JPH11505322A - Ｔｇｆ−ベータリセプター中の変異に基づく癌の診断および治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、II型TGFβリセプター（RII）が、変異誘導型／マイクロサテライトの不安定性／RERとして特定されたクラスのほとんどすべての結腸癌を含む結腸癌の、およそ25％において遺伝子的に不活性化されている（変異した）癌抑制遺伝子であるという発見に基づく。方法は癌の診断あるいは予後において使用するRIIの不活性化を検出するために提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＴＧＦ−ベータリセプター中の変異に基づく癌の診断および治療 本発明に通じる活動は、国立衛生研究所からの助成金番号CA38173，CA50457， CA51504，CA57208およびCA51183により支持された。米国政府は本発明の特定の 権利を保持する。発明の背景 発明の属する分野 本発明は、表現型による腫瘍の分類の助けとなる診断方法および特定の腫瘍表 現型にあつらえられた治療上の干渉に関する。特定すれば、本発明は、転換性成 長因子（transforming growth factor beta：TGFβ）による成長抑圧を不活性化 する、TGFβのタイプIIリセプター（RII）の変異形態、TGFβのRIIリセプターの 不活性化の検出法、およびRII機能を復帰させることによる腫瘍抑圧の復帰のた めの治療法に関する。 関連技術の調査 TGFβは複数の上皮細胞種の成長を阻害し、この負の制御の損失は腫瘍の発生 に寄与すると考えられる（Roberts，et al.，1990，「ペプチド成長因子類およ びそれらのリセプター（Peptide Growth Factors and Their Receptors）」、Ha ndbook of Experimental Pharmacology，A．Roberts and M．Sporn，編集、（Sp ell Biol.，6：597；Moses，et al.，1990，Cell，63：247；Filmus，et al，19 93，Curr．Opin．Oncol.，5：123；Markowitz，S.，et al.，1994，J．Clin．In vest.，93：1005；Wu，S.，et al.，1992，J．Cell Biol.，116：187；Wu，S.， et al.，1993，Cell Growth Differ.，4：115；Park，J．et al.，1994，Proc． Natl．Acad．Sci．U．S．A.，91：8772；Manning，et al.，1991，Oncogene，6 ：1471；Hoosein，N.，et al.，1989，Exp．Cell Res.，181：442；Geiser，et al.，1992，J．Biol．Chem.，267：2588）。以前の研究からは、TGFβが特定の 癌細胞系を抑圧すること、TGFβのアンチセンス阻害が弱い腫瘍性癌細胞系の腫 瘍性を高めること、そして特定の腫瘍細胞がTGFβに非応答性となりうることが 明らかとなった（Markowitz，et al.，1994，J．Clin．Invest.，93：1005；Wu ，S.，et al.，1992，J．Cell Biol.，116：187；Wu，S.，et al.，1993，Cell Growth Differ.，4：115；Park，J．et al.，1994，Proc．Natl．Acad．Sci．U ．S．A.，91：8772；Manning，et al.，1991，Oncogene，6：1471；Hoosein，N. ，et al.，1989，Exp．Cell Res.，181：442；Geiser，et al.，1992，J．Biol ．Chem，267：2588）。 TGFβの成長阻害シグナルは、ヘテロマー複合体として機能する２つのリセプ ター、タイプＩ（RI）およびタイプII（RII）を通して変換される（Lin，et al. ，1992，Cell，68：775；Moustakas，A.，et al.，1993，J．Biol．Chem.，268 ：22215；Wrana，J.，et al.，1992，Cell，71：1003）。発明の概要 本発明の目的は、患者の細胞内における機能性TGFβの不在の検出による癌の 診断または予防法を提供することである。 本発明の別の目的は、変異形態のRIIをコードするヌクレオチド配列を提供す ること、変異RII蛋白質を提供すること、および変異RIIと特異的に免疫反応する 抗体を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、置換遺伝子療法により不活性RIIを有する腫瘍を 処置する治療法を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、変異形態のRIIを発現する細胞と特異的に反応す る抗体を引き出す免疫原性組成物を提供することである。 これらおよび他の目的は、以下の態様一つまたはそれ以上により提供される。 一つの態様において、本発明は、患者の腫瘍組織からの細胞中の機能性タイプ II TGFβリセプター（RII）の量を測定し、腫瘍細胞中のRII量を患者の非新生細 胞中のRII量と比較し、腫瘍細胞中のRII減量分が変化した予後を示すことからな る、結腸癌または胃癌患者の予後を予測する助けとなる診断法を提供する。特定 の態様において、本発明は、患者の腫瘍組織中の機能性TGFβリセプターの存在 または不在を測定することからなり、機能性RIIの不在が複製エラーを伴うカル シノーマ（RER表現型）を示す、患者の腫瘍細胞表現型の分類の助けとなるスク リーニング法を提供する。このスクリーニング法は、好ましくは子宮内膜癌、卵 巣癌、胃癌、または膵臓癌に、そして最も好ましくは結腸癌に適用される。 他の態様において、本発明は、患者中の成長制御遺伝子の非機能性変異形態を 検出することからなる、患者の癌診断の助けとなる方法を提供するが、但し、成 長制御遺伝子はTGFβ様因子属のメンバーを結合するセリン／スレオニンリセプ ター属のメンバーであるタイプIIリセプターをコードするか、または該成長制御 遺伝子の野生型がコーディング領域中に繰り返しDNA配列モチーフを含み、該成 長制御遺伝子の非機能性変異形態の存在が患者の腫瘍組織または前癌の病変を示 す。特定の態様において、スクリーニング法は、TGFβのRIIリセプターの変異形 態、好ましくは正常RII配列のヌクレオチド1931-1936における６塩基対の繰り返 し配列GTGTGT中に起きたGTの２塩基対挿入、正常RII配列のヌクレオチド709から 718における１つのＡ塩基対から10塩基対のポリＡ配列の欠失、正常RII配列のヌ クレオチド709から718における２つのＡ塩基対から10塩基対のポリＡ配列の欠失 、および正常RII配列のヌクレオチド709から718における１つまたは２つのＡ塩 基対から10塩基対のポリＡ配列の付加からなる群から選択される変異により変更 されたRIIのcDNAによりコードされた変異形態のRIIの存在または不在を測定する ことからなる。ヌクレオチド709から718におけるポリＡ配列中の１つまたは２つ のＡ塩基の付加または欠失から生じるRII変異は、RIIリガンド結合ドメインを含 むがRII膜固定ドメインを欠く、削除されたRII関連蛋白質をコードし、それらは 細胞中から血液中に分泌される。 変異RIIは腫瘍または正常組織からのサンプル、または血清、血漿、血管また はリンパ管からの流体、腹水、尿、便、脳脊髄液、精液、乳房吸引液、および卵 巣起点（ovarian origin）の流体を含む生物学上の流体サンプルであって患者か らのサンプルについて実施されるアッセイにより検出されてよい。削除された分 泌変異RII蛋白質はTGFβへの結合能力により検出されてよい。変異RII蛋白質は 、可溶性蛋白質または異常な大きさの蛋白質へのTGFβの結合または野生型RIIの 外部ドメインに特異的な抗体へのそのような可溶性蛋白質の反応により検出して よい。別法として、患者中の変異RIIの存在は、RII変異に対して、または免疫寛 容 の破壊による天然RII蛋白質上の他のエピトープに対しての何れかを標的とする 抗体応答の生成を検出する免疫アッセイにより検出してよい。 さらに別の態様において、本発明は、患者からの生物学上のサンプル中のTGF βの変異RIIリセプターを検出することからなる、患者中の癌の診断の助けとな る方法を提供する。変異形態のRIIは直接検出してもよいし、あるいは患者から の生物学上のサンプル中の変異形態のRIIと免疫反応性の抗体を検出することに より検出してもよい。TGFβの変異RIIリセプターと免疫反応性の抗体は、野生型 RIIリセプターと免疫反応性であってもよい。 別の態様において、本発明は、TGFβリセプターRIIの変異形態をコードするヌ クレオチド配列からなるDNAまたはRNA何れかの異種ポリヌクレオチドを提供する が、変異は正常RII配列のヌクレオチド709から718における１または２つのアデ ノシン塩基対から10塩基対のポリアデノシン配列の付加または欠失であるか、ま たは好ましくは正常RII配列のヌクレオチド1931-1936における６塩基対の繰り返 し配列GTGTGT中に起きたGTの２塩基対挿入である。特定の態様において、この異 種ポリヌクレオチドは不活性形態のRIIを発現する発現ベクターである。 さらに別の態様において、本発明は、癌患者を処置する治療法を提供するが、 但し、患者の新生細胞は非機能性変異形態の成長制御遺伝子を発現し、成長制御 遺伝子はTGFβ様因子属のメンバーを結合するセリン／スレオニンリセプター属 のメンバーであるタイプIIリセプターをコードするか、または成長制御遺伝子の 野生型がコーディング配列中に繰り返しDNA配列モチーフを含み、そして該方法 は、非機能性変異形態の成長制御遺伝子産物または患者の新生細胞と同じ非機能 性変異形態の成長制御遺伝子をコードする発現ベクターを含む、免疫原性有効量 の免疫原性組成物を患者に投与することからなる。特定の態様において、本発明 は、患者の腫瘍細胞により発現されるのと同じ変異形態のRIIである変異TGFβリ セプターRIIをコードする発現ベクターの免疫原性有効量を患者に投与すること により、その腫瘍が変異形態のRIIを発現する結腸癌患者または胃癌患者を処置 するための治療法を提供する。 さらに別の態様において、本発明は、他のヒト蛋白質を実質的に含まないヒト TGFβリセプターRIIの変異蛋白質を提供するが、但し、該変異RII蛋白質は変異 により変更されたRIIのcDNAによりコードされた配列を有し、変異は正常RII配列 のヌクレオチド709から718における１または２つのアデノシン塩基対から10塩基 対のポリアデノシン配列の付加または欠失、または好ましくは、正常RII配列の ヌクレオチド1931-1936における６塩基対の繰り返し配列GTGTGT中に起きたGTの ２塩基対挿入の何れかである。本発明は、該変異蛋白質に特異的な抗体も提供す る。 さらに別の態様において、本発明は結腸癌患者を処置するための治療法を提供 するが、但し、患者の腫瘍細胞は変異形態のRIIを発現し、変異は正常RII配列の ヌクレオチド1931-1936における６塩基対の繰り返し配列GTGTGT中に起きたGTの ２塩基対挿入、または正常RII配列のヌクレオチド709から718における１または ２つのアデノシン塩基対から10塩基対のポリアデノシン配列の付加または欠失で あり、患者の腫瘍細胞と同じRII変異を含む変異形態のRIIを含む免疫原性組成物 を患者に投与することからなる。 さらに別の態様において、本発明は、癌患者を処置する治療法を提供するが、 但し、患者の新生細胞は非機能性変異形態の成長制御遺伝子を発現し、成長制御 遺伝子はTGFβ様因子属のメンバーを結合するセリン／スレオニンリセプター属 のメンバーであるタイプIIリセプターをコードするかまたは成長制御遺伝子の野 生型がコーディング配列中に繰り返しDNA配列モチーフを含み、そして該方法は 、患者の新生細胞と同じ非機能性変異形態の成長制御遺伝子と特異的に免疫反応 する物質の有効量を患者に投与することからなり、該物質は好ましくは成長制御 遺伝子と特異的に免疫反応する抗体または特定の活性化された細胞性免疫細胞で ある。好ましい態様において、該治療法はRIIのタイプIIのTGFβリセプターと特 異的に免疫反応する物質を投与することからなる。 さらに別の態様において、本発明は癌患者を処置する治療法を提供するが、但 し、患者の新生細胞は非機能性変異形態の成長制御遺伝子を発現し、成長制御遺 伝子はTGFβ様因子属のメンバーを結合するセリン／スレオニンリセプター属の メンバーであるタイプIIリセプターをコードするかまたは成長制御遺伝子の野生 型がコーディング配列中に繰り返しDNA配列モチーフを含み、そして該方法は、 患者の新生細胞により発現される機能性形態の成長制御遺伝子をコードする遺伝 子治療用ベクターを患者に投与することからなり、該遺伝子は機能するようにプ ロモーターに結合しており、遺伝子治療用ベクターは患者の中で発現されて新生 細胞により発現される機能性形態の成長制御遺伝子を生成する。特定の態様にお いて、本発明は、機能するようにプロモーターに結合した機能性TGFβリセプタ ーRIIをコードする遺伝子治療用ベクターを患者に投与することからなる、RER表 現型の結腸癌患者を処置する治療法を提供するが、該遺伝子治療用ベクターは患 者ないで発現されて機能性RIIを生成する。 TGFβリセプターの不活性化がTGFβへの応答性を欠如したヒト結腸癌細胞によ る機構なのか否かを決定するための調査において、RIIリセプターは結腸癌細胞 系のサブセットにおいて不活性化されたことが発見された。驚くことに、RIIの 不活性化はマイクロサテライト（microsatellite）の不安定性を示す腫瘍細胞に 共通の特徴であった（以後、「複製エラー」に関してはRER⁺と呼ぶ）。小さな繰 り返し配列領域におけるフレームシフトによるRIIの不活性化は、RER⁺表現型の 単純な訂正よりもむしろ腫瘍の増殖における決定的な段階であるらしい。図面の簡単な説明 図１Ａは、RNase保護アッセイにより測定されたRER⁺およびRER^-結腸癌細胞系 におけるタイプRIおよびRII転写物の発現を示す。 図１Ｂは、38の結腸癌細胞系におけるRIIおよびRI転写物の発現のレーザーデ ンシトメトリーによる定量を示す。 図２は、RNase保護アッセイにより測定した結腸癌の異種移植におけるRII転写 物の発現を示す。 図３は、TGFβ結合の研究により測定したRER⁺およびRER^-結腸癌細胞系中の細 胞表面TGFβリセプターの発現を示す。結腸癌細胞系のVACO群は接頭辞Ｖにより 示される。２つのパネルは２つの個別の実験の結果を表す。 図４は、RER⁺細胞系中の変異RII配列を示す。変異配列は、VACO481が野生型ヌ クレオチド1931-1936におけるGTの挿入；VACO457が野生型ヌクレオチド709-718 における１塩基欠失；RKOが野生型ヌクレオチド709-718における２塩基対の欠失 である。VACO細胞系は接頭辞Ｖにより示される。正常組織から得られた野生型の ポリアデニン配列（bp 709-718）はＮ標識されたレーン中に示される。 図５は、胃癌のヌクレオチド709-718におけるホットスポット中のRII変異の欠 失を示す。野生型（wt）のPCR産物の大きさは矢印により、+１、-１、および-２ bpのフレームシフトとして示される。示されているのは、対照RII cDNAプラス ミド、胃癌細胞系SNU-1およびSNU-638中のRII変異、胃癌腫瘍T13およびT18中のR II変異、および胃癌細胞系SNU-668中の野生型RIIである。発明の詳細な説明 TGFβはヒト上皮細胞の天然の成長阻害剤である。TGFβは正常な結腸癌上皮に より（Avery，A.，et al.，1993，Brit．J．Cancer，68：137）、悪性結腸癌上 皮により（Avery，A.，et al.，1993）およびほとんどの結腸癌細胞系により（B rattain，et al.，1994，Curr．Opin．Oncol.，６：77）発現される。TGFβの外 からの付加は細胞系として研究された初期結腸癌新生の増殖を壊滅させることが 示された（Markowitz，S.，et al.，1994，J．Clin．Invest.，93：1005）。結 腸癌および他の細胞系の研究において、TGFβリセプターRIIの不活性化がTGFβ 介在の成長阻害からの回避を可能にする（Geiser，et al.，1992，J．Biol．Che m.，267：2588；Wrana，J.，et al.，1992，Cell，71：1003；Boyd，et al.，19 89，J．Biol．Chem.，264：2272；Laiho，et al.，1991，前出、266：9108；Lai ho，et al.，1990，前出、265：18518）。本発明者らは、野生型RII発現の（遺 伝子トランスフェクションによる）復帰がリセプター陰性の乳癌細胞系および結 腸癌細胞系の両者においてインビボの腫瘍性を抑圧することを確信した。 本発明者らは、マイクロサテライトの不安定性（RER⁺）を高い率で示す結腸癌 細胞系も、予測に反してタイプIIのTGFβリセプター（RII）内の変異を示すこと を発見した。３つの異なる変異により100以上の実例について調べた。同一のRII 変異はRER⁺胃癌においても検出された。変異は、RII遺伝子中の小さな繰り返し 配列中にあり、細胞表面RIIリセプターの不在により伴い、そして極めて低レベ ルのRII転写物に関連している。この発見は、結腸癌の発癌現象における病態生 理段階のDNA修復の欠損に結び付いており、そしてRII変異によるTGFβ介在の成 長制御からの回避を含むRER腫瘍の増殖のための可能な経路を規定する。 以前の研究から、DNAのマイクロサテライトおよび発現された遺伝子の配列の 両者内におけるRER⁺細胞系中の高変異率を示した（Aaltonen，L.，et al.，1993 ，Science，260：812；Ionov，et al.，1993，Nature，363：558；Thibodeau，e t al.，1993，Science，260：816；Kim，et al.，1994，Am．J．Pathol.，145： 148；Eshleman，J.，et al.，1995，Oncogene，10：33）。タイプIIのTGFβリセ プターは、RER⁺結腸癌中の変異の共通の標的であり、そしてそうゆうものとして 証明可能な病理学上の事象と共にDNA修復の欠損と結びつくらしい（DNA修復の欠 損に関しては、Aaltonen，L.，et al.，1993；Ionov，et al.，1993；Thibodeau ，et al.，1993；Kim，et al.，1994；Liu，B.，et al.，1995，Nature Genet. ，9：48；Papadopoulos，N.，et al.，1994，Science，263：1625；Bronner，C. ，et al.，1994，Nature，17：258；Fishel，R.，et al.，1993，Cell，75：102 7；Leach，F.，et al.，1993，前出、75：1215；および、Nicolaides，N.，et a l.，1994，Nature，371：75を参照されたい）。RII遺伝子中の小さな繰り返し配 列は、RER⁺関連の変異誘発遺伝子の機構の有望な標的となるらしい。不活性化さ れたRIIを伴う細胞の増殖上の利点は、ひとたびそれらの細胞が発生したなら、 腫瘍の増殖を前進に作動させる。腫瘍増殖のこの経路はRER⁺表現型も検出された 非結腸癌ヒト悪性腫瘍、例えば子宮癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌および他の悪性腫 瘍において付加的に操作されてよい（Eshleman，et al.，1995，Willison編集、 「腫瘍学における最近の見解（Current Opinion in Oncology）」、Current Sci ence，Philadelphia，p．83に総評される）。 RIIの不活性化による腫瘍の増殖は、他の癌、例えば非RER結腸癌または乳癌に おいて付加的に操作されてよく、その際RIIはこれらの特定のRER関連変異以外の 機構により不活性化されてよい。本明細書にて記載されるとおりのRIIの不活性 化の検出法および以下に提供されるRII機能の復帰を狙った治療関与の利益は他 の癌にも同じく適用されよう。特に、ヒト乳癌の実質のサブセットは機能性RII を欠き、そしてその機能性RIIの欠損はエストロジェンリセプターの存在が陽性 （ER＋）の乳癌に特定の特徴である。この場合におけるRIIの不活性化は典型的 なRER＋癌に見いだされる変異以外の機構によるらしい（例えば、コーディング 領域またはプロモーター配列の何れかの他の種類の変異によるか、またはRII転 写制御の変更による）。癌の検出、診断、予後、および不在（不活性）RIIによ る腫瘍の処置のための下記の戦略は、これらの腫瘍にも同じく適用されうる。同 じことは、RIIが不活性化された非RER結腸癌の少数に関しても真実であろう。 RIIは、TGFβと構造上同一のリガンド属に結合するセリン−スレオニンキナー ゼリセプター属のメンバーであるタイプIIのリセプター群のひとつである。成長 因子のTGFβ属は、TGFβ、アクチビン、インヒビン；ミューラー阻害物質（MIS ）、および骨形態形成蛋白質（BMPs）並びに非哺乳動物種例えばドロソフィラお よびゼノパスから単離された近縁メンバーを含む。分化、発生および細胞増殖の 阻害におけるこれらさまざまな因子の役割のため、これら因子は、癌の遺伝子型 および表現型を決定する役割を担う制御機能の破壊に関与することも期待されて よい。 成長因子のこの属の各メンバーは、TGFβタイプIIおよびタイプＩリセプター に類似のリセプター二量体に結合して活性化することにより、その活性を示す。 これらは、タイプＩおよびタイプIIのセリン−スレオニンキナーゼリセプター亜 属を構成する（Massague，et al.，1994，Trends in Cell Biology，4：173-178 ）。この属において発見されたさまざまなタイプIIリセプターは、それぞれアク チビン、アクチビンおよびＭＩＳに対するAct R-II，Act R-IIBおよびC14を包含 する。さまざまなタイプＩリセプターは、Act RIB，Act RI（TSK 7L，Alk2，R1 ），TSR-1およびTβR-1と称され、アクチビンおよびTGFβを結合する。この属中 のタイプＩまたはタイプIIリセプター何れかの変異は、TGFβタイプIIリセプタ ー（RII）に関して記載されたのと同様の成長制御の機能障害をもたらすはずで ある。即ち、該リセプター亜属のこれらメンバーの監視は、癌の診断、予後およ び処置において有用なことも証明する。 RIIは、１から３の長さの繰り返しDNA配列を含む成長制御蛋白質の群のひとつ でもある（Ross，et al.，Trends in Neurosciences中、1993、６巻、254-261頁 を参照されたい）。神経または筋肉組織中のこれら繰り返し配列の不安定性は、 以前は神経系疾患と関連していた。RII中の繰り返しDNA配列に相同なこれら配列 の不安定性はRER癌中に存在し、そしてそれらの例に関して選択されることも期 待されるはずであり、その際、RIIのように、そのような変異は腫瘍に成長上の 利点を付与した。 定義 本発明を記載するにあたり、以下の用語は以下の定義に従い使用される。 「二本鎖DNA分子」は、通常の二重らせん中のデオキシリボヌクレオチド（ア デニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形態を意味する。この用 語は分子の一次および二次構造のみを意味し、任意の特定の３次元構造に限定し ない。即ち、この用語は、とりわけ、直鎖状DNA分子（例えば、制限断片）、ウ イルス、プラスミド、および染色体中に見いだされる二本鎖DNAを含む。特定の 二本鎖DNA分子の構造を議論するにあたり、配列はDNAの非転写鎖（即ち、mRNAに 相同な配列を有する鎖）に沿って5'から3'方向への配列のみを与える慣用にした がい、本明細書では記載される。 遺伝コードにしたがいDNA配列の翻訳がアミノ酸を生じる（即ち、DNA配列がア ミノ酸配列をコードする）ならば、DNA配列はアミノ酸配列に「対応する」。 ２つの配列が同じアミノ酸配列をコードするならば、一つのDNA配列は他のDNA 配列に「対応する」。 少なくとも約85％（好ましくは少なくとも約90％、そして最も好ましくは少な くとも約95％）のヌクレオチドが規定された長さのDNA配列と適合する場合、２ つのDNA配列は「実質同一」である。実質同一の配列は、例えば特定の系に関し て規定されたとおりのストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーシ ョン実験において同定されうる。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は当 業界の範囲である。例えば、Maniatis，et al.，下記；DNA Cloning，１巻およ びII 下記；Nucleic Acid Hybridization，下記を参照されたい。 DNA構築物の「異種（heterologous）」領域またはドメインは、巨大DNA分子中 であって天然の該巨大分子に関連して見いだされない巨大DNA中の同定可能なDNA セグメントである。即ち、異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合、該遺 伝子は、通常、供給源のゲノム中の哺乳動物ゲノミックDNAを周囲に有さないDNA が周囲に配置される。異種領域の他の例は、コーディング配列自体が天然に見い だされない構築物である（例えば、ゲノミックコーディング配列がイントロンを 含む場合のcDNA、または天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。アリ ールの変更または天然に生じる変異事象は、本明細書にて規定されるDNAの異種 領域を生じない。 コーディング配列は、蛋白質またはペプチド配列に（遺伝コードに鑑みて）対 応するかまたはコードするコドンのインフレームの配列である。互いの配列また はそれらの相補配列が同じアミノ酸配列をコードするならば、２つのコーディン グ配列は互いに対応する。適切な制御配列に関連した「コーディング配列」は、 インビボにおいてポリペプチドに転写および翻訳されてよい。ポリアデニレーシ ョンシグナルおよび転写停止配列は、コーディング配列の3'に位置するのが通常 である。「プロモーター配列」は、細胞中のRNAポリメラーゼに結合し、且つコ ーディング配列の下流（3'方向）の転写を開始することができるDNA制御領域で ある。コーディング配列は、プロモーター配列に結合するRNAポリメラーゼがコ ーディング配列をmRNAに転写して次にコーディング配列によりコードされる蛋白 質に翻訳される場合に、細胞中のプロモーター配列の「制御下にある」。 本発明を定義する目的において、プロモーター配列は、コーディング配列の転 写開始コドンにその3'末端において結合しており、上記バックグラウンドを検出 できるレベルにおける転写を開始するのに必要な最小の数の塩基または要素を含 むように上流に（5'方向）伸びる。プロモーター配列中には、転写開始部位（ヌ クレアーゼSIでマッピングされて便利に規定される）並びにRNAポリメラーゼの 結合に必須の蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされる。真核生 物のプロモーターは、常にではないがしばしば、「TATA」ボックスおよび「CAT 」ボックスを含む。原核生物のプロモーターは−10から−35コンセンサス配列に 加えて、シャインダルガノ配列を含む。 細胞は、外来DNAが細胞壁内部に導入される場合に、外来DNAにより「形質転換 される」。外来DNAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNAにインテグレート（共 有結合）されてもされていなくてもよい。原核生物および酵母においては、例え ば、外来DNAはエピソーム要素例えばプラスミド上に保持されてよい。真核生物 に関しては、安定な形質転換細胞が、外来DNAが染色体複製を通して娘細胞によ り受け継がれる場合のひとつである。この安定性は、真核生物が、外来DNAを含 む娘細胞の集団を構成する細胞系またはクローンを確立する能力により証明され る。 「クローン」は、単一細胞または有糸分裂による共通祖先に由来する細胞集団 である。 「細胞系」は、多くの世代にわたりインビトロで安定に成長できる初期細胞の クローンである。 ベクターを使用することにより、外来物質、例えばDNA、RNAまたは蛋白質を生 物に導入する。典型的なベクターは組換えウイルス（DNAに関して）およびリポ ーム（蛋白質に関して）を含む。「DNAベクター」は、自律複製DNA分子、例えば プラスミド、ファージまたはコスミッドであり、他のDNAセグメントを付加する ことにより付加されたセグメントの複製が生じる。 「発現ベクター」は、適切な宿主細胞により蛋白質合成を指示する制御配列を 含むDNAベクターである。これは通常、RNAポリメラーゼを結合してmRNAの転写を 開始するプロモーター、並びにリボソーム結合部位およびmRNAからポリペプチド への翻訳を指示する開始シグナルを意味する。正確な場所における正確な解読枠 中での発現ベクターへのDNA配列の挿入、続く該ベクターによる適切な宿主細胞 の形質転換は該DNA配列に対応するmRNAの生成、および通常は該DNA配列によりコ ードされる蛋白質の生成を可能にする。 選択された成分Ａを含む組成物は、成分Ａが成分Ａおよび他方の成分Ｂの総重 量の少なくとも約75％を形成する場合、成分Ｂを「実質的に含まない」。好まし くは、選択された成分Ａは総重量の少なくとも約90％、最も好ましくは総重量の 少なくとも約99％からなる。選択された生物活性蛋白質を含み、汚染蛋白質を実 質的に含まない組成物の場合、興味のある蛋白質の活性を有する組成物は単一分 子量のみの種を含むこと（即ち、「均一」組成物）が、ときには好ましい。 本明細書にて使用されるとおり、「生物サンプル」は、個人から単離された組 織または流体のサンプル、限定されないが血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚 の外部セクション、呼吸道、腸管道および尿生殖器道、涙、唾液、ミルク、血液 細胞、腫瘍、器官、そしてインビボ細胞培養成分のサンプル（げんいされないが 、細胞培養培地中における細胞成長によりもたらされる条件設定培地、ウイルス に感染された疑いのある細胞、および細胞成分）を含む。 「ヒト組織」は、固体の塊を構成するヒト細胞の凝集物である。この用語は、 ヒト細胞、例えば血液細胞またはヒト細胞系の懸濁液でもある。 用語「抗体」は、４つのイムノグロブリンペプチド鎖を構成する２つの重鎖お よび２つの軽鎖からなる完全な抗体、並びにイムノグロブリン断片を包含する。 「イムノグロブリン断片」は、抗体に関連した蛋白質分子であり、元の抗体のエ ピトープ結合特異性を保持することが知られている、例えばFab，F（ab）'2，Fv 等である。 一般法 他に指示がなければ、本発明の実施は、当業界の範囲の慣用的な分子生物、微 生物および組換えDNA技術を用いる。そのような技術は当業者にはよく知られて おり、文献中において完全に説明されている。例えば、Maniatis，Fritsch & Sa mbrook，「モリキュラークローニング：実験室マニュアル」（1982）；「DNAク ローニング：実践アプローチ」、巻ＩおよびII（D．N．Glover編集、1985）；「 オリゴヌクレオチド合成」（M．J．Gait編集、1984）；「核酸ハイブリダイゼー ション」（B．D．Hames & S．J．Higgins編集、1985）；「転写および翻訳」（B ．D．Hames & S．J．Higgins編集、1984）；「動物細胞培養」（R．I．Freshney 編集、1986）；「固定化細胞および酵素」（IRL出版、1986）；B．Perbal，「モ リキュラークローニングの実践ガイド（A Practical Guide to Molecular Cloni ng）（1984）、およびSambrook，et al.，「モリキュラークローニング：実験室 マニュアル」（1989）を参照されたい。 RII不活性化の検出 RIIの不活性化は、RII、その前駆体分子またはその作用を測定するあらゆるア ッセイにより監視することができる。不活性化は、RIIの存在に関して特異的な アッセイにおいてRIIまたは前駆体の不在から、または不活性であることが知ら れている変異形態の検出により検出することができる。RIIの変異形態の存在は 、間接に、変異RIIに特異的な抗体の患者からの血清中の陽性検出により検出す ることもできる。野生型RIIに特異的な抗体の検出は、RIIの自己寛容が破壊され たことを示し、、RIIが不活性化を示唆する様式において変化したことの別の指 標となる。 RII蛋白質およびそれらの発現の検出はヌクレオチドまたはペプチドレベル上 でもよい。抗RII抗体は、引用により本明細書に編入される国際特許出願公開WO9 3/09228に示されるとおり、RIIに対応する核酸配列から発現されたペプチドで哺 乳動物を免疫することにより、当業界において公知の技術を用いて調製できる。 これらの抗体は、さまざまな免疫アッセイ技術によりRII蛋白質の存在を検出す ることができる。ひとつまたは複数のエピトープを含有するのに十分なTGFβのR II配列を有するペプチドは、WO93/09228に開示された配列から生成することがで き、これらのペプチドを用いることにより野生型RII分子に特異的な抗体を検出 することができる。 ヌクレオチド709-718におけるポリＡ配列内の１つまたは２つのＡ塩基の付加 または欠矢により生じたRII変異は、RIIリガンド結合ドメインを含み、RII膜結 合を欠き、細胞から血液に選択される、削除されたRII関連蛋白質をコードする 。これらの削除された分泌変異RII蛋白質は濃縮することができ、そして／また はTGFβへの結合能力により検出できる。TGFβ結合は、固相支持体上に固定化さ れたTGFβへのRII変異蛋白質の結合によるか、または放射性または他の付加物で 標識されたTGFβへの結合により証明できる。即ち、変異RII蛋白質に関する別の アッセイは、可溶性または異常なサイズの蛋白質によるTGFβ結合の検出による アッセイのはずである。そのようなアッセイの例は、ビーズに府しゃくさせたTG Fβの結合により血液中の変異RII蛋白質を濃縮することを含み、外部RIIドメイ ン中のエピトープに反応性の抗RII抗体を用いたウエスタン分析によるこれらの 異常 な蛋白質の検出に続く。 本発明により提供されるヌクレオチドプローブ配列を用いることにより、あら ゆる標準技術にしたがい、RII蛋白質またはRIIの変異形態に対応するmRNAの発現 を検出することができる。発現は、インサイチュハイブリダイゼーションによる かまたはmRNAの抽出および検出の何れかにより検出してよい。変異形態のRIIを コードする配列はゲノミックレベルで検出してもよい。遺伝子プローブアッセイ および免疫アッセイのための特定の方法は、当業者にはよく知られている。好ま しい方法は、WO93/09228に開示されたとおりに、TGFβのRIIの配列から選択され たプライマーを用いるPCRである。同様なアッセイを用いることにより、不活性 化を検出するかまたはタイプIIのセリン／スレオニンキナーゼリセプター属の他 のメンバーの不活性変異体を検出することができる。 RIIの不活性化の検出には４つのアッセイが好んで用いられてきた。第１のア ッセイは、RIIのRNAの損失を検出するRNase保護アッセイである。第２のアッセ イは、機能性RIIリセプター蛋白質の不在を検出するRNase保護アッセイである。 これら２つのアッセイの化学およびモデル系におけるそれらの使用は、引用によ り本明細書に編入されるSum，et al.，J．Biol．Chem.，269：26449-26455に記 載されており、これらのアッセイの詳細は以下の実施例において提供される。RI Iの不活性化は、外来TGFβに非感受性の結腸癌細胞系からの変異RIIリセプター の直接のクローニングおよび配列決定によっても決定されてきた。RIIの不活性 化は、ヌクレオチド709-718およびその周辺領域のPCR増幅およびこの増幅断片の 変化した大きさの証拠によっても検出されてきた。RII遺伝子内の３つの変異は 実施例において詳細に記載される。ヒト結腸癌に適用された４つ全てのアッセイ からの発見も実施例において記載される。 変異RII遺伝子のPCRによる検出 RER＋腫瘍タイプ中のRII変異は、例えば正常な細胞のDNAから増幅されたセグ メントとは長さの異なるゲノミックセグメントの増幅により検出してよい。PCR に基づくアッセイが、ヌクレオチド709-718にRIIポリアデニンの繰り返しを含む 変異のホットスポットのために開発された。この繰り返しを含む73bpのゲノミッ クDNAからの増幅に続き、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う。増幅された 断片の大きさにおけるひとつまたは複数の塩基のシフトは、変異ホットスポット 内のフレームシフト変異の指標である。 RIIのmRNAの損失に関するアッセイ RIIのmRNA転写物は、RIIリセプターの合成を生じさせるために細胞中に存在し なければならない。したがって、RIIのmRNA生成の安定性を減じるかまたは全く 生成させない変異は細胞をTGFβ非感受性にする。RIIのmRNAの損失は、例えば、 RII配列を含むプローブのRNase保護によるmRNAへのインサイチュハイブリダイゼ ーションにより検出することができる。腫瘍組織からの細胞サンプル中のRIIのm RNAの存在または不在を検出するためのあらゆる効果的な方法は、本発明の範囲 にある。 RIIのヌクレオチド配列 RIIをコードするDNA配列は、国際特許出願公開WO93/09228中に提供された配列 情報またはジーンバンクに加盟番号M85079で提供された配列を用いて、化学合成 するかまたは幾つかのアプローチの一つを用いて合成できる。完全な配列は、標 準法により製造されたオーバーラッピングするオリゴヌクレオチドから集合させ 、そして完全なコーディング配列に集合させる。例えば、Edge（1981）Nature 2 92：756；Nambair，et al.，（1984）Science 223：1299；Jay et al.，（1984 ）J.Biol．Chem.，259：6311を参照されたい。単離法は、一部、適切な一本鎖ま たは二本鎖ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブを用いた核酸ハイブ リダイゼーションに依存する。そのようなプローブは、本明細書に開示されたDN Aまたはアミノ酸配列に基づき合成により構築するか、または本明細書に記載さ れたゲノミックまたはcDNAクローンから単離すことができる。オリゴヌクレオチ ドプローブおよびDNAライブラリーの調製および核酸ハイブリダイゼーションに よるそれらのスクリーニングは当業者には公知である。例えば、Sambrook，et a l.，「モリキュラークローニング：実験室マニュアル」（1989）；B．Perbal， 「モリキュラークローニングの実践ガイド（A Practical Guide to Molecular C loning）（1984）を参照されたい。一般的には、プローブは化学合成され、本明 細書 に開示されるとおりにRIIまたはその変異体の公知の核酸配列に基づくのが好ま しい。 当業者は、相当長く、および／または対応する核酸配列中に高度な重複を有す るはずのアミノ酸配列領域を包含するプローブを調製することが望まれることを 見いだすであろう。他の場合、２セットのプローブを、遺伝子の異なる領域各々 に対して同時に使用することが望まれるであろう。用いられるあらゆるプローブ の正確な長さは決定的ではないが、典型的なプローブ配列は1000ヌクレオチドよ り長くなく、最も典型的には500ヌクレオチドより長くなく、より典型的には250 ヌクレオチドより長くなく、100ヌクレオチドより長くなくてよく、そして75ヌ クレオチドよりも長くなくてよい。一般的には、約14から約20塩基対のプローブ が通常効果的であることは当業者に認識されている。より長いプローブは、関連 する標的配列が区別されるのに十分な違いを有する複数の唯一のポリヌクレオチ ド領域を包含することが必要かもしれない。このために、プローブは約10から約 10ヌクレオチドの長さが好ましく、最も好ましくは約20から約50ヌクレオチドで ある。 発現に関するヌクレオチドプローブアッセイ 上記の核酸プローブは、RIIを発現する細胞内のmRNA転写物の検出に用いてよ い。該プローブは一本鎖でも二本鎖でもDNAでもRNAでもありうる。プローブの大 きさは約20ヌクレオチドから数百ヌクレオチドに及んで変更されうる。最も望ま れるヌクレオチドプローブは、それらの意図する標的に関連しない配列を検出せ ず、関連しないヌクレオチド配列に顕著な相同性を示さず、そして自己ハイブリ ダイズまたはぞれら自体でフォールドするような掃補配列を含まない。望まれる プローブのグアニンおよびシトシン含有量は、グアニンおよびシトシンが豊富な 非関連配列との非特異的ハイブリダイゼーションを促進するほど高くない。最後 に、融解温度および結合の自由エネルギーは、意図される検出技術に都合よく適 合されるのが一般的である。プローブは放射性標識されるか、蛍光材料で標識さ れるか、ビオチン化ヌクレオチド等で標識されてよい。ヌクレオチドプローブの 調製および標識の方法は当業界で公知である。 組織セクションに対するヌクレオチドプローブのインサイチュハイブリダイゼ ーションは、例えば、引用により本明細書に編入される、Baldino，et al.，Met hods in Enzymol.，1989，vol．168，p.761-77；Emson，et al.，Methods in En zymol.，1989，vol．168，p.753-61；Harper，et al.，Methods in Enzymol.，1 987，vol．151，p.539-51；Angerer，et al.，Methods in Enzymol.，1987，vol ．152，p.649-61；Wilcox，et al.，Methods in Enzymol.，1986，vol．124，p. 510-33に記載されたとおりに、上記ヌクレオチドプローブを用いて実施する。RI IまたはRII変異体の発現に関連してmRNAを検出するための一つの好ましい方法は 、腫瘍から取られた組織セクションへのインサイチュハイブリダイゼーションで ある。細胞中におけるRIIに相当するヌクレオチド配列を有するプローブによる ハイブリダイゼーションの検出は、RIIに相当するmRNAのその細胞による発現を 示す。組織セクションを免疫組織化学学のために調製する。 別法として、組織サンプルからのRNAの抽出物は、本発明の蛋白質をコードす る配列の存在に関して分析することができる。ヌクレオチドプローブを用いる診 断試験は個人からの生物サンプルを用いる。核酸は当業者に公知の標準技術を用 いてサンプルから回収される。次に、核酸をプローブとインキュベートしてハイ ブリダイゼーションを検出する。プローブ配列に相当する配列を有する核酸の存 在は、ノーザンブロットまたはスロット／ドットブロットにより検出するのが好 ましい。ノーザンブロッティングまたはドットハイブリダイゼーションを用いる ことにより、公知の濃度および完全性を有する精製RNAサンプルは標識RIIプロー ブとハイブリダイズすることができる。各々のサンプルに関して、得られるシグ ナルは、細胞によりまたはサンプルにより発現が変化しない構成発現遺伝子に関 する標識プローブに同じサンプルをハイブリダイズだせた場合に得られるシグナ ルと、線量計で比較する。異なるサンプル間の比の比較は、RIIの発現レベルに おける違いの評価が可能にする。 別法として、RIIの配列に相当する配列の核酸は、RIIの核酸配列に基づくプラ イマーを用いて、核酸増幅により腫瘍組織のRNA抽出物中に検出してよい（例え ば、Van Brunt，BioTechnology，8：291-294：1990を参照されたい）。同様なプ ライマーを用いることにより、RIIまたはRII変異体をコードするゲノミックDNA 配列を増幅することができる。好ましい増幅法は、ポリメラーゼチェイン反応（ PCR）を用いる。プライマーは、核酸プローブに関して上記されたとおりに決定 されたRIIの核酸配列の唯一の部分に相当するように構築できる。これらのプラ イマーを用いることにより、腫瘍組織の核酸抽出物中のRNAまたはDNAは該唯一の RIIを含む場合に限り、PCRにより増幅される。 別法として、RIIのmRNA発現のレベルは定量ポリメラーゼチェイン反応により 評価することができる。RNAのヌクレオチド配列に相当する配列のプライマーを 用いることにより、逆転写酵素を用いて最初にcDNAを合成し、次にその結果得ら れるcDNAをポリメラーゼチェイン反応により増幅することができる。反応は、サ ンプル中に元から存在するmRNAの量に比例した量の増幅産物を精製するような条 件下で反応させて、停止する。産物の量は、電気泳動後の公知標準物とのエチジ ウムブロマイド蛍光の比較によるか、または、標識プローブを用いたドットハイ ブリダイゼーションにより定量できる。構成的に発現された遺伝子の発現は対照 として測定することができ、例えば以前に記載されたハイブリダイゼーション反 応を用いて、結果の標準化された比較を可能にする。増幅前の対照サンプル中の リボヌクレアーゼＡまたは他のRNAseによるサンプルの処理は、シグナルがRNAの みに由来することを実証する。 RII転写物の検出に関するRNase保護アッセイ mRNAの損失を検出するための好ましい方法は、RNase保護に基づく。このアッ セイの詳細は、Sun，et al．に公表された。簡単に言えば、RNase保護アッセイ は、放射性アンチセンスRII RNAプローブに結合するRNAの量を測定することによ り、サンプル中のRII mRNAの量を測定する。放射性アンチセンスRII RNAプロー ブは試験管中で、例えばRNAが転写されうるT3のRNAポリメラーゼ部位の下流にク ローン化されたRII cDNAの264bp（NarI-PstI）を運ぶプラスミドから生成される 。通常は、対照のヒトプローブ、例えばγ−アクチンRNAも同様のプラスミドか ら調製する。これらのプローブを、腫瘍細胞から抽出されたRNAと共にグアニジ ンバッファー中で室温において一晩ハイブリダイズさせる。次の朝、真正RII転 写 物に結合することにより保護されなかいプローブRNAをRNaseA+T1により消化して 破壊する。保護されたプローブRNAは、尿素アクリルアミドゲル上で電気泳動し て反応物から分離したのちにオートラジオグラフィーにより可視化する。 RNAプローブは、RI配列に基づきRNase保護アッセイによりタイプI TGFβリセ プター遺伝子（RI）からのRNA転写物の検出のためにデザインしてもよい(例えば 、ジーンバンク加盟番号L11695を参照されたい)。適切なRIプローブは、PCRセン スプラーマー5'GACCAGTGTGCTTCGTCTGC-3'（配列番号１）およびアンチセンスプ ラーマー5'GCTGGCTTTCCTTGGGTACC-3'（配列番号２）により結合したRI配列のHin fI消化により生成される164bpの3'断片に相当する。 野生型RII蛋白質の不在 機能性RIIリセプターは細胞膜中に存在し且つTGFβの作用を仲介するために細 胞表面に存在するはずであることが示されてきており、よって、TGFβ成長抑制 の不活性化は、細胞表面上で機能性RIIの不在を検出するあらゆる方法により監 視できる。RIIの存在は、免疫アッセイにより、RIIに特異的な抗体、例えば引用 に本明細書に編入される国際特許出願公開WO93/09228に記載された抗体を用いて 、測定することができる。抗体の結合の欠如は機能性RII分子の不在を示唆する はずである。不活性なRIIリセプターは、抗-RII抗体を用いることにより、異常 な細胞局在（例えば、免疫組織化学により）によるか、または異常な分子サイズ により（例えば、ウエスタンブロットアッセイにより）検出してもよい。別法と して、以下に記載される不活性変異形態のRIIに特異的な抗体を用いることによ り、直接に不活性RIIの存在を検出してよい。不活性変異体に対する抗体は、本 明細書に記載される核酸配列から組換え系中で変異蛋白質を発現させて、発現蛋 白質を用いて入道物を免疫することを含む標準法により調製してよい。 機能性RIIの不在は、機能性RI細胞表面リセプターの不在ももたらす（Wrana， et al.，（1992）Cell，71：1003；Sun，et al.，（1994）J．Biol．Chem.，629 ：26449）。したがって、機能性RIの不在は機能性RIIの不在に関する有用な代用 物として働く。よって、RIに特異的な抗体、例えば抗体V-22（カタログ番号sc-3 98、サンタクルーズバイオテクノロジー社、サンタクルーズ、CA）を用いた、機 能性RIの不在の検出は、不活性RIIで細胞を同定するための抗体に基づく別のア プローチを代表する。 抗体の生産 本発明の変異RII蛋白質に特異的に反応する抗体は、当業者には容易に明らか な多くの方法により得てよい。変異蛋白質は、以下に開示される変異ヌクレオチ ド配列を用いて組換え系において生産できる（例えば、Sambrook et al.を参照 されたい）。組換え蛋白質を免疫原として動物に注射することによりポリクロー ナル抗体の生産を引き出すことができる。その結果得られる抗血清は直接使用す るか、または例えば、不溶性支持体にカップリングした組換え生産RIIまたはRI を用いた親和性吸着により精製してよい。 さらに別法として、蛋白質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体は、よ く知られた方法にしたがい（例えば、Kohler and Milstein，1976，Eur．J．Imm unol.，6：611）、本発明のペプチドを免疫原として用いて、それを選択のため に用いるかまたは両機能のために使用して、調製してよい。本発明の組換え蛋白 質に特異的に免疫反応する抗体を調製するためのこれらおよび他の方法は、容易 に当業者の範囲内である。変異RIIを用いて引き出されたポリクローナル抗血清 中の他の成分抗体は変異RIIおよび野生型RIIの両者に共通なエピトープと反応す るかもしれないが、精製されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は 、野生型RIIよりも変異RIIに対して高い親和性を示すことが好ましく、より好ま しくは、それらの抗体は野生型RIIに対する親和性よりも２桁高い変異RIIに対す る親和性を有する。最も好ましくは、変異RIIに特異的な抗体は正常な（野生型 ）RIIに反応しない。同様な方法を用いることにより、当業者には明らかなとお り、野生型RIまたはRIIに特異的に免疫反応する抗体を生産することができる。 免疫アッセイ 本発明の抗体を用いることにより、組織セクション中のRI，RIIまたはRII変異 体を検出することができる。当業界において公知のあらゆる検出手段、例えば放 射性標識または染色により組織セクションへの抗体の結合を検出することができ る。特に有用な染色は、パーオキシダーゼ、水素化パーオキシダーゼおよび色素 体物質例えばアミノエチルカルバゾールを用いる。例えば、パーオキシダーゼ（ 多くの源から利用可能なよく知られた酵素）は、抗-RII抗体に結合するか、また はRIIと交差反応する蛋白質に特異的に結合する抗体に対するひとつまたは複数 の抗体を介して複合体形成することができる。そのような技術は当業界において よく知られている。他の色素隊物質および酵素も用いてよい。抗体の傾向標識ま たは放射性標識を用いることにより、セクションに対する抗体結合を検出しても よい。標識された抗体は抗-RIIまたは抗-RIIと免疫反応する二次抗体でよい。再 び、そのような技術はよく知られており、そして他の抗原に関する等価な標識ス キムは当業者には明らかとなろう。 RI，RIIまたは変異RII遺伝子産物と交差反応する蛋白質が患者中で検出される ための詳細な技術は、本発明において決定的ではない。生化学技術または免疫技 術は免疫組織化学を用いずに使用できる。溶液アッセイは、発色、化学発光また は傾向免疫アッセイ例えばELISA、サンドイッチおよび競合免疫アッセイ、メ拡 散（immuno-diffusion）、放射性免疫アッセイ、免疫電気泳動、ウエスタンブロ ットおよび他の技術を使用して、患者からの組織サンプルの抽出物を調製して該 抽出物をアッセイすることにより患者中のRI，RIIまたはRII変異体を検出して交 差反応性の蛋白質を定量してよい。 RI，RIIまたは変異RII遺伝子産物と交差反応する蛋白質は、生物流体、例えば 血清、血漿、滲出液、腹水、尿、便、脳脊髄液、精液、乳房吸引液および卵巣起 点（ovarian origin）の流体中で、当業界において公知のあらゆる蛋白質検出手 段を用いて定量することができる。好ましい方法は免疫検出手段を用いる。これ らは、放射性免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、補体固定、比濁計アッ セイ、免疫拡散または免疫電気泳動アッセイ等を含む。血漿は、当業界において 公知のとおり、使用前に抗凝血処理をすべきである。細胞要素および脂質は流体 から、例えば遠心分離により除去してよい。希釈流体、例えば尿に関しては、例 えば超濾過または塩析により蛋白質を濃縮してよい。 ヌクレオチド709-718におけるポリＡ配列内のひとつ又は複数のＡ塩基の付加 または欠失を生じるRII変異体は、RII細胞外ドメインを含み、且つRII膜結合を 欠いて細胞から血液中に分泌される、削除されたRII関連蛋白質をコードする。 これらの削除された分泌変異RII蛋白質は、濃縮し、および／または野生型RIIお よび変異RIIの両者に共通の外部ドメインと反応する抗体を用いる免疫アッセイ か、および／または削除された変異形態のRIIのカルボキシル末端においてコー ドされる変異エピトープと反応する抗体を用いる免疫アッセイにより検出するこ とができる。例えば、分泌された可溶性変異RIIは、野生型RIIおよび変異RIIの 両者に共通の外部ドメインと反応する抗体を用いるELISAか、および／または削 除された変異形態のカルボキシル末端においてコードされる変異エピトープと反 応する抗体を用いるELISAにより、血液中で検出することができる。別の例にお いて、分泌された可溶性RIIは免疫沈殿により血液から濃縮し、次にウエスタン 分析により検出することができる。再び、これは、野生型RIIおよび変異RIIの両 者に共通の外部ドメインと反応する抗体を用いることによるか、および／または 削除された変異形態のカルボキシル末端においてコードされる変異エピトープと 反応する抗体を用いることにより、達成することができる。 別法として、患者中の変異RIIの存在は、RII変異体に対するかまたは免疫寛容 の破壊により天然RII蛋白質上の他のエピトープに対する患者の抗体応答の生成 を検出する免疫アッセイにより検出してよい。患者中の癌原性変異に応答する血 清学上の抗体応答の患者における誘発は、p53蛋白質中の癌原性変異の腫瘍を有 する患者において以前に示された（Harris，et al.，1993，N．Eng．J．Med.，3 29：1318-1327に総評されるとおり）。ヌクレオチド709-718における10塩基対の ポリＡ配列内に位置するフレームシフト変異が膜の橋渡しドメイン前を削除され たRII蛋白質をコードすると予測されるとおり、そのようなRII変異蛋白質は直接 血液中に分泌され、そしてHarrisらにより議論されている細胞内p53蛋白質内の 変異よりもさらに激しい免疫応答を起こさせることが期待される。そのような免 疫応答は、変異RII配列中のエピトープに対する患者内の抗体の生産を起こさせ るか、またはp53変異を有する腫瘍を有する幾人かの患者において観察されると おり、免疫寛容を破壊して、天然RII蛋白質上のエピトープに応答する抗体の生 成をもたらすことができる。標準法例えば放射性免疫アッセイまたは酵素結合イ ムノソルベントアッセイ（ELISA）または他の同様なアッセイを用いた患者の血 清学上のRIIに対する応答の検出は、当業界において日常行われていることであ る。 ＴＧＦβの結合アッセイ 機能性RIIの存在を検出するための好ましい方法は、標識されたTGFβがRIIに 結合して交差結合し、そしてRII蛋白質に結合した標識の量を測定する、TGFβ結 合アッセイである。このアッセイの詳細は、引用により編入されるSunらに公表 されている。簡単に言えば、以下の実施例３に記載されるとおりに、細胞表面リ セプターを¹²⁵Ｉ標識TGFβとインサイチュ交差反応させてSDS-PAGEにより分離し てオートラジオグラフィーにより可視化することにより検出してよい。 TGFβ結合アッセイを使用することにより、削除変異RIIの生物流体を監視して もよい。ヌクレオチド709-718におけるポリＡ配列内のひとつ又は複数のＡ塩基 の付加または欠失を生じるRII変異体は、RIIリガンド結合ドメインを含み、且つ RII膜結合を欠いて細胞から血液中に分泌される、削除されたRII関連蛋白質をコ ードする。これらの削除された分泌変異RII蛋白質は濃縮されるか、および／ま たはTGFβへの結合能力のために検出することができる。TGFβの結合は放射性ま たは他の付加物で標識されたTGFβへの結合により証明することができる。即ち 、変異RII蛋白質に関する別のアッセイは可溶性蛋白質へのTGF別のの結合の検出 または異常なサイズの蛋白質により可能である。そのようなアッセイの例は、ビ ーズに付着したTGFβへの結合による血液中の変異RII蛋白質の濃縮、続いて外部 RIIまたは変異RIIドメイン中のエピトープと反応する抗-RII抗体（例えば、野生 型RIIまたは変異RIIの外部ドメインに対する抗体）を用いたウエスタン分析によ るこれら異常な蛋白質の検出からなるはずである。 変異 不活性化RIIを有するものとして特定される細胞系は、新規のRII変異を特定す る目的のために、そしてそれに続く腫瘍検出、診断、予後、あるいは療法におい て商業的に使用するために使用されてきた。このような細胞系には、Hct116、RK O、Ｃ、VACO457、VACO670、VACO432、VACO444、VACO5、VACO6、VACO8、VACO703 、 VACO481、およびVACO410が含まれ、これらそれぞれの結腸癌細胞系は不活性化さ れた変異RII遺伝子を持っている。これらそれぞれの細胞系におけるRIIの特定の 変異により、その変異RII産物を特定するための特定の試験が提供される。試験 は抗−変異抗体あるいは変異DNAあるいはRNAプローブ、またはRIIあるいは変異R IIに対する宿主免疫（抗体）反応の検出のどちらかに基づいている。ヒト腫瘍に おいてもっとも一般的である変異RIIを検出することを目的とするこのような試 験は、腫瘍検出、診断、および予後に対して直接的に適用する。さらに、もっと も一般的な変異を目的とした薬物については、腫瘍の治療において使用すること ができるかどうかについてスクリーニングしうる。 VACO481腫瘍において特定される変異RIIは、変異RIIに関する商業的な試験の 開発において使用しうる。我々は、自然発生ヒト結腸癌において存在することが 示された最初の変異RIIを特定した。この変異ではRII蛋白質の正常なアミノ酸配 列のうち最後の33アミノ酸が欠損し、代わりに新しく29アミノ酸が入っている。 通常での野生型の最後のアミノ酸（Val 534）から開始する、VACO481の変異RII の予想されるカルボキシル末端のアミノ酸配列は、VWQNASVSWSIWTGSRGGAARRRRFL KTAP（配列番号：５）である。これに対応する野生型のカルボキシル末端の配列 は、VAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK（配列番号６）である。 検出される別の変異には、VACO457やRKOにおいて見られるものが含まれる。VA CO457の変異においては、10塩基対の野生型のポリアデニン反復配列（ヌクレオ チド709-718）が１塩基分だけ短縮されている。この遺伝子は（野生型では567ア ミノ酸であるのに対して）最後の34アミノ酸（SLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAI LTCC（配列番号：３））がLys 128から始まる野生型（KPGETFFMCSCSSDECNDNIIFS EEYNTSNPDLL（配列番号：４））から置換された、161アミノ酸の短縮されたポリ ペプチドをコードする。同様にRKOの変異においては、10塩基対の野生型のポリ アデニン反復配列（ヌクレオチド709-718）が２塩基分だけ短縮されている。こ の遺伝子は、最後の２アミノ酸（AW）が、対応する野生型アミノ酸（Lys 128か ら始まるKP）から置換されている、129アミノ酸の短縮されたポリペプチドをコ ードする。 検出される別の変異は、VACO5およびVACO6において見いだされるもので、10塩 基対の野生型のポリアデニン反復配列（ヌクレオチド709-718）が１塩基分だけ 伸張されているものである。この遺伝子は、最後の２アミノ酸（AW）が、対応す る野生型アミノ酸（Pro 129から始まるPG）から置換されている130アミノ酸の短 縮されたポリペプチドをコードする。ポリアデニン反復配列において２塩基を付 加することによる４種類目の短縮された変異は、VACO457において見られるＣ末 端配列と同一の34アミノ酸を有するが、野生型配列におけるプロリン129がセリ ンなどに変換されていることにより、それより後の方で開始するアミノ酸配列が 置換されているという点においてのみ異なる。10塩基対の反復配列にさらに付加 あるいは欠損する結果として、同様な短縮された変異が起こりうる。その他のRI I変異としては、RIIについてのジーンバンク（GenBank）の配列の1899番ヌクレ オチドでＧからＡへの点突然変異があり、結果として不活性化RIIを伴う突然変 異誘発の表現型である非RER結腸癌細胞系のVACO8において、522番AsnからAspへ の置換が引き起こされる。ジーンバンクの配列の528番コドンにおけるＧからＡ への同様な点突然変異（CGTからCAT）により、結果としてHisからArgへの置換が 引き起こされる。この変異は不活性化RIIを有する別の非RER結腸癌細胞系である VACO410において特定されていた。これらの点突然変異は、細胞増殖を抑制するT GFβの能力の喪失および正常濃度のRIIのmRNA転写物が持続的に存在することを 伴う、RIIにおける点突然変異の、ヒト腫瘍における最初の例である。このよう にこれらの点突然変異は、RIIを不活性化しおよびRIIのリガンド結合、リセプタ ー蛋白質構造、リセプター蛋白質のプロセッシング、あるいはリセプター蛋白質 の安定性に影響をおよぼす、ヒト腫瘍における点突然変異の最初の例である。こ のクラスの変異は、VACO8およびVACO410のように、非RERであるとして特定され うる腫瘍において、そしてVACO8およびVACO410のように、増加された遺伝子変異 率により特定されうる腫瘍において、そしてさらに正常な濃度のRIIのmRNA転写 物が持続的に存在するとともに、リセプターリガンドとの結合の低下あるいは細 胞成長を抑制するTGFβの能力の低下という特性により特定されうる腫瘍におい て、引き起こされることが見いだされうる。変異RIIリセプターのこのような特 性を 調べるために本明細書中で提供されているアッセイは、同定するための標準的な 組換えDNA技術および本明細書中に記載されているような癌を診断する際に使用 するためのこれらの変異リセプターをコードするクローン化DNAと組み合わせて 使用することができる。 上記に開示されている変異RIIは、多くのヒト腫瘍において一般的な変異であ ることが期待されうるものであり、そしてそのため変異に対するアッセイは癌の 検出、診断あるいは可能な限りの予後に使用されてきた。このようなアッセイに は、変異ポリペプチドに対する抗体を使用した免疫アッセイ、TGFβ結合アッセ イ、あるいはRII遺伝子の変異領域を増幅するプライマー使用したPCR、変異アリ ールを検出するためのその他のDNAあるいはRNAプローブを使用したPCRが含まれ る。変異遺伝子配列を検出するための標準的なDNAを基礎とした技術には以下の ものが含まれる：すなわちPCRと直接シークエンシング法（例えば、McPherson， et al.，（1992）The Practical Approach Series，オックスフォード大学出 版；Sambrook，et al.，（1989）モリキュラークローニング：実験室マニュアル 、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニュ ーヨーク；およびMullis，et al.，（1987）Methods in Enzymology，155：335 を参照されたい）；PCRとアリール特異的ハイブリダイゼーション法（例えば、K umar，et al.，（1990）Oncogene，５：1271-1277；Kumar，et al.，（1990）Sc ience，248:1101-1104；van Mansfeld，et al.，（1992）PCR Meth．Appl.，１ ：211-216；Sukumar，et al.，(1991)Mol．Carcinogen，４：362-368；およびSu kumar，et al.，（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87：718-722を参照され たい）；一本鎖構造多型性の技術（SSCP、例えば、Iwahara，et al.，(1992)Bio tech.，12：64-66；およびOrita，et al.，（1989）Genomics，５：874-879を参 照されたい）；ミスマッチ増幅変異アッセイ法（MAMA、例えば、Cha，et al.， （1992）PCR Meth．Appl.，２：14-20；およびSommer，et al.，（1992）Biotec h.，12：82-87を参照されたい）；そして変性密度勾配ゲル電気泳動を用いたヘ テロデュープレックスアッセイ（heteroduplex assay）（DGGE、例えば、Fukuda ，et al.，（1993）Mol．Carcinogen，７：257-262；Ruano，et al.，（1992）P CR Meth．Appl.，２：112-116；およびSoto，et al.，（1992）PCR Meth．Appl.， ２：96-98を参照）が含まれる。これらのアッセイは腫瘍組織あるいは正常組織 の抽出物中の、あるいは便を含む生物学的液体中の変異RIIのDNAを検出するため に使用されうる。 RIIの不活性化の検出のための好ましいアッセイは上記に詳細に記載されてい るが、その他の検出方法も技術従事者（当業者）にとっては明らかでありうるも ので、RIIの不活性化を検出するためのこれらの他の方法を使用することはまた 、以下に記載する診断的および予後としての使用のための本発明の範囲内のもの である。 同様なアッセイは、TGFβ様因子の属のその他のメンバーに対するＩ型およびI I型リセプターの不活性化あるいは欠損を検出するために使用されうる。その他 のTGFβ様因子に対するII型リセプターの体細胞突然変異により、特定の因子／ リセプターシステムを介して媒介される増殖の調節下から細胞は解放され、結果 として変異を持つ細胞の制御されない成長（形質転換）が引き起こされうる。こ のような変異は本明細書中に記載されているように特徴づけられうるものであり 、そして一旦変異が特徴づけられれば、変異に対するアッセイは本明細書中に記 載した原理を使用することにより計画されうる。 これらのリセプターの変異は、（例えば、リセプターをコードするmRNAを測定 することにより、リセプターに特異的な抗体を測定することにより、細胞に対す る因子の結合を測定することにより、あるいは因子により刺激された生物活性を 測定することにより定められる様に）リセプター活性が抑制されているあるいは 発現されていない形質転換された細胞系において容易に特定されうる。TGFβに 対するII型リセプターについて記載されているように、ライブラリーからクロー ンを選択するために野生型リセプター配列に由来する核酸プローブあるいはプラ イマーを使用して、リセプターは形質転換細胞系から調製されたcDNAライブラリ ーあるいはゲノムDNAライブラリーからクローン化されうる。クローンが変異リ セプターをコードするDNAを含むことの確認は、例えば、mRNAあるいはそれにコ ードされる蛋白質の配列中あるいはその範囲内において相違を観察することによ りなしうる。リセプターの変異型をコードし、そして／または発現しているクロ ーンが一旦分離されてしまうと、患者サンプル中のリセプターの変異型を検出す ることはTGFβのRIIリセプターについて記載したものと同一のアッセイにより容 易になし得る。 RER癌における変異についての標的となりうることを我々が立証してきた、そ してその変異がRIIのように癌において成長に有利に寄与する場合に選択されう る、そのようなコーディング領域中の反復するDNA配列要素の存在をRIIと共有し ているそのほかの成長調節遺伝子が、不活性化されているあるいは存在しないこ とを検出するために、同様なアッセイが使用されうる。ジーンバンクの様な遺伝 子データベースをコンピュータで検索することにより、このような候補となる遺 伝子を特定することができる。このようなコンピュータ検索により見いだされた 遺伝子の候補の例には、Rossら（Trends in Neurosciences，1993，vol．16，pp .254-261）により開示されたたとえばサイクリンＤ遺伝子、アルファ２アドルナ リン作働性リセプター、および形質転換促進因子βそれ自体が含まれる。 診断および予後のためのRII不活性化アッセイの使用 TGFβに対するII型リセプターであるRIIは、結腸癌の25％において不活性化さ れている結腸癌の抑制遺伝子である。このことは、（上記により明らかにされた ）RIIの不活性化を検出するアッセイを、医学的に使用することが重要なことで あることを示している。これらの使用には、結腸癌あるいはその他の癌に対する 外科手術、放射線治療あるいは化学療法の後の患者の治癒あるいは再発の可能性 を予想することが含まれる。本発明は、RIIの遺伝子変異、RIIの伝令RNAの喪失 、RIIリセプター蛋白質の欠損、そして機能性RIIリセプター蛋白質の欠損（例え ば、変異RIIの存在）についてのアッセイを含む、RIIの不活性化を検出するため のすべてのアッセイのそのような使用を含むことを意図している。 RIIの欠損あるいはRIIの変異によるRIIの不活性化を検出するあらゆる方法が 、癌の診断、癌の検出、あるいは癌の予後、または結腸癌あるいは子宮内膜癌、 卵巣癌、胃癌、膵臓癌およびその他の悪性腫瘍などのその他の癌の研究機関にお ける使用目的で使用されうる。RIIの不活性化の検出は、不安定なマイクロサテ ラ イトDNAを有する結腸癌あるいはその他の癌（例えば、RER結腸癌、変異誘導型結 腸癌）を特定するための代わりのアッセイとして使用されうる。ヒトの癌におけ るどのRII変異も、癌の診断、予後のための試験を計画するために、あるいは癌 の治療法を計画するために使用されうる。癌の検出、診断、予後、あるいは療法 に使用するためのRII変異には、Hct116、RKO、C、VACO457、VACO670、VACO432、 VACO444、VACO5、VACO6、VACO8、VACO703、VACO481、およびVACO410細胞系中の 変異が含まれる。 本発明によれば、結腸癌あるいはその他の癌の臨床サンプルについて容易に行 いうる、RII変異についてのアッセイを案出することが可能である。RIIの不活性 化を検出するための２つの現在のアッセイ（RIIに対するTGFβの結合の喪失ある いはRII転写の喪失）は、腫瘍組織内の腫瘍細胞系においてよりよく機能する。 腫瘍中でよりよく機能するアッセイには、免疫組織化学的アッセイにおいて使用 する抗RII抗体あるいはインビトロにおける転写および翻訳アッセイ、RIIメッセ ージを検出するためのインサイチュハイブリダイゼーション法あるいはRT-PCRア ッセイ、あるいは変異RIIのゲノム配列を検出するアッセイなどの、通常はPCR増 幅をした後に行うRII変異を検出するためのアッセイが含まれる。別の方法とし ては、患者において変異RIIが存在することを、RII変異に対するかあるいは免疫 寛容を打破することにより本来のRII蛋白質の他のエピトープに対するかのどち らかを目的とする抗体反応の生成を患者の体内で検出する免疫アッセイにより検 出されうる。 RER腫瘍サブタイプの検出 RERアッセイは不安定なDNA（あるいは複製のエラー、Replication ERror）を 伴う結腸癌を特定する。これらの型の結腸癌は、一般的な様々な種類の遺伝性結 腸癌の典型である。それらには表面上は散発性の結腸癌がおよそ15％存在するも のの、表面上は散発性の結腸癌であるものが本当に散発性なのかあるいは発症が 年齢的に遅いだけの遺伝性結腸癌を代表するものなのかについては知られていな い。RERアッセイは、比較的純粋な腫瘍DNAを必要とする、扱いにくいアッセイで ある。 RIIの不活性化の検出法は、不安定なマイクロサテライトDNAを持つ結腸癌（RE R結腸癌、変異誘導型結腸癌）を特定するための代わりのアッセイとして使用さ れうる。111例のRERサブクラスの結腸癌のうち少なくとも100例では、不活性化 されたRII遺伝子を持つことが見いだされた。このように、RIIの不活性化を調べ るためのアッセイは、RER結腸癌を特定するための現在のアッセイと機能上代わ りのアッセイとなりうる。本発明は、上で議論されたRIIの不活性化のためのア ッセイ（たとえば抗RII抗体の使用、あるいはRII転写の欠損を検出するためのイ ンサイチュハイブリダイゼーション法、あるいは変異RIIのゲノム配列を検出す ること）を、RERアッセイに単純に変わるものとしてあるいは確証的なRERアッセ イを行う価値のある腫瘍を特定するために腫瘍をスクリーニングするため使用す ることを企図している。 それらが結腸癌のRERサブクラスの特徴と関連して記載されている一方で、本 明細書で記載されたアッセイはまた、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、そして膵臓癌 を含む不安定なマイクロサテライトDNAを有するその他の腫瘍型を特定するため にも有用である。 癌診断 RIIの不活性化を結腸癌の分子マーカーとして使用することは、新規な概念で ある。Parkら（1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91：8772-8776）は、RIIは 胃癌細胞系の少数において不活性化されていることを報告したが、しかし彼らは RII変異については特定しなかったしRERサブクラスの癌が一般的にRIIの不活性 化を伴うことを結びつけることはしなかった。さらに本発明によれば特定された 腫瘍の臨床的研究は、不活性化されたRIIを有する結腸癌の臨床動態をRIIが正常 である腫瘍と比較する方法をさらに精巧に考案しうる。RIIの存在あるいは欠損 を調べる試験の究極的な臨床的使用法は、現在乳癌の患者において治療するため の指針としてエストロゲンリセプターの存在あるいは欠損のためのアッセイを臨 床的に使用する方法と同一の方法であるだろう。 RII遺伝子は、変異の（特に体細胞変異の）標的として好適なものと思われ、 そのためRII遺伝子中に変異が現れることにより、それが腫瘍の進行度の初期の 指標となることが期待されうる。このように体組織あるいは体液中でRII変異を 検出するための方法は、腫瘍性変化が組織レベルで観察しうる前に細胞の変化（ RII変異）を検出することにより、癌あるいは前悪性病変を初期に検出するため に使用されうる。これらのアッセイはまた、RII変異を持つ複数の前悪性のクロ ーンを生成しうる、前もって癌の発生に対して処置された患者において、DNAの 不安定性を検出するためにも使用されうる。 RIIの不活性化による、RIIの欠損あるいはRIIの変異による、RIIの不活性化を 検出するためのどんな試験も、結腸癌あるいはその他の癌の診断のために使用さ れうる。これには、RII遺伝子変異、RII伝令RNAの欠損、RIIリセプター蛋白質の 欠損、そして機能性RIIリセプター蛋白質の欠損を調べるアッセイが含まれる。R IIの欠損あるいは変異RIIの存在はバイオプシーの材料を抗体で染色することに より検出されうる。RII転写の欠損はバイオプシー材料においてRNAのインサイチ ュハイブリダイゼーション技術により検出されうる。どちらのアッセイも癌の診 断に使用されうる。これらのアッセイは画像解析装置におり自動化されうる。同 様に、PCR技術を用いて、TGFβとの結合能力によるか、あるいは変異RIIに反応 性なあるいは変異型および野生型RIIにより一般的に共有されるエピトープに反 応性な抗体に対する結合能力によるかどちらかにより、可溶性あるいは異常な大 きさのRII蛋白質を検出するためのアッセイを用いて、あるいは変異を検出する ように設計されたDNAあるいはRNAプローブを用いて、変異RII蛋白質あるいは遺 伝子は体液あるいは排泄物において検出されうる。患者体内において変異RII蛋 白質が存在することはまた、変異RII蛋白質に対して、あるいは免疫寛容を打破 することにより本来のRII蛋白質上のその他のエピトープに対して、患者体内で 誘導された抗体反応を検出することにっても決定されうる。これらのアッセイに より、結腸癌などの変異リセプターを有する癌を初期において検出することが可 能になる。 RIIの不活性化を検出することにより癌を診断する同一のクラスの試験は、RII に相同性がある遺伝子が不活性化されている癌の診断にも使用しうる。このよう な遺伝子には、II型成長因子リセプターサブユニットをコードする遺伝子が、こ れらは構造上TGFβと相同性を持つリガンドの属と結合する、セリン−スレオニ ンキナーゼリセプターの属のメンバーであるリセプターに属する含まれうる。こ のような遺伝子には、反復DNA配列モチーフのコーディング領域を有するという 特徴をRIIと共有する、成長調節遺伝子も含まれる。 予後のアッセイ RIIの不活性化の検出は、結腸癌あるいはその他の癌に対する外科手術、放射 線治療あるいは化学療法の後の患者の治癒あるいは再発の可能性を予想するため に特に価値がある。RIIホルモンリセプターの不活性化を伴う結腸癌および胃癌 は、成長調節に関する特異的な欠損を共有する結腸癌および胃癌の特定の遺伝子 サブセットを構成する。不活性化されたRIIを有する腫瘍を特定するアッセイは 、手術により、化学療法により、あるいは放射線治療により腫瘍が治癒する可能 性を予想する際の予後としての価値を持つ。（この状況は、癌のサブセットがエ ストロゲンリセプターを欠損しておりこのサブセットが手術により治癒する可能 性が低く、ホルモン剤への反応性を欠損するという特徴的な生物学を有する乳癌 における状況と同一である。） 不安定なDNAに対するRER分子アッセイにおいて陽性であるかどうかを試験する ほとんどの結腸癌もまたRIIが不活性化されていることが示されるという我々の 観察により示されるように、RIIの欠損は予後の有用性がある。RER＋の結腸癌は 非RER結腸癌よりも手術により治癒しやすいということが他からすでに示唆され た（Thibodeau，et al.，Science，206：816（1993）；Lothe，et al.，Cancer Res.，52：5849（1993））。RIIの不活性化についてのアッセイはRERアッセイよ りも容易であり、そして少なくとも腫瘍の発生を予想しうるものである。 ヒトの癌において発見された不活性型のRII変異のあらゆるものが、癌の診断 および／または予後についての試験を設計するために、あるいは癌の治療を計画 するために使用されうる。我々は、ヒトの癌はRII変異を有することおよびこれ らの変異は（上記の概略のように）癌の検出、予後の際に使用するためにおよび RIIを標的とした癌療法剤を設計するために使用されうるという一般的な原理を 確立した。 本発明は、癌の診断、癌の検出あるいは癌の予後のために、あるいは研究機関 において使用するために、RIIおよびRI（Ｉ型リセプター）の発現あるいは発現 の欠損を検出するための特異的RNase保護アッセイも提供する。RIIの不活性化を 検出するためのRNase保護アッセイの明確な詳細については上記においておよび 以下の実施例において詳述する。上記に開示された配列に基づくRNAプローブが ＴGFβの成長調節経路においてたとえばRI（Ｉ型TGFβリセプター）の様なその 他のシグナル伝達構成要素不活性化を検出するためのRNase保護アッセイにおい て使用されうる。これらのRNase保護アッセイは、TGFβ経路のこれらの構成要素 のどんなものの不活性化を検出する際にも使用される商業的な試験用キット中に 簡単に取り込むために役にたつ。本発明は癌の検出、診断、予後および研究のた めにこれらのアッセイを使用することを企図している。 本発明は、癌の診断、癌の検出、あるいは癌の予後のために、あるいは研究機 関において使用するために、変異RIIの存在を検出するための特定のゲノムPCRア ッセイも提供する。RIIの不活性化を検出するためのRIIゲノムPCRアッセイの明 確な詳細については、上記あるいは以下の実施例において詳述する。上記に開示 された配列に基づくプライマーは、TGFβの成長調節経路におけるたとえばRI（ Ｉ型TGFβリセプター）の様なその他のシグナル伝達構成要素の不活性化を検出 するためにゲノムPCRアッセイにおいて使用されうる。これらのゲノムPCRアッセ イは、TGFβ経路のこれらの構成要素のあらゆるものの不活性化を検出する際に も使用される商業的な試験用キット中に簡単に取り込むために役にたつ。本発明 は、癌の検出、診断、予後および研究のためにこれらのアッセイを使用すること を企図している。 RIIの置換による療法的な処方 RII遺伝子療法は、癌細胞中に正常なRII遺伝子を導入するための遺伝子操作を 含む、癌を治療を目的として企図された。TGFβ様因子の属のメンバーに対する リセプターの変異により結果としてそれぞれの因子に対して無反応性となってい るあらゆる腫瘍が、機能性リセプターを腫瘍細胞に提供しそれにより細胞増殖の 調節を再構築する遺伝子療法に対して候補となる。好ましい候補としてあげられ るII型TGFβリセプター（RII）は結腸癌の恐らく25％において不活性化されてい る結腸癌抑制遺伝子であり、そのためこれらの結腸癌において機能性RIIの発現 を回復するための遺伝子療法は癌の患者にとっては有益なものとなるだろう。RI I遺伝子療法の１つの重要な理論的な有利性は、すでにRIIを発現している正常な 細胞に対して毒性を持たないことが予想されていることであろう。 本発明の方法において使用される遺伝子療法ベクターにはRIIを発現するレト ロウィルスベクターあるいはエピゾームベクターが含まれる（例えばば、双方と も本明細書中で参考文献として援用されている、Axelらの米国特許第4,399,216 号およびPastanらの米国特許第5,166,059号を参照）。本明細書で企図されてい るような送達システムにはウィルスによる送達システムおよびリポソームによる 送達システムが含まれる（例えば、本明細書中で参考文献として援用されている 、Davisらの米国特許第4,920,209号を参照）。RII遺伝子発現ベクターが作成さ れ、そしてそれにより乳癌の細胞系がマウスにおいて腫瘍を形成する能力をノッ クアウトすることができることを示した（Sunら、1994を参照）。RII遺伝子発現 ベクターを形質導入することにより、結腸癌細胞系の腫瘍を形成する能力をノッ クアウトすることができることが、同様の実験により示された。とりわけ、HCT1 16結腸癌細胞系において野生型RIIの発現を回復することができる遺伝子導入技 術を使用することにより、これらの癌細胞はマウス体内で腫瘍を形成する能力を 失った。 正常のTGFβリセプターを有する結腸細胞においては、TGFβに対して感作する ことにより細胞死（アポトーシス）が誘導されうることを、我々は示した。この ように結腸癌細胞において活性型RIIを回復する療法的な効果には、正常な細胞 死経路を回復することが含まれうる。RII遺伝子療法はこのように、従来からの 細胞傷害性の放射線照射あるいは化学療法と組み合わせて、そしてこれらに対す る細胞の感受性をあげるために有効である。 本明細書中で記載されているRII変異の療法的な別の使用法は、腫瘍免疫療法 の標的としてそれらを使用することである。RII変異配列は、変異リセプターと してあるいはHLA抗原と関連するペプチドとして細胞表面に提示されうる腫瘍特 異的抗原をコードする。このように、それらは腫瘍免疫療法の標的として使用さ れうる。このようなアプローチには、（なにも結合せずあるいは腫瘍壊死剤と抱 合させた）特異的なモノクローナル抗体により、あるいは特定の活性化された細 胞傷害性免疫細胞によりこれらの変異を標的にすることが含まれる。このような 抗体あるいは免疫細胞は、体外において試薬として生成されうるか、あるいはこ れらの変異を標的としたワクチンにより体内で生成されうる。本発明による活性 のある免疫療法において使用される免疫原性組成物には、上記に記載されている 用に調製された組換え変異RII蛋白質および変異RII蛋白質を発現する発現ベクタ ー（特に組換えウィルスベクター）が含まれる。このような発現ベクターは本明 細書中で参考文献として援用されているBaschangらの米国特許第4,446,128号、 あるいは本明細書中で開示されている変異RII配列を使用するAxelら、Pastanら あるいはDavisらに記載されているように調製することができる。注記すべきは 、癌の診断に使用するためのRIIエピトープに対する自己抗体を使用することに より、癌の治療に使用するためのRIIのエピトープに対する免疫療法が使用でき なくなる。これは、癌治療のための免疫療法の臨床的有効性には抗体と腫瘍壊死 剤との抱合あるいは液性よりもむしろ細胞性の免疫反応が生成することが必要と されうる。 RII発現を活動的にすることによる療法 上記に十分に述べたように、機能性RIIの欠損はER＋乳癌を特定するための部 分的な代用物として機能しうる。さらに機能性RIIを欠損する乳癌細胞のこのサ ブセットは、RER＋型ではない。これらER＋乳癌細胞には野生型のRII蛋白質配列 をコードするDNAが含まれ、そしてそのことから細胞の機能性RIIが欠損している のは、RII遺伝子それ自体に変異があるのではなく発現が抑制されているためで あるということが示された。このような事情により、RIIの発現の抑制を解くこ とによる代替的な療法の可能性が現れる。 ER＋乳癌においてDNAメチルトランスフェラーゼを阻害しまたそれによりDNAの メチル化を逆転化する薬物を用いて治療することにより、野生型RII発現は再活 性化されうることが発見された（実施例８では５−アザシチジンの処置により、 ER＋細胞系であるMCF-7、ZR-75およびT-47DにおいてRIIの発現が回復したことが 示される）。このように、ER＋乳癌細胞（およびDNAのメチル化亢進により機能 性RIIが同様に欠損しているその他の腫瘍）は、上記で記載されたような遺伝子 療法により野生型RII遺伝子を供給する代わりに、内在性の野生型遺伝子であるR IIの発現を回復するためにDNAメチルトランスフェラーゼの阻害薬を投与するこ とにより治療することができる。 この治療に対してふさわしい腫瘍は、本明細書中で記載されている、最初に機 能性RIIの欠損を確認し、そして同様にゲノム中に野生型のRII遺伝子が存在する ことを確認するというアッセイ手順を使用して特定することができる。腫瘍のDN Aにおけるメチル化の亢進を特定することはまた、この療法の指標でもある。腫 瘍中のDNAのメチル化は、同一の個体から採取された正常組織と比較して、メチ ル化感受性DNA制限酵素による改変サザンブロット法で示す遺伝子プローブ（た とえばcDNA）により認識することができる（たとえば、本明細書中で参考文献と して援用されている、Issa，et al.，（1994）Nature Genetics，７：536-540、 およびGonzalez-Zulueta,et al.，（1995）Cancer Research，55：4531-4535を 参照）。 ふさわしい薬物は、本明細書中で参考文献として援用されているFergussonら （（1995）Cancer Research，55：2279-2283）により教示されている手順に従い 確認しうる、DNAメチルトランスフェラーゼを阻害する組成物である。薬物が５ −アザシチジンと匹敵する阻害効果を示しうるものが望ましく、薬物が素早く吸 収され、経口投与でき、および／またはより長い血清中半減期を有することを含 む、より副作用が低くおよび／または薬効が増進しているものであることがより 望ましい。 実施例 本発明を容易により完全に理解するために、いくらかの実施例を以下に提供す る。しかしながら、本発明の範囲は、説明のみのためのものであるこれらの実施 例に開示された特定の態様には限定されない。 実施例１：RER＋細胞系におけるRIIの消失 RIおよびRII転写物の発現については、上記に記載された様にリボヌクレアー ゼ（RNase）保護アッセイを用いて38種のヒト結腸癌細胞系において検定した（ 同様にSun，et al.，1994も参照されたい）。それぞれのサンプルから得られた 総RNA（40μg）は、一回反応でRI、RIIおよびヒトγ−アクチンに対するプロー ブと一晩ハイブリッド形成した。図１Ａは、反応産物を示す、７Ｍ尿素−６％ア クリルアミドゲルのオートラジオグラムを示す。RIIプローブ（RIIp）は、およ そ274bpの緊密なダブレットを保護し、そしてRIプローブ（RIp）は222bpの断片 を保護した。対照のγ−アクチンプローブ（Actin-p）は126bpの断片を保護した 。結腸癌細胞系をレーンの上部に示し、VACO群の細胞系については名称の頭にＶ の字を付すことにより示した。対照反応としては酵母菌のtRNAにより生じた保護 のパターンを示す。２枚の写真は、２種の独立した実験から得られた結果を示す 。 RNaseによる保護パターンは（図１Ａにおいて示されているように）、レーザ ー濃度計（Laser Densitometry）により定量された。サンプルのローディング の変化量は、ヒトγ−アクチンの相対的な発現量によりサンプルの標準化をする ことにより調節した。任意のO.D.（吸光度）単位における相対的な転写発現量に ついて、11種のRER＋細胞系および27種のRER−細胞系について図１Ｂに示す。矢 印はRER＋細胞（黒矢印）およびRER−細胞（白矢印）のリセプター発現量の平均 濃度を示す。波線は最高度の感度で露光した場合に保護された転写物が裸眼で検 出される限界を示す。 RI転写物は、すべてのサンプルにおいて検出されたのに対して、RII転写物は 、サンプル中の12種（32％）で検出できないかあるいは濃度が顕著に減少してい ることがわかった（図１Ａおよび１Ｂ）。これらの細胞系については、これとは 別にRER表現型を調べた。これらの細胞のＲＥＲの状態は、Liu，Bら（1995，Nat ure Genet.，９：48）に記載されたように決定した。研究に供されたRER＋結腸 癌細胞は、RKO、Hct116、Ｃ、VACO432、VACO444、VACO457、VACO481、VACO5、VA CO6、VACO670およびVACO703である(Eshleman，J.，et al.，1995，Oncogene，10 ：33；Liu，B.，et al.，1995，NatureGenet.，９：48）。11種のRER＋細胞系の うち９種でRIIの発現が減少したが、しかし27種のRER−細胞系では３種でのみ 減少した（図１Ｂ）。この相関性は、高度に特異的であった（チースクアド（ch i-squared）テストにより、Ｐ＜0.001）。サザン（DNA）ブロット解析により、R ER＋細胞におけるRII転写物の喪失は、RII遺伝子の欠失あるいは再構成によるも のではなさそうだということが示された。 実施例２：RER＋腫瘍の異種移植片におけるRIIの消失 RER＋細胞においてRIIの不活性化が単に細胞培養中に選択された特性でないこ とを示すために、胸腺欠損マウスに移植することにより30種類のヒト結腸癌から 由来する腫瘍の異種移植片においてRIIの発現を調べた。外科的切除により得ら れたヒト結腸癌細胞組織（５mm²）を、胸腺欠損マウスの前肢皮下に移植した。 異種移植片は、それらが1000mm³になった時点で回収した。 異なるヒト結腸癌から確立した異種移植片（Ｘで標識）においてRIIおよびγ- アクチンの転写を測定するために、RNase保護アッセイを使用した。図２ではこ れら７種の細胞についての結果を示している。”Ｌ”で標識されたレーンには異 種移植片と同一の腫瘍から確立された不死化細胞系から得られたサンプルが含ま れ、そしてRIIの発現を比較して示している。対照の反応は酵母菌のtRNAにより 生成された保護パターン（Ｙで標識）を示す。 RII転写物は、RER＋異種移植片の100％（３種のうち３種）で欠損していた（ 図２、異種移植片１−３）が、しかしRER−異種移植片の93％（27種のうち25種 ）では高濃度で存在していた（図２、異種移植片４−７）。さらに、３種のRER ＋異種移植片でRII転写物が欠損しているという結果は、同一の腫瘍から確立さ れた３種の不死化細胞系において以前に観察された結果と同一の結果であった。 このように、RIIの転写が欠損することは、細胞系の細胞培養における人為的結 果ではなかった。 実施例３：TGFβ結合活性の欠損 細胞表面TGFβリセプターの発現をアッセイするために、¹²⁵Ｉ-標識TGFβを用 いて架橋結合実験を行った。Sun，L．ら（1994，J．Biol．Chem．269：26449） に記載されているように、¹²⁵Ｉ-標識ヒトTGFβと架橋結合させることで細胞表 面ＴＧＦβリセプターを標識した。標識されたリセプターは、SDS-ポリアクリル アミドゲル電気泳動により変性し、そしてオートラジオグラフで視覚化した。検 出可能な¹²⁵Ｉ-TGFβでRIIの転写量の減少を伴う試験したRER＋細胞系の８種類 のどれかと結合するものはなかった（図３）。これらの細胞系におけるRI表面リ セプターの欠損（図３）は、RIIリセプターがRIに対するTGFβの結合に必要であ るというかつての報告と一致している（Wrana，J.，et al.，1992，Cell，71：1 003；Sun，L.，et al.，1994，J．Biol．Chem．269：26449）。３番目のTGFβリ セプター（RIII）はほとんどのRER＋細胞系およびRER−細胞系において発現して いる（図３）。しかし、RIおよびRIIに対してリガンドを提示するときにおいて のみ機能すると考えられているように（Lopez-Casillas，et al.，1993，Cell， 73：1435）、機能的な重要性はないように思われる。 実施例４：RIIの不活性化変異 RIおよびRII細胞表面リセプターは、RIおよびRIIの転写物が正常量である２種 のRER＋の事例のうちの一つである、VACO481細胞においても検出できなかった。 RII中の変異によりTGFβがRIにもRIIにも両方ともに結合できなくなるが、RIに おける変異は一見するとTGFβのRIIに対する結合には影響がないかのように見え る（Wrana，J.，et al.，1992，Cell，71：1003；Boyd，et al.，1989，J．Biol ．Chem．264：2272；Laiho，et al.，1991，前出、266：9108；Laiho，et al.， 1990，前出、265：18518）。このように、VACO481細胞からRIおよびRII細胞表面 リセプターが欠損することは、RIIの変異によりもっとも容易に説明しうる。 RIIの変異が存在することは、最初はインビトロでの転写ー翻訳アッセイの結 果により示唆された。変異は、完全なVACO481のRIIに対するcDNAの配列解析によ り決定された。RIIは、相補的DNA（cDNA）からポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR） を用いることでクローン化された。PCR産物は、pCRIIクローニングベクター（イ ンビトロジェン社製）中にライゲーションし、蓄積されたDNA配列あるいは個々 のRIIクローンの配列を決定した。参考文献として使用した野生型RIIの配列は、 ジーンバンクの承認番号＃M85079として更新した。 VACO481のRIIに対するcDNAの配列解析から、1931番から1936番ヌクレオチドに ある６塩基対（bp）のGTGTGTなる配列中にGTの挿入があることが示され（図４） 、 この配列は正常な配列上では欠損していることが示された。結果として得られる フレームシフトは、強塩基性の29アミノ酸残基のCOOH末端をもって弱酸性の33ア ミノ酸残基である野生型のCOOH末端の代わりをしていることを示している。Val5 34から始まるVACO481のRII変異のCOOH末端配列は、以下に示される：ValTrpGlnA snAlaSerValSerTrpSerIleTrpThrGlySerArgGlyGlyAlaAlaArgArgArgArgPheLeuLysT hrAlaPro（配列番号：７）である。配列の変化（それらがVACO481腫瘍にも遺伝 子的に適合した正常な組織においても存在することから、多型性であると推測し ているのだが）には、ヌクレオチド1651番におけるＣからＴへの置換（Ala 439 からValへの変異）と3'非翻訳領域であるヌクレオチド2040番におけるＡからＣ への変異とが含まれる。想像では、この変異はRIIの立体構造、安定性、および ／またはリセプターの機能に必要であるその他の蛋白質と相互作用をする能力に 変化を起こしうる。同一のRIIフレームシフト変異はまた、VACO481細胞系を確立 した元になった初代培養結腸癌においても検出されたが、しかし同一の患者の正 常な結腸組織からは検出されなかったことから、変異は体細胞突然変異であるこ とがわかる。 mRNA転写物の5'領域に位置するフレームシフトの変異は、伝令の安定性を低下 させることと関連している。この型の変異を探すため、RII転写物が顕著に減少 はしているもののRT-PCRで回復することができる、さらに７種類のRER＋細胞系 からRIIに対するcDNAの5'部分をシークエンスした。これらの細胞系のそれぞれ において、RIIのフレームシフト変異が見つかった。これらの変異はすべて、10 個の反復するアデニン（ヌクレオチド709-718）中に位置し、１塩基だけ短いも の（５種の細胞系）あるいは２塩基だけ短いもの（２種の細胞系）が見いだされ た（図４）。また、先の患者の結腸腫瘍においてあるいはこれらの腫瘍の異種移 植片の初代培養において、細胞系のうち３種で検出されているRII変異を検出し た。２事例で、変異はこれら患者の正常組織において存在しないものとしてさら に確立された。野生型RII（567アミノ酸）と比較して、ポリアデニン系のうち１ および２塩基対の欠失により、それぞれ161アミノ酸、129アミノ酸の不活性型の 短縮されたリセプターがコードされることを示している。RIIの不活性化はこ のように、研究された11種のRER＋細胞系のうち10種でほとんどの事例において 低濃度のRIIの転写を伴うRII遺伝子の変異および／または細胞表面RIIの欠損が 発見されることにより示された。もう一つのRII変異は、不活性化RIIによる変異 誘導型表現型の非RER結腸癌細胞系であるVACO8において起こっている、RIIにつ いてのジーンバンクの配列のうち、ヌクレオチド1899番でのＧからＡへの点突然 変異であり、それにより結果としてAsnからAsp 522へ置換している。 実施例５：RER＋腫瘍と関連する不活性化RII RER＋結腸細胞系と比較して、RER−細胞系の少数のもののみがTGFβリセプタ ーが不活性化されていることを示す。RER−細胞系では、90％の細胞で（27のう ち24）でRIおよびRIIの転写物が存在することが（図１）、86％の細胞で（７の うち６）でRIおよびRII細胞表面リセプターの転写物が存在することが（たとえ ば図３を参照）、そしてTGFβによる細胞成長阻害は研究されたサンプルの100％ で（５のうち５）示された（Hoosein，N.，et al.，1989，Exp．Cell Res.，181 ：442）。 本研究におけるRER＋サンプル（細胞系および異種移植片）は、優勢な右側（r ight-sided）結腸癌（９種の評価可能なもののうち８種）、ほとんどは転移性の 結腸癌（９種の評価可能なもののうち５種）から由来していた。しかしながら、 RER−サンプルにも、17種の相当する右側（right-sided）結腸癌（RII欠損して いるものはなし）および32種の相当する転移性の結腸癌（RII欠損しているもの は２種のみ）が含まれていた。このようにRIIの欠損は、癌の発生部位や臨床的 段階よりはむしろ、癌のRER表現型の特徴である。 家族性結腸癌（遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌、HNPCC）から確立された２種 の細胞系、散発性結腸癌から得られた６種の細胞系（Aaltonen，L.，et al.，19 93，Science，260：812；Ionov，et al.，1993，Nature，363：558；Thibodeau ，et al.，1993，Science，260：816；Kim，et al.,1994，Am．J．Pathol.，145 ：148）、既知のミスマッチ修復遺伝子中に変異がある５種の細胞系、そして野 生型のこれらの遺伝子のみを持つ４種の細胞系（Liu，B.，et al.，1995，Natur e Genet.，９：48；Papadopoulos，N.，et al.，1994，Science，263：1625；Br on ner，C.，et al.，1994，Nature，17：258；Fishel，R.，et al.，1993，Cell， 75：1027；Leach，F.，et al.，1993，前出、75：1215；Nicolaides，N.，et al .，1994，Nature，371：75）が、我々のRER＋サンプル中には含まれている。II 型TGFβリセプターはこのように、RER＋結腸癌のサブセットのうち現在のところ 特定されているものそれぞれにおいて不活性化の標的である。 実施例６：ゲノムPCRアッセイによる結腸癌中でのRII変異の検出 II型TGFβリセプター（RII）マイクロサテライトの不安定性を伴う111種の結 腸直腸癌のうち100種類で、ポリアデニン領域中に変異があることを見いだした 。ほとんどの事例で、ポリアデニン領域中の変異がRIIの両方のアリールに影響 を与えていた。RER＋腫瘍型においてRII変異を検出するために、ヌクレオチド70 9-718までのRIIのポリアデニン反復配列を含む変異に関するホットスポットを検 出するための、PCRを基礎としたアッセイが開発された。この反復配列を包含す る73bpのゲノムDNAからPCR増幅した後、アクリルアミドゲル電気泳動を行った。 増幅した断片のサイズ中での１あるいはそれ以上の塩基対のシフトは、変異に関 するホットスポット中でフレームシフト変異があることを示している。特に、RI I遺伝子の73bpの領域（nt665-737）は、およそ10ngのＰ³²で末端標識したTA10-F 1プライマー5'-CTTTATTCTGGAAGATGCTGC-3'（配列番号：８）および150ngのリバ ースプライマーTA10-R1 5'-GAAGAAAGTCTCACCAGG-3'（配列番号：９）を用いて 、95℃30秒、55℃１分、70℃１分を１サイクルとして、30サイクル行うことで50 -200μgのゲノムDNAから増幅した。PCR産物は６％のLongRanger（FMCバイオプロ ダクツ社製）ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上で52℃で電気泳動することで 分離し、オートラジオグラフィーで視覚化した。それぞれのアッセイでの標準は 、野生型RIIを増幅することにより確立した。 実施例７：ゲノムPCRアッセイによる胃癌中でのRII変異の検出 II型転換性成長因子β（TGFβ）リセプター（RII）遺伝子の変異は、マイクロ サテライトの不安定性あるいは複製エラー（RER＋）を示す結腸癌の特徴であり 、これらRER結腸癌におけるRII変異は、RIIのコード領域に存在する10塩基対の ポリアデニン反復配列中に存在するフレームシフト変異が特徴的である。上記の PC Rアッセイを使用することにより、我々は、７種のRERの胃癌のうち５種（71＋17 ％）でヌクレオチド709-718のホットスポットにRIIフレームシフト変異があるこ とを検出した（たとえば図５を参照）。これらの結果より、RII遺伝子の変異は 成長に関して有利に働き、胃小腸系の上部（胃）および下部（結腸）の両方のRE R＋癌において選択されているということが示唆される。 実施例８：エストロゲンリセプター陽性（ER＋）の乳癌において検出されるR2の 不活性化 検出可能なRIIに対するmRNAの転写が欠損することを示すことにより、放射線 標識されたTGFβと結合することができる細胞表面RII蛋白質が欠損することを示 すことにより、そしてTGFβの機能的反応が欠損すること（TGFβに誘導される成 長抑制効果が欠損すること）を示すことにより、特定のヒト乳癌細胞系であるMC F-7において、機能性RIIが欠損することを示した（本明細書中で参考文献として 援用されている、Sun，et al.，1994）。Sunらにより概説されている方法を使用 して、ヒトの乳癌の実在するサブセットが機能性RIIを欠損すること、および機 能性RIIを欠損することが部分的にはエストロゲンリセプターが存在する（ER＋ ）乳癌の特徴であるということを示すためにこの観察を延長した。 RIIの不活性化はこのように、ER＋の乳癌において腫瘍発生に関与している。 DNAメチルトランスフェラーゼの阻害剤である５−アザシチジンによりDNAのメ チル化を阻害することにより、NCF-7、ZR-75およびT-47Dにおける野生型RIIの発 現が回復することが示された。細胞は2.5−5.0μMの５−アザシチジン存在下で 標 準的な条件のもと培養され、そして処理された細胞によるRII発現を８日後に、 実施例１に記載したRNase保護アッセイにより示した。RII蛋白質の発現は、実施 例３に記載した¹²⁵Ｉ-TGFβによる架橋結合により確定した。これによりこれら の細胞におけるRIIの発現の欠損はDNAのメチル化亢進のためであり、コード配列 それ自体に起こった変異によるものではないということを確認した。 別の観点、利点そして改良は、発明の関わる技術分野における通常の技術を有 するものには明らかであろうが、理解を明確にする目的で、前述の発明を特定の 態様とともに図面および実施例によりいくらか詳細に記載した。特に、これらの 腫瘍における特定のRII不活性化の様式により必要とされるものとして、癌の検 出、診断、予後、そしてRIIが欠損している（不活性である）腫瘍の治療のため に上記に概説されている戦略の改良は、いわゆる当業者には明らかであろう。前 述の説明および実施例は発明の範囲を示すためのものであるが、これらだけには 限定されない。医学、免疫学、ハイブリドーマ工学、薬学、および／または関連 する分野において技術を有する者には明らかである、発明を実施するための上記 に記載された様式の改良は、添付する請求の範囲によってのみ限定される発明の 範囲内にあることを意味している。 本明細書で言及されたすべての出版物および特許出願は、本発明が含まれる技 術分野の通常の知識を有する者の技術の程度を示している。それぞれの個々の出 版物あるいは特許出願を特定的に及び個々に参考文献として援用されていること を示している様に、すべての出版物および特許出願はある程度まで本明細書中で 参考文献として援用されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/71 Ｃ０７Ｋ 14/71 16/30 16/30 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ブラタイン，マイケル・ジー アメリカ合衆国オハイオ州43537，モウミ ー，ミル・リッジ 6707 (72)発明者 ウィルソン，ジェームズ・ケイ・ブイ アメリカ合衆国オハイオ州44122，シェイ カー・ハイツ，カールトン 2910

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．TGFβ様因子の属のメンバーに結合するセリン／スレオニンリセプターの 属のメンバーであるII型リセプターをコードし、あるいは野生型のコード領域中 に反復DNA配列のモチーフを含み、患者の腫瘍組織あるいは前癌病変として示さ れる成長調節遺伝子の非機能性変異型が存在することを含む、患者において非機 能性変異型の成長調節遺伝子を検出することを含む、患者において癌の診断を促 進する方法。 ２．患者の細胞によりII型TGFβリセプターの変異型（変異型RII）が発現され ていることを検出すること、あるいは腫瘍細胞において野生型RIIが欠損するこ とを検出することを含む、癌の診断あるいは予後を促進する方法。 ３．細胞における変異型RII核酸配列を検出すること、細胞上の変異型RII蛋白 質を検出すること、細胞上の機能性RIIが欠損することを測定すること、患者か ら採取された生物学的体液中に存在する可溶型RII断片を検出すること、または 患者の体内でRIIあるいは変異型RIIに対する自己免疫反応を検出することにより 、変異型RIIの発現あるいは野生型RIIの欠損を検出する、請求項２記載の方法。 ４．PCR増幅、核酸の配列決定、核酸プローブに対する結合、およびRNaseブ保 護から選択される方法により細胞内の変異型RIIの核酸配列を検出し、免疫組織 化学アッセイおよび細胞抽出液の免疫アッセイから選択された抗体結合アッセイ により細胞上の変異型RII蛋白質を検出し、細胞に対するTGFβの結合をアッセイ することおよびTGFβによる細胞活性の刺激をアッセイすることから選択される 細胞上の機能性RIIの欠損を測定し、変異型RIIあるいは野生型RIIに対して特異 的な抗体に対する可溶型の蛋白質に結合することおよびTGFβが可溶型蛋白質に 結合することから選択される患者から採取される生物学的体液中の可溶型RII断 片を検出し、あるいは、野生型RIIあるいは変異型RIIに対する液性免疫反応を測 定しまた野生型RIIあるいは変異型RIIに対する細胞性免疫反応を測定することに より、変異型RIIの発現あるいは野生型RIIの欠損を検出するための手順である、 請求項３記載の方法。 ５．変異型RIIの発現が、RER＋腫瘍の表現型、患者の予後、患者における腫瘍 あるいは前腫瘍の病変の存在、あるいは癌に対する患者の感受性を示す、請求項 ２−４のいずれか１項記載の方法。 ６．RIIの変異型が、正常なRII配列のうち1931-1936番のコドンの６塩基対の 反復配列であるGTGTGTにGTの２塩基対が挿入されること、正常なRII配列中の709 -718番のコドンの10塩基対のポリＡ配列への１塩基のＡが挿入あるいはそこから １塩基のＡが欠失されること、正常なRII配列中の709-718番のコドンの10塩基対 のポリＡ配列への２塩基のＡが挿入あるいはそこから２塩基のＡが欠失されるこ とを含む群から選択された変異により変更されたRIIのDNAによりコードされる、 請求項２−５のいずれか１項記載の方法。 ７．変異型のRIIが、正常なRII配列のうち1899番のアデニンがグアニンに置き 換わることによりRIIの522番アミノ酸がAsnからAspに変化すること、および正常 なRII配列中の1917番のアデニンがグアニンに置き換わることによりRIIの528番 アミノ酸がArgからHisに変化することを含む群から選択された変異により変更さ れたRIIのDNAによりコードされる、請求項２−５のいずれか１項記載の方法。 ８．変異が、正常なRII配列のうち1931-1936番のコドンの６塩基対の反復配列 であるGTGTGTにGTの２塩基対が挿入されること、正常なRII配列中の709-718番の コドンの10塩基対のポリＡ配列への１塩基のＡが挿入あるいはそこから１塩基の Ａが欠矢されること、正常なRII配列中の709-718番のコドンの10塩基対のポリＡ 配列への２塩基のＡが挿入あるいはそこから２塩基のＡが欠失されること、正常 なRII配列のうち1899番のアデニンがグアニンに置き換わることによりRIIの522 番アミノ酸がAsnからAspに変化すること、および正常なRII配列中の1917番のア デニンがグアニンに置き換わることによりRIIの528番アミノ酸がArgからHisに変 化することを含む群から選択された、変異型のII型TGFβリセプターをコードす る、異種核酸。 ９．請求項８記載の核酸によりコードされたポリペプチド配列を有する、蛋白 質。 10．機能性RII蛋白質に対するその親和性と比較してより親和性が高い、請求 項９記載の蛋白質に対する親和性を有する抗体。 11．請求項９記載の蛋白質に対して特異的である抗体あるいは免疫細胞を患者 に対して投与すること、請求項９記載の蛋白質を含む免疫原性組成物を患者に投 与すること、あるいは請求項９記載の蛋白質を発現することを目的としたベクタ ーを患者に投与することを含む、変異型RIIを発現する細胞を伴う、患者処置の ための治療方法。 12．機能性RIIをコードする発現ベクターを細胞に導入することを含む、変異 型RIIを発現する細胞を伴う、腫瘍を処置するための遺伝子療法。 13．患者が結腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌およびその他の悪性腫 瘍からなる群から選択される腫瘍を有する、請求項１−７あるいは11−12のいず れか１項記載の方法。