CN103221062A - 外周血sparc 结合抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有对于SPARC，特别地血浆SPARC的高亲和力的SPARC结合抗体，以及使用此类抗体治疗病况包括癌症的方法。

Description

外周血SPARC 结合抗体及其用途

交叉参考相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2010年6月3日提交的美国临时申请No.61/351,246的优先权利益，所述临时申请的完整内容通过引用并入本文。

发明背景

酸性的富含半胱氨酸的分泌蛋白(SPARC)(也被称作骨粘连蛋白(osteonectin))是281个氨基酸的糖蛋白。SPARC具有对于多种配体、包括阳离子(例如，Ca²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺)、生长因了(例如，血小板衍生生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF))、细胞外基质(ECM)蛋白(例如，胶原I-V和胶原IX、玻连蛋白和凝血酶敏感蛋白-1)、内皮细胞、血小板、白蛋白和羟基磷灰石的亲和力。SPARC的表达在发育上受到调控，主要在正常发育或响应于损伤的过程中在正在发生重塑的组织中表达(参见，例如，Lane等人,FASEB J.,8,163-173(1994))。高水平的SPARC蛋白在正在发育的骨和牙齿中表达。

SPARC为在几种侵袭性癌症中被上调的基质细胞蛋白(matricellular protein)，但在绝大部分正常组织中不存在(Porter等人,J.Histochem.Cytochem.,43,791(1995)和参见下文)。事实上，SPARC的表达在多种肿瘤(例如，膀胱、肝、卵巢、肾、肠和乳腺)中被诱导。在膀胱癌中，例如，SPARC表达与晚期癌相关联。已显示T2期或更晚期的侵袭性膀胱肿瘤相对于T1期的膀胱肿瘤(或不那么浅表性的肿瘤)表达更高水的SPARC并且具有更差的预后(参见，例如，Yamanaka等人,J.Urology,166,2495-2499(2001))。在脑膜瘤中，SPARC的表达只与侵袭性肿瘤关联(参见，例如，Rempel等人,Clincal Cancer Res.,5,237-241(1999))。还已在74.5%的原位侵袭性乳腺癌损伤(参见，例如，Bellahcene,等人,Am.J.Pathol.,146,95-100(1995))和54.2%的乳腺的浸润性导管癌(参见，例如，Kim等人,J.Korean Med.Sci.,13,652-657(1998))中检测到SPARC的表达。SPARC表达还与乳腺癌的频繁微钙化关联(参见，例如，Bellahcene等人，同上)，这表明SPARC表达可负责乳腺转移对骨的亲和力。还已知SPARC结合白蛋白(参见，例如，Schnitzer,J.Biol.Chem.,269,6072(1994))。

因此，存在对利用SPARC在疾病中的作用，特别地SPARC在一些癌症中的作用的组合物和方法的需要。

发明概述

在一个方面，本发明提供了包含SPARC结合抗体的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括Imm12、Imm14、hHTI或其组合。

在另一个方面，本发明提供了诊断或治疗动物的疾病例如癌症的方法，包括施用诊断上或治疗上有效的量的包含SPARC结合抗体的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括Imm12、Imm14、hHTI或其组合。

本发明还提供了利用一种或多种抗癌剂和SPARC结合抗体治疗动物的肿瘤的方法，包括：从动物分离生物样品，检测所述生物样品中的SPARC蛋白的表达，定量所述生物样品中SPARC蛋白的量，如果生物样品中的SPARC蛋白高于阈值水平，则施用治疗有效量的抗癌剂和治疗有效量的抗SPARC抗体，或如果SPARC蛋白低于阈值水平，则施用治疗有效量的抗癌剂并且不施用SPARC结合抗体。按照本发明使用的用于定量SPARC表达的量的适当的生物样品包括例如血液、血清和血浆。根据本发明的用于治疗肿瘤的适当的SPARC结合抗体包括基于例如Imm12、Imm14、hHTI等的人源化SPARC结合抗体。适用于SPARC结合抗体的用途的生物样品中的SPARC的阈值水平可以为至少约4.3ng/ml，至少约43ng/ml或优选，至少约430ng/ml。

在本发明的所有方法和组合物中，可将SPARC结合抗体缀合至治疗或诊断活性试剂。适合施用本发明提供的组合物和应用本发明的方法的适当动物包括但不限于人患者。

附图的几个视图的概述

图1为用于克隆和表达Imm1至Imm12的Fab区域的pASK84的限制性图谱。

图2提供了两个人SPARC结合Fab克隆Fab6和Fab16的氨基酸序列(SEQ ID NO15-16)。

图3为用于克隆和表达Fab16的pBAD载体的限制性图谱。

图4提供了pBad中的Fab16的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。

图5为用于从Fab6(SEQ ID NO:15)和Fab16(SEQ ID NO:16)克隆和表达完全人抗体Imm13和Imm14的pcDNA3002NEO载体的限制性图谱。

图6提供了Imm1(SEQ ID NO1和8)、Imm2(SEQ ID NO2和9)、Imm3(SEQ ID NO3和10)、Imm4(SEQ ID NO4和11)、Imm6(SEQ IDNO5和12)、Imm10(SEQ ID NO6和13)和Imm12(SEQ ID NO7和14)的构架区(FWR)和互补决定区(CDR)的氨基酸序列。

图7提供了针对人SPARC的Imm1至Imm6和Imm8至Imm12上清液的1:1、1:10和1:100稀释物以及对照mAb的定量ELISA结果。

图8提供了浓度为0.04μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL和5μg/mL的纯化的Imm1至Imm12抗人SPARC抗体以及阳性和阴性对照的定量ELISA结果。

图9提供了比较Imm1、Imm3、Imm4、Imm7、Imm9和Imm10抗体对HTI-SPARC(血小板SPARC)的结合以及Imm10、Imm11、Imm12和对照抗体对Bio1-SPARC的结合的定量ELISA结果。

图10提供了在不同浓度上Fab16对HTI-SPARC(血小板SPARC)和Bio1-SPARC的结合的定量ELISA结果。

图11为使用表面等离子体共振技术产生的Fab16对人HTI SPARC的结合的传感图。

图12为使用表面等离子体共振技术产生的Fab16对人BIO1SPARC的结合的传感图。

图13提供了Imm11、Imm12、Imm13和Imm14在不同浓度上结合人SPARC的定量ELISA结果。

图14为抗变性的人SPARC的Imm系列抗体的Western印迹。

图15为描述SPARC结合抗体mHTI(称为Imm17)、Imm12和Imm14以及对照mIgG对荷有LL/2Lewis肺癌的动物的存活的影响的曲线。

图16提供了Imm12、Imm14和mHTI(称为Imm17)结合人和鼠SPARC的定量ELISA结果。

图17A为描述对于高SPARC和低SPARC，组群1(已接受先前化学疗法的患者(PC))的总存活的曲线。

图17B为对于高SPARC和低SPARC，组群2(未接受先前化学疗法的患者(NPC))的总存活的曲线。

图18为描述在治疗之前和之后，组群1(先前化学疗法)和组群2(无先前化学疗法)与正常对照相比较的SPARC水平的点图。

图19为描述治疗后血浆SPARC的百分比变化的条形图。

图20A为描述高风险群(群集1)和低风险群(群集2)中的患者的无进展存活(PFS)的曲线。

图20B为描述高风险群(群集1)和低风险群(群集2)中的患者的总存活(OS)的曲线。

图21为描述对于高风险(HR)和低风险(LR)群集，组群1(先前化学疗法)和组群2(无先前化学疗法)的SPARC水平的点图。

图22A为描述与高风险(HR)群集中的所有患者相比较处于为0、1或2的风险水平的患者的无进展存活(PFS)的曲线。

图22B为描述与高风险(HR)群集中的所有患者相比较处于为0、1或2的风险水平的患者的总存活(OS)的曲线。

图23A为描述在利用25mg/kg的5-氟尿嘧啶(5-FU)和0.1mg、0.15mg或0.20mg的SPARC治疗后与盐水或单独的5-FU相比较的肿瘤体积的曲线。

图23B为描述在利用多西他赛(10mg/kg)和0.2mg的SPARC治疗后与盐水、单独的多西他赛或单独的SPARC相比较的肿瘤体积的曲线。

图24A为描述在利用舒尼替尼(SUT)(30mg/kg)、SPARC(BIO1)(0.2mg)和白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)(ABX)(15mg/kg)治疗后与阴性对照、单独的SPARC、单独的白蛋白结合型紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇+舒尼替尼以及白蛋白合型紫杉醇+SPARC相比较的HT29肿瘤体积的曲线。

图24B为描述在利用贝伐单抗(AVS)(0.2mg)、SPARC(BIO1)(0.2mg)和白蛋白结合型紫杉醇(ABX)(15mg/kg)治疗后与阴性对照、单独的SPARC、单独的白蛋白结合型紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇+贝伐单抗以及白蛋白结合型紫杉醇+SPARC相比较的HT29肿瘤体积的曲线。

图24C为描述在利用舒尼替尼(SUT)(30mg/kg)、SPARC(BIO1)(0.2mg)和白蛋白结合型紫杉醇(ABX)(10mg/kg)治疗后与单独的白蛋白结合型紫杉醇以及白蛋白结合型紫杉醇+舒尼替尼相比较的MDA-MB-231肿瘤体积的曲线。

图24D为描述在利用贝伐单抗(AVS)(0.2mg)、SPARC(BIO1)(0.2mg)和白蛋白结合型紫杉醇(ABX)(10mg/kg)治疗后与盐水、单独的SPARC、单独的白蛋白结合型紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇+贝伐单抗以及白蛋白结合型紫杉醇+SPARC相比较的PC3肿瘤体积的曲线。

图25为描述在施用0μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的重组野生型人SPARC(BIO1)后与阴性对照DPBS相比较的每珠粒芽数的条形图。

图26A描述了在0μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的重组野生型人SPARC(BIO1)下的管形成。

图26B为描述在浓度为0μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的重组野生型人SPARC(BIO1)存在的情况下与阳性对照VEGF和未处理的管相比较的管长度的点图。

图27为描述与盐水、单独的SPARC和单独的白蛋白结合型紫杉醇相比较，利用SPARC(4mg/kg)和白蛋白结合型紫杉醇(10mg/kg)处理的MDA-MB-435-Luc+转移模型中的蛋白质水平表征的肺转移的点图。

图28提供了包括SPARC(10mg/mL)和Imm12、SPARC和Imm14、SPARC和mHTI(鉴定为Imm17)、mIgG(阴性对照)、无抗体(阴性对照)以及在不存在SPARC或抗体的情况下的LL2转移组织样品中管形成的照片。

图29提供了多种抗体包括mHTI(称为“HTI”)、Imm-12和Imm-14与Imm-2和Imm-3相比较的肿瘤定位的定量荧光结果。

发明详述

本发明涉及某些SPARC结合抗体，已分析了所述抗体的对人和鼠SPARC的结合特异性以及抑制血管生成和转移的能力。令人惊讶地，分析显示虽然三种抗体在筛选ELISA中结合天然和变性人SPARC，但仅有一种抗体也结合鼠SPARC。还令人惊讶地发现这三种抗体Imm12、Imm14和mHTI具有抗血管生成(即，抗肿瘤)和抗转移性质。

定义

"肽"和“多肽”在本文中可互换使用并且是指由通过肽键连接的氨基酸残基的链组成的化合物。多肽的"活性部分"意指比全长多肽短，但保持可测量的生物活性和保持生物检测的肽。

如本文中所用，术语“肿瘤”是指任何赘生性生长、增殖或细胞团，无论是良性的还是恶性的(癌性的)，无论是原发性位点损伤还是转移灶。

如本文中所用，术语“癌症”是指由已丧失对正常生长控制的易感性的细胞的增殖引起或表征的增殖性病症。相同组织类型的癌症通常始于相同组织，并且可基于它们的生物特征被分成不同亚型。癌症的4个一般种类是癌(上皮细胞衍生的)、肉瘤(结缔组织或中胚层衍生的)、白血病(形成血液的组织衍生的)和淋巴瘤(淋巴组织衍生的)。已知有200多种不同类型的癌症，并且可影响身体的每一个器官和组织。不限制癌症的定义的癌症的具体实例可包括黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。可受不同癌症影响的器官和组织的实例包括胰腺、乳腺、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、前列腺、脑垂体、肾上腺、肾、胃、食管、直肠、小肠、结肠、肝、胆囊、头与颈、舌、嘴、眼和眼眶、骨、关节、脑、神经系统、皮肤、血液、鼻咽组织、肺、喉、尿道、宫颈、阴道、外分泌腺、和内分泌腺。可选择地，癌症可以是多中心的或可以是原发部位不明(CUPS)的。

如本文中所用，“适当的SPARC结合抗体”或“SPARC结合抗体”是能够特异性结合SPARC的抗体。

如本文中所用，“肿瘤靶向抗体”是指其中疾病为肿瘤、癌症、赘生物(neoplasm)等的疾病靶向抗体。

如本文中所用，“SPARC结合抗体”是指对于循环SPARC具有亲和力的抗体，其Kd在1或10或100或1000nM的范围内-优选小于或等于10nM。

如本文中所用，“治疗有效量”是指缓解(至一定程度，如由熟练医生判断的)哺乳动物的疾病或病况的一种或多种症状的组合物的量。此外，组合物的“治疗上有效的量”意指部分或完全回复至与疾病或病况相关或诱发疾病或病况的正常生理或生化参数的量。本领域临床医生可确定当例如静脉内、皮下、腹膜内、口服或通过吸入施用时为了治疗或预防特定疾病病况或病症的组合物的治疗有效量。为了在治疗上有效所需的组合物的精确量，除了许多患者特异性考虑外，将取决于许多因素例如活性试剂的比活性、使用的递送设备、试剂的物理特征、施用目的。但在理解本文中所示的公开内容后，治疗有效量的确定在本领域临床医生的能力之内。

如本文中所用，术语"治疗”、"处理"、"疗法"和"治疗性处理"是指治愈性治疗、预防性治疗或防治性治疗。"预防疗法”的实例是靶向疾病(例如，癌症或其他增殖性疾病)或与其相关的病况的可能性的预防或减少。需要治疗的人包括已患有疾病或病况的人以及易于患有待预防的疾病或病况的人。如本文中所使用的术语“治疗”、“处理”、“疗法”和“治疗性处理”也描述了目的在于抵抗疾病或相关病况的哺乳动物的管理和护理，并且包括施用组合物以缓解疾病、病况的症状、副作用或其他并发症。癌症的治疗性处理包括但不限于手术、化学疗法、放射疗法、基因疗法和免疫疗法。

如本文中所用，术语“试剂”或“药物”或“治疗剂”是指怀疑具有治疗性质的化合物、化合物的混合物、生物大分子或从生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别地哺乳动物)细胞或组织制备的提取物。可纯化、大体上纯化或部分纯化试剂或药物。根据本发明的“试剂”还包括放射治疗剂或“化学治疗剂”。

如本文中所用，术语“诊断剂”是指允许利用方法例如ELISA定量血浆/循环SPARC的试剂。

如本文中所用，术语“化学治疗剂”是指具有抗癌、赘生物和/或增殖性疾病的活性的试剂。

如本文中所用，术语"放射治疗方案"或"放射疗法”是指施用辐射以杀伤癌细胞。辐射与细胞内的不同分子相互作用，但导致细胞死亡的主要靶是脱氧核糖核酸(DNA)。然而，放射疗法通常也导致对细胞和细胞核膜和其他细胞器的损伤。DNA损伤通常包括糖-磷酸酯主链的单链和双链断裂。此外，可存在能破坏细胞功能的DNA和蛋白质的交联。取决于辐射类型，DNA损伤的机制可变化，相对生物有效性亦变化。例如，重粒子(即，质子、中子)直接破坏DNA并且具有更大的相对生物有效性。然而，电磁辐射通过主要由细胞的水的电离产生的寿命短暂的羟基自由基导致间接的离子化作用。辐射的临床应用由外线束放射(来自外部来源)和短距离放射治疗(使用植入或插入患者的辐射源)组成。外线束辐射由X射线和/或γ射线组成，而短距离放射治疗使用衰变并且发射α粒子或β粒子连同γ射线的放射性核。

如本文中所用，术语"备选治疗方案"或"备选疗法"(非上述一线化学治疗方案)可包括例如受体酪氨酸激酶抑制剂(例如Iressa^TM(吉非替尼)、Tarceva^TM(埃罗替尼)、Erbitux^TM(西妥昔单抗)、伊马替尼甲磺酸(Gleevec^TM))；蛋白体抑制剂(例如硼替佐米(Velcade^TM))；VEGFR2抑制剂例如PTK787(ZK222584)、aurora激酶抑制剂(例如ZM447439)；雷帕霉素的哺乳动物靶(mTOR)抑制剂、环加氧酶-2(COX-2)抑制剂、雷帕霉素抑制剂(例如西罗莫司、(Rapamune^TM));法呢酰基转移酶抑制剂(例如替匹法尼(Zarnestra^TM))；基质金属蛋白酶抑制剂(例如BAY12-9566；硫酸多糖tecogalan)；血管生成抑制剂(例如阿瓦斯丁(Avastin^TM)(贝伐单抗);夫马洁林的类似物例如TNP-4；羧胺三唑；BB-94和BB-2516；沙利度胺；白细胞介素-12；三羧氨基喹啉(linomide)；肽片段；和抗血管生长因子和血管生长因子受体的抗体)；血小板衍生生长因子受体抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、有丝分裂原激活的激酶抑制剂、有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶抑制剂、劳斯肉瘤病毒转化癌基因(SRC)抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、小缺氧诱导因子抑制剂、hedgehog抑制剂和TGF-β信号传导抑制剂。此外，免疫治疗剂也可被认为是备选治疗方案。例如，血清或含γ球蛋白的形成的抗体；非特异性免疫刺激佐剂；活性特异性免疫疗法；和过继免疫疗法。此外，备选疗法可包括其他基于生物学的化学实体例如多核苷酸，包括反义分子、多肽、抗体、基因疗法载体等。可单独或组合地或与本文中描述的其他治疗方案组合地施用此类备选治疗剂。组合治疗中备选治疗方案中使用的化学治疗剂和其他试剂的使用方法(包括给药和施用方案)对于本领域普通技术人员来说也是已知的。

如本文中所用，术语“肿瘤定位”意指在注射入荷瘤动物后，SPARC结合抗体在表达SPARC的肿瘤中所聚集的程度。肿瘤定位可通过任何适当的方法来测量，包括但不限于利用荧光染料标记抗体，将现有荧光抗体注射入具有肿瘤的动物，测定肿瘤荧光相对于来自远离任何肉眼可见肿瘤(gross tumor)的皮肤的荧光的比率,其中如果所述比率>20，优选>10，更优选>5，则定位存在。

抗体

本发明提供了SPARC结合抗体。具体地，SPARC结合抗体可以为Imm12、Imm14、mHTI、hHTI(mHTI的人源化形式)或其组合。

此外，本发明提供了能够结合血液中发现的SPARC例如HTI(血小板)SPARC和肿瘤部位发现的SPARC例如Bio1-SPARC的SPARC结合抗体。各种测定抗体结合强度的方法对于本领域普通技术人员来说是已知的。

对于人用途，为了避免免疫原性和免疫应答，优选使用人源化SPARC结合抗体或适当的片段例如Fab’、Fab或Fab2。人源化抗体或其片段可以例如使用下列已建立的方法之一来产生：1)可使用人IgG骨架并以抗SPARC抗体的可变CDR区替代其可变CDR区来构建人源化抗体，其中重链和轻链独立地在分开的启动子下表达或在一个启动子下与IRES序列一起共表达;2)可使用经工程改造具有人免疫系统的小鼠产生针对SPARC的人源化单克隆抗体；3)可使用噬菌粒(M13、λ大肠杆菌噬菌体或能够表面呈递的任何噬菌体系统)产生针对SPARC的人源化抗体。为了构建全长抗体，可将可变区转移至重链和轻链的CDR上。重链和轻链在哺乳动物细胞例如CHO、293或人髓样细胞中的共表达可提供全长抗体。类似地，可使用良好建立的方法制备Fab’、Fab或Fab2片段和单链抗体。

本发明还提供了特异性识别独特于血浆SPARC的表位的人源化抗体。人源化抗体通常为其中来自CDR的残基被来自非人物种例如小鼠、大鼠或兔子CDR的残基替代的具有期望的特异性、亲和力和能力的人抗体。在一些情况下，人抗体的Fv构架残基被相应的非人残基替代。任何适当的单克隆抗体可用作CDR的来源，例如，结合人和鼠SPARC，特别是结合循环人SPARC，在体外测定中显示良好的抗血管生成活性，以及在动物模型中具有前景的结果(例如，在异种移植模型系统中减少转移)的抗SPARC抗体。

人源化单克隆抗体存在4个一般步骤。这些步骤为：(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸序列和预测的氨基酸序列，(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程中将使用哪一个抗体构架区，(3)实际的人源化方法/技术和(4)转染和表达人源化抗体。参见，例如，美国专利No.4,816,567;5,807,715;5,866,692;6,331,415;5,530,101;5,693,761;5,693,762;5,585,089;6,180,370和6,548,640(将其通过引用并入本文)。例如，可将恒定区工程改造成更相似于人的恒定区，以在抗体被用于临床试验和人的治疗时避免免疫应答。参见，例如，美国专利No.5,997,867和5,866,692(将其通过引用并入本文)。

重要地，抗体被人源化保持对抗原的高亲和力和其它有利的生物性质。为了实现该目的，可通过使用亲代和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念上的人源化产品的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且对于本领域普通技术人员来说是熟悉的。例示和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。此类展示的检查允许分析残基在行使候选免疫球蛋白序列的功能中的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从共有序列和输入序列选择和组合构架残基以便获得期望的抗体特征，例如增加的对靶抗原的亲和力。一般而言，CDR残基直接和最实质性地参与影响抗原结合。人源化抗体还可在铰链区包含修饰以改进抗体的一个或多个特征。

或者，可利用噬菌体展示技术筛选和重组地制造抗体。参见，例如，美国专利No.5,565,332;5,580,717;5,733,743和6,265,150(将其通过引用并入本文)。或者，可将噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature348:552-553(1990))用于从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库体外产生人抗体和抗体片段。

在天然免疫应答中，抗体基因以高速率积累突变(体细胞高度突变)。引入的一些改变将赋予更高的亲和力，显示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞在随后抗原攻击过程中优先复制和分化。该天然过程可通过应用称为“链改组”的技术来模拟。Marks,等人,Bio/Technol.10:779-783(1992))。在该方法中，通过噬菌体展示获得的“初级”人抗体的亲和力可通过利用获自未免疫的供体的V结构域基因的天然存在的变体的文库(文库)连续替代重链和轻链V区域基因来增强。该技术使得能够产生具有在pM-nM范围内的亲和力的抗体和抗体片段。

基因改组还可用于从啮齿目动物抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始啮齿目动物抗体相似的亲和力和特异性。根据该方法(其也被称为“表位印迹(epitope imprinting)”)，利用一个文库的人V结构域基因替代通过噬菌体展示技术获得的啮齿目动物抗体的重链或轻链V结构域基因，从而产生啮齿目动物-人嵌合体。针对抗原的选择导致能够恢复功能性抗原-结合位点的人可变区的分离，即表位控制(印迹)伴侣的选择。当重复该方法以替代剩余的啮齿目动物V结构域时，获得人抗体(参见PCT公布号WO93/06213，1993年4月1日公布)。与通过CDR移植进行的啮齿目动物抗体的常规人源化不同，该技术提供了不具有啮齿目动物来源的构架或CDR残基的完全人抗体。很明显虽然上文中的论述涉及人源化抗体，但所述的一般原理适用于定制用于例如狗、猫、灵长类动物、马和牛的抗体。

本发明的SPARC结合抗体包括完全抗体以及保留针对SPARC的结合位点的抗体的片段(例如，Fab’、Fab和Fab2)。抗体可以是任何种类的抗体例如IgM、IgA、IgG、IgE、IgD和IgY。抗体可以是例如二价、单价或嵌合抗体(一个针对SPARC的效价和另一个针对活性试剂(例如tTF或篦麻毒素A，或本文中描述的另一种活性试剂)的效价)。人源化抗体不限于IgG。相同的技术可用于产生所有其它种类的抗体例如IgE、IgA、IgD、IgM，每一种抗体具有不同的适当地针对特定疾病靶的抗体-依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。抗体的功能性片段可通过限制性蛋白水解来产生。此类片段可以是单价的(例如Fab’)或双价的(例如Fab2)。还可在大肠杆菌(E.coli)中将片段合成为单链scfv或微型双功能抗体(diabody)。

组合物

本发明提供了包含上述SPARC结合抗体的组合物。在一些实施方案中，组合物包含Imm12、Imm14、mHTI或hHTI连同适当的载体。在其它实施方案中，组合物包含Imm12、Imm14、mHTI或hHTI的组合以及适当载体。在优选实施方案中，组合物是包含SPARC结合抗体和药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物。

本发明的组合物还可包含活性试剂。在一些实施方案中，活性试剂为能够直接产生其药理学效应的药学活性治疗剂。在其它实施方案中，活性试剂为诊断剂。在优选实施方案中，活性试剂为缀合有SPARC结合抗体或与其一起施用的诊断性或治疗性活性试剂。应理解一些活性试剂可用作诊断和治疗剂，因此此类术语不是相互排斥的。

本发明的组合物可用于相对于单独的活性试剂的递送增强活性试剂至患病部位的递送，或增强SPARC的清除，从而导致SPARC的血液水平的降低。在优选实施方案中，SPARC的血液水平的降低为至少约10%。在更优选实施方案中，SPARC的血液水平的降低为至少约15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或最优选至少约50%。

活性试剂可以是任何适当的治疗剂或诊断剂例如化学治疗剂或抗癌剂。适当的诊断剂包括荧光染料、放射性试剂、MRI造影剂、X射线造影剂、超声造影剂和PET造影剂。根据本发明使用的适当的化学治疗剂或其他抗癌剂包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂(genistein)、生物活性试剂(TNF、tTF)、放射性核素(131I、90Y、111In、211At、32P和其他已知的治疗性放射性核素)、阿霉素、安莎霉素类抗生素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺铂、卡铂、卡莫司汀、卡培他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯嘌呤、美法仑、甲氨蝶呤、雷帕霉素(西罗莫司)及衍生物、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸钠、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、紫杉烷、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、泰素、考布他汀、discodermolide和反铂。

根据本发明使用的其他适当的化学治疗剂包括但不限于抗代谢药例如，天冬酰胺酶)、抗有丝分裂物质(例如，长春花生物碱)、DNA损伤剂(例如，顺铂)、促细胞凋亡剂(诱导程序化细胞死亡或细胞凋亡的试剂)(例如，epipodophylotoxins)、分化诱导剂(例如，维生素A酸类(retinoids))、抗生素(例如，博来霉素)和激素(例如，他莫昔芬、己烯雌酚(diethylstilbestrol))。此外，根据本发明使用的适当的化学治疗剂包括抗血管生成试剂(血管生成抑制剂)例如，IFN-α、夫马洁林、血管他丁、内皮他丁、沙立度胺等。许多其它抗血管生成试剂已被鉴定并且在本领域是已知的，包括由Carmeliet和Jain(2000)列出的那些。抗血管生成试剂可以是天然存在的或非天然存在的。在一些实施方案中，化学治疗剂为合成抗血管生成肽。例如，先前已报告小的合成的促细胞凋亡肽的抗血管生成活性包括两个功能结构域，一个靶向肿瘤微血管上的CD13受体(氨肽酶N)并且另一个在内化后破坏线粒体膜。Nat.Med.1999,5(9):1032-8。在其它实施方案中，抗血管生成试剂为第二代二聚肽CNGRC-GG-d(KLAKLAK)₂，称为HKP(猎人杀手肽(Hunter KillerPeptide))，经发现具有提高的抗肿瘤活性。在某些实施方案中，抗血管生成试剂不是抗-VEGF抗体(例如贝伐单抗)，虽然本领域普通技术人员也理解可根据本发明使用贝伐单抗。

优选化学治疗剂包括多西他赛、紫杉醇及其组合。“其组合”是指包含超过1种药物剂型的施用，例如多西他赛和紫杉醇，以及多西他赛与紫杉醇的连续地但时间上不同的施用(例如，在一个周期中使用多西他赛但在下一周期中使用紫杉醇)。特别优选的化学治疗剂包含蛋白质结合药物的颗粒，包括但不限于，其中组成蛋白质结合的药物颗粒的蛋白质包括白蛋白，包括其中超过50%的化学治疗剂以纳米颗粒形式存在。最优选，化学治疗剂包含白蛋白结合的紫杉醇的颗粒例如

可按照本发明使用此类白蛋白结合的紫杉醇制剂(称为“白蛋白结合型紫杉醇”)，其中施用的紫杉醇剂量为约30mg/m²至约1000mg/m²，约3周的给药周期(即，约每3周一次施用紫杉醇的剂量)。此外，理想地，施用的紫杉醇的剂量为约50mg/m²至约800mg/m²，优选约80mg/m²至约700mg/m²，最优选约250mg/m²至约300mg/m²，约3周的给药周期。

其他治疗剂还包括但不限于生物活性多肽、抗体和其片段、外源凝集素和毒素(例如篦麻毒素A)或放射性核素。用作根据本发明的活性试剂的适当抗体包括但不限于缀合(偶联的)或未缀合的(未偶联的)抗体、单克隆或多克隆抗体、人源化或非人源化的抗体以及Fab′、Fab或Fab2片段、单链抗体等。涉及的抗体或抗体片段可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc片段。在不同优选实施方案中，活性试剂是抗体本身的Fc片段、单链抗体、Fab片段、微型双功能抗体(diabody)等。在更优选实施方案中，抗体或抗体片段介导补体激活、细胞介导的细胞毒性、调理作用、肥大细胞活化和/或其它免疫应答。

此外，药学活性试剂可以是siRNA。在优选实施方案中，siRNA分子抑制与肿瘤相关的基因(例如c-Sis和其他生长因子、EGFR、PDGFR、VEGFR、HER2、其他受体酪氨酸激酶、Src-家族基因、Syk-ZAP-70家族基因、BTK家族基因、其他细胞质酪氨酸激酶、Raf激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、其他细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶、Ras蛋白和其他调节性GTP酶)的表达。

还可将SPARC结合抗体缀合于聚乙二醇(PEG)。PEG缀合能够增加蛋白质的循环半衰期，降低蛋白质的免疫原性和抗原性，并改善其生物活性。可以使用任意合适的缀合方法，包括但不限于：例如，使甲氧基-PEG与SPARC结合抗体的可供利用的氨基或其它活性反应位点例如组氨酸或半胱氨酸反应。此外，可以使用重组DNA法将具有PEG反应活性基团的氨基酸添加到本发明的SPARC结合抗体中。可在将PEG与SPARC结合抗体反应之前加工PEG，例如，可将接头基团添加到PEG。此外，本发明可以使用可释放的和杂合的PEG化策略，例如SPARC结合抗体的PEG化，以便添加到SPARC结合抗体中的某些位点的PEG分子在体内被释放。此类PEG缀合方法是本领域已知的(参见，例如，Greenwald等人,Adv.Drug Delivery Rev.55:217-250(2003)。

涉及的SPARC结合抗体和其缀合物，可以配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)以及与无机酸例如盐酸或磷酸形成的盐，或与有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱例如异丙胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等。

通常在包含载体例如药学上可接受的载体的制剂中提供本发明的组合物。载体通常是液体，但也可以是固体，或液体与固体成分的组合。载体优选为生理上可接受的(例如药学上可接受的或药理学上可接受的)载体(例如赋形剂或稀释剂)。适当的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、重量克分子渗透压浓度调节剂、缓冲剂和pH调节剂。适当的添加剂包括生理上生物相容性缓冲剂、螯合剂或钙螯络合物的添加或任选地，钙或钠盐的添加。可包装药物组合物以以液体形式使用，或可进行冷冻干燥。优选生理上可接受的载体介质是水、缓冲的水、生理盐水、0.4%的盐水、0.3%的甘氨酸、透明质酸等。生理上可接受的载体是本领域公知的并且是可以容易获得的。载体的选择可至少部分地通过靶组织和/或细胞的位置和用于施用组合物的具体方法来确定。

可配制用于通过途径包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、鞘内、脑硬膜上、表面、经皮、皮下、经粘膜(包括例如肺)、鼻内、经直肠、经阴道或口服途径施用的组合物。所述组合物还可包含另外的成分例如稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂和pH调节剂等。

适合用于注射施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标接受体的血液等渗的溶质；水性和非水性的无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、冷冻保护剂和防腐剂。制剂的形式可以是单元剂量或多剂的密封的容器，例如安瓿和小瓶，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)的条件下，在临使用前，仅需要添加无菌的液体载体例如用于注射的水。可以从无菌粉末、颗粒或片剂来制备即用型的注射溶液和悬浮液。

可通过以所需的量将活性试剂与一种上面例举的成分或其组合(根据需要)一起掺入适当的溶剂，然后过滤灭菌来制备无菌注射液。优选地用于注射的溶液不含内毒素。通常，通过将活性化合物掺入包含基本分散介质和来自上面列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物来制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分+来自其先前无菌过滤的液体的任何另外理想的成分的粉末。在所有情况下，制剂必须是无菌的并且其流动性必须达到容易注射的程度。其在生产和储存的条件下必须是稳定的，并且必须能抗微生物例如细菌和真菌的污染作用而保存。可以在水中通过适宜地与表面活性试剂例如羟基纤维素混合来制备游离碱或药学上可接受盐形式的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备分散液。在通常的储存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以阻止微生物的生长。

在优选实施方案中，可以将活性成分捕获在例如通过凝聚技术或通过界面聚合法制备的微胶囊中，例如，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳剂中的聚羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980)。具体地，可通过这样的方法如Rezler等人,J.Am.Chem.Soc.129(16):4961-72(2007);Samad等人,Curr.Drug Deliv.4(4):297-305(2007);以及美国专利4,485,045和4,544,545中描述的方法来制备包含SPARC结合抗体的脂质体。具有增加的循环时间的脂质体公开于美国专利5,013,556中。

特别有用的脂质体可通过例如反相蒸发法利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂组合物产生。可通过确定孔径的过滤器挤出脂质体以产生具有理想的直径的脂质体。可如Werle等人,Int.J.Pharm.370(1-2):26-32(2009)中所述，将本发明的多肽缀合至脂质体。

在其他实施方案中，可使用天然病毒或病毒样颗粒、树枝状大分子、碳纳米装配物、聚合物载体、顺磁颗粒、磁铁颗粒、聚合物小体(polymersome)、filomicelle、胶束或脂蛋白递送组合物。

至气道内的施用可提供全身性或局部施用，例如至气管和/或肺。此类施用可使用气雾剂、溶液和设备例如支气管镜通过吸入或通过身体敷用来进行。对于吸入，本文中的组合物可方便地利用吹入器、喷雾器、泵、加压封装装置(pressurized pack)或用于递送气雾剂的其他方便的方法、粉末的非气雾喷雾器或液体的非气雾喷雾器递送。加压封装装置可包括适当的推进剂例如液化气体或压缩气体。液化气体包括例如氟化氯化烃类、氯氟烃、hydrochlorocarbon,烃类和烃醚类。压缩气体包括例如氮气、氧化亚氮和二氧化碳。具体地，包括二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当的气体的使用。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门以递送控制的量来确定剂量单位。在施用干燥粉末组合物中，粉末混合物可包括适当的粉末基底例如乳糖或淀粉。粉末组合物可以以单位剂型例如胶囊、药筒或可借助于吸入器或吹入器从其施用粉末的泡罩包装(blister pack)提供。

还可通过经粘膜或经皮肤方法进行全身性施用。对于经粘膜或经皮肤施用，将适合于待穿过的屏障的渗透剂用于制剂中。此类渗透剂在本领域内通常是已知的，并且对于经粘膜施用，包括例如去垢剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻腔喷雾、吸入的气雾剂、直肠或阴道栓剂、漱口药、速溶片剂或锭剂来实现。对于经皮肤施用，将活性成分配制于软膏、药膏、凝胶、泡沫或乳膏剂中，如本领域内通常已知的。

可使用药物递送系统递送药物组合物。此类递送系统包括透明质酸溶液或胶原片段的悬液。可将药物配制在微胶囊中，利用适当的聚合材料设计以用于控制释放，例如聚乳酸、乙羟纤维素、聚已酸内酯、聚已酸内酯二醇(polycaprolactone diol)、多聚赖氨酸、聚乙醇酸、聚马来酸、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]等。使用药物递送系统的特定制剂可以以液体悬液、软膏、复合至绷带、胶原罩(collagen shield)等的形式存在。

组合物还可包含任何其他适当的成分，特别地用于增强组合物的稳定性和/或其最终用途。因此，存在多种本发明的组合物的制剂。

持续释放的组合物还可用于本发明的组合物，例如在例如美国专利5,672,659和5,595,760中描述的组合物。立即或持续释放组合物的使用取决于待治疗的病况的性质。如果病况由急性或超急性的障碍组成，则利用立即释放的治疗优于延长释放组合物。或者，对于某些预防性或长期治疗，持续释放组合物可以是适当的。

此外，组合物可包含额外的治疗或生物活性试剂。例如，可存在在特定适应症的治疗中有用的治疗因子。控制炎症的因子例如布洛芬或甾类可以是减小与药物组合物的体内施用和生理压力相关的肿胀和炎症的组合物的部分。

由本发明提供的组合物可包括例如约0.5mL至约4mL的具有偶联至SPARC结合抗体的活性试剂的水性或有机液体，活性试剂的浓度为约10mg/mL至约100mg/mL，优选约1mg/mL至约10mg/mL，更优选约0.1mg/mL至约1mg/mL。活性试剂可以以任何适当的和治疗上有效的浓度存在，例如，浓度为约10mg/mL至约50mg/mL的贝伐单抗。

方法

本发明提供了通过施用诊断或治疗有效量的包含SPARC结合抗体的组合物来诊断或治疗动物的疾病的方法，所述SPARC结合抗体包括Imm12、Imm14、mHTI、hHTI或其组合。在一些实施方案中，本发明提供了通过施用有效量的Imm12、Imm14、mHTI、hHTI或其组合来诊断动物的疾病的方法。在其它实施方案中，本发明提供了通过施用有效量的Imm12、Imm14、mHTI、hHTI或其组合来治疗动物的疾病的方法。上述任何组合物可用于本发明的方法。

根据本发明的方法，可给哺乳动物施用治疗有效量的组合物以相对于单独的活性试剂的递送增加活性试剂至疾病部位的递送，或增加清除，从而导致SPARC的血液水平下降。在优选实施方案中，SPARC的血液水平的下降为至少约10%。在更优选实施方案中，SPARC的血液水平的下降为至少约15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或最优选至少约50%。

本发明还提供了诊断动物的疾病或病况的方法，包括(a)给动物施用诊断有效量的SPARC结合抗体，所述SPARC结合抗体包括Imm12、Imm14、mHTI、hHTI或其组合;(b)检测存在于动物的特定部位或组织中的SPARC结合抗体的量;和(c)如果存在的SPARC结合抗体的量显示显著高于正常水平的SPARC存在于特定部位或组织中，则疾病或病况存在。

同样的，本发明还提供了利用一种或多种抗癌剂和SPARC结合抗体治疗动物的肿瘤的方法，包括：从动物分离生物样品，检测所述生物样品中的SPARC蛋白的表达，定量生物样品中的SPARC蛋白的量，如果存在于生物样品中的SPARC蛋白显示高于阈值水平，则施用治疗有效量的抗癌剂和治疗有效量的抗-SPARC抗体，或者如果SPARC蛋白低于阈值水平，则施用治疗有效量的抗癌剂并且不施用SPARC结合抗体。

通常使用抗-SPARC抗体检测存在于样品中的SPARC蛋白的水平。然而，在一些实施方案中，可仅使用抗体的一部分，使用不为抗体的SPARC结合分子或使用一些检测SPARC表达、不需要抗体或SPARC结合分子的其它方法来测定SPARC蛋白的表达。

本方法可用于特征在于SPARC的过表达的任何病况。本发明对于其是有用的示例性疾病包括任意身体组织包括软组织、结缔组织、骨、实体器官、血管等中的异常增殖的病况、组织重构、增生、扩大的伤口愈合。可使用本发明的方法和组合物治疗或诊断的疾病的实例包括癌症、糖尿病或其它肾病、炎症、纤维化、关节炎、血管或人工血管移植物或血管内装置的再狭窄等。

本发明的方法的范围内的其它疾病包括但不限于癌症、再狭窄或其他增殖性疾病、纤维化、骨质疏松症或扩大的伤口愈合。具体，此类适当的疾病包括但不限于，其中：(a)癌症可以是例如原位癌、非典型增生、癌、肉瘤、癌肉瘤、肺癌、胰腺癌、皮肤癌、血液肿瘤、乳腺癌、脑癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、多发性骨髓瘤、肝癌、白血病、淋巴瘤、口癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、和甲状腺癌，(b)再狭窄可以是例如冠状动脉再狭窄、脑动脉再狭窄、颈动脉再狭窄、肾动脉再狭窄、股动脉再狭窄、周围动脉再狭窄或其组合，(c)其他增殖性疾病可以是例如超常增生(hyperplasias)、子宫内膜异位症、肥大性疤痕(hypertrophic scars)和疤痕疙瘩(keloid)、增生性糖尿病视网膜病、肾小球肾炎、增生性肺动脉高压、类风湿关节炎、动静脉畸形、粥样硬化斑块、冠状动脉疾病、延迟伤口愈合、血友病性关节(hemophilic joints)、不连接骨折(nonunion fractures)、郎-奥韦综合征(Osler-Weber syndrome)、银屑病、化脓性肉芽肿、硬皮病、tracoma、月经过多、血管粘附和乳头状瘤和(d)纤维化疾病可以是例如肝纤维化、肺纤维化和腹膜后纤维化。

动物可以是需要治疗或诊断的任何患者或受试者。在优选实施方案中，动物是哺乳动物。在特别优选实施方案中，动物是人。在其它实施方案中，动物可以是小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、马、牛或非人灵长类动物。

本发明还提供了使用抗SPARC中和抗体例如适当的SPARC结合抗体抑制SPARC活性的方法。中和抗体具有在体内阻断SPARC与其效应物的相互作用，例如SPARC与细胞表面组分的相互作用或SPARC对其天然配体例如白蛋白、生长因子和Ca²⁺的结合的能力。本发明提供了用于将化学治疗剂递送至动物的肿瘤的方法。该方法包括给人或其它动物施用治疗有效量的药物组合物，其中药物组合物包含偶联至适当的SPARC结合抗体的化学治疗剂和药学上可接受的载体。结合本发明的其它实施方案的本文中所示的化学治疗剂、动物及其组分的描述也适用于将化学治疗剂递送至肿瘤的上述方法的相同方面。

其对化学疗法的应答可被预测或测定，可按照本发明进行治疗的待检测的肿瘤的类型通常是在人和其它哺乳动物中发现的那些肿瘤类型。肿瘤同样地也可以是接种(例如在实验室动物中)的结果。许多类型和形式的肿瘤可在人和其它动物病况中遇到，并且无意将本发明的方法的应用限定于任何特定肿瘤类型或种类。正如已知的，肿瘤包括因不受控制的和进行性细胞分裂而产生的并且通常也称为“赘生物(neoplasm)”的异常组织团块。本发明的方法对于例如人的肿瘤细胞和结合的间质细胞、实体瘤和与软组织结合的肿瘤例如软组织肉瘤是有用的。

肿瘤或癌可位于口腔和咽、消化系统、呼吸系统、骨和关节(例如，骨转移)、软组织、皮肤(例如，黑素瘤)、乳腺、生殖系统、泌尿系统、眼和眼眶、脑和中枢神经系统(例如，神经胶质瘤)或内分泌系统(例如，甲状腺)，并且不一定限定于原发性肿瘤或癌症。与口腔相关的组织包括但不限于舌和嘴的组织。癌症可在消化系统的组织中产生，例如食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊和胰腺。呼吸系统的癌可影响喉、肺和支气管并且包括例如小细胞和非小细胞肺癌。肿瘤可产生于组成男性和女性生殖系统的子宫颈、子宫体、卵巢外阴、阴道、前列腺、睾丸和阴茎，以及构成泌尿系统的膀胱、肾、肾盂和输尿管。肿瘤或癌可位于头和/或颈(例如，喉癌和甲状旁腺癌)。肿瘤或癌还可位于造血系统或淋巴系统，包括例如，淋巴瘤(例如，何杰金病和非何杰金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤或白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病等)。优选地，肿瘤位于膀胱、肝、卵巢、肾、肠、脑或乳腺。

在其它实施方案中，本发明提供了用于通过SPARC结合抗体将药学活性试剂递送至特征在于SPARC的过表达的疾病的部位的方法。此类疾病包括异常增殖状况、组织重塑、超常增生和身体组织(例如，软组织、结缔组织、骨、实体器官、血管等)的扩大的伤口愈合。可通过施用包含偶联至适当的SPARC抗体的治疗剂的药物组合物治疗或诊断的疾病的实例包括癌症、糖尿病或其它视网膜病变、炎症、关节炎、血管的再狭窄、人造血管移植或血管内装置等。与本发明的其它实施方案结合的本文中所示的化学治疗剂、肿瘤、动物和其组分的描述也适用于递送药物活性试剂的上述方法的相同方面。

在其它实施方案中，本发明的方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的包含脂质体结合的或白蛋白结合的化学治疗剂的药物组合物，其中脂质体或白蛋白被偶连至适当的疾病靶向SPARC结合抗体。可使用任何适当的方法将化学治疗剂偶连至SPARC结合抗体。优选地，通过共价键包括例如二硫键将化学治疗剂化学地偶连至化合物。

也可按照本发明的方法施用一个或多个剂量的一种或多种化学治疗剂例如上述化学治疗剂。本发明方法中使用的化学治疗剂的类型和数目将取决于用于特定肿瘤类型的标准化学治疗方案。换句话说，虽然可利用单一化学治疗剂常规地治疗特定癌症，但也可用化学治疗剂的组合常规地治疗另一种特定癌症。用于将适当的治疗剂、化学治疗剂、放射性核素等偶联或缀合至抗体或其片段的方法在本领域已进行了详尽说明。下列实例进一步举例说明了本发明，但当然，不应当解释为以任何方式限制其范围。

根据本发明的方法包括例如组合治疗，其中动物也正在经历一个或多个选自手术、化学疗法、放射疗法、热疗法(thermotherapy)、免疫疗法、激素疗法和激光疗法的癌症治疗法。术语“共施用”和“组合治疗”是指给受试者施用两种或更多种治疗活性试剂。可将试剂包含在单一药物组合物中并且同时施用，或可将试剂包含在分开的制剂中，并且相继地给受试者施用。只要可在受试者中同时检测到两种试剂，两种试剂就被认为是共施用的。

本发明中涉及的组合治疗可包括但不限于抗体施用、疫苗施用、细胞毒性试剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物和生物反应调节剂的施用。可一起或相继使用两种或更多种组合的化合物。化学治疗剂的实例包括烷基化试剂、抗代谢药、天然产物、激素和拮抗剂以及杂类。烷基化试剂的实例包括氮芥例如氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-sarcolysin)和苯丁酸氮芥；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺例如六甲三聚氰胺和塞替派；烷基磺酸盐例如白消安；亚硝基脲例如卡莫司汀(BCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、洛莫司汀(CCNU)和链佐星(链脲佐菌素)；DNA合成拮抗剂例如磷酸雌莫司汀；和三嗪例如达卡巴嗪(DTIC、二甲基-三嗪咪唑羧酰胺)和替莫唑胺。抗代谢物的实例包括叶酸类似物例如甲氨蝶呤(amethopterin)；嘧啶类似物例如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶、5-FU、5FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷、FUdR)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)和吉西他滨；嘌呤类似物例如巯嘌呤(6-niercaptopurine、6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤，TG)和喷司他丁(2'-deoxycoformycin、deoxycoformycin)、克拉屈滨和氟达拉滨；和拓扑异构酶抑制剂例如安吖啶。天然产物的实例包括长春碱例如长春碱(VLB)和长春新碱；紫杉烷例如紫杉醇

和多西他赛

表鬼臼毒素例如依托泊苷和替尼泊苷；喜树碱例如托泊替康和伊立替康；抗生素类例如放线菌素D(actinomycin D)、柔红霉素(daunomycin、正定霉素)、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素(丝裂霉素C)、伊达比星、表柔比星；酶例如L-天冬酰胺酶；和生物应答调节剂例如干扰素-α和白细胞介素2。激素和拮抗剂的实例包括促黄体释放激素激动剂例如例如布舍瑞林；肾上腺皮质激素例如泼尼松和相关制剂；孕激素例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素例如己烯雌酚和炔雌醇和相关制剂；雌激素拮抗剂例如他莫昔芬和阿那曲唑；雄激素例如丙酸睾酮和氟甲睾酮和相关制剂；雄激素拮抗药例如氟他胺和比卡鲁胺；和促性腺素释放激素类似物例如亮丙瑞林。杂类的实例包括沙利度胺；铂的配合物例如顺铂(czs-DDP)、奥沙利铂和卡铂；蒽二酮(例如米托蒽醌)；取代的脲例如羟基脲；丙卡巴肼衍生物例如丙卡巴肼(N-丙卡巴肼、MIH)；肾上腺皮质抑制剂例如米托坦(邻、对'-DDD)和氨鲁米特；RXR激动剂例如贝沙罗汀(bexarotene)；和酪氨酸激酶抑制剂例如伊马替尼。

本发明的方法中表征的药物组合物可以以单次剂量或以多剂量施用。当通过输注施用抗体时，输注可是单次持续给药或可以通过多次输注递送。可将试剂直接注射进入异常靶基因表达的位置上或附近的组织。可将试剂多次注射进入所述位置上或附近的组织。

为约1ug/kg至100mg/kg的体重/施用的量级的剂量水平在疾病的治疗中是有用的。关于剂量，抗体可以以小于约75mg/kg的体重或小于约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg的体重和小于200nmol的抗体/kg的体重或小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015nmol的抗体/kg的体重的单位剂量施用。可以例如通过注射(例如，静脉内或肌内、鞘内或直接至器官内)、吸入或表面施用来施用单位剂量。

本领域普通技术人员也可容易地确定用于向给定的受试者施用本发明的抗体的适当的剂量方案。例如，可在SPARC表达的部位上或其附近以单次注射或沉积的方式给受试者施用SPARC-结合抗体组合物一次。可每天一次、每半周一次、每周一次、每二周一次、每半月一次、每月一次、每两月一次或在医生的指导下施用本发明的组合物。在一些实施方案中，可每天一次或二次给受试者施用组合物，进行约3至约28天，更优选约7至约10天的时期。在其他实施方案中，以低于每天一次，例如低于每2、4、8或30天一次的频率施用单位剂量。在其他实施方案中，不定期(例如，无规律的频率)施用单位剂量。

当给药方案包括多个施用时，应理解给受试者施用的有效量的SPARC-结合抗体组合物可包括在整个给药方案期间施用的抗体的总量。本领域普通技术人员应理解，确切的单个剂量可取决于多个因素而作稍微调整，包括待施用的具体SPARC结合抗体组合物、施用时间、施用途径、制剂的性质、排泄速度、待治疗的具体病症、病症的严重度、寡核苷酸试剂的药代动力学以及患者的年龄、性别、体重和一般健康状况。鉴于不同施用途径的不同功效，预期存在必需剂量水平的广泛变化。

可在单次剂量或在两次或更多次剂量中施用有效剂量，如在特定情况下需要或考虑的。如果需要促进重复或经常性输注，递送设备例如泵、半永久性支架(例如，静脉内、腹膜内、脑池内或囊内)或储池(reservoir)的植入可以是理想的。在成功的治疗后，可能需要使患者经历维持治疗以预防疾病状态的复发。抗体组合物的浓度是足以有效地治疗或预防病症或调节人的生理条件的量。施用的抗体的浓度或数量将取决于就施用的试剂和施用方法测定的参数。

某些因素可影响有效地治疗受试者所需的剂量，包括但不限于疾病或病症的严重度、先前的治疗、受试者的一般身体状况和/或年龄和其他现有疾病。还应理解，用于治疗的抗体的有效剂量可在整个特定治疗的过程中增加或减少。剂量的变化可产生于并且根据诊断测定的结果而变得显然。例如，可在施用抗体组合物后监控受试者。基于来自监控的信息，可施用额外量的抗体组合物。本领域普通技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方案和重复率。

实施例1

本实施例显示一系列能够结合人SPARC的抗体的制备。

使用小鼠品系RBF/DnJ，利用常规杂交瘤法在商业上产生12种小鼠来源的抗人SPARC抗体。

将pASK84表达载体(图1)用于表达命名为Imm1至Imm12的所得抗体的Fab区域。Fab区域被靶向外周，在外周中收集它们，随后在蛋白A琼脂糖柱上通过活动层析(activity chromatography)进行纯化。利用Western印迹验证身份，利用ELISA验证SPARC结合活性。

Imm13和Imm14是使用人噬菌体展示文库产生的完全人抗-人SPARC抗体。针对商业人Fab噬菌体展示文库

(CreativeBiolabs,Shirley,NY)淘选SPARC。鉴定了两个目标Fab序列：Fab6(SEQID NO15)和Fab16(SEQ ID NO16)，如图2中显示的。通过ELISA验证这两个Fab分子的SPARC结合活性。

将这些Fab区域克隆入pBAD载体(图3)，将其在细菌中进行表达和纯化。从裂解的细菌的周质级分分离由pBAD载体表达的Fab蛋白，序列提供于图4中。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳验证从周质级分获得的Fab区域的身份。将Fab蛋白在蛋白A琼脂糖柱上通过活动层析纯化至均质。

为了产生完全人SPARC结合抗体，通过pcDNA3002Neo载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)(图5)克隆和表达Fab6和Fab16的基因。纯化所得的抗体，通过凝胶电脉和N-末端分析验证其身份。将从Fab6产生的完全人抗体命名为Imm13，将从Fab16产生的完全人抗体命名为Imm14。

在按照上述方法产生它们后，通过利用商业小鼠同种型分型测试试剂盒(AbD Serotec,Raleigh,NC)按照同种型表征Imm1至Imm14抗体。结果示于表1中。

表1

克隆编号	Abraxis名称	同种型
			16	Imm1	IgG1(κ)
38	Imm2	IgG1,2b(κ)
			39	Imm3	IgG1,2b(κ)
43	Imm4	IgG1(κ)
			47	Imm5	IgG2a(κ)
49	Imm6	IgG1(κ)
			55	Imm7	IgG2a(κ)
58	Imm8	IgG2b(κ)
			62	Imm9	IgG1(κ)
66	Imm10	IgG1(κ)
			70	Imm11	IgG1(κ)
71	Imm12	IgG1(κ)
			F6	Imm13	IgG1(κ)
F16	Imm14	IgG1(κ)

选择的Imm系列抗体包括Imm12的可变互补决定区的序列示于图6中。将表1中的克隆Imm1至Imm14保藏在适当的保藏机构例如ATCC。

实施例2

本实施例显示使用ELISA测定来表征Imm系列抗体的SPARC结合。

利用多个在不同纯化阶段进行的ELISA测定来表征Imm1至Imm12(小鼠来源的抗-人SPARC抗体)结合重组人SPARC(Bio1-SPARC)的能力。图7显示在纯化之前对抗体上清液的系列稀释物(1:1、1:10和1:100)进行的ELISA测定的结果。在该测定中，Imm4、Imm6、Imm9、Imm10和Imm12显示最高的Bio1-SPARC结合，Imm12在所有抗体中显示最高的结合。利用浓度为0.04μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL和5μg/mL的纯化的抗体(图8)进行另一个ELISA测定。与未纯化的上清液相比较，纯化的抗体的结合通常得到提高。在该测定中，Imm4、Imm9、Imm11和Imm12显示最高的Bio1-SPARC结合。进行另一个ELISA以比较小鼠来源Imm系列抗体对两个不种类的SPARC:Bio1-SPARC和人血小板SPARC(HTI-SPARC)的结合(图9)。在该测定中，发现Imm4和Imm9对Bio1-SPARC的结合都明显好于对HTI-SPARC的结合。Imm11和Imm12都同样好地结合两个种类的人SPARC。

ELISA测定还用于表征完全人SPARC结合抗体Imm13和Imm14的SPARC结合。例如，根据蛋白质ELISA测定(图10)，Fab16(Imm14的Fab区域)以11nM的K_D结合HTI-SPARC并且以7nM的K_D结合Bio1-SPARC。在Biacore

(GE/Biacore International AB,Uppsala,Sweden)上进行的表面等离子体共振结合测定测试了Fab16对固定在传感芯片上的两种SPARC的结合(图11和12)。此类测定导致76.2nM(对于HTI SPARC)和132nM(对于Bio1-SPARC)的K_D值。

还进行了ELISA测定来直接比较选择的小鼠来源的抗人SPARC抗体Imm11和Imm12与完全人Imm13和Imm14的SPARC结合能力，其结果示于图13中。结果表明Imm13具有比两种小鼠来源的抗体更高的对SPARC的亲和力，然而Imm14具有更低的亲和力。

本实施例显示在结合测定中，Imm系列抗体中的某些抗体在体外结合重组人SPARC和人血小板SPARC。

实施例3

本实施例显示Imm系列抗体所结合的表位的分析。

将Western印迹用于确定Imm系列抗体是结合线性表位还是构象表位。在该分析中，将SPARC蛋白在SDS存在的情况下在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。因此，凝胶上的SPARC蛋白以其变性形式存在。将Imm系列抗体用作第一抗体，随后用山羊抗-小鼠IgG进行探测。将BSA用作阴性对照。示于图14中的测定结果显示Imm11和Imm12对SPARC的结合，然而Imm1至Imm11不结合变性的SPARC。在随后的测试中，还发现Imm14和mHTI结合变性的SPARC(数据未显示)。

这些结果显示Imm12、Imm14和mHTI能够基于线性或一级表位结合SPARC。

实施例4

本实施例讨论检查某些抗体对利用LL/2Lewis肺癌攻击的裸小鼠的存活的影响的体内测定的结果。

将C57BL雄性小鼠(约6周龄)称重，随后利用25规针静脉内注射约1x106个LL/2(Lewis肺癌)的细胞(约0.1mL)。每组使用最少10只动物。使所有组中的每一只动物接受200μg/小鼠的测试抗体或小鼠IgG，每周2次，持续4周。通过利用25-27规针进行至腹腔内的腹内注射来施用这些检品(test articles)/抗体。在肿瘤细胞注射30分钟内施用第一剂。

在肿瘤细胞注射之前给动物称重，在给药之前每周进行2次。每天2次检查所有动物的死亡率/发病率。在实验结束时，处死小鼠，取出原发性肿瘤和肺，将其固定和包埋。对无痛致死的动物和在尸僵前发现死亡的任何动物进行尸检。收集来自所有动物的血浆和肺，结束时进行称重。用10%的中性缓冲福尔马林灌注肺，随后将其浸没于其中。贮存组织以待另外的肉眼检查和组织病理学分析。

给动物施用mHTI、Imm12或Imm14。给阴性对照组施用mIgG。将抗体配制在PBS中，以200μg/小鼠的剂量，每周2次给动物施用，进行4周。随后在20天中记录动物的存活。

在各时间点上，与利用Imm12或Imm14处理的动物相比较，更高百分比的利用mHTI处理的动物存活。如图15中显示的，仅mHTI在抑制小鼠的肺转移中是有效的，p=0.02，相对小鼠对照IgG，对数秩(logrank)统计。如所预期的，不识别小鼠SPARC但识别人SPARC的Imm12和Imm14不抑制肺LL/2转移。如图16中显示的，Imm12和Imm14特异性结合人SPARC，但不结合小鼠SPARC；而mHTI能够结合小鼠和人SPARC。

这些结果显示mHTI对小鼠SPARC的特异性抑制导致同基因LL/2细胞在小鼠中的定殖和/或生长的抑制，并且显示mHTI或其人源化形式可用于治疗癌症。

实施例5

本实施例描述了由两个平行II期临床试验(组群)组成的研究，该研究用以评估卡铂和白蛋白结合型紫杉醇(A

也称作ABI-007)的组合在患有不可切除的IV期恶性黑素瘤的患者中的抗肿瘤活性和安全性谱。

组群1由先前利用化学疗法治疗的患者组成，组群2由新近诊断的并且未接触过化学疗法的患者组成。

本文中提供的数据来自通过North Central Cancer TreatmentGroup(NCCTG)进行的多机构合作组研究。该研究由所有参与机构的伦理审查委员会批准。从所有参与者获得了书面知情同意书。合格患者年龄为18岁或以上，具有不可切除的组织学上确认的IV期黑素瘤。其它资格标准包括如通过实体肿瘤的疗效评价标准(RECIST)确定的可测量的疾病，0-2的Eastern Cooperative Oncology Group(ECOG)行为状态(PS),3个月或更长的预期寿命，足够的血液学和肝功能，自最后一次化学疗法(仅组群1)、放射疗法或免疫疗法治疗以来4周或更长的时间。淘汰标准包括：任何先前的利用铂或紫杉烷(组群1&2)的治疗、任何先前的转移性疾病的化学疗法(组群2)、主动感染(active infection)、New YorkHeart Association Class III或IV级、2级或更高级的周围神经病变；在过去5年中其它恶性肿瘤(除了非黑色素皮肤癌或子宫颈的原位癌外)或在研究开始的3个月内未治疗的至脑的转移性黑素瘤或脑转移的进展。不招募怀孕或正在哺乳的妇女。

在28天的周期的第1、8和15天，在30分钟内通过静脉内输注利用100mg/m²的白蛋白结合型紫杉醇，然后在30分钟内利用靶AUC为2的卡铂(CBDCA)(使用Cockroft和Gault等式和实际体重，利用Calvert公式))来治疗合格患者(两个组群)，进行最多8个周期。如果患者不产生过度毒性或进行性疾病，在治疗医生的自行决定下进行超过8个周期的治疗。在注册14天内，患者经历完全身体检查、ECOG PS的评估、全血细胞计数(CBC)、血生化全项检查(comprehensive metabolicpanel)(包括乳酸脱氢酶(LDH))以及通过常规CT或MRI或螺旋CT进行的肿瘤评估。在每一个治疗周期之前，患者经历身体检查、毒性评估和抽血(对于血液学和化学组)。使用RECIST标准每8周一次评估肿瘤状态直至进展。在每一个治疗周期的第1天，如果绝对中性粒细胞计数(ANC)少于1,500/mm³，血小板计数(PLT)少于100,000/mm³，患者产生2级或更高级AST神经病或其它3级或更高级非血液学毒性，则中止治疗。当患者已从这些毒性恢复，则重新开始治疗，两种试剂的剂量均减少20%。在每一个治疗周期的第8或15天，如果：ANC少于1,000/mm³或PLT少于100,000/mm³或患者产生2级或更高神经病或3级或更高级非血液学毒性，则不参加治疗。如果毒性在4周内未恢复至可接受的水平和/或如果患者因毒性而需要第三剂量减少，则终止研究治疗。所有患者接受标准支持性医护，包括在治疗医生的自行决定下施用止吐药、抗生素、血液/血小板输液、红细胞生成素和集落刺激因子。

在2006年11月15日至2007年7月31日之间35个患者被累计入组群1，41个患者被累计入组群2(表2)。在组群1(PT)中，1个患者在签署知情同意书后但在开始治疗之前取消参与。这样，研究组群1由34个开始了研究治疗的患者(67.6%的男性)组成。招募的年龄中位数为60岁(年龄从28至84岁)。在组群2(CN)中，2个患者在签署知情同意书后但在开始治疗之前取消参与。这样，研究组群2由39个开始研究了治疗的患者(59.0%的男性)组成。招募的年龄中位数为59岁(年龄从23至91岁)。

对于组群1，施用的周期数的中位数为4个周期(总共：135个周期，范围：1-10)。21个患者(61.8%)在治疗的第8或15天没有参加治疗，或具有至少一个剂量减少。这主要是因为严重的中性粒细胞减少症、疲劳和神经病。研究中断的主要原因是疾病的进展(27个患者)。

对于组群2，施用的周期数的中位数为4个周期(总共：193个周期，范围：1-25)。25个患者在治疗的第8或15天没有参加治疗，或具有至少一个剂量减少，主要是因为严重的中性粒细胞减少症和神经病。研究中断的主要原因是疾病的进展(27个患者)。

通过将患者分层至“高”和“低”SPARC组中来评估血浆SPARC的预后功效。由于血浆SPARC的中位数为431ng/ml，因此高SPARC组被定义为具有高于431ng/ml的血浆SPARC的患者。患者群体的分组示于表2中。除1个例外，结果显示“高SPARC”患者倾向于具有比他们的“低SPARC”对应者更差的无进展存活(PFS)和总存活(OS)，虽然在先前的化学疗法组中仅OS被发现为在统计上是显著的(p=0.01)。

表2

	中位数	P-值	N
				无进展存活
先前化学疗法的组		0.21	31
				低SPARC	141天		17
高SPARC	58天		14
				无先前化学疗法的组		0.47	35
低SPARC	122天		16
				高SPARC	167天		19
总存活
				先前化学疗法的组		0.01	31
低SPARC	378天		17
				高SPARC	206天		14
无先前化学疗法的组		0.43	35
				低SPARC	426天		16
高SPARC	304天		19

虽然整体反应率在两个组群之间明显不同(25.6%对8.8%)，但在无进展存活或总存活上没有差异(图17A-B)。总地来说，治疗被温和地良好耐受，主要毒性为恶心、呕吐、周围神经病变和血细胞减少(中性粒细胞减少症、血小板减少症、白血球减少症)。

这些结果显示低循环SPARC水平与改善的总存活相关。此外，白蛋白结合型紫杉醇与卡铂的组合对于先前被治疗的或未接触化学疗法的转移性黑素瘤患者是可行的治疗选择。

实施例6

本实施例描述了来源于转移性黑素瘤患者和健康个体的样品的血浆SPARC浓度的评估。

用2.5μg/ml的于50mM碳酸盐缓冲液中的SPARC结合多克隆抗体(R&D Biosystems,Minneapolis,MN)涂铺ELISA板，在4℃下进行过夜。用PBS/0.1%Tween20(PBST)洗涤板4次，然后用酪蛋白封闭/稀释缓冲液(Thermo Fisher Scientific Inc.,IL)在室温(RT)下封闭2小时。为了产生SPARC标准曲线，将已知浓度的人血小板SPARC蛋白(HematologicTechnologies,Essex junction,VT)稀释在含有SPARC阴性的10%的混合正常人肝素血浆(PNHP)的封闭/稀释缓冲液中。在测试之前，将患者样品1/10稀释于封闭/稀释缓冲液中。在除去封闭液并且用PBST洗涤3次后，以一式两份将标准和稀释的血浆样品以100μl/孔涂铺在ELISA板上，在室温(RT)下温育2小时，随后用PBST再洗涤3次。为了检测结合的SPARC，加入100ul的0.5μg/ml的于封闭/稀释缓冲液中的生物素化的抗SPARC单克隆抗体(R&D Biosystems,Minneapolis,MN)，在RT下温育1小时，随后用PBST洗涤3次。在此之后，添加100ul/孔的1:20000稀释的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)，在RT下温育1小时。在3次PBST洗涤后，向每一个孔添加100ul的HRP-底物TMB(KPL#52-00-03)，然后监测650nm处的OD。在OD为0.6至0.8时，利用2N硫酸终止反应以进行测量。在ELISA板读数器(Molecular Devices;Sunnyvale,CA)上，在30分钟内在450nm处读取孔的光密度。

将源自健康个体的总共20个样品的结果与来自65个癌症患者血浆样品的结果相比较，如图18中显示的。ELISA结果的分析显示两个组的SPARC浓度的统计上显著的差异。健康个体的SPARC水平经测定为192ng/ml的中位浓度值，而癌症患者样品的中位血浆SPARC浓度经测量为390ng/ml(p值0.0002)(图18)。此外，进行治疗后，大部分患者的血浆SPARC明显下降(图19)。

这些结果显示了转移性黑素瘤患者的增加的SPARC表达并且可能与肿瘤负荷正相关。

实施例7

本实施例显示SPARC微环境标签(SMS)的制备。

在许多正常和肿瘤组织中评估一系列抗SPARC抗体的结合特征。测定肿瘤的各种组分的SPARC表达模式(如通过免疫染色测定的)，包括肿瘤细胞、血管、成纤维细胞、基质、炎性细胞和相邻的正常组织的SPARC表达水平。鉴定了两个对于SPARC具有差异亲和力的抗体，将其用于随访研究。具体地，使用单克隆抗体(“抗体M”)(SPARC单克隆抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN),目录号MAB941批号ECH045011，1:100稀释于tris碱性稀释剂)和多克隆抗体(“抗体P”)(SPARC多克隆抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN,目录号AF941批号EWN04，1:50稀释于tris碱性稀释剂中)测定染色的模式。

在载玻片上制备肿瘤的组织学切片，使用标准免疫染色方案进行染色。简而言之，将来自福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤块的组织核心(每块2个来自最具代表性区域的核心)进行排列(Beecher Instruments,Silver Spring,Md)以产生每一个测量为2.0mm的核心的组织微阵列，将其置于带正电荷的载玻片上。随后将具有样本的载玻片置于60℃烘箱中进行1小时，冷却，脱蜡，随后通过二甲苯和梯度乙醇溶液至水进行再水化。使用自动染色设备(Dako Cytomation Autostainer,Dako,Carpinteria,CA)进行染色。

将所有载玻片在3%过氧化氢水溶液中进行5分钟来进行猝灭，以封闭内源过氧化物酶。在缓冲液漂洗后，用抗体M或阴性对照试剂温育载玻片30分钟。温育小鼠辣根过氧化物酶聚合物试剂盒(Mouse MACH3HRP Polymer Kit,Biocare Medical,Concord,CA)，每试剂进行20分钟。在再一次漂洗后，应用DAB色原体(Dako,Carpinteria,CA)，进行10分钟。将苏木精用于复染载玻片。将相同的方案用于利用抗体P免疫染色样本，不同之处在于使用抗生物素蛋白-生物素检测试剂盒(BiocareMedical,Concord,CA)(每试剂温育15分钟)替代HRP检测试剂盒。

由专业认证的病理学家进行一系列肿瘤的SPARC表达的详尽病理学评估。对不同肿瘤组分的SPARC表达水平(如通过免疫组织化学测定的)进行打分。按0-3分给SPARC表达水平打分，3为最具阳性的评分，这是本领域所通常进行的并且对于本领域普通技术人员来说是公知的。

多克隆抗体显示成纤维细胞的SPARC的优先染色。而单克隆抗体优先染色肿瘤细胞的SPARC。

将逻辑回归和比例风险用于测定应答、无进展存活(“PFS”)和总存活(“OS”)与SPARC模式之间的关系。

肿瘤组之一为具有不可切除IV期黑素瘤患者的卡铂和白蛋白结合型紫杉醇(ABI-007)的II期试验。具体地，在28天的周期的第1、8和15天施用白蛋白结合型紫杉醇(100mg/m²)和卡铂(AUC2)。将肿瘤活组织检查的SMS用于将患者分入两个群集：高风险(组群1)和低风险(组群2)群集。如表3和图20A-B中所示，高风险和低风险SPARC标签与无进展存活和总存活相关。

表3

这些结果显示单独的SPARC微环境标签可就无进展存活和总存活方面区分低风险与高风险组。

实施例8

本实施例描述了SPARC微环境标签与血浆SPARC水平之间的关联性的分析。

如上文实施例5和7中所描述的，分析了血浆SPARC水平和SMS，将结果组合以测定患者结果的关联。

如图21中所示，基线血浆SPARC在SMS高风险与SMS低风险组之间是相似的。基于基线血浆SPARC和SMS高风险对低风险，将患者编码为具有0、1或2的风险水平。0的风险水平被鉴定为低基线血浆SPARC，具有SMS低风险。1的风险水平被鉴定为高基线血浆SPARC或SMS高风险。2的风险水平被鉴定为高基线血浆SPARC和SMS高风险。关于总存活和无进展存活的数据示于表4中。

表4

如图22A-B中所示，随着风险水平递增，存在朝更差的无进展存活和总存活的一般趋势。虽然结果对于2个风险组中的患者的无进展存活没有显著不同。

这些结果显示具有高血浆SPARC和高风险SMS的患者具有显著更差的总存活。

实施例9

本实施例描述了显示SPARC抵消某些化学疗法的功效的肿瘤异种移植物测定。

重量约20g的5至6周龄的雌性和雄性无胸腺NCr-nu小鼠购自Harlan,Inc.(Madison,Wisconsin,USA)。在细胞培养物中繁殖人癌细胞HT29(结肠)、PC3(前列腺)和MDA-MB-231(乳腺)，每雌性(对于MDA-MB-231和HT29)或雄性(对于PC3前列腺肿瘤)裸小鼠的胁腹皮下植入100万个细胞，并且让其生长至约60–100mm³，然后开始进行治疗。治疗包括5-氟尿嘧啶(5FU)、多西他赛

白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、白蛋白结合型紫杉醇+舒尼替尼苹果酸盐

或白蛋白结合型紫杉醇+贝伐单抗

使用或不使用外源施用的SPARC)。给每一个异种移植物的对照动物施用PBS。每周测量2次最长(长度)和最短(宽度)肿瘤直径(毫米)以及肿瘤深度。利用下式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)=宽度x长度x深度。肿瘤生长抑制(TGI)被定义为在对照动物被无痛致死时与对照组相比较的肿瘤体积减小的百分比。肿瘤倍增时间被定义为肿瘤体积倍增2次所需的时间。每周2次测量动物重量。使用Prism程序(GraphPad,San Diego,California,USA)进行统计分析。方差分析(ANOVA)统计值用于比较肿瘤生长曲线。

评估SPARC施用对利用5-氟尿嘧啶的治疗的影响。在HT29结肠癌异种移植物模型中，5-FU在抑制肿瘤生长中是有效的(TGI89.8%,P<0.0001，相对于盐水)，无体重减轻。如图23A中所示，SPARC的施用引起5-FU抗肿瘤活性的剂量依赖性抑制，在4、6和8mg/kg的剂量水平上分别导致50.8%、47.4%和10.4%的TGI(P=0.003，相对于5-FU方式，威尔科克森秩和检验)。单独的SPARC具有适中的抗肿瘤活性(35.4%;NS)。对于多西他赛获得了类似的结果(图23B)。

也在相同的HT29异种移植物模型中每4天1次评估与15mg/kg的白蛋白结合型紫杉醇组合的SPARC施药的影响，进行3个周期。与抗血管生成试剂舒尼替尼的组合显著增强白蛋白结合型紫杉醇(TGI>100%对94.8%,P=0.015对白蛋白结合型紫杉醇单一疗法，威尔科克森秩和检验)。相反地，SPARC的施用显著降低了白蛋白结合型紫杉醇的抗肿瘤活性(TGI84.8%对94.8%,P=0.007对白蛋白结合型紫杉醇单一疗法，威尔科克森秩和检验)。更重要地，外源SPARC大大消除了白蛋白结合型紫杉醇与舒尼替尼的协同作用(TGI52.3%对>100%(施用后51天),P=0.006对白蛋白结合型紫杉醇+舒尼替尼组合方式，威尔科克森秩和检验)(图24A)。利用白蛋白结合型紫杉醇+舒尼替尼和/或SPARC的治疗可被良好耐受而无明显体重减轻。类似地，单独的贝伐单抗诱导显著的TGI(75%,P<0.001)。然而，虽然在本实验中贝伐单抗增强白蛋白结合型紫杉醇的抗肿瘤活性，但利用SPARC的治疗仅导致极小的对白蛋白结合型紫杉醇/贝伐单抗组合的负面影响(图24B)。利用白蛋白结合型紫杉醇+贝伐单抗和/或SPARC的治疗被良好地耐受而无明显体重减轻。

这些发现在MDA-MB-231乳腺癌异种移植物(图24C)和PC3前列腺癌异种移植物(图24D)中得到进一步确认。在这些测定中，对于白蛋白结合型紫杉醇+舒尼替尼或白蛋白结合型紫杉醇+贝伐单抗的组合观察到的抗肿瘤效应因SPARC的施用而被显著抑制(P<0.001,图24C和24D)。在这些实验中，每天1次以10mg/kg的亚最适度剂量施用白蛋白结合型紫杉醇，进行5个周期。

这些数据显示外源SPARC促进肿瘤生长并且抵消化疗法例如白蛋白结合型紫杉醇、多西他赛和5-氟尿嘧啶的治疗益处。

实施例10

在本实施例中，在两个体外测定中研究SPARC的血管生成行为。

首先，在体外血管生成模型系统中研究SPARC对萌发(sprouting)的效应，如由Nakatsu等人(Methods Enzymol.443:65-82(2008))所描述的，使用人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)制备所述模型系统。在添加珠粒(beading)前2天，将在补充有10%FBS(Gibco,Carlsbad,CA)的M199培养基中生长的低传代HUVEC转换至EGM-2培养基(Clonetics,Walkersville,MD)。将Cytodex3微载体珠粒(Amersham PharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)进行水合，利用PBS(pH7.4)进行洗涤。将1x10⁶HUVEC细胞在37°C下与2500个水合的灭菌的珠粒一起在EGM-2培养基中温育4小时以进行包被。随后以500个珠粒/mL的浓度将包被的珠粒包埋在2mg/mL的含有0.15个单位/mL的抑肽酶的PBS中的血纤蛋白原中。随后，添加0.625个单位/mL凝血酶，将0.5mL的混合物添加至24孔板的每一个孔中。使溶液在RT下凝固5分钟，在37°C下再凝固15分钟。凝固后，将20,000个肺成纤维细胞于EGM-2培养基中接种在每一个孔中。将PBS中的1、10或100μg/mL的BioI SPARC蛋白或不含蛋白质的PBS添加至生长培养基，将培养物维持5天直至利用光学显微镜评估萌发。使用专业图像软件(Media Cybernetics,Bethesda,MD)测定形成的管数目/珠粒和培养物中的萌发的HUVEC细胞的形态学。

该测定的结果显示利用SPARC的处理以剂量依赖性方式诱导萌发(图25)。在1μg/mL时，少于50%的接种的HUVEC/珠粒已产生芽。10或100μg/mL SPARC的添加分别导致平均0.9或1.9个芽/珠粒(图26B)，而不存在SPARC的培养物中的平均芽数目仍然低于约0.5个芽/珠粒。

然后，使用TCS cellworks human Angiokit model kit(TCS-ZHA-1000,TCS Cell Works Buckingham,UK)检查SPARC对管形成的效应。在该测定中，内皮细胞最初在培养基质内形成小岛。随后它们开始增殖，随后进入迁移期，在该时期中，它们移动通过基质以形成丝状管结构。这些结构逐渐地联合起来(到9-11天)以形成与毛细床十分相似的吻合管的网络。

按照制造商的推荐(TCS Cell Works,Buckingham,UK)使用包含早期共培养物(第2-3天)的24孔预接种的内皮细胞组织培养板。培养物在37℃/5%CO₂下温育11天。在开始治疗后第4、7和9天利通过添加测试和对照化合物改变培养物上的培养基，然后在第11天利用70%乙醇进行固定。随后如下对固定的培养物进行染色：将兔抗-CD31一抗(ThermoScientific)在PBS/1%BSA封闭缓冲液中稀释至2μg/mL的终浓度。随后，将0.5mL的稀释的抗-CD31抗体添加至每一个孔中，在37°C下温育1小时。用PBS洗涤培养物3次，随后添加缀合有AP的二抗(ThermoScientific,1μg/mL)，在37°C下温育1小时，随后用PBS和水进行充分洗涤。为了使形成的管可见，每孔添加0.5mL的1步NIB/BCIP溶液(Thermo Scientific)，然后温育直至染色完成。随后用水终止反应。

随后利用光学显微镜评估形成的管的数目和长度。使用专门为分析使用AngioKit(TCS Cell Works,Buckingham,UK)产生的图像而开发的“AngioSys”图像分析系统进行管发生的比较。被分析软件捕获的染色的管在宽度上减小至单个象素。因此给定的视场内的象素的总数表示管的长度。可从该数据计算管长度、标准差和变异系数。可类似地测定总血管数目、总管面积和分支点的数目。

如图26中所示，在该系统中，SPARC展示出二相性血管生成活性。这些结果显示低浓度的SPARC(1和10μg/mL)可刺激血管生成，特别是10μg/mL的浓度，而高浓度SPARC(100μg/mL)显著抑制血管生成。

这两个测定的结果显示，至少在某些浓度时循环SPARC的活性刺激血管生成。

实施例11

本实施例举例说明了外源SPARC和白蛋白结合型紫杉醇对MDA-435转移模型的肿瘤进展的影响。

从Harlan,Inc.(Madison,Wisconsin,USA)购买体重约20g的5至6周龄的雌性和雄性无胸腺NCr-nu小鼠。将MDA-MB-435-Luc+以4x10⁶个细胞于50%Matrigel中原位植入乳房脂肪垫(MFP)，在治疗前让其达到180mm³的平均肿瘤体积。治疗为：2个周期的每两周1次10mg/kg白蛋白结合型紫杉醇、4mg/kg SPARC和贝伐单抗。在适当的时间间隔上，收获下列器官以定量转移：近端淋巴结、对侧淋巴结、肺、肝和脑。使用的统计检验包括t-检验和Mann Whitney-U。

每周监测小鼠2-3次，记录肿瘤生长。当肿瘤体积达到180mm³时，分选小鼠，施用第一周期的治疗。在第1与第2周期之间提供7个休息日。在该休息期连续施用贝伐单抗和SPARC。在整个研究过程中定期测量体重以评估来自疗法的毒性效应。白蛋白结合型紫杉醇引起极小体重减轻，该体重减轻在停药后迅速恢复(数据未显示)。

进行下列给药方案：对照(组1);每天施用1次10mg/kg白蛋白结合型紫杉醇，进行3至5个周期(组2)；每2周1次静脉注射4mg/kg可溶性SPARC(Bio1)(组3)；和每天施用1次10mg/kg白蛋白结合型紫杉醇，进行2至5个周期并且每2周施用1次4mg/kg SPARC(组4)。

对照肿瘤具有稳定的肿瘤生长，体积的平均增加为43.75±5.65mm³/天，在第56天终体积为1870.6mm³。SPARC处理的组显示23.16±4.38mm³/天的相似的生长速率，在63天中平均体积为1765mm³。单独的白蛋白结合型紫杉醇组具有18天的肿瘤消退，这导致在再生长发生之前76%的肿瘤体积的减小。9只小鼠中有5只具有可触摸的肿瘤；然而全都以22.98±0.89mm³/天的速率生长至739mm³的终平均体积。肿瘤的再生长在停止白蛋白结合型紫杉醇治疗后6天发生。消退持续29天，然后以6.10±1.16mm³/天发生再生长，达到136mm³的终体积。白蛋白结合型紫杉醇+SPARC组行为与白蛋白结合型紫杉醇组类似。发生了两个完全消退，但在治疗开始后21天以21.05±2.57mm³/天的速率发生再生长，直至653mm³的终体积。(表4)。

表4

还计算了总转移负荷。其表示为以每mg蛋白质标准化的RLU表示的组织提取物中测量的萤光素酶活性。所有对侧淋巴结对于所有组都是阴性的。在近端淋巴结、肝和脑中存在少量转移发生率。在照组的12只动物中有2只的近端淋巴显示转移。在对照和SPARC组中存在稍频繁的肝转移(存在于每一个组的3只小鼠中)。也存在一个具有脑转移的对照小鼠。

大部分转移发生在肺中。对照组12小鼠中有11只为阳性，具有33840±9176的平均RLU/mg总蛋白质(N=12)。SPARC对转移几乎没有效应，9只小鼠全部为阳性，具有为31630±10820的平均RLU/mg总蛋白质(N=9)。单独的白蛋白结合型紫杉醇对肺转移具有一定的效应，9只小鼠中仅4只为阳性并且具有为4722±2684的RLU/mg总蛋白质(N=9),p=0.015，相对于对照(学生t检验)。与白蛋白结合型紫杉醇共施用的SPARC将发病率增加至10只小鼠中有9只为阳性并且具有为13690±3579的RLU/mg总蛋白质(N=10),p=ns，相对于对照(学生t检验)。这些数据显示循环SPARC抵消了白蛋白结合型紫杉醇的抗转移活性。

因为循环血小板和巨噬细胞表达高水平的SPARC并且可以为血浆SPARC的来源(Sangaletti S.等人,Cancer Res.68:9050-9059(2008);Sangaletti S.等人,J.Exp.Med.198:1475-1485(2003))，因此这些结果显示在某些情况下，SPARC实验性地升高(即，通过外源施用的SPARC)或通过固有的循环SPARC的过表达(即，通过患者的表达SPARC的器官例如肿瘤、白细胞、血小板和巨噬细胞)升高，SPARC在化学疗法存在的情况下增加转移的风险。

实施例12

本实施例描述了管形成测定用于测定单克隆SPARC结合抗体Imm12、Imm14和mHTI对SPARC的血管生成行为的影响的用途。

如上文中实施例10中所述，使用TCS Cellworks human AngioKitmodel kit(TCS-ZHA-1000,TCS Cell Works,Buckingham,UK)进行该测定。培养基包含10μg/mL重组人SPARC蛋白。培养基还包含300μg/mL的上文中制备的小鼠SPARC结合单克隆抗体(Imm12、Imm14、mHTI)之一或对照(小鼠IgG)。

为了检查SPARC对管形成的影响以及SPARC结合单克隆抗体对该功能的干扰，利用光学显微镜评估形成的管的数目及其长度。

该测定的结果示于图28中。SPARC在培养基中的存在导致许多长管形成。这些结果确认了SPARC在该模型系统中的促血管生成效应。然而，所述3种抗-SPARC抗体的任一种的添加导致该效应的抑制。在Imm12或Imm14单克隆抗体存在的情况下，仅观察极短的管的极少量形成。mHTI至培养基的添加导致管的形成几乎完全被抑制。

这些结果显示SPARC结合抗体Imm12、Imm14和mHTI可克服SPARC的血管生成刺激效应。

实施例13

本实施例显示mHTI、Imm12和Imm14在体内动物模型中不定位在肿瘤位置上。

以200ug/小鼠的剂量用利用Alexa680荧光染料标记的Imm系列抗体处理植入有皮下HT29结肠异种移植物的裸小鼠。将标记的Imm抗体配制于盐水中，在第1天进行静脉内施用。在36天的过程中在这些小鼠中跟踪荧光信号。

图29中所示的本研究的结果表明mHTI(标记为“HTI”)、Imm12和Imm14不定位在该模型的肿瘤位置，然而Imm2良好地定位。

本文引用的所有参考文献，包括公开物、专利申请和专利通过引用方式并入本文，达到如同每篇参考文献都单独且特别被指明通过引用方式并入并以其全文显示于本文的程度。

在描述本发明的上下文中(尤其是以下权利要求的上下文中)术语"一种/个(a)"和"一种/个(an)"和"该/所述(the)"的使用应该被解释为涵盖了单数和复数，除非本文中另有指明或上下文明显矛盾。除非另有指明，否则术语"含有(comprising)"、"具有(having)"、"包括(including)"和"含有(containing)"应该被解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。除非本文另有指明，否则本文中提及的数值范围仅仅是作为单独提及落在该范围内的每个单独数值的简便方式，并且每个单独数值并入本说明书中，如同在本文中单独提及一样。除非本文另有指明或者上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以通过任意合适的顺序进行。除非另有要求，否则本文提供的任意和所有实施例或示例性语言(例如“例如”)仅仅意在更好地诠释本发明，而不对本发明的范围进行限制作用。本说明书中的任何语言不应被解释为指明未要求保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。

在本文中描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。本领域普通技术人员在阅读了上述说明书之后，那些优选实施方案的变体会变得明显。本发明人预期技术人员视情况而应用此类变型，本发明人想到本发明可以按照除了本文特异性描述以外的方式来实施。因此，本发明包括适用法律所允许的随附的权利要求中提及的主题的所有修饰和等同物。此外，除非本文另有指明或上下文明显矛盾，否则本发明中包括上述要素的以其所有可能变体进行的任意组合。

Claims (47)

1.一种包含SPARC结合抗体的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括Imm12、Imm14、hHTI或其组合。

2.权利要求1的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括hHTI。

3.权利要求1的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括Imm12。

4.权利要求1的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括Imm14。

5.权利要求1至4的任一项的组合物，其还包括缀合至SPARC结合抗体的活性试剂。

6.权利要求5的组合物，其中所述活性试剂包括治疗剂或诊断剂。

7.权利要求6的组合物，其中治疗剂或诊断剂为选自如下试剂的治疗剂：酪氨酸激酶抑制剂、激酶抑制剂、生物活性试剂、生物分子、放射性核素、阿霉素、安莎霉素类抗生素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺铂、卡铂、卡莫司汀、卡培他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯嘌呤、美法仑、甲氨蝶呤、雷帕霉素(西罗莫司)、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸钠、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、紫杉烷、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、泰素、考布他汀、discodermolide、反铂、抗-血管内皮生长因子化合物(“抗-VEGF”)、抗-表皮生长因子受体化合物(“抗-EGFR”)、5-氟尿嘧啶及衍生物、放射性核素、多肽毒素、细胞凋亡诱导剂、治疗增敏剂、酶或其活性片段，及其组合。

8.权利要求6的组合物，其中所述治疗剂或诊断剂为包含抗体或抗体片段的治疗剂。

9.权利要求8的组合物，其中所述抗体或抗体片段为IgG或IgA或IgD或IgE或IgM的Fc片段。

10.权利要求8或9的组合物，其中所述抗体或抗体片段介导补体活化、细胞介导的细胞毒性或调理作用、或肥大细胞活化或其它免疫应答中的一种或多种。

11.权利要求6的组合物，其中所述治疗剂或诊断剂为选自荧光染料、放射性试剂、MRI造影剂、X射线造影剂、超声造影剂和PET造影剂的诊断剂。

12.权利要求1-11的任一项的组合物，其中所述组合物包含在脂质体中。

13.权利要求1-11的任一项的组合物，其中所述组合物包含在白蛋白纳米颗粒中。

14.权利要求1-13的任一项的组合物，其中所述组合物还包含适当的药学载体。

15.权利要求1-16的任一项的组合物，其中通过静脉内，通过表面，通过注射，通过吸入，鼻内，经直肠或口服途径给患者施用所述组合物。

16.一种用于诊断或治疗动物的疾病的方法，包括施用诊断或治疗有效量的包含SPARC结合抗体的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括Imm12、Imm14、hHTI或其组合。

17.权利要求16的方法，其中所述SPARC结合抗体包括hHTI。

18.权利要求16的方法，其中所述SPARC结合抗体包括Imm12。

19.权利要求16的方法，其中所述SPARC结合抗体包括Imm14。

20.权利要求16-19的任一项的方法，其中所述组合物还包含缀合至SPARC结合抗体的活性试剂。

21.权利要求20的方法，其中所述活性试剂包含治疗剂或诊断剂。

22.权利要求21的方法，其中所述治疗剂或诊断剂为选自下列试剂的治疗剂：酪氨酸激酶抑制剂、激酶抑制剂、生物活性试剂、生物分子、放射性核素、阿霉素、安莎霉素类抗生素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺铂、卡铂、卡莫司汀、卡培他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯嘌呤、美法仑、甲氨蝶呤、雷帕霉素(西罗莫司)、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸钠、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、紫杉烷、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、泰素、考布他汀、discodermolide、反铂、抗-血管内皮生长因子化合物(“抗-VEGF”)、抗-表皮生长因子受体化合物(“抗-EGFRs”)、5-氟尿嘧啶及衍生物、放射性核素、多肽毒素、细胞凋亡诱导剂、治疗增敏剂、和酶或其活性片段。

23.权利要求21的方法，其中所述治疗剂或诊断剂为包含抗体或抗体片段的治疗剂。

24.权利要求23的方法，其中所述抗体或抗体片段为IgG、或IgA、或IgD、或IgE或IgM的Fc片段。

25.权利要求23或24的方法，其中所述抗体或抗体片段介导补体活化、细胞介导的细胞毒性或调理作用、或肥大细胞活化或其它免疫应答中的一种或多种。

26.权利要求21的方法，其中所述治疗剂或诊断剂为选自荧光染料、放射性试剂、MRI造影剂、X射线造影剂、超声造影剂和PET造影剂的诊断剂。

27.权利要求16-26的任一项的方法，其中所述组合物还包含适当的药学载体。

28.权利要求16-27的任一项的方法，其中通过静脉内，通过表面，通过注射，通过吸入，鼻内，经直肠或口服途径给患者施用治疗有效量的所述组合物。

29.权利要求16-28的任一项的方法,还包括施用治疗有效量的白蛋白结合的纳米颗粒紫杉醇。

30.权利要求16的方法，其中所述肿瘤选自：口腔肿瘤、咽肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、骨肿瘤、软骨肿瘤、骨转移、肉瘤、皮肤肿瘤、黑素瘤、乳腺肿瘤、生殖系统肿瘤、尿道肿瘤、眼眶肿瘤、脑和中枢神经系统肿瘤、神经胶质瘤、内分泌系统肿瘤、甲状腺肿瘤、食管肿瘤、胃肿瘤、小肠肿瘤、结肠肿瘤、直肠肿瘤、肛门肿瘤、肝肿瘤、胆囊肿瘤、胰腺肿瘤、喉肿瘤、肺肿瘤、支气管肿瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、宫颈肿瘤、宫体肿瘤、卵巢肿瘤、外阴肿瘤、阴道肿瘤、前列腺肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎肿瘤、膀胱肿瘤、肾肿瘤、肾盂肿瘤、输尿管肿瘤、头颈肿瘤、甲状旁腺癌、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓样白血病、慢性髓样白血病。

31.权利要求16-30的任一项的方法，其中所述动物为人。

32.一种利用抗癌试剂和SPARC结合抗体治疗动物的肿瘤的方法，包括：

(a)从所述动物分离生物样品;

(b)检测所述生物样品中的SPARC蛋白的表达；和

(c)定量所述生物样品中SPARC蛋白的量;

其中如果SPARC蛋白高于阈值水平，则施用治疗有效量的抗癌剂和治疗有效量的抗SPARC结合抗体；或

如果SPARC蛋白低于阈值水平，则施用治疗有效量的抗癌剂并且不施用SPARC结合抗体。

33.权利要求32的方法，其中所述SPARC结合抗体包括Imm12、Imm14、hHTI或其组合。

34.权利要求32的方法，其中从体液分离所述生物样品。

35.权利要求34的方法，其中所述体液选自脑脊髓液、血液、血浆、血清和尿液。

36.权利要求32-35的任一项的方法，其中所述动物为人。

37.权利要求32的方法，其中所述肿瘤选自：口腔肿瘤、咽肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、骨肿瘤、软骨肿瘤、骨转移、肉瘤、皮肤肿瘤、黑素瘤、乳腺肿瘤、生殖系统肿瘤、尿道肿瘤、眼眶肿瘤、脑和中枢神经系统肿瘤、神经胶质瘤、内分泌系统肿瘤、甲状腺肿瘤、食管肿瘤、胃肿瘤、小肠肿瘤、结肠肿瘤、直肠肿瘤、肛门肿瘤、肝肿瘤、胆囊肿瘤、胰腺肿瘤、喉肿瘤、肺肿瘤、支气管肿瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、宫颈肿瘤、宫体肿瘤、卵巢肿瘤、外阴肿瘤、阴道肿瘤、前列腺肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎肿瘤、膀胱肿瘤、肾肿瘤、肾盂肿瘤、输尿管肿瘤、头颈肿瘤、甲状旁腺癌、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓样白血病、慢性髓样白血病。

38.权利要求32的方法，其中所述治疗剂或抗癌试剂选自多西他赛、紫杉醇、紫杉烷、铂化合物、抗叶酸、抗代谢药、抗有丝分裂剂、DNA损伤剂、促细胞凋亡剂、分化诱导剂、抗血管生成试剂、抗生素、激素、肽、抗体及其组合。

39.权利要求32的方法，其中治疗所述动物还包括施用治疗有效量的血管生成抑制剂。

40.权利要求39的方法，其中所述血管生成抑制剂选自贝伐单抗、舒尼替尼、HKP、IFN-α、夫马洁林、血管他丁、内皮他丁、沙立度胺及其组合。

41.权利要求32的方法，其中所述化学治疗剂包含蛋白质结合的药物的颗粒。

42.权利要求40的方法，其中所述蛋白质结合的药物颗粒的蛋白质组分包括白蛋白。

43.权利要求41的方法，其中所述化学治疗剂包括白蛋白结合的紫杉醇的颗粒。

44.权利要求32-43的任一项的方法，其中利用抗体检测SPARC蛋白的表达。

45.权利要求32-43的任一项的方法，其中不利用抗体检测SPARC蛋白的表达。

46.权利要求32-43的任一项的方法，其中利用非抗体SPARC结合分子来检测SPARC蛋白的表达。

47.权利要求32-43的任一项的方法，其中不使用SPARC结合分子检测SPARC蛋白的表达。

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