JP2003512391A

JP2003512391A - 核マトリクスタンパク質、それらをコードするポリヌクレオチド配列およびその用途

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Publication number: JP2003512391A
Application number: JP2001532201A
Authority: JP
Inventors: ロバートエイチ．ゲッツェンバーグ
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・ピッツバーグ
Priority date: 1999-10-15
Filing date: 2000-10-16
Publication date: 2003-04-02
Also published as: EP1702984A3; EP1228210A2; ATE405646T1; CA2387864A1; WO2001029218A2; EP1702984A2; AU1570301A; US6617432B1; WO2001029218A3; US20030170754A1; EP1228210B1; US20050181418A1; AU784404B2; DE60040010D1

Abstract

(57)【要約】組織、特に前立腺組織において定義された発現を特徴とする核マトリクスタンパク質（NMP）を提供する。これらのNMPは、細胞の悪性段階を診断およびモニターするため、ならびにNMPに関連した細胞増殖性障害を治療するために有用なマーカーである。実質的に精製されたポリペプチドおよび本発明のNMPをコードするヌクレオチド配列も同様に提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ピッツバーグ大学癌研究所およびピッツバーグ大学癌研究所に与え
られたNIH助成金CA65463号からの支援を受けて行われた。

【０００２】発明の背景本発明は、一般的に本明細書において「NMP」と呼ばれる核マトリクスタンパ
ク質、より詳しくは細胞増殖障害に関連する前立腺の新規核マトリクスタンパ.
ク質に関する。

【０００３】前立腺癌の早期診断は、疾患の有効な治療にとって重要である。さらに、転移
能を有する疾患と転移能を有しない前立腺癌とを区別することは重要である。核
の構造変化は癌細胞では非常に頻繁であるために、それらは多くのタイプの癌の
病的な形質転換マーカーとして一般的に用いられている。核の形状は、核のマト
リクス、核の動的な骨格によって部分的に左右される。

【０００４】核マトリックスは、核の形態を決定し、組織特異的である3次元的な様式でDNA
を組織化し、遺伝子発現の調節を含む数多くの核過程を調節する際に重要な役割
を果たす、核の構造成分である。核マトリックスはDNA複製および転写などの重
要な細胞過程を調節する際に重要な役割を果たすことが明らかにされている（ゲ
ッツェンベルグ（Getzenberg）、J. Cell Biochem. 55: 22〜31（1994））。核
マトリックスは核の骨組みまたは足場であり、外縁のラミナと孔の複合体、内部
のリボ核タンパク質の網目構造および残りの核小体からなる（ベレズニー（Bere
zney）ら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 60; 141017（1974））。核マトリッ
クスは約10%の核タンパク質からなり、実質的に脂質、DNAおよびヒストンを含ま
ない（フェイ（Fey）ら、Critical. Reviews. Eukaryotic Gene Expression 1;
127〜44（1991））。

【０００５】大多数の既知のNMPは全ての細胞型および生理的条件に共通である。数多くの
研究室が、ある種の細胞型または状態に独特である可能性のあるNMPを同定して
いる。マイトジェン刺激および分化の誘発は核マトリックスタンパク質の組成お
よび構造を変化させることが明らかにされている。核マトリックスは、形質転換
に関与することが明らかにされている数多くの結合タンパク質を含有する。ベレ
ズニー（Berezney）は、肝細胞癌の核マトリックスタンパク質を調査して、核マ
トリックスが形質転換の際に変化されることを最初に示した（ベレズニー（Bere
zney）ら、Cancer Res. 39; 3031〜39（1979））。フェイ（Fey）およびペンマ
ン（Penman）は、発癌プロモーターは、腎細胞の核マトリックス-中間フィラメ
ント足場に特異的な形態学的識別特性を有することを明らかにした（フェイ（Fe
y）ら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81; 859〜66（1984））。フェイ（Fey）お
よびペンマン（Penman）は、NMPのパターンが正常細胞株と腫瘍発生細胞株との
間で異なることを続いて明らかにした（フェイ（Fey）ら、Loc. cit. 85; 121〜
25（1989））。NM-200.4と呼ばれる、核マトリックスタンパク質に対する抗体は
乳癌細胞株T-47Dにより形成された（エウイドナー（Weidner）ら、Am. J. Path.
138; 1293〜98（1991））。この抗体はヒト乳癌試料並びに肺癌、甲状腺癌およ
び卵巣癌由来の試料に強力に反応するが、同様の起源の正常な上皮細胞には反応
しない。これにより、ある種の抗NMP抗体を診断手段として使用する可能性が高
まっている。

【０００６】米国特許第5,824,490号は、前立腺癌を同定するために用いられる「PC-1」と
呼ばれるものを含む、前立腺組織に関連した特定の核マトリクスタンパク質を開
示する。ヒト前立腺試料を調べたところ、（1）正常前立腺のみに存在するが、
前立腺癌および良性前立腺過形成（BPR）の双方では欠失している（正常パター
ン）、（2）前立腺癌細胞のみに認められ、正常前立腺およびBPHにおいて欠失し
ている（前立腺癌パターン）、ならびに（3）正常およびBPH試料の双方に存在す
るが、前立腺癌には存在しない核マトリクスタンパク質が同定された。同様に、
ゲッツェンバーグ（Getzenberg）ら、Cancer Res. 1991（51）：6514〜20を参照
のこと。

【０００７】前立腺組織に関連したさらなる核マトリクスタンパク質は、パーチン（Partin
）ら、Cancer Res. 1993（53）：744〜746に開示されている。

【０００８】発明の概要本発明は、癌様細胞を正常細胞と区別する、そして転移性癌細胞を非転移性疾
患の細胞と区別することができる新規核マトリクスタンパク質、それらをコード
するポリヌクレオチド配列、それらをコードする配列とハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド配列、それらに対する抗体、およびその使用方法に関する。特に、
これらのタンパク質は、前立腺の細胞増殖性障害を診断および治療を作製するた
めに有用である。

【０００９】好ましい態様の詳細な説明一つの局面に従って、本発明は、正常前立腺細胞には存在しないが癌様前立腺
細胞に存在する精製核マトリクスタンパク質（NMP）またはその断片を含む。好
ましくは、この態様のタンパク質は、「D-1」、「D-2」、および「D-3」と呼ば
れるタンパク質から選択される。タンパク質D-1、D-2、およびD-3は、転移性お
よび非転移性癌様前立腺細胞の双方に存在する。

【００１０】もう一つの局面に従って、本発明は、正常前立腺細胞に存在するが、癌様前立
腺細胞には存在しない精製NMPまたはその断片に向けられる。好ましくは、この
態様のタンパク質は、NDP-1、NDP-2、NDP-3、NDP-4、NDP-5、NDP-6、NDP-7、NDP
-8、NDP-9、およびNDP-10と呼ばれるタンパク質から選択される。

【００１１】もう一つの局面に従って、本発明は一般的に、転移細胞または非転移細胞に対
して独自の核マトリクスタンパク質の有無を決定する段階を含む、転移細胞（好
ましくは前立腺）を非転移細胞（好ましくは前立腺）と区別する方法に向けられ
る。特に、前立腺の転移性癌細胞と非転移性細胞とを区別することができる前立
腺の核マトリクスタンパク質を本明細書において開示する。

【００１２】もう一つの局面に従って、本発明は、転移性前立腺腫瘍に存在するが、非転移
性前立腺腫瘍および正常前立腺細胞には存在しない精製NMPまたはその断片に向
けられる。好ましくは、この態様のタンパク質は、AM-1およびAM-2と呼ばれるタ
ンパク質から選択される。

【００１３】もう一つの局面に従って、本発明は、転移性前立腺腫瘍に存在しないが非転移
性前立腺腫瘍に存在する、精製NMPまたはその断片に向けられる。好ましくは、
この態様のタンパク質は、G-1およびG-2と呼ばれるタンパク質から選択される。
これらの２つのタンパク質、G-1およびG-2も同様に、正常前立腺細胞に存在しな
い。

【００１４】好ましくは、上記の態様におけるNMPの断片は、免疫原性断片である。同様に
、上記の態様において、NMPはヒトに由来することが好ましい。

【００１５】特に明記していない限り、「一つの（a）」、「一つの（an）」または「その
（the）」という用語は、一つまたはそれ以上を意味する。

【００１６】「精製核マトリクスタンパク質」という用語は、少なくとも一つの細胞成分か
ら分離されている核マトリクスタンパク質を意味する。この用語は、組み換えに
よって産生された精製核マトリクスタンパク質と、天然資源からの抽出によって
産生された精製核マトリクスタンパク質の両者を意味する。

【００１７】本発明の別の態様は、上記のように同定された先の態様のNMPまたはNMP断片を
コードする精製ポリヌクレオチド配列である。別の態様は、上記のNMPまたはNMP
断片をコードするポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする精製ポリ
ヌクレオチド配列である。

【００１８】別の態様は、上記のNMPまたはNMP断片をコードするポリヌクレオチド配列で形
質転換された宿主細胞である。組換えDNAによる宿主細胞の形質転換は当技術分
野上周知の従来技法によって実施することができる。宿主が大腸菌（E. coli）
などの原核細胞である場合には、DNAを取り込むことができる適格細胞は、指数
的増殖期の後に採取し、その後当技術分野上周知の手順によりCaCl₂法によって
処理した細胞から調製することができる。または、MgCl₂もしくはRbClを使用し
てもよい。形質転換はまた、宿主細胞のプロトプラストを形成することにより、
またはエレクトロポレーションによって実施することができる。

【００１９】宿主が真核細胞である場合には、リン酸カルシウム共沈のようなDNAのトラン
スフェクション方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リ
ポソームに封入したプラスミドの挿入またはウイルスベクターなどの従来の機械
的手順を使用することができる。真核細胞はまた、本発明のNMPをコードするDNA
配列および単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能な表現型をコー
ドする第2の外来DNA分子で同時形質転換することもできる。別の方法は、真核細
胞を一時的に感染または形質転換して、タンパク質を発現するために、シミアン
ウイルス40（SV40）またはウシパピローマウイルスなどの真核細胞ウイルスベク
ターを使用することである（真核細胞ウイルスベクター（EUKARYOTIC VIRAL VEC
TORS）、グルツマン（Gluzman）（編）、コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1982）。

【００２０】形質転換した宿主が発現するNMPまたはNMP断片の単離および精製は、分取クロ
マトグラフィーおよびモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む免疫
学的分離法を含む従来の手段によって実施することができる。本発明中に提供す
る抗体はNMPまたはその断片に免疫反応性である。

【００２１】別の態様は、上記のポリヌクレオチド配列を有する組換え発現ベクターである
。好ましくは、ベクターはウイルスである。好ましいウイルスはRNAウイルスで
あり、好ましいRNAウイルスはレトロウイルスである。別の好ましいベクターは
リポソームであり、好ましくは、例えば抗体またはリガンドを用いて標的にする
ことができる標的特異的なリポソームである。別の好ましいベクターはプラスミ
ドである。

【００２２】もう一つの態様は、上記のNMPまたはNMP断片に結合する抗体である。抗体はポ
リクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。本発明者ら
によって単離されたNMPを用いて、ダニング（Dunning）モデルとヒト組織の双方
において癌様前立腺組織と正常前立腺組織とを区別することができる抗体を調製
する。本発明の一つまたはそれ以上の態様はこれらの抗体に向けられる。さらに
、本発明のもう一つの態様は、進行および／または転移能を有する前立腺癌を有
する人を検出することができる抗体に向けられる。

【００２３】別の態様は、被験者の細胞増殖性疾患を検出するための方法、または細胞増殖
性疾患、好ましくは前立腺癌が進行する危険性にさらされた個体を検出する方法
であって、被験者の細胞構成成分に、細胞増殖性疾患に関連する細胞構成成分に
結合する抗体または核酸プローブを接触させる段階を含む方法である。好ましく
は、細胞構成成分は被験者の前立腺から採取され、好ましくは、核酸である。好
ましくは、核酸は、上記のNMPまたはNMP断片をコードするDNAである。核酸とし
てはRNAが好ましい。別の好ましい細胞構成成分は上記のNMPまたはNMP断片であ
る。分化の方法は単一のNMPおよび/もしくはその対応するDNA、または上記NMPお
よび/もしくはそのDNAの1つ以上の組合わせで行ってもよい。

【００２４】好ましくは、核酸プローブは上記の細胞構成成分に特異的にハイブリダイゼー
ションする。薬剤が核酸プローブである場合、好ましくは、それは検出可能なよ
うに標識される。好ましい標識には放射性同位体、生物発光化合物、化学発光化
合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素が含まれる。

【００２５】または、細胞構成成分がNMPまたはNMP断片である場合には、NMPまたはNMP断片
に特異的に結合する抗体を使用する。上記のように、抗体はモノクローナルであ
ってもポリクローナルであってもよい。

【００２６】別の態様は、疾患を有する被験者に、上記NMPをコードする配列をブロックす
る治療的有効量のアンチセンスポリヌクレオチド配列を投与する段階を含む、D-
1、D-2、D-3、AM-1、AM-2、NDP-1、NDP-2、NDP-3、NDP-4、NDP-5、NDP-6、NDP-7
、NDP-8、NDP-9、NDP-10、G-1およびG-2からなる群より選択されるタンパク質に
関連する細胞増殖性疾患を治療する方法である。この態様では、治療は、細胞増
殖性疾患に生じている1種以上のNMPの発現をブロックするよう設計される。さら
に好ましくは、方法が細胞増殖疾患の転移を阻害する方法であって、および好ま
しくは疾患が前立腺癌である。

【００２７】代替の治療方法では、アンチセンスポリヌクレオチド配列を使用する代わりに
、上記NMPの1種をコードするポリヌクレオチド配列を使用する。この態様では、
治療は、細胞増殖性疾患を予防または改善する1種以上のNMPが被験者に手依拠う
されるよう設計される。

【００２８】別の治療方法では、上記NMPの1種以上の機能をブロックすることができる抗体
を被験者に投与する。

【００２９】別の態様は、宿主被験者の細胞に、上記NMPの1種以上をコードするポリヌクレ
オチド配列を含む発現ベクターを導入する段階を含む、遺伝子治療法である。好
ましくは、発現ベクターはエクスビボで宿主被験者の細胞に導入されて形質転換
細胞を形成し、次いで、形質転換された細胞を被験者に再導入する。この目的の
ための好ましい発現ベクターはRNAウイルスであり、好ましくはレトロウイルス
である。

【００３０】本発明の別の態様は、前立腺細胞NMPの機能をブロックまたは増強する組成物
を同定するための方法に関する。本発明の方法には下記の段階が含まれる：（a）前立腺細胞と試験組成物とを相互作用させることができる条件下において
、NMP含有前立腺細胞を試験化合物と共にインキュベーションする段階、および（b）試験組成物が前立腺細胞NMPの機能をブロックまたは増強するかどうかを測
定する段階。

【００３１】本発明の別の態様は、上記NMPの1種をコードするポリヌクレオチド配列に結合
する核酸プローブを含む、前立腺の細胞増殖性疾患を検出するためのキットであ
る。好ましくは、プローブは検出を容易にするために、上記のような標識で標識
される。または、本発明のキットは上記NMPの1種に特異的に結合する抗体を含む
。さらに別の代替法は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅によって、上
記NMPの1種をコードする標的ポリヌクレオチド配列の増殖を可能にするオリゴヌ
クレオチドプライマーを本発明のキット中に使用することである。

【００３２】本発明のNMPはその断片および保存的置換された変異体を含む。本発明のNMPの
アミノ酸の一次配列を僅かに変更することにより、本明細書に記載するNMPポリ
ペプチドと比較して実質的に同等の活性を有するタンパク質が得られる。このよ
うな改変は部位特異的変異誘発によるように意図的なものであっても、自然発生
性であってもよく、非必須アミノ酸の欠失を含むことができる。これらの改変に
よって作製されるポリペプチドは全て、天然型NMPの生物活性が維持される限り
、本明細書に含まれる。さらに、1つ以上のアミノ酸が欠失しても、生物活性を
有意に変更することなく、得られた分子の構造を改変することができる。これに
より、より広い範囲の用途を有すると思われる比較的小さな活性分子が開発され
る。

【００３３】本明細書において使用される「保存的置換」という用語は、構造的に類似する
アミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。保存的置換の例には、イソ
ロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの1つの疎水性残基と別の疎
水性残基との置換、またはアルギニンとリジンの置換、グルタミン酸とアスパラ
ギン酸の置換、もしくはグルタミンとアルパラギンの置換等などの1つの極性残
基と別の極性残基との置換が含まれる。

【００３４】本発明のペプチドは、例えば、メリフィールド（Merrifield）、J. Am. Chem.
Soc. 85; 2149（1962）によって、並びにスチュワート（Stewart）およびヤン
グ（Young）、SOLID PHASE PEPTIDES SYNTHESIS 27〜62（フリーマン出版（Free
man Publ.）、1969）によって記載される周知の固相ペプチド合成方法によって
合成することができる。

【００３５】本発明のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はNMPまたはNMPの免疫
原性断片に免疫反応性である。必要に応じて、ポリクローナル抗体は、例えば、
NMPポリペプチドを結合させたマトリックスに結合させて、溶出することによっ
て、または通常の核マトリックスタンパク質を使用して非特異的抗体を選択的に
除去することによって、さらに精製することができる。異なるエピトープ特異性
を有するプールモノクローナル抗体から本質的に成る抗体、および別個のモノク
ローナル抗体製剤が提供される。本発明に使用される「抗体」という用語は、全
長の分子、並びにNMPのエピトープ決定基に機能的に結合することができる、Fab
およびF（ab'）₂断片などのその断片を含む。

【００３６】 NMPとの結合性を示す抗体結合領域を同定し、単離するための好ましい方法はX
バクテリオファージベクター系である。このベクター系は、マウス抗体レパート
リー（フセ（Huse）ら、Science 246: 1275〜81（1989）を参照のこと）、およ
びヒト抗体レパートリーのFab断片の組み合わせライブラリを大腸菌（Escherich
ia coli）において発現するために使用されている（ヌリナックス（Nullinax）
ら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 8095〜99（1990））。

【００３７】本明細書で用いられる、「細胞増殖性疾患」という用語は、前立腺の悪性およ
び非悪性（すなわち、良性）疾患を意味する。この用語は前立腺の過形成疾患を
さらに含む。これらの増殖性疾患を有する細胞は、形態的および遺伝子型的に周
囲の正常組織と異なると思われることが多い。上記のように、細胞増殖性疾患は
、例えば、本発明のNMPの発現または発現の欠損に関連することがある。細胞周
期中の不適当な時期または適正でない細胞型におけるNMPの発現により細胞増殖
性疾患が生じることがある。アンチセンスポリヌクレオチドの形態のNMPコード
ポリヌクレオチドは、前立腺の過形成および悪性腫瘍を治療する際に有用である
。細胞増殖性疾患がNMP発現に関連する場合、アンチセンスNMPポリヌクレオチド
配列またはNMP結合抗体を前立腺細胞に導入して、NMPの発現および／または機能
をブロックすることができる。または、細胞増殖性疾患が発現不足または変異NM
Pポリペプチドの発現に関連する場合、欠損しているNMPまたは発現が低下してい
るNMPをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。

【００３８】本発明の目的のために、NMPに特異的な抗体または核酸プローブを使用して、N
MPを含有することが疑われる生体液または生物組織中のNMPポリペプチド（抗体
プローブの場合）またはポリヌクレオチド（核酸プローブの場合）の存在を検出
することができる。NMP配列中の任意のコード配列領域に基づいたオリゴヌクレ
オチドプライマーは、例えばPCRによってDNAまたはRNAを増幅するために有用で
ある。検出可能な量の抗原を含有する任意の試料を使用することができる。本発
明の好ましい試料は、前立腺から採取された組織である。または、前立腺細胞を
含有することがある生体液を使用することができる。

【００３９】「被験者」という用語は、本明細書では哺乳類を意味して用いられ、好ましく
はヒトである。

【００４０】より感受性を高くすることができる別の技法は、プローブを低分子量ハプテン
と結合することである。次いで、これらのハプテンを第2の反応によって特異的
に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的
な抗ハプテン抗体と反応することができるジニトロフェノール、ピリドキサール
およびフルオレセインのようなハプテンを使用することは普通のことである。

【００４１】上記のように、本発明の特定のNMPを発現する細胞またはNMPに関連する細胞増
殖性疾患を検出するための方法を、他の前立腺癌または他の悪性腫瘍または臨床
的に寛解状態にある被験者の良性過形成症状を検出するために使用することがで
きる。従って、細胞中のNMPポリペプチドを検出するための方法は、正常細胞中
で発現されるNMPと比較して、特異的NMPを発現する細胞を同定することによって
、細胞増殖性疾患を検出するために有用である。本発明の方法を使用することに
よって、NMP発現を細胞中で同定することができ、適当な治療過程を使用するこ
とができる（例えば、NMPコードまたはアンチセンス遺伝子療法、および従来の
化学療法）。本発明のNMPの発現パターンは細胞の悪性度の病期によって異なる
ので、NMP発現を検出し、細胞の悪性度の病期を診断するための一連のNMP特異的
薬剤（例えば、核酸プローブまたはNMPに対する抗体）を用いて前立腺組織試料
をスクリーニングすることができる。

【００４２】本発明のモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を液相に使用することが
できる、または固相担体に結合することができる免疫アッセイ法に使用するため
に好適である。また、これらの免疫アッセイ法のモノクローナル抗体は種々の方
法で検出可能なように標識することができる。本発明のモノクローナル抗体を使
用することができる免疫アッセイ法の種類の例は、直接的または間接的な形式の
競合および非競合免疫アッセイ法である。このような免疫アッセイ法の例は、ラ
ジオイムノアッセイ（RIA）法およびサンドイッチ（免疫測定）アッセイ法であ
る。本発明のモノクローナル抗体を使用した抗原の検出は、生理的試料の免疫組
織学的アッセイ法を含む、前進的、復帰的または併発的に実施される免疫アッセ
イ法を使用して実施することができる。または、本発明の抗体を使用して、ウェ
スタンブロットおよび二次元ゲルなどの電気泳動によって分散されたゲルプロト
コールに存在するNMPを検出することができる。

【００４３】本発明のモノクローナル抗体は多数の異なる担体に結合することができ、NMP
の存在を検出するために使用することができる。周知の担体の例には、ガラス、
ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミ
ラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁
鉄鉱が含まれる。本発明の目的のためには担体の性質は可溶性であっても、不溶
性であってもよい。

【００４４】アッセイ法を実施する際には、インキュベーション培地中にある種の「ブロッ
ク剤」を添加することが望ましいことがある（通常、標識した可溶性抗体と共に
添加する）。「ブロック剤」は、実験試料中に存在する抗NMP免疫グロブリンに
対する非特異的なタンパク質、プロテアーゼまたは抗異好性免疫グロブリンが固
相支持体の抗体または放射性標識した指標抗体を架橋したり、分解して、偽陽性
または偽陰性の結果を生じないことを確実にするために添加される。従って、「
ブロック剤」の選択が、本発明に記載されているアッセイ法の特異性に実質的に
加わることがある。

【００４５】本発明のアッセイ法に使用されるもの（例えば、IgGi、IgG2a、IgM等）と同じ
部類または小部類（イソタイプ）の数多くの関連のない（すなわち、非特異的）
抗体を「ブロック剤」として使用することができることが見出されている。試料
中に交差反応性タンパク質を突然変異により生ずることによって（通常1〜100μ
g/μl）、適切な感度を維持するが任意の望ましくない妨害を阻害するのに十分
高い濃度で「ブロック剤」は使用される。

【００４６】本明細書において、「抗原決定基」という用語は、本発明のモノクローナル抗
体と特異的な相互作用をすることができる任意の決定基を意味する。抗原決定基
は通常アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群を含み、通常特異
的な三次元構造特性および特異的な荷電特性を有する。

【００４７】抗原のインビボ検出のために本発明のモノクローナル抗体を使用する際には、
検出可能なように標識されたモノクローナル抗体が、診断的に有効な用量で投与
される。「診断的に有効な」という用語は、検出可能なように標識されたモノク
ローナル抗体の量が、モノクローナル抗体が特異性を示すNMP抗原を有する部位
の検出を可能にするのに十分な量で投与されることを意味する。

【００４８】インビボにおいて診断するための検出可能なように標識されたモノクローナル
抗体の用量は、年齢、性別および個人の疾患の程度のような要因によって変わる
。モノクローナル抗体の用量は約0.001 mg/m²〜約500 mg/m²、好ましくは0.1 mg
/m²〜約200 mg/m²、最も好ましくは約0.1 mg/m²〜約10 mg/m²と異なってもよい
。このような用量は、例えば、多数回注射するかどうか、腫瘍負荷および他の因
子によって変わってもよい。

【００４９】インビボにおける画像診断のためには、利用可能な検出機器の種類が所定の放
射性同位体を選択する際の主要な要因となる。選択した放射性同位体は所定の種
類の機器にとって検出可能である種類の崩壊を有しなければならない。インビボ
で診断するための放射性同位体を選択する際のさらに別の重要な要因は、放射性
同位体の半減期は、標的による取り込みが最大の時でも放射性同位体が検出可能
であるほど十分に長いが、宿主に対する有害な照射が最少となるほど短いことで
ある。理想的には、インビボにおける画像法に使用する放射性同位体は粒子放射
を生じないが、従来のγ線カメラによって容易に検出することができる140〜250
KeVの範囲の大多数のプロトンを形成する。

【００５０】インビボにおける診断のためには、中間の官能基を使用することによって直接
的または間接的に放射性同位体を免疫グロブリンに結合することができる。金属
イオンとして存在する放射性同位体を免疫グロブリンに結合するためにしばしば
使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン-五酢酸（DTPA）およびエチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA）並びに同様の分子などの二官能性キレート剤である。
本発明のモノクローナル抗体に結合することができる放射性同位体の一般的な例
は¹¹¹In、⁹⁷Ru、⁶⁷Ga、Ga、⁷²As、⁸⁹Zrおよび²⁰¹Tlである。

【００５１】本発明のモノクローナル抗体は、核磁気共鳴画像法（MRI）または電子スピン
共鳴（ESR）におけるように、インビボにおける診断目的のためには、本発明の
モノクローナル抗体を常磁性同位体で標識することもできる。一般に、画像診断
を可視化するための任意の従来方法を使用することができる。通常、γ線および
陽電子放出放射性同位体をMRIのカメラ画像法および常磁性同位体のために使用
する。このような技法に特に有用な元素は⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶¹Dy、⁵²Crおよび⁵⁶Fe
を含む。

【００５２】本発明のモノクローナル抗体を使用して、NMPに関連する細胞増殖性疾患の寛
解経過をモニターすることができる。従って、NMPを発現する細胞の数の増加も
しくは減少または射出精液もしくは尿などの種々の生体液中に存在するNMPの変
化を測定することによって、疾患の改善を目的とする特定の治療法が有効である
かどうかを決定することができると思われる。

【００５３】本発明のモノクローナル抗体はまた、抗原決定基反応性のNMPポリペプチドを
発現する細胞増殖性疾患を有する動物に、本発明のモノクローナル抗体を用いて
免疫療法するために、単独またはエフェクター細胞と併用して使用することもで
きる（ドウイラード（Douillard）ら、Hybridoma 5（Supp.1）: S139（1986）を
参照のこと）。

【００５４】免疫療法に使用する場合には、本発明のモノクローナル抗体は標識していなく
ても、治療薬に結合されてもよい。これらの薬物は本発明のモノクローナル抗体
と直接的または間接的に結合されてもよい。間接的な結合の一例はスペーサー部
分を使用することによる。これらのスペーサー部分は不溶性であっても、可溶性
であってもよい（ダイナー（Diener）ら、Science 231: 148（1986）を参照のこ
と）。また、標的部位においてモノクローナル抗体分子から薬物の放出を可能に
するようにこれらのスペーサー部分を選択することができる。免疫療法のために
、本発明のモノクローナル抗体と結合することができる治療薬の例は薬物、放射
性同位体、レクチンおよび毒素である。

【００５５】本発明のモノクローナル抗体と接合することができる薬物は、タンパク質性薬
物と同様に非タンパク質性薬物を含む。「非タンパク質性薬物」という用語は、
例えばマイトマイシンC、ダウノルビシン、ビンブラスチン、および癌治療用の
その他の古典的に薬物を意味する化合物を包含する。

【００５６】本発明のモノクローナル抗体を結合することができるタンパク質性の薬物は、
免疫調節剤および他の生物応答改良剤を含む。「生物応答改良剤」という用語は
、本発明のモノクローナル抗体が特異性を示すNMP関連腫瘍の崩壊を増強するよ
うな様式で、免疫応答を改良する際に関与する物質を含む。免疫応答改良剤の例
としてはリンフォカインのような化合物が含まれる。リンフォカインは腫瘍壊死
因子、インターロイキン、リンホトキシン、マクロファージ活性化因子、遊走阻
止因子、コロニー刺激因子およびインターフェロンを含む。本発明のモノクロー
ナル抗体を標識することができるインターフェロンにはα-インターフェロン、
β-インターフェロンおよびγ-インターフェロン並びにそれらのサブタイプが含
まれる。

【００５７】免疫療法のために、放射性同位体を接合させた本発明のモノクローナル抗体を
使用する際には、腫瘍細胞の分布並びに同位体の安定性および放射性のような要
因に応じて、ある種の同位体は他よりもより好ましいことがある。必要に応じて
、腫瘍細胞の分布を、上記のインビボにおける診断技法によって評価することが
できる。細胞増殖性疾患に応じて、一部の放射物が他よりも好ましいことがある
。一般に、αおよびβ粒子放射性の放射性同位体が免疫療法に好ましい。例えば
、動物が固形腫瘍病巣を有する場合には、数ミリメーターの組織を貫通すること
ができる、9％ほどの高エネルギーのβ放出物が好ましい。一方、白血病の場合
のように、細胞増殖性疾患が１つの標的細胞からなる場合には、Biなどの幅が狭
く、高エネルギーのα照射が好ましい。治療目的のために、本発明のモノクロー
ナル抗体に結合することができる放射性同位体の例はI、Y、Cu、Bi、At、Pb、Sc
、Pd、ZnおよびReの放射性同位体である。

【００５８】レクチンは通常植物材料から単離されるタンパク質であり、特異的な糖部分に
結合する。多数のレクチンが細胞を凝集させることができ、リンパ球を刺激する
ことができる。リシンは免疫治療的に使用されている毒性レクチンである。毒性
を示す、リシンのα-ペプチド鎖を本発明の抗体に結合して、毒性効果の部位特
異的搬送を可能にすることができる。

【００５９】毒素は、植物、動物または微生物が産生する毒作用のある物質で、十分な用量
では致死的であることも多い。ジフテリア毒素はコリネバクテリウム-ジフテリ
ア（Corynebacterium diphtheria）が産生する物質であり、治療に使用すること
ができる。この毒素は、適当な条件下において分離することができるαサブユニ
ットおよびβサブユニットを含む。毒性のA成分を抗体に結合して、NMP産生細胞
に部位特異的に搬送するために使用することができる。

【００６０】本発明のモノクローナル抗体はα-インターフェロンと併用して使用すること
ができる。この治療法は、癌腫細胞によるモノクローナル抗体反応性抗原の発現
を増強することによって、モノクローナル抗体の癌腫標的性を高める（グライナ
ー(Greiner）ら、Science 235: 895（1987））。または、本発明のモノクローナ
ル抗体を、例えばγ-インターフェロンと併用して使用し、それによってエフェ
クター細胞によるFc受容体の発現を活性化して増加し、モノクローナル抗体とエ
フェクター細胞との結合性を増強し、標的腫瘍細胞を死滅させる。

【００６１】リポソームをNMP発現腫瘍に特異的に搬送するために、リポソームの膜に本発
明のモノクローナル抗体を組み込んだリポソームを使用することも可能である。
これらのリポソームは、モノクローナル抗体以外に、腫瘍部位で放出されると思
われる、上記のもののような免疫治療薬を含有するように形成することができる
（ウォルフ（Wolf）ら、Biochem. Biophys. Acta 802:259（1984））。

【００６２】本発明のモノクローナル抗体を投与するための用量範囲は、悪性疾患の症状が
改善される望ましい効果を生ずるのに十分多いものである。用量は、望ましくな
い交差反応、アナフィラキシー反応等などの有害な副作用を生じるほど大きくす
べきでない。一般に、用量は、患者の年齢、症状、性別および疾患の程度で変わ
り、当業者によって決定される。用量は、任意の複雑な事象では各医師者によっ
て調整することができる。用量は、約0.1mg/kg〜約2000mg/kg、好ましくは約0.1
mg/kg〜約500mg/kgを毎日1回以上、1日または数日間と変化させてもよい。一般
に、本発明のモノクローナル抗体を治療薬と接合して投与する場合、インビボに
おける画像診断に使用するものと比較して、より低用量を使用することができる
。

【００６３】本発明のモノクローナル抗体は注射または点滴によって非経口的に投与するこ
とができる。本発明のモノクローナル抗体は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔
内または経皮的に、単独またはエフェクター細胞と併用して投与することができ
る。

【００６４】本発明はまた、NMPヌクレオチド配列を使用してNMP関連細胞増殖性疾患患者を
治療するための方法を提供する。サプレッサーポリペプチドをコードすることが
できるNMPヌクレオチド配列は正常細胞における発現と比較すると、発現が低下
していることがあるので、この配列に関する適当な治療または診断技法を設計す
ることが可能である。従って、細胞増殖性疾患が悪性腫瘍に関連するNMPの発現
に関連する場合には、翻訳レベルでのNMP発現を妨害する核酸配列を使用するこ
とができる。この方法は、例えば、アンチセンス核酸およびリボザイムを使用し
て、アンチセンス核酸でNMP mRNAをマスキングするか、またはそれをリボザイム
で切断することによって、特異的なNMP mRNAの翻訳をブロックする。細胞増殖性
疾患または異常な細胞表現型が、例えば、NMPサプレッサーの発現低下に関連す
る場合には、UMPをコードする核酸配列（センス）を、この疾患を有する被験者
に投与してもよい。

【００６５】アンチセンス核酸は、特異的なmRNA分子の少なくとも一部と相補的であるDNA
またはRNA分子である（ウェインタウブ（Weintaub）、Scientific American, 26
2: 40（1990））。細胞内では、アンチセンス核酸は対応するmRNAにハイブリダ
イゼーションして、2本鎖分子を形成する。細胞は2本鎖となっているmRNAを翻訳
しないので、アンチセンス核酸はmRNAの翻訳を妨害する。約15ヌクレオチドのア
ンチセンスオリゴマーが好ましい。その理由は、それらは容易に合成され、標的
のNMP産生細胞に導入されたとき、比較的大きな分子より発現される可能性が低
いからである。

【００６６】リボザイムは、DNA制限エンドヌクレアーゼと類似した様式で他の1本鎖RNAを
特異的に切断する能力を有するRNA分子である。これらのRNAをコードするヌクレ
オチド配列を変更することにより、RNA分子中の特異的なヌクレオチド配列を認
識し、それを切断する分子を作製することができる（チェチ（Cech）、J. Amer.
Med. Assn, 260: 3030（1988））。この方法の主要な利点は、それらは配列特
異的であるので、特定の配列を有するmRNAだけを不活性化することである。

【００６７】 2種の基本的な型のリボザイム、すなわちテトラヒメナ型（ハッセルホッフ（H
asselhoff）、Nature, 334: 585, 1988）および「槌」型が存在する。テトラヒ
メナ型リボザイムは鎖長4塩基の配列を認識するが、「槌」型リボザイムは鎖長1
1〜18塩基の塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、配列が標的mRNA種に主
に存在する可能性が大きい。従って、特異的mRNA種を不活性化するためには、槌
型リボザイムはテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、18塩基の認識配列はこ
れより短い認識配列より好ましい。

【００６８】本発明はまた、NMPが媒介する細胞増殖性疾患を治療するための遺伝子療法を
提供する。この療法は適当なNMPポリヌクレオチド配列（アンチセンスまたはコ
ード鎖）を増殖性疾患を有する被験者の細胞に導入することが必要である。アン
チセンスNMPポリヌクレオチドの搬送は、キメラウイルスまたはリポソームなど
の組換え発現ベクターを使用して実施することができる。NMPの発現低下に関連
する疾患または癌関連NMPの発現に関連する疾患は、それぞれ、コードヌクレオ
チド配列またはアンチセンスヌクレオチド配列を用いた遺伝子療法を使用して治
療することができる。

【００６９】本明細書に開示されている遺伝子療法に使用することができる種々のウイルス
ベクターにはアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、好ましくはレト
ロウィスルなどのRNAウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクタ
ーはマウスまたは鳥類（avian）レトロウイルスの誘導体である。1本鎖の外来遺
伝子を導入することができるレトロウイルスベクターの例には、モロニー（Molo
ney）マウス白血病ウイルス（MoNuLV）、ハービー（Harvey）マウス肉腫ウイル
ス（HaMuSV）、マウス乳腺癌ウイルス（MuMTV）およびラウス（Rous）肉腫ウイ
ルス（RSV）が含まれるが、これらに限定されない。数多くの別のレトロウイル
スベクターは同義遺伝子を組込むことができる。被形質導入細胞を同定して、形
成することができるように、これらのベクターは全て選択可能なマーカーの遺伝
子を導入または組み入れることができる。例えば、関心のあるNMP配列を特異的
な標的細胞の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と共にウイルスベクター
に導入することによって、ベクターを標的特異的にする。レトロウイルスベクタ
ーは、例えば糖、糖脂質またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入
することによって、標的特異的にすることができる。好ましい標的化は、レトロ
ウイルスベクターを標的にする抗体を使用して実施される。

【００７０】組換えレトロウイルスは1つ以上の遺伝子が欠損しているので、それらは感染
性のあるベクター粒子を作製するためには助けを必要とする。パッケージングシ
グナルを欠失しているヘルパー細胞株には、例えばW2、PA317およびPA12が含ま
れるがこれらに限定されない。ゲノムがパッケージングされていないので、これ
らの細胞株は中空ビリオンを産生する。パッケージシグナルに欠失がないが、構
造遺伝子が関心のある他の遺伝子と置換されているこのような細胞にレトロウイ
ルスベクターを導入すると、ベクターをパッケージングすることができ、ベクタ
ービリオンを作製することができる。

【００７１】または、NIH 3T3または他の組織培養細胞に、従来のリン酸カルシウムトラン
スフェクションによって、レトロウイルスの構造遺伝子gag、polおよびenvをコ
ードするプラスミドで直接トランスフェクションすることができる。次いで、こ
れらの細胞に関心のある遺伝子を有するベクタープラスミドをトランスフェクシ
ョンする。得られた細胞は培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。

【００７２】 NMPアンチセンスポリヌクレオチドの他の標的搬送系には巨大高分子複合体、
ナノカプセル、マイクロスフェアー、ビーズ並びに水中油型エマルジョン、ミセ
ル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質に基づいた系が含まれる。リポソー
ムは、人工的な膜小胞で、インビトロおよびインビボにおいて搬送基材として有
用である。サイズが0.2〜4.0pmの単ラメラ小胞（ULV）は、大きな巨大分子を含
有する実質的な割合の水性緩衝液を封入することができる。RNA、DNAおよび欠失
のないビリオンをその水性の内部に封入することができ、生物的に活性な形態で
細胞に搬送することができる（フラレイ（Fraley）ら、Trends Biochem. Sci. 6
: 77 （1981））。

【００７３】リポソームの組成は、通常、リン脂質、特に相転移温度が高いリン脂質の組み
合わせに、ステロイド、特にコレステロールを併用したものである。他のリン脂
質または他の脂質を使用してもよい。リポソームの物理特性はpH、イオン強度お
よび2価陽イオンの存在に依存する。

【００７４】リポソームを作製する際に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール
、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールア
ミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドなどのホスファチジ
ル化合物が含まれる。脂質部分が炭素原子数14〜18、好ましくは炭素原子数16〜
18で、飽和であるジアシルホスファチジルグリセロールが特に有用である。例示
的なリン脂質は卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン
およびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。

【００７５】リポソームの標的化は解剖学的および機械論的要因に基づいて分類されている
。解剖学的分類は選択性のレベル、例えば、器官特異的、細胞特異的および細胞
小器官特異的に基づいている。機械論的標的化は、それが受動的か、または能動
的かに基づいて識別することができる。受動的標的化は、洞様毛細血管を有する
器官の細網内皮系（RES）の細胞にリポソームが分配する自然の傾向を利用して
いる。一方、能動的標的化は、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質ま
たはタンパク質などの特異的なリガンドと結合することによって、または天然に
存在する局在化部位ではない標的化を器官および細胞種に実施するために、リポ
ソームの組成またはサイズを変化させることによって、リポソームを変更するこ
とを含む。

【００７６】標的搬送系の表面は種々の方法で変更することができる。低浸透圧標的搬送系
の場合には、標的リガンドをリポソームの2重膜に安定して結合させておくため
に、脂質基を脂質2重膜に導入してもよい。脂質鎖を標的リガンドに結合するた
めに種々の結合基を使用することができる。

【００７７】一般に、標的搬送系の表面に結合される化合物は、標的搬送系に望ましい細胞
を見つけさせ、「中に入れさせる」リガンドおよび受容体である。リガンドは、
受容体などの別の化合物に結合する、関心のある任意の化合物であってもよい。

【００７８】一般に、特異的なエフェクター分子に結合する表面膜タンパク質は受容体と呼
ばれる。本発明において、本発明の抗体は好ましい受容体である。本発明の優れ
たNMPの場合には、抗体を使用して、リポソームに特異的細胞表面リガンドを標
的にさせる。好ましくは、標的組織は前立腺組織である。数多くの手法を使用し
て、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をリポソーム2重膜に共有結
合することができる。抗体標的リポソームはモノクローナル抗体もしくはポリク
ローナル抗体または標的細胞の抗原決定基に効率的に結合する限り、Fabもしく
はF（ab'）₂などの断片を含んでもよい。

【００７９】非経口投与のための製剤は滅菌した水性または非水性溶液、懸濁液およびエマ
ルジョンを含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコ
ール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エ
ステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝培地を含む水、アルコール
性/水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口投与基材には塩化
ナトリウム溶液、リンガー（Ringer）のデキストロース、デキストロースおよび
塩化ナトリウム、流体と栄養強化剤、電解質強化剤（リンガー（Ringer）のデキ
ストロースに基づいたものなど）を含む乳酸塩化したリンガー（Ringer）の静脈
内注射用基材等が含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活
性ガスなどの保存剤および他の添加剤が存在してもよい。

【００８０】本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはモノクローナル抗体を含有し、NM
Pに関連する細胞増殖性疾患を治療するために使用される薬物または薬学的組成
物を調製するための方法に関する。

【００８１】本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、決して限定されるもので
はない。

【００８２】ラット核マトリクスタンパク質の単離とシークエンシングダニングR3327ラット前立腺腺癌細胞株のG、AT2.1、およびMLL亜株を用いた。
細胞を10％ウシ胎児血清、250 nMデキサメタゾン、ペニシリンGおよびストレプ
トマイシンいずれも100単位/mlを含むRPMI 1640中で培養した。細胞を下記のよ
うに回収して分画し、核マトリクスタンパク質を単離した。

【００８３】ダニングR3327 AT2.1ラット前立腺腫瘍を、雄性コペンハーゲンラットの皮下
に移植して、腫瘍重量が３〜４ gに達した際に採取した。正常なラット背側前立
腺を、チャールスリバー社（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から得た無
傷の成熟スプレージ・ドーリーラット（300〜350 g）から得た。腫瘍および組織
試料を分画して、下記のように核マトリクスタンパク質を単離した。

【００８４】正常および腫瘍前立腺組織試料は、ピッツバーグ大学メディカルセンターで前
立腺癌のために手術を受ける予定の患者から得た。明記した細胞タイプのほぼ純
粋な集団を含むと病理学者によって明らかに同定されうる試料のみを用いた。

【００８５】核マトリクスタンパク質は、フェイ（Fey）ら、J. Cell Biol. 98：1983〜198
4）およびゲッツェンバーグ（Getzenberg）ら、Cancer Res. 51：6514〜6520、1
991の教示に従って上記で選択した前立腺組織、細胞、および腫瘍から単離した
。組織片を小片に細切し（１mm.sup3）、テフロン（登録商標）製の乳棒によっ
て氷中で２ｍＭバナジルリボヌクレオシド（RNA分解酵素阻害剤）を含む溶液中
で0.5％トライトンX-100によってホモジナイズし、脂質と可溶性タンパク質とを
放出した。次に、抽出物を350ミクロンのナイロンメッシュを濾過して通過させ
、0.25 M硫酸アンモニウムによって抽出して、可溶性細胞骨格成分を放出した。
25℃でのDNA分解酵素処理を用いて可溶性染色質を除去した。次に、残りの分画
を８M尿素によって解離して、主に炭水化物と細胞外マトリクス成分で構成され
る不溶性成分を沈殿させた。尿素を透析して除去し、中間フィラメントを再集合
させて、遠心によって除去した。次に、核マトリクスタンパク質をエタノール沈
殿した。溶液は全て、新しく調製した、セリンプロテアーゼを阻害するための１
mMフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）、0.3 μMアプロトニン（apr
otonin）、１μMロイペプチン、および１μMペプスタチンを含んだ。

【００８６】この分画のタンパク質に対する抗体を調製して、核および単離された核マトリ
クス分画のみに存在することが証明された。タンパク質組成物を、0.1 N水酸化
ナトリウム中にタンパク質を再浮遊させ、クーマシープラスタンパク質アッセイ
試薬キット（ピアス社、ロックフォード、イリノイ州）を用いてウシ血清アルブ
ミン（BSA）を標準物質として用いることによって決定した。

【００８７】二次元ゲル電気泳動に関して、エタノール沈殿させたNMPを９M尿素、65 mM 3-
［(3-コーラミドプロピル）-ジメチルアンモニオ］-1-プロパンスルホネート（C
HAPS）、2.2％両性電解質および140 mMジチオスレイトールを含む試料緩衝液に
溶解した。NMPｓを含む最終沈殿物は、総細胞タンパク質の１％未満であった。

【００８８】核マトリクスタンパク質は、高分解能二次元ゲル電気泳動技法によって分離し
た。高分解能二次元ゲル電気泳動は、インベスチゲーター2-Dシステム（ゲノミ
ック・ソリューションズ社、ケルムスフォード、マサチューセッツ州）を用いて
行った。簡単に説明すると、一次元等電集束を、前集束の1.5時間後に１mm×18
cmチューブ状ゲルを用いて18,000 V-時間行った。チューブゲルを押し出して、
１mmドデシル硫酸ナトリウムデュラクリル（ゲノミック・ソリューションズ社、
ケルムスフォード、マサチューセッツ州）高引張力ポリアクリルアミドゲル電気
泳動スラブゲルの上部に載せて、ゲルを12℃の一定温度制御で約５時間電気泳動
した。ゲルを50％メタノールおよび10％酢酸で固定した。十分にすすいで、脱水
した後、ゲルを、50 mMリン酸塩によって緩衝化した後、５％グルタルアルデヒ
ドおよび５mMジチオスレイトールによって処理した（pH 7.2）。ゲルを銀染色に
よって染色するか（アキュレートケミカル社、ウェストバリー、ニューヨーク州
）、または以下のようにPVDF（イムノビロン社、ミリポアコーポレーション）に
転写した。

【００８９】核マトリクスタンパク質50 μgを各ゲルにローディングした。タンパク質の分
子量標準物質は、ディバーシファイドバイオテクノロジー社（ニュートンセンタ
ー、マサチューセッツ州）からの銀標準物質であった。等電点はガラロ・シュレ
シガー社（カールプレース、ニューヨーク州）およびシグマケミカル社（セント
ルイス、ミズーリ州）からのカルバミル化標準物質を用いて決定した。多数のゲ
ルを各試料について泳動し、多数の試料を異なる時間で泳動した。試料タイプの
全てのゲルにおいて明らかに再現よく認められたタンパク質スポットのみを、各
マトリクス成分を実際に表すとして計数した。ゲルをバイオイメージ電気泳動分
析システム（バイオイメージ社、アナーバー、ミシガン州）を用いて分析し、こ
れはゲル間のタンパク質スポットを合致させて、ゲルとタンパク質スポットとを
データベース化する。チャプス洗浄剤と両性電解質との独自の組み合わせを用い
て、これらのゲルを泳動した。組織を用いてこれらの核マトリクスタンパク質を
単離したため、得られたタンパク質は、細胞培養から得られた核マトリクスタン
パク質とは有意に異なる組織核マトリクスタンパク質である。

【００９０】独自の染色方法論を用いて、高分解能二次元ゲルを染色した。ZnCl陰性染色技
術を用いて、新規核マトリクスタンパク質をシークエンシングする必要なく同定
した。

【００９１】関係するタンパク質スポットを多くのゲルから切除して、回収し、SDS/PAGEシ
ステムを用いてアガロース中で単一のバンドに濃縮した。アガロース切片にエド
マン分解プロセスを行って、そのアミノ酸配列を得た。

【００９２】以下のラットタンパク質を同定した：

【００９３】

【表１】

【００９４】

【表２】

【００９５】上記の表１および２において、分子量およびpIは、既知の分子量およびpIの標
準物質との比較によって決定した。

【００９６】抗体の産生ポリクローナル抗体は、KLHに結合させたD-2ペプチド２配列（上記の表を参照
のこと）を用いてニュージーランドホワイトウサギにおいて作製した。さらに、
AM-1に対応するより高い分解能の二次元ゲルから単離したゲルスポットに対する
抗体を産生した。ペプチドまたはスポットはウサギの背部にフロイントのアジュ
バント（FCA）0.5 mlを含む150 μg/mlの濃度で投与した。５回の追加免疫を３
週間間隔で投与した。各追加免疫のペプチドまたはスポットの濃度は、0.5 ml F
CAを含む100 μg/mlであった。

【００９７】抗体の試験正常および腫瘍組織からの各マトリクスタンパク質をSDS/PAGEで分離した。一
次抗体（100倍希釈）として抗血清を、そしてHRP標識ヤギ抗ウサギ（20,000倍希
釈）抗体を二次抗体として用いてウェスタン分析を行った。抗原を注射する前の
ウサギからの血清を内部対照として用いた。

【００９８】抗体の結果ウェスタン分析を用いて、D-2抗体は、ヒト前立腺腫瘍試料においてタンパク
質を検出することができるが、合致させた正常試料ではタンパク質に反応しない
。抗体はまた、それが同定された全てのダニング腫瘍細胞株においてD-2タンパ
ク質を検出することができる。

【００９９】ダニング腫瘍または細胞株をAM-1抗体によって染色すると、反応性は、転移性
株に限って認められ、調べた非転移性株のいずれにおいても認められない。

【０１００】ヒトNMP相対物（counterpart）を得る上記のラットD-2およびAM-1抗体を用いて、ヒトNMP相対物をヒト前立腺組織試
料から部分精製し、特徴を調べた。ヒト前立腺組織試料には、ラットNMPを単離
する上記の技術と類似の技術を行った。得られたゲルは、分離されたヒトNMPを
表す様々なバンドを含んだ。ラットD-2およびAM-1抗体をバンドに適用して、そ
れが特定のバンドに結合するか否かを調べた。双方の場合において、２つの抗体
は、ヒトNMP相対物を表す２つの明確なバンドに結合した。これらのバンドを既
知の標準物質と比較すると、ヒトD-2 NMPがラットD-2 NMPとほぼ同じ分子量とpI
（約40 kDとpI約5.91）を有することが示された。同様に、ヒトAM-1 NMPはラッ
トD-2 NMPとほぼ同じ分子量とpIを有した（約40 kDとpI約6.73）。

【０１０１】さらに、ラットAM-1抗体を用いてヒト前立腺組織を染色し、ラットモデルにお
いて分離できるように、ヒトにおいても転移性腫瘍と非転移性腫瘍とを分離でき
るか否かを調べた。ラットAM-1 NMPに対するこの抗体によるイムノブロットおよ
び免疫組織化学試験は、ヒト前立腺腫瘍組織と反応し、この転移性疾患特異的NM
Pが同様にヒト前立腺癌組織にも存在する証拠を提供する。抗AM-1抗体は、いく
つかのヒト前立腺癌を染色するが、正常前立腺組織は染色しない。前立腺癌から
の根治的前立腺切除術を受けた患者13人からの組織から、NMPをスクリーニング
した。イムノブロット分析から、患者13人中３人（23％）が腫瘍に限って陽性染
色を有し、５人（38％）が正常組織中、微量認められる腫瘍において有意な量の
染色を有したことが示される。これらの患者における陽性染色は、転移能を有す
る疾患と相関する可能性があると仮説を立てることができる。

【０１０２】本発明は詳細に且つ本発明の具体的な態様を参照して説明されているが、本発
明の精神および請求の範囲から逸脱することなく、種々の変更および改良を加え
られることが当業者には明らかであると思われる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 31/7088 Ａ６１Ｋ 31/7088 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 35/04 35/04 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B064 AG27 CA10 DA05 DA14 4C084 AA13 MA01 NA14 ZB262 4C086 AA02 EA16 MA01 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA41 DA76 DA86 EA28 EA51 FA71 FA74 HA05 HA06 HA15 HA16 HA17

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】転移細胞には存在するが、非転移細胞に存在しない核マトリ
クスタンパク質の有無を決定する段階を含む、転移細胞の有無を決定する方法。
【請求項２】決定段階が前立腺細胞の試料について行われる、請求項１記
載の方法。
【請求項３】核マトリクスタンパク質が、転移性前立腺細胞に存在するが
非転移性前立腺細胞には存在しない、分子量約40 kDおよびpI約6.73を有するAM-
1である、請求項２記載の方法。
【請求項４】決定段階が、AM-1またはその免疫原性断片に対して作製され
た抗体について行われる、請求項３記載の方法。
【請求項５】以下のタンパク質からなる群より選択される、癌様前立腺細
胞に存在するが正常前立腺細胞に存在しない精製核マトリクスタンパク質：（a）分子量約63 kDおよびpI約8.55を有するタンパク質D-1、（b）分子量約40 kDおよびpI約5.91を有するタンパク質D-2、ならびに（c）分子量約33 kDおよびpI約6.97を有するタンパク質D-3；または該タンパク質（a）〜（c）の一つの免疫原性断片。
【請求項６】タンパク質が分子量約63 kDおよびpI約8.55を有するD-1であ
る、請求項５記載のタンパク質。
【請求項７】配列番号：１、配列番号：２、および配列番号：３からなる
群より選択される少なくとも一つの配列を含む、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】タンパク質が分子量約40 kDおよびpI約5.91を有するD-2であ
る、請求項５記載のタンパク質。
【請求項９】配列番号：４および配列番号：５からなる群より選択される
少なくとも一つの配列を含む、請求項８記載のタンパク質。
【請求項１０】タンパク質が分子量約33 kDおよびpI約6.97を有するD-3で
ある、請求項５記載の方法。
【請求項１１】配列番号：６を含む請求項10記載のタンパク質。
【請求項１２】以下の段階を含む、癌様前立腺細胞と正常前立腺細胞とを
区別する抗体を産生する方法：請求項５記載のタンパク質または断片を抗原として選択する段階、該抗原に対する抗体を作製する段階、および該抗体を回収する段階。
【請求項１３】抗体がモノクローナル抗体である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】以下のタンパク質からなる群より選択される、正常前立腺
細胞に存在するが癌様前立腺細胞には存在しない精製核マトリクスタンパク質：（a）分子量約95 kDおよびpI約6.74を有するタンパク質NDP-1、（b）分子量約57 kDおよびpI約8.33を有するタンパク質NDP-2、（c）分子量約57 kDおよびpI約8.0を有するタンパク質NDP-3、（d）分子量約47 kDおよびpI約5.26を有するタンパク質NDP-4、（e）分子量約47 kDおよびpI約5.80を有するタンパク質NDP-5、（f）分子量約41 kDおよびpI約6.83を有するタンパク質NDP-6、（g）分子量約37.2 kDおよびpI約7.05を有するタンパク質NDP-7、（h）分子量約36.9 kDおよびpI約7.35を有するタンパク質NDP-8、（i）分子量約35 kDおよびpI約6.25を有するタンパク質NDP-9、ならびに（j）分子量約32.5 kDおよびpI約5.46を有するタンパク質NDP-10、または該タンパク質（a）〜（j）の一つの免疫原性断片。
【請求項１５】分子量約95 kDおよびpI約6.74を有するNDP-1である、請求
項14記載のタンパク質。
【請求項１６】分子量約57 kDおよびpI約8.33を有するNDP-2である、請求
項14記載のタンパク質。
【請求項１７】分子量約57 kDおよびpI約8.0を有するNDP-3である、請求項1
4記載のタンパク質。
【請求項１８】分子量約47 kDおよびpI約5.26を有するNDP-4である、請求
項14記載のタンパク質。
【請求項１９】分子量約47 kDおよびpI約5.80を有するNDP-5である、請求
項14記載のタンパク質。
【請求項２０】分子量約41 kDおよびpI約6.83を有するNDP-6である、請求
項14記載のタンパク質。
【請求項２１】分子量約37.2 kDおよびpI約7.05を有するNDP-7である、請
求項14記載のタンパク質。
【請求項２２】分子量約36.9 kDおよびpI約7.35を有するNDP-8である、請
求項14記載のタンパク質。
【請求項２３】分子量約35 kDおよびpI約6.25を有するNDP-9である、請求
項14記載のタンパク質。
【請求項２４】分子量約32.5 kDおよびpI約5.46を有するNDP-10である、
請求項14記載のタンパク質。
【請求項２５】以下の段階を含む、癌様前立腺細胞と正常前立腺細胞とを
区別する抗体を産生する方法：請求項15記載のタンパク質または断片を抗原として選択する段階、該抗原に対する抗体を作製する段階、および該抗体を回収する段階。
【請求項２６】抗体がモノクローナル抗体である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】以下のタンパク質からなる群より選択される、転移性前立
腺細胞には存在するが非転移性前立腺細胞には存在しない、精製核マトリクスタ
ンパク質：（a）分子量約40 kDおよびpI約6.73を有するタンパク質AM-1、ならびに（b）分子量約36 kDおよびpI約8.33を有するタンパク質AM-2；または該タンパク質（a）もしくは（b）の一つの免疫原性断片。
【請求項２８】分子量約40 kDおよびpI約6.73を有するAM-1である、請求
項27記載のタンパク質。
【請求項２９】配列番号：７を含む、請求項28記載のタンパク質。
【請求項３０】分子量約36 kDおよびpI約8.33を有するAM-2である、請求
項27記載のタンパク質。
【請求項３１】配列番号：８を含む、請求項30記載のタンパク質。
【請求項３２】以下の段階を含む、転移性細胞と非転移性前立腺細胞とを
区別する抗体を産生する方法：請求項29記載のタンパク質または断片を抗原として選択する段階、該抗原に対する抗体を作製する段階、および該抗体を回収する段階。
【請求項３３】抗体がモノクローナル抗体である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】以下のタンパク質からなる群より選択される、転移性前立
腺細胞には存在しないが非転移性前立腺細胞には存在する、精製核マトリクスタ
ンパク質：（a）分子量約55 kDおよびpI約6.48を有するタンパク質G-1、ならびに（b）分子量約52 kDおよびpI約6.93を有するタンパク質G-2；または該タンパク質（a）もしくは（b）の一つの免疫原性断片。
【請求項３５】分子量約55 kDおよびpI約6.48を有するG-1である、請求項
34記載のタンパク質。
【請求項３６】分子量約52 kDおよびpI約6.93を有するG-2である、請求項
34記載のタンパク質。
【請求項３７】以下の段階を含む、転移性細胞と非転移性前立腺細胞とを
区別する抗体を産生する方法：請求項34記載のタンパク質または断片を抗原として選択する段階、該抗原に対する抗体を作製する段階、および該抗体を回収する段階。
【請求項３８】抗体がモノクローナル抗体である、請求項37記載の方法。
【請求項３９】タンパク質が以下からなる群より選択される、精製核マト
リクスタンパク質またはその免疫原性断片に対して作製された抗体：（i）以下からなる群より選択される、癌様前立腺細胞に存在するが正常前立腺
細胞に存在しないタンパク質：（a）分子量約63 kDおよびpI約8.55を有するD-1、（b）分子量約40 kDおよびpI約5.91を有するD-2、ならびに（c）分子量約33 kDおよびpI約6.97を有するD-3；（ii）以下のタンパク質からなる群より選択される、正常前立腺細胞に存在する
が癌様前立腺細胞には存在しないタンパク質：（a）分子量約95 kDおよびpI約6.74を有するタンパク質NDP-1、（b）分子量約57 kDおよびpI約8.33を有するタンパク質NDP-2、（c）分子量約57 kDおよびpI約8.0を有するタンパク質NDP-3、（d）分子量約47 kDおよびpI約5.26を有するタンパク質NDP-4、（e）分子量約47 kDおよびpI約5.80を有するタンパク質NDP-5、（f）分子量約41 kDおよびpI約6.83を有するタンパク質NDP-6、（g）分子量約37.2 kDおよびpI約7.05を有するタンパク質NDP-7、（h）分子量約36.9 kDおよびpI約7.35を有するタンパク質NDP-8、（i）分子量約35 kDおよびpI約6.25を有するタンパク質NDP-9、ならびに（j）分子量約32.5 kDおよびpI約5.46を有するタンパク質NDP-10、（iii）以下のタンパク質からなる群より選択される、転移性前立腺細胞には存
在するが非転移性前立腺細胞には存在しないタンパク質：（a）分子量約40 kDおよびpI約6.73を有するタンパク質AM-1、ならびに（b）分子量約36 kDおよびpI約8.33を有するタンパク質AM-2；（iv）以下のタンパク質からなる群より選択される、転移性前立腺細胞には存在
しないが非転移性前立腺細胞には存在するタンパク質：（a）分子量約55 kDおよびpI約6.48を有するタンパク質G-1、ならびに（b）分子量約52 kDおよびpI約6.93を有するタンパク質G-2。
【請求項４０】請求項５記載のタンパク質の有無を決定する段階を含む、
前立腺癌細胞の有無を決定する方法。
【請求項４１】決定段階が、請求項５記載のタンパク質または断片に対し
て作製された抗体について行われる、請求項40記載の方法。