KR20170138539A - 표피 성장 인자 수용체(egfr)의 세포외 도메인 내에 돌연변이를 갖는 환자를 3종의 완전 인간 단클론성 항-egfr 항체의 조합물로 치료하는 방법 - Google Patents

표피 성장 인자 수용체(egfr)의 세포외 도메인 내에 돌연변이를 갖는 환자를 3종의 완전 인간 단클론성 항-egfr 항체의 조합물로 치료하는 방법 Download PDF

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알베르토 바르델리
제프리 디. 컨즈
베니 비. 울프
레이첼 씨. 네링
홍팡 왕
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메리맥 파마슈티컬즈, 인크.
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Abstract

본 명세서에는 인간 환자에게 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물(예를 들어, 제1 단클론성 항체(P1X), 제2 단클론성 항체(P2X), 및 제3 단클론성 항체(P3X)를 포함하고, 여기서 P1X, P2X 및 P3X는 2:2:1의 몰비인, MM-151)을 투여함으로써 인간 환자에서 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 암은 EGFR R451C, S464L, K467T, G465R, G465E, I491M, 및 S492R로 이루어진 군으로부터 선택된 EGFR의 세포외 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

Description

표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 세포외 도메인 내에 돌연변이를 갖는 환자를 3종의 완전 인간 단클론성 항-EGFR 항체의 조합물로 치료하는 방법
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 하기 미국 가출원: 2015년 4월 24일자로 출원된 제62/152,707호; 2015년 10월 22일자로 출원된 제62/244,991호; 2016년 3월 15일자로 출원된 제62/308,697호; 및 2016년 4월 15일자로 출원된 제62/323,475호의 우선권 및 이익을 주장한다. 상기에 언급된 출원의 내용은 참고로 본 명세서에 포함된다.
표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 전형적으로는 다수의 세포외 리간드, 예컨대 표피 성장 인자(EGF) 중 임의의 것의 결합에 의해서, 활성화될 때 세포의 내부로 신호(세포 증식을 유도하는 미토겐 신호 포함)를 전달하는 HER/ErbB 수용체 패밀리의 세포 표면 막관통 수용체이다.
EGFR-표적화된 단클론성 항체, 에컨대 세툭시맙 및 파니투무맙이 EGFR-발현 종양에 대해서 항상 효과적인 것은 아니다. 많은 경우에, 이들 항체 제제에 반응하여 이들로부터 이익을 제공받은 환자에서 결국 치료에 대한 2차 내성이 발생한다. 이러한 내성의 한 원인은 종양 세포를 세툭시맙 및/또는 파니투무맙에 반응하지 않게 하는 엑토도메인(ectodomain) 내의 하나 이상의 돌연변이의 발생이다.
항-EGFR 항체 효능을 개선시키려는 목적으로 취한 한 접근법은 EGFR의 세포외 도메인 상의 상이한 부위(에피토프)에 표적화된 항-EGFR 단클론성 항체의 혼합물(즉, 올리고클론성 항체)을 개발하는 것이었다. 예를 들어, PCT 국제 공개 제WO/2011/140254호 및 미국 특허 제7,887,805호를 참고하기 바란다. 이러한 개발은, 종양이 암 환자를 단클론성 항-EGFR 항체에 반응하지 않게 하는 특성을 갖는 암 환자를 식별하는 하는 것을 가능하게 하여, 이러한 환자가 올리고클론성 항-EGFR 항체의 투여를 통해서 효과적인 치료를 제공받을 수 있도록 하는 수요를 창출하였다. 본 개시 내용은 이러한 필요성을 해결하고, 다른 이점을 제공한다.
본 명세서에는 단클론성 항-EGFR 항체, 예를 들어, 세툭시맙 또는 파니투무맙에 불치성으로 진행되거나 또는 불치성이 된 암 환자를 치료하는 방법 및 그러한 암 환자를 위해서 치료를 선택하는 방법이 제공되며, 방법은 환자의 종양 세포가 세포외 도메인에 대한 EGFR 유전자 영역 암호에서 돌연변이를 획득하였는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 선택된 치료는 EGFR 세포외 도메인에 결합하는 항-EGFR 항체의 올리고클론성 혼합물을 포함한다.
또한, 종양(예를 들어, 악성 종양)이 단일 단클론성 항-EGFR 항체(예를 들어, 세툭시맙, 파니투무맙) 또는 Sym004로의 치료에 반응성이지 않지만, 본 명세서에 기술된 바와 같은 올리고클론성 항-EGFR 항체로의 치료에 반응성일지의 여부를 예측하는 방법이 제공되며, 방법은 환자의 종양 세포가 세포외 도메인에 대한 EGFR 유전자 영역 암호에서 돌연변이를 획득하였는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
추가로, EGFR 세포외 도메인 내에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하는 세포를 함유하는 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 EGFR 세포외 도메인에 결합하는 항-EGFR 항체의 (예를 들어, 단일 조성물 중의) 올리고클론성 혼합물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 선택된 올리고클론성 혼합물은 (a) 각각 서열번호 1, 2, 및 3의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 4, 5, 및 6의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 단클론성 항체; (b) 각각 서열번호 7, 8, 및 9의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 10, 11 및 12의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 단클론성 항체; 및 (c) 각각 서열번호 13, 14, 및 15의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 16, 17, 및 18의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 단클론성 항체를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 선택된 올리고클론성 혼합물은 (a) 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체; (b) 서열번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체; 및 (c) 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체를 포함한다.
사용될 수 있는 다른 항-EGFR 올리고클론성 항체 조성물은 PCT 국제 공개 제WO/2011/140254호 및 상응하는 계류중인 미국 특허 공개 및 상응하는 계류중인 미국 특허 제9,044,460호, 및 계류중인 미국 특허 제9,226,964호 및 제7,887,805호("Oligoclonal Applications")에 기술되어 있고, 뿐만 아니라 다른 항-EGFR 항체와 조합된 이러한 항체의 올리고클론성 혼합물은 암, 예를 들어 악성(신생물) 종양의 치료에 유용하다.
일 실시형태에서, 선택된 올리고클론성 항체(예를 들어, (a), (b), 및 (c)를 포함함)는 (예를 들어, 조성물 중에) 서로에 대해서 2:2:1의 몰비로 조합된다.
또 다른 실시형태에서, 환자는 EGFR 세포외 도메인에 결합하는 단클론성 항체 치료법, 예컨대 세툭시맙, Sym004, 또는 파니투무맙 중 하나 이상에 불치성이 되었다. 또 다른 실시형태에서, 환자는 플루오로피리미딘-함유 치료법, 옥살리플라틴-함유 치료법, 또는 이리노테칸-함유 치료법에 대해서 또는 그 치료법 이후에 질환 진행을 가졌다. 또 다른 실시형태에서, 환자는 항신생물제로의 이전 치료 이후에 항신생물 요법에 대해서 불치성으로 진행되거나 불치성이 되었다. 또 다른 실시형태에서, 환자는 항신생물제로의 이전 치료 이후에 항신생물 요법에 내성이 되었다. 또 다른 실시형태에서, 환자는 항신생물제로의 이전 치료 이후의 질환 진행 또는 재발 후에 치료된다. 또 다른 실시형태에서, 환자는 항신생물제로의 치료 실패 이후에 치료된다. 또 다른 실시형태에서, 암은 항신생물제에 대해서 내성을 획득한 암으로서 식별된다.
또 다른 실시형태에서, 환자는 결장직장암, 전이성 결장직장암(예를 들어, KRAS, NRAS, 및/또는 BRAF 야생형 전이성 결장직장암), 편평 세포 두경부암, 재발성 또는 전이성 두경부암, 흑색종, 유방암, 난소암, 신장 암종, 위장/결장직장암, 폐암(예를 들어, NSCLC), 또는 전립샘암으로 진단되었다.
추가로 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라서 시험되고/되거나 치료되는 종양은 피부, 중추 신경계, 두부, 목, 식도, 위, 결장, 직장, 항문, 간, 췌장, 담관, 담낭, 폐, 유방, 난소, 자궁, 자궁 경부, 질, 고환, 생식 세포, 전립샘, 신장, 요관, 방광, 부신, 뇌하수체, 갑상샘, 뼈, 근육 또는 결합 조직의 종양이다.
일 실시형태에서, 종양은 FDA-승인된 시험을 기초로 EGFR 세포외 도메인 내에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하는 세포를 포함하는 것으로 결정된다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 EGFR 세포외 도메인의 도메인 III 내에 돌연변이를 보유하는 세포를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 EGFR 유전자의 엑손 12 내에 돌연변이를 보유하는 세포를 함유한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 종양의 생검 샘플을 수득하는 단계, 및 종양이 EGFR의 세포외 도메인에 대한 DNA 또는 RNA 암호 내에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는지의 여부를 중합효소 연쇄 반응 또는 차세대 서열분석(NGS)을 사용하여 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 종양의 생검 샘플을 수득하는 단계, 및 종양이 EGFR의 세포외 도메인 내에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는지의 여부를 면역조직화학 또는 질량 분석법을 사용하여 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 환자로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계, 및 혈액 샘플이 EGFR의 세포외 도메인을 암호화하는 서열 내에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 순환 DNA를 함유하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
특별한 실시형태에서, 순환 DNA는 혈액 샘플로부터 단리된 무-세포 DNA이거나 또는 혈액 샘플 중의 순환 종양 세포로부터 단리된다. 다른 실시형태에서, 순환 DNA는 혈액 샘플 중의 순환 엑소좀으로부터 단리된 DNA 또는 RNA이다. 다른 실시형태에서, 순환 DNA는 소변 샘플로부터 단리된 무-세포 DNA이다. 다른 실시형태에서, 생검 종양 세포, 순환 종양 세포, 또는 무 세포 DNA는 EGFR의 세포외 도메인에 대한 DNA 또는 RNA 암호 내에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하고, 적어도 하나의 돌연변이는 EGFR 유전자의 엑손 12 내에 존재한다.
또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 EGFR R451C, S464L, K467T, G465R, G465E, I491M, 및 S492R로 본질적으로 이루어진 군으로부터 선택된, 단백질 서열 변화, 또는 단백질 서열 변화를 유발하는 DNA 또는 RNA 암호 영역이다. 특별한 실시형태에서, 단백질 서열 변화는 S492R이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료 방법은 1종 이상의 다른 항신생물제(예를 들어, 다른 화학치료제 또는 다른 소분자 약물)와 조합하여 항-EGFR 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 3종 이하의 다른 항신생물제가 치료 사이클 내에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 2종 이하의 다른 항신생물제가 치료 사이클 내에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 1종 이하의 다른 항신생물제가 치료 사이클 내에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 어떤 다른 항신생물제도 치료 사이클 내에 투여되지 않는다.
또한, 인간 환자에서 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암을 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 환자에게 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 제1 단클론성 항체는 P1X이고, 제2 단클론성 항체는 P2X이고, 제3 단클론성 항체는 P3X이고, 올리고클론성 항체 조합물은 P1X, P2X 및 P3X를 2:2:1의 몰비로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 제1 단클론성 항체는 각각 서열번호 1, 2, 및 3의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 4, 5, 및 6의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고; 제2 단클론성 항체는 각각 서열번호 7, 8, 및 9의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 10, 11 및 12의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고; 제3 단클론성 항체는 각각 서열번호 13, 14, 및 15의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 16, 17, 및 18의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 제1 단클론성 항체는 각각 서열번호 1, 2, 및 3의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 4, 5, 및 6의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고; 제2 단클론성 항체는 각각 서열번호 7, 8, 및 9의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 10, 11 및 12의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고; 제3 단클론성 항체는 각각 서열번호 13, 14, 및 15의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 16, 17, 및 18의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 방법은 암을 상이한 항-EGFR 요법(예를 들어, 세툭시맙, 파니투무맙 또는 Sym004)으로 치료한 이후에 인간 환자에서 EGFR 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암을 치료하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 올리고클론성 항체 조합물은 환자로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계, 및 혈액 샘플이 EGFR의 세포외 도메인을 암호하는 서열 내에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 순환 DNA를 함유하는지를 결정하는 단계 이후에 환자에게 투여된다. 일 실시형태에서, 올리고클론성 항체 조합물은 환자의 혈액 중에서 EGFR 세포외 도메인의 도메인 III 또는 도메인 IV 내에서 돌연변이를 검출한 단계 이후에 환자에게 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 올리고클론성 항체 조합물은 인간 환자에서 EGFR의 ECD 영역 내에서 엑손 12 돌연변이를 검출한 단계 이후에 환자에게 투여된다.
일 실시형태에서, 암은 EGFR의 세포외 도메인 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 이것은 EGFR R451C, S464L, K467T, G465R, G465E, I491M, 및 S492R로 이루어진 군으로부터 선택된, 단백질 서열 변화, 또는 단백질 서열 변화를 유발하는 DNA 또는 RNA 암호 영역이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27(즉, EGFR의 세포외 도메인에 상응하는 아미노산 서열)의 위치 451에서의 아르긴에서 시스테인으로이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27의 위치 464에서의 세린에서 루신으로이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27의 위치 467에서의 라이신에서 트레오닌으로이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27의 위치 465에서의 글리신에서 아르기닌으로이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27의 위치 465에서의 글리신에서 글루타메이트로이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27의 위치 491에서의 아이소루신에서 메티오닌으로이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27의 위치 492에서의 세린에서 아르기닌으로이다.
일 실시형태에서, 치료 방법은 EGFR 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암, 예컨대 K-Ras, N-Ras, 및/또는 BRAF 야생형 전이성 결장직장암의 치료를 포함한다. 일 실시형태에서, 돌연변이 암은 FDA-승인된 시험에 의해서 결정된 바와 같은, K-Ras 야생형, EGFR-발현 전이성 결장직장암이다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이 암은 두경부암(예를 들어, 두경부의 국소적으로 또는 국지적으로 진행된 편평 세포 암종)이다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이 암은 FDA-승인된 시험에 의해서 결정된 바와 같은 Ras-야생형 KRAS(엑손 2) 전이성 결장직장암(mCRC)이다.
또 다른 양상에서, 방법은 EGFR R451C, S464L, K467T, G465R, G465E, I491M, 및 S492R로 이루어진 군으로부터 선택된 EGFR의 ECD 내에 적어도 하나의 검출되는 돌연변이를 갖는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암을 갖는 인간 환자를 치료하는 것을 포함하고, 방법은 환자에게 3종의 단클론성 항체를 포함하는 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 단클론성 항체는 P1X이고, 제2 단클론성 항체는 P2X이고, 제3 단클론성 항체는 P3X이고, 올리고클론성 항체 조합물은 P1X, P2X 및 P3X를 2:2:1의 몰비로 포함한다.
또 다른 양상에서, 방법은 EGFR의 ECD의 도메인 III 또는 도메인 IV 내에 검출되는 돌연변이를 갖는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암을 갖는 인간 환자를 치료하는 것을 포함하고, 방법은 환자에게 치료적 유효량의 MM-151 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 올리고클론성 항체 조합물은 2:2:1 몰비의 P1X 단클론성 항체, P2X 단클론성 항체, 및 P3X 단클론성 항체로 이루어진다.
또한, 인간 환자에서 EGFR 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암을 치료하는 데 있어서의 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물(예를 들어, MM-151)의 용도가 제공된다. 일 실시형태에서, 제1 단클론성 항체는 P1X이고, 제2 단클론성 항체는 P2X이고, 제3 단클론성 항체는 P3X이고, 올리고클론성 항체 조합물은 P1X, P2X 및 P3X를 2:2:1의 몰비로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 제1 단클론성 항체는 각각 서열번호 1, 2, 및 3의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 4, 5, 및 6의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고; 제2 단클론성 항체는 각각 서열번호 7, 8, 및 9의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 10, 11 및 12의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고; 제3 단클론성 항체는 각각 서열번호 13, 14, 및 15의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 16, 17, 및 18의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 제1 단클론성 항체는 각각 서열번호 1, 2, 및 3의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 4, 5, 및 6의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고; 제2 단클론성 항체는 각각 서열번호 7, 8, 및 9의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 10, 11 및 12의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고; 제3 단클론성 항체는 각각 서열번호 13, 14, 및 15의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 16, 17, 및 18의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간 환자에서 EGFR 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암의 치료에서의 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물(예를 들어, MM-151)의 사용은 상이한 항-EGFR 요법(예를 들어, 세툭시맙, 파니투무맙 또는 Sym004)으로 암을 치료한 단계 이후에 이어진다. 일 실시형태에서, 사용은 인간 환자에서 EGFR 세포외 도메인의 도메인 III 또는 도메인 IV 내에서 돌연변이를 검출한 단계 이후에 이어진다. 또 다른 실시형태에서, 사용은 인간 환자에서 EGFR의 ECD 영역 내에서 엑손 12 돌연변이를 검출한 단계 이후에 이어진다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내에 적어도 하나의 돌연변이가 존재하고, 이것은 EGFR R451C, S464L, K467T, G465R, G465E, I491M, 및 S492R로 이루어진 군으로부터 선택된, 단백질 서열 변화, 또는 단백질 서열 변화를 유발하는 DNA 또는 RNA 암호 영역이다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 인간으로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계, 및 혈액 샘플이 EGFR의 세포외 도메인을 암호화하는 서열 내에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 순환 DNA를 함유하는지를 결정하는 단계 후에 검출된다.
일 실시형태에서, 용도는 EGFR 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암, 예컨대 K-Ras, N-Ras, 및/또는 BRAF 야생형 전이성 결장직장암의 치료하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 돌연변이 암은 FDA-승인된 시험에 의해서 결정된 바와 같은 Ras 야생형, EGFR-발현 전이성 결장직장암이다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이 암은 두경부암(예를 들어, 두경부의 국소적으로 또는 국지적으로 진행된 편평 세포 암종)이다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이 암은 FDA-승인된 시험에 의해서 결정된 바와 같은 Ras-야생형, 전이성 결장직장암(mCRC)이다.
추가로, EGFR R451C, S464L, K467T, G465R, G465E, I491M, 및 S492R로 이루어진 군으로부터 선택된 EGFR의 ECD 내에 적어도 하나의 검출되는 돌연변이를 갖는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암의 치료에서의 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도가 제공되며, 여기서 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물은 3종의 단클론성 항체를 포함하고, 여기서 제1 단클론성 항체는 P1X이고, 제2 단클론성 항체는 P2X이고, 제3 단클론성 항체는 P3X이고, 올리고클론성 항체 조합물은 P1X, P2X 및 P3X를 2:2:1의 몰비로 포함한다.
도 1a 내지 도 1g는 EGF 리간드와 EGFR 돌연변이체 간의 상호작용을 나타낸 7개의 그래프. HEK 293 세포를 표시된 NanoLuc(등록상표)-EGFR 돌연변이체를 발현하는 플라스미드로 형질감염시키고, 이어서 과량의 표지되지 않은 EGF의 존재(원형 마커가 있는 연회색선) 또는 부재(삼각형 마커가 있는 흑색선)하에서 EGF 트레이서(HaloTag(등록상표)-EGF)의 증가하는 용량으로 처리하여 EGF 트레이서가 EGFR 야생형(도 1a), EGFR R451C(도 1b), S464L(도 1c), K467T(도 1d), G465R(도 1e), I491M(도 1f), 및 S492R(도 1g)을 비롯한, NanoLuc-EGFR에 효과적으로 결합할 수 있는지를 평가한다. 표지되지 않은 EGF의 증가하는 용량(사각형 마커가 있는 진회색선)을 검정 대조군으로서 사용하여 측정된 신호가 HaloTag(등록상표)-EGF에 상응하는 것을 예증한다.
도 2a 내지 도 2g는 MM-151이 약물 치환 검정법에서 모든 EGFR 엑토도메인 돌연변이체에 결합할 수 있음을 나타낸 7개의 그래프. HEK 293 세포를 야생형 EGFR(도 2a) 및 NanoLuc-EGFR 돌연변이체 EGFR R451C(도 2b), S464L(도 2c), K467T(도 2d), G465R(도 2e), I491M(도 2f), 및 S492R(도 2g)을 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 이어서, 돌연변이체를 항-EGFR 약물 세툭시맙("CMAB", 회색 삼각형), 파니투무맙("PMAB", 연회색 원) 또는 MM-151(흑색 원)의 증가하는 농도(0에서 100㎍/㎖) 및 HaloTag-EGF 트레이서(18ng/㎖의 농도에서)로 처리하였다.
도 3a 내지 도 3h는 EGFR 엑토도메인 돌연변이체를 과발현하고, 세툭시맙 또는 세툭시맙과 파니투무맙 둘 모두에 내성인 LIM1215 세포(인간 결장직장 암종)가 MM-151에 감응성인 것을 나타낸 8개의 그래프. LIM1215를 표시된 EGFR 엑토도메인 돌연변이체를 발현하는 렌티바이러스로 감염시키고, 선택된 세포를 세툭시맙("CMAB"; 삼각형 마커가 있는 진회색선), 파니투무맙("PMAB"; 원형 마커가 있는 연회색선) 및 MM-151(사각형 마커가 있는 흑색선)의 증가하는 농도로 6일 동안 처리하였다. 세포 생존력을 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다. 표시된 돌연변이체 및 대조군은 GFP 대조군(도 3a), EGFR 야생형(도 3b), EGFR R451C(도 3c), S464L(도 3d), K467T(도 3e), G465R(도 3f), I491M(도 3g), 및 S492R(도 3h)이다.
도 4a 내지 도 4h는 EGFR 엑토도메인 돌연변이체를 과발현하는 LIM1215 세포에서 EGFR 신호전달의 웨스턴 블롯 분석법의 일련의 영상이다. LIM1215 세포를 표시된 EGFR 엑토도메인 돌연변이체를 발현하는 렌티바이러스로 감염시켰다. 표시된 돌연변이체 및 대조군은 GFP 대조군(도 4a), EGFR 야생형(도 4b), EGFR R451C(도 4c), S464L(도 4d), K467T(도 4e), G465R(도 4f), I491M(도 4g), 및 S492R(도 4h이다). 선택된 세포를 세툭시맙("CETUX"), 파니투무맙("PMAB") 또는 MM-151의 존재하에서 2시간 동안 배양하고, 이어서 EGF(5ng/㎖)로 15분 동안 자극시켰다. 포스포릴화된 EGFR("pEGFR"), 전체 세포 EGFR("TOT EGFR"), 포스포릴화된 AKT("pAKT"), 전체 세포 AKT("TOT AKT"), 포스포릴화된 ERK("pERK"), 전체 세포 ERK("TOT ERK") 및 빈쿨린(패널 내에서 샘플에 걸쳐서 유사한 단백질 농도를 나타내도록 하기 위한 하우스킵핑 대조군)을 비롯한 표시된 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석법을 세포 용해물 상에서 수행하였다.
도 5a 내지 도 5e는 EGFR 엑토도메인 돌연변이의 발현을 통해서 세툭시맙에 대한 획득된 내성을 보유하는 LIM1215 세포(인간 결장직장 암종)가 MM-151에 감응성인 것을 나타낸 5개의 그래프. 획득된 내성은 3 내지 9개월 동안 반복된 세포 패시징을 통해서 1.4μM 세툭시맙에 연속적으로 노출시켜서 시험관내에서 생성되었다. 이어서, 서브-클로닝을 수행하여 EGFR 세포외 도메인에 대해서 돌연변이를 획득한 하위-집단을 단리하였다. 이어서, 세포를 세툭시맙("CETUX"), 파니투무맙("PMAB") 또는 MM-151의 존재하에서 6일 동안 배양하였다. 세포 생존력을 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다. 이 검정법에 대한 대조군은 모 세포주("LIM1215 WT"; 도 5a) 및 S492R 돌연변이체를 발현하도록 조작된 세포주("LIM1215 KI EGFR S492R"; 도 5e)이다. 나타낸 획득된 내성 세포주는 "R5" 집단(도 5b) 및 EGFR G465R 돌연변이를 보유하는 것으로서 식별된 서브-클로닝된 세포주(도 5d)이다. EGFR I491M 돌연변이를 보유하는 것으로서 식별된 "R1" 집단으로부터의 서브-클로닝된 세포주가 또한 도시되어 있다(도 5c).
도 6a 내지 도 6c는 EGFR 엑토도메인 돌연변이의 발현을 통해서 세툭시맙에 대해서 획득된 내성을 보유하는 LIM1215 세포(인간 결장직장 암종)가 MM-151에 감응성인 것을 나타낸 3개의 그래프. 획득된 내성은 3 내지 9개월 동안 반복된 세포 패시징을 통해서 1.4μM 세툭시맙에 연속적으로 노출시켜서 시험관내에서 생성되었다. 이어서, 서브-클로닝을 수행하여 EGFR 세포외 도메인에 대해서 돌연변이를 획득한 하위-집단을 단리하였다. 이어서, 세포를 세툭시맙("CETUX"), 파니투무맙("PMAB") 또는 MM-151의 존재하에서 6일 동안 배양하였다. 세포 생존력을 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다. 이 검정법에 대한 대조군은 모 세포주("OXCO2 WT"; 도 6a)이다. 나타낸 획득된 내성 세포주는 "R2" 집단(도 6b) 및 EGFR I491M과 NRAS G13D 돌연변이의 공동-발현을 보유하는 것으로 식별된 서브-클로닝된 세포주("OXCO2 R2 cl.88"; 도 6c)이다.
도 7a 내지 도 7d는 EGFR 엑토도메인 돌연변이의 발현을 통해서 세툭시맙에 대해서 획득된 내성을 보유하는 CCK81 및 HCA46 세포(인간 결장직장 암종)가 MM-151에 감응성인 것을 나타낸 4개의 그래프. 획득된 내성은 3 내지 9개월 동안 반복된 세포 패시징을 통해서 1.4μM 세툭시맙에 연속적으로 노출시켜서(HCA46) 또는 6개월 동안 680nM에서 1.4μM로의 세툭시맙에 단계적으로 노출시켜서(CCK81) 시험관내에서 생성되었다. 이어서 서브-클로닝을 수행하여 EGFR 세포외 도메인에 대해서 돌연변이를 획득한 하위-집단을 단리하였다. 이어서, 세포를 세툭시맙("CETUX"), 파니투무맙("PMAB") 또는 MM-151의 존재하에서 6일 동안 배양하였다. 세포 생존력을 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다. 이 검정법에 대한 대조군은 각각의 모 세포주 "CCK81 WT"(도 7a) 및 "HCA46 WT"(도 7c)이다. 각각 EGFR S464L 및 EGFR G465E 돌연변이를 보유하는, CCK81(도 7b) 및 HCA46(도 7d)의 획득된 내성 서브-클론 세포주가 나타나 있다.
도 8a 내지 도 8d는 EGFR 엑토도메인 돌연변이의 발현을 통해서 세툭시맙에 대해서 획득된 내성을 보유하는 LIM1215(도 8a), OXCO2(도 8b), CCK81(도 8c), 및 HCA46(도 8d) 세포 내의 EGFR 신호전달의 웨스턴 블롯 분석법의 일련의 영상. 획득된 내성은 3 내지 9개월 동안 반복된 세포 패시징을 통해서 1.4μM 세툭시맙에 연속적으로 노출시켜서(LIM1215, OXCO2, 및 HCA46) 또는 6개월 동안 680nM에서 1.4μM로의 세툭시맙에 단계적으로 노출시켜서(CCK81) 시험관내에서 생성되었다. 이어서 서브-클로닝을 수행하여 EGFR 세포외 도메인에 대해서 돌연변이를 획득한 하위-집단을 단리하였다. 선택된 세포를 세툭시맙("CETUX"), 파니투무맙("PMAB") 또는 MM-151의 존재하에서 2시간 동안 배양하고, 이어서 EGF(10ng/㎖)로 15분 동안 자극시켰다. 포스포릴화된 EGFR("pEGFR"), 전체 세포 EGFR("TOT EGFR"), 포스포릴화된 AKT("pAKT"), 전체 세포 AKT("TOT AKT"), 포스포릴화된 ERK("pERK"), 전체 세포 ERK("TOT ERK") 및 빈쿨린(패널 내에서 샘플에 걸쳐서 유사한 단백질 농도를 나타내도록 하기 위한 하우스킵핑 대조군)을 비롯한 표시된 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석법을 세포 용해물 상에서 수행하였다. LIM1215 세포주는 모 세포주("LIM1215 WT")를 나타내고, "R5"는 획득된 내성 집단을 나타내고, "CL55"는 EGFR G565R 돌연변이를 보유하는 "R5" 집단의 서브-클론을 나타내고, "CLONE4"는 EGFR I491M과 NRAS G12C 돌연변이의 공동-발현을 보유하는 "R1" 집단의 서브-클론을 나타내고, "LIM1215 KI" 세포주는 S492R 돌연변이를 발현하도록 조작된 것이었다. OXCO2 세포주는 모 세포주("OXCO2 WT")를 나타내고, "R2"는 획득된 내성 집단을 나타내고, "CL88"은 EGFR I491M과 NRAS G13D 돌연변이의 공동-발현을 보유하는 "R2" 집단의 서브-클론을 나타내고, "CL113"은 NRAS G13D 돌연변이의 발현을 보유하는 "R2" 집단의 서브-클론을 나타낸다. CCK81 세포주는 모 세포주("CCK81 WT")를 나타내고, "R1"의 서브-클론은 EGFR S464L 돌연변이의 발현을 보유하는 획득된 내성 집단을 나타낸다. HCA46 세포주는 모 세포주("HCA46 WT")를 나타내고, "R5"의 서브-클론은 EGFR G465E 돌연변이의 발현을 보유하는 집단을 나타낸다.
도 9a 내지 도 9c는 EGFR 엑토도메인 내에 G465E 돌연변이를 보유하는 임상 결장직장 종양 샘플("제노환자(xenopatient)")로부터 유래된 세포주가 MM-151에 감응성인 것을 나타낸 일련의 3개의 그래프. 서브-클로닝을 수행하여 G465E 돌연변이를 또한 보유하는 하위-집단을 단리하였다. 이어서, 세포를 세툭시맙("CETUX"), 파니투무맙("PMAB") 또는 MM-151의 존재하에서 6일 동안 배양하였다. 세포 생존력을 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다. 제노환자-유래된 세포주(도 9a) 및 2종의 서브-클로닝된 세포주(도 9b 및 도 9c)가 나타나 있다.
도 10a 내지 도 10c는 동일한 EGFR 분자를 동시에 개입하는 3종의 항체 조합물 내의 개별 항체의 능력을 나타낸 일련의 3개의 그래프. 바이오센서에 접합된 조합물 내의 하나의 항체를 사용하여 생물층 간섭 측정 검정법(bio-layer interferometry assay)(포르테바이오(등록상표))을 수행하고, 그 후에 재조합 EGFR 세포외 도메인 돌연변이체와 함께 인큐베이션시키고, 이어서 조합물 내의 남아있는 항체(들)와 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션의 순서는 각각의 도면 패널에 표시된 바와 같다. EGFR 세포외 도메인 돌연변이체 K467T, R451C, 및 S492R을 평가한다. 평가된 항체 조합물은 MM-151(도 10a), 3종의 항체의 조합물(25E+P2X+P3X; 도 10b), 및 2종의 항체의 조합물(Sym992 및 Sym1024; 도 10c)이다.
도 11a 내지 도 11B는 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 과발현하고, 대표 EGFR 리간드에 의해서 활성화되는 LIM1215 세포(인간 결장직장 암종)가 MM-151에 감응성인 것을 나타낸 일련의 2개의 그래프. LIM1215를 안정하게 혈질감염시켜서 S492R EGFR 엑토도메인 돌연변이체를 발현하였고, 선택된 세포를 재조합 인간 EGF 리간드 8nM의 존재하에서 세툭시맙("CMAB"; 삼각형 마커가 있는 진회색선), Sym992와 Sym1024 항체의 조합물("Sym004"; 원형 마커가 있는 연회색선) 및 MM-151(사각형 마커가 있는 흑색선)의 증가하는 농도로 3일 동안 처리하였다. 세포 생존력을 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다. 모 LIM1215 세포주(형질감염되지 않음; 야생형 EGFR 만을 발현함)(도 11a) 및 EGFR S492R 돌연변이를 과발현하는 형질감염된 LIM1215 세포주(도 11b)가 나타나 있다.
도 12a 내지 도 12c는 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 과발현하거나 또는 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현하도록 조작된 LIM1215 세포(인간 결장직장 암종)가 생체내 뮤린 이종이식 모델에서 MM-151에 감응성인 것을 나타낸 일련의 3개의 그래프. 4 내지 5주령이고, 체중이 16 ± 0.5g인 암컷 nu/nu 마우스(NU-Foxn1nu; 샤를스 리버 랩스(Charles River Labs))를 성장 인자-감소된 마트리겔(Matrigel)(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 함유하는 PBS 중의 LIM1215(#2), LIM1215(#2) EGFR S492R, 또는 LIM1215(#2) EGFR S492R KI 세포 현탁물 0.2㎖로 마우스 당 5x106세포의 밀도로 접종하였다. 종양이 부피 기준으로 대략 300㎣에 도달한 후, 마우스에 처리군(10마리 마우스/군)으로 무작위화하여 PBS, 12.5 또는 25㎎/㎏의 세툭시맙, 또는 MM-151 툴 화합물(25E, P2X, 및 P3X 항체로 이루어짐)을 제공하였다. 처리는 IP 주사에 의해서, 세툭시맙, 25E 및 P3X을 Q7D 스케줄(예를 들어 월요일)로, 그리고 P2x를 주 3x 스케줄(예를 들어, 월요일, 수요일 금요일)로 투여하였다. 12.5㎎/㎏의 세툭시맙 용량 수준에 동등한 조합물에 대한 합계 노출을 유발하도록 계산된 용량(25E 6.25㎎/㎏ Q7D; P2X 8.75㎎/㎏ 주 3x; P3X 3.125㎎/㎏ Q7D) 및 25㎎/㎏의 세툭시맙 용량 수준에 동등한 조합물에 대한 합계 노출을 유발하도록 계산된 용량(25E 12.5㎎/㎏ Q7D; P2X 17.5㎎/㎏ 주 3x; P3X 6.25㎎/㎏ Q7D)의 MM-151 툴 화합물을 투여하였다. 세툭시맙, 25E, 및 P3X를 제1 투여에 대해서 2x 로딩 용량으로 투여하고, 그 후 후속 투여에 대해서 표시된 용량 수준으로 용량을 유지시켰다. 종양 치수를 캘리퍼스에 의해서 매주 3회 측정하였고, 수학식 π/6 x L x W2(여기서, L 및 W는 각각 더 큰 종양 직경 및 더 작은 종양 직경을 나타냄)을 사용하여 종양 부피를 계산하였다.
도 13a 내지 도 13b는 초기 임상 시험(NCT #01520389)에서 MM-151로 치료된 2명의 인간 결장직장암 환자에서 EGFR ECD 돌연변이의 임상 반응 및 존재의 오버레이를 나타낸 일련의 2개의 그래프. MM-51을 투여하기 전에 표시된 날짜에 혈청 샘플을 취하고, EGFR ECD 돌연변이의 존재를 돌연변이-특이적인 프라이머를 사용한 드롭렛 디지털 PCR(드롭렛 디지털 PCR: ddPCR)에 의해서 검출하였다. 각각의 EGFR ECD 돌연변이의 대립유전자(allelic) 빈도는 표시된 돌연변이를 보유하는 혈청 샘플 중의 무-세포 DNA(cfDNA)의 백분율을 반영한다. 임상 반응은 고형 종양의 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors: RECIST) 1.1 가이드라인에 의해서 정의되고, 임상 반응은 표시된 방문일에 측정되었다(MM-151로의 치료 전의 기준선, MM-151로의 치료 과정 동안, 그리고 질환 진행 시 포함). 제1 환자(095)를 2014년 8월29일에 임상 시험에 등록하기 위해서 스크리닝하였고, 2014년 9월 23일에 처음 치료하였고, 2015년 1월 22일에 질환 진행이 평가될 때까지 치료하였다. 제2 환자(051)를 2013년 2월 25일에 임상 시험에 등록하게 의해서 스크리닝하였고, 2013년 3월 19일에 처음 치료하였고, 2013년 8월 28일에 질환 진행이 평가될 때까지 치료하였다.
도 14는 야생형 EGFR(LIM1215(#2))을 발현하거나 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이(LIM1215(#2) EGFR S492R KI)를 발현하도록 조작된 LIM1215 세포(인간 결장직장 암종) 상의 EGFR을 개입하는 개별 항체의 능력을 나타낸 그래프. 항체를 알렉사 프루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 488 염료로 표지하였고, 세포의 표면 상의 EGFR에 대한 결합을 유세포 분석법에 의해서 측정하였다. 평가된 항체는 세툭시맙("CMAB"), P1X, P2X, 및 P3X이다. 각각의 개별 항체에 대한 결과를 LIM1215(#2) 대조군 세포주에 대해서 관찰된 결합 값에 정규화한다.
도 15a 내지 도 15c는 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 과발현하거나 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현하도록 조작되고 대표 EGFR 리간드에 의해서 활성화되는 LIM1215 세포(인간 결장직장 암종)가 MM-151에 감응성인 것을 나타낸 일련의 3개의 그래프. LIM1215(#2) 세포를 S492R EGFR 엑토도메인 돌연변이체를 발현하도록 CRISPR/Cas9 표적화 게놈 에디팅 시스템을 통해서 조작된 것이었다. 세포를 8nM의 재조합 인간 EGF 리간드의 존재하에서 세툭시맙("CMAB"), 파니투무맙("PMAB"), Sym992와 Sym1024 항체의 조합물("Sym004") 및 MM-151로 3일 동안 처리하였다. 세포 생존력을 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다. 도 15a에 LIM1215(#2) 세포주(야생형 EGFR 만을 발현함), EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 조작된 LIM1215(#2) EGFR S492R KI 세포주, 및 GFR S492R 돌연변이를 과발현하는 형질감염된 LIM1215(#2) EGFR S492R 세포주가 나타나 있고, 각각은 각각의 저해제 1μM 농도로 처리되었다. 도 15b 및 도 15c에 각각 모 LIM1215(#2) 세포주 및 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 조작된 LIM1215(#2) EGFR S492R KI 세포주가 나타나 있고, 각각은 세툭시맙(삼각형 마커가 있는 진회색선), 파니투무맙(다이아몬드 마커가 있는 연회색선), Sym004(원 마커가 있는 회색선), 또는 MM-151(사각형 마커가 있는 흑색선)의 증가하는 농도로 처리되었다.
도 16a 내지 도 16b는 EGFR S492R 또는 G465R 엑토도메인 돌연변이를 발현하도록 조작된 LIM1215 세포(인간 결장직장 암종)가 세툭시맙으로의 치료 과정에 걸쳐서 확장되지만, MM-151에 감응성인 것을 나타낸 그래프. 2개의 LIM1215 세포주 풀을 사용하고 - 하나는 EGFR 야생형을 발현하는 세포와 EGFR S492R 돌연변이체를 발현하는 세포의 혼합물을 함유하고, 두번째 것은 EGFR 야생형을 발현하는 세포 및 EGFR G465R을 발현하는 세포를 함유한다. 이들 풀은 LIM1215(#2) EGFR S492R KI 및 LIM1215(#2) EGFR G465R KI 세포주를 조작하는 과정 동안 생성되었다. EGFR S492R 돌연변이체 풀에서 0일에 초기 대립유전자 빈도는 4.6%(야생형 EGFR에 대한 돌연변이체 EGFR S492R)인 것으로 측정되었고, EGFR G465R 돌연변이체 풀에서 0일에 초기 대립유전자 빈도는 0.6%였다. 세포를 제15일(S492R) 또는 7일(G465R)에 걸쳐서 세툭시맙("CMAB", 삼각형 마커가 있는 진회색선), MM-151(사각형 마커가 있는 흑색선) 또는 배지 단독(원 마커가 있는 연회색선)으로 처리하였고, EGFR 엑토도메인 돌연변이의 대립유전자 빈도를 4일, 10일, 및 15일(S492R) 또는 0일, 3일, 및 7일(G465R)에 수집된 게놈 DNA에서 측정하였다. 음성 대조군으로서, 야생형 EGFR을 발현하는 LIM1215(#2) 세포의 희석되지 않은 플레이트(점선)를 사용하여 실험을 수행하였고, 모든 처리 조건에 대해서 모든 시간 지점에서 0%의 대립유전자 빈도가 측정되었다.
도 17a 내지 도 17b는 인간 EGFR 유전자의 개략도 및 EGFR 엑토도메인 돌연변이의 표이다. 도 17a에는 7개의 구조 단백질 도메인, 28개의 DNA 암호 엑손, 및 각각의 단백질 도메인들 사이의 경계를 마킹하는 아미노산 서열을 주목하는 마킹을 갖는 인간 EGFR 유전자의 개략도가 도시되어 있다. 아미노산 1 내지 24를 포함하는 추정 신호 펩타이드는 도시되어 있지 않다. 다음 621개의 아미노산 및 제1 15 엑손(엑손 #15는 세포외 도메인 IV와 막관통 도메인에 걸쳐 있음)을 함께 포함하는 4개의 세포외 도메인(I, II, III, IV)이 존재한다. EGFR 엑토도메인 돌연변이는 엑손 12에서 식별되었고, 이것은 아미노산 433 내지 499를 암호화한다. 이러한 영역은 세포외 도메인 III의 말단 부분과 도메인 IV의 시작 부분에 걸쳐 있다. 도 17b에는 임상 및/또는 전임상 샘플에서 식별되고, 문헌에 공개된 EGFR 엑토도메인 돌연변이를 열거한 표가 나타나 있다. 돌연변이는 아미노산 변화, DNA 염기 변화, 및 DNA 코돈 변화에 의해서 식별된다.
도 18은 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 과발현하거나 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현하도록 조작되고 대표 EGFR 리간드에 의해서 활성화되는 LIM1215 세포(인간 결장직장 암종)가 MM-151에 감응성인 것을 나타낸 EGFR 신호전달의 웨스턴 블롯 분석법의 일련의 영상. 각각 야생형 EGFR의 발현, EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이의 조작된 발현, 또는 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이의 과발현을 보유한 LIM1215(#2), LIM1215(#2) EGFR S492R KI, 및 LIM1215(#2) EGFR S492R 세포가 도시되어 있다. 세포를 세툭시맙, Sym004, 또는 MM-151 100nM의 존재하에서 24시간 동안 배양하고, 이어서, AREG(8nM) 또는 EGF(8nM) 리간드로 10분 동안 자극시켰다. 대조군으로서, 세포를 처리하지 않고 두거나(약물 또는 리간드 없음) 또는 표시된 바와 같이 각각의 리간드 단독으로 처리하였다. 포스포릴화된 EGFR("pEGFR") 및 액틴(패널 내에서 샘플에 대해서 유사한 단백질 농도를 나타내도록 하기 위한 하우스킵핑 대조군)을 비롯한 표시된 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 세포 용해물 상에서 웨스턴 블롯 분석법을 수행하였다.
도 19a 내지 19c는 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 과발현하거나 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현하도록 조작되고 대표 EGFR 리간드에 의해서 활성화되는 LIM1215 세포(인간 결장직장 암종)가 MM-151에 감응성인 것을 나타낸 ERK 신호전달의 ELISA 분석법의 일련의 3개의 플롯. 각각 야생형 EGFR의 발현, EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이의 조작된 발현, 또는 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이의 과발현을 보유하는 LIM1215(#2), LIM1215(#2) EGFR S492R KI, 및 LIM1215(#2) EGFR S492R 세포가 도시되어 있다. 세포를 세툭시맙, Sym004, 또는 MM-151의 증가하는 농도(1000 내지 0.244nM의 1:4 계열 희석)로 2시간 동안 처리하고, 이어서 AREG(8nM) 또는 EGF(8nM) 리간드로 10분 동안 자극시켰다. 포스포릴화된 ERK 단백질을 ELISA에 의해서 측정하였다. 결과를 리간드(EGF 또는 AREG)에 의해서 리간드 자극 단독(약물 없음)을 갖는 대조군 샘플의 중간값으로 정규화하였다. 도 19a에는 약물의 증가하는 농도로의 처리 및 EGF 리간드로의 자극 이후에 정규화된 포스포-ERK 반응의 열지도 표현이 도시되어 있다. 도 19b 및 도 19c에는 250nM의 약물로의 처리 및 각각 EGF 또는 AREG로의 자극 후의 정규화된 포스포-ERK 반응의 막대 플롯이 도시되어 있다.
도 20a 내지 도 20i는 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 과별현하거나 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현하도록 조작되고 대표 EGFR 리간드에 의해서 활성화되는 LIM1215 세포(인간 결장직장 암종)가 MM-151에 감응성인 것을 나타낸 세포 성장률 분석법의 일련의 9개의 플롯. 각각 야생형 EGFR의 발현, EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이의 조작된 발현, 또는 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이의 과발현을 보유하는 LIM1215(#2), LIM1215(#2) EGFR S492R KI, 및 LIM1215(#2) EGFR S492R 세포가 도시되어 있다. 세포를 리간드 없이 또는 AREG(8nM) 또는 EGF(8nM)의 존재하에서 세툭시맙, 파니투무맙, Sym004, 또는 MM-151의 증가하는 농도(0.15 내지 1000nM)로 처리하였다. 세포 컨플루언시(confluency)를 라이브-셀 이미저(live-cell imager)에서 72시간의 기간에 걸쳐서 2시간 간격으로 측정하였다. 성장률을 각각의 처리 조건에 대해서 계산하였고, 결과를 각각의 세포주에 대해서 대조군 샘플(약물 없음)에 대해서 정규화하였다.
용어 "EGFR", 및 "EGF 수용체"는 인간 EGFR 단백질(ErbB1 또는 HER1이라고도 지칭됨)을 지칭하도록 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되고; UniProtKB/스위스-프로트(Swiss-Prot) 목록 P00533을 참고하기 바란다. EGFR 세포외 도메인, 또는 EGFR-ECD는 생체내에서 세포 표면을 지나서 연장된 EGFR 단백질의 부분이고, 따라서 세포의 외부 상의 항체에 접근 가능하다. 야생형 EGFR-ECD 단백질 서열은 서열번호 19에 기재되어 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "EGFR-ECD 돌연변이" 또는 "EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이"는 야생형 서열에 비교할 때 적어도 하나의 아미노산 잔기에서 차이를 갖는 EGFR-ECD 단백질 서열을 지칭할 수 있고; "EGFR-ECD 돌연변이"는 또한 EGFR의 세포외 도메인의 단백질 서열 내의 변화에 상응하는 DNA 또는 RNA 암호 서열의 부분에서의 변화를 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA 또는 RNA 암호 서열 내의 변화는 EGFR 유전자 또는 전사물의 엑손 12에서 발생한다. 다른 실시형태에서, EGFR-ECD 돌연변이는 EGFR의 세포외 도메인의 도메인 III에 상응하는 단백질 서열에서의 변화이다.
용어 "항체"는 항원 결합 부위(예를 들어, VH/VL 영역 또는 Fv, 또는 CDR)로부터 유래된 적어도 하나의 항체를 포함하는 폴리펩타이드를 기술한다. 항체는 공지된 형태의 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이성 항체, 또는 키메릭 항체일 수 있다. 항체는 또한 Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, 어피바디(Affibody)(등록상표), 나노바디(nanobody), 또는 도메인 항체일 수 있다. 항체는 또한 하기 아이소타입: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, 및 IgE 중 임의의 것일 수 있다. 항체는 자연 발생 항체일 수 있거나 또는 단백질 조작 기술에 의해서(예를 들어, 돌연변이, 결손, 치환, 비-항체 모이어티에 대한 접합에 의해서) 변화된 항체일 수 있다. 예를 들어, 항체는 (자연 발생 항체와 비교하여) 하나 이상의 변이체 아미노산을 포함할 수 있는데, 이것은 항체의 특성(예를 들어, 기능적 특성)을 변화시킨다. 예를 들어, 다수의 이러한 변경은 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 이것은 예를 들어, 환자에서 반감기, 효과기 기능 및/또는 항체에 대한 면역 반응에 영향을 미친다. 용어 항체는 또한 적어도 하나의 항체-유래된 항원 결합 부위를 포함하는 인공 또는 조작된 폴리펩타이드 작제물을 포함한다.
용어 "단클론성 항체"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 용어 "올리고클론성 항체 혼합물" 또는 "항체 혼합물"은 단일 조성물로 존재하는, 2종 이상의 항체, 예를 들어, 단클론성 항체의 조합물을 지칭한다. 특별한 실시형태에서, 올리고클론성 항체 혼합물 또는 항체 혼합물은 MM-151이다. 항체 혼합물의 또 다른 예는 Sym004(심포젠(Symphogen))이다.
본 명세서에 기술된 방법에서 사용되는, 본 명세서에 기술된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다양한 관련 기술 분야에서 인식되는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 단클론성 항체는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 친숙한 다양한 기술에 의해서 수득될 수 있다. 간략하면, 목적하는 항원으로 면역화된 동물로부터의 비장 세포를 일반적으로 골수종 세포를 사용한 주입에 의해서 불멸화시킨다(문헌[Kohler & Milstein, Eur. J. Imanol. 6: 511-519 (1976)] 참고). 불멸화의 대안적인 방법은 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus), 암유전자, 또는 레트로바이러스, 또는 관련 기술 분야에 널리 공지된 다른 방법을 사용한 형질전환을 포함한다. 단일 불멸화 세포로부터 발생한 집락을 항원에 대한 목적하는 특이성 및 친화성의 항체의 생산에 대해서 스크리닝하고, 이러한 세포에 의해서 생산된 단클론성 항체의 수율은 척추동물 숙주의 복막강 내에 주사하는 것을 비롯한, 다양한 기술에 의해서 향상될 수 있다. 대안적으로, 문헌[Huse, et al., Science 246: 1275-1281 (1989)]에 의해서 요약된 일반적인 프로토콜에 따라서 인간 B 세포로부터의 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 단클론성 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 DNA 서열을 단리할 수 있다.
용어 "저해"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 활성의 완전 차단을 비롯하여, 생물학적 활성의 임의의 통계학적으로 유의한 감소를 지칭한다. 예를 들어, "저해"는 생물학적 활성의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 약 100%의 통계학적으로 유의한 감소를 지칭할 수 있다.
포스포릴화의 저해는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항체의 부재(대조군)하에서의 신호전달에 비해서 기질 단백질의 포스포릴화를 통계학적으로 유의하게 감소시키는 항체의 능력을 지칭한다. 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 세포내 신호전달 경로는 예를 들어, 포스포이노시타이드 3'-카이나제/Akt (PI3K/Akt/PTEN 또는 "AKT") 및/또는 미토젠-활성화 단백질 카이나제(MAPK/ERK 또는 "ERK") 경로를 포함한다. 또한 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, EGFR 매개된 신호전달은 기질의 포스포릴화(예를 들어, AKT 및/또는 ERK의 포스포릴화 또는 비포스포릴화)의 수준을 검정함으로써 측정될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 항-EGFR 항체 조합물 및 조성물은 AKT 및 ERK 중 하나 또는 둘 모두의 포스포릴화의 수준을 이러한 항체의 부재(대조군)하에서의 AKT 및/또는 ERK의 포스포릴화의 수준과 비교하여 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 약 100%만큼으로 통계학적으로 유의하게 저해한다. 이러한 EGFR 매개된 신호전달은 EGFR에 관여된 세포 케스케이드에서 단백질을 측정하는 관련 기술 분야에서 인식되는 기술, 예를 들어, ELISA, 웨스턴, 또는 멀티플렉스 방법, 예컨대 루미넥스(Luminex)(등록상표)를 사용하여 측정될 수 있다. 구 "EGFR 하류 신호전달의 저해"는 예를 들어, AKT 및/또는 ERK의 포스포릴화의 양의 감소에 의해서 측정되는 바와 같은, EGF 수용체로부터의 신호전달의 수준을 감소시키는 항체 또는 항체 혼합물의 능력을 지칭한다.
구 "세포 성장의 저해"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 생체내 또는 시험관내 항체의 부재(대조군)하에서의 세포 또는 세포들의 성장에 비해서 EGFR을 발현하는 세포 또는 세포들의 성장을 통계학적으로 유의하게 감소시키는 항체 또는 항체 혼합물의 능력을 지칭한다. 일 실시형태에서, EGFR을 발현하는 세포(예를 들면, 암 세포)의 성장은, 세포가 본 명세서에 개시된 조합물의 항체 조성물과 접촉할 때, 조합물의 항체 조성물의 부재(대조군)하에 측정된 성장에 비해서, 또는 세포가 단클론성 항체의 단일 종과 접촉할 때에 비해서, 적어도 10% 또는 적어도 20% 또는 적어도 30% 또는 적어도 40% 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 약 100% 감소될 수 있다. 세포 성장은 세포 분열 속도, 세포 분열을 겪는 세포 집단 내의 세포 분율 및/또는 종말 분화 또는 세포사로 인한 세포 집단으로부터의 세포 손실 속도를 측정하는 관련 기술 분야에서 인식되는 기술(예를 들어, 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)(등록상표) 또는 유사한 검정법 사용)을 사용하여 검정될 수 있다.
용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 명세서에 기술된 치료적 또는 예방적 조치를 지칭한다. "치료" 방법은 질환 또는 장애 또는 재발 질환 또는 장애를 예방하거나, 치유하거나, 지연시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 이의 하나 이상의 증상을 경감시키기 위해서, 또는 대상체의 생존을 이러한 치료의 부재하에서 예상되는 것보다 연장시키기 위해서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 항체 쌍 또는 3중물을 대상체, 예를 들어 EGFR 의존성 신호전달과 연관된 장애를 갖거나 또는 이러한 질환 또는 장애에 취약한 대상체에게 투여하는 것을 이용한다.
용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 치료 중 하나를 제공받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
용어 "샘플"은 환자로부터 얻은 조직, 체액 또는 세포(또는 상기 중 임의의 것의 분획)를 지칭한다. 보통, 조직 또는 세포는 환자로부터 제거될 것이지만, 생체내 진단이 또한 고려된다. 고형 종양의 경우, 조직 샘플을 수술로 제거된 종양으로부터 얻고, 통상의 기술에 의해서 시험을 위해 제조할 수 있다. 림프종 및 백혈병의 경우, 림프구, 백혈병 세포 또는 림프 조직을 얻고(예를 들어, 혈액으로부터의 백혈병 세포), 적절히 제조한다. 소변, 눈물, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 대변, 가래, 세포 추출물, 악성 흉수 등을 비롯한 다른 샘플이 특정 암에 또한 유용할 수 있다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 사용되는 임의의 생검 기술이 대상체로부터 샘플을 단리하기 위해서 사용될 수 있다. 생검은 일반적인 마취가 사용되는 개방 생검, 또는 개방 생검에서보다 더 작은 절편이 취해지는 폐쇄 생검일 수 있다. 생검은 조직의 부분이 제거되는 조직 생검(core biopsy) 또는 절개 생검(incisional biopsy); 전체 병변을 제거하려는 시도로 진행되는 절제 생검(excisional biopsy); 또는 조직 또는 유체의 샘플이 바늘로 제거되는 바늘 흡인 생검(경피) 생검(미세 바늘 흡인 생검)을 포함할 수 있다. 바늘은 얇은 중공 바늘일 수 있고, 그것은 덩어리에 삽입되어 덩어리로부터 세포를 추출할 수 있다. 일 실시형태에서, 샘플은 조직 샘플, 예를 들어, 수술 절제 또는 임의의 유형의 생검(예를 들어, 중심 바늘 생검, 미세 바늘 흡인(FNA) 생검 등)에 의해서 수득된 조직 샘플이다. 또 다른 실시형태에서, 샘플은 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 또는 전체 혈액 샘플)이거나 또는 소변 샘플이다.
생검물은 가공될 수 있다. 예를 들어, 생검물은 조직을 포르말린-고정 및 파라핀-내장(FFPE)시킴으로써 보존될 수 있다. 생검물은 더 작은 조각으로 가공될 수 있다. 생검물은 RNA를 보존하도록 처리될 수 있다. 생검물은 젖은 얼음(대략 4℃), 실온(대략 25℃) 상에서 저장될 수 있거나, 대략 -20℃, 또는 대략 -80℃에서 저장될 수 있고, 예를 들어 드라이아이스 상에서 저장될 수 있거나, 또는 액체 질소 또는 드라이아이스/알코올 슬러리에서 동결될 수 있다. 조직은 수술 절제 0.5, 1, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 또는 240분 내에 동결될 수 있다. 생검 조직 상에서 사용될 수 있는 고정화제는 예를 들어, 메탄올-아세톤, 카노이 픽사티브(Carnoy's fixative)(60% 에탄올, 30% 클로로폼, 10% 빙초산), 보우인 픽사티브(Bouin's fixative), 에탄올, 아세톤, 포르말린, 메타카른(카노이에서 에탄올을 60% 메탄올로 치환), UMFIX(만능 분자 픽사티브), 옴니픽스(Omnifix), 및 파인픽스(FINEfix)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항신생물제" 또는 "항암제"는 인간에서 신생물, 특히 악성(암성) 병변, 예컨대 암종, 육종, 림프종, 또는 백혈병의 발생 또는 진행을 저해하는 기능적인 특성을 갖는 작용제를 지칭한다. 전이의 저해가 빈번하게 항신생물제의 특성이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "Ras-야생형"은 K-Ras 또는 N-Ras의 엑손 2(코돈 12 및 13), 엑손 3(코돈 59 및 61), 및 엑손 4(코돈 117 및 146) 내에 체세포 돌연변이를 보유하지 않는 암을 지칭하고, 이하에서 "Ras"라 칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "BRAF 야생형"은 코돈 600(예를 들어, V600E) 내에 체세포 돌연변이를 보유하지 않는 암을 칭한다.
I. 항- EGFR 항체
본 명세서에서 사용하기에 적합한 항-EGFR 항체(또는 이로부터 유래된 VH/VL 도메인)의 조성물은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 관련 기술 분야에서 인식되는 항-EGFR 항체, 예컨대 Sym-004(심포젠), 세툭시맙, 파니투무맙 및 니모투주맙을 포함하는 조성물이 사용될 수 있다. 다른 약제학적 항-EGFR 항체는 잘루투무맙, 및 마투주맙을 포함하는데, 이들은 개발 중이다. 추가로, 사용될 수 있는 항-EGFR 올리고클론성 항체 조성물은 PCT 국제 공개 제WO/2011/140254호 및 상응하는 계류중인 미국 특허 제9,044,460호, 및 계류중인 미국 특허 제9,226,964호 및 제7,887,805호("Oligoclonal Applications")에 기술되어 있고, 뿐만 아니라 다른 항-EGFR 항체와 조합된 이러한 항체의 올리고클론성 혼합물이 암, 예를 들어, 악성(신생물) 종양의 치료에 유용하다. EGFR에 대한 결합을 위해서 이들 관련 기술 분야에서 인식되는 항체 중 임의의 것과 경쟁하는 항체가 또한 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 항-EGFR 항체의 예시적인 조성물은 "MM-151"이다. MM-151은 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하여 이의 신호전달을 저해하도록 설계된 3종의 완전 인간 단클론성 항체의 혼합물로 이루어진 올리고클론성 치료제이다. MM-151은 3종의 독립적인 항체의 혼합물(P1X + P2X + P3X)인데, 이들은 EGFR 상의 3개의 겹치지 않는 부위에 대해서 리간드-의존성 및 독립성 신호전달의 저해를 최대화한다(예를 들어, 교시가 본 명세서에 참고로 명확히 포함된 국제 특허 제WO 2013/006547호 참고). P1X, P2X 및 P3X 단클론성 항체는 교시가 본 명세서에 참고로 명확히 포함된 국제 특허 제WO 2011/140254호에 개시된, 각각 as ca, cd 및 ch라 지칭되는 모 항체의 친화성 성숙 항체이다. P1X, P2X 및 P3X의 CDR 아미노산 서열은 표 1에 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00001
P1X에 대한 전장 VH 및 VL 아미노 서열은 각각 서열번호 19 및 서열번호 20에 제시되어 있다. P2X에 대한 전장 VH 및 VL 아미노 서열은 각각 서열번호 21 및 서열번호 22에 제시되어 있다. P3X에 대한 전장 VH 및 VL 아미노 서열은 각각 서열번호 23 및 서열번호 24에 제시되어 있다. 추가로, 본 명세서에 나타내어진 바와 같은 VH 및 VL CDR 분절은 예를 들어, CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노에서 카복시 말단 순서로 배열된다.
일 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 조성물은 (1) 각각 서열번호 1, 2, 및 3의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 4, 5, 및 6의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 단클론성 항체; (2) 각각 서열번호 7, 8, 및 9의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 10, 11, 및 12의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 단클론성 항체; 및 (3) 각각 서열번호 13, 14, 및 15의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 16, 17, 및 18의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 단클론성 항체를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 조성물은 (1) 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체; (2) 서열번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체 및 (3) 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 조성물은 (1) 서열번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체; (2) 서열번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체; 및 (3) 서열번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 조성물은 (1) 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체; (2) 서열번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체; 및 (3) 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체를 포함한다.
다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체 (1), (2), 및 (3)은 서로에 대해서 2:2:1의 몰비로 조성물 중에 존재한다.
항-EGFR 항체는 단독으로 올리고클론성 항체와 함께 또는 상승작용적으로 작용하는 또 다른 치료제와 함께 투여되어 EGFR-매개된 신호전달과 연관된 질환을 치료할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료 방법은 항-EGFR 항체를 1종 이상의 다른 항신생물제(예를 들어, 다른 화학치료제 또는 다른 소분자 약물)과 조합하여 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 3종 이하의 다른 항신생물제가 치료 사이클 내에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 2종 이하 다른 항신생물제가 치료 사이클 내에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 1종 이하의 다른 항신생물제가 치료 사이클 내에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 다른 어떤 항신생물제도 치료 사이클 내에 투여되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 보조(adjunctive) 또는 조합 투여(공동투여)는 항-EGFR 항체 및 1종 이상의 항신생물제를 동일한 투여형 또는 상이한 투여형으로 동시에 투여하는 것, 또는 항-EGFR 항체 및 1종 이상의 항신생물제를 별개로 투여하는 것(예를 들어, 순차적인 투여)을 포함한다. 이러한 동시 투여 또는 순차적인 투여는 바람직하게는 항-EGFR 항체 및 1종 이상의 작용제가 치료되는 환자 중에 동시에 존재하게 한다.
II. 치료 방법
본 명세서에는 인간 환자에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 암은 피부, 중추 신경계, 두부, 목, 식도, 위, 결장, 직장, 항문, 간, 췌장, 담관, 담낭, 폐, 유방, 난소, 자궁, 자궁 경부, 질, 고환, 생식 세포, 전립샘, 신장, 요관, 방광, 부신, 뇌하수체, 갑상샘, 뼈, 근육 또는 결합 조직의 종양이다. 또 다른 실시형태에서, 암은 결장직장암, 전이성 결장직장암, 비-소 세포 폐암, 편평 세포 두경부암, 또는 재발성 또는 전이성 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 환자는 K-Ras 야생형 전이성 결장직장암으로 진단되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 암은 EGFR 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암, 예컨대 K-Ras, N-Ras, 및/또는 BRAF 야생형 전이성 결장직장암이다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이 암은 FDA-승인된 시험에 의해서 결정된 바와 같은 K-Ras 야생형, EGFR-발현 전이성 결장직장암이다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이 암은 두경부암(예를 들어, 두경부의 국소적으로 또는 국지적으로 진행된 편평 세포 암종)이다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이 암은 FDA-승인된 시험에 의해서 결정된 바와 같은 Ras-야생형 야생형 KRAS(엑손 2) 전이성 결장직장암(mCRC)이다.
또 다른 실시형태에서, 종양은 FDA-승인된 시험을 기초로 EGFR 세포외 도메인 내에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하는 세포를 포함하는 것으로 결정된다. 또 다른 실시형태에서, 암은 EGFR 세포외 도메인의 도메인 III 또는 도메인 IV 내에 돌연변이를 보유하는 세포를 포함하는 종양이다. 또 다른 실시형태에서, 암은 EGFR 유전자의 엑손 12 내에 돌연변이를 보유하는 세포를 함유하는 종양이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이는 EGFR R451C, S464L, K467T, G465R, G465E, I491M, 및 S492R로 이루어진 군으로부터 선택된, 단백질 서열 변화, 또는 단백질 서열 변화를 유발하는 DNA 또는 RNA 암호 영역이다. 일 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27(EGFR의 세포외 도메인에 상응하는 서열)의 위치 451에서의 아르기닌에서 시스테인으로이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27의 위치 464에서의 세린에서 루신으로이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27의 위치 467에서의 라이신에서 트레오닌으로이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27의 위치 465에서의 글리신에서 아르기닌으로이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27의 위치 465에서의 글리신에서 글루타메이트로이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27의 위치 491에서의 아이소루신에서 메티오닌으로이다. 또 다른 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 돌연변이는 서열번호 27의 위치 492에서의 세린에서 아르기닌으로이다.
일 양상에서, EGFR 세포외 도메인 내에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하는 세포를 포함하는 종양을 갖는 환자의 치료 방법이 제공되며, 방법은 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 EGFR 세포외 도메인에 결합하는 단클론성 항체 혼합물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 방법은 환자에게 본 명세서에 기술된 바와 같이, EGFR 세포외 도메인에 결합하는 항-EGFR 항체의 올리고클론성 혼합물을 단일 조성물로 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 방법은 EGFR 세포외 도메인에 결합하는 1종 이상의 단클론성 항체(예를 들어, 세툭시맙 또는 파니투무맙)에 불치성으로 진행되거나 불치성이 된 환자를 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 환자는 항신생물제로의 이전 치료 이후에 항신생물 요법에 불치성으로 진행되거나 불치성이 되었다. 또 다른 실시형태에서, 환자는 항신생물제로의 이전 치료 이후에 항신생물 요법에 내성이 되었다. 또 다른 실시형태에서, 환자는 항신생물제로의 이전 치료 이후의 질환 진행 또는 재발 이후에 치료된다. 또 다른 실시형태에서, 환자는 항신생물제로의 치료에 실패한 후에 치료된다. 또 다른 실시형태에서, 암은 항신생물제에 내성을 획득한 암인 것으로 식별된다.
또 다른 양상에서, 방법은 플루오로피리미딘-함유 치료법, 옥살리플라틴-함유 치료법, 또는 이리노테칸-함유 치료법 수행 시에 또는 그 이후에 질환 진행을 갖는 환자를 치료하는 것을 포함한다.
또 다른 양상에서, 방법은 환자에게 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물(예를 들어, MM-151)을 투여함으로써 인간 환자에서 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암을 치료하는 것을 포함한다.
또 다른 양상에서, 방법은 (a) 환자에서(예를 들어, 환자의 혈액에서) EGFR의 ECD의 엑손 12 내에서 돌연변이를 검출하는 단계; 및 이어서 (b) 환자에게 치료적 유효량의 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물(예를 들어, MM-151)을 투여하는 단계에 의해서 인간 환자에서 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암을 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 양상에서, 방법은 (a) (예를 들어, 환자의 혈액에서) EGFR 세포외 도메인의 도메인 III 또는 도메인 IV 내에서 돌연변이를 검출하는 단계; 및 이어서 (b) 환자에게 치료적 유효량의 MM-151 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물(예를 들어, MM-151)을 투여하는 단계에 의해서, 인간 환자에서 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암을 치료하는 것을 포함하며, 여기서 암은 두경부암 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 양상에서, 방법은 EGFR의 ECD의 도메인 III 또는 도메인 IV 내에 검출되는 돌연변이를 갖는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암을 갖는 인간 환자를 치료하는 것을 포함하며, 방법은 환자에게 치료적 유효량의 MM-151 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 올리고클론성 항체 조합물은 2:2:1 몰비의 P1X 단클론성 항체, P2X 단클론성 항체, 및 P3X 단클론성 항체로 이루어진다.
추가 양상에서, 방법은 EGFR R451C, S464L, K467T, G465R, G465E, I491M, 및 S492R로 이루어진 군으로부터 선택된 EGFR의 ECD 내에 적어도 하나의 검출되는 돌연변이를 갖는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암을 갖는 인간 환자를 치료하는 것을 포함하며, 방법은 환자에게 3종의 단클론성 항체를 포함하는 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 단클론성 항체는 P1X이고, 제2 단클론성 항체는 P2X이고, 제3 단클론성 항체는 P3X이고, 올리고클론성 항체 조합물은 P1X, P2X 및 P3X를 2:2:1의 몰비로 포함한다.
추가 양상에서, 방법은 환자에게 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물(예를 들어, MM-151)을 투여함으로써 인간 환자에서 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암의 출현을 예방하거나 이의 성장을 저해하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물은 이전 항-EGFR 요법(예를 들어, 세툭시맙, 파니투무맙, 또는 Sym004으로의 치료)이 제공되지 않은 환자에게 투여된다. 일 실시형태에서, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물은 이전 항-EGFR 요법(예를 들어, 세툭시맙, 파니투무맙, 또는 Sym004로의 치료)이 제공되었던 환자에게 투여된다. 일 실시형태에서, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물은 EGFR ECD 돌연변이를 검출한 직후에(예를 들어, 검출 후 수 시간 또는 수 일 내에) 투여된다.
EGFR 돌연변이의 존재는 공지된 기술을 사용하여 임의의 적합한 생물학적 샘플(예를 들어, 조직, 혈액, 소변 등)에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, EGFR 돌연변이는 대립유전자-특이적인 프라이머를 사용한 실시간 PCR, 대립유전자-특이적인 태크만(TaqMan) 프로브를 사용한 실시간 PCR, 정량 서열분석(PCR-기반 서열분석), 드롭렛 디지털 PCR(ddPCR), BEAMing 디지털 PCR 및 더 낮은 변성 온도에서의 개선 및 완전 풍부 CO-증폭(improved and complet enrichment CO-amplification at lower denaturation temperature:ICE COLD)-PCR을 비롯한, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)-기반 방법을 사용하여 검출된다. 또 다른 실시형태에서, EGFR 돌연변이는 예를 들어, 조지 에스 라이스-필로(orge S Reis-Filho)(Breast Cancer Research, 2009, 11(Suppl 3):S12)에 의해서 기술된 바와 같은, 차세대 서열분석(NGS)을 사용하여 검출된다. NGS("고-처리율 서열분석" 또는 "대량 병렬 서열분석"으로서도 공지됨)는 일루미나(Illumina)(솔렉사(Solexa)) 서열분석, 로슈(Roche) 454 서열분석, 이온 토런트(Ion torrent): 프로톤 / PGM 서열분석, 및 SOLiD 서열분석을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 상이한 최신 서열분석 기술을 기술하는 데 사용되는 용어이다. EGFR 돌연변이를 분석하기 위한 다른 플랫폼은 예를 들어, 생거 서열분석(Sanger Sequencing), 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 어레이, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 질량-분석법, FISH 등을 포함한다. EGFR ECD 도메인 돌연변이를 측정하기 위한 예시적인 검정법은 파운데이션원(FoundationOne)(파운데이션 메디슨(Foundation Medicine), NGS), 온코빔(OncoBEAM)(시스멕스 이노스틱스(Sysmex Inostics), PCR), 가든트(Guardant)360(가든트 헬쓰(Guardant Health), NGS), 트로바젠스 프리시젼 캔서 모니터링(Trovagene Precision Cancer Monitoring)(PCM)(트로바젠스(Trovagene), PCR), MX-ICP EGFR 엑손 12(S492R)(트랜스게놈(Transgenome), PCR), 및 옴니세크 콤프리헨시브 패널(OmniSeq Comprehensive Panel)(옴니세크 엘엘씨(Omniseq LLC), NGS)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
EGFR 돌연변이(예를 들어, EGFR 엑손 12 내의 돌연변이)의 존재 또는 부재를 결정하는 것은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 시험은 생물학적 샘플로부터 수집된 DNA 또는 RNA를 사용하여 일반적으로 수행된다. 일 실시형태에서, 이러한 돌연변이를 검출하기 위한 검정법은 임의의 적합한 프로토콜 및/또는 표준 제조 지시서에 따라서 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, EGFR 엑손 12 내의 돌연변이를 검출하기 위한 NGS-기반 방법은 엑손 12의 풀 커버리지(full coverage)를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, PCR-기반 방법은 엑손 12 내의 모든 코돈을 위한 코돈-특이적인 검정법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 다른 방법이 엑손 12를 평가하기 위해서 사용된다. 검정법이 엑손 12의 전부를 포함하지 않는 특별한 실시형태에서, 검정법은 바람직하게는 적어도 모든 공지된 엑손 12 돌연변이를 평가한다. 그러나, 돌연변이의 하위세트 만을 평가하는 제한된 검정법이 돌연변이를 식별할 수 있는 경우, 그것이 EGFR-ECD 돌연변이 양성성을 결정하기에 충분하다. 검정법 감도와 관련하여, EGFR-ECD 돌연변이 상태는 검정법의 검출의 한계치를 초과하는 돌연변이의 존재에 의해서 결정된다. 검출의 한계치(즉, EGFR 돌연변이의 최소 수준)보다 높은 차단점(역치)를 사용하는 것은 필요하지 않다. EGFR-ECD 대립유전자 빈도(% 돌연변이체 DNA 대 야생형 DNA의 측정치)에 대한 공개된 보고서는 0.1%만큼 낮은 수준인 것을 나타낸다. 일 실시형태에서, 적합한 검정법은 잠재적인 거짓 음성성을 예방하기 위해서 1% 미만(바람직하게는, 더 낮음)의 검출 한계치를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 검정법은 의료 실험 관리 법령(Clinical Laboratory Improvement Amendments: CLIA)에 의해서 보증될 수 있다(즉, CLIA 보증된 검정법).
치료 결과는 종양 반응에 대한 표준 측정법을 사용하여 평가될 수 있다. 요법에 대한 표적 병변(종양) 반응은 하기와 같이 분류된다:
완전 반응( CR ): 모든 표적 병변의 소실. 임의의 병리학적 림프절(표적이든 비-표적이든)은 단축에서 10mm 미만으로의 감소를 가져야 함;
부분적 반응(PR): 기준선 합계 직경을 참고로 하여, 표적 병변의 직경의 합계의 적어도 30％ 감소;
진행성 질환(PD): 연구 중의 최소 합계(이는 그것이 연구 중의 최소일 경우 기준선 합계를 포함함)를 참고로 하여, 표적 병변의 직경의 합계의 적어도 20％ 증가. 20％의 상대적 증가 이외에, 합계는 또한 적어도 5mm의 절대적 증가를 입증해야 함(주석: 하나 이상의 새로운 병변의 출현이 또한 진행으로 고려됨); 및
안정한 질환(SD): 연구 중인 동안 최소 합계 직경을 참고로 하여, PR로 적격화하기 위한 충분한 수축 또는 PD로 적격화하기 위한 충분한 증가가 없음(주석: 직경의 합계를 5mm 이상 증가시키지 않는 20％ 이하의 변화는 안정 질환으로서 암호화됨). 안정한 질환의 상태로 할당되기 위해서, 측정은 연구 참가 후 6주의 최소 간격으로 적어도 1회 안정한 질환 기준을 충족했어야 함.
요법에 대한 비-표적 병변 반응은 하기와 같이 분류된다:
완전 반응 ( CR ): 모든 비-표적 병변의 소실 및 종양 마커 수준의 정규화. 모든 림프절은 크기에 있어서 비-병리학적이어야 함(단축에서 <10mm). 종양 마커가 초기에 정상 상한을 초과하면, 이것은 완전 임상 반응인 것으로 간주될 환자에 대해서 정규화되어야 함;
비- CR /비-PD: 하나 이상의 비-표적 병변(들)의 지속 및/또는 정상 한계치를 초과하는 종양 마커 수준의 유지; 및
진행성 질환 (PD): 하나 이상의 새로운 병변의 출현 및 기존의 비-표적 병변의 명백한 진행 중 하나 또는 그들 둘 모두. 이러한 맥락에서, 명백한 진행은 단일 병변 증가가 아닌, 전체 질환 상태 변화를 나타내어야 한다.
본 명세서에서 개시된 방법에 따라서 치료된 환자는 바람직하게는 암의 적어도 하나의 징후에서 개선을 경험한다. 예를 들어, 치료는 종양 크기 감소, 전이 감소, 완전 차도, 부분적 차도, 안정한 질환, 모든 반응 속도의 증가, 또는 병리학적 완전 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치료 효과를 생성할 수 있다. 반응은 또한 측정가능한 종양 병변의 양 및/또는 크기의 감소에 의해서 측정될 수 있다. 측정 가능한 병변은 CT 스캔에 의한 10mm 초과(5mm 이하의 CT 스캔 절편 두께), 임상 실험에 의한 10mm 캘리퍼스 측정치 또는 흉부 X-선에 의한 20mm 초과로서 적어도 하나의 치수(최장 직경이 기록되어야 함)로 정확하게 측정될 수 있는 것으로서 정의된다. 비-표적 병변, 예를 들어, 병리학적 림프절의 크기가 또한 개선에 대해서 측정될 수 있다. 병변은 예를 들어, x-선, CT 또는 MRI 영상을 사용하여 측정될 수 있다. 현미경, 세포학 또는 조직학이 또한 요법에 대한 반응성을 평가하기 위해서 사용될 수 있다. 측정 가능한 종양이 반응 또는 안정한 질환에 대한 기준을 달리 충족시킨 경우 치료 동안 나타나거나 악화되는 삼출은 종양 진행을 나타내는 것으로 간주될 수 있지만, 삼출의 신생물 기원의 세포학적 확인이 존재하는 경우에만 그러할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 이렇게 치료된 환자는 종양 수축 및/또는 성장률의 감소, 즉 종양 성장의 억제를 경험한다. 또 다른 실시형태에서, 종양 세포 증식은 감소 또는 저해된다. 대안적으로, 하기 중 하나 이상이 치료에 대한 이로운 반응을 나타낼 수 있다: 암 세포의 수가 감소될 수 있음; 종양 크기가 감소될 수 있음; 주변 기관으로의 암 세포 침투가 저해, 지연, 둔화 또는 정지될 수 있음; 종양 전이가 둔화 또는 저해될 수 있음; 종양 성장이 저해될 수 있음; 종양의 재발이 예방 또는 지연될 수 있음; 암과 연관된 증상 중 하나 이상이 어느 정도 완화될 수 있음. 바람직한 반응의 다른 표시는 측정 가능한 종양 병변 또는 비-표적 병변의 양 및/또는 크기의 감소를 포함한다.
III. 선택 방법
또한, 본 명세서에는 EGFR을 발현하는 종양을 갖는 환자를 위해서 치료를 선택하는 방법이 제공되며, 여기서 환자는 항체 기반 항-EGFR 요법에 불치성이다.
일 실시형태에서, 방법은 a) 종양으로부터의 세포가 EGFR의 세포외 도메인 내에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하는지의 여부를 결정하는 단계; 및 b) 그러하면, 본 명세서에 기술된 항-EGFR 항체 조성물을 포함하는 치료를 선택하는 단계를 포함한다. 추가 실시형태에서, 방법은 종양의 생검 샘플을 수득하는 단계, 및 종양이 EGFR의 세포외 도메인에 대한 DNA 또는 RNA 암호 내에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는지의 여부를 중합효소 연쇄 반응 또는 차세대 서열분석(NGS)을 사용하여 결정하는 단계를 포함한다. 추가 실시형태에서, 방법은 종양의 생검 샘플을 수득하는 단계, 및 종양이 EGFR의 세포외 도메인 내에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는지의 여부를 (면역조직화학 또는 질량 분석법을 통해서) 결정하는 단계를 포함한다. 추가 실시형태에서, 방법은 환자로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계, 및 혈액 샘플이 EGFR의 세포외 도메인을 암호화하는 서열 내에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 순환 DNA(예를 들어, 혈액 샘플로부터 단리된 무-세포 DNA 또는 혈액 샘플 중의 순환 종양 세포로부터 단래된 DNA)를 함유하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 추가 실시형태에서, 생검 종양 세포, 순환 종양 세포, 또는 무-세포 DNA는 EGFR의 세포외 도메인에 대한 DNA 또는 RNA 암호 내에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하고, 적어도 하나의 돌연변이는 EGFR 유전자의 엑손 12에 존재한다. 추가 실시형태에서, EGFR의 세포외 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이는 EGFR R451C, S464L, K467T, G465R, I491M, 및 S492R로 본질적으로 이루어진 군으로부터 선택된, 단백질 서열 변화, 또는 단백질 서열 변화를 유발하는 DNA 또는 RNA 암호 영역이다. 추가 실시형태에서, 종양은 FDA-승인된 시험에 의해서 검출되는 바와 같은 EGFR 세포외 도메인 내에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하는 세포를 포함하는 것으로 결정된다.
IV. 예측 방법
또한, 본 명세서에는 올리고클론성 항체 혼합물이 항-EGFR 항체의 단일 종 만을 포함하는 1종 이상의 단클론성 항-EGFR 항체 제제로의 치료에 불치성인 암을 갖는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있는지의 여부를 결정하는 방법이 제공된다. 암의 치료를 위한 올리고클론성 항-EGFR 항체의 용도가 기술되어 있고, 여기서 암은 EGFR을 발현하고, EGFR은 세포외 도메인 내에 적어도 하나의 돌변변이를 갖는 것으로 결정된다.
일 실시형태에서, 종양(예를 들어, 악성 종양)은 단일 단클론성 항-EGFR 항체(예를 들어, 세툭시맙, 파니투무맙)의 치료에 반응성이 아니지만, 올리고클론성 항-EGFR 항체로의 치료에는 반응성일지를 예측하는 방법이 제공되며, 방법은 환자의 종양 세포가 세포외 도메인에 대한 EGFR 유전자 영역 암호 내에 돌연변이를 획득했는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태는 하기 비제한적인 실시예에 기술되어 있다. 하기 실시예는 단지 예시이고, 어떤 방식으로도 본 개시 내용의 범주를 제한하는 것으로서 이해되어서는 안되는데, 그 이유는 본 개시 내용을 읽은 후 다수의 변화 및 등가물이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이기 때문이다.
본 출원 전체에 인용된 모든 참고문헌, 젠뱅크 목록, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 참고로 본 명세서에 명확하게 포함된다.
실시예
물질 및 방법
실시예 전체에서, 달리 언급되지 않는 한, 하기 물질 및 방법이 사용된다.
일반적으로, 달리 표시되지 않는 한, 화학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학(특히, 예를 들어 항체 기술)의 종래의 기술 및 폴리펩타이드 제조에서의 표준 기술이 사용된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]; [Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996)]; [Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996)]; [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)]을 참고하기 바란다.
세포 배양 및 내성 세포의 생성
OXCO-2 세포를 5% FBS가 보충된 이스코브(Iscove) 배지(인비트로젠(Invitrogen)) 중에서 배양하였고; LIM1215 세포를 5% FBS 및 인슐린(1㎎/㎖)이 보충된 RPMI1640 배지(인비트로젠) 중에서 배양하였고; HCA-46 세포를 5% FBS가 보충된 DMEM(인비트로젠) 중에서 배양하였고, CCK81 세포를 5% FBS가 보충된 MEM(인비트로젠) 중에서 배양하였다. 모든 배지는 또한 2m㏖/L L-글루타민 및 항생제(100U/㎖ 페니실린 및 100㎎/㎖ 스트렙토마이신)을 함유하였고, 세포를 37℃에서 5% CO2 에어 인큐베이터에서 성장시켰다. OXCO-2 세포주는 2010년 3월의 브이, 세룬돌로 박사(Dr V. Cerundolo)로부터의 친절한 기증품이었다(옥스포드 대학교(University of Oxford), 웨더롤 분자 약학 연구소(Weatherall Institute of Molecular Medicine), 영국 옥스포드 소재). LIM1215 모 세포주는 이미 기술되어 있고(R. H. Whitehead, F. A. Macrae, D. J. St John, J. Ma, A colon cancer cell line (LIM1215) derived from a patient with inherited nonpolyposis colorectal cancer. J. Natl. Cancer Inst. 74, 759-765 (1985)), 그것은 루드빅 암 연구소(Ludwig Institute for Cancer Research)(스위스 취리히 소재)로부터의 승인하에 로버트 화이트헤드 교수(Prof. Robert Whitehead)(반데르빌트 대학교(Vanderbilt University), 미국 테네시주 내쉬빌 소재)로부터 입수되었다. HCA-46 세포주를 유러피언 컬렉션 오브 애니멀 셀 컬쳐스(European Collection of Animal Cell Cultures)(시그마-알드리치 에스알엘(Sigma-Aldrich Srl)에 의해서 분포됨)로부터 입수하였다. CCK81 세포주를 헬쓰 사이언스 리서치 뱅크(Health Science Research Resources Bank)로부터 입수하였다. HEK293 세포주를 ATCC(엘지씨 스탠다즈 에스.알.엘(LGC Standards S.r.l))로부터 구입하였고, 10% FBS가 보충된 DMEM(인비트로젠) 중에서 배양하였다.
각각의 세포주의 아이덴터티를 시험하였고, 셀 아이디 시스템(Cell ID System)에 의해서 그리고 젠 프린트 10 시스템(Gene Print 10 System)(프로메가(Promega))에 의해서, 10개의 상이한 유전자자리(D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, D21S11, vWA, TH01, TPOX, CSF1PO, 및 아멜로제닌)에서의 짧은 연쇄 반복부(short tandem repeat: STR)을 통해서 검증하였다. 멀티플렉스 PCR로부터의 앰플리콘을 모세관 전기이동(capillary electrophoresis)(3730 DNA 분석기, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에 의해서 분리하였고, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터의 젠맵퍼아이디(GeneMapperID) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 생성된 세포주 STR 프로파일을 교차-비교하였고, ATCC, ECACC, 및 셀뱅크 오스트레일리아 레포저토리스 온라인 데이터베이스(CellBank Australia repositories online databases)로부터 입수 가능한 STR와 매칭하였다. 모든 세포주를 시험하였고, 베너 지엠 클래식 키트(Venor GeM Classic Kit)(미네르바 바이오랩스(Minerva Biolabs))를 사용하여 마이코플라스마 오염에 대해서 음성을 유발하였다.
1.4μM의 농도에서 약물에 연속적으로 노출시킴으로써 LIM1215 R1을 생성하였다. LIM1215에 대해서 세툭시맙 용량을 350nM에서 1.4μM로 단계식으로 증가시킴으로써 LIM1215 R2를 얻었다. NCIH508의 경우 0.3μM의 농도 그리고 LIM1215, OXCO-2 및 HCA-46의 경우 1.4μM의 농도에서 약물에 연속적으로 노출시키고 3 내지 9개월 후 LIM1215 R3-5 및 OXCO-2, 및 HCA-46 세툭시맙-내성 유도체를 생성하였다. 6개월의 기간 동안 세툭시맙 투여량을 680nM에서 1.4μM로 단계적으로 증가시킴으로써 CCK81 세툭시맙-내성 유도체를 얻었다.
세포주에서의 돌연변이 분석
위자드 에스브이 제노믹 디엔에이 퓨리피케이션 시스템(Wizard SV Genomic DNA Purification System)(프로메가)에 의해서 게놈 DNA 샘플을 추출하였다. 생거 서열분석의 경우, 모든 샘플을 ABI PRISM 3730(어플라이드 바이오시스템즈)에 의한 자동화 서열분석에 적용하였다. 프라이머 서열은 다른 곳에 열거되어 있다(6, 9). 하기 유전자 및 엑손을 분석하였다: KRAS(엑손 2, 3, 및 4), NRAS(엑손 2 및 3), PIK3CA(엑손 9 및 20), BRAF(엑손 15), EGFR(엑손 12). 독립적인 PCR 반응으로부터 시작하여 모든 돌연변이를 2회 확인하였다.
KI 세포( LIM1215 KI EGFR S492R )의 생성
LIM1215 세포를 60 내지 80% 컨플루언스까지 10cm 접시에서 성장시켰다. 이어서, 배지를 흡입시키고, 2㎕의 rAAV(pAAV0223 EGFR S492R, 호라이즌 디스커버리(Horizon Discovery), 영국 캠브릿지 소재) 및 5㎖의 새로운 적절한 성장 배지를 세포에 첨가하였다. 바이러스를 37℃에서 4시간 동안 감염시켰다. 그 후, 5㎖의 성장 배지를 세포에 첨가하고, 이어서 14 내지 16시간 후에 새로운 배지로 완전히 교체하였다. 감염된 세포를 48시간 동안 성장시키고, 이어서 트립신처리에 의해서 수확하고, 제네티신(geneticin)(G418, 라이프 테크놀로지스 코포레이션, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재) 함유 배지를 갖는 96-웰 플레이트에 분포시켰다. 플레이트를 37℃에서 2주 동안 인큐베이션시키고, 그 후 재조합을 위해서 수확하고, 스크리닝하였다. 좌측 상동성 암의 외부에 위치된 전방향 프라이머, FW: 5' AAGATGGGGGAAAGAAGAGC 3'(서열번호 28), 및 Neo 유전자 내에 위치된 역방향 프라이머, RV: 5' GCATGCTCCAGACTGCCTTG 3'(서열번호 29)를 사용하여 "Neo 스크리닝" PCR에 의해서 유전자자리 특이적인 상동체 재조합 사건을 스크리닝하였다. 제조사 지시서에 따라서 Lyse-N-GoTM PCR 시약(피어스(Pierce), 미국 일리노이주 락포드 소재)을 사용하여 세포를 용해시켜서 단일 클론으로부터의 게놈 DNA를 얻었다. 10㎕ 반응 부피로 하기 조건을 사용하여 PCR 스크리닝을 수행하였다: 3분 동안 94℃의 1회 사이클; 15초 동안 94℃, 30초 동안 64℃, 1분 30초 동안 70℃의 3회 사이클; 15초 동안 94℃, 30초 동안 61℃, 1분 30초 동안 70℃의 3회 사이클; 15초 동안 94℃, 30초 동안 58℃, 1분 30초 동안 70℃의 3회 사이클; 15초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 1분 30초 동안 70℃의 35회 사이클; 5분 동안 70℃의 1회 사이클. 양성 클론에서, S492R 돌연변이의 도입 및 발현을 gDNA 및 cDNA 수준에서의 서열분석에 의해서 확인하였다.
LoxedP Neo 카세트를 제거하기 위해서, LIM1215 EGFR S492R 노크-인 세포를 적절한 성장 배지 5㎖ 중에서 크레 레콤비나제 아데노바이러스(Cre Recombinase Adenovirus) 1㎕와 함께 인큐베이션시켰다. 바이러스가 37℃에서 4시간 동안 세포를 감염시키게 하였다. 이어서, 성장 배지 5㎖를 세포에 첨가하고, 이어서 14 내지 16시간 후에 새로운 배지로 완전히 교체하였다. 이어서, 단일 클론을 단리하기 위해서 세포를 한계 희석법으로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 단일 클론이 50 내지 60%의 컨플루언스에 도달했을 때, 이들을 수확하고, 게놈 DNA를 상기 단락에 기술된 바와 같이, Lyse-N-Go PCRTM 시약을 사용하여 각각의 웰로부터 추출하였고, 이중 PCR 스크리닝을 수행하여 Neo 카세트의 제거를 평가하였다. 음성인 것으로 추정되는, 제1 PCR 반응은 상기에 기술된 바와 같은 "Neo 스크리닝"에 유사하였다. 그것을 게놈 DNA에 어닐링된 프라이머, FW: 5' AAGATGGGGGAAAGAAGAGC 3'(서열번호 30) 및 네오마이신 유전자, RV: 5' GCATGCTCCAGACTGCCTTG 3'(서열번호 31)를 사용하여 수행하였다. 이러한 PCR은 클론 외부에서 CRE에 대해서 음성이었다. 제2 PCR 반응은 돌연변이의 존재를 확인한다고 예상되었다. Neo 스크리닝에 대해서 상기에 언급된 동일한 조건, 회전 시간 및 온도를 사용하여, 각각 10㎕ 및 20㎕ 반응으로 PCR 반응을 수행하였다. 또한 기능적 수준에서 Neo 카세트의 제거를 증명하기 위해서, 선택된 클론을 G418-함유(0,8㎎/㎖) 배지 및 G418-무함유 배지 둘 모두에 시딩하였다. 예상된 바와 같이, 클론 외부의 CRE는 G418-무함유 배지 중에서만 생존할 수 있었다. 이어서, 이들 클론을 확장 및 최종 돌연변이 분석에 적용하였다.
LIM1215 (#2) EGFR S492R 세포주의 생성
LIM1215 세포를 추가 세포 뱅크(시그마-알드리치)로부터 획득하였고, 이들 세포를 본 명세서에서 "LIM1215(#2)"라 칭한다. 세포를 제조사에 의해서 짧은 연쇄 반복부 프로파일링에 의해서 증명하였고, 제조사의 지시서에 따라서 3개월 미만 동안 본 발명자의 실험실에서 패시징시켰다. LIM1215(#2) 세포를 5% CO2 대기에서 37℃에서 가습 인큐베이터 내에서 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(라이프 테크놀로지스)이 보충된 RPMI1640 배지(라이프 테크놀로지스) 중에서 배양하였다. EF1α 프로모터로부터의 S492R 돌연변이를 보유하는 EGFR을 발현하는 pD2539 안정한 발현 작제물을 DNA 2.0으로부터 획득하였다. 이러한 작제물을 다-단계 공정으로 DNA 2.0에 의해서 생성하였다. 먼저, 하기 잠재성 돌연변이-두 내부 BsaI 제한 효소 자리의 제거, 2개의 BsaI 지향성 엔도뉴클레아제 부위의 첨가에 의한 염기 1253과 1572 사이의 짧은 클로닝 카세트(이것은 EGFR 엑손 12의 전부를 포함함)의 생성, 및 발현을 모니터링하기 위한 독특한 "mod1a" 및 "mod2a" qPCR 프라이머 결합 부위의 삽입을 사용하여 전장 EGFR를 DNA 합성을 통해서 생성하였다. 두번째로, 이어서 이러한 EGFR 서열을 PM269 벡터에 삽입하여 "PM269-EGFR" 작제물을 생성하였다. 세번째로, 이어서 492R 돌연변이(1474A>C)를 함유하는 클로닝 카세트를 합성하고, 2개의 삽입된 BsaI 지향성 엔도뉴클레아제 부위를 사용하여 PM269-EGFR 작제물 내에 삽입하였다. 네번째로, 이어서 엘렉트라(Electra) 서브-클로닝 시스템(DNA 2.0)을 사용하여 변형된 EGFR 서열(서열번호 33)을 본 명세서에서 "pD2539-EGFR-S492R"이라 지칭되는, pD2539 안정한 발현 벡터에 전달하였다.
LIM1215(#2) 세포를 FuGENE(등록상표) 6 형질감염 시약(로슈 카탈로그 #11-814-443-001)을 사용하여 pD2539-EGFR-S492R로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 10% FBS 및 1㎍/㎖ 푸로마이신(라이프 테크놀로지스)이 보충된RPMI1640 배지(라이프 테크놀로지스) 중에서 2주 동안 성장시켜서 안정한 발현 풀을 생성하였다. RNA를 수집하고, RNeasy 플러스 미니 키트(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 추출하고, 고-용적 cDNA 역전사 키트(라이프 테크놀로지스)를 사용하여 역전사를 수행하였다. SYBR 그린 실시간 PCR을 ViiA7 장비(라이프 테크놀로지스) 상에서 수행하여 mod1a 프라이머(5'GGGTTCGCATCAGATCTCGTTA3'(서열번호 36); 5'TCAAGCACCTATGAACTCGGAC3'(서열번호 37))를 사용하여 EGFR S492R mRNA의 발현을 확인하였다. 발현을 퀴아젠으로부터 수득된 프라이머(Hs_ACTB_1_SG)를 사용하여 β-액틴 하우스킵핑 대조군에 정규화하였다.
이어서, pD2539-EGFR-S492R 플라스미드의 안정한 발현을 보유하는 LIM1215(#2) 세포주를 플레이트 당 50세포의 출발 밀도로 10cm 배양 플레이트에 플레이팅하고, 1㎍/㎖ 푸로마이신과 함께 선택 압력하에서 성장시켰다. 배지를 5일마다 변화시키고, 이어서, 24개의 단일 클론을 클로닝 디스크를 사용하여 집어내고, 선택 압력하에서 확장시켰다. 이어서, S492R mRNA의 발현을 24개의 클론에서 평가하였고, 최대 발현을 갖는 클론을 추가 실험을 위해서 선택하였다. 총 EGFR 단백질의 발현을 면역블롯(immunoblot)에 의해서 측정하였고, 모 LIM1215(#2) 세포주보다 대략 5.7배 더 높은 것이 관찰되었다. 이러한 클론을 본 명세서에서 "LIM1215(#2) EGFR S492R"이라 칭한다.
LIM1215 (#2) EGFR S492R KI 세포주의 생성
EGFR S492 영역("S492"; 5'AATTTTGGTTTTCTGACCGG3'(서열번호 38)), 및 대조군으로서 비-특이적인 서열("rg_0111"; 5'ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA3'(서열번호 39))을 표적화하도록 CRISPR 디자인 툴(메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지(Massachusetts Institute of Technology); http://crispr.mit.edu)를 사용하여 단일 가이드 RNA(sgRNA) 서열을 설계하였다. 2개의 sgRNA 서열을 DNA 2.0으로부터 수득된 포유동물 Cas9 게놈 에디팅 벡터(pD1321-AD, CAG-Cas9-2A-GFP) 내로 별도로 클로닝하였고, 이들을 각각 본 명세서에서 "pD1321-AD-S492R" 및 "pD1321-AD-rg_0111"이라 칭한다. EGFR S492R 돌연변이를 함유하는 단일-가닥 공여자 올리고뉴클레오타이드를 인터그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies)에 의해서 합성하였다(서열번호 34).
각각의 플라스미드(pD1321-AD-S492R 및 pD1321-AD-rg_0111)의 경우, LIM1215(#2) 세포를 플라스미드 및 EGFR S492R 단일-가닥 공여자 올리고뉴클레오타이드(서열번호 34) 둘 모두로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 플라스미드 상에서 암호화된 GFP 단백질의 발현을 기반으로 하는 유세포 분석법에 의해서 분류하였다. 게놈 DNA(gDNA)를 퀴아젠으로부터의 QIAamp(등록상표) DNA 미니 키트(카탈로그 #51306)를 사용하여 제조사의 지시서에 따라서 추출하였다. gDNA를 용리 완충액(10mM 트리스(Tris)-Cl, 0.5mM EDTA, pH 9.0) 50㎕ 중에 용리하고, gDNA 농도를 나노드롭(NanoDrop)(등록상표) 2000C UV-Vis 분광광도계(spectrophotometer)(써모사이언티픽(ThermoScientific)) 상에서 제조사의 지시서에 따라서 측정하였다. S492R 돌연변이의 존재를 생거 서열분석에 의해서 확인하였다.
풀링된 배양물로부터의 단일 세포를 96-웰 플레이트의 개별 웰 중에 단리하고, gDNA를 유전형분석(genotyping)을 위해서 추출하였다. EGFR S492R 돌연변이를 함유하는 것으로 식별된 단일 클론을 뱅킹하고, 추가 실험을 위해서 선택하였다. 유세포 분석법 항체 결합 검정법을 수행하여 세툭시맙 결합을 감소시키지만 P2X 결합을 유지한 클론을 식별하였다(둘 모두 LIM1215(#2) 세포주 발현 야생형 EGFR에 대한 결합에 상대적임). 이 클론을 본 명세서에서 "LIM1215(#2) EGFR S492R KI"라 칭한다.
pD1321-AD-rg_0111 플라스미드(야생형 EGFR 유전형을 유지하는 비-표적화 서열)와 함께 생성된 풀링된 배양물을 사용하여 유세포 분석법 실험을 수행하여 세툭시맙 및 P2X 항체의 결합이 야생형 EGFR을 발현하는 LIM1215(#2) 세포주에 비해서 유지되는지를 확인하였다. 이러한 풀링된 배양물을 본 명세서에서 "LIM1215(#2) EGFR S492 야생형"이라 칭한다.
LIM1215 (#2) EGFR G465R KI 세포주의 생성
EGFR G465 영역("G465sg1"; 5'CTCCATCACTTATCTCCTTG3'(서열번호 40); "G465sg2"; 5'GCTATGCAAATACAATAAAC3'(서열번호 41)), 및 대조군으로서 비-특이적인 서열("듀얼-rg0111"; 5'ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA3'(서열번호 42); "듀얼-rg-0135"; 5'CGCTTCCGCGGCCCGTTCAA3'(서열번호 43))을 표적화도록 CRISPR 디자인 툴(메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지; http://crispr.mit.edu)를 사용하여 단일 가이드 RNA(sgRNA) 서열을 설계하였다. 2개의 sgRNA 서열을 DNA 2.0으로부터 수득된 포유동물 니카제 Cas9-D10A 게놈 에디팅 벡터(pD1431-AD, EF1a-Cas9N-2A-GFP) 내에 클로닝하였고, 이들을 각각 본 명세서에서 각각 "pD1431-AD-nCas9G465R" 및 "pD1431-AD-nCas9 비_표적화"라 칭한다. EGFR G465R 돌연변이를 함유하는 단일-가닥 공여자 올리고뉴클레오타이드를 인터그레이티드 디엔에이 테크놀로지스에 의해서 합성하였다(서열번호 35).
각각의 플라스미드(pD1431-AD-nCas9G465R 및 pD1431-AD-nCas9 비-타겟화)의 경우에, LIM1215(#2) 세포를 플라스미드 및 EGFR G465R 단일-가닥 공여자 올리고뉴클레오타이드(서열번호 35) 둘 모두로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 플라스미드 상에서 암호화된 GFP 단백질의 발현을 기반으로 하는 유세포 분석법에 의해서 분류하였다. 게놈 DNA(gDNA)를 퀴아젠으로부터의 QIAamp(등록상표) DNA 미니 키트(카탈로그 #51306)를 사용하여 제조사의 지시서에 따라서 추출하였다. gDNA를 용리 완충액(10mM 트리스-Cl, 0.5mM EDTA, pH 9.0) 50㎕ 중에 용리하고, gDNA 농도를 나노드롭(등록상표) 2000C UV-Vis 분광광도계(써모사이언티픽) 상에서 제조사의 지시서에 따라서 측정하였다. G465R 돌연변이의 존재를 생거 서열분석에 의해서 확인하였다.
야생형 EGFR을 발현하는 세포와 EGFR ECD 돌연변이를 발현하는 세포의 혼합물을 갖는 시험관내 풀링된 배양 시스템 중에서의 EGFR ECD 돌연변이의 분석
실험 제1일에, 야생형 EGFR 및 EGFR 엑토도메인 돌연변이 둘 모두의 발현을 보유하는 세포의 풀을 1x105세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트 내에 시딩한다. 각각 EGFR S492R 또는 EGFR G465R 유전자 에디트를 보유하는 세포를 함유하는 LIM1215(#2) EGFR S492R KI 및 LIM1215(#2) EGFR G465R KI 세포주의 발생 동안 2개의 풀을 생성하였다. 세포를 5% CO2 대기에서 37℃에서 가습 인큐베이터 내에서 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(라이프 테크놀로지스)이 보충된 RPMI1640 배지(라이프 테크놀로지스) 중에서 배양하였다. 음성 대조군으로서, 야생형 EGFR 만을 발현하는 세포의 풀을 플레이팅하고, 동일한 방식으로 배양하였다(이러한 풀을 LIM1215(#2) EGFR S492 야생형 대조군 세포주의 발생 동안 생성하였다).
또한, 제1 일에, 5x105세포를 벤치탑 원심분리기에서 5분 동안 3000RPM에서 펠렛화하고, 상청액을 제거하고, 세포 펠렛을 추후 게놈 DNA 추출을 위해서 -80℃에서 저장하였다. 다음날, 세포를 1μM의 항체 또는 배지 단독(대조군)으로 처리하였다. 4일, 10일, 및 15일에, 각각의 플레이트 웰 내의 세포의 1/2을 새로운 플레이트로 옮기고, 세포의 1/2을 사용하여 추후 게놈 DNA 추출을 위해서, 상기와 같이 세포 펠렛을 형성하였다.
모든 세포 펠렛을 수집한 후, 샘플을 해동시키고, 인산염-완충 염수(PBS) 200㎕ 중에 재현탁시키고, 퀴아젠으로부터의 QIAamp DNA 미니 키트(카탈로그 #51306)를 사용하여 제조사의 지시서에 따라서 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA를 용리 완충액(10mM 트리스-Cl, 0.5mM EDTA, pH 9.0) 50㎕ 중에 용리하고, gDNA 농도를 나노드롭(등록상표) 2000C UV-Vis 분광광도계(써모사이언티픽) 사에서 제조사의 지시서에 따라서 측정하였다.
각각의 게놈 DNA 샘플에서 EGFR ECD 돌연변이의 대립유전자 빈도를 QX200(상표명) 드롭렛 디지털(상표명) PCR 시스템(바이오-라드(Bio-Rad))을 사용하여 드롭렛 디지털 PCR(ddPCR)에 의해서 평가하였다. EGFR S492R 및 G465R 돌연변이 및 상응하는 야생형에 대해서 특이적인 ddPCR 프라이머를 함유하는 커스텀 태크만(Custom TaqMan)(등록상표) SNP 유전형분석 검정법 키트를 라이프 테크놀로지스로부터 입수하였다(카탈로그 # 4331349; 검정법 ID: AHN1YEK, EGFRS492R; 검정법 ID: AHPAWKS, EGFRG465R). ddPCR 검정법을 제조사의 지시서에 따라서 반응 당 20ng의 게놈 DNA를 사용하여 수행하였고, 대립유전자 빈도를 총 (EGFR 돌연변이체 + 야생형) DNA 대립유전자에 대한 EGFR 돌연변이체 DNA 대립유전자의 백분율로서 계산하였다.
NanoBRET 검정법
HEK293 세포를 FuGENE(등록상표) HD 형질감염 시약(프로메가 카탈로그 #E2311)으로 일시적으로 형질감염시켜서 EGFR-NanoLuc 돌연변이체를 발현시켰다. 이어서, 형질감염된 세포를 약물의 증가하는 용량(0에서 100㎍/㎖) 및 HaloTag-EGF(트레이서) 18ng/㎖의 농도로 30분 동안 처리하였다. 이어서, NanoBRET(상표명) Nano-Glo(등록상표) 기질을 첨가하고, 플레이트를 글로맥스(GloMax)(등록상표)-멀티 마이크로플레이트 멀티모드 리더(Multi Microplate Multimode Reader)를 사용하여 분석한다. 본래 NanoBRET(상표명) 비율 값을 계산하기 위해서, 억셉터 방출값(acceptor emission value)(610nm)을 각각의 샘플에 대한 도너 방출값(donor emission value)(450nm)으로 나눈다.
세포 생존력 검정법
세툭시맙 및 파니투무맙을 이탈리아 밀란 소재의 니구아르다 카그란다 병원(Niguarda Ca' Granda Hospital)의 약국으로부터 입수하였다. MM-151을 매리맥 파마슈티컬스(Merrimack Pharmaceuticals)로부터 입수하였다. 세포주를 다음 밀도(LIM1215, HCA-46, NCIH508, 및 OXCO-2의 경우 2x103, CCK81의 경우 3x103)로 96-웰 배양 플레이트 내의 100㎕ 배지 중에 시딩하였다. 다음날, 각각의 약물(세툭시맙, 파니투무맙, MM-151)의 연속 희석물 100㎕를 혈청-무함유 배지 중의 세포에 첨가하여 100 내지 0㎍/㎖의 최종 농도를 달성하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2에서 6일 동안 인큐베이션시키고, 그 후 셀타이터-글로(등록상표) 발광 검정법(프로메가)을 사용하여 ATP 함량에 의해서 세포 생존력을 평가하였다. 측정치를 빅터-X4 플레이트 리더(Victor-X4 plate reader)(퍼킨엘머(PerkinElmer))를 사용하여 기록하였다. 처리된 웰을 미처리된 웰에 대해서 정규화한다.
LIM1215(#2) 세포 및 그것으로부터 유래된 세포주를 사용한 실험은 변형된 방법을 사용한다. 세툭시맙을 마이코덤(Myoderm)으로부터 입수하였고, Sym004 조합(Sym992 + Sym1024) 항체를 발현시키고, 특허 문헌으로부터의 서열 정보를 사용하여 정제하였고, MM-151을 매리맥 파마슈티컬스로부터 입수하였다. 세포주를 96-웰 배양 플레이트 내에서 10% 우태아 혈청이 보충된 100㎕ RPMI 배지(라이프 테크놀로지스) 중에 5x103세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 다음날, 각각의 약물(세툭시맙, Sym004, MM-151) 연속 희석물 100㎕를 8nM EGF 리간드가 보충된 RPMI 배지(프레프로테크(Preprotech)) 중에 첨가하여 1000 내지 1nM의 최종 농도를 달성하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션시키고, 그 후 셀타이터-글로(등록상표) 발광 검정법(프로메가)을 사용하여 ATP 함량에 의해서 세포 생존력을 평가하였다. 측정치를 앤비젼 플레이트 리더(Envision plate reader)(퍼킨엘머)를 사용하여 기록하였다. 처리된 웰을 8nM EGF 리간드 단독으로 처리된 웰에 대해서 정규화한다.
세포 성장률 검정법
세툭시맙을 마이코덤으로부터 입수하였고, Sym004 조합(Sym992 + Sym1024) 항체를 발현시키고, 특허 문헌으로부터의 서열 정보를 사용하여 정제하였고, MM-151을 매리맥 파마슈티컬스로부터 입수하였다. 세포주를 96-웰 배양 플레이트 내에서 10% 우태아 혈청이 보충된 100㎕ RPMI 배지(라이프 테크놀로지스) 중에 5x103세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 다음날, 시딩 배지를, 2% 우태아 혈청 및 각각의 약물의 연속 희석물(1000 내지 0.15nM의 최종 농도를 성취하도록)을 함유하고, 리간드가 보충되지 않거나, 8nM EGF 리간드(페프로테크(Peprotech)), 또는 8nM AREG 리간드(페프로테크)가 보충된 RPMI 처리 배지 300㎕로 변경하였다. 플레이트를 인큐사이트 줌(IncuCyte ZOOM) 라이브-셀 이미저로 바로 이동시키고, 72시간의 기간 동안 2-시간 간격으로 위상 콘트라스트 영상을 획득하였다. 성장률을 계산하기 위해서, 컨플루언스 데이터(세포에 의해서 피복된 웰 표면의 백분율)를 자연 로그-변환시키고, 생성된 선의 기울기를 선형 회귀를 통해서 측정하였다. 높은 컨플루언스에서의 성장 포화를 배제하기 위해서, 0 내지 70% 컨플루언스의 측정치 만을 사용하였다. 성장률을 각각의 세포주에 대해서 대조군(약물 없음) 조건에 대해서 정규화하였다.
포스포 - ERK 세포 신호전달 검정법
세포주를 96-웰 배양 플레이트(코스타(Costar); 카탈로그# 3997) 내에서 10% 우태아 혈청이 보충된 100㎕ RPMI 배지(라이프 테크놀로지스) 중에 3.5x104세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 다음날, 시딩 배지를 1% 우태아 혈청이 보충된 100㎕ RPMI 배지로 변경하였다. 다음날, 세포를 1% 우태아 혈청 및 각각의 약물의 연속 희석물(1000 내지 0.15nM의 최종 농도를 성취하도록)을 함유하는 배지 100㎕로 2시간 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 1% 우태아 혈청을 함유하고, 리간드를 함유하지 않거나 EGF 리간드(페프로테크) 또는 AREG 리간드(페프로테크)를 함유하는 50㎕ RPMI로 10분 동안 자극시켰다. 첨가 후에, 리간드의 최종 농도는 8nM였다. 이어서, 세포를 150㎕의 차가운 PBS로 세척하고, 54㎕ MPER 완충액 + 150mM NaCl + 포스파타제 저해제(로슈; 카탈로그# 04906837001 및 4693124001) 중에서 용해시켰다. 용해물을 15분 동안 -80℃에서 얼리고, 이어서 30분 동안 얼음 상에서 녹였다.
포스포-ERK를 샌드위치 ELISA에 의해서 측정하였다. 96-웰 블랭크 MSD 플레이트(메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery); 카탈로그# L15XA-3)를 PBS 중에 100X로부터 희석된 25㎕ 2X 포획 항체(1:50)(셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies); 카탈로그# R92TC-1)로 코팅하고, 실온에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날, 플레이트를 BIOTEK 플레이트 세척기 상에서 100㎕/웰 PCST(0.05% 트윈(Tween)-20)로 3회 세척하였다. 그 후에 플레이트를 실온에서 1시간 동안 150㎕ MSD 블록(block)(PBS 중의 1%, 0.2μm 여과됨)으로 차단시켰다. 플레이트를 BIOTEK 플레이트 세척기 상에서 100㎕/웰 PBST(0.05% 트윈-20)로 3회 세척하였다. 세포 용해물(니트(neat)) 또는 포스포-ERK 표준품(알앤디 시스템즈(R&D Systems); 카탈로그# DYC1018BE)을 25㎕/웰로 첨가하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 BIOTEK 플레이트 세척기 상에서 100㎕/웰 PBST(0.05% 트윈-20)로 3회 세척하였다. 검출 항체(셀 시그널링 테크놀로지스 ; 카탈로그# R92TC-1)를 1% MSD 블록 용액(1:50) 중에서 100X로부터 2X로 희석시키고, 25㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 BIOTEK 플레이트 세척기 상에서 100㎕/웰 PBST(0.05% 트윈-20)로 3회 세척하였다. 설포-태그(메조 스케일 디스커버리; 카탈로그# R32AC-5)를 갖는 2차 검출 항-마우스 IgG를 1% MSD 블록 용액 중에 1:1000으로 희석시키고, 25㎕/웰로 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 오비탈 쉐이커(orbital shaker)(300RPM) 상에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 BIOTEK 플레이트 세척기 상에서 100㎕/웰 PBST(0.05% 트윈-20)로 3회 세척하였다. 계면활성제를 갖는 MSD 판독 완충액(메조 스케일 디스커버리; 카탈로그# R92TC-1)을 ddH20 중에 4X로부터 2X로 희석시키고, 150㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 MSD SECTOR 이미저 2400(메조 스케일 디스커버리) 상에서 판독하였다. 배경 신호를 뺄셈하고, 재조합 ERK 표준품으로 회귀시키고, 희석 인자에 대해서 보정하도록 역계산함으로써 결과를 분석하였다. 반복 샘플을 평균내고, 표준 편차를 계산하였다.
DNA 작제물 및 돌연변이형성
NanoLuc(등록상표)-EGFR WT 벡터는 프로메가 코퍼레이션으로부터 구입되었고, pLX301-EGFR WT 작제물은 씨. 선 박사(Dr.C. Sun) 및 알. 베르나르즈 교수(Prof R. Bernards)(NKI, 네덜란드 암스테르담 소재)로부터의 관대한 선물이었다.
템플레이트 DNA로서 WT 상응 플라스미드를 사용하여 에질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)로부터의 퀵체인지(QuikChange) II 부위-안내 돌연변이형성 키트를 사용하여 6점 돌연변이(R451C, S464L, G465R, K467T, I491M, 및 S492R)를 함유하는 EGFR 돌연변이체를 작제하였다. 돌연변이의 존재를 DNA 서열분석에 의해서 확인하였다.
면역블롯 분석법
생화학적 분석법 전에, 모 세포를 5% FBS 배지 중에 10% FBS, KI 세포가 보충된 이의 특정 배지 중에서 성장시켰다. 세포를 1mM 소듐 오르토바나데이트, 100mM 소듐 플루오라이드 및 프로테아제 저해제의 혼합물(펩스타틴, 류펩틴, 아프로티닌 및 STI)의 존재하에서 차가운 EB 완충액(50mM 헤페스(Hepes) pH 7.4, 150mM NaCl, 1% 트리톤(Triton) X-100, 10% 글리세롤, 5mM EDTA, 2mM EGTA; 모든 시약은 시그마-알드리치 제품이었고, 트리톤 X-100만 플루카(Fluka) 제품이었음) 중에 가용화시킴으로써 전체 세포 단백질을 추출하였다. 추출물을 원심분리에 의해서 투명하게 하였고, 단백질 농도를 BCA 단백질 검정법 시약 키트(써모(Thermo))를 사용하여 측정하였다. 웨스턴 블롯 검출을 인핸스트 케미루미네센스 시스템(enhanced chemiluminescence system)(지이 헬쓰케어(GE Healthcare)) 및 퍼옥시다제 접합된 2차 항체(아머샴(Amersham))를 사용하여 수행하였다. 하기 1차 항체를 웨스턴 블롯팅을 위해서 사용하였다(표시된 경우를 제외하고는 모두 셀 시그널링 테크놀로지 제품임): 항-포스포 p44/42 ERK(thr202/tyr204); 항-p44/42 ERK; 항-포스포-AKT(Ser473), 항-AKT; 항-포스포 EGFR(tyr1068); 항-EGFR(clone13G8, 엔조 라이프 사이언스즈(Enzo Life Sciences)); 항-빈쿨린(시그마-알드리치). 다음날, 적절한 2차 항체와 인큐베이션시키고 1시간 후, 신호를 ECL(아머샴 바이오사이언스즈)을 사용하여 현상하였다.
LIM1215(#2) 세포주 및 이것으로부터 유래된 세포주를 사용한 실험은 변형된 방법을 사용한다. 세포를 6-웰 플레이트 내에서 10% 우태아 혈청이 보충된 2㎖ RPMI 배지 중에 5x105의 밀도로 시딩하였다. 다음날, 시딩 배지를 1%우태아 혈청이 보충된 RPMI 배지 1㎖로 교체하였다. 다음날, 세포를 1% 우태아 혈청 및 약물을 함유하는 배지(100nM의 최종 농도를 성취하도록) 111㎕로 24시간 동안 처리하였다. 다음날, 세포를 1% 우태아 혈청을 함유하고, 리간드를 함유하지 않거나 EGF 리간드(페프로테크) 또는 AREG 리간드(페프로테크)를 함유하는 123㎕ RPMI로 10분 동안 자극시켰다. 첨가 후에, 리간드의 최종 농도는 8nM이었다. 이어서, 세포를 1㎖의 차가운 PBS로 세척하고, 100㎕ MPER 완충액 + 150mM NaCl + 포스파타제 저해제(로슈; 카탈로그# 04906837001 및 4693124001) 중에서 용해시켰다. 추출물을 -80℃에서 얼렸다. 다음날, 추출물을 원심분리에 의해서 투명하게 하였고, 단백질 농도를 BCA 단백질 검정법 시약 키트(써모 피셔)를 사용하여 측정하였다.
샘플을 웨스턴 블롯 분석법을 위해서 다음과 같이 제조하였다. 40㎍의 단백질을 10% b-머캅토에탄올이 보충된 로딩 완충액(바이오-라드) 및 MPER 완충액 중에서 30㎕의 최종 부피로 희석시켰다. 샘플을 90C에서 5분 동안 끓이고, 보텍싱 및 원심분리하였다. 25㎕ 샘플을 4 내지 12% 크리테리온 XT 비스-트리스 겔(Criterion XT Bis-Tris Gel)(바이오-라드; 카탈로그# 3450124)의 웰 중에 로딩하였고, 제조사의 지시서에 따라서 180V에서 90분 동안 실시하였다. 이어서, 겔을 2X NuPAGE 트랜스퍼 버퍼(Transfer Buffer)(써모피셔) 중에서 20분 동안 진탕기 상에서 인큐베이션시키고, 이어서 아이블롯 트랜스퍼 시스템(iBlot transfer system)(써모피셔)을 사용하여 나이트로셀룰로스 막 상으로 옮겼다. 막을 1시간 동안 실온에서 진탕기 상에서 오딧세이 블로킹 버퍼(Odyssey Blocking Buffer)(리-코르(Li-cor); 카탈로그# 927-40000) 중에서 차단시키고, 이어서 4C에서 진탕기 상에서 차단 완충액 중에 희석된 1차 항체 중에서 밤새 인큐베이션시켰다(pEGFR: 셀 시그널링 테크놀로지스, 카탈로그# 3777; 총 EGFR: 셀 시그널링 테크놀로지스, 카탈로그 # 4267; 액틴 하우스-킵핑 대조군: 시그마 카탈로그# A1978). 다음날, 막을 TBS-T 용액 중에서 각각 5분 동안 3회 세척하였고, 이어서 실온에서 1시간 동안 진탕기 상에서 차단 완충액 중에서 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 사용된 2차 항체는 IRDye 800CW 염소 항-토끼 IgG(H+L)(리-코르, 카탈로그# 926-32211) 및 IRDye 680RD 염소 항-마우스 IgG(H+L)(리-코르, 카탈로그# 926-68070)였다. 이어서 막을 각각 TBS-T 용액으로 5분 동안 3회 세척하고, 이어서 PBS로 1회 세척하였다. 이어서, 막을 오딧세이 이미저(Odyssey Imager)(리-코르)를 사용하여 스캔하였다.
유세포 분석법에 의한 항체 결합의 평가
세포를 45㎕ FACS 완충액(인산염-완충 혈청, pH 7.4, 1% 우태아 혈청 및 0.1% 소듐 아자이드가 보충됨) 및 5㎕의 인간 트루스테인(TruStain) FcX™ 용액(바이오레전드, 인크(BioLegend, Inc); 카탈로그 #422302) 중에 1x105세포/웰의 밀도로 U-형 바닥 96-웰 플레이트(팔콘(Falcon); 카탈로그 #353077)로 옮겼다. 세포를 10분 동안 얼음(4℃) 상에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 알렉사-플루오르(Alexa-Fluor)(등록상표) 488 염료(써모피셔)와 접합되고, FACS 완충액으로 희석된 항체를 1시간 동안 0.1μM의 최종 농도로 첨가하였다. 결합 특이성을 확인하기 위해서, 웰의 1/2을 먼저 표지되지 않은 항체(5μM의 최종 농도로)와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 얼음(4℃) 상에서 FACS 완충액으로 2회 세척하고, FACS 완충액 중에 1:10000으로 희석된 TO-PRO(등록상표)-3 아이오다이드(Iodide)(642/661) 용액(써모피셔; 카탈로그 #T3605) 중에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 분석을 위해서 FACSCalibur(상표명)(비디 바이오사이언시스) 상에 로딩하였다. 살아있는 세포를 선택하고(TO-PRO(등록상표)-3 음성), 알렉사-플루오르(등록상표) 488의 강도를 측정하였다. 플로우조(FlowJo)(등록상표) 소프트웨어(플로우조, 엘엘씨)를 사용하여 각각의 샘플에 대한 평균 형광 강도를 계산하였다.
뮤린 이종이식 연구
4 내지 5주령이고, 체중이 16 ± 0.5g인 암컷 nu/nu 마우스(NU-Foxn1 nu; 샤를스 리버 랩스)를 표시된 바와 같이 마우스 당 5x106의 밀도로 성장 인자-감소된 마트리겔(비디 바이오사이언시스)을 함유하는 PBS 중의 0.2㎖의 LIM1215(#2) EGFR S492R, 0.2㎖의 LIM1215(#2) EGFR S492R KI, 또는 0.2㎖의 LIM1215(#2) 세포 현탁물로 접종하였다. 종양이 대략 300㎣ 부피에 도달한 후, PBS(비히클 대조군) 또는 약물을 제공하기 위해서 마우스를 처리군으로 무작위화하였다. 처리는 IP 주사에 의해서 투여되었다. 종양 크기를 캘리퍼스에 의해서 매주 3회 측정하였고, 수학식 π/6 x L x W2(여기서, L 및 W는 각각 더 큰 종양 직경 및 더 작은 종양 직경을 나타냄)을 사용하여 종양 부피를 계산하였다.
항체에 대한 투여 스케줄은 이의 약동학을 기반으로 결정된다. 뮤린 EGFR과 교차-반응하지 않는 항체(25E, P3X, 세툭시맙)는 마우스에서 대략 4 내지 5일의 거의 동등한 반감기를 갖는 것으로 관찰되었기 때문에, Q7d 스케줄(예를 들어 월요일)에 투여된다. 뮤린 EGFR과 교차-반응하는 항체(P1X, P2X)는 표적-매개된 약물 배치로 인해서 보다 신속한 클리어런스를 갖는 것으로 관찰되었기 때문에, 주 3x 스케줄(예를 들어 월요일, 수요일, 금요일)로 투여된다.
25E, P2X, 및 P3X 항체로 이루어진 3종의-항체 혼합물을 마우스에서 종양 성장 실험을 위한 MM-151 툴 화합물로서 사용한다. 항체 25E가 P1X에 대해서 대체되는데, 그 이유는 그것이 뮤린 EGFR을 개입하지 않고, 따라서 세툭시맙 비교물질을 매칭하는 매주 투여 스케줄을 허용하고, 인간 환자에서 약동학을 보다 잘 반영할 것이기 때문이다. P1X은 25E의 친화성 성숙 변이체(11 대 145p㏖/L)이고, 그 항체는 EGFR 상의 중첩 에피토프에 개입하지 않는다. MM-151 툴 화합물 중의 3종의 항체의 용량을 각각의 항체에 대한 약동학 모델의 컴퓨터 모의실험을 사용하여 계산하여 세툭시맙의 상응하는 용량의 것에 동등한 합계 혈청 노출을 유발하였다.
인간 환자로부터의 순환 무-세포 DNA에서 EGFR ECD 돌연변이의 분석
불치성인 진행된 고형 종양을 갖는 환자에서 MM-151의 1상 연구를 수행하여 단일요법으로서 또는 이리노테칸과의 조합물(프로토콜 MM-151-01-01-01, NCT# 01520389)로 MM-151의 안전성을 평가하고 최대 허용 용량을 설정하였다. 이러한 프로토콜의 일부로서, 혈액 및 종양 조직 샘플을 수집하고, 모든 환자로부터 MM-151 반응 및/또는 안전성을 예측 또는 평가하는 데 도움이 될 수 있는 가능한 바이오마커를 추가로 특정분석하고 연관성을 확인하기 위한 연구 바이오마커 분석에 대해서 서면 동의서를 받았다. 연구는 지역 가이드라인에 따라서, 각각의 지역의 생명윤리위원회(institutional review board)에 의해서 검토 및 승인되었다. 연구를 MM-151의 용량을 다양한 스케줄로 확대시키는 것을 평가하도록 설계하였다. 진행성 질환(제1 용량일로부터 8주마다의 방사선 스캔에 의해서 평가됨), 허용 가능하지 않는 독성 또는 연구자에 의해서 평가되는 바와 같은 중단을 위한 다른 이유까지 환자를 치료하였다. 혈청 샘플을 바이오마커 분석법을 지지하기 위한 프로토콜-한정 지점에서 수집하였다. 각각의 수집 시간 지점에서, 9.5㎖ 혈액을 첨가제가 없는 레드 탑 튜브(red top tube)에 수집하였고, 실온에서 15 내지 30분 동안 응고시켰다. 이어서, 샘플을 3000RPM에서 10 내지 15분 동안 원심분리하여 혈청으로부터 세포를 분리하였다. 혈청을 2개의 동등한 분취물로 분할하고, 중앙 저장 장치로 이송할 때까지 -80℃ 저장기에 넣었다.
순환 무-세포 DNA(cfDNA)를 제조사의 지시서에 따라서 퀴아앰프 써쿨레이팅 뉴클레익 에시드 키트QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit)(퀴아젠)를 사용하여 혈청으로부터 단리하였다. 이어서, 6㎕의 ctDNA를 GE/㎖ 측정을 위한 각각의 qPCR 반응을 위한 템플레이트로서 사용하였다. 모든 샘플을 3회 분석하였다. PCR 반응을 5㎕ GoTaq(등록상표) qPCR 마스터 믹스(CXR 참조 염료로 2X)(프로메가) 및 LINE-1 [1.5μ㏖] 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 함유하는 10㎕ 최종 부피를 사용하여 수행하였다. 단리된 cfDNA를 각각의 EGFR ECD 돌연변이에 특이적인 프라이머를 사용하여 ddPCR 슈퍼믹스 포 프로브즈(Supermix for Probes)(바이오-라드)를 사용하여 증폭시켰다. 드롭렛 디지털 PCR(ddPCR)을 제조사의 프로토콜에 따라서 수행하고, 총(돌연변이체 + 야생형) DNA 대립유전자에 대한 돌연변이체 DNA 대립유전자의 백분율 또는 분율 존재비로서 결과를 기록하였다. 8 내지 10㎕의 DNA 템플레이트를 10㎕의 ddPCR 슈퍼믹스 포 프로브즈(바이오-라드) 및 2㎕의 프라이머/프로브 혼합물에 첨가하였다. 이러한 20㎕ 샘플을 70㎕의 드롭렛 제너레이션 오일 포 프로브즈(Droplet Generation Oil for Probes)(바이오-라드)에 첨가하고, 소적 생성을 위해서 사용하였다. 이어서, 소적을 다음 조건의 열 사이클링에 적용하였다: 95℃에서 5분, 30초 동안 94℃, 1분 동안 55℃, 이어서 10분 동안 98℃(상승 속도 2℃/초)의 40회 사이클. 이어서, FAM 및 HEX 프로브의 형광 측정을 위해서 샘플을 QX200 드롭렛 리더(Droplet Reader)(바이오-라드)로 옮겼다. 양성 대조군 및 음성 대조군을 기초로 게이팅을 수행하고, 돌연변이체 집단을 식별하였다. 야생형 DNA 배경 내의 돌연변이체 DNA의 분율 존재비를 퀀타소프트(QuantaSoft) 소프트웨어(바이오-라드)를 사용하여 각각의 샘플에 대해서 계산하였다. 각각의 샘플에 대해서 다회 반복검증(최소 3회)을 수행하였다. 오염물-무함유 대조군으로서의 다회 반복검증을 비롯하여, 세포주로부터의 정상 대조군 gDNA 및 DNA 템플레이트가 없는 (물) 대조군의 ddPCR을 모든 샘플과 병렬로 수행하였다.
실시예 1: EGFR 세포외 도메인( ECD ) 돌연변이체는 리간드 및 단클론성 항-EGFR 항체 제제에 결합하는 능력을 감소시켰다.
생물발광 공명 에너지 전달(Bioluminescence Resonance Energy Transfer: BRET)을 사용하여 살아있는 세포 내의 단백질들 간의 상호작용을 정량적으로 측정한다. 생물발광성 에너지 도너로서 NanoLuc(등록상표) 루피서라제를 사용하고, 에너지 억셉터로서 형광-표지된 HaloTag(등록상표) 단백질을 사용하는 NanoBRET(상표명) 시스템(프로메가)을 사용한다. EGF 리간드가 EGFR 돌연변이체에 결합할 수 있는지의 여부를 측정하기 위해서, EGFR 트레이서 용량 반응 검정법을 수행하였다. HEK 293 세포를 표시된 NanoLuc-EGFR 돌연변이체(도 1)를 발현하는 플라스미드로 형질감염시키고, 이어서 과량의 표지되지 않은 EGF의 존재(연회색선) 또는 부재(흑색선)하에서 EGF 트레이서(HaloTag-EGF)의 증가하는 용량으로 처리하여, EGF 트레이서가 NanoLuc-EGFR에 효과적으로 결합할 수 있는지를 평가한다. NanoBRET(상표명) Nano-Glo(등록상표) 기질을 첨가하고, 플레이트를 글로맥스(등록상표)-멀티 마이크로플레이트 멀티모드 리더를 사용하여 분석하였다. 본래 NanoBRET(상표명) 비율 값을 계산하기 위해서, 억셉터 방출값(618nm)을 각각의 샘플에 대한 도너 방출값(460nm)으로 나누었다.
도 1에 도시된 바와 같이, 리간드(EGF)와 EGFR 야생형(도 1a) 및 세포외 도메인 돌연변이체 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하였고, 돌연변이체는 EGFR R451C(도 1b), S464L(도 1c), K467T(도 1d), G465R(도 1e), I491M(도 1f), 및 S492R(도 1g)을 포함한다. 모든 EGFR 돌연변이체를 시험하였고, EGFR I491M을 제외하고는, 이러한 EGFR 트레이서 용량 반응 검정법에서 EGF 트레이서에 결합할 수 있었다.
실시예 2: MM-151은 약물 치환 검정법에서 모든 EGFR 엑토도메인 돌연변 이체에 결합할 수 있다.
EGFR 돌연변이체와 항-EGFR 치료제 간의 상호작용을 평가하기 위해서, 약물 치환 검정법을 수행하였다. HEK 293 세포를 야생형 EGFR(도 2a) 및 NanoLuc-EGFR 돌연변이체 EGFR R451C(도 2b), S464L(도 2c), K467T(도 2d), G465R(도 2e), I491M(도 2f), 및 S492R(도 2g)을 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 이어서, 돌연변이체를 30분 동안 항-EGFR 약물 세툭시맙("CMAB", 회색 삼각형), 파니투무맙("PMAB", 연회색 원) 또는 MM-151(흑색 원)의 증가하는 용량(0에서 100㎍/㎖) 및 18ng/㎖의 농도의 HaloTag-EGF(트레이서)으로 처리하였다. NanoBRET(상표명) Nano-Glo(등록상표) 기질을 첨가하고, 플레이트를 글로맥스(등록상표)-멀티 마이크로플레이트 멀티모드 리더를 사용하여 분석하였다. 본래 NanoBRET(상표명) 비율 값을 계산하기 위해서, 억셉터 방출값(618nm)을 각각의 샘플에 대한 도너 방출값(460nm)으로 나누었다.
도 2에 도시된 바와 같이, MM-151은 시험된 EGFR 돌연변이체 모두에 효과적으로 결합하지만, 세툭시맙은 EGFR-S464L, EGFR-G465R, 또는 EGFR-S492R에 결합하지 않았고, 파니투무맙은 EGFR-S464L 또는 EGFR-G465R에 효과적으로 결합하지 않았다. 따라서, 시험된 약물 중 MM-151 만이 모든 돌연변이체 EGFR 세포외 도메인에 결합할 것이다.
실시예 3: EGFR 엑토도메인 돌연변이체를 과별현하고 세툭시맙 또는 세툭 시맙과 파니투무맙 둘 모두에 내성인 LIM1215는 MM-151에 감응성이다.
LIM1215 세포(인간 결장직장 암종, 셀뱅크 오스트레일리아 카탈로그 # CBA-0161)를 표시된 EGFR 엑토도메인 돌연변이체, 및 GFP 대조군(도 3a)을 비롯한 대조군, EGFR 야생형(도 3b), EGFR R451C(도 3c), S464L(도 3d), K467T(도 3e), G465R(도 3f), I491M(도 3g), 및 S492R(도 3h)을 발현하는 렌티바이러스로 감염시켰다. 선택된 세포를 세툭시맙("CMAB", 진회색선), 파니투무맙("PMAB", 연회색선) 및 MM-151(흑색선)의 증가하는 농도로 6일 동안 처리하였다. 세포 생존력을 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 세툭시맙은 돌연변이 S464L, G465R, K467T, I491M, 또는 S492R을 갖는 EGFR을 발현하는 세포의 성장을 저해할 수 없었고; 파니투무맙은 돌연변이 S464L, G465R, 또는 I491M을 갖는 EGFR을 발현하는 세포의 성장을 저해할 수 없었다. 이에 반해서, MM-151은 시험된 모든 돌연변이체 및 대조군에서 세포 성장을 저해할 수 있었다.
실시예 4: MM-151은 세툭시맙 또는 세툭시맙과 파니투무맙 둘 모두에 내성인 LIM1215 - 과별현 EGFR 엑토도메인 돌연변이체에서 EGFR 하류 신호전달을 차단한다.
이전 실시예에서 관찰된 성장 저해가 EGF 신호전달 케스케이드의 차단으로 인한 것인지를 예증하기 위해서, LIM1215 인간 결장직장 암종 세포를 빈 벡터(empty vector) 대조군(도 4a), 야생형 EGFR(도 4b), 또는 R451C,(도 4c), S464L(도 4d), K467T(도 4e), G465R(도 4f), I491M(도 4g), 및 S492R(도 4h)을 포함하는 EGFR 세포외 도메인 돌연변이체를 발현하는 렌티바이러스로 감염시켰다. 선택된 세포를 세툭시맙("CETUX"), 파니투무맙("PMAB") 또는 MM-151의 존재하에서 2시간 동안 배양하고, EGF(5ng/㎖)로 15분 동안 자극시켰다. 포스포-EGFR("pEGFR"), 총 EGFR("TOT EGFR"), 포스포-AKT("pAKT"), 총 AKT("TOT AKT"), 포스포-ERK("pERK"), 총 ERK("TOT ERK"), 및 로딩 대조군으로서의 빈쿨린에 대한 항체를 사용하여 면역블롯팅을 수행하였다.
도 4a 내지 도 4h에 도시된 바와 같이, MM-151은 모든 대조군 세포 및 EGFR 세포외 도메인 돌연변이체를 발현하는 세포에서 EGFR 하류 신호전달을 저해할 수 있다. 이에 반해서, 세툭시맙은 K467T 또는 S492R 돌연변이를 발현하는 세포 내의 신호전달 저해에 효과적이지 않았고, 세툭시맙과 파니투무맙 둘 모두도 S464L, G465R, 또는 I491M 돌연변이를 발현하는 세포 내의 신호전달 억제에 효과적이지 않았다.
실시예 5: MM-151은 EGFR 엑토도메인 돌연변이가 발현될 때 LIM1215 세툭시맙 -내성 클론 세포집단의 증식을 효과적으로 저해한다.
LIM1215 야생형 세포, LIM1215 내성 세포 집단(즉, 야생형과 내성 세포의 혼합물을 갖는 세포 집단, 이들 중 일부는 EGFR-ECD 돌연변이를 보유함) 및 LIM1215 내성 클론(즉, 클론 집단으로 성장한 EGFR-ECD 돌연변이를 발현하는 단리된 세포)을 세툭시맙, 파니투무맙 또는 MM-151의 증가하는 농도(0.01㎍/㎖ 내지 100㎍/㎖)로 6일 동안 처리하였다. 세포 생존력을 상기에 기술된 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다. 모든 검정법을 적어도 3회 독립적으로 수행하였다. CMAB: 세툭시맙; PMAB: 파니투무맙.
도 5a에 도시된 바와 같이, 3종의 약물 모두는 야생형 세포에서 세포 생존력을 저해할 수 있었다. 이에 반해서, 3종의 약물은 모두 세포 중 하나의 내성 집단의 세포 생존력을 강하게 저해할 수 없었다(도 5b, "LIM1215 R5 pop"). MM-151 만이 세포의 제2 내성 집단의 세포 생존력을 저해할 수 있었고(도 5c, "LIM1215 R5 pop EGFR G465R"), 여기서 세포의 집단은 EGFR-ECD 돌연변이 G465R을 갖는다. EGFR-ECD 돌연변이 I491M을 보유하는 클론 집단(도 5d)에서, 3종의 약물 중 어느 것도 세포 생존력을 우수한 정도로 저해할 수 없었지만, MM-151로 처리된 세포의 생존력은 약간 감소하였다. EGFR-ECD 돌연변이 S492R을 보유하는 클론 집단(도 5e)에서, 세툭시맙 만이 세포 성장을 저해하는 데 실패하였다. 함께, 이들은 EGFR-ECD 돌연변이체를 발현하는 세포에 대한 3종의 약물 각각의 효과에 대해서 상기 실시예에서 인지되는 관찰을 확인해 준다.
실시예 6: MM-151은 OXCO -2 세툭시맙 -내성 세포의 증식에 약하게 영향을 미친다.
LIM1215 야생형 세포에서와 같이, OXCO-2 세포는 EGFR을 내생적으로 발현하고, 항-EGFR 치료제에 감응성이다. 따라서, 실시예 5에서 상기에 기술된 방법을 사용하여 OXCO-2 세포를 평가하였다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 3종의 약물 모두는 야생형 세포에서 세포 생존력을 저해할 수 있었다. 이에 반해서, 3종의 약물 중 어느 것도 세포의 하나의 내성 집단의 세포 생존력을 강하게 저해할 수 없었지만(도 6b), MM-151은 세툭시맙 및 파니투무맙에 비해서 세포 생존력에 약간 효과를 갖는 것으로 보였고; 유사한 결과가 도 6c에서 인지되었는데, 여기서는 세포가 EGFR ECD 돌연변이 I491M을 발현하는 클론 집단이다.
실시예 7: MM-151은 높은 수준의 EGFR 엑토도메인 돌연변이를 발현하는 CCK81 및 HCA46 세툭시맙-내성 세포의 증식을 효과적으로 저해한다.
실시예 5에서 세포에 대해서 기술된 바와 같이, CCK81 및 HCA46 야생형 및 내성 세포 집단을 세툭시맙, 파니투무맙 또는 MM-151의 증가하는 농도로 6일 동안 처리하였다. 세포 생존력을 상기 방법에서 기술된 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다. 다른 세포주와 같이, 3종의 약물 모두는 야생형 CCK81 세포의 생존력(도 7a) 및 야생형 HCA46 세포의 생존력(도 7c)을 저해하였다. 이에 반해서, S464L 돌연변이를 보유하는 CCK81 클론 세포 집단은 세툭시맙 또는 파니투무맙으로의 처리에 의해서 영향을 받지 않았지만, MM-151은 세포 생존력을 저해할 수 있었다(도 7b). 유사한 결과가 G465E 돌연변이를 보유하는 HCA46 세포의 클론 집단에 대해서 관찰되었다(도 7d).
실시예 8: MM-151은 세툭시맙 내성 세포에서 EGFR 하류 신호전달을 차단한다.
야생형 및 세툭시맙 내성 집단 및 클론을 세툭시맙("CETUX"), 파니투무맙("PMAB") 또는 MM-151의 존재하에서 2시간 동안 배양하고, EGF(10 ng/㎖)로 15분 동안 자극시켰다. 면역블롯팅을 포스포-EGFR,("pEGFR"), 총 EGFR("TOT EGFR"), 포스포-AKT("pAKT"), 총 AKT("TOT AKT"), 포스포-ERK("pERK"), 총 ERK("TOT ERK"), 및 로딩 대조군으로서의 빈쿨린에 대한 항체를 사용하여 수행하였다.
항-EGFR-감응성 세포주 LIM1215, OXCO-2, CCK81, 및 HCA46을 평가하였다. 도 8a 내지 8d에 도시된 바와 같이, MM-151은 모든 대조군 세포 및 EGFR 세포외 도메인 돌연변이체를 발현하는 세포에서 EGFR 하류 신호전달을 저해할 수 있었다. LIM1215 세포에서, 파니투무맙 및 세툭시맙 둘 모두는 세툭시맙-내성 세포("R5 pop"), EGFR-ECD 돌연변이 G465R("R5 CL55"), I491M("R1 CLONE4"), 또는 S492R("KI")을 발현하는 세포의 클론 집단을 저해할 수 없었다(도 8a). OXCO-2 세포에서, 파니투무맙 및 세툭시맙 둘 모두는 세툭시맙-내성 세포("R2")의 혼합 집단 또는 EGFR-ECD 돌연변이 I491M("R2 CL88")을 발현하는 세포의 클론 집단을 저해할 수 없었다. 이에 반해서, 이들은 NRAS 돌연변이를 보유하는 세포의 클론 집단에서 EGFR 신호전달을 약간 저해하였지만, EGFR-ECD 돌연변이("R2 CL113")에서는 그렇지 않았다(도 8b). CCK81 세포에서, 3종의 약물 모두는 야생형 세포를 저해하였지만, MM-151 만이 S464L 돌연변이("R1")를 보유하는 세포의 클론 집단을 저해하였다(도 8c). 최종적으로, HCA46 세포에서, CCK81 세포에서 인지되는 바와 같이, 3종의 약물 모두는 야생형 세포를 저해하였지만, MM-151 만이 G465E 돌연변이("R5")를 보유하는 세포의 클론 집단을 저해하였다(도 8d).
실시예 9: MM-151은 제노환자 - 유래된 세포 및 EGFR 엑토도메인 돌연변이를 발현하는 클론에서 증식을 효과적으로 저해한다.
제노환자 iCRC0104로부터 유래된 세포(환자 종양으로부터 단리되고, 이어서 시험관내에서 배양된 세포)(EGFR G465E를 가짐) 및 내성 유도성 클론을 세툭시맙, 파니투무맙 및 MM-151의 증가하는 농도로 6일 동안 처리하였다. CRC104 배양물(도 9a) 및 2종의 클론 세포 집단(cl.1, 도 9b, 및 cl.2, 도 9c)의 세포 생존력을 상기에 기술된 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다. 3종의 배양물 모두에서, MM-151은 세포 생존력을 저해할 수 있는 반면, 세툭시맙 및 파니투무맙은 혼합된 세포 집단에서 생존력을 단지 매우 약하게 저해할 수 있었고(도 9a), 제2 클론 세포 집단에서는 단지 매우 높은 농도에서 생존력을 저해할 수 있었다(도 9c). 세툭시맙 및 파니투무맙은 제1 클론 세포 집단의 세포 생존력을 저해하지 않았다(도 9b).
실시예 10: EGFR - ECD 돌연변이체에 대한 3종의 항체 혼합물의 결합
EGFR-ECD 도메인의 도메인 III에만 결합하는 단클론성 항체 제제와 달리, 도메인 III에 더하여 세포외 도메인의 다른 부분에 결합하는, MM-151 항체 혼합물은 다수의 EGFR-ECD 돌연변이체에 대한 결합에 효과적이다. 다른 혼합물이 동일한 활성을 유발것인지의 여부를 결정하기 위해서, 무-세포 결합 실험을 하기에 기술된 바와 같이 수행하였다.
생물층 간섭 측정 검정법(포르테바이오(ForteBio)(등록상표)) 전에 모든 시약을 평형화시키고, 샘플을 실온에 두었다. 로딩 전에, 스트렙타비딘 바이오센서를 10분 동안 단백질-무함유 차단 완충액(피어스) 중에서 수화시켜서 임의의 비-특이적인 결합을 최소화하였다. 옥텟(Octet)(등록상표) 소프트웨어를 사용하고, 제조사의 지시서에 따른 절차를 사용하여 검정법을 수행하였다. 검정법은 하기 단계로 이루어졌다: 1X PBS 중에서 5분의 평형화, 1분의 비오티닐화된 항체 로딩(10㎍/㎖), 1분의 기준선 안정화, 열거된 EGFR의 세포외 도메인 변이체(500nM)로의 3분의 인큐베이션, 1분의 기준선 안정화, 열거된 제1 항체(500nM의 P3X 또는 "sym992")와 함께 3분 인큐베이션, 또 다른 1분의 기준선 안정화 후 열거된 제 항체(500nM의 P1X 또는 25E)와의 3분의 인큐베이션. 1X PBS를 전체적으로 매트릭스로서 사용하였다. 데이터를 분석하였고, 옥텟(등록상표) 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.
도 10a는 MM-151를 평가하는 무-세포 결합 실험을 나타낸다. 3종의 ECD 돌연변이체, K467T, R451C, 및 S492R은 항체 P2X에 성공적으로 결합하였고, 3종의 ECD 돌연변이체 모두의 경우, P3X가 또한 결합할 수 있다. ECD의 도메인 III에 결합하는, P1X는 K467T 및 R451C ECD 돌연변이체에 결합할 수 있지만, S492R 돌연변이체에는 결합할 수 없다. 유사한 결과가 도 10b에서 인지되었는데, 여기서는 P1X가 유사한 항체 25E로 대체되었다. 도 10c에 도시된 2종-항체 혼합물(제1 항체("sym1024")를 사용하여 모든 3종의 돌연변이체 세포외 도메인에 결합할 수 있음)은 K467T 및 R451C ECD 돌연변이체에 결합할 수 있지만, S492R 돌연변이체에 결합할 수 없었다. 함께, 이들 결과는 적어도 2종의 항체를 사용하여 EGFR 엑토도메인 돌연변이체에 개입하는 MM-151 올리고클론성 혼합물의 능력에 대한 상기 실시예에서 인지된 관찰을 확인해 준다. 추가로, 이들 결과는, 이 효과가 MM-151 및 관련된 3종의 항체의 조합물에 대해서 관찰되지만, sym-992와 sym-1024의 올리고클론성 혼합물에 대해서는 관찰되지 않음을 예증한다.
실시예 11: EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이체를 과발현하는 LIM1215는 세툭시맙 및 Sym004 둘 모두에 내성이고, MM-151에 감응성이다 .
LIM1215(#2) 세포주를 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현하는 플라스미드로 안정하게 형질감염시켰다. 선택된 세포를 8nM EGF 리간드의 존재하에서 세툭시맙("CMAB", 진회색선), sym-992와 sym-1024의 2종-항체 혼합물("Sym004", 연회색선) 및 MM-151(흑색선)의 증가하는 농도로 3일 동안 처리하였다. 세포 생존력을 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다. 도 11a 및 도 11b에 도시된 바와 같이, 세툭시맙은 야생형 EGFR를 발현하는 세포(형질감염되지 않음 대조군) 또는 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포의 성장을 저해할 수 없었고, Sym004 2종의-항체 혼합물은 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포의 성장을 저해할 수 없었다. 이에 반해서, MM-151은 야생형 EGFR을 발현하는 세포 및 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포의 성장을 저해할 수 있었다.
실시예 12: EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이체를 발현 또는 과별현하는 LIM1215는 생체내 이종이식 모델에서 세툭시맙 모두에 내성이고, MM-151에 감응성이다 .
하기 3종의 세포주-LIM1215(#2), LIM1215(#2) EGFR S492R KI(EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현하도록 조작됨), 또는 LIM1215(#2) EGFR S492R(EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현하는 플라스미드로 안정하게 형질감염됨)로 접종된 암컷 nu/nu 마우스에서 뮤린 이종이식 효능 연구를 수행하였다. 종양을 300㎣으로 성장시키고, 이어서, 마우스를 10개의 처리군으로 무작위화하였다. 무작위화 이후에, 마우스를 PBS(비히클 대조군), 세툭시맙, 또는 MM-151 툴 화합물로 2주 동안 치료하였다. 도 12a에 도시된 바와 같이, 모 LIM1215(#2) 세포주는 2개의 표시된 용량 수준에서 세툭시맙 및 MM-151 둘 모두에 감응성이다. 도 12b 및 도 12c에 도시된 바와 같이, 세툭시맙은 2개의 표시된 용량 수준에서 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이의 발현(도 12b) 및 과발현(도 12c)을 보유하는 세포주의 종양 성장을 저해할 수 없었다. 이에 반해서, MM-151은 두 용량 모두에서 종양 성장을 저해할 수 있었다.
실시예 13: 환자의 회전 무-세포 DNA에서 EGFR ECD 돌연변이의 종적 모니터링은 MM-151 요법에 대한 반응의 마커로서 기능할 수 있다.
MM-151 제1 상 임상 연구(NCT #01520389)(25)에서 수집된 혈청 샘플의 하위세트에서 순환 무-세포 DNA에서의 EGFR ECD 돌연변이의 분석을 수행하였다. 하위세트는 항-EGFR 항체(예를 들어 세툭시맙, 파니투무맙)에 노출 이전이라고 문서화된 11명의 결장직장암 환자를 포함하였고, 그들로부터 적절한 혈청 샘플을 입수하였다. 11명의 환자 중 2명에서 MM-151를 제1 투여하기 전에 기준선 샘플에서 드롭렛 디지털 PCR에 의해서 EGFR ECD 돌연변이를 검출하였다. MM-151 처리의 기간 동안 수집된 샘플에서 종적 분석을 수행하였고, MM-151 투여 동안 변화된 무-세포 DNA 중의 EGFR ECD 돌연변이의 대립유전자 빈도를 강조하였다. 환자 095에서 관찰된 EGFR G465E 돌연변이의 대립유전자 빈도의 극명한 감소가 CT 스캔에 의해서 대략 4주 후에 관찰된 종양 부피에서의 상당한 감소를 예상하였다(도 13a). EGFR S464L 및 G465R 돌연변이 각각에서의 감소 및 안정화는 환자 051에서 관찰된 연장된 질환 안정화를 동반한다(도 13b). 이들 돌연변이의 대립유전자 빈도의 감소의 반전은 24주에서 진행이 예상되었다.
실시예 14: EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포에 대한 개별 항체의 결합
유세포 분석법 결합 실험을 수행하여 세툭시맙("CMAB") 및 MM-151 혼합물(P1X, P2X, 및 P3X)의 3종의 성분 항체가 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현하도록 조작된 세포("LIM1215(#2) EGFR S492R KI", 회색 막대)(도 14)에 결합하는 정도를 평가하였다. 세포를 포화 농도(0.1μM)의 Alexa-488-표지된 항체와 함께 얼음(4℃) 상에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 항체에 대해서, 평균 형광 강도(mean fluoresence intensity: MFI) 값을 측정하고, EGFR 야생형 대조군(LIM1215(#2) EGFR S492 야생형, 흑색 막대)을 사용한 MFI에 정규화하였다. 실시예 10에 기술된 무-세포 결합 검정법으로부터의 결과와 일치하게, 세툭시맙 및 P1X의 결합은 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현하도록 조작된 세포 상에서 감소되지만, P2X 및 P3X 항체의 결합은 영향을 받지 않는다.
실시예 15: EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이체를 과별현하거나 또는 발현하도록 조작된 LIM1215는 세툭시맙 , 파니투무맙 , 및 Sym004에 내성이고, MM-151에 감응성이다 .
야생형 EGFR을 발현하는 세포(LIM1215(#2) EGFR S492 야생형), 야생형 EGFR에 더하여 EGFR S492R 돌연변이를 과별하는 세포(LIMI1215(#2) EGFR S492R), 및 유전자 에디팅을 통해서 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포(LIM1215(#2) EGFR S492R KI)를 사용하여 세포 생존력 실험을 수행하였다. 세포를 8nM EGF 리간드의 존재하에서 세툭시맙("CMAB"), 파니투무맙("PMAB"), sym-992와 sym-1024의 2종-항체 혼합물("Sym004") 및 MM-151로 3일 동알 처리하였다. 세포 생존력을 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검정법에 의해서 측정하였다.
도 15a에 도시된 바와 같이, 세툭시맙(흑색) 및 파니투무맙(진회색)은 야생형 EGFR을 발현하는 세포 또는 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포의 성장을 저해할 수 없었고, Sym004 2종의-항체 혼합물(연회색)은 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포의 성장을 저해할 수 없었다. 이에 반해서, MM-151(흑색 및 백색 스트라이프 패턴)은 야생형 EGFR을 발현하는 세포, EGFR S492R 돌연변이를 과발현하는 세포 또는 EGFR S492R 돌연변이를 발현하도록 조작된 세포의 세포 성장을 저해할 수 있었다. 모든 항체를 1μM의 농도로 투여하였다.
LIM1215(#2) EGFR S492 야생형 및 LIM1215(#2) EGFR S492R KI 세포를 사용하고, 8nM EGF 리간드의 존재하에서 세툭시맙(삼각형 마커가 있는 진회색선), 파니투무맙(다이아몬드 마커가 있는 연회색선), Sym004 (원 마커가 있는 회색선), 또는 MM-151(사각형 마커가 있는 흑색선)의 증가하는 농도를 사용하여 제2 실험을 수행하였다(도 15b 및 도 15c). 세툭시맙 및 파니투무맙은 야생형 EGFR을 발현하는 세포 또는 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포의 성장을 저해할 수 없었다. Sym004는 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포를 저해할 수 없었다. 이에 반해서, MM-151은 야생형 EGFR을 발현하는 세포(Sym004에 비해서 개선된 효력으로) 및 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포를 저해할 수 있었다.
실시예 16: EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포 또는 EGFR G465R 돌연변이를 발현하는 세포의 확장은 세툭시맙으로의 치료 기간 동안 관찰되고, MM- 151에 의 해서 저해된다.
종양(여기서 다른 세포는 야생형 EGFR을 발현함)에서 EGFR 돌연변이를 함유하는 세포의 선택적인 확장 오버 타임을 모방하기 위해서, 2개의 시험관내 풀링된 배양 실험을 수행하여 2종의 대표 EGFR 엑토도메인 돌연변이-EGFR S492R(도 16a) 및 EGFR G465R(도 16b)-의 대립유전자 빈도의 변화를 세툭시맙(삼각형이 있는 회색선) 마커, MM-151(사각형 마커가 있는 흑색선), 또는 배지 단독(원 마커가 있는 연회색선)으로의 처리 기간에 걸쳐서 평가하였다. 각각 EGFR S492R 또는 EGFR G465R 엑토도메인 돌연변이(실선)를 발현하도록 조작된 세포를 함유하는 LIM1215(#2)의 풀링된 배양물을 사용하여 제15일 또는 7일 실험을 수행하였다. EGFR S492R 실험에서의 대조군으로서, 야생형 EGFR을 발현하는 LIM1215(#2) 세포의 풀링된 배양물(야생형 EGFR 유전형을 유지하도록 비-표적화 sgRNA로 조작됨: 점선). 처리전 0일에 그리고 세포를 새로운 플레이트로 옮기고(각각의 프레이트 내의 세포의 대략 1/2), 게놈 DNA를 추출하기 전 4일, 10일, 및 15일에, 세포를 펠렛화하였다(5x105세포).
게놈 DNA에서 EGFR S492R 및 EGFR G465R 엑토도메인 돌연변이의 대립유전자 빈도를 드롭렛 디지털 PCR에 의해서 평가하였다. 예측된 바와 같이, S492R 대립유전자 빈도는 모든 실험일에 야생형 대조군 웰(처리에 관계없이)에서 0%인 것으로 측정되었다. 처리 전(0일)에 EGFR S492R 웰 중의 평균 S492R 대립유전자 빈도는 4.6%로서 측정되었고, 15일에 걸쳐서 단독 배지의 존재하에서 변함없이 유지되었다(범위: 4.6 내지 3.8%). 유사하게, EGFR G465R 웰에서 처리 전(0일)에 평균 G465R 대립유전자 빈도는 0.6%로서 측정되었고, 7일에 걸쳐서 단독 배지의 존재하에서 변함없이 유지되었다(범위: 0.3 내지 0.6%).
세툭시맙으로 처리된 EGFR S492R 웰에서 평균 대립유전자 빈도는 15일 기간에 걸쳐서 4.6%에서 42.1%로 증가되었다. 이에 반해서, MM-151로의 처리는 EGFR S492R 웰에서 평균 S492R 대립유전자 빈도를 4.6%에서 0.3%로 감소시켰다. 유사하게, 세툭시맙으로 처리된 EGFR G465R 웰에서 평균 대립유전자 빈도는 7일의 기간에 걸쳐서 0.6%에서 9.8%로 증가되었다. 이에 반해서, MM-151로의 처리는 EGFR G465R 웰에서 평균 G465R 대립유전자 빈도를 0.6%에서 0.3%로 감소시켰다.
실시예 17: 공지된 EGFR 세포외 도메인 돌연변이가 EGFR 상의 67 아미노산 서열로 단리된다 .
인간 EGFR 유전자는 1210개의 아미노산 서열을 암호화하는 28개의 엑손을 포함한다(도 17a). EGFR 단백질은 7개의 구조 단백질 도메인 및 아미노산 1 내지 24를 포함하는 추정 신호 펩타이드를 포함한다. 621개의 아미노산 및 제1 15 엑손(엑손 #15는 세포외 도메인 IV와 막관통 도메인에 걸쳐 있음)을 함께 포함하는 4개의 세포외 도메인(I, II, III, IV)이 존재한다.
EGFR 엑토도메인 돌연변이는 엑손 12에서 식별되었고, 이것은 아미노산 433 내지 499를 암호화한다. 도 17b에는 임상 및/또는 전임상 연구에서 식별되고, 문헌에 보고된 대표 돌연변이의 표가 나타나 있다. 이 영역은 세포외 도메인 III의 단부 부분과 도메인 IV의 시작 부분에 걸쳐있다.
실시예 18: MM-151은 대표 S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현하거나 과발현하는 LIM1215에서 저 친화성 EGFR 리간드 및 고 친화성 EGFR 리간드 둘 모두에 의해서 EGFR의 활성화를 차단한다.
이전 실시예 15 및 실시예 16에서 관찰된 성장 저해 및 클론 확장 저해가 EGFR 신호전달의 차단으로 인한 것이라는 것을 예증하기 위해서, 야생형 EGFR을 발현하는 세포(LIM1215(#2) EGFR S492 야생형), 야생형 EGFR에 더하여 EGFR S492R 돌연변이를 과발현하는 세포(LIMI1215(#2) EGFR S492R), 및 유전자 에디팅을 통해서 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포(LIM1215(#2) EGFR S492R KI)를 사용하여 포스포-EGFR 저해 검정법을 수행하였다. 세포를 세툭시맙으로 24시간 동안 처리하고, sym-992와 sym-1024의 2종의-항체 혼합물("Sym004") 및 MM-151로 처리하고, 8nM EGF 또는 AREG 리간드로 10분 동안 자극시켰다. 포스포-EGFR("pEGFR")에 대한 항체 및 로딩 대조군으로서 액틴을 사용하여 면역블롯팅을 수행하였다.
도 18에 도시된 바와 같이, MM-151은 LIM1215(#2) 대조군 세포 및 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현하거나 과발현하는 세포에서 AREG 및 EGF 리간드에 의해서 EGFR 활성화를 저해할 수 있다. 이에 반해서, 세툭시맙 및 Sym004은 야생형 EGFR을 발현하는 세포에서 EGFR 활성화를 억제할 수 있지만, 이들은 EGFR S492R 돌연변이의 발현 또는 과발현에서 AREG 및 EGF에 의해서 활성화된 포스포-EGFR의 단지 부분적이거나 또는 효과적이지 않은 저해를 도출하였다.
실시예 19: MM-151은 대표 S492R 엑토도메인 돌연변이를 발현 또는 과발현하는 LIM1215 세포에서 저 친화성 EGFR 리간드 및 고 친화성 EGFR 리간드 둘 모두에 의해서 ERK의 활성화를 차단한다.
이전 실시예 15 및 실시예 16에서 관찰된 성장 저해 및 클론 확장 저해가 EGFR의 하류에서의 세포 신호전달의 차단으로 인한 것이라는 것을 예증하기 위해서, 야생형 EGFR을 발현하는 세포(LIM1215(#2) EGFR S492 야생형), 야생형 EGFR에 더하여 EGFR S492R 돌연변이를 과발현하는 세포(LIM1215(#2) EGFR S492R), 및 유전자 에디팅을 통해서 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포(LIM1215(#2) EGFR S492R KI)를 사용하여 포스포-ERK 저해 검정법을 수행하였다. 세포를 세툭시맙, sym-992와 sym-1024의 2종의-항체 혼합물("Sym004") 및 MM-151로 2시간 동안 처리하고, 이어서 8nM EGF 또는 AREG 리간드로 10분 동안 자극시켰다. ELISA 실험을 수행하여 ERK의 활성화(포스포-ERK)를 측정하였다.
도 19a에 도시된 바와 같이, MM-151은 LIM1215(#2) 대조군 세포에서 EGF에 의한 ERK 활성화를 저해할 수 있거나 EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이의 과별현을 저해할 수 있다. 이에 반해서, 세툭시맙 및 Sym004 만이 대조군 세포에서 포스포-ERK를 저해하고, 파니투무맙 만이 대조군 세포 및 조작된 LIM1215(#2) EGFR S492R KI 세포에서 포스포-ERK를 저해한다. 세툭시맙, 파니투무맙, 및 Sym004은 EGFR S492R 돌연변이를 과발현하는 세포에서 포스포-ERK를 저해하는 데 효과적이지 않다.
도 19b 및 도 19c는 250nM 농도의 약물로 처리하고, 그 후 8nM의 EGF 또는 AREG 리간드로 10분 동안 자극시킨 것에 의한 포스포-ERK의 저해를 나타낸다. MM-151은 3종의 세포주에서 AREG 및 EGF 리간드에 의해서 활성화된 포스포-ERK를 저해할 수 있다. 이에 반해서, 세툭시맙 및 파니투무맙은 EGF 리간드에 의해서 자극된 포스포-ERK를 저해하는 데 효과적이지 않고, Sym004는 LIM1215(#2) 대조군 세포에서만 약간의 저해를 제공한다. 세툭시맙, 파니투무맙, 및 Sym004는 LIM1215(#2) 대조군 세포에서 AREG 리간드에 의해서 활성화된 포스포-ERK를 저해할 수 있지만, EGFR S492R 돌연변이를 발현하거나 과별현하는 세포에서 효과적이지 않거나 부분적인 저해를 제공한다.
실시예 20: EGFR S492R 엑토도메인 돌연변이체를 발현 또는 과별현하는 저 친화성 EGFR 리간드 또는 고 친화성 EGFR 리간드에 의해서 자극된 LIM1215 세포의 성장은 MM-151에 의해서 저해되고, 세툭시맙에 내성이고, 파니투무맙 및 Sym004에 의해서 단지 선택적으로 저해된다.
MM-151이 대표 EGFR S492R 돌연변이의 발현을 보유하는 세포에서 리간드-의존성 세포 성장 및 리간드-자극성 세포 성장 둘 모두를 저해하는지를 예증하기 위해서, 야생형 EGFR을 발현하는 세포(LIM1215(#2) EGFR S492 야생형), 야생형 EGFR에 더하여 EGFR S492R 돌연변이를 과발현하는 세포(LIM1215(#2) EGFR S492R), 및 유전자 에디팅을 통해서 EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포(LIM1215(#2) EGFR S492R KI)를 사용하여 세포 성장 검정법을 수행하였다.
세포를 8nM EGF 또는 AREG 리간드의 존재하에서 세툭시맙("CMAB", 삼각형 마커가 있는 진회색선), 파니투무맙("PMAB"; 다이아몬드 마커가 있는 연회색선), sym-992와 sym-1024의 2종의-항체 혼합물("Sym004", 원형 마커가 있는 진회색선) 및 MM-151(사각형 마커가 있는 흑색선)의 증가하는 농도와 함께 라이브-셀 이미저 상에서 3일 동안 인큐베이션시켰다. 웰의 컨플루언스를 72시간 실험에 걸쳐서 2-시간 간격으로 평가하였고, 이를 사용하여 각각의 조건하에서 세포 성장률을 계산하였다.
도 20a 및 도 20b에 도시된 바와 같이, 리간드가 없는 LIM1215(#2) 세포의 세포 성장률, 및 저-친화성 EGFR 리간드 AREG로 자극된 LIM1215(#2) 세포의 세포 성장률은 4종 약물 모두에 의해서 저해되었다. 그러나, 도 20c에 도시된 바와 같이, 세툭시맙 및 파니투무맙은 이러한 세포주에서 고-친화성 EGFR 리간드 EGF에 의해서 자극된 세포 성장을 저해할 수 없는 반면, Sym004는 (리간드가 없는 대조군에 대해서) 부분적인 저해를 도출한다. 이에 반해서, MM-151은 (리간드가 없는 대조군보다 낮은) 강한 저해를 도출한다.
LIM1215(#2) EGFR S492R KI 세포주를 사용하여 제2 실험을 수행하였다. 도 20d 내지 도 20f에 도시된 바와 같이, EGFR S492R 돌연변이를 발현하는 세포는 단독으로 또는 외인성 AREG 또는 EGF와 함께 배지 중에서 성장되는 경우 세툭시맙에 내성이다. 도 20e에 도시된 바와 같이, 저-친화성 EGFR 리간드 AREG로의 자극은 (도 20b에서 모 세포주와 비교할 때) Sym004에 의해서 제공된 저해를 감소시키지만, 파니투무맙 및 MM-151에 대한 감응성을 보유한다. 도 20f에 도시된 바와 같이, EGF에 의해서 자극된 세포 성장은 MM-151에 의해서만 저해된다.
LIM1215(#2) EGFR S492R 세포주를 사용하여 제3 실험을 수행하였다(도 20g 내지 도 20i). EGFR S492R 돌연변이를 과발현하는 세포는 단독으로 또는 외인성 AREG 또는 EGF와 함께 배지 중에서 성장되는 경우 세툭시맙에 내성이다. Sym004는 배지 단독에서 세포 성장의 부분적 저해를 제공하지만, 리간드-의존성 세포 성장(AREG 또는 EGF)은 저해하지 않는다. 파니투무맙은 단독으로 그리고 AREG의 존재하에서 배지 중에서 세포 성장을 저해하지만, EGF의 존재하에서는 그러하지 않다. 이에 반해서, MM-151은 대표 EGFR S492R 돌연변이를 과발현하는 세포에서 리간드-독립성 세포 성장 및 리간드-의존성 세포 성장 둘 모두를 저해한다.
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SEQUENCE LISTING <110> MERRIMACK PHARMACEUTICALS, INC. <120> METHODS OF TREATING PATIENTS HAVING MUTATIONS IN THE EXTRACELLULAR DOMAIN OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFR) WITH A COMBINATION OF THREE FULLY HUMAN MONOCLONAL ANTI-EGFR ANTIBODIES <130> MMJ-054PC <140> PCT/US2016/028987 <141> 2016-04-22 <150> 62/323,475 <151> 2016-04-15 <150> 62/308,697 <151> 2016-03-15 <150> 62/244,991 <151> 2015-10-22 <150> 62/152,707 <151> 2015-04-24 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Asp Pro 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 23 Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Leu Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Ser Val Pro 115 120 125 Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 24 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 24 Met Gly Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr 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acaaataaag caatagcatc 3360 acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc 3420 atcaatgtat cttatcatgt ctggctctag ctatcccgcc cctaactccg cccatcccgc 3480 ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt 3540 atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt 3600 ttggaggcct agggacgtac ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattacg cgcgctcact 3660 ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 3720 tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 3780 ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atgggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag 3840 cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc 3900 cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc 3960 tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa 4020 aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg 4080 ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac 4140 actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg 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agctcgatac ataaacgggt 6720 ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc 6780 ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg 6840 actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg 6900 gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac 6960 tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa 7020 aattttgact agcggaggct agaaggagag agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg 7080 ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata 7140 taaattaaaa catatagtat gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg 7200 cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca aatactggga cagctacaac catcccttca 7260 gacaggatca gaagaactta gatcattata taatacagta gcaaccctct attgtgtgca 7320 tcaaaggata gagataaaag acaccaagga agctttagac aagatagagg aagagcaaaa 7380 caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc cgctgatctt cagacctgga ggaggagata 7440 tgagggacaa ttggagaagt gaattatata aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag 7500 gagtagcacc caccaaggca aagagaagag tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa 7560 taggagcttt gttccttggg ttcttgggag cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa 7620 tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt 7680 tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc 7740 agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga 7800 tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca ccactgctgt gccttggaat gctagttgga 7860 gtaataaatc tctggaacag atttggaatc acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa 7920 ttaacaatta cacaagctta atacactcct taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa 7980 agaatgaaca agaattattg gaattagata aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca 8040 taacaaattg gctgtggtat ataaaattat tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt 8100 taagaatagt ttttgctgta ctttctatag tgaatagagt taggcaggga tattcaccat 8160 tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga ggggaccctt gcgccttttc caaggcagcc 8220 ctgggtttgc gcagggacgc ggctgctctg ggcgtggttc cgggaaacgc agcggcgccg 8280 accctgggtc tcgcacattc ttcacgtccg ttcgcagcgt cacccggatc ttcgccgcta 8340 cccttgtggg ccccccggcg acgcttcctg ctccgcccct 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cctcttacac ccagtggaga agctcccaac 2100 caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc 2160 ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt 2220 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc 2280 gatgaagcct acgtgatggc cagcgtggac aacccccacg tgtgccgcct gctgggcatc 2340 tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcacg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac 2400 tatgtccggg aacacaaaga caatattggc tcccagtacc tgctcaactg gtgtgtgcag 2460 atcgcaaagg gcatgaacta cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga cctggcagcc 2520 aggaacgtac tggtgaaaac accgcagcat gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa 2580 ctgctgggtg cggaagagaa agaataccat gcagaaggag gcaaagtgcc tatcaagtgg 2640 atggcattgg aatcaatttt acacagaatc tatacccacc agagtgatgt ctggagctac 2700 ggggtgaccg tttgggagtt gatgaccttt ggatccaagc catatgacgg aatccctgcc 2760 agcgagatct cctccatcct ggagaaagga gaacgcctcc ctcagccacc catatgtacc 2820 atcgatgtct acatgatcat ggtcaagtgc tggatgatag acgcagatag tcgcccaaag 2880 ttccgtgagt tgatcatcga attctccaaa atggcccgcg acccccagcg ctaccttgtc 2940 attcaggggg atgaaagaat gcatttgcca agtcctacag actccaactt ctaccgtgcc 3000 ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag 3060 cagggcttct tcagcagccc ctccacgtca agaacgccgt tattatcgag cttgagtgca 3120 accagcaaca attccaccgt ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgcccgatt 3180 aaagaggatt cgttcttgca gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac 3240 agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg 3300 cccgctggct ctgtgcagaa tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc 3360 cgcgacccac actaccagga cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac 3420 actgtccagc ccacctgtgt caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaag 3480 ggttcgcatc agatctcgtt agacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa 3540 gccaagccaa atggcatctt taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc 3600 gcgccacaat cgtccgagtt cataggtgct tga 3633 <210> 34 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 34 caactccata aactaaacag aaagcggtga cttactgcag ctgttttcac ctctgtttct 60 tataattttg gttttctgac cggaggtccc aaacagtttt ttccagttta ttgta 115 <210> 35 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 35 ccaaacagtt ttttccagtt tattgtattt gcatagcaca aatttttgtt tcttgaaatt 60 atcacatctc catcacttat ctccttgagc gagcgtaatc c 101 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 36 gggttcgcat cagatctcgt ta 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 37 tcaagcacct atgaactcgg ac 22 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 38 aattttggtt ttctgaccgg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA 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Claims (11)

  1. EGFR R451C, S464L, K467T, G465R, G465E, I491M, 및 S492R로 이루어진 군으로부터 선택된 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 세포외 도메인(ECD) 내에 적어도 하나의 검출되는 돌연변이를 갖는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암의 치료에서의 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도로서, 상기 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물은 3종의 단클론성 항체를 포함하되, 제1 단클론성 항체는 P1X이고, 제2 단클론성 항체는 P2X이고, 제3 단클론성 항체는 P3X이고, 상기 올리고클론성 항체 조합물은 P1X, P2X 및 P3X를 2:2:1의 몰비로 포함하는, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도.
  2. 인간 환자에서 EGFR 세포외 도메인(ECD) 돌연변이 암의 치료에서의 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도로서, 상기 올리고클론성 항체 조합물은 하기 항체들을 포함하는, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도:
    a. 각각 서열번호 1, 2, 및 3의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 4, 5, 및 6의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 제1 단클론성 항체;
    b. 각각 서열번호 7, 8, 및 9의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 10, 11 및 12의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 제2 단클론성 항체; 및
    c. 각각 서열번호 13, 14, 및 15의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 16, 17, 및 18의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 제3 단클론성 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 단클론성 항체는 P1X이고, 상기 제2 단클론성 항체는 P2X이고, 상기 제3 단클론성 항체는 P3X이고, 상기 올리고클론성 항체 조합물은 P1X, P2X 및 P3X를 2:2:1의 몰비로 포함하는, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상이한 항-EGFR 요법으로 상기 암을 치료한 단계 이후인, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세툭시맙, 파니투무맙 또는 Sym004로 상기 암을 치료한 단계 및 상기 인간 환자에서 상기 EGFR의 ECD 영역 내에서 엑손 12 돌연변이를 검출한 단계 이후인, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도.
  6. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자에서 상기 EGFR의 ECD 영역 내에서 엑손 12 돌연변이를 검출한 단계 이후인, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 K-Ras, N-Ras, 및/또는 BRAF 야생형 전이성 결장직장암(colorectal cancer)인, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도.
  8. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자의 혈액 또는 소변에서 상기 EGFR 세포외 도메인의 도메인 III 내에서 돌연변이를 검출한 단계 이후인, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도.
  9. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계, 및 상기 혈액 샘플이 상기 EGFR의 세포외 도메인을 암호화하는 서열 내에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 순환 DNA를 함유하는지를 결정하는 단계 이후인, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도.
  10. 제9항에 있어서, 상기 EGFR의 세포외 도메인 내의 상기 적어도 하나의 돌연변이는 EGFR R451C, S464L, K467T, G465R, G465E I491M, 및 S492R로 이루어진 군으로부터 선택된, 단백질 서열 변화, 또는 단백질 서열 변화를 유발하는 DNA 또는 RNA 암호 영역인, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 두경부암 또는 Ras 야생형 결장직장암인, 올리고클론성 항-표피 성장 인자 수용체(항-EGFR) 항체 조합물의 용도.
KR1020177033528A 2015-04-24 2016-04-22 표피 성장 인자 수용체(egfr)의 세포외 도메인 내에 돌연변이를 갖는 환자를 3종의 완전 인간 단클론성 항-egfr 항체의 조합물로 치료하는 방법 KR20170138539A (ko)

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