋試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌから入手可能なもの）を使用した表面への架橋等の化学的手段、または他の手段によって、表面に結合させてもよい。ある特定の実施形態において、リガンドは、表面に共有結合してもよい。さらに、一実施形態において、市販のトシル活性化ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）またはエポキシ表面反応基を有するＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）は、製造業者の説明書に従って、関心対象のリガンドと一緒にインキュベートされる。手短に言えば、そのような条件は、典型的に、約４°～３７℃の範囲の温度の約ｐＨ４～ｐＨ９．５のリン酸またはホウ酸塩緩衝液中でのインキュベーションを伴う。
活性化物質は、一般的に、ビーズと接触させる前に、適切な比率で一緒に混合される。「適切な反応条件」は、使用される特定の活性化物質に従って変わり得るが、例示的な条件は、例えば、約ｐＨ７．４のリン酸緩衝液（例えば０．５Ｍのリン酸）及び約４×１０８個のビーズ／ｍｌの粒子濃度中でのビーズ及び活性化物質、例えば、抗体の、インキュベーションを含み得る。ヒト血清アルブミン（例えば、組み換えＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン等の他の血清アルブミンが、活性化物質を安定化し、ビーズの表面上のあらゆる残っている疎水性パッチを遮断するために、任意で（例えば、約０．０５％ｗ／ｖの濃度で）存在してもよい。
適切な反応混合物を準備したら、必要な比率での表面への活性化物質の吸収を促進するのに適切な時間及び適切な条件下で、反応を進行させる。繰り返しになるが、特定の条件は、反応混合物の構成成分に応じて変わり得るが、例示的な条件には、緩徐な傾け及び回転を伴う、約３７℃で約６～約２４時間のインキュベーションが挙げられる。
どのような条件が選択されようとも、固定化反応が完了したら、適切な比率で活性化物質が表面に固定化されたビーズは、反応容器の側部に磁石を置き、上清を捨てることによって、残りの水性培地から取り出すことができる。ビーズは、一般に、洗浄されて、あらゆる余分な非結合抗体を除去し、次いで、使用準備が整う。そのようなビーズは、調製されたら、すぐに使用されてもよいか、または後で使用するために保管されてもよい。
いくつかの実施形態においてＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０を、表面に作用する作用物質との結合のために、利用してもよい。製造業者によると、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０は、４．５マイクロメートルのエポキシビーズである。これらは、非多孔性の単分散超常磁性ビーズである。高い溶液移動度は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）が、抗体結合しやすくするために、常に溶液と相互作用することを可能にする。該ビーズは、表面トシル基を有するものがさらに入手可能である。
作用物質は、同じビーズ上、すなわち「ｃｉｓ」、または別個のビーズ上、すなわち「ｔｒａｎｓ」のいずれかで、ビーズ上に固定化され得る。
代替実施形態において、本発明の活性化剤は、溶液であり得る。
特定のＴ細胞の亜集団の活性化及び増殖は、特定の表面作用物質及び表面作用物質の特定の比率によって、標的にされ得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞）の増殖のための本発明の組成物は、抗ＣＤ３作用物質及び抗ＣＤ２８作用物質を含む。本発明のＴ細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞）増殖組成物は、表面に結合した、低い、中程度の、または高い相対レベルのＣＤ３を含み得る。例として、低い抗ＣＤ３作用物質は、約０．０１～約０．０４、約０．０５～約０．４、約０．０６～約０．４、約０．０７～約０．４、約０．０８～約０．４、約０．０９～約０．４、約０．１～約０．４、約０．２～約０．４、約０．３、または約０．３４単位の濃度で表面上に存在し得、中程度の抗ＣＤ３作用物質は、約０．５～約１．５、約０．６～約０．８、または約０．７５単位の濃度で、本発明の表面上に存在し得、高い抗ＣＤ３作用物質は、約２～約４、約３～約４、約３．４、または約３．４１単位の濃度で、本発明の表面上に存在する。いくつかの実施形態において、低い相対レベルの抗ＣＤ３抗体を抗ＣＤ２８共刺激と併せて含む、Ｔ細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞）の増殖のためのビーズが、使用される。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞（例えば、メモリーＴ細胞）の活性化及び増殖のための本発明の組成物は、抗ＣＤ３作用物質、抗ＣＤ１３７作用物質、及び抗ＣＤ２８作用物質を含む。本発明のＴ細胞（例えば、メモリーＴ細胞）増殖組成物は、表面に結合した、低い、中程度～低、中程度～高、または高い相対レベルＣＤ３を含んでいてもよい。例として、低い抗ＣＤ３作用物質は、約０．００５～約０．０２、約０．００８～約０．０１５、または約０．０１単位の濃度で、本発明の表面上に存在してもよく、中程度で低めの抗ＣＤ３抗体は、約０．０２～約０．０８、約０．０３～約０．０７、または約０．０５単位の濃度で、本発明の表面上に存在してもよく、中程度で高めの抗ＣＤ３作用物質は、約０．０９～約０．１６、約０．１～約０．１５、約０．１４、または約０．１４２単位の濃度で、本発明の表面上に存在してもよく、高い抗ＣＤ３作用物質は、約１～約２、約１．３～約１．７、約１．４～約１．６、または約１．５単位の濃度で、本発明の表面上に存在してもよい。Ｔ細胞（例えば、メモリーＴ細胞）の増殖のためのいくつかの実施形態において、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ１３７共刺激と併せた低相対レベルの抗ＣＤ３抗体を含むビーズが、使用される。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１７細胞）の活性化及び増殖のための本発明の組成物は、抗ＣＤ３抗体、及び抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ５抗体、または抗ＣＤ２８抗体を含む。本発明の本発明のＴ細胞（例えば、Ｔｈ１７細胞）増殖組成物は、表面に結合した、低い、中程度の、または高い相対レベルのＣＤ３を含み得る。例として、低い抗ＣＤ３作用物質は、約０．０２～約０．１、約０．０３～約０．０８、約０．０４～約０．０７、約０．０５～約０．０７、または約０．０６単位の濃度で本発明の表面上に存在してもよく、中程度の抗ＣＤ３作用物質は、約０．１～約０．５、約０．２～約０．５、または約０．３単位の濃度で本発明の表面上に存在してもよく、高抗ＣＤ３作用物質は、約１～２、約１．３～約１．７、または約１．５単位の濃度で本発明の表面上に存在してもよい。Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１７細胞）の増殖のためのいくつかの実施形態において、抗ＣＤ５、抗ＣＤ２８、及び／または抗ＩＣＯＳ共刺激と併せた低相対レベルの抗ＣＤ３抗体を含むビーズが使用される。
抗体は、任意の数の手段によって固体支持体（例えば、ビーズ）に結合させてもよい。抗体を結合させるいくつかの方法は、抗体と固体支持体との共有結合を可能にする条件下で、抗体を固体支持体に接触させることを伴う。抗体結合ビーズを調製するために使用され得る市販製品は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４３１１Ｄ）である。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔは、抗体、及びレクチン等の他のタンパク質、機能酵素の、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－２７０ Ｅｐｏｘｙの表面上への共有結合を可能にする。表面エポキシ基は、第一級アミノ及びスルフヒドリル基によるタンパク質の結合を可能にする。ビーズは、「飽和」になるまで結合し得、結合後処理に曝露したら低バックグラウンド結合をもたらす。
ビーズを飽和させるために反応混合物中で使用されるタンパク質の量は、使用されるビーズの「搭載量」によって変わる。例として、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－２７０ Ｅｐｏｘｙビーズが使用される場合、飽和を確実にするために、１ｍｇのビーズ当たり少なくとも１０μｇのタンパク質が使用されることが、推奨される。これらのビーズの搭載量が典型的に、１ｍｇのビーズ当たりタンパク質の量が約７～９μｇと異なるため、真である。さらに、抗体負荷は、ビーズが接触する抗体の比率を変えることにより、１個のビーズ当たりで調節されてもよい。したがって、抗体／ビーズ結合は、ビーズ上に存在するリガンドの比率を、互いに対して、かつ／または各ビーズ上のリガンドの平均総量を変えるように調節されてもよい。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ Ｅｐｏｘｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４０１１）も、本発明の実施において使用されてもよい。ここでのプロセスにおいては、１ｍｌ（４×１０８個）のビーズの結合のためである。１ｍｌ（４×１０８個）のビーズ当たり約２００μｇの抗体（Ａｂ）が使用されるべきである。洗浄及び再懸濁されたビーズ１ｍｌを、管内に置く。次いで、この管を、磁石内に１分間置き、上清を処分する。次いで、この管を磁石から取り出し、ビーズを、緩衝液Ａ（０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４～８．０または０．１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．６～９．５）中に再懸濁させる。次いで、２００μｇの抗体（複数可）を添加することにより、体積を最大１ｍｌにする。次いで、混合物を１５分間インキュベートし、次いで、ＢＳＡを添加して、０．０１～０．１％ｗ／ｖにする。次いで、この混合物を、穏やかに傾け、回転させながら、室温で１６～２４時間インキュベートする。次いで、この管を、磁石内に１分間置き、上清を処分する。次いで、１ｍｌの緩衝液Ｂ（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ならびに２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を添加する。次いで、この混合物を混合し、穏やかに傾け、回転させながら５分間インキュベートする。この洗浄手順を２回繰り返す。磁石からの管及びビーズを、１ｍｌの緩衝液Ｂ（４×１０８個のビーズ／ｍｌ）中で再懸濁させる。
本発明の実施で使用され得る別の製品は、ＰＩＥＲＣＥ（商標）ＮＨＳ活性化磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８８８２７）である。これらのビーズは、ブロック状の磁気ビーズ表面上にＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）官能基を有する。これらは、超常磁性（磁気メモリーなし）及び１μｍの公称平均直径（公称）である。これらのビーズは、２．０ｇ／ｃｍ３の密度、及び２６μｇ以上のビーズのウサギＩｇＧ／ｍｇの結合能を有する。
まず初めに、タンパク質溶液及び磁気ビーズを室温にし、次いで、３００μｌの磁気ビーズを、１．５ｍｌ微量遠心管内に置く。管を磁気スタンド内に置き、ビーズを回収し、上清を処分する。１ｍｌの氷冷洗浄緩衝液Ａ（氷冷１ｍＭの塩酸）を、管内に導入し、１５秒間穏やかにボルテックスする。管を磁気スタンド内に置き、ビーズを回収し、上清を処分する。次いで、３００μｌのタンパク質溶液を管の中に添加し、次いで、この管を３０秒間ボルテックスする。混合物を、室温で１～２時間、ロテータ上でインキュベートする。インキュベーションの最初の３０分の間に、管を５分毎に１５秒間ボルテックスする。残りの時間に関しては、インキュベーションが完了するまで、管を、１５分毎に１５秒間ボルテックスする。ビーズを磁気スタンドで回収し、フロースルーは取っておく。１ｍｌの洗浄緩衝液Ｂ（０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．０）をビーズに添加し、管を１５秒間ボルテックスする。管を磁気スタンド内に置き、ビーズを回収し、上清を処分する。洗浄及び回収を、１回繰り返す。次いで、１ｍｌの超純水をビーズに添加し、管を１５秒間ボルテックスする。管を磁気スタンド内に置き、ビーズを回収し、上清を処分する。１ｍｌのクエンチング緩衝液（３Ｍのエタノールアミン、ｐＨ９．０）を、ビーズに添加し、管を３０秒間ボルテックスする。次いで、管を、ロテータ上に２時間、室温で置く。管を磁気スタンド内に置き、ビーズを回収し、上清を処分する。１ｍｌの水を、管に添加し、よく混合し、ビーズを回収し、上清を処分する。１ｍｌの保管緩衝液（５０ｍＭのホウ酸、０．０５％のアジ化ナトリウム、ｐＨ８．５）を、管に添加し、よく混合し、ビーズを回収し、上清を処分する。この洗浄ステップを、追加で２回繰り返す。３００μｌの保管緩衝液を、ビーズに添加、よく混合し、使用できる状態になるまで４℃で保管する。タンパク質結合磁気ビーズの最終濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌでなければならない。
本発明の実施で使用され得る他のビーズは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４３０６Ｄ）、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４０１３）、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４２０４）、及びＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６５５０２）である。
多くの場合において、本発明の実施で使用される固体支持体（例えば、ビーズ）は、タンパク質で飽和される。使用されるタンパク質の比率は、異なり得る。例えば、総負荷量の１００％が、リガンド（例えば、抗体）であり得る。そのような場合において、１つのリガンドが存在してもよく、または複数のリガンドが存在してもよい。複数のリガンドが存在する場合、同じ比率（１：１）または異なる比率（例えば、１：１０）で存在してもよい。本実施で使用され得るリガンドの例示的な比率は、本明細書の他の箇所に記載される。
（表２）例示的抗体混合物
Figure 0007084304000002
総リガンド負荷数も調節され得る。抗体リガンドを使用して表２に示されるように、固体支持体は、１００％未満の量で負荷されてもよい。これが行われる多くの場合において、さらなる反応からリガンド結合部位を遮断することが望ましい。これを行う一方法は、リガンド（複数可）及び非リガンド作用物質の両方が、固体支持体に結合することを可能にする条件下で、特定の用途に適したリガンド結合活性を有しない作用物質（例えば、タンパク質）（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｔ細胞受容体に結合しない１つ以上の抗体等）（非リガンド作用物質）に固体支持体を接触させることによってである。これは、異なるリガンドの比率及び異なる全シグナルの比率の調節を可能にする。これらの方針に沿ったいくつかの例は、表２に記載される。
Ｔ細胞に対する全シグナルは、任意の数の手法で調節されてもよい。例えば、固体支持体（例えば、ビーズ）１個当たりのシグナルが低い場合、各Ｔ細胞を、より多くの固体支持体表面と接触させてもよい。ビーズが使用される場合、これは、ビーズに対するＴ細胞の比率が調節され得ることを意味する。例えば、抗体を５０％負荷させたビーズを使用する場合、１００％負荷されたビーズと同じシグナルを得るために、２倍のビーズが使用され得る。
ＩＶ．本発明の使用方法
本発明のＴ細胞亜集団を、治療目的及び／または研究／発見の目的のために、任意の数の生理学的病態、疾患及び／または疾患状態で使用することができる。異常免疫応答を特徴とする病態または疾患は、自己免疫疾患、例えば糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、ループス、関節リウマチ、乾癬、または炎症性腸疾患であり得る。免疫抑制が有益である病態には、例えば、拒絶反応を避けるために、例えば、体液または部位の同種移植、または適切な免疫応答が妊娠の失敗及び流産に関与した不妊治療において正常または活性化された免疫応答が哺乳動物にとって不利益になる病態が含まれる。移植前、移植中、または移植後にそのような細胞を使用することによって、治療される患者（例えば、がん患者）に起こる場合がある広範囲の慢性移植片対宿主病が回避される。これらの細胞は、収集または（例えば、凍結による）保管の直後に、増殖前または増殖後、かつ治療でこれらを使用する前に、増殖させ得る。そのような療法は、既知の免疫抑制療法と併せて行われ得る。
適切なＴ細胞集団または亜集団が患者または動物から単離されたら、本発明の方法及び支持体を使用して得られたＴ細胞集団を増殖させる前に、遺伝子または任意の他の適切な改変または操作が、任意で行われてもよい。この操作は、例えば、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を用いてＴ細胞を刺激／再刺激して、該Ｔ細胞を活性化／再活性化させる形態をとり得る。
ある特定の実施形態において、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、次いでその後に再び採血し（またはアフェレーシスを行わせ）、本発明に従ってその血液からのＴ細胞を活性化させ、これらの活性化及び増殖させたＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間毎に数回行われ得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１０ｍｌ～４００ｍｌの採血から活性化されてもよい。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、約２０ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌ、約５０ｍｌ、約６０ｍｌ、約７０ｍｌ、約８０ｍｌ、約９０ｍｌ、または約１００ｍｌの採血から活性化される。対象の組成物の投与は、エアロゾル吸引、注射、摂取、輸液、インプラント、または移植による様式を含む、任意の都合のよい様式で行われ得る。本明細書に記載される組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内に投与されてもよい。一実施形態において、本発明のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態において、本発明のＴ細胞組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与されてもよい。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染／炎症（自己免疫）部位内に直接注射されてもよい。
本発明に従って生成されたＴ細胞亜集団の組成物は、実験的及び治療の用途を含む多くの潜在的用途を有する。具体的には、そのようなＴ細胞集団が望ましくないまたは不適切な免疫応答の抑制において極めて有用になることが予想される。そのような方法において、少数のＴ細胞は、患者から取り出され、次いでこれらのＴ細胞を患者内へ再注入する前に、生体外で操作及び増殖される。この手法で治療され得る疾患の例は、自己免疫疾患及び（例えば、同種移植免疫寛容のために）抑制された免疫活性が望ましい病態である。治療方法には、哺乳動物を用意し、Ｔ細胞を含む該哺乳動物から生体試料を得ることと、上述の本発明の方法に従って生体外でＴ細胞を増殖／活性化させることと、増殖／活性化されたＴ細胞を治療される哺乳動物に投与することと、が含まれ得る。最初の哺乳動物及び治療される哺乳動物は、同じであるか、または異なっていてもよい。該哺乳動物は、一般に、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル、またはヒト等の任意の哺乳動物であり得る。最初の哺乳動物（「ドナー」）は、同系、同種、または異種であってもよい。療法は、（例えば糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、ループス、関節リウマチ、乾癬、及び炎症性腸疾患を含む自己免疫疾患等の）異常免疫応答を有するか、または組織移植、もしくは不妊治療を受ける哺乳動物に用いられ得る。
そのような療法に伴う主な技術的ハードルには、関心対象の細胞の患者からの精製、ならびにインビトロでの該細胞の増殖及び／または操作が含まれる。そのような療法には一般に、多数の細胞が必要であり、したがって、産生されるＴ細胞の数を最大化し、十分な数のＴ細胞を産生するのに必要な時間を最小化するために、Ｔ細胞増殖をインビトロで誘導する方法を最適化することが不可欠であると考えることができる。本発明の組成物及び方法は、特異的亜集団の多数のＴ細胞をもたらす。
本発明のＴ細胞亜集団は、様々な用途及び治療モダリティで使用することができる。本発明のＴ細胞亜集団は、がん、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、感染性疾患、及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含むがこれらに限定されない疾患状態の治療で使用することができる。広い例示的Ｔ細胞療法としては、免疫枯渇後、または免疫枯渇後ではない、本発明の方法によって体外で選択的に増殖させたＴ細胞亜集団の対象への注入、またはドナー対象から単離した異種の体外で増殖させたＴ細胞の対象への注入（例えば、養子細胞移植）が挙げられる。
自己免疫障害
自己免疫疾患または障害は、自己抗原に対する不適切及び過剰な応答から生じる疾患である。研究は、自己免疫障害における欠損Ｔｒｅｇ細胞を関連付けている。自己免疫疾患としては、非限定的例として、真性糖尿病、網膜ブドウ膜炎及び多発性硬化症、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、脊椎関節症、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、クローン病、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、及び全身性エリテマトーデスが挙げられる。自己免疫疾患状態において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの数が減少している場合があるか、または機能的に欠陥がある場合がある。Ｔ細胞の増殖を抑制するための能力が低減された末梢神経由来のＴｒｅｇが、多発性硬化症（Ｖｉｇｌｉｅｔｔａｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９：９７１－９７９（２００４））、多腺性自己免疫性症候群２型（Ｋｒｉｅｇｅｌｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９：１２８５－１２９１（２００４）．）、Ｉ型糖尿病（Ｌｉｎｄｌｅｙｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ５４：９２－９２９（２００５））、乾癬（Ｓｕｇｉｙａｍａｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：１６４－１７３（２００５））、及び重症筋無力症（Ｂａｌａｎｄｉｎａｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０５：７３５－７４１（２００５））を有する患者において認められた。
Ｔ細胞療法を用いた自己免疫障害の治療は、異なる機構が関与し得る。一実施形態において、血液または免疫細胞の別の供給源は、自己免疫障害に罹患している対象から取り出されてもよい。本明細書に記載される本発明の方法を使用して、患者の試料由来のメモリーＴ細胞以外のＴ細胞型を選択的に増殖させることができる。自己細胞の取り出し及び増殖の後に、不適切なメモリーＴ細胞は、低線量全身照射、胸腺照射、抗胸腺細胞グロブリン、及び化学療法の実施を含む既知の方法により、不適切なメモリーＴ細胞の除去を必要とする対象内で枯渇され得る。本発明の例示的化学療法剤としては、ｃａｍｐａｔｈ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び放射線治療が挙げられるが、これらに限定されない。自己抗原を認識することができる不適当なメモリーＴ細胞の枯渇の後に、体外で増殖した自己Ｔ細胞を対象に再投与して、対象の免疫システムを再構成または再刺激することができる。
あるいは、または上述の治療モダリティに加えて、Ｔｒｅｇ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、胸腺、組織バイオプシー、腫瘍、リンパ節組織、胃腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓組織、または任意の他のリンパ組織、及び腫瘍を含む供給源から単離することができる。これらのＴ細胞は、本発明の方法を使用して選択的に増殖させることができる。これらの増殖させたＴｒｅｇ細胞は、不適当な免疫反応を抑制するために患者に再び投与され得る。このＴｒｅｇ療法は、免疫枯渇後に最小限の残りの免疫反応を抑制するか、または免疫枯渇を受けていない対象に施され得る。
移植片対宿主病
造血幹細胞移植における大きな問題は、ＧＶＨＤであり、このＧＶＨＤは、注入された造血幹細胞調製物中に存在するアロ反応性Ｔ細胞によって引き起こされる。臓器移植において、アロ反応性宿主Ｔ細胞によって媒介される移植片拒絶反応は、大きな問題であり、通常、移植患者の長期の免疫抑制によって克服される。
上述の方法に類似した方法において、Ｔ細胞療法に伴う有害なＧＶＨＤ事象のリスクまたは重症度の治療、低減は、異なる機構が関係し得る。一実施形態において、血液または免疫細胞の別の供給源は、ＧＶＨＤに罹患している対象から取り出されてもよい。本明細書に記載される本発明の方法は、外因性組織由来の抗原の持続性認識を含まない細胞型を選択的に増殖させる、メモリーＴ細胞以外のＴ細胞型を選択的に増殖させるために使用され得る。自己細胞の取り出し及び体外での増殖の後に、不適切なメモリーＴ細胞は、低線量全身照射、胸腺照射、抗胸腺細胞グロブリン、及び化学療法の実施を含む既知の方法により、不適切なメモリーＴ細胞の除去を必要とする対象内で枯渇され得る。本発明の例示的化学療法剤としては、ｃａｍｐａｔｈ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び放射線治療が挙げられるが、これらに限定されない。外因性組織上の抗原を認識することができる不適当なメモリーＴ細胞の枯渇の後に、体外で増殖した自己Ｔ細胞を対象に再投与して、対象の免疫システムを再構成または再刺激することができる。
あるいは、または上述の治療モダリティに加えて、患者血液から取り出されたＴｒｅｇ細胞を、選択的に増殖させてもよい。これらの増殖させたＴｒｅｇ細胞は、免疫枯渇後に最小限の残りの免疫反応を抑制するため、または免疫枯渇を受けていない対象においてのいずれかで、不適当な免疫反応を抑制するために患者に再び投与され得る。
アレルギー性疾患
アレルギー性疾患も、Ｔ細胞機能障害によって影響を受け得る。研究は、アレルゲン特異的Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）の損なわれたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ媒介阻害が、季節性アレルギーを患う患者に存在することを示した（Ｌｉｎｇ ＥＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２００４；３６３：６０８－１５．；Ｇｒｉｎｄｅｂａｃｋｅ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ ２００４；３４：１３６４－７２）。さらに、Ｔ細胞集団の割合変更が、健康な対象と比較して、アレルギー及び喘息疾患を有する個体において関連付けられている（Ａｋｄｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００４；１９９：１５６７－７５．；Ｔｉｅｍｅｓｓｅｎ ＭＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；１１３：９３２－９）。
上述の方法に類似した方法において、治療、Ｔ細胞療法を用いたアレルギー性疾患の治療、予防、または緩和は、異なる機構が関係し得る。自己免疫障害及びＧＶＨＤと同様、アレルギー性疾患は、不適当な免疫応答によって引き起こされる。不適当な抗原を認識することができる細胞の応答または枯渇の抑制は、アレルギー性症状を緩和し得る。アレルギーの治療のためのＴ細胞療法の方法において、アレルギー障害を患う対象から血液が取り出され得る。本明細書に記載される本発明の方法は、不適当な抗原（例えば、マメ科のタンパク質）由来の抗原の持続性認識を含まない細胞型を選択的に増殖させる、非Ｔメモリー細胞Ｔ細胞型を選択的に増殖させるのに使用され得る。自己細胞の取り出し及び増殖の後に、不適当なメモリーＴ細胞は、低線量全身照射、胸腺照射、抗胸腺細胞グロブリン、及び化学療法の実施を含む既知の方法により、不適当なメモリーＴ細胞の除去を必要とする対象内で枯渇され得る。本発明の例示的化学療法剤としては、ｃａｍｐａｔｈ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び放射線治療が挙げられるが、これらに限定されない。外因性組織上の抗原を認識することができる不適当なメモリーＴ細胞の枯渇の後に、体外で増殖した自己Ｔ細胞を対象に再投与して、対象の免疫システムを再構成または再刺激することができる。
あるいは、または上述の治療モダリティに加えて、患者血液から取り出されたＴｒｅｇ細胞を、選択的に増殖させてもよい。これらの増殖させたＴｒｅｇ細胞は、免疫枯渇後に最小限の残りの免疫反応を抑制するため、または免疫枯渇を受けていない対象においてのいずれかで、不適当な免疫反応を抑制するために患者に再び投与され得る。
炎症性疾患
Ｔ細胞療法は、炎症性疾患及び炎症関連障害の治療に関係している。これらの疾患の多くも、自己免疫製障害に分類され得る。炎症性疾患及び炎症関連障害の非限定的例としては、糖尿病、関節リウマチ、炎症性腸疾患、家族性地中海熱、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、インターロイキン－１受容体拮抗分子欠損症（ＤＩＲＡ）、及びベーチェット病が挙げられる。
非病原性抗原に対する不適切な免疫反応の抑制におけるＴｒｅｇ細胞の役割のため、これらのＴ細胞亜集団の数の減少、または機能を弱めることは、炎症性疾患に寄与し得る。これは、例えば、炎症性腸疾患にも当てはまる（Ｍ Ｈｉｍｍｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１２ Ｊｕｎ；１３６（２）：１１５－１２２）及びｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（Ｍ Ｎｏａｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１４ Ｊｕｎ；１３（６）：６６８－６７７）。
炎症性疾患は、自己免疫障害と機構的に類似する。したがって、炎症性疾患は、不適当な免疫応答によって部分的に引き起こされ得る。不適当な抗原を認識することができる細胞の応答または枯渇の抑制は、炎症症状を緩和し得る。炎症性疾患の治療のためのＴ細胞療法の方法において、血液が、炎症性障害を患う対象から取り出され得る。本明細書に記載される本発明の方法は、不適当な抗原（例えば、抗カルバミル化タンパク質（抗ＣａｒＰ）抗体によって媒介された関節リウマチにおけるカルバミル化タンパク質）の持続性認識を含まない細胞型を選択的に増殖させる、非Ｔメモリー細胞Ｔ細胞型を選択的に増殖させるのに使用され得る。自己細胞の取り出し及び増殖の後に、不適当なメモリーＴ細胞は、低線量全身照射、胸腺照射、抗胸腺細胞グロブリン、及び化学療法の実施を含む既知の方法により、不適当なメモリーＴ細胞の除去を必要とする対象内で枯渇され得る。本発明の例示的化学療法剤としては、ｃａｍｐａｔｈ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び放射線治療が挙げられるが、これらに限定されない。自己抗原を認識し、結果として生じる炎症応答を開始することができる不適当なメモリーＴ細胞の枯渇の後に、体外で増殖した自己Ｔ細胞を対象に再投与して、対象の免疫システムを再構成することができる。
あるいは、または上述の治療モダリティに加えて、患者血液から取り出されたＴｒｅｇ細胞を、選択的に増殖させてもよい。これらの増殖させたＴｒｅｇ細胞は、免疫枯渇後に最小限の残りの免疫反応を抑制するため、または免疫枯渇を受けていない対象においてのいずれかで、不適当な免疫反応を抑制するために患者に再び投与され得る。
過剰増殖性障害
がん患者からの証拠は、がんを含む過剰増殖性障害を伴う、Ｔ細胞機能障害をさらに暗示する。例えば、Ｔｒｅｇ活性の増加は、腫瘍抗原に対する不良な免疫応答を引き起こし、免疫機能障害に寄与し得る。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の集団の増加が、肺がん、膵臓がん、乳がん、肝臓がん、及び皮膚がん患者の血液または腫瘍自体のいずれかの中に認められた（Ｗｏｏ ＥＹ，ｅｔ ａｌ．；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；１６８：４２７２－６．；Ｗｏｌｆ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３；９：６０６－１２．、Ｌｉｙａｎａｇｅ ＵＫ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；１６９：２７５６－６１．、Ｖｉｇｕｉｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；１７３：１４４４－５３．、Ｏｒｍａｎｄｙ ＬＡ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：２４５７－６４）。
本発明の方法を使用して、腫瘍抗原もしくは過剰増殖性障害抗原、または過剰増殖性障害に関連する抗原に特異的なＴ細胞を、増殖することができる。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を引き起こす腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。
治療され得るがんには、血管形成されていない腫瘍、またはまだ実質的に血管形成されていない腫瘍、及び血管形成された腫瘍が含まれる。がんは、非固形腫瘍（例えば、血液腫瘍、例えば、白血病及びリンパ腫など）を含み得るか、または固形腫瘍を含み得る。本発明の生成物によって治療されるがんの種類には、がん腫、芽細胞腫、及び肉腫、ある特定の白血病またはリンパ系腫瘍、良性及び悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば、肉腫、がん腫、及びメラノーマが含まれるが、これらに限定されない。成人腫瘍／がん及び小児腫瘍／がんも含まれる。これらの中には、皮膚がん、脳がん及び他の中枢神経系がん、頭がん、頸部がん、筋肉／肉腫がん、骨がん、肺がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮がん、子宮頸がん、膣がん、外陰部がん、陰茎がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、膀胱がん、もしくは甲状腺がん、または膠芽腫を含むがんがある。
血液のがんは、血液または骨髄のがんである。血液の（血行性の）がんの例には、急性白血病（急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、及び骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病等）、慢性白血病（慢性骨髄球性（果粒球）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ性白血病等）を含む白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンスリンパ腫（緩慢性かつ高悪性度の形態）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、ならびに脊髄形成異常症が挙げられる。
固形腫瘍は、通常、嚢腫または液体領域を含まない異常な体積である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。異なる種類の固形腫瘍は、（肉腫、がん腫、及びリンパ腫等の）腫瘍を形成する細胞の種類から名付けられる。肉腫及びがん腫等の固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、リンパ系腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、甲状腺髄様がん、甲状腺乳頭がん、褐色細胞腫脂腺がん、乳頭部がん、乳頭状腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、ヘパトーマ、胆管がん、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、睾丸腫瘍、精上皮腫、膀胱がん、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（（脳幹神経膠腫及び混合膠腫等の）膠腫、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られている）星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、シュワン腫頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、及び脳転移等）が挙げられる。
治療を必要とする対象または患者を治療するための１つのアプローチは、本発明の増殖させたＴ細胞の使用、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させることにより、腫瘍細胞上で発現した抗原を標的にするように、Ｔ細胞を遺伝子組み換えすることである。ＣＡＲは、ヒト白血球抗原から独立した様式で、細胞表面抗原を認識するように設計された抗原受容体である。ＣＡＲを利用する治療において、免疫細胞を、患者血液または他の組織から回収してもよい。Ｔ細胞は、Ｔ細胞の表面上でＣＡＲを発現するように、下記のように操作され、Ｔ細胞が特異的抗原（例えば、腫瘍抗原）を認識することを可能にする。次いで、これらのＣＡＲ Ｔ細胞は、本発明の方法によって増殖され、患者内に注入され得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、または１×１０１２個の細胞で対象に投与される。患者への注入後、Ｔ細胞は、増殖し続け、ＣＡＲを発現し続け、ＣＡＲが操作されて認識する特異的抗原を抱えるＴ細胞に対して、免疫応答を開始させる。
一実施形態において、本発明は、ＣＡＲを発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供し、該ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗腫瘍特性を呈する。本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ）の細胞内シグナル伝達ドメインと融合した抗原結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように操作され得る。ＣＡＲは、Ｔ細胞内で発現したとき、抗原結合特異性に基づいて、抗原認識の方向を変えることができる。
ＣＡＲの抗原結合部分は、抗原結合部分と称される標的特異的結合因子を含む。部分の選択は、標的細胞の表面を画定するリガンドの種類及び数に左右される。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上で細胞表面マーカーとして機能するリガンドを認識するように選択されてもよい。したがって、本発明のＣＡＲ中の抗原部分ドメインには、ウイルス、細菌、及び寄生虫感染症、自己免疫疾患ならびにがん細胞と関連するものが含まれる。
ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、典型的に、ＣＡＲポリペプチドまたはプロモータへのＣＡＲポリペプチドの部分をコードする核酸を動作可能に結合させ、その構築物を発現ベクター内に組み込むことにより達成される。ベクターは、複製及び組み込み真核生物に好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネータ、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモータを含む。
本発明のＴ細胞は、標準的遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫化及び遺伝子療法にも使用することができる。遺伝子送達のための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照されたい。別の実施形態において、本発明は、遺伝子療法ベクターを提供する。
核酸をクローニングして、いくつかの種類のベクターにすることができる。例えば、核酸を、クローニングして、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにすることができる。特定の関心対象のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞内にもたらされ得る。ウイルスベクター技法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物体、プロモータ配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能マーカー内に複製機能の起点を含む。（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許第６，３２６，１９３）。
いくつかのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞内への遺伝子導入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための好都合なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、ベクター内に挿入され、当該技術分野で既知の技法を使用して、レトロウイルス粒子内に入れられ得る。次いで、組み換えウイルスを単離して、生体内または生体外のいずれかで対象の細胞に導入してもよい。いくつかのレトロウイルス系は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。いくつかのアデノウイルスベクターは、当該技術分野で既知である。一実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
追加のプロモータ領域（例えば、エンハンサ）が、転写開始の頻度を調節する。典型的に、これらは、開始部位の上流の領域３０～１１０ｂｐに位置するが、いくつかのプロモータは、開始部位の下流にも機能領域を含むことが最近示された。プロモータ領域間の隙間は、しばしばフレキシブルであり、そのため、領域が反転または互いに対して移動されたとき、プロモータ機能が保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモータにおいて、プロモータ領域間の隙間は、活性が低下し始める前に、５０ｂｐまで増加され得る。プロモータに応じて、個々の領域は、転写を活性化させるのに協働してまたは独立して機能し得るようである。ＣＡＲ Ｔ細胞の作製方法は、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第８，９０６，６８２号を参照されたい）。
Ｔ細胞がＣＡＲ Ｔ細胞である実施形態において、本発明の抗原結合部分の選択は、治療されるがんの特定の種類に左右される。腫瘍抗原は、当該技術分野で既知であり、例えば、膠腫関連抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト慢性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵＬ ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビング及びテロメラーゼ、前立腺がん腫腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インシュリン成長因子（ＩＧＦ－１）、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体及びメソテリンが含まれる。
一実施形態において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として機能し得るいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子には、黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ及びＧＰ１００、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）等の組織特異的抗原が含まれるが、これらに限定されない。他の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２等の転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）（ＣＥＡ）等のがん胎児性抗原（ｏｎｃｏ－ｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的免疫グロブリンは、個々の腫瘍に固有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。Ｂ細胞分化抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤｄ２０；ＲＯＲ１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、λ／κ軽鎖は、Ｂ細胞リンパ腫中の標的抗原についての他の候補である。
参照される種類の腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）でもあり得る。ＴＳＡは、腫瘍細胞に固有であり、体内の他の細胞上に発生しない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に固有ではなく、代わりに、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導することができない条件下で、正常な細胞上にも発現する。腫瘍上の抗原の発現は、免疫システムが抗原に応答することを可能にする条件下で起こり得る。ＴＡＡは、免疫システムが未熟で、応答することができない場合、胎児発生の間に正常な細胞上に発現する抗原であり得るか、またはＴＡＡは、通常、極めて低いレベルで正常な細胞上に存在するが、大幅により高いレベルで腫瘍細胞に発生する抗原であり得る。
ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的例としては、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２等の分化抗原及びＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５等の腫瘍特異的多系譜抗原；ＣＥＡ等の過剰発現胎児性抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ等の過剰発現発がん遺伝子及び変異腫瘍抑制遺伝子；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ等の染色体転座から生じた固有腫瘍抗原；ならびにエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７等のウイルス抗原が挙げられる。他の大きなタンパク質ベース抗原には、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ １５、ｐ １６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２４、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３／ＣＡ ２７／２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｃ２５０、ＧＡ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０、ＭＡＣ－２結合タンパク質／サイクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡｌ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＭＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、及び他のものが含まれる。
感染性疾患
感染性疾患に対する免疫応答には、抗病原体と抗炎症応答とのバランスが関与している。Ｔ細胞は、この複雑なバランスに大いに関与している。Ｔ細胞応答を引き起こすことができる伝染性病原体は、細菌性、ウイルス性、寄生性、または真菌であり得る。Ｔｒｅｇ細胞は、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ９（Ｌｕｎｄｇｒｅｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２００３；７１：１７５５－６２．）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（Ｃａｂｒｅｒａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００４；４０：１０６２－７１．；Ｓｔｏｏｐ ＪＮ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００５；４１：７７１－８．；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００３；３８：１４３７－４８）による感染の慢性化への寄与に関わる。特定のＴ細胞亜集団のこの増加は、メモリーＴ細胞応答を不適当に抑制することにより、これらの感染の長引く性質に寄与し得る。本発明の組成物は、特定のＴ細胞亜集団を特異的に増殖させるのに利用され得、そのような感染性疾患の治療で利用され得る。
感染性疾患は、病原体との直接接触、及びヒトからヒトへ、動物からヒトへ、または母から胎児への伝播により引き起こされ得る。あるいは、感染性疾患は、間接的接触により、例えば、ドアのハンドル、テーブル、カウンター、または蛇口のハンドル等の感染した表面との接触から伝播し得る。感染性疾患は、虫刺されまたは食品汚染を介してさらに伝播し得る。ＨＩＶまたはＡＩＤＳ等のある特定の自己免疫障害、及び一部のがんは、感染性疾患に対する易罹患性を増加させ得る。免疫システムを抑制するある特定の治療レジメンも、感染性疾患に対する易罹患性を促進し得る。例示的感染性疾患としては、痘瘡、マラリア、結核、発疹チフス、ペスト、ジフテリア、腸チフス、コレラ、赤痢、肺炎が挙げられる。
上述のように、Ｔ細胞の選択的増殖が疾患状態の治療で使用され得るいくつかの機構が存在する。感染性疾患状態において、感染症を患う患者は、感染性作用物質に対して十分な免疫を持たない。本発明の方法は、特定の感染性作用物質に対する免疫を有するドナーからの異種Ｔメモリー細胞を選択的に増殖させるために使用され得、養子Ｔ細胞移植で利用され得る。次いで、感染性作用物質経験ドナー由来の体外で増殖させたＴ細胞を、該感染症に感染した患者内に注入することができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、または１×１０１２個の細胞で対象に投与される。次いで、感染性抗原コンピテントドナーメモリーＴ細胞は、該患者における自己の免疫応答の開始を補助することができる。
感染性疾患の治療で本発明を利用する代替の方法には、再注入または養子細胞移植それぞれのための、自己または異種Ｔｈ１７細胞の選択的増殖が含まれる。本明細書に記載される方法を使用して、患者から単離された血液または組織由来のＴ細胞を、体外で増殖させることができる。次いでこれらの増殖させたＴ細胞を、特定の感染性抗原（例えば、連鎖球菌Ｍ－タンパク質、ナイセリア線毛、ボレリア・ブルグドルフェリ リポタンパク質ＶｉｓＥ、類鼻疽菌多糖類抗原、アスペルギルス・フミガーツス ガラクトマンナン、または野兎病菌リポ多糖類）に対する抗体を分泌させるＢ細胞の誘導を補助するために、患者に注入することができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、または１×１０１２個の細胞で対象に投与される。
併用療法
上に列挙される疾患状態の多くに対して既存の治療が推奨される場合がある。本発明によって増殖させたＴ細胞亜集団は、場合によっては、唯一の代替療法として、または他の既知の療法と併せて使用され得る。Ｔ細胞療法は、他の療法の実施の前、同時に、またはそれに続いて実施され得る。
本発明の方法はまた、抗原の反応性を促進し、生体内での有効性を促進するために、ワクチンとともに利用され得る。一実施形態において、本発明の組成物は、生体内のＴ細胞、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、及び／またはＩＬ－１５を促進する組成物と併せて患者に投与される。さらに、本発明によって増殖させたＴ細胞が体内で相対的に長い半減期を有すると仮定すると、これらの細胞は、関心対象の所望の核酸配列を担持し、がん、疾患、または感染部位に潜在的にホーミングすることにより、上述のように遺伝子療法のための最適な媒介物として機能し得る。したがって、本発明によって増殖させた細胞は、ワクチン、１つ以上のサイトカイン、１つ以上の治療用抗体等と併せて、患者に送達されてもよい。より強固なＴ細胞集団によって恩恵を受ける実質上あらゆる療法が、本発明の組成物と併せて使用され得る。
Ｖ．本発明のキット
（ｉ）対象からＴ細胞を単離するための組成物、（ｉｉ）Ｔ細胞の生体外培養のための組成物、（ｉｉｉ）１つ以上のＴ細胞亜集団（例えば、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇ、メモリーＴ細胞等）の選択的増殖のための組成物を備えるキットも、本明細書で提供される。本発明のキットは、Ｔｒｅｇ細胞の再活性化のための組成物を任意で含み得る。
キットは、洗浄ステップ、培養条件、及び特異的Ｔ細胞亜集団の選択的増殖のための、本発明の組成物を用いた、単離されたＴ細胞のインキュベーションの持続時間のための説明書等の、キットを使用するための書面での説明書も含み得る。
本明細書を通して示される全ての最大数値限定は、そのようなより低い数値限定が明示的に本明細書に記載されているかのように、全てのより小さい数値限定を含むことが意図される。本明細書を通して示される全ての最小数値限定は、そのようなより大きい数値限定が明示的に本明細書に記載されているかのように、全てのより大きい数値限定を含む。本明細書を通して示される全ての数値範囲は、そのようなより狭い数値範囲が全て明示的に本明細書に記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲内にある全てのより狭い数値範囲を含む。
本発明は、例示の目的で提供され、かつ制限することを意味しない以下の実施例を参照することにより、さらに理解することができる。
実施例１．初代Ｔ細胞及び培養条件
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、インフォームドコンセントの下、健康なドナーバフィーコートまたはアフェレーシスから単離する（ＨｅｍａＣａｒｅ Ｃｏｒｐ．，ＣＡ ＵＳＡ及びＡｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ＬＬＣ，ＷＡ，ＵＳＡ）。抗原特異的メモリーＴ細胞を、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＬＬＣ）で刺激した後、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）陽性ドナー由来のＰＢＭＣにおいて増やす。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低／－発現Ｔｒｅｇ細胞（Ｏｓｌｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｕｌｌｅｖａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）をもたらす、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ１２７の抗体標識に基づく蛍光活性化細胞選別によって浄化及びＣＤ４富化された（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ４ Ｔ細胞、カタログ番号１１３４６Ｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ ＵＳＡ）リンパ球分画から、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を得る。
Ｔ細胞を、ＰＢＭＣから直接、記載される様々なリガンド組成物及び化学量でＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を使用することにより、または単離もしくは富化させたＴ細胞サブセットからのいずれかで、活性化させる。活性化Ｔ細胞を、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＭＤ、ＵＳＡ、カタログ番号ＢＥ０４－４１８Ｆ）と、２～５％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲと、０．２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（これらの両方共、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮＹ，ＵＳＡ、カタログ番号１５７１０－０４９）との中で、３７℃及び５％のＣＯ２で培養し、０．５～２×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度を維持するように、１～３日に１回サイトカイン及び新しい培地を添加することにより、増殖を達成する。
流動選別したＴ調節性細胞（Ｔｒｅｇ）を、１００ｎｇ／ｍｌのラパマイシン（ＰＨＺ１２３５ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＹ ＵＳＡ）及び３００ＩＵのＩＬ－２／ｍｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＹ ＵＳＡ）を含有する培地内で増殖させる一方で、ＣＭＶ刺激Ｔ細胞を、１００ＩＵのＩＬ－２／ｍｌ中で増殖させる。Ｔｈ１７／Ｔｃ１７細胞を、Ｐａｕｌｏｓら（Ｐａｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ ５５：５５ｒａ７８（２０１０））に記載されるように、抗ＩＬ－４及び抗ＩＦＮ－γ中和抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ ＵＳ）の存在下で、極性化サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＬ－２３、及びＴＧＦ－β、全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＣＡ ＵＳＡ）を含有する培地中で増殖させる。１００ＩＵのＩＬ－２／ｍｌを、活性化後３日目に添加する。
実施例２．様々なリガンド組成物及び比率を持つＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ベースの増殖プラットフォームの生成
ＤＹＮＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）ＭＳ－４．５－ＲＥＫ粒子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｉｌｌｅｓｔｒｏｍ，Ｎｏｒｗａｙ）を、様々なＴ細胞サブセット：ｉ）Ｔｒｅｇ、ｉｉ）抗原経験メモリーＴ細胞、ｉｉｉ）及びＴｈ１７／Ｔｃ１７細胞それぞれの活性化及び極性化のために最適化した異なる量及び比率の刺激及び共刺激性リガンドと結合させる。刺激抗ＣＤ３抗体及びその共結合した共刺激性リガンドの相対量を、表３に要約する。
（表３）
Figure 0007084304000003
実施例３．Ｔ細胞の刺激及び増殖
Ｔ細胞を、ＰＢＭＣから直接、または、他の比率が記載されていない限り、１個のＴ細胞当たり１個のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を添加することにより、単離もしくは富化させたＴ細胞サブセットからのいずれかで、活性化させる。大部分の実験においてＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳ（商標）（ＣＤ３高）を、基準刺激因子として含める。加えて、代替Ｔｒｅｇ活性化試薬（ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＥｘｐＡｃｔ Ｔｒｅｇ Ｋｉｔ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉカタログ番号１７０－０７６－１１９）を、Ｔｒｅｇ増殖レベルを評価するために、実験に含めた。活性化Ｔ細胞を、２～３日間攪乱せずにおき、その後必要に応じて新しい培養液及びサイトカインを添加することにより、１０～１４日間増殖させる。Ｔｒｅｇを、一次活性化（０日目）と同じ刺激ビーズを利用して、９日目に再刺激する。細胞を、絶対細胞増殖を測定するために、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ ＵＳＡ）で分析する。
実施例４．抗体及びフローサイトメトリー分析
以下の細胞をＴｒｅｇ分析に用いた：ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＭＨＣＤ０４３１）、ＣＤ２５ ＡＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＭＨＣＤ２５０５）及びＣＤ１２７ ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ１８６８４）。細胞内ＦＯＸＰ３発現を、固定化／透過処理（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の後に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＢＤ５６００４７）により分析する。フローサイトメトリーデータを、ＢＤ ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で集め、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。リンパ球を、これらの順方向及びサイズ分散特性に従ってゲート（ｇａｔｅ）する。適当な無関係なアイソタイプ対照を使用して、負のゲートを設定する（ＩｇＧ２ａ ＰｅｒＣＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ 番号ＭＡ１－１０４２６）、ＩｇＧ１ ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＧ１０５）、ＩｇＧ１ ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＧ１０４）、及びＩｇＧ１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５７７０２））。
ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｐｒｏ５ Ｐｅｎｔａｍｅｒ ＡＰＣ（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ／Ａ＊０２：０１）（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ，Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ）及びＣＤ８－ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＨＣＤ０８０４）を使用して、適当なアイソタイプ対照（ＩｇＧ１ ＰＥ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＧ１０４）を用いて同定する。
ＰＭＡ／イオノマイシン活性化Ｔｈ１７細胞中の細胞内ＩＬ－１７発現を、固定化／透過処理（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の後に、ＩＬ－１７Ａ－ＰＥ（カタログ番号Ａ１８６９５、クローン：４Ｈ１５２４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）及び適当なアイソタイプ対照（ＩｇＧ２ｂ ＰＥ、カタログ番号４００３１３ ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、検出する。フローサイトメトリーデータを、ＢＤ ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で集め、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。
実施例５．フローサイトメトリーによる機能性
Ｔｈ１７極性化及び増殖Ｔ細胞を、タンパク質輸送阻害剤ブレフェルジン及びモネンシンを含有するＣｅｌｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４９７１）を使用して、ＰＭＡ／イオノマイシン（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）活性化後１３日目）刺激から４～５時間後に、Ｔｈ１７極性化及び増殖Ｔ細胞の細胞内ＩＬ－１７発現を特徴付ける。この刺激は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって提供されたプロトコルに従って行う。ＩＬ－１７発現を、記載されるように、フローサイトメトリーにより、細胞内ＩＬ－１７染色によって評価する。
実施例６．Ｔｒｅｇの活性化及び増殖
図１に示すように、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低／－フローサイトメトリー選別Ｔｒｅｇ（約９０％のＦＯＸＰ３＋細胞）を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｔｒｅｇプロトタイプで効率的に活性化させて、数百倍に増殖させ（上部）、増殖培養において１４日後に高ＦＯＸＰ３発現を保持した（下部）。細胞を、９日目に同じプロトタイプビーズを使用して再び刺激する。増殖の増加を、より少ない量のＣＤ３と結合するＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）で達成する。図１に見られるように、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８（低ＣＤ３－約０．３４）を利用した刺激プロトコルが、最も高いＴｒｅｇ増殖をもたらす。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８（高ＣＤ３－約３．４）は、いかなる効率的Ｔｒｅｇ増殖も生成しない。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８低（ＣＤ３－約０．３４）及びＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８中（ＣＤ３－約０．７５）は、代替Ｔｒｅｇ刺激試薬と類似してまたはより良好に機能する。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳ（商標）（ＣＤ３－約１．５）は、最適以下の増殖をもたらす。
実施例７．抗原経験（ＣＭＶ特異的メモリー）Ｔ細胞の活性化及び増殖
図２に見られるように、活性化後１０日目のＣＭＶ特異的メモリーＴ細胞の増殖倍率は、より多くのアゴニストＣＤ３抗体と結合したＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）プロトタイプによってもたらされるシグナル強度の増加と負に相関する。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的Ｔ細胞をモデルとして使用することにより、ＣＤ３、ＣＤ２８及び／またはＣＤ１３７抗体と結合した異なるＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）プロトタイプ、及びＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳ（商標）を使用して、ＣＭＶ＋ドナー由来のペプチド刺激ＰＢＭＣから増殖したＴ細胞に関して、増殖動態及び表現型を比較する。（より弱いＣＤ３活性化シグナルを提供する）少量のＣＤ３と結合したビーズの優位性が、ここに示される。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳ（商標）は、最適以下であり、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞を増殖させない。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ１３７／ＣＤ２８は、最も高いメモリーＴ細胞増殖をもたらす。
実施例８．Ｔｈ１７細胞の活性化、極性化及び増殖
Ｔ細胞を、Ｔｈ１７極性化条件を用いて培養し、ＣＤ３／ＩＣＯＳ（結合した様々な量の抗ＣＤ３抗体；１．５及び０．０６、及び２つの異なるＩＣＯＳクローン）またはＣＤ３／ＣＤ２８（ＣＴＳビーズ）に対する抗体と結合したＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）（ＣＴＳビーズ）を用いて増殖させる。３日目から、ＩＬ－２を培養液に添加する。１３日目に、ＩＬ－１７発現を評価する前に４～５時間、ＰＭＡ－イオノマイシンで培養液を刺激する。ヒストグラムは、ＩＬ－１７の細胞内発現を示す；ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＩＣＯＳ（ＩＳＡ－３）、ＣＤ３高及び低（１．５及び０．０６）、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＩＣＯＳ（異なるＩＣＯＳ Ｃ３９８．４Ａ、ｅＢｉｏｃｉｅｎｓｅｓ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから購入）、低ＣＤ３（０．０６）、ならびにＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳ（商標）。活性化シグナル強度及び共刺激の性質は、Ｔｈ１７細胞の極性化及び増殖に大きく影響を与える。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＩＣＯＳ（中－０．３）を用いた活性化は、「（高－１．５）」と類似した表現型をもたらす（図示せず）。
Ｔｈ１７細胞の好結果の極性化及び増殖は、弱ＣＤ３シグナル（ＣＤ３－０．０６）をもたらすように設計されたＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＩＣＯＳ（ＩＳＡ－３クローン）でのＴ細胞の活性化でのみ達成される。ＩＳＡ－３ ＩＣＯＳクローンのみが、この研究において機能的である。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳ（商標）（ＣＤ３－１．５）は、低／無Ｔｈ１７極性化／増殖をもたらす。
実施例９：ＩＬ－１７産生細胞の選択的増殖に対するビーズ：細胞比率の影響
Ｔ細胞を、３人のドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）から収集する。白血球アフェレーシスにより健康なドナーからＰＢＭＣを回収し、Ｆｉｃｏｌｌ－メトリゾ酸ナトリウム密度勾配よりさらに精製した。Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｎｏｒｍａｌ ＰＢＭＣ）。提供されたマニュアルに従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号１１３４４Ｄ）を使用することによるＣＤ３＋Ｔ細胞富化。
負に単離したＣＤ３＋Ｔ細胞を、所与のビーズ：細胞比率（ＢＣ１：１、１：３、１：５）（表４）のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＩＣＯＳ（低－中－高）で刺激し、Ｔｈ１７極性化サイトカインで３日間培養する。ＴＧＦ－β１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＰＨＧ９２１４；１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１β：ＰＨＣ０８１６ １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－２３；ＰＨＣ９３２４、２０ｎｇ／ｍｌ、ｒＩＬ－６；ＰＨＣ００６６ １０ｎｇ／ｍｌ、及びＩＬ－２（１００ＵＬｍｌ、３日目から。抗ＩＦＮγ抗体ＡＨＣ４０３２ １０μｇ／ｍｌ、抗ヒトＩＬ４、Ｅ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製（カタログ番号ＢＭＳ１２９）１０μｇ／ｍｌ。必要に応じて分割する。１０日目に、全増殖（Ｔ細胞増殖）を測定し、及び細胞を再刺激し、ＩＬ－１７産生細胞の分画を、ＩＬ－１７に関して細胞内フローサイトメトリー染色により評価する（ＩＬ－１７産生細胞％）。図４Ａ～図４Ｃに示すデータは、Ｔｈ１７細胞の選択的増殖に対するビーズ：細胞比率の影響を示す。ＩＬ－１７産生細胞の相対数を、ＩＬ－１７産生細胞の割合を全Ｔ細胞増殖倍率で乗じたものとして報告する。
（表４）
Figure 0007084304000004
ＡＢ＝ＣＤ３／ＩＣＯＳ抗体比率
ＢＣ＝ビーズに対する細胞の比率
実施例１０：Ｔｈ１７細胞を生成するためのプロトコル
序文
ＩＬ－１７Ａを分泌するＴ細胞（Ｔｈ１７及びＴｃ１７細胞）は、腫瘍を有するマウス内への養子移植後、非極性化Ｔ細胞またはＩＦＮ－γ分泌Ｔｈ１もしくはＴｃ１細胞よりも大幅に腫瘍を退行させる（Ｍｕｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１２：３６２－７３，（２００８），Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９４：１７３７－４７（２０１５），Ｇｕｅｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２４：１０７０－８０（２０１４））。ヒトＴｈ１７細胞発生の生成を調節する因子は、まだ論議が交わされており、Ｔｈ１７細胞の分化は、ＲＯＲγｔ、ＩＲＦ４、ＲＵＮＸ１、ＢＡＴＦ、及びＳＴＡＴ３を含む様々な転写因子によって制御されていることが報告されている（Ｎａｌｂａｎｔ ａｎｄ Ｅｓｋｉｅｒ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｅｌｉｔｅ Ｅｄ．），８：４２７－３５（２０１６））。養子細胞移植のためのＴｈ１７細胞を増殖させることができる確固とした培養条件の特定が、望ましい。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳ（商標）活性化が、Ｔｈ１極性化表現型を特徴とするＴ細胞産生物をもたらす一方で、ある特定の極性化条件下でＴ細胞に提供されるより弱いＣＤ３－シグナルは、Ｔｈ１７発生を誘導する（Ｐｕｒｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１：４８２９－３７（２０１０））。最適化されたＣＤ３シグナル強度は、１：５という低いビーズ対細胞比率を一緒に用いて、ビーズに結合したアゴニストＣＤ３抗体の量を低減することによって達成することができることが、見出された。ＩＣＯＳ共刺激と併せた弱いＣＤ３シグナルは、ＣＤ２８共刺激を提供するビーズと比較してＩＬ－１７Ａ産生Ｔ細胞のより大きい分画を生成することが見出された。
Ｔｈ１７細胞を生成することが示された以下の代替の経路及びプロトコルが、報告されている。ｉ）ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－２３及びＴＧＦ－βの存在下でのＣＤ５またはＣＤ６共刺激（ｄｅ Ｗｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８：６１０７－１４（２０１１））、ｉｉ）Ａｇ媒介ＣＤ３／ＴＣＲ刺激を伴うＳＬＡＭＦ３及びＳＬＡＭＦ６の会合（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８８：１２０６－１２（２０１２））、ｉｉｉ）アリール炭化水素受容体（ＡＲＨ）に作用するアゴニスト（Ｖｅｌｄｈｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２０６：４３－９（２００９）、ならびにｉｖ）強力なレチノイン酸受容体関連オーファン受容体（ＲＯＲ）アゴニストとして機能するコレステロール前駆体（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，１１：１４１－１４７（２０１５））。しかしながら、一般的に使用される培地ＲＰＭＩは、低レベルのＴｈ１７極性化だけを支持する。アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）アゴニストの前駆体である芳香族アミノ酸をより豊富に含む他の培地は、より高いＴｈ１７増殖を一貫してもたらし、ＡＨＲ活性化がＴｈ１７極性化に必要不可欠であることを示している。ＲＯＲγｔは、Ｔｈ１７細胞のマスター転写因子である。マウス内に注射されると、ＲＯＲγｔアゴニストは、高レベルのＴｈ１７サイトカインをもたらし、ＣＤ１３７等の共刺激性受容体のレベルを上昇させ、共阻害受容体ＰＤ－１の発現を減少させる（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，“ＲＯＲｇ ａｇｏｎｉｓｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ”ＡＡＣＲ ａｂｓｔｒａｃｔ ＃５６５，Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ ２０１６）。さらに、インビトロでＲＯＲγｔアゴニストで処理されたＴ細胞は、養子移植後に低ＰＤ－１発現を維持した。
ＡＨＲアゴニストの使用を含む極性化条件下での、低いＣＤ３強度活性化及びＣＤ５共刺激に続くＴ細胞の著しいＴｈ１７極性化が、見出された。
材料及び方法
初代Ｔ細胞及び培養条件：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、インフォームドコンセントの下、健康なドナーのバフィーコートまたはアフェレーシス（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＷＡ，ＵＳＡ）から単離した。負に単離したＴ細胞（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ、カタログ番号１１３４４Ｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、記載される様々なリガンド組成物及び化学量を用いて、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を使用することによって活性化させた。極性化条件を、文中に記載する。活性化Ｔ細胞を、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５（商標）（カタログ番号ＢＥ０２－０６０Ｆ、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）に加えて、２～５％のＣＴＳ（商標）免疫細胞ＳＲ（カタログ番号Ａ２５９６１－０２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及び０．２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（カタログ番号１５７５００６０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、３７℃及び５％のＣＯ２で培養し、指定されるように０．５～２×１０６個の細胞／ｍｌの細胞濃度を維持するように、１～３日に１回サイトカイン及び新しい培地を添加することにより、増殖を達成する。
プロトコル概要：Ｔｈ１７／Ｔｃ１７細胞を、Ｐａｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，２：５５ｒａ７８，（２０１０）に記載されるように、極性化サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＬ－２３、及びＴＧＦ－β（カタログ番号ＩＬ６－ＰＨＣ０６６、ＩＬ－１ β－ＰＨＣ０８１６、ＩＬ２３－ＰＨＣ９３２４、及びＴＧＦ－β－ＰＨＧ９２１４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含有する培地中で、抗ＩＬ－４及び抗ＩＦＮ－γ中和抗体（カタログ番号ＡＣ０６４２及びＡＣＨ４０３２，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）の存在下、増殖させた。極性化サイトカイン及び抗体を、最初の活性化（０～３日目）のためにのみ添加した。細胞を分割し、活性化後３日目から、１００ＩＵのＩＬ－２／ｍＬ及びＩＬ－２３を含有する培地中で保持した。
刺激Ｄｙｎａｂｅａｄｓ：刺激抗ＣＤ３抗体及びＤｙｎｏｓｐｈｅｒｅに結合したその共結合共刺激性リガンドの量を、表５に要約する。
（表５）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｔｈ１７ Ｅｘｐａｎｄｅｒ プロトタイプ及び対照
Figure 0007084304000005
抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体ＸＲ－ＣＤ３及びＸＲ－ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｎｏｒｗａｙ）、抗ＩＣＯＳ抗体ＩＳＡ－３（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ ＣＡ ＵＳＡ）、抗ＣＤ５抗体クローンＵＣＨＴ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｃ／ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ ＣＡ ＵＳＡ）。
Ｔｈ１７細胞の極性化及び増殖：負の単離によって健康なドナーＰＢＭＣから単離したＴ細胞（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ、カタログ番号１１３４４Ｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、異なる共刺激シグナルを伝達するように設計されたＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）－Ｔｈ１７プロトタイプ（ビーズに対する細胞の比率１：５）を用いて、極性化サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－６、ＴＧＦ－β）ならびに中和ＩＬ－４及びＩＦＮγ抗体の存在下で、活性化させた（表５）。活性化Ｔ細胞を、２～３日間攪乱せずにおき、その後必要に応じて新しい培養液及びサイトカインをＩＬ－２及びＩＬ－２３と一緒に添加することにより、１０～１４日間増殖させた。Ｔ細胞増殖を、細胞計数により評価した（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ ＵＳＡ）。増殖の１０～１４日目に、細胞を、表現型マーカーならびにＩＬ－１７Ａ及びＩＦＮγの細胞内発現に関してフローサイトメトリーによって分析する前、かつ固定化及び透過処理後に、モネンシン（ＢＤ ＧＯＬＧＩＳＴＯＰ（商標）、カタログ番号５５４７２４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びブレフェルジンＡ（ＢＤ ＧＯＬＧＩＰＬＵＧ（商標）、カタログ番号５５５０２９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する培地中で５時間、ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した。
（表６）極性化剤及び極性化剤の機能
Figure 0007084304000006
ＰＭＡ／イオノマイシン（タンパク質輸送阻害剤ブレフェルジン及びモネンシンを含有するＣｅｌｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｋｉｔ、カタログ番号００－４９７１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で活性化させたＴｈ１７細胞における細胞内サイトカイン発現を、ＩＬ－１７Ａ－ＰＥ（カタログ番号Ａ１８６９５、クローン：４Ｈ１５２４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）ならびにＩＬ１７－Ｆ、ＩＦＮ－γ及び適当なアイソタイプ対照（ＩｇＧ２ｂ ＰＥ、カタログ番号４００３１３ ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して検出する。フローサイトメトリーデータをＢＤ ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により集め、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
結果及び考察
ｉ）中和抗体の効果
αＩＬ－４／α－ＩＦＮγ抗体を、Ｔｈ１７細胞極性化プロトコルにおいて利用して、Ｔｈ１／Ｔｈ２極性化を妨害した。
ＣＤ３／ＣＤ２８活性化後にＴｈ１７生成を改善させるために、遮断抗体を導入した。臨床等級の遮断抗体は、高価であり、Ｔｈ１７細胞生成プロトコルをさらに複雑にする。
プロトコルの変更：ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＩＣＯＳまたはＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８のいずれかを用いて、最適化された条件を使用して、Ｔ細胞を活性化させる。サイトカインＴＧＦ－β、ＩＬ－２３、ＩＬ－６、ＩＬ－１βにより、Ｔｈ１７極性化を促進する。増殖後のＩＬ－１７産生ＣＤ４＋細胞の分画へのαＩＬ－４／α－ＩＦＮ－γ中和抗体の影響を、図５で比較する。
結論：ＣＤ３／ＩＣＯＳによる刺激は、ＣＤ３／ＣＤ２８と比較して、ＩＬ－１７産生Ｔ細胞のより高い割合の分画を生じる（ＣＤ４細胞の１６．５％に対して４２．５％）。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＩＣＯＳ（＋Ｔｈ１７極性化サイトカイン）でのＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激後のＴｈ１７細胞の生成は、中和ＩＦＮ－γ及びＩＬ－４抗体に対し、より決定的に依存しない。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激は、Ｔｈ１／Ｔｈ２遮断抗体の添加が必要である。
ｉｉ）ＣＤ５共刺激の効果
ＣＤ５は、ＩＬ－２３Ｒ発現の増加によりＴｈ１７発生を促進し、ＣＤ２８共刺激と比較して、長期にわたるＳＴＡＴ３活性化及びＲＯＲ－γｔのレベルの増加をもたらすことが報告されている（ｄｅ Ｗｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８：６１０７－１４（２０１１））。
プロトコルの変更：Ｔ細胞を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ５、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＩＣＯＳ、またはＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８で、同等のシグナル強度及び化学量を用いて活性化させた。Ｔｈ１７極性化を、サイトカイン（ＴＧＦ－β、ＩＬ－２３、ＩＬ－６、ＩＬ－１β）及びαＩＬ－４／α－ＩＦＮ－γ中和抗体の添加により促進した。ＩＬ－１７及びＩＦＮ－γ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の分画（細胞内染色）、ならびにＣＣＲ４＋ＣＣＲ６＋発現細胞（Ｔｈ１７に関連した表現型）の分画を比較した（図６及び図７）。
結論：ＣＤ３／ＣＤ５による刺激は、ＣＤ３／ＩＣＯＳと比較して、Ｔｈ１７プロファイルに相当するか、またはわずかにより高いＴｈ１７プロファイルをもたらし、ＩＬ－１７産生及びＣＣＲ４／ＣＣＲ６共発現により判定した場合、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激より優れている。
ｉｉｉ）ＡＨＲアゴニストの効果
ＡＨＲリガンドＦＩＣＺ（５，１１－ジヒドロインドロ（ｄｉｈｙｄｒｏｉｎｄｏｌｏ）（３，２－ｂ）カルバゾール－６－カルボキサルデヒド）は、Ｔｈ１７プログラムを上方調節することが示された（Ｖｅｌｄｈｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０６：４３－９（２００９）。
プロトコルの変更：Ｔ細胞を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ５、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＩＣＯＳ、またはＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８で、同等のシグナル強度及び化学量を用いて活性化させた。Ｔｈ１７極性化を、ｉ）サイトカイン（ＴＧＦ－β、ＩＬ－２３、ＩＬ－６、ＩＬ－１β）及びαＩＬ－４／α－ＩＦＮ－γ中和抗体、またはｉｉ）ＡＨＲアゴニストＦＩＣＺに加えてＩＬ－６、ＩＬ－１βａの添加により、促進した。Ｔｈ１７極性化を、極性化Ｔ細胞のＰＭＡ／イオノマイシン活性化に続いて、ＩＬ－１７及びＩＦＮ－γの細胞内染色により評価した（図８）。
結論：ＦＩＣＺは、ＣＤ５により共刺激したが、ＩＣＯＳでは共刺激しなかったＴ細胞に対して、有望な作用を有した。ＦＩＣＺ、ＩＬ－１β、及びＩＬ－６プロトコルは、標準極性化条件と比較して、より少ないＩＬ－１７産生細胞を生成し、最適化が必要である。
実施例１１：ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｔｒｅｇビーズを用いたＴｒｅｇ細胞の増殖（８０％超のＦＯＸＰ３）
（表７）本実施例で使用した材料及び材料の供給源
Figure 0007084304000007
選別したＴｒｅｇ細胞（８０％超のＦＯＸＰ３）をＸ－ＶＩＶＯ１５＋５％のＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５／ＣＴＳ）中で希釈して、２００万個の細胞／ｍＬにした。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）を、磁気単離により１回洗浄し、ビーズをＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５／ＣＴＳ中で４００万個／ｍＬに希釈した。対照ビーズを、１回洗浄し、３００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ２を有するＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５／ＣＴＳ中で４００万個／ｍＬにビーズを希釈した。次いで、当量の細胞、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５／ＣＴＳ、及びビーズを、４８ウェルプレートのウェルに添加して、４００μｌの総体積にした。手順は、各試料に対して３連で完了した。
（表８）試薬混合物
Figure 0007084304000008
０日目：Ｔｒｅｇ増殖混合物を、上述のようにＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５／ＣＴＳを用いて、３００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ２とともに４８ウェルプレートで調製した。
２日目：２００μＬのＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５／ＣＴＳ及び３００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ２を、各ウェルに添加し、得られた細胞懸濁液を混合した。
３～１２日目：細胞濃度を、顕微鏡によって毎日見積もった。約１５０～２００万個の細胞／ｃｍ２の密度に達したとき、細胞を、より大きいウェルまたはフラスコに移した。新しいＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５／ＣＴＳを３００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ２とともに、必要に応じて添加した。
５日目：２５０μＬのＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５／ＣＴＳを、各試料から除去し、２５０μＬの新しいＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５／ＣＴＳを、３００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ２とともに添加した。次いで、この細胞懸濁液を混合した。
７日目：約１５０～２００万個の細胞／ｃｍ２の細胞密度に達したら、細胞を、より大きいウェル／フラスコに移し、新しいＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５／ＣＴＳを、３００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ２とともに添加した。
９日目：新しいＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５／ＣＴＳを３００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ２とともに、再度添加し、細胞懸濁液を混合した。
１２日目：各ウェルにおいて体積を決定し、細胞を計数した。１００，０００～２００，０００個の細胞を、表９に記載される試薬を用いるＦｏｘＰ３染色のために使用した。
（表９）
Figure 0007084304000009
固定化／透過処理溶液を、固定化／透過処理（１部）と、固定化透過処理希釈剤（３部）とを混合することにより、調製した。固定化／透過処理緩衝液／洗浄液を、透過処理濃縮剤（１部）と、水（９部）とを混合することにより調製した。毎日新しいものを調製した。典型的に、１０万～２０万個の細胞を染色した。
細胞を、１ｍＬのＤＰＢＳ／０．１％のＨＡＳで１回洗浄し、３５０ｘｇで８分間遠心分離にかけ、上清を除去した。
細胞をパルスボルテックスして、次いでボルテックスにより混合した。１ｍＬの固定化／透過処理（１倍）溶液を添加し、細胞を、再度ボルテックスした。次いで、細胞懸濁液を、４℃度で６０分間インキュベートした。次いで、２ｍＬの透過処理緩衝液／洗浄液（１倍）を添加し、懸濁液を、４００ｘｇで８分間、４℃で遠心分離にかけ、上清を除去した。透過処理緩衝液／洗浄液の添加、及びそれに続いて遠心分離を１回繰り返した。
次いで、染色混合物５０μＬ（２．５μＬのＣＤ４ ＰｅｒＣＰ、２．５μＬのＣＤ２５ ＡＰＣ、５μＬのＦＯＸＰ３ ＡＦ４８８、２μＬのＣＤ１２７ＰＥ＋ ３８μＬの透過処理緩衝液／洗浄液（１倍））を試料に添加し、続いて、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、試料を、フローサイトメトリーにより分析した。
他の実施形態
本発明が本発明の詳細な説明とともに記載されている一方で、前述の説明は、例示することを意図し、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲に制限されない。他の態様、利点、及び変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
本特許及び本明細書で参照される学術文献は、当業者に利用可能な情報を確立する。本明細書に引用される全ての米国特許及び公開または非公開米国特許出願は、参照により組み込まれる。
本発明が特定の実施形態を参照して具体的に示され、記載される一方で、形態及び詳細における様々な変更が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく加えられ得ることが当業者には理解されるであろう。
本発明の例示的な対象が以下の条項によって表される。
条項１
Ｔ細胞亜集団のメンバーを選択的に増殖させるための方法であって、
Ｔ細胞の混合集団を、
（ａ）前記Ｔ細胞亜集団の前記メンバーに一次活性化シグナルを提供し、それによって前記Ｔ細胞を活性化させる、第１の作用物質と、
（ｂ）第２の作用物質及び第３の作用物質であって、これらの各々が、前記Ｔ細胞亜集団の前記メンバー上の２つ以上の異なるアクセサリー分子を刺激し、それによって（ａ）の前記活性化されたＴ細胞の増殖を刺激する、第２の作用物質及び第３の作用物質と
に曝露することを含み、
前記第１の作用物質、前記第２の作用物質、及び前記第３の作用物質の比率が、他のＴ細胞亜集団のメンバーよりも前記Ｔ細胞亜集団の前記メンバーを誘導して選択的に増殖させるように調節される、
方法。
条項２
前記第１の作用物質が、抗ＣＤ３抗体である、条項１の方法。
条項３
前記第２の作用物質が、抗体である、条項１の方法。
条項４
前記第３の作用物質が、抗体または非抗体タンパク質である、条項１の方法。
条項５
前記非抗体タンパク質が、ケモカインまたはサイトカインである、条項４の方法。
条項６
前記ケモカインまたはサイトカインが、
（ａ）インターロイキン－１α、
（ｂ）インターロイキン－２、
（ｃ）インターロイキン－４、
（ｄ）インターロイキン－１β、
（ｅ）インターロイキン－６、
（ｆ）インターロイキン－１２、
（ｇ）インターロイキン－１５、
（ｈ）インターロイキン－１８、
（ｉ）インターロイキン－２１、及び
（ｊ）トランスフォーミング増殖因子β１
からなる群から選択される１つ以上のタンパク質である、
条項４の方法。
条項７
前記第１の作用物質、前記第２の作用物質、及び前記第３の作用物質の比率が、前記第２または第３の作用物質と比較して、前記第１の作用物質の濃度がより低いように調節される、条項１の方法。
条項８
前記第１の作用物質のより低い濃度が、約０．３４単位である、条項７の方法。
条項９
前記第１の作用物質が、約０．３４単位の濃度の抗ＣＤ３抗体であり、第２の作用物質が、３．４単位の濃度の抗ＣＤ２８抗体である、条項８の方法。
条項１０
前記選択的に増殖されるＴ細胞亜集団が、Ｔｒｅｇ細胞である、条項８の方法。
条項１１
前記第１の作用物質のより低い濃度が、約０．０１単位である、条項７の方法。
条項１２
前記第１の作用物質が、約０．０１単位の濃度の抗ＣＤ３抗体であり、第２の作用物質が、抗ＣＤ２８抗体であり、第３の作用物質が、抗ＣＤ１３７抗体である、条項１１の方法。
条項１３
前記選択的に増殖されるＴ細胞亜集団が、メモリーＴ細胞である、条項１２の方法。
条項１４
前記第１の作用物質のより低い濃度が、約０．０６単位である、条項７の方法。
条項１５
前記第１の作用物質が、約０．３４単位の濃度の抗ＣＤ３抗体であり、第２の作用物質が、抗ＩＣＯＳ抗体である、条項１４の方法。
条項１６
前記選択的に増殖されるＴ細胞亜集団が、Ｔｈ１７細胞である、条項１５の方法。
条項１７
Ｔ細胞亜集団を選択的に増殖させるための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７シグナルに生体外で曝露することと、
（ｂ）前記Ｔ細胞を、Ｔｈ１７細胞、抗原経験Ｔ細胞、及び／または調節性Ｔ細胞の増殖を可能にする様式で培養することと
を含む、方法。
条項１８
前記ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７シグナルが、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び／または抗ＣＤ１３７抗体によって媒介される、条項１７の方法。
条項１９
前記抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７抗体が、メモリーＴ細胞の増殖のために、０．０１単位～１．５単位の濃度を包含する範囲で使用される、条項１７の方法。
条項２０
前記抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７抗体が、Ｔｈ１７細胞の増殖のために、０．０６単位～１．５単位の濃度を包含する範囲で使用される、条項１７の方法。
条項２１
前記抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７抗体が、Ｔｒｅｇ細胞の増殖のために、約０．３４単位～３．４１単位の濃度を包含する範囲で使用される、条項１７の方法。
条項２２
前記抗ＣＤ３抗体が、前記抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ１３７抗体の濃度と比較して、より低い濃度で使用される、条項１７の方法。
条項２３
前記Ｔ細胞が、ＣＤ３選択を使用して単離される、条項１７の方法。
条項２４
前記Ｔｈ１７細胞が、ＣＤ３＋、ＣＤ８／ＣＤ４＋／であり、ＩＬ－１７サイトカインを産生する、条項１７の方法。
条項２５
前記Ｔｈ１７細胞が、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、及び／またはＩＬ－２２を産生することができる、条項１７の方法。
条項２６
前記メモリーＴ細胞が、幹細胞様メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、及びエフェクターメモリーＴ細胞からなる群から選択される、条項１７の方法。
条項２７
前記幹細胞様メモリー細胞が、次のマーカー：ＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＩＬ－７Ｒα＋、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、及びＬＦＡ－１のうちの１つ以上を有する、条項２６の方法。
条項２８
前記セントラルメモリー細胞が、次のマーカー：ＣＤ３＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２７＋、及びＣＤ２８＋のうちの１つ以上を有する、条項２６の方法。
条項２９
前記セントラルメモリー細胞が、ＩＬ－２を産生することができる、条項２８の方法。
条項３０
前記エフェクターメモリー細胞が、次のマーカー：ＣＤ２８＋／－、ＣＤ２７＋／－、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＣＲ７－、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋のうちの１つ以上を有する、条項２６の方法。
条項３１
前記エフェクターメモリー細胞が、ＩＦＮγ及びＩＬ－４を産生することができる、条項２６の方法。
条項３２
前記Ｔｒｅｇ細胞が、次のマーカー：ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋、及びＣＤ１２７負／低のうちの１つ以上を有する、条項１７の方法。
条項３３
Ｔ調節性細胞を選択的に増殖させるための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞をＣＤ３及びＣＤ２８シグナルに生体外で曝露することと、
（ｂ）前記Ｔ細胞を、Ｔ調節性細胞の増殖を可能にする様式で培養することと
を含む、方法。
条項３４
前記ＣＤ３及びＣＤ２８シグナルが、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によって媒介される、条項３３の方法。
条項３５
前記抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体が、０．３４～３．４単位の濃度範囲を包含する範囲で使用される、条項３４の方法。
条項３６
前記抗ＣＤ３抗体が、抗ＣＤ２８及び／または抗体の濃度と比較して、より低い濃度で使用される、条項３４の方法。
条項３７
Ｔｈ１７細胞を選択的に増殖させるための方法であって、
（ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ２８及び／またはＩＣＯＳシグナルに生体外で曝露することと、
（ｂ）前記ＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｔｈ１７細胞の増殖を可能にする様式で培養することと
を含み、
ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＩＣＯＳの量が同じではない、方法。
条項３８
前記ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＩＣＯＳシグナルが、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＩＣＯＳ抗体によって媒介される、条項３７の方法。
条項３９
前記抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び抗ＩＣＯＳ抗体が、Ｔｈ１７細胞の増殖のために、０．０６～１．５単位の濃度範囲を包含する範囲で使用される、条項３７の方法。
条項４０
前記抗ＣＤ３抗体が、抗ＣＤ２８及び／または抗ＩＣＯＳ抗体の濃度と比較して、より低い濃度で使用される、条項３７の方法。
条項４１
抗原経験Ｔ細胞を選択的に増殖させるための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２７、及び／またはＣＤ１３７シグナルに生体外で曝露することと、
（ｂ）前記Ｔ細胞を、抗原経験Ｔ細胞の増殖を可能にする様式で培養することと
を含む、方法。
条項４２
前記ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２７、ならびに／または抗ＣＤ１３７シグナルが、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２７、及び／または抗ＣＤ１３７抗体によって提供される、条項４１の方法。
条項４３
前記抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２７、及び抗ＣＤ１３７抗体が、０．０１～１．５単位の濃度範囲を包含する範囲で使用される、条項４１の方法。
条項４４
前記抗ＣＤ３抗体が、抗ＣＤ２８及び／または抗ＣＤ１３７抗体の濃度と比較して、より低い濃度で使用される、条項４１の方法。
条項４５
ＣＤ３＋（１）Ｔ細胞、及び（２）（ａ）抗ＣＤ３抗体と（ｂ）Ｔ細胞亜集団の選択的増殖を行うことができる抗ＣＤ２８、抗ＣＤ１３７、またはＩＣＯＳ抗体とを含有するビーズ
を含む組成物であって、
存在する（ａ）抗ＣＤ３抗体の量と（ｂ）抗ＣＤ２８、抗ＣＤ１３７またはＩＣＯＳ抗体の量とが同じではない、
組成物。
条項４６
前記Ｔ細胞亜集団が、Ｔｈ１７細胞、抗原経験Ｔ細胞及び／または調節性Ｔ細胞からなる群から選択される、条項４５の組成物。
条項４７
抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２７及び抗ＣＤ１３７抗体が、メモリーＴ細胞の増殖のために、０．０１～１．５単位の濃度範囲を包含する範囲で使用される、条項４５の組成物。
条項４８
前記抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７抗体が、Ｔｈ１７細胞の増殖のために、０．０６～１．５単位の濃度範囲を包含する範囲で使用される、条項４５の組成物。
条項４９
前記抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２８抗体が、Ｔｒｅｇ細胞の増殖のために、０．３４～３．４１単位の濃度範囲を包含する範囲で使用される、条項４５の組成物。
条項５０
前記抗ＣＤ３抗体が、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ１３７抗体の濃度と比較して、より低い濃度で使用される、条項４５の組成物。
条項５１
（１）Ｔ細胞、及び（２）Ｔｈ１７細胞の選択的増殖を行うことができる抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７抗体を含有するビーズ
を含む組成物であって、
前記Ｔｈ１７細胞が、１つ以上のエフェクターサイトカインを産生することができ、前記ビーズ上に存在する抗ＣＤ３抗体の量と抗ＣＤ２８抗体の量とが同じではない、
組成物。
条項５２
前記１つ以上のエフェクターサイトカインが、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２２からなる群から選択される、条項５１の組成物。
条項５３
（１）Ｔ細胞、及び（２）抗原経験メモリーＴ細胞の選択的増殖を行うことができる抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７抗体を含有するビーズ
を含む組成物であって、
前記Ｔ細胞が、特異的抗原を認識することができ、前記ビーズ上に存在する抗ＣＤ３抗体の量と抗ＣＤ２８抗体の量とが同じではない、
組成物。
条項５４
前記特異的抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、及びがん抗原からなる群から選択される、条項５３の組成物。
条項５５
前記ウイルス抗原が、ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザ、及びＨＩＶからなる群から選択される、条項５４の組成物。
条項５６
前記抗原が、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）Ｍ－タンパク質、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）線毛、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）リポタンパク質ＶｉｓＥ、類鼻疽菌（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）多糖類抗原、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ガラクトマンナン、及び野兎病菌（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）リポ多糖類からなる群から選択される、条項５３の組成物。
条項５７
（１）Ｔ細胞、及び（２）調節性Ｔ細胞を選択的に増殖させることができる抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を含有するビーズ
を含む組成物であって、
前記ビーズ上に存在する抗ＣＤ３抗体の量と抗ＣＤ２８抗体の量とが同じではない、
組成物。
条項５８
前記調節性Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７低／負である、条項５７の組成物。
条項５９
前記調節性Ｔ細胞活性が、抑制活性を含む、条項５７の組成物。
条項６０
治療を必要とする個体を治療する方法であって、Ｔｈ１７細胞、抗原経験Ｔ細胞、及び／または調節性Ｔ細胞を含む薬学的に許容される組成物を、前記個体に投与することを含む、方法。
条項６１
前記治療を必要とする個体が、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、または感染性疾患を患っている、条項６０の方法。
条項６２
前記がんが、肺がん、膵臓がん、乳がん、肝臓がん、及び皮膚がんである、条項６１の方法。
条項６３
前記炎症性疾患が、糖尿病、関節リウマチ、炎症性腸疾患、家族性地中海熱、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、インターロイキン－１受容体拮抗分子欠損症（ＤＩＲＡ）、全身性紅斑症、ブドウ膜炎、及びベーチェット病からなる群から選択される、条項６１の方法。
条項６４
免疫システムの再構成を必要とする個体の免疫システムを再構成する方法であって、Ｔｈ１７細胞、抗原経験Ｔ細胞、及び／または調節性Ｔ細胞を含む薬学的に許容される組成物を、前記個体に投与することを含む、方法。
条項６５
養子免疫療法を必要とする個体に養子免疫療法を施す方法であって、Ｔｈ１７細胞、抗原経験Ｔ細胞、及び／または調節性Ｔ細胞を含む薬学的に許容される組成物を、前記個体に投与することを含む、方法。
条項６６
前記Ｔ細胞が、遺伝子組み換えされている、条項６０～６５のいずれかの方法。
条項６７
前記遺伝子組み換えが、キメラ抗原受容体である、条項６６の方法。
条項６８
前記遺伝子組み換えが、遺伝子組み換えされたＴ細胞受容体である、条項６６の方法。
条項６９
試料中の２つのＴ細胞亜型の比率を選択的に変えるための方法であって、
Ｔ細胞の混合集団を含む試料を、少なくとも２つの刺激剤と接触させることを含み、
前記刺激剤が、前記混合集団内の前記Ｔ細胞に異なる量のシグナルを提供し、１つのＴ細胞亜型が、第２のＴ細胞亜型と比較して選択的に増殖される、
方法。
条項７０
前記試料が、個体由来のバフィーコート細胞を含む、条項６９の方法。
条項７１
前記少なくとも２つの刺激シグナルが、ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激する、条項６９の方法。
条項７２
少なくとも１つのＴ細胞亜型が、前記混合集団から選択的に除去される、条項６９の方法。
条項７３
Ｔｒｅｇ Ｔ細胞が、前記混合集団内の全Ｔ細胞に対して比例して増加する、条項６９の方法。
条項７４
メモリーＴ細胞の総数が、前記試料において減少する、条項６９の方法。
条項７５
刺激シグナルＣＤ３の量が、ＣＤ２８刺激シグナルの半分未満である、条項６９の方法。
条項７６
Ｔｈ１７細胞を増殖させるための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞の集団をＣＤ３及びＣＤ５シグナルに生体外で曝露することと、
（ｂ）Ｔｈ１７細胞の増殖を可能にする条件下で前記Ｔ細胞の集団を培養することと
を含み、
前記Ｔ細胞の集団が、アリール炭化水素受容体アゴニストに曝露されるか、または外因性インターロイキン－２３に曝露されない、
方法。
条項７７
前記Ｔ細胞の集団が、異なるＴ細胞型の混合集団である、条項７６の方法。
条項７８
前記Ｔ細胞の集団を１つ以上の極性化剤（ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と接触させることをさらに含む、条項７６の方法。
条項７９
接触させることをさらに含み、前記１つ以上の極性化剤が、インターロイキン－１β、インターロイキン－２３、腫瘍成長因子－β、インターロイキン－６、インターロイキン－２１、インターロイキン－２、抗インターロイキン－４抗体、及び抗インターフェロンγ抗体からなる群から選択される１つ以上の作用物質である、条項７６の方法。
条項８０
前記Ｔ細胞の集団が、アリール炭化水素受容体アゴニストにさらに曝露される、条項７６の方法。
条項８１
前記アリール炭化水素受容体アゴニストが、６－ホルミルインドロ［３，２－ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）である、条項８０の方法。
条項８２
前記Ｔ細胞の集団が、インターロイキン－１β及びインターロイキン－６にさらに曝露される、条項７６の方法。
条項８３
前記Ｔｈ１７細胞が、１つ以上のキメラ抗原受容体を発現するように操作される、条項７６の方法。
条項８４
前記１つ以上のキメラ抗原受容体のうちの少なくとも１つが、哺乳動物細胞の細胞表面抗原に対して特異性を有する、条項７６の方法。
条項８５
前記哺乳動物細胞の細胞表面抗原が、腫瘍細胞に関連する抗原である、条項７６の方法。
条項８６
ＣＤ３シグナル、ＣＤ５シグナル、アリール炭化水素受容体アゴニスト、及び１つ以上のサイトカインを含む、組成物。
条項８７
前記１つ以上のサイトカインが、インターロイキン－１β及びインターロイキン－６の両方を含む、条項８６の組成物。
条項８８
Ｔ細胞の集団をさらに含む、条項８６の組成物。
条項８９
前記ＣＤ３シグナルが、抗ＣＤ３抗体である、条項８６の組成物。
条項９０
前記ＣＤ５シグナルが、抗ＣＤ５抗体である、条項８６の組成物。
条項９１
Ｔ細胞の集団、ＣＤ３シグナル、ＣＤ５シグナル、アリール炭化水素受容体アゴニスト、及び１つ以上のサイトカインを含む、組成物。
条項９２
前記Ｔ細胞の集団が、
（ａ）「バフィーコート」試料、
（ｂ）８０％超の混合Ｔ細胞を含有する白血球細胞の試料、
（ｃ）８０％超のＣＤ４＋Ｔ細胞を含有する試料、または
（ｄ）８０％超のＴｈ１７細胞を含有する試料
を含む混合物中に存在する、
条項９１の組成物。
条項９３
細胞の混合集団からのＴ細胞の分離及び活性化のための方法であって、
（ａ）前記細胞の混合集団と、前記細胞の混合集団中に存在するＴ細胞上に位置するタンパク質に対して結合親和性を有する少なくとも第１のリガンドが結合した前記固体支持体とを、前記Ｔ細胞の前記固体支持体への結合、及び同じＴ細胞の活性化を可能にする条件下で接触させることと、
（ｂ）前記固体支持体に結合していない細胞から、前記固体支持体に結合した前記Ｔ細胞を分離して、精製されたＴ細胞集団を得ることと
を含む、方法。
条項９４
前記固体支持体には、少なくとも第１のリガンド及び第２のリガンドが結合しており、前記第１のリガンド及び前記第２のリガンドの各々が、前記細胞の混合集団中に存在する個々のＴ細胞上に位置する異なるタンパク質に対して結合親和性を有する、条項９３の方法。
条項９５
前記第１のリガンドが、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ４抗体のいずれかであり、
前記第２のリガンドが、
（ａ）抗ＣＤ５抗体、
（ｂ）抗ＣＤ２８抗体、
（ｃ）抗ＣＤ１３７抗体、及び
（ｄ）抗ＩＣＯＳ抗体
からなる群から選択されるリガンドである、
条項９４の方法。
条項９６
ステップ（ｂ）で得られた精製されたＴ細胞集団の細胞を前記固体支持体から解放することをさらに含む、条項９３の方法。
条項９７
前記解放されたＴ細胞を増殖させることをさらに含む、条項９６の方法。
条項９８
前記解放されたＴ細胞の増殖が、培養培地中で起こる、条項９７の方法。
条項９９
１つ以上のケモカインまたはサイトカインが、前記培養培地中に存在する、条項９８の方法。
条項１００
前記１つ以上のケモカインまたはサイトカインが、ステップ（ａ）に存在する、条項９３の方法。
条項１０１
前記１つ以上のケモカインまたはサイトカインが、
（ａ）インターロイキン－１α、
（ｂ）インターロイキン－２、
（ｃ）インターロイキン－４、
（ｄ）インターロイキン－１β、
（ｅ）インターロイキン－６、
（ｆ）インターロイキン－１２、
（ｇ）インターロイキン－１５、
（ｈ）インターロイキン－１８、
（ｉ）インターロイキン－２１、及び
（ｊ）トランスフォーミング増殖因子β１
からなる群から選択される、
条項１００の方法。
条項１０２
Ｔ細胞の活性化及び増殖のための方法であって、
Ｔ細胞の混合集団を、
（ａ）Ｔ細胞亜集団のメンバー上の分子を刺激することによって、前記Ｔ細胞亜集団の前記メンバーに一次活性化シグナルを提供する、第１の作用物質、及び
（ｂ）前記第１の作用物質によって刺激された前記分子とは異なる、前記Ｔ細胞亜集団のメンバー上の分子を刺激する、第２の作用物質
と接触させることを含み、
それによって前記集団中のＴ細胞が活性化及び増殖され、
前記第１の作用物質及び前記第２の作用物質が、１つ以上の固体支持体に結合しており、
前記Ｔ細胞が、増殖を可能にする条件下で維持され、
前記固体支持体が、１２０時間未満の期間後に前記Ｔ細胞との接触から外される、
方法。
条項１０３
前記第１の作用物質が、抗ＣＤ３抗体である、条項１０２の方法。
条項１０４
前記第２の作用物質が、抗体である、条項１０２の方法。
条項１０５
前記Ｔ細胞が、抗体または非抗体タンパク質である第３の作用物質と接触される、条項１０２の方法。
条項１０６
前記非抗体タンパク質が、ケモカインまたはサイトカインである、条項１０５の方法。

Claims (10)

  1. Ｔ細胞の混合集団から得られたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７負／低Ｔ細胞を選択的に増殖させるための方法であって、該方法が、
    （ａ）該Ｔ細胞の混合集団を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７負／低Ｔ細胞について富化して、富化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７負／低Ｔ細胞集団を形成する段階と、
    （ｂ）該（ａ）の富化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７負／低Ｔ細胞集団を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させる段階と、
    を含み、
    該抗ＣＤ３抗体および該抗ＣＤ２８抗体が、１：３～１：２０の比率でビーズに結合されており、かつ、
    該ビーズ対細胞の比率が１０対１～２対１である、
    方法。
  2. 前記富化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７負／低Ｔ細胞集団が、フローサイトメトリー選別により生成される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記富化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７負／低Ｔ細胞集団が、９０％のＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞から構成される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記富化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７負／低Ｔ細胞集団を、９日間にわたって抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させる、請求項１に記載の方法。
  5. 前記富化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７負／低Ｔ細胞集団を、９日目に抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含む追加のビーズと接触させる、請求項４に記載の方法。
  6. 前記富化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７負／低Ｔ細胞集団を、段階（ｂ）においてインターロイキン－２とさらに接触させる、請求項１に記載の方法。
  7. 前記富化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７負／低Ｔ細胞集団を、抗ＣＤ１３７抗体とさらに接触させる、請求項１に記載の方法。
  8. 抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ１３７抗体の比率が、１：１である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ビーズが、１μｍ～１０μｍの直径を有する、請求項１に記載の方法。
  10. 前記抗体が、前記ビーズに共有結合されている、請求項１に記載の方法。
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