JP2008535475A - Ｑ３ｓｐａｒｃ欠失変異体及びその使用 - Google Patents

Abstract

【要約書】
本発明は、ヒトＳＰＡＲＣタンパク質の成熟形態中の３番目のグルタミンの欠失に対応する変異を有するＳＰＡＲＣポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする核酸、このようなポリペプチドに対する抗体、ならびにこのようなポリペプチド、核酸および抗体の使用方法を提供する。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、本明細書中でその全体が参照により組み込まれる、２００５年２月１８日に出願された米国仮特許出願番号６０／６５４，２６１の利益を主張する。

発明の分野
本発明は、抗体又はＳＰＡＲＣを認識する他の適切なリガンドを使用して、組織および器官において、癌、異常な増殖性、過形成性、再構築性及び炎症性の活性が関与する他の疾患を治療するための方法に関する。本発明はまた、変異体ＳＰＡＲＣポリペプチド及び核酸並びにそれらの使用方法、並びに標的化の方法、画像化の方法、及び抗ＳＰＡＲＣ治療に対する哺乳動物腫瘍の応答を決定するための方法に関する。

発明の背景
酸性でシステインに富んだ分泌タンパク質（オステオネクチン、ＢＭ４０又はＳＰＡＲＣとしても知られる）（本明細書中、以後「ＳＰＡＲＣ」）は、細胞形状の変化を惹起するマトリックス結合タンパク質であり、細胞周期の進行を阻害し、細胞外マトリックスの合成に影響を与える（Ｂｒａｄｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：６０４５−６０５０（２００３））。マウスＳＰＡＲＣ遺伝子が１９８６年にクローニングされ（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１４６５−１４７２（１９８６））、全長ヒトＳＰＡＲＣ ｃＤＮＡは１９８７年にクローニングされ配列決定された（Ｓｗａｒｏｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２：３７−４７（１９８８））。ＳＰＡＲＣ発現は、発生的に調節され、正常な発生の間又は損傷に応答して再構築を受けている組織において優勢に発現される。例えば、高レベルのＳＰＡＲＣタンパク質が、発生中の骨及び歯において発現される（例えば、Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，８，１６３ １７３（１９９４）；Ｙａｎ ＆ Ｓａｇｅ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４７：１４９５−１５０５（１９９９）を参照のこと）。

ＳＰＡＲＣは、数種の悪性度の高い癌でアップレギュレートされるが、対応する正常（ｉｎｏｒｍａｌ）組織には存在しない（Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，４３，７９１（１９９５））。ＳＰＡＲＣ発現は、種々の腫瘍（例えば、膀胱、肝臓、卵巣、腎臓、腸及び乳房）で誘導される。例えば、膀胱癌において、ＳＰＡＲＣ発現は進行した癌腫に関連している。病期Ｔ２以上の浸潤性膀胱腫瘍は、病期Ｔ１の膀胱腫瘍（又はそれより低い病期の表在性腫瘍）と比較してより高レベルのＳＰＡＲＣを発現し、予後が悪いことが示されている（例えば、Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６６，２４９５ ２４９９（２００１）を参照のこと）。髄膜腫において、ＳＰＡＲＣ発現は、浸潤性腫瘍のみと関連している（例えば、Ｒｅｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５，２３７ ２４１（１９９９）を参照のこと）。ＳＰＡＲＣ発現はまた、ｉｎ ｓｉｔｕ浸潤性乳癌病変の７４．５％で検出され（例えば、Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４６，９５ １００（１９９５）を参照のこと）、乳房の浸潤性乳管癌の５４．２％で検出されている（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，１３，６５２ ６５７（１９９８）を参照のこと）。ＳＰＡＲＣ発現はまた、乳癌における頻繁な微小石灰化と関連しており（例えば、Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照のこと）、このことは、ＳＰＡＲＣ発現が乳房転移の骨への親和性を担っている可能性があることを示唆している。

驚くべきことに、ＳＰＡＲＣは、ある系では抗腫瘍活性を有することも示されている。ＳＰＡＲＣは、Ｇ_１中期で細胞を停止させる強力な細胞周期インヒビターであり（Ｙａｎ ＆ Ｓａｇｅ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４７：１４９５−１５０５（１９９９））、ＳＰＡＲＣの誘導性の発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系において乳癌細胞の増殖を阻害することが示されている（Ｄｈａｎｅｓｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．７５：７３−８５（２００２））。同様に、外因性ＳＰＡＲＣは、ＨＯＳＥ（ヒト卵巣表面上皮）細胞及び卵巣癌細胞の両方の増殖を、濃度依存的様式で低下させることができる。さらに、ＳＰＡＲＣは、卵巣癌細胞においてアポトーシスを誘導する。ＳＰＡＲＣレセプターが卵巣上皮細胞のような細胞上に存在することを示すさらなる証拠が報告されている。ＳＰＡＲＣのそのレセプターへの結合は、その腫瘍抑制機能を媒介する組織特異的シグナル伝達経路を始動させる可能性が高いと提唱されている（Ｙｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９：６０９−６２２（２００１））。ｉｎ ｖｉｖｏ異種移植片モデル系において、精製されたＳＰＡＲＣが、血管形成を強力に阻害し、神経芽細胞腫の増殖を顕著に減じることもまた報告されている（Ｃｈｌｅｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：７３５７−７３６３（２００２））。

ＳＰＡＲＣは、非腫瘍性の増殖性疾患においても役割を果たす。メサンギウム細胞の増殖は、多くの糸球体疾患に特有の特徴であり、しばしば細胞外マトリックスの増大及び糸球体硬化症に先行する。実験的メサンギウム増殖性糸球体腎炎のモデルにおいて、ＳＰＡＲＣ ｍＲＮＡは、７日目までに５倍増大し、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってメサンギウム中で同定された。しかし、組換えＳＰＡＲＣ又は合成ＳＰＡＲＣペプチドは、血小板由来増殖因子によって誘導されるメサンギウム細胞のＤＮＡ合成をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害した（Ｐｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８（４）：１１５３−６７（１９９６））。同様に、過形成、肥大及び細胞間マトリックスの増大に起因する腎臓の拡張は、ヒトにおける糖尿病に特有の特徴であるが、腎臓のＳＰＡＲＣ ｍＲＮＡレベルは糖尿病の動物では低下した。さらに、糖尿病関連の腎肥大の発症は、ＳＰＡＲＣのｍＲＮＡ及びタンパク質の減少と関連している（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４８（４）：１２１６−２５（１９９５））。

ＳＰＡＲＣは、アテローム硬化症病変の発病に関与している。血漿ＳＰＡＲＣレベルは、冠動脈疾患を有する患者において上昇する（Ｍａｓａｈｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｂｅｓｉｔｙ Ｒｅｓ．９：３８８−３９３（２００１））。動脈内膜中の血管平滑筋細胞の増殖は、アテローム硬化症の発病において中心的役割を果たす。ＳＰＡＲＣは、アテローム硬化症病変に関連する血管平滑筋細胞及びマクロファージにおいて発現される。さらに、ＳＰＡＲＣは、血管損傷の間に血小板由来増殖因子の作用を調節すると仮説が立てられている（Ｍａｓａｈｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｂｅｓｉｔｙ Ｒｅｓ．９：３８８−３９３（２００１）；Ｒａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１２８１−１２８５（１９９２））。内皮ＰＡＩ−１産生に対するＳＰＡＲＣの刺激効果が血管損傷の部位で報告されており（Ｈａｓｓｅｌａａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１３１７８−１３１８４（１９９１））、アテローム硬化症を加速すると仮定されている（Ｍａｓａｈｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｂｅｓｉｔｙ Ｒｅｓ．９：３８８−３９３（２００１））。

ＳＰＡＲＣは、カチオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋）、増殖因子（例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質（例えば、ＩＶ型コラーゲン及びＩＸ型コラーゲン、ビトロネクチン並びにトロンボスポンジン１）、内皮細胞、血小板、アルブミン及びヒドロキシアパタイトを含む広範な種々のリガンドに対する親和性を有する（例えば、Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，８，１６３ １７３（１９９４）；Ｙａｎ ＆ Ｓａｇｅ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４７：１４９５−１５０５（１９９９）を参照のこと）。ＳＰＡＲＣは、アルブミンに結合することも知られている（例えば、Ｓｃｈｎｉｔｚｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，６０７２（１９９４）を参照のこと）。

抗体治療は、特異的なタンパク質マーカーを同定できる疾患を制御するための有効な方法である。例としては、Ａｖａｓｔｉｎ（抗ＶＥＧＦ抗体）、Ｒｉｔｕｘａｎ（抗ＣＤ２０抗体）及びＲｅｍｉｃａｄｅ（抗ＴＮＦ抗体）が挙げられる。このように、ＳＰＡＲＣに対する抗体は、ＳＰＡＲＣタンパク質を発現する、ヒト及び他の哺乳動物の腫瘍又は他の増殖性、過形成性、再構築性及び炎症性の障害を治療するための重要な治療剤を提示する。

従って、新規形態のＳＰＡＲＣ及びこのような新規形態のＳＰＡＲＣと反応性の抗体が必要とされる。本発明は、このような新規ＳＰＡＲＣポリペプチド、このような新規ＳＰＡＲＣポリペプチドをコードする核酸、並びにこのような新規ＳＰＡＲＣポリペプチド及び核酸の使用方法を提供する。本発明はさらに、ＳＰＡＲＣポリペプチドに対する抗体を提供する。

発明の要旨
配列番号１（プロセシングされていない１次翻訳産物の配列）中のアミノ酸２０に対応するグルタミンは、成熟タンパク質（１７アミノ酸のＳＰＡＲＣリーダー配列を有さないポリペプチド）中のアミノ酸位置３のグルタミン（「Ｑ３」グルタミン）に対応する。本発明は、配列番号１中のアミノ酸２０に対応するグルタミンが欠失したアミノ酸配列を含む、単離されたＳＰＡＲＣポリペプチド（本明細書中、以後「Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド」）を提供する。特に、本発明は、単離されたヒトＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを提供する。本発明はまた、単離されたＳＰＡＲＣポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、成熟Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドに対応する配列番号２のアミノ酸配列を含む。本発明はさらに、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。特に、本発明は、ヒトＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明が包含する単離された核酸としては、配列番号３の配列を含む核酸が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明はまた、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを提供し、このようなベクターとしては、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を制御するプロモーターをさらに含むベクターが挙げられるが、これに限定されない。さらに、本発明は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする核酸分子を含む細胞を提供し、この細胞は、原核細胞又は真核細胞のいずれかである。本発明はさらに、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを製造する方法を提供し、この方法は以下を含む：（ａ）Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする核酸で細胞を形質転換すること；（ｂ）形質転換された細胞によるＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドの発現を誘導すること、及び（ｃ）Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを精製すること。

別の実施形態において、本発明は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド又はＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする核酸及び医薬上許容される担体を含む組成物、並びにＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド及び担体を投与することを含む疾患を治療する方法を提供する。このような方法は、細胞増殖性疾患である疾患（例えば、癌、良性腫瘍、アテローム硬化症、血管再狭窄）が含まれるがこれらに限定されない疾患を治療するために、本発明に従って使用され得る。本発明はまた、細胞増殖性疾患である疾患（例えば、癌、良性腫瘍、アテローム硬化症、血管再狭窄）を含む疾患を感作する方法を提供し、この方法は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを投与することを含む。さらに、本発明は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを含む組成物を提供し、このポリペプチドは、治療剤又は診断剤（例えば、放射性同位体若しくは放射性核種、薬物、ポリペプチド又は毒素など）にカップリングまたはコンジュゲート化されている。或いは、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドは、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで安定化する分子（例えばポリエチレングリコールなど）にカップリングまたはコンジュゲート化され得る。Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド又はＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする核酸及び医薬上許容される担体は、任意の適切な経路（静脈内、腹腔内、腫瘍内又は吸入が挙げられるがこれらに限定されない）を介して投与できる。

１実施形態において、本発明は、ＳＰＡＲＣポリペプチド（特にＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド）を認識する抗体又はそのフラグメント及び医薬上許容される担体を提供する。ＳＰＡＲＣポリペプチドを認識するこのような抗体は、例えば、補体活性化及び／又は腫瘍若しくは他の増殖性障害に対する細胞媒介性細胞傷害性を媒介するために、本発明に従って使用され得る。

なお別の実施形態において、本発明は、ＳＰＡＲＣポリペプチド（特にＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド）を認識する抗体又はそのフラグメントにカップリングされた治療剤、及び医薬上許容される担体を含む組成物を提供する（この抗体又はそのフラグメントはヒト化されており、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、ｓｃｆｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）又はキメラを含むもの（本明細書中で、以後集合的に「抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体抗体」）が挙げられるが、これらに限定されない）。本発明に従って調製される抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得、非ヒト動物で製造され得、ヒト化され得る。さらに、本発明は、治療剤にカップリング又はコンジュゲート化された抗ＳＰＡＲＣ抗体（特に抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体抗体）を提供し、この治療剤は、化学療法剤、放射性核種又はペプチドである。適切な治療剤には、生物学的分子（例えば、ｔＴＦ及びＴＮＦなど）である治療剤も含まれる。

Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド又は抗ＳＰＡＲＣ抗体（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体抗体など）及び医薬上許容される担体は、任意の適切な経路（静脈内、腹腔内、腫瘍内又は吸入が挙げられるがこれらに限定されない）を介して投与され得る。従って、本発明は、哺乳動物において疾患部位（例えば腫瘍など）に治療剤を送達するための方法を提供し、この方法は、治療上有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含み、ここでこの治療剤は、医薬上許容される担体にカップリングされた化学療法剤又は放射性剤及び医薬上許容される担体を含む。本発明に従って治療できる適切な腫瘍には、ヒト又は非ヒト動物の膀胱、肝臓、卵巣、腎臓、腸、脳又は乳房に位置する腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明はさらに、哺乳動物において疾患部位（例えば腫瘍など）に診断剤を送達するための方法を提供し、この方法は、診断上有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。このような適切な組成物には、抗ＳＰＡＲＣ抗体（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体抗体など）にカップリングされた診断剤及び医薬上許容される担体を含む組成物が挙げられるが、これに限定されない。適切な診断剤には、放射性剤、ＭＲＩ造影剤、Ｘ線造影剤、超音波造影剤及びＰＥＴ造影剤が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明は、配列番号１中のアミノ酸位置２０に対応するグルタミンの欠失を有するＳＰＡＲＣポリペプチドを検出すること（即ち、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを検出すること）を含む、疾患（細胞増殖によって特徴付けられる疾患（例えば、癌、良性腫瘍、アテローム硬化症、血管再狭窄など）が挙げられるがこれらに限定されない）を分類する方法を提供する。適切な疾患としては、血管新生が生じる疾患もまた挙げられるがそれらに限定されない。このように、本発明は、ＳＰＡＲＣポリペプチドを検出する方法をさらに提供し、ここで検出されたポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含む。

本発明はさらに、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする核酸を検出することを含む、疾患を分類する方法を提供し、この核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。さらに、本発明は、核酸を検出することを含む疾患を分類する方法を提供し、検出された核酸は、配列番号３の核酸配列を含む。

発明の詳細な説明
ヒトＳＰＡＲＣ遺伝子は３０３アミノ酸のＳＰＡＲＣタンパク質をコードしているが、成熟ＳＰＡＲＣは２８５アミノ酸の糖タンパク質である。シグナル配列の切断後、３２ｋＤの分泌形態が産生され、これはグリコシル化に起因してＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で４３ｋＤに移動する。結晶学的データは、ＳＰＡＲＣタンパク質が３つのモジュラードメインを有することを示している。Ｎ末端ドメインは酸性であり、カルシウムに結合する。中央の「フォリスタチン様ドメイン」は、血管形成及び接着斑形成の阻害に関与するアミノ酸並びに（Ｋ）ＧＨＫ血管形成ペプチドを含む。カルボキシル末端の「Ｅ−Ｃドメイン」は、高親和性のカルシウム結合及び細胞伝播の阻害に関与するアミノ酸を含む（Ｙａｎ ＆ Ｓａｇｅ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．７：１４９５−１５０５，１９９９）。

Ｎ末端のＳＰＡＲＣドメイン（１７アミノ酸のシグナル配列の後の残基１〜５２）は、アスパラギン酸及びグルタミン酸に富んだ酸性領域である。このＮ末端ドメインは、低い親和性でいくつかのカルシウムイオンに結合し、ヒドロキシアパタイトと相互作用し、骨石灰化において役割を果たすと仮説が立てられている。このＮ末端ＳＰＡＲＣドメインは、細胞伝播及び走化性を阻害することもまた示されている（Ｙａｎ ＆ Ｓａｇｅ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４７：１４９５−１５０５（１９９９））。さらに、このＮ末端ドメインは、ＳＰＡＲＣの主要な免疫学的エピトープを含む。しかし、このドメインはＳＰＡＲＣ様タンパク質のファミリー間で多様な配列であり、ＳＰＡＲＣに対する抗体がＳＰＡＲＣ様タンパク質と交差反応することもＳＰＡＲＣ様タンパク質を認識することも見出されていない（Ｙａｎ ＆ Ｓａｇｅ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．７：１４９５−１５０５，１９９９）。

成熟ＳＰＡＲＣタンパク質中のアミノ酸位置３および４にある、Ｎ末端ドメイン内の２つの隣接グルタミン（プロセシングされていないタンパク質中のアミノ酸位置２０及び２１）は、トランスグルタミナーゼによる架橋の主な標的であるアミンアクセプター部位である（グルタミンは、１文字アミノ酸コードで「Ｑ」で示され、従って、これらのアミノ酸は、成熟ＳＰＡＲＣタンパク質中の「Ｑ３」および「Ｑ４」アミノ酸である）。トランスグルタミナーゼは、ペプチド結合したグルタミン残基のγ−カルボキサミド基と種々の１級アミンとの間のＣａ依存的な転移反応を触媒する。組織特異的な翻訳後修飾（例えばトランスグルタミナーゼ架橋）は、ＳＰＡＲＣの生物学的機能のいくつかを調節し得ることが提唱されている（Ｈｏｈｅｎａｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２３４１５−２３４２０（１９９５））。

本発明は、配列番号１中のアミノ酸２０に対応するグルタミンが欠失したアミノ酸配列を含む単離されたＳＰＡＲＣポリペプチド（Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド）を提供する。特に、本発明は、単離されたヒトＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを提供する。本発明はまた、単離されたＳＰＡＲＣポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、成熟Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド（１７アミノ酸のＳＰＡＲＣリーダー配列を有さないポリペプチド）に対応する、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

本発明はさらに、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。特に、本発明は、ヒトＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明が包含する単離された核酸分子には、配列番号３の配列を含む核酸が挙げられるが、これに限定されない。従って、本発明は、単離されたＳＰＡＲＣポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、配列番号３のＤＮＡ配列のヌクレオチド８７から９９２までの翻訳に対応し、全長Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド（１７アミノ酸のＳＰＡＲＣリーダー配列を有するポリペプチド）を生じる、配列番号４のアミノ酸配列を含む。また従って、本発明は、配列番号４および配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをそれぞれコードする、配列番号５および配列番号６のＤＮＡ配列を有する単離された核酸を提供する。配列番号６のＤＮＡ配列は、配列番号３のヌクレオチド１３８〜９９２に相当する。

本発明は、配列番号１中のアミノ酸２０に対応するグルタミンが欠失したアミノ酸配列を含む単離されたＳＰＡＲＣポリペプチドを提供する。従って、本発明は、単離されたＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも約１５アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約３０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約４０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約５０アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも約１００アミノ酸長である。さらに、本発明は、配列番号１中のアミノ酸２０に対応するグルタミン以外の配列が、配列番号１の対応する配列に対して少なくとも約８０％相同、好ましくは配列番号１の対応する配列に対して少なくとも約９０％相同、なおより好ましくは配列番号１の対応する配列に対して少なくとも約９５％相同、なおより好ましくは配列番号１の対応する配列に対して少なくとも約９９％相同であるポリペプチドを含む、単離されたＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを提供する。「配列番号１の対応する配列」とは、配列番号１の配列とアラインする配列であって、アラインメントの領域が少なくとも約１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも約１５アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約３０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約４０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約５０アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも約１００アミノ酸長である配列を意味する。種々の配列アラインメント法がバイオテクノロジーの分野で公知である（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ６：２７８（２００５）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２７２（２０）：５１０１−５１０９（２００５）を参照のこと）。

本発明はまた、単離されたＳＰＡＲＣポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、これには、アミノ末端またはカルボキシル末端にさらなるアミノ酸が付加されていない配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに少なくともさらに約１アミノ酸、好ましくは少なくともさらに約５アミノ酸、好ましくは少なくともさらに約１０アミノ酸、より好ましくは少なくともさらに約１５アミノ酸、より好ましくは少なくともさらに約２０アミノ酸、より好ましくは少なくともさらに約３０アミノ酸、より好ましくは少なくともさらに約４０アミノ酸、なおより好ましくは少なくともさらに約５０アミノ酸が、配列番号２のアミノ末端および／またはカルボキシ末端に付加した、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。

本発明はさらに、アミノ酸配列中に保存的置換が生じたＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを提供し、これには、置換されたアミノ酸が天然および／または非天然のアミノ酸を含むものが含まれる。保存的置換が意味するものを例示するために、群Ａ〜Ｆを以下に列挙する。以下の群の１つのメンバーの、同じ群の別のメンバーによる置換が、保存的置換とみなされる。

群Ａには、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、システイン、スレオニンならびに以下の側鎖：エチル、イソ−ブチル、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨＯＨＣＨ_３およびＣＨ_２ＳＣＨ_３、を有する修飾アミノ酸が含まれる。

群Ｂには、グリシン、アラニン、バリン、セリン、システイン、スレオニンおよびエチル側鎖を有する修飾アミノ酸が含まれる。

群Ｃには、フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、トリプトファン、シクロヘキシルメチル、および置換されたベンジル側鎖もしくはフェニル側鎖を有する修飾アミノ残基が含まれる。

群Ｄには、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸またはアスパラギン酸の置換または非置換の脂肪族、芳香族またはベンジルエステル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、シクロヘキシル、ベンジルまたは置換ベンジル）、グルタミン、アスパラギン、ＣＯ−ＮＨ−アルキル化グルタミンまたはアスパラギン（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピルおよびイソ−プロピル）、および側鎖−（ＣＨ_２）_３ＣＯＯＨを有する修飾アミノ酸、それらのエステル（置換または非置換の脂肪族、芳香族またはベンジルエステル）、それらのアミド、およびそれらの置換または非置換のＮ−アルキル化アミドが含まれる。

群Ｅには、ヒスチジン、リジン、アルギニン、Ｎ−ニトロアルギニン、ｐ−シクロアルギニン、ｇ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリン、２−アミノグアニジノブタン酸、リジンのホモログ、アルギニンのホモログおよびオルニチンが含まれる。

群Ｆには、セリン、スレオニン、システイン、および−ＯＨまたは−ＳＨで置換されたＣ１〜Ｃ５の直鎖または分枝鎖アルキル側鎖を有する修飾アミノ酸が含まれる。

群Ａ〜Ｆは例示であり、本発明を限定することを意図しない。

さらに、本発明は、配列番号１の配列中に、約１〜約５アミノ酸、好ましくは約１〜約３アミノ酸、より好ましくは１アミノ酸の、１つ以上のアミノ酸挿入または欠失を有する、単離されたＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを提供する。

本発明はさらに、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。適切な単離された核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド−核酸が挙げられるがこれらに限定されない。本発明が包含する単離された核酸には、配列番号３の５’側もしくは３’側にさらなるヌクレオチドを有さないか、または配列番号３の５’末端および／または３’末端に、少なくともさらに約１ヌクレオチド、好ましくは少なくともさらに約３ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約９ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、なおより好ましくは少なくとも約１，０００ヌクレオチドが付加した、配列番号３の配列を含む核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供し、その核酸配列は、配列番号３の対応する配列に対して少なくとも約８０％相同、好ましくは配列番号３の対応する配列に対して少なくとも約９０％相同、なおより好ましくは配列番号３の対応する配列に対して少なくとも約９５％相同、なおより好ましくは配列番号３の対応する配列に対して少なくとも約９９％相同である。「配列番号３の対応する配列」とは、配列番号３の配列とアラインする配列であって、アラインメントの領域が少なくとも約３０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約４５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約９０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、なおより好ましくは少なくとも約３００ヌクレオチド長である配列を意味する。種々の配列アラインメント法がバイオテクノロジーの分野で公知である（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ６：２７８（２００５）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２７２（２０）：５１０１−５１０９（２００５）を参照のこと）。

さらに、本発明は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供し、この単離された核酸分子は、低いストリンジェンシーの条件下で、好ましくは中程度にストリンジェントな条件下で、なおより好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号３にハイブリダイズする。「高いストリンジェンシーの条件」は、好ましくは、核酸配列の約２５％〜約５％のミスマッチ、より好ましくは約１５％〜約５％のミスマッチ、最も好ましくは約１０％〜約５％のミスマッチを許容する。「中程度にストリンジェントな条件」は、好ましくは、核酸配列の約４０％〜約１５％のミスマッチ、より好ましくは約３０％〜約１５％のミスマッチ、最も好ましくは約２０％〜約１５％のミスマッチを許容する。「低いストリンジェンシーの条件」は、好ましくは、核酸配列の約６０％〜約３５％のミスマッチ、より好ましくは約５０％〜約３５％のミスマッチ、最も好ましくは約４０％〜約３５％のミスマッチを許容する。

非特異的結合が存在しないことは、部分的な程度の相補性（例えば、約３０％未満の同一性）さえ欠く第２の標的の使用によって試験され得る；非特異的結合が存在しない場合、プローブは第２の非相補的標的とハイブリダイズしないであろう。部分的な相同性または完全な相同性（即ち同一性）が存在し得る。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する配列である。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、低いストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して試験され得る。「実質的に相同な」配列またはプローブは、低いストリンジェンシーの条件下で、標的に対する完全に相補的な配列の結合（即ちハイブリダイゼーション）と競合し、これを阻害しよう。これは、低いストリンジェンシーの条件が、非特異的結合を許容するような条件であることを示しているわけではない；低いストリンジェンシーの条件は、２つの配列の互いに対する結合が特異的（即ち選択的）相互作用であることを必要とする。用語「相同性」とは、ある程度の相補性をいう。

例示的な中程度のストリンジェンシーの条件としては、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｍｇ／ｍｌ 変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での３７℃で一晩のインキュベーション、その後の１×ＳＳＣ中で約３７〜５０℃での洗浄、或いは実質的に類似の条件（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１），ｐｐ．６．１−６．６２に記載される中程度にストリンジェントな条件）が挙げられる。高いストリンジェンシーの条件は、例えば以下のような条件である：（１）０．０１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、ならびに０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む組成物を５０℃で用いるなど、洗浄のために低いイオン強度および高い温度を使用する、（２）０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を７５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび７５ｍＭクエン酸ナトリウムと共に含む、ホルムアミド（例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド）を含む組成物などの変性剤を、ハイブリダイゼーションの間、４２℃で使用する、あるいは（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液および超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、ならびに１０％硫酸デキストランを含む組成物を４２℃で使用し、（ｉ）０．２×ＳＳＣ中で４２℃、（ｉｉ）５０％ホルムアミド中で５５℃、および（ｉｉｉ）０．１×ＳＳＣ（好ましくはＥＤＴＡと併用する）中で５５℃で洗浄する。

本発明はさらに、保存的アミノ酸置換を有するＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする核酸を提供し、この保存的アミノ酸置換には、（ａ）ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、システインまたはスレオニンの、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、システインまたはスレオニンへの変化、（ｂ）グリシン、アラニン、バリン、セリン、システインまたはスレオニンの、グリシン、アラニン、バリン、セリン、システインまたはスレオニンへの変化、（ｃ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンへの変化、（ｄ）グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミンまたはアスパラギンの、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミンまたはアスパラギンへの変化、（ｅ）ヒスチジン、リジンまたはアルギニンの、ヒスチジン、リジンまたはアルギニンへの変化、および（ｆ）セリン、スレオニンまたはシステインの、セリン、スレオニンまたはシステインへの変化、ならびに（ｇ）それらの組み合わせ、が挙げられる。

さらに、本発明は、配列番号１の配列中に、約１〜約５アミノ酸、好ましくは約１〜約３アミノ酸、より好ましくは１アミノ酸の、１つ以上のアミノ酸挿入または欠失を有する、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。

変異誘発は、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって実施され得る。一般に、変異誘発は、核酸配列を、配列の操作を容易にするために、プラスミドまたはいくつかの他のベクター中にクローニングすることによって、達成され得る。次いで、さらなる核酸配列をその核酸配列中に付加することができる独自の制限部位が、同定されるか、またはその核酸配列中に挿入される。二本鎖合成オリゴヌクレオチドは一般に、二本鎖オリゴヌクレオチドが標的配列に隣接する制限部位を組み込み、例えば置換ＤＮＡを組み込むために使用できるように、重複する合成一本鎖のセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから生成される。プラスミドまたは他のベクターは、制限酵素で切断され、適合する付着末端を有するオリゴヌクレオチド配列がこのプラスミドまたは他のベクター中にライゲーションされ、元のＤＮＡを置換する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的変異誘発の他の手段は当業者に公知であり、達成され得る（特に、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、例えば、Ｐａｒｉｋｈ ＆ Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：４２８−４３１（１９９８）を参照のこと）。変化の部位と重複する相補的プライマーを使用して、５００ｍＭのｄＮＴＰ、２単位のＰｆｕポリメラーゼ、各２５０ｎｇのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー、ならびにＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする配列を含むプラスミドＤＮＡ２００ｎｇを含む混合物中で、プラスミド全体をＰＣＲ増幅することができる。ＰＣＲは望ましくは、ＤＮＡ １Ｋｂにつき２．５分間の伸長時間で１８サイクルを要する。ＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩ（アデニンメチル化プラスミドＤＮＡのみを消化する）で処理されて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞中に形質転換され得る。形質転換体は、変化の組込みについて制限酵素消化によってスクリーニングされ得、次いでＤＮＡ配列分析によって確認され得る。

変異誘発された配列をコードする核酸フラグメントは、例えば、変異したヌクレオチドに隣接する５’プライマーおよび３’プライマー（好ましくは、さらなる独自の制限部位で終わるプライマー）を使用するＰＣＲ増幅によって、単離され得る。この様式でプライマーを使用することにより、独自の制限部位に隣接する増幅配列が生じる。独自の制限部位は、フラグメントのさらなる簡便なサブクローニングのために使用され得る。

本発明はさらに、例えば、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を制御するプロモーターをさらに含むベクターなどの、コードする核酸配列を含む組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、請求項３に記載の核酸分子を含む細胞を提供し、この細胞は、原核細胞または真核細胞である。組織培養の方法は当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１），ｐｐ．１６．１−１６．５４を参照のこと）。従って、本発明は、請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法をさらに提供し、この方法は以下を含む：（ａ）請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸で細胞を形質転換すること；（ｂ）形質転換された細胞によるこのポリペプチドの発現を誘導すること；および（ｃ）このポリペプチドを精製すること。

本発明はさらに、制御因子、およびＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドまたはＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド中に保存的アミノ酸変化を有する本明細書中に記載されるポリペプチドの発現のための制御因子（例えば、適切なプロモーター）に作動可能に連結された本明細書中に記載されるＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドの核酸分子を含む、核酸構築物を提供する。タンパク質発現は、ＲＮＡ転写のレベルに依存し、次にＤＮＡシグナルによって調節される。同様に、ｍＲＮＡの翻訳は、最低限でも、メッセージの５’末端の１０〜１００ヌクレオチド以内に通常位置するＡＵＧ開始コドンを必要とする。ＡＵＧ開始コドンに隣接する配列は、真核生物のリボソームによるその認識に影響を与えることが示されており、完全なＫｏｚａｋコンセンサス配列への服従が最適な翻訳を生じる（例えば、Ｋｏｚａｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９８７）を参照のこと）。また、細胞における外因性核酸の首尾よい発現は、得られるタンパク質の翻訳後修飾を必要とし得る。従って、本発明は、ベクターが例えばｐＣＤＮＡ３．１またはその誘導体である、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードするプラスミドを提供し、これには、本明細書中で開示されるｐＶＴ１０００Ｑ３プラスミドが挙げられるがこれに限定されない。

本明細書中に記載される核酸分子は、適切なプロモーターに作動可能に連結されたコード領域を好ましくは含み、このプロモーターは、真核細胞中で機能的であることが好ましい。ＲＳＶプロモーターおよびアデノウイルス主要後期プロモーターなど（これらに限定されない）のウイルスプロモーターが、本発明において使用され得る。適切な非ウイルスプロモーターとしては、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよび伸長因子１αプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルスプロモーターは、望ましくはヒトプロモーターである。さらなる適切な遺伝因子（これらの多くは当該分野で公知である）がまた、本発明の核酸および構築物にライゲーション、結合、またはこれらの中に挿入されて、さらなる機能、発現レベルまたは発現パターンを提供し得る。ＳＰＡＲＣファミリー遺伝子の発現のためのネイティブのプロモーターもまた使用され得るが、その場合、その染色体を実質的に変化させるプロセスによって修飾されない限り、それらを天然にコードする染色体中では使用されないことが好ましい。このような実質的に変化した染色体としては、レトロウイルスベクターまたは類似のプロセスによってトランスフェクトおよび変更された染色体を挙げることができる。あるいは、このような実質的に変化した染色体は、ＨＡＣ、ＹＡＣまたはＢＡＣのような人工染色体を含み得る。

さらに、本明細書中に記載される核酸分子は、転写を促進するためにエンハンサーに作動可能に連結され得る。エンハンサーは、隣接遺伝子の転写を刺激する、ＤＮＡのシス作用性因子である。多数の種由来の多数の異なる細胞型において連結された遺伝子に対して高レベルの転写を付与するエンハンサーの例としては、ＳＶ４０およびＲＳＶ−ＬＴＲ由来のエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエンハンサーは、細胞型特異的な効果を有する他のエンハンサーと組み合わせることができ、あるいは任意のエンハンサーを単独で使用してもよい。

タンパク質産生を最適化するために、本発明の核酸分子は、この核酸分子のコード領域の後にポリアデニル化部位をさらに含み得る。また、好ましくは全ての適切な転写シグナル（および必要に応じて翻訳シグナル）は、外因性核酸が導入される細胞中で適切に発現されるように正確に配置されよう。所望の場合、外因性核酸はまた、インフレームの全長転写物を維持したままｍＲＮＡ産生を促進するために、スプライス部位（即ち、スプライスアクセプター部位およびスプライスドナー部位）を組み込み得る。さらに、本発明の核酸分子は、プロセシング、分泌、細胞内局在などのために適切な配列をさらに含み得る。

この核酸分子は、任意の適切なベクター中に挿入され得る。適切なベクターとしてはウイルスベクターが挙げられるがこれに限定されない。適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよび家禽ポックスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは好ましくは、真核細胞（例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞）を形質転換する、ネイティブまたは操作された能力を有する。さらに、本発明に関して有用なベクターは、プラスミドまたはエピソームのような「裸の」核酸ベクター（即ち、ベクターを封入するタンパク質、糖および／または脂質を殆どまたは全く有さないベクター）であり得るか、あるいはベクターは、他の分子と複合体化され得る。本発明の核酸と適切に組み合わせることができる他の分子としては、ウイルス被膜、カチオン性脂質、リポソーム、ポリアミン、金粒子、および細胞分子を標的化するリガンド、レセプターまたは抗体のような標的化部分が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中に記載される核酸分子は、任意の適切な細胞、典型的には真核細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ）中へと形質転換され得、望ましくはＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド（例えば、本明細書中に記載されるような配列番号２またはその改変体からなるポリペプチド）の発現を生じる。核酸分子の発現、従ってＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド（例えば、本明細書中に記載されるような配列番号２のアミノ酸配列またはその改変体を含むポリペプチド）の産生を提供するために、細胞が培養され得る。

従って、本発明は、本明細書中に記載される本発明の核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供する。外因性ＤＮＡ分子で細胞を形質転換またはトランスフェクトする手段は、当該分野で周知である。例えば、限定ではなく、ＤＮＡ分子は、当該分野で周知の標準的な形質転換またはトランスフェクション技術（例えば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、プロトプラスト（ｐｒｏｔｏｂｌａｓｔ）融合、エレクトロポレーション、リポソームおよび直接的マイクロインジェクション）を使用して細胞中に導入される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１），ｐｐ．１．１−１．１６２，１５．１−１５．５３，１６．１−１６．５４を参照のこと）。形質転換に広く使用される方法は、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストランのいずれかによって媒介されるトランスフェクションである。細胞型に依存して、培養細胞集団の２０％までが、いつでもトランスフェクトできる。

形質転換法の別の例はプロトプラスト融合法であり、高コピー数の目的のプラスミドを保有する細菌由来のプロトプラストが、培養哺乳動物細胞と直接混合される。細胞膜の融合（通常ポリエチレングリコールを用いる）後、細菌の内容物が哺乳動物細胞の原形質中に送達され、プラスミドＤＮＡが核へ移行する。プロトプラスト融合は、一過性発現アッセイに一般に使用される細胞系統の多くについてはトランスフェクションほど効率的ではないが、ＤＮＡのエンドサイトーシスが非効率的に生じる細胞系統には有用である。プロトプラスト融合はしばしば、宿主染色体中にランダムに組み込まれた複数コピーのプラスミドＤＮＡを生じる。

種々の哺乳動物細胞および植物細胞への短時間の高電圧の電気パルスの印加であるエレクトロポレーションは、原形質膜におけるナノメートルサイズの穴の形成を引き起こす。ＤＮＡは、これらの穴を通って、または穴の閉鎖を伴う膜成分の再分布の結果として、細胞の原形質中に直接取り込まれる。エレクトロポレーションは非常に効率的であり得、クローンの遺伝子の一過的な発現および組み込まれた目的の遺伝子のコピーを保有する細胞系統の樹立の両方のために使用できる。

リポソーム形質転換は、リポソーム内のＤＮＡおよびＲＮＡの封入と、その後のリポソームの細胞膜との融合を含む。さらに、合成カチオン性脂質で被覆されたＤＮＡは、融合によって細胞中に導入され得る。あるいは、直鎖および／または分枝鎖のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が、トランスフェクションにおいて使用され得る。

ＤＮＡ分子の核への直接的マイクロインジェクションには、細胞区画（例えば、低ｐＨのエンドソーム）へＤＮＡ分子を曝さないという利点がある。従って、マイクロインジェクションは、組み込まれた目的の遺伝子のコピーを保有する細胞の系統を樹立するための方法として主に使用される。

このような技術は、真核細胞の安定な形質転換および一過性の形質転換の両方のために使用できる。安定に形質転換された細胞の単離は、目的の遺伝子での形質転換と組み合わせて、選択マーカーの導入を必要とする。このような選択マーカーには、ネオマイシンへの耐性を付与する遺伝子、ならびにＨＰＲＴ陰性細胞におけるＨＰＲＴ遺伝子が挙げられる。選択は、少なくとも約２〜７日間、好ましくは少なくとも約１〜５週間の、選択培地中での長期培養を必要とし得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１），ｐｐ．１６．１−１６．５４を参照のこと）。

本発明において使用するための核酸配列はまた、例えば、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成器で実施され得る、Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ ａｌ．（Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２（１９８７））に記載されるホスホロアミダイト法、またはトリエステル法（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１））によって、化学合成によって一部または全体が生成され得る。二本鎖フラグメントは、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖を一緒にアニーリングすることか、または適切なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を合成することのいずれかにより、化学合成の一本鎖産物から得てもよい。

遺伝子治療
遺伝子治療は、疾患と闘うために生きた細胞の遺伝物質を改変することを含む、医学的介入である。遺伝子治療は、多数の異なる型の癌および他の疾患についての臨床試験（ヒトを用いた研究試験）において研究されている。

本発明はさらに、「遺伝子治療」での使用に適切なＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する（例えば、Ｐａｔｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＡＡＰＳ Ｊ．７（１）：Ｅ６１−７７（２００５）を参照のこと）。適切な核酸としては、配列番号３を含む核酸または本明細書中に記載されるそれらの修飾物およびホモログが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子治療の目的の１つは、例えば、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする単離された核酸分子などの変更された遺伝子を細胞に供給することである。遺伝子治療はまた、例えば、免疫系の細胞を刺激して癌細胞を攻撃させることにより、細胞が如何に機能するかを変化させる方法としても研究されている。

一般に、遺伝子は、本明細書中に開示されたような「ベクター」を使用して細胞に送達される。遺伝子治療において使用される最も一般的な型のベクターはウイルスである。遺伝子治療においてベクターとして使用されるウイルスは、遺伝的に不能であり、自分自身を複製することができない。殆どの遺伝子治療の臨床試験は、所望の遺伝子を送達するのにマウスレトロウイルスに依存している。ベクターとして使用される他のウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルスおよびヘルペスウイルスが挙げられる。適切なウイルス遺伝子治療ベクターならびにそれらのｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの投与様式は、当該分野で公知である。

遺伝子治療は、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で実施できる。典型的には、ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療の臨床試験において、患者の血液または骨髄から細胞が取り出され、実験室で増殖される。これらの細胞は、所望の遺伝子を保有するウイルスに曝露される。ウイルスは細胞に入り、所望の遺伝子が細胞のＤＮＡの一部となる。細胞は実験室で増殖され、次いで静脈への注射によって患者に戻される。ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療において、例えばウイルスまたはリポソームのようなベクターが、患者の身体の内側の細胞に所望の遺伝子を送達するために使用される。

Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドは、組換え宿主細胞から発現および精製され得る。組換え宿主細胞は、原核生物でも真核生物でもよく、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、酵母などの真菌、ショウジョウバエおよびカイコ由来の細胞系統が含まれるがこれらに限定されない昆虫細胞、ならびに哺乳動物の細胞および細胞系統が挙げられるが、これらに限定されない。細胞（例えばヒト細胞）中でＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを発現する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏであれｉｎ ｖｉｖｏであれ、Ｑ３ ＳＰＡＲＣをコードするこのようなポリヌクレオチドのために選択されるコドンは、所定の細胞型（即ち種）について最適化され得る。コドン最適化のための多数の技術が当該分野で公知である（例えば、Ｊａｙａｒａｊ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（９）：３０１１−６（２００５）；Ｆｕｇｌｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３１（２）：２４７−９（２００３）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：ａ Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｗｅｂ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｏ Ｅｘｐｌｏｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐａｃｅ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”ｃｓｂｗ，２００５ ＩＥＥＥ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ−Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ（ＣＳＢＷ’０５），ｐｐ．２５８−２５９（２００５）を参照のこと）。

特定の実施形態において、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを発現および精製する場合、タンパク質の可溶性を改善するための技術が、封入体（不溶性画分）の形成を防止するために使用され、従って、大量のポリペプチドが得られる。封入体中に蓄積したＳＰＡＲＣは、その生理学的活性を保持しない不活性型ＳＰＡＲＣである。

精製されたＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドの可溶性は、当該分野で公知の方法によって改善できる。例えば、可溶性は、全長Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドではなく機能的フラグメントを発現させることによっても改善され得る。さらに、（例えばＥ．ｃｏｌｉ中で）発現されたタンパク質の可溶性を増大させるために、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ＆ Ｖａｌａｘ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：１９０−１９７（１９９６））に記載されるように、増殖温度を低下させ、より弱いプロモーターを使用し、より低いコピー数のプラスミドを使用し、誘導因子濃度を低下させ、増殖培地を変化させることによって、タンパク質合成の速度を低下させることができる。これは、タンパク質合成の速度を低下させ、通常、より可溶性のタンパク質が得られる。適切な折り畳みまたはタンパク質の安定性に必須な補欠分子族（ｐｒｏｓｔｅｔｈｉｃ ｇｒｏｕｐ）または補因子を添加するか、増殖の間の培地中のｐＨの変動を制御するための緩衝剤を添加するか、ラクトース（これは、殆どの栄養豊富な培地（例えば、ＬＢ、２×ＹＴ）中に存在する）によるｌａｃプロモーターの誘導を抑制するために１％グルコースを添加することもできる。ポリオール（例えば、ソルビトール）およびスクロースの添加によって引き起こされる浸透圧の上昇は、細胞における浸透圧保護剤の蓄積を引き起こし、これがネイティブのタンパク質の構造を安定化するので、これらを培地に添加してもよい。エタノール、低分子量チオールおよびジスルフィド、ならびにＮａＣｌを添加してもよい。さらに、シャペロンおよび／またはホルダーゼ（ｆｏｌｄａｓｅ）が、所望のポリペプチドと共に同時発現され得る。分子シャペロンは、折り畳み中間体と一過的に相互作用することによって、適切な異性化および細胞標的化を促進する。Ｅ．ｃｏｌｉのシャペロン系には、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＧｒｏＥＳ−ＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ−ＤｎａＪ−ＧｒｐＥ、ＣＩｐＢ。

ホルダーゼは、折り畳み経路に沿った律速段階を加速する。３つの型のホルダーゼが重要な役割を果たす：ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）、ジスルフィドオキシドレダクターゼ（ＤｓｂＡ）およびジスルフィドイソメラーゼ（ＤｓｂＣ）、タンパク質のシステインの酸化およびジスルフィド結合の異性化の両方を触媒する真核生物タンパク質であるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）。１つ以上のこれらのタンパク質と標的タンパク質との同時発現は、より高いレベルの可溶性標的タンパク質を生じ得る。

Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドは、その可溶性および産生を改善するために、融合タンパク質として産生され得る。この融合タンパク質は、インフレームで一緒に融合したＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む。第２のポリペプチドは、それが融合するポリペプチドの可溶性を改善するための、当該分野で公知の融合パートナーであり得る（例えば、ＮｕｓＡ、バクテリオフェリチン（ＢＦＲ）、ＧｒｐＥ、チオレドキシン（ＴＲＸ）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））。Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、ＮｕｓＡ−標的融合物の形成を可能にするｐＥＴ４３．１ベクターシリーズを提供している。ＤｓｂＡおよびＤｓｂＣも、融合パートナーとして使用した場合、発現レベルに対して正の影響を示しており、従って、より高い可溶性を達成するためにＳＰＡＲＣポリペプチドとの融合に使用され得る。

１実施形態において、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドは、本明細書でその全体が参照により組み込まれる、米国特許第６，３８７，６６４号に記載されるような、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドおよび融合パートナーのチオレドキシンを含む融合ポリペプチドとして産生される。チオレドキシン−ＳＰＡＲＣ融合物は、生理学的活性を失うことなく、製剤化の容易な（ｅａｓｙ−ｔｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）可溶性タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ中で大量に産生され得る。米国特許第６，３８７，６６４号は、チオレドキシンのＣ末端に融合したＳＰＡＲＣを有する融合ＳＰＡＲＣタンパク質を提供しているが、本発明の目的のためには、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドは、その感作機能が保持される限り、第２のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれにも融合され得ることが理解される。

可溶性を増大させることに加えて、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを含む融合タンパク質は、細胞におけるＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドの発現の容易な検出のために構築され得る。１実施形態において、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドに融合した第２のポリペプチドは、レポーターポリペプチドである。このレポーターポリペプチドは、このような検出目的のために提供される場合、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドと融合される必要はない。レポーターポリペプチドは、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドもまたコードする同じポリヌクレオチド（例えばベクター）によってコードされ、標的細胞中で同時導入および同時発現され得る。

好ましくは、本発明で使用されるレポーターポリペプチドは、自己蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ）である。自己蛍光タンパク質は、目的のポリヌクレオチド（およびポリペプチド産物）の発現の同定のための即時のアッセイを提供する。レポーターポリペプチドの活性（および推論によりその発現レベル）は、フローソーターを使用して定量的にモニタリングできるので、多数の独立した形質転換体を、連続的またはバルク集団のいずれかでアッセイし易い。次いで、最高の発現を有する細胞がスクリーニングされるか、または集団から選択され得る。これは、本発明に従う感作処理のためのＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む組換え細胞を選択する場合に有用である。

平均蛍光強度および分散のような定量的パラメータは、細胞集団の蛍光強度プロフィールから決定され得る（Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｈ．，１９９５，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２１７−２２８）。本発明において有用なレポーター分子の非限定的な例には、ルシフェラーゼ（ホタルまたは他の種由来）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）およびｄｓＲｅｄが挙げられる。

ＳＰＡＲＣポリペプチド（単独か、または融合タンパク質としてのいずれか）の発現は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）（例えば、米国特許第５，９６２，３２０号；同第６，１８７，３０７号および同第６，１９４，２０５号を参照のこと）のようなイムノアッセイ、ウエスタンブロット、または当該分野で慣用的な他の方法によって直接決定することもできる。Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドの発現は、（例えば、ノザンブロットまたはＤＮＡマイクロアレイのようなハイブリダイゼーション分析、あるいはＰＣＲによって）タンパク質の転写物を検出することによって、間接的に検出され得る。

１実施形態において、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、リンカーポリペプチドをコードする介在リンカー配列を介して、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに融合される。

別の実施形態において、リンカーポリペプチドは、プロテアーゼによって加水分解可能なペプチド結合を含むプロテアーゼ切断部位を含む。結果として、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドは、タンパク質分解によって、発現後に第２のポリペプチドから分離され得る。リンカーは、プロテアーゼの触媒部位もまた結合する結合のいずれかの側に、１つ以上のさらなるアミノ酸を含み得る（例えば、Ｓｃｈｅｃｔｅｒ ＆ Ｂｅｒｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７，１５７−６２（１９６７）を参照のこと）。あるいは、リンカーの切断部位は、プロテアーゼの認識部位とは別個であり得、２つの切断部位および認識部位が、１つ以上（例えば、２〜４）のアミノ酸によって分離され得る。１態様において、リンカーは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０またはそれより多いアミノ酸を含む。より好ましくは、リンカーは、約５〜約２５アミノ酸長であり、最も好ましくは、リンカーは約８〜約１５アミノ酸長である。

本発明に従って有用ないくつかのプロテアーゼが以下の文献中で考察されている：Ｈｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２１：２６５−２７９（１９９７）；Ｗｅｒｂ，Ｃｅｌｌ ９１：４３９−４４２（１９９７）；Ｗｏｌｆｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３１：２７５−２７８（１９９５）；Ｍｕｒａｋａｍｉ ＆ Ｅｔｌｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４６：１２４９−１２５９（１９８７）；Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０７：３１３−３２６（１９９５）；ＳｍｙｔｈおよびＴｒａｐａｎｉ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １６：２０２−２０６（１９９５）；Ｔａｌａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９６７７−９６８２（１９９７）；ならびにＴｈｏｒｎｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１７９０７−１７９１１（１９９７）。細胞表面プロテアーゼもまた、本発明に従う切断可能なリンカーと共に使用され得、これには以下が含まれるがこれらに限定されない：アミノペプチダーゼＮ；ピューロマイシン感受性アミノペプチダーゼ；アンギオテンシン変換酵素；ピログルタミルペプチダーゼＩＩ；ジペプチジルペプチダーゼＩＶ；Ｎ−アルギニン二塩基性コンバターゼ；エンドペプチダーゼ２４．１５；エンドペプチダーゼ２４．１６；アミロイド前駆体タンパク質セクレターゼα、βおよびγ；アンギオテンシン変換酵素セクレターゼ；ＴＧＦαセクレターゼ；ＴＮＦαセクレターゼ；ＦＡＳリガンドセクレターゼ；ＴＮＦレセプター−Ｉおよび−ＩＩセクレターゼ；ＣＤ３０セクレターゼ；ＫＬ１およびＫＬ２セクレターゼ；ＩＬ６レセプターセクレターゼ；ＣＤ４３、ＣＤ４４セクレターゼ；ＣＤ１６−ＩおよびＣＤ１６−ＩＩセクレターゼ；Ｌ−セレクチンセクレターゼ；葉酸レセプターセクレターゼ；ＭＭＰ１、２、３、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５；ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子；組織プラスミノゲン活性化因子；プラスミン；トロンビン；ＢＭＰ−１（プロコラーゲンＣ−ペプチダーゼ）；ＡＤＡＭ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１；ならびにグランザイムＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ。

細胞結合プロテアーゼに依存することの代替は、自己切断リンカーを使用することである。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテアーゼがリンカーとして使用され得る。これは、２Ａ／２Ｂ接合部でＦＭＤＶのポリタンパク質を切断する、１７アミノ酸の短いポリペプチドである。ＦＭＤＶ ２Ａプロペプチドの配列は、ＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰである。切断は、最後のグリシン−プロリンアミノ酸対でペプチドのＣ末端にて生じ、他のＦＭＤＶ配列の存在とは無関係であり、異種配列の存在下であっても切断する。

２つのタンパク質コード領域間（即ち、本発明に従う融合タンパク質のＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドと第２のポリペプチドとの間）へのこの配列の挿入は、それ自身を、そのＮ末端に２ＡプロテアーゼのＣ末端プロリンを保有するＣ末端側フラグメントと、そのＣ末端に２Ａプロテアーゼの残部を保有するＮ末端側フラグメントへと切断する、自己切断キメラの形成を生じる（例えば、ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１９８−２０８（１９９９）を参照のこと）。自己切断リンカーおよびさらなるプロテアーゼ−リンカーの組み合わせは、ＰＣＴ公報ＷＯ ０１／２０９８９（その全体が、本明細書中で参照として組み込まれる）にさらに記載されている。

上記リンカー配列をコードするポリヌクレオチドは、適切なプロテアーゼの天然の基質をコードする配列からクローニングされ得るか、あるいは当該分野で慣用的な方法を使用して化学合成され得る。

ＳＰＡＲＣリガンドおよび／または抗ＳＰＡＲＣ抗体を使用するアフィニティクロマトグラフィーもまた、本発明に従うＳＰＡＲＣポリペプチドを精製するために使用され得る。アフィニティクロマトグラフィーは、単独でか、またはイオン交換、分子サイジングもしくはＨＰＬＣクロマトグラフィー技術と組み合わせて使用され得る。このようなクロマトグラフィーアプローチは、カラムを使用して、またはバッチ形式で実施され得る。このようなクロマトグラフィー精製法は、当該分野で周知である。

本発明は、ＳＰＡＲＣ、特にＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドに対する抗体の、ＳＰＡＲＣが役割を果たす疾患に対する治療剤または画像化剤としての使用を提供する。抗体は、所定の条件設定下で、無関係の抗原または抗原混合物に対する結合に対して、適切な抗原に対する結合を比較することによって、結合の特異性について試験され得る。抗体が、無関係の抗原（例えば、野生型ＳＰＡＲＣポリペプチドを含む）または抗原混合物に対するよりも、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約７倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、適切な抗原に対してより強く結合する場合、その抗体は特異的であるとみなされる。さらに、本発明は、ＳＰＡＲＣポリペプチド（例えば、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド）に対する抗体を提供し、この抗体は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドおよび野生型ＳＰＡＲＣポリペプチドの両方に結合するが、この抗体は、野生型ＳＰＡＲＣポリペプチドに対するよりも、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約７倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドに対してより強く結合する。抗体結合強度を決定する種々の方法が、当業者に公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）を参照のこと）。

その抗体がＳＰＡＲＣポリペプチド（例えば、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドなど）に対する特異的結合を示す限り、ＳＰＡＲＣポリペプチド（例えば、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドなど）に対する任意の適切な抗体が本発明の方法において使用され得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得；動物の免疫によって産生されるか、組換えＤＮＡ技術（例えば、ファージディスプレイおよび抗体重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の可変領域のｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発または合成）によって産生されるかのいずれかであり得る。ポリクローナル抗体としては、ヒト抗体、ならびに鳥類（例えばニワトリ）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット）、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギなどの動物由来のヒト化抗体が挙げられるが、これらに限定されない。モノクローナル抗体としては、単一クローンの抗体を産生する細胞（ヒト細胞が挙げられるがこれに限定されない）由来の抗体、および他の動物型（例えば、ニワトリ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）の細胞由来の抗体が挙げられる。合成抗体には、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の可変領域の遺伝子操作を介して組換えＤＮＡ手段を使用して産生される抗体が挙げられる。合成抗体には、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドポリペプチド結合活性を有する化学合成された抗体フラグメント、またはファージディスプレイもしくは類似の技術由来の抗体も含まれる。抗体を製造する方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ｐｐ．１−４２０（１９８８）を参照のこと）。

ヒトでの使用について、免疫原性および免疫応答を回避するために、ヒト化抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドポリペプチド抗体またはＦｃもしくはＦａｂなどの適切なフラグメントを使用することが好ましい。ヒト化抗体またはそのフラグメントは、例えば、以下の確立された方法の１つを使用して産生される：（１）ヒト化抗体は、ヒトＩｇＧ骨格を使用してＳＰＡＲＣに対する抗体の可変ＣＤＲ領域を置換して構築され得、重鎖および軽鎖は、別個のプロモーターの下で独立して発現されるか、ＩＲＥＳ配列を有する１つのプロモーターの下で同時発現される；（２）ＳＰＡＲＣに対するヒト化モノクローナル抗体は、ヒト免疫系を有するように操作されたマウスを使用して惹起される；あるいは（３）ＳＰＡＲＣに対するヒト化抗体は、ファージミド（Ｍ１３、λ大腸菌ファージ、または表面提示が可能な任意のファージ系）を使用して惹起される。全長抗体を構築するために、可変領域が、重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲに移入される。重鎖および軽鎖を哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ、２９３またはヒト骨髄腫細胞）中で同時発現させることにより、全長抗体が生じる。同様に、ＦｃまたはＦａｂフラグメントおよび単鎖抗体は、充分確立された方法を使用して調製できる。

ＳＰＡＲＣポリペプチド（例えば、本発明に従って作成されたＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド）に対する抗体はまた、抗体全体またはＳＰＡＲＣポリペプチド（例えば、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド）に対する結合部位を保持する抗体のフラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦａｂ２）に限定されない。抗体はまた、抗体のいずれか１つのクラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＹ）に限定されない。抗体はまた、二価抗体、一価抗体、または１つの価がＳＰＡＲＣに対するものであり他方の価がエフェクター（例えば、ｔＴＦまたはリシンＡ）に対するものであるキメラに限定されない。ヒト化抗体はＩｇＧに限定されない。同じ技術を使用して、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭなどの抗体の全ての他のクラスを製造することができ、これらは各々、特定の疾患標的に適切な異なるＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を有する。抗体の機能的フラグメントは、限定的タンパク質分解によって生成され得る。これらのフラグメントは、Ｆａｂ’などの一価またはＦａｂ２などの二価であり得る。フラグメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中で単鎖ｓｃｆｖまたはダイアボディとして合成できる。

本発明はまた、腫瘍および再狭窄組織などのＳＰＡＲＣ発現組織の、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体による補体結合および／または細胞媒介性免疫応答のリクルートを介した破壊のための方法を提供する。この場合、抗ＣＤ２０抗体Ｒｉｔｕｘａｎと同様に、エフェクター部分は、ＳＰＡＲＣ発現細胞の直接的破壊を伴う補体活性化、または細胞媒介性免疫応答を介した組織破壊を生じる、ＳＰＡＲＣ発現組織に対する免疫細胞のリクルートのいずれかを媒介できるＦｃフラグメントである。

本発明はまた、ＳＰＡＲＣに対する中和抗体（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドポリペプチド抗体）を使用した、ＳＰＡＲＣ活性の阻害のための方法を提供する。中和抗体は、ＳＰＡＲＣとそのエフェクターとのｉｎ ｖｉｖｏでの相互作用、例えば、ＳＰＡＲＣの細胞表面補体との相互作用、またはＳＰＡＲＣのその天然のリガンド（例えば、アルブミン、増殖因子およびＣａ^２＋）への結合を、遮断する能力を有する。

本発明は、抗ＳＰＡＲＣ治療（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド治療）に対するヒトまたは他の哺乳動物の腫瘍の応答を決定するための方法を提供する。この方法は、（ａ）ヒトから生物学的サンプルを単離すること、（ｂ）この生物学的サンプルにおいてＳＰＡＲＣタンパク質（例えば、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドを含む）の発現を検出すること、および（ｃ）この生物学的サンプル中のＳＰＡＲＣタンパク質の量を定量すること、を含む。抗ＳＰＡＲＣ治療は、疾患組織中のＳＰＡＲＣに対するＳＰＡＲＣ抗体の結合に依存するので、疾患組織中のＳＰＡＲＣの存在が活性に必要である。

任意の適切な化学療法剤が、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドまたはＳＰＡＲＣポリペプチド（例えば、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドなど）に対する抗体にカップリング（またはコンジュゲート化）するために、本発明の方法において使用され得る。適切な化学療法剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：チロシンキナーゼインヒビター（ゲニステイン）、生物学的に活性な因子（ＴＮＦまたはｔＴＦ）、放射性核種（^１３１Ｉ、^９０Ｙ、^１１１Ｉｎ、^２１１Ａｔ、^３２Ｐおよび他の公知の治療的放射性核種）、アドリアマイシン、アンサマイシン系抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブシル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトテシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン（ｍｅｐｌｈａｌａｎ）、メトトレキサート、ラパマイシン（シロリムス）および誘導体、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレスタチン、ディスコデルモライド、トランスプラチン、抗血管内皮増殖因子化合物（「抗ＶＥＧＦ」）、抗上皮増殖因子レセプター化合物（「抗ＥＧＦＲ」）、５−フルオロウラシルなど。１種以上の化学療法剤の用量が、本発明に従って投与され得る。本発明の方法において使用される化学療法剤の型および数は、特定の腫瘍型に対する標準的な化学療法レジメンに依存しよう。言い換えれば、特定の癌は単一の化学療法剤で慣用的に治療され得るが、別の癌は化学療法剤の組み合わせで慣用的に治療され得る。

用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療、療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」および「治療的処置（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書中で使用する場合、治癒的治療、予防的治療（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ）または予防的治療（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ）をいう。「予防的治療（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ）」の例は、標的疾患（例えば、癌または他の増殖性疾患）またはそれに関連する状態の予防またはその機会の低減である。治療を必要とする者としては、その疾患または状態を既に有している者、ならびに予防すべき疾患または状態を有する素因を有する者が挙げられる。用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療、療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」および「治療的処置（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」はまた、本明細書中で使用する場合、疾患または関連の状態と戦う目的のための哺乳動物の管理および介護を記述し、これは、症状、副作用、またはその疾患、状態の他の合併症を緩和するための組成物の投与を含む。癌のための治療的処置には、手術、化学療法、放射線療法、遺伝子治療および免疫治療が含まれるが、これらに限定されない。

「治療上有効量」とは、哺乳動物において疾患または状態の１つ以上の症状を（当業者たる医療従事者によって判断されるとおり、ある程度まで）緩和する量を意味する。さらに、「治療上有効量」とは、疾患または状態に関連するかまたはそれらの原因である生理学的または生化学的パラメータを、部分的または完全に、通常に戻す量を意味する。当業者たる臨床医は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、経口または吸入を介するなどによって投与される場合の、特定の疾患状態または障害を治療または予防するための組成物の治療上有効量を決定できる。治療上有効であるために必要な組成物の正確な量は、患者特異的な多数の考慮事項に加えて、多数の因子（例えば、活性剤の比活性、使用される送達デバイス、薬剤の物理的特徴、投与目的など）に依存しよう。治療上有効とするために投与しなければならない組成物の量の決定は、当該分野で慣用的であり、当業者たる臨床医の技術範囲内である。

本明細書中で使用する場合、用語「薬剤」または「薬物」または「治療剤」は、治療特性を有すると思われる、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料（例えば、細菌、植物、真菌または動物（特に哺乳動物）の細胞または組織）から調製した抽出物をいう。薬剤または薬物は、精製されていても、実質的に精製されていても、部分的に精製されていてもよい。本発明に従う「薬剤」は、放射線療法剤をも含む。

本明細書中で使用する場合、用語「毒素」は、生物の代謝活動の特定の産物である毒性物質をいい、これには、細菌、植物および他の毒素（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、アブリン−Ａ毒素、リシンＡ（脱グリコシル化リシンＡおよびネイティブのリシンＡ）、ＴＧＦ−α毒素、チャイニーズコブラ（ｎａｊａ ｎａｊａ ａｔｒａ）由来の細胞毒、およびゲロニン（植物毒素））；植物、細菌および真菌由来のリボソーム不活化タンパク質（例えば、レストリクトシン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓが産生するリボソーム不活化タンパク質）またはサポリン（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ由来のリボソーム不活化タンパク質）など）が含まれる。

本明細書中で使用する場合、用語「増殖性疾患」とは、クローン性増殖（例えば癌）およびポリクローン性増殖（例えば、過形成；子宮内膜症、子宮内膜過形成、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）が挙げられるが、これらに限定されない）の両方を含む細胞増殖（例えば、有糸分裂）によって特徴付けられる疾患をいう。

本明細書中で使用する場合、生物学的分子は、生物学的活性を有する、生物の代謝活動によって産生される分子であり、例えば、サイトカイン、インターロイキン、ＴＮＦまたは組織因子（ＴＦ）などである。本明細書中で使用する場合、生物学的分子には、生きた細胞中に通常見出されるサブユニットからなる他の分子またはそれらのアナログ（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、阻害ペプチド−核酸などの、生物学的活性を有し得るＲＮＡなど）が含まれる。

適切な治療剤、化学療法剤、放射性核種、ポリペプチドなどを抗体またはそのフラグメントにカップリングまたはコンジュゲート化するための方法は、当該分野で充分記載されている。例えば、本発明は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドまたは抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体コンジュゲート（例えば、ＳＰＡＲＣ−放射性核種、ＳＰＡＲＣ−薬物、ＳＰＡＲＣ−免疫調節剤またはＳＰＡＲＣ−毒素コンジュゲートなど）を提供する。任意の適切な方法が、ＳＰＡＲＣコンジュゲートを形成するために本発明に従って使用され得る。例えば、限定ではなく、ＳＰＡＲＣタンパク質中の遊離アミノ基（例えば、リジンのε−アミノ基）が、カルボジイミドまたはヘテロ二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）剤などの試薬を用いてコンジュゲート化され得る。あるいは、例えばＳＰＡＲＣのスルフヒドリル基がコンジュゲート化に使用され得る。さらに、ＳＰＡＲＣ糖タンパク質または抗ＳＰＡＲＣ抗体（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体）に結合した糖部分が酸化されて、当該分野で公知の多数のカップリング手順において有用なアルデヒド基が形成され得る。本発明に従って形成されたコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏで安定であるか、あるいは酵素的に分解可能なテトラペプチド結合または酸に不安定なシス−アコニチル（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｙｌ）結合もしくはヒドラゾン結合のように、不安定であり得る。

本発明はまた、ＳＰＡＲＣ−担体−治療剤分子または抗ＳＰＡＲＣポリペプチド（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド）抗体、コンジュゲート（例えば、ＳＰＡＲＣおよび薬物の、担体とのコンジュゲート）を提供する。本発明に従って使用するのに適切な担体としては、デキストラン、ヒト血清アルブミンおよびヒドロキシプロピルメタクリルアミドが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、ＳＰＡＲＣまたは抗ＳＰＡＲＣ抗体（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体）、被覆された薬物担体構造（例えば、リポソームなど）を提供する。

本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲート化した、ＳＰＡＲＣポリペプチドおよびタンパク質を含むＳＰＡＲＣ分子ならびに抗ＳＰＡＲＣ抗体（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体）を提供する。ＰＥＧコンジュゲート化は、タンパク質の循環半減期を増大させ、タンパク質の免疫原性および抗原性を低下させ、生物活性を改善し得る。例えば、メトキシ−ＰＥＧをＳＰＡＲＣタンパク質の利用可能なアミノ基または他の反応性部位（例えば、ヒスチジンまたはシステイン）と反応させることが挙げられるがこれに限定されない、コンジュゲート化の任意の適切な方法が使用され得る。さらに、組換えＤＮＡアプローチが、ＰＥＧ−反応性基を有するアミノ酸を本発明のＳＰＡＲＣ分子および抗体に付加するために使用され得る。ＰＥＧは、本発明のＳＰＡＲＣタンパク質と反応させる前に加工され得る。例えば、リンカー基がＰＥＧに付加され得る。さらに、放出可能なハイブリッドＰＥＧ化戦略（例えば、ＳＰＡＲＣ分子中の特定の部位に付加されたＰＥＧ分子がｉｎ ｖｉｖｏで放出されるようなＳＰＡＲＣのＰＥＧ化）が、本発明に従って使用され得る。このようなＰＥＧコンジュゲート化方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５５：２１７−２５０（２００３）を参照のこと）。

さらに、本発明は、ＳＰＡＲＣ融合タンパク質を提供し、これには、例えば、診断上有用なタンパク質ドメイン（例えば、ハプテン、ＧＦＰ）、免疫学的に活性なタンパク質ドメイン（例えば、ＴＦまたはＴＮＦ）または毒素ドメインの上流または下流にＳＰＡＲＣ配列が融合したものが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明はまた、ＳＰＡＲＣ認識基（例えば、上記抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体またはそのフラグメントを含む抗体）にカップリングまたはコンジュゲート化された診断剤の使用方法を提供する。この診断剤には、放射性同位体または放射性核種、ＭＲＩ造影剤、Ｘ線造影剤、超音波造影剤およびＰＥＴ造影剤が含まれる。コンジュゲート化に利用される方法は当該分野で公知である。

サンプル中のＳＰＡＲＣタンパク質の発現は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって検出および定量できる。タンパク質の検出および定量の適切な方法には、ウエスタンブロット、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、銀染色、ＢＣＡアッセイ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０，７６−８５（１９８５））、タンパク質−銅錯体に基づく比色アッセイであるＬｏｗｒｙタンパク質アッセイ（例えば、Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３，２６５−２７５（１９５１）に記載される）、およびタンパク質結合の際のＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ Ｇ−２５０における吸光度の変化に依存するＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８（１９７６）に記載される）が挙げられる。腫瘍生検は、上記のいずれかの方法によって分析され得るか、または抗ＳＰＡＲＣ抗体（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体（モノクローナルまたはポリクローナルのいずれか））を、適切な可視化システム（即ち、ＨＲＰ基質およびＨＲＰコンジュゲート化二次抗体）と組み合わせて使用する免疫組織化学によって分析され得る。

本発明に従って検出、感作および／または治療される腫瘍の型は一般に、ヒトおよび他の哺乳動物中で見出されるものである。腫瘍は、実験動物の場合のように、接種の結果でもあり得る。ヒトおよび他の動物の状態において多くの型および形態の腫瘍に遭遇し、本発明の方法の適用を、いずれか特定の腫瘍型または多様性に制限することは意図していない。腫瘍は、知られるように、制御されない進行性の細胞分裂から生じる組織の異常な塊を含み、典型的には「新生物」としても知られる。本発明の方法は、例えばヒトにおける、腫瘍細胞および関連の間質細胞、固形腫瘍ならびに軟組織に関連する腫瘍（例えば、軟組織肉腫）に有用である。腫瘍または癌は、口腔および咽頭、消化器系、呼吸器系、骨および関節（例えば、骨転移）、軟組織、皮膚（例えば、黒色腫）、乳房、生殖器系、泌尿器系、眼および眼窩、脳および中枢神経系（例えば、グリオーマ）、または内分泌系（例えば、甲状腺）中に位置し得、原発性の腫瘍または癌である必要はない。口腔に関連する組織には、舌、および口の組織が挙げられるがこれらに限定されない。癌は、消化器系の組織（例えば、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢および膵臓が挙げられる）で生じ得る。呼吸器系の癌は、喉頭、肺および気管支を侵し得、例えば、非小細胞肺癌が挙げられる。腫瘍は、雄性および雌性の生殖系を構成する子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、膣、前立腺、精巣および陰茎、ならびに泌尿器系を構成する膀胱、腎臓、腎盂および尿管において生じ得る。腫瘍または癌は、頭部および／または頸部に位置し得る（例えば、喉頭癌および副甲状腺癌）。腫瘍または癌は、造血系またはリンパ系にも位置し得、例えば、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫または白血病（例えば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病など）が挙げられる。好ましくは、腫瘍は、膀胱、肝臓、卵巣、腎臓、腸、脳または乳房に位置する。

本発明はさらに、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドおよび医薬上許容される担体を患者に投与することを含む治療に対して、疾患を感作する方法を提供する。感作が必要なこのような適切な疾患には、治療抵抗性（例えば、化学療法または放射線療法抵抗性）の癌が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する場合、用語「感作」とは、治療的処置に応答する癌サンプルまたは哺乳動物の感受性の増大または抵抗性の減少をいう。治療的処置に対する感受性の増大または感受性の減少は、特定の治療について当該分野で公知の方法および本明細書の以下に記載される方法（細胞増殖アッセイまたは細胞死アッセイが含まれるがこれらに限定されない）に従って測定される。感受性または抵抗性はまた、一定の期間（例えば、ヒトについては６ヶ月、マウスについては４〜６週間）にわたって腫瘍サイズの減少を測定することによって、動物において測定され得る。組成物または方法は、このような組成物または方法の非存在下での治療感受性または抵抗性と比較して、治療感受性の増大または抵抗性の減少が約２５％以上（例えば、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、またはそれより大きい）または約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍またはそれより大きい場合、治療的処置に対する応答を感作する。治療的処置に対する感受性または抵抗性の決定は、当該分野で慣用的であり、当業者たる臨床医の技術範囲内である。このように、本発明に従う疾患感作のためにＳＰＡＲＣを使用することは、１種以上の非ＳＰＡＲＣ治療剤（例えば、併用化学療法または他の薬物）を投与することをさらに含み得る。

本発明はまた、哺乳動物において腫瘍に化学療法剤を送達するための方法を提供する。この方法は、治療上有効量の送達剤（例えば、医薬組成物）をヒトまたは他の哺乳動物に投与することを含み、この送達剤（例えば、医薬組成物）は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドまたは抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体にカップリングされた化学療法剤を含む。例えば、化学療法剤は、ＳＰＡＲＣタンパク質を認識する抗体などのＳＰＡＲＣ認識基またはＳＰＡＲＣ抗体単独にカップリングされ得る。医薬組成物は、好ましくは、ＳＰＡＲＣ認識基にカップリングされた化学療法剤および医薬上許容される担体を含む。上記化学療法剤、腫瘍、哺乳動物およびそれらの成分の記載は、本発明の他の実施形態と組み合わせて、腫瘍に化学療法剤を送達する上記方法の同じ態様にも適用可能である。

別の好ましい実施形態において、本発明はまた、ヒトまたはそのようなタンパク質またはマーカーを発現する他の動物におけるＳＰＡＲＣの過剰発現によって特徴付けられる疾患の部位に、医薬上活性な薬剤（例えば、抗ＳＰＡＲＣ抗体または抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体単独、あるいは抗ＳＰＡＲＣ抗体または抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体とカップリングまたはコンジュゲート化された化学療法剤など）を送達するための方法を提供する。このような疾患には、身体組織（例えば、軟組織、結合組織、骨、実質臓器、血管など）における増殖、組織再構築、過形成および過大な創傷治癒の異常な状態が含まれる。Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドまたは抗ＳＰＡＲＣポリペプチド抗体を含む医薬組成物（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体治療）を投与することによって治療可能であるかまたは診断される疾患の例としては、癌、糖尿病性または他の網膜症、炎症、関節炎、アテローム硬化症、腎糸球体間質疾患、血管、人工血管移植片またはデバイスにおける再狭窄などが挙げられる。

本発明の方法は、ＳＰＡＲＣの過剰発現によって特徴付けられる疾患に罹患した哺乳動物に、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドまたは抗ＳＰＡＲＣポリペプチド（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体）にカップリングされた化学療法剤または放射性元素を含む医薬組成物の治療上有効な量を投与することを含む。化学療法剤または放射性剤は、任意の適切な方法を使用して、ＳＰＡＲＣを認識する抗体にカップリングされ得る。好ましくは、化学療法剤は、例えばジスルフィド結合を含む共有結合を介して化合物に化学的にカップリングされ得る。

ｉｎ ｖｉｖｏでの使用のために、治療剤にカップリングまたはコンジュゲート化されたＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドまたは抗ＳＰＡＲＣポリペプチド抗体（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド抗体）は、望ましくは、生理学的に許容される担体を含む医薬組成物へと製剤化される。任意の適切な生理学的に許容される担体が、本発明の文脈において使用され得、このような担体は当該分野で周知である。

担体は典型的には液体であるが、固体、または液体および固体の成分の組み合わせであってもよい。担体は望ましくは、生理学的に許容される（例えば、医薬上または薬理学的に許容される）担体（例えば、賦形剤または希釈剤）である。生理学的に許容される担体は周知であり、容易に入手可能である。担体の選択は、少なくとも一部は、標的組織および／または細胞の位置、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定されよう。

典型的には、このような組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製され得る；注射の前の液体添加により溶液または懸濁液を調製するために使用するのに適切な固体形態もまた、調製され得る；これらの調製物は乳化もされ得る。注射剤での使用に適切な医薬製剤には、無菌の水溶液または水性分散物；公知のタンパク質安定剤および凍結保護剤を含む製剤、ゴマ油、ピーナツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤、および無菌の注射可能な溶液または分散物の即時の調製のための無菌粉末、が挙げられる。全ての場合において、製剤は無菌であるべきであり、容易な注射可能性が存在する程度まで流動的であるべきである。製剤は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えばヒドロキシセルロース）と適切に混合した水中で調製され得る。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中、ならびに油中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を防止する保存剤を含む。

Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドまたは抗ＳＰＡＲＣ（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドなど）治療は、中性または塩の形態で組成物へと製剤化され得る。医薬上許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）および無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）と形成される塩または有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）と形成される塩が含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。

この組成物は、特に組成物および／またはその末端使用の安定性を増強するための、任意の他の適切な成分をさらに含み得る。従って、本発明の組成物の広範な種々の適切な製剤が存在する。以下の製剤および方法は単なる例示であり、限定ではない。

吸入による投与に適切な製剤には、エアロゾル製剤が挙げられる。エアロゾル製剤は、加圧された適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に配置され得る。これらは、ネブライザーまたはアトマイザーからの送達のために、非加圧調製物としても製剤化され得る。

非経口投与に適切な製剤としては、水性および非水性の、等張の無菌注射溶液（これは、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、およびこの製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る）、ならびに水性および非水性の無菌懸濁液（これは、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存剤を含み得る）が挙げられる。これらの製剤は、単回用量または複数用量の密封容器（例えば、アンプルおよびバイアル）中で提示され得、使用直前に、水などの注射用無菌液体賦形剤の添加のみを要する、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即席の注射溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。本発明の好ましい実施形態において、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドまたは抗ＳＰＡＲＣ（例えば、抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド治療）が、注射（例えば、非経口投与）のために製剤化される。これに関して、製剤は望ましくは腫瘍内投与に適しているが、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射などのためにも製剤化され得る。

肛門投与に適切な製剤は、活性成分を種々の基剤（例えば、乳化基剤または水溶性基剤）と混合することによって坐剤として調製され得る。膣投与に適切な製剤は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤として提示され得、これらは、活性成分に加えて、適切であることが当該分野で公知の担体などを含む。

さらに、本発明の組成物は、さらなる治療剤または生物学的に活性な薬剤を含み得る。例えば、特定の適応症の治療において有用な治療因子が存在し得る。炎症を制御する因子（例えば、イブプロフェンまたはステロイド）は、医薬組成物のｉｎ ｖｉｖｏ投与および生理学的苦痛に関連する膨潤および炎症を低減させるための組成物の一部であり得る。

本発明はさらに、配列番号１中のアミノ酸位置２０に対応するグルタミンが欠失したＳＰＡＲＣポリペプチドを検出することを含む、疾患を分類する方法を提供する。この分類は、例えば、限定ではなく、疾患の存在を示すか、疾患の病期についての情報を提供するか、所定の患者についての予後を示すか、または治療に対する応答を予測し得る。適切な疾患には、血管新生が関与する疾患（例えば、癌または網膜症）または増殖性疾患（例えば、癌、良性腫瘍、糸球体腎症、アテローム硬化症、および増殖性血管再狭窄）が挙げられるが、これらに限定されない。適切なＳＰＡＲＣポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸配列を含む、検出された変異体ＳＰＡＲＣポリペプチドが挙げられるがこれに限定されない。

任意の適切な生物学的サンプルが、本発明の方法の文脈において哺乳動物から単離され、ポリペプチドおよび／または核酸の分析のために使用され得る。好ましくは、この生物学的サンプルは、腫瘍生検などにより、腫瘍から単離される。この生物学的サンプルは、当該分野で公知の方法を使用して哺乳動物から単離される。あるいは、生物学的サンプルは、例えば、脳脊髄液、血液、血漿、血清または尿を含む、哺乳動物の体液から単離され得る。特に、多数のタンパク質精製技術が当該分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ｐｐ．４２１−６９６（１９８８）を参照のこと）。

抗Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体抗体の使用（例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ）、ＳＰＡＲＣ特異的結合タンパク質の使用（例えば、放射標識ＳＰＡＲＣリガンド、ＥＬＩＳＡ様アッセイ）または部分的に精製されたもしくは精製されたＳＰＡＲＣポリペプチドの直接的配列決定（例えば、Ｓａｎｇｅｒ配列決定、ＨＰＬＣペプチドマッピングおよびＥｄｍａｎ分解、質量分析技術、酵素的分解）が含まれるがこれらに限定されない、配列番号１中のアミノ酸位置２０に対応する位置でグルタミンが欠失したＳＰＡＲＣポリペプチドの検出のための任意の適切な方法が、本発明に従って使用され得る（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ｐｐ．４２１−６９６（１９８８）；Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７（８）：７５０−７（２００５）；Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（５２）：５４１６１−７２（２００４）を参照のこと）。

本発明はまた、配列番号１のアミノ酸位置２０に対応する位置にグルタミンの欠失を有するＳＰＡＲＣポリペプチドをコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡである核酸が含まれる）を検出することを含む、疾患を分類する方法を検出することを含む、疾患を分類する方法を提供する。さらに、本発明は、検出される変異体ＳＰＡＲＣ核酸が配列番号３の核酸配列を含んでいるものが挙げられるがこれらに限定されない疾患を、分類する方法を提供する。この分類は、例えば、限定ではなく、疾患の存在を示すか、疾患の病期についての情報を提供するか、所定の患者についての予後を示すか、または治療に対する応答を予測し得る。適切な疾患には、血管新生が関与する疾患（例えば、癌または網膜症）または増殖性疾患（例えば、癌、良性腫瘍、糸球体腎症、アテローム硬化症、および増殖性血管再狭窄）が挙げられるが、これらに限定されない。

配列番号１のアミノ酸位置２０に対応する位置にグルタミンの欠失を有するＳＰＡＲＣポリペプチドをコードする核酸の検出のために、任意の適切な方法が本発明に従って使用され得る。

核酸配列情報は、多数の異なる方法で遺伝物質、特に、目的の配列を含む核酸（遺伝物質）を含む生物学的サンプルから獲得され得る。生物学的サンプルから核酸を抽出するための多数の方法が当該分野で公知である。生物学的サンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡの別々の単離または同時単離のための多数の公知の方法が存在する。典型的には、最初にサンプルが溶解され、次いでＤＮＡが、種々の長さの時間がかかり得る、種々の複数工程プロトコルのうちいずれか１つに従ってこの溶解物から単離されるときに、ＤＮＡは生物学的サンプルから単離され得る。ＤＮＡ単離方法は、フェノールの使用を含み得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１），ｐｐ．６．１−６．６２を参照のこと）。例えば、生物学的サンプルは界面活性剤溶液中で溶解され、溶解物のタンパク質成分がプロテアーゼで１２〜１８時間消化される。次に、溶解物がフェノールで抽出され、殆どの細胞成分を除去し、残りの水相をさらに処理してＤＮＡを単離する。ｖａｎ Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，１３０，４２３号）に記載される別の方法において、非腐食性フェノール誘導体が核酸の単離のために使用され、ＲＮＡおよびＤＮＡの混合物である調製物を生じている。

ＤＮＡ単離のための他の方法は、非腐食性カオトロピック剤を利用する。グアニジン塩、尿素およびヨウ化ナトリウムの使用に基づくこれらの方法は、カオトロピック水溶液中での生物学的サンプルの溶解およびその後の低級アルコールでの粗製ＤＮＡ画分の沈殿を含む（例えば、Ａｎａｌｅｃｔｓ，（１９９４）Ｖｏｌ ２２，Ｎｏ．４，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；米国特許第５，１２８，２４７号を参照のこと）。例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（米国特許第５，９４５，５１５号）に記載されるような、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を単離するための多数の他の方法が当該分野で公知であり、これにより、遺伝物質が２０分ほどの短時間で効率的に抽出できる。

一旦対象の核酸が対象から得られると、これは次いで、目的の配列中の１つ以上の多型または変異の存在または非存在を検出または決定するためにさらに分析され得る。ただし、得られた遺伝物質は目的の配列を含むものとする。特に、配列番号１中のアミノ酸２０に対応するグルタミンが欠失しているアミノ酸配列を含むＳＰＡＲＣポリペプチドをコードする核酸配列を検出できる。目的の配列は、他の変異を含んでいてもよく、あるいは目的の変異の周囲の配列をいくらか含んでいてもよい。

ヌクレオチドの正体または１つ以上の一塩基多型の存在の検出または決定（ＳＮＰタイピング）は、当該分野で公知の多数の方法またはアッセイのいずれか１つによって達成され得る。多数のＤＮＡタイピング方法論がＳＮＰの検出に有用であり、これには、配列特異的ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、オリゴヌクレオチドライゲーションおよび侵入切断法が含まれるがこれらに限定されない。適切な反応は、溶液中または固体支持体（例えば、ガラススライド、チップ、ビーズなど）上で生じ得る。

配列特異的ハイブリダイゼーションは、１つのヌクレオチド位置にて異なる２つのＤＮＡ標的間をハイブリダイゼーションによって識別できる、ハイブリダイゼーションプローブを含む。１つのアプローチにおいて、「分子ビーコン」は、３’ にレポーター分子を有し５’にクエンチャー分子を有するハイブリダイゼーションプローブであり、３’および５’の配列は、介在配列に対する適切な結合標的が存在しない場合にプローブがヘアピンループを形成するように、相補的である。ヘアピンループは、レポーターおよびクエンチャーを密に近づけて維持し、蛍光発光を減じるフルオロフォアのクエンチングを生じる。標的へのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアとクエンチャーとは充分に分離され、フルオロフォアからの蛍光の発光を可能にする。プライマー伸長反応（即ち、ミニシークエンシング、ヌクレオチド特異的伸長または単純なＰＣＲ増幅）もまた、配列識別反応において有用であり得る。

オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、ＳＮＰ１つ当たり２つの配列特異的プローブおよび１つの共通ライゲーションプローブを必要とする。共通ライゲーションプローブは、配列特異的プローブに隣接してハイブリダイズし、適切な配列特異的プローブの完全一致が存在する場合、リガーゼが、配列特異的プローブおよび共通プローブの両者をライゲーションする。

侵入切断法は、１ヌクレオチドが重複して標的ＤＮＡにアニールする、「Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）」（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プローブと呼ばれるオリゴヌクレオチドおよび配列特異的プローブを必要とする。配列特異的プローブが多型塩基に相補的である場合、インベーダーオリゴヌクレオチドの３’末端の重複は、Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼによって認識および切断されてアレル特異的プローブの５’アームを放出する構造を形成する。

５’エキソヌクレアーゼ活性または「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、標的ＤＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを置換および切断するＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性に基づき、蛍光シグナルを発生させる。これには、多型部位にて異なる２つのプローブが必要であり、一方のプローブは「正常」配列に相補的であり、他方のプローブは目的の変異に相補的である。これらのプローブは、５’末端に結合した種々の蛍光色素および３’末端に結合した１つのクエンチャーを有し、プローブがインタクトな場合には、クエンチャーはフルオロフォアと相互作用し、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によってプローブの蛍光をクエンチする。ＤＮＡアニーリング工程の間に、ハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡにハイブリダイズする。伸長工程において、５’側の蛍光色素は、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、レポーター色素の蛍光の増加を導く。ミスマッチしたプローブは、断片化せずに置換される。サンプル中の変異の存在は、２つの異なる色素のシグナル強度を測定することによって決定される。

さらに、配列の識別および検出のための多数の他の方法が存在し、アレイ化プライマー伸長ミニシークエンシング、タグマイクロアレイおよび配列特異的伸長などが、マイクロアレイ上で実施され得る。１つのこのようなアレイベースの遺伝子型決定プラットホームは、ミクロスフィアベースの「ｔａｇ−ｉｔ」ハイスループット遺伝子型決定アレイである（Ｂｏｒｔｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０（１１）：２０２８−３６（２００４））。

変異検出方法には、以下も含まれ得るがこれらに限定されない：

制限断片長多型（ＲＦＬＰ）戦略−ＲＦＬＰゲルベースの分析が、制限部位の存在または非存在に基づいて遺伝子内の多型部位での特定の変異の存在または非存在を示すために使用され得る；

配列決定−例えば、配列決定のためのＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ技術（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４（４）：５６０−５６４（１９７７））、またはジデオキシ法の配列決定がＳａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４（１２）：５４６３−５４６７（１９７７））により刊行されている。さらに、ＲＮＡ配列決定法も公知である。例えば、ジデオキシヌクレオチドと共に逆転写酵素が、脳心筋炎ウイルスＲＮＡを配列決定するために使用されている（Ｚｉｍｍｅｒｎ ＆ Ｋａｅｓｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５（９）：４２５７−４２６１（１９７８））。ＭｉｌｌｓおよびＫｒａｍｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６（５）：２２３２−２２３５）は、鎖停止機構でＲＮＡを配列決定するための、Ｑβレプリカーゼおよびヌクレオチドアナログであるイノシンの使用を記載している。ＲＮＡを配列決定するための直接化学法も公知である（例えば、Ｐｅａｔｔｉｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６（４）：１７６０−１７６４（１９７９））。核酸配列は、単一ヌクレオチドが蛍光増強マトリックス中に含まれたままで、切断されたヌクレオチドの天然の蛍光をレーザーで刺激することによっても読み取ることができる（米国特許第５，６７４，７４３号）；

一塩基多型または数ヌクレオチドが関与する他の変異の同定のためのハイブリダイゼーション法が、米国特許第６，２７０，９６１号および同第６，０２５，１３６号に記載されている；

蛍光偏光検出を用いるテンプレート指向性ダイターミネーター取り込み（ＴＤＩ−ＦＰ）法が、Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ４（４）：２０９−２１５（２００２））によって記載されている；

オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）は、酵素イムノアッセイによる検出を用いる、ポリメラーゼ連鎖反応単位複製配列鎖にアニールしたプローブと検出子オリゴヌクレオチドとのライゲーションに基づく（例えば、Ｖｉｌｌａｈｅｒｍｏｓａ，Ｊ．Ｈｕｍ．Ｖｉｒｏｌ．４（５）：２３８−４８（２００１）を参照のこと）；

ライゲーション−ローリングサークル増幅（Ｌ−ＲＣＡ）もまた、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（２２）：Ｅ１１６（２００１））に記載されるように、一塩基多型の遺伝子型決定に首尾よく使用されている；

５’ヌクレアーゼアッセイもまた、一塩基多型の遺伝子型決定に首尾よく使用されている（Ａｙｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（４）：９２０−２，９２４，９２６−８（２００１））；

ポリメラーゼプルーフリーディング法は、ＰＣＴ公報ＷＯ ０１／８１６３１に記載されるように、ＳＮＰの正体を決定するために使用される；

酵素により増幅された電気的変換による単一塩基対のＤＮＡ変異の検出は、Ｐａｔｏｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００１）１９（３）：２５３−２５７（２００１）に記載されている；

遺伝子チップ技術もまた、一塩基多型の識別のために公知であり、それにより、多数の多型が単一のアレイ上で同時に試験され得る（例えば、Ｇｒｉｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７（４）：３６５−７０（１９９９）を参照のこと）；

マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析もまた、マイクロシークエンシング産物の分析を介して一塩基多型を遺伝子型決定する際に有用である（例えば、Ｈａｆｆ ＆ Ｓｍｉｒｎｏｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１８）：３７４９−５０（１９９７）を参照のこと）。

配列特異的ＰＣＲ法もまた、一塩基多型を遺伝子型決定するために首尾よく使用されている（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．（２００２）１９（５）：５４３−５５３）。従って、本発明は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする核酸がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む方法を使用して検出される方法を提供する。さらに、本発明は、変異体および非変異体ＳＰＡＲＣ核酸がＰＣＲを含む方法を使用して検出される方法を提供し、この方法において、１つ以上の順方向プライマーは配列番号７〜９の配列を含むプライマーから選択され、逆方向プライマーは配列番号１０の配列を含む。

あるいは、対象の遺伝子配列データが既に知られている場合、得るとは、データベースから対象の核酸配列データを検索し、その後、多型部位において対象の核酸配列を読み取ることによって多型部位における核酸または遺伝子型の正体を決定または検出することを含み得る。

本発明はまた、内皮バリアを横切って血管から腫瘍間質へと治療組成物を輸送する手段を提供する。抗体治療および化学療法における主な障害は、内皮バリアを横切った腫瘍間質への移行である。アルブミンは、内皮バリアを横切るためにアルブミンレセプター輸送機構を利用する。この輸送機構は、文献に報告された機構（ｇｐ６０およびアルボンジン（ａｌｂｏｎｄｉｎ））と同じ機構であるか、または他の機構によるものであり得る。アルブミンに担持された治療剤は、増強された腫瘍取り込みを示した（実施例−ＡＢＩ−００７の腫瘍取り込みおよびトランスサイトーシス）。内皮バリアを横切る増強された移行は、生理学的アルブミン輸送機構を使用して達成され得る。

低分子について、アルブミンに対する薬物の親和性が増大するように、修飾がなされ得る。低分子の製剤について、アルブミンに対する薬物の結合を防止する溶媒が除去され得る。あるいは、低分子は、以下に記載するような、アルブミン、アルブミンに対する抗体、そのフラグメント、またはアルブミン−レセプターに対するリガンドに連結され得る。

タンパク質、抗体およびそのフラグメントのような生物学的分子について、生物学的分子がアルブミンに対する親和性を示すように、アルブミン結合ペプチドで生物学的分子を操作することが可能である。このペプチドは、アルブミン結合配列、アルブミンに対する抗体もしくは抗体フラグメント、アルブミン担体（例えば、ｇｐ６０／アルボンジン／スカベンジャーレセプター／またはＴＧＦ−βレセプター）に対する抗体もしくは抗体フラグメント、またはアルブミンのトランスポーターであるカベオラで見出される任意のタンパク質に対する抗体のいずれかであり得る。本発明はまた、１つの価がＳＰＡＲＣに対するものであり、他方の価が経内皮輸送のエフェクター（例えば、ｇｐ６０／アルボンジン／スカベンジャーレセプター／またはＴＧＦ−βレセプター）に対するものであるキメラとして調製された抗体またはその適切なフラグメント、あるいは内皮細胞のカベオラ中に見出される任意のタンパク質に対する抗体またはその適切なフラグメントを企図する。

以下の実施例は、本発明をさらに説明しているが、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでないことは当然である。

実施例１
この実施例は、ＭＸ−１腫瘍異種移植片における、ＳＰＡＲＣとアルブミンとの同時局在を示す。

パクリタキセルアルブミンナノ粒子（Ａｂｒａｘａｎｅ、ＡＢＸまたはＡＢＩ−００７）は、第ＩＩＩ相転移性乳癌試験において、Ｔａｘｏｌ（ＴＡＸ）を超える改善された応答率を有することが示されている（３３％対１９％、ｐ＜０．０００１）（例えば、Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ，ＳＡＢＣＳ ２００３を参照のこと）。ＴＡＸに対してＡＢＸで、パクリタキセル（Ｐ）のアルブミン媒介性の経内皮輸送およびパクリタキセルの腫瘍内蓄積の増加が、最近実証された（例えば、Ｄｅｓａｉ，ＳＡＢＣＳ ２００３を参照のこと）。アルブミンはＳＰＡＲＣに結合する（例えば、Ｓｃｈｎｉｔｚｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６０７２−８２（１９９４）を参照のこと）。

ＭＸ−１腫瘍細胞株は、ヒト乳癌由来である。ヒトＭＸ−１腫瘍異種移植片、ヒト原発性乳癌組織（ｎ＝１４１）および正常ヒト乳房組織（ｎ＝１１５）の連続凍結切片を免疫染色し、アルブミン、ＳＰＡＲＣ（抗ＳＰＡＲＣ抗体を使用する）およびカベオリン−１染色についてスコアリングした（０〜４）。培養ＭＸ−１細胞もまたＳＰＡＲＣについて免疫染色した。パクリタキセルアルブミンナノ粒子（Ａｂｒａｘａｎｅ、ＡＢＸまたはＡＢＩ−００７）およびＴａｘｏｌ（ＴＡＸ）を、放射性パクリタキセル（Ｐ）を用いて調製し（２０ｍｇ／ｋｇ 静脈内）、胸腺欠損マウスの正常組織におけるパクリタキセルの体内分布を決定するために使用した。

ＭＸ−１腫瘍におけるアルブミン染色は限局的であり、ＳＰＡＲＣと同時局在した（図１）。カベオリン−１染色により、アルブミン含有領域の血管密度は、アルブミンを含まない領域と異ならないことが確認された。ＭＸ−１培養細胞によるＳＰＡＲＣ発現は、抗ＳＰＡＲＣ抗体による陽性染色によって確認した。正常組織（ＳＰＡＲＣ陰性）におけるパクリタキセル蓄積は、７／１０の組織について、ＴＡＸと比較してＡＢＸについて有意に低かった（ｐ＜０．００４）。４６％のヒト原発性乳癌は、正常組織についての１％と比較して、強いＳＰＡＲＣ染色（スコア＞２）を示した（ｐ＜０．０００１）。５０個の腫瘍組織のサブセットにおいて、ＳＰＡＲＣ発現は、病期とも、ＥＲ状態とも、ＰｇＲ状態とも相関しなかったが、ｐ５３陰性腫瘍において高いＳＰＡＲＣ発現の傾向があった。

アルブミンおよびＳＰＡＲＣの同時局在は、ＳＰＡＲＣが、そのアルブミン結合活性により、乳腺腫瘍におけるアルブミン結合のための腫瘍内標的として挙動し得ることを示唆する。ＡＢＸにおけるパクリタキセルの輸送はアルブミンに依存するので（例えば、Ｄｅｓａｉ ＳＡＢＣＳ，２００３を参照のこと）、これは、ＴＡＸと比較して改善されたＡＢＸの腫瘍内蓄積を説明し得る。正常組織におけるＳＰＡＲＣ発現の欠如と一致して、正常組織におけるＡＢＸ蓄積はＴＡＸよりも低かった。ＳＰＡＲＣについての患者のスクリーニングにより、ＡＢＸに対してより応答性の患者の同定が可能となる。これらの腫瘍におけるＳＰＡＲＣの存在により、抗ＳＰＡＲＣ抗体を使用した標的化および治療が可能となる。

実施例２
この実施例は、パクリタキセルアルブミンナノ粒子（ＡＢＩ−００７）の、内皮レセプター（ｇｐ６０）媒介性のカベオラトランスサイトーシスを示す。

パクリタキセル（Ｐ）アルブミンナノ粒子（Ａｂｒａｘａｎｅ、ＡＢＸまたはＡＢＩ−００７）は、第ＩＩＩ相転移性乳癌試験において、Ｔａｘｏｌを超える改善された応答率を実証した（３３％対１９％、ｐ＜０．０００１）（ＳＡＢＣＳ，Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ，２００３）。Ｔａｘｏｌ（ＴＡＸ）中のＣｒｅｍｏｐｈｏｒは、血漿においてミセル中にＰを捕捉し、細胞区画に利用可能なパクリタキセルを減少させる（例えば、Ｓｐａｒｒｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．，５９，１４５４（１９９９）を参照のこと）。胸腺欠損マウスにおける研究により、等用量のＴＡＸと比較して、ＡＢＸでは３０〜４０％高い腫瘍内パクリタキセル濃度が示されている（ＳＡＢＣＳ，Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ，２００３）。アルブミンは、特異的レセプター（ｇｐ６０）媒介性カベオラ輸送によって、内皮細胞（ＥＣ）を横切って輸送される（例えば、Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８４，Ｌｌ８７（２００１）を参照のこと）。ＡＢＸ中のアルブミン結合パクリタキセルは、ｇｐ６０によって腫瘍微小血管ＥＣを横切って輸送され得、この機構は、ＴＡＸと比較してＡＢＸに対して特に活性であり得る。

一連の実験を実施して、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＬＭＶＥＣ）によるパクリタキセルの結合および輸送を、ＡＢＸおよびＴＡＸについて評価した。蛍光パクリタキセル（ＦＰ）をプローブとして使用し、蛍光ＡＢＸおよびＴＡＸを、ＦＰを用いて調製して、パクリタキセルの結合およびトランスウェル装置上で増殖したＥＣ単層を横切るパクリタキセルの輸送を探索した。

細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するパクリタキセルの結合は、ＴＡＸよりもＡＢＸについて１０倍高かった。ＥＣ単層を横切るＡＢＸからのパクリタキセルの輸送は、ＨＵＶＥＣおよびＨＭＶＥＣについてそれぞれ、ＴＡＸと比較して２〜３倍および２〜４倍増強された。輸送はアルブミン依存的であった。ＡＢＸからのパクリタキセルの輸送は、カベオラアルブミントランスサイトーシスに必要なレセプターであるｇｐ６０に結合することが知られている抗ＳＰＡＲＣ抗体の存在によって阻害された。カベオラトランスサイトーシスの公知のインヒビターであるＮＥＭおよびβ−メチルシクロデキストリン（ＢＭＣ）もまた、内皮単層を横切るＡＢＸからのパクリタキセルの輸送を阻害した（図２）。カベオラ輸送の阻害により、ＡＢＸからのＰの輸送がＴＡＸ輸送のレベルまで減少した。

これらの結果は、ＡＢＸからのパクリタキセルがｇｐ６０媒介性のカベオラトランスサイトーシスによってＥＣを横切って能動的に輸送されるが、ＴＡＸからのＰは、主に傍細胞（非カベオラ）機構によって、２〜４分の１の速度で輸送されるようであることを実証している。この経路は、ＴＡＸと比較してＡＢＸで見られたパクリタキセルの腫瘍内濃度の増加を一部担う可能性がある。ＴＡＸ中のＣｒｅｍｏｐｈｏｒは、内皮細胞を横切るパクリタキセルのトランスサイトーシスを阻害する。

実施例３
この実施例は、ＭＸ−１腫瘍細胞における表面ＳＰＡＲＣの発現を示す。

ＭＸ−１細胞をカバーガラス上で培養し、当該分野で公知の方法を使用してヒトＳＰＡＲＣに対する抗体で染色した。ＭＸ−１がＳＰＡＲＣを発現していることを実証する抗体染色が観察された。これらの結果は、ＭＸ−１腫瘍細胞中で検出されたＳＰＡＲＣ発現が、ＭＸ−１腫瘍細胞によるＳＰＡＲＣ分泌の結果であることを示唆する。染色は、正常初代細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、ＨＬＭＶＥＣ（ヒト肺微小血管内皮細胞）およびＨＭＥＣ（ヒト乳腺上皮細胞））よりもＭＸ−１腫瘍細胞で強力であった。ＳＰＡＲＣ染色の大部分は内部ＳＰＡＲＣであったが、共焦点顕微鏡および非透過化細胞の染色によって実証されるとおり、有意なレベルの表面ＳＰＡＲＣが検出された。

実施例４
この実施例は、標識されたアルブミンのＭＸ−１腫瘍細胞中への内在化およびＭＸ−１細胞内での細胞内ＳＰＡＲＣ発現との同時局在を示す。

ＭＸ−１細胞をカバーガラス上で培養し、適切な薬剤を用いて透過化した。細胞を蛍光アルブミンに曝し、洗浄後にＳＰＡＲＣ抗体に曝した。この後、アルブミンとは異なる蛍光タグを有する二次抗体に曝した。驚くべきことに、標識されたアルブミンは細胞内のＳＰＡＲＣの存在と同時局在することが観察され、このことは、アルブミンが迅速に内在化され、細胞内ＳＰＡＲＣに標的化されたことを示す。

実施例５
この実施例は、パクリタキセルおよびアルブミンを含む医薬組成物の、Ｔａｘｏｌと比較した、ｇｐ６０（アルブミンレセプター）を介した内皮トランスサイトーシスの増加を実証する。

ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＬＭＶＥＣ）をコンフルエントになるまでトランスウェル上で増殖させた。パクリタキセルおよびアルブミンを含む本発明の医薬組成物または蛍光パクリタキセル（Ｆｌｕｔａｘ）を含むＴａｘｏｌを、２０μｇ／ｍＬの濃度で、上部トランスウェルチャンバに添加した。

上部チャンバから下部チャンバへのトランスサイトーシスによるパクリタキセルの輸送は、蛍光光度計を用いて継続的にモニタリングした。Ｆｌｕｔａｘのみを含みアルブミンを含まないコントロールもまた使用した。Ｆｌｕｔａｘを含むコントロールは輸送を示さず、コンフルエントなＨＬＭＶＥＣ単層の完全性が確認された。アルブミン−パクリタキセル組成物からのパクリタキセルの輸送は、５％ ＨＳＡ（生理学的濃度）の存在下で、Ｔａｘｏｌからのパクリタキセルよりも速かった。アルブミン−パクリタキセル組成物およびＴａｘｏｌについての輸送速度定数（Ｋ_ｔ）は、それぞれ１．３９６／ｈおよび０．０３／ｈであった。単層を横切って輸送されたパクリタキセルの総量は、アルブミン−パクリタキセル組成物ではＴａｘｏｌよりも３倍高かった。従って、アルブミンまたは他の適切な模倣物（ｇｐ６０レセプターまたは他の内皮細胞レセプターに対する抗体またはフラグメントを含む）の使用は、内皮バリアを横切った腫瘍間質への所望の治療剤の輸送を補助し得る。

実施例６
この実施例は、ヒト乳癌細胞におけるＳＰＡＲＣタンパク質の過剰発現を示す。

ヒト乳癌細胞におけるＳＰＡＲＣ発現を、Ｃｙｂｒｄｉ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）製の腫瘍アレイを使用して決定した。この分析の結果を表１に示す。染色の強度を、「陰性」から４＋までスコアリングした。より大きい数字はより高い過剰発現強度に対応する。乳癌の４９％がＳＰＡＲＣについて陽性（２＋以上）と染色され、それに対して正常組織では１％であった（ｐ＜０．０００１）。

実施例７
この実施例は、ＳＰＡＲＣに対する抗ＳＰＡＲＣ抗体の特異的結合を実証する。

全細胞抽出物を、超音波処理によってＨＵＶＥＣ細胞から調製した。タンパク質を、５〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブレン上に移し、ＳＰＡＲＣに対するポリクローナル抗体およびＳＰＡＲＣに対するモノクローナル抗体で可視化した。これらの抗体は共に、ＳＰＡＲＣの正確な分子量である３８ｋＤａで単一バンドに反応した。ＭＸ−１を同じ方法で分析した場合、ＳＰＡＲＣは、清澄化した細胞溶解物または膜に富んだ膜画分の両方で検出された。

実施例８
この実施例は、頭頸部扁平上皮癌においてナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（ＡＢＩ−００７）を使用して、ＳＰＡＲＣ過剰発現と高い応答率との相関を実証する。

頭頸部（Ｈ＆Ｎ）および肛門管の扁平上皮癌（ＳＣＣ）を有する患者の第Ｉ相および第ＩＩ相の臨床試験において、動脈内送達されたナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ、ＡＢＸまたはＡＢＩ−００７）について、それぞれ７８％および６４％の応答率が観察された（例えば、Ｄａｍａｓｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，９２（１０），２５９２−２６０２（２００１）およびＤａｍａｓｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＪＲ，１８１，２５３−２６０（２００３）を参照のこと）。ＡＢＸおよびＴａｘｏｌ（ＴＡＸ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性の比較において、本発明者らは、扁平上皮頸部（Ａ４３１）株が、ＴＡＸ（０．０１２μｇ／ｍｌ）に対して、ＡＢＸ（０．００４μｇ／ｍｌ）について改善されたＩＣ_５０を実証することを観察した。ＴＡＸに対してＡＢＸでの、アルブミンにより媒介されるパクリタキセル（Ｐ）の経内皮カベオラ輸送およびＰの腫瘍内蓄積の増大が、最近実証された（例えば、Ｄｅｓａｉ，ＳＡＢＣＳ ２００３を参照のこと）。ヒトＨ＆Ｎ腫瘍組織（ｎ＝１１９）および正常ヒトＨ＆Ｎ組織（ｎ＝１５）を免疫染色し、腫瘍および正常組織アレイを使用して、ＳＰＡＲＣ染色についてスコアリングした（０〜４）。免疫染色は、ポリクローナルウサギ抗ＳＰＡＲＣ抗体を使用して実施した。ＳＰＡＲＣは、Ｈ＆Ｎ腫瘍の６０％（７２／１１９）において過剰発現され（スコア＞２）、それに対して正常組織では０％（０／１５）であった（ｐ＜０．０００１）。これは、アルブミン結合パクリタキセルの、扁平上皮Ｈ＆Ｎ癌で発現されたＳＰＡＲＣに対する結合に起因して、これらの腫瘍において以前に観察されたＡＢＸの高い単一薬剤活性を説明し得る。

新たな第Ｉ相用量増加試験（３週に１回、３０分かけて静脈内で与えたＡＢＸ）において、頭頸部癌患者のサブセット（ｎ＝３）を、ＡＢＸに対する応答について分析した。第Ｉ相試験において、２／３のＨ＆Ｎ患者が、１３５ｍｇ／ｍ^２（１ｐｔ）および２２５ｍｇ／ｍ^２（１ｐｔ）の用量レベルでの２サイクルの処置後、部分的応答（ＰＲ）を達成した。３番目の患者は２６０ｍｇ／ｍ^２で進行した。これらの患者からの腫瘍組織をＳＰＡＲＣについて染色したところ、１人の応答性患者は、ＳＰＡＲＣについて強い過剰発現を示した。

動脈内Ａｂｒａｘａｎｅで処置した頭頸部（Ｈ＆Ｎ）の扁平上皮癌（ＳＣＣ）を有する患者の別の第ＩＩ相臨床試験において、６８％の全体的応答率が示された。組織をＳＰＡＲＣ染色について分析した１０人の応答性患者において、７０％がＳＰＡＲＣを強く過剰発現することが見出された。

実施例９
この実施例は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードするヒトＳＰＡＲＣ ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定を実証する。

正常ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリーを、米国特許第６，３１６，１９３号に記載されたようなハイスループットのスクリーニング方法を使用して、ＳＰＡＲＣ ｃＤＮＡを含むクローンについてスクリーニングした。ＳＰＡＲＣ ｃＤＮＡクローンを単離し、その長さに沿って分布したプライマーを使用して配列決定し、完全なｃＤＮＡ配列を得た（図３を参照のこと）。配列決定データを、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムを使用してアセンブルした。ヒトＳＰＡＲＣ ｃＤＮＡについての参照Ｇｅｎｅｂａｎｋ配列（ＮＭ ００３１１８［ｇｉ：４８６７５８０９］、最終更新日は２００５年１２月４日）をアセンブリのために使用した。各プライマーについての配列決定データの分布を図３に示し、個々の配列反応の結果を図４に示す。

完全にアセンブルされた２，９５６塩基対のｃＤＮＡ配列（配列番号３）を図５に示す。図５中の太字／下線のトリヌクレオチドはそれぞれ、コードされたＱ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドの翻訳開始部位およびコードされた成熟Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド（１７アミノ酸のリーダー配列後のアミノ酸配列）中の第１コドンである。配列番号３のオープンリーディングフレームは、野生型ＳＰＡＲＣアミノ酸配列（配列番号１）中の２０位のグルタミンに対応するグルタミンの欠失を有する全長ＳＰＡＲＣタンパク質をコードする。

配列番号３からの、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードする全長オープンリーディングフレームの翻訳を図６に示す。このオープンリーディングフレームの開始コドンは、配列番号３のヌクレオチド８７にあり、このオープンリーディングフレームは配列番号３のヌクレオチド９９２で終わる。翻訳されたアミノ酸配列は３０２コドン長であり、配列番号４により開示される。全長オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列は、配列番号５により開示される。

図７は、配列番号３によりコードされる成熟Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドのアミノ酸配列（１７アミノ酸のリーダー配列を有さない配列）を示す。これは、配列番号３のヌクレオチド１３８〜９９２の翻訳から生じる。成熟Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドは配列番号２であり、成熟Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は配列番号６である。

実施例１０
この実施例は、配列番号３によってコードされるＳＰＡＲＣポリペプチド中の、野生型ＳＰＡＲＣアミノ酸配列（配列番号１）中の２０位でのグルタミンの欠失（「Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失」）の同定を実証する。

Ｇｅｎｅｂａｎｋ中に登録されたヒトＳＰＡＲＣ ｃＤＮＡ配列との、配列番号３のＤＮＡ配列のアラインメント（図８）は、配列番号３が、成熟ＳＰＡＲＣタンパク質のＱ３をコードするコドンに対応する３塩基対の欠失（太字）を含むことを実証した。さらに、配列番号３、配列番号４から翻訳されたＳＰＡＲＣのオープンリーディングのアラインメントは、野生型ＳＰＡＲＣアミノ酸配列中の２０位のグルタミン（Ｑ３アミノ酸）の欠失を実証した（図９）。

実施例１１
この実施例は、成熟ＳＰＡＲＣタンパク質のアミノ酸位置３および位置４でのグルタミン残基（「Ｑ３Ｑ４」アミノ酸）の進化的保存を実証する。

系統樹にわたるＳＰＡＲＣのアミノ酸配列の試験により、Ｑ３Ｑ４の哺乳動物および両生類にわたる保存が明らかとなった。単一のグルタミンは、ラットおよびニワトリでのみ観察された。Ｑ３もＱ３Ｑ４も魚類では観察されなかった。魚類および鳥類の骨格構造は、哺乳動物および両生類のものよりもかなり軽く、このことは、トランスグルタミナーゼのためのこの部位が、高度に架橋され、構造的に小型な骨格構造の形成に関与することを示唆している。Ｑ３のみを有するＳＰＡＲＣが、血管形成、腫瘍増殖、アルブミン結合などの非骨格機能に関与するのは自由であり得る。

高等生物におけるグルタミンのＱ３Ｑ４対の保存は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドが新規特性を有し得ることを示唆する。

実施例１２
この実施例は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの、発現ベクターへのサブクローニングを実証する。

ＳＰＡＲＣ ｃＤＮＡをＮｏｔＩで切り出し、ｐＣＤＮＡ３．１のＮｏｔＩ部位にサブクローニングして、ｐＶＴ１０００Ｑ３を得た。ＣＭＶプロモーターに対する挿入物の配向を、制限消化（ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＳｓｐＩ）および配列決定によって確認した。制限消化により、４つ全ての制限酵素について予測されたサイズを有するフラグメントが生じた（図１１）。ｐＶＴ１０００Ｑ３構築物についての制限マップを図１２に示す。

本発明者らは、ｐＶＴ１０００Ｑ３が、当業者に周知のトランスフェクション法を使用して、ＣＨＯ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ３、ＨＴ２９およびＭＸ−１細胞株を容易にトランスフェクトするであろうことを予測している。

実施例１３
この実施例は、Ｑ３のｐＶＴ１０００Ｑ３への挿入によるプライマー指向性変異誘発が、野生型ＳＰＡＲＣポリペプチドをコードする配列を生じることを実証する。

Ｑ３コドンを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー（図１３を参照のこと）を、当業者に周知のプライマー指向性変異誘発法で使用した。得られたプラスミドｐＶＴ１０００ｗｔは、予測された野生型Ｑ３Ｑ４ ＳＰＡＲＣ配列を示した。

実施例１４
この実施例は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチド（即ち、「Ｑ３変異」）をコードする核酸のＰＣＲ検出を実証する。

ＳＰＡＲＣ ｃＤＮＡのＱ３変異および野生型形態を検出するために設計したプライマーの位置および配列を図１４に示す。順方向プライマーとしての本発明のＰＣＲプライマーＳＰＡＲＣ−ＦＱ３、ＳＰＡＲＣ−ＦＷＴおよびＳＰＡＲＣ−ＦＱ３＆Ｗ（それぞれ、配列番号７〜９）および本発明の逆方向ＰＣＲプライマーとしての本発明の分子ＳＰＡＲＣ−ＲＱ３＆Ｗ（配列番号１０）を、当業者に周知の標準的な逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）反応で使用した。Ｑ３変異および野生型の配列を、表２に示されるように、ＰＣＲ反応において本発明のプライマーを使用し、その後ゲル電気泳動して識別した。

以下のＰＣＲ増幅条件を使用した：９５℃で１０分間のホットスタート、その後（９５℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で４０秒）×３０サイクル、および７２℃で１０分間の最終伸長。Ｑ３変異を保有するｐＶＴ１０００Ｑ３および野生型ＳＰＡＲＣを保有するｐＶＴ１０００ｗｔを、コントロールとして使用する。３０９塩基対産物の非存在について反応ミックス＃３および＃４で、３０９塩基対産物の存在について反応ミックス＃１および＃２で、Ｑ３変異を検出した。反応ミックス＃３および＃４での３０９塩基対産物の存在として、ならびに反応ミックス＃２での３０９塩基対産物の非存在として、野生型配列を検出した。反応ミックス＃１では、野生型配列は３０９塩基対産物を生じたが、反応ミックス＃３および＃４よりもかなり弱いレベルであった。従って、反応ミックス＃３は、野生型ＳＰＡＲＣ配列（非Ｑ３変異体配列）を検出するのにより強力である（図１５）。

本明細書中に引用された全ての参考文献（刊行物、特許出願および特許を含む）は、各参考文献が参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、その全体が本明細書中に示されるのと同程度まで、本明細書で参照により組み込まれる。

本発明（特に、添付の特許請求の範囲に関して）を記載することに関して、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の指示対象の使用は、本明細書中に異なって示されるか、文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方をカバーすると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、異なって示されない限り、オープンエンドの用語（即ち、「含むがそれに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中で異なって示されない限り、この範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として機能することを意図するに過ぎず、各個別の値は、それが本明細書中に個々に列挙されるのかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に異なって示されるかさもなくば文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意のおよび全ての例または例示的語句（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図するものであり、異なって特許請求されない限り、本発明の範囲を限定しない。本明細書中の語句はいずれも、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須なものとして示していると解釈すべきではない。

本発明者らが知る発明を実施するための最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態を本明細書中に記載している。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上記の記載を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がこのようなバリエーションを必要に応じて使用することを予測しており、また本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたもの以外の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法により許容されるとおり、本明細書に添付した特許請求の範囲に列挙された対象の全ての改変物および均等物を包含する。さらに、全ての可能なそれらのバリエーションにおける上記要素の任意の組み合わせが、本明細書中に異なって示されるかさもなくば文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。

図１は、ＭＸ−１腫瘍異種移植片におけるアルブミンおよびＳＰＡＲＣの染色を示す。 図２は、内皮細胞単層を横切るパクリタキセルのトランスサイトーシスを示す。 図３は、ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリーから単離されたＳＰＡＲＣ ｃＤＮＡクローンのＳＰＡＲＣ ＤＮＡ配列を決定するために使用した配列決定戦略を示す。 図４Ａは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｂは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｃは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｄは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｅは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｆは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｇは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｈは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｉは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｊは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｋは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｌは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｍは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｎは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｏは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｐは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｑは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｒは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｓは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｔは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図４Ｕは、図３に示された配列決定反応の結果を開示する。 図５は、配列番号３のＤＮＡ配列を開示する。 図６は、配列番号５の翻訳である配列番号４のアミノ酸配列を開示する。 図７は、配列番号６の翻訳である配列番号２のアミノ酸配列を開示する。 図８Ａは、配列番号３（Ｑｕｅｒｙ）と野生型ＳＰＡＲＣ ｃＤＮＡ配列（Ｓｂｊｃｔ）との、ＤＮＡ配列アラインメントを示す。 図８Ｂは、配列番号３（Ｑｕｅｒｙ）と野生型ＳＰＡＲＣ ｃＤＮＡ配列（Ｓｂｊｃｔ）との、ＤＮＡ配列アラインメントを示す。 図８Ｃは、配列番号３（Ｑｕｅｒｙ）と野生型ＳＰＡＲＣ ｃＤＮＡ配列（Ｓｂｊｃｔ）との、ＤＮＡ配列アラインメントを示す。 図９は、野生型ＳＰＡＲＣアミノ酸配列（ｓｅｑ１）と配列番号４（ｓｅｑ２）との、アミノ酸配列アラインメントを示す。 図１０Ａは、ＳＰＡＲＣアミノ酸配列の系統比較を開示する。 図１０Ｂは、ＳＰＡＲＣアミノ酸配列の系統比較を開示する。 図１１は、ｐＶＴ１０００Ｑ３プラスミドの確認的制限消化のゲル電気泳動結果を示す。 図１２は、ｐＶＴ１０００Ｑ３プラスミドの制限マップを示す。 図１３は、部位特異的変異誘発法において使用した変異誘発プライマーおよび標的化した配列を示す。 図１４は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドおよび／または野生型ＳＰＡＲＣポリペプチドをコードする核酸の存在を検出するために使用したＰＣＲプライマーの位置および配列を示す（「Ｑｕｅｒｙ」、変異体配列；「Ｓｂｊｃｔ」、野生型配列）。 図１１は、Ｑ３ ＳＰＡＲＣ欠失変異体ポリペプチドおよび／または野生型ＳＰＡＲＣポリペプチドをコードする核酸の存在を検出するために使用したＰＣＲ反応のゲル電気泳動結果を示す。

Claims (64)

1. 配列番号１中のアミノ酸２０に対応するグルタミンが欠失したアミノ酸配列を含む、単離されたＳＰＡＲＣポリペプチド。
2. 配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＳＰＡＲＣポリペプチド。
3. 請求項１に記載のＳＰＡＲＣポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
4. 核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。
5. 請求項３に記載の核酸配列を含むベクター。
6. ＳＰＡＲＣポリペプチドをコードする核酸配列の発現を制御するプロモーターをさらに含む、請求項５に記載のベクター。
7. 請求項３に記載の核酸分子を含む、細胞。
8. 原核細胞である、請求項７に記載の細胞。
9. 真核細胞である、請求項７に記載の細胞。
10. ａ．請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸で細胞を形質転換すること、
    ｂ．形質転換された細胞による該ポリペプチドの発現を誘導すること、および
    ｃ．該ポリペプチドを精製すること、
    を含む、請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法。
11. 請求項１に記載のポリペプチド及び医薬上許容される担体を含む、組成物。
12. 請求項１に記載のポリペプチドを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において疾患を治療する方法。
13. 疾患が細胞増殖性疾患である、請求項１２に記載の方法。
14. 請求項１に記載のポリペプチドを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において疾患を感作する方法。
15. １種以上の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
16. 疾患が癌である、請求項１４に記載の方法。
17. ポリペプチドが治療剤にカップリングされている、請求項１１に記載の組成物。
18. 治療剤が、放射性核種、薬物、ポリペプチド又は毒素である、請求項１７に記載の組成物。
19. ポリペプチドがポリエチレングリコールにカップリングされている、請求項１１に記載の組成物。
20. 請求項１に記載のポリペプチドを認識する抗体又はそのフラグメント及び医薬上許容される担体を含む、組成物。
21. 治療剤が抗体又はそのフラグメントにカップリングされている、請求項２０に記載の組成物。
22. 抗体又はそのフラグメントがヒト化されており、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、ｓｃｆｖ、ダイアボディ又はキメラを含むものである、請求項２０に記載の組成物。
23. 治療剤が、薬物、放射性核種、ポリペプチド又は毒素である、請求項２０に記載の組成物。
24. 抗体がポリクローナルであり、非ヒト動物で製造される、請求項２０に記載の組成物。
25. 抗体がヒト化されている、請求項２０に記載の組成物。
26. 抗体がモノクローナルであり、抗ＳＰＡＲＣ抗体を産生する単一系統と骨髄腫系統との融合によって製造される、請求項２０に記載の組成物。
27. 抗体が、ペプチド合成器によって、又はディスプレイファージの抗体への変換若しくは抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の可変領域の変異誘発／合成のいずれかによってｉｎ ｖｉｔｒｏで製造される、請求項２０に記載の組成物。
28. 抗体が一価又は二価のいずれかであり、該抗体がさらに単一特異的又は二重特異的のいずれかである、請求項２０に記載の組成物。
29. 治療剤が細胞傷害性パクリタキセル、ドキソルビシン又はカンプトテシンである、請求項２０に記載の組成物。
30. 治療剤がキナーゼインヒビターである、請求項２０に記載の組成物。
31. 治療剤が生物学的分子である、請求項２０に記載の組成物。
32. 治療剤が放射性核種である、請求項２０に記載の組成物。
33. 治療剤が抗体自体であり、該抗体が、補体活性化、腫瘍に対する細胞媒介性細胞傷害性又はそれらの組み合わせを媒介する、請求項２０に記載の組成物。
34. 投与経路が、静脈内、腹腔内、腫瘍内又は吸入である、請求項２０に記載の組成物。
35. 治療剤及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物の治療上有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において腫瘍に治療剤を送達するための方法であって、該治療剤は、請求項１に記載のポリペプチドを認識する抗体にカップリングされた化学療法剤又は放射性剤を含む、方法。
36. 抗体がポリクローナルであり、非ヒト動物で製造される、請求項３５に記載の方法。
37. 抗体がヒト化されている、請求項３５に記載の方法。
38. 抗体がモノクローナルであり、抗ＳＰＡＲＣ抗体を産生する単一系統と骨髄腫系統との融合によって製造される、請求項３５に記載の方法。
39. 抗体が、ペプチド合成器によって、又はディスプレイファージの抗体への変換若しくは抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の可変領域の変異誘発／合成のいずれかによってｉｎ ｖｉｔｒｏで製造される、請求項３５に記載の方法。
40. 抗体が一価又は二価のいずれかであり、該抗体がさらに単一特異的又は二重特異的のいずれかである、請求項３５に記載の方法。
41. 治療剤がパクリタキセル、ドキソルビシン又はカンプトテシンである、請求項３５に記載の方法。
42. 治療剤がキナーゼインヒビターである、請求項３５に記載の方法。
43. 治療剤が生物学的分子である、請求項３５に記載の方法。
44. 治療剤が放射性核種である、請求項３５に記載の方法。
45. 治療剤が抗体自体であり、該抗体が、補体活性化、腫瘍に対する細胞媒介性細胞傷害性又はそれらの組み合わせを媒介する、請求項３５に記載の方法。
46. 腫瘍が、膀胱、肝臓、卵巣、腎臓、腸、脳又は乳房に位置する、請求項３５に記載の方法。
47. 哺乳動物がヒトである、請求項３５に記載の方法。
48. 投与経路が、静脈内、腹腔内、腫瘍内又は吸入である、請求項３５に記載の方法。
49. 請求項１に記載のタンパク質を認識する抗体にカップリングされた診断剤及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物の治療上有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において腫瘍に診断剤を送達するための方法。
50. 診断剤が、放射性剤、ＭＲＩ造影剤、造影剤、超音波造影剤及びＰＥＴ造影剤を含むものである、請求項４９に記載の方法。
51. 抗体が、野生型ＳＰＡＲＣポリペプチドにも結合する、請求項２０に記載の組成物。
52. 配列番号１中のアミノ酸位置２０に対応する位置にグルタミンの欠失を有するＳＰＡＲＣポリペプチドを検出することを含む、疾患を分類する方法。
53. 疾患が血管新生を伴う、請求項５２に記載の方法。
54. 疾患が増殖性疾患である、請求項５２に記載の方法。
55. 増殖性疾患が癌である、請求項５４に記載の方法。
56. 検出された変異体ＳＰＡＲＣポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の方法。
57. 配列番号１のアミノ酸位置２０に対応する位置にグルタミンの欠失を有するＳＰＡＲＣポリペプチドをコードする核酸を検出することを含む、疾患を分類する方法。
58. 疾患が血管新生を伴う、請求項５７に記載の方法。
59. 疾患が増殖性疾患である、請求項５７に記載の方法。
60. 増殖性疾患が癌である、請求項５９に記載の方法。
61. 核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項５７に記載の方法。
62. 検出された変異体ＳＰＡＲＣ核酸が、配列番号３の核酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
63. ＳＰＡＲＣポリペプチドをコードする核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応を含む方法を使用して検出される、請求項５７に記載の方法。
64. ポリメラーゼ連鎖反応が、配列番号７〜９の配列を含むプライマーから選択される１以上の順方向プライマー及び請求項１０の配列を含む逆方向プライマーを使用する、請求項６３に記載の方法。

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