【発明の詳細な説明】
前立腺疾病の検出方法および治療方法
発明の背景
本発明は、前立腺疾病の診断および治療に関する。
前立腺ガンは、北米人口の中で、最も頻繁に診断されるガンであって、ガン死
の第２番目に主要な原因である（ムーン，ティイ（Moon，T．）１９９２年、ジ
ャーナル・オブ・アメリカン・ゲリエトリクス・ソサイエティイ（J．Am．Geria
t．Soc．）第４０巻：６６２−６２７頁）。５０才代を超える３０％の人々が、
該個人の寿命を通して良性なままであろうという潜伏性を有する。前立腺ガン進
展の原因および決定因子は知られていない。前立腺ガンを治療するためには、位
置をつきとめた前立腺新生物を外科手術または放射線照射によって頻繁に治療す
る。転移性の前立腺ガンは、しばしば、例えばＧｎＲＨアナログまたは抗-アン
ドロゲン剤を用いたホルモン調節で治療される。このことによって、１５ヶ月の
平均無進展余命（progression-free survival time）、および約３０ケ月の術後
余命（overall survival time）が供せられる。ホルモン療法に無反応な患者に
おいての成功例に欠けるため、化学療法の使用には限界がある。
神経成長因子受容体は、交感神経細胞およびＣＮＳ神経細胞、ならびに末梢神
経シュバン細胞を含めた多くの細胞型の細胞表面上に存在する。ＮＧＦは、エベ
レスによってＩ型および２型ＮＧＦ受容体と命名された２つのクラスの受容体（
エベレス（Eveleth）、１９８８年、イン・ビトロ・セルラー・デベロップメン
ト・バイオロジー（In Vitro Cell．Devel．Biol．）第２４巻：１１４８-１１
５３頁）を反映して、二相の平衡結合カイネティクスにて標的細胞と相互作用す
る（アングレス（Angres）ら、１９７７年、プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ（Proc．Natl．
Acad．Sci．ＵＳＡ）第７巻：２７８５-２７８９頁）。Ｉ型受容体が、ＮＧＦに
対して高アフィニティー（Ｋd＝１０-11）を示す一方、II型受容体はＮＧＦに対
して低いアフィニ
ティー（Ｋd＝１０-9）を示す（セクター（Schecter）ら、１９８１年、セル（C
ell）第２４巻：６８７-６９５頁；エベレス、前掲）。標識化ＮＧＦを原形質膜
に架橋させた実験においては、Ｉ型受容体が１４０ｋＤタンパク質と関連付けら
れている（マサーグ（Massague）ら、１９８１年、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem．）第２５６巻：９４１９-９４２４頁；
コウカラコス（Kouchalakos）ら、１９８６年、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J．Biol．Chem．）第２６１巻：１６０５４−１６０５９
頁）一方、II型受容体は７５ｋＤタンパク質と同定されている（グリーン（Gree
n）ら、１９８６年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Bi
ol．Chem．）第２６１巻：１５３１６-１５３２６頁）。約８５-９０％のＮＧＦ
結合部位が、低アフィニティーｐ７５受容体に典型的な特徴を示す（セクター（
Schecter）ら、前掲）。
最近、該高-アフィニティーＮＧＦ受容体は、ｔｒｋと同定され（カプラン（K
aplan）ら、１９９１年ａ、サイエンス（Science）第２５２巻：５５４-５５８
頁；カプラン（Kaplan）ら、１９９１年ｂ、ネイチャー（Nature）第３５０巻：
１５８-１６０頁；クライン（Klein）ら、１９９１年、セル（Cell）第６５巻：
１８９-１９７頁；ロス（Ross）、１９９１年、セル・レギュレーション（Cell
Regulation）第２巻：６８５-６９０頁）、該ｔｒｋはチロシンキナーゼ活性を
媒介するプロト-オンコジーンである。該ｔｒｋプロト-オンコジーンは、元来、
結腸カルシノーマ生検から単離された形質転換（すなわち、ガン誘起性の）遺伝
子として発見され、それ以来よく特徴付けられている（クーリエ（Coulier）ら
、１９８９年、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol．Cell．B
iol．）第９巻：１５-２３頁；マーチンーゼンカ（Martin-Zenca）ら、１９８９
年、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol．Cell．Biol．）第
９巻：２４-３３頁）。この発見は、チロシンキナーゼ遺伝子ファミリーの多く
のメンバーがヒトのガンに関係しているというより一般的な知見と一貫している
（クーリエ（Coulier）ら、前掲）。
発明の概要
本発明は、ヒト患者の生物試料に存在する神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）量
を
測定することを含み、ＮＧＦＲレベルが予め決定したレベル以下の場合には前ガ
ン性またはガン性状態が存在することが示される、ヒトの患者における前ガン性
またはガン性状態を診断する方法をその要旨とする。
本明細書中で用いる「神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）」とは、異なったタン
パク質のｔｒｋと同定されている、高アフィニティータンパク質受容体から区別
される、低アフィニティーｐ７５タンパク質受容体、すなわち、II型ＮＧＦ受容
体、およびその断片をいう。低アフィニティーｐ７５タンパク質受容体（以後、
ＮＧＦＲという）は、一般的に、カオ（Chao）ら（（１９８６年、サイエンス（
Science）第２３２巻：５１８-５２１頁））のクローン化核酸配列または予測さ
れたアミノ酸配列に対するその相同性によって同定できる。本発明のＮＧＦＲは
、ＮＧＦの完全なタンパク質に対して１-１０ｎＭのＫd値でＮＧＦに結合する生
物活性を有し、ＮＧＦＲの組換え細胞外ドメイン（ＲＥＤ）に対しては４２ｎＭ
もと高い生物活性を有する（ビサバジャーラ（Vissavajjhala）ら、１９９０年
、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem．）第２
６５巻：４７４６-４７５２頁）。
「予め決定したレベルのＮＧＦＲ」とは、ＮＧＦＲアッセイを繰り返すことに
より標準化したＮＧＦＲレベル、あるいは、正常（すなわち、いずれのガン性ま
たは前ガン性状態でもない）であることが知られる生物試料にて同時実験した対
照より確立されたＮＧＦＲレベルを意味する。
好ましい具体例において、該前ガン性またはガン性状態は、ヒト身体のいずれ
の生物組織に存在してもよく、限定するものではないが、最も良い例としては前
立腺の疾病状態である。該生物試料は、生存する患者におけるものとすることが
でき、該患者からの組織試料として単離でき、あるいは、例えば、尿、精液もし
くは血漿のごとき体液とすることができる。
該生物試料が生存する患者中にある場合、すなわち、該診断方法を該患者に対
して直接行う場合には、標識化抗-ＮＧＦＲ抗体、例えば、人体に適応させたモ
ノクローナル抗体を該患者に投与し、前立腺に隣接した抗体の量を測定すること
を、該測定法は包含できる。該抗体量は、例えば、ポジトロン発光断層撮影法
（positron emission tomography（ＰＥＴ））またはコンピューター化単一フォ
トン発光断層撮影法（single photon emission computed tomography）（ＳＰＥ
ＣＴ））による撮影によって測定できる。該標識化抗体を作製するのに用いる標
識は、必ずしも必要ではないが、ラジオアイソトープとすることができる。
生物試料を患者から単離する場合において、ガン性または前ガン性状態を診断
する方法には、さらに、該試料と標識化抗-ＮＧＦＲ抗体とを反応させて、該試
料中に存在するＮＧＦＲ量として示される、試料中のＮＧＦＲに結合する抗体量
を測定することも包含される。該抗体量は、例えば免疫組織化学により、生物試
料を固定して切片とした場合に測定できる。別法として、該生物試料が溶液中に
ある場合には、好ましくは、該試料を摩砕または抽出した後に該抗体量を測定で
きる。可溶化組織中のＮＧＦＲは、イムノアッセイにより測定できる。
該生物試料が該患者から単離された場合には、ガン性または前ガン性状態を診
断する方法は、さらに、該試料に対する標識化核酸プローブを導入し、試料中の
ＮＧＦＲ量の指標として、試料中のＮＧＦＲをコードするＲＮＡに結合したプロ
ーブ量を測定することも包含できる。該試料は、必ずしも必要ではないが、組織
学的に固定することができる。結合したプローブ量は、イン・サイチュー（in s
itu）・ハイブリダイゼーションまたは溶液ハイブリダイゼーションにより測定
できる。
該生物試料が体液の場合には、ガン性または前ガン性状態を診断する方法は、
さらに、該体液と抗-ＮＧＦＲ抗体とを反応させ、体液中に存在するＮＧＦＲ量
の指標として、体液中のＮＧＦＲに結合した抗体量を測定することも包含するこ
とができる。
また、本発明は、実質的に純粋なＮＧＦＲ調製物を患者に投与することを包含
する、ヒト患者におけるガン性または前ガン性状態を治療する方法をもその要旨
とする。該ＮＧＦＲは、好ましくは、ヒトＮＧＦＲであるが、いずれの入手源か
らのＮＧＦＲであってもよい。該ＮＧＦＲは、天然発生のものでも、完全なＮＧ
ＦＲポリペプチドの組換え形態でもよく、あるいは、ＮＧＦＲの生物学的に活性
な断片、ＮＧＦＲの切断断片、すなわち、ＮＧＦＲｔ、またはＲＥＤと称するＮ
ＧＦＲの組換え細胞外ドメインとすることもできる。
「ＮＧＦＲの実質的に純粋な調製物」とは、それと一緒にＮＧＦＲが細胞内で
天然発生したタンパク質が実質的に存在しない調製物である。
「相同性」とは、２つのポリペプチド分子または２つの核酸分子の間の配列類
似性を意味する。例えば、２つのポリペプチド分子の各々の位置がロイシンによ
って占められているごとく、２つの比較する配列の位置の双方が同一の塩基また
はアミノ酸モノマーサブユニットに占められている場合には、該分子はその位置
で相同性であるとする。２つの配列の間の相同性は、２つの配列が共に有する適
合または相同する位置の数の関数である。例えば、２つの配列の１０個の位置の
うち６個の位置が適合または相同する場合には、２つの配列は６０％相同性であ
る。例えば、アミノ酸配列のLeu-gly-val-ala-gly-proとLeu-his-tyr-ala-gly-l
euとは、５０％相同性を有する。
本発明の出願人らは、良性の前立腺増殖組織および前立腺腺ガン組織における
ＮＧＦＲの発現が、正常な前立腺組織に比して減少しており、全体としてヒト前
立腺の４つの転移性ガン細胞系に欠如していることを発見した。従って、ヒト前
立腺の新生物進展を診断する迅速な手段が、本発明により可能となる。前立腺の
ガン性または前ガン性状態と診断された患者にＮＧＦＲを投与した場合に、該Ｎ
ＧＦＲは有効な治療剤となり得る。
本発明の他の特徴および利点は、以下の説明および請求の範囲から明らかとな
ろう。
図面の簡単な説明
図１は、細胞質（Ａ）中のベシクル（矢印）を示す正常な前立腺上皮組織およ
びＴＳＵ-ｐｒ１ヒト前立腺上皮腫瘍細胞系（Ｅ）の第１代培養物の位相差像で
ある。
図２は、ヒト前立腺腺ガン組織（ＰＡ）、正常な前立腺（ＮＰ）、腎臓組織（
ＲＴ）、ｐ７５ＮＧＦＲを過剰に発現するＡ８７５ヒト・メラノーマ細胞系（Ａ
８）、および精巣（Ｔ）のミクロソーム調製物中のｐ７５ＮＧＦＲのイムノブロ
ット分析を示す。
図３は、正常な前立腺（ＮＰ）組織に比して、腺ガン標本および良性前立腺増
殖（ＢＰ1−ＢＰ5）標本の免疫反応性が減少または欠如したたことを示している
、（Ａ）
５つの前立腺腺ガン（ＰＡ1−ＰＡ5）標本のミクロソーム調製物中のｐ７５ＮＧ
ＦＲのイムノブロット分析を示す。
図４は、転移性上皮細胞系におけるｐ７５ＮＧＦＲの発現が欠如したことを示
している、ヒト前立腺ストロマ（ＨＳ）、ヒト前立腺上皮腫瘍細胞系、ＴＳＵ-
ｐｒ１（ＴＳ）、ＤＵ-１４５（ＤＵ）、ＰＣ-３（ＰＣ）およびＬＮＣａＰ（Ｌ
Ｎ）のミクロソーム調製物中のｐ７５ＮＧＦＲのイムノブロット分析を示す。
発明の詳細な説明
ヒト前立腺においては、低アフィニティーのｐ７５神経成長因子受容体（ＮＧ
ＦＲ）が上皮に局在する一方、ＮＧＦ-様タンパク質はストロマに局在する。前
立腺ストロマ培養細胞由来のこのＮＧＦ-様タンパク質は、イン・ビトロ（in vi
tro）でのヒト腫瘍上皮細胞系の傍分泌を介した成長に関与していることが示さ
れている。本出願人らは、正常な前立腺組織、良性の前立腺増殖（ＢＰＨ）組織
、腺ガン組織、およびヒト前立腺の４つの転移性腫瘍細胞系におけるＮＧＦＲの
発現を検査した。それを行うにあたって、本出願人らは、正常な前立腺組織にお
けるｐ７５ＮＧＦＲの発現、良性および悪性の前立腺組織におけるＮＧＦＲ発現
の部分的欠如、および４つの転移性腫瘍細胞系におけるＮＧＦＲ発現の完全な欠
如を発見した。このことは、ｐ７５ＮＧＲＦ発現およびヒト前立腺の新生物の進
展の間の逆関係を示唆しており、このことは、以下の実験によって証明する。
次いで、本出願人らは、発見したＮＧＦＲ発現と新生物進展との間の逆関係を
利用して、ヒト患者におけるガン性または前ガン性状態を早期に検出する診断方
法を設計した。一旦該状態が検出されれば、該患者をＮＧＦＲ調製物で治療する
ことができる。前立腺組織における状態は、一般的には新生物による形質転換を
示すのに用いることができるＮＧＦＲレベルの減少がどの程度であるかの例とし
て提供される。本発明の発見、動機および方法を以下にさらに記載する。
方法
細胞系および組織試料：ＰＣ-３、ＤＵ-１４５およびＬＮＣａＰ前立腺上皮腫瘍
細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；米国メ
リーランド州、ロックビル（Rockville，ＭＤ））から得た。ＴＳＵｐｒ１細胞
系は、
ジョン・アイザックス博士（Dr．John Isaacs（ジョンズ・ホプキンス大学（Joh
ns Hopkins University、米国メリーランド州、ボルチモア（Boltimore，ＭＤ）
）））から提供して頂いた。ヒト・メラノーマ細胞系（Ａ８７５）は、モーゼス
、カオ博士（Dr．Moses Chao）（コーネル大学、米国ニューヨーク州、ニュー・
ヨーク（New York，ＮＹ））の研究室から提供して頂いた。ＰＣ-３、ＤＵ-１４
５およびＴＳＵ-ｐｒ１細胞系は、抗生物質/抗真菌剤（１００ユニット/ｍｌの
ペニシリン、１００μｇ/ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ/ｍｌのファ
ンジゾン）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１０-7Ｍのテストステロン
（Ｔ）を補給したＲＰＭＩ １６４０培地中で保存した。ＬＮＣａＰ細胞系は、
ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）/１０％のＦＢＳ中で保存し、Ａ８７
５細胞系は、１０％のＦＢＳを補給したＲＰＭＩ １６４０培地中で保存した。
ＢＰＨ組織は、ジョージタウン大学・メディカル・センター（Georgetown Unive
rsity Medical Center）で、前立腺の経尿道的切除；放射線を射てた恥骨後前立
腺切除標本からの前立腺ガンおよび正常な前立腺組織；放射線を射てた腎臓摘出
標本からの腎臓組織および睾丸摘出標本からの睾丸から得た。ヒト前立腺ストロ
ーマ細胞および上皮細胞は、（ダキュウ（Djakiew）ら、１９９１年、キャンサ
ー・リサーチ（Canc．Res．）第５１巻：３３０４-３３１０頁に）以前に記載さ
れているように、コラゲナーゼ溶液中の組織試料の酵素消化によって単離した。
前立腺ストローマ細胞は、１０％のＦＢＳ/Ｔを含有するＲＰＭＩ １６４０培
地を入れた７５ｃｍ2組織培養用フラスコ（コスター社（Costar）、米国マサチ
ューセッツ州、ケンブリッジ（Cambridge，ＭＡ））中で培養した。正常な前立
腺上皮細胞は、ガラス・カバースリップ（glass coverslip）に平板し、２μｇ/
ｍｌのインスリン、１０ｎｇ/ｍｌの表皮成長因子、１μｇ/ｍｌのトランスフェ
リン、１０-7Ｍのデキサメタゾン、２ｍＭのグルタミン、２．５ｍｇ/ｍｌのウ
シ下垂体エキス（アップステート・バイオテクノロジー社（UpState Biotechnol
ogy Inc．）、米国ニューヨーク州、レイク・プラッシッド（Lake Placid，Ｎ．
Ｙ．））、１０ｎｇ/ｍｌのラット・プロラクチン（ＮＩＨ）および１０μｇ/ｍ
ｌのコレラ毒よりなる無血清培地（ＳＦＤＭ）を含有し、且つ、１０％のＦＢＳ
/Ｔおよびジヒドロテストステロン（１０-7）も全て
補給したＲＰＭＩ １６４０培地中で保存した。全培養細胞は、５％ＣＯ2/９５
％空気中、３７℃にてインキュベートし、該培地は２日毎に取り換えた。
特に記載しない限り、培地、培養組織、補給物、試薬および化学薬品はシグマ
・ケミカル社（Sigma Chemical Ｃo.）（米国ミズーリ州、セント・ルイス（St
．Louis，ＭＯ））から購入できる。
免疫細胞化学 細胞はガラス・カバースリップ中で約５０％密集まで増殖させた
。その細胞をリン酸緩衝液セーライン（ＰＢＳ）で２回洗浄し、無補給ＲＰＭＩ
１６４０培地中で３時間インキュベートした。次いで、該培地は、新たな無補給
ＲＰＭＩ １６４０培地で３時間毎に入れ換えた。ヒト前立腺ストロマ細胞用に
条件設定した培地は、（ダキュウ（Djakiew）ら、前掲に）以前に記載のごとく
調製し、２０μｇ/ｍｉ、５μｇ/ｍｌおよび１μｇ/ｍｌの濃度にて、第１代上
皮細胞および細胞系に２４時間のインキュベート期間添加した。続いて、該細胞
を氷冷メタノール中に２．５分間固定し、非特異的な結合を減じるための３％オ
バアルブミンで３７℃にて１時間ブロックし、ネズミ抗-ヒトｐ７５ＮＧＦＲモ
ノクローナル抗体（１：８０希釈；ベーリンガー・マンハイム社（Boehringer M
annheim）、米国インディアナ州、インディアナポリス（Indianapolis，ＩＮ）
）で３７℃にて３時間インキュベートした。そのカバースリップを（×６の）Ｐ
ＢＳで濯ぎ、２次抗体であるローダミン結合ヒツジ抗-ネズミＩｇＧ（１：４０
０希釈、カッペル社（Cappel）、米国ノースキャロライナ州、ダラム（Durham，
ＮＣ））中で１時間インキュベートした。ジェマーソン（Jemmerson）およびマ
ーゴリアッシュ（Margoliash）の方法（ジェマーソン（Jemmerson）ら、１９８
１年、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth．Enzymol．）第７４巻：２４
４-２７２頁）により全マウス血清（カッペル社（Capple））から部分精製した
ネズミＩgＧを、非特異的な対照として用いた。培養細胞の免疫細胞化学的染色
は、エピ蛍光付属部品で適応したゼイス（Zeiss）光学顕微鏡で視覚化した。
イムノブロット分析 細胞系および組織標本のミクロソームおよびサイトソル画
分は、カルティイの修飾分画方法（カルティイ（Culty）、１９８４年、セシス
（Thesis．）「副腎髄質のホスホイノシトール代謝およびステロイド生成」仏国
、
グレノーブル（Grenoble，France）：ユニバーシテ・シャーティフィク・エ・メ
ディカル・ド・グレノーブル（Universite Scientifique et Medical deGrenobl
e））によって摩砕および超音波破壊した後に得た。サイトソル画分は、氷冷精
製水に対して透析し凍結乾燥した。亜細胞性画分は、１０ｍＭのエチレンビス（
オキシエチレンニトリロ）テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）および１０μＭのフッ化フェ
ニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を補給した５０ｍＭのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）中に再懸濁した。非還元試料緩衝液を５０μｇの各ミクロソームおよび
サイトソルのタンパク質試料に添加した。続いて、該試料をドデシル硫酸ナトリ
ウム-ポリアクリルアミドゲル（１０％）電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）により分
離した。各試料からのタンパク質は、ニトロセルロース膜上にエレクトロトラン
スファーさせ、ＴＢＳ（２０ｍＭのトリス-ＨＣｌ）５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．５）中の５％脱脂粉乳中で１時間ブロックした。その膜を、ツイーン（Tw
een）２０（ＴＴＢＳ）および１％のゼラチン（バイオーラド社（Bio-Rad）、米
国カリフォルニア州、リッチモンド（Richmond，ＣＡ））を補給したＴＢＳ中の
ネズミ抗-ヒトｐ７５ＮＧＦＲモノクローナル抗体（１：８０希釈）と室温にて
一晩インキュベートした。その膜を、ＴＴＢＳで１０分間２回濯ぎ、１％のゼラ
チンを含有するＴＴＢＳ中の西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗-マウス
ＩgＧ（１：２０００）と１時間反応させ、ＴＴＢＳで２回、ＴＢＳで１回濯い
だ。免疫反応性は、４-クロロ-１-ナフトール過酸化水素反応基質を用いて視覚
化した。
結果
免疫蛍光 正常な前立腺上皮細胞およびＴＳＵ−ｐｒ１細胞系におけるｐ７５Ｎ
ＧＦＲの免疫細胞化学的局在を図１に示す。該ｐ７５ＮＧＦＲは、正常な上皮細
胞の細胞質ベシクル中に見い出された（図１Ｂ）。２０μｇ/ｍｌのヒト前立腺
ストローマ（ｈＰＳ）タンパク質で処理した正常な前立腺上皮細胞においては、
未処理細胞よりも分散したＮＧＦＲ免疫染色ベシクル数が多いようであった（図
１Ｂ）。１次抗体をネズミＩgＧで置き換えると、ｐ７５ＮＧＦＲ蛍光が消失し
た（図１Ｄ）。２０μｇ/ｍｌのｈＰＳで処理した（図１Ｆ）か、またはｈＰＳ
なしで処理した（図示せず）前立腺上皮腫瘍細胞系ＴＳＵ−ｐｒ１（図１Ｅ）は
、ｐ７５ＮＧＦＲで染色
しても免疫蛍光を示さなかった。ＤＵ-１４５、ＰＣ-３およびＬＮＣａＰ細胞系
も、ｐ７５ＮＧＦＲ免疫染色を示さなかった。ｐ７５ＮＧＦＲを過剰に発現する
Ａ８７５ヒト・メラノーマ細胞系を陽性対照として用いた。
イムノブロット分析 図２は、正常な前立腺および腺ガン組織標本のミクロソー
ム画分のｐ７５ＮＧＦＲ抗体でのイムノブロットの結果を示す。正常な前立腺組
織においては、７５ｋＤ免疫反応性のタンパク質が明らかに存在している。前立
腺腺ガン組織は、ＮＧＲＦタンパク質の発現を減少させることを示した。腎臓組
織を陰性対照として用いる一方、精巣組織およびＡ８７５メラノーマ細胞系を陽
性対照として用いた。前立腺腺ガンにおけるＮＧＦＲ発現の減少をさらに検査す
るため、５つの別々の前立腺腺ガン標本を検査した（図３Ａ）。等量のタンパク
質（５０μｇ/レーン）基準で試料を泳動させた場合、正常な前立腺組織に比し
て全ての腺ガン標本中のｐ７５ＮＧＦＦＲの発現が減少または欠如していた（図
３Ａ）。同様にして、等量のタンパク質（５０μｇ/レーン）基準で試料を泳動
させた場合にも、正常な前立腺組織に比して全てのＢＰＨ組織標本中のｐ７５Ｎ
ＧＦＲの発現が減少していた（図３Ｂ）。前立腺腫瘍細胞系であるＴＳＵ-ｐｒ
１、ＤＵ-１４５、ＰＣ-３およびＬＮＣａＰからのミクロソーム調製物は、ｐ７
５ＮＧＦＲ免疫反応性を完全に欠如していた（図４）。検査したいずれの前立腺
組織標本または細胞系のサイトソル画分においても、ｐ７５ＮＧＦＲに対しての
免疫反応性は認められなかった。
ＮＧＦＲ発現の減少はヒト組織における新生物の形質転換を示す
悪性への進展が低アフィニティーＮＧＦＲの欠如と関連するという発見は、Ｎ
ＧＦＲが腫瘍サプレッサーとして特定の場合において機能することを本出願人ら
に示唆している。正常な生理状態下では、低アフィニティーＮＧＦＲと同じく高
アフィニティーｔｒｋの双方にＮＧＦは結合できる。典型的には、該低アフィニ
テイーＮＧＦＲは、大過剰に細胞上に存在する（バレ（Vale）ら、１９８５年、
メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth．in Enzymology）第１０９巻：２１-
３９頁）。しかしながら、該低アフィニティーＮＧＦＲが減少した場合、ＮＧＦ
とｔｒｋとの相互作用が増加し、次に、影響する細胞におけるチロシンキナーゼ
活性が活性化されるであろう。チロシンキナーゼ活性化の上昇は、細胞性形質転
換と関連する（ウルリッチ（Ullrich）ら、１９９０年、セル（Cell）第６１巻
：２０３-２１２頁）。実際に、ｔｒｋプロトーオンコジーンでトランスフェク
トしたＮＩＨ ３Ｔ３細胞においては、ＮＧＦがこれら受容細胞の形質転換を誘
導した（コードン-カルド（Cordon-Cardo）ら、１９９１年、セル（Cell）、第
６６巻：１７３-１８３頁）。ｔｒｋプロトーオンコジーンの形質転換活性は、
大部分のオンコジーンと同等であって、ヒトの腫瘍から単離したｔｒｋオンコジ
ーンのものより５〜１０倍低いことが見い出された。かくして、前立腺細胞上の
低アフィニティーＮＧＦＲの欠如は、例えば、ＮＧＦによるｔｒｋ活性化の可能
性を非常に増加させ、その結果これらの細胞を形質転換させることができる。
この状態は、低-および高-アフィニティーＮＧＦ受容体のバランスが低-アフ
ィニティーＮＧＦＲの減少により乱されるいずれの組織においても起こり得る。
ガン性または前ガン性状態を診断する方法
本発明の全ての診断方法は、組織中のＮＧＦＲ量を検出し定量するために設計
されている。本発明の診断方法は、生存している患者、該患者から切除した組織
、または体液に用いることができる。組織または患者で測定したＮＧＦＲ量は、
正常な組織に存在するＮＧＦＲ量と比較する。正常な組織に存在するＮＧＦＲ量
は、実験組織を並べて測定でき、あるいは、可能ならば、ＮＧＦＲの標準レベル
を確立し、そこにおいて、通常はＮＧＦＲレベルが予期される範囲内となる反復
測定値によって該ＮＧＦＲの標準レベルは示される。
本発明の診断方法は、以下のように行う：
実施例１
患者におけるＮＧＦＲの減少を測定するために、抗-ＮＧＦＲ抗体、好ましく
は人体に適応させたモノクローナル抗体を適当な造影用ラジオアイソトープで標
識して該患者に投与する。次いで、検査すべき組織領域、例えば、前立腺領域で
放射線の取り込み量を測定する。造影はポシトロン発光断層撮影法（ＰＥＴ）、
コンピュータ化単一フォトン発光断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または、放射線-
標識抗体が正確に測定できる他の造影技術により行う。
本発明の診断方法に有用な抗-ＮＧＦＲ抗体としては、ＮＧＦＲ、または、例
えば、ＮＧＦＲｔのごとき、ＮＧＦＲの断片に特異的に結合するいずれのポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体も包含できる。かかる抗体の一例は、ベ
ーリンガー・マンハイム社（Boehringer Mannheim（米国インディアナ州、イン
ディアナポリス（Indianapolis，ＩＮ）））から購入できるモノクローナル抗体
８２１１（エベレス，ディイ・ディイ（Eveleth，Ｄ．Ｄ．）１９８８年、イン
・ビトロ・セル・デベロップ・バイオル（In Vitro Cell Ｄevelop．Ｂiol．）
第２４巻：１１４８頁；ハーリン，エム（Herlyn，Ｍ．）ら、１９８３年、キャ
ンサー・インベスティゲーション（Cancer Invest．）第１巻：２１５頁）であ
る。前ガン性およびガン性の前立腺細胞におけるＮＧＦＲの減少を測定するため
に、抗体８２１１を前記のごとく用いた。他の適当な抗体は、ロス（Ross）ら（
出典明示して本明細書の一部とみなす、米国特許第４，７８６，５９３号）、ジ
ョンソン（Johnson）（出典明示して本明細書の一部とみなす、米国特許第４，
８５５，２４１号）、およびディステファーノ（DiStefano）およびクラゲット-
ダム（Clagett-Dame）（出典明示して本明細書の一部とみなす、ＷＯ ９２/０９
６３１）により開示されているものを包含する。また、これらの参照は、他の適
当な抗体の産生に有用となり得る方法も開示している。
該抗体は、適当な検出因子、例えばラジオアイソトープで標識する。例えば、
該抗体は、ＳＰＥＣＴ造影法に有用なヨウ素-１２３またはテクネチウム９９ｍ
のいずれかで化学的に標識することができる。また、該抗体は、非放射性標識、
例えば、常磁性イオンで標識することもできる。いくつかの適当な放射性および
非-放射性標識は、該標識をタンパク質に結合させることができる多くの方法の
いくつかとして、ＷＯ ９１/０１１４４に開示されている。それを標識した後は
、当業者に公知の技術を用いて、ＰＥＴＮＳＰＥＣＴ、または核磁気共鳴（ＮＭ
Ｒ）造影法、あるいは該抗体上の特定の標識に最も適した他の造影方法により、
該抗体をヒト体内で検出できる。該標識抗体の取り込みの減少は、検査した組織
に前ガン性またはガン性状態が存在することを示している。
実施例２
患者からの組織試料における前立腺ＮＧＦＲの減少を測定するために、該組織
試料を適当に固定して切片とし、該組織切片を抗-ＮＧＦＲ抗体と反応させて、
ＮＧＦＲ量を免疫組織化学的に測定する。この試験については、ロス（Ross）ら
（出典明示して本明細書の一部とみなす、米国特許第４，７８６，５９３号）に
より記載されているごとく、該組織試料を該患者から切除し、固定し、染色し、
対比染色する。免疫組織化学用の組織を調製するいずれの方法も用いることがで
き、組織切片中のＮＧＦＲ抗原が持続的且つ視覚的に検出できる。かかる方法は
、当業者によく知られている。正常な組織に比しての染色強度の減少は、前ガン
性またはガン性細胞が存在することを示している。免疫染色は、前記に開示した
ＮＧＦＲ抗体を用いて行うことができる。
実施例３
患者からの組織試料中の前立腺ＮＧＦＲの減少を測定するさらなる方法におい
ては、該組織を溶液中に懸濁する。該組織試料を適当に摩砕して、当業者に公知
の多くの方法いずれかによってＮＧＦＲを抽出すれば、ＮＧＦＲ抗原の保存が可
能となる。ＮＧＦＲレベルは、イムノアッセイによって測定する。該抗原の定量
は、前記に開示したＮＧＦＲ抗体を用いて行う。イムノアッセイのある種のひな
型としては、（チッセン，Ｐ（Tijssen，Ｐ）、「酵素イムノアッセイの実践お
よび理論（Practice and Theory of Enzyme Immunoassays）」、エルセビアー（
Elsevier）１９８５年に）記載されているごとき、酵素イムノアッセイまたはラ
ジオイムノアッセイ（チャード，ティイ（Chard，Ｔ）、「ラジオイムノアッセ
イおよび関連技術入門（AnIntroduction to Radioimmunoassay and RelatedTech
niques）」、エルセビアー（Elsevier）、１９８２年）のいくつかの型のいずれ
かとすることができ、その最も有効なバージョンは当業者に公知である。正常な
前立腺組織に比しての組織中のＮＧＦＲ抗原濃度の減少は、前ガン性またはガン
性細胞が存在することを示している。
実施例４
患者からの組織試料におけるＮＧＦＲ発現の減少を測定するために、該組織試
料を適当に固定して切片とし、イン・サイチュー（in situ）ハイブリダイゼー
シ
ョンにより、標識核酸プローブと反応させてＮＧＦＲＣのｍＲＮＡ量を測定する
。この試験においては、スプリンガー（Springer）らにより記載されている（１
９９０年、セルラー・アンド・モレキュラー・ノイロバイオロジー（Cell．Mol
．Neurobiol．）第１０巻：３３-３９頁；１９９１年、ジャーナル・オブ・ヒス
トケミストリー・アンド・サイトケミストリー（J．Histochem．Cytochem．）第
３９巻：２３１-２３４頁）ごとく、該組織試料は冷凍し、切片とし、ＮＧＦＲ
核酸プローブと反応させる。これらの方法は、組織切片において、各々、オート
ラジオグラフまたは酵素細胞化学的なＮＧＦＲ ｍＲＮＡの検出を提供する。正
常な組織に比しての標識または染色強度の減少は、前ガン性またはガン性細胞が
存在することを示している。ＮＧＦＲのイン・サイチュー（in situ）ハイブリ
ダイゼーションによる細胞化学的検出は、ＮＧＦＲのｍＲＮＡに相補的であって
、且つ、プローブが検出ができるであろう方法により標識した、化学的または生
物学的に合成したいずれの核酸プローブを用いても行うことができる。最も有効
な核酸検出方法は標準的なもので、当業者に公知である。
実施例５
患者からの組織試料におけるＮＧＦＲ発現の減少を測定するためには、該組織
試料を適当に摩砕し、抽出して、例えば、ドット・ブロット、ノザン・ブロット
、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）または溶液ハイブリダイゼーション・アッセイ
のごとき適当なハイブリダイゼーション・アッセイによりＮＧＦＲのｍＲＮＡレ
ベルを測定することができる。この試験のためには、当業者に公知の方法により
、組織試料を適当に摩砕してＲＮＡを抽出する。適当な非放射性ハイブリダイゼ
ーション・アッセイが開示されている（ゲスドン，ジェイ・エル（Guesdon，Ｊ
．Ｌ．）、１９９２年、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（J．Imm
unol．Methods）第１５０巻：３３-４９頁；クリッカ，エル・ジェイ（Kricka，
Ｌ．Ｊ．）編、「非アイソトープＤＮＡプローブ技術（Nonisotopic ＤＮＡ Pro
be Techniques）」、アカデミック・プレス（Academic Press）１９９２年）。
別法として、当業者によく知られている、例えば、溶液ハイブリダイゼーション
（ブック（Buck）ら、１９８８年、デベロップメンタル・ブレイン・リサーチ（
Dev．Brain Ｒes．）第
４４巻：２５９-２６８頁）のごとき放射線方法を用いることもできる。前記方
法を用いて検出するための適当な長さおよび適当に標識した、ＮＧＦＲのｍＲＮ
Ａに実質的に相補的ないずれの核酸プローブも用いることができる。適当なプロ
ーブの一例としては、前掲のスプリンガー（Springer）ら、１９９０年、１９９
１年に提供されている。正常な組織に比してのハイブリダイゼーション強度の（
すなわち、ＮＧＦＲのｍＲＮＡにおける）減少は、前ガン性またはガン性細胞が
存在することを示している。
実施例６
患者からの体液試料におけるＮＧＦＲｔの減少を測定するためには、まず該試
料を患者から得る。好ましい体液として、尿、精液、血液、血漿、粘液、または
ヒトの患者から採取できる他の流体のいずれをも含む。ＮＧＦＲｔレベルは、イ
ムノアッセイまたはＮＧＦリガンド結合アッセイによって測定する。この試験の
ためには、該体液を、ＮＧＦＲｔの存在につき、ジョンソン（Johnson）（米国
特許第４，８５５，２４１号、前掲）またはディステファーノ（DiStefano）お
よびクラゲット-ダム（Clagett-Dame）（ＷＯ ９２/０９６３１、前掲）により
開示されているごとき、イムノアッセイまたは前記に参照した他の適当なイムノ
アッセイを用いてアッセイする。別法として、放射性-ヨウ素化ＮＧＦまたはビ
オチン化ＮＧＦでのリガンド結合アッセイを用い、続いて、当業者に公知の適当
な沈殿方法および検出方法を用いて、該体液試料を、ＮＧＦＲｔの存在につき検
出することもできる。体液の正常レベルに比しての体液におけるＮＧＦＲｔへの
リガンド結合の減少は、前ガン性またはガン性細胞が存在することを示す。
治療
前立腺組織におけるＮＧＦＲ発現の欠如は、明らかな新生物の進展へとつなが
る。ＮＧＦＲまたはＮＧＦＲｔの減少が示された患者のための適当な治療的処置
は、内因性ＮＧＦの結合部分としての前立腺ＮＧＦＲの欠如に置き換わる効果を
有する、ヒトＮＧＦＲｔの組換え形態を人工的に投与する。ＮＧＦＲの組換え外
因性ドメイン（ＲＥＤ）とも称されるこのポリペプチドも、クローン化され、発
現されている（ビサバジャーラ，ピイ（Vissavajjhala，Ｐ）ら、１９９０年、
ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Ｃhem．）第２６５巻：
４７４６-４７５２頁）。組換えヒト・タンパク質を発現させる他の方法はよく
知られている（例えば、出典明示して本明細書の一部とみなす、ゲードル，ディ
イ・ブイ（Goeddle，Ｄ．Ｖ．）編、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Metho
ds inEnzymology）、第１８５巻、アカデミック・プレス（Academic Press）、
１９９０年）。
実質的に純粋なＮＧＦＲタンパク質の調製
実質的に純粋なＮＧＦＲの精製方法は、ビサバジャーラ（Vissavajjhala）お
よびロス（Ross）（ビサバジャーラ（Vissavajjhala）ら、前掲）により記載さ
れている。加えて、クローン化遺伝子の利用性と共に、当業者に公知の標準的な
技術を用いて、実質的に純粋なＮＧＦＲポリペプチドを多量に製造することがで
きる（例えば、スコープス，アール（Scopes，Ｒ）、「タンパク質精製：原理と
実践（Protein Purification：Principles and Practice）」、１９８２年、ス
プリンガー、ベルラッグ（Springer Verlag）、ニュー・ヨーク（ＮＹ）参照）
。例えば、該ＮＧＦＲタンパク質またはその断片は、例えば、限定するものでは
ないが、沈殿法、クロマトグラフィー法、免疫吸着法またはアフィニティー技術
を含む方法のごとき、当該分野における学校で教育を受けた人に公知のタンパク
質単離の常法を用いて精製できる。該ポリペプチドは、クローン化ＮＧＦＲ遺伝
子、または、過剰産生細胞系へと遺伝子的に構築したＮＧＦＲのＤＮＡまたはｃ
ＤＮＡ組換え形態を用いて開始物質から精製できる。
投与方法
該ＮＧＦＲ調製物は、（例えば、賦形剤として安定化剤をも含有し得る生理食
塩水のごとき）医薬上許容できる緩衝液中に含ませてヒト患者に投与することが
できる。該治療剤であるＮＧＦＲ調製物は、治療すべき新生物が存在する位置お
よび状態に一致して投与する。例えば、該治療剤調製物は、全身的、経口的、非
経口的、皮内的または粘膜内的に投与することができる。生分解性で生体適合性
のポリマーを用いた持続放出性製剤、あるいは、ミセル、ゲルまたはリポソーム
を用いた部位特異的（on-site）デリバリー、あるいは形質転換様式で投与する
こ
とができる。好ましくは、例えば、静脈内、皮下、または筋肉内注射のごときに
より、該ＮＧＦＲ調製物を全身投与する。また、標的化ウイルスを適当な標的組
織に、外科的手術またはカテーテルあるいはビデオスコープを介して投与するこ
とも必要となり得る。
適当な治療用量とは、新生物を衰退させたり、その進展を遅らせる効果がある
ＮＧＦＲ量である。該投与量は、必ずしもそうとは限らないが、０．００１-１
００．０ｍｇ/ｋｇ体重の範囲、または当業者により適当であると臨床的に決定
された範囲とすることができる。
他の具体例
他の具体例も後記の請求の範囲の範囲内である。例えば、本発明の方法は、Ｎ
ＧＦＲタンパク質に実質的に相同性であるいずれかのタンパク質を投与または検
出することによって行うことができる。また、対立性の変形物；天然の突然変異
物；誘導した変異物；（例えば、２×ＳＳＣで４０℃にて、少なくとも４０ヌク
レオチドの長さのプローブを洗浄するごとき）高度または低度に厳密な条件下で
ハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質ないし天然に生じたＮ
ＧＦＲの核酸（高度または低度に厳密さ他の定義については、出典明示して本明
細書の一部とみなす、「分子生物学における最近のプロトコール（CurrentProto
cols in Molecular Biology）」ジョン・ワイリー・アンド・ソンズ（John Wily
＆ Sons）ニュー・ヨーク（New York）、１９８９年、６.３.１-６.３.６参照
）；およびＮＧＦＲタンパク質に対する抗血清、特にＮＧＦＲタンパク質の活性
部位もしくは結合ドメインに対する抗血清が特異的に結合するポリペプチドまた
はタンパク質も包含される。該範囲は、ＮＧＦＲタンパク質の生物学的に活性な
断片を含むキメラ・ポリペプチドも包含する。
また、本発明は、ＮＧＦＲタンパク質の生物学的に活性ないずれの断片または
アナログをも包含する。「生物学的に活性な」とは、ズパン（Zupan）ら（１９
８９年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem．
）第２６４巻：１１７１４-１１７２０頁）に記載されているＮＧＦＲ分子の特
性であるイン・ビボ（in vivo）またはイン・ビトロ（in vitro）の受容体結合
活性を有する
ことを意味する。ＮＧＦＲタンパク質受容体が一定範囲の生理的学的特性を示し
、かかる特性はＮＧＦＲ分子の異なった部分に起因することがあるため、有用な
ＮＧＦＲ断片またはＮＧＦＲアナログは、前記したごとき、いすれかのＮＧＦＲ
活性の生物アッセイにおいて生物活性を示すものである。これには、ＮＧＦへの
高いアフィニティー、すなわち１０μＭ未満のＫｄを有する天然発生または誘導
したタンパク質が含まれる。かかる天然発生のタンパク質の例は、α-マクログ
ロブリン（クー（Koo）ら、ジャーナル・オブ・ノイロサイエンス・リサーチ（Jour
nal of Neuroscience Research）第２巻：２４７-２６１頁）である。一方、誘
導したタンパク質の例は、ＮＧＦに対するモノクローナル抗体である。患者への
ＮＧＦＲ投与の効果を機能的に最小限にすることができるため、これらのタンパ
ク質ならびにその活性断片も本発明の範囲内である。
最も好ましいＮＧＦＲタンパク質断片またはアナログは、イン・ビボ（in viv
o）またはイン・ビトロ（in vitro）のＮＧＦＲ活性アッセイにおいて、１０％
、好ましくは４０％、または少なくとも９０％の活性を有するＮＧＦＲタンパク
質ファミリーの一員である。
好ましいアナログには、例えば、（例えば、バリンからグリシン、アルギニン
からリジン等のごとく）１つのアミノ酸が同様の特性を有する他のものに置換す
るごとき保存性のアミノ酸置換、または、該ポリペプチドの生物活性を欠如させ
ない１もしくはそれを超える非保存性のアミノ酸置換、欠損もしくは挿入におい
てのみ、野生型の配列とは異なる配列を有するＮＧＦＲ（またはその生物学的に
活性な断片）が包含される。
他の有用な修飾には、ペプチド安定性を向上させるものが包含される。かかる
アナログには、例えば、該ペプチド配列中に１またはそれを超える（ペプチド結
合に代わる）非ペプチド結合またはＤ-アミノ酸を有するものが包含される。
アミノ酸配列もしくは配列を含まない様式またはその双方において、該アナロ
グは、該ＮＧＦＲタンパク質ファミリーの天然発生の一員から異なり得る。少な
くとも７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、そして最も好まし
くは９５％または９９％さえも、２０個のアミノ酸残基、好ましくは４０個を超
えるアミノ酸残基、あるいは、さらに好ましくは、天然発生のＮＧＦＲポリペプ
チド配列の全配列と本発明のアナログとは相同性を一般的に示すであろう。
一次配列の改変には、天然および誘導された遺伝子変形物の双方が包含される
。また、例えば、Ｄ-アミノ酸のごとき、天然発生するＬ-アミノ酸以外の残基、
あるいは、例えば、βもしくはγアミノ酸のごとき、天然発生することがないア
ミノ酸または合成アミノ酸を含むアナログも包含される。また、安定性を向上さ
せるには、該ペプチド分子を環化させるか、または該ポリペプチドを、例えば、
キナーゼまたはホスファターゼのごときリン酸化修飾酵素に曝すことによって行
うことができる。他の有用な修飾物には、ポリペプチドのイン・ビボ（in vivo
）またはイン・ビトロ（in vitro）の（例えば、アセチル化、メチル化、リン酸
化、カルボキシル化またはグリコシル化のごとき）化学誘導体が包含させる。例
えば、合成およびプロセスの間、または、例えば、該ポリペプチドを（例えば、
哺乳動物のグリコシル化酵素のごとき）かかるプロセスを通常供する細胞由来の
グリコシル化に影響する酵素に該ポリペプチドを曝すことのごとき修飾工程で、
ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって該グリコシル化は
修飾でき；例えば、キナーゼまたはホスファターゼのごとき、リン酸化-修飾酵
素に該ポリペプチドを曝すことにより、リン酸化は修飾できる。
実質的に完全長のＮＧＦＲポリペプチドに加えて、本発明は、ＮＧＦＲポリペ
プチドの生物学的に活性な断片をも包含する。本明細書中で用いるごとき「断片
」なる語は、通常、長さにして、少なくとも約２０残基、さらに典型的には少な
くとも約４０残基、あるいは、好ましくは、少なくとも約６０残基であろうポリ
ペプチドに適用する。ＮＧＦＲポリペプチドの断片は、当業者に公知の方法で生
成させることができる。ＮＧＦＲタンパク質の生物活性を示す候補断片の能力は
、本明細書中に記載したごとく、当業者に公知の方法により検査できる。また、
該ペプチドの生物活性に必要でない残基を含有するＮＧＦＲポリペプチド、また
は、別のｍＲＮＡスプライシングもしくは別のタンパク質修飾工程から得られた
ものも包含される。
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フロントページの続き
(72)発明者 ジャキュー，ダニエル
アメリカ合衆国バージニア州22205、アー
リントン、ノース・シックスティーンス・
ストリート6518番
(72)発明者 ルイス，マイケル・イー
アメリカ合衆国ペンシルベニア州19382、
ウエスト・チェスター、サーベル・ロード
1007番