CN108025067A - 抗血管内皮生长因子受体2（vegfr2）抗体 - Google Patents

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Abstract

本申请提供抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体和其抗原结合片段。还提供了编码抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子、相关表达载体以及宿主细胞。提供了制备抗VEGFR2抗体和其抗原结合片段的方法。还提供了包含抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)的相关药物组合物以及使用其治疗以过度血管生成为特征的病理病况的方法。

Description

抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年6月30日提交的美国临时申请第62/187,204号的优先权权益，该案以全文引用的方式并入本文中。
以ASCII文本文件提交的序列表
以下以ASCII文本文件提交的内容以全文引用的方式并入本文中：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：719902000240SEQLIST.TXT，记录日期：2016年6月28日，大小：75KB)。
背景技术
血管内皮生长因子受体(又称为VEGFR2、KDR、FLK1及CD309)是由包括VEGFR1(FLT、FLT1)、VEGFR2和VEGFR3(FLT4、PCL)的三种密切相关的受体酪氨酸激酶构成的VEGF受体亚家族的细胞表面受体。VEGFR2与配体(如VEGF A、C、D或E)结合将诱导受体二聚合以及VEGFR2C末端结构域中若干酪氨酸(Y)残基的自体磷酸化。这一自体磷酸化引起若干信号转导级联的下游活化，从而引起内皮细胞增殖和迁移、血管渗透性和血管生成。
上皮癌症牵涉到VEGFR2或家族成员的突变、扩增或错误调控。举例来说，在肺腺癌中已检测到相对较高频率(9％)的VEGFR2突变和扩增。此外，针对NSCLC肿瘤进行的研究显示，肺腺癌和鳞状细胞癌中VEGFR2拷贝数变化的频率较高(32％)，引起较高的VEGFR-2蛋白质表达。VEGFR2被鉴别为癌基因使得需要开发针对VEGFR2的抗癌治疗剂。本发明满足这一需求以及其它需求。
发明内容
本文提供一种抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不阻断VEGFR2与VEGF的结合。本文还提供一种抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合VEGFR2的结构域5-7。本文还提供一种抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不阻断VEGFR2与VEGF的结合，并且其中所述抗体或其抗原结合片段结合VEGFR2的结构域5-7。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段结合至整个HUVEC细胞。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段在体外不抑制血管生成。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段在体内抑制血管生成。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段在体外不抑制血管生成，并且其中所述抗体或其抗原结合片段在体内抑制血管生成。
本文提供一种抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体或其抗原结合片段，其包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQNIASYLN(SEQ ID NO:76)或RASQSVS-S/N-S/N-YL-G/A(SEQ ID NO:83)或TRSRGSIASSYVQ(SEQ IDNO:80)或RSSQSL-L/V/Y-H/Y-G/S/R-D/N-G-N/K/Y-N/T-Y/F-LD(SEQ ID NO:84)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/A/G/K/E-G/A/V/N/S-S/D-N/S/Q/K-R/L-A/K/D/P-S/T(SEQ ID NO:60)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/Q-Q/S-A/S/R/G/Y-L/Y/S/A/D/G/T-Q/S/N/H/F-T/I/W/S-P/T-Y/L/P/V/G/I-T/V(SEQ ID NO:72)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列T/S-Y-Y/G/A/S-M/I-H/N/S(SEQ ID NO:34)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I/V/G/S-I-N/S/I-P/Y/S/G-S/D/I-G/F/S-G/S-S/N/T/Y/A-T/K/A/I-S/Y/N/H-YA-Q/D-K/S-F/V-K/Q-G(SEQ ID NO:40)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列GLWFGEGY(SEQ IDNO:49)或ESYGGQFDY(SEQ ID NO:43)或DLVVPAATLDY(SEQ ID NO:42)或D/G-F/I-Y/I-E/V-A/G-G/P-G/T-W/D-Y/A-FD-L/I(SEQ ID NO:51)或RDGSLGVGYYYMDF(SEQ ID NO:50)或VGATTSLYYYYGMDV(SEQ ID NO:47)或DGFGLAVAGPYWYFDL(SEQ ID NO:44)或PTRSRDFWSGLGYYYYMDV(SEQ ID NO:45)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述轻链可变结构域序列包括(1)含选自由SEQ ID NO:75-82组成的组的氨基酸序列的CDR-L1；(2)含选自由SEQID NO:54-59组成的组的氨基酸序列的CDR-L2；及(3)含选自由SEQ ID NO:63-71组成的组的氨基酸序列的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含选自由SEQ ID NO:29-33和85组成的组的氨基酸序列的CDR-H1；(2)含选自由SEQ ID NO:35-39和125组成的组的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)含选自由SEQ ID NO:42-50组成的组的氨基酸序列的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RSSQSLLHGNGNNYLD(SEQ ID NO:75)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列LGSNRAS(SEQ ID NO:54)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQALQTPYT(SEQ ID NO:63)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列TYYMH(SEQ ID NO:29)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列IINPSGGSTSYAQKFQG(SEQ ID NO:36)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列DLVVPAATLDY(SEQ ID NO:42)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQNIASYLN(SEQ ID NO:76)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列AASSLKS(SEQ ID NO:55)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QQSYSIPYT(SEQ ID NO:64)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYGMH(SEQ ID NO:30)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:37)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列ESYGGQFDY(SEQ ID NO:43)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQSVSNNYLG(SEQ ID NO:77)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO:56)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QQRSNWPLT(SEQ ID NO:65)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYAMH(SEQ ID NO:31)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:37)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列DGFGLAVAGPYWYFDL(SEQ ID NO:44)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RSSQSLVYSDGKTYLD(SEQ ID NO:78)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列KVSNRDS(SEQ ID NO:57)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGAHWPPT(SEQ ID NO:66)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYAIS(SEQ ID NO:85)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:38)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列PTRSRDFWSGLGYYYYMDV(SEQ ID NO:45)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO:79)的CDR-L1；(2)含GASSRAT(SEQ IDNO:56)中所述氨基酸序列的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QQRSNWPPT(SEQ ID NO:67)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYGMH(SEQ ID NO:30)的CDR-H1；(2)含VISYDGSNKHYADSVKG(SEQ ID NO:125)中所述氨基酸序列的CDR-H2；及(3)含DFYEAGGWYFDL(SEQ ID NO:46)中所述氨基酸序列的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列TRSRGSIASSYVQ(SEQ ID NO:80)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列ENDQRPS(SEQ ID NO:58)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QSYDFSTVV(SEQ ID NO:68)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYAIS(SEQ ID NO:85)的CDR-H1；(2)含GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:38)中所述氨基酸序列的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列VGATTSLYYYYGMDV(SEQ ID NO:47)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO:79)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO:56)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QQYGSSPGT(SEQ ID NO:69)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYSMN(SEQ ID NO:28)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列SISSSSSYIYYADSVKG(SEQ ID NO:35)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列GIIVGPTDAFDI(SEQ ID NO:48)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RSSQSLYYRDGYTFLD(SEQ ID NO:81)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列LSSKRDS(SEQ ID NO:59)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:70)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列TYAMS(SEQ ID NO:33)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列GISGSGGATHYADSVKG(SEQ ID NO:39)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列GLWFGEGY(SEQ ID NO:49)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RSSQSLLYSNGYNYLD(SEQ ID NO:82)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列LGSNRAS(SEQ ID NO:54)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQALQTPIT(SEQ ID NO:71)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYAIS(SEQ ID NO:85)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:38)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列RDGSLGVGYYYMDF(SEQ ID NO:50)的CDR-H3。
本文提供一种抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体或抗原结合片段，其为抗VEGFR2抗体的变体，包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ IDNO:23)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQID NO:25)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3，其中所述变体在SEQ ID NO:22、23、24、25、26和/或27中的一个或更多个中包含至少一个氨基酸取代。
还提供了一种抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体或其抗原结合片段，其竞争性抑制第二抗VEGFR2抗体与VEGFR2的结合，其中所述抗VEGFR2抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3。
本文还提供了一种抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至VEGFR2中与针对VEGFR2的第二抗VEGFR2抗体相同的表位，其中所述第二抗VEGFR2抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3，其中所述变体在SEQ ID NO:22、23、24、25、26和/或27中的一个或更多个中包含至少一个氨基酸取代。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含选自由SEQ ID NO:1和16组成的氨基酸序列的CDR-L1；(2)含选自由SEQ ID NO:2、7和8组成的氨基酸序列的CDR-L2；及(3)含选自由SEQ ID NO:3、9和12组成的氨基酸序列的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含选自由SEQ ID NO:4、13、14及15组成的氨基酸序列的CDR-H1；(2)含选自由SEQ ID NO:5、7、17、18、19、20及21组成的氨基酸序列的CDR-H2；(3)含选自由SEQ ID NO:6、10和11组成的氨基酸序列的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列LSS(SEQ ID NO:2)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQ ID NO:10)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRSGYTF(SEQ ID NO:16)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RFSFSTYA(SEQ ID NO:15)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGQAT(SEQ ID NO:20)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRSGYTF(SEQ ID NO:16)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGTT(SEQID NO:21)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRSGYTF(SEQ ID NO:16)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGTT(SEQID NO:21)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQ ID NO:10)的CDR-H3。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体包含人类IgG的Fc序列。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab)'2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双抗体及线性抗体。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体是多特异性抗体。
在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，根据以上实施例中的任一个的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段与治疗剂缀合。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段与标记缀合。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述标记选自由以下组成的组：放射性同位素、荧光染料和酶。
本文提供一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据(或适用于)以上实施例中的任一个的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段。还提供了一种表达载体，所述表达载体编码根据(或适用于)以上实施例中的任一个的核酸分子。本文提供了一种细胞，所述细胞包含根据(或适用于)以上实施例中的任一个的表达载体。本文提供了一种产生抗VEGFR2的方法，所述方法包括培养根据(或适用于)以上实施例中的任一个的细胞以及从细胞培养物回收所述抗VEGFR2。
提供了一种组合物，所述组合物包含根据(或适用于)以上实施例中的任一个的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载剂。还提供一种检测来自患者的样品中的VEGFR2蛋白质的方法，所述方法通过使根据(或适用于)以上实施例中的任一个的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段与样品接触以及检测结合至所述VEGFR2蛋白质的抗VEGFR2抗体来进行。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段被用于免疫组织化学分析(IHC)中或ELISA分析中。
本文提供了治疗对象的以过度血管生成为特征的病理病况的方法，该方法包括向所述对象施用有效量的根据(或适用于)以上实施例中的任一个的组合物。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述以过度血管生成为特征的病理病况选自由以下组成的组：癌症、眼部疾病或炎症。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述以过度血管生成为特征的病理病况是癌症。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述癌症是结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌或实体肿瘤。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，另外向所述对象施用选自由以下组成的组的治疗剂：抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂及细胞毒性剂。在根据(或适用于)以上实施例中的任一个的某些实施例中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。
附图说明
图1显示了用于比较抗VEGFR2抗体V1、V9、V10和1121B(Ref A)与VEGFR2结构域5-7的结合的ELISA的结果。
图2显示了用于评估抗VEGFR2抗体V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10及1121B(Ref A)抑制VEGF与VEGFR2的结合的能力的ELISA的结果。
图3显示了用于比较V9、1121B(Ref A)和1121N(Ref B)结合整个HUVEC细胞的能力的分析的结果。
图4显示了用于比较V1、V2、V6、V7、V8、V9、V10及1121B(Ref A)对HUVEC迁移的影响的分析的结果。
图5显示了用于比较V1、V2、V6、V7、V8、V9、V10及1121B(Ref A)对HUVEC存活的影响的分析的结果。
图6显示了用于比较V1、V2、V6、V7、V8、V9、V10及1121B(Ref A)对HUVEC增殖的影响的分析的结果。
图7显示了用于比较V9和1121B(Ref A)对体内血管生成的影响的分析的结果。
图8描绘了测量V1、V9、V10及1121B(Ref A)抑制肿瘤生长的能力的HCT-116肿瘤异种移植分析的结果。
图9显示了用于比较抗VEGFR2抗体V9、29、30、32、34及67与VEGFR2的结合的ELISA的结果。
图10A显示了用于比较抗VEGFR2抗体V9/V9(LC/HC)、V9/29(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)、1121B(Ref A)、抗PDGFRα抗体及ERBITUX(即，和抗EGFR抗体)与VEGFR2的结合的ELISA的结果。图10B显示了用于比较抗VEGFR2抗体V9/V9(LC/HC)、V9/29(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)、1121B(Ref A)、抗PDGFRα抗体及ERBITUX(即，和抗EGFR抗体)与VEGFR2的结合的另一组ELISA的结果。
图11A显示了用于评估抗VEGFR2抗体V9/V9(LC/HC)、V9/29(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)、1121B(Ref A)、1211N(Ref B)及Avastin(即，抗VEGF)在体外抑制HUVEC增殖的能力的分析的结果。图11B显示图11A中测试的各抗体的增殖抑制百分比。
图12A显示了用于评估抗VEGFR2抗体V9/V9(LC/HC)、V9/29(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)、1121B(Ref A)、1211N(Ref B)及Avastin(即，抗VEGF)在体外抑制HUVEC存活的能力的分析的结果。图12B显示图12A中测试的各抗体的存活抑制百分比。
图13A显示了用于比较抗VEGFR2抗体34/80A(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)及1121B(Ref A)与VEGFR2的结合的ELISA的结果。图13B提供在无1121B(Ref A)下图13A的结果。图13C显示了用于比较抗VEGFR2抗体34/80A(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)及1121B(Ref A)与VEGFR2的结合的另一组ELISA的结果。图13D提供在无1121B(Ref A)下图13C的结果。
图14A显示了用于比较抗VEGFR2抗体34/80A(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)及1121B(Ref A)与VEGFR2的结合的ELISA的结果。图14B提供在无1121B(Ref A)下图14A的结果。图14C显示了用于比较抗VEGFR2抗体34/80A(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)及1121B(Ref A)与VEGFR2的结合的另一组ELISA的结果。图14D提供在无1121B(Ref A)下图14C的结果。
图15显示了用于比较34/V9(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110/110A(LC/HC)、110/110B(LC/HC)、1121B(Ref A)及1121N(Ref B)结合整个HUVEC细胞的能力的分析的结果。
图16A显示了用于评估抗VEGFR2抗体V9/V9(LC/HC)、V9/29(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)、1121B(Ref A)、1211N(RefB)及Avastin(即，抗VEGF)在体外抑制HUVEC增殖的能力的分析的结果。图16B显示图16A中测试的各抗体的增殖抑制百分比。
图17A显示了用于评估抗VEGFR2抗体V9/V9(LC/HC)、V9/29(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)、1121B(Ref A)、1211N(Ref B)及Avastin(即，抗VEGF)在体外抑制HUVEC存活的能力的分析的结果。图17B显示图17A中测试的各抗体的存活抑制百分比。
图18A显示了用于评估34/V9(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、1121B(Ref A)、1121N(Ref B)及对照抗体(HLX02)结合小鼠VEGFR2的能力的ELISA的结果。图18B显示另一组重复ELISA的结果。
图19A显示了用于比较110B/110B(LC/HC)和1121N(Ref B)抑制VEGFR2磷酸化的能力的分析的结果。图19B提供图19A的定量结果。
图20显示了用于比较V9、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110/110A(LC/HC)、110/110B(LC/HC)、1121N(Ref B)及Avastin对HUVEC迁移的影响的分析的结果。
图21描绘了测量34/V9(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、1121B(Ref A)及1121N(Ref B)抑制肿瘤生长的能力的HCT-116肿瘤异种移植分析的结果。
图22描绘了测量34/V9(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、1121B(Ref A)及1121N(Ref B)抑制肿瘤生长的能力的HCT-116肿瘤异种移植分析的结果。
图23A显示了对不同34/V9(LC/HC)配制物(formulations)进行的稳定性测试的结果。图23B显示了对不同110/110B(LC/HC)配制物进行的稳定性测试的结果。
图24A显示了用于确定抗体110/110B是否能够结合VEGFR1的实验的结果。图24B显示了用于确定抗体110/110B是否能够结合VEGFR3的实验的结果。
图25显示了用于确定抗体110/110B是否能够抑制VEGF-C刺激的人类淋巴内皮细胞(HLEC)增殖的实验的结果。
图26A显示了用于确定抗体110/110B是否能够抑制VEGF-C刺激的VEGFR2磷酸化的实验的结果。图26B提供图26A的定量结果。
图27A显示了用于确定抗体110/110B是否能够抑制VEGF-C刺激的VEGFR3磷酸化的实验的结果。图27B提供图26A的定量结果。
图28描绘了测量110B/110B抑制肿瘤生长的能力的NCI-H460肿瘤异种移植分析的结果。
具体实施方式
本发明提供了新颖抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体。申请人意外地发现，相对于本领域中已知的其它抗VEGFR2抗体，本文中提供的抗VEGFR2抗体结合VEGR2的结构域5-7。本文所描述的抗VEGFR2抗体不阻断VEGF与VEGFR2的结合，但是能够在体外和体内抑制血管生成。
还提供了免疫缀合物、编码本文所描述的新颖抗VEGFR2抗体的核酸以及组合物(如药物组合物)。本发明还提供了使用新颖抗VEGFR2抗体检测样品(如体内或离体样品)中的VEGFR2的方法、用于治疗癌症的包含此类抗体的组合物，以及此类抗体在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
定义
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”是用于获得有益或所希望的结果，包括临床结果的一种方法。出于本发明的目的，有益或所希望的临床结果包括但不限于以下一种或更多种：缓解由疾病引起的一种或更多种症状；减轻疾病的程度；使疾病稳定(例如，预防或延迟疾病的恶化(例如进展))；预防或延迟疾病的扩散(例如转移)；预防或延迟疾病的再发；延迟或减慢疾病的进展；改善疾病状态；使疾病缓解(部分或完全缓解)；减少治疗疾病所需的一种或更多种其它药物的剂量；延迟疾病的进展；增加或提高生活质量；增加体重增长；和/或延长存活期。“治疗”还涵盖癌症病理结果(例如肿瘤体积)的减轻。本文中提供的方法考虑这些治疗方面中的任一个或更多个。
术语“再发”、“复发”或“复发性”是指在临床评估疾病消失之后，癌症或疾病重新出现。诊断出远端转移或局部再发可以视为复发。
术语“难治性”或“抗性”是指癌症或疾病对治疗不起反应。
术语“辅助疗法”是指在主要疗法，通常是手术之后给予的治疗。癌症或疾病的辅助疗法可以包括免疫疗法、化学疗法、放射疗法或激素疗法。
术语“维持疗法”是指用于帮助维持先前治疗的效果的预定的再治疗。维持疗法通常被用于帮助保持癌症缓解或延长对特定疗法的反应，不管疾病进展如何。
术语“侵袭性癌症”是指扩散到起源组织层外，进入正常周围组织中的癌症。侵袭性癌症可以是或可以不是转移性的。
术语“非侵袭性癌症”是指极早期癌症或尚未扩散到起源组织以外的癌症。
术语“无进展存活期”在肿瘤学中是指在治疗期间和之后癌症不生长的时间长度。无进展存活期包括患者经历完全反应或部分反应的时间量以及患者经历稳定疾病的时间量。
术语“进行性疾病”在肿瘤学中可以指从治疗开始，由于肿块增大或肿瘤扩散引起的超过20％的肿瘤生长。
“病症”是将得益于抗体治疗的任何病况。例如，经历或需要预防异常VEGFR2活性的哺乳动物。这包括了慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患上相关病症的病理病况。本文中待治疗的病症的非限制性实例包括癌症(如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌及实体肿瘤)和以过度血管生成为特征的病理病况。将得益于由本发明提供的抗VEGFR2抗体的治疗的示例性癌症和以过度血管生成为特征的病理病况将于本文中别处进一步详细描述。
如本文所用，术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞(不管是恶性还是良性)生长和增殖，以及所有癌变前和癌细胞和组织。
术语“抗体”是以最广义使用并且特别地涵盖例如单一单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多克隆抗体、单链抗体以及抗体片段(参见下文)，只要其特异性结合天然多肽和/或展现本发明的生物活性或免疫活性即可。在某些实施例中，所述抗体特异性结合至蛋白质，该结合可能受到本发明的单克隆抗体(例如本发明的保藏抗体等)抑制。短语抗体的“功能片段或类似物”是具有与相关抗体相同的定性生物活性的化合物。举例来说，本发明抗体的功能片段或类似物可以是能够特异性结合至VEGFR2的功能片段或类似物。在一个实施例中，所述抗体可以防止或大体上减弱VEGFR2诱导细胞增殖的能力。
“分离的抗体”是已经从其天然环境的组分鉴别和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰所述抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素以及其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施例中，抗体将被纯化至(1)如利用劳里法(Lowrymethod)测定，以抗体的重量计超过95％，并且最优选超过99重量％；(2)通过使用转杯式测序仪足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)使用考马斯蓝(Coomassie blue)或优选使用银染剂在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE测定为均质。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为在抗体天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
基本的4链抗体单元是由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链构成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异四聚体单元以及一个称为J链的另外的多肽组成，并因此含有10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合形成包含2至5个基本的4链单元以及J链的多价组装体(assemblage))。就IgG而言，该4链单元一般是约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键连接至H链，而取决于H链同型，两条H链由一个或更多个二硫键彼此连接。每条H链和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N末端具有一个可变结构域(VH)，随后对于α和γ链分别是三个恒定结构域(CH)并且对于μ和ε同型是四个CH结构域。每条L链在N末端具有一个可变结构域(VL)，随后在其另一端具有一个恒定结构域(CL)。VL与VH对准并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对准。相信特定的氨基酸残基在轻链可变结构域与重链可变结构域之间形成了界面。VH与VL对一起形成单一抗原结合位点。有关不同种类抗体的结构和特性，参见例如，《基础临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)》,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编),Appleton&Lange,康涅狄格州诺瓦克(Norwalk,CT),1994,第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以指定为称为κ和λ的两种明显不同类型中的一种。取决于重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被指定为不同种类或同型。有五个种类的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，分别具有称为α、δ、γ、ε及μ的重链。γ和α种类基于CH序列和功能的相对微小的差异，被进一步分成若干亚类，例如人类表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
术语“可变”是指各抗体间可变结构域某些区段的序列广泛不同的事实。V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在整个可变结构域的110个氨基酸的范围内并非均匀分布。实际上，V区由通过各自是9-12个氨基酸长的被称作“高变区”的变化极大的较短区隔开的含15-30个氨基酸的被称作构架区(FR)的相对不变的伸长段组成。天然重链和轻链的可变结构域各自包含由三个高变区连接的四个主要呈β折叠构型的FR，高变区形成连接β折叠结构的环并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起并且与另一条链的高变区保持在一起，促使抗体的抗原结合位点形成(参看Kabat等人,《免疫相关蛋白质序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)》,第5版,马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院的公共卫生署(Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.)(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现各种效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意图指在重链和轻链多肽的可变区内发现的不连续抗原组合位点。这些特殊区域描述于以下中：Kabat等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》252:6609-6616(1977)；Kabat等人,美国卫生与公共服务部(U.S.Dept.ofHealth and Human Services),“免疫相关蛋白质序列”(1991)；Chothia等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987)；及MacCallum等人,《分子生物学杂志》262:732-745(1996)，其中这些定义包括当相互比较时氨基酸残基的重叠或亚群。然而，应用的有关抗体或移植抗体或其变体的CDR的任一定义意图在如本文中所定义和使用的术语的范围内。作为比较，下表1中陈述了涵盖如以上引用的参考文献各自定义的CDR的氨基酸残基。
表1：CDR定义
1残基编号遵循前述Kabat等人的文献的命名法
2残基编号遵循前述Chothia等人的文献的命名法
3残基编号遵循前述MacCallum等人的文献的命名法
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从大体上均质抗体群获得的抗体，即，构成该群体的个别抗体除了可以少量存在的可能天然存在的突变外是相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点具有高度特异性。此外，相对于包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。除特异性外，单克隆抗体的有利之处还在于，可以合成这些抗体，而不受其它抗体污染。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法制造抗体。举例来说，可用于本发明中的单克隆抗体可以通过最先由Kohler等人,《自然(Nature)》256:495(1975)所描述的杂交瘤方法制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见例如美国专利第4,816,567号)。“单克隆抗体”还可以使用例如Clackson等人,《自然》,352:624-628(1991)；Marks等人,《分子生物学杂志》,222:581-597(1991)以及以下实例中描述的技术，从噬菌体抗体文库分离。
单克隆抗体在本文中包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体种类或子类的抗体中的相应序列同一或同源，而这些链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体种类或子类的抗体中的相应序列同一或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现本发明的生物活性即可(参见美国专利第4,816,567号；及Morrison等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,81:6851-6855(1984))。本文中所关注的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，这些抗体包含来源于非人类灵长类动物(例如旧域猴(Old World monkeys)、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人类恒定区序列。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及一个CL和至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人类天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选的是，完整抗体具有一种或更多种效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利第5,641,870号，实例2；Zapata等人,《蛋白质工程(Protein Eng.)》8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
表述“线性抗体”一般是指Zapata等人,《蛋白质工程》,8(10):1057-1062(1995)中所描述的抗体。简单点说，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，这些区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段；以及一个残留“Fc”片段，该名称反映它能够容易地结晶。Fab片段由一条完整L链以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。各Fab片段关于抗原结合是单价的，即，它具有单一抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大的F(ab')2片段，该片段大致对应于两个二硫键连接的Fab片段，具有二价抗原结合活性并且仍能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，CH1结构域的羧基末端增加了几个残基，包括一个或更多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab'-SH在本文中是用于恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab'的名称。F(ab')2抗体片段最初是以Fab'片段对形式产生，在这些Fab'片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶合也是已知的。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由Fc区的序列决定，该区域还是某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的部分。
“变体Fc区”包含由于至少一个如本文所定义的“氨基酸修饰”而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选的是，与天然序列Fc区或亲本多肽Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽Fc区中的约一个至约十个氨基酸取代，并且优选地，约一个至约五个氨基酸取代。在一个实施例中，本文中的变体Fc区将与天然序列Fc区具有至少约80％同源性，至少约85％同源性，至少约90％同源性，至少约95％同源性或至少约99％同源性。根据另一实施例，本文中的变体Fc区将与亲本多肽Fc区具有至少约80％同源性，至少约85％同源性，至少约90％同源性，至少约95％同源性或至少约99％同源性。
术语“含Fc区的多肽”是指包含Fc区的多肽，如抗体或免疫粘附素(参见本文中别处的定义)。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以例如在多肽纯化期间去除，或通过以重组方式工程改造编码多肽的核酸来去除。因此，包含具有根据本发明的Fc区的多肽(包括抗体)的组合物可以包含所有K447残基都被去除的多肽群、未去除K447残基的多肽群，或具有含和不含K447残基的多肽的混合物的多肽群。
抗体“效应子功能”是指可由抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起的生物活性并且随抗体同型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体下调；及B细胞活化。“天然序列Fc区”包含与在自然界中发现的Fc区同一的氨基酸序列。Fc序列的实例描述于例如但不限于Kabat等人,《免疫相关序列(Sequences ofImmunological Interest)》第5版,马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院公共卫生服务部(1991)中。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这一片段由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域紧密非共价缔合的二聚体组成。由这两个结构域折叠得到六个高变环(H链和L链各3个环)，这些高变环提供抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个抗原特异性CDR的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，但是亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”，又缩写为“sFv”或“scFv”，是包含VH和VL抗体结构域连接形成单一多肽链的抗体片段。优选的是，sFv多肽还在VH结构域与VL结构域之间包含多肽连接子，由此使sFv能够形成抗原结合所希望的结构。有关sFv的评述，参见Pluckthun,《单克隆抗体药理学(Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,纽约(New York),第269-315页(1994)；Borrebaeck 1995,见下文。
术语“双抗体”是指通过构建在VH结构域与VL结构域之间具有较短连接子(约5-10个残基)的sFv片段(参见前一段)，使得V结构域链间而非链内配对，产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段而制备的小抗体片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中该两个抗体的VH结构域和VL结构域存在于不同多肽链上。双抗体更完整地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人,《美国国家科学院院刊》,90:6444-6448(1993)中。
非人类(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人类抗体的极小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是来自接受体高变区的残基被来自具有所希望的抗体特异性、亲和力和能力的非人类物种(供体抗体)，如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的高变区的残基置换的人类免疫球蛋白(接受体抗体)。在一些情况下，人类免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人类残基替换。此外，人源化抗体可以包含在接受体抗体或供体抗体中未发现的残基。这些修饰的进行是为了进一步优化抗体性能。一般来说，人源化抗体将包含至少一个并且典型地两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的高变环都对应于非人类免疫球蛋白的高变环并且所有或基本上所有的FR都是具有人类免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人类免疫球蛋白的至少一部分。有关进一步详情，参见Jones等人,《自然》321:522-525(1986)；Reichmann等人,《自然》332:323-329(1988)；以及Presta,《结构生物学新见(Curr.Op.Struct.Biol.)》2:593-596(1992)。
有关本文中标识的多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”定义为在将任何保守取代视为序列同一性的一部分的情况下，在对准候选序列与比较多肽之后，候选序列中与比较多肽中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分含量。为了测定氨基酸序列同一性百分比而进行的比对可以按本领域技能内的各种方式实现，例如使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列全长内实现最大对准所需的任何算法。但是，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成氨基酸序列同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序是由Genentech,Inc.开发，并且源代码已与用户文档一起提交给位于华盛顿哥伦比亚特区(Washington D.C.)20559的美国版权局(U.S.Copyright Office)，其中其登记的美国版权登记号是TXU510087。ALIGN-2程序通过加利福尼亚州南旧金山(South San Francisco,California)的Genentech,Inc.公开可用。ALIGN-2程序应当被编译成在UNIX操作系统，优选数字式UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数都是由ALIGN-2程序设置并且不会变化。
术语“Fc受体”或“FcR”被用来描述结合至抗体Fc区的受体。在一个实施例中，本发明的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII及FcγRIV亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体以及替代性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“活化受体”)和FcγRIIB(一种“抑制受体”)，两者具有差别主要在于其胞质结构域方面的类似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》15:203-234(1997)中的评述)。所述术语包括同种异型，如FcγRIIIa同种异型：FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131和/或FcγRIIA-H131。FcR评述于Ravetch和Kinet，《免疫学年鉴》，9:457-92(1991)；Capel等人,《免疫方法(Immunomethods)》,4:25-34(1994)；以及de Haas等人,《实验室与临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)》,126:330-41(1995)中。其它FcR，包括将来鉴别的FcR，都涵盖在本文的术语“FcR”中。该术语还包括新生儿受体FcRn，该受体负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，117:587(1976)以及Kim等人，《免疫学杂志》，24:249(1994))。
术语“FcRn”是指新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn在结构上类似于主要组织相容性复合体(MHC)并且由α链非共价结合至β2-微球蛋白组成。新生儿Fc受体FcRn的多种功能评述于Ghetie和Ward(2000),《免疫学年鉴》18,739-766中。FcRn在免疫球蛋白IgG从母体被动递送至幼体以及血清IgG含量调控中起作用。FcRn可以用作挽救受体，在细胞内和穿过细胞结合和运输被吞饮的呈完整形式的IgG，并防止其经历默认降解路径。
人类IgG Fc区的“CH1结构域”(又称为“H1”的“C1”结构域)通常从约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号系统)。
“铰链区”一般定义为从人类IgG1的Glu216至Pro230的伸长段(Burton,《分子免疫学(Molec.Immunol.)》22:161-206(1985))。可以通过安置第一个和最后一个半胱氨酸残基，在相同位置形成重链间S-S键，来将其它IgG同型的铰链区与IgG1序列对准。
Fc区的“下部铰链区”通常定义为紧邻C末端的残基至铰链区，即Fc区的残基233至239的伸长段。在先前的报导中，FcR结合一般是由IgG Fc区的下部铰链区中的氨基酸残基引起。
人类IgG Fc区的“CH2结构域”(又称“H2”的“C2”结构域)通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2结构域的独特之处在于，它不与另一结构域紧密配对。实际上，在完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入了两个N-连接的分支链碳水化合物链。据推测，所述碳水化合物可以作为结构域-结构域配对的替代并且帮助稳定CH2结构域。Burton,《分子免疫学》22:161-206(1985)。
“CH3结构域”(又称为“C2”或“H3”结构域)包含C末端残基至Fc区中的CH2结构域(即，从抗体序列的约氨基酸残基341至C末端，典型地在IgG氨基酸残基446或447处)的伸长段。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。这些效应子功能一般需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合并且可以使用如例如本文所公开的各种分析进行评估。
“C1q”是包括免疫球蛋白Fc区的结合位点的多肽。C1q与两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1s一起形成复合体C1，即补体依赖性细胞毒性(CDC)路径的第一组分。人类C1q可以从例如加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA)的Quidel商购得到。
术语“结合结构域”是指多肽结合至另一分子的区域。在FcR情况下，结合结构域可以包含其多肽链(例如其α链)中负责结合Fc区的部分。一个有用的结合结构域是FcRα链的细胞外结构域。
包含具有“改变”的FcR结合亲和力或ADCC活性的变体IgG Fc的抗体是FcR结合活性(例如FcγR或FcRn)和/或ADCC活性相较于亲本多肽或包含天然序列Fc区的多肽有所增强或减弱的抗体。与FcR“展现增加的结合”的变体Fc结合至少一种FcR的亲和力高于(例如较低的表观Kd或IC50值)亲本多肽或天然序列IgG Fc。根据一些实施例，结合相较于亲本多肽改善达约3倍，优选约5倍、10倍、25倍、50倍、60倍、100倍、150倍、200倍，甚至500倍，或结合改善约25％至1000％。与FcR“展现减少的结合”的多肽变体结合至少一种FcR的亲和力低于(例如较高的表观Kd或较高的IC50值)亲本多肽。结合相较于亲本多肽减少可以是结合减少约40％或更高百分比。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的一种形式，其中分泌的Ig结合至某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至带有抗原的靶细胞并且随后利用细胞毒素杀灭靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞并且是此类杀灭作用必需的。用于介导ADCC的主要细胞，即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上FcR的表达概述于Ravetch和Kinet,《免疫学年鉴》9:457-92(1991)第464页上的表3中。为了评估所关注分子的ADCC活性，可以执行体外ADCC分析，如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中或以下实例中描述的分析。用于此类分析的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地或另外，所关注分子的ADCC活性可以在体内，例如在如Clynes等人,《美国国家科学院院刊(美国)》,95:652-656(1998)中所公开的动物模型中评估。
包含相较于具有野生型IgG Fc的多肽或亲本多肽“展现增加的ADCC”或在人类效应细胞存在下更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的变体Fc区的多肽是当在所述分析中具有变体Fc区的多肽的量与具有野生型Fc区的多肽(或亲本多肽)的量基本上相同时，在体外或体内大体上更有效地介导ADCC的多肽。一般来说，此类变体将使用本领域中已知的任何体外ADCC分析，如用于例如在动物模型等中测定ADCC活性的分析或方法进行鉴别。在一个实施例中，优选的变体在介导ADCC方面的有效性是野生型Fc(或亲本多肽)的约5倍至约100倍，例如约25至约50倍。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的溶解。补体系统的第一组分(C1q)与结合至同源抗原的抗体(属于适当子类)相结合将起始经典补体路径的活化。为了评估补体活化，可以进行CDC分析，例如，如Gazzano-Santaro等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》,202:163(1996))中所描述。Fc区氨基酸序列改变并且C1q结合能力增强或减弱的多肽变体描述于美国专利第6,194,551B1号和WO99/51642中。这些专利公开的内容明确地以引用的方式并入本文中。另外，参见Idusogie等人,《免疫学杂志》164:4178-4184(2000)。
本文所公开的抗VEGFR2抗体(或其片段)或组合物的“有效量”是足以实现具体陈述的目的的量。“有效量”可以凭经验以及利用与所述目的有关的已知方法测定。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”哺乳动物(也称为患者)的疾病或病症的如本文所公开的抗VEGFR2抗体(或其片段)或组合物的量。在癌症情况下，治疗有效量的如本文所公开的抗VEGFR2抗体(或其片段)或组合物可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小或重量；抑制(即，在一定程度上减缓并且优选停止)周围器官中癌细胞的浸润；抑制(即，在一定程度上减缓并且优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或更多种癌症相关症状。就本文所公开的抗VEGFR2抗体(或其片段)或组合物可以预防癌细胞生长和/或杀灭现有癌细胞来说，它可以具有细胞生长抑制性和/或细胞毒性。在一个实施例中，治疗有效量是生长抑制量。在另一个实施例中，治疗有效量是延长患者存活期的量。在另一个实施例中，治疗有效量是改善患者的无进展存活期的量。
本文所公开的本发明的抗VEGFR2抗体(或其片段)或组合物的“生长抑制量”是能够在体外或体内抑制细胞，尤其是肿瘤，例如癌细胞生长的量。用于抑制赘生性细胞生长的本发明的多肽、抗体、拮抗剂或组合物的“生长抑制量”可以凭经验以及由已知方法或由本文中提供的实例测定。
本发明的抗VEGFR2抗体(或其片段)或组合物的“细胞毒性量”是能够在体外或体内破坏细胞，尤其是肿瘤，例如癌细胞的量。用于抑制赘生性细胞生长的本发明的抗VEGFR2抗体(或其片段)或组合物的“细胞毒性量”可以凭经验以及由本领域中已知的方法测定。
本发明的抗VEGFR2抗体(或其片段)或组合物的“生长抑制量”是能够在体外或体内抑制细胞，尤其是肿瘤，例如癌细胞生长的量。用于抑制赘生性细胞生长的本发明的抗VEGFR2抗体(或其片段)或组合物的“生长抑制量”可以凭经验以及由已知方法或由本文中提供的实例测定。
如本文所用，“药学上可接受”或“药理学相容”意谓一种材料并非在生物学上或在其它方面不合需要的，例如该材料可以并入施用给患者的药物组合物中，而不会引起任何明显不合需要的生物作用，或不会以有害方式与含有其的组合物的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载剂或赋形剂优选符合毒理学和制造测试的所需标准，和/或包括在美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug administration)制定的无活性成分指南中。
术语“检测”意图包括确定一种物质的存在或不存在或定量一种物质(如VEGFR2)的量。因此，该术语是指本发明的材料、组合物和方法用于定性和定量测定的用途。一般来说，具体检测技术对于本发明的实践并不重要。
举例来说，根据本发明，“检测”可以包括：观察VEGFR2基因产物、mRNA分子或VEGFR2多肽的存在或不存在；VEGFR2多肽的含量或结合至靶的量的变化；VEGFR2多肽生物功能/活性的变化。在一些实施例中，“检测”可以包括检测野生型VEGFR2含量(例如mRNA或多肽含量)。检测可以包括定量当与对照相比较时在10％与90％之间的任何值，或在30％与60％之间的任何值，或超过100％的变化(增加或减小)。检测可以包括定量在2倍至10倍之间的任何值，包括2倍和10倍在内，或更大倍数，例如100倍的变化。
当在本文中使用时，“标记”一词是指直接或间接与抗体缀合的可检测化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物发生化学变化。
本文中提到“约”一个值或参数是指这一技术领域的熟练技术人员易于了解的对应值的常见误差范围。本文中提到“约”一个值或参数包括(且描述)有关所述值或参数本身的各方面。举例来说，提到“约X”的描述包括“X”的描述。
应了解，本文所述的本发明的各方面和实施例包括“包含”各方面和实施例、“由各方面和实施例组成”和“基本上由各方面和实施例组成”。
本文中引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，都以全文引用的方式并入本文中。
抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体
本发明是基于鉴别出结合血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的新颖抗体。所述抗VEGFR2抗体可以用于多种治疗和诊断方法中。举例来说，抗VEGFR2抗体可以单独使用或与其它药剂组合使用以治疗以异常VEGFR2表达或异常VEGFR2活性为特征的疾病，包括例如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌、实体肿瘤及以过度血管生成为特征的病理病况(如本文中别处描述的病况)。还可以使用本文中提供的抗体，通过向患者施用抗VEGFR2抗体并检测结合至来自患者的样品(例如体内或离体样品)中的VEGFR2蛋白质的抗VEGFR2抗体，或通过使抗VEGFR2抗体与来自患者的样品接触并定性地或定量地检测结合至所述VEGFR2蛋白质的抗VEGFR2抗体，来检测患者或患者样品中的VEGFR2蛋白质。
血管内皮生长因子受体2或“VEGFR2”(又称为例如KDR，即“激酶插入结构域受体”；FLK1，即“胎儿肝激酶1”；及CD309)是VEGFR受体家族，即三种密切相关的受体酪氨酸激酶亚家族的成员。VEGF受体典型地是第III类受体酪氨酸激酶，其特征在于，在其氨基末端细胞外受体配体结合结构域中具有若干，典型地5或7个免疫球蛋白样环(Kaipainen等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》,178:2077-88(1993))。VEGFR2促进血管生成和淋巴管生成信号传导，是内皮细胞上的主要VEGF受体。VEGFR2通过结合VEGFA而被活化，之后VEGFR2经历二聚合和酪氨酸自体磷酸化。自体磷酸化引起例如含SH2结构域的信号转导分子，如PLC-γ、VRAP(VEGF受体相关蛋白质)及Sck的下游直接活化，以及Src和PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)的间接活化。一般认为VEGFR2是引起内皮细胞增殖、迁移、分化、管形成、血管渗透性增加以及血管完整性维持的主要VEGF信号转导蛋白。异常VEGFR2表达或VEGFR2活性与许多癌症(如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌及实体肿瘤)和以过度血管生成为特征的病理病况(如本文中别处所描述的那些)有关。
抗VEGFR2抗体是以足够亲和力和特异性结合至VEGFR2的抗体。优选的是，本文中提供的抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)可以用作治疗剂以靶向和干扰涉及VEGFR2活性的疾病或病况。在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体不结合至VEGF受体家族的其它成员，如VEGFR1/FLT1或VEGFR3/FLT4/PCL/Chy。在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体还结合VEGFR3/FLT4/PCL/Chy。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体是重组人源化抗VEGFR2单克隆抗体。根据一个实施例，抗VEGFR2抗体包含本文所公开的抗体中的任一种的CDR、可变重链区和/或可变轻链区。
在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)不会竞争性抑制第二抗VEGFR2抗体与人类VEGFR2的结合。在某些实施例中，所述第二抗VEGFR2抗体包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:73)的CDR-L1；含氨基酸序列DSSNRAT(SEQ ID NO:52)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQHNTFPPT(SEQ ID NO:61)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列SYSMN(SEQ ID NO:28)的CDR-H1；含氨基酸序列SISSSSSYIYYADSVKG(SEQ ID NO:35)的CDR-H2；及含氨基酸序列VTDAFDI(SEQ ID NO:41)的CDR-H3。在某些实施例中，所述第二抗VEGFR2抗体是US2009/0306348中描述的1121B，该案的内容以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，所述第二抗VEGFR2抗体包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RASQGIDNWLG(SEQ ID NO:74)的CDR-L1；含氨基酸序列DASNLDT(SEQID NO:53)的CDR-L2；及含氨基酸序列QQAKAFPPT(SEQ ID NO:62)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列SYSMN(SEQ ID NO:28)的CDR-H1；含氨基酸序列SISSSSSYIYYADSVKG(SEQ ID NO:35)的CDR-H2；及含氨基酸序列VTDAFDI(SEQ IDNO:41)的CDR-H3。在某些实施例中，所述第二抗VEGFR2抗体是US 7,498,414中描述的1121N，该案的内容以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)不结合第二抗VEGFR2抗体所结合的VEGFR2结构域。在某些实施例中，所述第二抗VEGFR2抗体包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:73)的CDR-L1；含氨基酸序列DSSNRAT(SEQ ID NO:52)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQHNTFPPT(SEQID NO:61)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列SYSMN(SEQ ID NO:28)的CDR-H1；含氨基酸序列SISSSSSYIYYADSVKG(SEQ ID NO:35)的CDR-H2；及含氨基酸序列VTDAFDI(SEQ ID NO:41)的CDR-H3。在某些实施例中，所述第二抗VEGFR2抗体包括含氨基酸序列SEQ ID NO:104的轻链可变结构域和含氨基酸序列SEQ IDNO:106的重链可变结构域。在某些实施例中，所述第二抗VEGFR2抗体是US2009/0306348中描述的1121B。在某些实施例中，所述第二抗VEGFR2抗体包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RASQGIDNWLG(SEQ ID NO:74)的CDR-L1；含氨基酸序列DASNLDT(SEQ ID NO:53)的CDR-L2；及含氨基酸序列QQAKAFPPT(SEQ ID NO:62)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列SYSMN(SEQ ID NO:28)的CDR-H1；含氨基酸序列SISSSSSYIYYADSVKG(SEQ ID NO:35)的CDR-H2；及含氨基酸序列VTDAFDI(SEQ ID NO:41)的CDR-H3。在某些实施例中，所述第二抗VEGFR2抗体包括含氨基酸序列SEQ ID NO:105的轻链可变结构域和含氨基酸序列SEQ ID NO:106的重链可变结构域。在某些实施例中，所述第二抗VEGFR2抗体是US 7,498,414中描述的1121N。
SEQ ID NO:104-106的氨基酸序列提供于下：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDSSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQHNTFPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN(SEQ ID NO:104)
DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYDASNLDTGVPSRFSGSGSGTYFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKAFPPTFGGGTKVDIKGTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN(SEQ ID NO:105)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT(SEQ ID NO:106)
在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体不阻断VEGFR2与VEGF的结合。
在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体结合至VEGFR2的结构域5-7。
在某些实施例中，如通过以下实例中所描述的流式细胞术所测定，本文中提供的抗VEGFR2抗体结合至整个HUVEC细胞。
在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)管形成分析(如以下实例中描述的HUVEC管形成分析)中抑制管形成。在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体在HUVEC迁移分析(如以下实例中描述的HUVEC迁移分析)中抑制HUVEC迁移。在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体在HUVEC迁移分析(如以下实例中描述的HUVEC迁移分析)中不抑制HUVEC迁移。在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体在HUVEC存活分析(如以下实例中描述的HUVEC存活分析)中抑制HUVEC存活。在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体在HUVEC增殖分析(如以下实例中描述的HUVEC增殖分析)中抑制HUVEC增殖。
在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体在体外分析(如以下实例中所描述的HUVEC萌芽分析)中不抑制血管生成。在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体在体内分析(如以下实例中所描述的HUVEC基质胶塞分析)中抑制血管生成。在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体在体外分析(如以下实例中所描述的HUVEC萌芽分析)中不抑制血管生成，但在体内分析(如以下实例中所描述HUVEC基质胶塞分析)中抑制血管生成。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RASQNIASYLN(SEQ ID NO:76)或RASQSVS-S/N-S/N-YL-G/A(SEQ ID NO:83)或TRSRGSIASSYVQ(SEQ ID NO:80)或RSSQSL-L/V/Y-H/Y-G/S/R-D/N-G-N/K/Y-N/T-Y/F-LD(SEQ ID NO:84)的CDR-L1；含氨基酸序列L/A/G/K/E-G/A/V/N/S-S/D-N/S/Q/K-R/L-A/K/D/P-S/T(SEQ ID NO:60)的CDR-L2；及含氨基酸序列M/Q-Q/S-A/S/R/G/Y-L/Y/S/A/D/G/T-Q/S/N/H/F-T/I/W/S-P/T-Y/L/P/V/G/I-T/V(SEQ ID NO:72)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列T/S-Y-Y/G/A/S-M/I-H/N/S(SEQ ID NO:34)的CDR-H1；含氨基酸序列I/V/G/S-I-N/S/I-P/Y/S/G-S/D/I-G/F/S-G/S-S/N/T/Y/A-T/K/A/I-S/Y/N/H-YA-Q/D-K/S-F/V-K/Q-G(SEQ ID NO:40)的CDR-H2；及含氨基酸序列GLWFGEGY(SEQ ID NO:49)或ESYGGQFDY(SEQ ID NO:43)或DLVVPAATLDY(SEQID NO:42)或D/G-F/I-Y/I-E/V-A/G-G/P-G/T-W/D-Y/A-FD-L/I(SEQ ID NO:51)或RDGSLGVGYYYMDF(SEQ ID NO:50)或VGATTSLYYYYGMDV(SEQ ID NO:47)或DGFGLAVAGPYWYFDL(SEQ ID NO:44)或PTRSRDFWSGLGYYYYMDV(SEQ ID NO:45)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含选自由SEQ ID NO:75-82组成的组的氨基酸序列的CDR-L1；含选自由SEQ ID NO:54-59组成的组的氨基酸序列的CDR-L2；及含选自由SEQ ID NO:63-71组成的组的氨基酸序列的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含选自由SEQ ID NO:29-33组成的组的氨基酸序列的CDR-H1；含选自由SEQ ID NO:35-39和125组成的组的氨基酸序列的CDR-H2；及含选自由SEQ ID NO:42-50组成的组的氨基酸序列的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RSSQSLLHGNGNNYLD(SEQ ID NO:75)的CDR-L1；含氨基酸序列LGSNRAS(SEQ ID NO:54)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQALQTPYT(SEQ ID NO:63)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列TYYMH(SEQID NO:29)的CDR-H1；含氨基酸序列IINPSGGSTSYAQKFQG(SEQ ID NO:36)的CDR-H2；及含氨基酸序列DLVVPAATLDY(SEQ ID NO:42)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RASQNIASYLN(SEQ ID NO:76)的CDR-L1；含氨基酸序列AASSLKS(SEQ ID NO:55)的CDR-L2；及含氨基酸序列QQSYSIPYT(SEQ ID NO:64)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列SYGMH(SEQ IDNO:30)的CDR-H1；含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:37)的CDR-H2；及含氨基酸序列ESYGGQFDY(SEQ ID NO:43)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RASQSVSNNYLG(SEQ ID NO:77)的CDR-L1；含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO:56)的CDR-L2；及含氨基酸序列QQRSNWPLT(SEQ ID NO:65)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列SYAMH(SEQ IDNO:31)的CDR-H1；含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:37)的CDR-H2；及含氨基酸序列DGFGLAVAGPYWYFDL(SEQ ID NO:44)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RSSQSLVYSDGKTYLD(SEQ ID NO:78)的CDR-L1；含氨基酸序列KVSNRDS(SEQ ID NO:57)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQGAHWPPT(SEQ ID NO:66)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列SYAIS(SEQID NO:85)的CDR-H1；含氨基酸序列GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:38)的CDR-H2；及含氨基酸序列PTRSRDFWSGLGYYYYMDV(SEQ ID NO:45)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO:79)的CDR-L1；含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO:56)的CDR-L2；及含氨基酸序列QQRSNWPPT(SEQ ID NO:67)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列SYGMH(SEQ IDNO:30)的CDR-H1；含氨基酸序列VISYDGSNKHYADSVKG(SEQ ID NO:125)的CDR-H2；及含氨基酸序列DFYEAGGWYFDL(SEQ ID NO:46)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列TRSRGSIASSYVQ(SEQ ID NO:80)的CDR-L1；含氨基酸序列ENDQRPS(SEQ ID NO:58)的CDR-L2；及含氨基酸序列QSYDFSTVV(SEQ ID NO:68)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列SYAIS(SEQ IDNO:85)的CDR-H1；含氨基酸序列GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:38)的CDR-H2；及含氨基酸序列VGATTSLYYYYGMDV(SEQ ID NO:47)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO:79)的CDR-L1；含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO:56)的CDR-L2；及含氨基酸序列QQYGSSPGT(SEQ ID NO:69)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列SYSMN(SEQ IDNO:28)的CDR-H1；含氨基酸序列SISSSSSYIYYADSVKG(SEQ ID NO:35)的CDR-H2；及含氨基酸序列GIIVGPTDAFDI(SEQ ID NO:48)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RSSQSLYYRDGYTFLD(SEQ ID NO:81)的CDR-L1；含氨基酸序列LSSKRDS(SEQ ID NO:59)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:70)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列TYAMS(SEQID NO:33)的CDR-H1；含氨基酸序列GISGSGGATHYADSVKG(SEQ ID NO:39)的CDR-H2；及含氨基酸序列GLWFGEGY(SEQ ID NO:49)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列RSSQSLLYSNGYNYLD(SEQ ID NO:82)的CDR-L1；含氨基酸序列LGSNRAS(SEQ ID NO:54)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQALQTPIT(SEQ ID NO:71)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列SYAIS(SEQID NO:85)的CDR-H1；含氨基酸序列GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:38)的CDR-H2；及含氨基酸序列RDGSLGVGYYYMDF(SEQ ID NO:50)的CDR-H3。
本文所述CDR的序列提供于下表2中。
表2
SEQ ID NO:28 SYSMN SEQ ID NO:56 GASSRAT
SEQ ID NO:29 TYYMH SEQ ID NO:57 KVSNRDS
SEQ ID NO:30 SYGMH SEQ ID NO:58 ENDQRPS
SEQ ID NO:31 SYAMH SEQ ID NO:59 LSSKRDS
SEQ ID NO:32 SYSMN SEQ ID NO:63 MQALQTPYT
SEQ ID NO:33 TYAMS SEQ ID NO:64 QQSYSIPYT
SEQ ID NO:35 SISSSSSYIYYADSVKG SEQ ID NO:65 QQRSNWPLT
SEQ ID NO:36 IINPSGGSTSYAQKFQG SEQ ID NO:66 MQGAHWPPT
SEQ ID NO:37 VISYDGSNKYYADSVKG SEQ ID NO:67 QQRSNWPPT
SEQ ID NO:38 GIIPIFGTANYAQKFQG SEQ ID NO:68 QSYDFSTVV
SEQ ID NO:39 GISGSGGATHYADSVKG SEQ ID NO:69 QQYGSSPGT
SEQ ID NO:42 DLVVPAATLDY SEQ ID NO:70 MQGTHWPYT
SEQ ID NO:43 ESYGGQFDY SEQ ID NO:71 MQALQTPIT
SEQ ID NO:44 DGFGLAVAGPYWYFDL SEQ ID NO:75 RSSQSLLHGNGNNYLD
SEQ ID NO:45 PTRSRDFWSGLGYYYYMDV SEQ ID NO:76 RASQNIASYLN
SEQ ID NO:46 DFYEAGGWYFDL SEQ ID NO:77 RASQSVSNNYLG
SEQ ID NO:47 VGATTSLYYYYGMDV SEQ ID NO:78 RSSQSLVYSDGKTYLD
SEQ ID NO:48 GIIVGPTDAFDI SEQ ID NO:79 RASQSVSSSYLA
SEQ ID NO:49 GLWFGEGY SEQ ID NO:80 TRSRGSIASSYVQ
SEQ ID NO:50 RDGSLGVGYYYMDF SEQ ID NO:81 RSSQSLYYRDGYTFLD
SEQ ID NO:54 LGSNRAS SEQ ID NO:82 RSSQSLLYSNGYNYLD
SEQ ID NO:55 AASSLKS SEQ ID NO:85 SYAIS
SEQ ID NO:125 VISYDGSNKHYADSVKG
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含选自由SEQ ID NO 86-94组成的组的轻链可变结构域序列以及选自由SEQ ID NO 95-103组成的组的重链可变结构域序列。
SEQ ID NO:86-103的氨基酸序列提供于下。
DVVMTQSPLSLPVTPGESASISCRSSQSLLHGNGNNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLQISRVEPEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN(SEQ ID NO:86)
DVVMTQSPSSLSASVGDRVTVTCRASQNIASYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLKSGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFAAYYCQQSYSIPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQLGN(SEQ ID NO:87)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSNNYLGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN(SEQ ID NO:88)
DVVMTQSPLSLSVTPGEPASISCRSSQSLVYSDGKTYLDWFLQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVSDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGAHWPPTFGQGTRVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN(SEQ ID NO:89)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN(SEQ ID NO:90)
NFMLTQPHSVSESPGKTVTVSCTRSRGSIASSYVQWYQQRPGRSPTNVIYENDQRPSGVPTRFSGSVDRSSNSASLTISGLETEDEADYYCQSYDFSTVVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAG(SEQ ID NO:91)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSVSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPGTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN(SEQ ID NO:92)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLYYRDGYTFLDWYVQKPGQSPQLLIYLSSKRDSGVPDRISGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN(SEQ ID NO:93)
DVVMTQSPLSLAVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPITFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN(SEQ ID NO:94)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCRASGFSFTTYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDLVVPAATLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT(SEQ ID NO:95)
EVQLVQTGGGAVQPGRSLRLSCAATGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARESYGGQFDYWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT(SEQ ID NO:96)
EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGFGLAVAGPYWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT(SEQ ID NO:97)
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGPTRSRDFWSGLGYYYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT(SEQ ID NO:98)
EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDFYEAGGWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT(SEQ ID NO:99)
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTA
YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVGATTSLYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT(SEQ ID NO:100)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIIVGPTDAFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT(SEQ ID NO:101)
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGATHYADSVKGRFTISRDNSKNTVNLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLWFGEGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT(SEQ ID NO:102)
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGSLGVGYYYMDFWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT(SEQ ID NO:103)
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:86中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:95中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:87中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:96中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:88中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:97中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:89中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:98中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:90中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:99中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:91中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:100中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:92中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:101中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:93中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:102中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:94中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:103中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。
所述重链和轻链可变结构域以所有可能的逐对组合方式组合以产生多种抗VEGFR2抗体。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)竞争性抑制第二抗VEGFR2抗体与人类VEGFR2的结合。在一些实施例中，所述第二抗VEGFR2抗体是抗VEGFR2抗体的变体，其包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列LSS(SEQ ID NO:2)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3，其中所述变体在SEQ ID NO:1、2、3、4、5和/或6中的一个或更多个中包含至少一个氨基酸取代。在一些实施例中，所述变体在SEQID NO:1、2、3、4、5和/或6中的一个或更多个中包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸取代。在某些实施例中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在某些实施例中，所述氨基酸取代基本上不会减弱抗体结合抗原的能力。举例来说，可以进行基本上不会降低VEGFR2结合亲和力的保守改变(例如，如本文所提供的保守取代，如下表3中所述)。抗VEGFR2抗体变体的结合亲和力可以使用以下实例中描述的方法评估。
保守取代显示于标题为“保守取代”的表3中。较为重要的变化提供于表3中的“示例性取代”标题下，并且如下文关于氨基酸侧链种类进一步描述。氨基酸取代可以被引入所关注的抗体中并且针对所希望的活性，例如VEGFR2结合的保持/改善、免疫原性降低，或ADCC或CDC改善筛选产物。
表3：保守取代
非保守取代将需要这些种类之一的成员与另一种类交换。示例性取代型变体是亲和力成熟的抗体，该抗体宜例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，如本文所描述的技术产生。简单点说，使一个或更多个CDR残基突变并且将变体抗体展示于噬菌体上，并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。可以在HVR中进行改变(例如取代)以例如改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点(hotspot)”，即由在体细胞成熟过程期间经历高频率突变的密码子所编码的残基(参见例如，Chowdhury,《分子生物学方法(MethodsMol.Biol.)》207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)中实行，并且测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库并从中重新选择来实现亲和力成熟描述于例如Hoogenboom等人的《分子生物学方法》178:1-37(O'Brien等人编,Human Press,新泽西州特图瓦市(Totowa,NJ)(2001))中。
在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法中的任一种(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入被选择用于成熟的可变基因中。接着建立二级文库。然后，筛选该文库以鉴别具有所希望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR引导的方法，其中将若干HVR残基(例如每次4至6个残基)随机分组。参与抗原结合的HVR残基可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模明确地鉴别。确切地说，CDR-H3和CDR-L3通常作为靶。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)结合与第二抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)所结合相同的人类VEGFR2表位。在某些实施例中，所述第二抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)是抗VEGFR2抗体的变体，其包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列LSS(SEQ ID NO:2)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3，其中所述变体在SEQ ID NO:1、2、3、4、5和/或6中的一个或更多个中包含至少一个氨基酸取代。在一些实施例中，所述变体在SEQ ID NO:1、2、3、4、5和/或6中的一个或更多个中包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸取代。在某些实施例中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在某些实施例中，所述氨基酸取代基本上不会减弱抗体结合抗原的能力。举例来说，可以进行基本上不会降低VEGFR2结合亲和力的保守改变(例如，如本文所提供的保守取代，如上表3中所述)。
在某些实施例中，所述抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)是抗VEGFR2抗体的变体，其包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列LSS(SEQ ID NO:2)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3，其中所述变体在SEQ ID NO:1、2、3、4、5和/或6中的一个或更多个中包含至少一个氨基酸取代。在一些实施例中，所述变体在SEQ ID NO:1、2、3、4、5和/或6中的一个或更多个中包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸取代。在某些实施例中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在某些实施例中，所述氨基酸取代基本上不会减弱抗体结合抗原的能力。举例来说，可以进行基本上不会降低VEGFR2结合亲和力的保守改变(例如，如本文所提供的保守取代，如上表3中所述)。抗VEGFR2抗体变体的结合亲和力可以使用以下实例中描述的方法评估。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体竞争性抑制第二抗VEGFR2抗体与人类VEGFR2的结合，其中所述第二抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域，该轻链可变结构域包括含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体与第二抗VEGFR2抗体结合相同的人类VEGFR2表位，其中所述第二抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域，该轻链可变结构域包括含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3。
在某些实施例中，所述抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)是抗VEGFR2抗体的变体，其包含：轻链可变结构域，该轻链可变结构域包括含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQID NO:22)的CDR-L1；含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ IDNO:27)的CDR-H3，其中所述变体在SEQ ID NO:1、2、3、4、5和/或6中的一个或更多个中包含至少一个氨基酸取代。在一些实施例中，所述变体在SEQ ID NO:1、2、3、4、5和/或6中的一个或更多个中包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸取代。在某些实施例中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在某些实施例中，所述氨基酸取代基本上不会减弱抗体结合抗原的能力。举例来说，可以进行基本上不会降低VEGFR2结合亲和力的保守改变(例如，如本文所提供的保守取代，如上表3中所述)。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域，该轻链可变结构域包括含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含选自由SEQ ID NO:1和16组成的氨基酸序列的CDR-L1；含选自由SEQ ID NO:2、7和8组成的氨基酸序列的CDR-L2；及含选自由SEQ ID NO:3、9和12组成的氨基酸序列的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含选自由SEQID NO:4和13-15组成的氨基酸序列的CDR-H1；含选自由SEQ ID NO:5和17-21组成的氨基酸序列的CDR-H2；及含选自由SEQ ID NO:6和10-11组成的氨基酸序列的CDR-H3。本文所述CDR的序列提供于下表4中。
表4
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其抗原结合片段)包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列LSS(SEQ ID NO:2)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列RSS(SEQ ID NO:8)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQID NO:10)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGI(SEQID NO:11)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQID NO:10)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列SLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQID NO:10)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQID NO:10)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFTFSTYA(SEQ ID NO:13)的CDR-H1；含氨基酸序列INGSGGAT(SEQ ID NO:17)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFTFSTYA(SEQ ID NO:13)的CDR-H1；含氨基酸序列INGSGGAT(SEQ ID NO:17)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQID NO:10)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSSGAT(SEQ ID NO:18)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSSGAT(SEQ ID NO:18)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQID NO:10)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFPFSTYA(SEQ ID NO:14)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGNGGAT(SEQ ID NO:19)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRSGYTF(SEQ ID NO:16)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列RFSFSTYA(SEQ ID NO:15)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGQAT(SEQ ID NO:20)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRSGYTF(SEQ ID NO:16)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGTT(SEQ ID NO:21)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRSGYTF(SEQ ID NO:16)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGTT(SEQ ID NO:21)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQ ID NO:10)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFTFSTYA(SEQ ID NO:13)的CDR-H1；含氨基酸序列INGSGGAT(SEQ ID NO:17)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFTFSTYA(SEQ ID NO:13)的CDR-H1；含氨基酸序列INGSGGAT(SEQ ID NO:17)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQID NO:10)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSSGAT(SEQ ID NO:18)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSSGAT(SEQ ID NO:18)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQID NO:10)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，该重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFPFSTYA(SEQ ID NO:14)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGNGGAT(SEQ ID NO:19)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQID NO:6)的CDR-H3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体包括含SEQ ID NO:107-113中的任一个中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体包括含SEQ ID NO:114-124中所述的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)。SEQ ID NO:107-124的氨基酸序列提供于下。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:107中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:114中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:108中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:114中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:109中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:115中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:110中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:116中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:110中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:115中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:111中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:114中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:110中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:114中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:111中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:114中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:108中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:115中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:111中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:115中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:110中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:117中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:110中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:118中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:110中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:119中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:110中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:120中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:108中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:121中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:112中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:122中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:112中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:123中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:112中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:124中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:110中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:117中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:110中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:118中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体包括含SEQ ID NO:110中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:119中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:110中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:120中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:108中所述的氨基酸序列的轻链可变结构域以及含SEQ ID NO:121中所述的氨基酸序列的重链可变结构域。
所述重链和轻链可变结构域以所有可能的逐对组合方式组合以产生多种抗VEGFR2抗体。
在某些实施例中，所述抗体包含人类IgG，例如人类IgG1或人类IgG4的Fc序列。在某些实施例中，Fc序列已被改变或以其它方式变化，由此使其缺乏抗体依赖性细胞毒性(ADCC)效应子功能，此通常涉及其与Fc受体(FcR)的结合。有许多可以改变效应子功能的Fc序列变化或突变的实例。举例来说，WO 00/42072和Shields等人,《生物化学杂志》9(2):6591-6604(2001)描述了与FcR的结合改善或减少的抗体变体。这些出版物的内容明确地以引用的方式并入本文中。所述抗体可以呈Fab、Fab'、F(ab)'2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双抗体以及线性抗体的形式。另外，所述抗体可以是结合至EGFR，而且结合一种或更多种其它靶并抑制其功能的多特异性抗体。所述抗体可以与治疗剂(例如细胞毒性剂、放射性同位素和化疗剂)或通过成像检测患者样品中或体内的VEGFR2的标记(例如放射性同位素、荧光染料和酶)缀合。
还考虑编码抗VEGFR2抗体的核酸分子、包含编码本文所描述的CDR和/或重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核酸分子的表达载体，以及包含所述核酸分子的细胞。这些抗体可以用于本文所描述的的疗法中并且用于检测患者样品中(例如通过FACS、免疫组织化学分析(IHC)、ELISA分析)或患者体内的VEGFR2蛋白质。
功能特征
在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体对于VEGFR2的结合亲和力高于该抗体对VEGFR2同源物，如VEGFR1/FLT1或VEGFR3/FLT4/PCL/Chy的结合亲和力。通常，本文中提供的抗VEGFR2抗体“特异性结合”至VEGFR2(即，结合亲和力(Kd)值不超过约1×10-7M，优选不超过约1×10-8M并且最优选不超过约1×10-9M)，但对于VEGFR家族成员的结合亲和力比其对VEGFR2的结合亲和力低至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍。在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体的Kd小于1×10-9M。特异性结合至VEGFR2的抗VEGFR2抗体可以属于如上文所定义的不同类型抗体中的任一种，但优选是人源化或人类抗体。
在一些实施例中，如利用本领域中已知的方法，如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)所测定，抗VEGFR2抗体与非靶蛋白质(如VEGFR1/FLT1或VEGFR3/FLT4/PCL/Chy)结合的程度是该抗体与VEGFR2的结合的不到约10％。特异性结合可以例如通过相较于对照分子的结合，测定一种分子的结合进行测量，该对照分子一般是不具有结合活性的结构类似的分子。举例来说，可以通过与类似于靶的对照分子，例如过量未标记靶竞争来测定特异性结合。在此情况下，如果经标记的靶与探针的结合受到过量未标记靶的竞争性抑制，则指示特异性结合。如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性结合至”特定多肽或特定多肽靶上的表位，或对特定多肽或特定多肽靶上的表位“具有特异性”可以例如通过一个分子对靶的Kd是至少约10-4M，或者至少约10-5M，或者至少约10-6M，或者至少约10-7M，或者至少约10-8M，或者至少约10-9M，或者至少约10-10M，或者至少约10-11M，或者至少约10-12M或更高来展现。在一个实施例中，术语“特异性结合”是指一个分子结合至特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不结合至任何其它多肽或多肽表位的结合。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体还结合至VEGFR3。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体结合人类VEGFR2的Kd在约0.1pM至200pM(0.2nM)之间，例如是约0.1pM、约0.25pM、约0.5pM、约0.75pM、约1pM、约5pM、约10pM、约20pM、约30pM、约40pM、约50pM、约60pM、约70pM、约80pM、约90pM、约100pM、约110pM、约120pM、约130pM、约140pM、约150pM、约160pM、约170pM、约180pM、约190pM或大于约190pM，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体与VEGFR2的结合亲和力比1121B(参见US 2009/0306348)或1121N(参见US 7,498,414)与VEGFR2的结合亲和力高约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％或大于约100％(例如约105％、约110％、约120％或约130％)。在某些实施例中，抗VEGFR2与VEGFR2的结合亲和力比1121B(参见US 2009/0306348)或1121N(参见US 7,498,414)与VEGFR2的结合亲和力高约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约2.75倍、约3倍、约3.25倍、约3.5倍、约3.75倍、约4倍、约4.25倍、约4.5倍、约4.75倍或大于约4.75倍，包括在这些值之间的任何范围。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体结合人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体抑制HUVEC管形成。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体抑制HUVEC迁移。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体抑制HUVEC存活。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体抑制HUVEC增殖。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体抑制HUVEC萌芽。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体在体外抑制血管生成。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体在体内抑制血管生成。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体抑制VEGF-C刺激的人类淋巴内皮细胞(HLEC)增殖。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体抑制VEGF-C刺激的VEGFR-2磷酸化。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体还抑制VEGF-C刺激VEGFR-3磷酸化。
单克隆抗体
单克隆抗体可以例如使用杂交瘤方法，如Kohler和Milstein,《自然》,256:495(1975)所描述的方法制备，或者可以利用重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)制备，或者可以利用本文在以下实例中所描述的方法制备。在杂交瘤方法中，典型地用免疫剂使仓鼠、小鼠或其它适当宿主动物免疫以使淋巴细胞产生或能够产生特异性结合至该免疫剂的抗体。或者，淋巴细胞可以体外免疫。
免疫剂将典型地包括所关注蛋白质的多肽或融合蛋白，或包含该蛋白质的组合物。一般来说，如果需要人类来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人类哺乳动物源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。接着，使用适合融合剂，如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。Goding,《单克隆抗体：原理和实务(MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES PRACTICE)》(纽约:Academic Press,1986),第59-103页。永生化细胞系通常是被转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人类来源的骨髓瘤细胞。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在适合培养基中培养，该培养基优选含有一种或更多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。举例来说，如果亲本细胞不含酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则融合瘤培养基典型地将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的永生化细胞系是高效融合，支持选定的产抗体细胞稳定高水平表达抗体并且对如HAT培养基等培养基敏感的那些。更优选的永生化细胞系是鼠类骨髓瘤细胞系，这些可以例如从加利福尼亚圣地亚哥(San Diego,California)的Salk Cell DistributionCenter以及弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection,Manassas,Virginia)获得。还描述了用于制备人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞系。Kozbor,《免疫学杂志》,133:3001(1984)；Brodeur等人,《单克隆抗体制造技术和应用(MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES ANDAPPLICATIONS)》(Marcel Dekker,Inc.:纽约,1987)第51-63页。
然后，可以分析用于培养杂交瘤细胞的培养基中针对所述多肽的单克隆抗体的存在。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合分析，如放射免疫分析(RIA)或酶连免疫吸附剂分析(ELISA)测定。这些技术和分析是本领域中已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson和Pollard,《分析生物化学(Anal.Biochem.)》,107:220(1980)的史卡查分析(Scatchard analysis)测定。
在鉴别出所需要的杂交瘤细胞之后，可以通过限制性稀释程序对克隆株进行亚克隆，并利用标准方法使其生长。Goding,同上文。适于此目的的培养基包括例如杜氏改良型伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内以腹水形式生长。
可以通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法，从培养基或腹水分离或纯化出亚克隆株分泌的单克隆抗体。
单克隆抗体还可以通过重组DNA方法，如美国专利第4,816,567号中描述的那些方法制备。编码本文中提供的单克隆抗体的DNA可以使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠类抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。本文中提供的杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。一旦分离，就可以将DNA放入表达载体中，然后将其转染至不会另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，由此在重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成。举例来说，还可以通过用人类重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠类序列(美国专利第4,816,567号；Morrison等人,前述)或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价接合至免疫球蛋白编码序列来修饰DNA。此类非免疫球蛋白多肽可以取代本文中提供的抗体的恒定结构域，或可以取代本文中提供的抗体的一个抗原组合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。
抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域中已知的。举例来说，一种方法涉及重组表达免疫球蛋白轻链和经过修饰的重链。重链一般在Fc区中任一点处截短以防止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基被另一氨基酸残基取代或缺失以防止交联。
体外方法也适于制备单价抗体。可以使用但不限于本领域中已知的技术消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段。
人类和人源化抗体
抗体可以是人源化抗体或人类抗体。非人类(例如鼠类)抗体的人源化形式是典型地含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括具有所希望的特异性、亲和力及能力的人类免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的CDR的残基被来自非人类物种(供体抗体)，如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架残基被相应非人类残基替代。人源化抗体还可以包含在接受体抗体中以及在输入的CDR或构架序列中都不存在的残基。一般来说，人源化抗体可以包含至少一个并且典型地两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区并且所有或基本上所有的FR区是人类免疫球蛋白共同序列的FR区。人源化抗体优选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。Jones等人,《自然》,321:522-525(1986)；Riechmann等人,《自然》,332:323-329(1988)；Presta,《结构生物学新见》,2:593-596(1992)。
一般来说，人源化抗体中引入了一个或更多个非人类来源的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“输入”残基，这些残基典型地是从“输入”可变结构域获取。根据一个实施例，人源化可以基本上遵循Winter和合作者(Jones等人,《自然》,321:522-525(1986)；Riechmann等人,《自然》,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,《科学(Science)》,239:1534-1536(1988))的方法，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人类抗体的相应序列进行。因此，此类“人源化”抗体是基本上少于完整人类可变结构域被来自非人类物种的相应序列取代的抗体(美国专利第4,816,567号)。实际上，人源化抗体典型地是一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代的人类抗体。
作为人源化的一个替代方案，可以产生人类抗体。举例来说，现可产生在免疫后能够在不产生内源免疫球蛋白情况下产生完全人类抗体谱系的转基因动物(例如小鼠)。举例来说，已经描述，嵌合和生殖系突变小鼠中抗体重链接合区(JH)基因的纯合缺失导致完全抑制内源抗体的产生。将人类生殖系免疫球蛋白基因阵列转移至此类生殖系突变小鼠中将会在抗原攻击时产生人类抗体。参见例如，Jakobovits等人,《美国国家科学院院刊(PNASUSA)》,90:2551(1993)；Jakobovits等人,《自然》,362:255-258(1993)；Bruggemann等人,《免疫学年鉴(Year in Immunol.)》,7:33(1993)；美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,591,669号、第5,545,807号；及WO 97/17852。或者，可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如内源免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的小鼠中来制备人类抗体。在攻击之后，观察到人类抗体产生，该人类抗体在所有方面都与在人体中见到的极其类似，包括基因重排、组装以及抗体谱系。这一方法描述于例如美国专利第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号及第5,661,016号；Marks等人,《生物技术(Bio/Technology)》,10:779-783(1992)；Lonberg等人,《自然》,368:856-859(1994)；Morrison,《自然》,368:812-813(1994)；Fishwild等人,《自然·生物技术(Nature Biotechnology)》,14:845-851(1996)；Neuberger,《自然·生物技术》,14:826(1996)；Lonberg和Huszar,《国际免疫学综述(Intern.Rev.Immunol.)》,13:65-93(1995)中。
或者，可以使用噬菌体展示技术(McCafferty等人,《自然》348:552-553[1990])，由来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因谱系在体外产生人类抗体和抗体片段。根据此技术的一个实施例，将抗体V结构域序列同框克隆至丝状噬菌体，如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并以功能性抗体片段形式展示于噬菌体粒子的表面上。噬菌体展示可以通过多种形式进行，例如，如在以下实例部分中所描述或如例如Johnson,KevinS.和Chiswell,David J.,《结构生物学新见》3:564-571(1993)中所评述。若干V基因区段源可以用于噬菌体展示。Clackson等人,《自然》,352:624-628(1991)从来源于免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离出一系列不同的抗噁唑酮抗体。可以基本上遵循Marks等人,《分子生物学杂志》222:581-597(1991)，或Griffith等人,《欧洲分子生物学杂志(EMBOJ.)》12:725-734(1993)所描述的技术，构建来自未免疫人类供体的V基因谱系并且可以分离出针对一系列不同抗原(包括自身抗原)的抗体。另外，参见美国专利第5,565,332号和第5,573,905号。
如上文所论述，还可以由体外活化的B细胞产生人类抗体(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。
也可以使用本领域中已知的各种技术，包括噬菌体展示文库制备人类抗体。Hoogenboom和Winter,《分子生物学杂志》,227:381(1991)；Marks等人,《分子生物学杂志》,222:581(1991)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人类单克隆抗体。Cole等人,《单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)》,Alan R.Liss,第77页(1985)；和Boerner等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》,147(1):86-95(1991)。
多特异性抗体
多特异性抗体是对两种或更多种不同抗原具有结合特异性的单克隆、优选人类或人源化抗体(例如双特异性抗体对至少两种抗原具有结合特异性)。举例来说，结合特异性之一可以针对a5～1蛋白质，另一种可以针对任何其它抗原。根据一个优选实施例，所述另一抗原是细胞表面蛋白质或受体或受体亚基。举例来说，细胞表面蛋白质可以是自然杀伤(NK)细胞受体。因此，根据一个实施例，本发明的双特异性抗体可以结合VEGFR2以及例如第二细胞表面受体两种。
用于制备双特异性抗体的适合方法是本领域中众所周知的。举例来说，重组产生双特异性抗体是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条重链具有不同特异性。Milstein和Cuello,《自然》,305:537-539(1983)。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，所以这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生十种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一个抗体分子具有正确的双特异性结构。所述正确分子的纯化通常是通过亲和色谱法步骤实现。类似程序公开于WO 93/08829和Traunecker等人,《欧洲分子生物学学会》,10:3655-3659(1991)中。
具有所希望的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域可以与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。该融合优选与免疫球蛋白重链恒定结构域，包含铰链、CH2和CH3区的至少一部分进行。在所述融合物中的至少一种中存在含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH 1)是优选的。编码免疫球蛋白重链融合物并且必要时编码免疫球蛋白轻链的DNA被插入独立表达载体中，并且共转染至适合宿主生物体中。有关产生双特异性抗体的其它详情，参见例如Suresh等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》,121:210(1986)。
直接由重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已有描述。举例来说，已经使用亮氨酸拉链制造出双特异性抗体。Kostelny等人,《免疫学杂志》,148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽连接至两种不同抗体的Fab'部分。在铰链区还原抗体同二聚体以形成单体，并且接着使其再氧化以形成抗体异二聚体。这种方法还可以用于制备抗体同二聚体。Hollinger等人,《美国国家科学院院刊》,90:6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了一种制备双特异性抗体片段的替代机制。这些片段包含通过连接子连接至VL的VH，该连接子过短而不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一片段的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略也已有报导。参见Gruber等人,《免疫学杂志》,152:5368(1994)。
考虑超过二价的抗体。举例来说，可以制备三特异性抗体。Tutt等人,《免疫学杂志》147:60(1991)。
异缀合物(heteroconjugate)抗体
异缀合物抗体是由两种共价接合的抗体构成。举例来说，已经提出此类抗体可使免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利第4,676,980号)并且用于治疗HIV感染。WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089。预期可以使用合成蛋白质化学中的已知方法，包括涉及交联剂的方法在体外制备这些抗体。举例来说，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适合此目的的试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁酰亚氨酸甲酯，以及例如美国专利第4,676,980号中公开的那些。
效应子功能工程改造
可能希望改变本文中提供的抗体的效应子功能，以便增强例如抗体在治疗与过度血管生成有关的病理病况，如癌症(例如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌及实体肿瘤)或眼部疾病(例如本文中别处描述的那些)中的有效性。举例来说，可以向Fc区中引入半胱氨酸残基，由此在这一区域中形成链间二硫键。由此产生的同二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀灭作用和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》,176:1191-1195(1992)以及Shapes,《免疫学杂志》,148:2918-2922(1992)。还可以使用Wolff等人,《癌症研究(CancerResearch)》,53:2560-2565(1993)中所描述的异双官能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体。或者，抗体可以被工程改造成具有两个Fc区并且由此可以具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等人,《抗癌药物设计(Anti-Cancer Drug Design)》:219-230(1989)。
可以使Fc区序列突变或改变以改善FcR结合(例如FcγR、FcRn)。根据一个实施例，本发明的抗体相较于天然IgG或亲本抗体具有至少一种改变的选自由以下组成的组的效应子功能：ADCC、CDC和改善的FcRn结合。若干有用的特定突变的实例描述于例如Shields,RL等人(2001)JBC 276(6)6591-6604；Presta,L.G.(2002)《生物化学协会会刊(BiochemicalSociety Transactions)》30(4):487-490；及WO 00/42072中。
根据一个实施例，Fc受体突变是Fc区中至少一个选自由以下组成的组的位置的取代：238、239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc区中残基的编号是根据EU编号系统。在一些实施例中，Fc受体突变是D265A取代。在一些实施例中，Fc受体突变是N297A取代。其它适合突变陈述于美国专利第7,332,581号中。
在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体是无岩藻糖基化的(afucosylated)(即，“无岩藻糖基化抗VEGFR2抗体”或“非岩藻糖基化的抗VEGFR2抗体”)。“无岩藻糖基化抗体”或“非岩藻糖基化抗体”是指在Fc区中Asn297处具有较低岩藻糖残基含量的糖基化模式改变的IgG1或IgG3同型的抗体。人类IgG1或IgG3的糖基化在Asn297处以经至多2个Gal残基封端的核心岩藻糖基化的双天线型复杂寡糖糖基化形式发生。取决于末端Gal残基的量，这些结构称为GO、G1(a1,6或a1,3)或G2聚糖残基(Raju,T.S.,《国际生物制药工程工艺(BioProcess Int.)》1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如描述于Routier,F.H.,《糖缀合物杂志(Glycoconjugate J.)》14(1997)201-207。在非糖修饰的CHO宿主细胞中以重组方式表达的抗体通常在Asn297处以至少85％的量岩藻糖基化。在某些实施例中，本文中提供的无岩藻糖基化抗VEGFR2抗体具有较低的岩藻糖残基含量。在某些实施例中，本文中提供的无岩藻糖基化抗VEGFR2抗体在其糖基化模式中不具有岩藻糖。通常已知，抗体中的典型糖基化残基位置是根据EU编号系统在297位的天冬酰胺(“Asn297”)。
因此，在某些实施例中，本文中提供的无岩藻糖基化抗VEGFR2抗体包含的Fc序列已改变或以其它方式变化以使其在其糖基化模式中具有较低岩藻糖残基含量或不含岩藻糖。在某些实施例中，本文中提供的抗VEGFR2抗体包含根据EU编号系统在297位具有改变的Fc序列。
在某些实施例中，本文中提供的无岩藻糖基化抗VEGFR2抗体是由能够产生低岩藻糖基化或无岩藻糖基化聚糖的宿主细胞产生。可以产生无岩藻糖基化抗体的稳定哺乳动物宿主细胞已经确定且描述于例如Yamane-Ohnuki等人(2004)《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng.)》87,614-622；Mori等人(2004)《生物技术与生物工程》88,901-908；Kanda等人(2006)《生物技术与生物工程》94,680-688；Kanda(2007)《生物技术学刊(JBiotechnol.)》130,300-310；Imai-Nishiya(2007)《BMC生物技术学刊》7,84；Yamane-Ohnuki和Satoh(2009)mAbs 1,230-236中。在某些实施例中，在被工程改造成表达b(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III活性的糖修饰的宿主细胞中表达本文中提供的无岩藻糖基化抗VEGFR2抗体。在某些实施例中，在降低或去除了1,6-岩藻糖基转移酶活性的糖修饰的宿主细胞中表达本文中提供的无岩藻糖基化抗VEGFR2抗体。有关糖修饰的宿主细胞的制造的详情，参见例如US 6,946,292。可以例如通过发酵条件(例如发酵时间)或通过具有不同岩藻糖基化量的至少两种抗体的组合预定抗体岩藻糖基化的量。此类无岩藻糖基化抗体和对应的糖工程改造方法描述于WO 2005/044859；WO 2004/065540；WO 2007/031875；Umana等人,《自然·生物技术》17(1999)176-180；WO 99/154342；WO 2005/018572；WO 2006/116260；WO 2006/114700；WO 2005/011735；WO 2005/027966；WO 97/028267；US 2006/0134709；US 2005/0054048；US 2005/0152894；WO 2003/035835；WO 2000/061739中。这些经过糖工程改造的抗体具有增加的ADCC。其它产生根据本发明的无岩藻糖基化抗体的糖工程改造方法描述于例如Niwa,R.等人,《免疫学方法杂志》306(2005)151-160；Shinkawa,T.等人,《生物化学杂志》,278(2003)3466-3473；WO 03/055993或US 2005/0249722中。
在某些实施例中，本文中提供的无岩藻糖基化抗VEGFR2抗体是使用体外技术制备的。在某些实施例中，本文中提供的无岩藻糖基化抗VEGFR2抗体是以化学方式合成的。参见例如，Yamamoto等人(2008)JACS 130,501-510，其中描述了非岩藻糖基化形式单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)的化学合成。在某些实施例中，本文中提供的无岩藻糖基化抗VEGFR2抗体是通过使用岩藻糖苷酶去除IgG上的岩藻糖残基而产生。参见例如，Yazawa等人(1986)《生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun.)》136,563-569。
在某些实施例中，如由本领域普通技术人员中众所周知的分析所展示，相较于岩藻糖基化抗VEGFR2抗体，本文中提供的无岩藻糖基化抗VEGFR2抗体具有改善的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应子功能。参见例如Suzuki等人(2007)《临床癌症研究(ClinCancer Res)》13,1875。举例来说，在某些实施例中，本文所描述的无岩藻糖基化抗VEGFR2抗体的ADCC效应子功能活性是岩藻糖基化抗VEGFR2抗体的ADCC效应子功能活性的至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％或至少约300％，包括这些值之间的任何范围。在某些实施例中，本文所描述的抗VEGFR2抗体的ADCC效应子功能活性是岩藻糖基化抗VEGFR2抗体的ADCC效应子功能活性的超过约300％，包括是岩藻糖基化抗VEGFR2抗体的ADCC效应子功能活性的至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％、至少约400％、至少约410％、至少约420％、至少约430％、至少约440％、至少约450％、至少约460％、至少约470％、至少约480％、至少约490％、至少约500％、至少约510％、至少约520％、至少约530％、至少约540％、至少约550％、至少约560％、至少约570％、至少约580％、至少约590％或至少约600％，包括这些值之间的任何范围。
免疫缀合物
本发明还涉及免疫缀合物，这些免疫缀合物包含抗体与细胞毒性剂，如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)的缀合物。
可以使用的酶活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素(modeccin)A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素、有丝分裂素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素(enomycin)以及单端孢霉烯。多种放射性核素可用于制造放射性缀合的抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y及186Re。可用于产生此类免疫缀合物的示例性化疗剂包括本文中别处所描述的那些。
抗体与细胞毒性剂的缀合物是使用多种双官能蛋白质偶合剂制备，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸亚甲苯酯)以及双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。举例来说，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等人,《科学》238：1098(1987)中所描述来制备。碳-14标记的1-异硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。参见WO94/11026。
在另一个实施例中，所述抗体可以缀合至“受体”(如抗生蛋白链菌素)以用于肿瘤预靶向中，其中将抗体-受体缀合物施用给患者，随后使用清除剂去除循环中未结合的缀合物，然后施用缀合至细胞毒性剂(例如放射性核苷酸)的“配体”(例如抗生物素蛋白)。
共价修饰
在本发明的范围内包括抗VEGFR2抗体和其片段的共价修饰。一种类型的共价修饰包括使多肽的靶氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，该有机衍生化试剂能够与所述多肽的所选侧链或N末端或C末端残基反应。用双官能试剂进行衍生化例如可用于使多肽与不溶于水的载体基质或表面交联以用于抗体纯化方法中，且反之亦然。常用交联剂包括例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮水杨酸形成的酯、同型双官能亚氨基酯，包括二琥珀酰亚胺基酯如3,3'-二硫基双(琥珀酰亚胺基-丙酸酯)、双官能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷，以及如3-[(对叠氮苯基)-二硫基]丙酰亚胺甲酯等试剂。
其它修饰包括谷胺酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别脱酰胺成为相应谷氨酰基和天冬氨酰基残基；脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化[T.E.Creighton,《蛋白质：结构和分子性质(Proteins:Structure and Molecular Properties)》,W.H.Freeman&Co.,旧金山(SanFrancisco),第79-86页(1983)]；N末端胺的乙酰化；以及任何C末端羧基的酰胺化。
其它修饰包括毒素缀合至拮抗剂如美登素(maytansine)和类美登素、卡奇霉素(calicheamicin)以及其它细胞毒性剂。
另一类型的多肽共价修饰包含多肽以美国专利第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号或第4,179,337号中所述的方式连接至多种非蛋白质聚合物中的一种，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。
嵌合分子
在适宜情况下，还可以通过一种方式修饰本发明的抗VEGFR2抗体(或其片段)以形成包含所述多肽与另一异源多肽或氨基酸序列(例如免疫粘附素或肽体)的融合物的嵌合分子。
在一个实施例中，此类嵌合分子包含多肽与蛋白质转导结构域的融合物，该蛋白质转导结构域将多肽靶向递送至各种组织，并且更具体地说，使用例如人类免疫缺陷病毒TAT蛋白质的蛋白质转导结构域将多肽递送穿过血脑屏障(Schwarze等人,1999,《科学》285:1569-72)。
在另一个实施例中，此类嵌合分子包含多肽与标签多肽的融合物，该标签多肽提供了可以供抗标签抗体选择性结合的表位。表位标签一般被放在多肽的氨基或羧基末端处。所述多肽的此类表位标记形式的存在可以使用针对标签多肽的抗体进行检测。另外，提供的表位标签使所述多肽能够通过亲和纯化，使用抗标签抗体或结合至表位标签的另一类亲和基质容易地纯化。各种标签多肽和其对应的抗体是本领域中已知的。实例包括聚组氨酸(poly-His)或聚组氨酸-甘氨酸(poly-His-gly)标签；flu HA标签多肽和其抗体12CA5[Field等人,《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》,8:2159-2165(1988)]；c-myc标签以及针对该标签的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体[Evan等人,《分子与细胞生物学》,5:3610-3616(1985)]；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签和其抗体[Paborsky等人,《蛋白质工程》,3(6):547-553(1990)]。其它标签多肽包括Flag肽[Hopp等人,《生物技术(BioTechnology)》,6:1204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin等人,《科学》,255:192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽[Skinner等人,《生物化学杂志》,266:15163-15166(1991)]；及T7基因10蛋白质肽标签[Lutz-Freyermuth等人,《美国国家科学院院刊》,87:6393-6397(1990)]。
在一个替代实施例中，嵌合分子可以包含多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于二价形式的嵌合分子(例如“免疫粘附素”)，此类融合物可以是与IgG分子的Fc区融合。本发明的Ig融合物包括大致包含或仅包含人类残基94-243、残基33-53或残基33-52的多肽代替Ig分子内至少一个可变区。在一个特别优选的实施例中，免疫球蛋白融合物包括IgG1分子的铰链、CH2和CH3区，或铰链、CH1、CH2和CH3区。有关免疫球蛋白融合物的制备，另外参见1995年6月27日颁布的美国专利第5,428,130号。
免疫脂质体
本文所公开的抗体还可以配制为免疫脂质体形式。含有所述抗体的脂质体是通过本领域中已知的方法，如Epstein等人,《美国国家科学院院刊》,82:3688(1985)；Hwang等人,《美国国家科学院院刊》,77:4030(1980)；及美国专利第4,485,045号和第4,544,545号中描述的方法制备。具有增加的循环时间的脂质体公开于美国专利第5,013,556号中。
特别有用的脂质体可以通过逆相蒸发法，利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。将脂质体挤出穿过规定孔径的过滤器，得到具有所希望的直径的脂质体。可以如Martin等人,《生物化学杂志》,257:286-288(1982)中所描述，通过二硫键交换反应将本发明抗体的Fab'片段缀合至脂质体。在脂质体内还任选地包含抗肿瘤剂、生长抑制剂或化疗剂(如多柔比星(doxorubicin))。参见Gabizon等人,《美国国家癌症研究所杂志(J.National Cancer Inst.)》,81(19):1484(1989)。
使用抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体的治疗
在本发明的另一方面，使用抗VEGFR2抗体抑制血管生成。VEGFR刺激血管内皮会引起血管生成疾病和肿瘤血管形成。因此，本文中提供的人类抗VEGFR2抗体有效治疗患有血管化肿瘤或赘瘤或血管生成疾病的对象。此类肿瘤和赘瘤包括例如恶性肿瘤和赘瘤，如母细胞瘤、癌瘤或肉瘤，以及具有丰富血管的肿瘤和赘瘤。可以利用本发明所提供的方法治疗的癌症包括例如脑癌、泌尿生殖道癌症、淋巴系统癌症、胃癌、肾癌、结肠癌、喉癌以及肺癌和骨癌。非限制性实例进一步包括表皮样瘤；鳞状肿瘤，如头颈部肿瘤；腹膜癌；结肠直肠肿瘤；结肠直肠癌；直肠肿瘤；直肠癌；前列腺肿瘤；乳房肿瘤；持久性、复发性或转移性子宫颈癌瘤；肺肿瘤，包括肺腺癌以及小细胞和非小细胞肺肿瘤；胰腺肿瘤；甲状腺肿瘤；输卵管肿瘤；卵巢肿瘤(如复发性上皮卵巢癌)；及肝肿瘤。所述方法还被用于治疗血管化皮肤癌，包括鳞状细胞癌、基底细胞癌，以及可以通过抑制恶性角化细胞，如人类恶性角化细胞生长来治疗的皮肤癌。可以治疗的其它癌症包括卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、CNS赘瘤(成神经细胞瘤、毛细血管母细胞瘤、脊膜瘤和脑转移瘤)、黑素瘤、胃肠和肾细胞癌瘤和肉瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤(包括多形性成胶质细胞瘤)，以及平滑肌肉瘤。
本发明的另一方面包括治疗或预防以过度血管生成为特征的病理病况的方法，所述病理病况包含例如血管形成和/或炎症，如动脉粥样硬化、类风湿性关节炎(RA)、新生血管性青光眼、增生性视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变，黄斑变性、血管瘤、血管纤维瘤及银屑病。非赘生性血管生成疾病的其它非限制性实例是早产儿视网膜病(晶体后纤维膜增生症)、角膜移植物排斥反应、胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化、重症肌无力、克罗恩氏病(Crohn's disease)、自身免疫性肾炎、原发性胆汁性肝硬化、急性胰腺炎、同种异体移植排斥反应、过敏性炎症、接触性皮炎及迟发过敏性反应、炎症性肠病、败血性休克、骨质疏松、骨关节炎、神经元炎症诱发的认知缺陷、Osler-Weber综合症、再狭窄，以及真菌、寄生虫和病毒感染，包括巨细胞病毒感染。在某些实施例中，以过度血管生成为特征的病理病况是眼部疾病。在某些实施例中，眼部疾病选自由以下组成的组：视网膜病变、年龄诱导的黄斑变性(例如湿性AMD)、糖尿病性黄斑水肿、虹膜红变、由银屑病引起的葡萄膜炎、炎症性肾病、溶血性尿毒症性综合症、糖尿病性肾病(例如增生性糖尿病性视网膜病变)、炎症性肠病、慢性炎症、慢性视网膜脱落、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、角膜移植物排斥反应、角膜新血管生成、角膜移植物新血管生成、近视、眼部新生血管性疾病、Pagets病、类天疱疮、多动脉炎、激光放射状角膜切开术后、视网膜新血管生成、Sogrens综合症、溃疡性结肠炎、移植物排斥反应、肺炎、肾病综合症、水肿以及新生血管性青光眼。在某些实施例中，本发明提供用于制造供治疗眼部疾病(如以上描述的那些)用的药物的抗VEGFR2抗体(或其片段)。在某些实施例中，本发明提供用于治疗对象的眼部疾病(如以上描述的那些)的抗VEGFR2抗体(或其片段)。在某些实施例中，待治疗的对象是哺乳动物(例如人类、非人类灵长类动物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在某些实施例中，对象是人类。在某些实施例中，对象是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在某些实施例中，对象疑似患有眼部疾病(如以上描述的那些)或有患眼部疾病的风险。在某些实施例中，对象已被诊断患有眼部疾病(如以上描述的那些)。
本文所提供的抗VEGFR2抗体(或其片段)和/或组合物可以施用给对象(例如哺乳动物，如人类)以治疗涉及异常VEGFR2活性的疾病和病症，包括例如癌症(如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌及实体肿瘤)或以过度血管生成为特征的病理病况(如以上描述的那些)。在某些实施例中，本发明提供用于制造供治疗对象的癌症(如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌及实体肿瘤)或以过度血管生成为特征的病理病况(如以上描述的那些)用的药物的抗VEGFR2抗体(或其片段)。在某些实施例中，本发明提供用于治疗对象的癌症(如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌及实体肿瘤)或以过度血管生成为特征的病理病况(如以上描述的那些)的抗VEGFR2抗体(或其片段)。在某些实施例中，待治疗的对象是哺乳动物(例如人类、非人类灵长类动物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在某些实施例中，对象是人类。在某些实施例中，对象是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在某些实施例中，对象疑似患有癌症(如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌及实体肿瘤)或以过度血管生成为特征的病理病况(如以上描述的那些)或有患该癌症或病理病况的风险。在某些实施例中，对象被诊断患有癌症(如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌及实体肿瘤)或以过度血管生成为特征的病理病况(如以上描述的那些)。
有关癌症(如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌及实体肿瘤)或以过度血管生成为特征的病理病况(如以上描述的那些)的许多诊断方法以及这些疾病的临床描绘是本领域中已知的。此类方法包括但不限于，例如免疫组织化学、PCR、荧光原位杂交法(FISH)。有关异常VEGFR2活性或表达的诊断方法的另外的细节描述于例如Gupta等人(2009)《病理学方法(Mod Pathol.)》22(1):128-133；Lopez-Rios等人(2013)《临床病理学杂志(J Clin Pathol.)》66(5):381-385；Ellison等人(2013)《临床病理学杂志》66(2):79-89；及Guha等人(2013)《公共科学图书馆·综合(PLoS ONE)》8(6):e67782中。有本领域技能的临床医师可以例如通过使用临床测试、体检和医疗/家族史容易地确定个体是否是用本文所描述的抗VEGFR2抗体治疗的候选者。
施用可以通过任何适合的途径进行，包括例如静脉内、肌肉内或皮下。在一些实施例中，本文所提供的抗VEGFR2抗体(或其片段)和/或组合物是与第二、第三或第四药剂(包括例如抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化疗剂)组合施用以治疗涉及异常VEGFR2活性的疾病或病症。此类药剂包括例如多西他赛(docetaxel)、吉非替尼(gefitinib)、FOLFIRI(伊立替康(irinotecan)、5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸)、伊立替康、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、贝伐单抗(bevacizumab)(抗VEGF抗体)、FOLFOX-4(输注型氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸和奥沙利铂(oxaliplatin))、阿法替尼(afatinib)、吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨(capecitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、替万替尼(tivantinib)、依维莫司(everolimus)、CpG-ODN、雷帕霉素(rapamycin)、来那度胺(lenalidomide)、维罗非尼(vemurafenib)、内皮生长抑素、拉帕替尼(lapatinib)、PX-866、Imprime PGG及埃罗替尼(erlotinib)。在一些实施例中，抗VEGFR2抗体(或其片段)缀合至另外的药剂。
取决于待治疗的适应症以及具有本领域技能的医师所熟悉的给药相关因素，本文中提供的抗体将以有效治疗所述适应症，同时最大限度地减小毒性和副作用的剂量施用。为治疗癌症(如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌及实体肿瘤)或以过度血管生成为特征的病理病况(如本文中别处描述)，典型剂量可以例如在0.001至1000μg范围内；不过，低于或高于这一示例性范围的剂量也在本发明的范围内。日剂量可以是约0.1μg/kg至约100mg/kg总体重(例如约5μg/kg、约10μg/kg、约100μg/kg、约500μg/kg、约1mg/kg、约50mg/kg，或由前述值中的任意两个界定的范围)，优选是约0.3μg/kg至约10mg/kg总体重(例如约0.5μg/kg、约1μg/kg、约50μg/kg、约150μg/kg、约300μg/kg、约750μg/kg、约1.5mg/kg、约5mg/kg，或由前述值中的任意两个界定的范围)，更优选是约1μg/kg至1mg/kg总体重(例如约3μg/kg、约15μg/kg、约75μg/kg、约300μg/kg、约900μg/kg，或由前述值中的任意两个界定的范围)，并且甚至更优选是每天约0.5至10mg/kg体重(例如约2mg/kg、约4mg/kg、约7mg/kg、约9mg/kg，或由前述值中的任意两个界定的范围)。如上所述，可以通过定期评估所治疗的患者来监测治疗或预防功效。对于在数天或更长时间内重复施用，取决于病况，重复治疗直至出现所希望的疾病症状抑制。不过，其它剂量方案也可以使用并且在本发明的范围内。所希望的剂量可以通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物或通过连续输注施用组合物进行递送。
包含抗VEGFR2抗体的药物组合物可以每天施用一次、两次、三次或四次。这些组合物的施用频率也可以低于每天，例如一周六次、一周五次、一周四次、一周三次、一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次、一月一次、每个月一次、每三个月一次或每六个月一次。这些组合物还可以呈持续释放配制物形式，如在一段时间内逐渐释放组合物以供使用的植入物形式施用，并且该配制物允许降低组合物的施用频率，如一月一次、每2-6个月一次、每年一次或甚至单次施用。持续释放装置(如丸剂、纳米粒子、微米粒子、纳米球、微米球等)可以通过注射施用。
抗体(或其抗原结合片段)可以按单次日剂量施用，或总日剂量可以每天两次、三次或四次以分次剂量施用。这些组合物的施用频率也可以低于每天，例如一周六次、一周五次、一周四次、一周三次、一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次、一月一次、每个月一次、每三个月一次或每六个月一次。这些组合物还可以呈持续释放配制物形式，如在一段时间内逐渐释放所用组合物的植入物形式施用，并且该配制物允许降低组合物的施用频率，如一月一次、每2-6个月一次、每年一次或甚至单次施用。持续释放装置(如丸剂、纳米粒子、微米粒子、纳米球、微米球等)可以通过注射施用或以手术方式植入各种位置中。
癌症治疗可以通过例如但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩小、进展时间、存活持续时间、无进展存活率、总体反应率、反应持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性进行评价。可以采用确定疗法的功效的方法，包括例如通过放射性成像测量反应。
在一些实施例中，治疗功效是以使用以下等式计算的肿瘤生长抑制百分比(％TGI)测量：100-(T/C×100)，其中T是所治疗的肿瘤平均相对肿瘤体积，并且C是未治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积。在某些实施例中，％TGI是约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％或大于95％，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，抗VEGFR2的％TGI等于或大于1121B(参见US 2009/0306348)或1121N(参见US 7,498,414)的％TGI，例如是1121B(参见US2009/0306348)或1121N(参见US 7,498,414)的％TGI的约0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约2.1倍、约2.2倍、约2.3倍、约2.4倍、约2.5倍、约2.6倍、约2.7倍或大于约2.7倍。
药物配制物
抗VEGFR2抗体(或其片段)可以用适合载剂或赋形剂配制以使其适于施用。通过将具有所希望纯度的抗体(或其片段)与可选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(《雷氏药学大全(Remington's Pharmaceutical Sciences)》第16版,Osol,A.编(1980))混合，获得呈冻干配制物或水溶液形式的适合抗体配制物。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒性，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、氯化六羟季铵；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。示例性抗体配制物描述于明确地以引用的方式并入本文中的W098/56418中。适合于皮下施用的冻干配制物描述于W097/04801中。此类冻干配制物可以用适合稀释剂复原至高蛋白质浓度并且复原的配制物可以皮下施用至本文中待治疗的哺乳动物。
根据需要，本文中的配制物还可以含有多于一种用于所治疗的特定适应症的活性化合物，优选具有补充活性但不会不利地相互影响的那些。举例来说，可能需要进一步提供抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化疗剂。这些分子宜以有效用于预定目的的量以组合形式提供。这些其它药剂的有效量取决于配制物中存在的抗体的量、疾病或病症或治疗的类型，以及上文所论述的其它因素。这些药剂一般是以与本文所描述相同的剂量和施用途径或以迄今所用剂量的约1至99％使用。可以将活性成分包覆在微胶囊中，所述微胶囊是例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别呈胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微米球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或呈粗乳液形式。这类技术公开于《雷氏药学大全》第16版,Osol,A.编(1980)中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有所述拮抗剂的由固体疏水性聚合物构成的半渗透基质，所述基质呈成形制品，例如膜或微胶囊形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)构成的可注射微米球)，以及聚D-(-)-3-羟基丁酸。
可以使用脂质体转染试剂(Lipofectin)或脂质体将本发明的多肽和抗体(或其片段)或组合物递送至细胞中。在使用抗体片段情况下，优选特异性结合至靶蛋白的结合结构域的最小抑制片段。举例来说，基于抗体的可变区序列，可以设计出保持结合靶蛋白序列的能力的肽分子。此类肽可以按化学方式合成和/或通过重组DNA技术制造。参见例如Marasco等人,《美国国家科学院院刊》,90:7889-7893(1993)。
还可以将活性成分包覆在微胶囊中，所述微胶囊是例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别呈胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微米球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或呈粗乳液形式。此类技术公开于《雷氏药学大全》,前述中。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有抗体(或其片段)的由固体疏水性聚合物构成的半渗透基质，所述基质呈成形制品，例如膜或微胶囊形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)构成的可注射微米球)，以及聚D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够经100天释放分子，而某些水凝胶在较短时间段内释放蛋白质。当封装的抗体在体内保持较长时间时，这些抗体会因在37℃下暴露于水分而变性或聚集，导致生物活性丧失并且免疫原性可能发生变化。取决于所涉及的机制，可以设计合理策略实现稳定化。举例来说，如果发现聚集机制是通过硫基-二硫化物交换而形成分子间S-S键，则可以通过修饰硫氢基残基、自酸性溶液冻干、控制水分含量、使用适当添加剂以及开发特定聚合物基质组成来实现稳定化。
在某些实施例中，所述配制物包含浓度大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml(如约1.1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约1.7mg/ml、约1.8mg/ml、约1.9mg/ml或大于约1.9mg/ml)、大于约2mg/ml(如约2.1mg/ml、约2.2mg/ml、约2.3mg/ml、约2.4mg/ml、约2.5mg/ml、约2.6mg/ml、约2.7mg/ml、约2.8mg/ml、约2.9mg/ml或大于约2.9mg/ml)、大于约3mg/ml、大于约4mg/ml、大于约5mg/ml、大于约6mg/ml、大于约7mg/ml、大于约8mg/ml、大于约9mg/ml、大于约10mg/ml、大于约11mg/ml、大于约12mg/ml、大于约13mg/ml、大于约14mg/ml或约15mg/ml，包括这些值之间的任何范围的本文所描述的抗VEGFR2抗体。
在某些实施例中，抗VEGFR2抗体是在包含柠檬酸盐、组氨酸、乙酸盐、磷酸盐、蔗糖、NaCl、琥珀酸盐、甘氨酸、聚山梨醇酯80(Tween 80)或前述任何组合的缓冲液中配制。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体是在包含约10mM柠檬酸盐、约10mM乙酸盐或约10mM磷酸盐的缓冲液中配制。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体是在包含约50mM至约100mM NaCl的缓冲液中配制。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体是在包含约0.5％至约3％甘氨酸的缓冲液中配制。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体是在包含约0.005％至约0.02％聚山梨醇酯80(Tween 80)的缓冲液中配制。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体是在pH值介于约5.5与6.5之间的缓冲液中配制。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体是在包含10mM柠檬酸盐、75mM NaCl、2％甘氨酸、2％蔗糖及0.02％聚山梨醇酯80的缓冲液中配制，其中所述配制物是pH＝6.0。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体是在包含10mM乙酸盐、75mM、2％甘氨酸、2％蔗糖及0.02％聚山梨醇酯80的缓冲液中配制，其中所述配制物是pH＝6.0。在某些实施例中，抗VEGFR2抗体是在包含10mM磷酸盐、75mM NaCl、2％甘氨酸、2％蔗糖及0.02％聚山梨醇酯80的缓冲液中配制，其中所述配制物是pH＝6.0。
在某些实施例中，包含本文中提供的抗VEGFR2抗体的配制物在-80℃下稳定保持约0.5周、1.0周、1.5周、2.0周、2.5周、3.5周、4.0周、4.5周或5.0周，包括在这些值之间的任何范围。在某些实施例中，包含本文中提供的抗VEGFR2抗体的配制物(如包含10mM柠檬酸盐、75mM NaCl、2％甘氨酸、2％蔗糖及0.02％聚山梨醇酯80的配制物，其中所述配制物是pH＝6.0)在加速条件下(如在约40℃下储存)稳定保持约0.5周、1.0周、1.5周、2.0周、2.5周、3.5周、4.0周、4.5周或5.0周，包括在这些值之间的任何范围。
用于体内施用的配制物必须是无菌的。这易于通过例如经无菌过滤膜过滤实现。
使用抗表皮生长因子受体抗体诊断和成像的方法
特异性结合至VEGFR2多肽的经标记的抗VEGFR2抗体、其片段以及其衍生物和类似物可以用于诊断目的以检测、诊断或监测与VEGFR2表达、异常表达和/或活性有关的疾病和/或病症。举例来说，本文中提供的抗VEGFR2抗体(或其片段)可以用于原位、体内、离体和体外诊断分析或成像分析中。用于检测VEGFR2多肽的表达的方法包括(a)使用一种或更多种本发明的抗体分析个体的细胞(例如组织)或体液中所述多肽的表达及(b)将基因表达水平与标准基因表达水平相比较，由此所分析的基因表达水平相较于标准表达水平增加或降低指示异常表达。
本文中提供的另外的实施例包括诊断动物(例如哺乳动物，如人类)的与VEGFR2表达或异常表达有关的疾病或病症的方法。这些方法包括检测哺乳动物体内的VEGFR2分子。在某些实施例中，诊断包括：(a)向哺乳动物施用有效量的经标记抗VEGFR2抗体(或其片段)；(b)在施用后，等待一定时间间隔以允许经标记抗VEGFR2抗体(或其片段)优先集中在对象的表达VEGFR2分子的部位(并清除未结合的经标记分子达到背景水平)；(c)测定背景水平；及(d)检测对象体内的经标记分子，由此检测到高于背景水平的经标记分子指示对象患有与EGFR表达或异常表达有关的特定疾病或病症。背景水平可以通过各种方法测定，包括将所检测的经标记分子的量与预先测定的特定系统的标准值相比较。
可以使用本文中提供的抗VEGFR2抗体(或其片段)，使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法分析生物样品中的蛋白质含量(例如参见Jalkanen等人,《细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)》101:976-985(1985)；Jalkanen等人,《细胞生物学杂志》105:3087-3096(1987))。可用于检测蛋白质基因表达的其它基于抗体的方法包括免疫分析，如酶连免疫吸附剂分析(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。适合抗体分析标记是本领域中已知的并且包括酶标记，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)及锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru；鲁米诺(luminol)；及荧光标记，如荧光素和罗丹明(rhodamine)，以及生物素。
本领域中已知的技术可以适用于本文中提供的经标记抗体(或其片段)。此类技术包括但不限于，使用双官能缀合剂(参见例如美国专利第5,756,065号、第5,714,631号、第5,696,239号、第5,652,361号、第5,505,931号、第5,489,425号、第5,435,990号、第5,428,139号、第5,342,604号、第5,274,119号、第4,994,560号及第5,808,003号)。替代地或另外，可以例如通过使用对应于EGFR编码核酸或其补体的基于核酸的探针进行的荧光原位杂交法(FISH；参见1998年10月公开的W098/454 79)；DNA印迹法(Southern blotting)；RNA印迹法(Northern blotting)；或聚合酶链反应(PCR)技术，如实时定量PCR(RT-PCR)测量细胞中VEGFR2多肽编码核酸或mRNA的含量。还可以通过例如使用基于抗体的分析，测量生物流体如血清中的脱落抗原(shed antigen)来研究VEGFR2的过度表达(另外，参见例如1990年6月12日颁布的美国专利第4,933,294号；1991年4月18日公开的W091/05264；1995年3月28日颁布的美国专利5,401,638；及Sias等人,《免疫学方法杂志》132:73-80(1990))。除上述分析以外，熟练从业人员还可使用各种体内和离体分析。举例来说，可以使哺乳动物体内的细胞暴露于任选标记有可检测标记，例如放射性同位素的抗体，并且可以例如通过外部扫描放射性或通过分析从先前暴露于抗体的哺乳动物获得的样品(例如活检样品或其它生物样品)来评价抗体与的结合。
制品和试剂盒
本发明的另一实施例是一种制品，该制品含有可用于治疗癌症(如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌及实体肿瘤)或以过度血管生成为特征的病理病况(如本文中别处描述的那些)的材料。所述制品可以包含容器以及在容器上或与容器相联的标签或药品说明书(package insert)。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料形成，如玻璃或塑料。一般来说，容器容纳有效治疗所述病况的组合物并且可以具有无菌接取口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或是具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中的至少一种活性剂是本文中提供的抗VEGFR2抗体(或其片段)。标签或药品说明书指示所述组合物是用于治疗特定病况。标签或药品说明书还将包含有关向患者施用抗体组合物的说明。还考虑包含本文所描述的组合疗法的制品和试剂盒。
药品说明书是指通常包括在治疗产品的商业包装中的含有关于适应症、用法、剂量、施用、有关使用此类治疗产品的禁忌和/或警告的信息的说明书。在一个实施例中，药品说明书指示所述组合物用于治疗癌症(如结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌及实体肿瘤)或以过度血管生成为特征的病理病况(如本文中别处描述的那些)。
此外，所述制品还可以包括第二容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户的观点看所需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及注射器。
还提供试剂盒，这些试剂盒任选地与所述制品组合用于各种目的，例如用于分离或检测患者体内的VEGFR2。对于分离和纯化EGFR，试剂盒可以含有与珠粒(例如琼脂糖珠粒)偶合的本文中提供的抗VEGFR2抗体(或其片段)。可以提供含有所述抗体(或其片段)的试剂盒用于在体外，例如在ELISA或蛋白质印迹法(Western blot)中检测和定量VEGFR2。与所述制品相同，试剂盒可以包含容器以及在容器上或与容器相联的标签或药品说明书。举例来说，容器容纳包含至少一种本文中提供的抗VEGFR2抗体的组合物。可以包括另外的容器以容纳例如稀释剂和缓冲剂、对照抗体。标签或药品说明书可以提供有关组成的描述以及有关预定的体外或诊断用途的说明。
实例
实例1.抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体的产生、亲和力成熟和表征
通过用VEGFR2-Fc筛选人类噬菌体展示文库，鉴别出十个阳性抗VEGFR2抗体克隆株(即，V1-V10)。进行体外功能分析以表征这些克隆株，所述分析在下文进一步详细描述并且概述于表5中。所述分析是使用1121B(在本文中又称为Ref-A，即US 2009/0306348中描述的抗VEGFR2抗体)，和/或1121N(在本文中又称为Ref-B，即，US 7,498,414中描述的抗VEGFR2抗体)作为阳性对照进行。
表5
表5第1-4行分别提供了用于评估V1-V10与VEGFR2的结构域1-7、VEGFR2的结构域2-3、VEGFR2的结构域1-3及VEGFR2的结构域1-4的结合的ELISA分析的结果。如第2行中所示，V5和V8可以结合VEGFR2的结构域2-3；不过V5的结合亲和力较低。
进行另外的ELISA分析以评估V1、V9、V10及1121B与VEGFR2的结构域5-7的结合。简单点说，在微量滴定盘各孔中，用绵羊抗人fd抗体捕捉V1、V9、V10及1121B的连续稀释液。通过将VEGFR2-D5-7-AP融合蛋白添加至孔中来测量VEGFR2-D5-7结合。在培育并洗涤之后，将pNPP添加至孔中并培育30分钟。通过监测在405nm下吸光度的增加来测量AP活性。绘制抗体浓度随AP活性变化的图(图1)。如图1所示，克隆株V1、V9和V10结合VEGFR2的结构域5-7，而1121B则不结合。
表5第6行显示，发现克隆株V1-V10不阻断VEGFR2与VEGF的结合。简单点说，将各克隆株的连续稀释液与VEGFR2-AP一起在28℃下培育2小时。将各抗体:抗原混合物添加至微量滴定盘中涂有VEGF的孔中。在培育并洗涤之后，将pNPP添加至孔中并培育30分钟。通过监测在405nm下吸光度的增加来测量AP活性。绘制抗体浓度随AP活性变化的图(图2)。如图2中所示，1121B阻断VEGFR2与VEGF的结合，而克隆株V1-V10则不阻断。另外，在竞争性ELISA中确定V1、V9和V10不与1121B竞争结合至VEGFR2。(参见表5第7行。)
接下来，分析克隆株V1-V10与人类脐静脉内皮细胞(HUVEC，其表达VEGFR2)的结合。简单点说，用PBS洗涤HUVEC(2×105)一次，在4℃下用4％三聚甲醛固定30分钟，用FACS缓冲液(含1％胎牛血清的PBS)洗涤，并转移至96孔板各孔中(2×105个细胞/孔)。在4℃下以500×g离心5分钟之后，将100μl抗体(由3μl/ml储备液稀释3倍)添加至孔中并在4℃下培育30分钟。接着用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并将其与抗Fcr-FITC抗体一起在4℃下培育30分钟。接着用FACS缓冲液洗涤细胞三次，在4℃下用4％三聚甲醛固定30分钟，并在4℃下以500×g离心5分钟。丢弃上清液。将细胞再悬浮于FACS缓冲液中并通过流式细胞术分析。如图3中所示，发现克隆株V9结合HUVEC，而发现1121B(Ref A)和1211N(Ref B)都不结合HUVEC。
表5第8行和第9行提供了用于评估克隆株V1-V10抑制血管生成的能力的HUVEC管形成分析的定性结果。HUVEC当在低生长因子基底膜提取物的凝胶上培养时形成毛细管样管结构。所述分析是如下进行：将解冻的基质胶(低生长因子)添加至μ-Slides(IBIDI)上并使其在37℃下聚合1小时。将培养的HUVEC(来自BD Biosciences)从板脱离，洗涤3次，并且再悬浮于培养基(EBM-2+10％“用过的”EGM-2(即，培养2夜，接着收集并过滤)+5ng/mlbFGF)中。将50μl HUVEC与0.2μg/ml或5μg/ml各抗体一起在37℃培育20分钟。将50ng/mlVEGF-165(即，VEGF-A的具有165个氨基酸的剪接变体)添加至各板中，并在37℃下培育板6小时。当测试5μg/ml各抗体时，V8对于HUVEC管形成展现的抑制作用强于1121B。1121B对于HUVEC管形成展现的抑制作用强于V5、V6或V9。V5、V6和V9对于HUVEC管形成展现的抑制作用强于V2或V10。V7、V4和V1在5μg/ml下未对HUVEC管形成展现抑制作用。(数据未示出。)当测试0.2μg/ml各抗体时，V8和1121B对于HUVEC管形成展现的抑制作用强于V2或V6。V2和V6对于HUVEC管形成展现的抑制作用强于V10、V9、V4及V4。V5和V1在0.2μg/ml下未对HUVEC管形成展现抑制作用。(数据未示出。)
使用来自BD Biosciences和生物资源保存与研究中心(Bioresource Collectionand Research Center)的HUVEC混合物重复HUVEC管形成分析。测试2500ng/ml、50ng/ml和1ng/ml各抗体。当使用2500ng/ml各抗体时，1121B、V7、V8、V9及V10对于HUVEC管形成展现的抑制作用强于V1、V2和V6。(数据未示出。)当使用50ng/ml各抗体时，1121B和V6对于HUVEC管形成展现的抑制作用强于V1、V2、V7、V8及V9。V10在50ng/ml下未对HUVEC管形成展现抑制作用。(数据未示出。)当使用1ng/ml各抗体时，1121B和V7对于HUVEC管形成展现的抑制作用强于V6和V10。V8、V9、V1及V2在1ng/ml下未对HUVEC管形成展现抑制作用。(数据未示出。)
表5第10行提供了用于评估克隆株V1-V10抑制HUVEC迁移活性的能力的HUVEC迁移分析的定性结果。所述分析是如下进行：使汇合的HUVEC(8×105个细胞/板)传代培养26小时，随后使其脱离，在内皮细胞基础培养基-2(EBM-2)中洗涤三次，并将其以约5×105个细胞/微升的浓度再悬浮于EBM-2中。将0.1ml细胞悬浮液与30μg/ml抗体一起在37℃下培育20分钟。用50ml PBS冲洗8微米孔径的transwell渗透性支架小室(insert)(Millipore)并涂布50μl的10μg/ml纤维结合蛋白(2μg/cm2)，保持3小时。去除涂布溶液，并将细胞悬浮液/抗体混合物转移至transwell中。将transwell转移至孔中，且下部隔室含有0.7ml EBM-2，并含有或不含400ng/ml VEGF165-Fc。在培育16至17小时之后，取出剩余细胞，并用PBS洗涤transwell两次。用100％甲醇固定迁移的细胞20分钟，干燥，并且接着用含0.15％结晶紫的0.1M硼酸盐/2％乙醇pH＝9染色30分钟。接着用dH2O洗涤染色的transwell，并用棉签清洁transwell的上表面。用60μl的10％乙酸提取染色的细胞。在590nm下测量吸光度值。根据下式测定％迁移：
V1和V2对于HUVEC迁移展示的抑制作用强于V8、V9、V10及1211B。参见图4。
表5第11行提供了用于评估克隆株V1-V10抑制HUVEC存活的能力的HUVEC存活分析的定性结果。简单点说，在48孔培养板中，利用800μl EGM-2培养基使HUVEC生长至汇合，并且接着用PBS洗涤三次。将抗VEGFR2抗体的连续稀释液添加至孔中并在37℃下培育30分钟。向各孔中添加VEGF-165-Fc之后，在37℃(5％CO2)下培育细胞2天。第3天，将80μl的5mg/mlMTT(即，在活细胞中还原成紫色甲(formazan)的黄色四唑)添加至各孔中并培育3小时。将100μl DMSO添加至各孔中，并测量各孔在565nm下的吸光度。V1和1121B(Ref A)对于HUVEC存活展现的抑制作用强于V10，V9。V7、V6、V2及V8未对HUVEC存活展现抑制作用。(参见图5。)
表5第12行提供了用于评估克隆株V1-V10抑制HUVEC增殖活性的能力的HUVEC细胞增殖分析的定性结果。所述分析是如下进行：使HUVEC从培养板脱离，再悬浮于EBM-2培养基中并接种至48孔组织培养板各孔中。将各抗体的连续稀释液添加至孔中并在37℃下培育30分钟。向各孔中添加VEGF-165之后，在37℃(5％CO2)下培育细胞3天。培育结束时，将80μl的5mg/ml MTT添加至各孔中并培育3小时。将100μl DMSO添加至各孔中，并测量各孔在565nm下的吸光度。V9对于HUVEC增殖展现的抑制作用强于V1和1121B。V1和1121B对于HUVEC存活展现的抑制作用强于V10和V7。V6、V2和V8未对HUVEC增殖展现抑制作用。(参见图6。)
表5第13行提供了用于评估V1-V10抑制由血管生成因子诱导的HUVEC萌芽(即，3维血管生成)的能力的体外HUVEC萌芽分析的定性结果。简单点说，将25ng/ml VEGF165(eBioscience)、20ng/ml bFGF(eBioscience)以及递增浓度的1121B(Ref A)、Avastin、V1或V9添加至培养基:羟丙基甲基纤维素(40:60)溶液(100μl)中。接着，将其与工作胶原蛋白溶液(于1×PBS中，pH 7.0)以1:1混合。混合后，立即将基质添加至预先升温的48孔板中并使其回到37℃。同时，收集(150×g，没有制动)在未处理的无菌96孔微量板中经18小时诱导形成750个细胞的球体的HUVEC，用PBS洗涤一次，并且接着将其悬浮于EBM-2中(约50个细胞球/毫升)。将悬浮的细胞球转移至微管中并使其集结。在抽吸出上清液之后，将含生长因子和抗体的培养基:羟丙基甲基纤维素溶液(150μl)平铺在集结粒上，随后添加150μl工作胶原蛋白储备液。立即混合溶液并将其转移至含有基质底涂层的板中。在37℃下培育2小时之后，将150μl含有生长因子和抗体的培养基添加至各孔的表面。在37℃下培育48-64小时之后，获取萌芽的图像。
表5第14行提供了用于评估V1-V9在体内抑制血管生成的能力的基质胶塞分析的定性结果。该实验是在患有严重联合免疫缺陷病(SCID)小鼠中进行。通过在未处理的96孔微量板上以悬滴方式用移液管移取1000个HUVEC以允许过夜球体形成来制备HUVEC球。次日，收集HUVEC球并在基质胶溶液中与单一HUVEC混合以达到每个注入塞100个球状HUVEC和200,000个单一HUVEC的最终数量。添加最终浓度是1000ng/mL的VEGF165和成纤维细胞生长因子2(FGF-2)。向每个治疗组两只SCID小鼠皮下注射0.5mL细胞/基质悬浮液，所述悬浮液迅速聚合。从第0天(接种细胞/基质之后4小时)开始，每周两次给与抗体。第18天，研究终止。取出基质胶塞，拍照并在室温下于4％三聚甲醛中固定4至12小时。之后，根据标准程序用石蜡包埋所述胶塞。对于组织学检查人类血管结构，由所有胶塞制备石蜡切片(厚度8-10μm)。通过用小鼠抗人类CD34(Dako，目录号M716501)和FITC缀合的兔抗小鼠二次抗体(Dako，目录号F026102)染色来检测人类血管形成。对每个胶塞两个切片进行分析并使用Eclipse TE2000-U显微镜(Nikon)在200×放大率下从各切片获取5个图像。由FITC阳性(CD34阳性)区域的平均百分数测定人类血管结构水平。如图7中所示，V9在体内抑制血管生成的程度与1211B相同(Ref A)。
使用带有人类HCT-116人类结肠癌肿瘤异种移植物的小鼠分析克隆株V1、V9和V10的治疗功效。简单点说，将人类HCT-116人类结肠癌细胞(接种物＝1×106个细胞)植入雌性BALB/c裸小鼠中。将小鼠随机分成7组。每组用下表6中所描述的给药方案中的一种治疗：
表6
在开始治疗之后21天，用V9(100mg/kg)治疗的小鼠体内的肿瘤比接受安慰剂的小鼠体内的肿瘤小约51％，并且用1121B(100mg/kg)治疗的小鼠体内的肿瘤比接受安慰剂的小鼠体内的肿瘤小约61％。在开始治疗之后21天，用V9(50mg/kg)治疗的小鼠体内的肿瘤比接受安慰剂的小鼠体内的肿瘤小约43％，并且用1121B(50mg/kg)治疗的小鼠体内的肿瘤比接受安慰剂的小鼠体内的肿瘤小约31％。参见图8和下表7。
表7
1TV：肿瘤体积
2RTV：相对于初始的肿瘤体积
3TV/CV％：治疗组体积/对照组体积
4TGI％：肿瘤生长抑制率＝1-(T21-T0)/(C21-C0)％
5p值：<0.05＝*<0.01＝**<0.001＝***
接着，将克隆株V9再用于基于体外噬菌体展示的亲和力成熟实验中以产生结合性能改善的另外的克隆株。首先，通过PCR产生CDR-L2/CDR-L3/CDR-H3核酸文库，将其克隆至噬菌体展示载体中，并转化至大肠杆菌中以产生噬菌体文库。在3轮淘选之后，通过ELISA筛选77个Fab克隆株，并且发现有五个克隆株(即，29、30、32、34及67)的结合性能相当于或优于V9(参见图9)。
使用包含以下轻链/重链组合的全长IgG克隆株再进行ELISA：V9/V9、29/V9(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)、34/34(LC/HC)以及67/34(LC/HC)。还测试了1121B和两种阴性对照抗体。在微量滴定盘各孔中，用VEGFR2-Fc捕捉各克隆株、1121B和两种阴性对照抗体的连续稀释液。使用HRP缀合的抗人类κ二次抗体定量各孔中捕捉的抗体量。将HRP缀合的二次抗体添加至各孔中，并在培育之后，洗掉过量的二次抗体。将TMB添加至各孔中，并在培育之后，停止反应，并且通过监测在450nm下吸光度的增加来测量HRP活性(图10A)。34/V9(LC/HC)、34/34(LC/HC)和67/V9(LC/HC)在测试克隆株中展示与VEGFR2的最强结合。
进行第三组ELISA，其中在微量滴定盘各孔中用抗Fd捕捉具有V9/V9、29/V9(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)的全长IgG克隆株、1121B以及两种阴性对照抗体。使用AP缀合的VEGFR2定量各孔中捕捉的抗体量。培育之后，洗掉过量的VEGFR2-AP。将碱性磷酸酶底物添加至各孔中，并在培育之后，停止反应，并且通过监测在405nm下吸光度的增加来测量AP活性(图10B)。34/V9(LC/HC)、34/34(LC/HC)、29/V9(LC/HC)以及29/34(LC/HC)在测试克隆株中展示与VEGFR2的最强结合。
对V9/V9(LC/HC)、34/34(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/34(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)以及29/V9(LC/HC)进行SPR。结果示于下表8A-8C中。
表8A
LC/HC ka(1/(M*s)) kd(1/s) KD(M)
V9/V9 6.53×105 6.37×10-4 9.76×10-10
34/34 8.25×105 3.89×10-4 4.71×10-10
34/V9 7.48×105 2.72×10-4 3.64×10-10
67/34 5.49×105 2.63×10-4 4.79×10-10
67/V9 6.41×105 3.17×10-4 4.94×10-10
29/34 7.97×105 3.36×10-4 4.26×10-10
29/V9 9.64×105 2.10×10-4 2.18×10-10
表8B
表8C
LC/HC ka(1/(M*s)) kd(1/s) KD(M)
V9/V9 8.55×105 5.28×10-4 6.17×10-10
34/34 1.22×106 2.55×10-4 2.09×10-10
34/V9 9.23×105 2.37×10-4 2.57×10-10
67/34 7.98×105 6.53×10-5 8.19×10-11
67/V9 6.69×105 9.00×10-5 1.34×10-10
29/34 8.45×105 9.22×10-5 1.09×10-10
29/V9 9.32×105 2.23×10-4 2.39×10-10
1121B(Ref A) 7.52×105 9.62×10-4 1.28×10-9
29/V9(LC/HC)始终展示比其它测试克隆株强的KD。67/34(LC/HC)始终展示最低koff，并且34/34(LC/HC)始终展示最高kon。相较于V9/V9(LC/LC)，34/34(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/34(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)以及29/V9(LC/HC)都显示出解离的改善。
如上文所描述，使用克隆株V9/V9(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)、1121B(Ref A)、1121N(RefB)以及Avastin进行HUVEC增殖分析。如图11A和11B中所示，34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)和29/V9(LC/HC)在所有测试克隆株中展现出对HUVEC增殖的最强抑制。
如上文所描述，使用克隆株V9/V9(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)、1121B(Ref A)、1121N(RefB)以及Avastin进行HUVEC存活分析。如图12A和12B中所示，34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)和29/V9(LC/HC)在所有测试克隆株中展现出对HUVEC存活的最强抑制。
如上文所描述，使用克隆株V9/V9(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)、1121B(Ref A)、1121N(RefB)以及Avastin进行HUVEC管形成分析。1121N(RefB)展现对HUVEC管形成的最强抑制。相较于29/34(LC/HC)，V9/V9(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)及1121B(Ref A)展现较强的HUVEC管形成。(数据未示出。)
如上文所描述，使用克隆株V9/V9(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/V9(LC/HC)、67/V9(LC/HC)、29/34(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)、1121B(Ref A)、1121N(RefB)以及Avastin进行HUVEC萌芽分析。1121N(Ref B)展现对HUVEC萌芽的最强抑制。67/34(LC/HC)和34/34(LC/HC)对于HUVEC萌芽展现的抑制作用强于1121B(Ref A)。1121B(Ref A)对于HUVEC萌芽展现的抑制作用强于34/V9(LC/HC)。34/V9(LC/HC)对于HUVEC萌芽展现的抑制作用强于V9/V9(LC/HC)和67/34(LC/HC)，而V9/V9(LC/HC)和67/34(LC/HC)展现的萌芽抑制作用强于29/34(LC/HC)。29/V9(LC/HC)未对HUVEC萌芽展示强烈抑制作用。(数据未示出。)
选择克隆株29、34和67并用作产生CDR-H1/CDR-H1/CDR-H2文库的基础。通过PCR产生CDR-H1/CDR-H1/CDR-H2核酸文库，将其克隆至噬菌体展示载体中，并转化至大肠杆菌中以产生噬菌体文库。在两轮淘选之后，通过ELISA筛选出七个克隆株，即80A、80B、86A、86B、88、109、110A及110B，并且发现这些克隆株具有改善的结合特性。
使用包含以下轻链/重链组合的抗VEGFR2抗体克隆株再进行ELISA：V9/V9(LC/HC)、34/80A(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/34(LC/HC)以及67/34(LC/HC)，如下所示：在微量滴定盘各孔中，用抗Fc抗体捕捉各克隆株和1121B(Ref A)的连续稀释液。使用AP缀合的VEGFR定量各孔中捕捉的抗体量。培育之后，洗掉过量的VEGFR2-AP。将碱性磷酸酶底物添加至各孔中，并在培育之后，停止反应，并且通过监测在405nm下吸光度的增加来测量AP活性(图13A和13B)。1121B(Ref A)展示与VEGFR2最强的结合，其次是34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)和34/34(LC/HC)，再次是29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)和29/v9(LC/HC)。
再进行ELISA，其中在微量滴定盘各孔中用抗Fd捕捉V9/V9(LC/HC)、34/80A(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、29/V9(LC/HC)34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)以及1121B。使用AP缀合的VEGFR定量各孔中捕捉的抗体量。培育之后，洗掉过量的VEGFR2-AP。将碱性磷酸酶底物添加至各孔中，并在培育之后，停止反应，并且通过监测在405nm下吸光度的增加来测量AP活性(图13C和13D)。1121B(RefA)展示与VEGFR2最强的结合，其次是34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)和34/34(LC/HC)，再次是29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)和29/v9(LC/HC)。相较于V9，所有测试克隆株都展示与VEGFR2的较强结合(参见图13D)。
进行第三组ELISA。简单点说，在微量滴定盘各孔中用VEGFR2-Fc捕捉V9/V9(LC/HC)、34/80A(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)以及1121B。使用HRP缀合的抗人类κ二次抗体定量各孔中捕捉的抗体量。将HRP缀合的二次抗体添加至各孔中，并在培育之后，洗掉过量的二次抗体。将TMB添加至各孔中，并在培育之后，停止反应，并且通过监测在450nm下吸光度的增加来测量HRP活性(图14A和14B)。34/80A(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/34(LC/HC)以及67/34(LC/HC)展示与VEGFR2的最强结合，其次是V9/V9(LC/HC)和34/86B(LC/HC)。相较于1121B(Ref A)，所有测试克隆株都展示与VEGFR2的较强结合。
再进行ELISA，其中简单点说，用涂布中性抗生物素蛋白的微量滴定盘各孔中固定的生物素化VEGFR2-Fc捕捉V9/V9(LC/HC)、34/80A(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/34(LC/HC)、67/34(LC/HC)以及1121B。使用HRP缀合的抗人类κ二次抗体定量各孔中捕捉的抗体量。将HRP缀合的二次抗体添加至各孔中，并在培育之后，洗掉过量的二次抗体。将TMB添加至各孔中，并在培育之后，停止反应，并且通过监测在450nm下吸光度的增加来测量HRP活性(图14C和14D)。34/80A(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、29/V9(LC/HC)、34/34(LC/HC)以及67/34(LC/HC)展示与VEGFR2的最强结合，其次是V9/V9(LC/HC)和34/86B(LC/HC)。相较于1121B(Ref A)，所有测试克隆株都展示与VEGFR2的较强结合。
对V9/V9(LC/HC)、34/80A(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)及29/V9(LC/HC)进行SPR。结果示于下表9A和9B中。
表9A
LC/HC ka(1/(M*s)) kd(1/s) KD(M)
V9/V9 1.1×106 8.49×10-4 7.74×10-10
34/V9 7.84×105 2.27×10-4 2.89×10-10
34/80A 2.15×105 2.98×10-4 1.38×10-9
表9B
LC/HC ka(1/(M*s)) kd(1/s) KD(M)
V9/V9 7.90×105 8.82×10-4 1.12×10-9
34/80A 4.12×104 1.31×10-4 3.17×10-9
110A/110A 2.28×106 1.88×10-4 8.26×10-11
34/80B 4.88×104 2.44×10-4 5.01×10-09
110B/110B 1.70×106 2.19×10-4 1.29×10-10
29/V9 8.67×105 3.47×10-4 4.01×10-10
相较于其它测试克隆株，110A/110A(LC/HC)展现改善的ka、kd和KD。110A/110B(LC/HC)结合略低于110A/110A(LC/HC)。34/80B(LC/HC)结合略低于34/80A(LC/HC)。
对V9/V9(LC/HC)、34/80A(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)以及29/V9(LC/HC)进行SPR动力学分析。结果示于下表10A-10C中。
表10A
LC/HC ka(1/(M*s)) kd(1/s) KD(M) Rmax
V9/V9 2.02×106 3.94×10-4 1.95×10-10 42
110A/110A 1.80×106 8.76×10-6 4.88×10-12 107
34/86 6.12×105 1.00×10-4 1.64×10-10 79
34/80A 6.12×105 5.75×10-5 9.39×10-11 40
109/109 1.67×106 7.08×10-5 4.25×10-11 118
29/88 8.90×105 7.80×10-5 8.76×10-11 63
表10B
LC/HC ka(1/(M*s)) kd(1/s) KD(M) Rmax KD倍数
V9/V9 9.89×105 3.47×10-4 3.51×10-10 62.9 1
110A/110A 1.64×106 4.78×10-5 2.92×10-11 92.2 12
109/109 1.71×106 7.88×10-5 4.61×10-11 108.4 8
67/V9 6.20×105 6.03×10-5 9.72×10-11 73.3 4
34/34 9.30×105 1.39×10-4 1.49×10-10 69.2 2
表10C
LC/HC ka(1/(M*s)) kd(1/s) KD(M) Rmax KD倍数
V9/V9 9.98×105 4.24×10-4 4.25×10-10 70.69 1.0
110A/110A 1.35×106 1.21×10-4 8.92×10-11 104.93 4.8
109/109 1.54×106 8.19×10-5 5.33×10-11 116.29 8.0
67/V9 6.14×105 7.88×10-5 1.28×10-10 91.8 3.3
34/34 8.92×105 1.38×10-4 1.54×10-10 80.53 2.8
相较于V9/V9，110A/110A(LC/HC)和109/109(LC/HC)始终展示较高的ka和较低的kd。因此，110A/110A(LC/HC)和109/109(LC/HC)的KD较低。此外，110A/110A(LC/HC)和109/109(LC/HC)的Rmax始终较高。
如下评估克隆株34/V9(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)及110B/110B结合HUVEC全细胞的能力：收集HUVEC，用PBS洗涤并在4℃下用三聚甲醛固定30分钟。接着用FACS缓冲液洗涤细胞并将其添加至微量滴定板各孔中，接着离心。将34/V9(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)或110B/110B添加至各孔中并在4℃下培育30分钟。用FACS缓冲液洗涤各孔两次之后，将生物素化的兔抗人类IgG添加至各孔中并在4℃下培育30分钟。再用FACS缓冲液洗涤两次之后，将抗生蛋白链菌素-PE(即，抗生蛋白链菌素与藻红蛋白的缀合物)添加至各孔中并培育。用FACS缓冲液洗涤各孔两次，用4％三聚甲醛固定并离心。丢弃上清液，并将细胞再悬浮于FACS缓冲液中并通过流式细胞术分析。如图15中所示，克隆株110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)和109/109(LC/HC)展现的与HUVEC的结合强于1121N，而1121N展现的与HUVEC的结合强于34/V9(LC/HC)。相较于1121B，所有测试克隆株都展现与HUVEC的较强结合。这些结果对应于以上描述的ELISA结果。
如上文所描述，使用克隆株V9/V9(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、1121B(Ref A)、1121N(Ref B)以及Avastin进行HUVEC增殖分析。如图16A和16B中所示，110A/110A(LC/HC)和110B/110B(LC/HC)在包括1121B(Ref A)和1121N(Ref B)在内的所有测试克隆株中展现对HUVEC增殖的最强抑制。109/109(LC/HC)展现的对HUVEC增殖的抑制作用强于1121N(Ref B)，而1121N展现的对HUVEC增殖的抑制作用强于34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)及V9/V9(LC/HC)。34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/99(LC/HC)及V9/V9(LC/HC)展现的对于HUVEC增殖的抑制作用强于1121B(Ref A)，而1121B展现的对于HUVEC增殖的抑制作用强于34/80A(LC/HC)。
如上文所描述，使用克隆株V9/V9(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、1121B(Ref A)、1121N(Ref B)以及Avastin进行HUVEC存活分析。如图17A和17B中所示，110A/110A(LC/HC)和110B/110B(LC/HC)在包括1121B(Ref A)和1121N(Ref B)在内的所有测试克隆株中展现对HUVEC存活的最强抑制。109/109(LC/HC)展现的对HUVEC存活的抑制作用强于1121N(Ref B)，而1121N展现的对HUVEC存活的抑制作用强于34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)及V9/V9(LC/HC)。34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/99(LC/HC)及V9/V9(LC/HC)展现的对于HUVEC存活的抑制作用强于1121B(Ref A)，而1121B展现的对于HUVEC存活的抑制作用强于34/80A(LC/HC)。
如上文所描述，使用克隆株V9/V9(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、1121B(Ref A)、1121N(Ref B)以及Avastin进行HUVEC管形成分析。1121N(Ref B)在所有测试克隆株中展现对于HUVEC管形成的最强抑制。110A/110A(LC/HC)和110B/110B(LC/HC)展现的对于HUVEC管形成的抑制作用强于Avastin，而Avastin展现的对于HUVEC管形成的抑制作用强于29/88(LC/HC)。29/88(LC/HC)展现的对于HUVEC管形成的抑制作用强于109/109(LC/HC)，而109/109(LC/HC)展现的对于HUVEC管形成的抑制作用强于34/80B(LC/HC)和34/86A(LC/HC)。34/80B(LC/HC)和34/86A(LC/HC)展现的对于HUVEC管形成的抑制作用强于V9/V9(LC/HC)，而V9/V9(LC/HC)展现的对于HUVEC管形成的抑制作用强于34/86B(LC/HC)。
如上文所描述，使用克隆株V9/V9(LC/HC)、34/80B(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、110B/110B(LC/HC)、1121B(Ref A)、1121N(Ref B)以及Avastin进行HUVEC萌芽分析。1121N(Ref B)在所有测试克隆株中展现对于HUVEC萌芽的最强抑制。110A/110A(LC/HC)和110B/110B(LC/HC)展现的对于HUVEC萌芽的抑制作用强于109/109(LC/HC)，而109/109(LC/HC)展现的对于HUVEC萌芽的抑制作用强于34/86A(LC/HC)。34/86A(LC/HC)展现的对于HUVEC萌芽的抑制作用强于34/86B(LC/HC)，而34/86B(LC/HC)展现的对于HUVEC萌芽的抑制作用强于29/88(LC/HC)。29/88(LC/HC)展现的对于HUVEC萌芽的作用强于34/80B(LC/HC)，而34/80B(LC/HC)展现的对于HUVEC萌芽的抑制作用强于V9/V9(LC/HC)。
进行另一组ELISA，相较于1121B(Ref A)、1121N(Ref B)，评估克隆株34/V9(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)及110B/110B(LC/HC)的跨物种活性。使用小鼠VEGFR2-Fc作为捕捉试剂，并且使用HRP缀合的抗人类κ二次抗体定量各孔中捕捉的抗体量。将HRP缀合的二次抗体添加至各孔中，并在培育之后，洗掉过量的二次抗体。将TMB添加至各孔中，并在培育之后，停止反应，并且通过监测在450nm下吸光度的增加来测量HRP活性。图18A和18B显示了一式两份ELISA实验的结果，其中110B/110B对于小鼠VEGFR2显示出最强的结合亲和力。
接下来，进行分析以相较于1121N(Ref B)，评估110/110B(LC/HC)抑制VEGFR2磷酸化的能力。简单点说，将8×105个HUVEC细胞接种于10cm盘中并使其生长至汇合。接着在37℃下，用EBM-2更换培养基以使血清不足。将抗体添加至各盘中并在37℃下培育30分钟。接下来，将25μg/ml VEGF165(eBioscience，目录号68-8784-82)添加至各盘中，在37℃下保持10分钟以刺激VEGFR2。添加VEGF165之后，抽吸出培养基，并用冷PBS洗涤细胞。丢弃PBS，并将细胞溶解缓冲液(Cell Signaling，目录号9803S)+1×Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液(Pierce，目录号PIE78440)+5mM Na3VO4添加至各盘中。在4℃下培育5分钟之后，收集细胞并溶解，进行两个冷冻-解冻循环，并在4℃下以14,000×g离心15分钟。将上清液转移至新管中并使用BCA试剂(Pierce，目录号PIE23225)定量各管中的总蛋白质。将150μg各总溶解产物与5μg IMC-112N(即，Ref B，在室内制备，批号1405090516)一起用于免疫沉淀反应中。在倾斜旋转下，将免疫沉淀反应物在4℃下培育过夜。接着使用蛋白质A珠粒纯化免疫沉淀反应物，洗涤，并通过蛋白质印迹法，使用小鼠抗磷酸酪氨酸(4G10)抗体(Millipore，目录号05-1050)，随后HRP缀合的二次抗体进行分析。添加ECL，并利用x射线胶片检测抗磷酸酪氨酸抗体的结合。接着使用剥离缓冲液(Thermo，目录号21059)剥离膜，并用兔抗VEGFR2(55B11)抗体(Cell Signaling，目录号2479)，随后HRP缀合的二次抗体探测。添加ECL，并利用x射线胶片检测抗VEGFR2抗体的结合。如图19A中所示，相较于110/110B(LC/HC)，1121N(Ref B)以较低浓度较强地抑制VEGFR2磷酸化。图19A的结果在图19B中得到定量。
如上文所描述，进行迁移分析以评估克隆株V9、34/80A(LC/HC)、34/86A(LC/HC)、34/86B(LC/HC)、29/88(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110/110A(LC/HC)及110/110B(LC/HC)抑制HUVEC迁移活性的能力。如图20所示，109/109(LC/HC)展示的对于HUVEC迁移的抑制作用强于1211N(Ref B)。
接下来，进行ELISA实验以确定抗体110/110B是否能够结合VEGFR2家族的其它成员。简单点说，将重组人类VEGFR1-Fc融合蛋白(R&D Systems)固定于96孔板各孔中。向各孔中添加抗体1121N(Ref-B)、抗体110/110B和小鼠抗人类VEGFR1(由10μg/ml稀释3倍)。为了检测所述抗体与固定的VEGFR1-Fc的抗体结合，将山羊抗人类F(ab)'2-HRP或山羊抗小鼠F(ab)'2-HRP添加至各孔中。将TMB添加至各孔中，并在室温下培育5分钟之后，停止反应，并通过监测在450nm下吸光度的增加来测量HRP活性。如图24A中所示，发现110/110B和1121N(Ref-B)都不结合VEGFR1-Fc。
在一组类似的ELISA中，将1121N(Ref-B)、110/110B和小鼠抗人类VEGFR3(由10μg/ml稀释3倍)添加至固定有VEGFR3-Fc(R&D Systems)的96孔板各孔中。为了检测所述抗体与固定的VEGFR3-Fc的抗体结合，将山羊抗人类F(ab)'2-HRP或山羊抗小鼠F(ab)'2-HRP添加至各孔中。将TMB添加至各孔中，并在室温下培育15分钟之后，停止反应，并通过监测在450nm下吸光度的增加来测量HRP活性。如图24B中所示，发现110/110B与人类VEGFR3-Fc的结合活性高于1121N(Ref-B)。
VEGF-C的主要功能之一是在淋巴管生成中，其中其通过VEGFR-3作用于淋巴内皮细胞(LEC)以促进LEC存活、生长和迁移。进行实验以测定抗体110/110B对VEGF-C诱导的人类淋巴内皮细胞(HLEC)增殖的影响。使HLEC(ScienCell；P5)从板脱离，通过离心收集，并将其以3×104个细胞/毫升再悬浮于内皮细胞培养基(ECM)(ScienCell；目录号1001)中。将100μl细胞悬浮液接种于96孔板各孔中(即，达到3000个细胞/孔的计数)。约24小时之后，用PBS洗涤HLEC一次，并将70μl基础内皮细胞培养基(ECM-b)(ScienCell；目录号1001-b)添加至各孔中。将50μL含有1121(Ref-B)、110/110B、的ECM-b以4倍连续稀释液添加至各孔(即，由240μg/ml，达到每孔80μg/ml的最终浓度)中并在37℃下培育30分钟。将30μl的2.5μg/ml VEGF-C(PeproTech，目录号100-20C)添加至一半孔(即，达到每孔500ng的最终浓度)中，并在37℃和5％CO2下培育板约3天(72小时)。将30μl MTS/PMS混合物(MTS(四唑盐化合物)：Promega，目录号G1112；PMS(电子偶合试剂)：GeneLabs，目录号AC-A2212.0005)添加至各孔中，并在37℃下培育板3.5小时。利用在代谢活性细胞中发现的脱氢酶实现MTS向甲的转化。由490nm吸光度量测量的甲产物的量与培养物中活细胞的数量成正比。如图25中所示，1121N(Ref-B)和110/110B都抑制VEGF-C诱导的HELC增殖。
接下来，如下测定抗体110/110B对VEGF-C刺激的VEGFR2磷酸化的影响：将1×106个HLEC(ScienCell：P5)接种至10cm盘上并使其在内皮细胞培养基(ECM)(ScienCell；目录号1001)中生长至80-90％汇合。接着，用ECM-b(ScienCell；目录号#1001-b)更换培养基并在37℃下培育过夜。将抗体1121N(Ref-B)或110/110B添加至两组盘中。在一组盘中，添加0.288μg/ml抗体以达到50mM最终浓度，并且在第二组盘中，添加7.2μg/ml抗体以达到2mM最终浓度。添加200mg/ml VEGF-C(PeproTech；目录号100-210C)并在37℃下培育盘10分钟以刺激VEGFR2磷酸化。培育之后，抽吸出培养基，并用冷1×PBS洗涤各盘一次。丢弃PBS之后，将300-400μl细胞溶解缓冲液(CellSignaling；目录号9803S)添加至各盘中，随后添加1×HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液(Pierce；目录号PIE78440)和5mM Na3VO4。在4℃下培育5分钟之后，收集各盘的各细胞溶解产物并通过27G针进行均质化。将均质化的细胞溶解产物转移至管中，在干冰上进行两个冷冻-解冻循环，并且接着在4℃下以14,000×g离心15分钟。将上清液转移至新管中，并利用BCA试剂(Pierce；目录号PIE23225)测量各管中的总蛋白质浓度。
在免疫沉淀实验中使用150μg各溶解产物，该实验进行如下：将5μg抗体1121N(RefB)添加至各溶解产物中并在倾斜旋转下，在4℃下培育过夜。接下来，将树脂添加至各抗体/溶解产物混合物中并在倾斜旋转下，在4℃下培育2小时。接着，将所述混合物分别添加至Pierce Micro-A Pin柱(Pierce；目录号89879)中，并以2000×g离心所述柱1分钟。接着用500μl洗涤缓冲液(0.02％PBST+5mM Na3VO4)洗涤柱5次。将10-15μl5×样品缓冲液添加至每一树脂A样品中，并在95℃下将混合物煮沸5分钟。对各样品进行短暂离心(spun)以使树脂A集结，并且在6％SDS-PAGE凝胶上解析各样品。接着，使用标准方法将蛋白质转印至PVDF上。转印后，用5％BSA/PBS阻断膜。
首先，用在1％BSA/0.05PBST中1000倍稀释的小鼠抗磷酸酪氨酸(4G10)(Millipore：目录号05-1050)探测膜，并在0.1％PBST中洗涤三次，历时5分钟。接下来，在室温下，用在0.05％PBST中1000倍的山羊抗小鼠IgG(H+L)探测膜1小时并在0.1％PBST中洗涤三次，历时5分钟。添加ECL，并利用x射线胶片检测抗磷酸酪氨酸抗体的结合。
在室温下，用剥离缓冲液(Thermo；目录号21059)剥离膜，保持15分钟，并用0.05％PBST洗涤5分钟。接着，再次用5％BSA/PBS阻断膜。
接下来，用在1％BSA/0.05PBST中1000倍稀释的兔抗VEGFR2(55BB1)(CellSignaling；目录号2479)探测膜，并在0.1％PBST中洗涤三次，历时5分钟。接下来，在室温下，用在0.05％PBST中1000倍的山羊抗兔IgG(H+L)探测膜1小时并在0.1％PBST中洗涤三次，历时5分钟。添加ECL，并利用x射线胶片检测抗磷酸酪氨酸抗体的结合。
如图26A中所示，1121N(Ref B)和110/110B都可以抑制VEGF-C刺激的VEGFR2磷酸化。图26A的定量结果显示于图26B中。抗体1121N(Ref B)对于VEGFR2磷酸化的抑制作用强于抗体110/110B。
进行类似实验以测定抗体110/110B对VEGF-C刺激的VEGFR3磷酸化的影响。如上文所描述，在免疫沉淀中使用1μl山羊抗人类VEGFR3(R&D；目录号AF349)或3μl小鼠抗VEGF3(Millipore；目录号MAB3757)代替5μg抗体1121N(Ref B)；并且使用蛋白质G和蛋白质A珠粒使抗体/VEGFR3复合物沉淀；并使用1000倍稀释的小鼠抗VEGFR3(Millipore；目录号MAB3575)代替小鼠抗VEGFR2探测磷酸化的VEGF3，来进行实验。如图27A中所示，抗体1121N(Ref B)和抗体110/110B都可以抑制VEGF-C刺激的VEGFR3磷酸化。在显示图27A的定量结果的图27B中，已显示较低浓度的110/110B对于VEGFR3磷酸化的抑制作用高于较低浓度的1121N(Ref B)。
使用带有人类HCT-116人类结肠癌肿瘤异种移植物的小鼠，相较于1121B(即，RefA)、1121N(即，Ref B)和安慰剂，分析克隆株34/V9(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)及110B/110B(LC/HC)的治疗功效。简单点说，将人类HCT-116人类结肠癌细胞(接种物＝1×106个细胞)植入雌性BALB/c裸小鼠中。将小鼠随机分成7组。每组用下表11中所描述的给药方案中的一种治疗：
表11
在开始治疗之后46天，相较于34/V9(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、121B(即，Ref A)、1121N(即，Ref B)及安慰剂，用110B/110B(100mg/kg)治疗的小鼠展示肿瘤负荷的最大幅度减小。用110B/110B(100mg/kg)治疗的小鼠展示的肿瘤负荷减小程度要大于用109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、121B(即，Ref A)及安慰剂治疗的小鼠。参见图21和下表12。
表12
1TV：肿瘤体积
2RTV：相对于初始的肿瘤体积
3TV/CV％：治疗组体积/对照组体积
4TGI％：肿瘤生长抑制率＝＝1-(T46-T0)/(C46-C0)％
5p值：<0.05＝*<0.01＝**<0.001＝***
本文中提供了由表11中描述的异种移植实验得到的另外的数据。如图22和下表13中所示，在开始治疗之后42天，相较于34/V9(LC/HC)、109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、121B(即，Ref A)、1121N(即，Ref B)及安慰剂，用110B/110B(100mg/kg)治疗的小鼠展示肿瘤负荷的最大幅度减小。用110B/110B(100mg/kg)治疗的小鼠展示的肿瘤负荷减小程度要大于用109/109(LC/HC)、110A/110A(LC/HC)、121B(即，Ref A)及安慰剂治疗的小鼠。
表13
1TV：肿瘤体积
2RTV：相对于初始的肿瘤体积
3TV/CV％：治疗组体积/对照组体积
4TGI％：肿瘤生长抑制率＝1-(T42-T0)/(C42-C0)％
5p值：<0.05＝*<0.01＝**<0.001＝***
在表15中所列浓度下制备抗体34/V9和抗体110/110B的四种配制物(即，如下表14中所述的F1-F4)并在-80℃或40℃下储存两周进行测试。
表14
缓冲液 赋形剂 PH
F1 10mM组氨酸 75mM NaCl、1％甘氨酸、2％蔗糖、0.02％Tween 80 6
F2 10mM柠檬酸盐 75mM NaCl、2％甘氨酸、2％蔗糖、0.02％Tween 80 6
F3 10mM乙酸盐 75mM NaCl、2％甘氨酸、2％蔗糖、0.02％Tween 80 6
F4 10mM磷酸盐 75mM NaCl、1％甘氨酸、2％蔗糖、0.02％Tween 80 6
表15
接着，通过在还原和非还原条件下电泳来分析在每种储存条件下来自各配制物的抗体的样品。如图23A中所示，抗体34/V9的稳定性在F2配制物中最高。34/V9的稳定性在F3中和在F4中大致相当，并且34/V9在F1中最不稳定。关于抗体110/110B观察到相同结果。参见图23B。
使用带有人类NCI-H460非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤异种移植物的小鼠，相较于安慰剂分析110B/110B的治疗功效。简单点说，将人类NCI-H460NSCLC细胞(接种物＝3×106个细胞)植入雌性BALB/c裸小鼠中。将小鼠随机分成4组。每组用下表16中所描述的给药方案中的一种治疗：
表16
在开始治疗之后21天，相较于用110/110B(50mg/kg)、110/110B(25mg/kg)及安慰剂治疗的小鼠，用110/110B(100mg/kg)治疗的小鼠展示肿瘤负荷的最大幅度减小。参见图28和下表17。
表17
1TV：肿瘤体积
2RTV：相对于初始的肿瘤体积
3TV/CV％：治疗组体积/对照组体积
4TGI％：肿瘤生长抑制率＝1-(T42-T0)/(C42-C0)％
5p值：<0.05＝*<0.01＝**<0.001＝***
前述实例只是出于说明目的提供，并且不打算以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员根据前文描述将显而易知除本文所显示和描述的修改之外的本发明的各种修改，并且这些修改在所附权利要求书的范围内。
实施例清单
1.一种抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不阻断VEGFR2与VEGF的结合。
2.一种抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合VEGFR2的结构域5-7。
3.一种抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不阻断VEGFR2与VEGF的结合，并且其中所述抗体或其抗原结合片段结合VEGFR2的结构域5-7。
4.根据实施例1至3中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合至整个HUVEC细胞。
5.根据实施例1至4中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在体外不抑制血管生成。
6.根据实施例1至4中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在体内抑制血管生成。
7.根据实施例1至4中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在体外不抑制血管生成，并且其中所述抗体或其抗原结合片段在体内抑制血管生成。
8.一种抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体或其抗原结合片段，包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQNIASYLN(SEQ ID NO:76)或RASQSVS-S/N-S/N-YL-G/A(SEQ ID NO:83)或TRSRGSIASSYVQ(SEQ ID NO:80)或RSSQSL-L/V/Y-H/Y-G/S/R-D/N-G-N/K/Y-N/T-Y/F-LD(SEQ ID NO:84)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/A/G/K/E-G/A/V/N/S-S/D-N/S/Q/K-R/L-A/K/D/P-S/T(SEQ ID NO:60)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/Q-Q/S-A/S/R/G/Y-L/Y/S/A/D/G/T-Q/S/N/H/F-T/I/W/S-P/T-Y/L/P/V/G/I-T/V(SEQ ID NO:72)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列T/S-Y-Y/G/A/S-M/I-H/N/S(SEQ ID NO:34)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I/V/G/S-I-N/S/I-P/Y/S/G-S/D/I-G/F/S-G/S-S/N/T/Y/A-T/K/A/I-S/Y/N/H-YA-Q/D-K/S-F/V-K/Q-G(SEQ ID NO:40)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列GLWFGEGY(SEQ ID NO:49)或ESYGGQFDY(SEQ ID NO:43)或DLVVPAATLDY(SEQ ID NO:42)或D/G-F/I-Y/I-E/V-A/G-G/P-G/T-W/D-Y/A-FD-L/I(SEQ ID NO:51)或RDGSLGVGYYYMDF(SEQ ID NO:50)或VGATTSLYYYYGMDV(SEQ ID NO:47)或DGFGLAVAGPYWYFDL(SEQ ID NO:44)或PTRSRDFWSGLGYYYYMDV(SEQ ID NO:45)的CDR-H3。
9.根据实施例8所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含选自由SEQ ID NO:75-82组成的组的氨基酸序列的CDR-L1；(2)含选自由SEQ ID NO:54-59组成的组的氨基酸序列的CDR-L2；及(3)含选自由SEQ ID NO:63-71组成的组的氨基酸序列的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含选自由SEQ ID NO:29-33和85组成的组的氨基酸序列的CDR-H1；(2)含选自由SEQ ID NO:35-39和125组成的组的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)含选自由SEQ ID NO:42-50组成的组的氨基酸序列的CDR-H3。
10.根据实施例1或2所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RSSQSLLHGNGNNYLD(SEQ ID NO:75)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列LGSNRAS(SEQ ID NO:54)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQALQTPYT(SEQ ID NO:63)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列TYYMH(SEQ ID NO:29)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列IINPSGGSTSYAQKFQG(SEQ ID NO:36)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列DLVVPAATLDY(SEQ ID NO:42)的CDR-H3。
11.根据实施例8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQNIASYLN(SEQ ID NO:76)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列AASSLKS(SEQ ID NO:55)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QQSYSIPYT(SEQ ID NO:64)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYGMH(SEQ ID NO:30)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:37)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列ESYGGQFDY(SEQ ID NO:43)的CDR-H3。
12.根据实施例8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQSVSNNYLG(SEQ ID NO:77)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO:56)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QQRSNWPLT(SEQ ID NO:65)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYAMH(SEQ ID NO:31)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:37)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列DGFGLAVAGPYWYFDL(SEQ ID NO:44)的CDR-H3。
13.根据实施例8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RSSQSLVYSDGKTYLD(SEQ ID NO:78)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列KVSNRDS(SEQ ID NO:57)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGAHWPPT(SEQ ID NO:66)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYAIS(SEQ ID NO:85)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:38)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列PTRSRDFWSGLGYYYYMDV(SEQ ID NO:45)的CDR-H3。
14.根据实施例8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO:79)的CDR-L1；(2)含GASSRAT(SEQ ID NO:56)中所述氨基酸序列的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QQRSNWPPT(SEQ ID NO:67)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYGMH(SEQ ID NO:30)的CDR-H1；(2)含VISYDGSNKHYADSVKG(SEQ ID NO:125)中所述氨基酸序列的CDR-H2；及(3)含DFYEAGGWYFDL(SEQ ID NO:46)中所述氨基酸序列的CDR-H3。
15.根据实施例8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列TRSRGSIASSYVQ(SEQ ID NO:80)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列ENDQRPS(SEQ ID NO:58)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QSYDFSTVV(SEQ ID NO:68)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYAIS(SEQ ID NO:85)的CDR-H1；(2)含GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:38)中所述氨基酸序列的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列VGATTSLYYYYGMDV(SEQ ID NO:47)的CDR-H3。
16.根据实施例8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO:79)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO:56)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QQYGSSPGT(SEQ ID NO:69)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYSMN(SEQ ID NO:28)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列SISSSSSYIYYADSVKG(SEQ ID NO:35)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列GIIVGPTDAFDI(SEQ ID NO:48)的CDR-H3。
17.根据实施例8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RSSQSLYYRDGYTFLD(SEQ ID NO:81)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列LSSKRDS(SEQ ID NO:59)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:70)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列TYAMS(SEQ ID NO:33)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列GISGSGGATHYADSVKG(SEQ ID NO:39)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列GLWFGEGY(SEQ ID NO:49)的CDR-H3。
18.根据实施例8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RSSQSLLYSNGYNYLD(SEQ ID NO:82)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列LGSNRAS(SEQ ID NO:54)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQALQTPIT(SEQ ID NO:71)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYAIS(SEQ ID NO:85)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:38)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列RDGSLGVGYYYMDF(SEQ ID NO:50)的CDR-H3。
19.一种抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体或抗原结合片段，其为抗VEGFR2抗体的变体，包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3，其中所述变体在SEQ ID NO:22、23、24、25、26和/或27中的一个或更多个中包含至少一个氨基酸取代。
20.一种抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体或其抗原结合片段，其竞争性抑制第二抗VEGFR2抗体与VEGFR2的结合，其中所述第二抗VEGFR2抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3。
21.一种抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至VEGFR2中与针对VEGFR2的第二抗VEGFR2抗体相同的表位，其中所述第二抗VEGFR2抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3。
22.根据实施例20或21所述的抗VEGFR2抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3，其中所述变体在SEQ ID NO:22、23、24、25、26和/或27中的一个或更多个中包含至少一个氨基酸取代。
23.根据实施例20至22中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含选自由SEQ ID NO:1和16组成的氨基酸序列的CDR-L1；(2)含选自由SEQ ID NO:2、7和8组成的氨基酸序列的CDR-L2；及(3)含选自由SEQ ID NO:3、9和12组成的氨基酸序列的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含选自由SEQ ID NO:4、13、14及15组成的氨基酸序列的CDR-H1；(2)含选自由SEQ ID NO:5、7、17、18、19、20及21组成的氨基酸序列的CDR-H2；(3)含选自由SEQ ID NO:6、10和11组成的氨基酸序列的CDR-H3。
24.根据实施例20至22中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列LSS(SEQ ID NO:2)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
25.根据实施例20至22中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
26.根据实施例20至22中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQ ID NO:10)的CDR-H3。
27.根据实施例20至22中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
28.根据实施例20至22中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
29.根据实施例20至22中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRSGYTF(SEQ ID NO:16)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RFSFSTYA(SEQ ID NO:15)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGQAT(SEQ ID NO:20)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
30.根据实施例20至22中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRSGYTF(SEQ ID NO:16)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGTT(SEQID NO:21)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
31.根据实施例20至22中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRSGYTF(SEQ ID NO:16)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGTT(SEQID NO:21)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQ ID NO:10)的CDR-H3。
32.根据实施例1至31中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含人类IgG的Fc序列。
33.根据实施例1至32中任一个所述的抗VEGFR2抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab)'2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双抗体及线性抗体。
34.根据实施例1至33中任一个所述的抗VEGFR2抗体，其中所述抗体是多特异性抗体。
35.根据实施例1至34中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其与治疗剂缀合。
36.根据实施例1至34中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其与标记缀合。
37.根据实施例36所述的抗VEGFR2抗体，其中所述标记选自由以下组成的组：放射性同位素、荧光染料和酶。
38.一种编码根据实施例1至34中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。
39.一种编码根据实施例38所述的核酸分子的表达载体。
40.一种包含根据实施例39所述的表达载体的细胞。
41.一种产生抗VEGFR2的方法，包括培养根据实施例40所述的细胞以及从所述细胞培养物回收所述抗VEGFR2。
42.一种组合物，包含根据实施例1至35中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂。
43.一种检测来自患者的样品中的VEGFR2蛋白质的方法，所述方法是通过使根据实施例1至34和36至37中任一个所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段与所述样品接触以及检测结合至所述VEGFR2蛋白质的所述抗VEGFR2抗体来进行。
44.根据实施例43所述的方法，其中所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段被用于免疫组织化学分析(IHC)中或ELISA分析中。
45.一种治疗对象的以过度血管生成为特征的病理病况的方法，包括向所述对象施用有效量的根据实施例42所述的组合物。
46.根据实施例45所述的方法，其中所述以过度血管生成为特征的病理病况选自由以下组成的组：癌症、眼部疾病或炎症。
47.根据实施例46所述的方法，其中所述以过度血管生成为特征的病理病况是癌症。
48.根据实施例47所述的方法，其中所述癌症是结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌或实体肿瘤。
49.根据实施例48所述的方法，其中所述癌症是肺癌，并且其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
50.根据实施例45至49所述的方法，其中另外向所述对象施用选自由以下组成的组的治疗剂：抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂及细胞毒性剂。
序列表
<110> 姜伟东
林佩桦
曾琪铃
<120> 抗血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）抗体
<130> 719902000240
<140> 还未分配
<141> 与此同时
<150> 62/187,204
<151> 2015-06-30
<160> 125
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
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1
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<221> 变体
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<220>
<221> 变体
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<220>
<221> 变体
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<223> 合成构建体
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Ser Tyr Ala Met His
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<221> 变体
<222> 1
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<220>
<221> 变体
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<220>
<221> 变体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
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1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
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1 5 10 15
Gly
<210> 38
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
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<220>
<221> 变体
<222> 3
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<220>
<221> 变体
<222> 4
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<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> Xaa = S、D或I
<220>
<221> 变体
<222> 6
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<220>
<221> 变体
<222> 7
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<220>
<221> 变体
<222> 8
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<220>
<221> 变体
<222> 9
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<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = S、Y、N或H
<220>
<221> 变体
<222> 13
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<220>
<221> 变体
<222> 14
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<220>
<221> 变体
<222> 15
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<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> Xaa = K或Q
<400> 40
Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Gly
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Asp Leu Val Val Pro Ala Ala Thr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Glu Ser Tyr Gly Gly Gln Phe Asp Tyr
1 5
<210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Asp Gly Phe Gly Leu Ala Val Ala Gly Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10 15
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Pro Thr Arg Ser Arg Asp Phe Trp Ser Gly Leu Gly Tyr Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Asp Phe Tyr Glu Ala Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Val Gly Ala Thr Thr Ser Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Gly Ile Ile Val Gly Pro Thr Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Gly Leu Trp Phe Gly Glu Gly Tyr
1 5
<210> 50
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Arg Asp Gly Ser Leu Gly Val Gly Tyr Tyr Tyr Met Asp Phe
1 5 10
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = D或G
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> Xaa = F或I
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa = Y或I
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa = E或V
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> Xaa = A或G
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = G或P
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = G或T
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> Xaa = W或D
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> Xaa = Y或A
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = L或I
<400> 51
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Xaa
1 5 10
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr
1 5
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Ala Ala Ser Ser Leu Lys Ser
1 5
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser
1 5
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Glu Asn Asp Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Leu Ser Ser Lys Arg Asp Ser
1 5
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = L、A、G、K或E
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> Xaa = G、A、V、N或S
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa = S或D
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa = N、S、Q或K
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> Xaa = R或L
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = A、K、D或P
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = S或T
<400> 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Leu Gln His Asn Thr Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
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1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
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<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<221> 变体
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<220>
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<220>
<221> 变体
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<220>
<221> 变体
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<220>
<221> 变体
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<220>
<221> 变体
<222> 7
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<220>
<221> 变体
<222> 8
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<220>
<221> 变体
<222> 9
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Asp
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<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn Tyr Leu Gly
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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<211> 13
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Thr Arg Ser Arg Gly Ser Ile Ala Ser Ser Tyr Val Gln
1 5 10
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<211> 16
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Tyr Arg Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Asp
1 5 10 15
<210> 82
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
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<220>
<223> 合成构建体
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<221> 变体
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<221> 变体
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Xaa Xaa Tyr Leu Xaa
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 7
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<220>
<221> 变体
<222> 8
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<220>
<221> 变体
<222> 9
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<220>
<221> 变体
<222> 10
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<220>
<221> 变体
<222> 12
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<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> Xaa = N或T
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> Xaa = Y或F
<400> 84
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Leu Asp
1 5 10 15
<210> 85
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 86
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly
20 25 30
Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn
<210> 87
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ala Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Leu Gly Asn
145 150 155
<210> 88
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155
<210> 89
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asp Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Ser
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Ala His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn
<210> 90
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155
<210> 91
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 91
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Val Ser Cys Thr Arg Ser Arg Gly Ser Ile Ala Ser Ser
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Arg Ser Pro Thr Asn Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Val Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Glu Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Phe
85 90 95
Ser Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly
<210> 92
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Val Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155
<210> 93
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Tyr Arg
20 25 30
Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ser Ser Lys Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn
<210> 94
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 94
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn
<210> 95
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Val Val Pro Ala Ala Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 96
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 96
Glu Val Gln Leu Val Gln Thr Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Tyr Gly Gly Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Pro Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 97
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Phe Gly Leu Ala Val Ala Gly Pro Tyr Trp Tyr Phe
100 105 110
Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr
<210> 98
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Gly Pro Thr Arg Ser Arg Asp Phe Trp Ser Gly Leu Gly Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
130 135 140
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Glu Pro Val Thr
165
<210> 99
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Phe Tyr Glu Ala Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 100
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Gly Ala Thr Thr Ser Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr
<210> 101
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ile Ile Val Gly Pro Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 102
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 102
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 103
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
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<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Phe Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155
<210> 105
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155
<210> 106
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
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<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Tyr Arg
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<211> 163
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Tyr Arg
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Ser Gly Asn
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<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Tyr Arg
20 25 30
Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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65 70 75 80
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Ser Gly Asn
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<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 110
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Tyr Arg
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Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Gly Asn
<210> 111
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 111
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Tyr Arg
20 25 30
Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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100 105 110
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Ser Gly Asn
<210> 112
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Tyr Arg
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
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Ser Gly Asn
<210> 113
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Tyr Arg
20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Ser Ser Lys Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn
<210> 114
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 115
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 116
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Tyr
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145 150 155
<210> 117
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 117
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
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115 120 125
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130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 118
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 118
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 119
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Tyr
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130 135 140
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145 150 155
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<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 121
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Leu Trp Phe Gly Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 122
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gln Ala Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Asn
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Leu Trp Phe Gly Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 123
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Asn
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Leu Trp Phe Gly Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 124
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Asn
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Leu Trp Phe Gly Glu Gly Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly

Claims (50)

1.一种抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不阻断VEGFR2与VEGF的结合。
2.一种抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合VEGFR2的结构域5-7。
3.一种抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不阻断VEGFR2与VEGF的结合，并且其中所述抗体或其抗原结合片段结合VEGFR2的结构域5-7。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合至整个HUVEC细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在体外不抑制血管生成。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在体内抑制血管生成。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在体外不抑制血管生成，并且其中所述抗体或其抗原结合片段在体内抑制血管生成。
8.一种抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体或其抗原结合片段，包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQNIASYLN(SEQ ID NO:76)或RASQSVS-S/N-S/N-YL-G/A(SEQ ID NO:83)或TRSRGSIASSYVQ(SEQ ID NO:80)或RSSQSL-L/V/Y-H/Y-G/S/R-D/N-G-N/K/Y-N/T-Y/F-LD(SEQ ID NO:84)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/A/G/K/E-G/A/V/N/S-S/D-N/S/Q/K-R/L-A/K/D/P-S/T(SEQ ID NO:60)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/Q-Q/S-A/S/R/G/Y-L/Y/S/A/D/G/T-Q/S/N/H/F-T/I/W/S-P/T-Y/L/P/V/G/I-T/V(SEQ ID NO:72)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列T/S-Y-Y/G/A/S-M/I-H/N/S(SEQ ID NO:34)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I/V/G/S-I-N/S/I-P/Y/S/G-S/D/I-G/F/S-G/S-S/N/T/Y/A-T/K/A/I-S/Y/N/H-YA-Q/D-K/S-F/V-K/Q-G(SEQ ID NO:40)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列GLWFGEGY(SEQ ID NO:49)或ESYGGQFDY(SEQ ID NO:43)或DLVVPAATLDY(SEQ ID NO:42)或D/G-F/I-Y/I-E/V-A/G-G/P-G/T-W/D-Y/A-FD-L/I(SEQ ID NO:51)或RDGSLGVGYYYMDF(SEQ ID NO:50)或VGATTSLYYYYGMDV(SEQ IDNO:47)或DGFGLAVAGPYWYFDL(SEQ ID NO:44)或PTRSRDFWSGLGYYYYMDV(SEQ ID NO:45)的CDR-H3。
9.根据权利要求8所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含选自由SEQ ID NO:75-82组成的组的氨基酸序列的CDR-L1；(2)含选自由SEQID NO:54-59组成的组的氨基酸序列的CDR-L2；及(3)含选自由SEQ ID NO:63-71组成的组的氨基酸序列的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含选自由SEQ ID NO:29-33和85组成的组的氨基酸序列的CDR-H1；(2)含选自由SEQ ID NO:35-39和125组成的组的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)含选自由SEQ ID NO:42-50组成的组的氨基酸序列的CDR-H3。
10.根据权利要求1或2所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RSSQSLLHGNGNNYLD(SEQ ID NO:75)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列LGSNRAS(SEQ ID NO:54)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQALQTPYT(SEQ ID NO:63)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列TYYMH(SEQ ID NO:29)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列IINPSGGSTSYAQKFQG(SEQ ID NO:36)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列DLVVPAATLDY(SEQ ID NO:42)的CDR-H3。
11.根据权利要求8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQNIASYLN(SEQ ID NO:76)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列AASSLKS(SEQ ID NO:55)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QQSYSIPYT(SEQ ID NO:64)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYGMH(SEQ ID NO:30)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:37)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列ESYGGQFDY(SEQ ID NO:43)的CDR-H3。
12.根据权利要求8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQSVSNNYLG(SEQ ID NO:77)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO:56)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QQRSNWPLT(SEQ ID NO:65)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYAMH(SEQ ID NO:31)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:37)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列DGFGLAVAGPYWYFDL(SEQ ID NO:44)的CDR-H3。
13.根据权利要求8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RSSQSLVYSDGKTYLD(SEQ ID NO:78)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列KVSNRDS(SEQ ID NO:57)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGAHWPPT(SEQ ID NO:66)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYAIS(SEQ ID NO:85)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:38)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列PTRSRDFWSGLGYYYYMDV(SEQ ID NO:45)的CDR-H3。
14.根据权利要求8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO:79)的CDR-L1；(2)含GASSRAT(SEQ ID NO:56)中所述氨基酸序列的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QQRSNWPPT(SEQ ID NO:67)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYGMH(SEQ ID NO:30)的CDR-H1；(2)含VISYDGSNKHYADSVKG(SEQ ID NO:125)中所述氨基酸序列的CDR-H2；及(3)含DFYEAGGWYFDL(SEQ ID NO:46)中所述氨基酸序列的CDR-H3。
15.根据权利要求8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列TRSRGSIASSYVQ(SEQ ID NO:80)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列ENDQRPS(SEQ ID NO:58)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QSYDFSTVV(SEQ ID NO:68)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYAIS(SEQ ID NO:85)的CDR-H1；(2)含GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:38)中所述氨基酸序列的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列VGATTSLYYYYGMDV(SEQ ID NO:47)的CDR-H3。
16.根据权利要求8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO:79)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO:56)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列QQYGSSPGT(SEQ ID NO:69)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYSMN(SEQ ID NO:28)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列SISSSSSYIYYADSVKG(SEQ ID NO:35)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列GIIVGPTDAFDI(SEQ ID NO:48)的CDR-H3。
17.根据权利要求8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RSSQSLYYRDGYTFLD(SEQ ID NO:81)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列LSSKRDS(SEQ ID NO:59)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:70)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列TYAMS(SEQ ID NO:33)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列GISGSGGATHYADSVKG(SEQ ID NO:39)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列GLWFGEGY(SEQ ID NO:49)的CDR-H3。
18.根据权利要求8或9所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RSSQSLLYSNGYNYLD(SEQ ID NO:82)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列LGSNRAS(SEQ ID NO:54)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQALQTPIT(SEQ ID NO:71)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列SYAIS(SEQ ID NO:85)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:38)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列RDGSLGVGYYYMDF(SEQ ID NO:50)的CDR-H3。
19.一种抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体或抗原结合片段，其为抗VEGFR2抗体的变体，包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3，其中所述变体在SEQ ID NO:22、23、24、25、26和/或27中的一个或更多个中包含至少一个氨基酸取代。
20.一种抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体或其抗原结合片段，其竞争性抑制第二抗VEGFR2抗体与VEGFR2的结合，其中所述第二抗VEGFR2抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3。
21.一种抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至VEGFR2中与针对VEGFR2的第二抗VEGFR2抗体相同的表位，其中所述第二抗VEGFR2抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQ ID NO:22)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3。
22.根据权利要求20或21所述的抗VEGFR2抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYR-D/S-GYTF(SEQID NO:22)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列L/Q/R-SS(SEQ ID NO:23)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列M/L/F-QGTHWPYT(SEQ ID NO:24)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列G/R-F-S/T/P-FSTYA(SEQ ID NO:25)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列I-S/N-G-S/N-G/S-G/Q-A/T-T(SEQ ID NO:26)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEG-Y/L/I(SEQ ID NO:27)的CDR-H3，其中所述变体在SEQ ID NO:22、23、24、25、26和/或27中的一个或更多个中包含至少一个氨基酸取代。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含选自由SEQ ID NO:1和16组成的氨基酸序列的CDR-L1；(2)含选自由SEQ ID NO:2、7和8组成的氨基酸序列的CDR-L2；及(3)含选自由SEQ ID NO:3、9和12组成的氨基酸序列的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含选自由SEQ ID NO:4、13、14及15组成的氨基酸序列的CDR-H1；(2)含选自由SEQ ID NO:5、7、17、18、19、20及21组成的氨基酸序列的CDR-H2；(3)含选自由SEQ ID NO:6、10和11组成的氨基酸序列的CDR-H3。
24.根据权利要求20至22中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列LSS(SEQ ID NO:2)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；并且重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
25.根据权利要求20至22中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
26.根据权利要求20至22中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQ ID NO:10)的CDR-H3。
27.根据权利要求20至22中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
28.根据权利要求20至22中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRDGYTF(SEQ ID NO:1)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列LQGTHWPYT(SEQ ID NO:9)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGGAT(SEQ ID NO:5)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
29.根据权利要求20至22中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列QSLYYRSGYTF(SEQ ID NO:16)的CDR-L1；(2)含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及(3)含氨基酸序列MQGTHWPYT(SEQ ID NO:3)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括(1)含氨基酸序列RFSFSTYA(SEQ ID NO:15)的CDR-H1；(2)含氨基酸序列ISGSGQAT(SEQ ID NO:20)的CDR-H2；及(3)含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
30.根据权利要求20至22中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRSGYTF(SEQ ID NO:16)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGTT(SEQ ID NO:21)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGY(SEQ ID NO:6)的CDR-H3。
31.根据权利要求20至22中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列，所述轻链可变结构域序列包括含氨基酸序列QSLYYRSGYTF(SEQ ID NO:16)的CDR-L1；含氨基酸序列QSS(SEQ ID NO:7)的CDR-L2；及含氨基酸序列FQGTHWPYT(SEQ ID NO:12)的CDR-L3；和重链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包括含氨基酸序列GFSFSTYA(SEQ ID NO:4)的CDR-H1；含氨基酸序列ISGSGGTT(SEQ ID NO:21)的CDR-H2；及含氨基酸序列KGLWFGEGL(SEQ ID NO:10)的CDR-H3。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含人类IgG的Fc序列。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的抗VEGFR2抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab)'2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双抗体及线性抗体。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的抗VEGFR2抗体，其中所述抗体是多特异性抗体。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其与治疗剂缀合。
36.根据权利要求1至34中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段，其与标记缀合。
37.根据权利要求36所述的抗VEGFR2抗体，其中所述标记选自由以下组成的组：放射性同位素、荧光染料和酶。
38.一种编码根据权利要求1至34中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。
39.一种编码根据权利要求38所述的核酸分子的表达载体。
40.一种包含根据权利要求39所述的表达载体的细胞。
41.一种产生抗VEGFR2的方法，包括培养根据权利要求40所述的细胞以及从所述细胞培养物回收所述抗VEGFR2。
42.一种组合物，包含根据权利要求1至35中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂。
43.一种检测来自患者的样品中的VEGFR2蛋白质的方法，所述方法是通过使根据权利要求1至34和36至37中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段与所述样品接触以及检测结合至所述VEGFR2蛋白质的所述抗VEGFR2抗体来进行。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段被用于免疫组织化学分析(IHC)中或ELISA分析中。
45.一种治疗对象的以过度血管生成为特征的病理病况的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求42所述的组合物。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述以过度血管生成为特征的病理病况选自由以下组成的组：癌症、眼部疾病或炎症。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述以过度血管生成为特征的病理病况是癌症。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述癌症是结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胃食管癌、膀胱癌、肺癌或实体肿瘤。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述癌症是肺癌，并且其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
50.根据权利要求45至49所述的方法，其中另外向所述对象施用选自由以下组成的组的治疗剂：抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂及细胞毒性剂。
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