HU217220B - Eljárás új sejtaktívitást szabályozó szer előállítására - Google Patents

Eljárás új sejtaktívitást szabályozó szer előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU217220B
HU217220B HU9502673A HU9502673A HU217220B HU 217220 B HU217220 B HU 217220B HU 9502673 A HU9502673 A HU 9502673A HU 9502673 A HU9502673 A HU 9502673A HU 217220 B HU217220 B HU 217220B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
domain
cell
agent
endosome
binding site
Prior art date
Application number
HU9502673A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT76556A (en
HU9502673D0 (en
Inventor
Keith Alan Foster
John Robert North
Conrad Padraig Quinn
Clifford Charles Shone
Original Assignee
Microbiological Research Authority Of Camr (Centre For Applied Microbiology And Research)
The Speywood Laboratory Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Microbiological Research Authority Of Camr (Centre For Applied Microbiology And Research), The Speywood Laboratory Ltd. filed Critical Microbiological Research Authority Of Camr (Centre For Applied Microbiology And Research)
Publication of HU9502673D0 publication Critical patent/HU9502673D0/hu
Publication of HUT76556A publication Critical patent/HUT76556A/hu
Publication of HU217220B publication Critical patent/HU217220B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás új, sejtaktivitást szabályőzó szerelőállítására, amely gyógyszerként alkalmazható különfélerendellenességek kezelésére. A találmány értelmében hárőm dőméntkapcsőlnak egymáshőz kővalens kötéssel a következőképpen: B dőmén–Tdőmén–E dőmén, ahől a B dőmén egy kötő dőmén, amely a szert a sejten egy őlyan kötőhelyhezkapcsőlja, amely endőcitózis révén egy endőszómába őlvad be, ahől a Bdőmén nem Clőstridial neűrőtőxinból származik, a T dőmén egy transzlőkációs dőmén, amely áthelyezi az E dőmént (aszer más dőménjeivel és/vagy a kötőhellyel együtt vagy enélkül) azendőszóma belsejéből az endőszóma membránján át a sejtcitőszőlba, ésaz E dőmén egy effektőr dőmén, amely gátőlja az RMV-ket abban, hőgy azIMP-ket elszállítsák a sejt felületére, és ez a dőmén a Clőstridiűmneűrőtőxin könnyű láncának egy dőménje vagy dőménfragmentűma, amelynekZn2+-függő metallőprőteáz aktivitása van. A találmány tárgyát képezi aszert tartalmazó készítmény előállítása is. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás emlőssejt aktivitásának célzott szabályozására szolgáló új szer előállítására, pontosabban, a szer a speciális sejttípusok és külső környezetük közötti kölcsönhatás szabályozására használható. A szer gyógyszerként alkalmazható különböző rendellenességek kezelésénél.
Az élő sejtek alapvető tulajdonsága, hogy külső környezetükre válaszolni képesek. A sejt és a külső környezet közötti határfelület a plazmamembrán. A plazmamembránt foszfolipid kettősréteg alkotja, amelybe különféle proteinmolekulák vannak beágyazva. Ezek az integrált membránproteinek (IMP-k) felelősek sok olyan kölcsönhatásért, amely a sejt és külső környezete között működik.
Azok a kölcsönhatások, amelyekben az IMP-k részt vesznek, a következők: anyagok - beleértve a tápanyagokat - szállítása a sejthez és a sejtből: a plazmamembrán ionokkal szembeni permeabilitásának szabályozása; extracelluláris molekulák felismerése és válaszolás e molekulákra; egy sejt adhéziója egy másik sejthez. Az immunrendszer egy sajátos funkciója, amelyet szintén az IMP-k közvetítenek, abból áll, hogy az immunsejtek egy csoportja speciális idegen peptidszekvenciákat mutat be egy másik sejtcsoportnak.
Annak érdekében, hogy egy sejt válaszolni legyen képes külső környezetére, és hogy reagálni tudjon külső környezetével, annak egyik módja az, hogy megváltoztassa a plazmamembránon jelen lévő IMP-k mennyiségét és típusát. Az egyik mechanizmus, amellyel ez elérhető, az IMP-k reverzibilis intemalizációja endocitotikus folyamat útján a körforgalmat bonyolító membránvezikulákba (Recyclable Membráné Vesicle=RMV). Ezekben az esetekben az RMV-ben raktározott IMP-k egy belső IMP-tartalékot vagy -készletet képeznek, amely rendelkezésre áll arra az esetre, amikor az IMP-ket az RMV-k plazmamembránnal való exocitotikus fúziójának folyamata hirtelen a sejt felületére exportálja. Az exocitotikus/entocitotikus ciklus egyensúlyának a modulálása teszi lehetővé a sejt felületén lévő IMP-k sűrűségének gyors szabályozását. A sejtaktivitás szabályozására szolgáló folyamatban, például a vázizomzatban és zsírszövetben, az inzulinra válaszoló sejtek glükózfelvétele szabályozottan megy végbe. Az inzulin megnövelte az ezen sejtek plazmamembránjában a GLUT4 transzportőr egy izoform alakjának a mennyiségét. A sejt felületén a GLUT4 molekulák nagyobb koncentrációja megnöveli a glükózfelvételt. Tehát a plazmamembránban jelen lévő glükóztranszportőrök számának szabályozásával az inzulinra adott válasz modulálható.
A sejt felületén az IMP expressziójában külső szignálokra adott válaszként megjelenő változások egyik példája a C3b és C4b komplementfragmentumok receptorának, az 1. típusú CR1 komplementreceptomak a változása. A humán neutrofilek aktiválása következtében a plazmamembrán CR1 expressziója átmenetileg 6-10-szeresére növekszik.
Egy másik példa azt mutatja, hogy számos gyulladásos és immunsejt-aktiválás hatására sejtfelületi adhéziós molekuláinak expresszióját módosítja. Azaz, a neutrofilek vagy monociták aktiválása a sejt felületén lévő Mac-1 és pl50, 95 adhéziós molekulák modulálását eredményezi. Ezek az adhéziós molekulák fontos szerepet játszanak a gyulladásos sejteknek a gyulladásos helyekhez történő célzott eljuttatásában.
További példa, hogy bizonyos hormonok (inzulin, inzulinszerű növekedési faktor, interleukin-1 és trombocita eredetű növekedési faktor) a transzferrin receptorsejt felületi expressziójának gyors növekedését idézik elő különböző sejttípusoknál. A transzferrin receptor a sejt külső környezetéből megköti a vas(II)-transzferrint, ezáltal részt vesz a sejt vasfelvételének folyamatában. A transzferrin/transzferrin-receptor rendszer szerepet játszhat a vas központi idegrendszerbe való transzcelluláris szállításában is az agyi vérkeringés korlátain keresztül, ez a folyamat transzcitózis néven ismert. Transzcitózis szerepel az anyai immunitásnak a fejlődő magzathoz való szállításában.
További példa: tudjuk, hogy a diuretikus hormon, az aldoszteron, növeli a sejt felületén a Na+ csatornák kifejeződését a húgyhólyag epiteliális sejtek apikális membránjában. Ez a mechanizmus részt vesz a sóvisszatartásban, és például alacsony nátriumtartalmú diéta eseteiben lép fel.
Az IMP-k sejtmembránban való kifejeződése modulálásának egy másik példájában megfigyelték, hogy az immunrendszer működése az idegen, nem saját antigének felismerésén alapul. A felismerés és immunválasz részben az immunrendszer azon sejtjeitől származik, amelyek fel tudják ismerni az idegen peptidszekvenciákat, és ezekre válaszolni képesek. Ezeket a peptidszekvenciákat az immunrendszer antigén bemutatósejteknek nevezett sejtjei mutatják be más sejteknek. Az antigén bemutatósejtek felveszik az idegen, antigénhatású proteineket, ezeket peptidekké emésztik meg, és a fő hisztokompatibilitási komplex IMP-i által a sejtmembránon kialakított gödörben állítják ki az idegen peptideket.
Tehát az IMP-knek központi szerepük van egy sejt ama képessége szempontjából, hogy az mennyire képes kölcsönhatást létesíteni külső környezetével, és tekintve ezeknek a kölcsönhatásoknak a különböző és változatos természetét, nem meglepő, hogy az IMP-k roppant hosszú sorát fedezték fel. Egy sejt működésében az IMP-k döntő szerepe azt jelenti, hogy ezek gyakran lehetnek patofiziológiás állapotban és céljai lehetnek számos terápiás beavatkozásnak.
Az IMP-aktivitás szabályozására irányuló eddigi megoldások főként a sejt felületén már kifejeződött IMP funkciójának módosítására összpontosultak. Az eddigi terápiás beavatkozások tehát specifikus kezelést igyekeztek biztosítani konkrét IMP-k és konkrét sejttípusok konkrét funkciói számára. Terápiás szerekként használt inhibitorokat fejlesztettek ki specifikus transzport IMP-k számára. Például a neuronok 5HT transzport proteinjének inhibitorait depresszióellenes szerekként használják. Az egyes receptor IMP-k antagonistáit rendszerint gyógyszerként használják. Például ilyenek az antihisztaminok, amelyek mind a Hl, mind a H2 hisztaminreceptor szubtípusra specifikusak és a β-adrenoreceptor antagonistái. Az IMP-funkciók inhibitorait is széleskö2
HU 217 220 Β rűen használják gyógyszerek gyanánt. Ilyenek például a transzmembrán ionszállítás inhibitorai, mint a furoszemid és amilozid diuretikum. Ez utóbbi a húgyhólyag epiteliális sejtek apikális Na+ csatornájának inhibitora. Ismeretes, hogy a káliumcsatomák inhibitorai, mint aritmia elleni szerek, fejlesztés alatt állnak. A sejtadhéziós IMP-kre jelenleg szintén a szelektív antagonisták fejlesztése irányul.
Egy másik megoldás arra törekszik, hogy genetikai szinten szelektíven módosítsa az egyes IMP-k expresszióját az illető IMP-t kódoló megfelelő gén transzkripciójának a módosításával, hogy így módosítsa a specifikus IMP proteinszintézisét.
Összefoglalva, ismert, hogy az IMP-k meghatározó szerepet töltenek be egy sejt külső környezetére adott válaszában. Az IMP-k szabályozására kidolgozott eddigi megoldások általában a sejt felületén egy specifikus IMP-t vettek célba, és módosították működőképességét. Úgy véljük, hogy az IMP-k plazmamembránon belüli sűrűségének szabályozása széles körű alkalmazást nyerhet a különböző rendellenességek kezelésében. Az IMP-k nagymértékű sokfélesége és a jelenlegi terápiás beavatkozások szempontját tekintve, a találmány azon a felismerésen alapszik, hogy a szerek egyetlen fajtája képes módosítani az IMP-k expresszióját a sejttípusok széles változatában. Ugyanaz a szerfajta tudja módosítani a szállító IMP-k, a receptor IMP-k, az adhéziós IMP-k, a csatorna-IMP-k és az antigén-bemutató IMP-k expresszíóját. Az IMP-ket befolyásoló szereket előzőleg funkció szerint osztályozták: például Ca++antagonisták. Az egyes csoportok tagjai kémiai és mechanikai szempontból nagyon különbözőek voltak. Ezzel szemben, a találmányban említett szerek csoportja - a sajátos domének helyére ésszerű módon bevezetett olyan szubsztituensekkel, amelyek a szer funkciójára előre megszabható hatást gyakorolnak - szerkezetileg homogén. A találmány további elemét képezi, hogy a szer szelektíven irányítható speciális sejttípusok felé, és így lehetővé válik az IMP-expresszió szelektív módosulása csak egyfajta sejttípusban.
A találmány olyan szerre vonatkozik, amely egy sejt és külső környezete között fellépő kölcsönhatás szabályozására alkalmas. Pontosabban, a találmány egy olyan szert bocsát rendelkezésre, amellyel szabályozhatjuk az integrált membránprotein- (IMP) molekulák szállítását egy sejt belső szerkezetéből a sejtmembránhoz, miáltal módosítjuk a sejt és külső környezete közötti kölcsönhatást. Részletesebben kifejtve, a találmány tárgyát egy olyan új szer képezi, amely úgy módosítja a körforgalmú membránvezikulák (Recyclable Membráné Vesicles=RMVs) szerkezetét, hogy ne legyenek képesek az IMP-ket a sejt felületére szállítani.
Definíciók
Az alábbi kifejezések jelentése a következő:
- Integrált membránprotein (IMP) bármilyen olyan proteinre vonatkozik, amely egy biológiai membrán lipid kettős rétegébe van beágyazva és azon áthúzódik.
- Körforgalmú membránvezikula (Recyclable Membráné Vesicle=RMV) egy olyan intracelluláris vezikulát jelent, amely egy sejtben a címszóiban van jelen, egy lipid kettős rétegű membránhoz kötve. Az RMV-k a plazmamembránból képződnek és a sejt belsejébe haladnak az endocitózis elnevezésű folyamatban. Az RMC-k körforgalomban vesznek részt, azaz a sejt plazmamembránjából képződnek, és azzal fuzionálnak. A folyamatot, amelyben a plazmamembránhoz haladnak, majd abba beolvadnak, exocitózisnak nevezzük. A sejtben az RMV-k tevékenysége az IMP-k reverzibilis transzportjából áll, azaz az IMP-ket a sejt felületéhez és onnan vissza szállítják; ebben a tekintetben különböznek a neuroszekréciós sejtek szekretoros vezikuláitól.
- Endoszóma alatt azokat az intracelluláris vezikulákat értjük, amelyek a plazmamembránból képződnek endocitózis révén.
- A nehéz lánc a Clostridium neurotoxinokból származó két polipeptid lánc közül a nagyobbat jelenti; molekulatömege körülbelül 100 kD és szokásos elnevezése HC; a könnyű lánc a Clostridium neurotoxinokat képező két polipeptid lánc közül a kisebb; molekulatömege körülbelül 50 kD és szokásos elnevezése LC; a természetben előforduló nehéz és könnyű lánc kovalens kötéssel, legalább egy diszulfid kötés révén kapcsolódik egymáshoz.
- A Hj-fragmentum alatt a Clostridium neurotoxin proteolitikus hasítása - például tripszinnel vagy papainnal — révén keletkező nehéz lánc aminoterminális végéből származó egy fragmentumot értünk.
- H2L alatt egy olyan Clostridium neurotoxin fragmentumot értünk, amelyet proteolitikus hasítással - például tripszinnel vagy papainnal - állítunk elő, és amelyben a könnyű lánc még diszulfid kötésekkel van a H2 fragmentumhoz kötve.
A találmány egyik elemét képezi egy olyan szer, amely az IMP-szint szabályozásával - az IMP-szint felelős egy metabolit transzportjáért a sejtmembránon át szabályozza a metabolit hozzáférhetőségét a sejten belül.
A találmány egy további elemét képezi egy olyan szer, amely az IMP-szint szabályozásával - az IMPszint felelős egy metabolitnak a sejtbe történő szállításáért és a sejtből való elszállításáért a sejtmembránon át irányítja egy metabolit transzportját a sejten keresztül.
A találmány további elemét képezi egy olyan szer, amely az IMP-szint szabályozásával - az IMP-szint felelős egy sejt plazmamembránjának ionszelektív permeabilitásáért - modulálja az adott ion koncentrációját a sejten belül.
A találmány további elemét képezi egy olyan szer, amely az IMP-szint szabályozásával - az IMP-szint felelős egy szignált kibocsátó molekula felismeréséért - modulálja a sejt fogékonyságát ezen szignált adó molekulára.
A találmány még további elemét képezi egy olyan szer, amely az IMP-szint szabályozásával - az IMPszint felelős szignálok átadásáért a sejtmembránon keresztül, miután a szignált adó molekula membránjához
HU 217 220 Β kötődött - modulálja a sejt érzékenységét ezen szignált adó molekulára.
A találmány még további elemét képezi egy olyan szer, amely az IMP-szintet szabályozza. Az IMP-szint felelős azért, hogy a bekebelezett antigénekből származó peptidfragmentumokat kiültesse a sejt felszínére. Ennek következtében a szervezetben hatást gyakorol a szervezet immunválaszára.
A találmány tárgyát képezi egy olyan szer is, amely célspecificitással rendelkezik célsejttípusokra olyan módon, hogy a szer hatásterülete az említett sejttípusra korlátozódik.
Amint az előzőekben megállapítottuk, az IMP-aktivitás szabályozására irányuló korábbi próbálkozások elsősorban a sejt felületén már kifejeződött IMP funkciójának modulálására összpontosultak. A találmány, ezzel éles ellentétben, a sejt felületén kifejeződni készülő IMP-szintet modulálja.
Belátható, hogy a találmány tárgyát, amely abból áll, hogy egy szert bocsátunk rendelkezésre az IMP-szint szabályozására a sejt felületén, potenciálisan számos területen alkalmazhatjuk egy sejt környezetére adott válaszának modulálására. A találmány egy olyan szerre vonatkozik, amely úgy működik, hogy arra a mechanizmusra hat, amely az IMP-két a sejt felületére juttatja. Ezt példákkal, például az 1. és 2. példával bizonyítjuk. Egy ilyen szemek három különböző funkciója kell legyen, s a két első ismert ezen a szakterületen. Először kötődnie kell egy sejtfelületi szerkezethez (ez a kötőhely). Ezután be kell lépnie a sejt citoszolállományába. Ismert, hogy a molekulák belépése a sejtbe az endocitózis nevű folyamatban megy végbe. Azonban, minthogy tudjuk, hogy a sejt felületén csak bizonyos kötőhelyek vesznek részt az endocitózisban, csak ezek a kötőhelyek az alkalmas célhelyek. Amint a szer endocitózis révén bejutott a sejtbe, a szemek ezután el kell hagynia a képződött endoszómát az endoszomális membránon keresztül, hogy belépjen a citoszolba. A szakirodalomban jól ismert, hogy a szerek hogyan képesek véghezvinni a sejthez való specifikus kötődést és a citoszolba való belépést [például: J. Pastan, M. C. Willingham, D. S. P. Fitzgeralg, Cell, 47, 641-648 (1986); S. Olsnes, K. Sandvig, O. W. Petersen,
B. Van Dews, Immunoi. Today, 10, 291-295 (1989); T. B. Strom, P. L. Anderson, V. E. Rubin-Kelley, D. P. Williams, T. Kiyokawa, J. R. Murphy, Ann. N. Y. Acad. Sci. 636, 233-250 (1991)]. A szer harmadik funkciója a találmány meglepő felismerése, nevezetesen, hogy képes befolyásolni az RMV-t. Ennek a szemek az a további meglepő eleme, hogy az RMV-re való hatásával korlátozza annak azt a képességét, hogy IMP-ket szállítson a sejt felületére.
A találmány szerinti szer tehát a következő funkciós doméneket tartalmazza:
-AB dómén - kötő dómén - a szert egy kötőhelyhez köti az endocitózisra képes célsejtben, és így egy szert tartalmazó endoszóma képződik, ahol a B dómén nem Clostridium neurotoxinból származik;
-AT dómén - transzlokációs dómén - áthelyezi az E domént (a szer más doménjeivel és/vagy a kötőhellyel együtt vagy anélkül) az endoszóma belsejéből - az endoszomális membránon át a sejt citoszolrészébe;
- Az E dómén - effektor dómén - meggátolja az IMP-k RMV-k által végzett transzportját a sejt felületére.
A B domént úgy állítjuk elő, hogy az specifikus legyen egy célsejttípusra. A szakterületen jól ismert, hogy egy szerrel meg lehet célozni egy speciális sejttípust. Tehát a B dómén funkcióit betölthetjük a szakterületen ismert számos sejthez kötődő molekula egyikének a használatával. Ilyenek például - de nem kizárólag - az antitestek, monoklonális antitestek, antitestfragmentumok [Fab, F(ab)’2, Fv, egyláncú antitestek stb.], hormonok, citokinek, növekedési faktorok és lektinek.
A T dómén funkcióit olyan molekulákkal tudjuk biztosítani, amelyek megfelelő pórusokat képeznek az endoszomális membránban. Jól alátámasztott tény, hogy a toxinmolekulák bizonyos részei képesek ilyen pórusokat képezni. Ilyenek többek között az anthrax toxin fragmentumai, a botulinusztoxin, a tetanusztoxin, diftériatoxin és a Pseudomonas endotoxin [D. H. Hoch, M. Romero-Mira, Β. E. Ehrlich, A. Finkelstein, B. R. Das Gupta, L. L. Simpson, PNAS, 82, 1692-1696 (1985); S. Olsnes, H. Stenmark, J. O. Moskaug, S. McGill, I. H. Madshus, K. Sandvig, Microbial Pathogenesis, 8, 163-168 (1990)]. Egy ilyen molekula a Clostridium neurotoxinok nehéz lánca, például az A típusú botulinusz neurotoxin. Megállapítottuk, hogy a toxinmolekuláknak lehetőleg csak azokat a részeit használjuk, amelyek pórusképzésre képesek az endoszomális membránban.
Az E dómén funkciói, azaz az IMP-k sejtfelületre való szállításának gátlása, nem ismert ezen a szakterületen. Meglepő módon azt találtuk, hogy ha bizonyos toxinmolekulák különböző olyan részeit, amelyek funkcióik szempontjából különböznek azoktól, amelyek a pórusképzésre képesek - ilyenek a Clostridium neurotoxinok, mint akár a botulinusz-, akár a tetanusztoxin - bevezetjük a célsejtek citoplazmájába, ezek képesek meggátolni az RMV-kben lévő IMP-k transzportját a sejt felületére, és ezzel csökkentik ezen IMP-k koncentrációját a sejt felületén. Pontosabban kifejtve, azt találtuk, hogy a tetanusztoxin és az A, B, Cb D, E, F és G botulinusztoxin különösen alkalmas erre a célra. Ilyen molekula például egy Clostridium neurotoxin H2L elnevezésű része. A toxinból eltávolítottuk a nehéz lánc neuronok elleni aktivitású karboxiterminális felét, és megmaradt az aminoterminális fele, amelyet diszulfid híd köt a könnyű lánchoz. Egy másik példa lehet egy Clostridium neurotoxin könnyű lánca, mint például a B típusú botulinusz neurotoxin könnyű lánca, illetve a molekulának főként azok a részei, amelyeknek Zn++függő metalloproteáz-aktivitása van.
A találmány tehát egy alábbi szerkezetű szerre vonatkozik:
B domén-T domén-E dómén.
A doméneket kovalens kötések kötik össze, amelyek megfelelő betét- (spacer) szakaszokat tartalmaznak a domének között.
HU 217 220 Β
A találmány egyik kiviteli alakjában a B dómén egy olyan kötőmolekula, amely az endocitózisra képes célsejt egy kötőhelyéhez kötődik, a T dómén egy botulinusz neurotoxin nehéz lánca vagy ennek fragmentumai és az E dómén egy botulinusz neurotoxin könnyű lánca vagy ennek fragmentumai. A T és az E dómén a
C. botulinum ugyanazon vagy különböző szerotípusaiból származhat.
A találmány egy másik kiviteli alakjában a B dómén egy olyan kötőmolekula, amely az endocitózisra képes célsejt egy kötőhelyéhez kötődik, a T dómén egy tetanusz neurotoxin nehéz lánca vagy ennek fragmentumai és az E dómén egy botulinusz toxin könnyű lánca vagy ennek fragmentumai.
A találmány egy további kiviteli alakjában a B dómén egy olyan kötőmolekula, amely az endocitózisra képes célsejt egy kötőhelyéhez kötődik, a T dómén egy botulinusz neurotoxin nehéz lánca vagy ennek fragmentumai és az E dómén egy tetanusz neurotoxin könnyű lánca vagy ennek fragmentumai.
A találmány más kiviteli alakjában a B dómén egy olyan kötőmolekula, amely az endocitózisra képes célsejt egy kötőhelyéhez kötődik, a T dómén egy tetanusz neurotoxin nehéz lánca vagy ennek fragmentumai és az E dómén egy tetanusz neurotoxin könnyű lánca vagy ennek fragmentumai.
Magától értetődik, hogy a találmány az azonos vagy a különböző szervezetekből származó toxinmolekulák vagy toxinmolekula-fragmentumok bármilyen olyan kombinációjára vonatkozik, amely a leírt funkciókkal rendelkezik.
Ha a szert egy szervezetnek beadjuk, a célsejt felületén az IMP-k koncentrációja csökken. Ez több kívánt hatást eredményezhet: például egy metabolit vagy ion felvétele a sejtbe vagy átvitele a sejten keresztül csökken, csökken a célsejt válasza egy szingált adó molekulára, vagy változás megy végbe a szervezet immunválaszában.
1. példa
Tripszinnel kezelt 3T3-LI fibroblaszt szuszpenzióban elektroporációt alkalmaztunk 300 V/cm és 960 mF mellett - időkonstans: 11-11,5 msec - kondenzátorkészlettel ellátott BioRad-féle GenePulser-készülék használatával, 1 μΜ botulinusz neurotoxin-B (BONT-B) jelenlétében vagy enélkül. Elektroporáció után hagytuk a sejteket letapadni, amelyeket egysejtrétegű tenyészetben tartottunk fenn 24 tartályos lemezeken 37 °C-on 72 órán át. A sejteket ezután mostuk, majd 5 percig 37 °C-on 5 nM 1 típusú inzulinszerű növekedési faktor (IGF— 1) jelenlétében vagy enélkül inkubáltuk, ezután 5 percig jégen tartottuk. A sejtekről leszívtuk a felülúszót, amelyet 1,5 nM jéghideg 125I-transzferrinnel (specifikus aktivitás: 47 TBq/mM) helyettesítettünk. A nem specifikus kötést nem radioaktív transzfemn 100-szoros moláris túlsúlyával való inkubálásokkal állapítottuk meg. Két óra múlva a felülúszót eltávolitottuk, majd jéghideg pufferrel való háromszori mosás után a sejtréteget 1 n nátrium-hidroxidban emésztettük és a megkötött 125I-transzferrin mérésére LKB1275 minigamma gammaszámlálót használtunk. A transzferrinkötődés felerősödésének számításánál a 125I-transzferrinnek IGF-1 jelenlétében mért kötődését az IGF-1 nélkül mért specifikus kötődése százalékában fejeztük ki.
Az 1. táblázat bemutatja, hogy a BONT-B-vel kezelt sejtekben az IGF-1-re adott feleletben csökkent a 125Itranszferrinkötődés növekedése a kontrolihoz viszonyítva. Ez azt mutatja, hogy a BONT-B bevezetése a 3T3-LI fibroblasztok citoszolállományába gátolja ezekben a sejtekben a transzferrinreceptorok IGF-1 stimulált felszaporodását.
A 3T3-LI fibroblasztokból kivont Triton-X-114oldható proteinek emésztett elegyeit Western blottinganalízissel, egy, az 1. számú peptidszekvencia (QQTQAQVDEWDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLK) elleni poliklonális antitest használatával vizsgáltuk. Az említett peptidszekvenciát neuroszekréciós sejtek egy szekréciós vezikuláris proteinjében azonosítottuk. Ez az antivezikuláris antitest csökkent reaktivitást mutat azon BONT-B kezelt fibroblasztokból származó mintákból kapott megfelelő parallel sávval, amelyekről megállapították, hogy nincs neuroszekréciós aktivitásuk. Tehát a BONT-B módosítja a vezikula (valószínűleg az RMV) szerkezetét a 3T3-LI fibroblasztokban, a transzferrinfelszaporodás gátlásával megegyezően.
2. példa
A 3T3-LI fibroblasztokat elektroporációval kezeltük 0,5 μΜ botulinusz neurotoxin-A (BONT-A) jelenlétében és enélkül, az 1. példában megadott körülmények mellett. A kezelt és kezeletlen sejtekben a 125Itranszferrinkötődés IGF-1 stimulációját az 1. példában leírtak szerint vizsgáltuk.
A 2. táblázatban közölt eredmények mutatják, hogy a 3T3-LI fibroblasztok BONT-A-val való kezelése megszünteti a l25i-transzferrinkötődésnek IGF-l-re adott válaszban látott felerősödését. Ez azt mutatja, hogy a BONT-A-nak 3T3-LI fibroblaszt citoszolba való bevezetése gátolja ezekben a sejtekben a transzferrinreceptorok IGF-1 stimulált felszaporodását.
3. példa
A 3T3-LI fibroblasztokon elektroporációt végeztünk 0,5 μΜ BONT-A H2L-fragmentum (H2L-A) jelenlétében és enélkül, az 1. példában használt körülményekkel azonos módon. Ezt a fragmentumot az A szerotípusba tartozó C. botulinum neurotoxinjából állítjuk elő, részleges proteolízissel, tozil-fenilalanin-klórmetánnal kezelt tripszin használatával. A H2L-komplexet ezután Sephadex G-200-zal való kromatografálással tisztítjuk [C. C. Shone, P. Hambleton, J. Melling, Eur. J. Biochem, 151, 17-82 (1985)]. Az elektroporációt, valamint a 125I-transzferrinkötődés IGF-1 stimulációjának mérését a kezelt és kezeletlen sejtekben úgy végezzük, ahogyan azt az 1. példában leírtuk.
A 3. táblázatban látható eredményekből kitűnik, hogy a 3T3-LI fibroblasztok H2L-A-val való kezelése gátolja a 125I-transzferrin kötődésének az IGF-1-re adott válaszban látott felerősödését. Ez azt mutatja,
HU 217 220 Β hogy a botulinusz neurotoxin-A H2L-A fragmentumainak a 3T3-LI fibroblaszt citoszolba való bevitele gátolja ezekben a sejtekben a transzferrinreceptorok IGF-1 stimulált felszaporodását.
4. példa
3T3-LI adipocitákat dexametazonnal, 3-izobutil-lmetil-xantinnal és inzulinnal való kezeléssel differenciáltuk 3T3-LI fibroblasztokból, Frost és Lane közlése szerint [S. C. Frost, M. D. Lane, J. Bioi. Chem., 260, 2646-2652 (1985)]. A differenciálódás után 7 nap múlva a 3T3-LI adipocitákat szérummal kiegészített és szűréssel sterilizált, Dulbecco által módosított Eagle-táptalajjal hígított, A szerotípusú botulinum neurotoxinnal (a BONT-A végső koncentrációja: 200 nM) kezeltük. A toxinnal kezelt és a kontrolisejteket 37 °C-on 8% széndioxidot tartalmazó atmoszférában inkubáltuk 45 órán át. A sejteket ezután kétszer mostuk, majd szérummentes, Dulbecco által módosított Eagle-táptalajban, 8% szén-dioxid mellett 2 órán át inkubáltuk. Ezután Krebs-féle Reuger-foszfát-oldatban mostuk a sejteket, majd vagy Krebs-féle Reuger-foszfát-oldatban (alapfelvétel), vagy 100 nM inzulint tartalmazó Krebs-féle Reuger-foszfátoldatban (stimulált felvétel) inkubáltuk a sejteket 15 percig 37 °C-on. A glükózfelvétel megindítását [3H]-2-dezoxiglükóz (14,2 KBq, 10 pM glükóz) hozzáadásával végeztük. Az elegyet 10 percig 37 °C-on tartottuk, majd a reakciót úgy állítottuk le, hogy leszívtuk a glükózoldatot és gyors mosást végeztünk jéghideg foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal. A sejteket 0,2 n nátrium-hidroxid hozzáadásával lizáltuk és a kapott oldatot 0,2 M sósav hozzáadásával semlegesítettük. A [3H]-2-dezoxiglükóz-felvételt folyadékszcintilláció-számlálással mértük - Optiphase scintillant-ban - Wallac 1410 folyadékszcintillációs számláló használatával.
Ismeretes, hogy a Clostridium neurotoxinok képesek belépni bizonyos neuroszekréciós sejtekbe (például PC 12 sejtekbe) egy alacsony affmitású receptor útján, ha neutrotoxin magas koncentrációval inkubáljuk a sejtet hosszú időn keresztül. Úgy tűnik, hogy ez a folyamat egy receptoron keresztüli utat használ, amely különbözik a neuromuszkuláris kapcsolódáson jelen lévő, magasan specifikus, igen erős affmitású receptortól. Közölték ezenkívül, hogy bizonyos Clostridium-toxinok hatást gyakorolnak fagocita sejtekre - ilyenek a makrofágok - és feltételezik, hogy a sejtbe való belépésük e sejtek speciális fagocitaaktivitása révén történik. Azonban felismertük, hogy a Clostridium-neurotoxinok neuronszelektivitását egy nagyon szelektív kötődési és sejtbe való belépési mechanizmus okozza. Ezért igen meglepő ennek a vizsgálatnak a felismerése, hogy ugyanis, ha a 373-LI adipocitákat botulinum neutrotoxin-A-val inkubáljuk - mint leírtuk -, ez gátolja a [3H]-2-dezoxiglükóz transzport inzulinstimulált felerősödését (4. táblázat). Ismert, hogy az adipocitákban a glükóztranszport inzulin által okozott felerősödését a glükózszállító proteineknek az intracelluláris készletekből (RMV-k) a sejt felületére történő vándorlása okozza. Az eredményből tehát arra következtethetünk, hogy a botulinusz neurotoxin-A gátolja az RMV-kben a glükóztranszportőrök inzulinstimulált elmozdulását az adipocita sejtfelülethez.
5. példa
A 3T3-LI adipocitákat tripszinnel kezeltük, majd a sejtszuszpenziót elekroporációnak vetettük alá botulinusz-B toxin jelenlétében (0,32 pM) és enélkül.
Az elektroporációhoz egy 960 mF kondenzátort használtunk, amely 300 v/cm erősségű pulzusokat adott, 11-12 msec időkonstans mellett. Elektroporáció után a sejteket mostuk, majd szérumtartalmú táptalajban 6 tartályos lemezekre vittük. A sejteket nedves atmoszférában (levegő/CO2=92,5%/7,5%) 72 órán át 32 °C-on inkubáltuk. Ezután a sejteket mostuk, majd 0,1 n nátrium-hidroxid-oldatban extraháltuk. A kivonatot 0,1 n sósav hozzáadásával semlegesítettük, utána membránproteineket Triton-X-114-ba töltöttük le, ezt követően Western blotting-analízist végeztünk az 1. példában leírt antivezikuláris antitest használatával. Meglepő felismerése a vizsgálatnak az, hogy a botulinum neurotoxinnak az adipociták citoszolrészébe elektroporációval való bejuttatása a vezikula- (valószínűleg RMV) szerkezet módosítását eredményezi, amelyet a botulinusz neurotoxin-B-vel kezelt sejtekből származó mintákon az antitestnek a megfelelő parallel sávval mutatott, csökkent reaktivitása bizonyít.
6. példa
Ebben a példában egy olyan szer szintetizálását ismertetjük, amely az adipociták inzulinfüggő glükóztraszportőrének a sejt felületén való kifejeződését szabályozza. A példában a szer kötő doménje (B) az inzulinszerű növekedési faktor II, amelyet a BRL-3A sejtek kondicionált táptalajból Marguette és munkatársai [H. Marguette, G. J. Todaro, L. E. Henderson, & Oroszlán, 7. Bioi. Chem., 256. 2122-2125 (1981)] leírása szerint tisztítottunk.
Az A szerotípusú C. botulinum neurotoxinjából [J. Melling. P. Hambleton & C. C. Shone, Eye (1988), 2., 16-23.)] úgy állítottuk elő a transzlokációs domént (T), hogy a neurotoxint korlátozott proteolízisnek vetettük alá tozil-fenil-alanin-klór-metánnal kezelt tripszin használatával. A T domént tartalmazó frakciót ezután Sephadex G-200-οη való kromatografálással tisztítottuk [C. C. Shone, P. Hambleton, J. Melling, Eur. J. Biochem, 151, 75-82 (1985)]. Ezt a frakciót ezután foszfát/borát pufferben (pH 8,4) - kvatemer amino-etilSephadex oszlopra visszük fel, és az oszlopon inkubáljuk 4 °C-on egy éjszakán át 2M karbamid és 0,lM ditiotreit elegyében. Az oszlopot ezután 2M karbamid és 10 pM ditiotreit-tartalmú pufferrel mossuk. A T domént ezután 2M karbamid és 10 mM ditiotreit- tartalmú foszfát/borát pufferrel, 0,1-0,2 M nátrium-klorid gradienssel eluáljuk [B. Poulain, J. D. F. Wadsworth, E. A. Maisey, C. C. Shone, J. Melling, L. Tánc, J. O. Dolly, Eur. J. Biochem, 185, 197-203 (1989)]. A Clostridium neurotoxinok diszulfid kötéssel összekapcsolt két láncból álló proteinek, amelyek egy nehéz láncot és egy könnyű láncot tartalmaznak [L. L. Simpson, Ann. Rév. Pharmacol. Toxicol., 26, 427-453 (1986)]. Meg kell je6
HU 217 220 Β gyezni, hogy a megadott módon előállított T dómén a neurotoxin H2 elnevezésű nehéz láncának egy frakciójával azonos.
Az effektor domént (E) a C. tetani neurotoxinjából állítottuk elő Ampholite-tal készített szaharóz gradiensben, izoelektromos fókuszálással, 2M karbamiddal előállított redukáló körülmények mellett [V. Weller, Μ. E. Dauzenroth, L. D. Meyer zu Heringdorf, E. Habermann, Eur. J. Biochem, 182, 649-656 (1989)]. Megjegyezzük, hogy a megadott módon előállított E dómén a neurotoxin könnyű láncával azonos, és szokásos elnevezése LC.
Az E és T domént ekvimoláris arányban redukáló körülmények között kevertük össze, és 4 °C-on, rázás mellett, redukálószerek nélküli fiziológiás sóoldatban való ismételt dialízissel, kovalens kötéssel kapcsoltuk össze. Az esetleg visszamaradt szulfhidrilcsoportokat 150 pM jód-acetamid hozzáadásával - 30 perc, 4 °C — sötét helyen módosítottuk. A konjugált E-T terméket méretkizárásos kromatográfiával, Sephadex G-150 és kálium-foszfát puffer (pH 7,0) használatával tisztítottuk. Végül a B domént N-szukcinimidil-3-(2-piridil-tio)-propionát (SPDP) segítségével az E-T komplexhez kapcsoltuk. Az E-T komplexeket (5 mg) 1 ml foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban (PBS) feloldottuk, hozzáadtunk 0,5 ml, vízmentes alkoholban feloldott 200 mg SPDP-t. Az elegyet szobahőmérsékleten 30 percig reagáltattuk, majd a 2-piridil-diszulfiddal szubsztituált peptidet az SPDP feleslegétől Sephadex G-25-ön való kromatografálással választottuk el. A B domént hasonlóan kezeltük, de kevesebb SPDP-t (0,2 ml etanolban 20 mg) használtunk. A szubsztituált B domént ugyancsak Sephadex G-25 oszlopról nyertük vissza, majd ditiotreit hozzáadásával - 0,05 M végső koncentrációig - redukáltuk. A redukálószer feleslegét gélszűréssel - Sephadex G-25-ön - távolítottuk el. Ezután azonos mennyiségű (tömeg/tömeg) E-T komplexet és szubsztituált, redukált B domént kevertünk össze, és 4 °C-on 18 óra hosszat állni hagytuk az elegyet. A kapott szert ezután Sephadex G-150 és kálium-foszfát puffer (pH 7,0) használatával kromatográfiásan tisztítottuk.
A leírt módon előállított szert ezután arra vizsgáltuk, hogy képes-e gátolni 3T3-LI adipocitákban a glükóztranszportőr-expresszió inzulinstimulált növekedését. A 3T3-LI adipocitákat dexametazonnal, 3-izobutil-lmetil-xantinnal és inzulinnal való kezeléssel differenciáltuk a 3T3-LI fibroblasztokból [S. C. Frost, M. D. Lane, J. Bioi. Chem., 260, 2646-2652 (1985)], majd a differenciálódás megindulása utáni 8-12 nap között használtuk. A sejteket 90 percig 37 °C-on inkubáltuk a szerrel és a szer nélkül. A sejteket ezután 2 órán át szérummentes Dulbecco-féle Eagle-táptalajban inkubáltuk az egyes kísérletek elején. Az inzulinnal kezelt sejteket ezután 10 percig ÍO ^M inzulin hatásának tettük ki, amelyet egy 1,6 χ 10~14M törzsoldatból adtunk a sejtekhez. A fent leirt kezelés után a sejteket hirtelen Krebs-Ringer-foszfátoldattal mostuk 37 °C-on és 10 percen át mértük a [3M]-2dezoxiglükóz (14,2 KBq; 10mM)-Krebs-Ringer-foszfát-oldatban - felvételét 37 °C-on 107M inzulinnal és e nélkül. A reakciót a glükózoldat leszívásával és 0,2 M jéghideg nátrium-hidroxid-oldattal való azonnali mosással állítottuk le. Az oldatot 0,2M sósav hozzáadásával semlegesítettük, és ezután szcintillációszámolást végeztünk Optiphase scintillant-ban Wallac 1410 folyadékszcintilláció-számláló használatával.
7. példa
A találmány egy másik kiviteli alakjában az E és T domént ugyanazon botulinusz neurotoxin szerotípusból állítottuk elő, már egymással összekapcsolva. Az A szerotípusú C. botulinum neurotoxint korlátozott proteolízisnek vetettük alá, tozil-fenil-alanin-klór-metánnal kezelt tripszin használatával. Az E-T komplex tisztítását ezután Sephadex G-200-οη való kromatografálással végeztük [C. C. Shone, P. Hambleton, J. Melling, Eur. J. Biochem., 151, 75-82 (1985)].
Megjegyzendő, hogy ez a fragmentum a H2L-nek nevezett fragmentummal azonos. A szabadon maradt szulfhidrilcsoportokat a 6. példában leírt módon 150 mM jód-acetamid hozzáadásával módosítottuk. A kötő domént (B), azaz az inzulinszerű növekedési faktor ΙΙ-t a 6. példában leírtak szerint állítottuk elő, majd hozzákötöttük az E-T komplexhez SPDP segítségével, mint leírtuk. A szer hatását az inzulinfüggő glükóz transzportőr kifejeződésére adipocitákban úgy teszteltük, ahogyan a 6. példában leírtuk.
8. példa
A találmány egy következő kiviteli alakjában a C3b komplementfragmentum CR1 receptorának sejtfelületen való kifejeződésének szabályozására - neutrofilekben (CD35) - egy szert szintetizáltunk a következőképpen. A B domént a Pl50, 95 leukocita adhéziós molekula elleni SHCL3 monoklonális antitestből [S. A. Stacker, T. A. Springer, J. Immunoi., 1991., 146(2)., 648-655] állítottuk elő. Az E és T domént az A szerotípusú botulinusz neurotoxinból, már összekapcsolva izoláltuk, mint a 7. példában leírtuk, majd hozzákötöttük a B doménhez, ahogyan ebben a példában ismertetjük.
A szer hatását a CR1 (CD35) neutrofd sejtek felületén való kifejeződésére teljesvér-hemolizáló technika használatával tesztelhetjük. Normál donoroktól EDTA antikoagulánsba vett teljes vért kezeltünk 4 órán át a szerrel, majd 30 percen át 37 °C-on aktiváltuk 10~6 M fMet-Leu-Phe-oldattal, amelyet úgy készítettünk, hogy egy DMSO-ban készített 10~2M törzsoldatot PBS-el hígítottunk. A kontrollsejteket PBS-ben inkubáltuk. A vért ezután 30 percig szobahőmérsékleten 10 ml fikoeritrinnel (Phycoerythrin) konjugált anti-CD 35 monoklonális antitesttel (Serotec: MCA 554 PE) inkubáltuk, a vörösvérsejteket a Becton-Dickinson-féle lizáló oldatban lizáltuk, a leukocitákat PBS-sel mostuk és 2% formaldehidtartalmú PBS-ben reszuszpendáltuk. A felületre kötődött PE analízisét folyadék-citometriával végeztük, Lysis II software-rel ellátott FACScan (Becton-Dickinson) készülék használatával.
9. példa
A találmány egy további kiviteli alakjában egy szert szintetizáltunk a Mac-1 leukocita adhéziós molekula
HU 217 220 Β (CD 11b) sejtfelületen való kifejeződésének a szabályozására. A következőképpen jártunk el: a B domént a P 150,95 leukocita adhéziós molekula elleni SHCL 3 monoklonáris antitestből állítottuk elő, standard módszerekkel, pepszin használatával. A kapott anyagot gélszűréssel tisztítottuk [F. J. Martin, W. L. Hűbbel,
D. Papahadjopoulos, Biochemistry, 20, 4229-4238 (1981)]. Az E és T domént A szerotípusú botulinusz neurotoxinból már összekapcsolva állítottuk elő, ahogyan a 7. példában leírtuk, majd B doménnel az ebben a példában leírtak szerint kapcsoltuk össze.
A szer hatását a Mac-1 (CD 11b) neutrofil sejtek felületén való kifejeződésére előnyösen teljes vérlizáló technikával tesztelhetjük. A normál donoroktól EDTA antikoagulásba levett teljes vért 4 órán át 37 °C-on kezeltük a szerrel, azután 30 percen át 37 °C-on aktiváltuk 10 6M fMET-Leu-Phe peptiddel, amelyet egy DMSOban készített 10 2M törzsoldatból PBS-sel való hígítással készítettünk. A kontrolisejteket PBS-ben inkubáltuk. A vért ezután 30 percig szobahőmérsékleten 10 ml fluoreszcein-izotiocianáttal konjugált anti-CD 1 lb monoklonális antitesttel (Serotec: MCA 551F) inkubáltuk. A vörös vérsejteket Becton-Dickinson lizálófolyadék használatával lizáltuk, a leukocitákat PBS-sel mostuk és 2% formaldehidtartalmú PBS-ben reszuszpendáltuk. A felületre kötődött FITC-et folyadék-citometriával analizáltuk, Lysis II software-rel ellátott FACScan (Becton-Dickinson) készüléket használva.
10. példa
A találmány szerinti példában egy szert szintetizáltunk a húgyhólyag epitélium apikális membránjában a sejtek felületén lévő Na+-csatomák számának a szabályozására. A következőképpen jártunk el: a B domént a húgyhólyag epiteliális sejtek egy felületi markere elleni nagy affmitású monoklonális antitestből állítottuk elő, standard módszerekkel, pepszin használatával, és a kapott anyagot gélszűréssel tisztítottuk [F. J. Martin, W.
L. Hűbbel, D. Papahadjopoulos, Biochemistry, 20, 4229-4238 (1981)]. Az E és T domént A szerotípusú botulinusz neurotoxinból már összekapcsolva állítottuk elő a 7. példa szerint, és a komplexet úgy kapcsoltuk a B doménhez, ahogyan az alábbiakban leírjuk.
A szer hatását az amilozidérzékeny Na+-csatornák aldoszteron-stimulált növekedése húgyúti epiteliális sejtek használatával teszteltük. Húgyhólyagepiteliálissejteket - patkányhólyagból származó primer tenyészeteket készítettünk [M. D. Johnson, G. T. Bryan, C. A. Reznikoff, J. Urol., 133, 1076-1081 (1985)] a szerrel és a szer nélkül inkubáltuk 90 percig, 37 °C-on. Az aldoszteronnal kezelt sejteket ezután 1 órán át aldoszteron hatásnak tettük ki. Kezelés után a sejteket azonnal mostuk és 37 °C-on 5 perc inkubáció folyamán mértük a 22 Na+ amilozidérzékeny felvételét.
11. példa
Egy további találmány szerinti példában egy szert szintetizáltunk antigén bemutató B sejtek szabályozására a következőképpen. A B domént a pan B sejt elleni LL2 monoklonális antitestből [R. J. Kolitman et al.,
Cancer Research, 53., 819-825 (1993)] állítottuk elő standard módszerekkel, pepszin használatával és gélszűréssel való tisztítással [F. J. Martin, W. L. Hűbbel, D. Papahadjopoulos, Biochemistry, 20., 4229-4238 (1981)]. Az E és T domént A szerotípusú botulinusz neurotoxinból már összekapcsolva izoláltuk a 7. példában leírtak szerint és a B doménhez úgy kapcsoltuk, ahogy ebben a példában leírjuk.
A szer hatását az antigén-bemutatásra a TA3 egérlymphoma sejtvonal használatával teszteltük. A sejteket először 90 percig 37 °C-on inkubáltuk a szerrel, ezután tyúktojás-lizozimet (hem egg lysozyme=HEL) adtunk hozzá és az inkubálást tovább folytattuk 2 órán át 37 °Con. A TA3 sejteket ezután fixáltuk, mostuk, majd I-Akhasított HEL46-61-re specifikus 3A9 T sejt hibridómával tenyésztettük [R. G. Lorenz, P. M. Allén, Natúré, 337, 560 (1989)]. A 3A9 sejtek felülúszóját arra teszteltük, hogy képes-e fenntartani az IL-2-fuggő CTLL sejtvonal növekedését. A proliferatív válaszokat 3H-timidin beépülésével mértük 3 órán keresztül, miután a sejteket 2 napig tenyésztettük a felülúszóval.
A fenti példák csupán szemléltetik a találmányt. Azok, akik ezen a szakterületen jártasak, pontosan tudják, hogy a három dómén bármilyen kombinációja a találmány oltalmi körébe tartozik. A szer szintetizálásakor a találmány szerinti T-E alkotórésznek a célzó komponenshez való kapcsolását kémiai kötéssel érjük el olyan reagensek és technikák alkalmazásával, amelyeket a szakemberek jól ismernek. Tehát, bár az adott példák kizárólag az SPDP-t használják konjugáló reagens gyanánt, mégis minden más olyan konjugáló reagenst, amely a szer célzó komponensét kovalens kötéssel tudja kapcsolni és a szakemberek előtt ismert, magában foglal ez a bejelentés. Hasonlóan magától értetődik az ezen szakterületen gyakorlattal rendelkezők számára, hogy akár a teljes szert, akár a szer fragmentumait kódoló DNS könnyen megszerkeszthető, és ha megfelelő szervezetben kifejeződik, fel lehet használni a szer vagy a szer fragmentumainak az előállítására. A találmány szerinti szer ilyen genetikai szerkezetei, amelyeket a gyakorlott szakemberek által ismert technikákkal állítottak elő, szintén a találmány oltalmi körébe tartozik.
IPARI ALKALMAZÁS
A találmány szerinti szer in vivő alkalmazható, akár közvetlenül, akár gyógyászatilag elfogadható só vagy észter formájában, a különböző patofiziológiai állapotok kezelési módszereiben.
Például a szer egy formája felhasználható a glükóz anyagcserezavarainak kezelésére, ugyanis a szer bizonyos sejtek glükózfelvételét korlátozza. Ennek speciális példájaként a szer egy formáját a klinikailag kóros elhízás (obesitas) kezelésére használjuk, az adipózus sejtek glükózfelvételének korlátozására és ezáltal ezekben a sejtekben a lipidfelhalmozódás csökkentésére.
Egy másik példában a szer egy formáját a magas vérnyomás kezelésére használjuk, ugyanis szabályozza a vesesejtek ionfelvételét, miáltal irányítja ezen szervek folyadékleadását.
Egy további példában a szert gyulladás kezelésére alkalmazhatjuk, azáltal, hogy a szer szabályozza a cél8
HU 217 220 Β sejtek külső szignálokra - amelyek a gyulladásos választ kiváltják - adott válaszát.
Egy még további példában a szer egy formáját immun-rendellenességek kezelési módszereiben használhatjuk úgy, hogy szabályozzuk a peptidszekvenciák an- 5 tigén bemutató sejtek által az immunrendszer effektor sejtjei számára végzett bemutatását.
1. táblázat
3T3-LI fibroblasztokban az IGF-1 növeli a 125I-transzferrin-kötődést
Kezelés IGF-1 Alapkötődés %-a±SD*
Kontroll - 100+28 (n=3)
+ 258+46 (n=3)
BONT-B - 100+8 (n=3)
+ 149+27 (n=3)
x Al25I-transzfcrrin specifikus kötődése 3T3-LI fíbroblasztokhoz, az IGF -1 nélkül bekövetkezhető specifikus kötődés százalékában kifejezve.
2. táblázat
3T3-LI fibroblasztokban az IGF-1 növeli a 125I-transzferrin kötődését
3. táblázat
3T3-LI fibroblasztokban az IGF-1 növeli a 125I-transzferrin kötődését
Kezelés IGF-1 Alapkötődcs %-a+SDx
Kontroll + 100+28 (n=3) 258+46 (n=3)
H2L-A + 100+15 (n=3) 134+60 (n=3)
x A125I-transzferrin,specifikus kötődése 3T3-LI fíbroblasztokhoz, az IGF-1 nélkül bekövetkező specifikus kötődés %-ában kifejezve.
4. táblázat
3T3-LI adipociták [3H]-2-dezoxiglükóz-felvétele
Alap Inzulinstimulált
Kontroll 1655+62 (n=3) 14 328+264 (n=3)
BoNT-A-val kezelt 2306+49 (n=3) 5587+322 (n=3)
Kezelés IGF-1 Alapkötődés %-a±SDx
Kontroll + 100+28 (n=3) 258+46 (n=3)
BONT-A + 100+44 (n=3) 149+10 (n=3)
x A125I-transzferrin specifikus kötődése 3T3-LI fíbroblasztokhoz, 35 az IGF-1 nélkül bekövetkező specifikus kötődés %-ában kifejezve.
Az eredmények három párhuzamos meghatáro25 zás középértékei ± SEM. Az eredményt az egysejtréteg által 10 perc alatt felvett össz-dpm-ben adjuk meg.
(Dpm=disintegrations per minute).
Az 1. számú szekvencia adatai
I. A szekvencia jellemzői
A) hosszúság: 62 aminosav
B) típus: aminosav
D) topológia: lineáris
II. A molekula típusa: peptid
XI. A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia
Gin 1 Gin Thr Gin Al a 5 Gin Val As p Glu Val 10 Val Asp 11 e Me t Arg 15 Va 1
Asn Va 1 As p Ly s Va 1 Leu Glu Arg As p Gin Ly s Leu Ser Glu Leu As p
20 25 30
As p Arg Al a As p Al a Leu G1 n Al a Gly Al a Ser Gin Phe Glu Thr Ser
35 40 45
Al a Al a Ly s Leu Ly s Arg Ly s Ty r Trp Trp Ly s Asn Leu Ly s
50 55 60
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (35)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás olyan szer előállítására, amely a sejt és külső környezete között létrejött kölcsönhatás szabályozására alkalmas azáltal, hogy szabályozza az integrált membránproteinek (IMP-k) körforgalmú membránvezikulákban (RMV-kben) való transzportját a sejtmembránhoz, azzal jellemezve, hogy három domént - a Β, T és E domént - kapcsolunk egymáshoz kovalens kötéssel a következőképpen:
    B domén-T domén-E dómén, amelyben a B dómén egy kötő dómén, amely a szert a sejten egy olyan kötőhelyhez kapcsolja, amely endocitózis révén egy endoszómába olvad be, ahol a B dómén nem Clostridium neurotoxinból származik, a T dómén egy transzlokációs dómén, amely áthelyezi az E domént (a szer más doménjeivel és/vagy a kötőhellyel együtt vagy e nélkül) az endoszóma belsejéből az endoszóma membránján át a sejtcitoszolba, és az E dómén egy effektor dómén, amely gátolja az RMVket abban, hogy az IMP-ket elszállítsák a sejt felületére, és ez a dómén a Clostridium neurotoxin könnyű láncának egy doménje vagy doménfragmentuma, amelynek Zn2+-fuggő metalloproteáz-aktivitása van.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a T dómén a Clostridium neurotoxin nehéz lánc egy doménje vagy doménfragmentuma.
    HU 217 220 Β
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E dómén botulinusz neurotoxinból származik.
  4. 4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E dómén A típusú botulinusz neurotoxinból származik.
  5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E dómén B típusú botulinusz neurotoxinból származik.
  6. 6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a T dómén egy Clostridium neurotoxin nehéz láncának aminoterminális része.
  7. 7. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a T dómén egy Clostridium neurotoxin nehéz láncának aminoterminális része, amelyet tripszinnel végzett proteolitikus hasítással állítottunk elő.
  8. 8. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a T dómén botulinusz neurotoxinból származik.
  9. 9. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a T dómén A típusú botulinusz neurotoxinból származik.
  10. 10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a T dómén B típusú botulinusz neurotoxinból származik.
  11. 11. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén ligandumot tartalmaz egy, a célsejten lévő sejtfelületi akceptorhoz, amelyet a célsejt endocitózis révén képes bekebelezni egy endoszómába.
  12. 12. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén ligandumot tartalmaz egy, a célsejten lévő sejtfelületi receptorhoz, amelyet a célsejt endocitózis révén képes bekebelezni egy endoszómába.
  13. 13. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén egy, a célsejten lévő felületi antigén elleni monoklonális antitestet tartalmaz, vagy egy ilyen monoklonális antitestből származik, amelyet a célsejt endocitózis révén képes bekebelezni egy endoszómába.
  14. 14. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén - kötő dómén egy speciális sejttípusra jellemző kötőhelyhez kötődik.
  15. 15. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szer hatást gyakorol az adipociták glükózfelvételének szintjére az inzulinra adott válaszban és a B dómén az adipocitákon lévő olyan kötőhely egy liganduma, amelyet az adipociták endocitózis révén képesek bekebelezni egy endoszómába.
  16. 16. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szer befolyásolja neutrofilek válaszadó képességét a C3b komplement fragmentumra és a B dómén a neutrofileken lévő olyan kötőhely liganduma, amelyet a neutrofilek endocitózis révén képesek bekebelezni egy endoszómába.
  17. 17. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szer hatást gyakorol a Mac-1 adhéziós molekula neutrofileken való kifejeződésére és a B dómén a neutrofileken lévő olyan kötőhely egy liganduma, amelyet a neutrofilek endocitózis révén képesek bekebelezni egy endoszómába.
  18. 18. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szer befolyásolja az antigén bemutatósejtek antigén bemutatását és a B dómén az antigén bemutatósejteken lévő olyan kötőhely egy liganduma, amelyet az antigén bemutatósejt endocitózis révén képes bekebelezni egy endoszómába.
  19. 19. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén az inzulinszerű növekedési faktor II. receptor liganduma.
  20. 20. A 16. vagy 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén egy, a pl50,95 adhéziós molekula elleni monoklonális antitest, vagy egy ilyen monoklonális antitestből származik.
  21. 21. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén egy, az antigén bemutatósejteken lévő felületi antigén elleni monoklonális antitest vagy egy ilyen monoklonális antitest származéka, és az antigén bemutatósejt endocitózis révén képes az említett felületi antigént egy endoszómába bekebelezni.
  22. 22. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén az inzulinszerű növekedési faktor II.
  23. 23. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén az SHCL3 monoklonális antitest vagy ennek származéka.
  24. 24. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén az LL2 monoklonális antitest vagy ennek származéka.
  25. 25. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén az inzulinszerű növekedési faktor II, a T dómén az A típusú botulinusz neurotoxin nehéz láncainak aminoterminális része, amelyet tripszin használatával végzett proteolitikus hasítással állítunk elő, és az E dómén az A típusú botulinusz neurotoxin könnyű lánca.
  26. 26. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén az SHCL3 monoklonális antitest, a T dómén az A típusú botulinusz neurotoxin nehéz láncainak aminoterminális része, amelyet tripszin használatával végzett proteolitikus hasítással állítunk elő, és az E dómén az A típusú botulinusz neurotoxin könnyű lánca.
  27. 27. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B dómén az LL2 monoklonális antitest, a T dómén az A típusú botulinusz neurotoxin nehéz láncának aminoterminális része, amelyet tripszin használatával végzett proteolitikus hasítással állítunk elő, az E dómén az A típusú botulinusz neurotoxin könnyű lánca.
  28. 28. Az 1-27. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Β, T és E domént kapcsolunk egymáshoz kovalens kötéssel a következőképpen:
    B dómén- χ -T dómén- χ -E dómén, amelyben X vagy egy kovalens kötéssel kapcsolt spacer molekulát, vagy egy közvetlen kovalens kötést jelent, de legalább az egyik X spacer molekulát jelent.
  29. 29. In vitro módszer egy sejt és külső környezete közötti kölcsönhatás szabályozására, azzal jellemezve, hogy az IMP-k RMV-kben való transzportját a sejt10
    HU 217 220 Β membránhoz úgy szabályozzuk, hogy olyan szert, alkalmazunk, amely három, egymáshoz kovalens kötéssel kapcsolódó domént - a Β, T és E domént - tartalmaz az alábbi módon összekapcsolva:
    B domén-T domén-E dómén, amelyben a B dómén egy kötő dómén, amely a szert a sejten egy olyan kötőhelyhez kapcsolja, amely endocitózis révén egy endoszómába olvad be, ahol a B dómén nem Clostridial neurotoxinból származik, a T dómén egy transzlokációs dómén, amely áthelyezi az E domént (a szer más doménjeivel és/vagy a kötőhellyel együtt vagy e nélkül) az endoszóma belsejéből az endoszóma membránján át a sejtcitoszolba, és az E dómén egy effektor dómén, amely gátolja az RMVket abban, hogy -az IMP-ket elszállítsák a sejt felületére, és ez a dómén a Clostridium neurotoxin könnyű láncának egy doménje vagy doménfragmentuma, amelynek Zn2+-függő metalloproteáz-aktivitása van.
  30. 30. In vitro módszer egy metabolitnak a sejtmembránon át történő transzportjáért felelős IMP-szint szabályozására, azzal jellemezve, hogy ennek a metabolitnak a sejten belüli hozzáférhetőségét, vagy ennek a metabolitnak a transzportját a sejten át úgy szabályozzuk, hogy olyan szert alkalmazunk, amely három, egymáshoz kovalens kötéssel kapcsolódó domént - a Β, T és E domént - tartalmaz az alábbi módon összekapcsolva :
    B domén-T domén-E dómén, amelyben a B dómén egy kötő dómén, amely a szert a sejten egy olyan kötőhelyhez kapcsolja, amely endocitózis révén egy endoszómába olvad be, ahol a B dómén nem Clostridial neurotoxinból származik, a T dómén egy transzlokációs dómén, amely áthelyezi az E domént (a szer más doménjeivel és/vagy a kötőhellyel együtt vagy e nélkül) az endoszóma belsejéből az endoszóma membránján át a sejtcitoszolba és az E dómén egy effektor dómén, amely gátolja az RMVket abban, hogy az IMP-ket elszállítsák a sejt felületére, és ez a dómén a Clostridium neurotoxin könnyű láncának egy doménje vagy doménfragmentuma, amelynek Zn2+-fuggő metalloproteázaktivitása van.
  31. 31. In vitro módszer a sejt plazmamembránjának egy ionra nézve szelektív permeabilitásáért felelős IMP-szint szabályozására és ezen ion koncentrációjának a sejten belüli modulálására, azzal jellemezve, hogy olyan szert alkalmazunk, amely három, egymáshoz kovalens kötéssel kapcsolódó domént - a Β, T és E domént - tartalmaz az alábbi módon összekapcsolva:
    B domén-T domén-E dómén, amelyben a B dómén egy kötő dómén, amely a szert a sejten egy olyan kötőhelyhez kapcsolja, amely endocitózis révén egy endoszómába olvad be, ahol a B dómén nem Clostridial neurotoxinból származik;
    a T dómén egy transzlokációs dómén, amely áthelyezi az E domént (a szer más doménjeivel és/vagy a kötőhellyel együtt vagy e nélkül) az endoszóma belsejéből az endoszóma membránján át a sejtcitoszolba; és az E dómén egy effektor dómén, amely gátolja az RMVket abban, hogy az IMP-ket elszállítsák a sejt felületére, és ez a dómén a Clostridium neurotoxin könnyű láncának egy doménje vagy doménfragmentuma, amelynek Zn2+-függő metalloproteáz-aktivitása van.
  32. 32. In vitro módszer egy szignált kibocsátó molekula felismeréséért felelős IMP-szint szabályozására és a sejt ezen szignált kibocsátó molekulával szembeni érzékenysége modulálására, azzal jellemezve, hogy olyan szert alkalmazunk, amely három, egymáshoz kovalens kötéssel kapcsolódó domént - a Β, T és E domént tartalmaz az alábbi módon összekapcsolva:
    B domén-T domén-E dómén, amelyben a B dómén egy kötő dómén, amely a szert a sejten egy olyan kötőhelyhez kapcsolja, amely endocitózis révén egy endoszómába olvad be, ahol a B dómén nem Clostridial neurotoxinból származik;
    a T dómén egy transzlokációs dómén, amely áthelyezi az E domént (a szer más doménjeivel és/vagy a kötőhellyel együtt vagy e nélkül) az endoszóma belsejéből az endoszóma membránján át a sejtcitoszolba, és az E dómén egy effektor dómén, amely gátolja az RMV-ket abban, hogy az IMP-ket elszállítsák a sejt felületére, és ez a dómén a Clostridium neurotoxin könnyű láncának egy doménje vagy doménfragmentuma, amelynek Zn2+-függő metalloproteáz-aktivitása van.
  33. 33. In vitro módszer szignáloknak a sejtmembránon át való transzdukciójáért felelős IMP-szint szabályozására, ezt követően a szignált kibocsátó molekulának a membránhoz kötésére és a sejt ezen szignált adó molekulával szembeni érzékenysége modulálására, azzal jellemezve, hogy olyan szert alkalmazunk, amely három, egymáshoz kovalens kötéssel kapcsolódó domént - a Β, T és E domént - tartalmaz az alábbi módon összekapcsolva :
    B domén-T domén-E dómén, amelyben a B dómén egy kötő dómén, amely a szert a sejten egy olyan kötőhelyhez kapcsolja, amely endocitózis révén egy endoszómába olvad be, ahol a B dómén nem Clostridial neurotoxinból származik;
    a T dómén egy transzlokációs dómén, amely áthelyezi az E domént (a szer más doménjeivel és/vagy a kötőhellyel együtt vagy e nélkül) az endoszóma belsejéből az endoszóma membránján át a sejtcitoszolba; és az E dómén egy effektor dómén, amely gátolja az RMVket abban, hogy az IMP-ket elszállítsák a sejt felületére és ez a dómén a Clostridium neurotoxin könnyű láncának egy doménje vagy doménfragmentuma, amelynek Zn2+-függő metalloproteáz-aktivitása van.
  34. 34. In vitro módszer bekebelezett antigénekből származó peptidffagmentumoknak a sejt felületére való kiültetéséért felelős IMP-szint szabályozására, azzal jellemezve, hogy olyan szert alkalmazunk, amely három, egymáshoz kovalens kötéssel kapcsolódó domént - a Β, T és E domént - tartalmaz az alábbi módon összekapcsolva :
    B domén-T domén-E dómén,
    HU 217 220 Β amelyben a B dómén egy kötő dómén, amely a szert a sejten egy olyan kötőhelyhez kapcsolja, amely endocitózis révén egy endoszómába olvad be, ahol a B dómén nem Clostridial neurotoxinból származik;
    a T dómén egy transzlokációs dómén, amely áthelyezi az E domént (a szer más doménjeivel és/vagy a kötőhellyel együtt vagy e nélkül) az endoszóma belsejéből az endoszóma membránján át a sejtcitoszolba; és az E dómén egy effektor dómén, amely gátolja az RMVket abban, hogy az IMP-ket elszállítsák a sejt felületére, és ez a dómén a Clostridium neurotoxin könnyű láncának egy doménje vagy doménfragmentuma, amelynek Zn2+-függő metalloproteáz-aktivitása van.
  35. 35. Eljárás olyan készítmény előállítására, amely sejt és külső környezete között létrejött kölcsönhatás szabályozására alkalmas azáltal, hogy szabályozza az integrált membránproteinek (IMP-k) körforgalmú membránvezikulákban (RMV-kben) való transzportját a sejtmembránhoz, azzal jellemezve, hogy három domént - a Β, T és E domént - kapcsolunk egymáshoz kovalens kötéssel az alábbi módon:
    B dómén-T dómén-E dómén, amelyben a B dómén egy kötő dómén, amely a szert a sejten egy olyan kötőhelyhez kapcsolja, amely endocitózis révén egy endoszómába olvad be, ahol a B dómén nem Clostridial neurotoxinból származik;
    a T dómén egy transzlokációs dómén, amely áthelyezi az E domént (a szer más doménjeivel és/vagy a kötőhellyel együtt vagy e nélkül) az endoszóma belsejéből az endoszóma membránján át a sejtcitoszolba; és az E dómén egy effektor dómén, amely gátolja az RMV-ket abban, hogy az IMP-ket elszállítsák a sejt felületére, és ez a dómén a Clostridium neurotoxin könnyű láncának egy doménje vagy doménfragmentuma, amelynek Zn2+-függő metalloproteáz-aktivitása van;
    és a kapott szert gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal vagy hígítószerrel keverjük össze.
HU9502673A 1993-03-19 1994-03-18 Eljárás új sejtaktívitást szabályozó szer előállítására HU217220B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB939305735A GB9305735D0 (en) 1993-03-19 1993-03-19 Novel agent for controlling cell activity

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9502673D0 HU9502673D0 (en) 1995-11-28
HUT76556A HUT76556A (en) 1997-09-29
HU217220B true HU217220B (hu) 1999-12-28

Family

ID=10732382

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9502673A HU217220B (hu) 1993-03-19 1994-03-18 Eljárás új sejtaktívitást szabályozó szer előállítására

Country Status (24)

Country Link
US (1) US20080070278A1 (hu)
EP (1) EP0689459B1 (hu)
JP (2) JP4300265B2 (hu)
KR (1) KR960700756A (hu)
CN (1) CN1195551C (hu)
AT (1) ATE228856T1 (hu)
AU (1) AU671203C (hu)
BR (1) BR9406232A (hu)
CA (1) CA2158647A1 (hu)
CZ (1) CZ242695A3 (hu)
DE (1) DE69431832T2 (hu)
DK (1) DK0689459T3 (hu)
ES (1) ES2183836T3 (hu)
FI (1) FI954390A (hu)
GB (1) GB9305735D0 (hu)
HU (1) HU217220B (hu)
IL (1) IL109045A0 (hu)
IN (1) IN178499B (hu)
NO (1) NO953643L (hu)
NZ (1) NZ262484A (hu)
PL (1) PL178895B1 (hu)
PT (1) PT689459E (hu)
SG (1) SG73411A1 (hu)
SK (1) SK115595A3 (hu)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9305735D0 (en) * 1993-03-19 1993-05-05 North John R Novel agent for controlling cell activity
GB9617671D0 (en) * 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
US7192596B2 (en) * 1996-08-23 2007-03-20 The Health Protection Agency Ipsen Limited Recombinant toxin fragments
CA2331274C (en) * 1998-05-13 2010-04-06 Biotecon Gesellschaft Fur Biotechnologische Entwicklung Und Consulting Mbh Hybrid protein for inhibiting the degranulation of mastocytes and the use thereof
GB9922554D0 (en) * 1999-09-23 1999-11-24 Microbiological Res Authority Inhibition of secretion from non-neuronal cells
GB9926875D0 (en) * 1999-11-12 2000-01-12 Microbiological Research Agenc Use of lytic toxins and toxin conjugates
GB0321344D0 (en) * 2003-09-11 2003-10-15 Health Prot Agency Re-targeted toxin conjugates
EP1531647B1 (en) * 2003-11-14 2010-03-03 Starhome GmbH Terminated call control for roaming cellular telephone subscribers
US7659092B2 (en) * 2004-12-01 2010-02-09 Syntaxin, Ltd. Fusion proteins
US8603779B2 (en) 2004-12-01 2013-12-10 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
GB0426394D0 (en) 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
US8778634B2 (en) 2004-12-01 2014-07-15 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
US8399400B2 (en) * 2004-12-01 2013-03-19 Syntaxin, Ltd. Fusion proteins
US8512984B2 (en) 2004-12-01 2013-08-20 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
US20110171191A1 (en) * 2008-06-12 2011-07-14 Syntaxin Limited Suppression of neuroendocrine diseases
US8796216B2 (en) 2008-06-12 2014-08-05 Syntaxin Limited Suppression of neuroendocrine diseases
US9623117B2 (en) * 2011-04-04 2017-04-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for selective targeting and entry of bacterial toxins to cells
GB201312317D0 (en) 2013-07-09 2013-08-21 Syntaxin Ltd Cationic neurotoxins
WO2016110662A1 (en) 2015-01-09 2016-07-14 Ipsen Bioinnovation Limited Cationic neurotoxins
GB201517450D0 (en) 2015-10-02 2015-11-18 Ipsen Biopharm Ltd Method
EP3263710A1 (en) 2016-07-01 2018-01-03 Ipsen Biopharm Limited Production of activated clostridial neurotoxins
US20210187194A1 (en) 2018-02-26 2021-06-24 Ipsen Biopharm Limited Use of Ultrasound to Guide Injection of Non-cytotoxic Protease
GB201815817D0 (en) 2018-09-28 2018-11-14 Ispen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising and exogenous activation loop
GB201900621D0 (en) 2019-01-16 2019-03-06 Ipsen Biopharm Ltd Labelled polypeptides
GB201914034D0 (en) 2019-09-30 2019-11-13 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of neurological disorders
GB202100566D0 (en) 2021-01-15 2021-03-03 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of brain damage
GB202104294D0 (en) 2021-03-26 2021-05-12 Ipsen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an exogenous activation loop
JP2024513191A (ja) 2021-03-30 2024-03-22 イプセン バイオファーム リミテッド 疼痛及び炎症性障害の処置
KR20230155007A (ko) 2021-03-30 2023-11-09 입센 바이오팜 리미티드 통증 ＆ 염증성 장애의 치료를 위한 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소
GB202116795D0 (en) 2021-11-22 2022-01-05 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of visceral pain
GB202214232D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Ispen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an activating exogenous protease cleavage site
GB202214229D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Ipsen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an activating endosomal protease cleavage site

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4664911A (en) * 1983-06-21 1987-05-12 Board Of Regents, University Of Texas System Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties
US5668255A (en) * 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
EP0329184A3 (en) * 1988-02-19 1990-05-23 Neorx Corporation Antimers and antimeric conjugation
US5045451A (en) * 1988-10-26 1991-09-03 Board Of Regents Methods for screening antibodies for use as immunotoxins
WO1990010692A1 (en) * 1989-03-15 1990-09-20 University Of Florida Monoclonal antibody for use in detection and treatment of childhood leukemia
US5300496A (en) * 1991-09-30 1994-04-05 The University Of British Columbia Complexed vanadium for the treatment of diabetes mellitus
US5877295A (en) * 1992-09-30 1999-03-02 The Center For Blood Research Antibodies which bind a subpopulation of Mac-1 (CD11b/CD18) molecules which mediate neutrophil adhesion to ICAM-1 and fibrinogen
GB9305735D0 (en) * 1993-03-19 1993-05-05 North John R Novel agent for controlling cell activity

Also Published As

Publication number Publication date
CZ242695A3 (en) 1996-04-17
FI954390A (fi) 1995-11-17
HUT76556A (en) 1997-09-29
PL178895B1 (pl) 2000-06-30
CN1124929A (zh) 1996-06-19
WO1994021300A2 (en) 1994-09-29
JP4300265B2 (ja) 2009-07-22
BR9406232A (pt) 1996-01-09
HU9502673D0 (en) 1995-11-28
ATE228856T1 (de) 2002-12-15
CA2158647A1 (en) 1994-09-29
AU6217594A (en) 1994-10-11
NO953643D0 (no) 1995-09-15
PT689459E (pt) 2003-04-30
EP0689459A1 (en) 1996-01-03
KR960700756A (ko) 1996-02-24
FI954390A0 (fi) 1995-09-18
US20080070278A1 (en) 2008-03-20
DK0689459T3 (da) 2003-03-24
GB9305735D0 (en) 1993-05-05
AU671203B2 (en) 1996-08-15
NZ262484A (en) 1996-08-27
PL310698A1 (en) 1995-12-27
EP0689459B1 (en) 2002-12-04
DE69431832D1 (de) 2003-01-16
JP4740206B2 (ja) 2011-08-03
SK115595A3 (en) 1997-02-05
AU671203C (en) 2003-02-27
CN1195551C (zh) 2005-04-06
IL109045A0 (en) 1994-06-24
NO953643L (no) 1995-11-16
JPH09500867A (ja) 1997-01-28
SG73411A1 (en) 2000-06-20
ES2183836T3 (es) 2003-04-01
DE69431832T2 (de) 2003-04-10
IN178499B (hu) 1997-05-03
JP2007302696A (ja) 2007-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU217220B (hu) Eljárás új sejtaktívitást szabályozó szer előállítására
Hwang et al. Functional domains of Pseudomonas exotoxin identified by deletion analysis of the gene expressed in E. coli
US5182107A (en) Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
JP3431140B2 (ja) 抗体およびその使用方法
US10391180B2 (en) Self-assembling complex for targeting chemical agents to cells
US20090010966A1 (en) Modified diphtheria toxins
EP0815872A2 (en) Compounds for targeting
US20090098148A1 (en) High efficiency tissue-specific compound delivery system using streptavadin-protein a fusion protein
JP2013544779A5 (hu)
JP2013529085A5 (hu)
JP2001520206A (ja) 上皮細胞標的化結合体としてのｊ鎖およびアナログ
JP4912556B2 (ja) 細胞質内及び／又は細胞核内への対象物質の侵入を促進するペプチド
DE60008915T2 (de) Konstrukte zur verabreichung von therapeutischen wirkstoffen an die neuronzellen
Critchley et al. Fate of tetanus toxin bound to the surface of primary neurons in culture: evidence for rapid internalization.
AU2002256803B2 (en) Pharmaceutical use for secreted bacterial effector proteins
CA2340721A1 (en) Angiocidin: a cys-ser-val-thr-cys-gly specific tumor cell adhesion receptor
Lillich et al. Streptavidin-conjugated C3 protein mediates the delivery of mono-biotinylated RNAse A into macrophages
US8003595B2 (en) Amino acid sequences facilitating penetration of a substance of interest into cells and/or cell nuclei
CN116940668A (zh) 经表面修饰的红细胞及其产生方法
WO1994021300A1 (en) Novel agent for controlling cell activity
EP4393957A1 (en) Peptide-bound hybrid liposome exosome, peptide-bound exosome, composition containing these, and method for forming same
Butt et al. Immunolocalization of epimorphin in skin
Tagawa et al. A 60 kDa plasma membrane protein changes its localization to autophagosome and autolysosome membranes during induction of autophagy in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells
Cuatrecasas Internalization and processing of peptide hormone receptors
Geuze et al. Sorting in the Prelysosomal Compartment (CURL) Immunoelectron Microscopy of Receptors and Ligands

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee