JP2001520206A - 上皮細胞標的化結合体としてのｊ鎖およびアナログ - Google Patents

上皮細胞標的化結合体としてのｊ鎖およびアナログ

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JP2001520206A JP2000516704A JP2000516704A JP2001520206A JP 2001520206 A JP2001520206 A JP 2001520206A JP 2000516704 A JP2000516704 A JP 2000516704A JP 2000516704 A JP2000516704 A JP 2000516704A JP 2001520206 A JP2001520206 A JP 2001520206A
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アンドリュー シー． ハイアット，
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Abstract

(57)【要約】 非分極化上皮細胞に生物学的薬剤を送達する際に使用するための標的化分子が開示される。送達の際に、生物学的薬剤は、上皮細胞内に対して致死的である。標的化分子は、例えば、転移性の上皮細胞の根絶のために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、概して、特異的な細胞への、治療的化合物の標的化に関する。本発
明は、より詳細には、非分極化上皮細胞への化合物の送達において使用するため
の標的化分子に関する。このような標的化分子は、種々の治療的手順において使
用され得る。
【０００２】 （発明の背景） 標的組織への、薬物および他の薬剤の送達を改良することは、何年もの間、か
なりの研究の焦点である。現在、非経口的に患者に投与されるほとんどの薬剤は
、標的化されていないので、送達が必要とされない（そしてしばしば望ましくな
い）身体の細胞および組織への、薬剤の全身性の送達を生じる。このことは、有
害な薬物の副作用を生じ得、そして投与され得る薬物（例えば、細胞傷害性薬剤
、および他の抗ガン薬物または抗ウイルス薬物）の用量を頻繁に制限する。比較
すると、一般的に薬物の経口投与は、簡便なおよび経済的な投与の方法として認
識されるが、経口投与は、（ａ）上皮障壁を通じる薬物の取込み（これは望まし
くない全身性の分配を生じる）または（ｂ）胃腸管内の一時的な薬物滞留、のい
ずれかを生じ得る。従って、主要な目標は、処置によって利益を受け得る細胞お
よび組織に、薬剤を特異的に標的化するための方法を開発すること、そしてこの
ような薬剤の不適切な送達による他の細胞および組織への全身的な生理学的影響
を回避することであった。
【０００３】 この問題を何とかするため、胃腸管上皮細胞上の増殖因子レセプターに結合す
るキメラ分子を使用して治療学的薬剤の経上皮輸送を容易にすることを、数名の
研究者らが試みた（ＷＯ ９３／２０８３４を参照のこと）。しかし、これらの
方法は、いくつかの不都合を有している。例えば、このようなキメラ分子は、腸
管腔から上皮を通じてトランスサイトーシスされ、そして血流に吸収され、全身
性の分配および固有上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｐｒｏｐｅｒ）からの除去を
生じる。治療学的薬剤は、全身性の分配のために上皮から離れて特異的に標的化
されるので、上皮関連性の状態の処置について、これらのキメラ分子は一般的に
有用ではない。さらに、ＴＧＦ−γ、またはＥＧＦレセプターに結合する他の分
子は、多数のまたは全てのＥＧＦの見かけの生物学的活性（例えば、腸細胞の有
糸分裂誘発の刺激、または胃液分泌の抑制）を示す。治療的薬剤のトランスサイ
トーシス性の取込みに付随的なこのような効果は、上皮関連性の状態または疾患
の介入のために望ましくないかもしれず、または禁忌であり得る。さらに、ＥＧ
Ｆレセプターは、胃腸管の上皮細胞に独特ではなく、そして腎臓細胞および肝細
胞を含む多数の他の細胞上で見出され得る。従って、ＥＧＦレセプターに対する
親和性を有し、および血液中で全身的に分配される分子は、循環から迅速に除去
され、特定の器官に蓄積され、そして潜在的に分解または分泌され得る。
【０００４】 代わりのアプローチにおいて、他の研究者らは、抗重合体免疫グロブリンレセ
プターＩｇＧのＦａｂフラグメントを、このようなレセプターを含む上皮細胞に
対してインビトロでＤＮＡを標的化するために、用いてきた（Ｆｅｒｋｏｌら、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２３９４−２４００、１９９３を参照のこ
と）。さらに他の研究者らは、インビトロでの上皮細胞の単層を横切るキメラＩ
ｇＡ構築物のトランスロケーションを記載した（Ｔｅｒｓｋｉｋｈら、Ｍｏｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１３１３−１３１９、１９９４を参照のこと）。他の研
究者らはマウスにおいてインビボで腹水腫瘍インプラントを使用し、そして皮下
腫瘍細胞によって産生されるＩｇＡ二量体抗体が糞便に蓄積することを観察し、
このことはＩｇＡが胃腸管の上皮障壁を横切って輸送されることを示唆する（Ｇ
ｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１０４−１０７、１９９６を参
照のこと）。
【０００５】 上皮細胞は、毒素および病原体の侵入を物質的に防ぐ、防御障壁を形成するた
めにお互いに通常、整列しているが、この細胞整列における異常はしばしば、疾
患の指標である。特に、血液中またはリンパ液中に存在する非分極化上皮細胞 は、しばしば転移性疾患の指標である。転移性細胞の根絶は、癌治療の基本的な
目標であるが、化学療法のような従来の方法はしばしば、所望されない副作用を
生じる。
【０００６】 当該分野において、標的上皮細胞、特に別の上皮細胞または細胞と整列してい
ない非分極化上皮細胞に対して、薬剤を送達するためのシステムに対する必要性
が依然として残っている。本発明は、これらの必要性を満たし、そしてさらに他
の関連する利点を提供する。
【０００７】 （発明の要旨） 簡潔に記載すると、本発明は、上皮細胞に、生物学的薬剤を特異的に送達する
ための標的化分子を提供する。特定の局面において、本発明は、少なくとも１つ
の生物学的薬剤に連結される標的化分子を提供する。ここで、この標的化分子は
、（ａ）閉環された共有結合ループを形成し；そして（ｂ）ドメインの各々がβ
シート特徴を欠損するドメインによって分離された、βシート特徴を有する少な
くとも３つのペプチドドメインを含む；ポリペプチドを含み、この結果、この生
物学的薬剤は、非分極性上皮細胞に入り得、そして殺傷し得る。特定の実施態様
において、この標的化分子は、非分極性上皮細胞と会合した、またはこれから分
泌された細胞内または細胞外酵素の基質により、少なくとも１つの生物学的薬剤
に連結される。
【０００８】 別の局面において、本発明は、上記のような少なくとも１つの生物学的薬剤に
連結される標的化分子を含む薬学的組成物を、薬学的に受容可能なキャリアと組
合せて提供する。
【０００９】 さらなる局面において、非分極化上皮細胞と関連する疾患に罹患した患者を処
置する方法が提供され、この方法は、上記のような薬学的組成物を患者に投与す
る工程を包含する。このような疾患としては、非小細胞癌、乳癌、結腸癌、卵巣
癌、前立腺癌、および子宮内膜症が挙げられる。
【００１０】 関連の局面において、本発明は、非分極性上皮細胞と関連する疾患の患者にお
ける発症を阻害するための方法を提供し、上記のような薬学的組成物を、患者に
投与する工程を包含する。
【００１１】 本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を言
及する際に明らかになる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、それぞれ
が個々に援用されるように、それらの全体が本明細書中に参考として援用される
。
【００１２】 （発明の詳細な説明） 上記のように、本発明は、一般的に、生物学的薬剤の非分極化上皮細胞への送
達において使用するための標的化分子（ＴＭ）に関する。上皮細胞への送達の際
、薬剤は、細胞内に残存し得るか、またはトランスサイトーシスを介する経上皮
輸送を受け得る。例えば、薬剤およびＴＭは、原形質膜を横切って輸送され得、
そして上皮細胞内に残存し得るか、または、薬剤は細胞内に残存し得、一方ＴＭ
は経上皮輸送を受ける。上皮細胞内に残存する薬剤は、細胞成分もしくは外来成
分（例えば、ウイルス）の活性または機能を改変し得る。
【００１３】 本発明を詳細に記載する前に、本明細書中で使用される特定の用語の定義が提
供される。
【００１４】 上皮表面（または、上皮障壁）：身体の外部、身体の内部の閉鎖された腔また
は外部環境と連絡する身体の管を裏打ちする表面。上皮表面は、通常、整列した
上皮細胞を含み、そして尿生殖器、呼吸、栄養、接眼結膜、鼻、口、および咽頭
の腔、ならびに腺の管および分泌部分、および感覚器官のレセプターを包含する
。本明細書中で使用される用語、「上皮表面」は、「上皮障壁」と同義である。
上皮表面の一方の側面は、被覆物質および分泌物以外は、細胞成分および細胞外
成分の付着がない。表面の他方の側面は、通常、基底膜に近接し、そして下にあ
る組織の間質液および成分に曝されている。上皮表面は、代表的には、互いに密
接に並置される細胞から形成され、近接細胞の原形質膜間の接触は、堅固な接合
部（閉鎖帯）によって特徴付けられ、これは、上皮表面の外側ドメインおよび内
側ドメインの境界を定める。実験的な上皮様表面は、培養中に上皮様表面を形成
する、自己複製する細胞株（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ３４；ＨＥ
Ｃ−１Ａ、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ１１２）を用いて、インビトロで作成され得、堅
固な接合部を有し得、ならびに１つの遊離ドメイン（先端）および１つの付着ド
メイン（基底外側）を区別し得る。
【００１５】 非分極化上皮（ＮＰＥ）細胞：上皮表面から生じるが、上皮表面には存在しな
い細胞で、基底外側のドメイン、先端ドメインまたは閉鎖帯を有している細胞。
上皮表面は、腫瘍形成性、腫瘍転移および炎症性過形成を含む種々のプロセスに
よりＮＰＥ細胞を生成および放出し得る。ＮＰＥ細胞は、体液中に遊離で存在し
得、または閉鎖帯、基底外側のドメインまたは先端ドメインを含まない異常な会
合で、他の個々の上皮細胞と結合され得る。ＮＰＥ細胞は、腫瘍性の上皮増殖、
潰瘍性大腸炎、および過形成細胞増殖を生じる上皮炎症と関連する。ＮＰＥ細胞
は、例えば、Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：
１１１−１４６、１９８５によって記載されたように、抗分泌成分、抗ＩｇＡ、
または抗ＩｇＭのいずれかを利用する免疫組織化学的染色技術により同定され得
る。ＮＰＥ細胞はまた、抗分泌成分またはモノクローナル抗体Ｂｅｒ−ＥＰ４を
利用する免疫組織化学技術によって同定され得る（Ｌａｔｚａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｐａｔｈ．４３：２１３−２２０、１９９０参照のこと。）。
【００１６】 先端ドメイン：身体の外部環境、または身体の腔もしくは身体の管の容量に近
接する上皮表面の外側。細胞の外側は、閉鎖帯によって境界を定められ、被覆物
質、分泌物、および上皮表面の外側に面する細胞膜からなる。
【００１７】 管腔区画：上皮表面によって裏打ちされ、そして先端ドメインに近接する身体
の管、腔、または導管の内部空間。
【００１８】 基底外側ドメイン：閉鎖帯によって先端ドメインから境界を定められる上皮表
面の内部。基底外側ドメインは、基底膜に近接し、そして上皮表面の下にある組
織の間質液および成分に曝される。基底外側ドメインは、上皮表面の細胞の内側
にある。
【００１９】 基底外側膜：基底外側ドメイン内にある上皮表面の細胞の原形質膜の部分。
【００２０】 基底外側因子：インビボで基底外側膜の天然に存在する要素である基底外側ド
メインの成分。「上皮表面と会合する基底外側因子」は、基底外側ドメインまた
は基底外側ドメイン中の固有膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｐｏｅｒ）の成分へ
の、共有結合もしくは非共有結合によって付着される基底外側因子をいう。
【００２１】 インターナリゼーション：原形質膜によって境界を示される細胞区画への取込
みのプロセス。
【００２２】 特異的結合：ＴＭがＮＰＥ細胞の原形質膜上のレセプターと特異的に相互作用
する場合、ＴＭは、ＮＰＥ細胞に特異的に結合する。ＴＭが上皮表面の基底外側
ドメインで特異的に相互作用する場合、ＴＭは基底外側ドメインに特異的に結合
する。定量的アッセイおよび定性的アッセイの両方が、本発明の状況において、
非特異的な結合から特異的な結合を区別するために使用され得る。結合親和性（
ｋaff）の定量的測定は、特異的に結合する成分を同定するために使用され得る 。一般に、１０4Ｍ-1以上のｋaffは、２つの結合成分間の特異的な結合を構成す
る。結合相互作用の同族成分に対する結合親和性は、当該分野において周知であ
る多様な方法（平衡透析アッセイ、ラジオ免疫沈降アッセイ、固定化されたリガ
ンドを使用するアッセイ、単離された細胞または膜を使用するアッセイ、ＥＬＩ
ＳＡ、または他の直接的もしくは間接的な測定もしくは結合（例えば、プラズモ
ン共鳴）を含む）によって、実験的に評価され得る。
【００２３】 結合の定性的な特異性は、２つ以上の化学的、空間的、または時間的ドメイン
間の因子の結合の差次的な、または非対称性の分布によって実証され得る。この
差次的な分布は、視覚的に、または化学的もしくは物理的手段によって観察され
得、そして、一般に、ＮＰＥ細胞と非上皮原形質膜との間のシグナル強度におい
て、少なくとも約３〜１の差を反映する。ＴＭはまた、上皮表面から始まるＮＰ
Ｅ細胞上の因子に結合し得る。このような定性的な特異性は、原形質膜上の同族
の結合部位の数または有効性に対する薬剤の結合親和性の実質的な違いから得ら
れ得る。いくつかの細胞型の間での薬剤結合の定性的な特異性は、競合実験にお
いて観察され得る。このような実験において、ＴＭは、細胞型の間での分布を可
能にされて、そして平衡で、他の細胞型以上にＮＰＥ細胞に優先的に結合するこ
とが観察される。
【００２４】 標的化分子（ＴＭ）：ＮＰＥ細胞原形質膜上のコグネイト因子および上皮表面
上のコグネイト因子に対して特異的に結合し得る分子であって、ここでコグネイ
ト因子は均一に分布していない、分子。
【００２５】 生物学的薬剤：細胞によってまたはエクスビボで合成される、任意の分子、分
子の群、ウイルス、ウイルスの成分、細胞、または細胞成分は、細胞に由来し得
るか、および／または細胞の特性を改変することが実証され得る。生物学的薬剤
は、治療的薬剤（すなわち、疾患を処置もしくは防止するために、または患者の
生理機能を調節するために有用な、薬物および他の医療用化合物）を含む。好ま
しい生物学的薬剤は、ＴＭ促進性侵入の後に細胞を殺傷し得る。このような薬剤
は、本明細書において致死性薬剤といわれ得る。
【００２６】 連結化：イオン性相互作用によっておよび／もしくは疎水性相互作用によって
、または生理学的条件のｐＨ、イオン強度、および浸透ポテンシャルのもとで、
連結された実体が平衡時に互いに会合されるような他の手段によって、共有結合
する場合、生物学的薬剤は、ＴＭに連結される。
【００２７】 本明細書中で記載されるＴＭは、一般に上皮表面上に優先的に分布する因子（
例えば、基底外側因子）に特異的に結合し得る。ＴＭはまた、ＮＰＥ細胞中にお
ける、上皮表面から生じるような因子に結合し得る。ＴＭは、このような因子へ
の結合を介して、ＴＭに連結された生物学的薬剤のインターナリゼーションを生
じ得る。本明細書中に記載されるＴＭは、異なる３次元構造を有する。一般に、
ＴＭは、本明細書中で「コア」とよばれる、閉じた共有結合ループを形成するポ
リペプチドを含む。ポリぺプチドの全てのサブユニットは、同一の化学結合によ
って連結され得るが、そうである必要はない。好ましい実施態様において、ポリ
ぺプチドは、ペプチド結合および１つ以上のシステインジスルフィド架橋によっ
て共有結合されるアミノ酸および／またはイミノ酸を含む。
【００２８】 ＴＭのコアは、代表的に、βシートの特徴を欠損する領域の中に分散した、β
シートの特徴を有する少なくとも３つのペプチドドメインを含む。このことにつ
いては、「ペプチドドメイン」は、少なくとも３つのアミノ酸残基を含むポリぺ
プチドの一部である。ペプチドドメインは、ほぼ平面の側鎖基、および近接した
β鎖の骨格のカルボニル基とＮＨ基との間で水素結合が生じ得るような交互の配
置を有する広がったコンフォメーションをペプチド骨格が有する場合、βシート
の特徴を有するといわれる。さらに、ＴＭは、一般に、分子内シスチン内に存在
しない少なくとも１つのシステイン残基を含む。このようなシステインは、１つ
以上の生物学的薬剤をＴＭに連結するために使用され得るが、生物学的薬剤を連
結する他の手段もまた、意図される。
【００２９】 １つ以上の多様な他の構造が、ＴＭ内にさらに存在し得るが、そうである必要
はない。例えば、第２のペプチドループが、コア配列内に存在し得る。さらなる
Ｎ末端および／またはＣ末端配列が存在し得る。Ｎ末端配列は、存在する場合、
通常、直鎖状である。好ましいＮ末端配列は、短い（約１〜２０アミノ酸残基）
ペプチドドメインである。Ｃ末端配列は、直鎖状であり得、および／または１以
上のループを形成し得る。このような配列はβシートの特徴を有するドメインを
保有し得るが、そうである必要はない。これらの、および／または他のタンパク
質ドメインは、遺伝的手段によって、または化学的に、共有結合的なまたは非共
有結合的な相互作用を使用して、コアに付加され得る。
【００３０】 好ましい実施態様において、ＴＭは、ネイティブなＪ鎖配列の全てもしくは部
分、またはその改変体を含む。Ｊ鎖は、インビボでＩｇＭ単量体またはＩｇＡ単
量体を連結して、五量体ＩｇＭまたは二量体ＩｇＡを形成する、１５ｋＤのタン
パク質である（ＭａｘおよびＫｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．
１６１：８３２−８４９、１９８５を参照のこと）。今日までに、６つの生物体
由来のＪ鎖の配列が推定されている（図１および配列番号１〜配列番号６；Ｋｕ
ｌｓｅｔｈおよびＲｏｇｎｅ、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：３
７−４２、１９９４；Ｍａｔｓｕｕｃｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：４５６−４６０、１９８６；ＭａｘおよびＫｏｒｓｍｅ
ｙｅｒ、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６１：８３２−８４９、１９８５；Ｈｕ
ｇｈｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２７１：６４１−６４７、１９９０；Ｍｉ
ｋｏｒｙａｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：４２７９−４２８５、１９８
８；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３：１８８６−１８９１、１９９６を参照のこと）。ＴＭは、これらの生物体
の１つからの、または任意の他の生物体からのネイティブなＪ鎖を含み得る。
【００３１】 あるいは、ＴＭはネイティブなＪ鎖配列の部分または改変体を含み得る。改変
体は、１つ以上の置換および／または修飾においてのみ、ネイティブな配列から
異なるポリぺプチドである。本発明によって意図されるネイティブなＪ鎖配列の
部分および改変体は、ネイティブなＪ鎖が、上皮表面と会合する基底外側因子に
特異的に結合し、そして連結された生物学的薬剤のインターナリゼーションを引
き起こす能力を実質的に保持する、部分および改変体である。このような部分お
よび改変体は、例えば、本明細書中に記載される代表的なアッセイを使用して同
定され得る。
【００３２】 本明細書中に提供されるＴＭ組成物の状況内で、ＴＭは完全長の二量体ＩｇＡ
ではない。より詳細には、ＴＭは、天然に存在するＩｇＡ内に存在する全ての成
分（すなわち、連続的な可変ドメイン、ＣH１αドメイン、ＣH２αドメイン、お
よびＣH３αドメインを含む重鎖、ならびに連続的な可変ドメインおよびＣLドメ
インを含む軽鎖）を含むわけではない。このようなＴＭは、もちろん、ＩｇＡ分
子の１つ以上の部分を含み得、これはＩｇＭを含む。
【００３３】 上記のように、特異的結合は、定量的方法および／または定性的方法を使用し
て評価され得る。１つの代表的な定量的アッセイにおいて、標準的なイムノアフ
ィニティークロマトグラフィー法（Ｕｎｄｅｒｄｏｗｎら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ １４：１１１−１２０、１９７７）により、ヒト乳汁から単離さ
れた分泌成分（ＳＣ）は、第一級アミンカップリングによって、ＢＩＡＣＯＲＥ
装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用してＣＭ５セ
ンサーチップ上に固定化される。センサーチップは、３０μＬの０．０５Ｍ Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−エチル−Ｎ−（３−ジエチルアミノプロ
ピル）カルボジイミドの注入、次いで２５μＬの、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（
ｐＨ５．０）中のヒトＳＣ（１５μｇ／ｍＬ）の注入によって活性化される。次
いで、未反応のカルボジイミドは、３０μＬのエタノールアミンでクエンチング
される。全ての試薬は、１分間あたり５μＬの流速で送達される。結合および脱
離の反応速度を評価するために、１００μＭと１００ｎＭとの間の濃度でのＴＭ
の段階２倍希釈物が、１分間あたり２０μＬの流速で、結合緩衝液：２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2中に注 入される。希釈の間に、５０μＬの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）２００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍ 尿素を注入し、次いで、５０μＬの結合緩衝液を注入する
ことによって、表面は再生される。会合定数および解離定数は、ＢＩＡｅｖａｌ
ｕａｔｉｏｎ ２．１ソフトウエアを使用するセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａ
ｍ）に由来し、単純な会合定数（ｋa）および解離定数（ｋd）を導き出す。ｋaf f は、ｋa／ ｋdとして評価される。
【００３４】 １つの代表的な定性的アッセイにおいて、ＨＥＣ−１Ａ細胞の単層が、ＴＭの
定性的な結合を測定するために使用され得る。手順は以前に刊行されたプロトコ
ル（Ｂａｌｌら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３１：９６、１９９
５を参照のこと）に基づく。ＨＥＣ−１Ａ細胞は、２４ｍｍフィルタートランス
ウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）（Ｃｏｓｔａｒ、＃３４１２、０．４μｍ）上で
、１週間、細胞がコンフルエントになるまで培養される。単層で覆われたフィル
タートランスウェルは、冷却ＰＢＳ（４℃）で両表面を２回洗浄される。１．０
μｇのビオチン化されたリガンドを含む、１ｍｌの冷却ＭＥＭ−ＢＳＡが、先端
のチャンバーに添加され、そして１．５μｇのビオチン化されたリガンドを含有
する、１．５ｍｌの冷却ＭＥＭ−ＢＳＡ緩衝液（ＭＥＭ−ＢＳＡ（４℃）：ハン
クス塩、および０．５％ ＢＳＡ（これは、５６℃で３０分間処理されて、内因
性プロテアーゼを不活性化し、そしてフィルター滅菌される）を含有する、Ｌ−
グルタミン非含有の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ；カタログ番号１２３７０）を含有
する最小必須培地）は、基底外側チャンバーに添加される。培養物は、４℃で２
時間、静置されて、インターナリゼーションの不在下で、最大の結合を達成させ
る。両方のチャンバーから培地は除去され、そしてフィルターは冷却ＰＢＳで２
回洗浄される。次いで、フィルターは、メスを用いてトランスウェル支持体から
取り出され、そしてストレプトアビジン−フルオレセイン結合体（＃２１２２３
、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ
）（冷却ＰＢＳ中に０．１μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートされ、次いで、
冷却ＰＢＳで３回洗浄される。次いで、１ｃｍ平方の切片のフィルターは、２４
ｍｍフィルターから切断され、そして顕微鏡スライド上に取りつけられ、そして
上部蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）照明（励起４９０ｎｍ、発光５２
０ｎｍ）下で顕微鏡観察される。これらの条件下、先端膜は、ほとんどまたは全
く蛍光を示さないが、基底外側膜は、明るい蛍光（すなわち、シグナル強度にお
いて、３〜１差よりも大きい）を実証し、このことは、基底外側ドメインに特異
的に結合することを示す。類似のアッセイが、胃腸、口、または気管支の上皮組
織層から単離された上皮組織とともに用いられ得る。
【００３５】 別の代表的な定性的アッセイにおいて、個々のＨＥＣ−１Ａ細胞がＴＭの定性
的な結合を測定するために使用され得る。ＨＥＣ−１Ａ細胞は、細胞がコンフル
エントになるまで１週間、２４ｍｍフィルタートランスウェル（Ｃｏｓｔｅｒ、
♯３４１２、０．４μｍ）上で培養される。次いで、細胞はトリプシン処理によ
り破壊され得、そして個々の破壊された細胞は遠心分離により回収され得る。細
胞ペレットは冷却ＰＢＳで２回洗浄される。次いで、１．０μｇのビオチン化リ
ガンドを含有する１ｍｌの冷却ＭＥＭ−ＢＳＡが細胞に添加される。細胞は４℃
で２時間、静置されて、インターナリゼーションの不在下で最大の結合を達成さ
せる。培地は細胞から除去され、細胞は冷却ＰＢＳで２回洗浄される。次いで細
胞は、ストレプトアビジン−フルオレセイン結合体（♯２１２２３、Ｐｉｅｒｃ
ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）（冷却ＰＢ
Ｓ中に０．１μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートされる。次いで冷却ＰＢＳで
３回洗浄される。次いで細胞は顕微鏡スライド上に取りつけられ、そして上部蛍
光照明下（励起４９０ｎｍ、発光５２０ｎｍ）で顕微鏡観察される。これらの条
件下で、ＮＰＥ細胞の原形質膜は、明るい蛍光（すなわち、非上皮細胞と比較し
て、シグナル強度において３〜１差よりも大きい）を示し、このことはＮＰＥ細
胞表面へ特異的に結合することを示す。類似のアッセイが胃腸、口または気管支
の上皮組織層から単離された上皮組織またはＮＰＥ細胞とともに使用され得る。
【００３６】 一旦、ＮＰＥ細胞の原形質膜に結合すると、ＴＭはＮＰＥ細胞中へインターナ
リゼーションされ得る。インターナリゼーションを評価するための適切な細胞と
しては、ヒトのポリ免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）を発現するＭＤＣＫ
細胞（Ｔａｍｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：７０７−７１４、１９９５
を参照のこと）およびＨＥＣ１−Ａ細胞、ならびにポリ免疫グロブリン遺伝子を
発現する非上皮トランスジェニック細胞が挙げられる。インターナリゼーション
が観察され得るあるアッセイは、透析膜支持体（例えば、Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、♯３４１２）上でコンフルエントな単層になるまで増殖さ
せたＨＥＣ１−Ａ細胞株を使用する。簡単に述べると、１００ｎｇ〜１０μｇの
ＴＭ（例えば、標識されたフルオロセイン）が細胞単層の基底外側の区画におい
て１．５ｍＬのアッセイ緩衝液に添加され得、ＴＭの結合およびインターナリゼ
ーションは可能であるがトランスサイトーシスを阻害する温度（例えば、１６℃
で９０分）でインキュベートされ得る。次いで、両方の区画から培地が除去され
、そしてフィルターメンブレンが洗浄される（例えば、４℃においてＰＢＳで２
回）。このメンブレンは、例えば、３％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド、１％
（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒド、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１００ｍＭ リン
酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を含む固定溶液中に氷上で３０分浸される。このメ
ンブレンは、メスで周囲を切り取ることによりプラスチック挿入物から取り出さ
れ得、そして５ｍｍ平方の切片に切られ得る。これら全取りつけ切片は顕微鏡ス
ライド上に配置され得、そして上部蛍光照明下（励起４９０ｎｍ、発光５２０ｎ
ｍ）で顕微鏡により、または蛍光共焦点顕微鏡により観察され得る。インターナ
リゼーションされたＴＭは、細胞内小胞における明るい黄緑色の蛍光の存在によ
り示される。
【００３７】 インターナリゼーションが観察され得る別のアッセイはまた、透析膜支持体（
例えば、Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、＃３４１２）上でコンフル
エントな単層になるまで増殖させたＨＥＣ１−Ａ細胞株を用いる。細胞はトリプ
シン処理により破壊され、そして個々の破壊された細胞は遠心分離により回収さ
れる。細胞ペレットは冷却ＰＢＳで２回洗浄される。このアッセイを実施するた
めに、１００ｎｇ〜１０μｇのＴＭ（例えば、フルオレセイン標識された）が、
１．５ｍＬの細胞緩衝液に添加され得、そしてＴＭの結合およびインターナリゼ
ーションは可能であるが、トランスサイトーシスを阻害する温度（例えば、１６
℃で９０分間）で細胞とともにインキュベートされ得る。次いで、両方の区画か
ら培地が除去され、そして細胞は洗浄される（例えば、４℃にてＰＢＳで２回）
。細胞は、例えば、氷上で、３０分間、３％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド、
１％（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒド、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１００ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）の固定溶液中に、浸される。固定された細胞は
顕微鏡スライド上に配置され得、そして上部蛍光照明（励起４９０ｎｍ、発光５
２０ｎｍ）下で、顕微鏡によってまたは蛍光共焦顕微鏡によって観察され得る。
インターナリゼーションされたＴＭは、細胞内小胞中の明るい黄緑色の蛍光の存
在によって示される。
【００３８】 基底外側因子および／またはＮＰＥ細胞についての定性的な結合特異性（すな
わち基底外側ドメインと非基底外側ドメインとの間または上皮細胞と非上皮細胞
との間のシグナル強度における３〜１以上の差）を保持する改変体を生じる置換
および修飾は、保存的であると考えられる。好ましい保存的置換および修飾は、
少なくとも部分的には、１つ以上の他の種のＪ鎖と一致させる、配列中の変化を
含む。また、あるいは、ＴＭはネイティブなＪ鎖に存在しない特性を付与する他
の配列を含み得る。他の好ましい修飾は、Ｎ末端および／もしくはＣ末端での１
つ以上のタンパク質ドメインの付加、ならびに／またはネイティブなＪ鎖配列内
に存在するドメインの順番の変化を包含する。ただし改変体が、上皮基底外側因
子またはＮＰＥ細胞に特異的に結合し、そして連結された生物学的薬剤のインタ
ーナリゼーションを引き起こす能力が実質的に減少しないという条件では、改変
体は、このような置換および／または修飾の任意の組み合わせを含み得る。
【００３９】 ネイティブなＪ鎖は、代表的に６つのドメインを有する。第１（Ｎ末端）のド
メインは、シグナルペプチドとコアＴＭ分子との間の接合部として（インビボで
）作用する、短い直鎖状（すなわち、ループと対照して）ペプチドである。ドメ
イン１は、代表的に１〜２０個のアミノ酸残基を含み、そして第１のアミノ酸は
一般的に、Ｄ、Ｅ、またはＱである。図１において、ドメイン１は、残基番号１
１まで、そして残基番号１１を含むアミノ酸を含む。ドメイン１はＴＭ機能のた
めに必須でなく、そしてこのドメインを含まない改変体は本発明の範囲内である
。
【００４０】 ドメイン２は代表的に９０アミノ酸を含み、そして実質的なβシートの特徴を
有する。このβシート領域は、β鎖の特徴を欠損した様々の長さのペプチド（例
えば、残基２６〜３１、残基４９〜５３）を含み、通常、このペプチドは極性ア
ミノ酸および／または荷電性アミノ酸を含む。ＴＭにおいて、ドメイン２は、コ
アと呼ばれる、共有結合的により閉じたペプチドループであり、代表的に、これ
はドメイン２の最初の残基および最終の残基（図１の残基１２および１０１）か
ら構成される分子内シスチンによって形成される。ドメイン２内で、ドメイン３
（コア内にネスティングされるペプチドループ）を規定する別のシスチン結合が
存在し得る。本発明の状況内で、コア（ドメイン３を有するかまたは有さない）
は、ＴＭ機能を提供するのに十分であることが見出されている。従って、好まし
いＴＭは、ドメイン２（すなわち、図１の残基１２〜７０および残基９２〜１０
１）、またはＴＭ機能を実質的に保持するその部分もしくは改変体を含む。
【００４１】 ドメイン２内で、第２のシステインは、一般に単一のアミノ酸残基によって、
ドメイン２の最初のシステインから離されている（例えば、図１を参照のこと）
。ドメイン２の第２のシステインと第３のシステインとの間は、主にβシートの
特徴の領域である。これらの２つのシステイン（２および３）が存在する場合、
代表的にコア内にシスチンを形成しない。第４のシステインは、代表的に、２つ
の塩基性アミノ酸残基によって第３のシステインから離されており、そしてドメ
イン３を開始する。ドメイン３は、第４のシステインによって酸化される第５の
システインで終わる。生じるシスチンは、ドメイン２内に完全に含まれるドメイ
ン３を規定する共有結合ペプチドループを形成する。システイン６は、ドメイン
２の最終の残基であり、そしてドメイン２の最初の残基によってシスチンへと酸
化される。
【００４２】 Ｎ結合型グリコシル化についての規範的なペプチド配列（例えば、ＮＩＳ）が
、コア内にある。真核生物細胞によって生成される場合、炭水化物部分は、この
部位で、ＴＭのＮ残基に共有結合され得る。
【００４３】 存在する場合、ドメイン３は、代表的に、２１個のアミノ酸長のペプチドであ
る。このドメインは、コア内に完全に含まれる分子内シスチン結合を形成する、
アミノ末端およびカルボキシ末端のシステイン残基によって境界が定められる。
【００４４】 ドメイン４〜６は、ネイティブなＪ鎖中のカルボキシ末端ドメインであり、こ
れは、ＴＭ内に存在し得るが、そうである必要はない。ドメイン４は、代表的に
、７個のアミノ酸のペプチドである。ネイティブなＪ鎖において、このペプチド
は、システイン残基を含まず、そしてドメイン５にコアを結合する。ドメイン５
は、存在する場合、代表的に、共有結合によって閉じたループを生じる分子内シ
スチン結合を形成する、アミノ末端およびカルボキシ末端のシステイン残基によ
って境界が定められる２６個のアミノ酸のペプチドである。ネイティブなＪ鎖に
おいて、ドメイン５のアミノ末端およびカルボキシ末端の部分は、実質的なβシ
ートの特徴を有し、そして低いβシート傾向を有する短い３〜６残基のペプチド
によって離されている。ドメイン６は、代表的に、５アミノ酸以下の短いペプチ
ドであり、これはＴＭのカルボキシ末端として作用する。ドメイン４〜６は、Ｔ
Ｍの機能に必須でない。
【００４５】 上記のように、ネイティブなＪ鎖配列の多数の改変体は、本明細書中に記載さ
れるように、ＴＭ内で使用され得る。例えば、ＴＭコアは、上記のように、ドメ
インおよび／またはさらなる分子成分の付着および／または置換のための分子骨
格として作用し得る。可能な改変体は、以下を含む： ・ドメイン１が、約１３アミノ酸のペプチドを含み、そのうちの真ん中の３分
の１が、実質的なβシートの特徴を有する（例えば、ＤＱＥＤＥＲＩＶＬＶＤＮ
Ｋ；配列番号３７）、ＴＭ； ・４８位のアスパラギン残基が、ヒスチジンに変更されている（例えば、ＡＡ
ＴからＣＡＣ）、ＴＭ； ・ドメイン１が、３アミノ酸ペプチドであるＤＮＫを含む、ＴＭ； ・ドメイン１が、近位の同直線上の（ｃｏｌｉｎｅａｒ）ペプチドまたはタン
パク質から、ＴＭの遠位の部分を放出するために使用され得るプロテアーゼによ
る認識および切断に特異的な配列を有するペプチド（例えば、タバコエッチウイ
ルスプロテアーゼＮｉａによって認識されるペプチド：ＥＮＬＹＦＱＳ；配列番
号３８）を含む、ＴＭ； ・ドメイン１が、連続的なペプチドの細胞内標的化を特定するペプチド配列（
例えば、核標的化ペプチド）を含む、ＴＭ； ・ドメイン２内のネイティブなシステイン残基２または３の一方または両方が
、分子間架橋の可能性を排除するために、除去または置換されている（例えば、
ネイティブなＣについての、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｖ、またはＭ残基の置換）、ＴＭ； ・ドメイン３の一部が欠失され、それによってドメイン３の第３のβシートの
末端から遠位のアミノ酸と、ドメイン３の最終ペプチドの最初の残基との間のペ
プチド結合が存在する、ＴＭ； ・ループ構造または他の逆平行ペプチドドメインを形成する他のペプチドが、
ドメイン３の代わりに、またはその規定するシステインの間に含まれ、ＴＭに対
して官能性または認識ドメイン（例えば、ウイルスキャプシドタンパク質ループ
）を提供する、ＴＭ； ・ドメイン４が、短縮されて、ドメイン５および６を含まないＴＭを形成する
、ＴＭ； ・ドメイン４が、上記のようにドメイン３について置き換えられて、ＴＭに対
して新規な官能性、特異性、および／または構造を導入する、ＴＭ ・ドメイン４が、細胞性区画において、２つの分子へのＴＭの切断を生じる、
細胞性区画に特異的なタンパク質分解性部位を含む、ＴＭ； ・ドメイン５のループ構造が、ペプチド配列で置き換えられ、ＴＭに対して官
能性または認識ドメイン（例えば、単鎖抗体の可変領域またはウイルスキャプシ
ドタンパク質ループ）を提供する、ＴＭ； ・ドメイン６が、ペプチド配列において終結されるか、または細胞内標的へと
連続的なＴＭタンパク質を標的化するペプチド配列（例えば、内膜系における保
持のために、ＫＤＥＬ、配列番号４４、またはＨＤＥＬ、配列番号９０）で置き
換えられる、ＴＭ； ・１つ以上のジスルフィド結合および／またはペプチド結合を介して連結され
る、１つ以上の免疫グロブリン由来配列（例えば、Ｉｇ重鎖クラスのドメイン：
α３、α２、α１、ｍｕ４、ｍｕ３、ｍｕ２、ｍｕ１）をさらに含む、ＴＭ。こ
のような配列は、１つ以上の生物学的薬剤についての付着部位として作用し得る
。
【００４６】 代表的な改変体の上記の列挙は、例示の目的のためにのみ提供される。当業者
は、上述で引用される修飾は、単一のＴＭ内で組み合わされ得ること、および多
くの他の改変が、本発明の文脈において用いられ得ることを認識する。
【００４７】 ＴＭは、一般に、任意の種々の周知の精製法、化学的方法、および／または組
換え方法を使用して調製され得る。天然に存在するＴＭ（例えば、ヒトＪ鎖）は
、本明細書中に記載されるように、適切な生物学的物質から精製され得る。ＴＭ
の全てまたは部分は、生細胞において、普遍的な遺伝子コードによって規定され
る配列および成分、生存細胞に特異的な遺伝子コードのサブセットまたは修飾さ
れた遺伝子コードを用いて、合成され得る。当業者に公知の任意の種々の発現ベ
クターは、任意の適切な宿主細胞における発現を達成するために用いられ得る。
適切な宿主細胞としては、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類
、細菌、および他の動物細胞（例えば、ハイブリドーマ、ＣＨＯ、黒色腫）が、
挙げられる。
【００４８】 標的化分子をコードする合成遺伝子の例は、配列番号７に提供される。このよ
うな合成遺伝子は、例えば、ポリヘドリンベースのバキュロウイルス移入ベクタ
ー（例えば、ｐＭｅｌＢａｃ Ａ、ｐＭｅｌＢａｃ Ｂ、またはｐＭｅｌＢａｃ
Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）へ、適切な制限部位
（例えば、ＢａｍＨＩ部位およびＳａｌＩ部位）の間に連結され得、そして標準
的な方法に従って、Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕ ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用する同時トランスフェクション事
象において、昆虫細胞（例えば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｆ９、またはＳｆ２１
）へ導入され得る。他の適切なベクターおよび宿主細胞は、当業者に容易に明ら
かである。
【００４９】 合成ポリぺプチドＴＭまたは約１００のアミノ酸未満、および一般に５０アミ
ノ酸未満を有するその部分は、当業者に周知の合成技術を使用して作製され得る
。例えば、このようなポリぺプチドは、任意の市販の固相技術（例えば、Ｍｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法）を使用して合成され得、ここではアミノ酸は、伸長
するアミノ酸鎖に連続的に付加される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６、１９６３を参照のこと。ポリぺプチ
ドの自動化合成についての装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉ
ｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡのような業者から容易に入手可能であり
、そして製造業者の指示に従って操作され得る。
【００５０】 上記のＴＭに加えて、ＴＭでなく上皮細胞および／またはＮＰＥ細胞と会合す
る基底外側因子に特異的に結合し得、そして上皮細胞へのインターナリゼーショ
ンを続いて生じ得る、他の分子が存在する。このような分子は、ポリ免疫グロブ
リンレセプターに結合する抗体ドメインを含むペプチドまたはタンパク質を含む
。分子のこのタイプは、培養における上皮様表面を用いるスクリーニングアッセ
イにおいて同定され得る。
【００５１】 １つの適切なスクリーニングアッセイにおいて、ペプチドのコンビナトリアル
ライブラリーが用いられ、この各ペプチドは、容易に検出可能な生化学的マーカ
ーまたは化学的マーカー（例えば、ビオチニル−リジン残基または放射性標識さ
れたヨウ素への共有結合によって修飾されるチロシン残基）を含む。このような
アッセイにおいて、個々のペプチドまたは８〜１５アミノ酸残基を有するぺプチ
ドのファミリーは、上皮様単層細胞培養物および／またはＮＰＥ細胞の基底外側
ドメインに曝露される溶液中でインキュベートされる。ペプチド溶液のインキュ
ベーション後、細胞培養物の先端ドメイン上の溶液は、合成の間に誘導された生
化学的マーカーまたは化学的マーカーについての分析によって、輸送されたペプ
チドの存在についてアッセイされる。例えば、質量分析による、輸送されたペプ
チドのペプチド配列のその後の分析が、培養物において上皮様表面および／また
はＮＰＥ細胞原形質膜を横切って輸送され得るペプチドの同定を示すために使用
される。次いで、この様式において同定される任意のペプチドは、蛍光マーカー
を含むための化学的手段によって合成される。次いで、蛍光マーカーを含むペプ
チドは、結合を可能にするが、インターナリゼーションを可能しない条件下（例
えば、４℃）、または取込みを可能にするが、トランスサイトーシスを可能にし
ない条件下（例えば、１６℃）で、上皮様単層細胞培養物またはＮＰＥ細胞の基
底外側ドメインに曝露された溶液中でインキュベートされ、そして細胞は、顕微
鏡観察されて、ペプチドが、上皮様層の細胞と結合する能力、またはこれによっ
てインターナリゼーションされる能力を決定する。
【００５２】 類似のアッセイが、ポリ免疫グロブリンレセプターを含有する上皮細胞に結合
する能力、これによってインターナリゼーションおよびトランスサイトーシスさ
れる能力について、モノクローナル抗体、１本鎖抗体、抗体結合領域、またはＦ
ａｂフラグメントの集団をスクリーニングするために使用され得る。分泌性の成
分で、ポリ免疫グロブリンレセプターで免疫された動物、またはこのような免疫
に対してネイティブな動物において惹起される抗体は、上皮様単層細胞培養物ま
たはＮＰＥ細胞の基底外側ドメインに曝露された溶液中でインキュベートされる
。抗体のインキュベーション後、細胞培養物の先端ドメイン上の溶液が、抗体ま
たは抗体フラグメントの存在についての分析によって、輸送抗体の存在について
アッセイされる。この評価は、酵素連結免疫吸着アッセイについての市販の抗体
を使用して、またはイムノブロット技術によって、行われ得る。これらのアッセ
イのいずれも、抗体を特徴付けする分野の当業者によって、容易に行われ得る。
【００５３】 次いで、この様式において同定される、任意の抗体または抗体フラグメントは
、単離され、そして蛍光マーカーに結合され得る。従って、蛍光マーカーに付着
された免疫グロブリンは、次いで、結合を許容するが、インターナリゼーション
を許容しない条件下（例えば、４℃）、または取込みを許容するが、トランスサ
イトーシスを許容しない条件下（例えば、１６℃）で、上皮様単層細胞培養物の
基底外側ドメインに曝露された溶液中でインキュベートされ、そして細胞は、顕
微鏡観察されて、抗体が、上皮様層の細胞を結合する能力、またはこれによって
インターナリゼーションされる能力を決定する。Ｆｅｒｋｏｌら、Ｊ． Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２３９４−２４００は、類似の方法によって抗体結合
ドメインを同定した。
【００５４】 １つ以上の生物学的薬剤へのＴＭの連結は、当業者に公知の任意の手段（例え
ば、遺伝子融合、共有結合的な化学的付着、非共有結合的付着（例えば、吸着）
またはこのような手段の組合せ）によって達成され得る。生物学的薬剤にＴＭを
連結するための方法の選択は、一部、薬剤の化学的性質に依存して、そして薬剤
が、上皮細胞内で、基底外側ドメインで機能するか否か、またはトランスサイト
ーシスを受けるか否かに依存して、変化する。遺伝子融合による連結は、生物学
的薬剤およびＴＭの両方を含む単一の融合ペプチドをコードする核酸分子を作製
するために、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して行われ得る。必要に応じて、
融合ペプチドは、１つ以上のリンカー配列および／または細胞内標的化について
の配列（例えば、ＫＤＥＬ、プロテアーゼ切断部位、核標的化配列など）を含み
得る。次いで、組換え核酸分子は、適切なベクターに導入され、そして適切な宿
主細胞において発現される。このような組換え分子を作製するための、およびペ
プチドを発現するための技術は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９を参照のこと）
。公知のポリぺプチド配列を有する任意の生物学的薬剤は、遺伝子融合によって
、ＴＭに連結され得る。例えば、組換え技術を使用して、１つ以上の免疫グロブ
リン由来の配列（例えば、１本鎖抗原結合タンパク質、ヒンジ、ＦｖγまたはＦ
ｖκ）は、Ｎ末端および／またはＣ末端で、ＴＭに連結され得る。
【００５５】 連結はまた、任意の種々の適切な方法を使用して、共有結合的付着によって達
成され得る。例えば、ＴＭおよび生物学的薬剤は、ＴＭおよび生物学的薬剤の両
方に反応し得、そして２つの間の架橋を形成し得る二官能性試薬（リンカー）を
使用して、連結され得る。一般に利用可能な二官能性のクロス−リンカーは、炭
水化物、アミン、スルフヒドリル、およびカルボキシル官能基を結合し得るか、
または共有結合を可能にするために、光反応基を用い得る。これらの試薬は、例
えば、さらなるペプチドリンカー（次いで、これは生物学的薬剤に付着される）
の付着のために特に有用である。リンカーの共有結合的付着は、ＴＭに連結され
る抗体の抗原結合部位に存在するアミノ酸側鎖への結合を介して、達成され得る
。簡潔には、このような残基へのリンカーの付着は、リンカーが抗原として認識
され、そして適合性の反応残基が、リンカー上におよび抗体の結合ドメイン中に
存在する場合、それ自身の抗体認識プロセスの結果として生じ得る。このような
反応性の抗体は、代表的に、求核基（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、
グルタミン、リジン、および／またはアスパラギン）として作用し得る側鎖を有
するアミノ酸残基を含む抗原結合部位を有する。上皮細胞内に残存する薬剤の送
達のために、標的細胞内で切断されるリンカーは、特に有用であり得る。細胞内
の生物学的薬剤の放出は、細胞の遺伝子能力を導入または増加し得る（例えば、
ガン腫細胞において、Ｐ５３タンパク質レベルを増加する）か、または既存の細
胞活性を阻害し得る（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫瘍形成、
腫瘍維持、および／または転移に必須である機能的な細胞内転写物（例えば、高
レベルの糖分解酵素を生成する転写物）を結合し得る）。
【００５６】 任意の種々の分子は、本発明におけるリンカーとして作用し得る。ポリヌクレ
オチドおよび／またはペプチドリンカーが、使用され得る。次いで、このような
分子は、例えば、腸内ヌクレアーゼおよびプロテアーゼ（例えば、エンテロキナ
ーゼ、トリプシン）によって、それぞれ消化されて、生物学的薬剤を放出し得る
。好ましいリンカーは、上皮障壁と会合されるプロテアーゼ（すなわち、上皮細
胞もしくは表面内、上皮細胞もしくは表面上に存在するか、または上皮細胞もし
くは表面に近接するプロテアーゼ）についての基質を含む。
【００５７】 多数のプロテアーゼは、上皮細胞に存在するか、またはこれらに会合する。分
泌されるタンパク質のプロセシングは、例えば、細胞内膜系からの分泌の前に、
新規に合成されたタンパク質（プレタンパク質とよばれる）の一部分のタンパク
質分解性の切断を必要とする。さらなるプロセシングは、細胞から活性酵素を遊
離するために必要とされ得、例えば、さらなるタンパク質分解から生じ得、ここ
では基質は、プロタンパク質またはプロ酵素と呼ばれ得る。これらのプロタンパ
ク質の特異的なタンパク質分解性の切断部位は、新規に合成されたタンパク質の
配列と、最終的な分泌タンパク質とのアミノ酸配列の比較によって同定され得る
。これらの切断部位は、特定の細胞内プロテアーゼの基質認識配列を同定する。
上皮細胞に特異的な、１つのこのようなプロテアーゼ認識部位は、ヒトポリ免疫
グロブリンレセプターの残基５８５〜６００（ｐＩｇＲ、配列番号４５；Ｐｉｓ
ｋｕｒｉｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１７３５−１７４７、１９９５
に従う番号づけ）からのアミノ酸配列内に存在し得る。あるいは、ｐＩｇＲの細
胞内切断は、残基６０１〜６３０（ＶＲＤＱＡＱＥＮＲＡＳＧＤＡＧＳＡＤＧＱ
ＳＲＳＳＳＳＫＶＬＦ、配列番号９１）内に含まれ得る。成熟ＳＣを得るための
カルボキシ末端からのＳＣのその後の短縮化は、粘膜環境におけるカルボキシペ
プチダーゼに起因して生じ得る。残基６０１〜６３０からの配列の全てもしくは
部分を含むペプチドは、トランスサイトーシスするＴＭ−薬物結合体のエンドソ
ーム放出のために有用であり得る。別のこのようなプロテアーゼ認識部位は、多
くのマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）についてのペプチド基質を同定
し、アミノ酸配列ＰＬＧＩＩＧＧ（配列番号９２）を含む。ガン細胞は、しばし
ば、豊富な量のＭＭＰを含み、そしてこれを分泌するので、この配列は、ガン細
胞中またはその周辺で、効率よく、特異的に切断されることが期待される。別の
このようなプロテアーゼ認識部位は、ガン細胞中にまた豊富であり得るプロテア
ーゼを同定し、プロカテプシンＥの残基３０〜４０（配列番号３９）を含む。し
かし、別のタイプのプロテアーゼ認識配列は、ヒトＩｇＡ１のＣＨ２領域におけ
る残基（ＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＣＣＨＰＲＬ、配列番号９３
）を含み、そして微生物によって分泌されるＩｇＡ特異的プロテアーゼによって
切断可能である。
【００５８】 これらのプロテアーゼ認識部位は、一般に、上皮細胞の細胞内環境に、または
上皮障壁に、薬物、画像化化合物、または他の生物学的薬剤を送達することを可
能にする、切断しやすい（ｓｃｉｓｓｉｌｅ）リンカーを設計するにおいて極め
て有用である。上皮細胞へのこのような化合物の送達は、ヒトｐＩｇＲの残基５
８５〜６００（配列番号４５）、または残基６０１〜６３０（配列番号９１）を
、生物学的化合物をＴＭに結合する切断しやすいリンカーの部分として使用する
ことによって、達成され得る。上皮起源の腫瘍への、抗ガン薬物の送達は、ＭＭ
Ｐの基質認識配列（配列番号９２）またはプロカテプシンＥの残基３０〜４０（
配列番号３９）を、ＴＭに対する切断しやすいリンカーの部分として使用して、
達成され得る。あるいは、切断しやすいリンカーは、新規に合成され、そして分
泌されたタンパク質の比較、または類似の技術によって同定され得る、他のガン
細胞特異的なまたは上皮障壁特異的なプロセシングプロテアーゼから設計され得
る。切断しやすい結合を切断するために使用され得る、他のタイプのプロテアー
ゼは、例えば、哺乳動物十二指腸において見出され得る。エンテロキナーゼ認識
配列の（Ａｓｐ）4−ｌｙｓは、十二指腸上皮障壁を横切るＴＭ媒介性のトラン スサイトーシスによって、生物学的化合物を十二指腸に送達するための切断しや
すいリンカーとして使用され得る。タンパク質分解性の切断は、小さなフラグメ
ントのリンカー（例えば、ＶＱＹＴ、配列番号４０、プロカテプシン由来；ＥＫ
ＶＡＤ。配列番号４１、ｐＩｇＲ由来；またはＩＩＧＧ、配列番号９４、一般的
なＭＭＰ基質配列由来）を有する生物学的薬剤を放出する。次いで、このような
残基のリンカーセグメントはさらに、タンパク質分解酵素（例えば、カルボキシ
ペプチダーゼＩＩまたはアミノペプチダーゼＩ）によって消化され、未修飾の生
物学的薬剤を生じ得る。
【００５９】 切断しやすいペプチドリンカーは、一般に、約５〜約５０のアミノ酸残基長で
ある。これらは、遺伝子融合技術よって（すなわち、ＴＭコドンもしくは付加物
コドンの５'または３'配列とインフレームに）、または種々の官能基（例えば、
ＮＨ2、ＣＯＯＨ、ＳＨ）の結合を可能にする、任意の種々の化学的手順によっ て、ＴＭに、もしくはＴＭに付着される付加物に、共有結合的に連結され得る。
あるいは、切断しやすいペプチドは、それ自身、抗原を含み得、次いで抗原は、
コグネイト抗原結合能力を含むＴＭに結合され得る。例えば、配列−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−（配列番号
９５）を含む切断しやすいペプチドは、抗ｍｙｃ抗体（カタログ番号Ｒ９５０−
２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって認識および結
合される。同様に、そのカルボキシ末端でオリゴヒスチジンを含有する切断しや
すいペプチドは、抗Ｈｉｓ（Ｃ−末端）抗体（カタログ番号Ｒ９３０−２５、Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって認識および結合される
。
【００６０】 上皮細胞と会合される細胞内プロテアーゼについての他の基質としては、ホス
ホリパーゼまたはグリコシダーゼについての基質が挙げられるが、これらに限定
されない。あるいは、リンカーは、細胞における放出のために、負に荷電された
核酸分子を結合する、反復する正に荷電されたリジン残基を含み得る。ペプチド
リンカーは、ペプチド生物学的薬剤（例えば、抗生物質のセクロピン、マゲイニ
ン（ｍａｇａｉｎｉｎ）、およびマストパリン（ｍａｓｔｏｐａｒｉｎ））につ
いて、特に有用であり得る。
【００６１】 炭水化物は、ネイティブな炭水化物に、またはＴＭのポリぺプチド骨格に、共
有結合的に付着され得、そしてリンカーとして用いられ得る。適切な炭水化物と
しては、ラクトース（これは、例えば、小腸に存在するラクターゼによって分解
され得る）、スクロース（スクラーゼによって消化され得る）、およびα−限定
デキストリン（デキストラーゼによって消化される）が挙げられるが、これらに
限定されない。炭水化物リンカーの切断を担う酵素が上皮障壁の管腔ドメインの
刷子縁膜に付着されることが見出され得る。例えば、スクラーゼ−イソマルター
ゼは、マルトース、マルトトリオース、およびマルトペントースの１，４−α結
合を切断する。それゆえ、腸刷子縁特異的リンカーは、１，４−α結合によって
連結されるマルトースの任意のポリマーから構成される。ＴＭに付着される場合
、このリンカーは、トランスサイトーシスによって上皮障壁を介して通過し、そ
して上皮障壁の先端ドメイン上に存在するスクラーゼ−イソマルターゼによって
切断されるのみである。
【００６２】 脂質はまた、またはあるいは、リンカーとしての使用のために、ポリぺプチド
骨格に、共有結合的に付着され得る。次いで、この様式において用いられるモノ
グリセリドは、グリセロールまたは脂肪酸に連結される生物学的薬剤を放出する
ために、腸リパーゼによって消化され得る。リン脂質は、ホスファチジルセリン
極頭基へのペプチド結合を介して、またはホスファチジルイノシトールの頭基の
水酸基の１つへのエーテル結合またはエステル結合によって、ＴＭに付着され得
る。非極性頭基（ジアシルグリセロール）は、活性形態または不活性形態の生物
学的薬剤によって、全体が置換され得る。例えば、Ｒ基を介して、１−ホスホ−
ｍｙｏ−イノシトール−ＴＭのリン酸に連結されたペニシリンは、細菌感染に由
来するホスホリパーゼＣによって放出されるまで、不活性である。他の適切なリ
ンカー部分は、当業者に明白である。
【００６３】 連結はまた、ＴＭと生物学的薬剤との間で、直接的な共有結合を形成すること
によって、行われ得る。リンカーが用いられるか否かに関わらず、任意の種々の
標準的な方法が、共有結合を形成するために使用され得る。ペプチド生物学的薬
剤およびリンカーについて、このような共有結合は、ＴＭおよび生物学的薬剤の
システイン残基間のジスルフィド結合であり得る。簡潔には、このような結合は
、高等生物体の内膜系からの分泌のプロセス中に形成され得る。このような場合
において、ぺプチド生物学的薬剤およびＴＭは、内膜上での合成を特定する適切
なシグナルを含まなければならない。このようなシグナルは、当業者に周知であ
る。反応性抗体は、生物学的薬剤またはリンカーに直接的に共有結合的に付着さ
れ得る。反応基または特定の反応についての遷移状態アナログを含む抗原に対し
て惹起される抗体は、抗原と、または類似の分子と、共有結合的な相互作用を形
成し得る結合部位における、残基を含み得る。このような反応の例は、ジケトン
とビニル様の（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）アミド結合を形成するために反応するモ
ノクローナル抗体３８Ｃ２の結合部位におけるリジン残基と他の密接に関連する
分子との間で生じる（Ｗａｇｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１７９７−１
８００、１９９５）。反応性抗体もしくは反応性抗体の結合部位を含むＴＭは、
脂質、ペプチド、炭水化物、核酸、または他の組成物のリンカーとの共有結合を
形成するために使用され得る。結合部位において共有結合を介してＴＭに付着さ
れた生物学的薬剤を含むＴＭは、抗体ドメインにおいて正常な配座および機能を
有することが予測され得る。抗原結合部位の外側の抗体構造に対する改変の非存
在は、身体に導入される場合、外来としてのこのような分子の認識が変化する可
能性を最小にする。さらに、ヒト起源の抗体の結合部位を介してつながれる分子
は、血清および他の身体区画において、ネイティブな抗体の半減期に類似する半
減期を有し、そしてＴＭに対する抗体応答を刺激する低い傾向を有することが期
待される。
【００６４】 上記のように、任意の治療学的な生物学的薬剤は、ＴＭに連結され得る。生物
学的薬剤としては、タンパク質、ペプチド、およびアミノ酸；核酸およびポリヌ
クレオチド；ステロイド；ビタミン；多糖；無機物；脂肪；無機化合物、および
細胞または細胞成分が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的薬剤はま
た、インビボで生物学的活性を有する薬剤を作製するプロドラッグであり得る。
一般に、生物学的薬剤は、上記のような種々の技術を用いて結合され得、そして
任意の方向で存在し得る。
【００６５】 ペプチド生物学的薬剤の分類は、種々の結合薬剤を含む。本明細書で使用され
る「結合薬剤」とは、細胞内で分子に結合し、かつその分子の不活性化および／
または分子の除去を促進する任意の化合物である。結合薬剤は、例えば、細胞内
部の必須成分および頂面の境界を横切る続いてトランスサイトーシスする成分を
結合することによるウイルス性の病原集合体を阻害するため；トランスサイトー
シスによる細菌性の毒素を結合し、そして除去するため；血清または細胞毒素も
しくは代謝物を結合し、そして除去するため；あるいは環境毒素を結合し、そし
て除去するために使用され得る、単鎖抗原結合タンパク質を含む。
【００６６】 結合薬剤はまた、例えば、反応抗原結合部位であるが、これに限定されない抗
原結合部位であり得る。例えば、抗原結合部位は、酵素（例えば、活性部位）に
結合し得、そして酵素の活性を阻害し得る。抗原結合部位もまた、他の分子に結
合し得、そして他の細胞機能（例えば、リボソームまたはトランスポーターのよ
うな）を阻害し得る。
【００６７】 例えば、エステラーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、およびペプチダー
ゼのような、キナーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、プ
ロテアーゼ、リガーゼ、およびオキシドレダクターゼを含む酵素もまた、使用し
得る。例えば、ＴＭに連結した酵素は、細菌毒素の特異的なタンパク質分解性切
断、タンパク質または必須細胞表面機能への付着（ウイルス性または細菌性）、
腫瘍の維持または転移に不可欠である分泌されたガン細胞特異的タンパク質（例
えば、プロテアーゼ）のタンパク質分解性切断、ウイルスまたは細菌の病原性に
不可欠である細胞表面炭水化物の分解、あるいは細胞外性のガン細胞特異的機能
または病原体特異的機能を阻害する生化学的な機能（例えば、リン酸化）の特異
的な移行を生じ得る。
【００６８】 ペプチド生物学的薬剤はまた、酵素インヒビター（例えば、ロイペプチン、キ
モスタチンまたはペプスタチン）；ホルモン（例えば、インスリン、プロインス
リン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、コロニー刺激因子、成長ホルモン、甲状
腺ホルモン、エリトロポエチン、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、腫瘍壊
死因子）；ホルモン放出ホルモン（例えば、成長ホルモン放出ホルモン、コルチ
コトロピン放出因子、黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出抑制ホ
ルモン（ソマトスタチン）、絨毛膜性腺刺激ホルモン放出因子および甲状腺ホル
モン放出ホルモン）；細胞レセプター（例えば、エストロゲンレセプター等のホ
ルモンレセプター）および細胞レセプターサブユニット；成長因子（例えば、腫
瘍血管新生因子、上皮増殖因子、神経成長因子、インスリン様成長因子）；サイ
トカイン（例えば、インターフェロンおよびインターロイキン）；組織適合抗原
；細胞接着分子；神経ペプチド；アセチルコリン等の神経伝達物質；α−リポプ
ロテインなどのリポタンパク質；ヒアルロン酸等のプロテオグリカン；性腺刺激
ホルモンなどの糖タンパク質；抗体（ポリクローナル、モノクローナルまたはフ
ラグメント）；ならびに、上述のいずれかのアナログおよび化学改変誘導体であ
り得る。
【００６９】 ポリヌクレオチド生物学的薬剤としては、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＥＢＮａ−１また
は逆転写酵素アンチセンスヌクレオチドなどのアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ＤＮＡまたはＲＮＡ）；活性ガン遺伝子またはウイルス特異的遺伝子産物に特
異的なポリヌクレオチドおよび自己免疫Ｂ細胞免疫グロブリン遺伝子またはＴ細
胞レセプター遺伝子における独特な配列あるいは変異タンパク質対立遺伝子（例
えば、変異βアミロイドタンパク質）に相補的なポリヌクレオチド；ならびに薬
物耐性遺伝子を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、発現ベ
クター内のＤＮＡ、またはＲＮＡ）が挙げられる。また、触媒活性を有するポリ
ヌクレオチド剤（例えば、リボザイム）、あるいは細胞もしくはウイルスのＤＮ
Ａ，ＲＮＡまたはタンパク質に共有結合する能力を有するポリヌクレオチド剤も
含まれる。ヌクレオチド（例えば、チミン）および放射性核種（例えば、ヨウ素
、臭素、鉛、パラジウム、銅）もまた使用され得る。
【００７０】 広範な種々のステロイド生物学的薬剤も使用され得、プロゲステロン、アンド
ロゲンおよびエストロゲン（エチニルエストラジオールなどの避妊薬を含む）が
挙げられる。同様に、ビタミン類（ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫなどの脂溶性ビ
タミンならびにそれらのアナログを含む）などの薬剤も、ＴＭに連結され得る。
無機生物学的薬剤としては、酸化鉄などの酸化物が挙げられる。多糖類生物学的
薬剤は、種々の炭水化物、ならびにリポ多糖類およびへパリン等の化合物のいず
れかを含む。
【００７１】 特定の好ましい実施態様の中で、ＴＭに連結する生物学的薬剤は、ＮＰＥ細胞
死を誘導する。広範な種々のこのような致死性の生物学的薬剤のいずれもが、本
目的に使用され得、そして有効性は、一般的に、ＴＭにより媒介されるＮＰＥ細
胞への送達により増強される。例えば、生物学的薬剤は、抗腫瘍薬剤（例えば、
ドキソルビシン、カルボプラチン、ダクチノマイシン、フルオロウラシル、また
はマイトマイシン）、抗転移性細胞薬剤（例えば、タモキシフェン、エトポシド
、ダカルバジン、クロラムブシル、またはシクロホスファミド）、または抗子宮
内膜症性細胞薬剤であり得る。さらに、他の生物学的薬剤によって、その作用様
式を考慮することなしにＮＰＥ細胞を殺傷することは、ＮＰＥ細胞への標的化送
達がない場合、他になければ、はるかに有毒すぎる酵素および毒素により成し遂
げられ得る。例えば、サパリン（ｓａｐａｒｉｎ）のような毒性酵素、ならびに
リシンのような毒素が、ＴＭに連結され得、そして治療目的に使用され得る。他
の適切な生物学的薬剤は、抗体、核酸および炭水化物を含む。
【００７２】 もちろん、上記の生物学的薬剤の例は、単に例示する目的で示したのであって
、本発明の範囲を限定するためのものではない。本発明の範囲内で用いられ得る
他の試薬は、当業者にとって明白である。
【００７３】 １つの実施態様において、上述の標的分子は、天然ではこの標的分子と会合し
ない生物学的薬剤と連結される。この実施態様の状況では、生物学的薬剤はヨウ
素ではない。生物学的薬剤は、例えば、酵素、結合剤、インヒビター、核酸、炭
水化物または脂質であり得る。１つの好ましい実施態様において、生物学的薬剤
は抗原結合部位を含む。
【００７４】 １つ以上の生物学的薬剤に連結されたＴＭは、上皮組織またはＮＰＥ細胞に生
物学的薬剤を送達するために有利である場合（インターナリゼーションおよび／
またはトランスサイトーシスのために）はいつでも使用され得る。例えば、上皮
表面またはＮＰＥ細胞に関連した種々の状態は、ＴＭに連結された致死性または
非致死性の生物学的薬剤を用いて処置および／または予防され得る。一般的に、
致死性の生物学的薬剤を使用するこのような処置は、ＮＰＥ細胞死を生じる。細
胞死は、ＮＰＥ細胞をＴＭ生物学的薬剤と接触させる直接の結果、または他の分
子により媒介される間接の結果であり得る。例えば、直接の細胞殺傷は、ＴＭ−
毒素（例えば、ＴＭ−ドキソルビシンまたはＴＭ−サパリン）の取り込みから生
じ得る。間接の殺傷は、次いで、プロドラッグを活性毒素に変換するＴＭ−酵素
の取り込みから生じ得る（例えば、ＤｅｏｎａｒｉａｎおよびＥｐｅｎｅｔｏｓ
、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７０：７８６〜９４、１９９４の表１を参照のこと
）。このような状態は、ガン、ウイルス感染、および炎症性障害を含むがこれら
に限定されない。適切な生物学的薬剤は、処置および／または予防される状態の
性質に依存して変化し、上記に提供された薬剤、ならびに、当業者に公知の他の
薬剤を含む。
【００７５】 本明細書で使用される「処置」とは、状態の症状を軽減すること、または進行
を遅延または抑止することをいう。ＴＭに連結した生物学的薬剤は、一般に、状
態に罹患した患者に対し、薬学的組成物の形態で治療有効投薬量が投与される。
薬学的組成物を調製するために、有効濃度の一種以上のＴＭ−生物学的薬剤複合
体を、適切な薬学的キャリアまたはビヒクルと混合する。あるいは、薬学的組成
物は、宿主に由来する細胞または別の生物に由来する細胞（例えば、骨髄腫細胞
、幹細胞、樹状細胞、肝細胞または基底細胞）を含み得、これらの細胞は、宿主
の体内に導入される場合、ＴＭを産生する。投与の際に症状を改善するか、また
は疾患を処置するＴＭ（またはＴＭをインビボ産生する細胞）の量を有効量とみ
なす。治療有効濃度および量は、公知のインビトロおよびインビボ系におけるＴ
Ｍの試験によって経験的に決定され得る；次いで、ヒトまたは他の動物に対する
投薬量はこれらに基づいて推定され得る。薬学的キャリアまたはビヒクルには、
投与の特定形態に適することが当業者に公知であるような任意のキャリアが含ま
れる。
【００７６】 本発明の組成物は、種々の異なる経路（経口、非経口、静脈内、皮内、皮下ま
たは局所を含む）による、液状、半液状または固形の形態での投与のために調製
され得、そして各投与経路に適した様式で処方される。好適な投与態様は、処置
される適応性に依存する。
【００７７】 経口、非経口、皮内、皮下または局所の適用に使用する溶液または懸濁液は、
一種以上の以下の成分：滅菌希釈剤、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝化生理食
塩水）、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコ
ールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールおよびメチルパラベン等の抗菌剤
；アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩等
の緩衝剤；ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの毒性の調整のた
めの薬剤を含み得る。さらに、他の薬学的活性成分および／または適切な賦形剤
、例えば、塩、緩衝剤、安定剤などが組成物中に存在し得るが、これは必要では
ない。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして適切であり
得る。これらは、当業者に公知の方法により調製され得る。
【００７８】 ＴＭは、これが体内から急速に排出されるのを防ぐキャリア、例えば、時期放
出性処方物またはコーティングとともに調製され得る。このようなキャリアとし
ては、例えば、これらに限定されないが、移植片およびマイクロカプセル化送達
系等の徐放処方物ならびにエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸
、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが挙げら
れる。
【００７９】 薬学的組成物は、一般的には、望ましくない副作用を最小限に抑えて治療的に
有用な効果を発揮するように処方され、そして投与される。受容可能な副作用の
数および程度は、組成物が投与される状態に依存する。例えば、重篤度の低い障
害を処置する場合は耐性でない、毒性でかつ望ましくない特定の副作用は、腫瘍
等の致命的な疾患を処置する場合は耐性である。組成物中の生物学的薬剤の濃度
は、これらの吸収、不活化および排出速度、投薬スケジュールおよび投与される
量ならびに当業者にとって公知の他の要因に依存する。
【００８０】 組成物は、一度に投与され得るか、または時間間隔毎に投与されるように多数
のより少ない用量に分割され得る。正確な投薬量および処置期間は、処置される
疾患の関数であり、そして公知の試験プロトコルを用いるか、またはインビボあ
るいはインビトロ試験データからの推定により経験的に決定され得る。投薬量は
また、緩和すべき状態の重篤度に応じて異なり得る。任意の特定の被験体につい
て、患者の個々の必要に従って、時間の経過とともに具体的な投薬計画は調整さ
れ得る。
【００８１】 以下の実施例は、例示のために提供され、そしてこれは限定のためでない。
【００８２】 （実施例） （実施例１） （標的分子の調製） この実施例では、代表的な標的分子の調製を示す。
【００８３】 （Ａ． 生物学的供給源からの代表的ＴＭの精製） ２量体ＩｇＡ（ｄＩｇＡ）の調製：１０ｍＬのヒトＩｇＡ骨髄腫血漿（Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ，；Ｉｎｃ．Ｆａｌｌｂｒｏｏｋ，ＣＡ
）を、等量のＰＢＳと混合し、そして２０ｍＬの飽和硫酸アンモニウム（Ｈ2Ｏ ）を攪拌下で滴下した。一晩４℃でインキュベートした後、沈殿物を１７，００
０×ｇでの１５分間の遠心分離によりペレット化し、そして上清画分を除いた。
このペレットを２ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。得られた画分を、１３，５００×
ｇで５分間遠心分離して明澄化し、そして０．４５μｍフィルター（Ｎｙｌｏｎ
６６、直径１３ｍｍ、Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅ
ｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を通過させる。２ｍｌ（約半分）の明澄化画分をＳ
ｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−２００カラム（１．６×５１ｃｍ；０．２５
ｍｌ／分ＰＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウム）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉ
ｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に適用し、そして２ｍｌの画分を採集する。最高濃度
のｄＩｇＡを有することが（各画分１０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により）見
出された画分を凍結乾燥し、２００μｌの脱イオンＨ2Ｏに再懸濁し、Ｓｕｐｅ ｒｏｓｅ（登録商標）６カラム（１．０×３０ｃｍ；０．２５ｍｌ／分ＰＢＳお
よび０．１％アジ化ナトリウム）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ
，ＮＪ）に適用する。１ｍｌの画分を採取し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分
析を行う。第１３画分が９０％を超える純度でｄＩｇＡを含むことが見出される
。
【００８４】 ｄＩｇＡの緩和な還元によるＪ鎖の調製：１０ｍｇ未満のｄＩｇＡを含むサン
プル１ｍｌを上述のようにして調製し、そして１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ６．０）および５ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液に対して透析する。６ｍｇの２
−メルカプトエチルアミンＨＣｌを終濃度０．０５Ｍとなるように加え、そして
サンプルを３７℃で９０分間インキュベートする。還元されたタンパク質を、Ｐ
ＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化した脱塩カラムに通す。タンパク質含有画分を
、ＢＣＡ試薬を用いるアッセイにより検出する。次いで、Ｊ鎖をゲル濾過および
イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製する。
【００８５】 分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）の調製：１００ｍＬのヒト母乳（Ｌｅｅ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１００ｍｌのＰＢＳと混
合し、そして１７，０００×ｇで１時間、４℃で遠心分離する。脂肪層の下の明
澄層をきれいな遠心分離ボトルに移し、そして１７，０００×ｇで３０分間、４
℃で遠心分離する。サンプルのｐＨを２％酢酸で４．２に調整する。４℃で１時
間インキュベートした後、サンプルを１７，０００×ｇで１時間、４℃で遠心分
離し、そして上清画分を新たな試験管に移し、そして０．１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ
７に調整する。等量の飽和硫酸アンモニウムを攪拌下で加え、そしてサンプルを
４℃で一晩インキュベートする。沈殿物を遠心分離（１７，０００×ｇ、９０分
間、４℃）によりペレット化し、約７ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、そして４℃でＰ
ＢＳに対して徹底的に透析する。
【００８６】 得られた約２５ｍｌのうち、１．１ｍｌをさらに精製する。不溶固形分を遠心
分離（１３，５００×ｇ、１０分間）により除去し、そしてこの明澄化上清画分
に等量の０．０５Ｍ ＺｎＳＯ4を加える。ｐＨを約４０μｌの１Ｍ ＮａＯＨ を加えることにより６．８５に調整する。この物質を室温で５分間放置した後、
サンプルを１３，５００×ｇで、１０分間、室温で遠心分離する。１．５ｍｌの
上清を１．５ｍＬの飽和硫酸アンモニウムと混合し、そして４℃で１時間放置す
る。沈殿物質を遠心分離（１３，５００×ｇ、１０分間、室温）によりペレット
化し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により９０％を超えるｓＩｇＡが含まれてい
ることが見出される。
【００８７】 ２つのα鎖由来ペプチドと架橋したニックＪ鎖からなる分子（ＣＮＢｒ切断フ
ラグメント）の調製：上述（「ｓＩｇＡの調製」）のようにして調製したｓＩｇ
Ａを含むペレットを、３７５μｌの脱イオンＨ2Ｏに再懸濁する。サンプルをガ ラスバイアルに移し、そしてバイアルを、ほぼ縁まで８７５μｌのギ酸で満たす
。約２０ｍｇの固体ＣＮＢｒを加え、そしてテフロン製中蓋を使用してバイアル
を封止する。４℃で一晩反応を進行させる。次に、サンプルを脱イオンＨ2Ｏ（ ２回交換）およびＰＢＳに対して４℃にて透析し、そして凍結乾燥し、２００μ
ＬのＨ2Ｏで再懸濁し、そしてＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６カラム（１．０ ×３０ｃｍ、０．２５ｍｌ／分ＰＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウム）に適用
する。１ｍＬの画分を採取する。Ｊ鎖を含む画分を各画分のアリコート由来のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質をイムノブロットすることにより、同
定する。
【００８８】 最高濃度のＪ鎖を有する画分を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＣＬ（ｐＨ８．１）で平
衡化したＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅ
ｎ）に通し、そして２０ ＰＩ Ｐｏｒｏｓ陰イオン交換カラム（４．６ｍｍ×
１００ｍｍ；ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａ
ｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）に適用する。カラムを、１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＣＬ（ｐＨ８．１）で洗浄し、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．１
中の０〜１．０Ｍ ＮａＣｌの直線勾配（１５ｍｌ勾配）を用いて溶出する。カ
ラムからのタンパク質の溶出は、２８０ｎｍでの吸収度としてモニタリングし、
そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したアリコートのイムノブロッティングによ
り、Ｊ鎖含有画分を同定する。
【００８９】 Ｊ鎖精製についての代替法：種々の供給源が、ヒトＪ鎖を単離するための出発
物質として適切である。ＩｇＡ多発性骨髄腫患者の血清由来の高分子ＩｇＡ、ワ
ルデンストレームマクログロブリン血症患者の血清由来の分泌ＩｇＡまたはＩｇ
Ｍ、ならびにヒト母乳由来の分泌型ＩｇＡを、Ｊ鎖精製の出発物質として用い得
る。Ｊ鎖（１６，０００）およびＬ鎖（２２，５００）の分子量の差は、ゲル濾
過によるこれらの２つの鎖の満足行く分離を可能にするために充分大きいはずで
あるが、Ｊ鎖の独特なコンフォメーションおよびその二量体化能力により、しば
しばＬ鎖とＪ鎖との同時溶出が生じる。単離手順は、Ｊ鎖の陰電荷（アスパラギ
ン酸およびグルタミン酸残基の高含量に起因する）が、ヨード酢酸を用いた還元
システイン残基のＳ−亜硫酸分解またはアルキル化によりさらに増大することを
利用する。続いてＪ鎖は、塩の直線勾配を用いたＤＥＡＥ−またはＣＭ−セルロ
ースクロマトグラフィー、あるいは解離剤の存在下または非存在下での調製用電
気泳動によりＨ鎖およびＬ鎖から分離され得る。
【００９０】 免疫化学的および物理化学的に均一なＪ鎖の単離を生じるＤＥＡＥセルロース
による精製：出発物質として、部分的酸化亜硫酸分解および続く５Ｍグアニジ−
ＨＣｌにおけるＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００によるゲル濾過により
得られた、重合性ＩｇＡ、Ｓ−ＩｇＡ、またはＩｇＭのＪ鎖含有Ｌ鎖画分を使用
し得る。あるいは、Ｓ−スルホン化ＩｇＡまたはＳ−ＩＧＡが、直接ＤＥＡＥ−
セルロースにかけられ得る。しかし、通常は、夾雑しているＨ鎖を除去するには
５Ｍグアニジン−ＨＣｌでのＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００によるゲ
ル濾過を用いてさらなる分離を行なう必要がある。
【００９１】 出発物質は以下の試薬からなる：血清の重合性ＩｇＡもしくはＩｇＭ、または
初乳Ｓ−ＩｇＡのＬ鎖画分；０．０１Ｍリン酸二ナトリウムの脱イオン８Ｍ尿素
溶液および０．７Ｍ ＮａＣｌ含有の同緩衝液；８Ｍ尿素含有０．０１Ｍリン酸
二ナトリウムで平衡化したＤＥＡＥセルロース；１％ＮＨ4ＨＣＯ3溶液における
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５カラム。
【００９２】 凍結乾燥したＬ鎖画分を８Ｍ尿素の０．０１Ｍリン酸二ナトリウムに溶解し、
同リン酸溶液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムにかける。このカラムを
この緩衝液で完全に洗浄する。吸着されたタンパク質を、８Ｍ尿素の０．０１Ｍ
リン酸二ナトリウムおよび０．７Ｍ ＮａＣｌの０．０１Ｍリン酸二ナトリウム
の直線勾配により溶出する。２画分を得、後者の画分はＪ鎖を含有している。
【００９３】 Ｊ鎖含有画分を、ＣＯ2でバブリング（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）して中性に調節し た１％ＮＨ4ＨＣＯ3でのＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５カラムにより脱
塩する。Ｊ鎖の純度を、抗Ｌ鎖、抗Ｈ鎖、および抗Ｊ鎖試薬とのアルカリ性尿素
ゲル電気泳動または免疫電気泳動により評価し得る。
【００９４】 （Ｂ．ＴＭポリペプチドの直接合成） 手動による合成を、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ−Ｍｉｌｌｉｇｅｎ （Ｂｅｄｆｏｒ
ｄ、ＭＡ）から購入したＢＯＣ−Ｌアミノ酸を用いて行う。機械補助合成を、Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（大阪、日本）およびＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）からのＢＯＣ−Ｌ
−アミノ酸を用いて行う。ＢＯＣ−Ｄアミノ酸は、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅからである。ＢＯＣ−Ｌ−Ｈｉｓ（ＤＮＰ）およびＢＯＣ−Ｌ−Ａｂａ
は、Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）
から購入する。Ｂｏｃ−アミノ酸−（４−カルボキシアミドメチル（ｃａｒｂｏ
ｘａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ））−ベンジル−エステル−コポリ（スチレン−ジビ
ニルベンゼン）樹脂［Ｂｏｃ−アミノ酸−ＯＣＨ２−Ｐａｍ樹脂］は、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から、４−メチ
ルベンズヒドリルアミン（４ＭｅＢＨＡ）樹脂は、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，（Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）から入手する。ジイ
ソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）は、Ａｌｄｒｉｃｈからであり、そして２
−（ＩＨ−ベンゾトリアゾール−ｔ−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウ
ロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）は、Ｒｉｃｈｅｌｉｅｕ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）から入手する。
手動合成については、ＮＮ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ＮＮ−
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（全てペプチド合
成等級）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を、Ａｕｓｐ
ｅｐ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入する。機械補助合成
については、ＤＩＥＡおよびＤＣＭをＡＢＩから、そしてＤＭＦをＡｕｓｐｅｐ
から購入する。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ（Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ）からである。アセトニトリル（ＨＰＬＣ等級）は、Ｗａｔｅｒ
ｓ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）から入手する。ＨＦは、Ｍａ
ｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ（Ｓｔ．Ｌｏｉｕｓ、ＭＯ）から購入する。他の試薬およ
び溶媒は、ＡＣＳ分析試薬等級である。＃２焼結ガラスフィルターフリットでの
スクリューキャップガラスペプチド合成反応容器（２０ｍＬ）は、Ｅｍｂｅｌ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｌａｓｓｗａｒｅ（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、Ａｕｓｔ
ｒａｌｉａ）から入手する。固相ペプチドの手動合成のための振盪機は、Ｍｉｌ
ｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）から入手する。ａｌｌ−Ｋｅｌ Ｆ装置（
Ｔｏｈｏ；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、大阪から）を、ＨＦ切断のた
めに用いる。アルゴン、ヘリウム、および窒素（全て超純粋等級）を、Ｐａｒｓ
ｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入する。
【００９５】 （鎖アセンブリ） 合成を、Ｂｏｃアミノ酸−ＯＣＨ２−Ｐａｍ樹脂あるいは４−ＭｅＢＨＡ樹脂
上で行う。Ｂｏｃアミノ酸類を、以下の側鎖の保護に用いる：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）
；Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）（手動合成）およびＡｓｐ（ＯｃＨｘｌ）；Ｃｙｓ（Ｂｚ
ｌ）（機械補助合成）；Ａｓｎ、非保護の（手動合成）およびＡｓｎ（Ｘａｎ）
（機械補助合成）；Ｇｌｕ（ＯｃＨｘｌ）；Ｈｉｓ（ＤＮＰ）；Ｌｙｓ（２ＣＩ
Ｚ）；Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）；Ｔｒｐ（ＩｎＦｏｒｍｙｌ）；およびＴｙｒ（ＢｒＺ
）。ＧｌｎおよびＭｅｔは、非保護の側鎖に用いる。
【００９６】 （手動プロトコル） 合成を、０．２ ｍｍｏｌスケールで行う。Ｎa−Ｂｏｃ基を、１００％ＴＦ Ａで１分間、２回処理し、次いでＤＭＦでの３０分間流により除去する。活性化
剤としてＨＯＢｔ／ＤＩＣ（３０分間の活性化）あるいはＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ（
２分間の活性化）のいずれかを用いて、ＤＭＦ中で予め形成した活性エステルと
して、ペプチド樹脂塩を事前に中性にせずに、Ｂｏｃアミノ酸（０．８ ｍｍｏ
ｌ）を結合させる。ＨＯＢｔ／ＤＩＣにより形成させた活性エステルによる結合
のために、ＴＦＡ Ｏ-・+ＮＨ３ペプチド樹脂塩の量に対して１．５当量のＤＩ
ＥＡを活性化Ｂｏｃアミノ酸／樹脂混合物に添加してインサイチュで中和する。
ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡにより形成された活性エステルとの結合のために、ＴＦＡ
Ｏ-・+ＮＨ３ペプチド樹脂塩の量に対してさらに２当量のＤＩＥＡを、活性化混
合物に添加する。結合時間は、その間いかなる二重結合も生じさせずに、１０分
である。結合工程の後、ニンヒドリン定量法により残余遊離Ｂｏｃアミノ基の測
定のために、ペプチド−樹脂のサンプル（３〜５ｍｇ）を取り出す。結合収量は
、代表的には＞９９．９％である。操作を全て、テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）裏打
ちのスクリューキャップの２０ｍＬのガラス反応容器で手動で行う。ＮＩＩ脱保
護工程および結合工程の間、ペプチド−樹脂を振盪機で穏やかに転倒撹拌する。
【００９７】 （脱保護および切断） Ｂｏｃ基を除去する前に、ＤＮＰ基を取り除くために、Ｈｉｓ（ＤＮＰ）含有
ペプチドを３０分間、２回、２０％メルカプトエタノール／１０％ＤＩＥＡのＤ
ＭＦ溶液で処理する。清浄ＴＦＡ処理（１分間２回）により、ＮaＢｏｃ基をペ プチド−樹脂から除去する。ペプチド−樹脂をＤＭＦで洗浄し、ＤＭＦ中の１０
％ＤＩＥＡで中和する（１分間、１回）。ＤＮＰおよびＢｏｃ基を除去した後に
、ペプチド−樹脂を３０分間、２回、エタノールアミンの水／ＤＭＦ溶液で処理
し、Ｔｒｐのホルミル基（ＩｎＦｏｒｍｙｌ）を除去する。
【００９８】 ＤＭＦおよびＤＣＭでの洗浄後、減圧下で部分的に脱保護したペプチド−樹脂
を、乾燥させる。側鎖の保護基を取り除き、そして同時にＨＦ／ｐ−クレゾール
（９：１ ｖ／ｖ、０℃、１時間）あるいはＨＦ／ｐクレゾール／チオクレゾー
ル（容量で、９：０．５：０．５、０℃、１時間）処理により、このペプチドを
樹脂から切断する。ＨＦを０℃で減圧下で除去し、そして粗ペプチドを沈澱させ
、そして氷冷ジエチルエーテルで洗浄し、次いで２０％または５０％のいずれか
の酢酸水に溶解し、Ｈ2Ｏで希釈し、そして凍結乾燥する。
【００９９】 （ペプチドの連結） 上記の合成手順により生成したＴＭのペプチドセグメントの連結を、例えば、
Ｂａｃａら、Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ． １１７：１８８１−１８８７、１９９５；およ
びＤａｗｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９， １９９４に記
載される手順を用いて、非保護ペプチドの化学連結により行う。これらの手順に
より、連結性ペプチド結合での遊離スルフヒドリルが得られ得るか、またはジス
フィド結合が得られ得る。あるいは、特定位のシステイン残基がＬ−アミノ酪酸
と置換される。
【０１００】 一つの手順では、(カルボキシル基にチオエステルを含有する合成セグメント ペプチド１は、ペプチド２のアミノ末端でのＣｙｓ残基の側鎖チオールによる求
核的攻撃を受ける。ペプチド２の(アミノ基の有利な幾何的配置（五員環を含む ）のために、最初のチオエステル連結産物は、迅速な分子内反応を受け、連結部
位でのシステイン部分のネイティブなペプチド結合を有する産物を生じる。両方
の反応性ペプチドセグメントは、完全な非保護形態であり、そして標的ペプチド
は、さらなる操作を行うことなく最終形態で得られる。ペプチド１あるいはペプ
チド２のさらなるシステイン残基いずれも還元状態で残余する。この手順を、ネ
イティブな化学的連結と言及する。
【０１０１】 別の手順において、非保護ペプチドセグメントを、ブロモアセチル部分上に脱
プロトン化α−チオ酸基を求核的攻撃により連結し、チオエステルを介して化学
的に連結した二量体を生成する。さらに、２，２'−ジピリジルジスルフィドに よるシステアミン含有単量体の誘導体化後、Ｃ末端システアミン部分を、Ｎ末端
メルカプトアセチル基に連結し得る。ジスルフィド連結二量体を、Ｓ−（２−ピ
リジルスルフェニル）システアミン誘導体のチオリシスにより形成する。
【０１０２】 これらの手順を使用して、以下に提供された代表的なＴＭのような、種々のＴ
Ｍ立体配置を誘導体化させる。ＴＭコアは、残基１２〜１０１からなり、そして
伸長したＴＭは、残基１〜１３６からなる。
【０１０３】
【表１】 （Ｃ．ＴＭをコードする合成ＤＮＡの合成および発現） ＤＮＡ鎖を、ホスホルアミダイト法（これは、当該分野で周知である）により
合成し得、それにより、個々の構成ブロックのヌクレオチドをアセンブルして、
所望の配列を作製する。ＴＭ ＤＮＡのＤＮＡ自動合成は、所望の配列全体を形
成するための、ＴＭの個々のオリゴヌクレオチドコード部分の合成および結合を
含む。合成ＤＮＡは、多数の商業的供給源から購入し得る。
【０１０４】 ＴＭのトランスジェニック発現は、合成コードＤＮＡの、適切な生物の形質転
換のためのベクターへの連結を必要とする。ベクターへの連結の技術については
文献に充分に記載されている。例えば、昆虫細胞でのＴＭの導入および発現を可
能にするために、合成ＴＭ ＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）に連結させて、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＴＭ組換え体を形成する。次いで
、この組換えベクターを使用して、ヘルパープラスミドおよびバキュロウイルス
シャトルベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉ細菌を形質転換する。次いで、置換さ
れたＴＭコード配列を含有する高分子量シャトルベクターＤＮＡを単離し、そし
て昆虫細胞のトランスフェクションに用いる。組換えバキュロウイルスをトラン
スフェクトされた細胞から採取し、そしてタンパク質発現のための昆虫細胞培養
物の続く感染に用いる。
【０１０５】 ＴＭは、ＴＭをコードするＤＮＡ分子を細胞で発現することにより合成され得
る。このＤＮＡは、染色体外ＤＮＡエレメントに含まれ得るか、またはこのＴＭ
を発現する細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。あるいは、このＴＭ ＤＮＡ
は、ＤＮＡあるいはＲＮＡウイルス（それらが常在する細胞内でＴＭの発現に指
向する）のゲノムの部分として含まれ得る。ＴＭをコードするＤＮＡ配列の例を
配列番号７に示す。このＤＮＡ配列およびこのＴＭ ＤＮＡによりコードされる
アミノ酸配列（配列番号１７）もまた表ＩＩに示す。
【０１０６】 そのようなＴＭ遺伝子を合成する一つの方法は、完全なＴＭ遺伝子へのＴＭ遺
伝子の部分をコードするオリゴヌクレオチドの連続的アセンブリを包含する。こ
のＴＭ遺伝子の最終的なアセンブリは、細胞系での発現に適したＤＮＡ発現ベク
ターを生じ得るか、またはこのＴＭ遺伝子は、簡便なクローニングベクターに構
築され得、次いで細胞系での発現に適したＤＮＡ発現ベクターに移動され得る。
部分コード領域からのＴＭ遺伝子の連続的なアセンブリの利点は、ＴＭ遺伝子の
アセンブリの間、１つ以上の個々の部分についての別の配列を用いることにより
、ＴＭ遺伝子の改変バージョンを生成する能力である。あるいは、ＴＭ遺伝子に
おいてコードされる制限エンドヌクレアーゼ部位を、ＴＭ遺伝子の一部または全
てのアセンブリの後に使用して、ＴＭコード配列の部分を置き換えて、別のＴＭ
コード配列を産生し得る。これは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９により記載されるような周知の
技術を使用する。ＴＭ遺伝子は、表ＩＩに示される配列のいくつかの部分コード
領域：約−２〜２０のＤ１コードアミノ酸；約１９〜６６のＣ２コードアミノ酸
；約６５〜１０２のＬ３コードアミノ酸；および約１０２〜１４２のＴ４コード
アミノ酸に分けられる。他に示されることがなければ、以下の節のアミノ酸残基
数に対する参照は、表ＩＩに示される残基に対する。
【０１０７】 （ＴＭコアポリペプチドをコードする合成遺伝子のアセンブリ） ＴＭコア遺伝子の配列は、Ｃ２，Ｄ１．１（Ｄ１の改変バージョン）、および
Ｌ３Δ（Ｌ３の改変バージョン）の組合せによって規定され得る。ＴＭコアの１
つのバージョンは、表ＩＩＩに列挙されたオリゴヌクレオチド１．１、２．１、
３、４、５、６、７、８、９Ｌ３Δおよび１０Ｌ３Δ（配列番号４８、４９、５
４〜５６、５８、６０、６１、６３、６４）から生成され得、そして以下の配列
のポリペプチドをコードする： ＤＱＫＣＫＣＡＲＩＴＳＲＩＩＲＳＳＥＤＰＮＥＤＩＶＥＲＮＩＲＩＩＶＰＬＮ
ＮＲＥＮＩＳＤＰＴＳＰＬＲＴＲＦＶＹＨＬＳＤＬＣＫＫＤＥＤＳＡＴＥＴＣ（
表ＩＸおよび配列番号１８）。Ｄ１．１、Ｃ２およびＬ３Δを含有する遺伝子ま
たは、保存的置換もしくは修飾のみが相違する配列をコードする代替物は、完全
なＴＭコア遺伝子である。
【０１０８】 （Ｃ２のアセンブリ） 一例として、ＴＭ遺伝子（ＴＭコアを含む）のデノボ合成は、部分遺伝子（Ｃ
２と称し、ＴＭのアミノ酸１９〜６６をコードする）のアセンブリによって開始
され得る。Ｃ２ ＤＮＡの配列およびＣ２ ＤＮＡによりコードされたペプチド
の配列を、表ＩＶならびに配列番号９および１９に示す。表ＩＩＩのオリゴヌク
レオチド３、４、５、６、７および８（それぞれ、配列番号５４、５５、５６、
５８、６０および６１）を、ＴＭコアポリペプチドの約４８個のアミノ酸をコー
ドするＤＮＡフラグメントにアニーリングすることにより、Ｃ２を生成する。オ
リゴヌクレオチド３と４、５と６、および７と８の対が、重複ＤＮＡ二重鎖へと
まず一対がアニーリングされ、次いで３個の二本鎖ＤＮＡは、互いにアニーリン
グされ、６個の個々のオリゴヌクレオチドから構成される二本鎖ＤＮＡ複合体を
形成する。オリゴヌクレオチド１および８は、それぞれ酵素Ｘｂａ ＩおよびＢ
ｇｌ ＩＩにより制限されるＤＮＡ不対末端と適合可能である突出した不対末端
を有している。Ｃ２を、複数のクローニング領域のＸｂａＩおよびＢｇｌ ＩＩ
制限エンドヌクレアーゼ部分でベクターｐＭｅＩＢａｃＸＰにアニーリングし、
そしてこのＤＮＡフラグメントを酵素学的に連結してベクターｐＴＭＣを形成す
る（方法１）。
【０１０９】 （方法１：ｐＴＭＣを形成するための、オリグヌクレオチドからのＣ２ ＤＮ
Ａの合成およびｐＭｅｌＢａｃＸｐへの挿入） 個々のオリゴヌクレオチド３、４、５、６、７、および８（配列番号５４〜５
６、５８、６０、６１）を、１ｍＭ（１ナノモル／μｌ）の濃度で別々にＴＥ緩
衝液に溶解する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）。２ナノモルの各オリゴヌクレオチドを微量遠
沈管において、１０μＬのアニーリング緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．
０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で同量のその対（例えば、（
３と４）、（５と６） または（７と８））と合わせ、そしてその管を５分間５
０ｍＬの沸騰水に浸す。次いで、微量遠沈管を入れた沸騰水浴全体を熱源から取
り出し、そして室温（約２４℃）まで放冷し、オリゴヌクレオチドに塩基対ＤＮ
Ａ二重鎖を形成させる。室温で３０分間インキュベートした後、１ナノモルの各
オリゴヌクレオチド対（例えば、（３と４）、（５と６）および（７と８））を
１つの微量遠沈管中に合わせる。これらのＤＮＡ二重鎖を含む管を加熱ブロック
中で１５分間５５℃でインキュベートし、その加熱ブロックから取り出し、そし
て室温に対して平衡化し、ＤＮＡ二重鎖の重複相補領域をアニーリングさせ、Ｔ
ＭＤ ＤＮＡ Ｃ２の部分をコードするＤＮＡ二重鎖を形成する。
【０１１０】 次いで、１ナノモルのオリゴヌクレオチド二重鎖を、エンドヌクレアーゼＸｂ
ａＩおよびＢｇｌ ＩＩで予め制限した０．１ピコモルのｐＭｅｌＢａｃ ＸＰ
と混合する。ｐＭｅｌＢａｃ ＸＰは、ｐＭｅｌＢａｃ Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）由来の、合成ＴＭ遺伝子のクローニング
および昆虫細胞での続く発現のためのＤＮＡベクターである。分泌シグナルと複
数クローニング部位の配列（配列番号４２および４３）は：
【０１１１】
【化１】 である。
【０１１２】 次いで、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９に記載されているように、ベクターＤＮＡと合
成遺伝子フラグメントとの混合物を、１５分間３５℃まで加熱し、次いで１／１
０容量のＬｉｇａｔｉｏｎ Ｓｔｏｃｋ Ｂｕｆｆｅｒを加え、ＤＮＡリガーゼ
を添加し、そして反応混合物を１２時間１２℃でインキュベートして、オリゴヌ
クレオチドとベクターＤＮＡとの間のホスホジエステル結合を連結する。次に、
ＤＮＡを、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）によりコンピテン
トＥ．ｃｏｌｉ細胞のトランスフェクションに用いる。合成ＤＮＡのアセンブリ
およびクローニングがうまく行われているかを評価するために、プラスミドＤＮ
Ａを、これらの細胞から単離し、そして制限エンドヌクレアーゼ消化、またはＤ
ＮＡ配列決定により評価する。次いで、得られたプラスミド、ｐＴＭＣを、合成
ＴＭ配列の連続的付加のためのフレームワークとして使用する。
【０１１３】 （Ｄ１．１のアセンブリおよびＴＭ合成遺伝子への挿入） Ｃ２近位のＴＭ ＤＮＡのフラグメント（Ｄ１．１と称す）は、ＴＭのアミノ
酸９〜２０をコードする。Ｄ１．１のＤＮＡ配列および一次アミノ酸ペプチド配
列を、表Ｖならびに配列番号１０および２０に示す。Ｄ１．１は、ＴＭコアポリ
ペプチドの近位アミノ酸（残基１２〜２０）、およびこのＴＭコアをリーダーペ
プチド（ＴＭ合成に用いられる発現系に適切である）と結合する作用のある３つ
のアミノ酸の短いペプチドをコードする。方法１に記載したように、Ｄ１．１を
、オリゴヌクレオチド１．１および２．１（それぞれ、配列番号４８および５１
）のＤＮＡ二重鎖へのアニーリングにより作製する。オリゴヌクレオチド１．１
および２．１は、それぞれＢａｍＨＩ（またはＢｇｌ ＩＩ）およびＸｂａ Ｉ
の不対末端と適合性のある突出不対末端を有する。Ｄ１．１を、ｐＴＭＣについ
て方法１に記載したものと類似した様式で、複数のクローニング領域のＢａｍＨ
ＩおよびＸｂａ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位でアニーリングし、そしてＤＮ
Ａフラグメントを酵素学的に連結して、ベクターｐＴＭＤ１．１Ｃを形成する。
【０１１４】 （Ｌ３ΔのアセンブリおよびＴＭ合成遺伝子への挿入） Ｃ２遠位のＴＭ ＤＮＡのフラグメント（Ｌ３Δと称す）は、表ＩＩに示した
ＴＭのアミノ酸６６〜７０および９２〜１０１の連続的なポリペプチドをコード
する。Ｌ３のＤＮＡ配列およびペプチド配列を表ＶＩならびに配列番号１１およ
び２１に示す。方法１に記載したように、Ｌ３Δを、オリゴヌクレオチド９Ｌ３
Δおよび１０Ｌ３Δ（それぞれ配列番号６３および６４）をＤＮＡ二重鎖にアニ
ーリングすることにより生成して、約１４のアミノ酸をコードするＴＭコアＤＮ
Ａの遠位部分を生成する。オリゴヌクレオチド９Ｌ３Δおよび１０Ｌ３Δは、そ
れぞれＢｇｌ ＩＩおよびＥｃｏＲＩの不対末端と適合性のある突出不対末端を
有する。Ｌ３Δを、ｐＴＭＣについて方法１に記載したものと類似した様式で、
Ｂｇｌ ＩＩおよびＥｃｏＲＩの制限エンドヌクレアーゼ部位でベクターｐＴＭ
Ｄ１．１Ｃに連結して、そしてＤＮＡフラグメントを酵素学的に連結し、ベクタ
ーｐＴＭコアを形成する。
【０１１５】 ＴＭもまた、Ｌ３（以下に示す）をＬ３Δの代わりに用いることを除いて上記
のように合成され得る。ＴＭのような配列は、表Ｘおよび配列番号１３に提供さ
れる。
【０１１６】 （全長ＴＭポリペプチドをコードする合成遺伝子のアセンブリ） 全長ＴＭ遺伝子配列を、Ｄ１、Ｃ２、Ｌ３およびＴ４の組み合わせにより決定
し得る。全長ＴＭ遺伝子の一例（配列番号７）は、表ＩＩＩに列挙したオリゴヌ
クレオチド１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１
４、１５、および１６（それぞれ、配列番号４６、４７、５４〜５６、５８、６
０〜６２、７３〜７９）から生成する。Ｄ１、Ｃ２、Ｌ３およびＴ４を含む遺伝
子または保存的置換もしくは修飾でのみ相違するコード配列は、全長ＴＭ遺伝子
である。
【０１１７】 Ｄ１のアセンブリおよびＴＭ合成遺伝子への挿入。Ｃ２近位のＴＭ ＤＮＡの
フラグメント（Ｄ１と称す）は、ＴＭのアミノ酸−２〜２０をコードする。Ｄ１
のＤＮＡ配列とペプチド配列を表ＶＩと配列番号１５と２５に示す。Ｄ１は、Ｔ
Ｍコアポリペプチドの近位アミノ酸（残基１２〜２０）、およびリーダーペプチ
ド（ＴＭ合成に用いられる発現系に適切である）とＴＭコアを結合するのに役立
つ１３のアミノ酸のペプチドをコードする。Ｄ１を、オリゴヌクレオチド１と２
（表ＩＩＩ）をアニーリングすることにより生成する。オリゴヌクレオチド１と
２とは、それぞれＢａｍＨＩ（あるいはＢｇｌ ＩＩ）とＸｂａ Ｉの不対末端
と適合性のある突出不対末端を有する。Ｄ１を、ｐＴＭＣの方法１に記載したも
のと類似した様式で、複数のクローニング領域のＢａｍＨＩとＸｂａ Ｉ制限エ
ンドヌクレアーゼ部位でｐＴＭＣにアニーリングし、ＤＮＡフラグメントを酵素
学的に連結し、ベクターｐＴＭＤＣを形成する。
【０１１８】 Ｌ３のアセンブリおよびＴＭ合成遺伝子内への挿入。 Ｌ３と呼ばれる、Ｃ２
に対して遠位のＴＭ ＤＮＡのフラグメントは、ＴＭの６６〜１０１のアミノ酸
をコードする。Ｌ３のＤＮＡ配列およびペプチド配列は、表ＶＩＩ．Ａおよび配
列番号１４および２４に示される。約３５個のアミノ酸をコードするＴＭコアＤ
ＮＡの遠位部分を生成するために、オリゴヌクレオチド９、１０、１１、および
１２（それぞれ、配列番号６２、７３〜７５）（表ＩＩＩ）を、ＤＮＡ二重鎖に
アニーリングすることにより、Ｌ３を生成する。４個の個々のオリゴヌクレオチ
ドから構成される二本鎖ＤＮＡ複合体を形成するために、まずオリゴヌクレオチ
ド対の９および１０、ならびに１１および１２を一緒にアニーリングする。オリ
ゴヌクレオチド９および１２は、それぞれＢｇｌ ＩＩおよびＰｓｔ Ｉの不対
末端と適合する突出不対末端を有する。ベクターｐＴＭＤＣＬを形成するため、
ｐＴＭＣの方法１に記述したのと類似の様式で、Ｂｇｌ ＩＩおよびＰｓｔ Ｉ
制限エンドヌクレアーゼ部位でのベクターｐＴＭＤＣならびに酵素的に連結した
ＤＮＡフラグメント内にＬ３をアニーリングする。
【０１１９】 Ｔ４のアセンブリおよびＴＭ合成遺伝子内への挿入。Ｔ４と呼ばれるＬ３に対
して遠位のＴＭ ＤＮＡフラグメントは、ＴＭの１０２〜１４１のアミノ酸をコ
ードする。Ｌ４のＤＮＡ配列およびペプチド配列を、表ＶＩＩＩならびに配列番
号１２および２２に示す。約３６個のアミノ酸をコードする全長ＴＭ ＤＮＡの
遠位部分であるＤＮＡフラグメント内に、オリゴヌクレオチド１３、１４、１５
、および１６（それぞれ、配列番号７６〜７９）（表ＩＩＩ）をアニーリングす
ることにより、Ｌ３を生成する。オリゴヌクレオチド対の１３および１４、なら
びに１５および１６を、まず重複ＤＮＡ二重鎖内に対合させてアニーリングし、
そして続いて２本の二本鎖ＤＮＡを一緒にアニーリングして、４つの個々のオリ
ゴヌクレオチドから構成される二本鎖ＤＮＡ複合体を形成する。オリゴヌクレオ
チド１３および１６は、それぞれＰｓｔ ＩおよびＥｃｏＲＩの不対末端に適合
する突出不対末端を有する。ｐＴＭＣについて方法１で記述したのと類似の様式
で、Ｐｓｔ ＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位でベクターｐＴＭ
ＤＣＬにＴ４をアニーリングし、そしてＤＮＡフラグメントを酵素的に連結して
ベクターｐＴＭを形成する。
【０１２０】 改変ＴＭポリペプチドをコードする合成遺伝子のアセンブリ：表ＩＩＩに掲げ
た、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１
５、または１６（それぞれ、配列番号４６、４７、５４〜５６、５８、６０〜６
２、７３〜７９）に対する代替のオリゴヌクレオチドを使用することにより、全
長ＴＭまたはＴＭコアからペプチド配列を改変した、他のＴＭ遺伝子のバージョ
ンを合成し得る。これら代替のオリゴヌクレオチドは、部分ＴＭ遺伝子の合成の
間に使用し得るか、または制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡフラグメントを除去
し、そして元の配列を代替のコード配列に置換することより、アセンブリされた
ＴＭ遺伝子またはＴＭ遺伝子フラグメントのコード配列を置換し得るＤＮＡフラ
グメントを生成するために使用し得る。さらに、ＴＭと関連のないポリぺプチド
をコードするＤＮＡ配列を、種々の位置で、ＴＭコード配列に挿入し得る。
【０１２１】 非グリコシル化ＴＭポリペプチドをコードする合成遺伝子のアセンブリ。 １
つの実施例では、Ｃ２Δｇｌｙｃｏと呼ばれる新たなフラグメントを形成するた
めに、Ｃ２と、オリゴヌクレオチド５．１ｄｇおよび６．１ｄｇ（配列番号５７
および５９）（表ＩＩＩ）とをアセンブリする間に、オリゴヌクレオチド５およ
び６を置換する。このオリゴヌクレオチド置換によって、残基４８でコードされ
るアスパラギンがヒスチジンに変わるように、改変Ｃ２ ＤＮＡ配列を生じる。
オリゴヌクレオチド５．１ｄｇおよび６．１ｄｇを除いて、Ｃ２と同様な様式で
、Ｃ２Δｇｌｙｃｏを作製する。ＴＭコアおよび全長ＴＭ配列について記載した
ものと類似の様式で、種々のＴＭ配列の合成において、Ｃ２Δｇｌｙｃｏを使用
し得る。
【０１２２】 ＴＭポリヌクレオチドをコードする合成遺伝子と改変Ｌ３ドメインとのアセン
ブリ。 別の実施例では、ＴＭアミノ酸残基７１〜９１は、３アミノ酸ペプチド
：ｓｅｒ−ａｓｐ−ｉｌｅで置換される。この実験例では、オリゴヌクレオチド
９．２Δ３および１０．２Δ３（配列番号６７および６８）（表ＩＩＩ）を、ま
ずＤＮＡ二重鎖内にアニーリングし、続いてＢｇｌ ＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限
エンドヌクレアーゼ部位でベクターｐＴＭＤＣ内にアニーリングする。次いで、
アニーリングされたＤＮＡフラグメントは、酵素的に連結されて、ベクターｐＴ
ＭＬΔ３を形成する。
【０１２３】 ＴＭポリペプチドをコードする合成遺伝子と置換したシステイン残基６８との
アセンブリ。 他の実施例では、オリゴヌクレオチド対９．３Δ３ｓｅｒおよび
１０．３Δ３ｓｅｒ（配列番号６９および７０）または９．３Δ３ｖａｌおよび
１０．３Δ３ｖａｌ（配列番号７１および７２）を、ＤＮＡ二重鎖内にアニーリ
ングし、そして酵素ＣｌａＩで消化し、続いて制限酵素ＣｌａＩおよびＰｓｔ
Ｉで消化されているｐＴＭＬΔ３内にアニーリングする。これら２個のオリゴヌ
クレオチド対は、ｐＴＭ１Δ３内に挿入した場合、位置６８のシステインがそれ
ぞれセリンまたはバリンで置換されたＴＭΔ３分子を生じる。
【０１２４】 ＴＭポリペプチドをコードする合成遺伝子と置換されたシステイン残基１４と
のアセンブリ。 別の実施例では、オリゴヌクレオチド対１．２ｓｅｒおよび２
．２ｓｅｒ（配列番号５０および５１）または１．２ｖａｌおよび２．２ｖａｌ
（配列番号５２および５３）をアニーリングし、システイン残基１４がそれぞれ
セリンまたはバリンで置換されているＤ１に対する代替のドメインを生成し得る
。次いで、これらオリゴヌクレオチド対を、Ｄ１について上述したのと同じ様式
で、多重クローニング領域のＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ
部位でｐＴＭＣ内にアニーリングし、そしてそのＤＮＡフラグメントを酵素的に
連結して、ベクターｐＴＭＤ１Ｃに対する代替を形成する。
【０１２５】 内膜保持シグナル（ｅｎｄｏｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇ
ｎａｌ）を含む、ＴＭコアポリペプチドをコードする合成遺伝子のアセンブリ。
【０１２６】 さらなる実施例では、ＴＭコアは、カルボキシ末端アミノ酸残基として、内膜
保持シグナルＫＤＥＬ（配列番号４４）とともに合成される。この実施例では、
オリゴヌクレオチド９Ｌ３ΔＫＤＥＬおよび１０Ｌ３ΔＫＤＥＬ（配列番号６５
および６６）で、上述のＴＭコア合成時にオリゴヌクレオチド９Ｌ３Δおよび１
０Ｌ３Δを置換して、ベクターｐＴＭＬΔ３ＫＤＥＬを形成する。
【０１２７】 内膜保持シグナルを含む、全長ＴＭポリペプチドをコードする合成遺伝子のア
センブリ。 別の実施例では、ＴＭはカルボキシ末端アミノ酸残基として、内膜
保持シグナルＫＤＥＬ（配列番号４４）で合成される。この実施例では、Ｔ４の
合成について上述したように、オリゴヌクレオチド１５ＫＤＥＬおよび１６ＫＤ
ＥＬ（配列番号８０および８１）でオリゴヌクレオチド１５および１６を置換す
る。これら２個のオリゴヌクレオチドの置換により、コード配列Ｔ４ＫＤＥＬが
形成されるが、これはｐＴＭの上述の合成で、Ｔ４に置換する場合には、ベクタ
ーｐＴＭＫＤＥＬを形成する。
【０１２８】 さらなるアミノ末端配列を含む、ＴＭポリペプチドをコードする合成遺伝子の
アセンブリ。 ある実施例では、ＴＭ遺伝子は、アミノ末端ドメインの一部とし
て含まれる残基５８５〜６００（ＡＩＱＤＰＲＬＦＡＥＥＫＡＶＡＤ；配列番号
４５）からのポリ免疫グロブリンレセプター配列とともに合成される。オリゴヌ
クレオチドＰ１およびＰ２（配列番号８２および８３）は、このポリ免疫グロブ
リンレセプター配列とＤ１のアミノ酸残基をコードする。Ｐ１およびＰ２は、そ
れぞれＢａｍＨＩおよびＸｂａＩの不対末端と適合する突出不対末端を有する。
上述のように、ＴＭ発現ベクターの合成において、Ｄ１．１またはＤ１の代わり
に使用し得るＤＮＡ二重鎖内にオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２をアニーリン
グする。
【０１２９】 ＴＭ成分が別のペプチドドメイン（ＴｐＳ２）により置換されているＴＭポリ
ペプチドをコードする合成遺伝子のアセンブリ。 この実施例では、ＴＭ遺伝子
は、ＴＭドメイン４、５、および６を置換するペプチドとともに合成される。Ｔ
ｐＳ２と称するこのペプチドは、ドメイン２の末端残基と三葉型（ｔｒｅｆｏｉ
ｌ）ペプチドｐＳ２（Ｓｕｅｍｏｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．８８：１１０１７−１１０２１，１９９１に報告されている）のコード配列
との間のエンテロキナーゼ切断可能なペプチドをコードする。ＤＮＡ配列および
ＴｐＳ２のペプチド配列は、表ＸＩならびに配列番号１６および２６に示されて
いる。ＴｐＳ２は、オリゴヌクレオチドＴｐ１、Ｔｐ２、Ｔｐ３、Ｔｐ４、Ｔｐ
５、およびＴｐ６（それぞれ、配列番号８４〜８９）（表ＩＩＩ）を、約６４個
のアミノ酸をコードするＤＮＡフラグメント内にアニーリングすることにより生
成する。オリゴヌクレオチド対Ｔｐ１およびＴｐ２、Ｔｐ３およびＴｐ４、なら
びにＴｐ５およびＴｐ６を、まず重複ＤＮＡ二重鎖内に対合させてアニーリング
し、続いて２つの二重鎖ＤＮＡを一緒にアニーリングして、６個の個々のオリゴ
ヌクレオチドから構成される二重鎖ＤＮＡ複合体を形成する。オリゴヌクレオチ
ドＴｐ１およびＴｐ６は、それぞれＰｓｔ ＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の不対
末端と適合する、突出不対末端を有する。ｐＴＭＣについて方法１で記述してい
るのと類似の様式で、Ｐｓｔ ＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位
でのベクターｐＴＭＤＣＬにＴｐＳ２をアニーリングし、そしてそのＤＮＡフラ
グメントを酵素学的に連結して、ベクターｐＴＭｐＳｐ２を形成し、これは、三
葉型ペプチドｐＳ２がＴＭドメイン４、５、および６の置換として含まれる、Ｔ
Ｍをコードする。
【０１３０】 Ｄ．ヒトＪ鎖をコードするｃＤＮＡの単離および発現 ヒトＪ鎖メッセンジャーＲＮＡの５’末端に相補的な合成ＤＮＡを使用して、
２つのヒト小腸ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；カタログ番号ＨＬ１１３３ａおよびｄＨＬ
１１３３ｂ）をスクリーニングする。標準反応におけるポリヌクレオチドキナー
ゼを使用して、プローブを［32Ｐ］で標識する。製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
によって記述されているように、ライブラリースクリーニングを行う。Ｃｈｕｒ
ｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１：１９９１−１９９５，１９８４に従って、ハイブリダイゼーションを行な
う。オートラジオグラフィー後、陽性プラークを単離し、そしてファージを１０
分間煮沸することによって破壊する。標準ＰＣＲ緩衝液、ヒトＪ鎖ｃＤＮＡの５
’および３’末端に相補的なプライマーの２５ｐｍｏｌｅ、各ｄＮＴＰの２００
μＭ、およびＴａｑポリメラーゼの１．０単位を含む総容量５０μＬ中で、ｃＤ
ＮＡ挿入をＰＣＲにより増幅する。３５サイクルの増幅の前に、９４℃、３分間
でＤＮＡを変性する。各サイクルは、９４℃で１分間、６２℃で１分間、および
７２℃で１分間からなっていた。ＰＣＲフラグメントを、ｐＵＣ１９内にクロー
ン化して、配列決定する。次いで、全長ｃＤＮＡ挿入物を、２つのＰＣＲプライ
マー内に配置された制限部位を利用して適切な昆虫発現ベクター（ｐＭｅｌＢａ
ｃＸＰ）内にサブクローン化する。
【０１３１】 （表ＩＩ） （代表的な全長ＴＭ分子のＤＮＡ配列および一次アミノ酸構造）
【０１３２】
【表２】 （表ＩＩＩ） （代表的な部分ＴＭ遺伝子の構築のためのオリゴヌクレオチド）
【０１３３】
【表３】 （表ＩＶ） （ＴＭのドメインＣ２のペプチドおよびＤＮＡ配列（ＴＭ ａａ残基１９〜
６５））
【０１３４】
【表４】 （表Ｖ） （ＴＭのドメインＤ１．１のＤＮＡ配列および一次アミノ酸構造（ＴＭ ａ
ａ残基９〜２０））
【０１３５】
【表５】 （表ＶＩ） （ＴＭのドメインＤ１のＤＮＡ配列および一次アミノ酸構造（ＴＭ ａａ残
基２−２０））
【０１３６】
【表６】 （表ＶＩＩ） （ＴＭのドメインＬ３ΔのペプチドおよびＤＮＡ配列（ＴＭ ａａ残基６６
−７０および９２−１０１））
【０１３７】
【表７】 （表ＶＩＩ．Ａ） （ＴＭのドメインＬ３のペプチドおよびＤＮＡ配列（ＴＭ ａａ残基６６〜
１０１））
【０１３８】
【表７Ａ】 （表ＶＩＩＩ） （Ｔ４フラグメントのＤＮＡおよび一次アミノ酸配列（ＴＭ ａａ残基１０
２〜１４１））
【０１３９】
【表８】 （表ＩＸ） （代表的なＴＭコアエレメントのＤＮＡ配列および一次アミノ酸配列）
【０１４０】
【表９】 （表Ｘ） （代表的なＴＭのＤＮＡ配列および一次アミノ酸構造）
【０１４１】
【表１０】 （表ＸＩ） （ＴｐＳ２のＤＮＡおよび一次アミノ酸配列）
【０１４２】
【表１１】 （実施例２） （生物学的薬剤のＴＭへの連結） この実施例は、代表的な生物学的薬剤のＴＭへの結合の例示する。
【０１４３】 （Ａ．ＴＭに結合した機能遺伝子の調製） ＴＭ−ポリリジン結合体の調製：上記の生物学的供給源から単離したＴＭを、
Ｆｅｒｋｏｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２３９４−２４００，１
９９３によって記載されるように、ヘテロ二官能架橋試薬のＮ−スクシンイミジ
ル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）を使用して、ポリ
（Ｌ−リジン）（Ｍｒ ２０，０００Ｄ）に共有結合する。ＳＰＤＰ還元後に、
ＴＭを１５倍モル過剰のポリ（Ｌ−リジン）およびＳＰＤＰとともにインキュベ
ートし、反応を、２℃で２４時間行なう。結合体を透析して、低分子量反応産物
を除去し、そして０．１％ ＳＤＳ−７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法を使用して、生成したタンパク質を分離することによって分析する。
【０１４４】 遺伝子およびプラスミド調製。ｐＲＩＣＩＮプラスミド（改変ｐＢＲ３２２ベ
クターに挿入したＲｏｕｓ肉腫ウイルス長末端反復プロモーターに連結したｒｉ
ｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（Ｓｈｉｒｅら、Ｇｅｎｅ ９３：１８３−１８
８，１９９０）由来のリシン遺伝子を含有する）を、致死性遺伝的機能のＮＰＥ
細胞への導入のために使用する。そのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α中で
増殖させ、標準的な技法により抽出しそして精製する。制限エンドヌクレアーゼ
でプラスミドを消化することによって、適切なフラグメントを生じ、１．０％ア
ガロース ゲル電気泳動法により、純度を確証する。
【０１４５】 ＴＭ−ポリリジン−ＤＮＡ複合体の調製：３Ｍ ＮａＣｌで、プラスミドＤＮ
ＡとＴＭ−ポリリジンを組み合わせることにより、複合体を形成する。リジンに
対するＤＮＡリン酸塩の荷電比は、約１．２：１である。サンプルを、２２℃で
６０分間インキュベートし、次いで３，５００ダルトン分子量限度の膜を通して
、０．１５Ｍ ＮａＣｌに対して、１６時間、透析する。１５μｍ孔径のＭｉｌ
ｌｉｐｏｒｅフィルターにより複合体をろ過して、使用前まで４℃に維持する。
最終ＴＭ複合体を、ＴＭ−ｐＲＩＣＩＮと称する。
【０１４６】 ＤＮＡの割合に対する至適結合体の測定：ＤＮＡに対する結合体の最適な比率
を決定するために、ＰＲＳＶＺ１０μｇに結合体の漸増量を添加することにより
、１：４、１：８、１：１６および１：３２のキャリア（ＴＭ）に対するＤＮＡ
のモル比とする。上述のようにサンプルをインキュベートし、０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌに対して、一晩、透析する。使用前、複合体をろ過する。１．０％アガロー
スゲル電気泳動法により、等量のＤＮＡ（１μｇ）を含むサンプルを分離し、臭
化エチジウムで染色する。ニトロセルロースフィルター上にプラスミドＤＮＡを
移し、そしてＤＮＡプローブとして、ＰＲＳＶＺの２．３−ｋＢのＥｃｏＲＩフ
ラグメントを使用して、サザンブロットハイブリダイゼーション法により分析す
る。
【０１４７】 （Ｂ．致死性薬剤に対する種々のリンカーを用いたＴＭの調製） ペプチドリンカーのｆｍｏｃ合成の一般的方法：反応は、一般に、０．２ｍｍ
ｏｌのスケールで行い、そして前述の手順に従う（Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ａ
．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、１９８４
；Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌ
ｉｎ、１９８８）。カップリング反応をカルボキシ末端でｐ−アルコキシベンジ
ルアルコール樹脂（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−樹脂、Ｐｅｎｉｎｓ
ｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）製品＃ＦＭ０５８
ＡＡＲ、０．２〜０．５ｍｅｑ／ｇ）に固定化した保護アミノ酸（アミノ酸＃１
）を使用して開始する。一級アミンの保護基は、９−フルオレニルメチルオキシ
カルボニル基、ｆｍｏｃを含む。Ｒ基保護（例えば、トリチル、ｔ−ブチル、ブ
トキシカルボニル、アセトアミドメチル、エチルチオ）は、Ｒ基の性質に依存す
る。反応は、二元二方コックを取付けた燒結ガラスフィルター（例えば、Ｋｉｍ
ａｘ＃２８４００−３０１）を含む漏斗で行う。まず、アミノ酸＃１上のｆｍｏ
ｃ保護基を、２０％ピペリジンのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、室温で１
５分間インキュベーションして除去する。次に、ピペリジンを過剰量のＤＭＦで
洗浄する。最小ＤＭＦ（約１ｍｌ）に溶解したｆｍｏｃ保護アミノ酸＃２（１
ｍｍｏｌ）を樹脂に加えた後、最小ＤＭＦに溶かした１ ｍｍｏｌヒドロキシベ
ンゾトリアゾールもまた添加する。カップリングは、１ ｍｍｏｌジイソプロピ
ルカルボジイミドを加えて開始する。反応を室温で穏やかに振とうしながら１時
間進行させる。次に、樹脂を過剰量のＤＭＦで洗浄し、全ての試薬を除去する。
反応効率を標準ニンヒドリンアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ製品＃２１２０５）を使用
してモニターする。次に、所望の配列を含む各アミノ酸の付加のために、この手
順を繰り返す（すなわち、脱保護、洗浄、カップリング、洗浄）。最終ペプチド
は、水およびスカベンジャー（例えば、トリイソプロイルシラン（ｔｒｉｉｓｏ
ｐｒｏｙｌｓｉｌａｎｅ）、エタンジチオール、チオアニソール、ブロモトリメ
チルシラン）を含む９５％ＴＦＡ中、室温で１〜３時間インキュベートすること
により樹脂から取り出す。この手順は、同様に全Ｒ基保護を取り除く。ＴＦＡ溶
液から、４容量のジエチルエーテルを加えることによりペプチドを沈殿させ、こ
のペプチドペレットをＤＭＦに再溶解し、そして逆相液体クロマトグラフィーに
より精製する。
【０１４８】 切断しやすいペプチドおよびｐＨ−感受性ヒドラジドリンカーを介してＴＭに
付着した致死性薬剤：３−デアミノ−３−（４−モルホリニル）−ドキソルビシ
ン（ＭＲＡ）を、Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅｓ， ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ４：
９９−１０６、１９９１に記載されるように、ジアルデヒドを介して反応させた
後、シアノボロヒドレートナトリウムと反応させてドキソルビシン（Ａｌｄｒｉ
ｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から調製する。ＭＲＡは、シ
リカゲルカラムによる分離後、精製し、次の手順によりペプチドスペーサーで修
飾する。まず、ペプチドＰＬＧＩＩＧＧ（配列番号９２）をエステル化し、相当
するメチルエステルを得る。次に、ペプチドのアミノ末端を無水コハク酸と縮合
させた後、エステル末端をヒドラジン水和物と反応させてモノヒドラジドを得る
。次に、この活性化ペプチドのヒドラジド部分をＭＲＡのＣ−１３カルボニル基
を介して反応させ、ＭＲＡ−ＰＬＧＩＩＧＧ（配列番号９２）を得、これを分離
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により精製する。精製した薬物−リンカー中
間体をコハク酸末端でジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と反応させる。この活性化化合物を再度ＴＬ
Ｃにより精製した後、２０倍過剰量のＭＲＡ−ＰＬＧＩＩＧＧ（配列番号９２）
を精製ＴＭにｐＨ ８で３時間加えることにより、ＴＭのリジン残基に結合させ
る。この調製で使用したＴＭを上述のように、生物供給源から単離する。この結
合体をＴＭ（ｂｉｏ）−ＭＲＡと称する。
【０１４９】 結合反応混合物を遠心分離して、沈殿物質を除去し、５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム、０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−
５０カラムに適用する。ＴＭ（ｂｉｏ）−ＭＲＡ結合体を含む画分をプールし、
４℃で保存する。薬物対ＴＭの比率を、それぞれ９．９ ｍＭ-1ｃｍ-1および１
３ ｍＭ-1ｃｍ-1の吸光係数を用い、２８０および４８０ ｎｍにおいて分光光
度測定法により測定する。結合体をＤｕｐｏｎｔ ＧＦ−２５０ゲルろ過カラム
におけるＨＰＬＣおよび非還元条件下の７．５％アクリルアミドゲルにおけるＮ
ａＤｏｄＳＯ4／ＰＡＧＥにより分析する。
【０１５０】 ＴＭに結合した致死性酵素。サポリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ
）を、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰを製造業者のプロトコル（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃ
ｋｆｏｒｄ，ＩＬ）にしたがって使用して、ＴＭに共有結合させる。そのサポリ
ンをまず、上記のようにＳＰＤＰと反応させ、次いでサポリン−ＳＰＤＰを還元
し、そしてＴＭと反応させる。最終生成物を、上記のように精製し、そしてＴＭ
−ＳＡＰと称する。
【０１５１】 切断しやすいペプチドおよびｐＨ感受性ヒドラジドリンカーを介して二量体Ｉ
ｇＡに結合した致死性薬剤。上述のように調製した活性化薬物リンカー化合物を
、精製ｄＩｇＡに２０倍過剰量のＭＲＡ−ＰＬＧＩＩＧＧ（配列番号９２）をｐ
Ｈ ８で３時間添加することにより、二量体ＩｇＡのリジン残基にカップリング
させる。この調製に使用したｄＩｇＡは、上述のように、生物供給源から単離す
る。この結合体をｄＩｇＡ−ＭＲＡと称する。
【０１５２】 結合反応混合物を、沈殿した物質を除去するために遠心分離し、そして５０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−５０のカラムにアプライする。ｄＩｇＡ−ＰＬＧＩＩＧＧ（配
列番号９２）結合体を含む画分をプールし、そして４℃にて保存する。薬物対ｄ
ＩｇＡ比を、それぞれ９．９ｍＭ-1ｃｍ-1および１３ｍＭ-1ｃｍ-1の吸光係数を
使用して、２８０ｎｍおよび４８０ｎｍでの分光測定法によって決定する。結合
体を、Ｄｕｐｏｎｔ ＧＦ−２５０ゲル濾過カラムでのＨＰＬＣによって、およ
び非還元条件下での７．５％アクリルアミドゲルでのＮａＤｏｄＳＯ4／ＰＡＧ Ｅによって分析する。
【０１５３】 小胞体における残留について標的化された致死剤。３−デアミノ−３−（４−
モルホリニル）−ドキソルビシン（ＭＲＡ）を、ジアルデヒドを介する反応、続
いてＭｕｅｌｌｅｒら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，
ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ４：９９〜１０６、１
９９１によって記載されるようなシアノボロハイドレートナトリウムとの反応に
よって、ドキソルビシン（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から調
製する。ＭＲＡを、シリカゲルカラムでの分離後に精製し、そして以下の手順に
よってペプチドスペーサーで修飾する。第１に、ペプチドＰＬＧＩＩＧＧ（配列
番号９２）をエステル化し、対応するメチルエステルを生成する。続いて、エス
テル末端をヒドラジンハイドレートと反応させ、モノヒドラジドを生成する。次
いで、この活性化されたペプチドのヒドラジド部分を、ＭＲＡのＣ−１３カルボ
ニル基を介して反応させ、ＭＲＡ−ＰＬＧＩＩＧＧ（配列番号９２）を生成し、
これを、分離用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって精製する。精製され
た薬物−リンカー中間体を、ＳＰＤＰとアミノ末端で反応させる。この活性化さ
れた化合物を、再度ＴＬＣによって精製し、次いで２０倍過剰のＭＲＡ−ＰＬＧ
ＩＩＧＧ（配列番号９２）を精製されたＴＭにｐＨ８にて３時間添加することに
よって、コアＴＭのスルフヒドリル基に結合させる。この調製において使用する
ＴＭを、トランスジェニック昆虫細胞から単離する。ＥＲ残留シグナルＫＤＥＬ
を、上記のホスホラミダイトオリゴヌクレオチド結合によってＴＭコアタンパク
質の部分として合成し、そして昆虫発現ベクターに連結し、ｐＴＭを作製する。
この結合体をＴＭ（ＫＤＥＬ）−ＭＲＡと呼ぶ。
【０１５４】 結合反応混合物を、沈殿した物質を除去するために遠心分離し、そして５０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−５０のカラムにアプライする。ＴＭ（ＫＤＥＬ）−ＭＲＡ結合
体を含む画分をプールし、そして４℃にて保存する。薬物対ＴＭ比を、それぞれ
９．９ｍＭ-1ｃｍ-1および１３ｍＭ-1ｃｍ-1の吸光係数を使用して、２８０ｎｍ
および４８０ｎｍでの分光測定法によって決定する。結合体を、Ｄｕｐｏｎｔ
ＧＦ−２５０ゲル濾過カラムでのＨＰＬＣによって、および非還元条件下での７
．５％アクリルアミドゲルでのＮａＤｏｄＳＯ4／ＰＡＧＥによって分析する。
【０１５５】 抗原結合部位に連結される致死剤。第１に、リンカーペプチドＰＬＧＩＩＧＧ
（配列番号９２）を、上記のようにヒドラジドを介してＭＲＡに結合する。しか
し、この手順において、無水コハク酸工程を除外し、遊離のアミノ末端を含むペ
プチド−ＭＲＡを生成する。精製された薬物−リンカー中間体を、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド（ＤＣＣ）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ
）、および２０倍過剰のジケトン１とアミノ末端で反応させる（Ｗａｇｎｅｒら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１７９７〜１８００、１９９５）。１，３−ジケト
ン１を、Ｗａｇｎｅｒらにおいて記載されるように合成する。
【０１５６】 ジケトン−ペプチド−ＭＲＡ結合体を、ＴＭに共有結合するように操作された
抗体３８Ｃ２（Ｗａｇｎｅｒら）の抗原結合部位と反応させる。ＴＭ−３８Ｃ２
を生成するための操作手順は、本質的に、実施例２Ｃにおいて先に記載されると
おりである。３８Ｃ２抗体を産生する細胞株由来のｍＲＮＡを、確立された手順
によって単離する。特定のリンカーを、上記のような別々の増幅反応において、
Ｆｖ−Ｃγ１切片およびκ鎖全体の増幅を生じるポリメラーゼ連鎖反応を開始す
るために使用する。
【０１５７】 重鎖および軽鎖の定常領域を介するジスルフィド架橋によって結合された、得
られる重鎖（Ｆｖ−ＣH１）−ＴＭ：κハイブリッド抗体を、上記のように精製 する。
【０１５８】 ハイブリッド抗体のジケトン−ペプチド−ＭＲＡとの反応は、ジケトン部分と
、結合ポケット中のリジン残基のεアミノ基との間の安定なビニル性アミド結合
を生じる。最終化合物を、ＴＭ（３８Ｃ２）−ＭＲＡと呼ぶ。
【０１５９】 （実施例３ 生物学的薬剤の細胞内および臨床的送達） 本実施例は、生物学的薬剤の上皮細胞への送達について、実施例２に記載され
るように調製されたＴＭの使用を例示する。
【０１６０】 （Ａ．細胞および培養物） 培養培地。以下のストック溶液を組み合わせ、培養溶液（ＭＤＣＫ培地という
）を作製する。２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓとともにイーグル平衡化塩溶液を含む、最
小必須培地（ＭＥＭ）、５００ｍＬ；１００×Ｌ−グルタミン、２．５ｍＬ；１
００×非必須アミノ酸、５．４ｍＬ；ウシ胎仔血清、２７ｍＬ；ペニシリン−ス
トレプトマイシン、５．５ｍＬ；１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、２２０μＬ。
すべてのストック溶液を、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄから購
入する。
【０１６１】 上皮細胞単層からのＮＰＥ細胞培養物の調製。基底外側（ｂａｓａｌａｔｅｒ
ａｌ）ドメインも先端ドメインも含まない、非接着性上皮細胞の実験的調製のた
めに、培養皿を、アガロースの層でコートした。５ｍｌの１％アガロース（溶解
させ、そして約５０℃まで冷却させた）を、７５ｃｍ2組織培養フラスコに注ぎ 、そして凝固させた。７５ｃｍ2フラスコ中で増殖するコンフルエントなＭＤＣ Ｋ細胞、ＨＥＣ１Ａ細胞、またはＨＴ−２９細胞を、滅菌ＰＢＳで２回、続いて
２ｍｌのトリプシン溶液で洗浄した。細胞を、３７℃にて１０分間インキュベー
トする。９ｍｌの予め温めた培養培地を、回旋させながらフラスコに添加し、細
胞を懸濁させた。細胞を、滅菌５０ｍｌのコニカルチューブに移し、そして３０
０×ｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを、２０ｍｌ
の新鮮な培養培地中に再懸濁させた。２ｍｌの細胞懸濁液、続いてさらなる１０
ｍｌの予め温めた培地を、アガロースをコートしたフラスコに添加した。フラス
コを、５％ ＣＯ2中で３７℃にてインキュベートした。細胞は、少なくとも１ 週間、生存可能である。
【０１６２】 ヒト胸膜液からのＮＰＥ細胞の調製。胸膜液を、悪性胸水に関して診断された
患者から得た。その液中に含まれる細胞を、胸膜腔からの取り出し後にできるだ
けすぐに、低スピードの遠心分離によって得た。細胞ペレットを、ＭＤＣＫ培養
培地中に再懸濁させた。この細胞を、ＭＰＥと呼ぶ。
【０１６３】 細胞生存率アッセイ。生細胞を、非蛍光性細胞透過可能性のカルセインＡＭの
、強度に蛍光性のカルセインへの酵素学的転換によって決定される、偏在性細胞
内エステラーゼ活性の存在によって識別する。試薬（キット＃Ｌ３２２４）を、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得た
。細胞を、低スピードの遠心分離によって収集し、そして滅菌ＰＢＳで３回洗浄
した。細胞を、製造業者によって提供される指示書に従って、溶液中で染色した
。カルセインを産生する細胞の割合によって表される細胞生存率を、蛍光顕微鏡
によって評価した。
【０１６４】 ＮＰＥ細胞をテキサスレッドで標識した二量体ＩｇＡで標識すること。精製さ
れた二量体ＩｇＡ（１〜５ｍｇ）を、０．１Ｍのカルボン酸／重炭酸ナトリウム
、ｐＨ９．０中で冷却した。５０マイクロリットルのテキサスレッドスルホニル
クロリド（１ｍｇ、５０μｌの無水アセトニトリル中に溶解）をタンパク質溶液
に添加した。反応物を、２５℃にて１時間インキュベートする。反応物を、脱塩
カラムに通し、結合していない色素を除去した。脱塩されたｄＩｇＡの吸光度比
（５２０ｎｍ／２８０ｎｍ）は、０．８であった。
【０１６５】 細胞を、低スピードの遠心分離によって収集し、そして１ｍｌの細胞培養培地
中に再懸濁させた。細胞を４℃まで冷却した。細胞懸濁液の２００マイクロリッ
トルアリコートを、冷却した１．５ｍｌのチューブに置いた。１０マイクロリッ
トルのテキサスレッド−ｄＩｇＡ結合体を、各チューブに添加し；４℃にて一晩
、振盪させながら結合を進行させた。１ｍｌの冷却した細胞培養培地を添加し、
そして細胞を、遠心分離および５０ｍｌの培地中への再懸濁によって回収した。
テキサスレッド−ｄＩｇＡへの結合を、蛍光顕微鏡によって可視化させた。
【０１６６】 （Ｂ．ＴＭ−ポリリジンを使用する、ＮＰＥ細胞への遺伝子の送達） ＮＰＥ細胞へのＴＭ−ｐＲＩＣＩＮ送達。トランスフェクションの４日前、細
胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄する。細胞の半分をＲＰＭＩ １６４０培
地に戻し、そして残りの半分をＬｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ１５培地、グルコース欠
損培地中で増殖させる。ヒトγインターフェロン（１００Ｕ／ｍｌ）を、トラン
スフェクションの２日前に、グルコース欠損培地中で増殖させた細胞の半分に添
加する。ＮＰＥ細胞を無グルコース培地に移すことによって、ヒトγインターフ
ェロンでの処理と同様に、ｐＩｇＲの発現が増加する。細胞密度は、トランスフ
ェクションの時点で、１プレートあたり約５×１０4細胞である。増殖培地を変 え、そして細胞をＰＢＳで洗浄する。ＴＭ−ｐＲＩＣＩＮ複合体（１０、２０、
４０、または８０ｐｍｏｌのＴＭに非共有結合した、２．５ｐｍｏｌのＤＮＡ）
、ポリリジン−ＤＮＡ複合体（１．２ｎｍｏｌのポリリジンと複合体化された２
．５ｐｍｏｌのＤＮＡ）、ＴＭ−ポリリジン（８０ｐｍｏｌ）単独、または２．
５ｐｍｏｌ（２０μｇ）ＤＮＡ単独を含む溶液を、個々のプレートに添加する。
各サンプルを、細胞のトランスフェクション前に濾過する。細胞を、インビトロ
またはインサイチュのいずれかで３７℃にて４８時間インキュベートした後、生
存率アッセイを行う。
【０１６７】 ＴＭ−ｐＲＩＣＩＮでトランスフェクトしたすべてのＮＰＥ細胞（ＭＤＣＫ、
ＨＴ−２９、ＨＥＣ−１Ａ，ＭＰＥ）は、生存率アッセイおよび蛍光顕微鏡分析
によって判断される場合、顕著に減少したカルセインの産生を示す。生存率は、
ＴＭ−ポリリジン−ＤＮＡ処理の結果として、１０％未満であると評価される。
細胞をまた、テキサスレッド−ｄＩｇＡとともにインキュベートする。生存率の
減少した（緑色蛍光を有さない）細胞は、ｄＩｇＡ結合に起因して、不変に赤色
蛍光であり、このことは、細胞殺傷が細胞傷害性剤のＴＭ送達に起因することを
示す。
【０１６８】 （Ｃ．リンカーでＴＭに結合した致死剤の送達） ＴＭに連結した致死剤のＮＰＥ細胞への送達。上記のように調製したＮＰＥ細
胞（ＭＤＣＫ、ＨＴ−２９、ＨＥＣ−１Ａ、ＭＰＥ；１ｍｌ培養培地中、２×１
０6細胞）を、ＴＭ（ｂｉｏ）−ＭＲＡ（培養培地中１ｍｇ／ｍｌの１００μｌ ）とともに、３７℃にて２〜１２時間、インキュベートする。次いで、細胞を、
低スピードの遠心分離によってペレットにし、培養培地中に再懸濁し、そして３
７℃にてさらに１２〜４８時間インキュベートする。次いで、細胞を、上記のよ
うに生存率およびテキサスレッド−ＩｇＡ取り込みについてアッセイする。
【０１６９】 ＴＭ（ｂｉｏ）−ＭＲＡとともにインキュベートしたすべてのＮＰＥ細胞（Ｍ
ＤＣＫ、ＨＴ−２９、ＨＥＣ−１Ａ、ＭＰＥ）は、生存率アッセイおよび蛍光顕
微鏡分析によって判断される場合、カルセインの顕著に減少した産生を示す。生
存率は、ＴＭ（ｂｉｏ）−ＭＲＡ曝露の結果として、１０％未満であると見積も
られる。減少した生存率を有する（緑色蛍光を有さない）細胞は、ｄＩｇＡ結合
に起因して不変に赤色蛍光であり、このことは、細胞殺傷が細胞傷害性剤のＴＭ
送達に起因することを示す。
【０１７０】 ＴＭに連結された致死酵素のＮＰＥ細胞への送達。上記のように調製したＮＰ
Ｅ細胞（ＭＤＣＫ、ＨＴ−２９、ＨＥＣ−１Ａ、ＭＰＥ；１ｍｌ培養培地中、２
×１０6細胞）を、ＴＭ−ＳＡＰ（培養培地中１ｍｇ／ｍｌの１００μｌ）とと もに、３７℃にて２〜１２時間インキュベートする。次いで、細胞を、低スピー
ドの遠心分離によってペレットにし、培養培地中に再懸濁し、そして３７℃にて
さらに１２〜４８時間インキュベートする。次いで、細胞を、上記のように生存
率およびテキサスレッド−ＩｇＡ取り込みについてアッセイする。
【０１７１】 ＴＭ−ＳＡＰとともにインキュベートしたすべてのＮＰＥ細胞（ＭＤＣＫ、Ｈ
Ｔ−２９、ＨＥＣ−１Ａ、ＭＰＥ）は、生存率アッセイおよび蛍光顕微鏡分析に
よって判断される場合、カルセインの顕著に減少した産生を示す。生存率は、Ｔ
Ｍ−ＳＡＰ曝露の結果として、１０％未満であると見積もられる。減少した生存
率を有する（緑色蛍光を有さない）細胞は、ｄＩｇＡ結合に起因して不変に赤色
蛍光であり、細胞殺傷が細胞傷害性剤のＴＭ送達に起因することを示す。
【０１７２】 二量体ＩｇＡに連結した殺傷剤のＮＰＥ細胞への送達。上記のように調製した
ＮＰＥ細胞（ＭＤＣＫ、ＨＴ−２９、ＨＥＣ−１Ａ、ＭＰＥ；１ｍｌ培養培地中
、２×１０6細胞）を、ｄＩｇＡ−ＭＲＡ（培養培地中１ｍｇ／ｍｌの１００μ ｌ）とともに、３７℃にて２〜１２時間インキュベートする。次いで、細胞を、
低スピードの遠心分離によってペレットにし、培養培地中に再懸濁し、そして３
７℃にてさらに１２〜４８時間インキュベートする。次いで、細胞を、上記のよ
うに生存率およびテキサスレッド−ＩｇＡ取り込みについてアッセイする。
【０１７３】 ｄＩｇＡ−ＭＲＡとともにインキュベートしたすべてのＮＰＥ細胞（ＭＤＣＫ
、ＨＴ−２９、ＨＥＣ−１Ａ、ＭＰＥ）は、生存率アッセイおよび蛍光顕微鏡分
析によって判断される場合、カルセインの顕著に減少した産生を示す。生存率は
、ｄＩｇＡ−ＭＲＡ曝露の結果として、１０％未満であると見積もられる。減少
した生存率を有する（緑色蛍光を有さない）細胞は、ｄＩｇＡ結合に起因して不
変に赤色蛍光であり、このことは、細胞殺傷が細胞傷害性剤のＴＭ送達に起因す
ることを示す。
【０１７４】 小胞体における残留について標的化された殺傷剤のＮＰＥ細胞への送達。上記
のように調製したＮＰＥ細胞（ＭＤＣＫ、ＨＴ−２９、ＨＥＣ−１Ａ、ＭＰＥ；
１ｍｌ培養培地中、２×１０6細胞）を、ＴＭ（ＫＤＥＬ）−ＭＲＡ（培養培地 中１ｍｇ／ｍｌの１００μｌ）とともに、３７℃にて２〜１２時間インキュベー
トする。次いで、細胞を、低スピードの遠心分離によってペレットにし、培養培
地中に再懸濁し、そして３７℃にてさらに１２〜４８時間インキュベートする。
次いで、細胞を、上記のように生存率およびテキサスレッド−ＩｇＡ取り込みに
ついてアッセイする。
【０１７５】 ＴＭ（ＫＤＥＬ）−ＭＲＡとともにインキュベートしたすべてのＮＰＥ細胞（
ＭＤＣＫ、ＨＴ−２９、ＨＥＣ−１Ａ、ＭＰＥ）は、生存率アッセイおよび蛍光
顕微鏡分析によって判断される場合、カルセインの顕著に減少した産生を示す。
生存率は、ＴＭ（ＫＤＥＬ）−ＭＲＡ曝露の結果として、１０％未満であると見
積もられる。減少した生存率を有する（緑色蛍光を有さない）細胞は、ｄＩｇＡ
結合に起因して不変に赤色蛍光であり、このことは、細胞殺傷が細胞傷害性剤の
ＴＭ送達に起因することを示す。
【０１７６】 ハイブリッド抗体の抗原結合部位に連結された殺傷剤のＮＰＥ細胞への送達。
上記のように調製したＮＰＥ細胞（ＭＤＣＫ、ＨＴ−２９、ＨＥＣ−１Ａ、ＭＰ
Ｅ；１ｍｌ培養培地中、２×１０6細胞）を、ＴＭ（３８Ｃ２）−ＭＲＡ（培養 培地中１ｍｇ／ｍｌの１００μｌ）とともに、３７℃にて２〜１２時間インキュ
ベートする。次いで、細胞を、低スピードの遠心分離によってペレットにし、培
養培地中に再懸濁し、そして３７℃にてさらに１２〜４８時間インキュベートす
る。次いで、細胞を、上記のように生存率およびテキサスレッド−ＩｇＡ取り込
みについてアッセイする。
【０１７７】 ＴＭ（３８Ｃ２）−ＭＲＡとともにインキュベートしたすべてのＮＰＥ細胞（
ＭＤＣＫ、ＨＴ−２９、ＨＥＣ−１Ａ、ＭＰＥ）は、生存率アッセイおよび蛍光
顕微鏡分析によって判断される場合、カルセインの顕著に減少した産生を示す。
生存率は、ＴＭ（３８Ｃ２）−ＭＲＡ曝露の結果として、１０％未満であると見
積もられる。減少した生存率を有する（緑色蛍光を有さない）細胞は、ｄＩｇＡ
結合に起因して不変に赤色蛍光であり、このことは、細胞殺傷が細胞傷害性剤の
ＴＭ送達に起因することを示す。
【０１７８】 ＴＭに連結された殺傷剤の臨床的使用。悪性胸水は、通常、広範な転移に関与
する疾患である。悪性胸水の８０パーセントは、上皮細胞由来である。悪性胸水
を有する患者は、臨床的に、呼吸の短さおよび胸の重さを示し；胸膜液は、頻繁
にＮＰＥ細胞を夾雑する。患者の最初の診断は、胸膜液の蓄積（通常は、片側）
を示す、胸部Ｘ線による。診断は、吸引された液の細胞学的試験（胸腔穿刺）、
または胸膜生検の組織学的試験によって確認される。胸膜液から得られるＮＰＥ
細胞を、ＴＭに連結された致死剤に対するそれらの感受性について、上記のよう
に評価する。
【０１７９】 ＴＭに連結された致死剤を利用する処置プロトコルは、ＮＰＥ細胞殺傷を最適
化することが意図される。胸膜腔を覆う中皮細胞は、ＴＭ結合体によって影響を
及ぼされない。なぜなら、それらは、ＴＭ取り込みについてレセプターを含まな
いからである。薬物を、上記のように調製されるペプチドリンカーＰＬＧＩＩＧ
Ｇ（配列番号９２）を介してＴＭに連結する。１００μｇ〜１ｇの薬物結合体を
、針吸引によって胸水容量の５０％を除去した後に胸膜内に注射する。ポリエチ
レンカテーテルを有するかまたは有さない＃１６ゲージ針を、２％リドカインで
の局所麻酔の後に、後腋窩線（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｘｃｉｌｌａｒｙ ｌｉ
ｎｅ）に沿って肋間アクセスによって胸膜腔に置く。胸水の半分（約１リットル
）を、減圧吸引によって除去し、その後、所定の用量の薬物結合体を、１０〜５
０ｃｃの滅菌生理食塩水の希釈容量で注射する。その後、患者を、下側位置、頭
側位置、ならびに右側位置、および左側位置に動かし、分布を増強する。選択し
た間隔で、胸膜液を吸引し、細胞生存率を決定する。この手順を、効力指数およ
び毒性に対する患者の耐性によって決定される間隔で反復する。臨床的効力を、
患者の症状の観察、内科学的兆候、体重、および連続胸部Ｘ線によって評価する
。胸水の再蓄積または分解の速度の決定を、連続Ｘ線によって決定する。細胞生
存率を用いて、生体染色および免疫学的技術を利用する細胞学的効力を決定し、
細胞機能を評価する。
【０１８０】 記載されるようにＴＭ（ｂｉｏ）−ＭＲＡで処置された患者は、１ヶ月後に、
胸膜腔を占めるＮＰＥ細胞における顕著な減少を示す。
【０１８１】 前述から、本発明の特定の実施態様が例示の目的で本明細書中に記載されてい
るが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得る
ことが理解される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ヒト（最上行）（配列番号１）、マウス（第２行）（配列番号２）、
ウサギ（第３行）（配列番号３）、ウシ（第４行）（配列番号４）、ウシガエル
（第５行）（配列番号５）、およびミミズ（第６行）（配列番号６）について報
告されているネイティブなＪ鎖配列の比較である。各非ヒト配列について、ヒト
配列におけるアミノ酸残基に同一であるアミノ酸残基は、ダッシュ（−）によっ
て示される。ヒト配列と異なる残基は、標準的な１文字略語を使用して示される
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/42 Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00 31/12 31/12 35/00 35/00 Ａ６１Ｋ 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハイアット， アンドリュー シー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92103, サン ディエゴ， トランス ストリー ト 660 (72)発明者 フィッチェン， ジョン エイチ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92037, ラ ホヤ， ラ ホヤ ビレッジ ドラ イブ 3874 Ｆターム(参考） 4C076 AA16 CC04 CC27 CC35 DD24 EE41A EE59 FF34 4C084 AA02 AA17 BA03 CA25 DC02 DC22 NA14 ZB112 ZB262 ZB332 4C086 AA01 AA02 AA03 EA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB11 ZB26 ZB33

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１つの生物学的薬剤に連結される標的化分子であ
    って、ここで該標的化分子が： （ａ）閉環された共有結合ループを形成し；そして （ｂ）βシート特徴を有する、少なくとも３つのペプチドドメインを含む、 ポリペプチドを含み、該ドメインの各々が、βシート特徴を欠損するドメインに
    よって分離され；その結果、該生物学的薬剤が、非分極化上皮細胞に入り得、そ
    して殺傷し得る、標的化分子。
  2. 【請求項２】 前記生物学的薬剤が、酵素、結合薬剤、インヒビター、核酸
    、炭水化物および脂質からなる群から選択される、請求項１に記載の少なくとも
    １つの生物学的薬剤に連結される標的化分子。
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の少なくとも１つの生物学的薬剤に
    連結される標的化分子を含む薬学的組成物であって、薬学的に受容可能なキャリ
    アと組み合わされる、薬学的組成物。
  4. 【請求項４】 非分極化上皮細胞に関連した疾患に罹患した患者を処理する
    ための方法であって、請求項３に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を包
    含する、方法。
  5. 【請求項５】 前記患者が、癌、ウイルス感染および炎症性障害からなる群
    から選択される疾患に罹患する、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記癌が、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌
    および子宮内膜症からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 非分極化上皮細胞に関連する疾患の患者における発生を阻害
    するための方法であって、請求項３に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程
    を包含する、方法。
  8. 【請求項８】 前記疾患が、癌、ウイルス感染および炎症性障害からなる群
    から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 生物学的薬剤が非分極化上皮細胞に入り得、そして殺傷し得
    るように少なくとも１つの該生物学的薬剤に連結される標的化分子であって、こ
    こで該標的化分子が： （ａ）閉環された共有結合ループを形成し；そして （ｂ）βシート特徴を有する少なくとも３つのペプチドドメインを含む、 ポリぺプチドを含み、該ドメインの各々が、βシート特徴を欠損するドメインに
    よって分離され；ここで該標的化分子が、非分極化上皮細胞と会合されるか、ま
    たはこれから分泌される細胞内または細胞外の酵素の基質によって、少なくとも
    １つの生物学的薬剤に連結される、標的化分子。
  10. 【請求項１０】 前記酵素が、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、ホスホリパ
    ーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素およびヌクレアーゼからなる群から選択され
    る、請求項９に記載の少なくとも１つの生物学的薬剤に連結される標的化分子。
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