JPH09500867A - 細胞活性を制御するための新規作用薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は哺乳動物細胞活性の標的化した新規作用薬を述べる、特に本作用薬は特定の細胞型群のその外部環境に合わせた相互作用の制御に用いられる。本作用薬は様々の疾患の処置のための薬剤としての適用を有する。本発明による作用薬は以下の方法に従って結合した３つのドメインＢ、ＴそしてＥからなる。ドメインＢ--ドメインＴ--ドメインＥここでドメインＢは、エンドソーム（endosome）を形成するためエンドサイトーシスを受ける細胞表面への結合部位に作用薬を結合する結合ドメインである。ドメインＴはエンドソームからエンドソーム膜を通過して細胞の細胞質中に（結合部位有りもしくは無しに）作用薬を輸送する輸送ドメインである。ドメインＥは完全な膜タンパク質を細胞の表面に輸送するリサイクル性の膜小胞の能力を阻害する効果ドメインである。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞活性を制御するための新規作用薬 技術分野 本発明は、哺乳動物細胞活性の標的化制御をおこなう新規作用薬に関する、特 に本作用薬は細胞周囲の外部環境と特定の細胞タイプ群の相互作用を制御するの に用いられる。本作用薬は様々の疾患の処置のための薬物としての適用を有する 。 技術的背景 生細胞の基本的性質は彼らの外部環境に応答する能力である。細胞とその外部 環境間のインターフェースは原形質膜である。原形質膜はたくさんの種類のタン バク質分子を埋められているリン脂質二重層からなる。これらの完全な膜タンパ ク質（ＩＭＰｓ）は、細胞とその外部環境間の多くの相互作用に応答している。 ＩＭＰｓが含まれる本相互作用は以下を含む：細胞の内および外への栄養物質 を含む物質類の輸送；原形質膜のイオンの透過性の制御；細胞外分子の認識とそ れへの応答；そしてある細胞から他の細胞への吸着。免疫系の特殊化された機能 は、同様にＩＭＰｓをへて仲介され、ある免疫細胞群による他の細胞群への特別 な外来ペプチド配列の描写とされる。 外部環境に応じておよびそれと相互作用する能力を調節する方法のひとつは原 形質膜に存在するＩＭＰｓの量と型を変化することによる。これが達成されるひ とつの機構はリサイクル可能な膜小胞（ＲＭＶｓ）中へのエンドサイトテイック 経路を経てのＩＭＰｓの可逆的内在化 (internalisation)である。この場合に、 ＲＭＶｓ中に貯蔵されたＩＭＰｓは、原形質膜とＲＭＶｓのエクソサイトテイッ ク（exocytotic）な融合の過程をへて細胞表面にすばやく輸送されうるＩＭＰｓ の内在性貯蔵あるいはプールとなる。このエクソサイトテイック／エンドサイト テイックサイクルの平衡への転調（modulation）は細胞表面に存在するＩＭＰｓ の濃度のすばやい調節を許容する。細胞活性を制御する過程の一例として、骨格 筋と脂肪組織におけるインシュリン応答細胞によるグルコースの取り込みがある 。インシュリンはインシュリン応答細胞の原形質膜に見いだされるグルコースト ランスポーター（transporter）、ＧＬＵＴ４の特定のアイソマー（isoform）の 量を増加する。本細胞の表面でのＧＬＵＴ４の濃度が高い程グルコース取り込み を増加させる。それ故、原形質膜に存在するグルコーストランスポーター数を制 御することによってインシュリンへの応答が転調される。 外部シグナルに応答して細胞表面のＩＭＰ発現を変換する他の例として補体断 片Ｃ３ｂとＣ４ｂに対する受容体、タイプ１補体受容体ＣＲ１のそれがある。ヒ ト好中球の活性化に基づいて、ＣＲ１の原形質膜発現が一時的に６から１０倍に 増加する。 他の例として、多くの炎症および免疫細胞は活性化に起因して細胞表面の吸着 分子の発現を修飾する。それ故、好中球あるいは単核細胞の活性化は細胞表面吸 着分子Ｍａｃ−１とｐ１５０，９５の転調を起こす。これらの吸着分子は炎症細 胞の炎症部位を標的化しそこに移動するために重要である。 また他の例において、さまざまのホルモン（インシュリン、インシュリン様成 長ホルモン、インターロイキン１そして血小板由来成長因子）は、様々の細胞型 のトランスフェリン受容体の細胞表面発現における迅速に増加させる。トランス フェリン受容体は細胞の外部環境から２鉄（diferric）トランスフェリンを結合 する、そしてそこで細胞による鉄の取り込みに関与する。このトランスフェリン ／トランスフェリン−受容体システムは同様にトランスサイトーシス（transcyt osis）のような既知の過程、例えば血液脳関門を通過して中枢神経系に入る鉄の 細胞間輸送にも役割を演じているであろう。トランスサイトーシスは同様に発生 中の胎児への母親の免疫の輸送にも関与する。 また他の例として利尿ホルモンアルドステロンが膀胱の上皮細胞群の尖細胞膜 （apical membrane）中へのＮａ⁺チャネルの細胞表面発現を増加させることが知 られている。この機構は、塩の保持を含み、例えば低ナトリウム含有食品の条件 下において起こる。 ＩＭＰｓの細胞膜発現のさらなる転調の例として、免疫系の機能が外部のない し非自己の抗原の認識に基づいていることが注目されている。この認識と免疫応 答の一部分は外部ペプチド配列を認識してそして応答する免疫系の細胞群により 提供される。これらのペプチド配列は抗原提示細胞として知られている免疫系の 別の細胞により免疫細胞に提示される。抗原提示細胞は、外部抗原性タンパク質 を摂取し、これらをペプチド群に消化しそして外部ペプチド群を主要な組織適合 性複合体のＩＭＰｓによって細胞膜に形成された裂け目に現れる。このようにＩ ＭＰｓはその外部環境と相互作用する細胞の能力の中心である。そして異なった 様々な性質の相互作用を与えられる、異なった巨大なＩＭＰｓの配列があるのを 見いだすことは驚くべき事ではない。細胞機能におけるＩＭＰｓの中心的役割は それらがしばしば病的な生理学的状態に関与することであり、そして多くの治療 的介入のための標的となる。 ＩＭＰ活性の制御に関する従来の技術は主に細胞表面で一旦発現されたＩＭＰ の機能を転調することに焦点を当ててきた。このように従来技術の治療的な介入 は特定のＩＭＰｓにそして特定の細胞タイプ群の特定の機能に特異的であるよう に向けられてきた。特異的輸送ＩＭＰｓの阻害が治療薬として開発されてきた。 例えば、ニューロンの５ＨＴ輸送蛋白の阻害は抗うつ薬として用いられる。特定 の受容体ＩＭＰｓの拮抗物質は非常に普通に薬理学的作用物として用いられる。 例としてヒスタミン受容体のＨ１とＨ２サブタイプの両方に特異的な抗ヒスタミ ン類そしてβ−アドレノセプターの拮抗剤がある。ＩＭＰ機能の阻害剤も広く薬 理学的作用物として用いられる。例として利尿性フロセミドとアミロライドのよ うな膜内外イオン移送の阻害がある、後者は膀胱上皮尖細胞Ｎａ⁺チャネルの阻 害剤である。カリウムチャネルの阻害剤は抗不整脈薬として開発下にあることが 知られている。細胞吸着ＩＭＰｓは同様に選択的拮抗物質の開発のための最近の 標的である。 追跡されうる他のアプローチは、そのＩＭＰおよび特定のＩＭＰ蛋白合成の転 調をコードする適切な遺伝子の転写レベルの変換による、それ故、特異的ＩＭＰ タンパク質合成の転調による遺伝的レベルでの特定のＩＭＰｓの発現を選択的に 修飾することにある。 要旨として、ＩＭＰｓは細胞の外部環境との応答に基本的な役割を果たすこと が知られている。ＩＭＰｓの制御への従来のアプローチは一般に細胞表面で特異 的なＩＭＰｓを標的としその機能的能力を修飾することである。原形質膜内での ＩＭＰｓの密度の制御は様々な疾患の処置への広い適用を予想させる。ＩＭＰｓ の大きな多様性の観点からそして現在の治療的相互作用の特定の性質から、一つ の種類の作用薬群が様々の細胞タイプ群におけるＩＭＰｓの発現を修飾できる本 発明における発見は驚くべきことである。同じ種類の作用薬は同様に輸送ＩＭＰ ｓ、受容体ＩＭＰｓ、吸着ＩＭＰｓ、チャネルＩＭＰｓそして抗原提示ＩＭＰｓ の発現を修飾できる。 先に、ＩＭＰｓに影響する作用薬は機能によって、例えば、化学的にそして機 械的に非常に異なっている各々の群のメンバーであるＣａ⁺⁺アンタゴニストが上 げられる。対照的に現在の発明に参照される作用薬の種類は作用薬の機能に予想 されうる効果をもつ特定のドメインの合理的に構成された代用物で構造的に均一 である。本発明のさらなる点は、作用薬がある細胞タイプにのみＩＭＰ発現の選 択的転調を許容する特定の細胞タイプを選択的に標的化し得るものである。 発明の説明 本発明はその外部環境と細胞の相互作用を制御するための作用薬に関する。特 に本発明はその外部環境との細胞の相互作用を修飾するように、細胞の内部成分 から細胞膜への完全な膜タンパク質（Integral Membrane Protein）（ＩＭＰ） 分子の輸送を制御するための作用薬を提供する。 さらに本発明は、ＩＭＰｓを細胞の表面に輸送する能力を阻害するようなリサイ クル性膜小胞（Recycle Membrane Vesicle）（ＲＭＶｓ）の構造を修飾する新規 作用薬を提供する。 定義 下記の用語は以下の意味を有する； 完全な膜タンパク質（ＩＭＰ）は生物学的膜の脂質二重層内部に埋め 込まれ脂質二重層に亘る全てのタンパク質を意味する。 リサイクル膜小胞（ＲＭＶ）は細胞の細胞質ゾルに存在し、脂質二重 層に結合した細胞内小胞を意味する。ＲＭＶｓは原形質膜から形成されそしてエ ンドサイトーシスと呼ばれる過程によって細胞内に移動する。ＲＭＶｓは細胞原 形質膜から形成されたり融合する過程を経るサイクルを形成している。細胞原形 質膜へ移動し、細胞膜と融合するこの過程は、細胞内におけるＲＭＶｓの機能は 細胞表面からおよび細胞表面へのＩＭＰｓの可逆性輸送にある；この過程におい て、これらは神経分泌細胞の分泌小胞とは異なっている。 エンドソームはエンドサイトーシスの過程で原形質膜から形成された 細胞内小胞を意味する。 重鎖はクロストリジアル ニューロトキシン(Clostridial neurotoxin )類を形成する二つのポリペプチド鎖の大きい方を意味する；それは約１００ｋ Ｄａの分子量をもち通常ＨＣとして規定される。軽鎖はクロストリジアルニュー ロトキシンを形成する二つのポリペプチド鎖の小 さい方を意味する；それは約５０ｋＤａの分子量をもちそして通常ＬＣとして規 定される。自然に存在している重鎖および軽鎖は少なくとも一個のジスルフィド 結合によって共有結合している。 Ｈ₂断片は、タンパク質分解酵素例えばトリプシンあるいはパパイン による切断によってクロストリジアルニューロトキシンの重鎖のアミノ末端から 得られた断片を意味する。 Ｈ₂Ｌは、タンパク質分解酵素例えばトリプシンあるいはパパインに よって分解したクロストリジアル ニューロトイシンの断片を意味し、まだＬ鎖 がジスルフィド結合によってＨ₂断片に結合している。 本発明の一面として、作用薬は細胞膜を通過しての代謝物の輸送に応答するＩ ＭＰのレベルを制御しそして細胞内代謝物の利用性を制御することを提供するも のである。 本発明の他の面として、作用薬は細胞の外そして細胞の中へ細胞膜を通過して 代謝物の輸送に応答するＩＭＰのレベルの制御をしその結果、細胞を通しての代 謝物の輸送を制御することを提供するものである。 また本発明の他の面として、作用薬はイオンに対する細胞の原形質膜の選択的透 過性に応答するＩＭＰのレベルを制御し、これによって細胞内のイオンの濃度を 転調するためのものである。 また本発明の他の面として作用薬は信号分子の認識のために応答するＩＭＰのレ ベルを制御し、これによって信号分子への細胞の応答性を転調するものである。 また本発明の他の面として、作用薬は信号分子の膜への結合を伴う細胞膜を通 過する信号の誘導を起こすＩＭＰのレベルを制御しこれによって信号分子への細 胞の応答性を転調するものである。 また本発明の他の面は、作用薬は摂取した抗原から誘導されたペプチド断片の 細胞表面における描写に応答するＩＭＰのレベルを制御することである。生物体 においてこの結果、各生物体の免疫応答に影響することである。 本発明は同様に標的細胞タイプに特異的な標的を有していて本作用薬の効果面 が前記細胞型に限定されている作用薬を提供する。 先に述べたように、ＩＭＰ活性の制御にアプローチする従来技術は細胞表面で 一旦発現されたＩＭＰの機能を転調することに主に焦点を当てている。これに対 し、細胞表面で発現されるようになるＩＭＰのレベルを転調する。 本発明の詳細な説明 本発明の目的は、細胞表面でのＩＭＰのレベルを制御する作用薬を提供するた め、環境に合わせた細胞の応答を修飾するための多くの可能な適用形態を持つこ とであることが理解される。この発明は実施例、例えば、実施例１と２に証拠づ けられるようにＩＭＰｓが細胞の表面に運ばれ機構に影響するように機能する作 用薬を含有する。そのような作用薬は３つの別個の機能を達成しなければならな い、それらの２つは当業者には知られている。最初細胞表面構造（結合部位）に 結合しなければならない。次に細胞の細胞質ゾル中に入らなければならない。分 子が細胞中へはいることはエンドサイトーシスの過程によって生じることが知ら れている。しかしながらほんのいくつかの細胞表面結合部位がエンドサイトーシ スに含まれることが知られているだけであり、これらの結合部位のみが標的とし て適切である。エンドサイトーシスによって細胞中に一旦取り込まれた作用薬は 、エンドゾームを出て細胞質に入らねばならない。特異的な細胞結合を達成しそ して細胞質ゾル中に作用薬の入ることは文献的にも良く知られている（例えば： Pastan，I; Willingham，MC; & Fitzgerald，DSP，1986，Cell 47,641-648，Ols nes，S: Sandvig，K:Petersen，OW; & Van Dews，B，-1989，Immunol．Today10 ，291-295，Strom，TB; Anderson，PL; Rubin-Kelley，VE; Williams，DP; Kiyokawa，T; & Murphy，JR; 1991，Ann NY Acad．Sci 636,-250）。作用薬の第 三の機能は本発明の驚くべき発見で本ＲＭＶに影響する能力である。さらなる本 作用薬の驚くべき面はＲＭＶに影響することによって細胞表面へのＩＭＰｓを輸 送する能力を制限することである。 それゆえ、本発明の作用薬は次の機能的ドメインからなる； ドメインＢ、結合ドメインは、エンドサイトーシスを受けることがで きる標的細胞における結合部位に作用薬を結合する作用薬を含むエンドソームを もたらす。 ドメインＴ，輸送ドメインは、エンドソーム内から作用薬もしくは化 合物の一部分をエンドソーム膜を通過して細胞の細胞質中に輸送する ドメインＥ、効果ドメインは、ＲＭＶｓによる細胞の表面へのＩＭＰ ｓの輸送を阻害する ドメインＢは標的細胞タイプに特異性をもつように作ることができる。特定の 細胞タイプに作用薬を標的化する能力は熟練研究者では良く知られている。この ように、ドメインＢの機能は従来技術として知られている抗体類、モノクローナ ル抗体、抗体断片（Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ）^' ₂、Ｆｖ，単一鎖抗体類等）、ホルモン 、サイトカイン、成長因子そしてレクチン類を含む多くの細胞結合分子の一つの 使用によって達成されうる、しかしこれに限定されるものではない。 ドメインＴの機能はエンドソーム膜内の適切な穴を形成しうる分子によって達 成される。トキシン分子のある部分はアントラックストキシン、ボツリヌストキ シン、テタヌストキシン、ジフテリアトキシンそして緑膿菌エンドトキシンの断 片、他のトキシンもそのような穴を形成できることが立証されている(Hoch，DH; RomeroMira，M;Ehrlich，BE;Finkelstein，A; Das Gupta，ER; & Simpson，LL; 1985 PNAS 82 1692-1696，Olsnes，S; Stenmark，H; Moskaug，JO; McGill，S; Madshus，IH; &Sandvig，K，1990，Microbial Pathogenesis 8,163-168）。一つ のそのような分子は例えばボツリヌスニューロトキシンＡ型 クロストリジアル ニューロトキシンの重鎖である。好ましくは、エンドソーム膜内に穴形成できる トキシン分子の部位のみを用いることを見いだされている。 ドメインＥの機能である細胞の表面へＩＭＰｓを輸送する能力の阻害は当業者 に知られていない。驚くべきことは、穴形成のできるトキシン分子機能的に異な るある種の分子、これにはボツリヌスあるいはテタヌストキシンのいずれかのよ うなクロストリジウムニューロトキシンの断片を含むが、その種々の部分が細胞 原形質に入ったとき、ＲＭＶｓ中のＩＭＰｓの細胞表面への輸送を阻害され、そ の結果として細胞表面でのこれらのＩＭＰｓの濃度を減少することを見いだした 。特にテタヌストキシンとボツリヌスタイプＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，そしてＧ の断片が特に適当である。そのような分子の例として、トキシンの重鎖のカルボ キシ末端半分の好中球活性が除去され、軽鎖に連結したジスルフィドを有するア ミノ末端の半分を残しているところのＨ₂Ｌ断片として知られているクロストリ ジウムニューロトキシンの一部分があげられる。他の例としてボツリヌスニュー ロトキシンタイプＢの軽鎖、特にＺｎ⁺⁺依存性メタロプロテアーゼ（金属保有蛋 白分解酵素）活性を有する分子の部分のようなクロストリジウムニューロトキシ ンの軽鎖があげれられるだろう。 本発明はそれ故下記の構造の作用薬を含む； ドメインＢ--ドメインＴ--ドメインＥ ドメインはドメイン間に適切なスペーサー領域を含む連結基によって共有結合 で連結される。 本発明の一つの具体例においては、ドメインＢはエンドサイトーシスを受ける 標的細胞の結合部位に結合することができる結合分子である、ドメインＴはボツ リヌスニューロトキシンの重鎖あるいはそれの断片である、そしてドメインＥは ボツリヌスニューロトキシンの軽鎖あるいはそれの断片である。ドメインＴとＥ はＣ．ボツリヌスの同じまたは異なった血清型からのものであってもよい。 本発明の他の具体例においては、ドメインＢはエンドサイトーシスを受ける標 的細胞の結合部位に結合できる結合分子である、ドメインＴはテタヌスニューロ トキシンの重鎖あるいはそれの断片である、そしてドメインＥはボツリヌスニュ ーロトキシンの軽鎖またはそれの断片である。 本発明の他の具休例として、ドメインＢはエンドサイトーシスを受ける標的細 胞の結合部位に結合できる結合分子である、ドメインＴはボツリヌスニューロト キシンの重鎖またはそれの断片そしてドメインＥはテタヌスニューロトキシンの 軽鎖もしくはそれの断片である。 本発明の他の具休例として、ドメインＢはエンドサイトーシスを受ける標的細 胞の結合部位に結合できる結合分子である。ドメインＴはテタヌスニューロトキ シンの重鎖またはそれの断片である、そしてドメインＥはテタヌスニューロトキ シンの軽鎖またはそれの断片である。 本発明は記述された機能を持つ同じまたは異なった生物体からのトキシン分子 またはトキシンの断片の全ての組み合わせを含むと理解される。 作用薬が生物体に投与されると標的細胞の表面でのＩＭＰｓの濃度は減少する。 このことは細胞中へのあるいは細胞を通過しての代謝物またはイオンの取り込み の減少、信号分子への標的細胞の応答の減少、あるいは生物体の免疫応答の変化 を含む沢山の望ましい効果をもたらすことができる。 実施例１ ３Ｔ３−ＬＴ繊維芽細胞を分散液中でトリプシン処理し、１ｍＭのボツリヌス ニューロトキシンＢ（ＢＯＮＴ−Ｂ）の存在下ないし非存在下において、キャパ シタンスエクステンダー（capacitance extender）を備えたバイオラッド社のジ ーンパルサーを用いて１１−１１．５ｍｓｅｃｓで一定時間，３００Ｖ／ｃｍ、 ９６０ｍＦ通電(electroporate)した。通電後細胞を吸着させそして７２時間２ ４穴プレート中で３７℃で単層培養を維持した。次に細胞を洗浄しそして５ｎＭ インシュリン様成長因子タイプ１(ＩＧＦ−１)の存在もしくは非存在下で３７℃ で５分間インキュベートしその後氷上に５分間放置した。細胞から上清を吸引し そして氷冷１.５ｎＭ 125Ｉ−トランスフェリン(特異活性４７Ｔｂｇ／ｍｍｏ ｌ)で置換した。非特異的結合を非放射性トランスフェリンの１００倍モル濃度 の添加下で平衡化してインキュベートして概算した。２時間後上清が除去され、 氷冷緩衝液で３回洗浄し細胞層を１Ｎ ＮａＯＨ中で消化した。そしてＬＫＢ１ ２７５ミニガンマガンマカウンターを用いて結合¹²⁵Ｉトランスフェリンを測定 した。トランスフェリン結合のアップレギュレーションはＩＧＦ−１の存在下に おける特異的¹²⁵Ｉ−トランスフェリン結合を計算しＩＧＦ−１の存在しない条 件での特異的結合に対するパーセンテージとして表示した。 表１は、対照に比較してＢｏＮＴ−Ｂで処理した細胞においてＩＧＦへの応答 を示す¹²⁵Ｉ−トランスフェリン結合の上昇が減少することを示す。これは３Ｔ ３−ＬＩ繊維芽細胞の細胞質ゾルへのＢｏＮＴ−Ｂの挿入がこれら挿入細胞にお けるトランスフェリン受容体のＩＧＦ−１刺激アップレギュレーションを阻害す ることを示す。 ３Ｔ３−ＬＩ繊維芽細胞消化物から抽出されたトライトン−Ｘ−１１４−可溶 性タンパク質は、神経分泌細胞の分泌小胞蛋白質中に同定されるペプチド配列Ｓ ＥＱ．ＩＤ．１（ＱＱＴＱＡＱＶＤＥＶＶＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬ ＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＱＡＧＡＳＱＦＥＴＳＡＡＫＬＫＲＫＹＷＷＫＮＬＫ）に 対して作成したポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロットで分析した。こ の抗小胞抗体は神経分泌活性は有さず、ＢｏＮＴ−Ｂ−処置繊維芽細胞からのサ ンプルに明白な２重バンドを示し反応性の減少を示した。このように、ＢｎＮＴ −Ｂはトランスフェリン受容体のアップレギュレーションを阻害し同時に３Ｔ３ −ＬＴ繊維芽細胞における小胞構造（多分ＲＭＶ）を修飾する。 実施例２ ３Ｔ３繊維芽細胞が実施例１に示されたのと同一条件を用いて０．５ｍＭ ボ ツリヌスニューロトキシン−Ａ（ＢｏＮＴ−Ａ）の存在下および非存在下で通電 された。¹²⁵Ｉ−トランスフェリン結合のＩＧＦ−１刺激を実施例１に述べたよ うにして処置と未処置中で分析した。 表２の結果は、３Ｔ３−ＬＩ繊維芽細胞のＢｏＮＴ−Ａ処置がＩＧＦ−１に応 答して見られた¹²⁵Ｉ−トランスフェリン結合のアップレギュレーションを消失 することを示す。これは３Ｔ３−ＬＩ繊維芽細胞の細胞質ゾル中へのＢｏＮＴ− Ａの挿入が、これらの細胞におけるトランスフェリン受容体のＩＧＦ−１刺激ア ップレギュレーションを阻害することを示す。 実施例３ ３Ｔ３繊維芽細胞が実施例１で行われたのと同一の条件を用いて０．５ｍＭの ＢｏＮＴ−ＡのＨ₂Ｌ−断片（Ｈ₂−Ａ）の存在もしくは非存在下で通電された。 この断片は、トシルフェニルアラニンクロロメタン処置トリプシンを用いて限定 タンパク質分解によってＣボツリヌスのニューロトキシン、抗原型Ａから作成し た。 Ｈ₂Ｌ複合体は次にセファデックスＧ−２００上でのクロマトグラフィーによっ て精製した(Shone，CC:Hambleton，P: & Melling，J; 1985．Eur J Biochem 151 ，17-82)。処置そして未処置細胞における¹²⁵Ｉ−トランスフェリン結合のＩＧ Ｆ−１刺激の測定であるので実施例１に述べたように通電を行った。 表３の結果は、３Ｔ３−ＬＩ繊維芽細胞のＨ2Ｌ処置がＩＧＦ−１への応答に 見られたように¹²⁵Ｉ−トランスフェリンの結合のアップレギュレーションを阻 害することを示す。これは３Ｔ３−ＬＩ繊維芽細胞の細胞質中へのボツリヌスニ ューロトキシン−Ａ Ｈ₂−Ａ断片の挿入がこれらの細胞におけるトランスフェ リン受容体のＩＧＦ−１が刺激するアップレギュレーションを阻害することを示 す。 実施例４ ３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞は記述(Frost，SC & Lane MD，1985，J Biol Chem 260，2 646-2652)されているようにデキサメタソン、３−イソブチル−１−メチルキサ ンチンそしてインシュリンとの処理によって３Ｔ３−ＬＩ繊維芽細胞から分化す る。 分化後７日目の３Ｔ３−ＬＩの脂肪細胞は、濾過滅菌された血清を含むダルベ ッコの修飾イーグル培地中で希釈したボツリヌスニューロトキシン抗原型Ａ（最 終濃度ＢｏＮＴ Ａ：２００ｎＭ）で処理された。トキシン処理細胞と対照細胞 は８％ＣＯ₂中で４５時間３７℃でインキュベートした。次に細胞は２度洗浄し そして無血清ダルベッコの修飾イーグル培地中で２時間８％ＣＯ₂中でインキュ ベートした、その後細胞はクレブスリンガー燐酸塩で洗浄しそしてクレブスリン ガー燐酸塩（基準取り込み、basal uptake）あるいは１００ｎＭインシュリンを 含むクレブスリンガー燐酸塩（刺激された取り込み）中で３７℃１５分間インキ ュベートした。 グルコース取り込みは［3Ｈ］２−デオキシグルコース（１４．２ＫＢｑ，１ ０μＭグルコース）の添加によって開始される。３７℃で１０分間後、反応はグ ルコース溶液の吸引と氷冷燐酸緩衝食塩水でのすばやい洗浄によって停止される 。 細胞は０．２ＮＮａＯＨの添加で溶解させそして得られた溶液は、０．２ＮＨ Ｃｌの添加によって中和した。そして［3Ｈ］２−デオキシグルコースの取り込 みがワラック１４１０液体シンチレーションカウンターを用いてオプチフェーズ シンチラント(optiphase scintillant)中で液体シンチレーション計数によって 測定した。 クロストリジアルニューロトキシンは、ニューロトキシンの高濃度で長期間細 胞とインキュベートされたならば、低親和性受容体を経てある神経分泌細胞（例 えばＰＣ１２細胞）に入ることができることが知られている。この過程は神経筋 接合部に存在する高い特異性と高い親和性を有する受容体とは異なった受容体を 経る経路を用いるように思われる。加えて、あるクロストリジアルトキシンはマ クロファージのような食細胞に効果を有する、そこで細胞中への侵入(entry)は これらの特異的食細胞崩壊活性を経ていると予想されることが報告されている。 しかしながら一般的にクロストリジアルニューロトキシンの神経選択性は非常に 選択的な結合と細胞侵入メカニズムの結果であると認識されている。それ故、記 述されたようにボツリヌスニューロトキシン−Ａと３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞のイン キュベーションは［3Ｈ］２−デオキシグルコース輸送のインシュリン−刺激化 アップレギュレーションの顕著な抑制を引き起こすと言う、本研究の発見は驚く べきことである（表４）。脂肪細胞中のグルコース輸送のインシュリン−アップ レギュレーションは細胞内プール（ＲＭＶｓ）から細胞表面へのグルコーストラ ンスポーター（transporter）タンパク質の移動の結果であると知られている。 このように、本結果は、ボツリヌスニューロトキシン−Ａが脂肪細胞の細胞表面 へのＲＭＶｓ中でのグルコーストランスポーターのインシュリン刺激化移動を阻 害することを示している。 実施例５ ３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞がトリプシン処理されそして本細胞の分散液がボツリヌ スＢの存在もしくは非存在下（０．３２ｍＭ）でエレクトロポレートされた。９ ６０ｍＦキャパシターが３００Ｖ／ｃｍのパルス強度をもたらすエレクトロポレ ーション(electroporation)のために用いられた；通電時間は１１−１２ｍｓで あった。エレクトロポレーション後細胞は洗浄し、そして培地と血清とともに６ 穴プレートに植えられた。細胞を湿潤雰囲気中（空気／ＣＯ₂：９２．５％／７ ．５％）７２時間３７℃でインキュベートした。インキュベートの終わりに細 胞は洗浄しそして０．１Ｎ ＮａＯＨで抽出した。抽出物を０．１Ｎ ＨＣｌで の中和後、膜タンパク質はトリトンＸ−１１４中で分配され、そして続いて実施 例１に述べた抗小胞抗体を用いてウエスタンブロッテイングによって分析した。 脂肪細胞の細胞質ゾル中へのボツリヌスニューロトキシンのエレクトロポレーシ ョンで、ニューロトキシンＢ処置細胞からのサンプルについて明確な２重のバン ドが得られこれにもとづき抗体の反応性の減少を証拠づけるように、小胞（恐ら くＲＭＶ）の構造の修飾をもたらすと言う、本研究の発見は驚くべきことである 。 実施例６ 本実施例において、作用薬は、脂肪細胞のインシュリン依存性グルコース輸送 の細胞表面発現を制御するために合成される。この実施例における作用薬につい ての結合ドメイン（Ｂ）はインシュリン様成長因子IIであり、Marguette，H;Tod aro，GJ;Henderson，LE & Oroszlan，S，1981，J Biol．Chem 256 2122-2125に 記述されるように、ＢＲＬ−３Ａ細胞の調製培地から精製される。 輸送ドメイン（Ｔ）はトシルフェニルアラニンクロロメタン−処置トリプシン を用いるニューロトキシンの限定蛋白分解によってＣ．ボツリヌスのニューロト キシン血清型Ａから調製された。ドメインＴを含む画分は次にセファデックスＧ −２００上のクロマトグラフィーによって精製した（Shone，CC; Hambleton,P;& Melling，J; 1985，Eur．J．Biochem．151，75-82）。次に本画分は燐酸／ほう 酸緩衝液ｐＨ８．４中、第四球アミノエチル−セファデックスカラム上に負荷し た、そして２Ｍ尿素と０．１Ｍジチオトレイトールとともに４℃一晩カラム上で インキュベートした。カラムは次に２Ｍ尿素と１０ｍＭジチオトレイトールを含 む緩衝液で洗浄した。次にドメインＴを２Ｍ尿素と１０ｍＭジチオトレイトール を含む燐酸／ほう酸緩衝液を用いて０．１Ｍから０．２ＭへのＮａＣｌの段階的 勾配によって溶出した(Poulation，B; Wadsworth，JDF; Maisey，EA; Shone，CC ; Melling，J; Tauc，L; & Dolly，JO，1989，Eur．J．Biochem．165，197- 203)。クロストリジアルニューロトキシンは重鎖と軽鎖からなるジスルフィド連 結二本鎖タンパク質である(Simpson，LL，1986，Ann．Rev．Pharmicol．Toxicol .26，427-453)。与えられた手段に従って生産されたドメインＴはＨ₂として参照 されるニューロトキシンの重鎖の画分に等しいことを注目せねばならない。 効果ドメイン（Ｅ）は、２Ｍ尿素中で還元条件下でアンフォライトを用いる蔗 糖勾配中の等電点電気泳動(isoelectric focusing)によってＣ．テタニのニュー ロトキシンから調製された(Weller,U; Dauzenroth，M-E; Meyer zu Heringdorf ，D & Habermann，E，1989，Eur．J．Biochem.，182，649-656)。与えられた方 法で生産されたドメインＥは通常ＬＣとして参照されるニューロトキシンの軽鎖 に等しいことは注目せねばならない。 ドメインＥとＴは還元条件下、等モルで混合されそして還元試薬のない状態で 生理的食塩水中で撹拌しながら４℃で透析を繰り返すことによって共有結合で結 合される。残った全てのフリーのスルフヒドリルは暗黒下４℃で３０分間１５０ ｍＭのヨードアセトアミドを添加して誘導される。結合したＥ−Ｔ生成物はカリ ウム燐酸緩衝液ｐＨ７．０を用いるセファデックスＧ−１５０上でのサイズエッ スクルージョンクロマトグラフィー(size exclusion chromatography)によって 精製した。最後に、ドメインＢはＮ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジロチ オ）ブロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）を用いてＥ−Ｔ結合体に結合した。Ｅ−Ｔ複合 体(５ｍｇ)を燐酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)の１ｍｌに溶解し、そしてこれに０．５ｍ ｌの無水エタノールに溶解したＳＰＤＰの２００ｍｇに添加する。混合物を３０ 分間室温で反応させた後、２−ピリジルジスルフィド−置換ペプチドをセファデ ックスＧ２５を通してのゲル濾過によって過剰のＳＰＤＰから分離した。ドメイ ンＢも、低濃度のＳＰＤＰ（０．２ｍｌのエタノール中に２０ｍｇ）を用いた点 を除き同様に処理した。置換ドメインＢはセファデックスＧ２５カラムから再び 集められそして次に０．０５Ｍの最終濃度にジチオトレイトールを添加して還元 した。過剰の還元剤はセファデックスＧ２５上のゲル濾過によて除去される。置 換 Ｅ−Ｔ複合体と置換されたおよび還元されたドメインＢの等量（Ｗ／Ｗ）が次に 混合され４℃で１８時間放置された。次にこの作用薬がカリウム燐酸緩衝液ｐＨ ７．０を用いるセファデックスＧ−１５０上のクロマトグラフィーによって精製 した。 上述したようにして調製した作用薬は、次に３Ｔ３−Ｌｉ脂肪細胞中でのグル コーストランスポート発現のインシュリン刺激化増加を阻害する能力を試験した 。３Ｔ３−Ｌｉ脂肪細胞は３Ｔ３−Ｌｉ繊維芽細胞からデキサメタソン、３−イ ソブチル−１−メチルキサンチンおよびインシュリンを上述したように処理する ことによって分化する(Frost，SC & Lane MD，1985，J Biol Chem 260，2646-26 52)。そして分化開始後８日と１２日の間のものを用いる。細胞は作用薬の存在 下または不存在下３７℃で９０分間インキュベートする。次に細胞は各々の実験 のはじめに無血清ダルベッコ修飾イーグル培地中で２時間インキュベートした。 インシュリン処置細胞は次にストックの１．６×１０^-4Ｍ溶液から加えられる１ ０^-7Ｍインシュリンに１０分間暴露する。上述の処置後、細胞は３７℃でクレブ スリンガー燐酸塩で迅速に洗浄し、そして１０^-7Ｍインシュリンの有りまたは無 しで１０分間の３７℃でクレブスリンガー燐酸塩中の［3Ｈ］２−デオキシグル コース（１４．２ ＫＢｑ：１０ｍＭ）の取り込みを測定した。反応はグルコー ス溶液の吸引と氷冷燐酸緩衝食塩水による迅速な洗浄によって停止され、そして 細胞は０．２Ｍ水酸ナトリウムを加えて溶解した。溶液はワラック１４１０液体 シンチレーションカウンターを用いるオプチフェーズシンチラント中でのシンチ レーション計測に先だって０．２ＭＨＣｌの添加によって中和される。 実施例７ 本発明の他の実施例において、ドメインＥとＴはボツリヌスニューロトキシン の同一血清型から生産されそしてすでに一緒に結合した状態で生産される。Ｃ． ボツリヌスのニューロトキシン血清型Ａがトシルフェニルアラニンクロロメタン 処置トリプシンを用いて限定蛋白分解に供し、Ｅ−Ｔ複合体は次にセファデック スＧ−２００上のクロマトグラフィーによって精製した(Shone，CC; Hambleton ，P; & Melling，J 1985，Eur．J．Biochem．151，75-82）。 この断片はＨ₂Ｌ断片として参照されるものと同じであることを記述しなけれ ばならない。全ての残っているフリーのスルフィドリル実施例６に述べたように １５０ｍＭヨードアセトアミドの添加によって誘導された。結合ドメイン（Ｅ） は実施例６に述べられたようにして調製したインシュリン様成長因子IIであり、 そして述べられたようにＳＰＤＰを用いてＥ−Ｔ複合体を形成させた。脂肪細胞 におけるインシュリン依存グルコース輸送の発現における本作用薬の活性が実施 例６に示したように試験された。 実施例８ 本発明の他の実施例において、好中球（ＣＤ３５）における補体断片Ｃ３ｂの ためのＣＲＩ受容体の細胞表面発現の調節のための作用薬が次の方法によって合 成される。Ｂドメインは白血球吸着分子Ｐ１５０，９５へのＳＨＣＬ３モノクロ ーナル抗体から調整される。ＥとＴドメインは実施例７に述べたようにすでに結 合しているボツリヌスニューロトキシン血清型Ａから調製され、その実施例に述 べたようにドメインＢに結合される。 ＣＲＩ（ＣＤ３５）の好中球細胞表面発現対する本作用薬の活性を試験するた めの好ましい方法としては全血溶解テクニックを用いることである。正常のドナ ーからのＥＤＴＡで抗凝固全血を３７℃で４時間本作用薬で処理する、次にＤＭ ＳＯ中に作ったストックの１０^-2ＭからＰＢＳで希釈して１０^-6ＭのｆＭｅｔ− Ｌｅｕ−Ｐｈｅを用いて３７℃で３０分間活性化した。対照の細胞はＰＢＳでイ ンキュベートした。次に血液をフィコエリスリン結合モノクローナル抗体抗ＣＤ ３５（セロテック：ＭＣＡ５５４ＰＥ）の１０ｍｌとともに室温で３０分間イン キュベートし、赤血球をベクトンデイッキンソン溶解溶液を用いて溶解した。白 血球はＰＢＳで洗浄しＰＢＳ中の２％フォルムアルデヒドに再分散した。表面に 結合したＰＥをリシスIIソフトウエアーを備え付けたＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン デイッキンソン）を用いてフローサイトメトリー（flow cytometry）によって分 析した。 実施例９ 本発明の他の実施例において、白血球吸着分子（ＣＤ１１ｂ）の細胞表面発現 の調節のため本作用薬は以下の方法で合成した。Ｂドメインはペプシンを用いる 標準的方法によって白血球吸着分子Ｐ１５０，９５へのＳＨＣＬ３モノクローナ ル抗体から調製し、ゲルろ過によって精製した（Martin，FJ; Hubbell，WL; and Papahadjopoulos，D，1981，Biochemistry 20，4229-4238）。ＥおよびＴドメ インはボツリヌスニューロトキシン血清型Ａから調製され、実施例７に述べたよ うにすぐに結合し、そしてその実施例に述べたようにドメインＢに結合する。 Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）の好中球細胞表面発現における本作用薬の活性を試 験するための好ましい方法は全血溶解テクニックを用いることである。正常なド ナーからのＥＤＴＡ抗凝固全血を３７℃で４時間本作用薬で処理し、次にＤＭＳ Ｏ中に作ったストックの１０^-2ＭからＰＢＳで希釈して１０^-6ＭのｆＭｅｔ−Ｌ ｅｕ−Ｐｈｅを用いて３７℃で３０分間活性化した。対照の細胞はＰＢＳでイン キュベートした。血液は次にイソシアン酸フルオレセイン結合モノクローナル抗 体抗ＣＤ１１ｂ（セロテック：ＭＣＡ５５１Ｆ）の１０ｍｌで室温で３０分間イ ンキュベートした。赤血球はベクトンデイッキンソン溶解溶液を用いて溶解した 、白血球はＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の２％フォルムアルデヒド中に分散した。 表面に結合したＦＴＴＣをリシスIIソフトウエアーを備え付けたＦＡＣｓｃａｎ （ベクトンデイッキンソン）を用いてフローサイトメトリーによって分析した。 実施例１０ 本発明の他の実施例において、膀胱上皮細胞の尖膜におけるＮａ⁺チャネルの 細胞表面含量の調節に対する本作用薬を以下の方法で合成した。Ｂドメインはペ プシンを用いる標準的方法によって膀胱上皮細胞の細胞表面マーカーへの高い親 和性を有するモノクローナル抗体から調製し、そしてゲルろ過によって精製した (Martin，FJ; Hubbell，WL; and Papahadjopoulos，D，1981，Biochemistry 20 ，4229-4238)。ＥおよびＴドメインはボツリヌスニューロトキシン、血清型Ａか ら調整し、実施例７に示したように容易に結合し、そしてその実施例に述べたよ うにドメインＢに結合した。 アミロライド感受性Ｎａ⁺チャネルーのアルドステロン刺激増加における本作 用薬の効果を尿管系上皮細胞を用いて試験する。ラット膀胱から予備培養として 調製した（Johnson，MD; Bryan，GT; Reznikoff，CA; 1985，J Urol 133, 1076 - 1081）膀胱上皮細胞を３７℃で９０分間本作用薬の存在もしくは非存在下でイ ンキュベートした。次にアルドステロン処置細胞をアルドステロンに１時間露出 した。上述したように処置後、細胞を迅速に洗浄し、そして３７℃５分間のイン キュベーションでの²²Ｎａ⁺のアミロイド感受性の取り込みを測定した。 実施例１１ 本発明の他の実施例において、Ｂ−細胞による抗原提示を調節する作用薬が以 下の方法によって合成された。Ｂドメインは、ペプシンを用いる標準的方法を用 いてパンＥ細胞モノクローナル抗体ＬＬ２から調製し、そしてゲルろ過によって 精製した(Martin，FJ: Hubbell，WL & Papahadjopoulos，D，1981，Biochemistr y，20，4229-4238）。ＥおよびＴドメインはボツリヌスニューロトキシン、血清 型Ａから調整し、実施例３に述べたように容易に結合し、そしてその実施例に述 べたようにして同様にドメインＢに結合した。 抗原提示における作用薬の効果をマウスＢリンパ腫細胞株ＴＡ３を用いて試験 した。これらの細胞は初めに３７℃で９０分間本作用薬とともにインキュベート し、そして次にニワトリ卵リソチーム（ＨＥＬ）を添加し、３７℃で２時間イン キュベートした。次にＴＡ３細胞を固定しそしてＩ−Ａ^K−限定ＨＥＬ４６−６ １特異的Ｔ−細胞ハイブリドーマ３Ａ９での培養前に洗浄した（Lorenz，RG & A llen，PM，1989，Nature 337，560）。３Ａ９からの上清をＩＬ−２依存性細胞 株ＣＴＬＬの成長をサポートする能力について試験した。増殖応答は上清との２ 日間の培養に続く３時間の³Ｈチミジンの取り込みによって測定した。 上述した実施例は本発明の純粋に例証したものである。この３つのドメインの 如何なる組み合わせも本発明の範囲内にあることは当業者にとって明らかである はづである。本作用薬の合成において、本発明のＴ−Ｅ成分の標的成分への結合 は当業者に知られた試薬と技術を用いて化学的結合を経て達成される。このよう に、本実施例では専らＳＰＤＰ結合試薬を用いたけれども、試薬の標的成分に共 有結合で接着する標的成分と共有的に結びつくことができ、当業者に知られてい るる全ての他の結合試薬が本発明の範囲をカバーされる。同様に、本作用薬の作 用薬全てあるいは断片のいずれかをコードするＤＮＡは容易に構築され、適切な 生物に発現されたとき、本作用薬あるいは本作用薬の断片を生産するためにもち いることができることは当業者には明かなことである。当業者に知られた技術に よって得られる本発明の作用薬のそのような遣伝子工学的構築物も本発明の範囲 として同様にカバーされる。 工業的有用性 本発明で述べられた本作用薬は、インビボで直接にあるいは薬理学的に受け入 れられる塩としてあるいはエステルとして様々な病的状態の処置の方法に用いる ことができる。 例えば、本作用薬の一形態は、ある細胞によるグルコースの取り込みを制限す ることによってグルコース代謝疾患の処置の方法に用いることができる。この特 異的な例は、本作用薬の一形態の使用で、脂肪細胞によるグルコース取り込みを 制限し、これらの細胞における脂肪の蓄積を減少させる臨床的な肥満の処置方法 があるだろう。 他の実施例において、本作用薬の一形態は腎臓細胞によるイオン取り込みを調 節することによりこれらの器官から体液の排泄を調節し高血圧を処置する方法に 用いることができる。 また他の実施例では、本発明の一形態は炎症応答のトリガーである外部シグナ ルへの標的細胞の応答を制御することによって炎症の処置の方法に用いることが できる。 また他の実施例において、本作用薬の一形態は免疫系の効果細胞への抗原提示 細胞によるペプチド配列の提示を制御することによる免疫疾患のための処置の方 法に用いることができる。 本結果は３回の結果の平均値±ＳＥＭであるそして１０分のインキュベーショ ンの間に細胞単層によって取り込まれた全ｄｐｍとして現す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年８月１９日 【補正内容】 実施例１ ３Ｔ３−ＬＴ繊維芽細胞を分散液中でトリプシン処理し、１μＭのボツリヌス ニューロトキシンＢ（ＢＯＮＴ−Ｂ）の存在下ないし非存在下において、キャパ シタンスエクステンダー（capacitance extender）を備えたバイオラッド社のジ ーンパルサーを用いて１１−１１．５ｍｓｅｃｓで一定時間，３００Ｖ／ｃｍ、 ９６０ｍＦ通電(electroporate)した。通電後細胞を吸着させそして72時間24穴 プレート中で３７℃で単層培養を維持した。次に細胞を洗浄しそして５ｎＭイン シュリン様成長因子タイプ１(ＩＧＦ−１)の存在もしくは非存在下で３７℃で５ 分間インキュベートしその後氷上に５分間放置した。細胞から上清を吸引しそし て氷冷１.５ｎＭ 125Ｉ−トランスフェリン(特異活性４７Ｔｂｇ／ｍｍｏｌ)で 置換した。非特異的結合を非放射性トランスフェリンの１００倍モル濃度の添加 下で平衡化してインキュベートして概算した。２時間後上清が除去され、氷冷緩 衝液で３回洗浄し細胞層を１Ｎ ＮａＯＨ中で消化した。そしてＬＫＢ１２７５ ミニガンマガンマカウンターを用いて結合¹²⁵Ｉトランスフェリンを測定した。 トランスフェリン結合のアップレギュレーションはＩＧＦ−１の存在下における 特異的¹²⁵Ｉ−トランスフェリン結合を計算しＩＧＦ−１の存在しない条件での 特異的結合に対するパーセンテージとして表示した。 表１は、対照に比較してＢｏＮＴ−Ｂで処理した細胞においてＩＧＦへの応答 を示す¹²⁵Ｉ−トランスフェリン結合の上昇が減少することを示す。これは３Ｔ ３−ＬＩ繊維芽細胞の細胞質ゾルへのＢｏＮＴ−Ｂの挿入がこれら挿入細胞にお けるトランスフェリン受容体のＩＧＦ−１剌激アップレギュレーションを阻害す ることを示す。 ３Ｔ３−ＬＩ繊維芽細胞消化物から抽出されたトライトン−Ｘ−１１４−可溶 性タンパク質は、神経分泌細胞の分泌小胞蛋白質中に同定されるペプチド配列Ｓ ＥＱ．ＩＤ．１（ＱＱＴＱＡＱＶＤＥＶＶＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬ ＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＱＡＧＡＳＱＦＥＴＳＡＡＫＬＫＲＫＹＷＷＫＮＬＫ）に 対して作成したポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロットで分析した。こ の抗小胞抗体は神経分泌活性は有さず、ＢｏＮＴ−Ｂ−処置繊維芽細胞からのサ ンプルに明白な２重バンドを示し反応性の減少を示した。このように、ＢｎＮＴ −Ｂはトランスフェリン受容体のアップレギュレーションを阻害し同時に３Ｔ３ −ＬＴ繊維芽細胞における小胞構造（多分ＲＭＶ）を修飾する。 実施例２ ３Ｔ３繊維芽細胞が実施例１に示されたのと同一条件を用いて０．５μＭ ボ ツリヌスニューロトキシン−Ａ（ＢｏＮＴ−Ａ）の存在下および非存在下で通電 された。¹²⁵Ｉ−トランスフェリン結合のＩＧＦ−１剌激を実施例１に述べたよ うにして処置と未処置中で分析した。 表２の結果は、３Ｔ３−ＬＩ繊維芽細胞のＢｏＮＴ−Ａ処置がＩＧＦ−１に応 答して見られた¹²⁵Ｉ−トランスフェリン結合のアップレギュレーションを消失 することを示す。これは３Ｔ３−ＬＩ繊維芽細胞の細胞質ゾル中へのＢｏＮＴ− Ａの挿入が、これらの細胞におけるトランスフェリン受容体のＩＧＦ−１剌激ア ップレギュレーションを阻害することを示す。 実施例３ ３Ｔ３繊維芽細胞が実施例１で行われたのと同一の条件を用いて０．５μＭの ＢｏＮＴ−ＡのＨ₂Ｌ−断片（Ｈ₂−Ａ）の存在もしくは非存在下で通電された。 この断片は、トシルフェニルアラニンクロロメタン処置トリプシンを用いて限定 タンパク質分解によってＣボツリヌスのニューロトキシン、抗原型Ａから作成し た。 Ｈ₂Ｌ複合体は次にセファデックスＧ−２００上でのクロマトグラフィーによっ て精製した(Shone，CC:Hambleton，P: & Melling，J; 1985．Eur J Biochem 151 ，17-82)。処置そして未処置細胞における¹²⁵Ｉ−トランスフェリン結合のＩＧ Ｆ −１剌激の測定であるので実施例１に述べたように通電を行った。 表３の結果は、３Ｔ３−ＬＩ繊維芽細胞のＨ2Ｌ処置がＩＧＦ−１への応答に 見られたように¹²⁵Ｉ−トランスフェリンの結合のアップレギュレーションを阻 害することを示す。これは３Ｔ３−ＬＩ繊維芽細胞の細胞質中へのボツリヌスニ ューロトキシン−Ａ Ｈ₂−Ａ断片の挿入がこれらの細胞におけるトランスフェ リン受容体のＩＧＦ−１が剌激するアップレギュレーションを阻害することを示 す。 それ故、記述されたようにボツリヌスニューロトキシン−Ａと３Ｔ３−ＬＩ脂肪 細胞のインキュベーションは［3Ｈ］２−デオキシグルコース輸送のインシュリ ン−剌激化アップレギュレーションの顕著な抑制を引き起こすと言う、本研究の 発見は驚くべきことである（表４）。脂肪細胞中のグルコース輸送のインシュリ ン−アップレギュレーションは細胞内プール（ＲＭＶｓ）から細胞表面へのグル コーストランスポーター（transporter）タンパク質の移動の結果であると知ら れている。このように、本結果は、ボツリヌスニューロトキシン−Ａが脂肪細胞 の細胞表面へのＲＭＶｓ中でのグルコーストランスポーターのインシュリン剌激 化移動を阻害することを示している。 実施例５ ３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞がトリプシン処理されそして本細胞の分散液がボツリヌ スＢの存在もしくは非存在下（０．３２μＭ）でエレクトロポレートされた。９ ６０ｍＦキャパシターが３００Ｖ／ｃｍのパルス強度をもたらすエレクトロポレ ーション(electroporation)のために用いられた；通電時間は１１−１２ｍｓで あった。エレクトロポレーション後細胞は洗浄し、そして培地と血清とともに６ 穴プレートに植えられた。細胞を湿潤雰囲気中（空気／ＣＯ₂：９２．５％／７ ．５％）７２時間３７℃でインキュベートした。インキュベートの終わりに細胞 は洗浄しそして０．１Ｎ ＮａＯＨで抽出した。抽出物を０．１Ｎ ＨＣｌでの 中和後、膜タンパク質はトリトンＸ−１１４中で分配され、そして続いて実施例 １に述べた抗小胞抗体を用いてウエスタンブロッテイングによって分析した。脂 肪細胞の細胞質ゾル中へのボツリヌスニューロトキシンのエレクトロポレーショ ンで、ニューロトキシンＢ処置細胞からのサンプルについて明確な２重のバンド が得られこれにもとづき抗体の反応性の減少を証拠づけるように、小胞（恐らく ＲＭＶ）の構造の修飾をもたらすと言う、本研究の発見は驚くべきことである。 実施例６ 本実施例において、作用薬は、脂肪細胞のインシュリン依存性グルコース輸送 の細胞表面発現を制御するために合成される。 結合したＥ−Ｔ生成物はカリウム燐酸緩衝液ｐＨ７．０を用いるセファデックス Ｇ−１５０上でのサイズエッスクルージョンクロマトグラフィー(size exclusio n chromatography)によって精製した。最後に、ドメインＢはＮ−スクシンイミ ジル ３−（２−ピリジロチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）を用いてＥ−Ｔ結 合体に結合した。Ｅ−Ｔ複合体（５ｍｇ）を燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の１ｍｌ に溶解し、そしてこれに０．５ｍｌの無水エタノールに溶解したＳＰＤＰの２０ ０ｍｇを添加する。混合物を３０分間室温で反応させた後、２−ピリジルジスル フィド−置換ペプチドをセファデックスＧ２５を通してのゲル濾過によって過剰 のＳＰＤＰから分離した。ドメインＢも、低濃度のＳＰＤＰ（０．２ｍｌのエタ ノール中に２０ｍｇ）を用いた点を除き同様に処理した。置換ドメインＢはセフ ァデックスＧ２５カラムから再び集められそして次に０．０５Ｍの最終濃度にジ チオトレイトールを添加して還元した。過剰の還元剤はセファデックスＧ２５上 のゲル濾過によて除去される。置換Ｅ−Ｔ複合体と置換されたおよび還元された ドメインＢの等量（Ｗ／Ｗ）が次に混合され４℃で１８時間放置された。次にこ の作用薬がカリウム燐酸緩衝液ｐＨ７．０を用いるセファデックスＧ−１５０上 のクロマトグラフィーによって精製した。 上述したようにして調製した作用薬は、次に３Ｔ３−Ｌｉ脂肪細胞中でのグル コーストランスポート発現のインシュリン剌激化増加を阻害する能力を試験した 。３Ｔ３−Ｌｉ脂肪細胞は３Ｔ３−Ｌｉ繊維芽細胞からデキサメタソン、３−イ ソブチル−１−メチルキサンチンおよびインシュリンを上述したように処理する ことによって分化する(Frost，SC & Lane MD，1985，J Biol Chem 260，2646-26 52)。そして分化開始後８日と１２日の間のものを用いる。細胞は作用薬の存在 下または不存在下３７℃で９０分間インキュベートする。次に細胞は各々の実験 のはじめに無血清ダルベッコ修飾イーグル培地中で２時間インキュベートした。 インシュリン処置細胞は次にストックの１．６×１０^-4Ｍ溶液から加えられる１ ０^-7Ｍインシュリンに１０分間暴露する。上述の処置後、細胞は３７℃でクレブ スリン ガー燐酸塩で迅速に洗浄し、そして１０^-7Ｍインシュリンの有りまたは無しで１ ０分間の３７℃でクレブスリンガー燐酸塩中の［3Ｈ］２−デオキシグルコース （１４．２ ＫＢｑ：１０ｍＭ）の取り込みを測定した。反応はグルコース溶液 の吸引と氷冷燐酸緩衝食塩水による迅速な洗浄によって停止され、そして細胞は ０．２Ｍ水酸化ナトリウムを加えて溶解した。溶液はワラック１４１０液体シン チレーションカウンターを用いるオプチフェーズシンチラント中でのシンチレー ション計測に先だって０．２ＭＨＣｌの添加によって中和される。 【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年２月２１日 【補正内容】 請求の範囲 １．下記の方法によって連結した３つのドメインＢ、ＴおよびＥからなるもので あって、リサイクル性の膜小胞（Recyclable Membrane Vesicle、ＲＭＶｓ）中 の細胞膜への完全な膜タンパク質類（Integral Membrane Proteins、ＩＭＰｓ） の輸送を制御することによって細胞の外部環境と細胞の相互作用を制御する作用 薬。 ドメインＢ--ドメインＴ--ドメインＥ ここで ドメインＢは、エンドソームに取り込まれエンドサイトーシスを受ける細胞の結 合部位に本作用薬を結合する結合ドメインである。 ドメインＴは、エンドソーム内からエンドソーム膜を通過して細胞の細胞質ゾル 中に本作用薬（結合部位とともにもしくは無しに）を輸送する輸送ドメインであ る。 ドメインＥは、細胞の表面にＩＭＰｓを輸送する本ＲＭＶｓの能力を阻害しかつ Ｚｎ⁺⁺依存性メタロプロテアーゼ活性を有するクロストリジアルニューロトキシ ンの軽鎖のドメインあるいはドメイン断片である効果ドメインである。 ２．ドメインＴがクロストリジアルニューロトキシン重鎖のドメインまたはドメ イン断片である請求項１の作用薬。 ３．ドメインＥがボツリヌスニューロトキシンから得られる請求項１または２に に記載の作用薬。 ４．ドメインＥがボツリヌスニューロトキシンタイプＡから得られる前記いずれ かの請求項に記載の作用薬。 ５．ドメインＥがボツリヌスニューロトキシンタイプＢから得られる請求項１か ら３のいずれかに記載の作用薬。 ６．ドメインＴがクロストリジアルニューロトキシンの重鎖のアミノ末端部分で ある、前記の請求項のいずれかに記載の作用薬。 ７．ドメインＴがトリプシンを用いたタンパク質分解酵素切断によって得られる クロストリジアルニューロトキシンの重鎖のアミノ末端部分である、前記の請求 項のいずれかに記載の作用薬。 ８．ドメインＴがボツリヌスニューロトキシンから得られる、前記の請求項のい ずれかに記載の作用薬。 ９．ドメインＴがボツリヌスニューロトキシンタイプＡから得られる、前記の請 求項のいずれかに記載の作用薬。 １０．ドメインＴがボツリヌスニューロトキシンタイプＢによって得られる、請 求項１−８のいずれかに記載の作用薬。 １１．下記の方法で互いに連結した３つのドメインＢ，ＴそしてＥからなる前記 の請求項のいずれかに記載の作用薬。 ドメインＢ--Ｘ--ドメインＴ--Ｘ--ドメインＥ ここでＸは共有結合で連結したスペーサー分子あるいは直接に共有結合で連結す るが、少なくとも一つのＸはスペーサー分子である。 １２．ドメインＢが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける ことができる標的細胞上の細胞表面受容体（acceptor）へのリガンドからなる、 前記の請求項のいずれかに記載の作用薬。 １３．ドメインＢが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける ことができる標的細胞上の細胞表面受容器（receptor）へのリガンドからなる、 前記の請求項のいずれかに記載の作用薬。 １４．ドメインＢが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける ことができる標的細胞上の表面抗原へのモノクローナル抗体もしくはモノクロー ナル抗体から誘導されるからなる、前記の請求項のいずれかに記載の作用薬。 １５．ドメインＢ、結合ドメインが、特定の細胞タイプに特徴的である結合部位 に結合する、前記の請求項のいずれかに記載の作用薬。 １６．ドメインＢが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける ことができる脂肪細胞上の結合部位へのリガンドであって、インスリンに応答し て脂肪細胞によるグルコース取り込みの速度に影響する、前記の請求項のいずれ かに記載の作用薬。 １７．ドメインＢが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける ことができる好中球の結合部位へのリガンドであって補体断片Ｃ３ｂへの好中球 の応答性に影響する、請求項１−１５のいずれかに記載の作用薬。 １８．ドメインＢが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける ことができる好中球の結合部位へのリガンドであって吸着分子Ｍａｃ−１の好中 球による発現に影響を与える、請求項１−１５のいずれかに記載の作用薬。 １９．ドメインＢが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける ことができる抗原提示細胞上の結合部位へのリガンドであって抗原提示細胞によ る抗原の提示に影響を与える、請求項１−１５のいずれかに記載の作用薬。 ２０．ドメインＢが、インスリン様成長ホルモンIIのリガンドである請求項１６ の作用薬。 ２１．ドメインＢが吸着分子ｐ１５０，９５へのモノクローナル抗体もしくはモ ノクローナル抗体から誘導される請求項１７または１８の作用薬。 ２２．ドメインＢが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける ことができ抗原提示細胞上で表面抗原へのモノクローナル抗体もしくはモノクロ ーナル抗体から誘導されるところの請求項１９の作用薬。 ２３．ドメインＢがインスリン様成長ホルモンIIである請求項２０の作用薬。 ２４．ドメインＢがモノクローナル抗体ＳＨＣＬ３であるかまたはそれから誘導 される請求項２１の作用薬。 ２５．ドメインＢがモノクローナル抗体ＬＬ２であるかまたはそれから誘導され る請求項２２の作用薬。 ２６．ドメインＢがインスリン様成長因子IIであり、ドメインＴがトリプシンを 用いるタンパク質分解酵素切断によって得られたボツリヌスニューロトキシンタ イプＡの重鎖のアミノ末端部位でありそしてドメインＥがボツリヌスニューロト キシンタイプＡの軽鎖である請求項２３の作用薬。 ２７．ドメインＢがモノクローナル抗体ＳＨＣＬ３であり、ドメインＴがトリプ シンを用いるタンパク質分解酵素切断によって得られたボツリヌスニューロトキ シンタイプＡの重鎖のアミノ末端部位であり、そしてドメインＥがボツリヌスニ ューロトキシンタイプＡの軽鎖である請求項２３の作用薬。 ２８．ドメインＢが、モノクローナル抗体ＬＬ２であり、ドメインＴがトリプシ ンを用いるタンパク質分解酵素切断によって得られたボツリヌスニューロトキシ ンタイプＡの重鎮のアミノ末端部位であり、そしてドメインＥがボツリヌスニュ ーロトキシンタイプＡの軽鎖である請求項２５の作用薬。 ２９．下記の方法において３つのドメインＢ，ＴそしてＥの共有結合による接着 からなる先行する請求項のいずれかに記載の作用薬を得るための方法。 ドメインＢ--ドメインＴ--ドメインＥ ３０．下記方法において３つのドメインＢ，ＴおよびＥが共有結合による接着か らなる請求項１から２５のいずれかに記載の作用薬を得るための方法； ドメインＢ--Ｘ--ドメインＴ--Ｘ--ドメインＥ ここでＸは共有結合で連結したスペーサー分子あるいは直接に共有結合で連結す るが、少なくとも一つのＸはスペーサー分子である。 ３１．本作用薬をコードする遣伝的構築物を構築し、宿主生物に前記構築物を組 み込みそして本作用薬を生産するように構築物を発現させる請求項１から２８の 請求項にいずれかに記載の作用薬を得る方法。 ３２．１から２８の請求項のいずれかに記載の作用薬を適用することからなる、 ＲＭＶｓ中にある細胞膜へのＩＭＰｓの輸送を制御することからなる細胞の外部 環境と細胞の相互作用を制御する方法。 ３３．１から２８の請求項のいずれかに記載の作用薬を適用することからなる、 細胞膜を通過しての代謝物の輸送に応答するＩＭＰのレベルを制御し、その結果 として、細胞を通って代謝物の輸送をあるいは細胞内の代謝物の有用性を制御す る方法。 ３４．１から２８の請求項のいずれかに記載の作用薬を適用することからなる、 イオンに対する細胞の原形質膜の選択的透過性に応答するＩＭＰのレベルを制御 し、細胞内イオンの濃度を転調する方法。 ３５．１から２８の請求項のいずれかに記載の作用薬を適用することからなる、 信号分子の認識に応答しＩＭＰのレベルを制御し、信号分子の細胞への認識性を 転調する方法。 ３６．１から２８の請求項のいずれかに記載の作用薬を適用することからなる、 信号分子の膜への結合につながる細胞膜を通過しての信号の伝達に応答するＩＭ Ｐのレベルを制御し、信号分子への細胞の応答性を転調する方法。 ３７．１から２８の請求項のいずれかに記載された作用薬を適用することからな る、摂取された抗原から誘導したペプチド断片の細胞表面での描写に応答するＩ ＭＰのレベルを制御する方法。 ３８．グルコース代謝疾患の処置のための医薬として１から２８の請求項のいず れかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入れられる塩の使用。 ３９．臨床的肥満の処置のための医薬として１から２８の請求項のいずれかに記 載された作用薬のいずれかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入 れられる塩の使用。 ４０．高血圧の処置のための医薬として、１から２８の請求項のいずれかに記載 された作用薬のいずれかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入れ られる塩の使用。 ４１．炎症疾患の処置のための医薬として、１から２８の請求項のいずれかに記 載された作用薬のいずれかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入 れられる塩の使用。 ４２．免疫系疾患の処置のための医薬として、１から２８の請求項のいずれかに 記載された作用薬のいずれかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け 入れられる塩の使用。 ４３．ＲＭＶｓ中の細胞膜へのＩＭＰｓの異常な輸送の状態の処置のための医薬 の製造において、１から２８の請求項のいずれかに記載の作用薬の使用。 ４４．グルコース代謝疾患の処置のための医薬の製造において、１から２８の請 求項のいずれかに記載の作用薬の使用。 ４５．臨床的肥満の処置のための医薬の製造において、１から２８の請求項のい ずれかに記載の作用薬の使用。 ４６．高血圧の処置のための医薬の製造において、１から２８の請求項のいずれ かに記載の作用薬の使用。 ４７．炎症疾患の処置のための医薬の製造において、１から２８の請求項のいず れかに記載の作用薬の使用。 ４８．免疫系疾患の処置のための医薬の製造において、１から２８の請求項のい ずれかに記載の作用薬の使用。 ４９．１から２８の請求項のいずれかに記載の作用薬を有効投与量を投与するこ とからなるグルコース代謝疾患の処置の方法。 ５０．１から２８の請求項のいずれかに記載の作用薬を有効投与量を投与するこ ることからなる臨床的肥満の処置の方法。 ５１．１から２８の請求項のいずれかに記載の作用薬を有効投与量を投与するこ ることからなる高血圧の処置の方法。 ５２．１から２８の請求項のいずれかに記載の作用薬を有効投与量を投与するこ ることからなるとからなる炎症性疾患の処置の方法。 ５３．１から２８の請求項のいずれかに記載の作用薬を有効投与量を投与するこ ることからなる免疫系システムの疾患の処置の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ (72)発明者 ノース，ジョン ロバート イギリス ウィルツ エスピー４ ７イー ユー，アメスバリー，チャーチ ストリー ト，ジ オールド ヴィカリッジ (72)発明者 フォスター，ケイス アラン イギリス サリー ケーティ４ ８エック スジー，ウォーセスター パーク，オーク ス アベニュー137 (72)発明者 クイン，コンラッド パドレイグ イギリス ウィルツ エスピー１ ３キュ ーエス，サリスバリー，エス ティ フラ ンシス ロード36 (72)発明者 ショーン，クリフォード チャールズ イギリス ウィルツ エスピー５ ３ビー エヌ，アルダーバリー，オークウッド グ ローブ44

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．リサイクル性の膜小胞(Recyclable Membrane Vesicle、ＲＭＶｓ) 中の細胞 膜への完全な膜タンパク質類（Integral Membrane Proteins、ＩＭＰｓ）の輸送 を制御することによって細胞の外部環境と細胞の相互作用を制御する本作用薬。 ２．細胞膜を通過しての代謝物の輸送に応答するＩＭＰのレベルを制御し、その 結果として、細胞を通って代謝物の輸送をあるいは細胞内の代謝物の有用性を制 御する請求項１の作用薬。 ３．細胞膜を通過して細胞内外への代謝物の輸送に応答するＩＭＰのレベルを制 御し、その結果として、細胞を通って代謝物の輸送をあるいは細胞内の代謝物の 有用性を制御する請求項１の作用薬。 ４．イオンに対する細胞の原形質膜の選択的透過性に応答するＩＭＰのレベルを 制御し、細胞内イオンの濃度を転調する請求項１の作用薬。 ５．信号分子の認識に応答するＩＭＰのレベルを制御し、信号分子の細胞への認 識性を転調する請求項１の作用薬。 ６．信号分子の膜への結合につながる細胞膜を通過しての信号の伝達に応答する ＩＭＰのレベルを制御し、信号分子への細胞の応答性を転調する請求項１の作用 薬。 ７．摂取された抗原から誘導したペプチド断片の細胞表面での描写に応答するＩ ＭＰのレベルを制御する請求項１の作用薬。 ８．標的化細胞タイプに対する標的化特性を有し、作用薬の有効範囲を該細胞タ イプに限定する、前記記載のいずれかの作用薬。 ９．下記の方法によって連結した３つのドメインＢ、ＴおよびＥからなる前記記 載のいずれかの作用薬。 ドメインＢ--ドメインＴ--ドメインＥ ここで ドメインＢは、エンドサイトーシスを受ける細胞の結合部位に本作用薬を結合し てエンドソームを生成する結合ドメインである。 ドメインＴは、エンドソーム内からエンドソーム膜を通して細胞の細胞質ゾル中 に本作用薬（結合部位とともにもしくは無しに）を輸送する輸送ドメインである 。 ドメインＥは、細胞の表面にＩＭＰｓを輸送する本ＲＭＶｓの能力を阻害する効 果ドメインである。 １０．下記の方法で互いに連結した３つのドメインＢ，ＴそしてＥからなる請求 項９の作用薬。 ドメインＢ--Ｘ--ドメインＴ--Ｘ--ドメインＥ ここでＸはスペーサー分子あるいは共有結合、ただし少なくとも一つのＸはスペ ーサー分子である。 １１．ドメインＢが、特殊な細胞タイプに特徴的な結合部位に結合する結合ドメ インである請求項９または１０の作用薬。 １２．ドメインＢがエンドサイトーシスを受け、エンドソームを生成する標的細 胞上の表面抗原に対するモノクローナル抗体からなり、ドメインＴが得られたエ ンドソームから細胞の細胞質ゾルへ作用薬を輸送するトキシン分子のドメインま たはドメイン断片からなり、ドメインＥが、Ｚｎ⁺⁺依存性タンパク質分解活性で ドメインＴと機能的に異なるトキシン分子のドメインまたはドメイン断片からな る、前記のいずれかの請求項に記載の作用薬。 １３．ドメインＢが、エンドサイトーシスを受け、エンドソームを生成する標的 細胞上の細胞表面受容体へのリガンドからなり、ドメインＴが得られたエンドソ ームから細胞の細胞質ゾルへ作用薬を輸送するトキシン分子のドメインまたはド メイン断片からなり、ドメインＥが、Ｚｎ⁺⁺依存性タンパク質分解活性でドメイ ンＴと機能的に異なるトキシン分子のドメインまたはドメイン断片からなる、前 記のいずれかの請求項に記載の作用薬Ｑ １４．ドメインＢがインシュリン様成長因子へのリガンドであり、ドメインＴが 細胞膜を通ってトキシンの輸送に応答するボツリヌスニューロトキシン重鎖のド メインまたはドメイン断片であり、ドメインＥがＺｎ⁺⁺依存性メタロプロテアー ゼ活性をもつボツリヌスニューロトキシン軽鎖のドメインまたはドメイン断片で ある、インシュリンに応答における脂肪細胞によるグルコース取り込み速度に影 響する、請求項１３の作用薬。 １５．ドメインＴおよびＥがクロストリアルニューロトキシンから得られる請求 項９から１４のいずれかに記載の作用薬。 １６．下記の方法で３つのドメインＢ，ＴおよびＥが共有的に結合してなる前記 請求項のいずれかに記載の作用薬製造方法。 ドメインＢ--ドメインＴ--ドメインＥ ここで、ドメインＢが、エンドサイトーシスを受けエンドソームを生成する細胞 の結合部位に作用薬を結合する結合ドメインであり、ドメインＴが、エンドソー ム内からエンドソーム膜を通して細胞の細胞質ゾル中に本作用薬（結合部位とと もにもしくは無しに）を輸送する輸送ドメインであり、ドメインＥは、細胞の表 面にＩＭＰｓを輸送するＲＭＶｓの能力を阻害する効果ドメインである。 １７．下記の方法で３つのドメインＢ，ＴおよびＥが共有的に結合してなる請求 項１６の作用薬製造方法。 ドメインＢ--Ｘ--ドメインＴ--Ｘ--ドメインＥ ここで、Ｘはスペーサー分子あるいは共有結合、ただし少なくとも一つのＸはス ペーサー分子である。 １８．ドメインＢが特定の細胞タイプに特徴的である結合部位に結合する結合ド メインである、請求項１６または１７の製造方法。 １９．本作用薬をコードする遺伝的構築物を構築し、宿主生物に前記構築物を組 み込みそして本作用薬を生産するように構築物を発現させる請求項１から２８の 請求項にいずれかに記載の作用薬を製造する方法。 ２０．グルコース代謝疾患の処置のための医薬として前記請求項のいずれかに記 載の作用薬またはそれらの薬理学的に受け入れられる塩の使用。 ２１．臨床的肥満の処置のための前記請求項のいずれかに記載の作用薬のいずれ かに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入れられる塩の使用。 ２２．高血圧の処置のための前記請求項作用薬のいずれかに記載された作用薬ま たはそれらの薬理学的に受け入れられる塩の使用。 ２３．炎症疾患の処置のための前記請求項作用薬のいずれかに記載された作用薬 またはそれらの薬理学的に受け入れられる塩の使用。 ２４．免疫系疾患の処置のための前記請求項作用薬のいずれかに記載された作用 薬またはそれらの薬理学的に受け入れられる塩の使用。