MX2014000270A - Anticuerpos frente el receptor del factor de crecimiento epidermico (egfr) y usos de éstos. - Google Patents

Anticuerpos frente el receptor del factor de crecimiento epidermico (egfr) y usos de éstos.

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Abstract

Se divulgan anticuerpos anti-EGFR, composiciones terapéuticas que comprenden combinaciones de anticuerpos anti-EGFR, así como métodos para utilizar dichos anticuerpos y composiciones para tratar trastornos relacionados con el EGFR (por ejemplo, cánceres).

Description

ANTICUERPOS FRENTE AL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO (EGFR) Y USOS DE ÉSTOS Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61/504633 (presentada el 5 de julio de 201 1 ) y la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61/558945 (presentada el 1 1 de noviembre de 201 1 ), ambas de las cuales se incorporan en el presente documento por referencia.
Antecedentes El sistema inmune natural ha evolucionado para producir anticuerpos para la neutralización eficaz de agentes patógenos. Las preparaciones de anticuerpos naturales aislados a partir de animales inmunizados son de origen policlonal, y presentan inmunodominancia en comparación con anticuerpos individuales, que se limitan a uno o unos pocos epítopos de un antígeno en particular. Los anticuerpos anti tumorales son capaces de bloquear el crecimiento o destruir células tumorales a las que se unen y se han desarrollado como agentes terapéuticos para el cáncer altamente eficaces. Mezclas de anticuerpos antitumorales pueden conseguir efectos supresores tumorales que son mayores que los conseguidos con cualquier anticuerpo individual en la mezcla.
Dichos resultados se han conseguido mediante la combinación de dos o más anticuerpos de neutralización frente al receptor del factor de crecimiento epidérmico, EGFR (ErbBI). Se ha demostrado que anticuerpos que se unen a e inhiben EGFR proporcionan beneficios anticáncer útiles y son de gran valor médico y comercial. Combinaciones en particular de pares de anticuerpos anti-EGFR, aún no competitivos, antagonistas dieron como resultado la regulación negativa de EGFR que era más rápida y más eficaz que la aplicación de cualquier anticuerpo solo (Friedman et al. (2005) PNAS 102: 1915-1920). La combinación de dos anticuerpos anti-EGFR de competencia cruzada {es decir, que compiten entre sí por la unión a antígenos) ha mostrado que no es sinérgica. Es posible que la unión de una pluralidad de anticuerpos a distintos epítopos de EGFR forme estructuras cristalinas de receptores que forman complejos en superficies celulares, lo que conduce a una internalización y degradación más eficaz que la obtenida con anticuerpos que se dirigen a un solo epítopo. También se ha indicado que la combinación de un par en particular de anticuerpos receptores de anti-EGFR da como resultado actividad antitumoral aditiva y en algunos casos sinérgica in vivo (Perera et al. (2005) Clin Cáncer Res 1 1 : 6390-6399). El anticuerpo monoclonal 806, producido contra el mutante de2-7 EGFR, combinado con anticuerpo antagonista 528 presentó una actividad antitumoral significativamente superior en un modelo de xenoinjerto de glioma que el tratamiento solamente con anticuerpo. Se mostró que el mecanismo de la actividad antitumoral sinérgica estaba asociado con una regulación negativa rápida de EGFR, que no estaba inducida por el tratamiento con los anticuerpos individuales. De forma análoga, la fosforilación de EGFR se redujo considerablemente en presencia de otro par de anticuerpos anti-EGFR, cetuximab y EMD55900 (Kamat er a/. (2008) Cáncer Biol Ther 7: 726-33).
También se ha mostrado que determinadas combinaciones de anticuerpos que se dirigen al receptor relacionado, ErbB2, funcionan con sinergia (Friedman et al. (2005). El trastuzumab combinado con pertuzumab inhibió la supervivencia de células de cáncer de mama BT474 en dosis en las que anticuerpos individuales eran ineficaces (Nahta et al. (2004) Cáncer Res 64: 2343-2346). En otro estudio, tres anticuerpos anti-ErbB2 no competitivos una destrucción mucho más eficaz in vitro de células BT474 en combinación que de forma individual y se obtuvieron resultados similares en un modelo de xenoinjerto in vivo de BT474 (Spiridon et al. (2002) Clin Cáncer Res 8: 1699-701 ).
Se ha indicado otra evidencia de que la combinación de más de un anticuerpo puede potenciar el efecto de supresión del crecimiento {por ejemplo, citotóxico) de anticuerpos en células tumorales. Por ejemplo, se combinaron anticuerpos monoclonales para el antígeno tumoral 17-1 A, se estudió la lisis de células tumorales, y se encontró que anticuerpos monoclonales, así como combinaciones de anticuerpos de competición, eran ineficaces, mientras que combinaciones de dos o más anticuerpos de no competición dieron como resultado un lisis completa de células tumorales.
Además de anticuerpos de combinación, también se ha conseguido mayor potencia del anticuerpo mediante el aumento de la afinidad del antígeno de anticuerpos antitumorales expresados de forma recombinante a través de técnicas de ADN recombinante conocidas como maduración de la afinidad.
Por consiguiente, aún se necesitan enfoques y métodos adicionales para producir acción de anticuerpos antitumorales para aumentar la respuesta de tumores a anticuerpos y combinaciones de anticuerpos anti-EGFR, incluyendo anticuerpos anti-EGFR con mayor afinidad tumoral y combinaciones de dichos anticuerpos anti-EGFR de alta afinidad que aumentan la inhibición de la señalización y proporcionan resultados antitumorales citostáticos o citotóxicos más eficaces.
Sumario En el presente documento se proporcionan nuevos anticuerpos monoclonales que se unen a EGFR e inhiben diversas funciones de EGFR. Estos anticuerpos proporcionan efectos terapéuticos útiles, y cuando se combinan entre sí o con otros anticuerpos del receptor anti-ErbB {por ejemplo, otros anticuerpos anti-EGFR), son capaces de presentar un efecto terapéutico sinérgico o aditivo en comparación con la administración de cada anticuerpo solo. Estos anticuerpos, cuando se administran individualmente o en combinaciones tal como se proporciona en el presente documento, son útiles para tratar una diversidad de trastornos (por ejemplo, cánceres) asociados con la señalización celular mediada por EGFR. Por consiguiente, en el presente documento también se proporcionan nuevos anticuerpos monoclonales aislados que presentan las propiedades de unirse a EGFR y que inhiben diversas funciones de EGFR, y en el presente documento también se presentan combinaciones de dichos anticuerpos que presentan dichas propiedades. Además se proporcionan usos de estos anticuerpos con fines de diagnóstico y terapéuticos, ya que son usos de los anticuerpos y combinaciones de anticuerpos que se divulgan en el presente documento.
En una realización, se proporciona un anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de EGFR y comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada y ligera, en el que las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada y ligera se seleccionan entre el grupo que consiste en: (a) las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (b) las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 y 12, respectivamente; y (c) las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente.
En otra realización, se proporciona un anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de EGFR y comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en el que las secuencias de las regiones variables de cadena pesada y ligera se seleccionan entre el grupo que consiste en: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 20; (b) una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (c) una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24.
Los anticuerpos monoclonales que se han mencionado anteriormente se pueden unir a EGFR con una KD de, por ejemplo, superior a 100 nM, o superior a 10 nM, o superior a 1 nM, o superior a 100 pM, o superior a 10 pM, o superior a 1 pM. Los anticuerpos monoclonales pueden presentar una o más de las propiedades funcionales que se divulgan en el presente documento. El anticuerpo monoclonal puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano. En otras realizaciones, el anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico, inmunoconjugado, Fab, Fab'2, ScFv, affibody®, avímero, nanocuerpo o un anticuerpo de dominio. En otras realizaciones, El anticuerpo monoclonal puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de isotipo lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1 , lgA2, IgAsec, IgD, o IgE.
Además se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden uno cualquiera o más de los anticuerpos monoclonales anti-EGFR que se han mencionado anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además se proporcionan kits. El kit puede comprender, por ejemplo, una composición farmacéutica en un envase. Además se proporcionan procedimientos para tratar el cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que comprende uno cualquiera o más de los anticuerpos monoclonales anti-EGFR que se han mencionado anteriormente. Los anticuerpos monoclonales anti-EGFR que se han mencionado anteriormente o combinaciones de éstos para el tratamiento de un cáncer (o para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer) también se proporcionan.
En otra realización, se proporciona una composición que comprende dos o tres anticuerpos monoclonales que se unen al dominio extraceiular de EGFR, en la que los dos o tres anticuerpos monoclonales se seleccionan entre el grupo que consiste en: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 y 12, respectivamente y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17 y 18, respectivamente; y en la que la composición comprende (a) y (b), (a) y (c), (b) y (c) o (a), (b) y (c).
En otra realización más, se proporciona una composición que comprende dos o tres anticuerpos monoclonales que se unen al dominio extraceiular de EGFR, en la que los dos o tres anticuerpos monoclonales se seleccionan entre el grupo que consiste en: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 20; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24; y en la que la composición comprende (a) y (b), (a) y (c), (b) y (c) o (a), (b) y (c).
Cada uno de los anticuerpos monoclonales (a), (b) y (c) en las composiciones que se han mencionado anteriormente que comprenden dos o tres anticuerpos se pueden unir a EGFR con una Kd del, por ejemplo, superior a 100 nM, o superior a 10 nM o superior a 1 nM. Cada uno de los anticuerpos monoclonales (a), (b) y (c) puede presentar una o más de las propiedades funcionales que se divulgan en el presente documento. Cada uno de los anticuerpos monoclonales (a), (b) y (c) puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano. En otras realizaciones, uno o más de los anticuerpos monoclonales (a), (b), y (c) se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en un anticuerpo biespecífico, inmunoconjugado, Fab, Fab'2, ScFv, affibody®, avímero, nanocuerpo, y un anticuerpo de dominio. En otras realizaciones, cada uno de los anticuerpos monoclonales (a), (b), y (c) se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en anticuerpos de isotipo lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1 , lgA2, IgAsec, IgD y IgE. Los anticuerpos monoclonales (a), (b) y (c) también pueden estar en forma de IgY y anticuerpos camélidos.
Además se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cualquiera de las composiciones que se han mencionado anteriormente que comprenden dos o tres anticuerpos monoclonales anti-EGFR y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además se proporcionan kits. El kit puede comprender, por ejemplo, una composición farmacéutica en un envase. Además se proporcionan métodos para tratar cáncer en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que comprende una cualquiera de las composiciones que se han mencionado anteriormente que comprenden dos o tres anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Además se proporcionan las composiciones que se han mencionado anteriormente que comprenden dos o tres anticuerpos monoclonales anti-anti-EGFR (y su uso para la preparación de un medicamento) para el tratamiento de un cáncer.
En otra realización, se proporciona una composición que comprende tres anticuerpos monoclonales anti-EGFR, comprendiendo dicha composición un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo, en la que (i) el primer anticuerpo comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (ii) el segundo anticuerpo comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 y 12, respectivamente; y (iii) el tercer anticuerpo comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente, y en la que el primer, segundo y tercer anticuerpos están presentes en una relación molar de 2:2:1 entre sí.
En otra realización más, se proporciona una composición que comprende tres anticuerpos monoclonales anti-EGFR, comprendiendo dicha composición un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo, en la que (i) el primer anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 20; (ii) el segundo anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (iii) el tercer anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24, y en la que el primer, segundo y tercer anticuerpos están presentes en una relación molar de 2:2:1 entre sí.
Cada uno del primer, segundo y tercer anticuerpos en las composiciones que se han mencionado anteriormente se puede unir a EGFR con una Kd de, por ejemplo, superior a 100 nM, o superior a 10 nM o superior a 1 nM. En otra realización, el primer anticuerpo se une a EGFR con una KD en un intervalo de 1 x 10-9 M a 1 ,1 x 10-1 1 M, el segundo anticuerpo se une a EGFR con una KD en un intervalo de 1 x 10-9 M a 7,0 x 10-1 1 M y el tercer anticuerpo se une a EGFR con una KD en un intervalo de 1 x 10-9 M a 3,6 x 10-1 1 M. Cada uno del primer, segundo y tercer anticuerpos en las composiciones que se han mencionado anteriormente puede presentar una o más de las propiedades funcionales que se divulgan en el presente documento. Cada uno del primer, segundo y tercer anticuerpos en las composiciones que se han mencionado anteriormente puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano. En otras realizaciones, uno o más del primer anticuerpo, el segundo anticuerpo y el tercer anticuerpo se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en un anticuerpo biespecífico, inmunoconjugado, Fab, Fab'2, ScFv, affibody, avímero, nanocuerpo, y un anticuerpo de dominio. En otras realizaciones, cada uno del primer anticuerpo, el segundo anticuerpo y el tercer anticuerpo se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en anticuerpos de isotipo lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1 , lgA2, IgAsec, IgD y IgE.
Además se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cualquiera de las composiciones de anti-EGFR que se han mencionado anteriormente que comprenden un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo en una relación de 2:2:1 , y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica es una composición estéril. En otra realización, la composición farmacéutica es adecuada para inyección. En otra realización más, la composición farmacéutica es una composición estéril adecuada para inyección intravenosa. Además se proporcionan kits. El kit puede comprender, por ejemplo, una composición farmacéutica en un envase. Además se proporcionan métodos para tratar cáncer en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que comprende una cualquiera de las composiciones de anti-EGFR que se han mencionado anteriormente que comprenden primer, segundo y tercer anticuerpos en una relación de 2:2:1. Además se proporciona el uso de cualquiera de las composiciones anti-EGFR que se han mencionado anteriormente que comprenden primer, segundo y tercer anticuerpos en una relación de 2:2:1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer.
En otra realización, se proporciona un método para preparar una composición de anticuerpo anti-EGFR, método que comprende la combinación en una sola composición de: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 y 12, respectivamente; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente; en la que (a), (b) y (c) se combinan a una relación molar de 2:2:1 entre sí.
En otra realización, se proporciona un método para preparar una composición de anticuerpo anti-EGFR, método que comprende la combinación en una sola composición de: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°:20; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24; en la que (a), (b) y (c) se combinan a una relación molar de 2:2:1 entre sí.
En otra realización, se proporciona un método para tratar un sujeto con anticuerpos anti-EGFR, método que comprende administrar al sujeto: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 y 12, respectivamente; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente; en el que (a), (b) y (c) se administran al sujeto en una relación molar de 2:2:1 entre sí.
En otra realización, se proporciona un método para tratar un sujeto con anticuerpos anti-EGFR, método que comprende administrar al sujeto: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°:20; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24; en el que (a), (b) y (c) se administran al sujeto en una relación molar de 2:2:1 entre sí.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 A es un gráfico de barras que muestra los resultados de un experimento de agolpamiento directo de epítopos con ELISA con los anticuerpos P1 X, P2X y P3X usando antígeno EGFR-ECD de tipo silvestre (TS), un mutante de epítopo Bin 1 (Bin 1 MT) y un mutante de epítopo Bin 3 (Bin 3 MT).
La Figura 1 B es un gráfico que muestra los resultados de un experimento de agrupamiento de epítopos por resonancia de plasmones superficiales usando el epítopo ICR10 (Bin 2) conjugado sobre un chip de Biacore, con inyección de antígeno EGFR-ECD de tipo silvestre, seguido de inyección secuencial de los anticuerpos P1 X, P2X y P3X.
La Figura 2A es un gráfico que muestra los resultados de un experimento de agrupamiento de epítopos por resonancia de plasmones superficiales usando el anticuerpo P1 X conjugado sobre un chip de Biacore, con inyección de antígeno EGFR-ECD de tipo silvestre, seguido de inyección secuencial de los anticuerpos P3X, P2X y P1 X.
La Figura 2B es un gráfico que muestra los resultados de un experimento de agrupamiento de epítopos por resonancia de plasmones superficiales usando el anticuerpo P2X conjugado sobre un chip de Biacore, con inyección de antígeno EGFR-ECD de tipo silvestre, seguido de inyección secuencial de los anticuerpos P3X, P2X y P1 X.
La Figura 2C es un gráfico que muestra los resultados de un experimento de agrupamiento de epítopos por resonancia de plasmones superficiales usando el anticuerpo P3X conjugado sobre un chip de Biacore, con inyección de antígeno EGFR-ECD de tipo silvestre, seguido de inyección secuencial de los anticuerpos P3X, P2X y P1 X.
La Figura 3 es un gráfico que muestra los resultados de la cinética de unión de anticuerpos P1 X, P2X y P3X a EGFR sobre células A431 tal como se mide a través de citometría de flujo (representación FACS).
La Figura 4 es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA fosfo-EGFR (pEGFR), demostrando la inhibición de pEGFR con anticuerpos individuales: tratamiento con un solo agente con anticuerpo P1 X, P2X o P3X.
La Figura 5A es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA fosfo-ERK (pERK), demostrando el efecto de la maduración por afinidad sobre la inhibición de pERK por comparación de la inhibición de pERK mediante anticuerpo parental (anticuerpo ca) y P1 X madurado por afinidad.
La Figura 5B es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA fosfo-ERK (pERK), comparando la inhibición de pERK mediante anticuerpos parentales (anticuerpos ca y ch) y P1 X+P3X madurados por afinidad.
La Figura 5C es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA fosfo-ERK (pERK), comparando la inhibición de pERK mediante anticuerpos parentales (anticuerpos ca y cd) y P1 X + P2X madurados por afinidad.
La Figura 6A es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA fosfo-ERK (pERK), demostrando la inhibición de pERK mediante anticuerpo P1 X, con un valor de la CI50 de aproximadamente 25 nM.
La Figura 6B es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA fosfo-ERK (pERK) para células A431 tratadas con una serie de dilución de 5 relaciones de combinación de P3X + P2X en combinación con una concentración de P1 X constante de 25 nM.
La Figura 6C es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA fosfo-ERK (pERK) para células A431 tratadas con una serie de dilución de 6 relaciones de combinación de P1 X:P2X:P3X.
La Figura 6D es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA fosfo-ERK (pERK) para células A431 tratadas con una serie de dilución de 5 relaciones de combinación de P1 X:P2X.
La Figura 7A es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA fosfo-EGFR (pEGFR) (círculos) y un ELISA fosfo-ERK (pERK) (triángulos), demostrando la inhibición mediante una combinación a 2:2:1 de P1X:P2X:P3X.
La Figura 7B es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA fosfo-ERK (pERK), demostrando la inhibición mediante formulación a 2:2:1 de P1 X:P2X:P3X (P1 X+P2X+P3X) frente a anticuerpo individual P1 X solo.
La Figura 7C es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA fosfo-ERK (pERK), demostrando la inhibición mediante P1 X + P2X + P3X frente a anticuerpo individual P2X solo.
La Figura 8A es un gráfico de barras que muestra resultados de análisis de western blot para la cinética de internalización de EGFR total (tEGFR) de células H1975 tratadas previamente con anticuerpos P1X + P2X + P3X durante diversos períodos de tiempo antes de la estimulación con EGF.
La Figura 8B es un gráfico de barras que muestra resultados de análisis de western blot para células H1975 tratadas previamente con anticuerpos P1X + P2X + P3X antes de la estimulación con EGF, mostrando niveles de tEGFR, pERK, fosfo-AKT (pAKT) y fosfo-c-Jun (p-c-Jun) en las células, normalizados al control de carga (PCNA) y a lisados de células sin tratar de control.
La Figura 9A es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de viabilidad celular para células HCC827, demostrando la inhibición de la proliferación celular tumoral por tratamiento con anticuerpos P1 X+P2X+P3X, en comparación con cetuximab, en presencia de ligando de EGF.
La Figura 9B es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de viabilidad celular para células H1975, demostrando la inhibición de la proliferación celular tumoral por tratamiento con anticuerpos P1 X+P2X+P3X, en comparación con cetuximab, en presencia de ligando de EGF.
La Figura 9C es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de viabilidad celular para células HCC827, demostrando la inhibición de la proliferación celular tumoral por tratamiento con anticuerpos P1 X+P2X+P3X, en comparación con cetuximab, en presencia de ligando de anfiregulina (AREG).
La Figura 9D es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de viabilidad celular para células H1975, demostrando la inhibición de la proliferación celular tumoral por tratamiento con P1 X + P2X + P3X anticuerpos, en comparación con cetuximab, en presencia de ligando de AREG.
La Figura 10A es un gráfico que muestra los resultados de un experimento en modelo de ratón con xenoinjerto tumoral DU145, demostrando volumen disminuido de tumor in vivo en ratones tratados con anticuerpos P1 X+P2X+P3X, en comparación con controles de PBS y cetuximab.
La Figura 10B es un gráfico que muestra los resultados de un experimento en modelo de ratón con xenoinjerto tumoral H1975, demostrando volumen disminuido de tumor in vivo en ratones tratados con anticuerpos P1 X+P2X+P3X, en comparación con control de PBS.
La Figura 1 1 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de unión celular con antagonismo de ligandos, demostrando la capacidad de bloqueo del ligando de EGF de P1 X, P2X o P3X solos a dosis bajas.
La Figura 12A es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de unión celular con antagonismo de ligandos, demostrando la capacidad de bloqueo de ligando de EGF de P1 X, P2X o P3X solos, o en triple combinación, a dosis elevadas.
La Figura 12B es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de unión celular con antagonismo de ligandos, demostrando la capacidad de bloqueo de ligando de EGF de P1X Fab, P2X Fab o P3X Fab solos, o en triple combinación, a dosis elevadas.
La Figura 13A es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de inhibición de fosfo-EGFR, demostrando la capacidad inhibidora de combinaciones triples de P1 X + P2X + P3X o P1 X Fab+P2X Fab+P3X Fab a dosis bajas (50 ng/ml; 8 nM).
La Figura 13B es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de inhibición de fosfo-EGFR, demostrando la capacidad inhibidora de combinaciones triples de P1 X + P2X + P3X o P1 X Fab+P2X Fab+P3X Fab a dosis elevadas (500 ng/ml; 80 nM).
La Figura 13C es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de inhibición de fosfo-ERK, demostrando la capacidad inhibidora de combinaciones triples de P1X + P2X + P3X o P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab a dosis bajas (50 ng/ml; 8 nM).
La Figura 13D es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de inhibición de fosfo-ERK, demostrando la capacidad inhibidora de combinaciones triples de P1X + P2X + P3X o P1 X Fab+P2X Fab+P3X Fab a dosis elevadas (500 ng/ml; 80 nM).
La Figura 14 es una inmunotransferencia de un ensayo de regulación negativa del receptor de EGF en células tratadas previamente con combinaciones triples de P1 X + P2X + P3X o P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab o con cetuximab. La proteína constitutiva pena se usó como un control.
Descripción Detallada I. Definiciones Los términos "EGFR", "ErbBI", y "receptor de EGF" se usan de forma intercambiable en el presente documento para hacer referencia a proteína EGFR humana; véase registro N° P00533 de UniProtKB/Swiss-Prot. La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de EGFR humana (EGFR-ECD) se muestra en el Ejemplo 1 y en la SEC ID N°: 33.
El término "inhibición", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier disminución estadísticamente significativa en la actividad biológica, que incluye el bloqueo total de la actividad. Por ejemplo, "inhibición" puede hacer referencia a una disminución estadísticamente significativa de aproximadamente un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, o aproximadamente un 100 % en la actividad biológica.
Inhibición de la fosforilación, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo para disminuir de forma estadísticamente significativa la fosforilación de una proteína sustrato con respecto a la señalización en ausencia del anticuerpo (control). Tal como se conoce en la técnica, rutas de señalización intracelular incluyen, las rutas por ejemplo, de fosfoinosítido 3'-quinasa/Akt (PBK/Akt/PTEN o "AKT") y/o proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK/ERK o "ERK"). Además, tal como se conoce en la técnica, la señalización mediada por EGFR se puede medir sometiendo ensayo a nivel de fosforilación del sustrato trate (por ejemplo, fosforila ción o no fosforilación de AKT y/o ERK). Por consiguiente, en una realización, combinaciones y composiciones de anticuerpos anti-EGFR proporciona la inhibición estadísticamente significativa del nivel de fosforilación de o de tanto AKT como ERK en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o aproximadamente un 100 % con respecto al nivel de fosforilación de AKT y/o ERK en ausencia de dicho anticuerpo (control). Dicha señalización mediada por EGFR se puede medir usando técnicas reconocidas en la técnica que miden una proteína en una cascada celular que implica EGFR, por ejemplo, métodos de ELISA, western, o multiplex, tal como Luminex®.
La expresión "inhibición del crecimiento de células que expresan EGFR", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo para disminuir de forma estadísticamente significativa el crecimiento de una célula que expresa EGFR con respecto al crecimiento de la célula en ausencia del anticuerpo (control) ¡n vivo o in vitro. En una realización, el crecimiento de una célula que expresa EGFR (por ejemplo, una célula cancerosa) puede disminuir en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o aproximadamente un 100 % cuando las células se ponen en contacto con una composición de anticuerpo de la combinación que se divulga en el presente documento, con respecto al crecimiento medido en ausencia de la composición de anticuerpo de la combinación (control). El crecimiento celular se puede someter a ensayo usando técnicas reconocidas en la técnica que miden la velocidad de la división celular, la fracción de células dentro de una población de células que experimentan división celular, y/o la velocidad de pérdida celular a partir de una población celular debido a diferenciación terminal o muerte celular (por ejemplo, usando un ensayo de brillo de título celular o incorporación de timidina).
La expresión "inhibición de un ligando de EGFR que se une a EGFR", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo para disminuir de forma estadísticamente significativa la unión de un ligando de EGFR a su receptor, EGFR, con respecto a la unión del ligando de EGFR en ausencia del anticuerpo (control). Esto significa que, en presencia del anticuerpo, la cantidad del ligando de EGFR que se une a EGFR con respecto a un control (sin anticuerpo), disminuye de forma estadísticamente significativa. La cantidad de un ligando de EGFR que se unen a EGFR puede disminuir en presencia de una composición o combinación de anticuerpos que se divulga en el presente documento en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o aproximadamente un 100 % con respecto a la cantidad en ausencia del anticuerpo (control). Una disminución en la unión de ligando EGFR se puede medir usando técnicas reconocidas en la técnica que miden el nivel de unión de ligando EGFR marcado (por ejemplo, EGF radiomarcado o betacelulina radiomarcada) a células que expresan EGFR en presencia o ausencia (control) del anticuerpo.
La expresión "inhibición de la dimerización de EGFR", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo para disminuir de forma estadísticamente significativa la dimerización de EGFR (emparejándose con otro receptor de ErbB receptor para formar homodímeros, por ejemplo, emparejamientos ErbB1 / ErbB1 , o heterodímeros, por ejemplo, emparejamientos ErbB1 / ErbB3) con respecto a la dimerización de EGFR en ausencia del anticuerpo (control). En una realización, la dimerización de EGFR puede disminuir en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o aproximadamente un 100 % cuando células que expresan EGFR se ponen en contacto con una composición o combinación de anticuerpos que se divulga en el presente documento, con respecto la dimerización de EGFR medida en ausencia del anticuerpo (control). Una disminución en la dimerización de EGFR se puede medir usando técnicas reconocidas en la técnica que miden el nivel dimerización de EGFR en presencia o en ausencia (control) del anticuerpo.
La expresión "regulación negativa de la expresión de EGFR", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo para disminuir de forma estadísticamente significativa la expresión de EGFR sobre una superficie celular, por ejemplo, mediante el aumento de la internalización de EGFR y/o mediante la disminución del reciclado de EGFR a partir de vesículas intracelulares con respecto a la expresión de EGFR en ausencia del anticuerpo (control). En una realización, la expresión de EGFR puede disminuir en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o aproximadamente un 100 % cuando células que expresan EGFR se ponen en contacto con una composición o combinación de anticuerpos que se proporciona en el presente documento, con respecto a la expresión de EGFR sobre la superficie celular medida en ausencia del anticuerpo (control). La regulación negativa de la expresión de EGFR sobre una superficie celular incluye, por ejemplo, un aumento en la internalización / reciclado del receptor, y/o un aumento en internalización / degradación del receptor. Un aumento en la internalización de EGFR se puede medir usando técnicas reconocidas en la técnica que miden el nivel internalización de EGFR en presencia o en ausencia (control) del anticuerpo.
Con respecto a combinaciones de anticuerpos de EGFR (que se describen en el presente documento), los términos "aditivo" o "capacidad de adición", tal como se usan en el presente documento, hacen referencia a la actividad de dos o más anticuerpos en las que su actividad combinada (con respecto a una función en particular, por ejemplo, inhibición del crecimiento celular) es igual a la suma de sus actividades individuales. Es decir, la suma de las actividades de dos o más anticuerpos que se proporcionan en el presente documento, cuando actúan individualmente sobre una célula que expresa EGFR, es aproximadamente equivalente al efecto combinado de estos anticuerpos que actúan en conjunto sobre la misma célula. En una realización, el efecto aditivo se mide con respecto a cualquiera de las propiedades que se han analizado anteriormente (por ejemplo, inhibición de la fosforilación de AKT o ERK, inhibición del crecimiento de células que expresan EGFR, etc.).
Los términos "sinergia" o "sinérgico", tal como se usan en el presente documento, hacen referencia a la actividad de dos o más anticuerpos en la que su actividad combinada (con respecto a una función en particular, por ejemplo, inhibición del crecimiento celular) es mayor que el efecto aditivo esperado de sus actividades individuales. Por ejemplo, el efecto aditivo esperado se puede definir de acuerdo con criterios de independencia de Bliss. De acuerdo con los criterios de Bliss, el efecto de dos fármacos (por ejemplo, anticuerpos) es igual a la suma de los efectos de los fármacos individuales menos la multiplicación de los efectos de los fármacos individuales: E12 = E1 + E2 - E1*E2 en la que E1 es el % de inhibición para el fármaco 1 , E2 es el % de inhibición para el fármaco 2, y E12 es el % de inhibición esperada para la combinación.
El efecto sinérgico se puede aplicar a cualquiera de las propiedades que se analizan en el presente documento (por ejemplo, inhibición de la fosforilación de AKT o ERK dependiente de EGFR, inhibición del crecimiento de células que expresan EGFR, etc.). En una realización particular, se consigue un aumento de al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o superior de la actividad de los anticuerpos combinados con respecto al efecto aditivo de sus actividades individuales.
Los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina", tal como se usan de forma intercambiable en el presente documento, incluyen anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión a antígenos (parte que se une al antígeno) o semejantes de una sola cadena de éstos. Un "anticuerpo" comprende al menos una cadena pesada (H) y una cadena ligera (L). En las IgG de origen natural, por ejemplo, estas cadenas pesadas y ligeras están interconectadas mediante enlaces disulfuro y existen dos cadenas pesada y ligera emparejadas, éstas dos también interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de cadena pesada (abreviado en el presente documento como Vh) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta de tres dominios, CHI, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de cadena ligera (abreviado en el presente documento como VI) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones Vh y VI se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones de determinación de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR) o regiones de Unión (J) (JH o JL en cadenas pesadas y ligeras respectivamente). Cada Vh y VI está compuesto de tres CDR, tres FR y un dominio J, colocados desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, J. las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras se unen con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores huésped, que incluyen diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) o factores humorales tales como el primer componente (Clq) el sistema de complemento clásico. De este modo, uno o más fragmentos del anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, EGFR) se pueden usar las combinaciones que se divulgan en el presente documento. Se ha mostrado que fragmentos de un anticuerpo de longitud total pueden realizar la función de unión a antígenos de un anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de unión señalados como una parte o fragmento de unión a antígenos de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento de Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VI, Vh, Cl_ y CHI; (ii) un fragmento de F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos de Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región de la región bisagra; (iii) un fragmento de Fd que consiste en los dominios Vh y CHI; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VI y Vh de una sola rama de un anticuerpo, (v) un dAb que incluye los dominios VH y VL; (vi) un fragmento de dAb (Ward et al. (1989) Nature 341 , 544-546), que consiste en un dominio Vh; (vii) un dAb que consiste en un dominio VH o un VL; y (viii) una región aislada que determina la complementariedad (CDR) o (ix) una combinación de dos o más CDR aisladas que se pueden unir opcionalmente mediante un conector sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VI y Vh, están codificados mediante genes separados, éstos pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que les permite que sean preparados como una sola cadena de proteínas en la que las regiones VI y Vh están emparejadas para formar moléculas monovalentes (tal como se conoce un semejante de una sola cadena de un fragmento de inmunoglobulina en forma de una sola cadena de Fv (scFv). También se pretende que dichos anticuerpos de una sola cadena estén incluidos dentro del término "anticuerpo". Se obtienen fragmentos de anticuerpos usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos se identifican sistemáticamente para su utilidad de la misma forma de general ya que son anticuerpos intactos. Se pueden producir partes de unión a antígenos mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.
La expresión "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos básicamente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. También se incluyen en el término "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, fragmentos de unión a antígenos (que incluyen scFvs) de dichas inmunoglobulinas. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos frente a un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonal), que por lo general incluyen diferentes anticuerpos, dirigidos frente a determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige frente a un solo determinante en el antígeno. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando cualquier técnica reconocida en la técnica y los que se describen en el presente documento tal como, por ejemplo, un método de hibridoma, un animal transgénico, métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.816.567), o usando bibliotecas de anticuerpos de fagos que usan las técnicas que se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 7.388.088 y en la solicitud de patentes de Estados Unidos con N° de Serie 09/856.907 (Pub. Int. De PCT N° WO 00/31246). Anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y de anticuerpos humanizados y pueden aparecer de forma natural o se producen de forma recombinante.
La expresión "anticuerpo recombinante", se refiere a anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aislan con medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina (por ejemplo, genes de ¡nmunoglobulina humana) o un hibridoma preparado a partir de éstos, (b) anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos combinatorios, recombinantes (por ejemplo, que contiene secuencias de anticuerpos humanos) que usan presentación de fagos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante partir otro medio que implique el empalme de secuencias genéticas de inmunoglobulina (por ejemplo, genes de inmunoglobulina humana) con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos recombinantes pueden tener regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro y de este modo las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y VI de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, a pesar de que se derivan de y están relacionadas con secuencias Vh y VI de línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro de la gama de línea germinal humana in vivo.
La expresión "inmunoglobulina quimérica" o anticuerpo se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo cuyas regiones variables se derivan de una primera especie y cuyas regiones constantes se derivan de una segunda especie. Se pueden construir inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, por ejemplo mediante ingeniería genética, a partir de segmentos de genes de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies.
La expresión "anticuerpo humano", tal como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que las regiones tanto marco como CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana tal como se describe, por ejemplo, en Kabat et al. (Véase Kabat, et al. (1991 ) Sequences of proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Publicación NIH N° 91 -3242). Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de ¡nmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados con secuencias de ¡nmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitios in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", tal como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.
El anticuerpo humano puede tener al menos uno o más aminoácidos reemplazados con un resto de aminoácidos, por ejemplo, un resto de aminoácidos que potencia la actividad que no está codificado con la secuencia de ¡nmunoglobulina de línea germinal humana. Por lo general, el anticuerpo humano puede tener hasta veinte posiciones reemplazadas con restos de aminoácidos que no son parte de la secuencia de ¡nmunoglobulina de línea germinal humana. En una realización en particular, estos reemplazos están dentro de las regiones CDR tal como se describe con detalle a continuación.
La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que incluye al menos una cadena de anticuerpos humanizados (es decir, al menos una cadena ligera o pesada humanizada). La expresión "cadena de anticuerpos humanizados" (es decir, una "cadena ligera de ¡nmunoglobulina humanizada") se refiere a una cadena de anticuerpos (es decir, una cadena ligera o pesada, respectivamente) que tiene una región variable que incluye una región marco variable básicamente a partir de un anticuerpo humano y regiones de determinación de la complementariedad (CDR) (por ejemplo, al menos una CDR, dos CDR, o tres CDR) básicamente a partir de anticuerpo no humano, y adicionalmente incluye región constantes (por ejemplo, una región constante o parte de la misma, en el caso de una cadena ligera, y preferentemente tres regiones constantes en el caso de una cadena pesada).
"Aislado", tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo o combinación de dos, tres o cuatro anticuerpos que están básicamente libres de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, una composición aislada de anticuerpos ca, cf, y ch, cada uno de los cuales se une específicamente a EGFR, está básicamente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de EGFR). Además, un anticuerpo aislado por lo general está básicamente libre de otro material y/o agentes químicos celulares. En una realización, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" que tienen diferentes especificidades de unión a EGFR se combinan en una composición bien definida.
Tal como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o lgG1 ) que está codificado por genes de región constante de cadena pesada. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo monoclonal que se proporciona en el presente documento comprende solamente anticuerpos del isotipo lgG1. En otras realizaciones, una composición de anticuerpo monoclonal que se proporciona en el presente documento comprende solamente anticuerpos del isotipo lgG2. En otras realizaciones, una composición de anticuerpo monoclonal que se proporciona en el presente documento comprende anticuerpos de dos o tres isotipos diferentes.
Un "antígeno" es una entidad (por ejemplo, una entidad o péptido proteínico) a la que se une un anticuerpo. En diversas realizaciones, un antígeno es EGF. En una realización en particular, un antígeno es EGFR humano.
Por consiguiente, en la presente divulgación también están incluidas combinaciones de anticuerpos que se unen a epítopos en EGFR que comprenden todos o una parte de los epítopos reconocidos por los anticuerpos en particular de las combinaciones que se describen en el presente documento. En otra realización, se proporcionan los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con los anticuerpos que se describen en el presente documento. Los anticuerpos que compiten y los anticuerpos que reconocen el mismo o un epítopo de superposición se pueden identificar usando técnicas de rutina tales como inmunoensayo, por ejemplo, mostrando la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, es decir, un ensayo de unión competitiva. La unión competitiva se puede determinar usando un ensayo tal como el que se describe en los Ejemplos que siguen a continuación.
Las expresiones "unión específica", "que se une específicamente", "unión selectiva", y "que se une selectivamente", hacen referencia a que un anticuerpo presenta una afinidad perceptible por un antígeno o epítopo en particular y, generalmente, no presenta reactividad cruzada significativa con otros antígenos y epítopos. "Perceptible" o unión preferente incluye la unión con una KD de 106, 107, 108, 109, o 1010 M-1 o superior. La KD de una interacción de anticuerpo a antígeno (la constante de afinidad) indica la concentración de anticuerpo a la que un 50 % de moléculas de anticuerpo y antígeno están unidas en conjunto. Por lo tanto, a una concentración de antígeno fijada adecuada, un 50 % de un anticuerpo de mayor afinidad (es decir, más fuerte) se unirá a moléculas de antígeno a una concentración de anticuerpo menor que la que sería necesaria para conseguir el mismo porcentaje de unión con un anticuerpo de menor afinidad. Por lo tanto, un valor menor de Kd indica una afinidad mayor (más fuerte). Tal como se usa en el presente documento, afinidades "mayores" son afinidades más fuertes, y son de menor valor numérico que sus elementos de comparación, con una KD de 107 M-1 siendo de menor valor numérico y por lo tanto que representa una mayor afinidad que una Kd de 106 M-1. Son generalmente preferentes afinidades mayores (es decir, con un valor de Kd menor y por lo tanto más fuerte) que 107 M-1 , preferentemente mayor que 108 M-1. Además se contemplan valores intermedios a los que se han expuesto en el presente documento, y una afinidad de unión preferente se puede indicar como un intervalo de afinidades, por ejemplo afinidades de unión preferente para anticuerpos anti-EGFR que se divulgan en el presente documento son, de 106 a 1012 M-1 , preferentemente de 107 a 1012 M-1 , más preferentemente de 108 a 1012 M-1 . Un anticuerpo que "no presenta reactividad cruzada significativa" es uno que no se unirá de forma perceptible a un antígeno fuera de diana (por ejemplo, una proteína no EGFR). Por ejemplo, en una realización, un anticuerpo que se une específicamente a EGFR presentará al menos dos, y preferentemente tres, o cuatro o más órdenes de magnitud de mayor afinidad de unión (es decir, unión que presenta un valor de Kd inferior a dos, tres, o cuatro o más órdenes de magnitud) para EGFR que para moléculas de ErbB distintas a ErbB1 (EGFR) o para proteínas o péptidos de no ErbB. La unión específica o selectiva se puede determinar de acuerdo con cualquier medio reconocido en la técnica para determinar dicha unión, que incluye, por ejemplo, de acuerdo con ensayos de unión de análisis de Scatchard y/o competitivos (competición) tal como se describe en el presente documento.
El término "KD", tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante del equilibrio de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno en particular o la afinidad de un anticuerpo por un antígeno. En una realización, el anticuerpo que se proporciona en el presente documento se une a un antígeno (por ejemplo, EGFR) con una afinidad (KD) de 100 nM o superior (es decir, o menos) (por ejemplo, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM o menos), tal como se mide usando un ensayo de resonancia de plasmones superficiales , un ensayo de unión celular, o un ensayo de diálisis en equilibrio. En una realización particular, un anticuerpo se une a EGFR con una afinidad (tal como se representa con la constante de disociación Kd) de 8 nM o superior (por ejemplo, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 2 nM, 1 ,5 nM, 1 ,4 nM, 1 ,3 nM, 1 ,2nM, l,l nM, 1 nM o inferior), tal como se mide con un ensayo de resonancia de plasmones superficiales o un ensayo de unión celular. En otras realizaciones, un anticuerpo se une a un antígeno (por ejemplo, EGFR) con una afinidad (Kd) de aproximadamente menor que 10-7 M, tal como aproximadamente menor que 10-8 , 10-9 M o 10-10 o incluso menos que cuando se determina con tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento BIACORE 3000 usando EGFR recombinante como el analito y el anticuerpo, como el ligando, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad para unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno muy relacionado. Otros métodos para determinar la KD incluyen unión en equilibrio a células vivas que expresan EGFR a través de citometría de flujo (FACS) o en disolución usando tecnología KinExA®.
El término "Kdisociación", tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación para la disociación de un anticuerpo a partir del complejo anticuerpo/antígeno.
Los términos "CI50" y "CI90", tal como se usan en el presente documento, hacen referencia a la medida de la eficacia de un compuesto (por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR) en la inhibición de una función biológica o bioquímica (por ejemplo, la función o actividad de EGFR) en un 50 % y un 90 %, respectivamente. Por ejemplo, CI50 indica la cantidad de un anticuerpo anti-EGFR que se necesita para inhibir la actividad de EGFR (por ejemplo, el crecimiento de una célula que expresa EGFR) a la mitad. Es decir, es la concentración inhibitoria (Cl) máxima media (50 %) de un anticuerpo anti-EGFR (Cl al 50 %, o CI50). De acuerdo con la FDA, CI50 representa la concentración de un fármaco que se requiere para un inhibición de un 50 % in vitro. La CI50 y la CI90 se pueden determinar mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, por preparación de una curva de dosis-respuesta y examinando el efecto de diferentes concentraciones del antagonista (es decir, el anticuerpo anti-EGFR) en la inversión de la actividad de EGFR.
Tal como se usa en el presente documento, "patrón de glicosilación" se define como el patrón de unidades de hidratos de carbono que se unen de forma covalente a una proteína, más específicamente a una proteína de inmunoglobulina.
La expresión "molécula de ácido nucleico", tal como se usa en el presente documento, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario.
La expresión "molécula de ácido nucleico aislado", tal como se usa en el presente documento con referencia a ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Vh, VI, CDR3), pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias de nucleótidos están básicamente libres de otras secuencias de nucleótidos genómicos, por ejemplo, los que codifican anticuerpos que se unen antígenos distintos de EGFR, que otras secuencias pueden flanquear de forma natural el ácido nucleico o en el ADN genómico humano.
El término "que modifica", o "modificación", tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a cambiar uno o más aminoácidos en los anticuerpos o partes de unión a antígenos de éstos. El cambio se puede producir por adición, sustitución o supresión de un aminoácido en una o más posiciones. El cambio se puede producir usando técnicas conocidas, tales como mutagénesis por PCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo o una parte de unión a antígenos de éstos identificados usando los métodos que se proporcionan en el presente documento se pueden modificar, para modificar de ese modo la afinidad de unión al anticuerpo o parte de unión a antígenos de éste a EGFR. Se proporcionan "sustituciones conservativas de aminoácidos" en las secuencias de los anticuerpos, es decir, modificaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos que no abrogan la unión del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleótidos o que contienen la secuencia de aminoácidos, al antígeno, es decir, EGFR. Sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen la sustitución de un aminoácido en una clase con un aminoácido de la misma clase, en la que una clase se define mediante propiedades fisicoquímicas habituales de cadena lateral de aminoácidos y frecuencias de sustitución elevadas en proteínas homologas encontradas en la naturaleza, tal como se determina, por ejemplo, con una matriz convencional de intercambio de frecuencias de o matriz de BLOSU . Se han clasificado seis clases generales de cadenas laterales de aminoácidos e incluyen: Clase I (Cys); Clase II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Clase III (Asn, Asp, Gln, Glu); Clase IV (His, Arg, Lys); Clase V (He, Leu, Val, Met); y Clase VI (Phe, Tyr, Trp). Por ejemplo, la sustitución de una Asp para otro resto de clase III tal como Asn, Gln, o Glu, es una sustitución conservativa. Por lo tanto, un resto de aminoácido no esencial predicho en un anticuerpo anti-EGFR está reemplazado preferentemente con otro resto de aminoácido de la misma clase. Son bien conocidos en la técnica métodos para identificar sustituciones conservativas de nucleótidos y de aminoácidos que no eliminan la unión a antígenos.
La expresión "sustitución de aminoácidos no conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido en una clase con un aminoácido de otra clase; por ejemplo, sustitución de una Ala, un resto de clase II, con un resto de clase III tal como Asp, Asn, Glu, o Gln.
Como alternativa, en otra realización, se pueden introducir mutaciones (conservativas o no conservativas) aleatoriamente junto a toda o parte de una secuencia de codificación de anticuerpos anti-EGFR, tal como por mutagénesis por saturación, y los anticuerpos anti-EGFR resultantes modificados se pueden identificar sistemáticamente por su actividad de unión.
Una "secuencia consenso" es una secuencia formada a partir de los aminoácidos que aparecen con más frecuencia (o nucleótidos) en una familia de secuencias relacionadas. En una familia de proteínas, cada posición en la secuencia consenso está ocupada con el aminoácido que aparece con más frecuencia en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos se producen con la misma frecuencia, cualquiera se puede incluir en la secuencia consenso. Un "marco consenso" de una inmunoglobulina se refiere a una región marco en la secuencia consenso de inmunoglobulina. De forma análoga, la secuencia consenso para las CDR de se puede derivar mediante la alineación óptima de las secuencias de aminoácidos de CDR aminoácido de anticuerpos EGFR que se proporcionan en el presente documento.
Para ácidos nucleicos, la expresión "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos, o secuencias designadas de éstos, cuando se alinean y se comparan de forma óptima, son idénticos, con inserciones o supresiones apropiadas de nucleótidos, en al menos aproximadamente un 80 % de los nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente de un 90 % a un 95 %, y más preferentemente de al menos aproximadamente un 98 % a un 99,5 % de los nucleótidos. Como alternativa, existe homología sustancial cuando los segmentos se hibridar han en condiciones de hibridación selectiva, con el complemento de la hebra.
Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o básicamente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "aparece básicamente puro" cuando se purifica lejos de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas convencionales, que incluyen tratamiento alcalino/SDS, frecuencia de CsCI, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica.
Las composiciones de ácidos nucleicos, aunque a menudo comprenden una secuencia nativa (excepto para sitios de restricción modificados y similares), a partir de cADN, genómico o mezclas de éste se pueden mutar alternativamente, de acuerdo con técnicas convencionales para proporcionar secuencias genéticas alteradas. Para secuencias de codificación, estas mutaciones, pueden modificar la secuencia de aminoácidos codificados según se desee. En particular, se contemplan secuencias de ADN básicamente homologas con cambios constantes en V, D, J nativo y otras de las secuencias mencionadas que se describen en el presente documento.
La expresión "unido de forma operativa" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos situada en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una secuencia previa o director de secreción se une en forma operativa a ADN para un polipéptido si se expresa como una proteína previa que participan la secreción del polipéptido; un promotor potenciador está unido de forma operativa a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido de forma operativa a una secuencia de codificación si está colocado de modo que se facilite la traducción. Generalmente, "unido de forma operativa" significa que las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas, y, en el caso de un director de secreción, contiguo y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue por ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos se usan de acuerdo con la práctica convencional. Un ácido nucleico está "unido de forma operativa" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor potenciador está unido de forma operativa a una secuencia de codificación se afecta a la transcripción de la secuencia. Con respecto a las secuencias que regulan la transcripción, unido de forma operativa se refiere a que las secuencias de ADN se están uniendo son contiguas y, cuando sea necesario unen dos regiones de codificación de proteínas, contiguas y en marco de lectura. Para secuencias de cambio, unido de forma operativa indica que las secuencias son capaces de realizar recombinación de cambio.
El término "vector", tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN en el genoma viral. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped después de la introducción en la célula huésped, y por lo tanto se replican junto con el genoma huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se unen de forma operativa. En el presente documento dichos vectores se denominan "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. Los términos, "plásmido" y "vector" se pueden usar de forma intercambiable. Sin embargo, también se contemplan otras formas de vectores de expresión, tales como virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados), que actúan como funciones equivalentes.
La expresión "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una célula en la que se ha introducido el vector de expresión recombinante. Se debería entender que dichas expresiones pretenden hacer referencia no solamente a la célula sujeto en particular sino también a la descendencia de dicha célula. Dado que se pueden producir determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutaciones o a influencias ambientales, dicha descendencia, de hecho, puede no ser idéntica para célula precursora, pero aún están incluidas dentro del alcance de la expresión "célula huésped" tal como se usa en el presente documento.
Los términos "tratar", "que trata", y "tratamiento", tal como se usan en el presente documento, hacen referencia a medidas terapéuticas o preventivas que se describen en el presente documento. Los métodos de "tratamiento" que usan la administración a un sujeto de un anticuerpo par de anticuerpos o trío que se divulga en el presente documento, por ejemplo, un sujeto que padece una enfermedad o trastorno asociado con la señalización dependiente de EGFR predispuesta padecer dicha enfermedad o trastorno, para prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de, o mejorar uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno o enfermedad o trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento.
La expresión "enfermedad asociada con la señalización dependiente de EGFR", o "trastorno asociado con la señalización dependiente de EGFR", tal como se usa en el presente documento, incluye estados de enfermedad y/o síntomas asociados con un estado de enfermedad, en la que se encuentran mayores niveles de EGFR y/o activación de cascadas celulares que implican EGFR. La expresión "enfermedad asociada con la señalización dependiente de EGFR", también incluye estados de enfermedad y/o síntomas asociados con la activación de rutas alternativas de señalización de EGFR. En general, la expresión "enfermedad asociada con la señalización dependiente de EGFR", se refiere a cualquier trastorno, el inicio, progresión o persistencia de los síntomas de los que se requiere la participación de EGFR. Trastornos mediados por EGFR a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, cáncer.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que por lo general se caracteriza por crecimiento celular sin regular. Ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gástrico, cáncer pancreático, tumores de células gliales tales como glioblastoma y neurofibromatosis, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, melanoma, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñon, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. En una realización en particular, un cáncer tratado o diagnosticado usando los métodos que se divulgan en el presente documento se selecciona entre melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovarios, carcinoma renal, cáncer gastrointestinal/colon, cáncer de pulmón, y cáncer de próstata.
La expresión "cantidad eficaz", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de una parte de unión a un anticuerpo o un antígeno de éste que se une a EGFR, que es suficiente para efectuar tratamiento, pronóstico o diagnóstico de una enfermedad asociada con la señalización dependiente de EGFR, tal como se describe en el presente documento, cuando se administra a un sujeto. Las cantidades terapéuticamente eficaces de anticuerpos que se proporcionan en el presente documento, cuando se usan solos o en combinación, variarán dependiendo de la actividad relativa de los anticuerpos y combinaciones (por ejemplo, en la inhibición del crecimiento celular) y dependiendo del sujeto y estado de la enfermedad que se está tratando, el peso y la edad del sujeto, la gravedad del estado de la enfermedad, la forma de administración y similares, que un experto en la materia puede determinar fácilmente. Las dosificaciones para la administración pueden variar, por ejemplo, que aproximadamente 1 ng a aproximadamente 10,000 mg, de aproximadamente 5 ng a aproximadamente 9,500 mg, de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 9,000 mg, de aproximadamente 20 ng a aproximadamente 8,500 mg, de aproximadamente 30 ng a aproximadamente 7,500 mg, de aproximadamente 40 ng a aproximadamente 7,000 mg, de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 6,500 mg, de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 6,000 mg, de aproximadamente 200 ng a aproximadamente 5,500 mg, de aproximadamente 300 ng a aproximadamente 5,000 mg, de aproximadamente 400 ng a aproximadamente 4,500 mg, de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 4,000 mg, de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 3,500 mg, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 3,000 mg, de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 2,600 mg, de aproximadamente 20 pg a aproximadamente 2,575 mg, de aproximadamente 30 pg a aproximadamente 2,550 mg, de aproximadamente 40 pg a aproximadamente 2,500 mg, de aproximadamente 50 pg a aproximadamente 2,475 mg, de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 2,450 mg, de aproximadamente 200 pg a aproximadamente 2,425 mg, de aproximadamente 300 pg a aproximadamente 2,000, de aproximadamente 400 pg a aproximadamente 1 ,175 mg, de aproximadamente 500 pg a aproximadamente 1 ,150 mg, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 1 ,125 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1 ,100 mg, de aproximadamente 1 ,25 mg a aproximadamente 1 ,075 mg, de aproximadamente 1 ,5 mg a aproximadamente 1 ,050 mg, de aproximadamente 2,0 mg a aproximadamente 1 ,025 mg, de aproximadamente 2,5 mg a aproximadamente 1 ,000 mg, de aproximadamente 3,0 mg a aproximadamente 975 mg, de aproximadamente 3,5 mg a aproximadamente 950 mg, de aproximadamente 4,0 mg a aproximadamente 925 mg, de aproximadamente 4,5 mg a aproximadamente 900 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 875 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 850 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 825 mg, de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 800 mg, de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 775 mg, de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 750 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 725 mg, de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 700 mg, de aproximadamente 300 mg a aproximadamente 675 mg, de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 650 mg, de aproximadamente 500 mg, o de aproximadamente 525 mg a aproximadamente 625 mg, de un anticuerpo. Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial (es decir, efectos secundarios) de un anticuerpo se minimizan y/o se equilibran con los efectos beneficiosos.
La expresión "agente terapéutico" pretende incluir todos y cada uno de los compuestos que tienen una capacidad para disminuir o inhibir la gravedad de los síntomas de una enfermedad o trastorno, o aumentar la frecuencia y/o duración de periodos sin síntomas o con síntomas reducidos en una enfermedad o trastorno, o inhibir o prevenir impedimento o discapacidad debido a un sufrimiento por una enfermedad o trastorno, o inhibir o retrasar la progresión de una enfermedad o trastorno, o inhibir o retrasar el comienzo de una enfermedad o trastorno, o inhibir o prevenir la infección en una enfermedad o trastorno infeccioso. Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos incluyen moléculas orgánicas pequeñas, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, biologías diseñadas de forma recombinante, compuestos de ARNi, inhibidores de tirosina quinasa, y anticuerpos comerciales. En determinadas realizaciones, los inhibidores de tirosina quinasa incluyen, por ejemplo, uno o más de erlotinib, gefitinib, y lapatinib, que actualmente son agentes farmacéuticos comercializados. Anticuerpos anti-EGFR farmacéuticos disponibles en el mercado incluyen cetuximab y panitumumab. Otros anticuerpos anti-EGFR farmacéuticos incluyen zalutumumab, nimotuzumab, y matuzumab, que están en desarrollo.
El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.
El término "sujeto" incluye cualquier mamífero, por ejemplo, un primate. Por ejemplo, los métodos y composiciones que se divulgan en el presente documento se pueden usar para tratar un sujeto que padece cáncer. En una realización en particular, el sujeto es un ser humano.
El término "muestra" se refiere a tejido, fluido corporal, o una célula (o una fracción de cualquiera de los anteriores) tomada de un paciente o de un sujeto. Normalmente, el tejido o célula serán retirados del paciente, pero también se contempla el diagnóstico in vivo. En el caso de un tumor sólido, se puede tomar una muestra de tejido a partir de un tumor retirado quirúrgicamente y preparado para someterlo a ensayo mediante técnicas convencionales. En el caso de linfomas y leucemias, se pueden obtener linfocitos, células leucémicas, o tejidos de linfa (por ejemplo, células leucémicas de sangre) y preparar apropiadamente. Otras muestras, que incluyen orina, lágrimas, suero, plasma, fluido cerebroespinal, heces, esputo, extractos celulares etc. también pueden ser útiles para cánceres en particular.
Diversos aspectos de la divulgación se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.
II. Anticuerpos Anti-EGFR v Combinaciones De Los Mismos En el presente documento se divulgan nuevos anticuerpos monoclonales anti-EGFR, incluyendo tres que se mencionan en los Ejemplos como P1 X, P2X y P3X. Los anticuerpos monoclonales P1 X, P2X y P3X son anticuerpos madurados por afinidad de anticuerpos parentales denominados ca, cd y ch, respectivamente, que se divulgan en la Solicitud de PCT N° PCT/US201 1/35238. Las secuencias de aminoácidos de CDR de los anticuerpos parenterales y madurados por afinidad, con los aminoácidos cambiados en los anticuerpos madurados por afinidad, se muestran a continuación en negrita y subrayados: ca Va CDR l CDR2 CDR3 SYAIS HPIFGTANY DPSVDL (SEC ID N° (SEC ID N°: 27) (SEC ID N*: 28) P I X V CDR l d- CDR3 SYAIS UPIFGTVNY DPSVNL (SEC ID N° (SEC ID N°: 2) (SEC ID N°: 3) QSISSWLA DASSL QQFAAHA (SEC ID N°: 29) (SEC ID N° (SEC ID N°: 30) PlX Vj. CDRl CDR2 CDR3 QSISSWWA DASSL QQYHAHP (SEC ID N°: 4) (SEC ID N* (SEC ID N°: 6) CDRl CDR2 CDR3 SYAIS HPIFGTANY MGRGKV (SEC ID N° (SEC ID ??: 27) (SEC ID N°: 9) CDR l CPR2 CDR3 SYAIS IIPIFGAANP MGRGKV (SEC ID N° (SEC ID N°: 8) (SEC ID N°: 9) cd Vr. CDR l CDR2 CDR3 QSVLYSSNN NYLA WASTR QQYYGSP (SEC ID W: 31 ) (SEC ID N*: 1 1 ) (SEC ID N°: 12) P2X V,. CDR ] CDR2 CDR QSVLYSPNN NYLA WASTR QQYYGSP (SEC ID Ne: 10) (SEC ID N«: 1 1 ) (SEC ID N*: 12) ch V CDR 1 CDR 2 CDR3 SYG1N ISAYNGNTNY DLGCYCSGS (SEC ID N*: 13) (SEC ID N»: 32) (SEC ID N°: 15) P3X V CDR 1 CDR 2 CDR3 SYGI 1SAYNGNTYY DLGGYGSGS (SEC ID N° (SEC ID N°: 14) (SEC ID N*: 15) ch Vi. CDR 1 CDR2 CDR3 QSVSSNLA GASTR ODYRTWPR (SEC ID N°: 16) (SEC ID N°: 17) (SEC ID N°: 18) P3X V CDR 1 CDR2 CDR3 QSVSSNLA GASTR QDY TWPR (SEC ID N°: 16) (SEC ID N°: 17) (SEC ID Ne: 18) Las secuencias amino de Vh y VI de longitud total para P1 X se muestran en las SEC ID N°: 19 y 20, respectivamente. Las secuencias amino de Vh y VI de longitud total para P2X se muestran en las SEC ID N°: 21 y 22, respectivamente. Las secuencias amino de Vh y VI de longitud total para P3X se muestran en las SEC ID N°: 23 y 24, respectivamente. Además, los segmentos de CDR de Vh y VI tal como se presentan en el presente documento se colocan, por ejemplo, en el orden de amino a carboxi terminal de CDR1 , CDR2 y CDR3.
En una realización, se proporciona un anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de EGFR y comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada y ligera, en el que las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada y ligera se seleccionan entre el grupo que consiste en: (a) las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (b) las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 y 12, respectivamente; y (c) las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente.
En otra realización, se proporciona un anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de EGFR y comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en el que las secuencias de las regiones variables de cadena pesada y ligera se seleccionan entre el grupo que consiste en: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 20; (b) una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (c) una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24.
Además se proporcionan combinaciones de los anticuerpos anti-EGFR que se han mencionado anteriormente. Dichas combinaciones pueden contener, por ejemplo, cualquier combinación de dos de los anticuerpos anti-EGFR que se han mencionado anteriormente. Otra combinación puede comprender todos los tres anticuerpos anti-EGFR que se han mencionado anteriormente. Por consiguiente, en otro aspecto, se proporciona una composición que comprende dos o tres anticuerpos monoclonales que se unen al dominio extracelular de EGFR, en la que los dos o tres anticuerpos monoclonales se seleccionan entre el grupo que consiste en: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID ITs: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 y 12, respectivamente y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17 y 18, respectivamente; y en la que la composición comprende (a) y (b), (a) y (c), (b) y (c) o (a), (b) y (c).
En otra realización más, se proporciona una composición que comprende dos o tres anticuerpos monoclonales que se unen al dominio extracelular de EGFR, en la que los dos o tres anticuerpos monoclonales se seleccionan entre el grupo que consiste en: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 20; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24; y en la que la composición comprende (a) y (b), (a) y (c), (b) y (c) o (a) (b) y (c).
Los anticuerpos anti-EGFR que se divulgan en el presente documento, ya sea como un solo anticuerpo o en una combinación de anticuerpos, se pueden unir a EGFR con una Kd de, por ejemplo, superior a 100 nM, o superior a 10 nM o superior a 1 nM. Tal como se usa en el presente documento con respecto a la Kd, la expresión "superior a nM" significa que un anticuerpo tiene una KD, expresado como una concentración nanomolar, que es menor que el número indicado. Por ejemplo, una KD que es "mayor que" 100 nM indica una Kd, expresada como una concentración nanomolar, que tiene un valor menor que 100 nM (por ejemplo, es 50 nM).
En otras realizaciones, un anticuerpo relacionado con P1 X, tal como un anticuerpo que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente, o un anticuerpo que comprende las secuencias Vh y VI de SEC ID N°s: 19 y 20, respectivamente, se puede unir a EGFR con una KD en un intervalo de aproximadamente 1 x 10-9 M a 1 ,1 x 10-1 1 M o superior.
En otras realizaciones, un anticuerpo relacionado con P2X, tal como un anticuerpo que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8 y 9 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 , y 12, respectivamente, o un anticuerpo que comprende las secuencias Vh y VI de SEC ID N°s: 21 y 22, respectivamente, se puede unir a EGFR con una Kd en un intervalo de aproximadamente 1 x 10-9 M a 7,0 x 10-11 M o superior.
En otras realizaciones, un anticuerpo relacionado con P3X, tal como un anticuerpo que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14 y 15 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente, o un anticuerpo que comprende las secuencias Vh y VI de SEC ID N°s: 23 y 24, respectivamente, se puede unir a EGFR con una KD en un intervalo de aproximadamente 1 x 10-9 a 3,6 x 10-10 o superior.
Los anticuerpos anti-EGFR que se divulgan en el presente documento, ya sea como un solo anticuerpo o en una combinación de anticuerpos, pueden presentar una u otras propiedades funcionales más tal como se divulga en el presente documento, que incluyen, pero no se limitan a: (a) inhibición de la fosforilación de AKT o ERK, por ejemplo, la fosforilación de AKT o ERK dependiente de EGFR, tal como se mide en un ensayo basado en células; (b) inhibición del crecimiento de células que expresan EGFR; (c) inhibición de la unión del ligando EGF a EGFR (por ejemplo, inhibición de la unión de uno o más ligandos que se unen a EGFR, que incluyen EGF, factor de crecimiento de tipo EGF que se une a heparina (HB-EGF), factor de crecimiento de transformación (TGF), epígeno, epiregulina, betacelulina, o anfiregulina); (d) inhibición de la dimerización de EGFR; (e) regulación negativa de EGFR sobre superficies celulares (por ejemplo, por internalización y reciclado del receptor, y/o internalización y degradación del receptor); (f) inhibición de la proliferación celular tumoral in vitro; y/o (g) inhibición del crecimiento tumoral ¡n vivo.
Los anticuerpos que se divulgan en el presente documento incluyen todas las formas conocidas de anticuerpos y otros armazones proteicos con propiedades similares a las de los anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico, un inmunoconjugado, un anticuerpo quimérico o un armazón proteico con propiedades similares a las de los anticuerpos, tal como repeticiones de fibronectina o anquirina. El anticuerpo también puede ser un Fab, Fab'2, ScFv, affibody®, avímero, nanocuerpo, o un anticuerpo de dominio. El anticuerpo también puede tener cualquier isotipo, que incluye cualquiera de los siguientes isotipos: lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1 , lgA2, IgAsec, IgD, e IgE. Los anticuerpos IgG son preferentes. Los anticuerpos de longitud total se pueden preparar a partir de secuencias Vh y VI usando técnicas convencionales de ADN recombinante y ácidos nucleicos que codifican las secuencias de región constante deseadas a unir de forma operativa a las secuencias de la región variable. Los ejemplos no limitantes de secuencias adecuadas de región constante incluyen la región constante kappa de cadena ligera que se divulga en la SEC ID N°: 25 y la región constante de cadena pesada de lgG1 que se divulga en la SEC ID N°: 26.
Tal como se divulga en los ejemplos, se ha descubierto combinaciones triples de los anticuerpos P1 X + P2X + P3X son particularmente eficaces cuando se usan en una relación molar de P1 X:P2X:P3X de 2:2:1. Por lo tanto, para dicha combinación triple de anticuerpos, se selecciona un 40 % de la concentración total para que sea P1 X, se selecciona un 40 % de la concentración total para que sea P2X y se selecciona un 20 % de la concentración total para que sea P3X.
Por consiguiente, en otra realización, se proporciona una composición que comprende tres anticuerpos monoclonales anti-EGFR, comprendiendo dicha composición un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo, en la que (i) el primer anticuerpo comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (ii) el segundo anticuerpo comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 y 12, respectivamente; y (iii) el tercer anticuerpo comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente, y en la que el primer, segundo y tercer anticuerpos están presentes en una relación molar de 2:2:1 entre sí.
En otra realización más, se proporciona una composición que comprende tres anticuerpos monoclonales anti-EGFR, comprendiendo dicha composición un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo, en la que (i) el primer anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 20; (ii) el segundo anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (iii) el tercer anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24, y en la que el primer, segundo y tercer anticuerpos están presentes en una relación molar de 2:2:1 entre sí.
Se proporcionan métodos para preparar composiciones de anticuerpo anti-EGFR que comprenden tres anticuerpos, en las que los anticuerpos se preparan en una relación de 2:2:1. Más específicamente, en otra realización, se proporciona un método para preparar una composición de anticuerpo anti-EGFR, método que comprende la combinación en una sola composición de: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 y 12, respectivamente; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente; en la que (a), (b) y (c) se combinan a una relación molar de 2:2:1 entre sí.
En otra realización, se proporciona un método para preparar una composición de anticuerpo anti-EGFR, método que comprende la combinación en una sola composición de: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°:20; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24; en la que (a), (b) y (c) se combinan a una relación molar de 2:2:1 entre sí.
Además se proporcionan métodos para tratar un sujeto con los tres anticuerpos anti-EGFR en los que los anticuerpos se administran al sujeto en una relación de 2:2:1. Más específicamente, se proporciona un método para tratar un sujeto con anticuerpos anti-EGFR, método que comprende administrar al sujeto: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 y 12, respectivamente; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente; en el que (a), (b) y (c) se administran al sujeto en una relación molar de 2:2:1 entre sí.
En otra realización, se proporciona un método para tratar un sujeto con anticuerpos anti-EGFR, método que comprende administrar al sujeto: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°:20; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24; en el que (a), (b) y (c) se administran al sujeto en una relación molar de 2:2:1 entre sí.
Detalles adicionales sobre la formulación de anticuerpos anti-EGFR en composiciones farmacéuticas y métodos de uso de dichas composiciones en enfermedades relacionadas con EGFR se describen en las subsecciones que siguen a continuación.
III. Métodos para Producir Anticuerpos (i) Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales, de los que se proporcionan en el presente documento, se preparan más habitualmente mediante técnicas convencionales de ADN recombinante en base a las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y VI que se divulgan en el presente documento.
Además o como alternativa, se pueden producir anticuerpos monoclonales usando una diversidad de técnicas conocidas, tal como la técnica convencional de hibridación de células somáticas, transformación viral u oncongénica de linfocitos B, o técnicas de presentación de levaduras o fagos que usan bibliotecas de genes de anticuerpos humanos. En realizaciones en particular, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales totalmente humanos.
Por consiguiente, en una realización, se usa un método de hibridomas para producir un anticuerpo que se une a EGFR. En este método, un ratón u otro animal huésped apropiado se puede inmunizar con un antígeno adecuado para obtener linfocitos que producen o que son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al antígeno usado para la inmunización Como alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. A continuación, los linfocitos se pueden condensar con células de mieloma usando un agente de condensación adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. El medio de cultivo en el que las células de hibridoma están creciendo se somete a ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos frente al antígeno. Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitantes y haciéndolos crecer con métodos convencionales. Medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio de D-ME o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer in vivo as en forma de tumores escíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden separar a partir del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía sobre hidroxilapatito, electroforesis sobre gel, diálisis, o cromatografía por afinidad.
En otra realización, se pueden aislar anticuerpos que se unen a EGFR a partir de bibliotecas de anticuerpos generadas usando técnicas bien conocidas tales como las que se describen como por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 5.223.409; N° 5.403.484; y N° 5.571 .698 de Ladner et al.; Patentes de Estados Unidos N° 5.427.908 y N° 5.580.717 de Dower et al.; Patentes de Estados Unidos N° 5.969.108 y N° 6.172.197 de McCafferty et al.; y Patentes de Estados Unidos N° 5.885.793; N° 6.521.404; N° 6.544.731 ; N° 6.555.313; N° 6.582.915 y N° 6.593.081 de Griffiths et al.. Además, también se puede usar producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de n ) por intercambio de cadenas, así como infección combinatoria y recombinación ¡n vivo como una estrategia para construir fagotecas muy grandes. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos con N° de Serie 09/856.907 (Pub. Int. de PCT N° WO 00/31246).
En una realización en particular, el anticuerpo monoclonal que se une a EGFR se produce usando presentación de fagos. Esta técnica implica la generación de una biblioteca de Fab humano que tiene una combinación única de secuencias de inmunoglobulinas aisladas a partir de donantes humanos y que se genera con una diversidad sintética en las CDR de cadena pesada. La biblioteca se identifica sistemáticamente a continuación para Fabs que se unen a EGFR.
En otra realización más, se pueden generar anticuerpos monoclonales humanos dirigidos frente a EGFR usando ratones transgénicos o transcromosómicos que son portadores de partes del sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón (véanse por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.545.806; N° 5.569.825; N° 5.625.126; N° 5.633.425; N° 5.789.650; N° 5.877.397; N° 5.661 .016; N° 5.814.318; N° 5.874.299; y N° 5.770.429; todas de Lonberg y Kay; la Patente de Estados Unidos N° 5.545.807 de Surani et al.; Publicaciones de PCT WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y la Publicación de PCT WO 01/14424 de Korman et al).
En otra realización, se pueden producir anticuerpos humanos usando un ratón que es portador de secuencias de ¡nmunoglobulina humana sobre transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que es portador de un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma cadena ligera humana (véase por ejemplo, la Publicación de PCT WO 02/43478 de Ishida et al.).
Además adicionalmente, sistemas alternativos de animales transgénicos que expresan genes de ¡nmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden usar para reducir anticuerpos anti-EGFR. Por ejemplo, se puede usar un sistema alternativo de transgénico denominado el Xenoratón (Abgenix, Inc.); dichos ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 5.939.598; N° 6.075.181 ; N° 6.1 14.598; N° 6.150.584 y N° 6.162.963 de Kucherlapati et al.
Además, en la técnica están disponibles sistemas alternativos de animales transcromosómicos que expresan genes de ¡nmunoglobulina humana y se pueden usar para producir anticuerpos anti-EGFR. Por ejemplo, se pueden usar ratones portadores tanto de un transcromosoma de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Además, se han descrito en la técnica vacas portadoras de transcromosomas humanos de cadena pesada y ligera y se pueden usar para producir anticuerpos anti-EGFR.
En otra realización más, se pueden preparar anticuerpos usando una planta transgénica y/o células de plantas cultivadas (tales como, por ejemplo, tabaco, maíz y lentejas de agua) que producen dichos anticuerpos. Por ejemplo, se pueden usar hojas de tabaco transgénico que expresan anticuerpos para producir dichos anticuerpos, por ejemplo, usando un promotor inducible. Además, se puede usar maíz transgénico para expresar dichos anticuerpos y partes de unión a antígenos de éstos. También se pueden producir anticuerpos en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgénicas que incluyen partes de anticuerpos, tales como anticuerpos de una sola cadena (los scFv), por ejemplo, usando semillas de tabaco y tubérculos de patata.
La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales (o partes de éstos) que se unen a EGFR preparados usando cualquier técnica que incluye las que se divulgan en el presente documento, se puede determinar por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA). La afinidad de unión de un anticuerpo monoclonal o parte de éste también se puede determinar mediante análisis de Scatchard.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo EGFR producido usando cualquiera de los métodos que se han analizado anteriormente se puede alterar u optimizar adicionalmente para conseguir una especificidad y/o afinidad de unión deseada usando técnicas reconocidas en la técnica, tales como las que se describen en el presente documento.
En una realización, se pueden usar secuencias parciales de anticuerpos derivados de un anticuerpo EGFR para producir anticuerpos relacionados estructuralmente y funcionalmente. Por ejemplo, los anticuerpos interactúan con antígenos diana predominantemente a través de restos de aminoácidos que están situados en las seis regiones de determinación de la complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de la CDR son responsables de la mayor parte de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos específicos de origen natural mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR a partir del anticuerpo específico de origen natural injertado en las secuencias marco a partir de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades. Dichas secuencias marco se pueden obtener a partir de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias genéticas de anticuerpos de línea germinal.
Por lo tanto, una o más características estructurales de un anticuerpo anti-EGFR, tales como las CDR, se pueden usar para crear anticuerpos anti-EGFR relacionados estructuralmente que mantienen al menos una propiedad funcional deseada, por ejemplo, inhibición del crecimiento de células que expresan EGFR.
En una realización en particular, una o más regiones de CDR que se divulgan en el presente documento se combinan de forma recombinante con regiones marco y CDR humanas conocidas para crear anticuerpos anti-EGFR adicionales, diseñados por ingeniería de forma recombinante. Las regiones marco de cadena variable pesada y ligera pueden tener su origen en la misma o diferentes secuencias de anticuerpos.
Es bien conocido en la técnica que los dominios CDR3 de cadena pesada y ligera de anticuerpos desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo hacia un antígeno. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, se generan anticuerpos que incluyen las CDR3 de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos en particular que se describen en el presente documento. Los anticuerpos pueden incluir adicionalmente las CDR1 y/o CDR2 de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos que se divulgan en el presente documento.
Las regiones CDR 1 , 2, y/o 3 de los anticuerpos diseñados por ingeniería que se han descrito anteriormente pueden comprender la secuencia o secuencias exactas de aminoácidos tales como las que se divulgan en el presente documento. Sin embargo, el experto habitual en la materia observará que puede ser posible alguna desviación de las secuencias exactas de CDR, particularmente para las secuencias de CDR1 y CDR2, que pueden tolerar más variaciones que las secuencias de CDR3 sin alterar la especificidad de los epítopos (dichas desviaciones, por ejemplo, son sustituciones conservativas de aminoácidos). Por consiguiente, en otra realización, el anticuerpo diseñado por ingeniería puede estar compuesto de una o más CDR1 y CDR2 que, por ejemplo, son idénticas en un 90 %, un 95 %, un 98 %, un 99% o un 99,5 % a las correspondientes CDR de un anticuerpo mencionado en el presente documento.
En otra realización, uno o más restos de una CDR se pueden alterar para modificar la unión para conseguir una constante de asociación de unión más favorecida. Usando esta estrategia, se puede conseguir un anticuerpo que tiene una afinidad de unión ultra elevada, por ejemplo, de 1010 M-1 o superior. Técnicas de maduración por afinidad, bien conocidas en la técnica y las que se describen en el presente documento, se pueden usar para alterar la región o regiones de CDR seguido de identificación sistemática de las moléculas de unión resultantes para el cambio deseado en la unión. Por consiguiente, dado que la o las CDR están alteradas, los cambios en la afinidad de unión así como la inmunogenicidad se pueden controlar y puntuar de modo que se consigue un anticuerpo optimizado para la mejor unión combinada y baja inmunogenicidad.
También se pueden hacer modificaciones dentro de una o más de las regiones marco o de unión de las regiones variables de la cadena pesada y/o la ligera de un anticuerpo, siempre que la afinidad de unión a antígenos posterior a estas modificaciones sea superior a 106 M-1.
En otra realización, el anticuerpo está modificado adicionalmente con respecto a la función efectora, para potenciar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento de cáncer, por ejemplo. Por ejemplo se pueden introducir un resto o restos de cisteína en la región Fe, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener capacidad de internalización y/o mayor muerte celular mediada por complementos y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Anticuerpos homodiméricos con mayor actividad antitumoral también se pueden preparar usando agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales. Como alternativa, un anticuerpo se puede diseñar por ingeniería que tiene regiones dobles de Fe y que por lo tanto pueden tener mayor lisis de complementos y capacidades de ADCC.
Además se proporcionan anticuerpos e inmunoconjugados biespecíficos, tal como se analiza a continuación. (ii) Anticuerpos Biespecíficos En el presente documento, los anticuerpos biespecíficos incluyen al menos dos especificidades de unión para EGFR que se unen preferentemente a epítopos de no superposición o de no competición. Dichos anticuerpos biespecíficos pueden incluir especificidades de unión adicionales, por ejemplo, una tercera especificidad de unión a EGFR y/o una especificidad de unión para otro receptor ErbB (por ejemplo, ErbB3) u otro antígeno, tal como el producto de un oncogén. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud total o como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos de F(ab')2).
Métodos para preparar anticuerpos biespecíficos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 051 17973 y el documento WO 06091209). Por ejemplo, la producción de anticuerpos biespecíficos de longitud total se puede basar en la coexpresión de dos inmunoglobulinas emparejadas de cadena pesada-cadenas ligeras, en la que las dos cadenas tienen diferentes especificidades. Además se han descrito diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente a partir de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Además se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dineros de Fv de una sola cadena (sFv).
En una realización en particular, el anticuerpo biespecífico comprende un primer anticuerpo (o parte de unión de éste) que se une a EGFR derivatizado o unido a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une al menos dos sitios de unión diferentes o moléculas diana. Un anticuerpo se puede derivatizar o unir a más de una molécula funcional distinta para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión diferentes y/o moléculas diana; también se pretende que dichas moléculas multiespecíficas estén incluidas en la expresión "molécula biespecífica" tal como se usa en el presente documento. Para crear una molécula biespecífica, un anticuerpo que se divulga en el presente documento se puede unir funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a unas u otras moléculas de unión más, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, mimético de péptido o de unión, de modo que resulte una molécula biespecífica.
Por consiguiente, se contemplan moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para EGFR y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo diana. En una realización en particular, el segundo epítopo diana es un receptor de Fe, por ejemplo, FcnRI humano (CD64) o un receptor de Fcn humano (CD89). Por lo tanto, también se proporcionan moléculas biespecíficas capaces de unirse a células efectoras que expresan tanto FcnR, FcnR como FcnR (por ejemplo, monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMN)), y a células diana que expresan EGFR. Estas moléculas biespecíficas se dirigen a células que expresan EGFR a células efectoras y desencadenan actividades celulares efectoras mediadas por el receptor de Fe, tales como fagocitosis de células de expresión de EGFR, citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), liberación de citoquinas, o generación de anión superóxido.
En una realización, las moléculas biespecíficas comprenden como una especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de éste, que incluye, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv de una sola cadena. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo de éste tal como un Fv o un constructo de una sola cadena tal como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.946.778, de Ladner et al.
Las moléculas biespecíficas se pueden preparar mediante la conjugación de las especificidades de unión constitutivas, por ejemplo, las especificidades de unión anti-FcR y anti-EGFR, usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica se puede generar separadamente y a continuación se puede conjugar con otra. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, una diversidad de agentes de acoplamiento o de reticulación se puede usar para la conjugación covalente. Ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5'-ditiobis(2-n¡trobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 -carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC). Agentes de conjugación preferente son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, se pueden conjugar a través de enlace de sulfhidrilo de las regiones bisagra del extremo de C de las dos cadenas pesadas. En una realización particularmente preferente, la región bisagra está modificada para contener un número impar de restos de sulfhidrilo, preferentemente uno, antes de la conjugación.
Como alternativa, ambas especificidades de unión se pueden codificar en el mismo vector y expresar y montar en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molécula biespecífica puede ser una molécula de una sola single que comprende un anticuerpo de una sola cadena y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de una sola cadena que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de una sola cadena. Métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen por ejemplo en la Patente de Estados Unidos N° 5.260.203; Patente de Estados Unidos N° 5.455.030; Patente de Estados Unidos N° 4.881 .175; Patente de Estados Unidos N° 5.132.405; Patente de Estados Unidos N° 5.091.513; Patente de Estados Unidos N° 5.476.786; Patente de Estados Unidos N° 5.013.653; Patente de Estados Unidos N° 5.258.498; y Patente de Estados Unidos N° 5.482.858.
En la unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas se puede confirmar, por ejemplo, mediante ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis por FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento), o ensayo de western blot. Cada uno de estos ensayos generalmente detectar la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular mediante el uso de un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de FcR-anticuerpo se pueden detectar usando por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo ligado a enzimas que reconoce y se une específicamente a los complejos de anticuerpo-FcR. Como alternativa, los complejos se pueden detectar usando cualquiera de una diversidad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar de forma radiactiva y usar en un radioinmunoensayo (RIA). El isótopo radiactivo se puede detectar mediante medios tales como el uso de de un contador ? ?-? o un contador de centelleo o por autoradiografía. (iii) Inmunoconiuqados Los inmunoconjugados que se proporcionan en el presente documento se pueden formar mediante la conjugación de los anticuerpos que se describen en el presente documento con otro agente terapéutico. Agentes adecuados incluyen, por ejemplo, un agente citotóxicos (por ejemplo, un agente quimioterapeútico), una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de éstas), y/o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).
Agentes quimioterapeúticos útiles en la generación de dichos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de éstas que se pueden usar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos de no unión de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Una diversidad de radionucleidos están disponibles para la producción de anticuerpos anti-EGFR radioconjugados. Ejemplos incluyen 212BÍ, 1311, 131 ln, 90Y y 186Re.
Se pueden preparar inmunoconjugados usando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinim¡d¡l-3-(2-p¡rid¡ldit¡ol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCI), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolieno), y compuestos de flúor bis-activo (tales como l,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminpentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo (véase, por ejemplo, el documento W094/1 1026).
IV. Métodos para Identificar Sistemáticamente Anticuerpos Después de producir anticuerpos, éstos se pueden identificar sistemáticamente para diversas propiedades, tales como las que se describen en el presente documento, usando una diversidad de ensayos que son bien conocidos en la técnica.
En una realización, los anticuerpos se identifican sistemáticamente (por ejemplo, por citometría de flujo o por ELISA) para su unión a EGFR usando, por ejemplo, EGFR purificado y/o células que expresan EGFR, tales como células A431. Los epítopos unidos mediante los anticuerpos anti-EGFR se pueden identificar y comparar adicionalmente, por ejemplo, para identificar anticuerpos de no competición (por ejemplo, anticuerpos que se unen a diferentes epítopos), así como anticuerpos que compiten por la unión y/o se unen al mismo epítopo o epítopos de superposición.
Se pueden identificar anticuerpos competitivos y no competitivos usando técnicas de rutina. Dichas técnicas incluyen, por ejemplo, un inmunoensayo, que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear (o no bloquear) la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, es decir, un ensayo de unión competitiva. La unión competitiva se determina en un ensayo en el que la inmunogiobulina se está ensayando inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como EGFR. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto en fase sólida (RIA), inmunoensayo enzimático directo o indirecto en fase sólida (EIA), ensayo de competición de sándwich; EIA directo de biotina-avidina en fase sólida; ensayo marcado directo en fase sólida, ensayo de sándwich marcado directo en fase sólida; RIA marcado con 1251 directo en fase sólida; EIA directo de biotina-avidina en fase sólida; y RIA marcado directo. La técnica de resonancia de plasmones superficiales que se expone en los Materiales y Métodos de los Ejemplos y en el Ejemplo 2, que sigue a continuación, también se puede usar ventajosamente para este fin. Por lo general, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que portan cualquiera de éstas, un ensayo sin marcar de inmunogiobulina y una inmunogiobulina de referencia marcada.
La inhibición competitiva se mide mediante la determinación de la cantidad de marca unida a la superficie sólida o células en presencia de de la inmunogiobulina de ensayo. Habitualmente, la inmunogiobulina de ensayo está presente en exceso. Habitualmente, un anticuerpo de competición está presente en exceso, éste inhibirá la unión específica del anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos un 50-55 %, un 55-60 %, un 60-65 %, un 65-70 %, un 70-75 % o superior.
Otras técnicas de identificación sistemática para determinar el epítopo unido a otros anticuerpos que se divulgan en el presente documento incluyen, por ejemplo, análisis de rayos X de cristales de complejos de antígeno:anticuerpo, que proporciona resolución atómica del epítopo. Otros métodos controlan la unión del anticuerpo a fragmentos de antígenos o variaciones mutadas del antígeno en la que la pérdida de unión debida a una modificación de un resto de aminoácido dentro de la secuencia de antígenos a menudo se considera una indicación de un componente del epítopo. Además, también se pueden usar métodos combinatorios computacionales para localización de epítopos. Estos métodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interés para aislar por afinidad péptidos específicos cortos a partir de bibliotecas peptídicas de presentación de fagos combinatorias. Los péptidos se consideran a continuación como guías para la definición del epítopo que se corresponde con el anticuerpo usado para identificar sistemáticamente la biblioteca de péptidos. Para la localización de epítopos, también se han desarrollado algoritmos computacionales que se ha mostrado que localizan epítopos discontinuos conformacionales.
En otra realización, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de no competición anticuerpos anti-EGFR) se identifican sistemáticamente por la capacidad para unirse a epítopos expuestos por la unión al ligando, por ejemplo, EGF (es decir, no inhiben la unión de ligandos de unión a EGFR a EGFR). Dichos anticuerpos se pueden identificar, por ejemplo, poniendo en contacto células que expresan EGFR (por ejemplo, células A431 ) con un ligando de EGFR marcado (por ejemplo, EGF radiomarcado o biotinilado) en ausencia (control) o presencia del anticuerpo anti-EGFR. Si el anticuerpo no inhibe la unión de EGF a EGFR, entonces no se observará disminución estadísticamente significativa en la cantidad de marca recuperada, con respecto a la cantidad en ausencia del anticuerpo. Como alternativa, si el anticuerpo inhibe la unión de EGF a EGFR, entonces se observará una disminución estadísticamente significativa en la cantidad de marca recuperada, con respecto a la cantidad en ausencia del anticuerpo.
Los anticuerpos también se pueden identificar sistemáticamente (someter a ensayo) su afinidad de unión. Esto se puede realizar, por ejemplo, usando un ensayo de resonancia de plasmones, por ejemplo, tal como se describe a continuación.
Los anticuerpos también se pueden identificar sistemáticamente por su capacidad para inhibir la señalización a través de EGFR usando ensayos de señalización, tales como, los que se describen en el presente documento. Por ejemplo, la capacidad de un anticuerpo para inhibir fosforilación mediada por ligando de EGFR de los EGFR se puede someter a ensayo mediante el tratamiento de células que expresan EGFR con un ligando de EGFR (por ejemplo, EGF) en presencia y ausencia del anticuerpo. Las células se pueden lisar a continuación, centrifugar los lisados en bruto para retirar material insoluble, y medir la fosforilación de EGFR, por ejemplo, por transferencia de western seguido de exploración con un anticuerpo anti-fosfotirosina.
Como alternativa, la capacidad de un anticuerpo para inhibir la señalización corriente abajo a través de EGFR se puede medir mediante ensayos de quinasa para sustratos conocidos de EGFR tales como, por ejemplo, AKT y/o ERK, seguido de estimulación de EGFR con ligando de EGF. Por ejemplo, se pueden incubar células que expresan EGFR con un anticuerpo candidato y estimular con ligando de EGF. Los lisados celulares preparados posteriormente a partir de dichas células se pueden inmunoprecipitar con un anticuerpo para un sustrato de EGFR (o una proteína en una ruta celular que implica EGFR) tal como, un anticuerpo anti-AKT, y someter a ensayo la actividad de quinasa (por ejemplo, actividad de quinasa AKT) usando técnicas reconocidas en la técnica. Una disminución en o desaparición completa en el libro actividad (por ejemplo, actividad de quinasa) de un sustrato o una proteína de EGFR en una ruta que implica EGFR en presencia del anticuerpo, con respecto al nivel o actividad en ausencia del anticuerpo es indicativo de un anticuerpo que inhibe la señalización de EGFR.
Se pueden identificar anticuerpos que disminuyen los niveles de EGFR en las superficies celulares por su capacidad para regular de forma negativa o inhibir la expresión de EGFR en células tumorales. En determinadas realizaciones, los anticuerpos disminuyen EGFR en superficies celulares mediante la inducción de internalización (o aumentando la endocitosis) de EGFR (por ejemplo, por internalización y reciclado del receptor y/o internalización y degradación del receptor) o inhibición y reciclado del EGFR internalizado. Para someter a ensayo ésto, EGFR se puede biotinilar y el número de moléculas de EGFR en la superficie celular se puede determinar fácilmente, por ejemplo, midiendo la cantidad de biotina en una monocapa de células en cultivo en presencia o ausencia de un anticuerpo, seguido de inmunoprecipitación de EGFR y exploración con estreptavidina. Una disminución en la detección de EGFR biotinilado en el tiempo en presencia de un anticuerpo es indicativo de un anticuerpo que disminuye los niveles de EGFR en las superficies celulares.
Además se pueden someter a ensayo anticuerpos y combinaciones de anticuerpos por su capacidad para inhibir el crecimiento de células que expresan EGFR (in vivo o in vitro), tales como células tumorales, usando técnicas reconocidas en la técnica, que incluyen el Ensayo de Cell Titer-Glo que se describe en los Ejemplos que siguen a continuación y Ensayo de incorporación de timidina marcada con tritio. Además, los anticuerpos se pueden identificar sistemáticamente por la capacidad para inhibir el crecimiento esferoide de células que expresan EGFR.
Esto se puede realizar usando un ensayo que aproxima las condiciones de un crecimiento tumoral en desarrollo tal como se describe en el presente documento.
En otra realización, combinaciones de anticuerpos anti-EGFR se identifican sistemáticamente por los valores de la CI50 y/o CI90 con respecto a la inhibición de una actividad o función de EGFR en particular, tal como señalización mediada por EGFR (por ejemplo, como se mide con métodos de ELISA, Western, o multiplex, tal como Luminex®). A continuación se pueden seleccionar combinaciones de anticuerpos, cada una de las cuales posee un valor particularmente deseado de CI50 y/o CI90 (por ejemplo, una CI90 de aproximadamente 80 nM para inhibir la señalización de EGFR). En una realización, la combinación tiene un valor de CI50 o CI90 mayor que un anticuerpo de referencia conocido (por ejemplo, cetuximab). En otra realización, la combinación tiene una CI50 o CI90 aditiva (es decir, la suma de las actividades de los anticuerpos, cuando actúan individualmente sobre una célula que expresa EGFR, es aproximadamente equivalente al efecto combinado de estos anticuerpos que actúan en conjunto sobre la misma célula) En otra realización, la combinación tiene una CI50 o CI90 sinérgica (es decir, la suma de los efectos de los anticuerpos, cuando actúan individualmente sobre una célula que expresa EGFR, es menor que el efecto combinado de estos anticuerpos que actúan en conjunto sobre la misma célula).
V. Composiciones Farmacéuticas En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene un o una combinación de los anticuerpos monoclonales anti-EGFR que se divulgan en el presente documento, formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, las composiciones incluyen una combinación de anticuerpos aislados múltiples (por ejemplo, dos o tres) que se unen a diferentes epítopos en EGFR. Cuerpos tienen preferentemente un efecto aditivo o sinérgico con respecto a la inhibición de una actividad o función de EGFR en particular, tal como señalización mediada por EGFR. Las composiciones farmacéuticas preferentes son composiciones estériles, composiciones adecuadas para inyección, composiciones estériles adecuadas para inyección mediante una ruta de administración deseada, tal como por inyección intravenosa.
Tal como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, molécula biespecífica y multiespecífica, puede estar revestido con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Las composiciones se pueden administrar solas o en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una composición que se proporciona en el presente documento con al menos uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como los agentes anticáncer que se describen en el presente documento. En una realización, la terapia de combinación puede usar una composición que se proporciona en el presente documento de dos o tres de los anticuerpos anti-EGFR que se divulgan el presente documento. En otra realización, la terapia de combinación puede usar una composición que comprende al menos uno de anticuerpos anti-EGFR que se divulgan el presente documento combinados con uno otros anticuerpos más, tales como uno o u otros anticuerpos anti-EGFR más conocidos en la técnica {por ejemplo, anticuerpos anti-EGFR tal como se divulga en la Solicitud de PCT N° PCT/US201 1/3528). Las composiciones también se pueden administrar en conjunto con terapia de radiación y/o cirugía. Las combinaciones en particular de anticuerpos anti-EGFR también se puede administrar separadamente o secuencialmente, con o sin agentes terapéuticos adicionales.
Las composiciones se pueden administrar a través de una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Tal como observará el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Los anticuerpos se pueden preparar con vehículos que protegerán a los anticuerpos frente a una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos, y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biocompatibles, biodegradables, tales como vinil acetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágena, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son conocidos generalmente por los expertos en la materia.
Para administrar composiciones mediante determinadas vías de administración, puede ser necesario revestir los constituyentes, por ejemplo, anticuerpos, con, o coadministrar las composiciones con un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Diluyentes aceptables incluyen soluciones tampón salinas y acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones de CGF de agua en aceite en agua así como liposomas convencionales.
Vehículos aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos excelentes para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Salvo en la medida de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los anticuerpos, está contemplado el uso de éstos en composiciones que se proporcionan en el presente documento. Además se pueden incorporar en las composiciones constituyentes activos complementarios.
Por lo general, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para aumentar la concentración del fármaco. El vehículo puede ser un medio disolvente o de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de éstos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición. Incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina se puede producir una absorción prolongada de las composiciones inyectables.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación de los anticuerpos monoclonales en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes que se han enumerado anteriormente, siempre que se requiera, seguido de microfiltración por esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los anticuerpos en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de los que se han enumerado anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferentes de preparación son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución filtrada previamente estéril de éstos.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente tal como lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Por ejemplo, se pueden administrar anticuerpos humanos una o dos veces a la semana por inyección subcutánea o una o dos veces al mes por inyección subcutánea.
Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación individual para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Forma de dosificación individual tal como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones individuales para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de anticuerpos calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La memoria descriptiva para las formas de dosificación individual que se proporcionan en el presente documento se recetan por y directamente dependientes de (a) las características únicas de los anticuerpos y el efecto terapéutico en particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de composición tales como anticuerpos para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1 ) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfito sódico, sulfito sódico y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamin tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.
Para las composiciones terapéuticas, las formulaciones incluyen las adecuadas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, y parenteral. La administración parenteral es la vía de administración más común para las composiciones terapéuticas que comprenden anticuerpos. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación individual y se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica farmacéutica. La cantidad de anticuerpos que se pueden combinar con un material vehículo para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se está tratando, y el modo de administración en particular. Esta cantidad de anticuerpos generalmente ser una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. Generalmente, de cada cien por cien, esta cantidad variará de aproximadamente un 0,001 por ciento a aproximadamente un noventa por ciento de anticuerpo en masa, preferentemente de aproximadamente un 0,005 por ciento a aproximadamente un 70 por ciento, más preferentemente de aproximadamente un 0,01 por ciento a aproximadamente un 30 por ciento.
Las expresiones "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" tal como se usan en el presente documento se refieren a modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas que se proporcionan en el presente documento incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de éstos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulgentes y agentes de dispersión. Ejemplos en particular de adyuvantes que son bien conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, adyuvantes inorgánicos (tales como sales de aluminio, por ejemplo, fosfato de aluminio e hidróxido de aluminio), adyuvantes orgánicos (por ejemplo, escualeno), adyuvantes a base de aceite, virosomas (por ejemplo, virosomas que contienen una hemaglutinina y neuraminidasa unidas a membranas derivadas del virus de la gripe).
La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto por procedimientos de esterilización como por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, y similares. Además puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede conseguir por la inclusión de uno o más agentes que retrasa la absorción tales como monoestearato de aluminio o gelatina.
Cuando las composiciones se administran como agentes farmacéuticos, a seres humanos y animales, se pueden administrar solos o como una composición farmacéutica que contienen, por ejemplo, de un 0,001 a un 90 % (más preferentemente, de un 0,005 a un 70 %, tal como de un 0,01 . 30 %) de principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Independientemente de la vía de administración seleccionada, las composiciones que se proporcionan en el presente documento, se pueden usar en una forma hidratada adecuada, y se pueden formular en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.
Los niveles reales de dosificación de los anticuerpos en las composiciones farmacéuticas que se proporcionan en el presente documento deben variar con el fin de obtener una cantidad del ingrediente activo que es eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración en particular, que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones usadas en particular, o el éster, sal o amida de éstas, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto que se está usando en particular, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones usadas en particular, la edad, sexo, peso, afección, salud general e historia médica previa del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Un médico veterinario que tenga una experiencia habitual en la materia puede determinar y recetar fácilmente la cantidad eficaz de la composición requerida. Por ejemplo, el médico veterinario podría comenzar con dosis de los anticuerpos a niveles inferiores de los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se consiga el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de las composiciones que se proporcionan en el presente documento será la cantidad de los anticuerpos que es la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis eficaz dependerá generalmente de los factores que se han descrito anteriormente. Es preferente que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, o subcutánea, administrada preferentemente proximal al sitio de la diana. Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composición terapéutica se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas separadamente a intervalos apropiados durante todo el día, opcionalmente, en formas de dosificación individual. Mientras sea posible que los anticuerpos se administren solos, es preferente administrar anticuerpos como una formulación (composición).
Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, los que se divulgan en las Patentes de Estados Unidos N° 5.399.163, N° 5.383.851 , N° 5.312.335, N° 5.064.413, N° 4.941.880, N° 4.790.824, N° 4.596.556, N° 4.487.603, N° 4.486.194, N° 4.447.233, N° 4.447.224, N° 4.439.196, y N° 4.475.196.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos monoclonales se pueden formular para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para asegurar que anticuerpos terapéuticos atraviesan la BBB (desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 4.522.81 1 ; N° 5.374.548; N° 5.399.331 ; N° 5.891.468; N° 6.056.973; N° 6.210.707, N° 6.224.903; N° 6.316.024; N° 7.122.202; N° 7.135.177; y N° 7.507.407 y Publicación de Patente de Estados Unidos N° 200701 16753. Los liposomas pueden comprender uno o más restos que se unen a y/o se transportan selectivamente en células u órganos específicos, potenciando de este modo la administración dirigida del fármaco.
Se proporcionan composiciones farmacéuticas comprenden tríos de anticuerpos anti-EGFR en una relación de 2:2:1 , que es la composición que comprende tres anticuerpos anti-EGFR diferentes, en particular un anticuerpo relacionado con P1 X, un anticuerpo relacionado con P2X y un anticuerpo relacionado con P3X, que se une a diferentes epítopos de EGFR, formulados en una relación específica de 2:2.1 . Además de estos tres anticuerpos, estas composiciones farmacéuticas pueden comprender un vehículo y/o otro excipiente de excipientes farmacéuticamente aceptables tales como los que se han descrito con detalle anteriormente. La composición farmacéutica se puede proporcionar en un solo envase que contiene todos los tres anticuerpos o, como alternativa, la composición farmacéutica puede comprender un envase que comprende tres envases distintos cada uno de los cuales contiene de los tres anticuerpos anti-EGFR diferentes (así como un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o otro excipientes tal como se ha descrito anteriormente.
Se proporcionan usos de los anticuerpos anti-EGFR que se han descrito anteriormente, solos (como agentes Individuales), en combinaciones en parejas (dos anticuerpos), o en combinaciones triples (tres anticuerpos) en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la señalización dependiente de EGFR. También se proporcionan los anticuerpos anti-EGFR que se han descrito anteriormente, solos (como agentes individuales), en combinaciones en parejas (dos anticuerpos), o en combinaciones triples (tres anticuerpos) para el tratamiento de cáncer (o para usar en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer), tales como un cáncer que expresa EGFR, tal como un cáncer que incluye, pero no se limita a melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovarios, carcinoma renal, cáncer gastrointestinal, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello glioblastoma, cáncer de próstata y otros tumores sólidos y/o metastásicos.
Además, las composiciones que se contemplan pueden incluir adicionalmente, o preparar para su uso como un medicamento en terapia en combinación con, un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente anticáncer adicional. Un "agente anticáncer" es un fármaco usado para tratar para tratar tumores, cánceres, neoplasias, y similares. La terapia con fármacos (por ejemplo, con composiciones de anticuerpos que se divulgan el presente documento) se puede administrar sin otro tratamiento, o en combinación con otros tratamientos tales como cirugía, calor, o terapia de radiación {por ejemplo, con radiación ionizante). Se pueden usar varias clases de agentes anticáncer en el tratamiento del cáncer, dependiendo de la naturaleza del órgano o tejido implicado. Por ejemplo, los cánceres de mama normalmente se estimulan con estrógenos, y se pueden tratar con fármacos que inactivan las hormonas sexuales. De forma análoga, el cáncer de próstata se puede tratar con fármacos que inactivan los andrógenos. Agentes anticáncer para su uso en combinación con composiciones de anticuerpos que se divulgan en el presente documento incluyen, entre otros, los que se indican en el Apéndice A, que no se deberían interpretar como limitantes. Uno o más agentes anticáncer se pueden administrar simultáneamente o antes o después de la administración de la composición de anticuerpos que se divulgan en el presente documento. Las composiciones de anticuerpos que se divulgan en el presente documento se pueden administrar secuencialmente o junto con el agente anticáncer adicional, por ejemplo, un agente anticáncer que se divulga en el Apéndice A, que sigue a continuación.
Además se proporcionan kits que comprende uno o más anticuerpos anti-EGFR desvelada del presente documento, contenidos opcionalmente en un solo vial o envase, e incluyen, por ejemplo, instrucciones para su uso en el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad asociada con la regulación positiva de EGFR y/o señalización dependiente de EGFR (por ejemplo, un cáncer tal como los que se describen en la subsección VI que sigue a continuación). Los kits pueden incluir una etiqueta que indica incluso pretendido de los contenidos del kit. El término etiqueta incluye cualquier material escrito, de marketing o material grabado proporcionado en o con el kit, o que de otro modo acompaña al kit. Dichos kits pueden comprender la composición de anticuerpo en forma de dosificación individual, tal como en un vial de una sola dosis o una jeringa cargada previamente de una sola dosis. Los kits que comprenden una combinación de los anticuerpos anti-EGFR que se divulgan en el presente documento (por ejemplo, una combinación de un anticuerpo relacionado con P1 X, un anticuerpo relacionado con P2X, y un anticuerpo relacionado con P3X) pueden comprender un solo vial que contiene todos los componentes de la combinación o, como alternativa, el kit de comprender cada componente en viales separados con instrucciones para la administración de los anticuerpos en terapia de combinación. En una realización preferente, un anticuerpo relacionado con P1 X, un anticuerpo relacionado con P2X, y un anticuerpo relacionado con P3X se proporcionan en una relación de 2:2:1 en un solo vial o, como alternativa, proporcionan cada uno en viales separados con acciones para administración de los tres anticuerpos en una relación de 2:2:1.
VI. Métodos de Uso de Anticuerpos Los anticuerpos y las composiciones que se divulgan en el presente documento se pueden usar en una amplia diversidad de aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico, particularmente en aplicaciones oncológicas. Por consiguiente, en otro aspecto, que se proporciona en el presente documento, aparecen métodos para inhibir la actividad de EGFR en un sujeto mediante la administración de uno o más anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento en una cantidad suficiente para inhibir la actividad mediada por EGFR-. Indicaciones terapéuticas en particular que se pueden tratar incluyen, por ejemplo, cánceres de órganos o tejidos tales como piel, cerebro y sistema nervioso central, cabeza y cuello, esófago, estomago, colon, recto, ano, hígado, páncreas, conductos biliares, vesícula biliar, pulmón o bronquios, mama, ovarios, útero, cérvix, vagina, testículos, células germinales, próstata, riñon, uréter, vejiga urinaria, adrenal, pituitaria, tiroides, huesos, músculos u otros tejidos conectores, leucemia, mieloma múltiple, linfoma Hodgkin y linfoma no Hodgkin.
Además, anticuerpos de los que se divulgan en el presente documento también se pueden usar para diagnosticar o pronosticar enfermedades (por ejemplo, cánceres) asociados con EGFR, por ejemplo, poniendo en contacto uno o más anticuerpos, parejas de anticuerpos o tríos de anticuerpos que se divulgan en el presente documento (por ejemplo, ex vivo o in vivo) con células del sujeto, y midiendo el nivel de unión a EGFR en las células, en las que niveles elevados de forma anómala unión a EGFR el sujeto tiene un cáncer asociado con EGFR.
Además se proporcionan métodos de uso de los anticuerpos anti-EGFR que se divulgan en el presente documento en una diversidad de aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas ex vivo e in vivo que implican señalización dependiente de EGFR, que incluye una diversidad de cánceres.
Por consiguiente, en una realización, se proporciona un método para tratar una enfermedad asociada con la señalización dependiente de EGFR entre administración a un sujeto de un anticuerpo o preferentemente de una combinación de anticuerpos que se proporcionan en el presente documento en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad. Enfermedades adecuadas incluyen, por ejemplo, la diversidad de cánceres que incluyen, pero no se limitan a, melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovarios, carcinoma renal, cáncer gastrointestinal, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello glioblastoma, cáncer de próstata y otros tumores sólidos y/o metastásicos.
El anticuerpo se puede administrar sólo o con otro agente terapéutico que actúa en conjunto con o de forma sinérgica con el anticuerpo para tratar la enfermedad asociada con la señalización mediada por EGFR. Dichos agentes terapéuticos incluyen los que se describen en el presente documento, por ejemplo, moléculas orgánicas pequeñas, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, biologías diseñadas de forma recombinante, compuestos de ARNi, inhibidores de la tirosina quinasa, y anticuerpos comerciales, como agentes anticáncer (por ejemplo, citotoxinas, agentes quimioterapeúticos, moléculas pequeñas y radiación). Los ejemplos no limitantes de agentes anticáncer que se pueden usar en terapia de combinación con uno o más de los anticuerpos anti-EGFR que se divulgan en el presente documento incluyen que se enumeran en el Apéndice A.
Otras realizaciones se describen en los siguientes Ejemplos no limitantes.
Ejemplos Materiales v Métodos para los Ejemplos En general, en los siguientes ejemplos, a menos que se indique de otro modo, se usaron técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos), y técnicas convencionales de preparación de inmunoglobulina recombinante.
Líneas celulares Todas las líneas celulares a usar en los experimentos que se describen a continuación se obtienen del National Cáncer Institute o ATCC.
Líneas Celulares : A431 - carcinoma epidermoide DU145 - carcinoma de próstata H1975 - adenocarcinoma de pulmón; cáncer de pulmón de células no pequeñas HCC827 - adenocarcinoma de pulmón; cáncer de pulmón de células no pequeñas Purificación de proteínas de Mutantes del Dominio Extracelular de EGFR (EGFR-ECD) Los mutantes del dominio extracelular de EGFR (EGFR-ECD) se generan para el agrupamiento de epítopos de mAb. Se diseñaron mutaciones en base tanto a epítopos de cetuximab (Li S. et al., Cáncer Cell. 7: 301 -31 1 , 2005) como de H1 1 (Spangler J. et al. PNAS. 107: 13252-13257, 2010) y después del análisis estructural de la estructura de EGFR-ECD (Protein Data Bank ID: 1 NQL; Ferguson K.M. et al. Mol Cell. 11 : 507-517, 2003). Los restos están mutados en alaninas tal como se indica en las secuencias de proteínas incluidas en la presente solicitud. La síntesis de ADN de constructos de expresión se puede obtener comercialmente a partir de DNA2.0 (www.dna20.com). La subclonación del ADN posterior, expresión de proteínas en células 293F y purificación de proteínas se completan usando métodos convencionales.
Inhibición de la Señalización Mediada por EGF de EGFR o ERK en Células Tumorales La inhibición de la señalización de células tumorales mediadas por ligandos se investiga como sigue a continuación: células A431 o Du145 se siembran con una densidad de 35.000 células/pocilio o 17.500 células por medio pocilio en placas para cultivo celular de 96 pocilios y se cultivan en medio de DMEM o RPMI-1640 complementado con antibióticos, L-glutamina 2 mM y suero bovino fetal al 10 % (FBS) durante 24 horas a 37 °C y dióxido de carbono al 5 %. Las células se privan de suero en medio de FBS al 1 % con antibióticos y L-glutamina 2 m durante aproximadamente 20 horas a 37 °C y dióxido de carbono al 5 %. Las células se preincuban a continuación con concentraciones variables de anticuerpos anti-EGFR durante 2 horas, y a continuación se estimulan con ligando EGF humano (50 ng/ml) (PeproTech, N° de cat AF-100-15) durante 10 minutos a 37 °C y dióxido de carbono al 5 %. Las células se lavan con PBS enfriado con hielo y se lisan en 50 ni de tampón de Lisis enfriado con hielo (tampón de Lisis con Extracto de Proteína de Mamífero (MPER-Pierce, N° 78505) modificado con NaCI 150 mM y cóctel inhibidor de proteasa (Sigma, P714)) mediante incubación en hielo durante 30 minutos. Los lisados se analizan inmediatamente por ELISA para ERK (un efector corriente abajo de EGFR) fosforilación de EGFR, o se congelan a -80 °C hasta su uso.
Ensayos de ELISA Para el ELISA de sándwich de fosfo-EGFR, placas de alta unión de GREINER de 96 pocilios de mitad de área (N° Cat. 675077; GREINER BIO-ONE, Monroe, NC) se revisten con 50 ni de un anticuerpo EGFR (EGFR Ab-1 1 , Clone: 199.12, sin BSA ni azida, Fisher Scientific, N° Cat. MS396P1 ABX), y se incuban durante una noche a temperatura ambiente.
A la mañana siguiente, las placas se lavan 3 veces con 100 nl/pocillo de PBST (Tween-20 al 0,05 %) en un lavador de placas de BIOTEK. Las placas se bloquean posteriormente durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con BSA al 2 % en PBS. Las placas se lavan 3 veces con 100 nl/pocillo de PBST (Tween-20 al 0,05 %) en el lavador de placas de BIOTEK. Los lisados celulares (50 ni) o patrones (kit para ELISA pEGFR pY1068, R&D Systems, N° Cat. DYC3570) se diluyen en tampón de lisis al 50 % BSA-PBS y al 1 % (según las recomendaciones del fabricante) y se añaden a las placas por duplicado y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente o durante una noche a 4 °C con agitación. Las placas se lavan a continuación 3 veces con 100 nl/pocillo en el lavador de placas de BIOTEK con PBST (PBS con Tween-20 al 0,05 %). Aproximadamente 50 ni de un anticuerpo de detección conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (kit para ELISA pEGFR pY1068, R&D Systems, N° Cat. DYC3570) diluido en BSA al 2%, se añade PBS y se incuba durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. La placa se lava 3 veces con 100 nl/pocillo en el lavador de placas de BIOTEK con PBST (Tween-20 al 0,05 %). Se añaden aproximadamente 50 ni de sustrato SUPERSIGNAL PICO ELISA y la placa se lee usando un lector de placas Envision (Perkin Elmer). Para el análisis de datos, se promedian muestras por duplicado y se usan barras de error para representar la desviación estándar entre los dos replicados. Las curvas de inhibición y los valores correspondientes de CI50 se calculan usando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) a través de regresión de los datos a una ecuación logística de 4 parámetros.
El ELISA de fosfo-ERK se realiza de forma similar al ELISA de fosfo-EGFR con los siguientes cambios: El kit de Duoset para ELISA de pERK humano se adquiere en R&D Systems (N° de cat. DYC1018-5) y se usa tal como lo recomienda el fabricante.
Un ELISA directo se realiza usando EGFR-ECD de tipo silvestre (TS), un muíante de epítopo de Bin1 , o un muíante de epítopo de Bin3 como reactivos de captura (4 ng/ml).
Placas de alta unión de GREINER de 96 pocilios de mitad de área (N° de Cat. 675077; GREINER BIO-ONE, Monroe, NC) se revisten con 50 ni de reactivo de captura y se incuba durante una noche a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, las placas se lavan 3 veces con 100 nl/pocillo en un lavador de placas de BIOTEK con PBST (Tween-20 al 0,05 %) y se bloquean durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con BSA al 1 % en PBS, pH 7,2. Concentraciones variables (1 , 0,25, 0,06, y 0,02 ng/ml) de anticuerpos monoclonales (mAbs) diluidos en BSA al 1 % en PBS, pH 7,2 se incuban con los reactivos de captura a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido de detección con dilución a 1 :50.000 en BSA al 1 % en PBS, pH 7,2 de Fragmento de Fe de IgG Anti-Humana de Cabra AffiniPure Conjugado con Peroxidasa (N° de Catálogo de Jackson Immunoresearch 109-035-008) durante 2 horas. Se añaden aproximadamente 50 ni de sustrato Supersignal PICO ELISA y la placa se lee usando un lector de placas Envision (Perkin Elmer). Para el análisis de datos, se promedian muestras por duplicado y se usan barras de error para representar la desviación estándar entre los dos replicados.
Afinidad de Unión: Ensayo de Exclusión Cinética (KinExA) Las afinidades y la reactividad cruzada de anticuerpos se miden en disolución con receptor de EGF recombinante usando instrumentación para KinExA (SAPIDYNE Instruments, Boise, ID). Los materiales usados para este ensayo son un instrumento KinExA 3000 y software (Sapidyne Instruments, Boise, ID), perlas de polimetilmetacrilato (PMMA) (Sapidyne Instruments), IgG anti-EGFR humana, EGFR recombinante humano, IgG anti-humana de cabra conjugada con Cy5 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), solución salina tamponada con fosfato (PBS), y albúmina de suero bovino en PBS (100 mg/ml).
Para acoplar el receptor de EGF recombinante con perlas de PMMA, se añaden 100 l ig de EGFR recombinante a una alícuota medida previamente de 200 mg de perlas de PMMA, y se añade PBS para conseguir el volumen total de 1 mi. Las perlas se incuban durante 1 h a temperatura ambiente en una rueda giratoria. A continuación las perlas se centrifugan brevemente y el sobrenadante se retira. Se añaden 100 ni de 100 mg/ml de BSA en PBS a las perlas, con adición de PBS adicional para conseguir un volumen total de 1 mi. Las perlas se incuban de nuevo durante 1 h a temperatura ambiente en una rueda giratoria. Las perlas se transfieren a continuación a una botella de vidrio que contiene 27 mi de PBS.
Para determinar la afinidad de unión anticuerpo monovalente, una dilución en serie de doce etapas de EGFR recombinante (75 nM, 25 n , 8,3 nM, 2,8 nM, 0,9 nM, 0,3 nM, 100 pM, 33 pM, 1 1 pM, 4 pM, 1 ,3 pM, 0 pM) se prepara en 5 mi de PBS que tiene una concentración constante de anticuerpo anti-EGFR. Para una medida precisa de la afinidad, la concentración total del sitio de unión a anticuerpos ("ABC"; dos veces la concentración molar de anticuerpo, debido a Valencia) debería ser menor que la afinidad monovalente del anticuerpo para EGFR. Las mezclas receptoras de anticuerpos se incuban durante 2 h a temperatura ambiente para conseguir el equilibrio. Dependiendo de la afinidad esperada del complejo anticuerpo-receptor, este tiempo de equilibrio se puede ajusfar en consecuencia. En un tubo separado, se preparan 15 mi de 2 ng/ml de anticuerpo secundario de IgG antí-humana conjugada con Cy5, usando una dilución a 1 :1000 de anticuerpo de reserva (2 mg/ml) en PBS. A continuación, las líneas del instrumento KinExA se unen a cada uno de los 12 tubos de solución de anticuerpo-receptor. Cada solución se inyecta a través de una columna rellena con EGFR-perlas. (El instrumento KinExA rellena automáticamente una columna de perlas recién preparadas para cada inyección). Después de una etapa de lavado, el anticuerpo secundario marcado se pasa a través de la columna. Finalmente, usando la cantidad medida de receptor sin complejar a concentraciones diferentes de receptor, los datos de valoración en equilibrio se ajustan a un modelo de unión a 1 :1 en el software de KinExA para producir una KD del valor de afinidad. Cuanto más bajo sea el valor de KD, mayor es la afinidad de unión (más fuerte, en algunas ocasiones se indica como más elevado). Por lo tanto una lectura en la que un anticuerpo se une con una Kd de x nM o superior significa que se une con un valor de Kd de, por ejemplo, 1 x 10-8 M (10 nM) o con un valor de Kd más bajo, por ejemplo, 1 x 10-10 M (0,1 nM), con el valor de KD más bajo indicando mayor afinidad (más elevada).
Para determinar la constante de asociación de unión usando el "método directo" de KinExA, la afinidad de unión monovalente en equilibrio (Kd) se determina usando el enfoque anterior y la concentración total del sitio de unión a anticuerpos (ABC). A continuación, usando el software de "Demostración de la Curva de Unión Teórica" software (Sapidyne Instruments), se determina la concentración del antígeno de partida (LO) para el experimento cinético. Para realizar ésto, se introducen los valores de afinidad y ABC determinados en el experimento de afinidad de unión monovalente, y se selecciona una concentración de antígeno de partida como la concentración en la que aproximadamente un 20 % del anticuerpo no se unirá al antígeno en el equilibrio. Esto asegura una buena relación de señal a ruido en el experimento. Se preparan 15 mi de 2 ng/ml anticuerpo secundario de IgG anti-humana conjugado con Cy5, usando una dilución a 1 :1000 y anticuerpo de reserva (2 mg/ml) en PBS. En un tubo separado, se preparan 8 mi de solución de anticuerpo anti-EGFR a una concentración de 2 x ABC. Esta concentración es el doble de la concentración de funcionamiento, ya que se mezcla con 8 mi de solución de antígeno antes del experimento. En un tubo separado, se preparan 8 mi de solución de EGFR recombinante a una concentración de 2 x LO. Esta concentración también es el doble de la concentración de funcionamiento, dado que se mezcla con 8 mi de solución de anticuerpo antes del experimento. A continuación, las perlas revestidas con EGFR y la solución de anticuerpo secundario se colocan en el envase y la línea apropiados, respectivamente. La solución de anticuerpo y antígeno se mezcla completamente y se conecta inmediatamente a la línea apropiada, y se usa el software KinExA para medir la cantidad de anticuerpo libre como una función del tiempo en la solución resultante. Para determinar la constante de asociación kon (Kon), se usa el software KinExA para ajustar el agotamiento de la cantidad de anticuerpo libre como una función del tiempo para una ecuación de velocidad bimolecular reversible. La constante de disociación Koff (Koff) es igual a la Kon * KD (Kd).
Afinidad de Unión: Ensayo de Resonancia de Plasmones Superficiales El Ensayo de Resonancia de Plasmones Superficiales se realiza tal como sigue a continuación: cada anticuerpo o antígeno (300 RU) se inmoviliza en un chip de CM5 usando acoplamiento de amina. A continuación se inyectan diferentes concentraciones de anticuerpos o antígenos para estudiar su asociación y disociación con la proteína inmovilizada. Entre diferentes inyecciones, el chip se regenera usando tampón adecuado de regeneración (tal como glicina, pH 2,5). La fase de disociación se ajusta usando la Ecuación 1 para determinar KOff (velocidad de disociación): R= FVexp(- o/t) (1) La fase de asociación se ajusta usando este valor de KOff y la Ecuación 2 para determinar Kon (velocidad de asociación) y Kd (constante de equilibrio). ^2) en la que C representa la concentración de antígeno o de anticuerpo en solución, Rmáx representa la señal de saturación y í representa el tiempo.
Aqrupamiento de Epítopos: Ensayo de Resonancia de Plasmones Superficiales El agrupamiento de epítopos se realiza usando el ensayo resonancia de plasmones superficiales, tal como se ha descrito anteriormente. Uno de los anticuerpos se inmoviliza en la superficie del chip. A continuación se inyecta dominio extracelular de EGFR humano expresado de forma recombinante (EGFR-ECD). Aunque EGFR-ECD se asocia con el anticuerpo conjugado con la superficie del chip, la señal de resonancia aumenta. Se realizan inyecciones secuenciales de anticuerpos que pertenecen a los tres grupos 1 , 2 y 3. Si el anticuerpo se une a epítopos de superposición con el anticuerpo inyectado, entonces la señal no cambiará en comparación con la inyección previa. Si el anticuerpo se une a un epítopo de no superposición, la señal en el chip será más elevada que la de la inyección previa. El anticuerpo conjugado con el chip se inyecta finalmente como ligando libre para confirmar la falta de unión con epítopos de superposición.
Ensayo de Unión Celular Los ensayos de unión celular para determinar los valores de Kd se realizan como sigue a continuación: células A431 se separan con 3 mi de tripsina-EDTA a 37 °C durante 5 minutos. Se añade DMEM completo (10 mi) inmediatamente a las células tripsinizadas, se vuelve a suspender cuidadosamente y se centrifuga en una centrifugadora de mesa de Beckman a 1 100 rpm durante 5 minutos. Las células se vuelven a suspender en tampón de tinción (PBS + BSA al 0,2 % + azida sódica al 0,1 %) a una concentración de 2 x 106 células por mi y se siembran alícuotas de 50 ni (1 x 105 células) en una placa de titulación de 96 pocilios.
Una solución de reserva de 300 ni de anticuerpo anti-EGFR 2000 nM se prepara en tampón de tinción y 100 ni de éste se diluyen en serie en 200 ni de tampón de tinción. Las concentraciones del anticuerpo diluido varían de 2000 nM a 0,1 nM. A continuación se añaden alícuotas de 150 ni de las diferentes diluciones de proteína directamente a la suspensión celular de 50 ? I dando concentraciones finales de 1500 nM, 500 nM, 166,7 nM, 55,6 nM, 18,5 nM, 6,17 nM, 2,05 nM, 0,68 nM, 0,23 nM y 0,076 nM de anticuerpo.
Células en alícuotas en la placa de 96 pocilios se incuban con las diluciones de anticuerpo durante 2 h a temperatura ambiente con agitación y se lavan 3 veces con 300 ?? de tampón de tinción. Las células se incuban a continuación con 100 ni de una dilución a 1 :750 de IgG anti-humana de carga marcada con Alexa 647 en tampón de tinción BD durante 45 minutos con agitación a 4 °C. Finalmente, las células se lavan dos veces, se microgranulan y se vuelven a suspender en 250 ni de tampón de tinción + 0,5 ng/ml de yoduro de propidio. El análisis de 10.000 células se realiza en un citómetro de flujo FACSCALIBUR usando el canal FL4. Los valores de MFI y las concentraciones correspondientes de los anticuerpos anti-EGFR se representan en el eje y y en el eje x, respectivamente. La Kd de la molécula se determina usando el software GRAPHPAD PRISM que usa el modelo de unión de un sitio para una curva de regresión no lineal.
El valor de KD se calcula en base a la fórmula Y=Bmáx*X/KD+X (Bmáx = fluorescencia en la saturación. X = concentración de anticuerpo. Y = grado de unión).
Medida de niveles de EGFR a través de inmunotransferencia Para preparar lisados celulares, células H1975 se tripsinizan, cosechan, recuentan, y siembran en discos de 6 pocilios a 1 x 106 células por pocilio y se incuba durante una noche para permitir la unión a la placa de cultivo. Las células se tratan previamente con una concentración I ?? de P1 X + P2X + P3X (P1 X + P2X + P3X o P1X, P2X, y P3X indica una combinación con una relación molar de 2:2:1 de P1X, P2X, y P3X) durante 1 , 2, 5, y 24 horas antes de la estimulación con rhEGF (Peprotech, N° de cat. 100-15) durante 10 minutos. Las células se lisan con I00 ni de Reactivos de Extracción de Proteínas de Mamífero (Pierce, N° de cat. 78505). El reactivo de extracción de proteínas se complementa con PhosSTOP (Roche, N° de cat. 04906837001 ) y comprimidos de Cóctel Inhibidor de Proteasa (Roche, N° de cat. 04693124001 ). Los extractos de células H1975 se desnaturalizan por ebullición durante 5 minutos en tampón de muestra, sometido a condiciones de reducción, y se realiza electroforesis usando genes de poliacrilamida al 4-12 % para SDS-PAGE durante 50 minutos a 200 V. Después de la transferencia de proteínas a una membrana de nitrocelulosa, los sitios no específicos se bloquean por incubación con tampón de bloqueo Odyssey (LI-COR, N° de cat. 927-400-00) durante una hora a temperatura ambiente. Las membranas se incuban tal como sea necesario con anti-EGFR monoclonal de ratón (1 F4 - tEGFR de marcado; Señalización Celular, N° de cat. 2239); anti-fosfo44/42 MAPK monoclonal de conejo (Erk1/2, Thr202/Tyr204, D13.1 .4E - pERK de marcado; Señalización Celular, N° de cat. 4370); anti-fosfoAKT monoclonal de conejo (Ser473, 193H12; Señalización Celular, N° de cat. 4058); fosfo-c-Jun monoclonal de conejo (Ser73, D47G9 - p-c-Jun de marcado; Señalización Celular, IT de cat. 3270) y anti-PCNA de conejo (FL-261 ) (Santa Cruz Biotechnology, N° de cat. sc-7907). Después de incubación durante una noche con los anticuerpos primarios, se incubaron inmunotransferencias con el anticuerpo secundario marcado con IRDye apropiado (anti-ratón cabra IR800CW (Odyssey, N° de cat. 926-32 0) o anti-conejo cabra IR800CW (Odyssey, N° de cat.926-321 1 )) durante 10 minutos y se hizo vacío a través de la membrana usando d.i. de SNAP, Sistema de Detección de Proteínas (Millipore). Se detectan bandas usando el Sistema de Formación de Imágenes por Infrarrojos LI-COR de Odyssey y se analizan usando el software de Odyssey.
Inhibición de la Proliferación Celular Tumoral In Vitro La inhibición de la proliferación celular de células que expresan EGFR se examina in vitro tal como sigue a continuación: células cancerosas HCC827 y H1975 se siembran en placas de cultivo tisular de 96 pocilios a 5.000 células por pocilio y se cultiva en medio RPMI-1640 complementado con antibióticos, L-glutamina 2 mM suero bovino fetal al 10 % (FCS) durante 24 horas a 37 °C y dióxido de carbono al 5 %. El medio se intercambia continuación por RPMI-1640 (con antibióticos, L-glutamina 2 mM, FBS al 1%) complementado con 50 ng/ml de EGF o 200 ng/ml de AREG (anfiregulina; R&D Systems) en presencia de concentraciones variables de P1X + P2X + P3X o cetuximab (Bristol-Myers Squibb). La viabilidad celular se mide usando el Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CelITiter-Glo® (CTG) (Promega Corporation, N° de cat. G7572) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo CTG mide el número de células viables en el cultivo en base a la cuantificación del ATP presente, que es un indicador de células metabólicamente activas. Los tratamientos de control incluyen células tratadas con RPMI-1640 con antibióticos, L-glutamina 2 mM, FCS al 1% en presencia (mencionado como "+EGF" o "+AREG") o en ausencia (mencionado como "-EGF" o "-AREG") de 50 ng/ml de EGF o de 200 ng/ml de AREG.
Estudios de Xenoinierto de Ratón DU145 v H1975 Una combinación de ratones Nu/nu P1 X, P2X, y P3X (Charles River Labs) se inyectan por vía subcutánea con células. Se permite que los tumores resultantes crezcan hasta que alcanzan un tamaño medio de 300 mm3. A continuación se inicia la dosificación con las concentraciones indicadas de combinaciones de P1 X con P2X, y P3X, cetuximab o volumen proporcional de PBS como vehículo de control. Las medidas se toman a intervalos de 4 días y los volúmenes tumorales se calculan usando la fórmula Volumen = TT/6X(WXL2).
Las dosis de cetuximab y P1 X + P2X + P3X se normalizan para proporcionar exposiciones uniformes al suero.
La eficacia de una combinación de P1 X con P2X, y P3X ¡n vivo se evalúa en un modelo de ratón murino de xenoinjerto de células de cáncer de próstata DU145. Se inyectan 8 x I06 células DU145 por vía subcutánea en el costado de ratones nu/nu. Una vez que los tumores alcanzan un tamaño medio de 300 mm3, se inicia el tratamiento. Se tratan grupos de 10 ratones con vehículo de control (PBS); 2,075 mg/kg de cetuximab, P1 X con P2X, y P3X a concentraciones del componente estaban en una "relación de murino" diseñada para proporcionar una Cmáx de 2:2:1 para P1 X, para P2X y para P3X, respectivamente, en el ratón, tal como sigue a continuación: P1 X = 2,53 mg/kg, P2X = 7,26 mg/kg y P3X = 0,66 mg/kg. Los ratones en el grupo de cetuximab se dosifican cada cuatro días. Los ratones en el grupo P1 X + P2X + P3X se dosifican cada dos días. Estas dosis y los intervalos de dosificación se eligen para dar una exposición equivalente al suero de cetuximab y el trío de anticuerpo de relación de murino.
Ensayo de Unión Celular de Antagonismo de Liqandos Se realizan ensayos de unión celular para determinar la unión de ligando de EGF en presencia de anticuerpos individuales o múltiples tal como sigue a continuación: células A431 se separan con 5 mi de tripsina-EDTA a 37 °C durante 5 minutos. Se añade DMEM completo (10 mi) inmediatamente a las células tripsinizadas, se vuelve a suspender cuidadosamente y se centrifuga en una centrifugadora de mesa de Beckman a 1200 rpm durante 7 minutos. Las células se vuelven a suspender en tampón de tinción (PBS + FBS al 2 % + azida sódica al 0,1 %) a una concentración de 3 x 105 células por mi y alícuotas de 100 ni (3 x 104 células) se siembran en una placa de titulación de 96 pocilios.
Una solución de reserva de 2x de 5 mi de anticuerpo anti-EGFR se prepara en tampón de tinción a las concentraciones indicadas en cada ejemplo. Una solución de reserva de 3x de 10 mi de ligando EGF humano recombinante conjugado con una marca de biotina (biotina-EGF) se prepara en tampón de tinción y 100 ?? de ésta se diluyen en serie en 200 ni de tampón de tinción. Las concentraciones del biotina-EGF diluido varían de 600 nM a 9 pM. Alícuotas de 100 ni del anticuerpo anti-EGFR se añaden a continuación directamente a la suspensión celular de 100 ni proporcionando una concentración final tal como se indica en cada ejemplo. Alícuotas de células en la placa de 96 pocilios se incuban con las diluciones de anticuerpo durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación se añaden alícuotas de 100 ni de biotina-EGF directamente a la suspensión celular de 100 ni proporcionan una concentración final de 200 nM, 66,67 nM, 22,22 nM, 7,41 nM, 2,47 nM, 0,82 nM, 0,27 nM, 0,09 nM, 0,03 nM, 0,01 nM, y 0,003 nM de biotina-EGF. Alícuotas de células en la placa de 96 pocilios se incuban con las diluciones de anticuerpo y biotina-EGF durante 10 min a temperatura ambiente, se lavan 1 vez con 100 ni de tampón de tinción, y a continuación se centrifugan en una centrifugadora de mesa de Beckman a 1200 rpm durante 7 minutos. Las células se vuelven a suspender en 100 ni de una dilución a 1 :500 de conjugado de Estreptavidina con Alexa Fluor® 647 (Invitrogen Life Technologies) en tampón de tinción durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, las células se lavan dos veces con 100 ni de tampón de tinción, se microgranulan y se vuelven a suspender en 80 ni de tampón de fijación (PBS + FBS al 2 % + paraformaldehído al 2 %) y se transfieren a Placas de Ensayo con fondo en U de 96 pocilios (Becton Dickinson) se cierran herméticamente con papel de aluminio se almacenan a 4 °C.
El análisis de 10.000 células se realiza en un citómetro de flujo FACSCALIBUR usando el canal FL4. Los datos se analizan usando el software Winüst 6.0. Los valores de Intensidad de Fluorescencia Media (MFI) y las concentraciones correspondientes de ligando de biotina-EGF se representan en el eje y y en el eje x, respectivamente.
Ejemplo : Localización/ Aqrupamiento de Epítopos Se generaron anticuerpos P1 X, P2X, y P3X a través de maduración por afinidad de anticuerpos precursores. Los anticuerpos precursores respectivos ca, cd, y ch se divulgan en la solicitud de patente relacionada con N° de Serie PCT/US201 1/3528. Los experimentos de localización y agrupamiento de epítopos se realizaron para demostrar que P1 X, P2X, y P3X comparten los mismos epítopos de no superposición al igual que sus respectivas moléculas precursoras.
Los grupos se diseñan de modo que los anticuerpos seleccionados incluirían tres epítopos de no superposición, distintos, en el dominio extracelular (ECD) de EGFR. Éstos se agrupan en tres grupos: Bin1 se localiza en el Dominio III de EGFR y representa al epítopo c225 (el sitio de unión de cetuximab); Bin2 se localiza en el Dominio I y representa el epítopo ICR10 (Abcam Ab231 ) (Cochran er a/. (2004) Journal of Immunological Methods, 287: 147-158); y Bin3 se localiza en el Dominio III y representa el epítopo clon H1 1 (Spangler J. er a/. PNAS. 107: 13252-13257, 2010). Los mutantes Bin1 (B1 -7MT-Ala) y Bin3 (B3-4MT) se generaron para la localización de epítopos en las posiciones de los aminoácidos que se muestran a continuación en negrita en el dominio extracelular de EGFR.
EGFR ECD ( SEC ID N°: 33) MKPSGTAGAA LLALLAAÍ.CP A$RALEEKKV COGTSN LT LGTFEDHFLS LQRMFNHCEV VI.GflLE J7YV QRNY LSFLK TXQEVAGYYL TALMTVERIP LENLQIIRGH MYYENSYALA VLSflYPANíT GLKELPKRNL QEILHGAVRF SMNPALC E SI WRDIVSS DFÍÍSNMSMDF Q HLGSCQ C DP3CPNG3CW GAGEENCQKL TKITCAQQCS GRCRG SPSD CCHNQCAAGC TüPRESDCLV CRKFRDEATC TCPPLMLY NPTTYQHDVM PEGKYSFGAT CV CPRNYV VTDHG5CVRA CGADoYEMEE DGVRKCK CE GPCRKVC GI GIGEFKDSLS IMATNIKHFK NCT ISGDLH ILPVAFRGDS PTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGFLLIQAVí PENRTDLHAF ENLBIIRGRT KQHGQFSLAV VSt-HITSLGL RSLKEISDGD VIISGIKNLC YAÍITINKKKL FGISGQKTKI I3NRGEN5C ATGQVCHALC SPEGCWGPEP RDCVSCRMVS RGRE \"DKCH LLEGEPREFV ENSECIQCHP ECLPQAtíKIT CTGRGPDNCI QCAHYIDGPH CVKTCPAGVM GF.MNTLVWKY A AGHVCHLC HPMCTYGCTG PGLEGCPTWG PKIPSHHHHH H Los siguientes mutantes de sustitución se prepararon en las posiciones del aminoácido en negrita usando tecnología convencional de ADN recombinante para crear los mutantes de los epítopos Bin1 (B1 ) y Bin3 (B3) con los siguientes restos de mutantes: Mutantes Restos Mutantes de Binl (Bl) Bl-7MT-Ala: Q408A, Q432M, H433E, 467A, K489A, I491A, N497A Restos Mutantes de Bin3 (B3) B3-4MT: S380A, F381G, T382A, H383G Se realizó un ensayo directo de ELISA usando EGFR-ECD de tipo silvestre (TS), un mutante de epítopo de Bin1 (epítopo c225), o un mutante de epítopo de Bin3 (epítopo H1 1 ) como reactivos de captura. Concentraciones variables (1 , 0,25, 0,06, y 0,02 ng/ mi) de anticuerpos monoclonales (mAbs) P1X (Bin1 ), P2X (Bin2), y P3X (Bin3) se incubaron con los reactivos de captura a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido de detección con anticuerpo policlonal Fe anti-humano conjugado con HRP durante 1 hora. Tal como se muestra en la Figura 1 A, todos los tres anticuerpos están unidos al dominio extracelular de EGFR de TS, mientras que el P1X del anticuerpo Bin1 no se unió al epítopo mutante de Bin1 , y el anticuerpo P3X no se unió al epítopo mutante de Bin3.
Se realizó un experimento de resonancia de plasmones superficiales para demostrar que P2X se asocia con el epítopo ICR10 en el Dominio I del dominio extracelular de EGFR (Figura IB). ICR10 se conjugó con la superficie de un chip de BIACORE. Se inyectó EGFR-ECD 0,5 ?? seguido de inyecciones secuenciales de 0,5 ?? de anticuerpos P1 X (???1 ), P2X (Bin2), y P3X (Bin3). Mientras que se observa que P1 X y P3X se asocian simultáneamente con EGFR-ECD unido a ICR10, se muestra que P2X no se asocia.
Para demostrar que los epítopos para P1 X, P2X, y P3X son distintos y de no superposición, se realizó una serie de tres experimentos de agolpamiento por resonancia de plasmones superficiales. P1 X (Figura 2A), P2X (Figura 2B), o P3X (Figura 2C) se conjugaron con la superficie de un chip de BIACORE. Se inyectó EGFR-ECD 0,5 ? seguido de inyecciones secuenciales de 0,5 i iM de anticuerpos P3X, P2X, y P1 X. De la inyección de este anticuerpo como conjugado con el chip de BIACORE sirve como un control negativo. En todos los tres experimentos, se observa que los dos anticuerpos de los grupos restantes se asocian con EGFR-ECD. Por lo tanto, los resultados de los tres experimentos demuestran que P1 X, P2X, y P3X tienen epítopos distintos, de no superposición, y se pueden asociar simultáneamente con EGFR-ECD.
Ejemplo 2: Afinidades de unión Las afinidades monovalentes de P1X, P2X, y P3X hacia EGFR se midieron por KinExA. Los datos se muestran a continuación en la Tabla 1. Las afinidades de P1 X, P2X, y P3X son todas superiores a 0,4 nM y todas están mejoradas con respecto a las moléculas precursoras. La afinidad de P1 X (1 1 pM) es 13,18 veces superior a la de la molécula precursora ca de Bin 1 (145 pM). La afinidad de P2X (70 pM) es 7,71 veces superior a la de la molécula precursora cd de Bin 2 (540 pM). La afinidad de P3X (360 pM) es 2,10 veces superior a la de la molécula precursora ch de Bin 3 (757 pM).
Tablal Ejemplo 3: Ensayos de unión celular con anticuerpos individuales Un ensayo de unión celular se realizó para demostrar que los anticuerpos monoclonales P1 X, P2X, y P3X se pueden asociar con EGFR sobre células A431 (Figura 3). Las células A431 se incubaron con una serie de dilución de anticuerpo individual durante 2 h y la cantidad de anticuerpo unido se midió por citometría de flujo cuantitativa, tal como se ha descrito en la sección de metodología que se ha mencionado anteriormente. Las concentraciones usadas en las series de dilución para los anticuerpos se muestran a continuación en la Tabla 2. El experto habitual en la materia entenderá que cada valor de concentración específica en la Tabla 2 está sujeto a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0,1 nM representa un valor de aproximadamente 0,1 nM).
Tabla 2 Las afinidades de unión sobre las células en estas condiciones experimentales se calcularon, mediante regresión a una ecuación logística de 4 parámetros usando el software GraphPad Prism®, para ser 168 pM (P1 X), 340 pM (P2X) y 748 p (P3X).
Ejemplo 4: Inhibición de la señalización del receptor fosfo-EGF mediante anticuerpos individuales Células A431 se trataron con anticuerpos individuales y su capacidad para inhibir la actividad de fosfo-EGFR dependiente de EGF se midió mediante ELISA de fosfo-EGFR. P1 X y P2X inhiben de forma potente la actividad de fosfo-EGFR de una manera dependiente de la dosis, con valores respectivos de CI50 de 3,09 n y 4,19 nM, mientras que el tratamiento con P3X provoca la inhibición parcial de fosfo-EGFR (Figura 4). Las concentraciones usadas en las series de dilución para los anticuerpos se muestran a continuación en la Tabla 3. El experto habitual en la materia entenderá que cada valor de concentración específica en la Tabla 3 está sujeto a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0,1 n representa un valor de aproximadamente 0,1 nM).
Tabla 3 Ejemplo 5: Inhibición de la señalización de fosfo-ERK mediante combinaciones individuales v por pares de anticuerpos v comparación de anticuerpos precursores Células A431 se trataron con una serie de dilución de un solo P1 X o anticuerpo ca y la inhibición de fosfo-ERK se midió con ELISA de fosfo-ERK (Figura 5A). P1 X provocó la inhibición dependiente de la dosis de la actividad de fosfo-ERK mientras que el anticuerpo precursor ca provocó solamente la inhibición parcial.
Células A431 se trataron con una serie de dilución de combinaciones por pares de P1 X+P3X o sus respectivos anticuerpos precursores ca + ch y la inhibición de fosfo-ERK se midió por ELISA de fosfo-ERK (Figura 5B). Ambas combinaciones inhiben la generación de fosfo-ERK de una manera dependiente de la dosis, pero la combinación de P1 X + P3X proporciona mayor inhibición. La combinación de P1 X + P3X evocó una inhibición de un 82 % de la actividad de fosfo-ERK mientras que la combinación precursora provocó solamente un 71 %, tal como se calcula mediante un ajuste a una ecuación logística de 4 parámetros usando el software GraphPad Prism.
Células A431 se trataron con una serie de dilución de combinaciones por pares de P1 X + P2X o sus respectivos anticuerpos precursores ca+cd y la inhibición de fosfo-ERK se midió por ELISA de fosfo-ERK (Figura 5C). Ambas combinaciones inhiben la generación de fosfo-ERK de una manera dependiente de la dosis, pero la combinación de P1X + P2X se muestra una mejora observable en el valor de la CI90 frente a la combinación precursora.
Las concentraciones usadas en las series de dilución para los anticuerpos se muestran a continuación en la Tabla 4 (para los datos en la Figura 5A) y en la Tabla 5 (para los datos en las Figuras 5B y 5C). El experto habitual en la materia entenderá que cada valor de concentración específica en las Tablas 4 y 5 está sujeto a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0,1 nM representa un valor de aproximadamente 0,1 nM).
Tabla 4 Se indica que las concentraciones que se muestran en la Tabla 5 son concentraciones totales para los pares de anticuerpos usados. La relación usada es de 1 :1 de modo que cada anticuerpo individual en el par comprende la mitad de la concentración total.
Ejemplo 6: Inhibición de la señalización de fosfo-ERK mediante relaciones diferentes de combinación de P1X, P2X, v P3X Células A431 se trataron con una serie de dilución de P1 X y la inhibición de fosfo-ERK se midió por ELISA (Figura 6A). Las concentraciones usadas en las series de dilución para los anticuerpos se muestran a continuación en la Tabla 6. El experto habitual en la materia entenderá que cada valor de concentración específica en la Tabla 6 está sujeto a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0,1 nM representa un valor de aproximadamente 0,1 nM).
Tabla 6 El experimento se realizó tal como se describe en la sección de metodología. En estas condiciones experimentales, P1 X inhibe un 81 % de la actividad de fosfo-ERK a dosis de saturación con un valor de CI50 de aproximadamente 25 nM (27 nM). Por lo tanto, la localización aproximada en la representación de la CI50 se indica en la Figura 6A como "25 nM" y 25 nM se fijó como la concentración constante de P1 X en siguientes experimentos.
Células A431 se trataron con series de dilución de 5 relaciones de combinación de P3X + P2X en combinación con una concentración constante de P1 X de 25 nM y la inhibición de fosfo-ERK se midió por ELISA (Figura 6B). Las concentraciones usadas en las series de dilución para los anticuerpos se muestran a continuación en la Tabla 7. El experto habitual en la materia entenderá que cada valor de concentración específica en la Tabla 7 está sujeto a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0,1 nM representa un valor de aproximadamente 0,1 nM).
Tabla 7 Se indica que las concentraciones que se muestran en la Tabla 7 son concentraciones totales para P2X + P3X. A concentración individual de P2X y P3X es dependiente de la relación indicada. El experimento se realizó tal como se describe en la sección de metodología. Las relaciones de P3X:P2X usadas fueron 1 :0, 0:1 , 1 :2, 2:1 , y 1 :1.
Todas las relaciones inhibieron más de un 70 % de la actividad de fosfo-ERK, con todas las combinaciones conteniendo todos los tres anticuerpos que proporcionan el mayor grado de inhibición.
Células A431 se trataron con series de dilución de 6 relaciones de combinación de P1 X:P2X:P3X y la inhibición de fosfo-ERK se midió por ELISA (Figura 6C). Las concentraciones usadas en las series de dilución para los anticuerpos se muestran a continuación en la Tabla 8. El experto habitual en la materia entenderá que cada valor de concentración específica en la Tabla 8 está sujeto a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0,1 nM representa un valor de aproximadamente 0,1 nM).
Tabla 8 El experimento se realizó tal como se describe en la sección de metodología. Las relaciones o P1X:P2X:P3X usados fueron 1 :0,01 :1 , 1:0,1:1, 1:1:1, 2:0,01:1, 2:0,1:1 , y 2:2:1. Todas las relaciones inhibieran más de un 70 % de la actividad de fosfo-ERK.
Células A431 se trataron con series de dilución de 5 relaciones de combinación de P1 X:P2X y la inhibición de fosfo-ERK se midió por ELISA (Figura 6D). Las concentraciones usadas en las series de dilución para los anticuerpos se muestran a continuación en la Tabla 9. El experto habitual en la materia entenderá que cada valor de concentración específica en la Tabla 9 está sujeto a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0,1 nM representa un valor de aproximadamente 0,1 nM).
Tabla 9 Se indica que las concentraciones que se muestran en la Tabla 9 son concentraciones totales para P1 X + P2X. una concentración individual de P1 X y P2X es dependiente de la relación indicada. El experimento se realizó tal como se describe en la sección de metodología. Las relaciones de P1X:P2X usados fueron 1 :2, 5:1 , 9:1 , 50:1 , y 1 :5. Todas las relaciones excepto 1 :5 (P1 X:P2X) inhibieron más de un 70 % de la actividad de fosfo-ERK dentro del intervalo de concentraciones usadas en el experimento. Sin embargo, ajustando una curva de inhibición logística de 4 parámetros a los datos de la relación 1 :5 (P1 X:P2X) predice que esta combinación conseguirá un 70 % de inhibición de fosfo-ERK a una concentración de 35,7 nM, ligeramente mayor que la dosis usada en el experimento y bien dentro del intervalo que se puede conseguir en condiciones fisiológicas.
Ejemplo 7: Inhibición de la señalización de Fosfo-EGFR v Fosfo-ERK mediante una combinación de relación 2:2:1 ratio de P1X, P2X, and P3X Células A431 se trataron con una serie de dilución de una combinación con relación molar 2:2: 1 anticuerpos P1 X, P2X, y P3X (esta combinación a esta relación molar se menciona en el presente documento como "P1 X + P2X + P3X") y la inhibición de fosfo-EGFR y de fosfo-ERK se midió por ELISA (Figura 7A). Las concentraciones usadas en las series de dilución para los anticuerpos se muestran a continuación en la Tabla 10, El experto habitual en la materia entenderá que cada valor de concentración específica en la Tabla 10 está sujeto a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0, 1 nM representa un valor de aproximadamente 0, 1 nM).
Tabla 10 Se indica que las concentraciones que se muestran en la Tabla 10 son concentraciones totales para P1 X + P2X + P3X. La relación usada es de 2:2:1 , de modo que las concentraciones individuales de P1X, P2X y P3X son de un 40 %, un 40 % y un 20 %, respectivamente. Se realizaron experimentos se realizaron tal como se describe en la sección de metodología. La combinación de tres anticuerpos es un inhibidor potente de las actividades tanto de fosfo-EGFR como de fosfo-ERK, con valores respectivos de CI50 de 2,30 nM y 9,87 nM.
P1 X + P2X+ P3X se comparó con un P1 X individual (Figura 7B) y con un P2X individual (Figura 7C). Las células A431 se trataron con una serie de dilución de anticuerpo y la inhibición de fosfo-ERK se midió por ELISA. Las concentraciones usadas en las series de dilución para los anticuerpos para los experimentos que se muestran en las Figuras 7B y 7C se muestran a continuación en la Tabla 1 1. El experto habitual en la materia entenderá que cada valor de concentración específica en la Tabla 1 1 está sujeto a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0,1 nM representa un valor de aproximadamente 0,1 nM).
Tabla 11 Se indica que las concentraciones que se muestran en la Tabla 1 1 son concentraciones totales para P1 X + P2X + P3X. La relación usada es de 2:2:1 , de modo que las concentraciones individuales de P1 X, P2X y P3X son de un 40 %, un 40 % y un 20 %, respectivamente. Los experimentos se realizaron tal como se describe en la sección de metodología con la excepción de que se usó 80 nM de ligando EGF para estimular las células. La combinación de anticuerpos de relación 2:2:1 es un potente inhibidor de la actividad de fosfo-ERK en comparación con P1 X y P2X, que proporcionan parcial y ninguna inhibición respectivamente.
Ejemplo 8: Regulación negativa del receptor EGF e inhibición de pERK. señalización de pAKT y p-c-Jun en células H1975 después del tratamiento con P1X + P2X + P3X Las células se incubaron previamente durante 2 horas con anticuerpo total 1 ?? equivalente a P1 X + P2X + P3X antes de la estimulación con 50 ng/ml de rhEGF (PeproTech) durante 10 minutos, tal como se ha descrito en la sección de metodología que se ha mencionado anteriormente. Las inmunotransferencias de lisados celulares se examinaron por separado con anticuerpos frente a tEGFR, pERK, pAKT o p-c-Jun y la densitometría de las bandas se normalizó al PCNA de control de carga y a lisados de células sin tratar de control. La regulación negativa del receptor de EGF en respuesta al tratamiento de P1 X + P2X + P3X se muestra en la Figura 8A y la inhibición de la señalización de pERK, pAKT y p-c-Jun en respuesta al tratamiento de P1 X + P2X + P3X se muestra en la Figura 8B.
Ejemplo 9: Inhibición de la proliferación celular tumoral in vitro Se analizó la inhibición de la proliferación celular tumoral in vitro mediante los métodos que se han descrito anteriormente o variaciones menores de éstos. Las líneas de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) HCC827 y H1975 se sembraron a 5000 células/pocilio y se trataron con combinaciones de anticuerpo que variarán de 0,1 -1 ? (concentración final). Las Figuras 9A-9D muestran la inhibición de la proliferación celular usando el Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CelITiter-Glo® (CTG) (Promega Corporation) que mide el número de células viables en cultivo en base a la cuantificación del ATP presente, que es un indicador de células metabólicamente activas. Las Figuras 9A y 9B muestran una inhibición potente del crecimiento de células HCC827 y H1975 sobre un intervalo de concentraciones de P1 X + P2X + P3X, pero no mediante el tratamiento con cetuximab o medio de ensayo solo (FCS al 1 %) en presencia de ligando de EGF. Las Figuras 9C y 9D muestran una inhibición potente del crecimiento de células HCC827 y H1975 sobre un intervalo de concentraciones tanto para P1 X + P2X + P3X como para cetuximab, pero no mediante medio de ensayo solo (FCS al 1 %) en presencia de ligando de AREG. Estos resultados muestran la capacidad de P1 X + P2X + P3X para inhibir la proliferación celular tumoral in vitro como respuesta a ligandos tanto de alta afinidad (EGF) como de baja afinidad (AREG), a la vez que cetuximab solamente es eficaz en células tratadas con ligando de baja afinidad (AREG). Las concentraciones usadas en las series de dilución para los anticuerpos para los experimentos que se muestran en las Figuras 9A-D se muestran a continuación en la Tabla 12. El experto habitual en la materia entenderá que cada valor de concentración específica en la Tabla 12 está sujeto a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0,1 nM representa un valor de aproximadamente 0,1 nM).
Tabla 12 Se indica que las concentraciones que se muestran en la Tabla 12 son concentraciones totales para P1 X + P2X + P3X. La relación usada es de 2:2: , de modo que las concentraciones individuales de P1 X, P2X y P3X sori de un 40 %, un 40 % y un 20 %, respectivamente.
Ejemplo 10: Inhibición de la proliferación celular tumoral in vivo la eficacia de P1 X + P2X + P3X in vivo se evaluó en un modelo de ratón murino de xenoinjerto de células H1975 de cáncer de pulmón. Se inyectaron 2 x I06 células NCI-H1975 por vía subcutánea en el costado de ratones nu/nu. Una vez que los tumores hubieron alcanzado un tamaño medio de 300 mm3, el tratamiento comenzó. Grupos de 10 ratones se trataron con vehículo de control (PBS); o el trío de anticuerpos de relación de murino en las siguientes concentraciones de los componentes: trío de anticuerpos de relación de murino-P1 X Bajo = 2,53 mg/kg, P2X = 7,26 mg/kg y P3X = 0,66 mg/kg o trío de anticuerpos de relación de murino-P1X Medio = 5,06 mg/kg, P2X = 14,52 mg/kg y P3X = 1 ,33 mg/kg. Los ratones se trataron cada dos días.
Los resultados que se muestran en la Figura 10A (modelo de xenoinjerto de DU145) y la Figura 10B (modelo de xenoinjerto de H1975) demuestran la capacidad de P1 X + P2X + P3X para inhibir la proliferación celular tumoral ¡n vivo.
Ejemplo 11 : Ensayos de unión celular de antagonismo de liqandos con anticuerpos individuales Un ensayo de unión celular se realizó para demostrar que los anticuerpos monoclonales P1 X, P2X, y P3X pueden antagonizar la interacción del ligando de EGF y del receptor de EGF en células A431 . Las células A431 se incubaron con una dosis de anticuerpo individual durante 1 h seguido de una serie de dilución de ligando de biotina-EGF y la cantidad de ligando de biotina-EGF unido se midió por citometría de flujo cuantitativa, tal como se ha descrito en la sección de métodos que se ha mencionado anteriormente. Las concentraciones para los anticuerpos se muestran a continuación en la Tabla 13 y representan una concentración de sub-saturación (concentración de EC90 aprox.) de unión celular tal como se determina a partir del análisis demostrado en el Ejemplo 3. Las concentraciones usadas en las series de dilución para el ligando de biotina-EGF se muestran a continuación en la Tabla 14. Los valores en la Tabla 13 y en la Tabla 14 están sujetos a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0,1 nM representa un valor de aproximadamente 0, 1 nM).
Tabla 13 Tabla 14 Los resultados se muestran en la Figura 1 , que demuestra que cada uno de los anticuerpos individuales (P1 X, P2X y P3X) solos son capaces de antagonizar la interacción del ligando de EGF y del receptor de EGF o en células A431 , con P1 X y P2X presentando actividad inhibidora más potente que P3X.
Ejemplo 12: Ensayos de unión celular de antagonismo de liqandos con anticuerpos individuales y combinaciones de anticuerpos o Fabs Un ensayo de unión celular se realizó para determinar el grado en el que anticuerpos individuales y combinaciones de anticuerpos múltiples de anticuerpos monoclonales P1 X, P2X, y P3X y combinaciones individuales y múltiples de fragmentos de Fab monovalente P1 X Fab, P2X Fab, y P3X Fab puede antagonizar la interacción de ligando de EGF y del receptor de EGF en células A431. Las células A431 se incubaron con una dosis de anticuerpo o Fab durante 1 h seguido de una serie de dilución de ligando de biotina-EGF y la cantidad de ligando de biotina-EGF unido se midió por citometría de flujo cuantitativa, tal como se ha descrito en la sección de metodología que se ha mencionado anteriormente. La concentración de anticuerpos y Fab fue I0 nM. Las combinaciones de tres anticuerpos (P1 X + P2X + P3X) y tres anticuerpos (P1X Fab + P2X Fab + P3X Fab) se formularon en una relación de 2:2:1 y picaron a una concentración total de 10 nM. Las concentraciones usadas en las series de dilución para el ligando de biotina-EGF se han mostrado anteriormente en la Tabla 14. El experto habitual en la materia entenderá que cada valor de concentración específica en la Tabla 14 está sujeto a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0,1 nM representa un valor de aproximadamente 0,1 nM).
Los resultados se muestran en la Figura 12A (anticuerpos monoclonales virtuales y combinaciones de anticuerpos monoclonales P1 X, P2X, y P3X) y la Figura 12B (fragmentos Fab monovalente individual y combinaciones de fragmentos Fab monovalente P1 X Fab, P2X Fab, y P3X Fab). Los resultados en la Figura 12A demuestran de nuevo que todos los tres anticuerpos solos fueran capaces de antagonizar la interacción del ligando de EGF y del receptor de EGF en células A431 , con P1X y P2X presentando una actividad inhibidora más potente que P3X, y la combinación triple de P1 X + P2X + P3X también presentó una actividad inhibidora potente. Los resultados en la Figura 12B demuestran que P1 X Fab mostró la mayor actividad inhibidora solo, con P3X Fab solo mostrando actividad inhibidora intermedia solo y P2X Fab mostrando solamente actividad inhibidora mínima solo. La combinación triple de P1 X Fab + P2X Fab + P3X Fab también mostró fuerte actividad inhibidora, aunque menos potente que la de P1 X Fab solo.
Ejemplo 13: Inhibición de la señalización de Fosfo-EGFR v Fosfo-ERK mediante una combinación de relación molar 2:2:1 de anticuerpos P1X, P2X. v P3X o Fabs Células A431 se trataron con una serie de dilución de una combinación de anticuerpos P1 X, P2X, y P3X ("P1 X + P2X + P3X") o los Fabs P1 X Fab, P2X Fab, P3X Fab con una relación molar de 2:2:1 (esta combinación a esta relación molar se menciona en el presente documento como "P1 X Fab+ P2X Fab + P3X Fab") y fosfo-EGFR y la inhibición de fosfo-ERK se midió por ELISA. Se realizaron experimentos con rhEGF (PeproTech) dosificados a una concentración de 50 ng/ml o 500 ng/ml. Las concentraciones usadas en las series de dilución para los anticuerpos y Fabs se muestran a continuación en la Tabla 15. El experto habitual en la materia entenderá que cada valor de concentración específica en la Tabla 15 está sujeto a alguna variabilidad experimental menor, de modo que cada concentración específica dada indica un valor de aproximadamente la concentración indicada (por ejemplo, una concentración indicada en una tabla como 0,1 nM representa un valor de aproximadamente 0,1 nM).
Tabla 15 Los resultados se muestran en la Figuras 13A-D, en las que Figuras 13A y 13B muestran los resultados del ensayo de inhibición de fosfo-EGFR y las Figuras 13C y 13D muestran los resultados del ensayo de inhibición de fosfor-ERK, con las Figuras 13A y 13C mostrando los resultados a dosis bajas (50 ng/ml o 8 nM) y con las Figuras 13B y 13D mostrando los resultados a dosis elevadas (500 ng/ml o 80 nM).
Con respecto a la inhibición de fosfo-EGFR, los resultados en las Figuras 13A y 13B demuestran que ambas combinaciones triples, mAbs de P1 X + P2X + P3X y fragmentos de P X Fab + P2X Fab + P3X Fab, presentaron fuerte inhibición tanto en la dosis baja como en la dosis alta sometidas a ensayo.
Con respecto a la inhibición de fosfo-ERK, los resultados en las Figuras 13C y 13D demuestran que ambas combinaciones triples, mAbs de P1 X + P2X + P3X y fragmentos de P1 X Fab + P2X Fab + P3X Fab, presentaron inhibición tanto en la dosis baja como en la dosis alta sometidas a ensayo, con la combinación de mAb de P1X + P2X + P3X presentan de inhibición más potente que la combinación del fragmento de P1 X Fab+P2X Fab+P3X Fab.
Ejemplo 14: Regulación negativa del receptor de EGF en células DU-145 después del tratamiento con P1X + P2X + P3X. P1X Fab + P2X Fab + P3X Fab. o cetuximab Las células se incubaron previamente durante 2, 6, o 24 horas con P1 X + P2X + P3X, P1 X Fab + P2X Fab + P3X Fab, o cetuximab equivalente a 50 nM, 100 nM, y 50 nM, respectivamente. La combinación de Fab se dosifica a dos veces la concentración como P1 X + P2X + P3X y cetuximab para dar cuenta de un solo resto de unión en una molécula de Fab frente a dos restos de unión de molécula de IgG. Las inmunotransferencias de lisados celulares se examinaron con anticuerpos frente a EGFR de transmembrana (tEGFR) y la proteína constitutiva de pena como un control, tal como se ha descrito en la sección de metodología que se ha mencionado anteriormente. Los resultados demuestran que el tratamiento con P1 X + P2X + P3X conducen a regulación negativa observable de EGFR, de una manera dependiente del tiempo, mientras que el tratamiento con P1 X Fab + P2X Fab + P3X Fab o cetuximab no condujeron a regulación negativa observable de EGFR en la inspección visual de las inmunotransferencias.
Equivalentes Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de determinar solamente el uso de experimentación de rutina, muchos equivalentes de las realizaciones específicas que se describen en el presente documento. Dichos equivalentes pretenden estar incluidos en las siguientes reivindicaciones. Se contempla que cualquier combinación de las realizaciones que se divulgan en la cualquier pluralidad de las reivindicaciones dependientes está dentro del alcance de la divulgación.
Incorporación por Referencia Todas las patentes, solicitudes de patente en trámite y publicaciones de patente que se han mencionado anteriormente en el presente documento se incorporan por la presente por referencia en sus totalidades.
APÉNDICE A AGENTES ANTICÁNCER Agente Comentarios Ejemplos anticáncer Ant i c erp . Ant icuerpos Al 2 (rrAb totalmente que horr r. i zadeq ¿G unen a 19C12 {mA totalEr.er.te IGF- :.ñ h ma izadDÍ (receotor de CP75 -371 (mA totalmente tipo 1 del. humanizado i tactor de H' iZ (nAb humanizado) cree Iriie-nto de aitaiR3 (ratón) t i po scFV FC (quimera de insu! : niced , xatoo/humar.3) qje ¿e expréssai: EM/1Ü4 (ratón ? sobre la AMü 479 (sAb totalmente- su er; icio- humanizado; Antgen) celular de la IMCA 12 (ja&b totalmente mayo es de los humanizado; -c nceres imclone ¡¡ hurasnos NSC- 742460 (Dyax) MR- 03 6, F5CC35 {Fierre Fabre Kedicastent, Merck) Anticuer os acucuriiab ÍEM07¿OOC5 que se unen a Erhitux®/cetu¾íinab { imclene ) EGFR; vect i ix®/pan.í tu urnab u aciones que (Arr.qen) aleonan a la rAfc 806 expresión o nimotuzurnab {ThexaciMS) acti idad de IKCE7S39 <;ncyte) F.3FR pueden dar paniturn rra (Vectibix®; como resultado Acogei: ) cáncer Anticuerpos AV 3 íAVFO) que =e unen, a mz 102 í Ara-gen i CMIOT (tactor de 5D5 <OA-5D5) (Gener.tech) transición epitelial me-senque ial ) ; un rr.i Grr.bro de la tan i lia de MET de t i reo i na quxnasa= rece t aras j ??-1..? ¡Kerrírssck Pharnace-u:.. :ca". s) Ab N" 14 descri :: ;>n el d&curaerit WO 200a '¡0 fi24 184C3; ¿DllHi ju3 t'-hsrsna AS) U3~12¿"/'A>!C:¿iib í U 3 Fhsrns/Aíügeni Anticuerpos Hex e tin® (irast rusa ; an ..í-5:".: P¿ GGFier ec /rtóc e) ; Oronrtarg® ?:!??2; í cri:u;-urr=t; ÍCÍ,E:i;73; e nc ntech hecie i Kc-ieciilai i F- 1 P NVF- AEW54I- A Pe ue.-.ae BKS- -i'j¦ *¿41 iK-üenz imidaz que áe tice 1 rseter 1-2- ilt -lii- piridin -¿-ona> dr aen s ds crac s.iticnto EMS-554.417' I GF i i< de- i o c Leí o 1 iqsn insu" ; r¡ ; c ; , 1KE2¿ que s expresa FQ 01 en la super * í cié r&iuiar de la rrayerv. a de lc¾ human s Kci; c;:1a-; PGFR Ire¿á-;S/g í it:.nit Feauenas *;ut.a : ;;:¡ei que {Ast rsJenscí.j us =c srectan s la Cl- lC'j ¡PD lá3éC5) (Prizcr Cír i.qsn s GKDreiíon o a TWEKB/ISDat ir: ib K:-' : .3 a;: í vi dad :.ie (Gl.sx:;3r-[il Ki ..:;e¦) EGFR p.;e :5en dar 'T y¼x; b& d i t = i I. a t: o de X apa L i n i b ¡ s:n i t h 1 i r¡ e "ár.cer B&ecnaa* T3 :.:evaS Frlc-i inib l:CL í<?s: Phsrnis) KI - ití, ¡Kjvarris¡ PD- ] 5b"a0 EKB-5É9 Tirios tina A3 7Ü;4 i3 Cl&roa i; ino) -í, 7 - dirnecoxiq inazoii'a) yp!ec-lai í:rbB2, : sia'c.ic.- HK.'l- 272 ¡nerat :n:i.b; Wyot.ñ j Ff:quí;f: ;¿ ;:o .jc .;lc corro K S a 7. f iancspirci ina; •q'je se iir i<::, un Kc-sar; EI.-CE2 t: araíli= de y c <:-Q pt r & rííli, que =c ele i., Q r miji ¿i -:c 3 u I.a= i r.,::er~ ^ s a'.éciil ar, cMKT (Factor dü PHA¡i¾5 5^ Requerías ;.íans i c : ::n í¾.RC ?91 (Arjuiel ¦:iue se epitel i al ARC 5SORÍ- t&rQ-jle » i: : .·. i :ic r. í¿ :r.a ¡je nqueiri ¿'i 1 '! ; i -i..:!"! ;r i e rr ;:v::o do- 3. ::i !: a .i 1.la. ritj KKT cié ·:. i .¡.na au n a. .-'i I ¦ :. -re t i „ > Ant i ~ciscab l i un sriti:r¡ccabo ito es tlourcuracílo <S-FU) un. «gente químico arecit -?: : ns/ XELODA© cor. una estructura i Hl Roches similar a na metot exato de sus an ia 5- rrií: lucrómet i 1-2' -des (me a o litio) cxiuridina sódica requerida para (Tre-xail) (Barr) reacc lories ra11 itre ed/Tomudex® bioq-j m. c s ( Aótrszane a) ncrir.ales, aunque lo pentetrexed/Ai im a« su:: j clcncenents (Li y) di re rentes coruc para Legal minter íe ir con las ar abi nosido de el tos.iris tunci nes reármales (Cytarabine, Ara-C de la¿ células:, r ioguar. ine/Lanvls® .n luyendo la (GlaxcSiuithKi i ríe) división celular. 5· azacit idina 6¦ mercaptopur ina ( ercaptcpur na, 6- -j asat :opr Ina/Azasari-S ( TE A ) pemostat ir.s/sipents (Hespirá Ene. > fosfato de i i udara,b i.n / "-'1udara¾ Oayer Health Cares ciadr i ina ieostatin© íl-CdA, 2- clorodesoxiadenosina) (Orrho Biotech) t Icxnricina ¡ 5 f lucro-- de-so i ur id inaj FUC ® {HOicira, in Agentes de Un. agente inhibidor de la slauilacioo antinsoplásico de Ri onucleot ido al qu i " ac ícr: as un Reductasa \ KR } soiintc de c i o i.oí: osí: aG; ila/Cy oxar.® slqu: laclen que ene ÍB SÍ /NG Sar® Í EVA j a un grupo al uilo a. i.i: os i:sin Ida / i t oxana® A.DN. ade que las (ASTA Medica) células caniierosas TlcTEFA (3edi rG, gene r atinen Le Abr xís, Teva} crol iteran de forma ECNL* - no res rictiva más 1, i bis {2 cloróse 11 ) - - que l hacen ias nitosourea células sanas, estas CCNü -s n ;s¿ sensibles ai 1, - (2-cl2r et: 1 ;¦ 3-cicl daño en el A M, y los Qhe x i1 - 1- n1 rosourea agentes de (CCNÜ de meei lo? s'.quilsci r. se- usan hexamet limelamír.5 lin i ame nte ra í alt.retarr.iiis, tratar na HMK) /HexaLen© ÍMGI diversidad de Fharraa Inc. ) o uniere s busuilan /Mfleran© íGlaxosraithKline) procarbazír.s KCL / Katulañe® {Sl< ia Tan) Dacarbazina (OTicm cloraEcb cilo/Leukaran© íSrrithKline Be echara) Keltalan/Alkera~si (GlaxoSrai hKl : ne ) cisplsrono {cisplati no, CD Fi/Plaiínol {Bristol Kyers) carbopl t inc/ParapI s~ xn € (BMS) exa 1 iplat ír,o/s lox itan© (¿snotl-Aventis US} EendarnusLina car oquona arrilsi i na clcrocnetina dacarbazina {BTio toteraust ina lorr.ust ina rr nnosuli ano nedaplat i no nirrust ina predr.isms ina ran Lnustina satrapiat irio senr.usfc ina es rep oz cina terr.ozolorr.ida t rs osul tarto tr iaz iq ona r .i.et i 1s n me 1amina cetranitrato de tr ipl atino trctosranr.í a urarnust ina ioidores :.o¿ i hibidores ae doxoru icina HCL oxil® la la topoiseme rasa sc-r. (Alza) •¦o i. soine r asa agentes de o i trato de quimioterapia daunorubicina/Daunoxorne di senados a ® interter r cor. la (Gi iead > ac ión de enzirtas i r..oxar¡trena c opc 1 ssr.c rasa HCL/Novantrcna (EMD (topoisorrerasa r y Sereno) TI), que sor. enzimas act inemie ina D que coni rolan los e to ós ide /Ve pe s id® cambios en la í-i-trucLürí. del ADH E pophoáC (Hospira, al cat lizar la Bedio.rd, reva ruptura y la nueva Pa rentera!, Etc. ) unión de la topotecan HCL/H camtin® est ructura (GlaxosmithKline ) rr:nc pal de tcnipc¿ ido .tostcdiesr.er de ( VM-26 ] /vuncrt® í'BMS ) hebras de AD ir inotecan HCL i CPT- 11 } durante el ciclo carr.ptosar® (Pharmacia i celular nerita! . ü johr) eamptotecira íC?T| e lote car. r abite cán AqencGS de LO= mi crotábulcs son vincristina/oncov ir.® dirección a uno de los sultato de nui.crof ubulos componente s del vlnblastina/velbart© cite esqueleto. (discontinuo) (Lilly) Tienen un diámetro artrato de de aproximadamente v i n ore 1. h .i na/ Ka ve 1 b i n e<® 24 rr, y una longitud (FierreFsbre ) que varia de varios sulfato de rr. i ex ene i ros a vindesina/sldis me© posiblemente {Lilly} nti 2 ¿metros en los pac I it axe l/Taxol# í EMS ) a enes de las de-ce taxe 1 /Taxote r ©» células ra i vi osas„ ísanoti Avenéis USÍ Los nuc o ábalos F í it axe 1 sirven corro D a..n opa r t i eu 1 ad o corap-c cntes CABi-üO") /Abraxane® estructu ales (Abraxis BiOScience, dentro de las Inc. > células y están ix bepi ona/ KEMPRA** tso.1.1 cades en muchos ÍBK3 proceses celulares larotaxcl que incluyen o tatsxGl mi Loáis, tesetaxe 1 citegui no-sis, y v inf lunina transccr fe- vesicul r. inh ib.do.re Las i..resina rr.es ilato de de qin nasas quinabas son enzimas iraat m ib/ Gleevec der.tr o de la célela ([Levareis) que funcionan rtalatc de uniendo gr os sunitin:b/Suten.t¾ fosfato a la (Ptize-r } tiros ina del tosí lato de asme-ac ido . so raí en i / exavar¾ Mediante e blc ueo i Baye-r ) de la capacidad de rronoridraco de las proteínas clorhidrato de nilotinlb ti.ros.ina quí nasas /Tssiqna® ¡Novaré s) para í: un clonar, AMG 3 b (Amqen) estos compuestos axitinib <AG~0O736? proporcionan una Pfizer, me. ) herramienta para bostitincb fSKl-606 controlar el' wyetr.) creo, i. Diento de sl linate de brivanib células cancerosas. BMS) cediranib { AZD2171 ; Recentín, Ascraaeneea) dasatinib ¡BMS- 354B25 : Spryce.1-2; B S> les aurtinib {CEP-701; Cefalcnj ditosfatc de rnote=ani*o (AXS-706; Amqen/Takeds) pazopanib KCL (GW78603^; Ar ala, G K ) serraxanib ¡su54l$t Pharraacia) vandctar.ib (B.ZD64?; zactima; Ascraseneca) vatalanib !PTK-7a~; Hovartis, Bavex sc erir.q P arnta) (NSC7X878I; Exelixis, GS S inhibidores induce aporcosis i-a=¾«ra«ftr.asa Sl=osr® de :a sir.tesií celular (Merck i Co-J de proteínas Aqsni.e s induce a presentar interfercn Alfa i nrrurio e una, respuesta Inmune inhibidor tís la en pacientes con Angíogéne» is AvastinC cáncer (Genentedhd IL-¿ - interle uina (Aldesleuqoina) / Frcleu-cirafc- (Chironj IL~ 1 - irtterleioaiiina 12 las terapias ci trato de horrr.or.a Ies toreraifeno/Fareston® asoci as con la (GTX, rr.encpau= la y con. inc . i enve ie irr.iervco i u I ve strant ,··'Fa s 1 edexc- us a aun»litar la (AstraZeneca) cantidad de ra 1o ifeno HcL E is a® determinadas (Lilly) honr.or.a5 er. el ana¿trazol Ar irídex® orean.: site Dara (AstraZeneca) compensar la let rozol/ remara© d :.= irucior. ( ovart áj horrtor.al fadrozol >;CGS 169 9A > relsc :onada con I e xetestano AI:oma.s i it® edad y con (Pharmacia i e te rraedade ¿ . Upjohn) :.a terapia hom.orsl acetato ds cono un tratamiento leuproiida/Eligards para el csr.cer (DTL USA} cjene raímen e reduce lupron© EIAF Pharm. ) el nivel de na o zas acerato de hormonas qosereiina/Zo adex®< especii i c s, (Astrazeneca) bloquea a una. par.oaco de honr.or.a = partir de tr iptere lin / r el star® la interacción con (Katson Labs) su receptor celular busere lina/Supreiact® o de otro nodo altera fsanori Aventlsí la capacidad del naf are 1 i na cáncer ie ser cetrore lix/cet rotide© estimulad-: con (EMD Se roño) ho.rr on.as para crecer bi ca.lutarr.ida/easodexc y propagarse . Dichas (Astrazeneca ) terapias hormonales n i 1 ut ara i da / H i 1 and r on incluyen cor lo ÍRvert i ¿ Pharm . tanto antagonistas acetato de hormonales e tte est rol /Megace® IBMS) inhibidores de la An logos de síntesis de sorr¾atc¿tatina {por hormonas, En algunos ejemplo, .Acetato de casos, tsxbi n =e o c t r e o t ida/ s a ndo s t at i pueden usar (Kovar::=s ? antagonistas de sbarelíx íPienaxiuP*' ; hormonas como Amg&n} terapias hormonales acerato de abí aterona ant icáncer . CCB7C3Ü; BTG pie) af imoxi fe no ¾Tamo3el Ascend Therape t.ics, ined inhibidor de arocr.ata.sa (Ata rae i t a n o má s torernireno? intarcia Therapeutics, Inc. } arzoxiteno (Eli Lilly & ce) Asentar^; DN- i G i (tíovacea; oregor. Health Sciences Uí tlutamida lEulexin®, sche ine; Prostacur, laboratorios Alrairali, s . A) letrozol (CG320267} (Femara®, chupa:; Es roche k©, ( Jags onpa 2 Fharrnaceutica J s ltd; } celestrogen®, valerato de estradiol i Jagsor.pal) acet to de magest rol/Me gace® acetato de- ttedrox i proqe ¡sterorta (Ver apiex®-; Coirsbiphar MT20¾ íMedisyr.
Tscftr.ologies, inc.j deear.eato de r.androlor.a (Zestabolir.®; M n* i ni pharma Ltd) tamoxífeno (Tax fen®, Yung S n Fharrasceut i cal ; Torr.iren-s, Aloen Laboratories Ltd. ) l trato de tamoxífeno ÍKCJI vade.x, AstraZeneca; soltansox, lUSft Pharma ir.c citraco de tanoxiíeno SDPH.AR.MA, Seph arma JS o. ) Fármacos predrrisolona antiinf "amatorios de amecasona /Decadrcn® usados para reducir ( ystn) la ini laxación que preánisona (Deltasona, causa el dolor por orasona, Pred Líquida, cáncer . sterapred©> In ibidores incluye imidaccles k ©tocona de la a,torratasa in ibidores ta ruta de si rol ÍTÍUS de ri'TüR señal ilación ce ralos (Rapamí ciña) /Rapam ne© fue descubierta íWyethi cr :qír.almentG Terr.SÍ oliimis durante estudios del ) Torrsel®- agente íWyethi irmunosupresor Ce toro limas (AP2357S rasainicl na . Esta (Arlad PhartR. i ruta altamente Everoiimus e r.servada reaula la (RADCül ? /ce-rtican® p olifer ción y el (Kovari i=} metabolismo celular cene reí uesta a íac ore= eií ier.tales, uniendo 1* señalización del receptor del tactor de crecimiento elul r a través de iDütDíncfSitido- 3-qu inasa (Fl- 3K) si crecimiento, proliiera iin y =nqicqenes 3 s ce lu ar ,.
Aqc n cá ~dr iarricioa, que io- terape 5-i iuorouraci lo, út : o= citoxina, bleoraicína, miiorr.i i na C, daunoxicina, carrríinornic ma, a»inopterir¾a, dactiriDnicma, mi oralciñas, e=peraio...ciñas, clofarab iría, rr.erc=ptopurina, pen ostacir.a, t iogeanina, eitarabina, decicabina, I: lox riíiina, gemeicabina (Gerazar) r enocitabina, sapacitabina i ni; i fa.dore:; inhibidor de AKT Astex® de Is proteína íaSTEC Therapeul cs) cu inasa B Inhibidores de AKT iP Bi NERVIAKü .Nerviano Medical Sciences) inhibidor de la AKT Ouinasa TELI ¡Tellk inc) AKT DSC IPH3.RA (De iphers Fharmaceutical s, LLC } pcrirosxna ( RXD401, D-212É6; eryx Biop arraacsut i cal¡s inc, AEterna zentaris mo peritos ina con Docetaxel ( eryx Bicpharraaceuí icals in , AE srna Zentaris rnci pcriicsína cor.
Gemci cabina í&Eterr.a Zentaris inc) pe rifes ina cor. paclitaxel (ASterna Sen.aris Ir.c) inhibidor de la prote na quinasa-E DEVELOGEN ( eveloGen G j PX31£ íoncotbyreon, in.r, 5 RXOiiíi ¡Rexahr.
Pharraaeeut icals me) X0 C1 íRexa r.
Pharraaceut icals inc) VQD002 íVioQU&st F srraacsuricals ino XL41S iExGlixis Inc) SEN027 lAKterria zentaris inc) in ibidores de la EGT226 íNOVSrtis AG) Fostatiai 1 · ir¡ AL 101 ¡ calistoga Pharraaeeuticais, Inc.! i - cidras a CHR4432 (enroma Trie rape c ios Lias inhibidores de Erk/PD ETERMA lAEterr.a 2entari,s inc) GDCO l (señente h ln /?i.ramed Limited/Roche Holdings :.td) enzastacr ina KCL (LY3l76:5; En asna rina; El LiUyj 1Y¿ 4.002 ortmannin Inhibidores de PI3K SEXAFCRK (Separore Fharmaesut i ca 1s$ ????? íoncothyreori, inc . ) SF1126 íSeraafore Pharraaeeut íea.l=) V C 8000 í¥M Discovery, T nc . ? XL1 7 {Exelixiá inc) XL147 con XL64"? (Exelixis inci XI.76? ÍEXQIIXÍÍ inc) FJ 103 i Roche/ Firame d> Inhibidores YC200, R-roscovitina de Quina ¿a i (Seliciclib ccDoncil entes iclacel ?haraa! ele cielina HSC-649890, LB& 8275, HMR-I 75 (alvocitíibí RCIí TEr9, CD2S9 iMCxine (Merck KGaA) ???2G55 (idera) IMO-2055 asís Pharma 1018 iss (Dyna ax Teehr.ologíes/UCSF) PF-3512676 (Pfizer} in ibidor lor¡aiarnibíSCH6¾336; En:: im i : ce- Sara¿sr; s parcen, ? Ar izona) Ant i-TRAIL AMG-655 (Aeterna semaris, Keryx Biop srma ) AD02L/TRAIL, «¾G95i ( Genentech. , Arngen } APC AE fsAb totalmente hurtar, izado; Ge nentec inhibidores fp ote ina o ir.asa e ARRY262 (Array BicFb.arraa de MB1K Q inas» i A t ivads inc) por m toas nos ARRY704 (Array BicFharna (MAP2K1 ) ; Mit-ogen- in j Frotema Q ínasa de AHRY8tí6 {Array BicPharms Quinas» 2 ¾ t ívada me) por Müogsr,oá A3l0i02¿ (Merck sereno (MAP2K21 j 3. ) A2D6244 (As rasenecs Fie) A:*DS330 (Astrazene-cs r i o ) RDEA119 (Ardea Eiosciences, Inc. ) RDEA 43C (Ardea Bioscier.ees, inc. ) XL5 i. B >ExeIix:.;; Inc; ener.tech ínc¡ inhibido imprime PGG íBiotneral í;i.vs r sos CHE-2797 i inhibidor de 1a utainopeptidasa Mi ; Chroms The-rapeuties) E7820, NSC 719239 (rn bidcr de la Intsgrin»-al£a2r Eisai) IDCCS 0"E3y (ADAM 17, Inhibidor ds TACE; in yte ) CKF202 , BIIB 2- ( Inhibidor de H ¿ C»; Biogen idee) KP ~0, KPK-56 (inhibidor de Ic/MsI/Ret Scherinq- Pionco } SKCX-275/MS-275 (inhibidor de HDAC Syn ax) Zarnestr5*f ripitarnib, RU 5771 (inhibidor de Ras; Jar.ssen Pharira) vc-.lc-cixirr.ab-; sc-= 20G-4,M20ü (inhibidor de la integrina alrs.5»l; Bi gen Idee; Eli Lilly UCSF/PDL BioPhsrras) apri oxib ÍTP2 C i ; Inhibidor de la C0X-2, Da chi. sankyo; Traqara Phsrrrisj BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECtTEHCTAS EGFR ECD CSEQ ID NO: 33? i Í'RPSGT¾¾A !AALlAALCP «.¿PALSKKKV LGTFE HFLS 61 v xtrr; QRtrvDLSFLK TIQEVAGTVL 1A 1TVEBIP L-.Ht.QI IFGK MYYEWSYALA \2t V£,5WíT-AH r HUKCUWWL. ^EIIWKJAVRF 3E11¾AI«CWVE SIQWRDIVSS I8t SHHIJSSOO "PSCPMGS W ASRRHCQKl. T T TCAQQCS GRCRG SP&r CCHSIQCAA«C 241 IÜF*K$t)Ct.V CR rSOEAl ???? ??,??? r«'TTfQMÍVW CVK CPRHVV ÍOI VTCHGS VPjS, GADS'íiKEt IWWKCKKCB Gtf.p-KVCtlGI IHATWTKHFK J6Í KCISISGI-LH -Li 'Atm S rTBXt'PLDl'Q üLL L TVSE PEH rüLHAi" 121 BHLaitP/JRr ?¾??¾«·41? V.;i,HrTSL(il. vi i&Qim;Lc YAMTIMWKKL 481 FCT.S¾OKrKl tSKRGEMSCK ATS VCRALC KOOrS KKVS 1 t eSEPPEF gMSBCICCHf- E LPQAI-1W1T T6P6P UCÍ QCAÜi'IOOPH 601 QEKtiTLVM i ADAÜHVtKLC KtWCTY6CTO PtíliEGCPTHQ PXIP.SMHHHH H

Claims (44)

REIVINDICACIONES
1 . Un anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de EGFR y que comprende secuencias de cadena pesada y ligera CDR1 , CDR2, y CDR3, en las que las secuencias de cadena pesada y ligera CDR1 , CDR2, y CDR3 se seleccionan entre el grupo que consiste en: (a) las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (b) las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 0, 1 1 y 12, respectivamente; y (c) las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente.
2. Un anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de EGFR y comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en el que las secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera s se seleccionan entre el grupo que consiste en: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 20; (b) una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (c) una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24.
3. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o 2, que se une a EGFR con una Kd superior a 100 nM.
4. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 3, que se une a EGFR con una KD superior a 10 nM.
5. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 3, que se une a EGFR con una Kd superior a 1 nM.
6. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o 2, que es un anticuerpo humano.
7. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo biespecífico, inmunoconjugado, Fab, Fab'2, ScFv, avímero, nanocuerpo y un anticuerpo de dominio.
8. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo monoclonal se selecciona entre el grupo que consiste en anticuerpos de isotipo lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1 , lgA2, IgAsec, IgD y IgE.
9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Un kit que comprende la composición farmacéutica de la reivindicación 9 en un envase.
1 1 . Un método para tratar cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 9.
12. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o 2 para el tratamiento de un cáncer.
13. Una composición que comprende dos o tres anticuerpos monoclonales que se unen al dominio extracelular de EGFR, en la que los dos o tres anticuerpos monoclonales se seleccionan entre el grupo que consiste en: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 y 12, respectivamente y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17 y 18, respectivamente; y en la que la composición comprende (a) y (b), (a) y (c), (b) y (c) o (a), (b) y (c).
14. Una composición que comprende dos o tres anticuerpos monoclonales que se unen al dominio extracelular de EGFR, en la que los dos o tres anticuerpos monoclonales se seleccionan entre el grupo que consiste en: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 20; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID NT: 22; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24; y en la que la composición comprende (a) y (b), (a) y (c), (b) y (c) o (a), (b) y (c).
15. La composición de la reivindicación 13 o 14, en la que cada uno de los anticuerpos monoclonales (a), (b) y (c) se une a EGFR con una KD superior a 100 nM.
16. La composición de la reivindicación 15, en la que cada uno de los anticuerpos monoclonales (a), (b) y (c) se une a EGFR con una KD superior a 10 nM.
17. La composición de la reivindicación 15, en la que cada uno de los anticuerpos monoclonales (a), (b) y (c) se une a EGFR con una KD superior a 1 nM.
18. La composición de la reivindicación 13 o 14, en la que cada uno de los anticuerpos monoclonales (a), (b) y (c) es un anticuerpo humano.
19. La composición de la reivindicación 13 o 14, en la que uno o más de los anticuerpos monoclonales (a), (b), y (c) se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en un anticuerpo biespecífico, inmunoconjugado, Fab, Fab'2, ScFv, avímero, nanocuerpo y un anticuerpo de dominio.
20. La composición de la reivindicación 13 o 14, en la que cada uno de los anticuerpos monoclonales (a), (b), y (c) se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en anticuerpos de isotipo lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1 , lgA2, IgAsec, IgD y IgE.
21 . La composición de la reivindicación 13 o 14, que comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
22. Un kit que comprende la composición de la reivindicación 21 en un envase.
23. Un método para tratar cáncer en los sujetos, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición de la reivindicación 21 .
24. La composición de la reivindicación 13 o 14 para el tratamiento de un cáncer.
25. Una composición que comprende tres anticuerpos monoclonales anti-EGFR, comprendiendo dicha composición un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo, en la que (i) el primer anticuerpo comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (ii) el segundo anticuerpo comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 11 y 12, respectivamente; y (iii) el tercer anticuerpo comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente, y en la que el primer, segundo y tercer anticuerpos están presentes en una relación molar de 2:2:1 entre sí.
26. La composición de comprende tres anticuerpos monoclonales anti-EGFR, comprendiendo dicha composición un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo, en la que (i) el primer anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 20; (ii) el segundo anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (iii) el tercer anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24, y en la que el primer, segundo y tercer anticuerpos están presentes en una relación molar de 2:2:1 entre sí.
27. La composición de la reivindicación 25 o 26, en la que cada uno del primer anticuerpo, el segundo anticuerpo y el tercer anticuerpo se une a EGFR con una Kd superior a 100 nM.
28. La composición de la reivindicación 27, en la que cada uno del primer anticuerpo, el segundo anticuerpo y el tercer anticuerpo se une a EGFR con una KD of superior a 10 nM.
29. La composición de la reivindicación 27, en la que cada uno del primer anticuerpo, el segundo anticuerpo y el tercer anticuerpo se une EGFR con una KD superior a 1 nM.
30. La composición de la reivindicación 25 o 26, en la que el primer anticuerpo se une a EGFR con una Kd en un intervalo de 1 x 10-9 M a 1 ,1 x 10-1 1 M, el segundo anticuerpo se une a EGFR con una KD en un intervalo de 1 x 10-9 M a 7,0 x 10-1 1 M y el tercer anticuerpo se une EGFR con una KD en un intervalo de 1 x 10-9 M a 3,6 x 10-10 M.
31. La composición de la reivindicación 25 o 26, en la que cada uno del primer anticuerpo, el segundo anticuerpo y el tercer anticuerpo son anticuerpos humanos.
32. La composición de la reivindicación 25 o 26, en la que uno o más del primer anticuerpo, el segundo anticuerpo y el tercer anticuerpo se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en un anticuerpo biespecífico, ¡nmunoconjugado, Fab, Fab'2, ScFv, avímero, nanocuerpo y un anticuerpo de dominio.
33. La composición de la reivindicación 25 o 26, en la que cada uno del primer anticuerpo, el segundo anticuerpo y el tercer anticuerpo se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en anticuerpos de isotipo lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1 , lgA2, IgAsec, IgD y IgE.
34. La composición de la reivindicación 25 o 26, que comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
35. La composición de la reivindicación 34, que es una composición estéril.
36. La composición de la reivindicación 34, que es adecuada para inyección.
37. La composición de la reivindicación 34, que es una composición estéril adecuada para inyección intravenosa.
38. Un kit que comprende la composición de la reivindicación 34 en un envase.
39. Un método para tratar cáncer en sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición de la reivindicación 34.
40. La composición de la reivindicación 25 o 26 para el tratamiento de un cáncer.
41 . Un método para preparar una composición de anticuerpo anti-EGFR, método que comprende la combinación en una sola composición: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 11 y 12, respectivamente; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente; en la que (a), (b) y (c) se combinan a una relación molar de 2:2:1 entre sí.
42. Un método para preparar una composición de anticuerpo anti-EGFR, método que comprende combinar en una sola composición: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°:20; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24; en la que (a), (b) y (c) se combinan a una relación molar de 2:2:1 entre sí.
43. Un método para tratar a un sujeto con anticuerpos anti-EGFR, método que comprende administrar al sujeto: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 1 , 2, y 3 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 4, 5, y 6, respectivamente; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 7, 8, y 9, respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 10, 1 1 y 12, respectivamente; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada de SEC ID N°s: 13, 14, y 15 respectivamente, y las secuencias CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera de SEC ID N°s: 16, 17, y 18, respectivamente; en la que (a), (b) y (c) se administran al sujeto en una relación molar de 2:2:1 entre sí.
44. Un método para tratar a un sujeto con anticuerpos anti-EGFR, método que comprende administrar al sujeto: (a) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°:20; (b) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 22; y (c) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 24; en la que (a), (b) y (c) se administran al sujeto en una relación molar de 2:2:1 entre sí.
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