CZ242695A3

CZ242695A3 - Agent for regulation of a cell interaction with its outer environment, process of its preparation, regulation method of the cell interaction with its outer environment and the use of such agent

Info

Publication number: CZ242695A3
Application number: CZ952426A
Authority: CZ
Inventors: John Robert North; Keith Alan Foster; Conrad Padraig Quinn; Clifford Charles Shone
Original assignee: Speywood Lab Ltd; Microbiological Res Authority
Priority date: 1993-03-19
Filing date: 1994-03-18
Publication date: 1996-04-17
Also published as: HUT76556A; EP0689459A1; NZ262484A; IL109045A0; DK0689459T3; AU671203B2; PT689459E; KR960700756A; JP4300265B2; CN1195551C; AU671203C; ES2183836T3; PL310698A1; DE69431832T2; JPH09500867A; BR9406232A; CN1124929A; IN178499B; CA2158647A1; US20080070278A1

Description

Činidlo pro,regulování interakce buňky s jejím vnějším prostředím, způsob jeho získání, způsob regulování interakce buňky s jejím vnějším prostředím a použití tohoto činidla

Oblast techniky

Tento vynález se týká nového činidla pro regulování interakce buňky s jejím vnějším prostředím, způsobu jeho získání_fj způsobu regulování interakce buňky s jejím vnějším prostředím' a použití tohoto činidla. Toto činidlo se používá jako farma- jHusvií ceutický prostředek pro léčení různých onemcnění. ' r~

Dosavadní stav techniky

Základní vlastností živých buněk je jejich schopnost odpovídat na vnější prostředí. Mezifázím mezi buňkou a vnějším pro— středím je plasmová membrána. Plasmová membrána sestává z fcjsfolipídové dvojvrstvy, v níž je uloženo mnoho druhů proteipových molekul. Tyto integrální membránové proteiny (IMP) jsou zodpovědný za mnoho integrací buňky s jejím vnějším prostředím.

^{3 6} .X '6 0

01S-0Q ΐ i: <j o

Mezi interakce, v nichž jsou zahrnuty IMP, patří: transport materiálů včetně živin do a z buňky, regulovaná propustnost plasmové membrány pro ionty, rozpoznávání a odpověď na extracelulární molekuly a adheze jedné buňky k jiné. Specializovanou funkcí imunního systému, která je také zprostředkována IMP, je presentace zvláštních cizích peptidových sekvencí jednou skupinou imunních buněk jiné skupině.

Jedním způsobem, kterým buňka reguluje svoji schopnost odpovídat na vnější prostředí a interagovat s tímto prostředím, je měnění množství a typů IMP přítomných v plasmové membráně. Jedním mechanismem, kterým se toho dosáhne, je reversibilní internalizace IMP endocytotickou cestou do recyklovatelných membránových vezikul (RMV). V tomto případě IMP skladované v RMV představují vnitřní sklad nebo sestavu IMP dostupných pro rychlý export k buněčnému povrchu způsobem exocytotického napojení RMV s plasmovou membránou. Modulace rovnováhy tohoto exocytotického/ endocytot ického cyklu umožňuje.rychlou regulaci hustoty IMP přítomných na povrchu buněk. V jednom příkladu způsobu regulování buněčné aktivity je regulován příjem glukosy buňkami skeletálního svalu odpovídajícími na insulin a tukovou tkání. Insulin zvyšuje množství příslušné isoformy transportéru glukosy, GLUT4, který se nalézá v plasmové membráně těchto buněk. Vyšší koncentrace molekul GLUT4 na povrchu buňky vede ke zvýšenému příjmu glukosy. Regulováním počtu transportérů glukosy v plasmové membráně lze tedy modulovat odpověď na insulin. .

Jiným příkladem změn exprese IMP na povrchu buňky jako odpověď na vnější signály je příklad receptorů fragmentů C3b a C4b komplementu, receptorů CR1 komplementu typu 1. Po aktivaci lidských neutrofilů se exprese CR1 v plasmové membráně přechodně 6 až lOkrát zvýší.

V jiném příkladu četné zánětlivé a imunitní buňky po aktivaci modifikují expresi adhezních molekul na povrchu buněk. Aktivace neutrofilů nebo monocytů vede tedy k modulaci adhezních molekul Mac-1 a pl50,95 na povrchu buněk. Tyto adhezní molekuly jsou důležité pro zacílení a pohyb zánětlivých buněk do místa zánětu.

V ještě dalším příkladu rozmanité hormony (insulin, růstový faktor podobný insulinu, interleukin 1 a růstový faktor odvozený od destiček) způsobují rychlý nárůst exprese trasferinového receptorů na povrchu buněk u různých typů buněk. Transferinový receptor váže diželezitý transferin z vnějšího prostředí buněk a hraje tedy roli v příjmu železa buňkami. Tento systém transferin/transferinový receptor může hrát roli také při transcelulárním pohybu železa do CNS přes barieru krve mozku, procesu známém jako transcytosa. Transcytosa hraje roli také v přenosu mateřské imunity na vyvíjející se plod.

V ještě jiném příkladu je známo, že diuretický hormon al9 dosteron zvyšuje expresi na povrchu buněk Na⁺ kanálka v apikálrii membráně epitelních buněk močového měchýře. Tento mechanismus hraje roli v retenci solí a vyskytuje se například při dietách obsahujících nízká množství sodíku. {

V dalším příkladu modulace exprese IMP buněčnou membránou je třeba si všimnout, že funkce imunního systému.je založena na rozpoznávání cizích nebo nikoliv svých antigenů. část této rozpoznávací-a imunitní-odpovědi se dosáhne buňkami imunitního...........

systému schopnými rozpoznávat a odpovídat ma cizí peptidové sekvence. Tyto peptidové sekvence jsou předkládány imunitním buňkám jinými buňkami imunního systému známými jako antigen presentující buňky. Antigen presentující buňky pohlcují cizí antigenní proteiny, štěpí je na peptidy a předávají tyto cizí peptidy do štěrbiny vytvořené na. buněčné membráně. IMP hlavního histokompatibilního komplexu.

IMP jsou tedy centrem schopnosti buněk interagovat s- je- ;·. jich vnějším prostředím. Vzhledem k dané razné a proměnlivé'povaze těchto interakcí není překvapujícím objev, že existuje obrovský soubor razných IMP. Klíčovou rolí IMP ve funkci buněk· je to, že jsou často zahrnuty v pathofysiologických stavech- a— že jsou cílem mnoha terapeutických intervencí. »

Přístup k regulaci IMP aktivity v oblasti techniky byl dosud zaměřen hlavně na úpravu funkce IMP již exprimovaného na povrchu buněk. Terapeutické intervence podle dosud známého stavu oblasti techniky mají tedy tendenci být specifické pro příslušné IMP a na příslušné funkce příslušných typů buněk. Jako terapeutická činidla byly vyvinuty inhibitory specifických transportních IMP, Například inhibitory 5HT transportního proteinu neuronů se používají jako anti-ďepresivní činidla. Antagonisté příslušných receptorových IMP jsou velmi obvykle používanými farmaceutickými činidly. Mezi příklady patří antihistaminy, jak ty, které jsou specifické na HI a H2 subtypy histaminového receptorů, tak antagonisté β-adrenoreceptoru. Inhibitory funkce IMP jsou také rozšířeně používány jako farmaceutická či4 nidla. Mezi příklady patří inhibitory pohybů iontů přes membránu, jako jsou diuretika furosemid a amilorid, druhý z nich je inhibitorem apikálního Na⁺ kanálku epitelních buněk močového měchýře. Je známo, že inhibitory draselných kanálků jsou vyvíjeny jako antiarytmická činidla. Buněčné adhezní IPM jsou také současným cílem vývoje selektivních antagonistů.

Jiným přístupem je Selektivně modifikovat expresi příslušných IMP na genetické úrovni změnou úrovně transkripce přísluš- ného genu kódujícího IMP a tedy modulace syntézy specifického IMP proteinu.

*

Souhrnně - je známo, že IMP hrají rozhodující roli při odpovědi buněk na jejich vnější prostředí. Předcházející přístupy k regulování IMP obecně zahrnovaly cílení specifických IMP nas* _; povrch buňky a modifikování jeho funkční kapacity. Lze předví-. á ΐ' dat, že regulace hustoty IMP v plasmové membráně má široká použití při léčení rozmanitých poruch. Z hlediska obrovské rozmanitosti IMP a příslušné povahy běžných terapeutických interakcí je překvapující objev tohoto vynálezu, že jediná skupina čini-v del může modifikovat expresi IMP rozmanitých buněčných typů.^

Stejná skupina činidel je také schopna modifikovat expresi ./ transportních IMP, receptorových IMP, adhezních IMP, kanálkových IMP a antigen presentujících IMP. Dříve byla činidla ovlivňující IMP klasifikována podle funkce, například antagonisté Ca⁺⁺, členové každé skupiny jsou chemicky a mechanisticky velmi rozmanití. Skupina činidel podle tohoto vynálezu je naproti tomu strukturně homogenní s racionálně zavedenými substitucemi příslušných domén, které mají předpověditelné účinky na funkci činidla. Dalším aspektem tohoto vynálezu je to, že činidlo lze selektivně zacílit na příslušné typy buněk, což umožk ňuje selektivní modulaci exprese IMP pouze v tomto typu buněk.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká činidla pro regulování interakce buňky s jejím vnějším okolím. Specificky - tento vynález poskytuje činidlo pro regulování transportu molekul integrálního membrá-nového-proteinu (IMP) z vnitřních 'šlo žék buňky do buněčné membrány, takže modifikuje buněčné interakce s vnějším okolím. Podrobněji - tento vynález poskytuje nové činidlo, které modifikuje strukturu RMV tak, že je inhibována jejich schopnost transportovat IMP na povrch těchto buněk.

' Následující pojmy mají následující významy:

Integrální membránový protein (IMP) znamená jakýkoliv protein, který je uložen a nachází se v lipidové dvojvrstvě biologické membrány.

Pojem recyklovatelná membránová vezikula (RMV) znamená intracelulární vezikulu, která je přítomna v cytosolu buňky navázanou lipidní dvojvrstvou membránou. RMV jsou vytvořeny z plasmy membrány a pohybují se dovnitř buňky procesem, který se nazývá endocytosa. RMV podléhají cyklickému procesu tvorby z plasmové membrány buněk a spojení s plasmovou membránou buněk. Proces pohybu k plasmové membráně a spojení se s plasmovou membránou se nazývá exocytosa. Funkcí RMV v buňce je reversibilní transport IMP na a z povrchu buňky. V tom se liší od sekrečních vezikul neurosekrečních buněk.

Endosom znamená intracelulární ve^ikuly, které se vytvoří z plasmové membrány procesem endocytosy.

Těžký řetězec znamená větší ze dvou polypeptidových řetězce, které tvoří klostridiální neurotoxiny. Má molekulovou hmotnost přibližně 100 000 a jeobvykle označován HC. Lehký řetězec znamená menší z těchto dvou polypeptidových řetězců, které tvoří klostridiální neurotoxiny. Má molekulovou hmotnost přibližně kolem 50 000 a je obvykle označován LC. Přirozeně se vyskytující těžký a lehký řetězec jsou kovalentně spojeny alespoň jednou disulfidovou vazbou.

H₂ fragment znamená fragment odvozený od aminového konce těžkého řetězce klostridiálního neurotoxinu proteolytickým štěpením, například trypsinem nebo papainem.

HjL znamená fragment klostridiálního neurotoxinu produkovaný proteolytickým štěpením, například působením trypsinu nebo papainu, při čemž lehký řetězec je ještě spojen disulf idovými vazbami s H₂ fragmentem.

Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu se získává činidlo pro regulaci hladiny IMP zodpovědného za transport metabolitů přes buněčnou membránu, takže reguluje biologickou dostupnost metabolitů uvnitř buňky.

Podle jiného aspektu tohoto«vynálezu se získává činidlo pro regulaci hladiny IMP zodpovědného za transport metabolitů ·^ι -¾ přes buněčnou membránu do buňky a z buňky, takže reguluje ^ř transport metabolitů buňkou.

Podle ještě jiného aspektu tohoto vynálezu se získává činidlo pro regulaci hladiny IMP zodpovědného za selektivní pro- ; 7¾ pustnost plasmové mebrány buňky pro ion, Čímž se upravuje kon- ' centrace tohoto iontu uvnitř buňky.

Podle ještě jiného aspektu tohoto vynálezu sě získává činidlo pro regulaci hladiny IMP zodpovědného za rozpoznávání signální molekuly, čímž se upravuje vnímavost této buňky na signální molekulu.

Podle ještě jiného aspektu tohoto vynálezu se získává činidlo pro regulaci hladiny IMP zodpovědného za transdukci signálů přes buněčnou membránu následující po navázání na membránu signální molekuly, čímž se upravuje citlivost buňky na tuto signální molekulu.

Podle ještě jiného aspektu tohoto vynálezu se získává činidlo pro regulaci hladiny IMP zodpovědného za projev existence peptidových fragmentů odvozených od přijatých antigenů na povrΊ chu buňky. Výsledkem je ovlivnit imunitní odpověď tohoto orga.....nismu.'.....

Tento vynález dále poskytuje činidlo, které je, cílově specifické na cílové typy buněk, takže rozsah účinku tohoto činidla je omezen na uvedené typy buněk.

Jak bylo shora uvedeno, přístup k regulaci IMP. aktivity známý z oblasti techniky se. soustředil hlavně na-úpravu -funkce IMP jednou exprimovaného na povrchu buňky. V přímém kontrastu tento vynález upravuje hladinu IMP, která se exprimuje na povrchu buněk.

Lze vidět, že předmět tohoto vynálezu, získat činidlo pro regulování hladiny IMP na povrchu buněk, má mnoho potenciálních použití pro úpravu odpovědi buňky na své okolí. Tento vynález zahrnuje činidlo, které funguje tak, že ovlivňuje mechanismus.; kterým se IMP přivádí k povrchu buňky, jak je vidět z příkladů, např. z příkladu .1 a 2. Toto činidlo musí mít tři diskrétní funkce, první dvě jsou známy odborníkům. Za prvé se musí vázat na strukturu povrchu buňky (vazebné místo). Potom musí vstupovat do cytosolu buňky. Je známo, že ke vstupu molekuly do buňky dochází procesem endocytosy. Avšak jelikož je známo, že jenom některá vazebná místa povrchu buněk jsou zahrnuta v endocytose, pouze tato vazebná místa jsou vhodnými jako cílová místa. Jakmile je jednou činidlo endosytosou v buňce, musí opustit výsledný endosom přes endosomální membránu, aby vstoupilo do cytosolu. Schopnost dosáhnout specifického buněčného navázání a vstupu činidel do cytosolu je dobře známa ž odborné literatury (například Pastan I., Willingham M.C., Fitzgerald D.S.P.: Cell 47. 641 (1986), Olsnes s., Sandvig K., Petersen O.W., Van Dews B.: Immunol. Today 10, 291 (1989), Strom T.B., Anderson P.L., Rubin-Kelley V.E., Williams D.P., Kiyokawa T., Murphy J.R. : Ann. NY Acad. Sci. 636, 233 (1991).). Třetí funkce tohoto činidla je překvapujícím objevem tohoto vynálezu. Jde o schopnost ovlivňovat RMV. Dalším překvapujícím aspektem tohoto činidla je to, že ovlivněním RMV omezuje jeho schopnost transportovat

XMP na povrch buňky.

Činidlo podle tohoto vynálezu tedy obsahuje následující funkční domény:

doménu B, vazebnou doménu, která váze činidlo na vazebné místo cílové buňky schopné podléhat endocytose za vzniku endosomu obsahujícího toto Činidlo, doménu T, translokační doménu, která přemisťuje činidlo • nebo část činidla z endosomu přes endosomovou membránu do cytosolu buňky a doménu E, efektorovou doménu, která inhibuje transport IPM na povrch buňky působením RMV.

Doména B se může připravit tak, že je specifická pro cílový typ buňky. Schopnost zacílit činidlo na příslušný typ buňky je dobře známa z oblasti techniky. Funkce domény B by se tedy mohly dosáhnout použitím jedné z mnoha molekul vázajících se, na buňky, jak je známo z oblasti techniky, včetně, ale bez omezení pouze na tyto, protilátek, monoklonálních protilátek, fragmentů protilátek (Fab, F(ab)'_z, Fv, protilátek s jedním řetězcem atd.), hormonů, cytokinů, růstových faktorů a lektinů..

Funkce domény T by se mohly dosáhnout molekulami schopnými tvořit příslušné póry uvnitř endosomální membrány. Je dobře dokumentováno, že některé části toxinových molekul jsou schopny vytvořit tyto póry, včetně, mimo jiných, fragmentů antraxového toxinu, botulinového toxinu, toxinu tetanu, toxinu diftérie a endotoxinu Pseudomonas (Hoch D.H., Romero-Mira Μ., Ehrlich B. E., Finkelstein A., Das Gupta B.R., Simpson L.L.: PNAS 82, 1692 (1985), Olsnes S., Stenmark H., Moskaug J.O., McGill S., Madshaus I.H., Sandvig K.: Microbial Pathogenesis 8, 163 (1990).). Jednou takovou molekulou je těžký řetězec klostridiálních neurotoxinů, například botulinového neurotoxinu typu A. Bylo zjištěno, že se s výhodou používají pouze ty části toxinové molekuly, které jsou schopny tvořit póry uvnitř endosomové membrány·

Funkce domény E, inhibice schopnosti transportovat IPM na

---------------povrch buňky, nejsou známy v oblast i techniky. Překvapivě bylo zjištěno, že různé části některých toxinových molekul - funkčně vzdálené od těch, které jsou schopny tvořit póry, včetně fragmentů klostridiálních neurotoxinů, jako jsou buď botulinové nebo tetanové toxiny, jestliže se zavedou do cytoplasmy cílových buněk, jsou schopny inhibovat transport IPM v RMV na povrch buněk a tak snižovat koncentraci těchto IMP na povrchu buněk. Zvláště pak bylo zjištěno, že fragmenty tetanového toxinu a botulinu typů A, B, C_p D, E, F a G jsou zvláště vhodné. Příkladem takové molekuly je část klostridálního neurotoxinu známá jako HjL fragment, v němž neuronální cílová aktivita karboxykoncové poloviny těžkého řetězce toxinu je odstraněna a zůstává tak aminokoncová polovina disulfidu navázaná na lehký řetězec. Jiným příkladem by byl lehký řetězec klostridiálního. neuroto' ' xinu, jako je lehký řetězec botulinového neurotoxinu typu B, zvláště ty části molekuly, které mají metalgproteasovou aktivitu závislou na Zn⁺⁺. \ ... .jx • 4*'·'

Tento vynález tedy zahrnuje činidlo následující struktury:

doména B — doména T — doména E .

Tyto domény jsou kovalentně svázány vazbami, které mohou mezi doménami obsahovat příslušné spacerové oblasti (oblasti s raménky).

V jednom provedení podle tohoto vynálezu doména B znamená vazebnou molekulu, která je schopna navázat se na vazebné místo cílové buňky, která podléhá endocytose, doména T znamená těžký řetězec botulinového neurotoxinu nebo jeho fragmenty a doména E znamená lehký řetězec botulinového neurotoxinu nebo jeho fragmenty. Domény T a E mohou pocházet ze stejného nebo různých serotypů C. botulinum.

V jiném provedení podle vynálezu doména B znamená vazebnou molekulu, která je schopna navázat se na vazebné místo cílové buňky, která podléhá endocytose, doména T znamená těžký řetězec tetanového neurotoxinu nebo jeho fragmenty a doména E znamená lehký řetězec botulinového neuotoxinu nebo jeho fragmenty.

V jiném provedení podle vynálezu doména B znamená vazebnou molekulu, která je schopna navázat se na vazebné místo cílové buňky, která podléhá endocytose, doména T znamená těžký řetězec botulinového neurotoxinu nebo jeho fragmenty a doména E znamená lehký řetězec tetanového neurotoxinu nebo jeho fragmenty.

V jiném provedení podle vynálezu doména B znamená vazebnou molekulu, která je schopna navázat se na vazebné místo cílové buňky, která podléhá endocytose, doména T znamená těžký řetězec tetanového neurotoxinu nebo jeho fragmenty a doména E znamená lehký řetězec tetanového neurotoxinu nebo jeho fragmenty.

Tomu je třeba rozumět tak, že tento vynález zahrnuje ja-,, koukoliv kombinaci toxinových molekul nebo fragmentů toxinových molekul ze stejného nebo z různých organismů, které mají shora popsané funkce.

Jestliže se toto činidlo podává organismu, koncentrace IMP na povrchu cílové buňky se snižuje. To může vést k četným žádoucím účinkům včetně snížení příjmu metabolitu nebo železa do buňky nebo při průchodu buňkou, snížení odpovědi cílové buňky na signální molekulu nebo změnu imunitní odpovědi organismu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Fibroblasty 3T3-LI se trypsinizují na suspenzi a elektroporují se při 300 V/cm, 960 mF, s časovou konstantou 11 až 11,5 msek přístrojem Bio-Rad Gen Pulser s nastaveným kapacitním výkonem v přítomnosti nebo bez přítomnosti ΙμΜ botulinového neurotoxinu B (BoNT-B). Po elektroporaci se buňky nechají přilnout a uchovávají se v jednovrstvé monokultuře při 37 °C na deskách s 24 jamkami 72 h. Buňky se pak promyjí a inkubují se 5 min při ____3.7-2C v-přítomnosti nebo bez přítomnosti''5nM “růstového'faktoru typu 1 podobného insulinu (IGF-1), načež se nechají stát 5 min na ledu. Supernatant se odebere od buněk a nahradí se ledem ochlazeným l,5nM ¹²⁵I-transferinem (specifická aktivita 47 Tbq/ /mmol). Nespecifická vazba se vyhodnotí v paralelních inkubacích provedených v přítomnosti stonásobného molárního nadbytku neradioaktivního transferinu. Po 2 h še supernatant odstraní, následují 3 promytí ledem ochlazeným pufrem, buněčná vrstva se rozštěpí IN NaOH a navázaný ^1Z5I-transferin se změří počítačem gamačástic LKB1275 minigamma gamma counter. Regulace navázaného tranferinu se vypočte jako specifický ¹²⁵I-transferin navázaný v přítomnosti IGF-1, což se vyjádří jako procento specifického navázání v nepřítomnosti IGF-1.

Tabulka I ukazuje, že došlo ke snížení zvýšení navázání ¹²⁵I-transferinu jako odpovědi na IGF-1 v buňkách, na které bylo působeno BoNT-B, při srovnání s kontrolou. To ukazuje, že z,avedení BoNT-B do cytosolu 3T3-LI fibroblastů inhibuje IGF-st.imulovanou regulaci transferinových receptorů v těchto buňkách.

Proteiny rozpustné v Tritonu X-114 extrahované* ze štěpů 3T3-LI fibroblastů se analyzují Westernovým blotováním pomocí polyklonální protilátky proti peptidové sekvenci vzorce I

QQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLK (I) identifikované v sekretovaném vez ikulovém proteinu neurosekrečních buněk. Tato anti-vezikulová protilátka vykazuje sníženou reaktivitu s relevantním dvojitým pásem ve vzorcích z fibroblastů zpracovaných s BoNT-B, u nichž není popsána žádná neurosekreční aktivita. BoNT-B modifikuje strukturu vezikul (převážně RMV) ve fibroblastech 3T3-LI současně s .inhibováním regulace transferinových receptorů.

Příklad 2

Fibroblasty 3T3-LI se elektroporují v přítomnosti nebo'bez přítomnosti 0,5μΜ botulinového neurotoxinu A (BoNT-A) za podmínek identických s podmínkami uvedenými v příkladu 1. IGF-1 stimulace ¹²⁵I-inter ferinu se testuje v buňkách, na než bylo nebo nebylo působeno BoNT-A postupem, jak shora uvedeno v příkladu *

1.

Výsledky v tabulce II ukazují, že působením BůNT-A na 3T3-LI fibroblasty se likviduje regulace ¹²⁵I-transfer inového navázání jako odpověď na IGF-1. To ukazuje, že zavedení BoNT-A do cytosolu 3T3-LI fibroblastů inhibuje IGF-1 stimulovanou regulaci transferinových receptorů v těchto buňkách.

Příklad 3 .

Fibroblasty 3T3-LI se elektroporuj í v přítomnosti nebo bez přítomnosti 0,5μΜ H^L-fragmentu BoNT-A (H₂L-A) za podmínek identických s podmínkami uvedenými v příkladu 1. Tento fragment se připravuje z neurotoxinu, serotyp A, C botulinu omezenou proteolysou působením trypsinu, na který bylo působeno tosylfenyíalaninchlormethanem. Komplex H₂L se pak vyčistí chromatografií na sephadexu G-200 (Shone C.C., Hambleton Ρ. , Melling J.: Eur. J. Biochem. 151. 17 (1985).). Provede se elektroporace podle postupu popsaného v příkladu 1 stejně jako měření IGF-1 stimulace navázání ¹²⁵I-transferinu ve zpracovaných a nezpracovaných buňkách.

Výsledky uvedené v tabulce III ukazují, že působení H²L-A na 3T3-LI fibroblasty inhibuje regulace navázání ¹²⁵I-transferinu jako odpověď na IGF-1. To ukazuje, že zavedení fragmentu H₂L-A botulinového neurotoxinu A do cytosolu 3T3-LI fibroblastů inhibuje IGF-1 stimulovanou regulaci transferinových receptorů v těchto buňkách.

Příklad 4

3T3 tukové buňky se od 3T3-LI fibroblastů odliší působením dexamethasonu, 3-isobutyl-i-methylxanthinu a insulinu, jak je popsáno v oblasti techniky (Frost S.C. a Lané M.D.: J. Biol. Chem. 260. 2646 (1985).). Na 3T3-LI tukové buňky se 7 dhů po diferenciaci nechá působit botulinový neurotoxin, serotyp A, zředěný ĎMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) obsahujícím sérum a sterilně se. zf iltruje. (konečná- koncentrace - BoNT A: 200nM) . Zpracovaný toxin a kontrolní buňky se inkubují 45 h při 37 °C. s 8 % CO₂. Buňky se pak dvakrát promyjí a inkubují se 2 h s 8 % CO₂ v DMEM bez sera, potom se promyjí v Krebs-Ringerově fosforečnanu a inkubují se buď v Krebs-Ringerově fosforečnanu (bazální příjem) nebo v Krebs-Ringerově fosforečnanu obsahujícím ΙΟΟηΜ insulin (stimulovaný příjem) 15 minut při 37 °C. Příjem glukosy se iniciuje přidáním [³H]-2-deoxyglukosy (14,2 kBq, ΙΟμΜ glukosa) . Po 10 minutách při 37 °C se reakce zastaví odpipetováním roztoku glukosy a rychlým promytím ledem ochlazeným fosforečnanem pufrovaným solným roztokem. Buňky se lyžuj ^přidáním 0,2N NaOH. Roztok se zneutralizuje přidáním 0,2M HCI. Příjem [³H]-2-deoxyglukosy se měří počítačem scintilací Wallác 1410 liguid scintillation counter.

Je známo, že klostridální neurotoxiny jsou schopny vstoupit do některých neurosekrečních buněk (například buněk PC12)' receptorem s nízkou afinitou, jestliže jsou inkubovány vysoké koncentrace neurotoxinu s buňkami po prodlouženou dobu. Tento postup používá cesty přes receptor, který je vzdálený od vysoce specifického a vysoce afinitního receptorů přítomného v neuromuskulárním spojení. Dále bylo popsáno, že některé klostridiální toxiny mají účinky na fagocytární buňky, jako jsou makrofágy, u nichž se předpokládá vstup do buněk specifickou fagocytární aktivitou těchto buněk. Obecně se však uvádí, že neuronální selektivita klostridiálních neurotoxinů je výsledkem velice selektivního navázání a mechanismu buněčného vstupu. Je tedy překvapujícím zjištěním těchto studií, že inkubace 3T3-LI tukových buněk s botulinovým neurotoxinem A, jak popsáno, způ14 sobuje značnou inhibici insulinem stimulované regulace transportu [³H]-2-deoxyglukosy (tabulka IV). Je známo, že insulinová regulace transportu glukosy v tukových buňkách je výsledkem pohybu proteinů glukosového transportéru z intracelulární sestavy (RMV) na povrch buněk. Tento výsledek tedy ukazuje, že botulinový neurotoxin A inhibuje insulinem stimulovaný pohyb glukosových transportérů v RMV na buněčný povrch tukových buněk.

Příklad 5

Na 3T3-LI tukové buňky se působí trypsinem. Suspenze buněk se elektroporuje v přítomnosti nebo bez přítomnosti botulinu B (0,32 μΜ). Pro elektroporaci se použije 960mF kondenzátor s pulzní silou 300 v/cm. časová konstanta je 11 až 12 ms. Po elektroporaci se buňky promyjí a vysejí se na desku se 6 jamkami s mediem a šerem. Buňky se inkubují při 37 °C ve vlhké atmosféře (vzduch/C0₂, 92,5 %/7,5 %) 72 h. Na konci této doby se buňky promyjí a extrahují se do O,1N NaOH. Po neutralizaci extraktu působením 0,IN HC1 se membránové proteiny extrahují Tritonem X-114 a pak se analyzují Westernovým blotováním pomocí anti-vezikulových protilátek popsaných v příkladu 1. Překvapujícím zjištěním této studie je to, že elektroporace botulinového neurotoxinu v cytosolu tukových buněk vede k modifikaci vezikulové struktury (převážně RMV), jak je zřejmé ze snížené reaktivity protilátky s odpoídajícím dvojitým pásem vzorků z buněk, na něž bylo působeno botulinovým neurotoxinem B.

*

Příklad 6 t

V tomto příkladu se syntetizuje činidlo pro regulaci exprese glukosového transportéru tukových buněk závislého na insulinu na povrchu buněk. Vazebnou doménou (B) pro činidlo v tomto příkladu je růstový faktor II podobný insulinu, který se vyčistí z upraveného media buněk BRL-3A, jak je to popsáno v literatuře (Marquette Η., TodaroG.J., Henderson L.E., Oroszlan S.: J. Biol. Chem. 256, 2122 (1981).).

Translokační doména (T) se připrav! z neurotoxinu, serotyp A, C. -botuH-num·,—omezenou~prbtědlýšóu neurotoxinu trypsinem, který byl zreagován s tosylfenylalaninchlormethanem. Frakce obsahující doménu T se vyčistí chromatografií na sephadexu G-200 (Shone C.C., Hambleton P., Melling J.: Eur. J. Biochem. 151, 75 (1985).). Tato frakce se pak ve fosforečnanovém/boritanovém pufru, pH 8,4, nanese na kolonu kvarterního aminoethyl-sephadexu a inkubuje se na koloně přes noc při 4 °C s 2M močovinou a O,1M dithiohreitolem. Kolona se promyje .pufrem-obsahujícím 2M močovinu a lOmM dithiothreitol. Doména T se eluuje fosforečnanovým/boritanovým pufrem obsahujícím 2M močovinu a lOmM dithiothreitol a postupně gradientem NaCl od 0,1 do 0,2M (Poulain B., Wadsworth J.D.F., Maisey E.A., Shone C.C., Melling J., Tauc L., Dolly J.O.: Eur. J. Biochem. 185. 197 (1989).). Klostridiální neurotoxiny jsou proteiny s dvěma řetězci spojenými disulfidovou vazbou, které sestávají z těžkého řetězce a lehkého řetězce (Simpson L.L. í Ann. Rev. Pharmicol. Toxicol. 26, 427 (1986).). Je třeba poznamenat,, že doména T, připravená daným způsobem, je ekvivalentní s frakcí těžkého řetězce neurotoxinu označovaného jako H₂.

Efektorová doména (E) se připraví z neurotoxinu C. tetani isoelektrickou fokusací v sacharosovém gradientu s amfolýtem za redukčních podmínek ve 2M močovině (Weller U., Dauzenroth M.E., Meyer zu Heringdorf D., Habermann E.t Eur. J. Biochem. 182, 649 (1989).). Je třeba uvést, že doména E vyrobená uvedeným způsobem je ekvivalentní s lehkým řetězcem’· neurotoxinu, který se obvykle označuje jako LC.

Domény Ea Tse smíchají Vekvimolárních množstvích za redukujících podmínek a kovalentně se kondenzují opakovanou dialýzou při 4 °c za míchání ve fysiologickém solném roztoku bez přítomnosti redukčních činidel. Jakékoliv zbývající volné merkaptoskupiny se derivatizují přidáním l50mM jodacetamidu 30 minut při 4 °C ve tmě. Konjugovaný E-T produkt se vyčistí vylučovací chromatogrfaií podle velikosti na sephadexu G-150 pufrem s fosforečnanem draselným, pH 7,0. Doména B se nakonec zkonden16 zuje s E-T komplexem pomocí N-sukcinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionátu (SPDP). E-T komplex (5 mg) se rozpustí v 1 ml fosforečnanem pufrovaného solného roztoku (PBS). K němu se přidá 200 mg SPDP rozpuštěného v 0,5 ml absolutního ethanolu. Po 30-minutové reakci této směsi za teploty místnosti se 2-pyridyldisulfidem substituovaný peptid oddělí od nadbytku SPDP gelovou filtrací na sephadexu G25. Podobně se zpracuje doména B, ale s menším množstvím SPDP (20 mg v 0,2 ml ethanolu). Substituovaná doména B se opět isoluje z kolony se sephadexem G25 a zredukuje se dithiothreitolem na konečnou 0,05M koncentraci. Nadbytek redukčního činidla se odstraní gelovou filtrací na sephadexu G25. Potom se smíchají stejné podíly (hmotnostní díly) substituovaného E-T komplexu a substituované a redukované domény B a nechají se 18 h při 4 °C. Toto činidlo se pak vyčistí chromatografií na sephadexu G-150 v pufru fosforečnanu draselného, pH 7,0.

Toto činidlo, připravené jak shora popsáno, se pak testuje na schopnost inhibovat insulinem stimulované zvýšení exprese glukosového transportéru v tukových buňkách 3T3-L1. Tukové buňky 3T3-LI se odliší od 3T3-L1 fibrobiastů reakcí s dexamethasonem, 3-isobutyl-l-methylxanthinem a insulinem, jak popsáno v literatuře (Frost S.C., Lané M.D.: J. Biol. Chem. 260. 2646 (1985).), a používají se mezi 8. a 12. dnem po počátku diferenciace. Buňky se inkubují s činidlem nebo bez činidla 90 minut při 37 °C. Buňky se pak inkubují 2 h v DMEM bez sera na počátku každého pokusu. Buňky, na něž bylo působeno insulinem, se pak na 10 minut vystaví působení 10^_7M insulinu, který se přidá ze zásobního l,6.10“⁴M roztoku. Po shora uvedeném zpracování se buňky rychle promyjí Krebs-Ringerovým fosforečnanem při 37 °C. Potom se měří příjem [³H]-2-deoxyglukosy (14,2 kBq, 10 mM) v Krebs-Ringerově fosforečnanu při 37 °C s nebo be2 10'⁷M insulinu po dobu 10 minut. Reakce se zastaví odpipetováním glukosového roztoku a rychlým promytím ledem ochlazeným fosforečnanem pufrovaným solným roztokem. Buňky se lyžují 0,2M hydroxidem sodným. Před měřením scintilací přístrojem Wallac 1410 liguid scintillation counter se roztok zneutralizuje přidáním 0,2M HC1.

Příklad Ί

V jiném příkladu tohoto vynálezu se domény E a T připravují ze stejného serotypu botulinového neurotoxinu. Připravuji se již napojené. Neurotoxin, serotyp A, C. Botulinum se podrobí omezené proteolyse trypsinem, který byl zreagován s tosylfenylalaňinchlormethanem. E-T komplex se pak vyčistí chromatografií na sephadexu G-200 (Shone C.C., Hambléton P., Melling J.: Eur. J. Biochem. 151, 75 (1985).). ...............

Je třeba poznamenat, že tento fragment je ekvivalentní s fragmentem označovaným jako H₂L fragment. Jakékoliv zbývající merkaptové skupiny se derivatizují přidáním l50mM jodacetamidu jak shora popsáno v příkladu 6. Vazebnou doménou (B) je růstový faktor II podobný insulinu, připravený jak shora popsáno v příkladu 6 a kondenzovaný s E-T komplexem pomocí SPDP jak shora popsáno. Aktivita tohoto Činidla na,expresi glukosového transportéru závislého na insulinu v tukových buňkách je testována jak shora popsáno v příkladu*6.

Příklad 8

V jiném příkladu tohoto vynálezu se činidlo pro regulaci exprese na povrchu buňky CR1 receptorú pro doplňkový fragment *

C3b v neutrofilech (CD 35) syntetizuje následujícím způsobem. Doména B se připravuje z SHCL3 monoklonální protilátky na leukocytovou adhezní molekulu P150,95. E a T domény se připraví z botulinového neurotoxinu, serotyp A, ihned se zkondenzují jak shora popsáno v příkladu .7 a zkondezují se s doménou B, jak shora popsáno v uvedeném příkladu.

Výhodným způsobem testování aktivity činidla na expresi CR1 (CD35) na povrchu neutrofilních buněk je použití techniky lyžování úplné krve. Úplná krev normálních dárců, jejíž srážení je zabráněno působením EDTA, se nechá reagovat 4 h s tímto činidlem. Potom se aktivuje 30 minut při 37 °C. pomocí 10^_6M fMet-Leu-Phe zředěného PBS z 1O'^ZM zásobního roztoku připraveného v

DMSO. Kontrolní buňky se inkubují s PBS. Tato krev se pak 30 minut inkubuje s 10 ml s phykoerythrinem konjugované monoklonální protilátky antiCD35 (Serotec: MCA 554PE), červené krvinky se lyžují Becton Dickinsonovou lyžující kapalinou, leukocyty se promyjí PBS a resuspendují se ve 2% formaldehydu v PBS. PE navázaný na povrchu se analyzuje průtokovou cytometrií FACScanem (Becton Dickinson) se softwarem Lysys II.

Příklad 9 „

V jiném příkladu tohoto vynálezu se činidlo pro regulaci exprese leukocytové adhezní molekuly Mac-1 (CD lib) na povrchu buněk syntetizuje následujícím způsobem. Doména B se připraví 2 SHCL3 monoklonální protilátky na leukocytovou adhezní molekulu P150,95 standardními způsoby pomocí pepsinu a vyčistí se gelovou filtrací (Martin F.J., Hubbell W.L., Papahadjopoulos D. : ~ Biochemistry 20. 4229 (1981).). E a T domény se připraví z botulinového neurotoxinu, serotyp A, ihned se zkondenzují jak shora popsáno v příkladu 7 a.zkondenzují se s doménou B, jak shora popsáno v uvedeném příkladu.

Výhodným způsobem testování aktivity činidla na expresi Mac-1 (CDllb) na povrchu neutrofilních buněk je použití techniky lyžování úplné krve. Úplná krev normálních dárců, jejíž srážení je zabráněno působením EDTA, se nechá reagovat 4 h s tímto činidlem při 37 °C a pak se aktivuje 30 minut při 37 °C pomocí 10'⁶ fMet-Leu-Phe zředěného PBS z 1O'^ZM zásobního roztoku připraveného v DMSO. Kontrolní buňky se inkubují s PBS. Tato krev se pak 30 minut inkubuje s 10 ml s isothiokanatanem fluoresceinu konjugované monoklonální protilátky antiCDllb (Serotec: MCA 551F), červené krvinky se lyžují Becton Dickinsonovou lyžující kapalinou, leukocyty se promyjí PBS a resuspendují se ve 2% formaldehydu v PBS. FITC navázaný na povrchu se analyzuje průtokovou cytometrií FACScanem (Becton Dickinson) se softwarem Lysys II.

Příklad 10

V jiném příkladu tohoto vynálezu se činidlo pro regulaci obsahu Na⁺-kanálků na povrchu buněk v apikální membráně epi tělu močového měchýře syntetizuje následujícím způsobem. Doména B se připraví z vysoce afinitní monoklonální protilátky na markér povrchu epitelních buněk močového měchýře standardním způsobem pomocí pepsinů a vyčistí se gelovou filtrací (Martin F.J., Hubbell W.L. , Papahadjopoulos D.: ..Biochemistry 20, - 4229 (1981)-. ·)·. E a T domény se připraví z botulinového neurotoxinu, serotyp A, ihned se zkondenzují jak shora popsáno v příkladu 7 a zkondenzují se s doménou B, jak shora popsáno v uvedeném příkladu.

Vliv tohoto činidla na aldosteronem stimulovaná zvýšení v Na*-kanálcíph citlivých na amilorid se testuje pomocí urinárních epitelních buněk. Epitelní buňky močového měchýře, připravené jako primární kultury z močového měchýře krys (Johnson M. D., Bryan G.T., Reznikoff C.A.: J. Urol. 1331076 (1985)τ)-se inkubují s činidlem nebo bez činidla 90 minut při 37 °c. Buňky, na které bylo působeno aldosteronem, se pak vystaví působení aldosteronu po dobu 1 h. Po shora uvedeném zpracování se tyto buňky rychle promyjí. Měří se příjem ²²Na⁺ citlivého na amilorid během 5 minut inkubace při 37 °C.

Příklad 11

V jiném příkladu tohoto vynálezu se následujícím způsobem syntetizuje činidlo pro regulaci antigenu presentovaného B-buňkami. B. doména se připraví z B buněčné monoklonální protilátky LL2 standardním způsobem použitím pepsinu a vyčistí se gelovou filtrací (Martin F.J., Hubbell W.L., Papahadjopoulos D.: Biochemistry 20, 4229 (1981),). E a T domény se připraví z botulinového neurotoxinu, serotyp A, ihned se zkondenzují jak shora popsáno v příkladu 3 a zkondezují se s doménou B, jak shora popsáno v uvedeném příkladu.

Vliv tohoto činidla na přítomnost antigenu se testuje po20 mocí myší B lymfomové buněčné linie TA3. Tyto buňky se nejdříve inkubují s činidlem 90 minut při 37 °C. Potom se přidá lysozym slepicích vajec (HEL) a v inkubaci se pokračuje 2h při 37 °C. TA3 buňky se pak fixují a promyjí se před kultivací s I-A^K-omezeným HEL46-61 specifickým T-buněČným hybridomem 3A9 (LorenzR.G., Allen P.M.: Nátuře 337, 560 (1989).). Supernatant z 3A9 buněk se testuje na schopnost podporovat růst buněčné linie CTLL závislé na IL-2. Proliferační odpovědi se měří inkorporací ³H-thymidinu během 3 h dva dny po kultivaci se supernatantem.

Shora popsané příklady jsou pouhými ilustracemi tohoto vynálezu. Odborníkovi z oblasti techniky by mělo být jasné, že jakákoliv kombinace těchto tří domén je v rozsahu tohoto vynálezu. Při syntéze činidla se zkondenzování T-E složky podle vynálezu na cílovou složku dosáhne chemickou kondenzací použitím _λreakčních činidel a způsobů známých odborníkům z oblasti techniky. I když se v uvedených příkladech používá jako kondenzační činidlo výlučně SPDP, v rozsahu tohoto vynálezu je zahrnuto jakékoliv jiné kondenzační, reakční činidlo schopné kovalentně připojit cílovou složku Činidla a známé odborníkům v oblasti techniky. Podobně je odborníkům v oblasti techniky zřejmé, že· lze snadno zkonstruovat DNA kódující buď celé činidlo nebo⁴’* fragmenty tohoto činidla, a jestliže dochází k její expresi v organismu, lze ji použít pro přípravu činidla nebo fragmentů tohoto činidla. Tyto genetické konstrukce činidla podle vynálezu, získané způsoby známými z oblasti techniky, jsou také v rozsahu tohoto vynálezu.

činidlo použité v tomto vynálezu lze používat in vivo buď přímo nebo jako farmaceuticky přijatelnou sůl nebo ester při léčení různých pathofysiologických stavů.

Například jedna forma činidla se může používat při léčení poruch metabolismu glukosy omezením příjmu glukosy některými buňkami. Specifickým příkladem by bylo použití tohoto Činidla při léčení klinické obezity omezením příjmu glukosy tukovými buňkami a tedy snížení hromadění tuků v těchto buňkách.

V jiném příkladu se tohoto činidla může použít při léčení --------hypertenze regulOvánímpř'íjmu iontů buňkami ledvin a tedy regulováním výdeje kapaliny těmito orgány,

V ještě jiném příkladu se tohoto činidla může použít při léčení zánětu regulováním odpovědi cílových buněk na vnější signály, které vyvolávají zánětlivou odpověď.

V ještě jiném příkladu se tohoto činidla může-použít při léčení imunitních poruch regulováním přítomnosti peptidových sekvencí antigen presentujících buněk na efektorové buňky imunitního systému.

Tabulka I

IGF-1 regulace navázání ¹²⁵I-transferinu v 3T3-LI fibroblastech

léčení	IGF-1	bazální	navázání ± SD*
kontrola	-	100	± 28 (n=3)
	+	258	± 46 (n=3)
BoNT-B	-	100	± 8 <n=3)
	+	149	+ 27 (n=3)

Specifické navázání ¹²⁵I-transferinu na 3T3-LÍ fibroblasty vyjádřené jako procento specifického navázání v nepřítomnosti

IGF-1.

Tabulka II

IGF-1 regulace navázání ¹²⁵I-transferinu v 3T3-LI fibroblastech

1	léčení	IGF-1	bazální i	navázání ± SD*
	kontrola	-	100 ±	28 (n=3)
		+	258 ±	46 (n=3)
	BoNT-A	-	100 ±	44 (n=3) . „
		+	149 ±	10 (n=3)

* Specifické navázání ^1Z5I-transferinu na 3T3-LI fibroblasty vyjádřené jako procento specifického navázání v nepřítomnosti IGF-1.

Tabulka III

IGF-1 regulace navázání ¹²⁵I-transferinu v 3T3-LI fibroblastech

léčení	IGF-1	bazální navázání ± SD*
kontrola	-	100 ± 28 (n=3)
	. +	258 ± 46 (n=3)
h₂l-a	-	100 ± 15 (n=3)
	+	134 + 60 (n=3)

Specifické navázání ¹²⁵I-transferinu na 3T3-LI fibroblasty vyjádřené jako procento specifického navázání v nepřítomnosti

IGF-1.

Tabulka IV

Příjem [³H]-2-deoxyglukosy 3T3-LI tukovými buňkami bazální stimulováno insulinem kontrola 1665 ± 67 (n=3) 14328 ± 264 (n=3) léčeno BoNT-A 2306 ± 49 (n=3) 5587 ± 322 (n=3)

Výsledky jsou uvedeny jako průměrné hodnoty + SEM tří stanovení a jsou uvedeny jako celkový počet dezintegrací za minutu (dpm) monovrstvou buněk během 10-minutové inkubace.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Činidlo· pro regulování interakce buňky s jejím vnějším prostředím, vyznačující se tím, že obsahuje tři domény Β, T a E navzájem spolu navázané následujícím způsobem:

doména B - - doména T - - doména Ε , kde doména B znamená vazebnou doménu, která váže činidlo na vazebné místo buňky, která podléhá endocytose, a tím se inkorporuje do endosomu, doména T znamená trans lokační doménu, která přemisťuje Činidlo (s nebo bez vazebného místa) z endosomu přes endosomovou membránu do cytosolu buňky a doména E znamená efektorovou doménu, která inhibuje schopnost RMV transportovat IMP na povrch buňky a znamená doménu nebo fragment domény lehkého řetězce klostridiálního neurotoxinu, který má metaloproteasovou aktivitu závislou na Zn⁺⁺. .
2. Činidlo podle nároku 1, vyznačující se t í m, že doména T znamená doménu nebo fragment domény těžkého řetězce klostridiálního neurotoxinu.
3. Činidlo podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í m, že doména E se získává z botulinového neurotoxinu.
4. činidlo podle kteréhokoliv z nároků l až 3, vyznačující se tím, že doména E se získává z botulinového neurotoxinu typu A.

₊ ^r
5. Činidlo podle nároků 1 až 3,vyznačující se tím, že doména E se získává z botulinového neurotoxinu typu B.
6. činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyzná.....— č -u-j í c-í - s-e' t^ťmf žďdóměňá^ Ť^žnamená část na aminovém konci těžkého řetězce E klostridiálního neurotoxinu.
7. činidlo podle kteréhokoliv z nároků laž6, vyznačující se tím, že doména T znamená část na aminovém konci těžkého řetězce klostridiálního neurotoxinu získaného proteolytickým štěpením trypsinem.
8. Činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že doména T se získává z botulinového neurotoxinu.
9. činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že doména T se získává z botulinového neurotoxinu typu A.
10. činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, v y z fa čující se tím, že doména T se získává z botulinového neurotoxinu typu B.
11. činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, vyzná. . čující se tím, že tři domény B, T a E jsou spolu spojeny následujícím způsobem:

doména B - - X - doména T - - X - - doména E, kde X znamená buď kovalentně naváženou molekulu s raménkem nebo přímou kovalentní vazbu, ale alespoň jeden X znamená *

molekulu s raménkem.
12.. činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že doména B obsahuje ligand na akceptor buněčného povrchu na cílové buňce, schopné endocytosou se inkorporovat do endosomů.
13. Činidlo podle kteréhokoliv z nároků laž 12, vyzná26 čující se tím, že doména B obsahuje ligand na receptor buněčného povrchu na cílové buňce, schopné endocytosou se inkorporovat do endosomu.
14. Činidlo podlé kteréhokoliv z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že doména B obsahuje monoklonální protilátku nebo je odvozena od monoklonální protilátky na povrchový antigen na cílové buňce, schopné endocytosou se inkorporovat do endosomu.
15. činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že doména B, vazebná doména, se váže do vazebného místa, které je charateristické pro specielní typ buněk.
16. Činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, Že ovlivňuje rychlost příjmu glukosy tukovými buňkami.v odpovědi na insulin, kde doména B znamená ligand do vazebného místa na tukové buňce, schopné endocytosou se inkorporovat do endosomu.
17. činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, vy z na -čující s e t í m, že ovlivňuje odpověď neutrofilů

- na fragment C3b doplňku, kde doména B znamená ligand do vazebného místa na neutrofilech, schopné endocytosou se inkorporovat do endosomu.
18. činidlo podle kteréhokoliv z nároků laž 15, vyznačující se tím, že ovlivňuje expresi neutrofilů adhezní molekuly Mac-1, kde doména B znamená ligand do vazebného místa na neutrofilech, schopné endocytosou se inkorporovat do endosomu.
19. Činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, vyzná¥ čující se tím, že ovlivňuje presentaci antigenů antigen-presentujícími buňkami, kde doména B znamená ligand do vazebného místa na anntigen presentujících buň27 kách, schopné endocytosou se inkorporovat do endosomu.^
20. činidlo podle nároku 16, vyznačující Se tím, že doména B znamená ligand na receptor růstového faktoru II podobný insulinu.
21. Činidlo podle nároku 17 nebo 18, vyznačující se t í m, že doména B znamená monoklonální protilátku nebo je. odvozena od monoklonální protilátky na adheznímolekulu pl50,95.
22. Činidlo podle nároku 19, vyznačující se t í in, že doména B znamená monoklonální protilátku nebo je odvozena od monoklonální protilátky na povrchový antigen na antigen presentujících buňkách, schopné endocytosou se inkorporovat do endosomu.
23. činidlo podle nároku 20, v y z n a č u j í c í se tím, že doména B znamená růstový faktor II podobný'insulinu.
24. Činidlo podle nároku 21, vyznačující se t í m, že doména B 'znamená nebo je odvozena od monoklonální protilátky SHCL3.
25. činidlo podle nároku 22, vyznačující se tím, že doména B znamená nebo je odvozena od monoklonální protilátky LL2.
26. činidlo podle nároku 23, vyznačující se tím, že doména B znamená růstový faktor II podobný insulinu, doména T znamená část na aminovém konci těžkého řetězce botulinového neurotoxinu typu A získaného proteolytickým štěpením.trypsinem a doména E znamená lehký ře, tězec botulinového neurotoxinu typu A.
27. činidlo podle nároku 24, vyznačující se tím, že doména B znamená monoklonální protilátku SHCL3, doména T znamená část na aminovém konci těžkého řetězce botulinového neurotoxinu typu A získaného proteolytickým štěpením trypsinem a doména E znamená lehký řetězec botulinového neurotoxinu typu A.
28. Činidlo podle nároku 25, vyzn.ačující se tím, že doména B znamená monoklonální protilátku LL2, doména T znamená část na aminovém konci.těžkého řetězce botulinového neurotoxinu typu A získaného proteolytickým štěpením trypsinem a doména E znamená lehký řetězec botulinového neurotoxinu typu A.

*
29. Způsob získání činidla podle kteréhokoliv z nároků 1 až 28, vyznačující se t í m, že zahrnuje ko-_;valentní připojení tří domén B, T a E následujícím způsobem:

doména B - - doména T - - doména E.
30. Způsob získání činidla podle kteréhokoliv z nároků 1 až 28, vyznačující se t í m, že zahrnuje kovalentní připojení tří domén B, T a E následujícím způsobem:

doména B - - X - - doména T - - X - - doména E , kde X znamená buď kovalentně naváženou molekulu s raménkem nebo přímou kovalentní vazbu, ale alespoň jeden X znamená molekulu s raménkem.
31. Způsob získání činidla podle kteréhokoliv z nároků i až 28, vyznačující se tím, že zahrnuje zkonstruování genetické konstrukce, která kóduje činidlo, zahrnutí této konstrukce do hostitelského organismu a expresi této konstrukce za vzniku činidla.

z nároků 1 až 28 pro stavů abnormálního
32. Použití činidla podle kteréhokoliv výrobu léčivého prostředku pro léčení tr'anspóřtLr~IHP” k membráně buňky v RMV
33. Použití činidla podle kteréhokoliv výrobu léčivého prostředku pro léčení g1úkosy.

t
34. Použití činidla podle kteréhokoliv výrobu „léčivého prostředku pro léčení
35. Použití činidla podle kteréhokoliv výrobu léčivého prostředku pro léčení
36. Použití činidla podle kteréhokoliv výrobu léčivého prostředku pro léčení nění .
37. Použití činidla podle kteréhokoliv výrobu léčivého prostředku pro léčení systému.