JP2007302696A - 細胞活性を制御するための新規作用薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明による作用薬は以下の方法に従って結合した3つのドメインB、TそしてEからなる。
ドメインB--ドメインT--ドメインE
ここで
ドメインBは、エンドソーム(endosome)を形成するためエンドサイトーシスを受ける細胞表面への結合部位に作用薬を結合する結合ドメインである。
ドメインTはエンドソームからエンドソーム膜を通過して細胞の細胞質中に(結合部位有りもしくは無しに)作用薬を輸送する輸送ドメインである。
ドメインEは完全な膜タンパク質を細胞の表面に輸送するリサイクル性の膜小胞の能力を阻害する効果ドメインである。
【選択図】なし
Description
例としてヒスタミン受容体のH1とH2サブタイプの両方に特異的な抗ヒスタミン類そしてβ-アドレノセプターの拮抗剤がある。IMP機能の阻害剤も広く薬理学的作用物として用いられる。例として利尿性フロセミドとアミロライドのような膜内外イオン移送の阻害がある、後者は膀胱上皮尖細胞Na+チャネルの阻害剤である。カリウムチャネルの阻害剤は抗不整脈薬として開発下にあることが知られている。細胞吸着IMPsは同様に選択的拮抗物質の開発のための最近の標的である。
さらに本発明は、IMPsを細胞の表面に輸送する能力を阻害するようなリサイクル性膜小胞(Recycle Membrane Vesicle)(RMVs)の構造を修飾する新規作用薬を提供する。
下記の用語は以下の意味を有する;
先に述べたように、IMP活性の制御にアプローチする従来技術は細胞表面で一旦発現されたIMPの機能を転調することに主に焦点を当てている。これに対し、細胞表面で発現されるようになるIMPのレベルを転調する。
ドメインB、結合ドメインは、エンドサイトーシスを受けることができる標的細胞における結合部位に作用薬を結合する作用薬を含むエンドソームをもたらす。
ドメインT,輸送ドメインは、エンドソーム内から作用薬もしくは化合物の一部分をエンドソーム膜を通過して細胞の細胞質中に輸送する。
ドメインE、効果ドメインは、RMVsによる細胞の表面へのIMPsの輸送を阻害する ドメインBは標的細胞タイプに特異性をもつように作ることができる。特定の細胞タイプに作用薬を標的化する能力は熟練研究者では良く知られている。このように、ドメインBの機能は従来技術として知られている抗体類、モノクローナル抗体、抗体断片(Fab,F(ab)'2、Fv,単一鎖抗体類等)、ホルモン、サイトカイン、成長因子そしてレクチン類を含む多くの細胞結合分子の一つの使用によって達成されうる、しかしこれに限定されるものではない。
ドメインB--ドメインT--ドメインE
ドメインはドメイン間に適切なスペーサー領域を含む連結基によって共有結合で連結される。
本発明の一つの具体例においては、ドメインBはエンドサイトーシスを受ける標的細胞の結合部位に結合することができる結合分子である、ドメインTはボツリヌスニューロトキシンの重鎖あるいはそれの断片である、そしてドメインEはボツリヌスニューロトキシンの軽鎖あるいはそれの断片である。ドメインTとEはC.ボツリヌスの同じまたは異なった血清型からのものであってもよい。
このことは細胞中へのあるいは細胞を通過しての代謝物またはイオンの取り込みの減少、信号分子への標的細胞の応答の減少、あるいは生物体の免疫応答の変化を含む沢山の望ましい効果をもたらすことができる。
この断片は、トシルフェニルアラニンクロロメタン処置トリプシンを用いて限定タンパク質分解によってCボツリヌスのニューロトキシン、抗原型Aから作成した。
分化後7日目の3T3-L1の脂肪細胞は、濾過滅菌された血清を含むダルベッコの修飾イーグル培地中で希釈したボツリヌスニューロトキシン抗原型A(最終濃度BoNT A:200nM)で処理された。トキシン処理細胞と対照細胞は8%CO2中で45時間37℃でインキュベートした。次に細胞は2度洗浄しそして無血清ダルベッコの修飾イーグル培地中で2時間8%CO2中でインキュベートした、その後細胞はクレブスリンガー燐酸塩で洗浄しそしてクレブスリンガー燐酸塩(基準取り込み、basal uptake)あるいは100nMインシュリンを含むクレブスリンガー燐酸塩(刺激された取り込み)中で37℃15分間インキュベートした。
表面に結合したFTTCをリシスIIソフトウエアーを備え付けたFACscan(ベクトンデイッキンソン)を用いてフローサイトメトリーによって分析した。
例えば、本作用薬の一形態は、ある細胞によるグルコースの取り込みを制限することによってグルコース代謝疾患の処置の方法に用いることができる。この特異的な例は、本作用薬の一形態の使用で、脂肪細胞によるグルコース取り込みを制限し、これらの細胞における脂肪の蓄積を減少させる臨床的な肥満の処置方法があるだろう。
[提出日]1994年8月19日
[補正内容]
実施例1
3T3−LT繊維芽細胞を分散液中でトリプシン処理し、1μMのボツリヌス
ニューロトキシンB(BONT−B)の存在下ないし非存在下において、キャパ
シタンスエクステンダー(capacitance extender)を備えたバイオラッド社のジ
ーンパルサーを用いて11−11.5msecsで一定時間,300V/cm、
960mF通電(electroporate)した。通電後細胞を吸着させそして72時間24穴
プレート中で37℃で単層培養を維持した。次に細胞を洗浄しそして5nMイン
シュリン様成長因子タイプ1(IGF−1)の存在もしくは非存在下で37℃で5
分間インキュベートしその後氷上に5分間放置した。細胞から上清を吸引しそし
て氷冷1.5nM 125I−トランスフェリン(特異活性47Tbg/mmol)で
置換した。非特異的結合を非放射性トランスフェリンの100倍モル濃度の添加
下で平衡化してインキュベートして概算した。2時間後上清が除去され、氷冷緩
衝液で3回洗浄し細胞層を1N NaOH中で消化した。そしてLKB1275
ミニガンマガンマカウンターを用いて結合125Iトランスフェリンを測定した。
トランスフェリン結合のアップレギュレーションはIGF−1の存在下における
特異的125I−トランスフェリン結合を計算しIGF−1の存在しない条件での
特異的結合に対するパーセンテージとして表示した。
表1は、対照に比較してBoNT−Bで処理した細胞においてIGFへの応答
を示す125I−トランスフェリン結合の上昇が減少することを示す。これは3T
3−LI繊維芽細胞の細胞質ゾルへのBoNT−Bの挿入がこれら挿入細胞にお
けるトランスフェリン受容体のIGF−1剌激アップレギュレーションを阻害す
ることを示す。
3T3−L1繊維芽細胞消化物から抽出されたトライトン−X−114−可溶
性タンパク質は、神経分泌細胞の分泌小胞蛋白質中に同定されるペプチド配列S
EQ.ID.1(QQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKL
SELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLK)に
対して作成したポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロットで分析した。こ
の抗小胞抗体は神経分泌活性は有さず、BoNT−B−処置繊維芽細胞からのサ
ンプルに明白な2重バンドを示し反応性の減少を示した。このように、BnNT
−Bはトランスフェリン受容体のアップレギュレーションを阻害し同時に3T3
−LT繊維芽細胞における小胞構造(多分RMV)を修飾する。
実施例2
3T3繊維芽細胞が実施例1に示されたのと同一条件を用いて0.5μM ボ
ツリヌスニューロトキシン−A(BoNT−A)の存在下および非存在下で通電
された。125I−トランスフェリン結合のIGF−1剌激を実施例1に述べたよ
うにして処置と未処置中で分析した。
表2の結果は、3T3−L1繊維芽細胞のBoNT−A処置がIGF−1に応
答して見られた125I−トランスフェリン結合のアップレギュレーションを消失
することを示す。これは3T3−L1繊維芽細胞の細胞質ゾル中へのBoNT−
Aの挿入が、これらの細胞におけるトランスフェリン受容体のIGF−1剌激ア
ップレギュレーションを阻害することを示す。
実施例3
3T3繊維芽細胞が実施例1で行われたのと同一の条件を用いて0.5μMの
BoNT−AのH2L−断片(H2−A)の存在もしくは非存在下で通電された。
この断片は、トシルフェニルアラニンクロロメタン処置トリプシンを用いて限定
タンパク質分解によってCボツリヌスのニューロトキシン、抗原型Aから作成し
た。
H2L複合体は次にセファデックスG−200上でのクロマトグラフィーによっ
て精製した(Shone,CC:Hambleton,P: & Melling,J; 1985.Eur J Biochem 151
,17-82)。処置そして未処置細胞における125I−トランスフェリン結合のIG
F−1剌激の測定であるので実施例1に述べたように通電を行った。
表3の結果は、3T3−L1繊維芽細胞のH2L処置がIGF−1への応答に
見られたように125I−トランスフェリンの結合のアップレギュレーションを阻
害することを示す。これは3T3−L1繊維芽細胞の細胞質中へのボツリヌスニ
ューロトキシン−A H2−A断片の挿入がこれらの細胞におけるトランスフェ
リン受容体のIGF−1が剌激するアップレギュレーションを阻害することを示
す。
それ故、記述されたようにボツリヌスニューロトキシン−Aと3T3−L1脂肪
細胞のインキュベーションは[3H]2−デオキシグルコース輸送のインシュリ
ン−剌激化アップレギュレーションの顕著な抑制を引き起こすと言う、本研究の
発見は驚くべきことである(表4)。脂肪細胞中のグルコース輸送のインシュリ
ン−アップレギュレーションは細胞内プール(RMVs)から細胞表面へのグル
コーストランスポーター(transporter)タンパク質の移動の結果であると知ら
れている。このように、本結果は、ボツリヌスニューロトキシン−Aが脂肪細胞
の細胞表面へのRMVs中でのグルコーストランスポーターのインシュリン剌激
化移動を阻害することを示している。
実施例5
3T3−L1脂肪細胞がトリプシン処理されそして本細胞の分散液がボツリヌ
スBの存在もしくは非存在下(0.32μM)でエレクトロポレートされた。9
60mFキャパシターが300V/cmのパルス強度をもたらすエレクトロポレ
ーション(electroporation)のために用いられた;通電時間は11−12msで
あった。エレクトロポレーション後細胞は洗浄し、そして培地と血清とともに6
穴プレートに植えられた。細胞を湿潤雰囲気中(空気/CO2:92.5%/7
.5%)72時間37℃でインキュベートした。インキュベートの終わりに細胞
は洗浄しそして0.1N NaOHで抽出した。抽出物を0.1N HClでの
中和後、膜タンパク質はトリトンX−114中で分配され、そして続いて実施例
1に述べた抗小胞抗体を用いてウエスタンブロッテイングによって分析した。脂
肪細胞の細胞質ゾル中へのボツリヌスニューロトキシンのエレクトロポレーショ
ンで、ニューロトキシンB処置細胞からのサンプルについて明確な2重のバンド
が得られこれにもとづき抗体の反応性の減少を証拠づけるように、小胞(恐らく
RMV)の構造の修飾をもたらすと言う、本研究の発見は驚くべきことである。
実施例6
本実施例において、作用薬は、脂肪細胞のインシュリン依存性グルコース輸送
の細胞表面発現を制御するために合成される。
結合したE−T生成物はカリウム燐酸緩衝液pH7.0を用いるセファデックス
G−150上でのサイズエッスクルージョンクロマトグラフィー(size exclusio
n chromatography)によって精製した。最後に、ドメインBはN−スクシンイミ
ジル 3−(2−ピリジロチオ)プロピオン酸塩(SPDP)を用いてE−T結
合体に結合した。E−T複合体(5mg)を燐酸緩衝食塩水(PBS)の1ml
に溶解し、そしてこれに0.5mlの無水エタノールに溶解したSPDPの20
0mgを添加する。混合物を30分間室温で反応させた後、2−ピリジルジスル
フィド−置換ペプチドをセファデックスG25を通してのゲル濾過によって過剰
のSPDPから分離した。ドメインBも、低濃度のSPDP(0.2mlのエタ
ノール中に20mg)を用いた点を除き同様に処理した。置換ドメインBはセフ
ァデックスG25カラムから再び集められそして次に0.05Mの最終濃度にジ
チオトレイトールを添加して還元した。過剰の還元剤はセファデックスG25上
のゲル濾過によて除去される。置換E−T複合体と置換されたおよび還元された
ドメインBの等量(W/W)が次に混合され4℃で18時間放置された。次にこ
の作用薬がカリウム燐酸緩衝液pH7.0を用いるセファデックスG−150上
のクロマトグラフィーによって精製した。
上述したようにして調製した作用薬は、次に3T3−L1脂肪細胞中でのグル
コーストランスポート発現のインシュリン剌激化増加を阻害する能力を試験した
。3T3−L1脂肪細胞は3T3−L1繊維芽細胞からデキサメタソン、3−イ
ソブチル−1−メチルキサンチンおよびインシュリンを上述したように処理する
ことによって分化する(Frost,SC & Lane MD,1985,J Biol Chem 260,2646-26
52)。そして分化開始後8日と12日の間のものを用いる。細胞は作用薬の存在
下または不存在下37℃で90分間インキュベートする。次に細胞は各々の実験
のはじめに無血清ダルベッコ修飾イーグル培地中で2時間インキュベートした。
インシュリン処置細胞は次にストックの1.6×10-4M溶液から加えられる1
0-7Mインシュリンに10分間暴露する。上述の処置後、細胞は37℃でクレブ
スリン
ガー燐酸塩で迅速に洗浄し、そして10-7Mインシュリンの有りまたは無しで1
0分間の37℃でクレブスリンガー燐酸塩中の[3H]2−デオキシグルコース
(14.2 KBq:10mM)の取り込みを測定した。反応はグルコース溶液
の吸引と氷冷燐酸緩衝食塩水による迅速な洗浄によって停止され、そして細胞は
0.2M水酸化ナトリウムを加えて溶解した。溶液はワラック1410液体シン
チレーションカウンターを用いるオプチフェーズシンチラント中でのシンチレー
ション計測に先だって0.2MHClの添加によって中和される。
[手続補正書]特許法第184条の8
[提出日]1995年2月21日
[補正内容]
請求の範囲
1.下記の方法によって連結した3つのドメインB、TおよびEからなるもので
あって、リサイクル性の膜小胞(Recyclable Membrane Vesicle、RMVs)中
の細胞膜への完全な膜タンパク質類(Integral Membrane Proteins、IMPs)
の輸送を制御することによって細胞の外部環境と細胞の相互作用を制御する作用
薬。
ドメインB--ドメインT--ドメインE
ここで
ドメインBは、エンドソームに取り込まれエンドサイトーシスを受ける細胞の結
合部位に本作用薬を結合する結合ドメインである。
ドメインTは、エンドソーム内からエンドソーム膜を通過して細胞の細胞質ゾル
中に本作用薬(結合部位とともにもしくは無しに)を輸送する輸送ドメインであ
る。
ドメインEは、細胞の表面にIMPsを輸送する本RMVsの能力を阻害しかつ
Zn++依存性メタロプロテアーゼ活性を有するクロストリジアルニューロトキシ
ンの軽鎖のドメインあるいはドメイン断片である効果ドメインである。
2.ドメインTがクロストリジアルニューロトキシン重鎖のドメインまたはドメ
イン断片である請求項1の作用薬。
3.ドメインEがボツリヌスニューロトキシンから得られる請求項1または2に
に記載の作用薬。
4.ドメインEがボツリヌスニューロトキシンタイプAから得られる前記いずれ
かの請求項に記載の作用薬。
5.ドメインEがボツリヌスニューロトキシンタイプBから得られる請求項1か
ら3のいずれかに記載の作用薬。
6.ドメインTがクロストリジアルニューロトキシンの重鎖のアミノ末端部分で
ある、前記の請求項のいずれかに記載の作用薬。
7.ドメインTがトリプシンを用いたタンパク質分解酵素切断によって得られる
クロストリジアルニューロトキシンの重鎖のアミノ末端部分である、前記の請求
項のいずれかに記載の作用薬。
8.ドメインTがボツリヌスニューロトキシンから得られる、前記の請求項のい
ずれかに記載の作用薬。
9.ドメインTがボツリヌスニューロトキシンタイプAから得られる、前記の請
求項のいずれかに記載の作用薬。
10.ドメインTがボツリヌスニューロトキシンタイプBによって得られる、請
求項1−8のいずれかに記載の作用薬。
11.下記の方法で互いに連結した3つのドメインB,TそしてEからなる前記
の請求項のいずれかに記載の作用薬。
ドメインB--X--ドメインT--X--ドメインE
ここでXは共有結合で連結したスペーサー分子あるいは直接に共有結合で連結す
るが、少なくとも一つのXはスペーサー分子である。
12.ドメインBが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける
ことができる標的細胞上の細胞表面受容体(acceptor)へのリガンドからなる、
前記の請求項のいずれかに記載の作用薬。
13.ドメインBが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける
ことができる標的細胞上の細胞表面受容器(receptor)へのリガンドからなる、
前記の請求項のいずれかに記載の作用薬。
14.ドメインBが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける
ことができる標的細胞上の表面抗原へのモノクローナル抗体もしくはモノクロー
ナル抗体から誘導されるからなる、前記の請求項のいずれかに記載の作用薬。
15.ドメインB、結合ドメインが、特定の細胞タイプに特徴的である結合部位
に結合する、前記の請求項のいずれかに記載の作用薬。
16.ドメインBが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける
ことができる脂肪細胞上の結合部位へのリガンドであって、インスリンに応答し
て脂肪細胞によるグルコース取り込みの速度に影響する、前記の請求項のいずれ
かに記載の作用薬。
17.ドメインBが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける
ことができる好中球の結合部位へのリガンドであって補体断片C3bへの好中球
の応答性に影響する、請求項1−15のいずれかに記載の作用薬。
18.ドメインBが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける
ことができる好中球の結合部位へのリガンドであって吸着分子Mac−1の好中
球による発現に影響を与える、請求項1−15のいずれかに記載の作用薬。
19.ドメインBが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける
ことができる抗原提示細胞上の結合部位へのリガンドであって抗原提示細胞によ
る抗原の提示に影響を与える、請求項1−15のいずれかに記載の作用薬。
20.ドメインBが、インスリン様成長ホルモンIIのリガンドである請求項16
の作用薬。
21.ドメインBが吸着分子p150,95へのモノクローナル抗体もしくはモ
ノクローナル抗体から誘導される請求項17または18の作用薬。
22.ドメインBが、エンドソーム中に取り込まれエンドサイトーシスを受ける
ことができ抗原提示細胞上で表面抗原へのモノクローナル抗体もしくはモノクロ
ーナル抗体から誘導されるところの請求項19の作用薬。
23.ドメインBがインスリン様成長ホルモンIIである請求項20の作用薬。
24.ドメインBがモノクローナル抗体SHCL3であるかまたはそれから誘導
される請求項21の作用薬。
25.ドメインBがモノクローナル抗体LL2であるかまたはそれから誘導され
る請求項22の作用薬。
26.ドメインBがインスリン様成長因子IIであり、ドメインTがトリプシンを
用いるタンパク質分解酵素切断によって得られたボツリヌスニューロトキシンタ
イプAの重鎖のアミノ末端部位でありそしてドメインEがボツリヌスニューロト
キシンタイプAの軽鎖である請求項23の作用薬。
27.ドメインBがモノクローナル抗体SHCL3であり、ドメインTがトリプ
シンを用いるタンパク質分解酵素切断によって得られたボツリヌスニューロトキ
シンタイプAの重鎖のアミノ末端部位であり、そしてドメインEがボツリヌスニ
ューロトキシンタイプAの軽鎖である請求項23の作用薬。
28.ドメインBが、モノクローナル抗体LL2であり、ドメインTがトリプシ
ンを用いるタンパク質分解酵素切断によって得られたボツリヌスニューロトキシ
ンタイプAの重鎮のアミノ末端部位であり、そしてドメインEがボツリヌスニュ
ーロトキシンタイプAの軽鎖である請求項25の作用薬。
29.下記の方法において3つのドメインB,TそしてEの共有結合による接着
からなる先行する請求項のいずれかに記載の作用薬を得るための方法。
ドメインB--ドメインT--ドメインE
30.下記方法において3つのドメインB,TおよびEが共有結合による接着か
らなる請求項1から25のいずれかに記載の作用薬を得るための方法;
ドメインB--X--ドメインT--X--ドメインE
ここでXは共有結合で連結したスペーサー分子あるいは直接に共有結合で連結す
るが、少なくとも一つのXはスペーサー分子である。
31.本作用薬をコードする遣伝的構築物を構築し、宿主生物に前記構築物を組
み込みそして本作用薬を生産するように構築物を発現させる請求項1から28の
請求項にいずれかに記載の作用薬を得る方法。
32.1から28の請求項のいずれかに記載の作用薬を適用することからなる、
RMVs中にある細胞膜へのIMPsの輸送を制御することからなる細胞の外部
環境と細胞の相互作用を制御する方法。
33.1から28の請求項のいずれかに記載の作用薬を適用することからなる、
細胞膜を通過しての代謝物の輸送に応答するIMPのレベルを制御し、その結果
として、細胞を通って代謝物の輸送をあるいは細胞内の代謝物の有用性を制御す
る方法。
34.1から28の請求項のいずれかに記載の作用薬を適用することからなる、
イオンに対する細胞の原形質膜の選択的透過性に応答するIMPのレベルを制御
し、細胞内イオンの濃度を転調する方法。
35.1から28の請求項のいずれかに記載の作用薬を適用することからなる、
信号分子の認識に応答しIMPのレベルを制御し、信号分子の細胞への認識性を
転調する方法。
36.1から28の請求項のいずれかに記載の作用薬を適用することからなる、
信号分子の膜への結合につながる細胞膜を通過しての信号の伝達に応答するIM
Pのレベルを制御し、信号分子への細胞の応答性を転調する方法。
37.1から28の請求項のいずれかに記載された作用薬を適用することからな
る、摂取された抗原から誘導したペプチド断片の細胞表面での描写に応答するI
MPのレベルを制御する方法。
38.グルコース代謝疾患の処置のための医薬として1から28の請求項のいず
れかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入れられる塩の使用。
39.臨床的肥満の処置のための医薬として1から28の請求項のいずれかに記
載された作用薬のいずれかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入
れられる塩の使用。
40.高血圧の処置のための医薬として、1から28の請求項のいずれかに記載
された作用薬のいずれかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入れ
られる塩の使用。
41.炎症疾患の処置のための医薬として、1から28の請求項のいずれかに記
載された作用薬のいずれかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入
れられる塩の使用。
42.免疫系疾患の処置のための医薬として、1から28の請求項のいずれかに
記載された作用薬のいずれかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け
入れられる塩の使用。
43.RMVs中の細胞膜へのIMPsの異常な輸送の状態の処置のための医薬
の製造において、1から28の請求項のいずれかに記載の作用薬の使用。
44.グルコース代謝疾患の処置のための医薬の製造において、1から28の請
求項のいずれかに記載の作用薬の使用。
45.臨床的肥満の処置のための医薬の製造において、1から28の請求項のい
ずれかに記載の作用薬の使用。
46.高血圧の処置のための医薬の製造において、1から28の請求項のいずれ
かに記載の作用薬の使用。
47.炎症疾患の処置のための医薬の製造において、1から28の請求項のいず
れかに記載の作用薬の使用。
48.免疫系疾患の処置のための医薬の製造において、1から28の請求項のい
ずれかに記載の作用薬の使用。
49.1から28の請求項のいずれかに記載の作用薬を有効投与量を投与するこ
とからなるグルコース代謝疾患の処置の方法。
50.1から28の請求項のいずれかに記載の作用薬を有効投与量を投与するこ
ることからなる臨床的肥満の処置の方法。
51.1から28の請求項のいずれかに記載の作用薬を有効投与量を投与するこ
ることからなる高血圧の処置の方法。
52.1から28の請求項のいずれかに記載の作用薬を有効投与量を投与するこ
ることからなるとからなる炎症性疾患の処置の方法。
53.1から28の請求項のいずれかに記載の作用薬を有効投与量を投与するこ
ることからなる免疫系システムの疾患の処置の方法。
Claims (24)
- リサイクル性の膜小胞(Recyclable Membrane Vesicle、RMVs) 中の細胞膜への完全な膜タンパク質類(Integral Membrane Proteins、IMPs)の輸送を制御することによって細胞の外部環境と細胞の相互作用を制御する本作用薬。
- 細胞膜を通過しての代謝物の輸送に応答するIMPのレベルを制御し、その結果として、細胞を通って代謝物の輸送をあるいは細胞内の代謝物の有用性を制御する請求項1の作用薬。
- 細胞膜を通過して細胞内外への代謝物の輸送に応答するIMPのレベルを制御し、その結果として、細胞を通って代謝物の輸送をあるいは細胞内の代謝物の有用性を制御する請求項1の作用薬。
- イオンに対する細胞の原形質膜の選択的透過性に応答するIMPのレベルを制御し、細胞内イオンの濃度を転調する請求項1の作用薬。
- 信号分子の認識に応答するIMPのレベルを制御し、信号分子の細胞への認識性を転調する請求項1の作用薬。
- 信号分子の膜への結合につながる細胞膜を通過しての信号の伝達に応答するIMPのレベルを制御し、信号分子への細胞の応答性を転調する請求項1の作用薬。
- 摂取された抗原から誘導したペプチド断片の細胞表面での描写に応答するIMPのレベルを制御する請求項1の作用薬。
- 標的化細胞タイプに対する標的化特性を有し、作用薬の有効範囲を該細胞タイプに限定する、前記記載のいずれかの作用薬。
- 下記の方法によって連結した3つのドメインB、TおよびEからなる前記記載のいずれかの作用薬。
ドメインB--ドメインT--ドメインE
ここで
ドメインBは、エンドサイトーシスを受ける細胞の結合部位に本作用薬を結合してエンドソームを生成する結合ドメインである。
ドメインTは、エンドソーム内からエンドソーム膜を通して細胞の細胞質ゾル中に本作用薬(結合部位とともにもしくは無しに)を輸送する輸送ドメインである。
ドメインEは、細胞の表面にIMPsを輸送する本RMVsの能力を阻害する効果ドメインである。 - 下記の方法で互いに連結した3つのドメインB,TそしてEからなる請求項9の作用薬。
ドメインB--X--ドメインT--X--ドメインE
ここでXはスペーサー分子あるいは共有結合、ただし少なくとも一つのXはスペーサー分子である。 - ドメインBが、特殊な細胞タイプに特徴的な結合部位に結合する結合ドメインである請求項9または10の作用薬。
- ドメインBがエンドサイトーシスを受け、エンドソームを生成する標的細胞上の表面抗原に対するモノクローナル抗体からなり、ドメインTが得られたエンドソームから細胞の細胞質ゾルへ作用薬を輸送するトキシン分子のドメインまたはドメイン断片からなり、ドメインEが、Zn++依存性タンパク質分解活性でドメインTと機能的に異なるトキシン分子のドメインまたはドメイン断片からなる、前記のいずれかの請求項に記載の作用薬。
- ドメインBが、エンドサイトーシスを受け、エンドソームを生成する標的細胞上の細胞表面受容体へのリガンドからなり、ドメインTが得られたエンドソームから細胞の細胞質ゾルへ作用薬を輸送するトキシン分子のドメインまたはドメイン断片からなり、ドメインEが、Zn++依存性タンパク質分解活性でドメインTと機能的に異なるトキシン分子のドメインまたはドメイン断片からなる、前記のいずれかの請求項に記載の作用薬。
- ドメインBがインシュリン様成長因子へのリガンドであり、ドメインTが細胞膜を通ってトキシンの輸送に応答するボツリヌスニューロトキシン重鎖のドメインまたはドメイン断片であり、ドメインEがZn++依存性メタロプロテアーゼ活性をもつボツリヌスニューロトキシン軽鎖のドメインまたはドメイン断片である、インシュリンに応答における脂肪細胞によるグルコース取り込み速度に影響する、請求項13の作用薬。
- ドメインTおよびEがクロストリアルニューロトキシンから得られる請求項9から14のいずれかに記載の作用薬。
- 下記の方法で3つのドメインB,TおよびEが共有的に結合してなる前記請求項のいずれかに記載の作用薬製造方法。
ドメインB--ドメインT--ドメインE
ここで、ドメインBが、エンドサイトーシスを受けエンドソームを生成する細胞の結合部位に作用薬を結合する結合ドメインであり、ドメインTが、エンドソーム内からエンドソーム膜を通して細胞の細胞質ゾル中に本作用薬(結合部位とともにもしくは無しに)を輸送する輸送ドメインであり、ドメインEは、細胞の表面にIMPsを輸送するRMVsの能力を阻害する効果ドメインである。 - 下記の方法で3つのドメインB,TおよびEが共有的に結合してなる請求項16の作用薬製造方法。
ドメインB--X--ドメインT--X--ドメインE
ここで、Xはスペーサー分子あるいは共有結合、ただし少なくとも一つのXはスペーサー分子である。 - ドメインBが特定の細胞タイプに特徴的である結合部位に結合する結合ドメインである、請求項16または17の製造方法。
- 本作用薬をコードする遺伝的構築物を構築し、宿主生物に前記構築物を組み込みそして本作用薬を生産するように構築物を発現させる請求項1から28の請求項にいずれかに記載の作用薬を製造する方法。
- グルコース代謝疾患の処置のための医薬として前記請求項のいずれかに記載の作用薬またはそれらの薬理学的に受け入れられる塩の使用。
- 臨床的肥満の処置のための前記請求項のいずれかに記載の作用薬のいずれかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入れられる塩の使用。
- 高血圧の処置のための前記請求項作用薬のいずれかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入れられる塩の使用。
- 炎症疾患の処置のための前記請求項作用薬のいずれかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入れられる塩の使用。
- 免疫系疾患の処置のための前記請求項作用薬のいずれかに記載された作用薬またはそれらの薬理学的に受け入れられる塩の使用。
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