PL178895B1

PL178895B1 - Nowy oczyszczony czynnik do kontrolowania oddziaływania komórki z jej środowiskiem zewnętrznym i sposób wytwarzania czynnika do kontrolowania oddziaływania komórki z jej środowiskiem zewnętrznym

Info

Publication number: PL178895B1
Application number: PL94310698A
Authority: PL
Inventors: John R. North; Keith A. Foster; Conrad P. Quinn; Clifford Ch. Shone
Original assignee: Microbiological Res Authority; Speywood Lab Ltd
Priority date: 1993-03-19
Filing date: 1994-03-18
Publication date: 2000-06-30
Also published as: HUT76556A; KR960700756A; IN178499B; ATE228856T1; AU6217594A; JP4740206B2; SG73411A1; HU217220B; CA2158647A1; NZ262484A; FI954390A0; DE69431832T2; GB9305735D0; WO1994021300A2; CN1195551C; DE69431832D1; NO953643L; AU671203B2; SK115595A3; FI954390A

Abstract

1. Nowy oczyszczony czynnik do kontrolowania oddzialywania komórki z jej srodowiskiem zewnetrznym, przez kon- trolowanie transportu Bialek Integralnych Blony (IMP) do blony komórkowej w Odnawialnych Pecherzykach Blonowych (RMV), który obejmuje trzy Domeny: B, T i E polaczone ze soba w nastepujacy sposób: Domena B — Domena T — Domena E gdzie Domena B jest Domena wiazaca, która wiaze czynnik z Miejscem wiazania, na komórce, które ulega endocytozie i jest wbudowywane do endosomu, przy czym domena B nie jest uzyskana z neurotoksyny Clostridium; Domena T jest Domena przenoszaca, która przenosi czynnik (z lub bez innych domen czynnika i/lub Miejsca wiazania) z endosomu przez blone endosomalna do cytozolu komórki; i Domena E jest Domena efektorowa, która hamuje zdolnosc RMV do transportowania IMP do powierzchni komórki i jest domena lub fragmentem domeny Lancucha lekkiego neurotoksyny Clostridium posiadajacego aktywnosc metaloproteinazy zaleznej od Zn2 + . 30. Sposób wytwarzania czynnika do kontrolowania oddzialywania komórki z jej srodowiskiem zewnetrznym, przez kontrolowanie transportu Bialek Integralnych Blony (IMP) do blony komórkowej w Odnawialnych Pecherzykach Blono- wych (RMV), który obejmuje trzy Domeny: B, T i E polaczone ze soba w nastepujacy sposób: Domena B — Domena T — Domena E, przy czym Domena B jest Domena wiazaca, która wiaze czynnik z Miejscem wiazania, na komórce, które ulega endocytozie i jest wbudowywane do endosomu, przy czym Domena B nie jest uzyskana z neurotoksyny Clostridium; Domena T jest Domena przenoszaca która przenosi czynnik (z lub bez innych domen czynnika i/lub Miejsca wiazania) z endosomu przez blone endosomalna do cytozolu komórki; 1 Domena E jest Domena efektorowa, która hamuje zdolnosc RMV do transportowania IMP do powierzchni komórki i jest domena lub fragmentem domeny lancucha lekkiego neurotoksyny Clostridium posiadajacego aktywnosc metaloproteinazy zaleznej od Zn2 + , znamienny tym, ze trzy Domeny B, T i E kontaktuje sie najpierw z reagentem sprzegajacym, po czym kon- taktuje sie je ze soba wiazac je kowalencyjnie w sposób wskazany powyzej. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy czynnik do kontrolowania oddziaływania poszczególnych typów komórek ssaków z ich środowiskiem zewnętrznym. Czynnik znajduje zastosowanie jako środek farmaceutyczny do leczenia różnych chorób. Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania takiego czynnika.

Podstawową czynnością żywych komórek jest ich zdolność do odpowiadania na ich środowisko zewnętrzne. Granicą pomiędzy komórką a jej środowiskiem zewnętrznym jest błona komórkowa. Błona komórkowa zbudowana j est z dwuwarstwy fosfolipidowej, w której zanurzonych jest wiele rodzajów cząsteczek białkowych. Te Integralne Białka Błony (IMP) odpowiedzialne są za wiele oddziaływań komórki z jej środowiskiem zewnętrznym.

Oddziaływania, w których biorą udział IMP obejmują: transport substancji, w tym substancji odżywczych, do i z komórki; regulowaną przenikalność błony komórkowej dla jonów; rozpoznawanie i odpowiedź na cząsteczki zewnątrzkomórkowe; i przyleganie komórki do innej komórki. Wyspecjalizowane funkcje układu odpornościowego, w których również uczestniczą IMP, obejmują przedstawianie szczególnych sekwencji peptydowych przez jedną z grup komórek odpornościowych innej grupie. Jednąz możliwości regulowania przez komórkę swojej zdolności do odpowiedzi na środowisko zewnętrzne i oddziaływania ze środowiskiem zewnętrznym, jest zmiana ilości i typów IMP obecnych z błonie plazmatycznej. Jednym z mechanizmów, dzięki którym jest to osiągane, jest odwracalna internalizacja IMP szlakiem endocytamym do Odnawialnych Pęcherzyków Błonowych (RMV). W tych przypadkach IMP magazynowane są w RMV tworzących magazyn wewnętrzny albo pulę IMP, dostępną do szybkiego eksportu na powierzchnię komórki drogąprocesu fuzji egzocytamej RMV z błonąplazmatyczną. Modulacja równowagi tego cyklu egzocytozy/endocytozy umożliwia szybką regulację

178 895 gęstości IMP obecnych na powierzchni komórki. W jednym przykładzie procesu kontrolowania aktywności komórki, regulowane jest pobieranie glukozy przez komórki zdolne do reagowania na insulinę w mięśniach szkieletowych i tkance tłuszczowej. Insulina zwiększa ilość szczególnej izoformy transportera glukozy, GLUT4, spotykanego w błonie komórkowej tych komórek. Wyższe stężenie cząsteczek GLUT4 na powierzchni komórek powoduje zwiększone pobieranie glukozy. Tak więc, przez kontrolowanie liczby transporterów glukozy obecnych w błonie plazmatycznej może być modulowana odpowiedź na insulinę.

Innym przykładem zmiany w ekspresji IMP na powierzchni komórki w odpowiedzi na sygnały zewnętrzne jest odpowiedź receptorów dla składników dopełniacza C3b i C4b, receptorów dopełniacza typu 1 CR1. Pod wpływem aktywacji ludzkich neutrofilów ekspresja CR1 w błonie plazmatycznej przejściowo zwiększa się 6- do 10-krotnie.

W innym przykładzie, pod wpływem pobudzenia, znaczna liczba komórek stanu zapalnego i układu odpornościowego zmienia ekspresję na swej powierzchni cząsteczek adhezyjnych. Podobnie, aktywacja neutrofili i monocytów prowadzi do modulacji na powierzchni tych komórek cząsteczek adhezyjnych Mac-1 i pl50,95. Te cząsteczki adhezyjne pełnią ważne funkcje w kierowaniu i poruszaniu komórek stanu zapalnego do miejsc, gdzie toczy się stan zapalny.

W jeszcze innym przykładzie, różne hormony (insulina, insulinopodobny czynnik wzrostowy, interleukina 1 i płytkowopochodny czynnik wzrostowy) powodują raptowne zwiększenie, na powierzchni komórek, receptora transferyjny w wielu typach komórek. Receptor dla transferyny wiąże transferynę, związaną z dwoma jonami żelaza, ze środowiska zewnętrznego komórki i w ten sposób uczestniczy w pobieraniu żelaza przez komórkę Układ transferyna/receptor dla transferyny może również odgrywać rolę w przezkomórkowym transporcie żelaza do CNS (CUN) przez barierę krew/mózg, procesie znanym jako transcytoza. Transcytoza bierze również udział w przeniesieniu matczynej odporności na rozwijający się płód.

W jeszcze innym przykładzie, hormon diuretyczny, aldosteron, znany jest ze zwiększania ekspresji na powierzchni komórki kanałów Na⁺ w błonie szczytowej nabłonkowych pęcherza moczowego. Mechanizm ten bierze udział w retencji soli i występuje, przykładowo, w stanie diety nisko-solnej.

W dalszym przykładzie modulacji ekspresji IMP w błonie komórkowej, zauważono, że czynność układu odpornościowego opiera się na rozpoznawaniu obcych, czyli nie-swoich, antygenów. Część tego rozpoznawania i odpowiedzi odpornościowej zapewniana jest przez komórki układu odpornościowego, które są zdolne do rozpoznawania i odpowiedzi na obce sekwencje peptydowe. Te sekwencje peptydowe prezentowane są komórkom układu odpornościowego przez inne komórki tego układu znane jako komórki prezentujące antygen. Komórki prezentujące antygen wchłaniają obce antygenowo białka, trawią ich peptydy i pokazują obce peptydy w rowku utworzonym w błonie komórkowej przez IMP głównego układu zgodności tkankowej.

Stąd, IMP odgrywają kluczową rolę w zdolności komórki do oddziaływania z jej środowiskiem zewnętrznym i nie jest zaskakującym, w oparciu o różnąi wszechstronną naturę tych oddziaływań, stwierdzenie, że zakres działania różnych IMP jest niezwykle szeroki. Kluczowa rola IMP dla czynności komórki oznacza, że są one często związane ze stanami patofizjologicznymi i są celem dla wielu zabiegów leczniczych.

W poprzednim stanie wiedzy, podejścia do kontrolowania aktywności IMP skupiały się głównie na modulowaniu funkcji IMP już ekspresjonowanych na powierzchni komórki. Stąd uprzedni stan wiedzy w dziedzinie interwencji leczniczych dążył do specyficzności w stosunku do poszczególnych IMP i szczególnych funkcji poszczególnych typów komórek. Opracowywano inhibitory specyficznych transportowych IMP jako czynniki terapeutyczne. Przykładowo, inhibitory białek transportujących 5HT neuronów używane sąjako leki antydepresyjne. Antagoniści poszczególnych receptorowych IMP używane są powszechnie jako środki farmaceutyczne. Przykłady obejmują leki przeciwhistaminowe, które są specyficzne dla obu podtypów HI i H2 receptorów histaminowych, oraz antagonistów receptorów adrenergicznych β. Inhibitory funkcji IMP są również szeroko stosowane jako środki farmaceutyczne. Przykłady obejmują inhibitory śródbłonowego transportu jonów jak diuretyki: furosemid i amilorid, z których ten drugi jest in

178 895 hibitorem kanałów Na⁺ błony szczytowej komórek nabłonka pęcherza moczowego. Inhibitory kanałów potasowych znane są jako opracowywane leki antyarytmiczne. IMP przylegania komórkowego są obecnie również celem opracowywania selektywnych antagonistów.

Innym podejściem jest selektywna modyfikacja ekspresji poszczególnych IMP na poziomie genetycznym przez zmianę poziomu transkrypcji odpowiedniego genu kodującego IMP i w ten sposób modulację syntezy białka konkretnego IMP.

W sumie, IMP znane sąz odgrywania kluczowej roli w odpowiedzi komórki na jej środowisko zewnętrzne. Poprzednio podejścia kontrolowania IMP używały głównie celowania specyficznego IMP na powierzchni komórki i modyfikowania jego funkcji. Uważa się, że regulowanie gęstości IMP w błonie komórkowej może mieć szerokie zastosowanie przy leczeniu różnych chorób. W świetle olbrzymiej różnorodności IMP i szczególnej natury obecnych interakcji leczniczych zaskakujące jest stwierdzenie, na którym oparty jest wynalazek, że pojedyncza klasa czynników może modulować ekspresję IMP w różnych typach komórek. Ta sama klasa środków jest również zdolna do modyfikacji ekspresji IMP transportowych, IMP receptorowych, IMP adhezyjnych, IMP kanałowych i IMP prezentujących antygen. Poprzednio, czynniki wpływające na IMP klasyfikowano na podstawie funkcji, przykładowo antagoniści Ca²⁺, zaś ich chemiczna i mechanistyczna natura była bardzo różna. Klasa środków będących przedmiotem niniejszego wynalazku, w przeciwieństwie, jest strukturalnie homogenna, z racjonalnie wprowadzonymi zamiennikami poszczególnych domen, posiadających określony wpływ na funkcję czynnika. W dalszym aspekcie wynalazku, czynnik może być specyficznie kierowany do poszczególnych typów komórek w celu wywołania selektywnej modulacji ekspresji IMP tylko w tym typie komórek.

Niniejszy wynalazek dotyczy nowego czynnika do kontrolowania oddziaływania komórki z jej środowiskiem zewnętrznym przez kontrolowanie transportu cząsteczek Białek Integralnych Błony (IMP) z wewnętrznych przedziałów komórki do błony komórkowej, tak, że oddziaływanie komórki z jej środowiskiem zewnętrznym jest modulowane. Nowy czynnik modyfikuje strukturę Odnawialnych Pęcherzyków Błonowych (RMV) tak, że jest zahamowana ich zdolność do transportu IMP do powierzchni komórki.

Definicje:

Integralne Białka Błony (IMP) oznaczają każde białko, wbudowane i przenikające przez lipidową dwuwarstwę błony biologicznej.

Odnawialne Pęcherzyki Błonowe (RMV) oznaczają pęcherzyki wewnątrzkomórkowe, obecne w cytozolu komórki, związane z dwuwarstwową błoną lipidową. RMV są utworzone z błony plazmatycznej i poruszają się do wnętrza komórki w procesie określanym jako endocytoza. RMV podlegają cyklicznym procesom tworzenia się i łączenia z błoną plazmatyczną komórki. Proces poruszania się do błony i łączenia się z błoną plazmatyczną określany jest jako egzocytoza. Czynnością RMV w komórce jest odwracalny transport IMP do i z powierzchni komórki; co powoduje ich odmienność od pęcherzyków wydzielniczych komórek neurosekrecyjnych.

Endosomy oznaczają takie pęcherzyki wewnątrzkomórkowe, które tworzą się z błony komórkowej w procesie zwanym endocytozą.

Łańcuch ciężki oznacza większy z dwóch łańcuchów polipeptydowych tworzących neurotoksynę Clostridium; posiada on masę cząsteczkową około 100 kDa i jest powszechnie określany jako HC. Łańcuch lekki oznacza mniejszy z dwóch łańcuchów polipeptydowych tworzących neurotoksynę Clostridium; posiada on masę cząsteczkową około 50 kDa i określany jest powszechnie jako LC. W naturze łańcuch lekki i ciężki połączone są kowalencyjnie przez co najmniej jeden mostek dwusiarczkowy.

Fragment H₂ oznacza fragment uzyskany z końca aminowego łańcucha ciężkiego neurotoksyny Clostridium, przez trawienie proteolityczne przy użyciu, przykładowo, trypsyny lub papainy.

Fragment H₂L oznacza fragment neurotoksyny Clostridium, wytworzony przez trawienie proteolityczne przy użyciu, przykładowo, trypsyny lub papainy, gdy łańcuch lekki wciąż jest połączony z fragmentem H₂ wiązaniami dwusiarczkowymi.

178 895

W jednym z aspektów wynalazku dostarczony jest czynnik do kontrolowania poziomu 1MP odpowiedzialnych za transport metabolitów przez błonę komórkową, tak, że kontrolowana jest dostępność metabolitu w komórce. W innym aspekcie wynalazku dostarczony jest czynnik do kontrolowania poziomu IMP w komórce, odpowiedzialnych za transport metabolitów przez błonę komórkową, do i z komórki, tak, że kontrolowany jest transport metabolitu przez komórkę.

W jeszcze innym aspekcie wynalazku dostarczony jest czynnik do kontrolowania poziomu IMP w komórce, odpowiedzialnych za selektywną przenikalność przez błonę komórkową jonów, tak, że modulowane jest stężenie jonów w komórce.

W jeszcze innym aspekcie wynalazku dostarczony jest czynnik do kontrolowania poziomu IMP w komórce, odpowiedzialnych za rozpoznawanie cząsteczek przekazujących sygnał tak, że modulowana jest zdolność do odpowiadania komórki na cząsteczki przekazujące sygnał.

W jeszcze innym aspekcie wynalazku dostarczony jest czynnik do kontrolowania poziomu IMP w komórce, odpowiedzialnych za przekazywanie sygnału przez błonę komórkową, w następstwie związania się z błoną cząsteczki przekazującej sygnał, tak, że modulowanajest zdolność do odpowiadania komórki na cząsteczki przekazujące sygnał.

W jeszcze innym aspekcie wynalazku dostarczony jest czynnik do kontrolowania poziomu IMP w komórce, odpowiedzialnych za pokazywanie na powierzchni komórek fragmentów peptydów uzyskanych z wchłoniętych antygenów. Wynikiem tego w organizmie jest wpływ na odpowiedź odpornościową tego organizmu.

Wynalazek dostarcza również czynnika, który posiada swoistość do typu komórek docelowych, tak, że zakres działania czynnika jest ograniczony do wspomnianych typów komórek.

Jak to uprzednio stwierdzono, podejścia do kontrolowania aktywności IMP, oparte na uprzednim stanie wiedzy, polegały głównie na modulowaniu funkcji IMP już ekspresjonowanych na powierzchni komórki. W przeciwieństwie do powyższego, niniejszy wynalazek moduluje poziom IMP, które będą ekspresjonowane na powierzchni komórki.

Jak można zauważyć, cel wynalazku, którym jest dostarczenie czynnika do kontrolowania poziomu IMP na powierzchni komórki, posiada liczne zastosowania w modulowaniu odpowiedzi komórki na jej środowisko. Wynalazek obejmuje czynnik, którego funkcja wpływa na mechanizmy, dzięki którym IMP przenoszone sąna powierzchnię komórki, co udokumentowano przykładami, np. przykładem 1 i 2. Czynnik taki musi wypełniać trzy różne funkcje, z których dwie pierwsze sąznane. Po pierwsze, musi wiązać się ze strukturąpowierzchni komórki (Miejsce Wiązania). Musi wchodzić do cytozolu komórki. Wejście cząsteczek do komórki opiera się na endocytozie, i tylko Miejsca Wiązania są odpowiednie do tego celu. Pobrany przez komórkę drogą endocytozy, czynnik musi opuścić powstały endosom przez błonę endosomalną w celu wniknięcia do cytozolu. Zdolność do związania się ze specyficzną komórką i wniknięcie czynnika do cytozolu jest znane w literaturze (przykładowo: Pastan, I; Willingham, MC; & Fitzgerald, DSP, 1986, Celi 47,641-648, Olsnes, S; Sandvig, K; Petersen, OW; & VanDews, B, 1989, Immunol. Today 10,291-295, Strom, TB; Anderson, PL; Rubin-Kelley, VE; Williams, DP; Kiyokawa, T; & Murphy, JR, 1991, AnnN. Y. Acad. Sci. 636,233-250). Trzeciąfunkcjączynnikajest nieoczekiwane stwierdzenie zdolności do wpływania na RMV. Dalszym, nieoczekiwanym aspektem niniejszego wynalazku jest to, że wpływanie na RMV ogranicza ich zdolność do transportowania IMP do powierzchni komórki.

Czynnik, będący przedmiotem niniejszego wynalazku, składa się z trzech Domen czynnościowych B, T i E, połączonych ze sobą w następujący sposób:

Domena B — Domena T — Domena E gdzie

Domena B jest Domeną wiążącą, która wiąże czynnik z Miejscem wiązania, na komórce, które ulega endocytozie i jest wbudowywane do endosomu, przy czym domena B nie jest uzyskana z neurotoksyny Clostridium;

Domena T jest Domeną przenoszącą, która przenosi czynnik (z lub bez innych domen czynnika i/lub Miejsca wiązania) z endosomu przez błonę endosomalnądo cytozolu komórki; i

178 895

Domena E jest Domeną efektorową, która hamuje zdolność RMV do transportowania IMP do powierzchni komórki i jest domeną lub fragmentem domeny Łańcucha lekkiego neurotoksyny Clostridium posiadającego aktywność metaloproteinazy zależnej od Zn²⁺.

Domena B może być wykonana w sposób zapewniający specyficzność dla typu komórki docelowej. Zdolność do kierowania czynnika do poszczególnego typu komórek jest dobrze znana. Stąd, funkcje Domeny B mogą być uzyskane przy użyciu jednej z wielu znanych cząsteczek wiążących się z komórką, obejmujących, choć nie ograniczonych do: przeciwciał, przeciwciał monoklonalnych, fragmentów przeciwciał (Fab, F(ab)'₂, Fv, przeciwciał jednołańcuchowych, itp), hormonów, cytokin, czynników wzrostowych i lektyn.

Funkcje Domeny T mogą być uzyskane przez cząsteczki zdolne do tworzenia odpowiednich porów w błonie endosomalnej. Jest dobrze udokumentowane, że pewne części cząsteczek toksyn są zdolne do tworzenia takich porów, w tym, m. in.: fragmenty toksyny wąglika, toksyny jadu kiełbasianego, toksyny tężca, toksyny krztuśca i endotoksyny Pseudomonas (Hoch, DH; Romero-Mira, M; Ehrlich, BE; Finkelstein, A; Das Gupta, BR; & Simpson, LL, 1985, PNAS 82, 1692-1696; Olsnes, S; Stenmark, H; Moskaug, JO; McGill, S; Madshus, IH; & Sandvig, K, 1990, Microbial Pathogenesis 8,163-168). Jednąz takich cząsteczekjest Łańcuch ciężki neutotoksyny Clostridium, przykładowo neurotoksyny typu A jadu kiełbasianego. Odkryto korzystne zastosowanie tylko tych części cząsteczki toksyny, która jest zdolna do tworzenia porów w błonie endosomalnej.

Funkcje Domeny E, hamowanie zdolności do transportowania IMP do powierzchni komórki nie są znane w tej dziedzinie wiedzy. Nieoczekiwanie, stwierdzono, że różne części pewnych cząsteczek toksyny różne funkcjonalnie od tych, zdolnych do tworzenia porów, w tym fragmenty neurotoksyn Clostridium, zarówno toksyny jadu kiełbasianego jak i tężca, gdy wprowadzone są do cytoplazmy komórek docelowych, są zdolne do zahamowania transportu IMP w RMV do powierzchni komórki, zmniejszając stężenie tych IMP na powierzchni komórki. W szczególności, stwierdzono, że fragmenty toksyny tężca i jadu kiełbasianego typu A, B, C₂, D, E, F i G są szczególnie użyteczne. Przykładem takiej cząsteczki jest część neurotoksyny Clostridium, znanej jako fragment H₂L, z której usunięto aktywność kierującą na neurony końca karboksylowego połowy łańcucha ciężkiego, pozostawiając połowę z końca aminowego, połączoną wiązaniem dwusiarczkowym z łańcuchem lekkim. Innym przykładem może być łańcuch lekki neurotoksyny pałeczki jadu kiełbasianego typu B, w szczególności te części cząsteczki, które posiadają aktywność metaloproteinazy zależnej od Zn²⁺.

Domeny czynnika według wynalazku są związane kowalencyjnie wiązaniami, które mogą obejmować odpowiednie regiony odstępnika pomiędzy Domenami.

W jednym z wykonań wynalazku, Domena B jest cząsteczką wiążącą, zdolną do wiązania z Miejscem Wiązania na komórce docelowej, która ulega endocytozie, Domena T jest łańcuchem ciężkim neurotoksyny pałeczki jadu kiełbasianego lub jej fragmentem i Domena E jest łańcuchem lekkim neurotoksyny pałeczki jadu kiełbasianego lub jej fragmentem. Domeny T i E pochodzą z tego samego lub różnych serotypów C. botulinum.

W innym wykonaniu wynalazku, Domena B jest cząsteczką wiążącą, zdolną do wiązania z Miejscem Wiązania na komórce docelowej, które ulega endocytozie, Domena T jest łańcuchem ciężkim neurotoksyny tężca lub jej fragmentem zaś Domena E jest łańcuchem lekkim neurotoksyny pałeczki jadu kiełbasianego lub jej fragmentem.

W innym wykonaniu wynalazku, Domena B jest cząsteczką wiążącą, zdolną do wiązania z Miejscem Wiązania na komórce docelowej, które ulega endocytozie, Domena T jest łańcuchem ciężkim neurotoksyny tężca lub jej fragmentem zaś Domena E jest łańcuchem lekkim neurotoksyny tężca lub jej fragmentem. Jest zrozumiałe, że wynalazek obejmuje każde połączenie cząsteczek toksyn lub ich fragmentów z tego samego lub z różnych organizmów, których funkcje opisano. Gdy czynnik podawany jest organizmowi, zmniejsza się stężenie IMP na powierzchni komórki docelowej. Może to prowadzić do wielu pożądanych efektów, takich jak zmniejszone pobieranie metabolitów lub jonów do lub przez komórkę docelową, zmniejszoną odpowiedź

178 895 komórki docelowej na cząsteczki przekazujące sygnał lub zmiana odpowiedzi odpornościowej organizmu.

Korzystnie Domena T jest domeną lub fragmentem domeny łańcucha ciężkiego neurotoksyny Clostridium, a korzystnie częścią aminokwasową łańcucha ciężkiego neurotoksyny Clostridium.

Korzystnie Domena T jest uzyskana z neurotoksyny botulinowej (jadu kiełbasianego), korzystnie typu A lub typu B.

Również Domenę E uzyskuje się z neurotoksyny botulinowej (jadu kiełbasianego), korzystnie typu A lub typu B.

Domena B stanowi ligand receptora na powierzchni komórki docelowej, zdolnego do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu. Korzystnie, Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne lub jest uzyskiwana z przeciwciała monoklonalnego, skierowanego przeciwko antygenowi na powierzchni komórki docelowej, zdolnemu do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu. Domena B, Domena wiążąca, wiąże się z Miejscem wiązania, które jest charakterystyczne dla konkretnego typu komórki.

Czynnik według wynalazku wpływa na stopień wychwytu glukozy przez komórkę tłuszczową w odpowiedzi na insulinę, przy czym zawarta w nim Domena B stanowi ligand miejsca wiązania na powierzchni komórki tłuszczowej, zdolnego do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu. Korzystnie, Domena B stanowi ligand dla receptora insulinopodobnego czynnika wzrostowego Π, a zwłaszcza Domena B stanowi insulinopodobny czynnik wzrostowy II.

Czynnik według wynalazku może też wpływać na zdolność do odpowiedzi neutrofilów na składnik dopełniacza C3b, a zawarta w nim Domena B stanowi ligand miejsca wiązania na powierzchni neutrofila, zdolnego do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu oraz wpływa na ekspresję cząsteczki adhezyjnej Mac-1 przez neutrofile, a zawarta w nim Domena B stanowi ligand miejsca wiązania na powierzchni neutrofila, zdolnego do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu. W obu tych przypadkach korzystnie Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne albo jest uzyskana z przeciwciała monoklonalnego przeciwko cząsteczce adhezyjnej pl50, 95, a zwłaszcza B stanowi przeciwciało monoklonalne albo jest uzyskana z przeciwciała monoklonalnego SHCL3.

Czynnik wpływa też na prezentowanie antygenu przez komórki prezentujące antygen, a zawarta w nim Domena B stanowi ligand miejsca wiązania na powierzchni neutrofila, zdolnego do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu, a korzystnie Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne albo jest uzyskana z przeciwciała monoklonalnego przeciwko antygenowi powierzchniowemu komórki prezentującej antygen, zdolnemu do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu, a zwłaszcza Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne albo jest uzyskana z przeciwciała monoklonalnego LL2.

Korzystnie w czynniku według wynalazku Domena B stanowi insulinopodobny czynnik wzrostowy II, Domena T stanowi aminokońcową część łańcucha ciężkiego neurotoksyny botulinowej typu A, uzyskaną trawieniem proteolitycznym z użyciem trypsyny, i Domena E stanowi łańcuch lekki neurotoksyny botulinowej typu A.

Korzystnie też w czynniku według wynalazku Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne SHCL3, Domena T stanowi aminokońcową część łańcucha ciężkiego neurotoksyny botulinowej typu A, uzyskaną trawieniem proteolitycznym z użyciem trypsyny, i Domena E stanowi łańcuch lekki neurotoksyny botulinowej typu A.

Korzystnie także w czynniku według wynalazku Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne LL2, Domena T stanowi amino-końcową część łańcucha ciężkiego neurotoksyny botulinowej typu A, uzyskaną trawieniem proteolitycznym z użyciem trypsyny, i Domena E stanowi łańcuch lekki neurotoksyny botulinowej typu A.

Czynnik według wynalazku może korzystnie być w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub estru.

178 895

Czynnik według wynalazku może korzystnie mieć następującą budowę:

Domena B -X- Domena T -X- Domena E gdzie X oznacza albo cząsteczkę odstępnika związaną kowalencyjnie lub bezpośrednie wiązanie kowalencyjne, ale przynajmniej jeden z X oznacza cząsteczkę odstępnika.

Sposób wytwarzania czynnika według wynalazku polega na tym, że trzy Domeny B, T i E kontaktuje się najpierw z reagentem sprzęgającym, po czym kontaktuje się je ze sobą wiążąc je kowalencyjnie w kolejności:

Domena B — Domena T — Domena E.

W przypadku wytwarzania czynnika o budowie

Domena B -X- Domena T -X- Domena E w której co najmniej jeden z X oznacza cząsteczkę odstępnika trzy Domeny B, T i E kontaktuje się z reagentem sprzęgającym, przy czym co najmniej dwie z nich kontaktuje się też z cząsteczką odstępnika zdolnego do wiązania kowalencyjnego, i wiąże się je kowalencyjnie we wskazanej kolejności.

Korzystnie do wytwarzania czynnika według wynalazku Domeny T i E stosuje się już w sprzężonej formie.

Przykład 1. Fibroblasty 3T3-LI trypsynizowano do uzyskania zawiesiny i poddano elektroporacji przy 300V/cm, 960 mF w czasie 11-11.5 ms, przy użyciu urządzenia Gene Pulsar, z przystawką zwiększającą pojemność, f-my BioRad, w obecności lub pod nieobecność 1 mM neurotoksyny botulinowej B (BoNT-B). Po elektroporacji komórkom umożliwiono przylgnięcie i hodowano w postaci pojedynczej warstwy w 37°C w płytkach 24-studzienkowych przez 72 godziny. Komórki przemywano i inkubowano przez 5 minut w obecności lub pod nieobecność 5 nM insulinopodobnego czynnika wzrostowego typu 1 (IGF-1), a następnie pozostawiano na lodzie przez 5 minut. Supematanty aspirowano znad komórek i zastępowano lodowatą 1.5 nM ¹²⁵I-transferyną (akt. spec. 47 Tbq/mmol). Wiązanie niespecyficzne oceniano w równoległej inkubacji wykonanej w obecności 100 krotnego nadmiaru transferyny nieradioaktywnej. Po dwóch godzinach supematant usuwano zaś komórki przemywano trzykrotnie lodowatym buforem, po czym trawiono warstwę komórek 1 N NaOH, i mierzono związaną ¹²⁵I-transferynę przy użyciu urządzenia LKB1275 minigamma gamma counter. Podwyższenie wiązania transferyny obliczano jako specyficzne wiązanie ¹²⁵I-transferyny w obecności IGF-1, wyrażone jako procent wiązania specyficznego pod nieobecność IGF-1.

Tabela 1 pokazuje zmniejszone podwyższenie wiązania ¹²⁵I-transferyny w odpowiedzi na IGF-1 w komórkach traktowanych BoNT-B, w porównaniu z kontrolą. Wskazuje to, że wprowadzenie BoNT-B do cytozolu fibroblastów 3T3-LI hamuje stymulowaną przez IGF-1 dodatnią regulację receptorów dla transferyny w tych komórkach.

Produkty trawienia białek rozpuszczalnych w Tritonie Χ-114, ekstrahowanych z fibroblastów 3T3-LI, analizowano met. Western biot przy użyciu przeciwciała monoklonalnego, indukowanego przez sekwencję peptydową o Identyfikatorze Sekw. Nr 1: (QQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRK YWWKNLK), stwierdzonej w białku pęcherzyków wydzielniczych komórek neurosekrecyjnych. To przeciwciało przeciw-pęcherzykowe wykazywało zmniejszoną reaktywność z odpowiednim podwójnym prążkiem w próbkach z traktowanych BoNT-B fibroblastów, u których nie opisano aktywności neurosekrecyjnej. Stąd, BoNT-B modyfikuje strukturę pęcherzyków (prawdopodobnie RMV) w fibroblastach 3T3-LI konkurencyjnie z dodatnią regulacją receptorów dla transferyny.

178 895

Przykład 2. Fibroblasty 3T3-LI poddano elektroporacji w obecności lub pod nieobecność 0.5 mM neurotoksyny botulinowej A (BoNT-A) używając warunków identycznych jak podane w przykładzie 1. Stymulację przy użyciu IGF-1 wiązania ¹²⁵I-transferyny badano w traktowanych i nietraktowanych komórkach jak to opisano w przykładzie 1. Wyniki przedstawione w tabeli 2 pokazują, że traktowanie BoNT-A fibroblastów 3T3-LI znosi dodatniąregulację wiązania ¹²⁵I-transferyny obserwowaną w odpowiedzi na IGF-1. Wskazuje to, że wprowadzenie BoNT-A do cytozolu fibroblastów 3T3-LI hamuje stymulowaną przez IGF-1 dodatnią regulację receptora dla transferyny w tych komórkach.

Przykład 3. Fibroblasty 3T3-LI poddano elektroporacji w obecności lub pod nieobecność 0.5 mM fragmentu H₂L BoNT-A (H₂L-A), używając warunków identycznych jak podane w przykładzie 1. Fragment ten jest wytwarzany z neurotoksyny, serotypu A C. botulinum, przez ograniczoną proteolizę przy użyciu trypsyny poddanej działaniu tosylo-fenylalanylochlorometanu. Kompleks H₂L jest następnie oczyszczany przez chromatografię na sefadeksie G-200 (Shone, CC; Hambleton, P; & Melling, J. 1985, Eur. J. Biochem 151,17-82). Elektroporację wykonano jak to opisano w przykładzie 1, podobnie jak oznaczenie stymulacji przez IGF-1 wiązania ¹²⁵I-transferyny, w traktowanych i nietraktowanych komórkach.

Wyniki w tabeli 3 pokazują że traktowanie fragmentem H₂L-A fibroblastów 3T3-LI hamuje dodatnią regulację wiązania ¹²⁵I-transferyny. Wskazuje to, że wprowadzenie fragmentu H₂L-A neurotoksyny jadu kiełbasianego do cytozolu fibroblastów 3T3-LI hamuje stymulowaną przez IGF-1 dodatnią regulację receptora transferyny w tych komórkach.

Przykład 4. Z fibroblastów 3T3-LI wyróżnicowano adipocyty 3T3-LI przez traktowanie ich deksametazonem, 3-izobutylo-l-metyloksantynąi insuliną jak to opisano (Frost, SC & Lane MD, 1985, J. Biol. Chem. 260, 2646-2652). Adipocyty 3T3-LI w 7 dni po różnicowaniu traktowano neurotoksyną Botulinum serotyp A w pożywce Dulbecco’s zawierającej surowicę i sterylizowanej przez filtrowanie (stężenie końcowe BoNT-A: 200 nM). Komórki traktowane toksyną i kontrolne inkubowano w 37°C przez 45 godzin w 8% CO₂. Komórki przemywano dwukrotnie i inkubowano w 8% CO₂ przez 2 godziny w pożywce Dulbecco’s bez surowicy, po czym komórki przemywano buforem fosforanowym Krebsa Ringera i inkubowano w tym buforze (wychwyt podstawowy) bądź w tymże buforze zawierającym 100 nM insulinę (wychwyt stymulowany) przez 15 minut w 37°C. Wychwyt glukozy zainicjowano przez dodatek [³H] 2deoksyglukozy (14.2 KBq, 10 μΜ glukoza). Po 10 minutach w 37°C reakcję zatrzymano przez aspirowanie roztworu glukozy i raptowne przepłukanie lodowatym roztworem fizjologicznym soli buforowanym fosforanem. Komórki zniszczono 0.2 N NaOH i zobojętniono roztwór przez dodatek 0.2 M HC1. Wychwyt [³H] 2-deoksyglukozy badano przez pomiar scyntylacji w fazie płynnej w roztworze Optiphase przy użyciu urządzenia Wallac 1410 liquid scinti llation counter.

Wiadomo, że neurotoksyny Clostridium zdolne są do wnikania do pewnych komórek neurosekrecyjnych (przykładowo komórek PC 12) drogą receptora o niskim powinowactwie, gdy komórki inkubowane sąprzez czas dłuższy w wysokich stężeniach neurotoksyny. Proces ten wydaj e się używać szlaku przez receptor różny od wysoce specyficznych receptorów o wysokim powinowactwie, obecnych na złączy nerwowo-mięśniowym. Dodatkowo, istnieją doniesienia, że pewne toksyny Clostridium wywierają wpływ na komórki żerne jakmakrofagi, wniknięcie do których, jak się uważa odbywa się drogą specyficznej aktywności fagocytamej tych komórek. Generalnie, uważa się, jednakże, że selektywność neurotoksyn Clostridium jest wynikiem bardzo wybiórczego mechanizmu wiązania i wniknięcia do komórki. Jest jednak nieoczekiwanym odkryciem tego badania, że inkubacja adipocytów 3T3-LI z neurotoksyną botulinową A, jak to opisano, powoduje znaczne zahamowanie stymulowanej glukozą dodatniej regulacji transportu [³H] 2-deoksyglukozy (tabela 4). Wiadome jest, że zależna od insuliny dodatnia regulacja transportu glukozy w adipocytach jest wynikiem przesunięcia białek transportujących glukozę z pul wewnątrzkomórkowych (RMV) do powierzchni komórki. Stąd, wynik ten pokazuje, że neurotoksyna jadu kiełbasianego A, hamuje stymulowany insuliną ruch transporterów glukozy w RMV do powierzchni komórki adipocytów.

178 895

Przykład 5. Adipocyty 3T3-LI trypsynizowano i elektroporowano powstałą zawiesinę komórkową w obecności lub pod nieobecność Botulinum B (0.32 mM). Kondensatora 960 mF użyto do elektroporacji wytwarzając siłę pulsu 300 V/cm; w czasie 11-12 ms. Po elektroporacji komórki przepłukano i wysiano w płytce 6-studzienkowej z pożywką i surowicą. Komórki inkubowano w 37°C w wilgotnej atmosferze (powietrze/CO₂; 92.5%/7.5%) przez 72 godziny. Pod koniec tego okresu komórki przepłukano i ekstrahowano w 0.1 N NaOH. Po zobojętnieniu ekstraktu przy użyciu 0.1 M HC1, białka błonowe rozdzielono w Tritonie X-114 i następnie analizowano met. Western blotting przy użyciu przeciwciała przeciw-pęcherzykowego opisanego w przykładzie 1. Nieoczekiwanym wynikiem tego badania było stwierdzenie, że elektroporacja neurotoksyny botulinowej do cytozolu adipocytów powoduje modyfikację struktury pęcherzyków (prawdopodobnie RMV) czego dowodzi zmniejszona reaktywność przeciwciała z odpowiednim, podwójnym prążkiem w próbkach pochodzących z komórek traktowanych neurotoksyną jadu kiełbasianego B.

Przykład 6.W tym przykładzie, zsyntetyzowano czynnik do regulacji ekspresji na powierzchni komórki zależnych od insuliny transporterów glukozy adipocytów. Domenę wiążącą (B) dla czynnika w tym przykładzie stanowi insulino-podobny czynnik wzrostowy II, oczyszczony z pożywki uwarunkowanej komórkami BRL-3A jak to opisano (Marąuette, H; Todaro, GL; Henderson, LE; & Oroszlan, S, 1981, J. Biol. Chem. 256, 2122-2125).

Domena Przenosząca (T) wytworzona została z neurotoksyny, serotyp A, C. botulinum przez ograniczoną proteolizę przy użyciu trypsyny poddanej działaniu tosylo-fenylalanylochlorometanu. Frakcja zawierająca Domenę T jest następnie oczyszczana przez chromatografię na sefadeksie G-200 (Shone, CC; Hambleton, P; & Melling, J. 1985, Eur. J. Biochem 151,17-82). Frakcja ta nakładana jest w buforze fosforanowo/boranowym, pH 8.4, na kolumnę czwartorzędowego aminoetylosefadeksu i inkubowana na kolumnie w temp. 4°C przez noc, z 2 M mocznikiem i 0.1 M ditiotreitolem. Kolumna jest następnie płukana buforem zawierającym 2 M mocznik i 10 mM ditiotreitol. Domena T j est następnie wypłukiwana przy użyciu buforu fosforanowo/boranowego zawierającego 2 M mocznik i 10 mM ditiotreitol i stopniowy gradient NaCl od 0.1 do 0.2 M (Poulain, B; Wadsworth, JDF; Maisei, EA; Shone, CC; Melling, J; Tauc, L; & Doiły, JO, 1989, Eur, J. Biochem. 185, 197-203). Neurotoksyny Clostridium są dwułańcuchowymi białkami połączonymi wiązaniami dwusiarczkowymi, zbudowanymi z łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego (Simpson, LL, 1986, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 26, 427-453). Należy nadmienić, że Domena T, uzyskiwana w ten sposób, jest równoważna frakcji łańcucha ciężkiego neurotoksyny określanej jako H₂.

Domenę efektorową(E) wytworzono z neurotoksyny C. tetani przez ogniskowanie izoelektryczne w gradiencie sacharozy, z amfolitem w warunkach redukujących w 2 M moczniku (Weller, U; Dauzenroth, M-E; Meyer zu Heringdorf, D; & Habermann, E, 1989, Eur, J. Biochem. 182, 649-656). Należy nadmienić, że Domena E, uzyskiwana w ten sposób, jest równoważna frakcji łańcucha lekkiego neurotoksyny, określanej jako LC.

Domeny E i T zmieszano w proporcjach molamych w warunkach redukujących i połączono kowalencyjnie przez powtarzaną dializę, w temperaturze 4°C z wytrząsaniem, wobec roztworu fizjologicznego soli pod nieobecność odczynników redukujących. Pozostałe wolne grupy sulfhydrylowe zobojętniono przez dodanie 150 mM jodoacetamidu przez 30 min. w 4°C, w ciemności. Skonjugowany produkt E-T oczyszczono chromatografią na sefadeksie G-150 przy użyciu buforu fosforanu potasu, pH 7.0. Na koniec, do kompleksu E-T przyłączono Domenę B przy użyciuN-sukcymidylo-3(2-pirydylotio) propionianu (SPDP). Kompleks E-T (5 mg) rozpuszczono w 1 ml roztworu fizjologicznego soli zbuforowanego fosforanem (PBS), i dodano do tego 200 mg SPDP rozpuszczonego w 0.5 ml metanolu absolutnego. Po reakcji mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 30 minut, peptyd z rodnikiem 2-pirydylodwusiarczkowym oddzielono od nadmiaru SPDP przez filtrację na sefadeksie G-25. Domenę B traktowano podobnie, ale z użyciem mniejszej ilości SPDP (20 mg w 0.2 ml etanolu). Podstawiona Domena B ponownie została zebrana z kolumny sefadeksu G-25, i redukowana przez dodanie ditiotreitolu do stężenia końcowego 0.05 M. Nadmiar czynnika redukującego usunięto przez filtrację na żelu

178 895

Sephadex G-25. Równe części (w/w) podstawionego kompleksu E-T i podstawionej i zredukowanej Domeny B zmieszane zostały i pozostawione w 4°C przez 18 godzin. Czynnik oczyszczono przez chromatografię na żelu Sephadex G-150 przy użyciu buforu fosforanu potasu, pH 7.0.

Czynnik, wytworzony jak to opisano, badano następnie na zdolność do zahamowania stymulowanego przez insulinę zwiększania ekspresji transporterów glukozy w adipocytach 3T3-LI Adipocyty 3T3-LI różnicowano z fibroblastów 3T3-LI przez traktowanie ich deksametazonem, 3-izobutylo-l-metyloksantynąi insuliną jak to opisano (Frost, SC & Lane MD, 1985, J. Biol. Chem. 260, 2646-2652) i użyto ich między 8 a 12 dniem po zapoczątkowaniu różnicowania. Komórki inkubowano z lub bez czynnika przez 90 minut w 37°C. Komórki inkubowano przez 2 godziny w pożywce Dulbecco’s bez surowicy na początku każdego doświadczenia. Komórki traktowane insuliną eksponowano przez 10 minut na ΙΟ'⁷ M insulinę dodawaną z roztworu wyjściowego 1.6 χ ΙΟ⁴ M. Po traktowaniu w opisany powyżej sposób komórki przemywano szybko buforem fosforanowym Krebsa Ringera w 37°C i mierzono wychwyt [³H] 2deoksyglukozy (14.2 KBq, 10 μΜ glukoza) przez 10 minut w 37°C w buforze fosforanowym Krebsa Ringera z ΙΟ’⁷ M insuliną lub bez. Reakcję zatrzymano przez aspirowanie roztworu glukozy i raptowne przepłukanie lodowatym 0.2 N NaOH i zobojętniono roztwór przez dodatek 0.2 M HC1. Wychwyt [³H] 2-deoksyglukozy badano przez pomiar scyntylacji w fazie płynnej w roztworze Optiphase przy użyciu urządzenia Wallac 1410 liquid scintillation counter.

Przykład7.W innym przykładzie wynalazku wytworzono Domeny E i T z tego samego serotypu neurotoksyny botulinowej i wyprodukowano je już połączone. Neurotoksynę, serotypu A C. botulinum, poddano ograniczonej proteolizie przy użyciu trypsyny poddanej działaniu tosylo-fenylalanylo-chlorometanu. Kompleks E-T był następnie oczyszczany przez chromatografię na sefadeksie G-200 (Shone, CC; Hambleton, P; & Melling, J, 1985, Eur. J. Biochem 151, 17-82).

Należy nadmienić, że fragment ten jest równoważny z określanym jako fragment H₂L. Pozostałości wolnych grup sulfhydrylowych zobojętniono przez dodanie 150 mM jodoacetamidu jak to opisano w przykładzie 6. Domeną wiążącą (B) był insulinopodobny czynnik wzrostowy II przygotowany tak, jak to opisano w przykładzie 6, i połączony z kompleksem E-T przy użyciu SPDP jak to opisano. Aktywność czynnika, w stosunku do ekspresji zależnego od insuliny transportu glukozy w adipocytach, badano jak to opisano w przykładzie 6.

Przykład8.W innym przykładzie wynalazku, czynnik do regulacj i ekspresj i na powierzchni komórki, receptora CR1 dla składników dopełniacza C3b na neutrofilach (CD35), zsyntetyzowano w następujący sposób. Domenę B przygotowano z przeciwciała monoklonalnego SHCL3, przeciwko cząsteczce adhezyjnej leukocytów PI50,95. Domeny E i T przygotowano z neurotoksyny botulinowej, serotypu A, połączonych już, jak to opisano w przykładzie 7 i połączono z Domeną B jak to opisano w tym przykładzie.

Korzystną metodą badania aktywności czynnika w stosunku do ekspresji CR1 (CD35), na powierzchni komórki neutrofila, jest użycie techniki lizy pełnej krwi. Krew pełna, z dodatkiem antykoagulanta EDTA, od normalnych dawców traktowana jest czynnikiem przez 4 godziny i aktywowana przez 30 minut w 37°C przy użyciu ΙΟ’⁶ M fMet-Leu-Phe rozpuszczonego w PBS z roztworu wyjściowego χ ΙΟ’² M w DMSO. Komórki kontrolne inkubowane są e PBS. Krew inkubowana była przez 30 minut w temperaturze otoczenia z 10 ml przeciwciała monoklonalnego anty-CD35 sprzężonego z fikoerytryną(Serotec: MCA554PE), erytrocyty poddawane są lizie przy użyciu płynu do lizy f-my Becton-Dickinson, leukocyty przemywane są dwukrotnie PBS i zawieszane w 2% formaldehydzie w PBS. Związana z powierzchnią fikoerytryna analizowana jest fluorymetrią przepływową przy użyciu FACScan (Becton-Dickinson) wyposażonego w oprogramowanie Lysys Π.

Przykład 9. Winnym przykładzie wynalazku,czynnik do regulacji ekspresjina powierzchni komórki, cząsteczki adhezyjnej leukocytów Mac-1 (CDIIb) zsyntetyzowano w następujący sposób. Domenę B przygotowano z przeciwciała monoklonalnego SHCL3, przeciwko cząsteczce adhezyjnej leukocytów PI50, 95 używając standardowej metodologii z użyciem pepsyny, i oczyszczono przez filtrację na żelu (Martin, FJ; Hubbell, WL; i Papahadjopoulos, D, 1981, Bio

178 895 chemistry 20, 4229-4238). Domeny E i T przygotowano z neurotoksyny botulinowej, serotypu A, połączonych już, jak to opisano w przykładzie 7 i połączono z DomenąB jak to opisano w tym przykładzie.

Korzystną metodą badania aktywności czynnika w stosunku do ekspresji Mac-1 (CDI Ib), na powierzchni komórki neutrofila, jest użycie techniki lizy pełnej krwi. Krew pełna, z dodatkiem antykoagulanta EDTA, od normalnych dawców traktowana jest czynnikiem przez 4 godziny i aktywowana przez 30 minut w 37°C przy użyciu ΙΟ^-6 M fMet-Leu-Phe rozpuszczonego w PBS z roztworu wyjściowego xl0'² M w DMSO. Komórki kontrolne inkubowane są e PBS. Krew inkubowana była przez 30 minut w temperaturze otoczenia z 10 ml przeciwciała monoklonalnego anty CDI Ib sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny (Serotec: MCA551F), erytrocyty poddawane są lizie przy użyciu płynu do lizy f-my Becton-Dickinson, leukocyty przemywane są dwukrotnie PBS i zawieszane w 2% formaldehydzie w PBS. Związana z powierzchnią fluoresceina analizowana jest fluorymetrią przepływową przy użyciu FACScan (BectonDickinson) wyposażonego w oprogramowanie Lysys II.

Przykład 10.W innym przykładzie wynalazku, czynnik do regulacji gęstości na powierzchni komórki, kanałów Na⁺ w błonie szczytowej nabłonka pęcherza moczowego, zsyntetyzowano w następujący sposób. Domenę B przygotowano z przeciwciała monoklonalnego o dużym powinowactwie do markera powierzchniowego komórek nabłonkowych pęcherza moczowego, używając standardowej metodologii z użyciem pepsyny, i oczyszczono przez filtrację na żelu (Martin, FJ; Hubbell, WL; i Papahadjopoulos, D, 1981, Biochemistry 20,4229-4238). Domeny E i T przygotowano z neurotoksyny botulinowej, serotypu A, połączonych już, jak to opisano w przykładzie 7 i połączono z DomenąB jak to opisano w tym przykładzie.

Wpływ czynnika na stymulowany aldosteronem wzrost ilości wrażliwych na amilorid kanałów Na⁺ badano używając komórek pęcherza moczowego. Komórki pęcherza moczowego, przygotowane jako hodowla pierwotna z pęcherza szczura (Johnson, MD; Bryan,GT; Reznikoff, CA; 1985, J. Uroi. 133, 1076-1081), inkubowano z lub bez czynnika przez 90 minut w 37°C. Komórki traktowane aldosteronem eksponowano przez 1 godzinę na aldosteron. Po traktowaniu w opisany sposób, komórki raptownie przepłukano i mierzono wrażliwy na amilorid wychwyt ²²Na⁺ w ciągu 5 minutowej inkubacji w 37°C.

Przykład 11.W innym przykładzie wynalazku, czynnik do regulacji prezentacji antygenu przez limfocyty B, zsyntetyzowano w następujący sposób. Domenę B przygotowano z przeciwciała monoklonalnego LL2 anty-panB, używając standardowej metodologii z użyciem pepsyny, i oczyszczono przez filtrację na żelu (Martin, FJ; Hubbell, WL; i Papahadjopoulos, D, 1981, Biochemistry 20,4229-4238). Domeny E i T przygotowano z neurotoksyny botulinowej, serotypu A, połączonych już, jak to opisano w przykładzie 3 i połączono z DomenąB jak to opisano w tym przykładzie.

Wpływ czynnika na prezentację antygenu badano z użyciem linii komórkowej TA3 mysiego chłoniaka B. Komórki te najpierw inkubowano z czynnikiem przez 90 minut w 37°C, a następnie dodano lizozymu jaja kurzego (HEL) i kontynuowano inkubację przez 2 godziny w 37°C. Komórki TA3 utrwalono i przepłukano, po czym hodowano z hybrydomą3A9 z limfocytów T, I-A^k-restrykcyjnych, swoistych względem HEL46-61 (Lorenz, RG & Allen, PM, 1989, Naturę, 337, 560). Nadsącz z komórek 3A9 badano na jego zdolność do podtrzymywania wzrostu linii komórkowej CTLL, IL-2 zależnej. Odpowiedź proliferacyjna mierzona była przez wbudowywanie ³Htymidyny przez okres 3 godzin następujący po 2 dniach hodowli z nadsączem.

Przykłady opisane powyżej są czysto ilustratywne dla wynalazku. Powinno być jasne dla specjalisty, że każda kombinacja trzech domen mieści się w zakresie niniejszego wynalazku. W syntezie czynnika według wynalazku, połączenie składnika T-E ze składnikiem kierującym uzyskuj e się drogą sprzęgania chemicznego z użyciem odczynników i technik znanych specj alistom. Stąd, jakkolwiek w podanych przykładach używano wyłącznie odczynnika sprzęgającego SPDP, stosowanie dowolnego innego odczynnika sprzęgającego zdolnego do kowalencyjnego połączenia składnika kierującego i znanego specjalistom wchodzi w zakres tego wynalazku. Oczywista jest dla specjalisty możliwość skonstruowania DNA kodującego cały czynnik lub

178 895 jego fragmenty i ekspresji w odpowiednim organizmie z wytworzeniem czynnika lub jego fragmentów.

Czynnik opisany w tym wynalazku może być zastosowany in vivo bezpośrednio lub jako dopuszczalna farmaceutycznie sól lub ester w sposobie leczenia różnych stanów patofizjologicznych. Przykładowo, jedna z postaci czynnika może być zastosowana w leczeniu zaburzeń metabolizmu glukozy przez ograniczenie wychwytu glukozy przez określone komórki. Specyficznym przykładem tego może być zastosowanie jednej z postaci czynnika w leczeniu otyłości klinicznej przez ograniczenie wychwytu glukozy przez komórki tkanki tłuszczowej i w ten sposób zredukowanie gromadzenia tłuszczu w tych komórkach.

W innym przykładzie postać czynnika może być użyta w leczeniu nadciśnienia przez regulowanie wychwytu jonów przez komórki nerek i w ten sposób kontrolowanie wypływu płynów z tych narządów.

W jeszcze innym przykładzie postać czynnika może być zastosowana w leczeniu stanu zapalnego przez kontrolowanie odpowiedzi komórek docelowych na zewnętrzne sygnały, wyzwalające odpowiedź zapalną.

W jeszcze innym przykładzie postać czynnika może być zastosowana w sposobie leczenia zaburzeń układu odpornościowego przez kontrolowanie prezentacji sekwencji peptydowych przez komórki prezentujące antygen komórkom efektorowym układu odpornościowego.

Tabela 1 125 Dodatnia regulacja IGF-1 wiązania I-transferyny przez fibroblasty 3T3-LI

Traktowanie	IGF-1	% wiązania podstawowego ± SD*
Kontrola BoNT-B	+ +	100 ±28 (n = 3) 258 ± 46 (n = 3) 100 ± 8(n = 3) 149 ±27 (n = 3)

* Wiązanie podstawowe ¹²⁵I-transferyny przez fibroblasty 3T3-LI wyrażono jako procent wiązania specyficznego pod nieobecność IGF-1.

Tabela 2 125 Dodatnia regulacja IGF-1 wiązania I-transferyny przez fibroblasty 3T3-LI

Traktowanie	IGF-1	% wiązania podstawowego ± SD*
Kontrola	-	100±28(n = 3)
	+	258 ± 46 (n = 3)
BoNT-A	-	100 ±44 (n = 3)
	+	149 ± 10(n = 3)

125 · * Wiązanie podstawowe I-transferyny przez fibroblasty 3T3-LI wyrażono jako procent wiązania specyficznego pod nieobecność IGF-1.

Tabela 3 125 Dodatnia regulacja IGF-1 wiązania I-transferyny przez fibroblasty 3T3-LI

Traktowanie	IGF-1	% wiązania podstawowego ± SD*
Kontrola	+	100 ±28 (n=3) 2558 ±46 (n = 3)
H₂L-A	+	100 ± 15 (n=3) 149 ± 60 (n = 3)

178 895

Tabela 4

Wychwyt [ H]-2-dezoksyglukozy przez adipocyty 3T3-LI

	Podstawowy	Stymulowany insuliną
Kontrola Traktowane BoNT-A	1655±67(n = 3) 2306 ± 49 (n = 3)	14328 ± 264 (n = 3) 5587 ± 322 (n = 3)

Wyniki oznaczają średnie ± SEM powtórzonego trzykrotnie oznaczenia i podano jako całkowite dpm oznaczone dla warstwy komórek podczas 10 minut inkubacji.

178 895

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: THE SPEYWOOD LABORATORY LIMITED (B) ULICA: ST GEORGE'S HOSPITAL MEDICAL SCHOOL, CRANMER TERRACE (C) MIASTO: LONDYN (E) KRAJ: WIELKA BRYTANIA (F) KOD POCZTOWY: SW17 OQS (A) NAZWA: PUBLIC HEALTH LABORATORY SERVICE BOARD (B) ULICA: 61 COLINDALE AVENUE (C) MIASTO: LONDYN (E) KRAJ: WIELKA BRYTANIA (F) KOD POCZTOWY: NW9 5DF (A) NAZWISKO: DR. JOHN NORTH (B) ULICA: THE OLD VICARAGE, CHURCH STREET (C) MIASTO: AMESBURY (D) STAN: WITSHIRE (E) KRAJ: WIELKA BRYTANIA (F) KOD POCZTOWY: SP4 7EU (A) NAZWISKO: DR, KEITH ALLAN FOSTER (B) ULICA: 137 OAKS AVENUE (C) MIASTO: WORCESTER PARK (D) STAN: SURREY (E) KRAJ: WIELKA BRYTANIA (F) KOD POCZTOWY: KT4 8XG (A) NAZWISKO: CONRAD PADRAIG QUINN (B) ULICA: 36 ST FRANCIS ROAD

178 895 (C) MIASTO: SALISBURY (D) STAN: WILTSHIRE (E) KRAJ: WIELKA BRYTANIA (F) KOD POCZTOWY: SP1 3 QS (A) NAZWISKO: CLIFFORD CHARLES SHONE (B) ULICA: 44 OAKWOOD GROVE (C) MIASTO: ALDERBURY (D) STAN: WILTSHIRE (E) KRAJ: WIELKA BRYTANIA (F) KOD POCZTOWY: SP5 3BN (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: NOWY CZYNNIK DO KONTROLOWANIA AKTYWNOŚĆ KOMÓRKI (iii) LICZBA SEKWENCJI: 1 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentlnRel. #1.0, wer. 1.25 (EPO) (vi) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA ZGŁOSZENIA:

(A) Nr ZGŁOSZENIA: GB 9303735.4 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 19 MARCA 1993 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 62 Aminokwasy (B) RODZAJ: Aminokwas (C) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: Peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 1:

178 895

Gin Gin

Asn Val

Asp Arg

Ala Ala

Thr Gin

Asp Lys

Ala Asp

Lys Leu

Ala Gin

Val Leu

Ala Leu

Lys Arg

Val Asp

Glu Arg

Gin Ala

Lys Tyr

Glu Val

Asp Gin

Gly Ala

Trp Trp

Val Asi

Lys Leu

Ser Gin

Lys Asn

Ile Met

Ser Glu

Phe Glu

Leu Lys

Arg Val Leu Asp Thr Ser

178 895

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowy oczyszczony czynnik do kontrolowania oddziaływania komórki z jej środowiskiem zewnętrznym, przez kontrolowanie transportu Białek Integralnych Błony (IMP) do błony komórkowej w Odnawialnych Pęcherzykach Błonowych (RMV), który obejmuje trzy Domeny: B, T i E połączone ze sobą w następujący sposób:

Domena B — Domena T — Domena E gdzie

Domena B jest Domeną wiążącą która wiąże czynnik z Miejscem wiązania, na komórce, które ulega endocytozie i jest wbudowywane do endosomu, przy czym domena B nie jest uzyskana z neurotoksyny Clostridium;

Domena T jest Domeną przenoszącą która przenosi czynnik (z lub bez innych domen czynnika i/lub Miejsca wiązania) z endosomu przez błonę endosomalnądo cytozolu komórki; i

Domena E jest Domeną efektorową która hamuje zdolność RMV do transportowania IMP do powierzchni komórki i jest domeną lub fragmentem domeny Łańcucha lekkiego neurotoksyny Clostridium posiadającego aktywność metaloproteinazy zależnej od Zn²⁺.
2. Czynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że Domena T j est domeną lub fragmentem domeny łańcucha ciężkiego neurotoksyny Clostridium.
3. Czynnik według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że Domenę E uzyskano z neurotoksyny botulinowej (jadu kiełbasianego).
4. Czynnik według zastrz. 3, znamienny tym, że Domenę E uzyskano z neurotoksyny botulinowej typu A.
5. Czynnik według zastrz. 3, znamienny tym, że Domenę E uzyskano z neurotoksyny botulinowej typu B.
6. Czynnik według zastrz. 2, znamienny tym, że Domena T jest częścią aminokońcową łańcucha ciężkiego neurotoksyny Clostridium.
7. Czynnik według zastrz. 2, znamienny tym, że Domena T jest częścią aminokońcową łańcucha ciężkiego neurotoksyny Clostridium, uzyskaną przez trawienie proteolityczne przy użyciu trypsyny.
8. Czynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że Domena T jest uzyskana z neurotoksyny botulinowej (jadu kiełbasianego).
9. Czynnik według zastrz. 8, znamienny tym, że Domena T jest uzyskana z neurotoksyny botulinowej typu A.
10. Czynnik według zastrz. 8, znamienny tym, że Domenę T uzyskano z neurotoksyny botulinowej typu B.
11. Czynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje trzy Domeny: B, T i E połączone ze sobą w następujący sposób:

Domena B -X- Domena T -X- Domena E gdzie X oznacza albo cząsteczkę odstępnika związaną kowalencyjnie lub bezpośrednie wiązanie kowalencyjne, ale przynajmniej jeden z X oznacza cząsteczkę odstępnika.
12. Czynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że Domena B stanowi łigand akceptora, na powierzchni komórki docelowej, zdolnego do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu.

178 895
13. Czynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że Domena B stanowi ligand receptora, na powierzchni komórki docelowej, zdolnego do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu.
14. Czynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne lub jest uzyskiwane z przeciwciała monoklonalnego, skierowanego przeciwko antygenowi na powierzchni komórki docelowej, zdolnemu do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu.
15. Czynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że Domena B, Domena wiążąca, wiąże się z Miejscem wiązania, które jest charakterystyczne dla konkretnego typu komórki.
16. Czynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że wpływa na stopień wychwytu glukozy przez komórkę tłuszczową w odpowiedzi na insulinę, przy czym zawarta w nim Domena B stanowi ligand miejsca wiązania na powierzchni komórki tłuszczowej, zdolnego do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu.
17. Czynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że wpływa na zdolność do odpowiedzi neutrofilów na składnik dopełniacza C3b, a zawarta w nim Domena B stanowi ligand miejsca wiązania na powierzchni neutrofila, zdolnego do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu.
18. Czynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że wpływa na ekspresję cząsteczki adhezyjnej Mac-1 przez neutrofile, a zawarta w nim Domena B stanowi ligand miejsca wiązania na powierzchni neutrofila, zdolnego do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu.
19. Czynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że wpływa na prezentowanie antygenu przez komórki prezentujące antygen, a zawarta w nim Domena B stanowi ligand miejsca wiązania na powierzchni neutrofila, zdolnego do ulegania endocytozie i bycia wbudowania do endosomu.
20. Czynnik według zastrz. 16, znamienny tym, że Domena B stanowi ligand dla receptora insulinopodobnego czynnika wzrostowego II.
21. Czynnik według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne albo jest uzyskana z przeciwciała monoklonalnego przeciwko cząsteczce adhezyjnej pl50, 95.
22. Czynnik według zastrz. 19, znamienny tym, że Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne albo jest uzyskana z przeciwciała monoklonalnego przeciwko antygenowi powierzchniowemu komórki prezentującej antygen, zdolnemu do ulegania endocytozie i wbudowania do endosomu.
23. Czynnik według zastrz. 20, znamienny tym, że Domena B stanowi insulinopodobny czynnik wzrostowy Π.
24. Czynnik według zastrz. 21, znamienny tym, że Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne albo jest uzyskana z przeciwciała monoklonalnego SHCL3.
25. Czynnik według zastrz. 22, znamienny tym, że Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne albo jest uzyskana z przeciwciała monoklonalnego LL2.
26. Czynnik według zastrz. 23, znamienny tym, że Domena B stanowi insulinopodobny czynnik wzrostowy Π, Domena T stanowi amino-końcową część łańcucha ciężkiego neurotoksyny botulinowej typu A, uzyskaną trawieniem proteolitycznym z użyciem trypsyny, i Domena E stanowi łańcuch lekki neurotoksyny botulinowej typu A.
27. Czynnik według zastrz. 24, znamienny tym, że Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne SHCL3, Domena T stanowi amino-końcową część łańcucha ciężkiego neurotoksyny botulinowej typu A, uzyskaną trawieniem proteolitycznym z użyciem trypsyny, i Domena E stanowi łańcuch lekki neurotoksyny botulinowej typu A.
28. Czynnik według zastrz. 25, znamienny tym, że Domena B stanowi przeciwciało monoklonalne LL2, Domena T stanowi amino-końcową część łańcucha ciężkiego neurotoksyny botulinowej typu A, uzyskaną trawieniem proteolitycznym z użyciem trypsyny, i Domena E stanowi łańcuch lekki neurotoksyny botulinowej typu A.
29. Czynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub estru.

178 895
30. Sposób wytwarzania czynnika do kontrolowania oddziaływania komórki z jej środowiskiem zewnętrznym, przez kontrolowanie transportu Białek Integralnych Błony (IMP) do błony komórkowej w Odnawialnych Pęcherzykach Błonowych (RMV), który obejmuje trzy Domeny: B, T i E połączone ze sobą w następujący sposób:

Domena B — Domena T — Domena E, przy czym

Domena B jest Domeną wiążącą, która wiąże czynnik z Miejscem wiązania, na komórce, które ulega endocytozie i jest wbudowywane do endosomu, przy czym Domena B nie jest uzyskana z neurotoksyny Clostridium;

Domena T jest Domeną przenoszącą, która przenosi czynnik (z lub bez innych domen czynnika i/lub Miejsca wiązania) z endosomu przez błonę endosomalnądo cytozolu komórki; i

Domena E jest Domeną efektorową, która hamuje zdolność RMV do transportowania IMP do powierzchni komórki i jest domeną lub fragmentem domeny łańcucha lekkiego neurotoksyny Clostridium posiadającego aktywność metaloproteinazy zależnej od Zn²⁺, znamienny tym, że trzy Domeny B, T i E kontaktuje się najpierw z reagentem sprzęgającym, po czym kontaktuje się je ze sobąwiążąc je kowalencyjnie w sposób wskazany powyżej.
31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że trzy Domeny B, T i E kontaktuje się z reagentem sprzęgającym, przy czym co najmniej dwie z nich kontaktuje się też z cząsteczką odstępnika zdolnego do wiązania kowalencyjnego, i wiąże się je kowalencyjnie w następujący sposób:

Domena B -X- Domena T -X- Domena E gdzie X oznacza albo cząsteczkę odstępnika związaną kowalencyjnie lub bezpośrednie wiązanie, kowalencyjne ale przynajmniej jeden z X oznacza cząsteczkę odstępnika.
32. Sposób według zastrz. 30 lub 31, znamienny tym, że Domeny T i E stosuje się w już sprzężonej formie.

* * *