CN103781494B

CN103781494B - 针对表皮生长因子受体(egfr)的抗体及其用途

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Publication number: CN103781494B
Application number: CN201280040289.9A
Authority: CN
Inventors: R·布克哈利德; M·菲尔德豪斯; A·金; N·科利; E·克劳兰德; J·D·卡恩斯; A·A·卢戈夫斯科伊; U·尼尔森
Original assignee: Merrimack Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Merrimack Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-07-05
Filing date: 2012-07-02
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2032-07-02
Also published as: US9902999B2; US20160083800A1; CN103781494A; US20150368346A1; MX350861B; AU2012279132B2; CA2840088A1; WO2013006547A2; US8691231B2; MX2014000270A; US20140234314A1; US9885087B2; EP3090759A1; US20140127207A1; TW201313739A; WO2013006547A9; US20120308576A1; JP2018070622A; WO2013006547A3; EP2729172A2

Abstract

本发明公开抗EGFR抗体、包含抗EGFR抗体的组合的治疗组合物以及使用所述抗体和组合物治疗EGFR相关病症(例如癌症)的方法。

Description

针对表皮生长因子受体(EGFR)的抗体及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请号61/504633(2011年7月5日提交)和美国临时申请号61/558945(2011年11月11日提交)的优先权益，所述美国临时申请两者皆以引用的方式并入本文。

背景

天然免疫系统已进化产生用于高效中和病原体的抗体。自免疫动物分离的天然抗体制剂是多克隆起源，且与局限于特定抗原的一个或数个表位的个别抗体相比显示免疫优势。抗肿瘤抗体能够阻断其所结合的肿瘤细胞的生长或杀死所述细胞，已被开发成高度有效的癌症治疗剂。抗肿瘤抗体的混合物达成的肿瘤抑制作用可大于由所述混合物中的任何个别抗体所达成的肿瘤抑制作用。

所述结果已通过组合两种或更多种针对表皮生长因子受体EGFR(ErbB1)的中和抗体达成。已证明结合且抑制EGFR的抗体提供有用抗癌益处且具有巨大医学和商业价值。拮抗而非竞争性抗EGFR抗体对的特定组合导致EGFR下调，此比单独应用任一抗体更快且更有效(Friedman等(2005)PNAS102:1915-1920)。两种交叉竞争性(即彼此竞争性结合抗原)抗EGFR抗体的组合已显示是非协同性的。多个抗体与EGFR的不同表位结合有可能于细胞表面上形成复合受体的点阵，从而导致内化和降解比用靶向单一表位的抗体获得的内化和降解更高效。也已报道特定抗EGFR受体抗体对的组合在体内产生累加性且在一些情况下协同性抗肿瘤活性(Perera等(2005)ClinCancerRes11:6390-6399)。与拮抗抗体528组合的单克隆抗体806(针对突变de2-7EGFR产生)在神经胶质瘤异种移植物模型中显示的抗肿瘤活性显著高于用任一抗体单独治疗的抗肿瘤活性。显示协同抗肿瘤活性的机制与EGFR快速下调相关，所述下调不受用个别抗体进行治疗诱导。类似地，在另一对抗EGFR抗体西妥昔单抗(cetuximab)和EMD55900存在下EGFR磷酸化大大降低(Kamat等(2008)CancerBiolTher7:726-33)。

也已显示靶向相关受体ErbB2的抗体的某些组合协同地起作用(Friedman等(2005))。与帕妥珠单抗(pertuzumab)组合的曲妥珠单抗在个别抗体无效的剂量下抑制BT474乳癌细胞的存活(Nahta等(2004)CancerRes64:2343-2346)。在另一研究中，三种非竞争性抗ErbB2抗体在组合使用时显示比个别使用时更有效体外杀死BT474细胞，且于BT474体内异种移植物模型中获得类似结果(Spiridon等(2002)ClinCancerRes8:1699-701)。

已报道组合一种以上抗体可增强抗体对肿瘤细胞的生长抑制(例如细胞毒性)作用的其它证据。举例而言，组合针对肿瘤抗原17-1A的单克隆抗体，研究肿瘤细胞溶解，且发现单克隆抗体以及竞争性抗体的组合无效，而两种或更多种非竞争性抗体的组合导致肿瘤细胞完全溶解。

除组合抗体之外，通过称为亲和力成熟的重组DNA技术增加重组表达的抗肿瘤抗体的抗原亲和力也已达成较高抗体效能。

因此，仍然需要用于产生抗肿瘤抗体作用以便增强肿瘤对抗EGFR抗体和抗体组合的反应性的其它途径和方法，所述抗EGFR抗体和抗体组合包括增强信号转导抑制且提供更有效细胞抑制或细胞毒性抗肿瘤结果的具有较高肿瘤亲和力的抗EGFR抗体和所述高亲和力抗EGFR抗体的组合。

概述

本文中提供与EGFR结合且抑制各种EGFR功能的新型单克隆抗体。这些抗体提供有用治疗作用，且当彼此组合或与其它抗ErbB受体抗体(例如其它抗EGFR抗体)组合时，与单独施用各种抗体相比能够显示协同或累加治疗作用。这些抗体在个别或以如本文中提供的组合形式施用时适用于治疗与EGFR介导的细胞信号转导相关的多种病症(例如癌症)。因此，本文中也提供显示与EGFR结合且抑制各种EGFR功能的性质的分离的新型单克隆抗体、以及显示所述性质的所述抗体的组合。也提供这些抗体用于诊断和治疗目的的用途，且公开本文中的抗体和抗体组合的用途。

在一个实施方案中，提供结合EGFR细胞外结构域且包含重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的单克隆抗体，其中所述重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列选自由以下组成的组：

(a)分别为SEQIDNO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:4、5和6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；

(b)分别为SEQIDNO:7、8和9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:10、11和12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；以及

(c)分别为SEQIDNO:13、14和15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:16、17和18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。

在另一实施方案中，提供与EGFR细胞外结构域结合且包含重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，其中所述重链和轻链可变区序列选自由以下组成的组：

(a)包含SEQIDNO:19的重链可变区和包含SEQIDNO:20的轻链可变区；

(b)包含SEQIDNO:21的重链可变区和包含SEQIDNO:22的轻链可变区；以及

(c)包含SEQIDNO:23的重链可变区和包含SEQIDNO:24的轻链可变区。

以上提及的单克隆抗体可以例如优于100nM、或优于10nM、或优于1nM、或优于100pM、或优于10pM、或优于1pM的K_D与EGFR结合。单克隆抗体可显示一种或多种本文中公开的功能性质。单克隆抗体可为例如人抗体。在其它实施方案中，抗体可为双特异性抗体、免疫缀合物、Fab、Fab’2、ScFv、高亲和性多聚体(avimer)、纳米体或结构域抗体。在其它实施方案中，单克隆抗体可为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE同种型抗体。

也提供包含以上提及的抗EGFR单克隆抗体的任何一者或多者和药学上可接受的载体的药物组合物。也提供试剂盒。试剂盒可包括例如于容器中的药物组合物。也提供治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含以上提及的抗EGFR单克隆抗体的任何一者或多者。也提供用于治疗癌症(或用于制造治疗癌症的药剂)的以上提及的抗EGFR单克隆抗体或其组合。

在另一实施方案中，提供包含两种或三种与EGFR细胞外结构域结合的单克隆抗体的组合物，其中所述两种或三种单克隆抗体选自由以下组成的组：

(a)包含分别为SEQIDNO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:4、5和6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的单克隆抗体；

(b)包含分别为SEQIDNO:7、8和9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:10、11和12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的单克隆抗体；以及

(c)包含分别为SEQIDNO:13、14和15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:16、17和18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的单克隆抗体；

且其中所述组合物包含(a)和(b)、(a)和(c)、(b)和(c)或(a)、(b)和(c)。

(a)包含含有SEQIDNO:19的重链可变区和含有SEQIDNO:20的轻链可变区的单克隆抗体；

(b)包含含有SEQIDNO:21的重链可变区和含有SEQIDNO:22的轻链可变区的单克隆抗体；以及

(c)包含含有SEQIDNO:23的重链可变区和含有SEQIDNO:24的轻链可变区的单克隆抗体；

于包含两种或三种抗体的以上提及的组合物中的单克隆抗体(a)、(b)和(c)各自可以例如优于100nM、或优于10nM或优于1nM的K_D与EGFR结合。单克隆抗体(a)、(b)和(c)各自可显示本文中公开的一种或多种功能性质。单克隆抗体(a)、(b)和(c)各自可为例如人抗体。在其它实施方案中，单克隆抗体(a)、(b)和(c)中的一者或多者独立地选自由双特异性抗体、免疫缀合物、Fab、Fab’2、ScFv、高亲和性多聚体、纳米体和结构域抗体组成的组。在其它实施方案中，单克隆抗体(a)、(b)和(c)各自独立地选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE同种型抗体组成的组。单克隆抗体(a)、(b)和(c)也可呈IgY和骆驼(camelid)抗体形式。

也提供药物组合物，其包含含有两种或三种抗EGFR单克隆抗体和药学上可接受的载体的以上提及的组合物中的任一者。也提供试剂盒。试剂盒可包括例如于容器中的药物组合物。也提供治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有两种或三种抗EGFR单克隆抗体的以上提及的组合物中的任一者。也提供用于治疗癌症的包含两种或三种抗-抗EGFR单克隆抗体的以上提及的组合物(及其用于制造药剂的用途)。

在另一实施方案中，提供包含三种单克隆抗EGFR抗体的组合物，所述组合物包含第一抗体、第二抗体和第三抗体，其中(i)所述第一抗体包含分别为SEQIDNO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:4、5和6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(ii)所述第二抗体包含分别为SEQIDNO:7、8和9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:10、11和12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；且(iii)所述第三抗体包含分别为SEQIDNO:13、14和15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:16、17和18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，且其中所述第一、第二和第三抗体以彼此2:2:1的摩尔比存在。

在另一实施方案中，提供包含三种单克隆抗EGFR抗体的组合物，所述组合物包含第一抗体、第二抗体和第三抗体，其中(i)所述第一抗体包含含有SEQIDNO:19的重链可变区和含有SEQIDNO:20的轻链可变区；(ii)所述第二抗体包含含有SEQIDNO:21的重链可变区和含有SEQIDNO:22的轻链可变区；且(iii)所述第三抗体包含含有SEQIDNO:23的重链可变区和含有SEQIDNO:24的轻链可变区，且其中所述第一、第二和第三抗体以彼此2:2:1的摩尔比存在。

于以上提及的组合物中的第一、第二和第三抗体各自可以例如优于100nM、或优于10nM或优于1nM的K_D与EGFR结合。在另一实施方案中，第一抗体以1x10^-9M至1.1x10^-11M范围内的K_D与EGFR结合，第二抗体以1x10^-9M至7.0x10^-11M范围内的K_D与EGFR结合，且第三抗体以1x10^-9M至3.6x10^-10M范围内的K_D与EGFR结合。以上提及的组合物中的第一、第二和第三抗体各自可显示本文中公开的一种或多种功能性质。以上提及的组合物中的第一、第二和第三抗体各自可为例如人抗体。在其它实施方案中，第一抗体、第二抗体和第三抗体中的一者或多者独立地选自由双特异性抗体、免疫缀合物、Fab、Fab’2、ScFv、亲和体、高亲和性多聚体、纳米体和结构域抗体组成的组。在其它实施方案中，第一抗体、第二抗体和第三抗体各自独立地选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE同种型抗体组成的组。

也提供包含以上提及的抗EGFR组合物中的任一者的药物组合物，所述抗EGFR组合物包含2:2:1比率的第一抗体、第二抗体和第三抗体以及药学上可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物是无菌组合物。在另一实施方案中，药物组合物适于注射。在另一实施方案中，所述药物组合物是适于静脉内注射的无菌组合物。也提供试剂盒。试剂盒可包括例如于容器中的药物组合物。也提供治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有2:2:1比率的第一、第二和第三抗体的以上提及的抗EGFR组合物中的任一者。也提供任何以上提及的抗EGFR组合物用于制造治疗癌症的药剂的用途，所述抗EGFR组合物包含2:2:1比率的第一、第二和第三抗体。

在另一实施方案中，提供制备抗EGFR抗体组合物的方法，所述方法包括于单一组合物中组合：

其中(a)、(b)和(c)以彼此2:2:1的摩尔比组合。

在另一实施方案中，提供用抗EGFR抗体治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用：

其中(a)、(b)和(c)以彼此2:2:1的摩尔比施用于所述受试者。

本发明的其它特征和优点将根据以下详述和权利要求而显而易知。

附图简述

图1A是展示使用野生型EGFR-ECD抗原(WT)、Bin1表位突变体(Bin1MT)和Bin3表位突变体(Bin3MT)，用P1X、P2X和P3X抗体进行直接ELISA表位分区实验的结果的柱状图。

图1B是展示表面等离子共振表位分区实验结果的图，所述实验使用缀合于Biacore芯片上的ICR10表位(Bin2)，其中注射野生型EGFR-ECD抗原，随后相继注射P1X、P2X和P3X抗体。

图2A是展示表面等离子共振表位分区实验结果的图，所述实验使用缀合于Biacore芯片上的P1X抗体，其中注射野生型EGFR-ECD抗原，随后相继注射P3X、P2X和P1X抗体。

图2B是展示表面等离子共振表位分区实验结果的图，所述实验使用缀合于Biacore芯片上的P2X抗体，其中注射野生型EGFR-ECD抗原，随后相继注射P3X、P2X和P1X抗体。

图2C是展示表面等离子共振表位分区实验结果的图，所述实验使用缀合于Biacore芯片上的P3X抗体，其中注射野生型EGFR-ECD抗原，随后相继注射P3X、P2X和P1X抗体。

图3是展示如通过流动式细胞测量术所测量，P1X、P2X和P3X抗体对A431细胞上的EGFR的结合动力学的结果的图(FACS图)。

图4是展示磷酸-EGFR(pEGFR)ELISA的结果的图，其显示由单一抗体达成的pEGFR抑制：用P1X、P2X或P3X抗体进行单一药剂处理。

图5A是展示磷酸-ERK(pERK)ELISA的结果的图，其通过比较由亲本抗体(ca抗体)和亲和力成熟P1X抗体达成的pERK抑制来显示亲和力成熟对pERK抑制的影响。

图5B是展示磷酸-ERK(pERK)ELISA的结果的图，其比较由亲本抗体(ca和ch抗体)和亲和力成熟P1X+P3X抗体达成的pERK抑制。

图5C是展示磷酸-ERK(pERK)ELISA的结果的图，其比较由亲本抗体(ca和cd抗体)和亲和力成熟P1X+P2X抗体达成的pERK抑制。

图6A是展示磷酸-ERK(pERK)ELISA的结果的图，其显示由P1X抗体达成的pERK抑制，IC₅₀值是约25nM。

图6B是展示用5个组合比率的P3X+P2X的稀释系列以及25nM恒定P1X浓度处理的A431细胞的磷酸-ERK(pERK)ELISA的结果的图。

图6C是展示用6个组合比率的P1X:P2X:P3X的稀释系列处理的A431细胞的磷酸-ERK(pERK)ELISA的结果的图。

图6D是展示用5个组合比率的P1X:P2X的稀释系列处理的A431细胞的磷酸-ERK(pERK)ELISA的结果的图。

图7A是展示磷酸-EGFR(pEGFR)ELISA(圆形)和磷酸-ERK(pERK)ELISA(三角形)的结果的图，其显示由P1X:P2X:P3X的2:2:1组合达成的抑制。

图7B是展示磷酸-ERK(pERK)ELISA的结果的图，其显示相对于单独P1X单一抗体，由P1X:P2X:P3X(P1X+P2X+P3X)的2:2:1制剂达成的抑制。

图7C是展示磷酸-ERK(pERK)ELISA的结果的图，其显示相对于单独P2X单一抗体，由P1X+P2X+P3X达成的抑制。

图8A是展示H1975细胞的总EGFR(tEGFR)内化动力学的蛋白质印迹分析结果的柱状图，所述H1975细胞在用EGF刺激之前用P1X+P2X+P3X抗体预处理各种时间段。

图8B是展示在用EGF刺激之前用P1X+P2X+P3X抗体预处理的H1975细胞的蛋白质印迹分析结果的柱状图，其展示相对于上样对照(PCNA)和对照未处理细胞的溶解物校正的细胞tEGFR、pERK、磷酸-AKT(pAKT)和磷酸-c-Jun(p-c-Jun)含量。

图9A是展示HCC827细胞的细胞活力测定的结果的图，其显示与西妥昔单抗相比在EGF配体存在下通过用P1X+P2X+P3X抗体处理所达成的肿瘤细胞增殖抑制。

图9B是展示H1975细胞的细胞活力测定的结果的图，其显示与西妥昔单抗相比在EGF配体存在下通过用P1X+P2X+P3X抗体处理所达成的肿瘤细胞增殖抑制。

图9C是展示HCC827细胞的细胞活力测定的结果的图，其显示与西妥昔单抗相比在两性调节蛋白(AREG)配体存在下通过用P1X+P2X+P3X抗体处理所达成的肿瘤细胞增殖抑制。

图9D是展示H1975细胞的细胞活力测定的结果的图，其显示与西妥昔单抗相比在AREG配体存在下通过用P1X+P2X+P3X抗体处理所达成的肿瘤细胞增殖抑制。

图10A是展示DU145肿瘤异种移植物小鼠模型实验的结果的图，其显示与PBS和西妥昔单抗对照相比在P1X+P2X+P3X抗体处理的小鼠中体内肿瘤体积减小。

图10B是展示H1975肿瘤异种移植物小鼠模型实验的结果的图，其显示与PBS对照相比在P1X+P2X+P3X抗体处理的小鼠中体内肿瘤体积减小。

图11是展示配体拮抗细胞结合测定的结果的图，其显示低剂量下单独P1X、P2X或P3X的EGF配体阻断能力。

图12A是展示配体拮抗细胞结合测定的结果的图，其显示高剂量下单独P1X、P2X或P3X或三元组合的EGF配体阻断能力。

图12B是展示配体拮抗细胞结合测定的结果的图，其显示高剂量下单独P1XFab、P2XFab或P3XFab或三元组合的EGF配体阻断能力。

图13A是展示磷酸-EGFR抑制测定的结果的图，其显示低剂量(50ng/ml；8nM)下P1X+P2X+P3X或P1XFab+P2XFab+P3XFab的三元组合的抑制能力。

图13B是展示磷酸-EGFR抑制测定的结果的图，其显示高剂量(500ng/ml；80nM)下P1X+P2X+P3X或P1XFab+P2XFab+P3XFab的三元组合的抑制能力。

图13C是展示磷酸-ERK抑制测定的结果的图，其显示低剂量(50ng/ml；8nM)下P1X+P2X+P3X或P1XFab+P2XFab+P3XFab的三元组合的抑制能力。

图13D是展示磷酸-ERK抑制测定的结果的图，其显示高剂量(500ng/ml；80nM)下P1X+P2X+P3X或P1XFab+P2XFab+P3XFab的三元组合的抑制能力。

图14是用P1X+P2X+P3X或P1XFab+P2XFab+P3XFab的三元组合预处理或用西妥昔单抗预处理的细胞中EGF受体下调测定的免疫印迹。管家蛋白pcna用作对照。

详述

I.定义

术语“EGFR”、“ErbB1”和“EGF受体”在本文中可互换使用来指人EGFR蛋白；参见UniProtKB/Swiss-Prot条目P00533。人EGFR的细胞外结构域(EGFR-ECD)的氨基酸序列展示于实施例1和SEQIDNO:33中。

如本文所用的术语“抑制”是指生物活性的任何统计显著降低，包括完全阻断活性。举例而言，“抑制”可指生物活性统计显著降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或约100%。

如本文所用，抑制磷酸化是指相对于不存在抗体下的信号转导(对照)，抗体能够统计显著降低底物蛋白的磷酸化。如本领域中已知，细胞内信号转导路径包括例如磷酸肌醇3’-激酶/Akt(PI3K/Akt/PTEN或“AKT”)和/或有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK/ERK或“ERK”)路径。也如本领域中已知，EGFR介导的信号转导可通过测定底物的磷酸化程度(例如AKT和/或ERK的磷酸化或无磷酸化)来测量。因此，在一个实施方案中，抗EGFR抗体组合和组合物提供相对于不存在所述抗体下的AKT和/或ERK磷酸化程度(对照)，使AKT和ERK中任一者或两者的磷酸化程度统计显著抑制至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或约100%。所述EGFR介导的信号转导可使用本领域认可的测量涉及EGFR的细胞级联中的蛋白的技术来测量，所述技术例如ELISA、蛋白质印迹或多重方法，如

如本文所用，措词“抑制表达EGFR的细胞的生长”是指相对于不存在抗体下的细胞生长，抗体能够体内或体外统计显著降低表达EGFR的细胞的生长。在一个实施方案中，当使表达EGFR的细胞(例如癌细胞)与本文中公开的抗体组合物或组合接触时，相对于不存在所述抗体组合物或组合下测量的生长(对照)，所述细胞的生长可降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或约100%。可使用本领域认可的技术测定细胞生长，所述技术测量细胞分裂速率、细胞群体内经受细胞分裂的细胞的分数、和/或由于末端分化或细胞死亡而自细胞群体损失细胞的速率(例如使用细胞效价辉光测定(celltiterglowassay)或胸苷并入法)。

如本文所用，措词“抑制EGFR配体与EGFR结合”是指相对于不存在抗体下的EGFR配体结合(对照)，抗体能够统计显著降低EGFR配体与其受体EGFR结合。此意指相对于对照(无抗体)，在抗体存在下，与EGFR结合的EGFR配体的量统计显著降低。在本文中公开的抗体组合物或组合存在下，结合EGFR的EGFR配体的量相对于不存在所述抗体下的量(对照)可降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或约100%。可使用本领域认可的技术来测量EGFR配体结合的降低，所述技术测量存在或不存在(对照)抗体下，标记的EGFR配体(例如放射性标记的EGF或放射性标记的β细胞素)的结合程度。

如本文所用，措词“抑制EGFR二聚”是指相对于不存在抗体下的EGFR二聚(对照)，抗体能够统计显著降低EGFR二聚(与另一ErbB受体配对以形成同二聚体(例如ErbB1/ErbB1配对)或异二聚体(例如ErbB1/ErbB3配对))。在一个实施方案中，当使表达EGFR的细胞与本文中公开的抗体组合物或组合接触时，相对于不存在所述抗体下测量的EGFR二聚(对照)，EGFR二聚可降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或约100%。可使用本领域认可的技术来测量EGFR二聚的降低，所述技术测量存在或不存在(对照)抗体下的EGFR二聚程度。

如本文所用，措词“下调EGFR表达”是指相对于不存在抗体下的EGFR表达(对照)，抗体能够统计显著降低EGFR在细胞表面上的表达，例如通过增加EGFR的内化和/或通过减少来自细胞内囊泡的EGFR的再循环。在一个实施方案中，当使表达EGFR的细胞与本文中提供的抗体组合物或组合接触时，相对于不存在所述抗体下测量的EGFR在细胞表面上的表达(对照)，EGFR表达可降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或约100%。下调EGFR在细胞表面上的表达包括例如增加受体的内化/再循环和/或增加受体的内化/降解。可使用本领域认可的技术来测量EGFR内化的增加，所述技术测量存在或不存在(对照)抗体下的EGFR内化程度。

关于EGFR抗体的组合(本文中描述)，如本文所用的措词“累加”或“累加性”是指两种或更多种抗体的活性，其中它们的组合活性(相对于特定功能，例如抑制细胞生长)等于它们的个别活性的总和。也就是说当个别地作用于表达EGFR的细胞时，本文中提供的两种或更多种抗体的活性总和约等于所述抗体一起作用于相同细胞的组合效应。在一个实施方案中，关于以上论述的任何性质(例如抑制AKT或ERK磷酸化、抑制表达EGFR的细胞的生长等)测量累加效应。

如本文所用，措词“协同”或“协同的”是指两种或更多种抗体的活性，其中它们的组合活性(相对于特定功能，例如抑制细胞生长)大于它们的个别活性的预期累加效应。举例而言，预期累加效应可根据Bliss独立性准则(Blissindependencecriteria)加以定义。根据Bliss准则，两种或更多种药物(例如抗体)的效应等于个别药物的效应总和减去个别药物的效应的乘积：

E12=E1+E2-E1*E2

其中E1是由药物1达成的抑制%，E2是由药物2达成的抑制%，E12是由组合达成的预期抑制%。

协同效应可适用于本文中论述的任何性质(例如抑制EGFR依赖性AKT或ERK磷酸化、抑制表达EGFR的细胞的生长等)。在一特定实施方案中，相对于抗体的个别活性的累加效应，组合抗体达成活性增加至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或90%以上。

如在本文中可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(抗原结合部分)或单链同源物。“抗体”包含至少一个重(H)链和一个轻(L)链。在天然存在的IgG中，例如这些重链和轻链通过二硫键互连且存在两对重链和轻链，这两对也通过二硫键互连。各重链包含重链可变区(本文中缩写为V_H)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(本文中缩写为V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，即CL。V_H区和V_L区可进一步再分成高变区(称为互补决定区(CDR))，其间散布有更保守区域，称为框架区(FR)或接合(J)区(重链和轻链中分别为JH或JL)。各V_H和V_L主要由依以下顺序自氨基端至羧基端排列的三个CDR、三个FR和一个J结构域组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、J。重链和轻链的可变区与抗原结合。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括各种免疫系统细胞(例如效应细胞)或体液因子，如经典补体系统的第一组分(Clq)。因此，抗体的保留与抗原(例如EGFR)特异性结合的能力的一个或多个片段可用于本文中公开的组合中。已显示全长抗体的片段可执行抗体的抗原结合功能。表示为抗体的抗原结合部分或片段的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由V_L、V_H、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，包含在铰链区处通过二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(v)包括VH和VL结构域的dAb；(vi)dAb片段(Ward等,(1989)Nature341,544-546)，其由V_H结构域组成；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；和(viii)分离的互补决定区(CDR)；或(ix)两种或更多种分离的CDR的组合，所述CDR可任选通过合成接头加以接合。此外，虽然Fv片段的两个结构域V_L和V_H由单独基因编码，但其可使用重组方法通过合成接头加以接合，所述合成接头使其能够以单一蛋白链形式制得，在所述单一蛋白链中，V_L区和V_H区配对以形成单价分子(免疫球蛋白片段的所述单链同源物称为单链Fv(scFv))。所述单链抗体也意图涵盖在术语“抗体”内。抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的一般性方式针对效用筛选片段。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解来产生。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指自大致上均质抗体的群体获得的抗体，即除可以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成所述群体的个别抗体是相同的。如本文所用的术语“单克隆抗体”也涵盖所述免疫球蛋白的抗原结合片段(包括scFv)。单克隆抗体具有高度特异性，其针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。可使用本领域认可的任何技术和本文中描述的技术，例如像杂交瘤方法、转基因动物、重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)，或使用噬菌体抗体文库，利用描述于例如美国专利号7,388,088和美国专利申请号09/856,907(PCT国际公布号WO00/31246)中的技术来制备单克隆抗体。单克隆抗体包括嵌合抗体、人抗体和人源化抗体且可天然存在或重组产生。

术语“重组抗体”是指通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，如(a)自免疫球蛋白基因(例如人免疫球蛋白基因)转基因或转染色体动物(例如小鼠)或自其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)自转型以表达抗体的宿主细胞(例如自转染瘤)分离的抗体，(c)自使用噬菌体展示的重组组合抗体文库(例如含有人抗体序列)分离的抗体，和(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因)剪接至其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组抗体可具有源自人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，所述重组人抗体可经受体外突变诱发且因此重组抗体的V_H区和V_L的氨基酸序列是虽然源自人生殖系V_H和V_L序列且与人生殖系V_H和V_L序列相关，但在体内可能不天然存在于人抗体生殖系谱系内的序列。

术语“嵌合免疫球蛋白”或抗体是指可变区源自第一物种且恒定区源自第二物种的免疫球蛋白或抗体。嵌合免疫球蛋白或抗体可例如通过遗传工程改造，自属于不同物种的免疫球蛋白基因区段构建。

如本文所用的术语“人抗体”意图包括具有可变区的抗体，其中框架区与CDR区两者皆源自例如由Kabat等(参见Kabat等(1991)SequencesofproteinsofImmunologicalInterest,第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版物号91-3242)所述的人生殖系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么所述恒定区也源自人生殖系免疫球蛋白序列。人抗体可包括不由人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性突变诱发或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人抗体”不意图包括CDR序列源自已移植于人框架序列上的另一哺乳动物物种(如小鼠)的生殖系的抗体。

人抗体的至少一个或多个氨基酸可被氨基酸残基(例如不由人生殖系免疫球蛋白序列编码的活性增强性氨基酸残基)置换。通常，人抗体的多达二十个位置可被不为人生殖系免疫球蛋白序列的一部分的氨基酸残基置换。在一特定实施方案中，这些置换在如下文详细描述的CDR区内。

术语“人源化抗体”是指包括至少一个人源化抗体链(即至少一个人源化轻链或重链)的抗体。术语“人源化抗体链”(即“人源化免疫球蛋白轻链”)是指如下抗体链(即分别为轻链或重链)，其具有包括大致上来自人抗体的可变框架区和大致上来自非人抗体的互补决定区(CDR)(例如至少一个CDR、两个CDR或三个CDR)的可变区且进一步包括恒定区(例如在轻链的情况下，为一个恒定区或其部分，且在重链的情况下，优选为三个恒定区)。

如本文所用，“分离”意指大致上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体或两种、三种或四种抗体的组合(例如抗体ca、cf和ch(各自与EGFR特异性结合)的分离的组合物大致上不含特异性结合除EGFR外的抗原的抗体)。此外，分离的抗体通常大致上不含其它细胞物质和/或化学物质。在一个实施方案中，将具有不同EGFR结合特异性的“分离的”单克隆抗体的组合于明确组合物中加以组合。

如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG1)。在一些实施方案中，本文中提供的单克隆抗体组合物仅包含IgG1同种型的抗体。在其它实施方案中，本文中提供的单克隆抗体组合物仅包含IgG2同种型的抗体。在其它实施方案中，本文中提供的单克隆抗体组合物包含两种或三种不同同种型的抗体。

“抗原”是抗体所结合的实体(例如蛋白实体或肽)。在各种实施方案中，抗原是EGF。在一特定实施方案中，抗原是人EGFR。

因此，本公开内容也涵盖结合EGFR上的表位的抗体的组合，所述表位包含由本文中描述的组合中的特定抗体识别的表位的全部或一部分。在另一实施方案中，提供与本文中描述的抗体竞争结合EGFR的抗体。竞争性抗体和识别相同或重叠表位的抗体可使用常规技术，如免疫测定，例如通过显示一种抗体阻断另一抗体与靶标抗原结合的能力(即竞争性结合测定)来鉴定。可使用如描述于以下实施例中的测定来测定竞争性结合。

术语“特异性结合”和“选择性结合”意指抗体显示对特定抗原或表位的明显亲和力，且大体上不显示与其它抗原和表位的显著交叉反应性。“明显”或优选结合包括以10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰M^-1或更佳的K_D进行结合。抗体抗原相互作用的K_D(亲和力常数)指示50%抗体与抗原分子结合在一起所处的抗体浓度。因此，在适合固定抗原浓度下，50%的较高(即较强)亲和力抗体将在低于将为用较低亲和力抗体达成相同结合百分比所需的抗体浓度的抗体浓度下结合抗原分子。因此，较低K_D值指示较高(较强)亲和力。如本文所用，“较佳”亲和力是较强亲和力，且具有低于其比较物的数值，其中10⁷M^-1的K_D具有较低数值且因此表示优于10⁶M^-1的K_D的亲和力。优于(即具有较低K_D值且因此较强)10⁷M^-1、优选优于10⁸M^-1的亲和力一般为优选的。也涵盖处于本文中陈述的那些数值中间的值，且优选结合亲和力可指示为亲和力的范围，例如对于本文中公开的抗EGFR抗体，优选结合亲和力是10⁶至10¹²M^-1、优选10⁷至10¹²M^-1、更优选10⁸至10¹²M^-1。“不显示显著交叉反应性”的抗体是将不与脱靶抗原(例如非EGFR蛋白)明显结合的抗体。举例而言，在一个实施方案中，与EGFR特异性结合的抗体将对EGFR显示优于对除ErbB1(EGFR)外的ErbB分子或对非ErbB蛋白或肽至少两个且优选三个、或四个或更多个数量级的结合亲和力(即显示低两个、三个或四个或更多个数量级的K_D值的结合)。可根据用于测定所述结合的任何本领域认可的手段，包括例如根据如本文所述的Scatchard分析和/或竞争性(竞争)结合分析来测定特异性或选择性结合。

如本文所用的术语“K_D”意指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数或抗体对抗原的亲和力。在一个实施方案中，本文中提供的抗体以100nM或更佳(即或更小)(例如90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM或1nM以下)的亲和力(K_D)结合抗原(例如EGFR)，如使用表面等离子共振测定、细胞结合测定或平衡透析测定所测量。在一特定实施方案中，抗体以8nM或更佳(例如7nM、6nM、5nM、4nM、2nM、1.5nM、1.4nM、1.3nM、1.2nM、1.1nM、1nM或1nM以下)的亲和力(如由解离常数K_D表示)结合EGFR，如通过表面等离子共振测定或细胞结合测定所测量。在其它实施方案中，当使用重组EGFR作为分析物以及抗体作为配体在BIACORE3000仪器中通过表面等离子共振(SPR)技术测定时，抗体以约小于10^-7M，如约小于10^-8M、10^-9M或10^-10M或甚至10^-10M以下的亲和力(K_D)结合抗原(例如EGFR)，且与预定抗原结合的亲和力比其与除预定抗原或密切相关抗原外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力大至少两倍。用于确定K_D的其它方法包括通过流动式细胞测量术(FACS)或使用技术在溶液中测定与表达EGFR的活细胞的平衡结合。

如本文所用的术语“K_off”意指抗体自抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。

如本文所用的术语“IC50”和“IC90”是指化合物(例如抗EGFR抗体)分别抑制50%和90%的生物学或生物化学功能(例如EGFR的功能或活性)的有效性的量度。举例而言，IC50表示抑制一半EGFR活性(例如表达EGFR的细胞的生长)需要多少抗EGFR抗体。也就是说其为抗EGFR抗体的半数最大(50%)抑制浓度(IC)(50%IC或IC₅₀)。根据FDA，IC50表示达成体外50%抑制所需的药物浓度。IC50和IC90可通过本领域中已知的技术，例如通过构建剂量-反应曲线且检查不同浓度的拮抗剂(即抗EGFR抗体)对逆转EGFR活性的作用来确定。

如本文所用，“糖基化样式”定义为与蛋白质、更特定而言与免疫球蛋白共价连接的碳水化合物单元的样式。

如本文所用的术语“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可为单链或双链，但优选为双链DNA。

如本文关于编码抗体或抗体片段(例如V_H、V_L、CDR3)的核酸所用的术语“分离的核酸分子”意指核苷酸序列基本上不含其它基因组核苷酸序列(例如编码结合除EGFR外的抗原的抗体的序列)的核酸分子，所述其它序列可在人基因组DNA中天然侧接核酸。

如本文所用的术语“修饰”意指使抗体或其抗原结合部分中的一个或多个氨基酸变化。变化可通过在一个或多个位置处添加、取代或缺失氨基酸而产生。变化可使用已知技术，如PCR突变诱发而产生。举例而言，在一些实施方案中，可修饰使用本文中提供的方法鉴定的抗体或其抗原结合部分，从而改进所述抗体或其抗原结合部分与EGFR的结合亲和力。提供抗体序列中的“保守氨基酸取代”，即不会消除由所述核苷酸序列编码或含有所述氨基酸序列的抗体与抗原(即EGFR)的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。保守氨基酸取代包括一个种类中的氨基酸由相同种类的氨基酸取代，其中种类是根据共有物理化学氨基酸侧链性质和在自然界中所见的同源蛋白中的高取代频率(如例如通过标准Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵所测定)确定。氨基酸侧链已分类为六个一般种类且包括：I类(Cys)；II类(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III类(Asn、Asp、Gln、Glu)；IV类(His、Arg、Lys)；V类(Ile、Leu、Val、Met)；和VI类(Phe、Tyr、Trp)。举例而言，用Asp取代如Asn、Gln或Glu的另一III类残基是保守取代。因此，抗EGFR抗体中的预期非必需氨基酸残基优选被来自相同种类的另一氨基酸残基置换。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法在本领域中是熟知的。

术语“非保守氨基酸取代”是指用来自另一种类的氨基酸取代一个种类中的氨基酸；例如用如Asp、Asn、Glu或Gln的III类残基取代II类残基Ala。

或者，在另一实施方案中，可沿抗EGFR抗体编码序列的全部或一部分，如通过饱和突变诱发来随机引入突变(保守或非保守)，且所得修饰的抗EGFR抗体可针对结合活性进行筛选。

“共有序列”是由相关序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列。在蛋白质家族中，共有序列中的各位置由家族中最常出现在那个位置的氨基酸占据。如果两个氨基酸同等频繁地出现，那么共有序列中可包括任一者。免疫球蛋白的“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。类似地，关于CDR的共有序列可通过本文中提供的EGFR抗体的CDR氨基酸序列的最佳比对获得。

对于核酸，术语“实质上同源”指示两种核酸或其指定序列在最佳对准且比较时在至少约80%核苷酸、通常至少约90%至95%且更优选至少约98%至99.5%核苷酸中为相同的，伴有适当核苷酸插入或缺失。或者，当区段将在选择性杂交条件下与所述链的互补链杂交时，存在实质上同源。

核酸可存在于完整细胞、细胞溶解物中或以部分纯化或大致上纯净形式存在。当通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl条带化(CsClbanding)、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和本领域中熟知的其它技术)与其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白质)纯化分离时，核酸被“分离”或“变得大致上纯净”。

来自cDNA、基因组或其混合物的核酸组合物虽然常包含天然序列(除修饰的限制位点等之外)，但或者可根据标准技术进行突变以提供改变的基因序列。对于编码序列，这些突变必要时可修饰编码的氨基酸序列。特定而言，涵盖与本文中描述的天然V、D、J、恒定、转换序列及其它所述序列大致上同源的DNA序列。

术语“可操作地连接”是指将核酸序列与另一核酸序列呈某一功能关系置放。举例而言，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，那么其可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列转录，那么其可操作地连接至编码序列；或如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，那么其可操作地连接至编码序列。一般而言，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是邻近的，且在分泌前导序列的情况下，是邻近的且处于阅读相中。然而，增强子不必是邻近的。连接是通过在适宜限制位点处进行接合来达成。如果所述位点不存在，那么根据常规规范使用合成寡核苷酸转接头或接头。当核酸与另一核酸序列呈某一功能关系置放时，其被“可操作地连接”。举例而言，如果启动子或增强子影响序列转录，那么其可操作地连接至编码序列。关于转录调控序列，可操作地连接意指所连接的DNA序列是邻近的，且当有必要接合两个蛋白编码区时，是邻近的且处于阅读框中。对于转换序列，可操作地连接指示序列能够影响转换重组。

如本文所用的术语“载体”意指能够转运其已连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可接合其它DNA区段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中其他DNA区段可接合至病毒基因组中。某些载体能够在其所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离哺乳动物载体)在引入宿主细胞中后可整合至宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导其可操作地连接的基因的表达。所述载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，适用于重组DNA技术中的表达载体常呈质粒形式。术语“质粒”和“载体”可互换使用。然而，也涵盖起相等作用的其它形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

如本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意指其中已引入重组表达载体的细胞。应了解所述术语不仅意指特定标的细胞，而且指所述细胞的子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而出现在后代中，所以所述子代实际上可不与亲本细胞相同，但仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。

如本文所用的术语“治疗”是指本文中描述的治疗或预防措施。“治疗”方法采用将本文中公开的抗体或抗体对或三元组合施用于受试者，例如患有与EGFR依赖性信号转导相关的疾病或病症或易患有所述疾病或病症的受试者，以预防、治愈、延迟所述疾病或病症或复发疾病或病症，减轻其严重性或改善其一种或多种症状，或使受试者存活延长超过不存在所述治疗下的预期存活。

如本文所用的术语“与EGFR依赖性信号转导相关的疾病”或“与EGFR依赖性信号转导相关的病症”包括发现EGFR含量增加和/或涉及EGFR的细胞级联的活化程度增加的疾病状态和/或与疾病状态相关的症状。术语“与EGFR依赖性信号转导相关的疾病”也包括与替代性EGFR信号转导路径的活化相关的疾病状态和/或症状。一般而言，术语“与EGFR依赖性信号转导相关的疾病”是指任何病症，其发作、进展或症状持续需要EGFR的参与。示例性EGFR介导的病症包括但不限于例如癌症。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理学病状，其特征通常在于细胞生长不受调控。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰脏癌、神经胶质细胞肿瘤(如神经胶母细胞瘤和神经纤维瘤)、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidneycancer/renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈部癌。在一特定实施方案中，使用本文中公开的方法治疗或诊断的癌症选自黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、肾癌、胃肠/结肠癌、肺癌和前列腺癌。

如本文所用的术语“有效量”是指结合EGFR的抗体或其抗原结合部分的量，所述量在施用于受试者时足以影响如本文所述的与EGFR依赖性信号转导相关的疾病的治疗、预后或诊断。当单独或组合使用时，本文中提供的抗体的治疗有效量将视抗体和组合的相对活性(例如抑制细胞生长)而变化，且视所治疗的受试者和疾病状况、受试者的重量和年龄、疾病状况的严重性、施药方式等而变化，其可易于由本领域一般技术人员确定。施药剂量可在以下范围内：例如约1ng至约10,000mg、约5ng至约9,500mg、约10ng至约9,000mg、约20ng至约8,500mg、约30ng至约7,500mg、约40ng至约7,000mg、约50ng至约6,500mg、约100ng至约6,000mg、约200ng至约5,500mg、约300ng至约5,000mg、约400ng至约4,500mg、约500ng至约4,000mg、约1μg至约3,500mg、约5μg至约3,000mg、约10μg至约2,600mg、约20μg至约2,575mg、约30μg至约2,550mg、约40μg至约2,500mg、约50μg至约2,475mg、约100μg至约2,450mg、约200μg至约2,425mg、约300μg至约2,000、约400μg至约1,175mg、约500μg至约1,150mg、约0.5mg至约1,125mg、约1mg至约1,100mg、约1.25mg至约1,075mg、约1.5mg至约1,050mg、约2.0mg至约1,025mg、约2.5mg至约1,000mg、约3.0mg至约975mg、约3.5mg至约950mg、约4.0mg至约925mg、约4.5mg至约900mg、约5mg至约875mg、约10mg至约850mg、约20mg至约825mg、约30mg至约800mg、约40mg至约775mg、约50mg至约750mg、约100mg至约725mg、约200mg至约700mg、约300mg至约675mg、约400mg至约650mg、约500mg或约525mg至约625mg抗体。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。有效量也为如下量，其中抗体的任何毒性或有害作用(即副作用)最小和/或由有益作用超过。

术语“治疗剂”意图涵盖具有以下能力的任何和所有化合物：减轻或抑制疾病或病症的症状的严重性，或增加疾病或病症中无症状或症状减轻时期的频率和/或持续时间，或抑制或预防由疾病或病症痛苦所致的损伤或失能，或抑制或延迟疾病或病症的进展，或抑制或延迟疾病或病症的发作，或抑制或预防传染性疾病或病症中的感染。治疗剂的非限制性实例包括小有机分子、单克隆抗体、双特异性抗体、重组工程改造的生物制品、RNAi化合物、酪氨酸激酶抑制剂和商业抗体。在某些实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂包括例如目前市面上的药物埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)和拉帕替尼(lapatinib)中的一者或多者。可商购医药抗EGFR抗体包括西妥昔单抗和帕尼单抗(panitumumab)。其它医药抗EGFR抗体包括处于开发中的扎鲁木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)和马妥珠单抗(matuzumab)。

术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。

术语“受试者”包括任何哺乳动物，例如灵长类动物。举例而言，本文中公开的方法和组合物可用于治疗患有癌症的受试者。在一特定实施方案中，受试者是人。

术语“样本”是指取自患者或受试者的组织、体液或细胞(或任何前述者的一部分)。通常，组织或细胞将自患者移除，但也涵盖体内诊断。在实体肿瘤的情况下，组织样本可取自手术移除的肿瘤且通过常规技术制备以供测试。在淋巴瘤和白血病的情况下，可获得淋巴细胞、白血病细胞或淋巴组织(例如来自血液的白血病细胞)且加以适当制备。其它样本，包括尿、眼泪、血清、血浆、脑脊髓液、粪便、痰、细胞提取物等也可适用于特定癌症。

本公开内容的多个方面更详细描述于以下各小节中。

II.抗EGFR抗体及其组合

本文中公开新型抗EGFR单克隆抗体，包括实施例中称为P1X、P2X和P3X的三种单克隆抗体。P1X、P2X和P3X单克隆抗体是PCT申请号PCT/US2011/35238中公开的分别称为ca、cd和ch的亲本抗体的亲和力成熟抗体。以下展示亲本和亲和力成熟抗体的CDR氨基酸序列，其中亲和力成熟抗体中的变化氨基酸加粗且加下划线：

P1X的全长V_H和V_L氨基序列分别于SEQIDNO:19和20中展示。P2X的全长V_H和V_L氨基序列分别于SEQIDNO:21和22中展示。P3X的全长V_H和V_L氨基序列分别于SEQIDNO:23和24中展示。另外，如本文中提供的V_H和V_LCDR区段例如依CDR1、CDR2和CDR3的氨基至羧基端顺序排列。

(a)包含SEQIDNO:19的重链可变区和包含SEQIDNO:20的轻链可变区；

(c)包含SEQIDNO:23的重链可变区和包含SEQIDNO:24的轻链可变区。

也提供以上提及的抗EGFR抗体的组合。所述组合可含有例如两种以上提及的抗EGFR抗体的任何组合。另一组合可包含全部三种以上提及的抗EGFR抗体。因此，另一方面，提供包含两种或三种与EGFR细胞外结构域结合的单克隆抗体的组合物，其中所述两种或三种单克隆抗体选自由以下组成的组：

本文中公开的抗EGFR抗体(无论呈单一抗体形式或呈抗体的组合形式)可以例如优于100nM、或优于10nM或优于1nM的K_D与EGFR结合。如本文中关于K_D所用，术语“优于___nM”意指抗体具有低于指示数字的K_D(表示为纳摩尔浓度)。举例而言，“优于”100nM的K_D指示表示为纳摩尔浓度的K_D的值低于100nM(例如是50nM)。

在其它实施方案中，P1X相关抗体，如包含分别为SEQIDNO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:4、5和6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体，或包含分别为SEQIDNO:19和20的V_H和V_L序列的抗体，可以约1x10^-9M至1.1x10^-11M范围内或优于1.1x10^-11M的K_D与EGFR结合。

在其它实施方案中，P2X相关抗体，如包含分别为SEQIDNO:7、8和9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:10、11和12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体，或包含分别为SEQIDNO:21和22的V_H和V_L序列的抗体，可以约1x10^-9M至7.0x10^-11M范围内或优于7.0x10^-11M的K_D与EGFR结合。

在其它实施方案中，P3X相关抗体，如包含分别为SEQIDNO:13、14和15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:16、17和18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体，或包含分别为SEQIDNO:23和24的V_H和V_L序列的抗体，可以约1x10^-9M至3.6x10^-10M范围内或优于3.6x10^-10M的K_D与EGFR结合。

本文中公开的抗EGFR抗体(无论呈单一抗体形式或呈抗体的组合形式)可显示如本文中公开的一种或多种其它功能性质，包括但不限于：

(a)抑制AKT或ERK磷酸化，例如EGFR依赖性AKT或ERK磷酸化，如细胞基测定中所测量；

(b)抑制表达EGFR的细胞的生长；

(c)抑制EGF配体与EGFR结合(例如抑制结合EGFR的一种或多种配体的结合，所述配体包括EGF、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)、转化生长因子(TGF)、上皮细胞有丝分裂蛋白(epigen)、表皮调节素(epiregulin)、β细胞素或两性调节蛋白(amphiregulin))；

(d)抑制EGFR二聚；

(e)下调细胞表面上的EGFR(例如通过内化和再循环受体和/或内化和降解受体)；

(f)抑制体外肿瘤细胞增殖；和/或

(g)抑制体内肿瘤生长。

本文中公开的抗体包括所有已知形式的抗体和具有抗体样性质的其它蛋白骨架。举例而言，所述抗体可为人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、免疫缀合物、嵌合抗体或具有抗体样性质的蛋白骨架，如纤连蛋白或锚蛋白重复序列。抗体也可为Fab、Fab’2、ScFv、高亲和性多聚体、纳米体或结构域抗体。抗体也可具有任何同种型，包括任何以下同种型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。IgG抗体是优选的。可使用标准重组DNA技术和编码欲与可变区序列可操作地连接的所需恒定区序列的核酸自V_H和V_L序列制备全长抗体。适合恒定区序列的非限制性实例包括SEQIDNO:25中公开的κ轻链恒定区和SEQIDNO:26中公开的IgG1重链恒定区。

如实例中所公开，已发现当以2:2:1的P1X:P2X:P3X摩尔比使用时，P1X+P2X+P3X抗体的三元组合是特别有效的。因此，对于所述三元抗体组合，总浓度的40%选择为P1X，总浓度的40%选择为P2X且总浓度的20%选择为P3X。

因此，在另一实施方案中，提供包含三种单克隆抗EGFR抗体的组合物，所述组合物包含第一抗体、第二抗体和第三抗体，其中(i)所述第一抗体包含分别为SEQIDNO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:4、5和6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(ii)所述第二抗体包含分别为SEQIDNO:7、8和9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:10、11和12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；且(iii)所述第三抗体包含分别为SEQIDNO:13、14和15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:16、17和18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，且其中所述第一、第二和第三抗体以彼此2:2:1的摩尔比存在。

提供制备包含三种抗体的抗EGFR抗体组合物的方法，其中所述抗体以2:2:1比率制备。更特定而言，在另一实施方案中，提供制备抗EGFR抗体组合物的方法，所述方法包括于单一组合物中组合：

其中(a)、(b)和(c)以彼此2:2:1的摩尔比组合。

也提供用三种抗EGFR抗体治疗受试者的方法，其中所述抗体以2:2:1比率施用于所述受试者。更特定而言，提供用抗EGFR抗体治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用：

(b)包含分别为SEQIDNO:7、8和9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:10、11和12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的单克隆抗体；和

其中(a)、(b)和(c)以彼此2:2:1的摩尔比施用于所述受试者。

以下小节中描述关于将抗EGFR抗体配制成药物组合物的更多细节和在EGFR相关疾病中使用所述组合物的方法。

III.产生抗体的方法

(i)单克隆抗体

本文中提供的单克隆抗体最通常是通过标准重组DNA技术，基于本文中公开的V_H区和V_L区的氨基酸序列来制备。

另外或或者，可使用多种已知技术，如标准体细胞杂交技术、B淋巴细胞的病毒或致癌转化、或使用人抗体基因文库的酵母或噬菌体展示技术来产生单克隆抗体。在特定实施方案中，所述抗体为完全人单克隆抗体。

因此，在一个实施方案中，使用杂交瘤方法来产生结合EGFR的抗体。在这个方法中，可用适合抗原免疫小鼠或其它适当宿主动物以引发产生或能够产生将与用于免疫的抗原特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可体外免疫淋巴细胞。随后可使用适合融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。测定杂交瘤细胞生长所处的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。在鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可通过限制稀释程序对克隆进行亚克隆且通过标准方法使其生长。适用于这个目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可作为动物体内的腹水肿瘤在体内生长。由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规免疫球蛋白纯化程序(例如像蛋白质A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法)自培养基、腹水或血清分离。

在另一实施方案中，结合EGFR的抗体可自使用熟知技术产生的抗体文库分离，所述技术如描述于以下专利中的技术：例如Ladner等的美国专利号5,223,409、5,403,484和5,571,698；Dower等的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等的美国专利号5,969,108和6,172,197；以及Griffiths等的美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081。另外，也可使用通过链改组来产生高亲和力(nM范围)人抗体，以及作为用于构建极大噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组。参见例如美国专利申请号09/856,907(PCT国际公布号WO00/31246)。

在一特定实施方案中，结合EGFR的单克隆抗体是使用噬菌体展示来产生。这个技术涉及产生具有自人供体分离的免疫球蛋白序列的独特组合且在产生的重链CDR中具有合成多样性的人Fab文库。随后筛选文库中结合EGFR的Fab。

在另一实施方案中，可使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生针对EGFR的人单克隆抗体(参见例如美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429，皆属于Lonberg和Kay；Surani等的美国专利号5,545,807；PCT公布号WO92/03918、WO93/12227、WO94/25585、WO97/13852、WO98/24884和WO99/45962，皆属于Lonberg和Kay；以及Korman等的PCT公布号WO01/14424)。

在另一实施方案中，可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来产生人抗体(参见例如Ishida等的PCT公布WO02/43478)。

此外，表达人免疫球蛋白基因的替代性转基因动物系统在本领域中可用且可用于产生抗EGFR抗体。举例而言，可使用称为Xenomouse(Abgenix公司)的替代性转基因系统；所述小鼠描述于例如Kucherlapati等的美国专利号5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584和6,162,963中。

此外，表达人免疫球蛋白基因的替代性转染色体动物系统在本领域中可用且可用于产生抗EGFR抗体。举例而言，可使用携带人重链转染色体与人轻链转染色体两者的小鼠。此外，携带人重链和轻链转染色体的母牛已在本领域中描述且可用于产生抗EGFR抗体。

在另一实施方案中，可使用产生所述抗体的转基因植物和/或培养的植物细胞(例如烟草、玉米和浮萍)制备抗体。举例而言，表达抗体的转基因烟草叶可用于通过例如使用可诱导性启动子来产生所述抗体。此外，转基因玉米可用于表达所述抗体及其抗原结合部分。抗体也可自包括如单链抗体(scFv)的抗体部分的转基因植物种子，例如使用烟草种子和马铃薯块茎大量产生。

使用包括本文公开的技术在内的任何技术制备的结合EGFR的单克隆抗体(或其部分)的结合特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定(如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体或其部分的结合亲和力也可通过Scatchard分析来测定。

在某些实施方案中，使用任何以上论述的方法产生的EGFR抗体可使用本领域认可的技术(如本文中描述的技术)进一步改变或优化以达成所需结合特异性和/或亲和力。

在一个实施方案中，源自EGFR抗体的部分抗体序列可用于产生结构和功能相关抗体。举例而言，抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原相互作用。因此，在个别抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更多样。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，所以有可能通过构建包括移植于具有不同性质的不同抗体的框架序列上的来自特定天然存在抗体的CDR序列的表达载体来表达模拟特定天然存在抗体的性质的重组抗体。所述框架序列可自包括生殖系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。

因此，抗EGFR抗体的一种或多种结构特征(如CDR)可用于产生保留至少一种所需功能性质(例如抑制表达EGFR的细胞的生长)的结构相关抗EGFR抗体。

在一特定实施方案中，本文中公开的一种或多种CDR区与已知人框架区和CDR重组组合以产生其它重组工程改造的抗EGFR抗体。重链和轻链可变框架区可源自相同或不同抗体序列。

本领域中熟知的是抗体重链和轻链CDR3结构域在抗体对抗原的结合特异性/亲和力方面起特别重要作用。因此，在某些实施方案中，产生包括本文中描述的特定抗体的重链和/或轻链CDR3的抗体。抗体可进一步包括本文中公开的抗体的重链和/或轻链CDR1和/或CDR2。

上述工程改造的抗体的CDR1、2和/或3区可包含如本文中公开的氨基酸序列一样的准确氨基酸序列。然而，一般技术人员应了解可能与准确CDR序列存在某一偏差，特别对于CDR1和CDR2序列而言，所述CDR1和CDR2序列可容许比CDR3序列更大的变化而不改变表位特异性(所述偏差为例如保守氨基酸取代)。因此，在另一实施方案中，工程改造的抗体可主要由与本文中列举的抗体的相应CDR例如90%、95%、98%、99%或99.5%一致的一种或多种CDR1和CDR2组成。

在另一实施方案中，可改变CDR的一个或多个残基以改进结合来达成更有利结合速率。使用这个策略，可达成具有例如10¹⁰M^-1或10¹⁰M^-1以上的超高结合亲和力的抗体。本领域中熟知的亲和力成熟技术和本文中描述的亲和力成熟技术可用于改变CDR区，随后筛选具有所需结合变化的所得结合分子。因此，当CDR改变时，可监测结合亲和力以及免疫原性的变化并计分以便达成针对最佳组合结合和低免疫原性优化的抗体。

也可在抗体的重链和/或轻链可变区的框架区或接合区的一者或多者内进行修饰，只要这些修饰之后的抗原结合亲和力优于10⁶M^-1即可。

在另一实施方案中，关于效应功能进一步修饰抗体，以例如增强抗体治疗癌症的有效性。举例而言，可将半胱氨酸残基引入Fc区中，从而允许在这个区中形成链间二硫键。由此产生的同二聚抗体可具有提高的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀死性和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚抗体也可使用异基双官能交联剂制备。或者，可工程改造具有双Fc区的抗体且因此其可具有增强的补体溶解和ADCC能力。

也提供如以下论述的双特异性抗体和免疫缀合物。

(ii)双特异性抗体

本文中的双特异性抗体包括至少两种针对EGFR的结合特异性，所述抗体优选结合非重叠或非竞争性表位。所述双特异性抗体可包括其它结合特异性，例如第三EGFR结合特异性和/或针对另一ErbB受体(例如ErbB3)或另一抗原(如致癌基因的产物)的结合特异性。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')₂双特异性抗体)。

制备双特异性抗体的方法在本领域中是熟知的(参见例如WO05117973和WO06091209)。举例而言，全长双特异性抗体可基于两个配对免疫球蛋白重链-轻链的共表达来产生，其中所述两个链具有不同特异性。也已描述直接自重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。举例而言，已使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。也已报道通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略。

在一特定实施方案中，双特异性抗体包含第一抗体(或其结合部分)，其与衍生或连接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白(例如针对受体的另一抗体或配体))的EGFR结合以产生与至少两个不同结合位点或靶标分子结合的双特异性分子。抗体可衍生或连接至一种以上其它功能分子以产生与两个以上不同结合位点和/或靶标分子结合的多特异性分子；所述多特异性分子也意图由如本文所用的术语“双特异性分子”涵盖。为产生双特异性分子，可使本文中公开的抗体功能性连接(例如通过化学偶合、基因融合、非共价缔合或其它方式)至一个或多个其它结合分子(如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)以产生双特异性分子。

因此，涵盖包含至少一种针对EGFR的第一结合特异性和针对第二靶标表位的第二结合特异性的双特异性分子。在一特定实施方案中，第二靶标表位是Fc受体，例如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，也提供能够与表达FcγR、FcαR或FcεR的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))和表达EGFR的靶标细胞两者结合的双特异性分子。这些双特异性分子使表达EGFR的细胞靶向效应细胞且触发Fc受体介导的效应细胞活性，如表达EGFR的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧化物阴离子的产生。

在一个实施方案中，双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv或单链Fv)作为结合特异性。抗体也可为轻链或重链二聚体或其任何最小片段，如Ladner等的美国专利号4,946,778中描述的Fv或单链构建体。

可使用本领域中已知的方法，通过缀合组成结合特异性(例如抗FcR和抗EGFR结合特异性)来制备双特异性分子。举例而言，双特异性分子的各结合特异性可分别产生且随后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶合或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯(磺基-SMCC)。优选缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者皆可自PierceChemical公司(Rockford,IL)获得。

当结合特异性是抗体时，其可通过两个重链的C端铰链区的巯基键结而缀合。在一特别优选实施方案中，在缀合之前修饰铰链区以含有奇数个(优选一个)巯基残基。

或者，两种结合特异性可在同一载体中编码且在同一宿主细胞中表达并装配。当双特异性分子是mAbxmAb、mAbxFab、FabxF(ab')₂或配体xFab融合蛋白时，这个方法特别有用。双特异性分子可为包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两种单链分子。制备双特异性分子的方法例如描述于以下专利中：美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858。

可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定确认双特异性分子与其特定靶标的结合。这些分析各自通常通过使用对特定相关蛋白质-抗体复合物具有特异性的标记的试剂(例如抗体)来检测相关复合物的存在。举例而言，FcR-抗体复合物可使用例如识别且特异性结合所述抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测。或者，复合物可使用多种其它免疫测定中的任一者来检测。举例而言，抗体可被放射性标记且用于放射免疫测定(RIA)中。放射性同位素可通过如使用αγ-β计数器或闪烁计数器的手段或通过自动放射摄影术来检测。

(iii)免疫缀合物

本文中提供的免疫缀合物可通过使本文中描述的抗体与另一治疗剂缀合来形成。适合试剂包括例如细胞毒性剂(例如化学治疗剂)、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)和/或放射性同位素(即放射缀合物)。

适用于产生所述免疫缀合物的化学治疗剂已于上文描述。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂吉菌素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecene)。多种放射性核素可用于产生放射缀合的抗EGFR抗体。实例包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。

免疫缀合物可使用多种双官能蛋白偶合剂，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(如戊二醛)、双-迭氮基化合物(如双(对迭氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)来制备。碳14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂(参见例如WO94/11026)。

IV.筛选抗体的方法

在产生抗体之后，可使用本领域中熟知的多种测定针对各种性质，如本文中描述的那些性质筛选所述抗体。

在一个实施方案中，使用例如纯化EGFR和/或表达EGFR的细胞(如A431细胞)针对与EGFR的结合筛选抗体(例如通过流动式细胞测量术或ELISA)。可进一步鉴定且比较由抗EGFR抗体结合的表位例如以鉴定非竞争性抗体(例如结合不同表位的抗体)以及竞争结合和/或结合相同或重叠表位的抗体。

可使用常规技术鉴定竞争性抗体和非竞争性抗体。所述技术包括例如免疫测定，其显示一种抗体阻断(或不阻断)另一抗体与靶标抗原结合的能力，即竞争性结合测定。在某一测定中测定竞争性结合，其中所测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原(如EGFR)特异性结合。已知多种类型的竞争性结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定；固相直接¹²⁵I标记RIA；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA和直接标记RIA。陈述于实施例中的材料和方法和下文实施例2中的表面等离子共振技术也可有利地用于这个目的。通常，所述分析涉及使用与固体表面结合的纯化抗原，或带有这些未标记测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白中任一者的细胞。竞争性抑制是通过测定在测试免疫球蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记的量来测量。通常，测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将使参考抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%以上。

确定本文中公开的抗体所结合的表位的其它筛选技术包括例如抗原:抗体复合物晶体的x射线分析，其提供表位的原子解析。其它方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变化形式的结合，其中归因于抗原序列内的氨基酸残基修饰的结合损失常被视为指示表位组分。此外，也可使用用于表位定位的计算组合方法。这些方法依赖于相关抗体能够使特定短肽自组合噬菌体展示肽文库亲和性分离。所述肽随后被视为确定对应于用于筛选肽文库的抗体的表位的前导物。对于表位定位，也已开发显示会定位构象不连续表位的计算算法。

在另一实施方案中，针对与在结合配体(例如EGF)后暴露的表位结合(即不抑制EGFR结合配体与EGFR结合)的能力筛选抗体(例如非竞争性抗体抗EGFR抗体)。所述抗体可通过例如在不存在(对照)或存在抗EGFR抗体下使表达EGFR的细胞(例如A431细胞)与标记的EGFR配体(例如放射性标记的或生物素化EGF)接触来鉴定。如果抗体不抑制EGF与EGFR结合，那么将观察到相对于不存在抗体下回收的标记的量，回收的标记的量无统计显著降低。或者，如果抗体抑制EGF与EGFR结合，那么将观察到相对于不存在所述抗体下回收的标记的量，回收的标记的量具有统计显著降低。

也可针对抗体的结合亲和力筛选(测试)抗体。此举可例如使用等离子共振测定(例如如下所述)来进行。

也可使用信号转导测定(如本文中描述的那些测定)针对抗体抑制通过EGFR进行信号转导的能力筛选抗体。举例而言，抗体抑制EGFR配体介导的EGFR磷酸化的能力可在存在和不存在所述抗体下通过用EGFR配体(例如EGF)处理表达EGFR的细胞来评估。随后可溶解细胞，离心粗溶解物以移除不溶性物质，且例如通过蛋白质印迹法，随后用抗磷酸酪氨酸抗体探测来测量EGFR磷酸化。

或者，抗体抑制通过EGFR进行下游信号转导的能力可通过在由EGF配体刺激EGFR之后针对已知EGFR底物(例如像AKT和/或ERK)的激酶测定来测量。举例而言，可将表达EGFR的细胞与候选抗体一起孵育且用EGF配体刺激。随后自所述细胞制备的细胞溶解物可用针对EGFR底物(或涉及EGFR的细胞路径中的蛋白)的抗体(如抗AKT抗体)免疫沉淀，且使用本领域认可的技术测定激酶活性(例如AKT激酶活性)。在抗体存在下，涉及EGFR的路径中的EGFR底物或蛋白的含量或活性(例如激酶活性)相对于不存在抗体下的含量或活性的降低或完全消失指示抗体抑制EGFR信号转导。

降低细胞表面上EGFR的含量的抗体可通过其下调或抑制肿瘤细胞上的EGFR表达的能力来鉴定。在某些实施方案中，抗体通过诱导EGFR的内化(或增加内吞作用)(例如通过内化和再循环受体和/或内化和降解受体)或通过抑制内化EGFR的再循环来降低细胞表面上的EGFR。为对此进行测试，可使EGFR生物素化且例如通过测量存在或不存在抗体下培养的单层细胞上生物素的量，随后免疫沉淀EGFR且用抗生蛋白链菌素探测，可易于测定细胞表面上EGFR分子的数目。在抗体存在下对生物素化EGFR的检测量随时间降低指示抗体会降低细胞表面上的EGFR含量。

也可使用本领域认可的技术测试抗体和抗体组合抑制表达EGFR的细胞(如肿瘤细胞)生长(体内或体外)的能力，所述技术包括以下实施例中描述的CellTiter-Glo测定、和氚标记的胸苷并入测定。也可针对抑制表达EGFR的细胞的球体生长的能力筛选抗体。此举可通过使用估算如本文所述的发展中肿瘤生长的条件的测定来进行。

在另一实施方案中，针对关于抑制特定EGFR活性或功能(如EGFR介导的信号转导)的IC50和/或IC90值(例如如通过ELISA、蛋白质印迹或多重方法(如)所测量)筛选抗EGFR抗体的组合。随后可选择各自具有特别需要的IC50和/或IC90值(例如抑制EGFR信号转导的IC90约80nM)的抗体的组合。在一个实施方案中，组合具有大于已知参考抗体(例如西妥昔单抗)的IC50或IC90值。在另一实施方案中，组合具有累加IC50或IC90(即当个别地作用于表达EGFR的细胞时，抗体的活性总和约等于所述抗体一起作用于相同细胞的组合效应)。在另一实施方案中，组合具有协同IC50或IC90(即当个别地作用于表达EGFR的细胞时，抗体的效应总和小于所述抗体一起作用于相同细胞的组合效应)。

V.药物组合物

另一方面，本文中提供组合物(例如药物组合物)，其含有与药学上可接受的载体一起配制的本文中公开的抗EGFR单克隆抗体的一者或组合。在一个实施方案中，组合物包括结合EGFR上的不同表位的多种(例如两种或三种)分离抗体的组合。所述抗体优选具有关于抑制特定EGFR活性或功能(如EGFR介导的信号转导)的累加或协同效应。优选药物组合物是无菌组合物、适于注射的组合物和适于通过所需施药途径(如通过静脉内注射)注射的无菌组合物。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上可相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。载体优选适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊椎或表皮施药(例如通过注射或输注)。视施药途径而定，活性化合物(即抗体、双特异性和多特异性分子)可包覆于某一材料中以保护所述化合物免受酸和可使所述化合物失活的其它天然条件的作用。

组合物可单独或以组合疗法(即与其它药剂组合)施用。举例而言，组合疗法可包括本文中提供的具有至少一种或多种其它治疗剂(如本文中描述的抗癌剂)的组合物。在一个实施方案中，组合疗法可使用本文中提供的具有本文中公开的两种或三种抗EGFR抗体的组合物。在另一实施方案中，组合疗法可使用包含至少一种本文中公开的抗EGFR抗体与一种或多种其它抗体，如一种或多种本领域中已知的其它抗EGFR抗体(例如如PCT申请号PCT/US2011/3528中公开的抗EGFR抗体)组合的组合物。所述组合物也可连同放射疗法和/或手术一起施用。也可与或不与其它治疗剂一起分别或相继施用抗EGFR抗体的特定组合。

组合物可通过本领域中已知的多种方法施用。如熟练技术人员所应了解，施药途径和/或模式将视所需结果而变化。抗体可与将防止抗体快速释放的载体一起制备，如控制释放制剂，包括植入物、经皮贴片和微囊封递送系统。可使用生物可降解、生物可相容聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备所述制剂的许多方法已申请专利或通常为本领域技术人员已知。

为通过某些施药途径施用组合物，可能必需用某一材料包覆成分(例如抗体)或将组合物与所述材料共施用以防止其不活化。举例而言，可使组合物于适当载体(例如脂质体或稀释剂)中来施用于受试者。可接受的稀释剂包括生理盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规脂质体。

可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。所述介质和试剂用于医药活性物质在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与抗体不相容，否则涵盖其用于本文中提供的组合物中。补充活性成分也可并入组合物中。

在制造和储存条件下，治疗组合物通常必须是无菌且稳定的。组合物可配制成溶液、微乳剂、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可例如通过使用如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需粒径和通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)可导致可注射组合物的吸收延长。

可通过将单克隆抗体以所需量在必要时与以上列举的一种成分或成分的组合一起并入适当溶剂中，随后进行微过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般而言，分散液是通过将抗体并入含有基础分散介质和来自上文列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。

调整剂量方案以提供最佳所需反应(例如治疗反应)。举例而言，可施用单次大丸剂，可随时间施用若干分次剂量，或剂量可如治疗情形的紧急性所指示按比例降低或增加。举例而言，人抗体可通过皮下注射每周施用一次或两次，或通过皮下注射每月施用一次或两次。

尤其有利的是以便于施药和剂量均一性的剂量单位形式配制肠胃外组合物。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于欲治疗受试者的单位剂量的物理个别单元；各单元含有经计算与所需医药载体联合产生所需治疗效应的预定量的抗体。本文中提供的剂量单位形式的规格由以下指定且直接取决于以下：(a)抗体的独特特征和欲达成的特定治疗效应，和(b)本领域中关于混配用于治疗个体敏感性的所述抗体的固有限制。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

对于治疗组合物，制剂包括适于经口、经鼻、局部(包括经颊和舌下)、直肠和肠胃外施用的那些制剂。肠胃外施药是用于包含抗体的治疗组合物的最常见施药途径。制剂可宜以单位剂型提供且可通过药学技术中已知的任何方法制备。可与载体物质组合以产生单一剂型的抗体的量将视所治疗的受试者和特定施药模式而变化。抗体的这个量将通常是足以产生治疗效应的量。通常，以百分之一百计，这个量将在以质量计约0.001%至约90%抗体的范围内，优选在约0.005%至约70%范围内，最优选在约0.01%至约30%范围内。

如本文所用的措词“肠胃外施药”和“肠胃外施用”意指除肠内和局部施药外的通常通过注射达成的施药模式，且不加限制地包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内、硬膜外和胸骨内注射和输注。可用于本文中提供的药物组合物中的适合水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。适当流动性可例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒径和通过使用表面活性剂来维持。

这些组合物也可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。本领域中熟知的佐剂的特定实例包括例如无机佐剂(如铝盐，例如磷酸铝和氢氧化铝)、有机佐剂(例如角鲨烯)、基于油的佐剂、病毒体(例如含有源自流感病毒的膜结合血球凝集素和神经胺酸苷酶的病毒体)。

防止存在微生物可通过灭菌程序和通过包括各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等)两者来确保。也可合乎需要的是在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可通过包括一种或多种延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝或明胶)来使可注射医药形式的吸收延长。

当组合物以医药形式施用人和动物时，其可单独给予或以含有例如0.001至90%(更佳0.005至70%，如0.01至30%)的活性成分与药学上可接受的载体组合的药物组合物形式给予。

无论选择何种施药途径，本文中提供的组合物均可以适合水合形式使用，且其可通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。

可改变本文中提供的药物组合物中抗体的实际剂量水平，以获得有效达成针对特定患者、组合物和施药模式的所需治疗反应，而不对患者具有毒性的活性成分的量。所选剂量水平将取决于多种药物动力学因素，包括所用特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施药途径、施药时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和先前病史以及医学技术中熟知的类似因素。具备本领域中一般技能的医师或兽医可易于确定且指定所需组合物的有效量。举例而言，医师或兽医可以低于为达成所需治疗效应所需水平的水平开始抗体剂量且逐渐增加剂量直至达成所需效应。一般而言，本文中提供的组合物的适合日剂量将为作为有效产生治疗效应的最低剂量的那个抗体量。所述有效剂量将通常取决于上述因素。优选静脉内、肌内、腹膜内或皮下施药，优选邻近靶标位点施用。必要时，治疗组合物的有效日剂量可任选以单位剂型以在全天内以适当间隔分开施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用。虽然有可能单独施用抗体，但优选以制剂(组合物)形式施用抗体。

治疗组合物可用本领域中已知的医学装置施用，例如以下中公开的那些医学装置：美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824、4,596,556、4,487,603、4.,486,194、4,447,233、4,447,224、4,439,196和4,475,196。

在某些实施方案中，可配制单克隆抗体以确保体内适当分布。举例而言，血脑屏障(BBB)隔绝许多高度亲水性化合物。为确保治疗抗体穿过BBB(必要时)，可将其例如配制于脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,399,331；5,891,468；6,056,973；6,210,707；6,224,903；6,316,024；7,122,202；7,135,177和7,507,407和美国专利公布20070116753。脂质体可包含一个或多个附着于和/或选择性转运至特定细胞或器官中，因此增强靶向药物递送的部分。

提供包含2:2:1比率的抗EGFR抗体三元组合的药物组合物，即所述组合物包含三种不同抗EGFR抗体，尤其是以特定2:2:1比率配制的与不同EGFR表位结合的P1X相关抗体、P2X相关抗体和P3X相关抗体。除三种抗体之外，这些药物组合物也可包含药学上可接受的载体和/或其它赋形剂，如以上详细描述者。药物组合物可提供于含有所有三种抗体的单一容器中，或者，药物组合物可包含含有三个不同容器的包装，各容器含有三种不同抗EGFR抗体之一(以及如上所述的药学上可接受的载体和/或其它赋形剂)。

提供上述抗EGFR抗体单独(作为单一药剂)、以成对组合(两种抗体)或以三元组合(三种抗体)形式制造治疗与EGFR依赖性信号转导相关的疾病的药剂的用途。也提供上述抗EGFR抗体，其单独(作为单一药剂)、以成对组合(两种抗体)或以三元组合(三种抗体)形式用于治疗癌症(或欲用于制造治疗癌症的药剂)，所述癌症如表达EGFR的癌症，如包括但不限于以下的癌症：黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、肾癌、胃肠癌、结肠癌、肺癌、胰脏癌、皮肤癌、头颈部癌、神经胶母细胞瘤、前列腺癌及其它实体和/或转移性肿瘤。

另外，涵盖的组合物可进一步包括其它治疗剂，例如其它抗癌剂，或被制备来在与另一治疗剂，例如另一抗癌剂的组合疗法中用作药剂。“抗癌剂”是用于治疗肿瘤、癌症、恶性肿瘤等的药物。药物疗法(例如用本文中公开的抗体组合物进行)可不与其它治疗一起施用，或与如手术、加热或放射疗法(例如用电离放射进行)的其它治疗组合施用。视涉及的器官或组织的性质而定，癌症治疗中可使用若干种类的抗癌剂。举例而言，乳癌通常用雌激素刺激，且可用使性激素失活的药物治疗。类似地，前列腺癌可用使雄激素失活的药物治疗。与本文中公开的抗体组合物组合使用的抗癌剂尤其包括列于附录A中的那些抗癌剂，其不应被视为限制性的。可与施用本文中公开的抗体组合物同时或在此之前或之后施用一种或多种抗癌剂。本文中公开的抗体组合物可相继或与其它抗癌剂(例如以下附录A中公开的抗癌剂)一起施用。

也提供包括任选含于单一小瓶或容器中的本文中公开的一种或多种抗EGFR抗体的试剂盒，且所述试剂盒包括例如用于治疗或诊断与EGFR上调和/或EGFR依赖性信号转导相关的疾病(例如癌症，如以下小节VI中描述的癌症)的说明书。试剂盒可包括指示试剂盒内含物的预定用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起或另外伴随试剂盒提供的任何书面营销材料或记录材料。所述试剂盒可包括如于单一剂量小瓶或单一剂量预装注射器中的呈单位剂型的抗体组合物。包括本文中公开的抗EGFR抗体的组合(例如P1X相关抗体、P2X相关抗体和P3X相关抗体的组合)的试剂盒可包括含有所述组合的所有组分的单一小瓶，或者，所述试剂盒可包括在单独小瓶中的各组分以及用于在组合疗法中施用抗体的说明书。在一优选实施方案中，P1X相关抗体、P2X相关抗体和P3X相关抗体以2:2:1比率提供于单一小瓶中，或者，与用于以2:2:1比率施用三种抗体的说明书一起各自提供于单独小瓶中。

VI.使用抗体的方法

本文中公开的抗体和组合物可用于广泛多种治疗和诊断应用，尤其致癌应用中。因此，另一方面，本文中提供通过以足以抑制EGFR介导的活性的量施用一种或多种本文中描述的抗体或组合物来抑制受试者中的EGFR活性的方法。可治疗的特定治疗适应症包括例如如皮肤、脑和中枢神经系统、头和颈、食管、胃、结肠、直肠、肛门、肝、胰脏、胆管、胆囊、肺或支气管、乳房、卵巢、子宫、子宫颈、阴道、睾丸、生殖细胞、前列腺、肾、输尿管、膀胱、肾上腺、垂体、甲状腺、骨、肌肉或其它结缔组织的器官或组织的癌症、白血病、多发性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’slymphoma)和非何杰金氏淋巴瘤。

本文中公开的抗体也可用于例如通过使本文中公开的一种或多种抗体、抗体对或抗体三元组合(例如离体或体内)与来自受试者的细胞接触，且测量与所述细胞上的EGFR结合的程度来诊断或预后与EGFR相关的疾病(例如癌症)，其中与EGFR的异常高程度结合指示所述受试者患有与EGFR相关的癌症。

也提供在涉及EGFR依赖性信号转导的多种离体和体内诊断和治疗应用(包括多种癌症)中使用本文中公开的抗EGFR抗体的方法。

因此，在一个实施方案中，提供通过以有效治疗与EGFR依赖性信号转导相关的疾病的量施用于受试者本文中提供的抗体或优选抗体组合来治疗所述疾病的方法。适合疾病包括例如多种癌症，包括但不限于黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、肾癌、胃肠癌、结肠癌、肺癌、胰脏癌、皮肤癌、头颈部癌、神经胶母细胞瘤、前列腺癌及其它实体和/或转移性肿瘤。

抗体可单独或与连同所述抗体起作用或与所述抗体起协同作用的另一治疗剂一起施用以治疗与EGFR介导的信号转导相关的疾病。所述治疗剂包括本文中描述的那些治疗剂，例如小有机分子、单克隆抗体、双特异性抗体、重组工程改造的生物制品、RNAi化合物、酪氨酸激酶抑制剂和商业抗体以及抗癌剂(例如细胞毒素、化学治疗剂、小分子和放射)。可与本文中公开的一种或多种抗EGFR抗体一起用于组合疗法中的抗癌剂的非限制性实例包括列于附录A中的那些抗癌剂。

其它实施方案描述于以下非限制性实施例中。

实施例

用于实施例的材料和方法

一般而言，除非另外指示，否则在以下实施例中使用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(尤其例如抗体技术)的常规技术以及重组免疫球蛋白制备中的标准技术。

细胞系

下述实验中欲使用的所有细胞系皆获自NationalCancerInstitute或ATCC。

细胞系：

A431–表皮样癌

DU145–前列腺癌

H1975–肺腺癌；非小细胞肺癌

HCC827–肺腺癌；非小细胞肺癌

EGFR细胞外结构域(EGFR-ECD)突变体的蛋白质纯化

产生EGFR细胞外结构域(EGFR-ECD)的突变体以用于mAb表位分区(binning)。基于西妥昔单抗(LiS.等,CancerCell.7:301-311,2005)和H11(SpanglerJ.等,PNAS.107:13252-13257,2010)表位两者以及基于对EGFR-ECD结构的结构分析(蛋白质数据库(ProteinDataBank)ID:1NQL;FergusonK.M.等,MolCell.11:507-517,2003)设计突变。使残基突变成如包括于本申请中的蛋白质序列中所指示的丙氨酸。表达构建体的DNA合成可以商业方式获自DNA2.0(www.dna20.com)。使用常规方法完成后续DNA亚克隆、于293F细胞中表达蛋白质、和蛋白质纯化。

抑制肿瘤细胞中EGFR或ERK的EGF介导信号转导

如下研究对配体介导的肿瘤细胞信号转导的抑制：A431或Du145细胞以35,000个细胞/孔或17,500个细胞每半孔的密度接种于96孔组织培养板中，且于补充有抗生素、2mML-谷氨酰胺和10%胎牛血清(FBS)的DMEM或RPMI-1640培养基中于37℃和5%二氧化碳下生长24小时。使细胞于具有抗生素和2mML-谷氨酰胺的1%FBS培养基中于37℃和5%二氧化碳下血清饥饿约20小时。随后，细胞与不同浓度的抗EGFR抗体一起预孵育2小时，并随后用人EGF配体(50ng/ml)(PeproTech，目录号AF-100-15)于37℃和5%二氧化碳下刺激10分钟。细胞用冰冷PBS洗涤且于50μl冰冷溶解缓冲液(用150mMNaCl和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，P714)改进的哺乳动物蛋白质提取物溶解缓冲液(MPER-Pierce，#78505))中通过于冰上孵育30分钟加以溶解。即刻通过ELISA分析溶解物的ERK(EGFR的下游效应物)和EGFR磷酸化，或在-80℃下冷冻直至使用。

ELISA测定

对于磷酸-EGFR夹心ELISA，用50μLEGFR抗体(EGFRAb-11，克隆：199.12，无BSA和迭氮化物，FisherScientific，目录号MS396P1ABX)涂布96半孔GREINER高结合板(目录号675077；GREINERBIO-ONE,Monroe,NC)，且在室温下孵育隔夜。次日早晨，用100μl/孔的PBST(0.05%吐温20)于BIOTEK洗板器上将板洗涤3次。随后用含2%BSA的PBS将板在室温下阻断约1小时。用100μl/孔PBST(0.05%吐温20)于BIOTEK洗板器上将板洗涤3次。将细胞溶解物(50μl)或标准物(pEGFRpY1068ELISA试剂盒，R&DSystems，目录号DYC3570)于50%溶解缓冲液和1%BSA-PBS中稀释(按照制造商的建议)且一式两份添加至板中，并在震荡下在室温下孵育2小时或在4℃下孵育隔夜。随后于BIOTEK洗板器中用100μl/孔的PBST(具有0.05%吐温20的PBS)将板洗涤3次。添加约50μl稀释于2%BSA,PBS中的与辣根过氧化酶(HRP)缀合的检测抗体(pEGFRpY1068ELISA试剂盒，R&DSystems，目录号DYC3570)且在室温下孵育约2小时。于BIOTEK洗板器中用100μl/孔的PBST(0.05%吐温20)将板洗涤3次。添加约50μLSUPERSIGNALPICOELISA底物且使用Envision(PerkinElmer)读板器读取板。对于数据分析，对重复样本求平均值且使用误差条表示两个重复实验之间的标准偏差。使用GraphPadPrism软件(GraphPadSoftware公司)通过相对于4参数逻辑方程进行数据回归来计算抑制曲线和相应IC50值。

类似于磷酸-EGFRELISA进行磷酸-ERKELISA，其中具有以下变化：人pERKELISADuoset试剂盒购自R&DSystems(目录号DYC1018-5)且如制造商所建议加以使用。

使用EGFR-ECD野生型(WT)、Bin1表位突变体或Bin3表位突变体作为捕捉试剂(4μg/ml)进行直接ELISA。用50μL捕捉试剂涂布96半孔GREINER高结合板(目录号675077；GREINERBIO-ONE,Monroe,NC)且在室温下孵育隔夜。次日早晨，于BIOTEK洗板器中用100μl/孔的PBST(0.05%吐温20)将板洗涤3次且用含1%BSA的PBS(pH7.2)在室温下阻断约1小时。将稀释于含1%BSA的PBS(pH7.2)中的不同浓度(1、0.25、0.06和0.02μg/ml)的单克隆抗体(mAb)与捕捉试剂一起在室温下孵育2小时，随后用于含1%BSA的PBS(pH7.2)中1:50,000稀释的过氧化酶缀合的AffiniPure山羊抗人IgGFc片段(JacksonImmunoresearch，目录号109-035-008)检测2小时。添加约50μLSupersignalPICOELISA底物且使用Envision(PerkinElmer)读板器读取板。对于数据分析，对重复样本求平均值且使用误差条表示两个重复实验之间的标准偏差。

结合亲和力：动力学排除测定(KinExA)

使用KinExA仪器(SAPIDYNEInstruments,Boise,ID)在具有重组EGF受体的溶液中测量抗体的亲和力和交叉反应性。用于这个测定的材料是KinExA3000仪器和软件(SapidyneInstruments,Boise,ID)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠粒(SapidyneInstruments)、人抗EGFRIgG、重组人EGFR、Cy5缀合的山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA)、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)和于PBS中的牛血清白蛋白(100mg/ml)。

为使重组EGF受体与PMMA珠粒偶合，将100μg重组EGFR添加至200mgPMMA珠粒的预测量等分试样中，且添加PBS以使总体积为1ml。将珠粒在室温下于转轮上孵育1小时。随后将珠粒短暂离心且移除上清液。向珠粒中添加100μl含100mg/mlBSA的PBS，进一步添加PBS以使总体积为1ml。再次将珠粒在室温下于转轮上孵育1小时。随后将珠粒转移至含有27mLPBS的玻璃瓶中。

为测定单价抗体结合亲和力，于具有恒定浓度的抗EGFR抗体的5mlPBS中制备重组EGFR的十二步稀释系列(75nM、25nM、8.3nM、2.8nM、0.9nM、0.3nM、100pM、33pM、11pM、4pM、1.3pM、0pM)。为进行精确亲和力测量，总抗体结合位点浓度(“ABC”；归因于价数而为抗体摩尔浓度的两倍)应小于抗体对EGFR的单价亲和力。将抗体-受体混合物在室温下孵育2小时以达成平衡。视抗体-受体复合物的预期亲和力而定，可相应调整这个平衡时间。使用储备(2mg/mL)抗体于PBS中的1:1000稀释液，于单独管中制备15mL的2μg/mLCy5缀合的抗人IgG二次抗体。随后，将KinExA仪器线与12个抗体-受体溶液管的各者连接。通过填充式EGFR-珠粒柱注射各溶液。(KinExA仪器自动填充用于各注射的新鲜珠粒柱。)在洗涤步骤之后，使标记的二次抗体穿过柱。最后，使用处于不同受体浓度下的未复合受体的测量量，在KinExA软件中将平衡滴定数据相当于1:1结合模型拟合以得到亲和力值K_D。K_D值越低，结合亲和力越佳(愈强，有时表述为越高)。因此，陈述抗体以xnM或更佳的K_D结合意指抗体以例如1x10^-8M(10nM)的K_D值或以例如1x10^-10M(0.1nM)的较低K_D值结合，其中较低K_D值指示较佳(较高)亲和力。

为使用KinExA“直接方法”测定结合速率，使用以上方法和总抗体结合位点浓度(ABC)来确定平衡单价结合亲和力(K_D)。随后，使用“理论结合曲线显示(TheoreticalBindingCurveDemonstration)”软件(SapidyneInstruments)，确定动力学实验的起始抗原浓度(L0)。为此，输入在单价结合亲和力实验中测定的亲和力和ABC值，且选择起始抗原浓度作为在平衡时大致20%抗体将不与抗原结合的那个浓度。此确保实验中的信噪比良好。使用储备(2mg/mL)抗体于PBS中的1:1000稀释液制备15mL的2μg/mLCy5缀合的抗人IgG二次抗体。在单独管中制备2xABC浓度的8mL抗EGFR抗体溶液。这个浓度是操作浓度的两倍，因为溶液在实验之前与8mL抗原溶液混合。在单独管中制备2xL0浓度的8mL重组EGFR溶液。这个浓度也是操作浓度的两倍，因为溶液在实验之前与8mL抗体溶液混合。随后，将EGFR涂布的珠粒和二次抗体溶液分别置于适当容器和管线中。将抗体和抗原溶液充分混合且立即与适当管线连接，且使用KinExA软件来测量所得溶液中随时间而变的游离抗体量。为确定缔合常数k_on(Kon)，使用KinExA软件将随时间而变的游离抗体量的减少相当于可逆双分子速率方程拟合。解离常数K_off(Koff)等于K_on*K_D(Kd)。

结合亲和力：表面等离子共振测定

如下进行表面等离子共振测定：

使用胺偶合将抗体或抗原(300RU)固定于CM5芯片上。随后注射不同浓度的抗体或抗原以研究其与固定的蛋白的缔合和解离。在不同注射之间，使用适合再生缓冲液(如甘胺酸，pH2.5)使芯片再生。使用方程1拟合解离相以确定K_off(解离速率)：

R=R_o*exp(-K_off*t)(1)

使用这个K_off值和方程2拟合缔合相以确定K_on(缔合速率)和K_D(平衡常数)。

R = \frac{R_{\max} * C}{K_{D} + C} (1 - \exp (- (K_{on} * C + K_{off}) t) - - - (2)

其中C表示溶液中抗原或抗体浓度，R_max表示饱和信号且t表示时间。

表位分区：表面等离子共振测定

如上所述，使用表面等离子共振测定进行表位分区。将一种抗体固定于芯片的表面上。随后注射重组表达的人EGFR细胞外结构域(EGFR-ECD)。当EGFR-ECD与缀合于芯片表面的抗体缔合时，共振信号增强。相继注射属于三个小区1、2和3的抗体。如果抗体结合与注射的抗体重叠的表位，那么与先前注射相比，信号将不变化。如果抗体与非重叠表位结合，那么芯片上的信号将高于先前注射。最后将与芯片结合的抗体作为游离配体注射以确认缺少与重叠表位的结合。

细胞结合测定

如下进行用于确定K_D值的细胞结合测定：在37℃下用3mL胰蛋白酶-EDTA使A431细胞剥离5分钟。立即向胰蛋白酶化细胞中添加完全DMEM(10mL)，温和再混悬且于Beckman台式离心机中以1100rpm短暂离心5分钟。将细胞以2x10⁶个细胞/ml的浓度再混悬于染色缓冲液(PBS+0.2%BSA+0.1%迭氮化钠)中且将50μl(1x10⁵个细胞)等分试样接种于96孔滴定板中。

在染色缓冲液中制备2000nM抗EGFR抗体的300μl储备溶液且将其中100μl连续稀释于200μl染色缓冲液中。稀释抗体的浓度在2000nM至0.1nM范围内。随后将150μl不同蛋白质稀释度的等分试样直接添加至50μl细胞混悬液中，从而得到最终浓度1500nM、500nM、166.7nM、55.6nM、18.5nM、6.17nM、2.05nM、0.68nM、0.23nM和0.076nM的抗体。

将96孔板中的等分细胞与抗体稀释液一起在室温下在震荡下孵育2小时且用300μl染色缓冲液洗涤3次。随后在4℃下在震荡下将细胞与100μlAlexa647标记的山羊抗人IgG于BD染色缓冲液中的1:750稀释液一起孵育45分钟。最后，将细胞洗涤两次，使其集结且再混悬于250μl染色缓冲液+0.5μg/ml碘化丙啶中。在使用FL4通道的FACSCALIBUR流动式细胞仪中对10,000个细胞进行分析。将MFI值和抗EGFR抗体的相应浓度分别绘于y轴和x轴上。使用GRAPHPADPRISM软件，使用用于非线性回归曲线的单位点结合模型确定分子的K_D。

基于公式Y=Bmax*X/K_D+X(B_max=饱和时的荧光。X=抗体浓度。Y=结合程度)计算K_D值。

通过免疫印迹法测量EGFR含量

为制备细胞溶解物，将H1975细胞胰蛋白酶化，收集，计数，且以1x10⁶个细胞/孔接种于6孔皿中并孵育隔夜以使其附着于培养板。将细胞用1μM浓度的P1X+P2X+P3X(P1X+P2X+P3X或P1X、P2X和P3X指示2:2:1摩尔比的P1X、P2X和P3X组合)预处理1、2、5和24小时，随后用rhEGF(Peprotech，目录号100-15)刺激10分钟。细胞用100μl哺乳动物蛋白质提取试剂(MammalianProteinExtractionReagent，Pierce，目录号78505)溶解。对蛋白质提取试剂补充PhosSTOP(Roche，目录号04906837001)和蛋白酶抑制剂混合物(ProteaseInhibitorCocktail)片(Roche，目录号04693124001)。通过于样本缓冲液中煮沸5分钟使H1975细胞提取物变性，经受还原条件，且在200V下使用SDS-PAGE4-12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳50分钟。在将蛋白质转移至硝化纤维素膜之后，通过在室温下与Odyssey阻断缓冲液(LI-COR，目录号927-400-00)一起孵育一小时来阻断非特异性位点。视需要将膜与以下一起孵育：小鼠单克隆抗EGFR(1F4–标记性tEGFR；CellSignaling，目录号2239)；兔单克隆抗phospho44/42MAPK(Erk1/2，Thr202/Tyr204，D13.14.4E-标记性pERK；CellSignaling，目录号4370)；兔单克隆抗phosphoAKT(Ser473，193H12；CellSignaling，目录号4058)；兔单克隆phospho-c-Jun(Ser73，D47G9–标记性p-c-Jun；CellSignaling，目录号3270)；和兔抗PCNA(FL-261)(SantaCruzBiotechnology，目录号sc-7907)。在与一次抗体一起孵育隔夜之后，将免疫印迹与适当IRDye标记的二次抗体(IR800CW山羊抗小鼠(Odyssey，目录号926-3210)或IR800CW山羊抗兔(Odyssey，目录号926-3211))一起孵育10分钟且使用SNAPi.d.蛋白质检测系统(Millipore)通过膜来抽真空。使用LI-COROdyssey红外成像系统(LI-COROdysseyInfraredImagingSystem)检测条带且使用Odyssey软件进行分析。

体外抑制肿瘤细胞增殖

如下体外检查对表达EGFR的细胞的细胞增殖的抑制：以5,000个细胞/孔将HCC827和H1975癌细胞接种于96孔组织培养板中且于补充有抗生素、2mML-谷氨酰胺和10%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基中于37℃和5%二氧化碳下生长24小时。随后在存在不同浓度的P1X+P2X+P3X或西妥昔单抗(Bristol-MyersSquibb)下将培养基转换成补充有50ng/mLEGF或200ng/mlAREG(两性调节蛋白；R&DSystems)的RPMI-1640(含抗生素、2mML-谷氨酰胺、1%FBS)。根据制造商说明书，使用(CTG)发光细胞活力测定(LuminescentCellViabilityAssay)(PromegaCorporation，目录号G7572)测量细胞活力。所述CTG测定基于对存在的ATP定量来测量培养物中的活细胞数目，ATP是代谢活性细胞的指示物。对照处理包括在存在(称为“+EGF”或“+AREG”)或不存在(称为“-EGF”或“-AREG”)50ng/mLEGF或200ng/mlAREG下用含抗生素、2mML-谷氨酰胺、1%FCS的RPMI-1640处理细胞。

DU145和H1975小鼠异种移植物研究

用细胞皮下注射P1X、P2X和P3XNu/nu小鼠(CharlesRiverLabs)的组合。使所得肿瘤生长直至其达到300mm³的平均尺寸。随后用指示浓度的P1X与P2X和P3X的组合起始给药，西妥昔单抗或匹配体积的PBS作为媒介物对照。以4天间隔进行测量且使用公式体积=π/6x(WxL²)计算肿瘤体积。校正西妥昔单抗和P1X+P2X+P3X剂量以提供统一血清暴露量。

于DU145前列腺癌细胞异种移植物鼠类小鼠模型中评估P1X与P2X和P3X的组合的体内功效。向nu/nu小鼠侧腹皮下注射8x10⁶个DU145细胞。一旦肿瘤达到300mm³的平均尺寸即起始治疗。各组10只小鼠用以下任一者处理：媒介物对照(PBS)；2.075mg/kg西妥昔单抗、P1X与P2X和P3X，组分浓度处于被设计来提供小鼠中分别对于P1X、P2X和P3X为2:2:1C_max的“鼠类比率”下，如下：P1X=2.53mg/kg，P2X=7.26mg/kg和P3X=0.66mg/kg。西妥昔单抗组中的小鼠每四天给药一次。P1X+P2X+P3X组中的小鼠每两天给药一次。选择这些剂量和给药间隔以提供西妥昔单抗和鼠类比率抗体三元组合的等效血清暴露量。

配体拮抗细胞结合测定

如下进行用于确定在单一或多种抗体存在下的EGF配体结合的细胞结合测定：在37℃下用5mL胰蛋白酶-EDTA将A431细胞剥离5分钟。立即向胰蛋白酶化细胞中添加完全DMEM(10mL)，温和再混悬且于Beckman台式离心机中以1200rpm短暂离心7分钟。以3x10⁵个细胞/ml的浓度将细胞再混悬于染色缓冲液(PBS+2%FBS+0.1%迭氮化钠)中，且将100μl(3x10⁴个细胞)等分试样接种于96孔滴定板中。

于染色缓冲液中以各实施例中指示的浓度制备抗EGFR抗体的5mL2x储备溶液。于染色缓冲液中制备10mL与生物素标签缀合的重组人EGF配体(生物素-EGF)的3x储备溶液，且将其中100μl连续稀释于200μl染色缓冲液中。稀释生物素-EGF的浓度在600nM至9pM范围内。随后将抗EGFR抗体的100μl等分试样直接添加至100μl细胞混悬液中，从而得到如各实施例中指示的最终浓度。将96孔板中的等分细胞与抗体稀释液一起在室温下孵育1小时。随后将生物素-EGF的100μl等分试样直接添加至100μl细胞混悬液中，从而得到最终浓度200nM、66.67nM、22.22nM、7.41nM、2.47nM、0.82nM、0.27nM、0.09nM、0.03nM、0.01nM和0.003nM的生物素-EGF。将96孔板中的等分细胞与抗体和生物素-EGF稀释液一起在室温下孵育10分钟，用100μl染色缓冲液洗涤1次，并随后于Beckman台式离心机中以1200rpm短暂离心7分钟。将细胞在室温下在黑暗中再混悬于100μlAlexa647抗生蛋白链菌素缀合物(InvitrogenLifeTechnologies)于染色缓冲液中的1:500稀释液中30分钟。最后，用100μl染色缓冲液洗涤细胞两次，使其集结且再混悬于80μl固定缓冲液(PBS+2%FBS+2%多聚甲醛)中并转移至96孔U形底测定板(BectonDickinson)中且用箔片密封并储存在4℃下。

在使用FL4通道的FACSCALIBUR流动式细胞仪中对10,000个细胞进行分析。使用WinList6.0软件分析数据。将平均荧光强度(MFI)值和生物素-EGF配体的相应浓度分别绘于y轴和x轴上。

实施例1：表位定位/分区

通过亲本抗体的亲和力成熟产生抗体P1X、P2X和P3X。相应亲本抗体ca、cd和ch公开于共同申请的专利申请号PCT/US2011/3528中。进行表位定位和分区实验以证实P1X、P2X和P3X如同其相应亲本分子一样共有相同非重叠表位。

设计小区以便所选抗体将跨越EGFR的细胞外结构域(ECD)上的三个不同非重叠表位。这些小区分组为三种小区：Bin1定位于EGFR的结构域III且表示c225表位(西妥昔单抗结合位点)；Bin2定位于结构域I且表示ICR10表位(AbcamAb231)(Cochran等(2004)JournalofImmunologicalMethods,287:147-158)；且Bin3定位于结构域III且表示克隆H11表位(SpanglerJ.等,PNAS.107:13252-13257,2010)。产生Bin1(B1-7MT-Ala)和Bin3(B3-4MT)突变体以用于在EGFR细胞外结构域中以下用粗体展示的氨基酸位置处的表位定位。

EGFRECD(SEQIDNO:33)

1MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEV

61VLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALA

121VLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDF

181QNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGC

241TGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYV

301VTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFK

361NCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAF

421ENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKL

481FGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCN

541LLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVM

601GENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSHHHHHH

使用标准重组DNA技术在加粗氨基酸位置处制备以下取代突变体以产生具有以下突变残基的Bin1(B1)和Bin3(B3)表位突变体：

突变体

Bin1(B1)突变残基

B1-7MT-Ala:Q408A、Q432M、H433E、K467A、K489A、I491A、N497A

Bin3(B3)突变残基

B3-4MT:S380A、F381G、T382A、H383G

使用EGFR-ECD野生型(WT)、Bin1表位突变体(c225表位)或Bin3表位突变体(H11表位)作为捕捉试剂进行直接ELISA。将不同浓度(1、0.25、0.06和0.02μg/ml)的单克隆抗体(mAb)P1X(Bin1)、P2X(Bin2)和P3X(Bin3)与捕捉试剂一起在室温下孵育2小时，随后用HRP缀合的抗人Fc多克隆抗体检测1小时。如图1A所示，所有三种抗体均与EGFR的WT细胞外结构域结合，而Bin1抗体P1X不与Bin1突变表位结合，且P3X抗体不与Bin3突变表位结合。

进行表面等离子共振实验以证实P2X与EGFR细胞外结构域的结构域I上的ICR10表位缔合(图1B)。使ICR10与BIACORE芯片的表面缀合。注射0.5μMEGFR-ECD，随后相继注射0.5μM抗体P1X(Bin1)、P2X(Bin2)和P3X(Bin3)。虽然观察到P1X和P3X同时与ICR10结合的EGFR-ECD缔合，但P2X显示不缔合。

为证实P1X、P2X和P3X的表位不同且是非重叠的，进行一系列三表面等离子共振分区实验。使P1X(图2A)、P2X(图2B)或P3X(图2C)与BIACORE芯片的表面缀合。注射0.5μMEGFR-ECD，随后相继注射0.5μM抗体P3X、P2X和P1X。注射与BIACORE芯片上所缀合相同的抗体作为阴性对照。在所有三个实验中，观察到来自剩余小区的两种抗体与EGFR-ECD缔合。因此，三个实验的结果证实P1X、P2X和P3X具有非重叠不同表位且可同时与EGFR-ECD缔合。

实施例2：结合亲和力

通过KinExA测量P1X、P2X和P3X对EGFR的单价亲和力。数据展示于下表1中。P1X、P2X和P3X的亲和力均优于0.4nM且相对于亲本分子均提高。P1X的亲和力(11pM)比Bin1亲本分子ca(145pM)优13.18倍。P2X的亲和力(70pM)比Bin2亲本分子cd(540pM)优7.71倍。P3X的亲和力(360pM)比Bin3亲本分子ch(757pM)优2.10倍。

表1

抗体	缔合速率(1/M*s)	解离速率(1/s)	K_D(M)
				P1X	3.73E+06	4.10E-05	1.10E-11
ca(P1X亲本)	N.D.	N.D.	1.45E-10
				P2X	7.06E+05	4.94E-05	7.00E-11
cd(P2X亲本)	9.62E+05	5.20E-04	5.40E-10
				P3X	1.16E+06	4.16E-04	3.60E-10
ch(P3X亲本)	5.87E+05	4.44E-04	7.57E-10

实施例3：用单一抗体进行的细胞结合测定

进行细胞结合测定以证实单克隆抗体P1X、P2X和P3X可与A431细胞上的EGFR缔合(图3)。将A431细胞与单一抗体的稀释系列一起孵育2小时，且通过定量流动式细胞测量术(如以上方法章节中所述)测量所结合抗体的量。抗体的稀释系列中使用的浓度展示于下表2中。一般技术人员应了解表2中的各特定浓度值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

表2

使用GraphPad软件，通过相对于4参数逻辑方程进行回归，在这些实验条件下的细胞上结合亲和力计算为168pM(P1X)、340pM(P2X)和748pM(P3X)。

实施例4：由单一抗体达成的磷酸-EGF受体信号转导抑制

用单一抗体处理A431细胞且通过磷酸-EGFRELISA测量其抑制EGF依赖性磷酸-EGFR活性的能力。P1X和P2X以剂量依赖性方式强力抑制磷酸-EGFR活性，相应IC50值为3.09nM和4.19nM，而用P3X处理会引发部分磷酸-EGFR抑制(图4)。抗体的稀释系列中使用的浓度展示于下表3中。一般技术人员应了解表3中的各特定浓度值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

表3

实施例5：由单一抗体和成对抗体组合达成的磷酸-ERK信号转导抑制以及与亲本抗体的比较

用单一P1X或ca抗体的稀释系列处理A431细胞且通过磷酸-ERKELISA测量磷酸-ERK抑制(图5A)。P1X引发对磷酸-ERK活性的剂量依赖性抑制，而ca亲本抗体仅引发部分抑制。

用P1X+P3X或其相应亲本抗体ca+ch的成对组合的稀释系列处理A431细胞且通过磷酸-ERKELISA测量磷酸-ERK抑制(图5B)。两种组合皆以剂量依赖性方式抑制磷酸-ERK产生，但P1X+P3X的组合提供优越抑制。P1X+P3X的组合引发磷酸-ERK活性抑制82%，而亲本组合仅引发71%抑制，如通过使用GraphPadPrism软件相对于4参数逻辑方程拟合所计算。

用P1X+P2X或其相应亲本抗体ca+cd的成对组合的稀释系列处理A431细胞且通过磷酸-ERKELISA测量磷酸-ERK抑制(图5C)。两种组合皆以剂量依赖性方式抑制磷酸-ERK产生，但相对于亲本组合，P1X+P2X的组合显示IC90值存在可观察性提高。

抗体的稀释系列中使用的浓度展示于下表4(关于图5A中的数据)和表5(关于图5B和5C中的数据)中。一般技术人员应了解表4和5中的各特定浓度值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

表4

表5

浓度，Log(摩尔浓度)	浓度，nM
		-5.69897	2000.00
-6.176091	666.67
		-6.653213	222.22
-7.130334	74.07
		-7.607455	24.69
-8.209515	6.17
		-8.811575	1.54
-9.413635	0.39
		-10.01569	0.10
-10.61775	0.02

应注意表5中展示的浓度是所用抗体对的总浓度。所用比率是1:1，因此抗体对中的各个别抗体占总浓度的一半。

实施例6：由不同组合比率的P1X、P2X和P3X达成的磷酸-ERK信号转导抑制

用P1X的稀释系列处理A431细胞且通过ELISA测量磷酸-ERK抑制(图6A)。抗体的稀释系列中使用的浓度展示于下表6中。一般技术人员应了解表6中的各特定浓度值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

表6

实验如方法章节中所述来进行。在这些实验条件下，P1X在饱和剂量下抑制81%的磷酸-ERK活性且IC50值是约25nM(27nM)。因此，IC50图上的近似位置在图6A中由“25nM”指示且将25nM设定为以下实验中的恒定P1X浓度。

用5个组合比率的P3X+P2X的稀释系列以及25nM的恒定P1X浓度处理A431细胞且通过ELISA测量磷酸-ERK抑制(图6B)。抗体的稀释系列中使用的浓度展示于下表7中。一般技术人员应了解表7中的各特定浓度值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

表7

浓度，Log(摩尔浓度)	浓度，nM
		-5.69897	2000.00
-6.176091	666.67
		-6.653213	222.22
-7.130334	74.07
		-7.607455	24.69
-8.084577	8.23
		-8.561698	2.74
-9.038818	0.91
		-9.51594	0.30
-9.993061	0.10

应注意表7中展示的浓度是P2X+P3X的总浓度。P2X和P3X的个别浓度取决于指示的比率。实验如方法章节中所述来进行。所用P3X:P2X比率是1:0、0:1、1:2、2:1和1:1。所有比率皆抑制超过70%的磷酸-ERK活性，其中含有所有三种抗体的那些组合提供最高抑制程度。

用6个组合比率的P1X:P2X:P3X的稀释系列处理A431细胞且通过ELISA测量磷酸-ERK抑制(图6C)。抗体的稀释系列中使用的浓度展示于下表8中。一般技术人员应了解表8中的各特定浓度值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

表8

实验如方法章节中所述来进行。所用P1X:P2X:P3X比率是1:0.01:1、1:0.1:1、1:1:1、2:0.01:1、2:0.1:1和2:2:1。所有比率皆抑制超过70%的磷酸-ERK活性。

用5个组合比率的P1X:P2X的稀释系列处理A431细胞且通过ELISA测量磷酸-ERK抑制(图6D)。抗体的稀释系列中使用的浓度展示于下表9中。一般技术人员应了解表9中的各特定浓度值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

表9

应注意表9中展示的浓度是P1X+P2X的总浓度。P1X和P2X的个别浓度取决于指示的比率。实验如方法章节中所述来进行。所用P1X:P2X比率是1:2、5:1、9:1、50:1和1:5。在实验中，除1:5外的所有比率(P1X:P2X)皆在所用浓度范围内抑制超过70%的磷酸-ERK活性。然而，拟合1:5比率(P1X:P2X)数据的4参数逻辑抑制曲线预测这个组合将以35.7nM的浓度达成70%磷酸-ERK抑制，所述浓度略高于实验中使用的剂量且完全在生理条件下可达到的范围内。

实施例7：由P1X、P2X和P3X的2:2:1比率组合达成的磷酸-EGFR和磷酸-ERK信号转导抑制

用2:2:1摩尔比组合(在这个摩尔比下的这个组合在本文中称为“P1X+P2X+P3X”)的抗体P1X、P2X和P3X的稀释系列处理A431细胞且通过ELISA测量磷酸-EGFR和磷酸-ERK抑制(图7A)。抗体的稀释系列中使用的浓度展示于下表10中。一般技术人员应了解表10中的各特定浓度值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

表10

浓度，Log(摩尔浓度)	浓度，nM
		-6.30	500.00
-6.78	166.67
		-7.26	55.56
-7.73	18.52
		-8.21	6.17
-8.69	2.06
		-9.16	0.69
-9.64	0.23
		-10.12	0.08
-10.60	0.03

应注意表10中展示的浓度是P1X+P2X+P3X的总浓度。所用比率是2:2:1，因此P1X、P2X和P3X的个别浓度分别是40%、40%和20%。实验如方法章节中所述来进行。三种抗体的组合是磷酸-EGFR活性和磷酸-ERK活性两者的强力抑制剂，相应IC50值是2.30nM和9.87nM。

将P1X+P2X+P3X与单一P1X(图7B)和单一P2X(图7C)相比较。用抗体的稀释系列处理A431细胞且通过ELISA测量磷酸-ERK抑制。用于图7B和7C中展示的实验的抗体的稀释系列中使用的浓度展示于下表11中。一般技术人员应了解表11中的各特定浓度值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

表11

应注意表11中展示的浓度是P1X+P2X+P3X的总浓度。所用比率是2:2:1，因此P1X、P2X和P3X的个别浓度分别是40%、40%和20%。除使用80nM的EGF配体刺激细胞之外，实验如方法章节中所述来进行。与分别提供部分抑制和不提供抑制的P1X和P2X相比，抗体的2:2:1比率组合是磷酸-ERK活性的强力抑制剂。

实施例8：在用P1X+P2X+P3X处理之后H1975细胞中的EGF受体下调和pERK、pAKT和p-c-Jun信号转导抑制

如以上方法章节中所述，使细胞与等于1μM总抗体的P1X+P2X+P3X一起预孵育2小时，随后用50ng/mlrhEGF(PeproTech)刺激10分钟。用针对tEGFR、pERK、pAKT或p-c-Jun的抗体分别探测细胞溶解物的免疫印迹，且将条带的密度测定法相对于上样对照PCNA和对照未处理细胞的溶解物校正。响应于P1X+P2X+P3X处理的EGF受体下调展示于图8A中且响应于P1X+P2X+P3X处理的pERK、pAKT和p-c-Jun信号转导抑制展示于图8B中。

实施例9：体外抑制肿瘤细胞增殖

通过上述方法或其微小变化形式分析体外肿瘤细胞增殖抑制。将非小细胞肺癌(NSCLC)株系HCC827和H1975以5000个细胞/孔接种且用在0.1-1μM(最终浓度)范围内的抗体组合处理。图9A-9D展示使用(CTG)发光细胞活力测定(PromegaCorporation)测量的细胞增殖抑制，所述测定基于对存在的ATP定量来测量培养物中的活细胞数目，ATP是代谢活性细胞的指示物。图9A和9B展示在EGF配体存在下，在P1X+P2X+P3X浓度范围内对HCC827和H1975细胞生长的强力抑制，但细胞生长不受西妥昔单抗处理或单独测定培养基(1%FCS)抑制。图9C和9D展示在AREG配体存在下，在P1X+P2X+P3X和cetuximab两者的浓度范围内对HCC827和H1975细胞生长的强力抑制，但细胞生长不受单独分析培养基(1%FCS)抑制。这些结果证实P1X+P2X+P3X能够响应于高亲和力(EGF)和低亲和力(AREG)配体体外抑制肿瘤细胞增殖，而西妥昔单抗仅在用低亲和力(AREG)配体处理的细胞中有效。用于图9A-D中展示的实验的抗体的稀释系列中使用的浓度展示于下表12中。一般技术人员应了解表12中的各特定浓度值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

表12

应注意表12中展示的浓度是P1X+P2X+P3X的总浓度。所用比率是2:2:1，因此P1X、P2X和P3X的个别浓度分别是40%、40%和20%。

实施例10：体内抑制肿瘤细胞增殖

在H1975肺癌细胞异种移植物鼠类小鼠模型中评估P1X+P2X+P3X的体内功效。向nu/nu小鼠侧腹皮下注射2x10⁶个NCI-H1975细胞。一旦肿瘤达到300mm³的平均尺寸即起始治疗。用以下各物处理各组10只小鼠：媒介物对照(PBS)；或在以下组分浓度下的鼠类比率抗体三元组合：鼠类比率抗体三元组合-低P1X=2.53mg/kg、P2X=7.26mg/kg且P3X=0.66mg/kg，或鼠类比率抗体三元组合-中等P1X=5.06mg/kg、P2X=14.52mg/kg和P3X=1.33mg/kg。每两天处理小鼠一次。

图10A(DU145异种移植物模型)和图10B(H1975异种移植物模型)中展示的结果证实P1X+P2X+P3X能够体内抑制肿瘤细胞增殖。

实施例11：用单一抗体进行的配体拮抗细胞结合测定

进行细胞结合测定以证实单克隆抗体P1X、P2X和P3X可拮抗EGF配体和A431细胞上的EGF受体的相互作用。如以上方法章节中所述，使A431细胞与一种剂量的单一抗体一起孵育1小时，随后与生物素-EGF配体的稀释系列一起孵育，且通过定量流动式细胞测量术测量结合的生物素-EGF配体的量。抗体的浓度展示于下表13中且表示如由实施例3中显示的分析所确定的细胞结合的亚饱和浓度(近似EC90浓度)。生物素-EGF的稀释系列中使用的浓度展示于下表14中。表13和表14中的值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

表13

表14

浓度，Log(摩尔浓度)	浓度，nM
		-6.70	200
-7.18	66.67
		-7.65	22.22
-8.13	7.41
		-8.61	2.47
-9.08	0.82
		-9.56	0.27
-10.04	0.09
		-10.52	0.03
-11.00	0.01
		-11.52	0.003

结果展示于图11中，图11证实单独单一抗体(P1X、P2X和P3X)各自能够拮抗EGF配体和A431细胞上的EGF受体的相互作用，其中P1X和P2X显示比P3X更强力的抑制活性。

实施例12：使用单一抗体或Fab及其组合进行的配体拮抗细胞结合测定

进行细胞结合分析以确定单克隆抗体P1X、P2X和P3X的单一抗体和多抗体组合以及单价Fab片段P1XFab、P2XFab和P3XFab的单一Fab片段和多Fab片段组合可拮抗EGF配体和A431细胞上的EGF受体的相互作用的程度。如以上方法章节中所述，使A431细胞与一种剂量的抗体或Fab一起孵育1小时，随后与生物素-EGF配体的稀释系列一起孵育，且通过定量流动式细胞测量术测量结合的生物素-EGF配体的量。抗体和Fab的浓度是10nM。以2:2:1比率配制三种抗体(P1X+P2X+P3X)和三种抗体(P1XFab+P2XFab+P3XFab)的组合且以10nM的总浓度给药。生物素-EGF的稀释系列中使用的浓度展示于上表14中。一般技术人员应了解表14中的各特定浓度值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

结果展示于图12A(单一单克隆抗体P1X、P2X和P3X及其组合)和图12B(单一单价Fab片段P1XFab、P2XFab和P3XFab及其组合)中。图12A中的结果再次证实所有三种抗体皆能够单独拮抗EGF配体和A431细胞上的EGF受体的相互作用，其中P1X和P2X显示比P3X更强力的抑制活性，且P1X+P2X+P3X的三元组合也显示强力抑制活性。图12B中的结果证实P1XFab显示单独最强抑制活性，单独P3XFab显示单独中等抑制活性且P2XFab仅显示单独最小抑制活性。P1XFab+P2XFab+P3XFab的三元组合也显示强抑制活性，但强力性小于单独P1XFab。

实施例13：由P1X、P2X和P3X抗体或Fab的2:2:1摩尔比组合达成的磷酸-EGFR和磷酸-ERK信号转导抑制

用2:2:1摩尔比组合的抗体P1X、P2X和P3X(“P1X+P2X+P3X”)或FabP1XFab、P2XFab、P3XFab的稀释系列(在这个摩尔比下的这个组合在本文中称为“P1XFab+P2XFab+P3XFab”)处理A431细胞且通过ELISA测量磷酸-EGFR和磷酸-ERK抑制。用以50ng/mL或500ng/mL的浓度给药的rhEGF(PeproTech)进行实验。抗体和Fab的稀释系列中使用的浓度展示于下表15中。一般技术人员应了解表15中的各特定浓度值具有某一微小实验变化性，因此给出的各特定浓度指示约为指示浓度的值(例如表中指示为0.1nM的浓度表示约0.1nM的值)。

表15

浓度，Log(摩尔浓度)	浓度，nM
		-5.70	2000.00
--6.18	666.67
		-6.65	222.22
-7.13	74.07
		-7.61	24.70
-8.08	8.23
		-8.56	2.74
-9.04	0.91
		-9.52	0.30
-9.99	0.10

结果展示于图13A-D中，其中图13A和13B展示磷酸-EGFR抑制测定的结果且图13C和13D展示磷酸-ERK抑制测定的结果，其中图13A和13C展示低剂量(50ng/ml或8nM)下的结果且图13B和13D展示高剂量(500ng/ml或80nM)下的结果。

关于对磷酸-EGFR的抑制，图13A和13B中的结果证实两种三元组合P1X+P2X+P3XmAb和P1XFab+P2XFab+P3XFab片段在测试的低剂量和高剂量两者下皆显示强抑制。

关于对磷酸-ERK的抑制，图13C和13D中的结果证实两种三元组合P1X+P2X+P3XmAb和P1XFab+P2XFab+P3XFab片段在测试的低剂量和高剂量两者下皆显示抑制，其中P1X+P2X+P3XmAb组合显示比P1XFab+P2XFab+P3XFab片段组合更强力的抑制。

实施例14：在用P1X+P2X+P3X、P1XFab+P2XFab+P3XFab或西妥昔单抗处理之后DU-145细胞中的EGF受体下调

使细胞与分别用等于50nM、100nM和50nM的P1X+P2X+P3X、P1XFab+P2XFab+P3XFab或西妥昔单抗一起预孵育2、6或24小时。将Fab组合以P1X+P2X+P3X和西妥昔单抗的两倍浓度给药，以相对于IgG分子上的两个结合部分来说明Fab分子上的单一结合部分。如以上方法章节中所述，用针对跨膜EGFR(tEGFR)的抗体和作为对照的pcna管家蛋白探测细胞溶解物的免疫印迹。响应于处理的EGF受体下调展示于图14中。结果显示对免疫印迹进行目测检查，用P1X+P2X+P3X处理导致EGFR以时间依赖性方式可观察性下调，而用P1XFab+P2XFab+P3XFab或西妥昔单抗处理不导致EGFR可观察性下调。

等效物

本领域技术人员将仅使用常规实验即会认识到或能够确定本文中所述的本发明的特定实施方案的许多等效物。所述等效物意图由以下权利要求涵盖。意图任何多个从属权利要求中公开的实施方案的任何组合皆在本公开内容的范围内。

以引用方式并入

上文提及的所有专利、申请中的专利申请和专利公布皆据此以引用的方式整体并入本文。

附录A

抗癌剂

序列表概要

EGFRECD(SEQIDNO:33)

1MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEV

61VLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALA

121VLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDF

181QNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGC

241TGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYV

301VTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFK

361NCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAF

421ENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKL

481FGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCN

541LLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVM

601GENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSHHHHHH

Claims

1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体以1nM或更低的K_D值结合EGFR细胞外结构域，所述K_D值使用表面等离子共振确定，且其中所述抗体包含重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列选自由以下组成的组：

2.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体与EGFR细胞外结构域以1nM或更低的K_D值结合，所述K_D值使用表面等离子共振确定，且其中所述抗体包含重链可变区序列和轻链可变区序列，其中所述重链和轻链可变区序列选自由以下组成的组：

(a)如SEQIDNO:19所示的重链可变区和如SEQIDNO:20所示的轻链可变区；

(b)如SEQIDNO:21所示的重链可变区和如SEQIDNO:22所示的轻链可变区；以及

(c)如SEQIDNO:23所示的重链可变区和如SEQIDNO:24所示的轻链可变区。

3.如权利要求1或2所述的单克隆抗体，其中所述抗体选自由双特异性抗体、免疫缀合物、Fab、Fab’2、ScFv、高亲和性多聚体、纳米体和结构域抗体组成的组。

4.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

5.一种包含三种单克隆抗EGFR抗体的组合物，所述组合物包含第一抗体、第二抗体和第三抗体，其中(i)所述第一抗体包含分别为SEQIDNO:1、2和3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:4、5和6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(ii)所述第二抗体包含分别为SEQIDNO:7、8和9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:10、11和12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；且(iii)所述第三抗体包含分别为SEQIDNO:13、14和15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别为SEQIDNO:16、17和18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，且其中所述第一、第二和第三抗体为以1nM或更低的K_D值结合EGFR的人抗体或人源化抗体，所述K_D值使用表面等离子共振确定，且其中所述第一、第二和第三抗体以2:2:1的摩尔比存在。

6.一种包含三种单克隆抗EGFR抗体的组合物，所述组合物包含第一抗体、第二抗体和第三抗体，其中(i)所述第一抗体包含如SEQIDNO:19所示的重链可变区和如SEQIDNO:20所示的轻链可变区；(ii)所述第二抗体包含如SEQIDNO:21所示的重链可变区和如SEQIDNO:22所示的轻链可变区；且(iii)所述第三抗体包含如SEQIDNO:23所示的重链可变区和如SEQIDNO:24所示的轻链可变区，且其中所述第一、第二和第三抗体为以1nM或更低的K_D值结合EGFR的人抗体或人源化抗体，所述K_D值使用表面等离子共振确定，且其中所述第一、第二和第三抗体以2:2:1的摩尔比存在。

7.如权利要求5或6所述的组合物，其中所述第一抗体、所述第二抗体和所述第三抗体各自为独立地选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE的同种型的抗体。

8.如权利要求7所述的组合物，其中所述第一抗体、所述第二抗体和所述第三抗体各自为IgG1同种型抗体。

9.如权利要求4-6任一项所述的组合物，所述组合物是适于静脉内注射的无菌组合物。

10.有效量的权利要求1-3任一项的单克隆抗体或权利要求4-9任一项的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

11.如权利要求10所述的用途，其中所述癌症是黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胃肠癌/结肠癌、肺癌或前列腺癌。