JP4673978B2 - 濃縮された抗原特異的ｔ細胞、ならびに関係する治療および予防の組成物および方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の背景）
Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でのＴＣＲ複合体とＭＨＣ／ペプチド複合体との間の分子相互作用を必要とする。これらのリガンドとの接触はＴＣＲのダウンレギュレーションが後に続き（１）、そしてＴ細胞とＡＰＣの相互作用はＡＰＣ由来のＭＨＣ分子をＴ細胞の表面に接着させることができる（２，３）ことが既知であるが、ＡＰＣ上のＭＨＣ／ペプチド複合体の運命は不明である。ＭＨＣ分子の再利用が単一のＭＨＣ／ペプチド複合体に数百までのＴＣＲ分子を誘発させると仮定されている（４）。こうした情況下では、ＭＨＣ／ペプチドおよびＴＣＲの一過性の会合が存在し、そしてＡＰＣ上のＭＨＣの運命はＴＣＲの拘束（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）により決定されないと推定されている。しかしながら、Ｔ細胞／ＡＰＣ界面での安定な超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）の形成（５）はこれらの複合体がどのように解離されるかという疑問を提起する。
【０００２】
（発明の要約）
抗原特異的Ｔ細胞によるＭＨＣクラスＩ／抗原複合体のインターナリゼーションが、Ｔ細胞の不均質な集団からの抗原特異的Ｔ細胞の濃縮方法を提供するために、本発明で利用されている。本発明の方法は、個々の抗原特異的Ｔ細胞を精製する、もしくは多数の抗原に特異的なＴ細胞の混合物から、１つの特定の抗原に特異的なＴ細胞のより均一な収集物を得るための手段を提供する。加えて、本発明の方法は、多数の抗原に特異的なＴ細胞の混合した集団中に存在する１つの特定の抗原に特異的なＴ細胞の存在を検出しかつそれを定量するための手段を提供する。
【０００３】
（発明の詳細な記述）
Ｔ細胞の応答は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でのＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体との接触を介して開始される。しかしながら、これらの複合体の運命は未知である。ここで、緑色蛍光タンパク質と融合されたＭＨＣクラスＩ分子を発現する生存ＡＰＣを使用して、われわれは、ペプチド特異的なＴ細胞とＡＰＣの相互作用が、ＭＨＣクラスＩ分子のクラスターが接触部位で数分以内に集合することを誘導することを示し；その後、これらのＭＨＣクラスＩのクラスターは小さな凝集物でＴ細胞により獲得される。われわれは、Ｔ細胞によるＭＨＣクラスＩの獲得がＴＣＲのダウンレギュレーションと相互に関連し、そしてＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子がＴ細胞によりエンドサイトーシスされかつ分解されることをさらに立証する。これらのデータは、それによりＭＨＣ／ペプチド複合体のＴＣＲ認識がＴ細胞によるＭＨＣ分子のインターナリゼーションにより省略される可能性がある、新規の機構もまた示す。
【０００４】
Ｔ細胞の拘束後のＡＰＣ上でのＭＨＣ／ペプチド複合体の運命を検討するため、われわれは、ＭＨＣクラスＩのＬd−緑色蛍光タンパク質融合分子（Ｌd−ＧＦＰ）を発現する安定な哺乳動物およびショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞系を生じさせた。Ｌd−ＧＦＰを含有するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の発現ベクター（ＪＨ１０２）は、以下のように構築した。すなわち、ＰＣＲ突然変異誘発により、ベクターＭＪ２６２（２２）中のＬdの終止コドンのそれぞれ前および後にＸｈｏ ＩおよびＳａｌ Ｉクローニング部位を生じさせた。その後、ＥＧＦＰのＤＮＡフラグメント（Ｘｈｏ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ）をベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ３（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））から単離し、そして突然変異されたＭＪ２６２ベクター中のＬdの３’端にサブクローニングした。新たな構築物（ＪＨ１０２）の配列をＤＮＡ配列決定により確かめた。それは、ＬdおよびＥＧＦＰの完全長の配列を含有する。Ｌdの配列とＥＧＦＰの配列の間に、ベクターのマルチクローニング部位由来であった２２アミノ酸をコードするリンカー配列を生じさせた。Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１分子を伴いもしくは伴わずにＬd−ＧＦＰを発現する安定なショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞系は、既に記述されたとおり（９）生じさせた。Ｌd−ＧＦＰ哺乳動物細胞発現ベクターの構築は以下のとおりであった。Ｌdを含有するＢａｍ ＨＩ ＤＮＡフラグメントをベクターＪＨ１０２から単離し、そしてベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ３（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））にサブクローニングした。生じるプラスミド（ＪＨ１０３）を電気穿孔法によりＲＭＡ．Ｓ細胞中にトランスフェクションし、そしてＬd−ＧＦＰを発現する安定な細胞系をＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）を用いる選択により生じさせた。抗原が会合されたＭＨＣクラスＩ分子の産生のためのいかなる手段も本発明での使用に適することが、当業者に容易に明らかである。当該技術分野で既知の方法の例は、限定されるものでないが米国特許第５，５９５，８８１号、米国特許第５，８２７，７３７号および米国特許第５，７３１，１６０号明細書に記述されるものを挙げることができる。緑色蛍光タンパク質以外の多様な検出可能なマーカーをＭＨＣクラスＩ分子に融合することができ、そして本発明の方法での使用に適し、また、多様な手段によりＭＨＣクラスＩ分子に連結することができることもまた当業者に容易に明らかである。本発明の方法で使用することができる検出可能なマーカーの例は、限定されるものでないが、ＭＨＣクラスＩタンパク質に取り込まれたもしくはこれに結合された放射性同位元素、あるいは例えば組換え融合タンパク質を創製することにより、化合物もしくはタンパク質を翻訳後に化学的に連結することにより、あるいは抗原−抗体またはストレプトアビジン−ビオチンもしくはアビジン−ビオチン結合対のようないずれかの結合対パートナーを利用して検出可能なマーカーをタンパク質に連結することによりＭＨＣクラスＩタンパク質に連結することができるいずれかの比色的もしくは蛍光の化合物もしくはタンパク質を挙げることができる。
【０００５】
Ｌd−ＧＦＰを発現する細胞系を、２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックマウス系からのＣＤ８+ Ｔ細胞（Ｔ細胞抗原ＱＬ９を特異的に認識する（８））（２Ｃ Ｔ細胞）に特異的なＱＬ９ペプチド（７）を提示するための抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。Ｌdを発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞について既に報告されたとおり（９）、Ｌd−ＧＦＰおよび２種の補助刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）分子、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１を発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は、ペプチド特異的なＴＣＲのダウンレギュレーションおよび２Ｃ細胞の強い増殖応答を誘導し、Ｌd−ＧＦＰ分子が機能的であることを示した。別の方法で述べられない限り、Ｌd−ＧＦＰ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１でコトランスフェクションされたショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞（Ｌd−ＧＦＰ．Ｂ７．ＩＣＡＭ）をＡＰＣとして使用した。Ｌdに強く結合するがしかし２Ｃ ＴＣＲにより認識されない（９）Ｐ１Ａペプチド（１０）を特異性対照として使用した。Ｔ細胞への抗原の提示のためのいかなる手段も本発明の方法での使用に適することが、当業者に容易に明らかである。限定されるものではないが米国特許第５，５９５，８８１号、米国特許第５，８２７，７３７号および米国特許第５，７３１，１６０号明細書に記述されるものを挙げることができる、多様な抗原提示系が既知である。ａｎｔ Ｔ細胞抗原が本発明の方法で有用であることもまた当業者に容易に明らかである。ＭＨＣクラスＩタンパク質と会合することができかつＴ細胞に提示することができるいかなるＴ細胞抗原も、本発明での使用に適する。こうした抗原のいかなる供給源も、抗原が化学的に合成されるにしろ天然の供給源に由来するにしろ、本発明での使用に適する。抗原はいずれの供給源由来であることもでき、そしていずれかの特定の型に限定されないが、但し、抗原がＭＨＣクラスＩタンパク質と会合しかつ抗原をＴ細胞に提示することができる。
【０００６】
休止期の（ｒｅｓｔｉｎｇ）ＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞を精製し、そして多様な期間の間、ＱＬ９ペプチドを負荷されたショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣとともに培養し；その後、共焦点顕微鏡（フルオビュー（ＦｌｕｏＶｉｅｗ）、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ））を用いて、Ｔ細胞およびＡＰＣの動的相互作用を検討した。ＡＰＣとの２Ｃ Ｔ細胞の相互作用の数分以内に、Ｌd−ＧＦＰ分子はＴ細胞の接触の部位で大型のクラスターを形成した（図１Ａ）。対照的に、対照のＰ１Ａペプチドの添加では、Ｌd−ＧＦＰは、Ｔ細胞との接触後、ＡＰＣ上に均一に分布されたままであった（図１Ａ）。単一のＴ細胞が１個以上のＡＰＣに結合した、もしくは１個のＡＰＣが数個のＴ細胞と相互作用した情況では、特異的ＱＬ９ペプチドにより導き出されたＬd−ＧＦＰクラスターが、Ｔ細胞とＡＰＣの接触部位のそれぞれで形成された。前活性化された２Ｃ Ｔ細胞で類似の結果が得られた（図１Ｂ）。ＱＬ９に誘導されたＬd−ＧＦＰクラスターの形成はショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣに独特でなかった。なぜなら、Ｌd−ＧＦＰでトランスフェクションされたＲＭＡ．Ｓ細胞（１１）（マウスの細胞系）をＡＰＣとして使用した場合に類似のクラスターが生じたからである。興味深いことに、ＱＬ９依存性のＬd−ＧＦＰクラスター形成は、Ｌd−ＧＦＰ単独で（Ｂ７−１もしくはＩＣＡＭ−１を伴わずに）トランスフェクションされたショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣでもまたみられた。従って、Ｔ細胞とＡＰＣの接触部位でのＭＨＣクラスターの形成は、主としてＴＣＲ／ＭＨＣ／ペプチドの相互作用に依存する。
【０００７】
Ｔ細胞／ＡＰＣ複合物の時間経過研究は、界面のＬd−ＧＦＰクラスターが１時間の期間にわたって徐々に大きさを減少させそして最終的にはＡＰＣから消失したことを示した。驚くことに、Ｌd−ＧＦＰクラスターの大きさの減少に付随して、Ｌd−ＧＦＰの小型の断続的（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ）凝集物が、ＡＰＣとの拘束後約１５分ほどで２Ｃ Ｔ細胞と会合したようであった。ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣおよびＱＬ９ペプチドでの休止期２Ｃ Ｔ細胞の拘束の２分以内に（図１Ｃ）、Ｌd−ＧＦＰの大型のクラスターが接触部位に出現した。しかしながら、培養のさらなる２０分後、Ｌd−ＧＦＰの小型の凝集物が２Ｃ Ｔ細胞中で明白であり；培養の３０分後に２Ｃ Ｔ細胞中でより多くのＬd−ＧＦＰ凝集物が出現した（図１Ｃ）。Ｔ細胞中のＬd−ＧＦＰの存在は前活性化された２Ｃ Ｔ細胞を用いてもまた検討した（図１Ｄ、Ｅ）。活性化された２Ｃ Ｔ細胞を、Ｌd−ＧＦＰでトランスフェクションされたショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣ（図１Ｄ）もしくはＲＭＡ．Ｓ細胞（図１Ｅ）のいずれかおよびＱＬ９ペプチドとともに３０分間培養した場合、Ｌd−ＧＦＰの複数の小型の凝集物が、活性化された２Ｃ Ｔ細胞中で観察された。Ｌd−ＧＦＰの凝集物はより低親和性のペプチドｐ２Ｃａ（７）により活性化された２Ｃ Ｔ細胞中でもまた出現し、そして対照Ｐ１ＡペプチドではＬd−ＧＦＰの凝集はＴ細胞中でみられなかった。従って、Ｌd−ＧＦＰの獲得はペプチド特異的であるようである。
【０００８】
Ｔ細胞によるＬd−ＧＦＰのペプチド特異的な獲得をＦＡＣＳ分析によりさらに検討した。図２Ａに示されるとおり、Ｌd−ＧＦＰは、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣおよびＱＬ９ペプチドとともに３０分間培養した後に、大多数の休止期の２Ｃ Ｔ細胞上で検出された。対照的に、Ｌd−ＧＦＰは、対照のＰ１Ａペプチドを負荷されたＡＰＣとともに培養された２Ｃ Ｔ細胞上で観察されなかった（図２Ａ）。速度論の研究は、ＱＬ９ペプチドを用いて、２Ｃ細胞により獲得されたＬd−ＧＦＰの量が３０分で最大であり、そしてその後数時間にわたって徐々に減少したことを示した（図２Ｂ）。１６時間までに、Ｔ細胞中の大部分のＬd−ＧＦＰは消失していた。２Ｃ Ｔ細胞によるＬdの獲得は、Ｌdを発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣとともに培養された２Ｃ Ｔ細胞上でのＬdの発現のＦＡＣＳ分析によってもまた確認された。ペプチドの力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）研究は、Ｔ細胞によるＬd−ＧＦＰの獲得が高濃度のＱＬ９ペプチドを用いて最も顕著であり、そして２Ｃ細胞に対しより低親和性のペプチド、ｐ２Ｃａペプチド（７）でより小さく顕著（だが有意）であったことを示した。ＡＰＣによる補助刺激分子（Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１）の発現は、２Ｃ Ｔ細胞によるＬd−ＧＦＰ分子の獲得を高めなかった。
【０００９】
ＡＰＣおよびＧＦＰ標識されたＭＨＣとのインキュベーション後のＴ細胞の付加的ＦＡＣＳ分析の結果を図５に示す。示されたパーセンテージの抗原特異的Ｔ細胞（２Ｃ）および非抗原特異的Ｔ細胞（Ｂ６）とのＴ細胞の混合物を、ＭＨＣ−ＧＦＰ（Ｌd−ＧＦＰ）を発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣとともに培養した。抗原性ペプチド（ＱＬ９）もしくは対照ペプチド（Ｐ１Ａ）とともに３７℃で１時間培養した後、Ｌd−ＧＦＰ+ Ｔ細胞をＦＡＣＳにより分析した。各サンプル中のＬd−ＧＦＰ+ Ｔ細胞のパーセント（Ｙ軸）を、そのサンプル中の抗原特異的Ｔ細胞（２Ｃ）の示されたパーセント（Ｘ軸）に対してプロットした。該データは、ＡＰＣにより提示されるＧＦＰ標識を、Ｔ細胞の混合物中の抗原特異的Ｔ細胞の量に対する正しい比率で取り込んでいるＴ細胞の分離を明瞭に立証する。
【００１０】
２Ｃ Ｔ細胞によるＡＰＣ由来のＬd分子の取込みは、免疫沈降研究において、Ｔ細胞による35Ｓ標識されたＡＰＣ由来のＭＨＣ Ｉ分子の獲得によりさらに立証された（図２Ｃ）。これらの研究のＡＰＣとして、Ｌdを発現する線維芽細胞（Ｌ細胞）（１２）を使用した。なぜなら、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞と異なり、それらは接着性（ＡＰＣ／Ｔ細胞混合物からのＴ細胞の純粋な一集団の単離で大きく補助する特性）であるからである。２Ｃ細胞を、ＬdでトランスフェクションされたＬ細胞（Ｌ−Ｌd）およびＱＬ９ペプチドとともに培養した後、Ｌdを２Ｃ細胞から免疫沈降させることができ、培養の４時間でピークに達した。２Ｃ細胞から沈降されたＬdの量は、培養物中の２Ｃ Ｔ細胞の数と緊密に相互に関連した（図２Ｃ）。しかしながら、対照ペプチド（Ｐ１Ａ）の存在下では、Ｌdの沈降は非常に制限された。Ｌ細胞上で発現される他のクラスＩ分子（ＤkおよびＫk）は、免疫沈降により２Ｃ Ｔ細胞中で検出可能でなかった（図２Ｃ）。重要なことに、Ｔ細胞によるＬd分子のペプチド依存性の獲得は、抗ＴＣＲもしくは抗ＬdいずれかのｍＡｂを培養物に添加することにより封鎖することができ、Ｔ細胞によるＬdの獲得がＴＣＲとＭＨＣ／ペプチドとの間の特異的相互作用を必要とすることを示した（図２Ｄ）。
【００１１】
Ｔ細胞によるＬd分子の迅速な獲得が２Ｃ ＴＣＲの同等に迅速なダウンレギュレーションと相互に関連したことは注目に値する（図２Ｂ）。ＴＣＲのダウンレギュレーションはＴ細胞によるインターナリゼーションを反映する（１３）ため、Ｌd分子もまたインターナリゼーションされる（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）かもしれない。この疑問を取り扱うため、液体に可溶性の蛍光色素（ＤｉＩ）（モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））（１４）を使用して、活性化された２Ｃ細胞の膜を標識した。図３Ａに示されるとおり、Ｌd−ＧＦＰを発現するＡＰＣおよびＱＬ９ペプチドとともにＴ細胞を３０分間培養した後、実質的な数の小型のＬd−ＧＦＰ凝集物が、活性化されたＴ細胞中で検出された。Ｌd−ＧＦＰ凝集物のいくらかはＴ細胞の明瞭に内側にあった一方、他者はＴ細胞とＡＰＣの接触部位に留まった（図３Ａ）。ＤｉＩ標識された２Ｃ Ｔ細胞のＡＰＣとともに２時間のさらなる培養は、２Ｃ Ｔ細胞の内側のＬd−ＧＦＰの夥しい凝集物をもたらし、そしてこれらの凝集物はＤｉＩ標識された膜小胞と共に配置された（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）（図３Ｂ）。
【００１２】
２Ｃ Ｔ細胞中のＬd−ＧＦＰの細胞内局在化を、トランスフェリン受容体に特異的なモノクローナル抗体での２Ｃ Ｔ細胞の表面染色によりさらに確認した（図３Ｃ）。ＱＬ９ペプチドの存在下で、Ｌd−ＧＦＰを発現するＡＰＣとともに活性化された２Ｃ Ｔ細胞を１時間培養した場合に、Ｌd−ＧＦＰ凝集物がＴ細胞の内側で検出され、そして核周囲の分布を示した（図３Ｃ）。対照的に、Ｐ１Ａペプチドを使用した場合には、Ｌd−ＧＦＰ凝集物が２Ｃ Ｔ細胞中で観察されなかった（図３Ｃ）。
【００１３】
ＡＰＣからＴ細胞により獲得されたＬd分子がインターナリゼーションされる可能性があるという上の観察結果は、この過程がどのように起こるかという疑問を提起する。可溶性のリガンドはクラスリン被覆小孔を介するエンドサイトーシスによりインターナリゼーションされることが知られている（１５）。Ｔ細胞によるＬd−ＧＦＰのインターナリゼーションはＴＣＲおよびＭＨＣ／ペプチドの相互作用に依存性であり、かつ、Ｌd−ＧＦＰがＴＣＲと共に局在化した（図３Ｄ）ため、ＡＰＣからのＭＨＣ分子がＴＣＲに媒介されるエンドサイトーシスによりインターナリゼーションされることが可能である。
【００１４】
トランスフェリンは受容体に媒介されるエンドサイトーシスによって細胞によりインターナリゼーションされる（１３）ため、われわれは、２Ｃ Ｔ細胞中でのＬd−ＧＦＰの細胞内の運命の跡を辿るためのマーカーとして、テキサスレッドに結合されたトランスフェリンを使用した。図４Ａに示されるとおり、トランスフェリンはＴ細胞によりインターナリゼーションされ、そして複数の膜小胞と会合した。Ｔ細胞によりインターナリゼーションされたＬd−ＧＦＰ凝集物は、類似のパターンの細胞内分布を表した（図４Ａ）。トランスフェリンおよびＬd−ＧＦＰの上置き像（ｏｖｅｒｌａｙ ｉｍａｇｅ）は、Ｔ細胞によりインターナリゼーションされたＬd−ＧＦＰ凝集物が、トランスフェリンを含有する小胞と共に局在化したことを示した（図４Ａ）。これらのデータは、ＴＣＲとの相互作用後にＡＰＣ由来のＭＨＣ分子がエンドサイトーシスによってＴ細胞によりインターナリゼーションされることを強く示唆する。
【００１５】
細胞の低ｐＨ区画に特異的に蓄積する赤色蛍光色素、リソトラッカー（ｌｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）（１６）をリソゾームのマーカーとして使用して、Ｌd−ＧＦＰの細胞内の運命を追跡した。図４Ａに示されるとおり、２Ｃ Ｔ細胞をＡＰＣとともに１時間培養した後、Ｌd−ＧＦＰが、リソトラッカー（ｌｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）色素により示されるとおりＴ細胞の酸性区画中に出現した。リソゾーム中のＬdの存在は、ＬＡＭＰ−１（リソゾームに会合される膜分子）に特異的なｍＡｂでの固定された２Ｃ Ｔ細胞の免疫染色によりさらに確認された。
【００１６】
リソトラッカー（ｌｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）およびＬＡＭＰ−１でのＬd−ＧＦＰの共局在化は、２Ｃ Ｔ細胞によりエンドサイトーシスされたＬd−ＧＦＰがリソゾームの分解にさらされたことを示唆する。この可能性を検査するため、２Ｃ細胞を、リソゾーム阻害剤（ＮＨ4Ｃｌ、クロロキンおよびＥ６４）の存在もしくは非存在下で、Ｌd−ＧＦＰのショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣおよびＱＬ９ペプチドとともに６時間まで培養し、そしてその後Ｌd−ＧＦＰの総量についてＦＡＣＳにより分析した。図４Ｂに示されるとおり、２Ｃ細胞におけるＬd−ＧＦＰの消失は、リソゾーム阻害剤の添加により明瞭に阻害された。
【００１７】
類似の知見がＬdの免疫沈降でみられた（図４Ｃ）。示される実験において、２Ｃ細胞を最初に４時間、35Ｓ標識されたＬdでトランスフェクションされたＬ細胞およびＱＬ９ペプチドとともに培養し；Ｌdのさらなる取込みを予防するため、その後、２Ｃ細胞をＡＰＣと分離し、そしてリソゾーム阻害剤（ＮＨ4ＣｌおよびＥ６４）の存在もしくは非存在下で２〜４時間培養した。これらのＡＰＣを含まない条件下で、２Ｃ細胞中のＬd分子は、阻害剤とともに培養された細胞についてよりも、培地単独中で培養された細胞について、より迅速に消失した。
【００１８】
いくつかの研究が、Ｔ細胞とＡＰＣの相互作用が、ＡＰＣからの多数の分子をＴ細胞の表面に接着させることができることを示している（２，３）。本開示は、ＣＤ８+ ２Ｃ細胞について、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩ分子（Ｌd）が、Ｔ細胞とＡＰＣの相互作用の部位で超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）を形成した後にＴ細胞により獲得されることを立証し（３）；ＳＭＡＣ中でのＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子の出現はペプチド依存性でありかつ迅速に発生する。加えて、われわれは、ＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子が、ＴＣＲへの結合後にＴ細胞によりエンドサイトーシスされ、そしてその後リソゾーム経路によって分解されることを示す。興味深いことに、Ｔ細胞はＡＰＣからのＢ７分子もまたインターナリゼーションすることができる（３）。Ｂ７がインターナリゼーション後に分解されるかどうかは不明である。
【００１９】
Ｔ細胞およびＡＰＣの抗原特異的相互作用は、抗原用量および時間依存性の様式で、リソゾーム中でＴＣＲのインターナリゼーションおよび分解を誘導する（１７）。ここで、われわれは、ＡＰＣ由来のＭＨＣ Ｉ分子のインターナリゼーションおよび分解の要件および速度論が、ＴＣＲのインターナリゼーションおよび分解のものに類似であること、ならびにＡＰＣ由来のＭＨＣがＴ細胞中でＴＣＲと共局在化することを立証した。これらの知見は、ＭＨＣ Ｉ分子およびＴＣＲがＴ細胞によって一緒にインターナリゼーションかつ分解されることを強く示唆する。Ｔ細胞活性化の連続的誘発モデルによれば、ＴＣＲとのＭＨＣ／ペプチドの一過性の会合が複数のＴＣＲの連続的な誘発（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）に必要とされる（１，４）。しかしながら、ＴＣＲとの特異的相互作用の後にＭＨＣ分子が安定なクラスターを形成し、そしてその後ＴＣＲとともにインターナリゼーションされるというわれわれの知見は、ＴＣＲ／ＭＨＣ／ペプチドの相互作用が一過性でないことを示唆する。これは、Ｔ細胞の活性化におけるＭＨＣおよびＴＣＲの共インターナリゼーションの役割に関する疑問を提起する。
【００２０】
成長因子およびホルモンのような可溶性リガンドの場合には、インターナリゼーションがシグナル伝達に関与していることが既知である（１８）。これゆえに、Ｔ細胞によるＭＨＣ分子のインターナリゼーションは、ＴＣＲに媒介される細胞内シグナル伝達に寄与しているかもしれず（１９）、また、Ｔ細胞中でのＴＣＲおよびＭＨＣの共局在化が持続性のＴＣＲのシグナル伝達に必要とされるのかもしれない（２０）。隣接するＴ細胞上の特定の受容体を介する７膜貫通リガンド（ｂｏｓｓ）のインターナリゼーションが昆虫の目の発生に重要である（２１）という知見により、類似の、しかし関係のない観察結果が提供される。
【００２１】
代替の１つの可能性は、Ｔ細胞とＡＰＣの相互作用の間のＭＨＣ分子のインターナリゼーションが、応答性のＴ細胞をＡＰＣからの過剰の刺激から保護するための装置であるということである。ここで、Ｔ細胞へのＭＨＣクラスＩ分子の結合がＴＣＲのダウンレギュレーションと緊密に相互に関連することは注目に値する。すなわち、双方の過程は類似の速度論を有し、共刺激分子に非依存性であり、そして低濃度のＭＨＣに結合されるペプチドではずっとより少なく顕著である。これゆえに、高濃度のペプチドを発現するＡＰＣとのＴ細胞の相互作用に関して、ＴＣＲ／ＭＨＣ／ペプチド複合体の迅速なインターナリゼーションが、ＴＣＲのシグナル伝達の強度を低下させそして従って耐性誘導の危険を小さくするよう作用しているのかもしれない。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 発明にかかる、ＭＨＣクラスＩ分子はＴ細胞とＡＰＣの接触部位でクラスターを形成する。休止期の（Ａ）もしくは活性化された（Ｂ）ＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞を、室温で、Ｌd−ＧＦＰ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１を発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣならびに１０？ＭのＱＬ９もしくはＰ１Ａペプチドとともに培養した。共焦点顕微鏡系（フルオビュー（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ）、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ））を使用し、ΔＴＣ３培養皿（バイオプテクス（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ））中のＡＰＣにＴ細胞を添加した直後に、ＧＦＰの蛍光を分析した。左図：Ｌd−ＧＦＰ蛍光。中央図：Ｔ細胞／ＡＰＣ対のＤＩＣ（微分干渉対比）像。右図：Ｌd−ＧＦＰ蛍光およびＤＩＣ像の上置き。（Ｃ）ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣ（＋ＱＬ９）からＬd−ＧＦＰを獲得する休止期のＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞。Ｔ細胞／ＡＰＣ対中のＬd−ＧＦＰ蛍光後の時間経過画像形成を３０秒ごとに実施した。それぞれ５、２０および３０分で採られたＬd−ＧＦＰ蛍光像を左図に示し、また、Ｌd−ＧＦＰ／ＤＩＣの上置き像を右図に示す。（Ｄ）ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣからＬd−ＧＦＰを獲得する活性化されたＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞。活性化されたＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞を、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣ（＋ＱＬ９）とのインキュベーション前に５μＭのＤｉＩ（赤色）（モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））で前染色した。代表的なＴ細胞／ＡＣＰ対の像を示す。（Ｅ）活性化されたＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞によるＲＭＡ．Ｓ細胞（＋ＱＬ９）からのＬd−ＧＦＰの獲得。
【図２】 発明にかかる、ＣＤ８+２Ｃ Ｔ細胞によるＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子のＴＣＲに媒介される獲得。休止期の２Ｃ Ｔ細胞を、３７℃で、示された時間の間、ＱＬ９もしくはＰ１Ａペプチドを負荷された、Ｌd−ＧＦＰ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１を発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞とともに培養した。Ｌd−ＧＦＰの総量およびＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞上のＴＣＲの表面レベルをＦＡＣＳにより分析した。（Ａ）培養の０および３０分での２Ｃ Ｔ細胞上でのＬd−ＧＦＰおよびＴＣＲの発現。（Ｂ）２Ｃ Ｔ細胞上でのＬd−ＧＦＰおよびＴＣＲ発現の速度論。２Ｃ Ｔ細胞上でのＬd−ＧＦＰおよびＴＣＲの発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳを用いて、示された時点で分析した。（Ｃ）２Ｃ Ｔ細胞からのＡＰＣ由来のＬdクラスＩ分子の免疫沈降。力価測定された数の２Ｃ細胞（レーン１：Ｔ細胞なし、レーン２：２×１０7個およびレーン３：４×１０7個）を、Ｌdを発現する３×１０6個の35Ｓ−メチオニン標識されたＬ細胞（１２）とともに培養した。４時間の培養後にＬ細胞（Ｌ−Ｌd）から２Ｃ Ｔ細胞を精製し、そして精製された２Ｃ細胞の細胞ライセートをそれぞれ抗Ｈ−２K ｍＡｂもしくは抗Ｌd ｍＡｂ（２８−１４−８）（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））を用いて免疫沈降させた。（Ｄ）Ｔ細胞によるＬd分子の獲得はＴＣＲ／ＭＨＣ／ペプチドの相互作用に依存する。２Ｃ Ｔ細胞を、示されたようなｍＡｂの存在もしくは非存在下で４時間、Ｌ−Ｌd細胞およびＱＬ９ペプチドとともに培養した。抗ＴＣＲ ｍＡｂ、１Ｂ２（２Ｃ ＴＣＲの双方の鎖を認識する）を使用し、そして上述されたとおりＬdの免疫沈降を実施した。
【図３】 発明にかかる、Ｔ細胞によるＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子のインターナリゼーション。（Ａ）ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣと相互作用する活性化された２Ｃ Ｔ細胞のＺ軸に沿った連続共焦点像。ＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞を５？ＭのＤｉＩ（赤色）で標識し、そしてＬd−ＧＦＰ（緑色）を発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣおよびＱＬ９ペプチドとともに３０分間培養した。（Ｂ）ＤｉＩ標識された膜小胞とのＬd−ＧＦＰの共局在化。２Ｃ Ｔ細胞を、Ｌd−ＧＦＰを発現するＱＬ９を負荷されたＲＭＡ．Ｓ細胞とともに３７℃で２時間インキュベートした。（Ｃ）２Ｃ Ｔ細胞により獲得されたＬd−ＧＦＰは細胞質中にある。活性化されたＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞をリソゾームプロテアーゼ阻害剤（１００？Ｍクロロキンおよび５０？Ｍ Ｅ６４）で前処理し、そしてＬd−ＧＦＰおよび示されたペプチドを発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＰＡＣとともに１時間培養した。その後、それらをトランスフェリン受容体に特異的なビオチニル化抗体、次いでストレプアビジン（Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−Ｃｙｔ３（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））で染色した。（Ｄ）２Ｃ Ｔ細胞におけるＴＣＲおよびＬd−ＧＦＰの細胞内共局在化。２Ｃ細胞を、Ｌd−ＧＦＰを発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣおよびＱＬ９もしくはＰ１Ａペプチドとともに１時間培養した後、ＴＣＲに対するビオチニル化ｍＡｂ（抗ＣＤ３？、抗ＴＣＲ？、およびクローン型ｍＡｂ、１Ｂ２）のカクテルで、そしてその後ストレプアビジン−テキサスレッドで細胞内染色した。
【図４】 発明にかかる、Ｔ細胞によるＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子のエンドサイトーシスおよび分解。（Ａ）２Ｃ Ｔ細胞中での、トランスフェリン（ｔｆとして標識を付けられる）およびリソトラッカー（ｌｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）（ｌｙとして標識を付けられる）とのＬd−ＧＦＰの共局在化。左図の像：活性化されたＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞に、テキサスレッド結合トランスフェリン（５？ｇ／ｍｌ）を負荷し、そしてＱＬ９ペプチドを負荷されたショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣ（Ｌd−ＧＦＰ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。右図の像：活性化されたＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞を、Ｌd−ＧＦＰを発現するＱＬ９を負荷されたＲＭＡ．Ｓ細胞とともにインキュベートし、５ｎＭのリソトラッカーレッド（ｌｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ）ＤＮＤ−９９（モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））で染色した。（Ｂ）リソソーム阻害剤による２Ｃ細胞上でのＬd−ＧＦＰの阻害。休止期のＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞を、リソソーム阻害剤のカクテル（２５ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭクロロキンおよび１０μＭ Ｅ６４）の存在もしくは非存在下に、Ｌd−ＧＦＰを発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣおよびＱＬ９ペプチドとともに培養した。示された時間の間の培養の後、ＣＤ８+ ２Ｃ細胞上のＬd−ＧＦＰ蛍光強度をＦＡＣＳにより分析した。（Ｃ）２Ｃ Ｔ細胞中でのＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子の分解。２Ｃ Ｔ細胞を、ＮＨ4ＣｌおよびＥ６４の存在もしくは非存在下に、示された時間の間、35Ｓ−メチオニン標識されたＬdでトランスフェクションされたＬ細胞とともに培養した。Ｌdの免疫沈降を図２で記述されたとおり実施した。残存するＬdの量をデンシトメトリーにより定量した。
【図５】 発明にかかる、非特異的Ｔ細胞と混合された多様な比の２Ｃ Ｔ細胞を使用する、抗原ＱＬ９を負荷された、ＧＦＰ標識されたＭＨＣクラスＩ分子を特異的に取り込んだＣＤ８＋ ２Ｃ Ｔ細胞のＦＡＣＳによる分離を示す。
（発明の背景）
Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でのＴＣＲ複合体とＭＨＣ／ペプチド複合体との間の分子相互作用を必要とする。これらのリガンドとの接触はＴＣＲのダウンレギュレーションが後に続き（１）、そしてＴ細胞とＡＰＣの相互作用はＡＰＣ由来のＭＨＣ分子をＴ細胞の表面に接着させることができる（２，３）ことが既知であるが、ＡＰＣ上のＭＨＣ／ペプチド複合体の運命は不明である。ＭＨＣ分子の再利用が単一のＭＨＣ／ペプチド複合体に数百までのＴＣＲ分子を誘発させると仮定されている（４）。こうした情況下では、ＭＨＣ／ペプチドおよびＴＣＲの一過性の会合が存在し、そしてＡＰＣ上のＭＨＣの運命はＴＣＲの拘束（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）により決定されないと推定されている。しかしながら、Ｔ細胞／ＡＰＣ界面での安定な超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）の形成（５）はこれらの複合体がどのように解離されるかという疑問を提起する。
【０００２】
（発明の要約）
抗原特異的Ｔ細胞によるＭＨＣクラスＩ／抗原複合体のインターナリゼーションが、Ｔ細胞の不均質な集団からの抗原特異的Ｔ細胞の濃縮方法を提供するために、本発明で利用されている。本発明の方法は、個々の抗原特異的Ｔ細胞を精製する、もしくは多数の抗原に特異的なＴ細胞の混合物から、１つの特定の抗原に特異的なＴ細胞のより均一な収集物を得るための手段を提供する。加えて、本発明の方法は、多数の抗原に特異的なＴ細胞の混合した集団中に存在する１つの特定の抗原に特異的なＴ細胞の存在を検出しかつそれを定量するための手段を提供する。
【０００３】
（発明の詳細な記述）
Ｔ細胞の応答は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でのＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体との接触を介して開始される。しかしながら、これらの複合体の運命は未知である。ここで、緑色蛍光タンパク質と融合されたＭＨＣクラスＩ分子を発現する生存ＡＰＣを使用して、われわれは、ペプチド特異的なＴ細胞とＡＰＣの相互作用が、ＭＨＣクラスＩ分子のクラスターが接触部位で数分以内に集合することを誘導することを示し；その後、これらのＭＨＣクラスＩのクラスターは小さな凝集物でＴ細胞により獲得される。われわれは、Ｔ細胞によるＭＨＣクラスＩの獲得がＴＣＲのダウンレギュレーションと相互に関連し、そしてＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子がＴ細胞によりエンドサイトーシスされかつ分解されることをさらに立証する。これらのデータは、それによりＭＨＣ／ペプチド複合体のＴＣＲ認識がＴ細胞によるＭＨＣ分子のインターナリゼーションにより省略される可能性がある、新規の機構もまた示す。
【０００４】
Ｔ細胞の拘束後のＡＰＣ上でのＭＨＣ／ペプチド複合体の運命を検討するため、われわれは、ＭＨＣクラスＩのＬd−緑色蛍光タンパク質融合分子（Ｌd−ＧＦＰ）を発現する安定な哺乳動物およびショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞系を生じさせた。Ｌd−ＧＦＰを含有するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の発現ベクター（ＪＨ１０２）は、以下のように構築した。すなわち、ＰＣＲ突然変異誘発により、ベクターＭＪ２６２（２２）中のＬdの終止コドンのそれぞれ前および後にＸｈｏ ＩおよびＳａｌ Ｉクローニング部位を生じさせた。その後、ＥＧＦＰのＤＮＡフラグメント（Ｘｈｏ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ）をベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ３（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））から単離し、そして突然変異されたＭＪ２６２ベクター中のＬdの３’端にサブクローニングした。新たな構築物（ＪＨ１０２）の配列をＤＮＡ配列決定により確かめた。それは、ＬdおよびＥＧＦＰの完全長の配列を含有する。Ｌdの配列とＥＧＦＰの配列の間に、ベクターのマルチクローニング部位由来であった２２アミノ酸をコードするリンカー配列を生じさせた。Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１分子を伴いもしくは伴わずにＬd−ＧＦＰを発現する安定なショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞系は、既に記述されたとおり（９）生じさせた。Ｌd−ＧＦＰ哺乳動物細胞発現ベクターの構築は以下のとおりであった。Ｌdを含有するＢａｍ ＨＩ ＤＮＡフラグメントをベクターＪＨ１０２から単離し、そしてベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ３（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））にサブクローニングした。生じるプラスミド（ＪＨ１０３）を電気穿孔法によりＲＭＡ．Ｓ細胞中にトランスフェクションし、そしてＬd−ＧＦＰを発現する安定な細胞系をＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）を用いる選択により生じさせた。抗原が会合されたＭＨＣクラスＩ分子の産生のためのいかなる手段も本発明での使用に適することが、当業者に容易に明らかである。当該技術分野で既知の方法の例は、限定されるものでないが米国特許第５，５９５，８８１号、米国特許第５，８２７，７３７号および米国特許第５，７３１，１６０号明細書に記述されるものを挙げることができる。緑色蛍光タンパク質以外の多様な検出可能なマーカーをＭＨＣクラスＩ分子に融合することができ、そして本発明の方法での使用に適し、また、多様な手段によりＭＨＣクラスＩ分子に連結することができることもまた当業者に容易に明らかである。本発明の方法で使用することができる検出可能なマーカーの例は、限定されるものでないが、ＭＨＣクラスＩタンパク質に取り込まれたもしくはこれに結合された放射性同位元素、あるいは例えば組換え融合タンパク質を創製することにより、化合物もしくはタンパク質を翻訳後に化学的に連結することにより、あるいは抗原−抗体またはストレプトアビジン−ビオチンもしくはアビジン−ビオチン結合対のようないずれかの結合対パートナーを利用して検出可能なマーカーをタンパク質に連結することによりＭＨＣクラスＩタンパク質に連結することができるいずれかの比色的もしくは蛍光の化合物もしくはタンパク質を挙げることができる。
【０００５】
Ｌd−ＧＦＰを発現する細胞系を、２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックマウス系からのＣＤ８+ Ｔ細胞（Ｔ細胞抗原ＱＬ９を特異的に認識する（８））（２Ｃ Ｔ細胞）に特異的なＱＬ９ペプチド（７）を提示するための抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。Ｌdを発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞について既に報告されたとおり（９）、Ｌd−ＧＦＰおよび２種の補助刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）分子、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１を発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は、ペプチド特異的なＴＣＲのダウンレギュレーションおよび２Ｃ細胞の強い増殖応答を誘導し、Ｌd−ＧＦＰ分子が機能的であることを示した。別の方法で述べられない限り、Ｌd−ＧＦＰ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１でコトランスフェクションされたショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞（Ｌd−ＧＦＰ．Ｂ７．ＩＣＡＭ）をＡＰＣとして使用した。Ｌdに強く結合するがしかし２Ｃ ＴＣＲにより認識されない（９）Ｐ１Ａペプチド（１０）を特異性対照として使用した。Ｔ細胞への抗原の提示のためのいかなる手段も本発明の方法での使用に適することが、当業者に容易に明らかである。限定されるものではないが米国特許第５，５９５，８８１号、米国特許第５，８２７，７３７号および米国特許第５，７３１，１６０号明細書に記述されるものを挙げることができる、多様な抗原提示系が既知である。ａｎｔ Ｔ細胞抗原が本発明の方法で有用であることもまた当業者に容易に明らかである。ＭＨＣクラスＩタンパク質と会合することができかつＴ細胞に提示することができるいかなるＴ細胞抗原も、本発明での使用に適する。こうした抗原のいかなる供給源も、抗原が化学的に合成されるにしろ天然の供給源に由来するにしろ、本発明での使用に適する。抗原はいずれの供給源由来であることもでき、そしていずれかの特定の型に限定されないが、但し、抗原がＭＨＣクラスＩタンパク質と会合しかつ抗原をＴ細胞に提示することができる。
【０００６】
休止期の（ｒｅｓｔｉｎｇ）ＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞を精製し、そして多様な期間の間、ＱＬ９ペプチドを負荷されたショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣとともに培養し；その後、共焦点顕微鏡（フルオビュー（ＦｌｕｏＶｉｅｗ）、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ））を用いて、Ｔ細胞およびＡＰＣの動的相互作用を検討した。ＡＰＣとの２Ｃ Ｔ細胞の相互作用の数分以内に、Ｌd−ＧＦＰ分子はＴ細胞の接触の部位で大型のクラスターを形成した（図１Ａ）。対照的に、対照のＰ１Ａペプチドの添加では、Ｌd−ＧＦＰは、Ｔ細胞との接触後、ＡＰＣ上に均一に分布されたままであった（図１Ａ）。単一のＴ細胞が１個以上のＡＰＣに結合した、もしくは１個のＡＰＣが数個のＴ細胞と相互作用した情況では、特異的ＱＬ９ペプチドにより導き出されたＬd−ＧＦＰクラスターが、Ｔ細胞とＡＰＣの接触部位のそれぞれで形成された。前活性化された２Ｃ Ｔ細胞で類似の結果が得られた（図１Ｂ）。ＱＬ９に誘導されたＬd−ＧＦＰクラスターの形成はショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣに独特でなかった。なぜなら、Ｌd−ＧＦＰでトランスフェクションされたＲＭＡ．Ｓ細胞（１１）（マウスの細胞系）をＡＰＣとして使用した場合に類似のクラスターが生じたからである。興味深いことに、ＱＬ９依存性のＬd−ＧＦＰクラスター形成は、Ｌd−ＧＦＰ単独で（Ｂ７−１もしくはＩＣＡＭ−１を伴わずに）トランスフェクションされたショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣでもまたみられた。従って、Ｔ細胞とＡＰＣの接触部位でのＭＨＣクラスターの形成は、主としてＴＣＲ／ＭＨＣ／ペプチドの相互作用に依存する。
【０００７】
Ｔ細胞／ＡＰＣ複合物の時間経過研究は、界面のＬd−ＧＦＰクラスターが１時間の期間にわたって徐々に大きさを減少させそして最終的にはＡＰＣから消失したことを示した。驚くことに、Ｌd−ＧＦＰクラスターの大きさの減少に付随して、Ｌd−ＧＦＰの小型の断続的（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ）凝集物が、ＡＰＣとの拘束後約１５分ほどで２Ｃ Ｔ細胞と会合したようであった。ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣおよびＱＬ９ペプチドでの休止期２Ｃ Ｔ細胞の拘束の２分以内に（図１Ｃ）、Ｌd−ＧＦＰの大型のクラスターが接触部位に出現した。しかしながら、培養のさらなる２０分後、Ｌd−ＧＦＰの小型の凝集物が２Ｃ Ｔ細胞中で明白であり；培養の３０分後に２Ｃ Ｔ細胞中でより多くのＬd−ＧＦＰ凝集物が出現した（図１Ｃ）。Ｔ細胞中のＬd−ＧＦＰの存在は前活性化された２Ｃ Ｔ細胞を用いてもまた検討した（図１Ｄ、Ｅ）。活性化された２Ｃ Ｔ細胞を、Ｌd−ＧＦＰでトランスフェクションされたショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣ（図１Ｄ）もしくはＲＭＡ．Ｓ細胞（図１Ｅ）のいずれかおよびＱＬ９ペプチドとともに３０分間培養した場合、Ｌd−ＧＦＰの複数の小型の凝集物が、活性化された２Ｃ Ｔ細胞中で観察された。Ｌd−ＧＦＰの凝集物はより低親和性のペプチドｐ２Ｃａ（７）により活性化された２Ｃ Ｔ細胞中でもまた出現し、そして対照Ｐ１ＡペプチドではＬd−ＧＦＰの凝集はＴ細胞中でみられなかった。従って、Ｌd−ＧＦＰの獲得はペプチド特異的であるようである。
【０００８】
Ｔ細胞によるＬd−ＧＦＰのペプチド特異的な獲得をＦＡＣＳ分析によりさらに検討した。図２Ａに示されるとおり、Ｌd−ＧＦＰは、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣおよびＱＬ９ペプチドとともに３０分間培養した後に、大多数の休止期の２Ｃ Ｔ細胞上で検出された。対照的に、Ｌd−ＧＦＰは、対照のＰ１Ａペプチドを負荷されたＡＰＣとともに培養された２Ｃ Ｔ細胞上で観察されなかった（図２Ａ）。速度論の研究は、ＱＬ９ペプチドを用いて、２Ｃ細胞により獲得されたＬd−ＧＦＰの量が３０分で最大であり、そしてその後数時間にわたって徐々に減少したことを示した（図２Ｂ）。１６時間までに、Ｔ細胞中の大部分のＬd−ＧＦＰは消失していた。２Ｃ Ｔ細胞によるＬdの獲得は、Ｌdを発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣとともに培養された２Ｃ Ｔ細胞上でのＬdの発現のＦＡＣＳ分析によってもまた確認された。ペプチドの力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）研究は、Ｔ細胞によるＬd−ＧＦＰの獲得が高濃度のＱＬ９ペプチドを用いて最も顕著であり、そして２Ｃ細胞に対しより低親和性のペプチド、ｐ２Ｃａペプチド（７）でより小さく顕著（だが有意）であったことを示した。ＡＰＣによる補助刺激分子（Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１）の発現は、２Ｃ Ｔ細胞によるＬd−ＧＦＰ分子の獲得を高めなかった。
【０００９】
ＡＰＣおよびＧＦＰ標識されたＭＨＣとのインキュベーション後のＴ細胞の付加的ＦＡＣＳ分析の結果を図５に示す。示されたパーセンテージの抗原特異的Ｔ細胞（２Ｃ）および非抗原特異的Ｔ細胞（Ｂ６）とのＴ細胞の混合物を、ＭＨＣ−ＧＦＰ（Ｌd−ＧＦＰ）を発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣとともに培養した。抗原性ペプチド（ＱＬ９）もしくは対照ペプチド（Ｐ１Ａ）とともに３７℃で１時間培養した後、Ｌd−ＧＦＰ+ Ｔ細胞をＦＡＣＳにより分析した。各サンプル中のＬd−ＧＦＰ+ Ｔ細胞のパーセント（Ｙ軸）を、そのサンプル中の抗原特異的Ｔ細胞（２Ｃ）の示されたパーセント（Ｘ軸）に対してプロットした。該データは、ＡＰＣにより提示されるＧＦＰ標識を、Ｔ細胞の混合物中の抗原特異的Ｔ細胞の量に対する正しい比率で取り込んでいるＴ細胞の分離を明瞭に立証する。
【００１０】
２Ｃ Ｔ細胞によるＡＰＣ由来のＬd分子の取込みは、免疫沈降研究において、Ｔ細胞による35Ｓ標識されたＡＰＣ由来のＭＨＣ Ｉ分子の獲得によりさらに立証された（図２Ｃ）。これらの研究のＡＰＣとして、Ｌdを発現する線維芽細胞（Ｌ細胞）（１２）を使用した。なぜなら、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞と異なり、それらは接着性（ＡＰＣ／Ｔ細胞混合物からのＴ細胞の純粋な一集団の単離で大きく補助する特性）であるからである。２Ｃ細胞を、ＬdでトランスフェクションされたＬ細胞（Ｌ−Ｌd）およびＱＬ９ペプチドとともに培養した後、Ｌdを２Ｃ細胞から免疫沈降させることができ、培養の４時間でピークに達した。２Ｃ細胞から沈降されたＬdの量は、培養物中の２Ｃ Ｔ細胞の数と緊密に相互に関連した（図２Ｃ）。しかしながら、対照ペプチド（Ｐ１Ａ）の存在下では、Ｌdの沈降は非常に制限された。Ｌ細胞上で発現される他のクラスＩ分子（ＤkおよびＫk）は、免疫沈降により２Ｃ Ｔ細胞中で検出可能でなかった（図２Ｃ）。重要なことに、Ｔ細胞によるＬd分子のペプチド依存性の獲得は、抗ＴＣＲもしくは抗ＬdいずれかのｍＡｂを培養物に添加することにより封鎖することができ、Ｔ細胞によるＬdの獲得がＴＣＲとＭＨＣ／ペプチドとの間の特異的相互作用を必要とすることを示した（図２Ｄ）。
【００１１】
Ｔ細胞によるＬd分子の迅速な獲得が２Ｃ ＴＣＲの同等に迅速なダウンレギュレーションと相互に関連したことは注目に値する（図２Ｂ）。ＴＣＲのダウンレギュレーションはＴ細胞によるインターナリゼーションを反映する（１３）ため、Ｌd分子もまたインターナリゼーションされる（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）かもしれない。この疑問を取り扱うため、液体に可溶性の蛍光色素（ＤｉＩ）（モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））（１４）を使用して、活性化された２Ｃ細胞の膜を標識した。図３Ａに示されるとおり、Ｌd−ＧＦＰを発現するＡＰＣおよびＱＬ９ペプチドとともにＴ細胞を３０分間培養した後、実質的な数の小型のＬd−ＧＦＰ凝集物が、活性化されたＴ細胞中で検出された。Ｌd−ＧＦＰ凝集物のいくらかはＴ細胞の明瞭に内側にあった一方、他者はＴ細胞とＡＰＣの接触部位に留まった（図３Ａ）。ＤｉＩ標識された２Ｃ Ｔ細胞のＡＰＣとともに２時間のさらなる培養は、２Ｃ Ｔ細胞の内側のＬd−ＧＦＰの夥しい凝集物をもたらし、そしてこれらの凝集物はＤｉＩ標識された膜小胞と共に配置された（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）（図３Ｂ）。
【００１２】
２Ｃ Ｔ細胞中のＬd−ＧＦＰの細胞内局在化を、トランスフェリン受容体に特異的なモノクローナル抗体での２Ｃ Ｔ細胞の表面染色によりさらに確認した（図３Ｃ）。ＱＬ９ペプチドの存在下で、Ｌd−ＧＦＰを発現するＡＰＣとともに活性化された２Ｃ Ｔ細胞を１時間培養した場合に、Ｌd−ＧＦＰ凝集物がＴ細胞の内側で検出され、そして核周囲の分布を示した（図３Ｃ）。対照的に、Ｐ１Ａペプチドを使用した場合には、Ｌd−ＧＦＰ凝集物が２Ｃ Ｔ細胞中で観察されなかった（図３Ｃ）。
【００１３】
ＡＰＣからＴ細胞により獲得されたＬd分子がインターナリゼーションされる可能性があるという上の観察結果は、この過程がどのように起こるかという疑問を提起する。可溶性のリガンドはクラスリン被覆小孔を介するエンドサイトーシスによりインターナリゼーションされることが知られている（１５）。Ｔ細胞によるＬd−ＧＦＰのインターナリゼーションはＴＣＲおよびＭＨＣ／ペプチドの相互作用に依存性であり、かつ、Ｌd−ＧＦＰがＴＣＲと共に局在化した（図３Ｄ）ため、ＡＰＣからのＭＨＣ分子がＴＣＲに媒介されるエンドサイトーシスによりインターナリゼーションされることが可能である。
【００１４】
トランスフェリンは受容体に媒介されるエンドサイトーシスによって細胞によりインターナリゼーションされる（１３）ため、われわれは、２Ｃ Ｔ細胞中でのＬd−ＧＦＰの細胞内の運命の跡を辿るためのマーカーとして、テキサスレッドに結合されたトランスフェリンを使用した。図４Ａに示されるとおり、トランスフェリンはＴ細胞によりインターナリゼーションされ、そして複数の膜小胞と会合した。Ｔ細胞によりインターナリゼーションされたＬd−ＧＦＰ凝集物は、類似のパターンの細胞内分布を表した（図４Ａ）。トランスフェリンおよびＬd−ＧＦＰの上置き像（ｏｖｅｒｌａｙ ｉｍａｇｅ）は、Ｔ細胞によりインターナリゼーションされたＬd−ＧＦＰ凝集物が、トランスフェリンを含有する小胞と共に局在化したことを示した（図４Ａ）。これらのデータは、ＴＣＲとの相互作用後にＡＰＣ由来のＭＨＣ分子がエンドサイトーシスによってＴ細胞によりインターナリゼーションされることを強く示唆する。
【００１５】
細胞の低ｐＨ区画に特異的に蓄積する赤色蛍光色素、リソトラッカー（ｌｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）（１６）をリソゾームのマーカーとして使用して、Ｌd−ＧＦＰの細胞内の運命を追跡した。図４Ａに示されるとおり、２Ｃ Ｔ細胞をＡＰＣとともに１時間培養した後、Ｌd−ＧＦＰが、リソトラッカー（ｌｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）色素により示されるとおりＴ細胞の酸性区画中に出現した。リソゾーム中のＬdの存在は、ＬＡＭＰ−１（リソゾームに会合される膜分子）に特異的なｍＡｂでの固定された２Ｃ Ｔ細胞の免疫染色によりさらに確認された。
【００１６】
リソトラッカー（ｌｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）およびＬＡＭＰ−１でのＬd−ＧＦＰの共局在化は、２Ｃ Ｔ細胞によりエンドサイトーシスされたＬd−ＧＦＰがリソゾームの分解にさらされたことを示唆する。この可能性を検査するため、２Ｃ細胞を、リソゾーム阻害剤（ＮＨ4Ｃｌ、クロロキンおよびＥ６４）の存在もしくは非存在下で、Ｌd−ＧＦＰのショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣおよびＱＬ９ペプチドとともに６時間まで培養し、そしてその後Ｌd−ＧＦＰの総量についてＦＡＣＳにより分析した。図４Ｂに示されるとおり、２Ｃ細胞におけるＬd−ＧＦＰの消失は、リソゾーム阻害剤の添加により明瞭に阻害された。
【００１７】
類似の知見がＬdの免疫沈降でみられた（図４Ｃ）。示される実験において、２Ｃ細胞を最初に４時間、35Ｓ標識されたＬdでトランスフェクションされたＬ細胞およびＱＬ９ペプチドとともに培養し；Ｌdのさらなる取込みを予防するため、その後、２Ｃ細胞をＡＰＣと分離し、そしてリソゾーム阻害剤（ＮＨ4ＣｌおよびＥ６４）の存在もしくは非存在下で２〜４時間培養した。これらのＡＰＣを含まない条件下で、２Ｃ細胞中のＬd分子は、阻害剤とともに培養された細胞についてよりも、培地単独中で培養された細胞について、より迅速に消失した。
【００１８】
いくつかの研究が、Ｔ細胞とＡＰＣの相互作用が、ＡＰＣからの多数の分子をＴ細胞の表面に接着させることができることを示している（２，３）。本開示は、ＣＤ８+ ２Ｃ細胞について、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩ分子（Ｌd）が、Ｔ細胞とＡＰＣの相互作用の部位で超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）を形成した後にＴ細胞により獲得されることを立証し（３）；ＳＭＡＣ中でのＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子の出現はペプチド依存性でありかつ迅速に発生する。加えて、われわれは、ＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子が、ＴＣＲへの結合後にＴ細胞によりエンドサイトーシスされ、そしてその後リソゾーム経路によって分解されることを示す。興味深いことに、Ｔ細胞はＡＰＣからのＢ７分子もまたインターナリゼーションすることができる（３）。Ｂ７がインターナリゼーション後に分解されるかどうかは不明である。
【００１９】
Ｔ細胞およびＡＰＣの抗原特異的相互作用は、抗原用量および時間依存性の様式で、リソゾーム中でＴＣＲのインターナリゼーションおよび分解を誘導する（１７）。ここで、われわれは、ＡＰＣ由来のＭＨＣ Ｉ分子のインターナリゼーションおよび分解の要件および速度論が、ＴＣＲのインターナリゼーションおよび分解のものに類似であること、ならびにＡＰＣ由来のＭＨＣがＴ細胞中でＴＣＲと共局在化することを立証した。これらの知見は、ＭＨＣ Ｉ分子およびＴＣＲがＴ細胞によって一緒にインターナリゼーションかつ分解されることを強く示唆する。Ｔ細胞活性化の連続的誘発モデルによれば、ＴＣＲとのＭＨＣ／ペプチドの一過性の会合が複数のＴＣＲの連続的な誘発（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）に必要とされる（１，４）。しかしながら、ＴＣＲとの特異的相互作用の後にＭＨＣ分子が安定なクラスターを形成し、そしてその後ＴＣＲとともにインターナリゼーションされるというわれわれの知見は、ＴＣＲ／ＭＨＣ／ペプチドの相互作用が一過性でないことを示唆する。これは、Ｔ細胞の活性化におけるＭＨＣおよびＴＣＲの共インターナリゼーションの役割に関する疑問を提起する。
【００２０】
成長因子およびホルモンのような可溶性リガンドの場合には、インターナリゼーションがシグナル伝達に関与していることが既知である（１８）。これゆえに、Ｔ細胞によるＭＨＣ分子のインターナリゼーションは、ＴＣＲに媒介される細胞内シグナル伝達に寄与しているかもしれず（１９）、また、Ｔ細胞中でのＴＣＲおよびＭＨＣの共局在化が持続性のＴＣＲのシグナル伝達に必要とされるのかもしれない（２０）。隣接するＴ細胞上の特定の受容体を介する７膜貫通リガンド（ｂｏｓｓ）のインターナリゼーションが昆虫の目の発生に重要である（２１）という知見により、類似の、しかし関係のない観察結果が提供される。
【００２１】
代替の１つの可能性は、Ｔ細胞とＡＰＣの相互作用の間のＭＨＣ分子のインターナリゼーションが、応答性のＴ細胞をＡＰＣからの過剰の刺激から保護するための装置であるということである。ここで、Ｔ細胞へのＭＨＣクラスＩ分子の結合がＴＣＲのダウンレギュレーションと緊密に相互に関連することは注目に値する。すなわち、双方の過程は類似の速度論を有し、共刺激分子に非依存性であり、そして低濃度のＭＨＣに結合されるペプチドではずっとより少なく顕著である。これゆえに、高濃度のペプチドを発現するＡＰＣとのＴ細胞の相互作用に関して、ＴＣＲ／ＭＨＣ／ペプチド複合体の迅速なインターナリゼーションが、ＴＣＲのシグナル伝達の強度を低下させそして従って耐性誘導の危険を小さくするよう作用しているのかもしれない。
【００２２】
【表１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 発明にかかる、ＭＨＣクラスＩ分子はＴ細胞とＡＰＣの接触部位でクラスターを形成する。休止期の（Ａ）もしくは活性化された（Ｂ）ＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞を、室温で、Ｌd−ＧＦＰ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１を発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣならびに１０？ＭのＱＬ９もしくはＰ１Ａペプチドとともに培養した。共焦点顕微鏡系（フルオビュー（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ）、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ））を使用し、ΔＴＣ３培養皿（バイオプテクス（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ））中のＡＰＣにＴ細胞を添加した直後に、ＧＦＰの蛍光を分析した。左図：Ｌd−ＧＦＰ蛍光。中央図：Ｔ細胞／ＡＰＣ対のＤＩＣ（微分干渉対比）像。右図：Ｌd−ＧＦＰ蛍光およびＤＩＣ像の上置き。（Ｃ）ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣ（＋ＱＬ９）からＬd−ＧＦＰを獲得する休止期のＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞。Ｔ細胞／ＡＰＣ対中のＬd−ＧＦＰ蛍光後の時間経過画像形成を３０秒ごとに実施した。それぞれ５、２０および３０分で採られたＬd−ＧＦＰ蛍光像を左図に示し、また、Ｌd−ＧＦＰ／ＤＩＣの上置き像を右図に示す。（Ｄ）ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣからＬd−ＧＦＰを獲得する活性化されたＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞。活性化されたＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞を、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣ（＋ＱＬ９）とのインキュベーション前に５μＭのＤｉＩ（赤色）（モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））で前染色した。代表的なＴ細胞／ＡＣＰ対の像を示す。（Ｅ）活性化されたＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞によるＲＭＡ．Ｓ細胞（＋ＱＬ９）からのＬd−ＧＦＰの獲得。
【図２】 発明にかかる、ＣＤ８+２Ｃ Ｔ細胞によるＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子のＴＣＲに媒介される獲得。休止期の２Ｃ Ｔ細胞を、３７℃で、示された時間の間、ＱＬ９もしくはＰ１Ａペプチドを負荷された、Ｌd−ＧＦＰ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１を発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞とともに培養した。Ｌd−ＧＦＰの総量およびＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞上のＴＣＲの表面レベルをＦＡＣＳにより分析した。（Ａ）培養の０および３０分での２Ｃ Ｔ細胞上でのＬd−ＧＦＰおよびＴＣＲの発現。（Ｂ）２Ｃ Ｔ細胞上でのＬd−ＧＦＰおよびＴＣＲ発現の速度論。２Ｃ Ｔ細胞上でのＬd−ＧＦＰおよびＴＣＲの発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳを用いて、示された時点で分析した。（Ｃ）２Ｃ Ｔ細胞からのＡＰＣ由来のＬdクラスＩ分子の免疫沈降。力価測定された数の２Ｃ細胞（レーン１：Ｔ細胞なし、レーン２：２×１０7個およびレーン３：４×１０7個）を、Ｌdを発現する３×１０6個の35Ｓ−メチオニン標識されたＬ細胞（１２）とともに培養した。４時間の培養後にＬ細胞（Ｌ−Ｌd）から２Ｃ Ｔ細胞を精製し、そして精製された２Ｃ細胞の細胞ライセートをそれぞれ抗Ｈ−２K ｍＡｂもしくは抗Ｌd ｍＡｂ（２８−１４−８）（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））を用いて免疫沈降させた。（Ｄ）Ｔ細胞によるＬd分子の獲得はＴＣＲ／ＭＨＣ／ペプチドの相互作用に依存する。２Ｃ Ｔ細胞を、示されたようなｍＡｂの存在もしくは非存在下で４時間、Ｌ−Ｌd細胞およびＱＬ９ペプチドとともに培養した。抗ＴＣＲ ｍＡｂ、１Ｂ２（２Ｃ ＴＣＲの双方の鎖を認識する）を使用し、そして上述されたとおりＬdの免疫沈降を実施した。
【図３】 発明にかかる、Ｔ細胞によるＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子のインターナリゼーション。（Ａ）ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣと相互作用する活性化された２Ｃ Ｔ細胞のＺ軸に沿った連続共焦点像。ＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞を５？ＭのＤｉＩ（赤色）で標識し、そしてＬd−ＧＦＰ（緑色）を発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣおよびＱＬ９ペプチドとともに３０分間培養した。（Ｂ）ＤｉＩ標識された膜小胞とのＬd−ＧＦＰの共局在化。２Ｃ Ｔ細胞を、Ｌd−ＧＦＰを発現するＱＬ９を負荷されたＲＭＡ．Ｓ細胞とともに３７℃で２時間インキュベートした。（Ｃ）２Ｃ Ｔ細胞により獲得されたＬd−ＧＦＰは細胞質中にある。活性化されたＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞をリソゾームプロテアーゼ阻害剤（１００？Ｍクロロキンおよび５０？Ｍ Ｅ６４）で前処理し、そしてＬd−ＧＦＰおよび示されたペプチドを発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＰＡＣとともに１時間培養した。その後、それらをトランスフェリン受容体に特異的なビオチニル化抗体、次いでストレプアビジン（Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−Ｃｙｔ３（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））で染色した。（Ｄ）２Ｃ Ｔ細胞におけるＴＣＲおよびＬd−ＧＦＰの細胞内共局在化。２Ｃ細胞を、Ｌd−ＧＦＰを発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣおよびＱＬ９もしくはＰ１Ａペプチドとともに１時間培養した後、ＴＣＲに対するビオチニル化ｍＡｂ（抗ＣＤ３？、抗ＴＣＲ？、およびクローン型ｍＡｂ、１Ｂ２）のカクテルで、そしてその後ストレプアビジン−テキサスレッドで細胞内染色した。
【図４】 発明にかかる、Ｔ細胞によるＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子のエンドサイトーシスおよび分解。（Ａ）２Ｃ Ｔ細胞中での、トランスフェリン（ｔｆとして標識を付けられる）およびリソトラッカー（ｌｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）（ｌｙとして標識を付けられる）とのＬd−ＧＦＰの共局在化。左図の像：活性化されたＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞に、テキサスレッド結合トランスフェリン（５？ｇ／ｍｌ）を負荷し、そしてＱＬ９ペプチドを負荷されたショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣ（Ｌd−ＧＦＰ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。右図の像：活性化されたＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞を、Ｌd−ＧＦＰを発現するＱＬ９を負荷されたＲＭＡ．Ｓ細胞とともにインキュベートし、５ｎＭのリソトラッカーレッド（ｌｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ）ＤＮＤ−９９（モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））で染色した。（Ｂ）リソソーム阻害剤による２Ｃ細胞上でのＬd−ＧＦＰの阻害。休止期のＣＤ８+ ２Ｃ Ｔ細胞を、リソソーム阻害剤のカクテル（２５ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭクロロキンおよび１０μＭ Ｅ６４）の存在もしくは非存在下に、Ｌd−ＧＦＰを発現するショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣおよびＱＬ９ペプチドとともに培養した。示された時間の間の培養の後、ＣＤ８+ ２Ｃ細胞上のＬd−ＧＦＰ蛍光強度をＦＡＣＳにより分析した。（Ｃ）２Ｃ Ｔ細胞中でのＡＰＣ由来のＭＨＣクラスＩ分子の分解。２Ｃ Ｔ細胞を、ＮＨ4ＣｌおよびＥ６４の存在もしくは非存在下に、示された時間の間、35Ｓ−メチオニン標識されたＬdでトランスフェクションされたＬ細胞とともに培養した。Ｌdの免疫沈降を図２で記述されたとおり実施した。残存するＬdの量をデンシトメトリーにより定量した。
【図５】 発明にかかる、非特異的Ｔ細胞と混合された多様な比の２Ｃ Ｔ細胞を使用する、抗原ＱＬ９を負荷された、ＧＦＰ標識されたＭＨＣクラスＩ分子を特異的に取り込んだＣＤ８＋ ２Ｃ Ｔ細胞のＦＡＣＳによる分離を示す。
Claims (9)
- ａ）特異的抗原と会合されたＭＨＣクラスＩタンパク質の供給源をＴ細胞の集団と接触させる工程であって、かつ、当該ＭＨＣクラスＩタンパク質が蛍光マーカー、比色マーカーおよび放射能標識マーカーよりなる群から選ばれる検出可能なマーカーを含有するものである工程、
ｂ）特異的抗原と会合されたＭＨＣクラスＩタンパク質が供給源からインターナリゼーションされるのにＴ細胞にとって十分な２分〜６時間の間、Ｔ細胞の集団と一緒に、特異的抗原と会合されたＭＨＣクラスＩタンパク質をインキュベートする工程；および
ｃ）検出可能なマーカーのインターナリゼーションされたＴ細胞を同定する工程
を含んで成る、抗原特異的Ｔ細胞の検出方法。 - 検出可能なマーカーを含有する特異的抗原と会合されたＭＨＣクラスＩタンパク質の供給源が、蛍光タンパク質と融合されたＭＨＣクラスＩタンパク質を発現する組換え細胞である、請求項１記載の方法。
- 蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質である、請求項２記載の方法。
- 組換え細胞がショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞である、請求項２記載の方法。
- 検出可能なマーカーのインターナリゼーションされたＴ細胞の同定が、検出可能なマーカーの蛍光を検出することによりなされる、請求項１記載の方法。
- 検出可能なマーカーのインターナリゼーションされたＴ細胞の同定が、蛍光標示式細胞分取器中で検出可能なマーカーの蛍光を検出することによりなされる、請求項１記載の方法。
- 検出可能なマーカーが蛍光マーカーである、請求項１記載の方法。
- 検出可能なマーカーが緑色蛍光タンパク質である，請求項７記載の方法。
- 検出可能なマーカーを含有する特異的抗原と会合されたＭＨＣクラスＩタンパク質の供給源がＭＨＣクラスＩタンパク質と緑色蛍光タンパク質を含む組換え融合分子である、請求項８記載の方法。
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