ES2219699T3 - Anticuerpo monoclonal br110 y usos del mismo. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA LIGANDOS SUSCEPTIBLES DE INTERNALIZACION (ESTO ES, LIGANDOS BR110) QUE ESPECIFICAMENTE RECONOCEN Y SE UNEN AL ANTIGENO BR110. TRAS UNIRSE AL ANTIGENO, EL LIGANDO Y EL ANTIGENO FORMAN UN COMPLEJO. COMO COMPLEJO, EL ANTIGENO PUEDE DETECTARSE UTILIZANDO METODOS BIEN CONOCIDOS YA DESARROLLADOS Y SISTEMAS COMERCIALES.

Description

Anticuerpo monoclonal BR110 y usos del mismo.

Antecedentes de la invención

El cáncer incluye una amplia gama de enfermedades que afectan a una de cada cuatro personas en todo el mundo. Claramente, en términos del número de personas afectadas, el cáncer es un serio motivo de preocupación médica. Dada la gravedad del problema y su impacto sobre la sociedad, los agentes diagnósticos y terapéuticos eficaces dirigidos contra el cáncer se valoran por encima de su valor. Los anticuerpos frente a antígenos asociados a tumores humanos son logros tecnológicos recientes que prometen ser importantes agentes diagnósticos y terapéuticos contra ciertos cánceres.

Los anticuerpos frente a antígenos asociados a tumores humanos se conocen bien y están bien descritos. Uno de tales antígenos asociados a tumores se denomina antígeno GA733-2. El antígeno GA733-2 tiene un peso molecular de aproximadamente 34 kD-40kD y es un miembro de una familia de antígenos GA733 (Linenbach y col. PNAS USA 86: 27-31 (1989)). La función biológica del antígeno GA733 se desconoce (International Publication nº WO 93/0829, publicado el 29 de abril de 1993).

Usando la sonda del ADN del GA733-2, los investigadores fueron capaces de seleccionar una genoteca y aislar una secuencia homóloga denominada GA733-1. A partir del gen de GA733-1 los investigadores fueron capaces de expresar el antígeno. Sin embargo ninguno había determinado si el antígeno era un antígeno asociado a tumor.

El hecho de que el gen de GA 733-1 se aisló de una genoteca se añadió a la incertidumbre de si el gen y el antígeno codificado en él se encontraban generalmente en las células normales, las células tumorales o ambas, y la frecuencia en la que se encontraban. El peso molecular y la función del antígeno GA733-1 se desconocen. El antígeno GA733-1 contiene varios epítopos y se conoce un segmento del ADN que codifica el GA733-1 (patente de EE.UU. nº 5.185.254, supra).

El antígeno GA 733-2 es reconocido por un anticuerpo monoclonal denominado AcMo GA733 (también conocido como anticuerpo GA733-2) (Herlyn y col. Hybridoma, 5: S3-S10 (1986)). Se ha evaluado el AcMo GA733 para el diagnóstico y tratamiento de tumores gastrointestinales humanos. Exhibe características tumoricidas. A pesar del hecho de que el GA733-1 y el GA-733-2 comparten un 49% de homología en la secuencia de aminoácidos (patente de EE.UU. nº 5.185.254, presentada el 9 de febrero de 1993), el AcMo GA733 se une al antígeno GA733-2, pero no se une al antígeno GA 733-1. El AcMo Ga733 sí se une a las células epiteliales normales.

Además del Ga733, varios Acm derivados de forma independiente tales como CO17-1A, M77, M79, 323/A3, todos ellos reconocen y se unen al antígeno GA733-2 (Publicación Internacional nº WO 93/0829, supra). El anticuerpo monoclonal CO17-1A (también conocido como anticuerpo 17-1A) se une al antígeno GA733-2 pero no reconoce ni se une al antígeno GA733-1.

En la actualidad no hay anticuerpos monoclonales conocidos dirigidos contra el antígeno GA733-1. Los ligandos BR110 de la invención reconocen y se unen al antígeno GA733-1 y se internalizan en las células tras unirse al antígeno. Además, los ligandos BR110 de la invención parece que exhiben actividad tumoricida.

Los anticuerpos que se internalizan son infrecuentes. En la actualidad, hay una necesidad de aplicaciones terapéuticas para tales anticuerpos "que se internalizan", es decir anticuerpos que las células tumorales a las que se unen pueden captar con facilidad. Por ejemplo, tales anticuerpos se pueden aplicar a agentes biológicos y/o químicos que sólo son eficaces cuando se transportan al interior de la célula.

Resumen de la invención

Los ligandos BR110 de la invención, por ejemplo anticuerpos monoclonales BR110, cumplen las necesidades terapéuticas y diagnósticas mencionadas anteriormente.

Los ligandos BR110 comparten características comunes. Por ejemplo, cada ligando BR110 reconoce y se une de forma específica al antígeno BR110 y está dirigido a al menos una parte del epítopo al cual el anticuerpo monoclonal BR110 (ATCC nº 11698) está dirigido.

En una forma de realización de la invención, el ligando BR110 es el anticuerpo monoclonal BR110 (ATCC nº 11698). Además, otra forma de realización del ligando BR10 de la invención es un anticuerpo recombinante humano/murino, cuya región de unión al antígeno inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica del anticuerpo monoclonal BR110 producido por el hibridoma HB 11698 a su antígeno objetivo. Además, la invención proporciona usos para los ligandos BR110 de la invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación gráfica del plásmido pSE 70.0.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Como se usa en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "ligando" incluye una molécula de anticuerpo intacta y cualquier molécula que tenga al menos una región de unión al antígeno o porción de la misma (es decir, la región variable de una molécula de anticuerpo), por ejemplo, una molécula Fv, molécula Fab, molécula Fab', molécula F(av')_{2}, un anticuerpo biespecífico, una proteína de fusión o cualquier molécula producida por ingeniería genética que reconoce y se une de forma específica al antígeno Br110.

Como se usa en la presente memoria descriptiva "región de unión al antígeno" significa una porción de la molécula que reconoce el antígeno objetivo.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "inhibe competitivamente" significa ser capaz de reconocer y unirse a un sitio determinante al cual está dirigido el anticuerpo monoclonal BR110 usando ensayos competitivos de anticuerpo recíproco convencionales. (Belanger L, Sylvestre C y Dufour D (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sándwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15).

Como se usa en la presente memoria descriptiva "antígeno objetivo" es el antígeno GA 733-1 o porciones del mismo.

Como se usa en la presente memoria descriptiva "unido" significa unir dos o más entidades o segmentos generalmente separadas mediante un enlace covalente o un enlace no covalente.

Como se usa en la presente memoria descriptiva "funcionalmente activo" significa la porción de la molécula que es capaz de reconocer y unirse a su objetivo.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "molécula biológica o químicamente activa" significa cualquier molécula biológica o química que puede inhibir o interrumpir el crecimiento celular o, de otro modo, actúa de forma perjudicial para la célula.

Como se usa en la presente memoria descriptiva "inmunoconjugado" significa cualquier molécula o ligando tal como un anticuerpo unido química o biológicamente a una citotoxina, un agente radioactivo, una enzima, una toxina, un fármaco antitumoral o un agente terapéutico. El anticuerpo puede unirse a la citotoxina, al agente radioactivo, al fármaco antitumoral o al agente terapéutico en cualquier localización en la molécula, siempre y cuando sea capaz de unirse a su objetivo. Entre los ejemplos de inmunoconjugados se incluyen conjugados químicos toxina anticuerpo y proteínas de fusión anticuerpo-toxina.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "cantidad eficaz" es una cantidad del anticuerpo, el inmunoconjugado o la molécula recombinante, que mata a las células objetivo o inhibe la proliferación de las mismas.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "proteína de fusión" significa cualquier proteína quimérica en la que una región de unión al antígeno está conectada a una molécula biológicamente activa, por ejemplo una toxina, una enzima o un fármaco proteico.

Para que la invención descrita en la presente memoria descriptiva pueda entenderse más completamente se expone en la siguiente descripción.

A. Los ligandos de la invención

La presente invención proporciona ligandos que se internalizan (es decir, ligandos BR110) que reconocen y se unen de forma específica al antígeno BR110.

El ligando de la invención puede estar en cualquier forma, siempre y cuando tenga una región de unión al antígeno que inhibe de forma competitiva la unión inmunoespecífica del anticuerpo monoclonal BR110 producido por el hibridoma HB 11698 a su antígeno objetivo. Por tanto, cualquier proteína recombinante (por ejemplo, proteínas de fusión en las que el anticuerpo se combina con una segunda proteína como una linfoquina o un factor de crecimiento inhibidor del tumor) que tenga la misma especificidad de unión que el anticuerpo BR110 entra dentro del alcance de esta invención.

En una forma de realización de la invención, el ligando es un anticuerpo monoclonal BR110. El hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal BR110 se ha depositado según los requerimientos del Tratado de Budapest el 10 de agosto de 1994 con la American Type Culture Collection ("ATCC") 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 y se ha identificado como el nº de registro HB 11698.

En otra forma de realización, el ligando es una molécula Fv (tal como una molécula Fv de cadena sencilla), una molécula Fab, una molécula Fab', una molécula F(ab')2, una proteína de fusión, un anticuerpo biespecífico, un heteroanticuerpo o cualquier molécula recombinante con una región de unión al antígeno del anticuerpo BR110. El ligando de la invención está dirigido al epítopo hacia el que el anticuerpo monoclonal BR110 (ATCC nº 11698) está dirigido.

En una forma de realización de la invención, el ligando de la invención está dirigido hacia el epítopo al que el anticuerpo monoclonal BR110 está dirigido y exhibe una afinidad de al menos aproximadamente 2 x 10^{8} litros/mol a su objetivo o, en el caso de los anticuerpo multivalentes, una avidez que es al menos tal elevada como la que resultaría de la unión de un anticuerpo bivalente de afinidad 10^{8} litros/mol a un antígeno. Son posibles diferentes afinidades y se abarcan en la invención.

El ligando de la invención puede modificarse, es decir mediante modificaciones de aminoácidos en la molécula, de forma que se produzcan moléculas derivadas. También puede ser posible la modificación química.

Las moléculas retendrían la propiedad funcional del polipéptido, a saber, la molécula con tales sustituciones permitirá la unión del polipéptido al antígeno GA733-1 o porciones del mismo.

Entre las sustituciones de aminoácidos se incluyen, pero no se limita a ellos, sustituciones de aminoácidos conocidas en la técnica como "conservadoras".

Por ejemplo, es un principio bien establecido de la química proteica que ciertas sustituciones de aminoácidos, denominadas "sustituciones conservadoras de aminoácidos" frecuentemente pueden efectuarse en una proteína sin alterar ni la conformación ni la función de la proteína.

Tales cambios incluyen sustituir cualquier isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (G) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa.

Otras sustituciones también se pueden considerar conservadoras, dependiendo del entorno del aminoácido concreto y su función en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) con frecuencia pueden intercambiarse, como también lo pueden hacer alanina y valina (V).

La metionina (M), que es relativamente hidrófoba, con frecuencia puede intercambiarse con leucina e isoleucina y, en ocasiones, con valina. A menudo, la lisina (K) y la arginina (R) pueden intercambiarse en localizaciones en las que la característica significativa del residuo aminoacídico y los diferentes pK de estos residuos de aminoácidos no son significativos. Otros cambios más se pueden considerar "conservadores" en entornos determinados.

B. Procedimientos para preparar los ligandos de la invención

Los ligandos de la invención incluyen (1) anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos, (2) moléculas recombinantes que tienen al menos una región de unión al antígeno o una porción de la misma, por ejemplo una molécula Fv, una molécula Fab, una molécula Fab', una molécula F(ab')_{2}, un anticuerpo biespecífico, una proteína de fusión, o (3) cualquier molécula preparada mediante ingeniería genética, todas ellas reconocen y se unen de forma específica al antígeno BR110.

Anticuerpos monoclonales de la invención

Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales de la presente invención se preparan siguiendo los procedimientos generales descritos por Kohler y Milstein (1975)) en Continuous culture of fused cells secreting antibody of defined specifity. Nature 256, 495-497) con algunas modificaciones (M. Yeh y col., "Cell Surface Antigens Of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibody", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 (6): 297-31 (1979) y Yeh y col., "A Cell-Surface Antigen Which is Present In the Ganglioside Fraction And Shared By Human Melanomas", Int. J. Cancer, 29: 269-75 (1982)). En este procedimiento, los hibridomas se preparan condensando las células productoras de anticuerpos (típicamente células de bazo de ratones previamente inmunizados con un inmunogen) con células de una línea de células tumorales inmortales usando procedimientos de hibridación de células somáticas.

Los nuevos anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria descriptiva se generaron mediante la inmunización de ratones con células de carcinoma de mama humana H3922 previamente tratadas con neuraminidasa. Para la inmunización con células de carcinoma de mama humana H3922, se inocula a los animales por vía intraperitoneal al menos una vez con 10^{7} células del inmunogen. Después, estos animales reciben dosis de recuerdo de inmunogen dos o más veces. Se extraen los bazos de los animales varios días después de la última dosis de recuerdo y se prepara una suspensión de células de bazo para fusión usando técnicas de fusión conocidas con células de mieloma
murino.

Los hibridomas que resultan del procedimiento de fusión se dejan crecer. A continuación, los sobrenadantes resultantes se seleccionan usando procedimientos de inmunoensayo para detectar los anticuerpos presentes en los sobrenadantes capaces de unirse al antígeno específico (Hardy RR (1986) Purification and characterization of monoclonal antibodies. En: Weir DM y Herzenberg LA (eds) Handbook of Experimental Immunology, 4ª ed. Vol. 1, pág. 13. Oxford: Blackwell Scientific Publications; Engvall E y Perlmann P (1971) Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8, 871).

Proteínas recombinantes de la invención

Sería rutinario preparar proteínas recombinantes capaces de unirse a los mismos determinantes antigénicos que el anticuerpo BR110. La identificación de proteínas recombinantes que reconocen el mismo sitio de unión simplemente implica realizar ensayos de competición en los que los anticuerpos de la presente invención compiten con otro anticuerpo por el objetivo (Belanger L, Sylvestre C y Dufour D (1973) Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sándwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15). Los ensayos de competición son rutinarios y sus protocolos están bien establecidos (E. Harlow y D. Lane, eds., "Antibodies a laboratory manual" 1988, páginas 567-577).

Pueden construirse clases, isotipos y otras variantes del anticuerpo de la invención que tiene la región de unión al antígeno del anticuerpo BR110 usando técnicas de fusión y de cambio de clase que se conocen en la técnica. (Winter G y Milstein C (1991) Man-made antibodies. Nature 349, 293-299. Pluckthum A (1991) Antibody engineering: advances from the use of Escherichia coli expression systems. Bio/Technology 9, 545-551. Moore GP (1989) Genetically engineered antibodies. Clinical Chemistry 35, 1849-1853).

La presente invención proporciona proteínas de fusión BR110. Las técnicas generales para la construcción de vectores de expresión para proteínas de fusión están bien establecidas (Ernst Winnacker, "From Genes to Clones: Introduction to Gene Technology" Capítulo 7, 1987 en las páginas 239-317). Por ejemplo, un enfoque general para la construcción de vectores de expresión que dirigen la síntesis de proteínas de fusión es el siguiente.

El material de partida puede ser un clon de ADNc, en el que el gen de interés se ha eliminado de un vector. Usando procedimientos conocidos en la técnica se coloca un sitio de restricción cercano al codón de iniciación. La siguiente es una etapa de digestión que cortaría asimétricamente fragmentos de ADN. A continuación, la mezcla de fragmentos de ADN obtenidos se clona en un vector. Por supuesto, en el poliligador del vector escogido debe haber un sitio de fragmentación. Dado que está disponible un amplio espectro de vectores, no debe ser difícil encontrar un vector adecuado que contenga el sitio de fragmentación deseado. Una vez que se ha identificado un clon adecuado, se puede usar el sitio de fragmentación para insertar el gen de interés, que se puede obtener del clon de ADNc original.

La presente invención proporciona proteínas BR110 quiméricas. La preparación de una proteína BR110 quimérica capaz de unirse al mismo determinante antigénico que el anticuerpo BR110 es rutinaria (Morrison, S. L.., Johnson, M. J., Herzenberg, L. A. y Oi, V. T. (1984). Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855, Morrison, S., L. (1985). Transfectomas provide novel chimeric antibodies. Science 229, 1202-1207).

Se puede usar ingeniería genética para crear inmunoglobulinas quiméricas (1) combinando el segmento del gen de la región variable de la cadena pesada de roedores (V_{H}) con el gen de la región constante de la cadena pesada de seres humanos para preparar el constructo del gen de la cadena pesada, (2) uniendo el segmento del gen de la región variable de la cadena ligera de roedores (V_{L}) con un exón de la región constante de la cadena ligera (C_{L}) de seres humanos para crear el constructo del gen de la cadena ligera, y (3) efectuar la transfección de los constructos génicos de las cadenas pesada y ligera en una línea celular de mieloma (Fell y col., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8507-8511 (1989); Morrison, S. L., Johnson, M. J., Herzenberg, L. A., y Oi, V. T. (1984). Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

En principio, cualquier dominio variable de roedor puede emparejarse con un isotipo de región constante humana de forma que se pueda seleccionar la combinación óptima de especificidad antigénica y funciones efectoras (tales como fijación del complemento CCDA (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) (Morrison, S. L. (1985). Transfectomas provide novel chimeric antibodies. Science 229, 1202-1207).

Si es necesario, se puede realizar un ajuste fino de los constructos mediante la introducción de mutaciones puntuales en los segmentos génicos de la región variable que alteren la afinidad del anticuerpo quimérico por su ligando (Kunkel, T. A., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 32; 488-492; Kunkel, T. A., y col., 1987, Methods Enzymol. 154: 367-
382).

Para reducir o eliminar cualquier característica murina del ligando BR110, se pueden producir versiones humanizadas del mismo usando manipulaciones moleculares y tecnología de transfectomas (Co, M. S., Deschamps, M., Whitley, R. J. Y Queen, C. (1991). Humanized antibodies for antiviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869-2873).

Para el anticuerpo humanizado se pueden seleccionar diferentes isotipos de cadena pesada de seres humanos, dependiendo del efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, cuando se desea la destrucción de la célula objetivo, se puede seleccionar la región constante de la IgG1 de seres humanos ya que puede ser reconocida por FcgR I, FcgR II y FcgR III y media la CCDA (Anderson, C. L. y Looney, R. J. (1986). Human Leukocyte IgG Fc receptors. Immunol. Today 7, 264-266).

Se han producido anticuerpos quiméricos con funciones efectoras diferentes mediante la unión de distintas secuencias a las que codifican la región de unión al antígeno. Estas secuencias diferentes incluyen enzimas (Neuberg y col., Nature 312: 604 (1984)), Immunoglobulin constant regions from another species and constant regions of another immunoglobulin chain (Sharon y col., Nature 309: 364 (1984); Tan y col., J. Immunol. 135: 3565-3567 (1985)).

En otras situaciones, tales como en las técnicas de imagen para diagnóstico, bloqueo receptor-anticuerpo o liberación de fármaco mediada por anticuerpos, los isotipos que se unen mal a los receptores Fc (o no se unen) y/o son relativamente ineficaces en la lisis mediada por el complemento (tal como IgG2, IgG4 o IgA) pueden ser los isotipos de elección.

Las manipulaciones moleculares y la tecnología de transfectoma son medios habituales para "humanizar" los anticuerpos de roedores con especificidades de interés. Cabe esperar que estos anticuerpos quiméricos de roedor-ser humano sean menos antigénicos y más útiles en el tratamiento de seres humanos (Co, M. S., Deschamps, M., Whitley, R. J. Y Queen, C. (1991). Humanized antibodies for antiviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869-2873).

En general, un ejemplo de un procedimiento que se puede usar para producir anticuerpos quiméricos implica las siguientes etapas:

a)

identificar y clonar el segmento génico correcto que codifica la porción de unión al antígeno de la molécula de anticuerpo; este segmento génico (conocido como VDJ, regiones variables, de diversidad y de unión para las cadenas pesadas, o VJ, regiones variables de unión para las cadenas ligeras, o simplemente V o región variable) puede estar en forma de ADNc o genómica;

b)

clonar los segmentos génicos que codifican la región constante o la parte deseada de la misma;

c)

ligar la región variable con la región constante de forma que el anticuerpo quimérico completo está codificado en una forma transcribible y traducible;

d)

ligar este constructo en un vector que contenga un marcador seleccionable y regiones de control génico, tales como promotores, intensificadores y señales de adición poli(A);

e)

amplificar este constructo en bacterias;

f)

introducir este ADN en células eucarióticas (transfección), más a menudo en linfocitos de mamíferos;

g)

seleccionar las células que expresan el marcador seleccionable;

h)

detectar de forma selectiva las células que expresan el anticuerpo quimérico deseado; y

i)

probar el anticuerpo para determinar la especificidad de unión adecuada y las funciones efectoras.

En la técnica se conocen bien otros procedimientos para producir anticuerpos quiméricos.

La identificación de anticuerpos quiméricos que reconozcan el sitio de unión del anticuerpo BR110 es rutinaria, por ejemplo mediante ensayos de competición (E. Harlow y D. Lane, eds., "Antibodies a laboratory manual" 1988, páginas 567-577).

El anticuerpo monoclonal BR110 de la invención también se pueden preparar conjugando químicamente las regiones variables del ligando BR110 y una región constante de seres humanos a través de medios químicos, por ejemplo conjugación con (2) agentes que generan disulfuro tales como 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), (2) enlaces tioéter, (3) clorambucilo activado, (4) partículas de entrecruzamiento lábiles en presencia de ácidos y fotoescindibles, y (5) enlace avidín biotina (Stevenson, F. K., Bell, A. J., Cusack, R., Hamblin, T. J., Slade, C. J., Spellerberg, M. B. Y Stevencson, G. T. (1991). Preliminary studies for an immunotherapeutic approach to the treatment of human myeloma using chimeric anti-CD38 antibody. Blood 77, 1071-1079; S. Wong "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking" (1993) CRC Press, Inc.).

Otros procedimientos para producir el ligando de la invención son posibles (Liu, A. Y., Robinson, R. R., Murray, E. D. Jr., Ledbetter, J. A., Hellstrom, I. Y Hellstrom, K. E. (1987a). Production of a mouse-human chimeric monoclonal antibody to CD20 with potent Fc-dependent biologic activity. J. Immunol. 139, 3521-3526).

La presente invención también proporciona anticuerpos monoclonales BR110 biespecíficos. La preparación de anticuerpos monoclonales BR110 biespecíficos capaces de unirse al mismo determinante antigénico que el anticuerpo BR110 es rutinaria (Haber y col., 1990; Wels, W., Hwert, I.M., Zwickl, M., Hardman, N., Groner B., Inés, N.E. (1992) Construction, bacterial expression and characterization of a bifunctional single-chain antibody phosphatase fusion protein targeted to the human ERBB-2 receptor. Biotechnology 10: 1128-1132; A. Traunecker y col. (1991) EMBO Journal 10 (12): 3655-3659).

Fragmentos de anticuerpo BR110 de la invención

Los fragmentos de anticuerpo BR110 incluyen molécula Fv, molécula Fab, molécula Fab', molécula F(ab')_{2}.

El ligando BR110 murino ATCC nº 11698 se puede purificar mediante cromatografía de afinidad a partir de líquido ascítico de roedores. Los fragmentos F(ab')_{2} se pueden generar mediante la digestión con pepsina de anticuerpo monoclonal BR110 purificado según Lamoyi, "Preparation of F(ab')_{2} Fragments from Mouse IgG of Various Subclasses", Meth. Enzymol. 121: 652-663 (1986).

Por otro lado, se pueden producir fragmentos F(ab')2 por medio de ingeniería genética usando metodologías rutinarias (Mayforth R. D., Quintans, J. (1990) Current Concepts: Designer and catalytic antibodies. New Eng. J. Med 323: 173-178; Waldman, T. A. (1991) Monoclonal antibodies in diagnosis and therapy. Science 252: 1657-1662; Winter, G., Milstein, C. (1991) Man-made Antibodies. Nature 349: 293-299; Morrison, S. L. (1992) In Vitro antibodies: strategies for production and application. Ann. Rev. Immunol. 10: 239-266; Haber y col., 1990; Wells, W., Harwerth. I. M., Zwickl, M., Hardman, N., Groner B., Hynes, N. E. (1992) Construction, bacterial expression and characterization of a bifunctional single-chain antibody phosphatase fusion protein targeted to the human ERBB-2 receptor. Biotechnology 10: 1128-1132; A. Traunecker y col. (1991) EMBO Journal 10 (12): 3655-3659).

La unión de todo el ligando BR110 se puede distinguir de la unión de fragmentos F(ab')_{2} usando proteína A conjugada-peroxidasa de rábano (PR), que se une a todo el anticuerpo pero no a los fragmentos F(ab')_{2}.

Los fragmentos Fab del BR110 se pueden producir mediante escisión proteolítica del anticuerpo BR110 intacto usando, por ejemplo, papaína (Parham, P., 1986 Preparation and purification of active fragments from mouse monoclonal antibodies. En "Handbook of experimental immunology. En cuatro volúmenes". Volumen I "Immunochemistry" (Eds. D. W. Weir y col.) páginas 14,1-14,23, Blackwell Scientific Publishers, Oxford. Parham P (1986) Preparation and purification of active fragments from mouse monoclonal antibodies. En: Weir DM y Herzenberg LA (eds) Handbook of experimental Immunology, 4ª ed, Vol. 1,pág. 14. Oxford: Blackwell Scientific Publications).

Por otro lado, los fragmentos Fab se pueden producir por medios de ingeniería genética usando técnicas rutinarias (Huse y col. 1989 "Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin receptor in phage lambda" Science 246: 1275-1281).

Protocolo para construir y purificar conjugados de ligando BR110 y proteínas de fusión

La invención proporciona inmunoconjugados BR110 que comprenden un ligando BR110 unido a al menos una porción de una molécula biológica o químicamente activa (Batra y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8545-8549 (1989); Kondo y col., J. Biol. Chem. 263: 9470-9475 (1988); y Batra y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8545-8549 (1989). La molécula biológica o químicamente activa, tal como agente citotóxico, puede inhibir o interrumpir el crecimiento celular o, de otro modo, actuar en detrimento de la célula.

De acuerdo con la práctica de la invención, entre las moléculas biológica o químicamente activas se incluyen, pero no se limita a ellas, una enzima, una linfoquina, una toxina, un isótopo paramagnético, biotina, un fluoróforo, un cromóforo, un metal pesado, un radioisótopo o un agente quimioterapéutico. Entre los ejemplos de toxinas adecuadas se incluyen, pero no se limita a ellas, exotoxina de Pseudomonas, ricino, briodina y la toxina diftérica. Otros ejemplos incluyen bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, mitoxantrón, mitomicina, cisplatino y procarbazina.

Se pueden usar técnicas de ingeniería genética conocidas en la técnica como se ha descrito en la presente memoria descriptiva para preparar inmunotoxinas recombinantes producidas ligando una secuencia de ADN que codifica una región de unión al antígeno de BR110 con una secuencia de ADN que codifica una molécula biológica o químicamente activa a nivel del ADN y expresando en una células huésped transformada la molécula citotóxica como proteína recombinante. Las inmunotoxinas recombinantes son moléculas homogéneas que retienen la especificidad de la porción de unión a la célula del anticuerpo BR110 con el potencial citotóxico de la toxina (Kondo y col., J. Biol. Chem. 263: 9470-9475 (1988); Siegall y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9738-9742 (1988) Pastan, I., y FitzGerald, D. (1991). Recombinant toxins for cáncer treatment. Science 254, 1173-1177. Pastan, I., Willingham, M. C. y FitzGerald, D. J. (1986). Immunotoxins. Cell 47, 641-648).

Los inmunoconjugados recombinantes, en particular los inmunoconjugados de cadena sencilla, presentan una ventaja sobre los conjugados fármaco/anticuerpo en que se producen con más facilidad que estos conjugados, y generan una población de moléculas homogéneas, es decir, polipéptidos sencillos compuestos por los mismos residuos de aminoácidos (Trail, P. A., y col. Cure of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubicin imunoconjugates. Science, 261: 212-215, 1993). Cuando la molécula biológica o químicamente activa es una toxina o un fármaco, el conjugado es más potente que su homólogo no conjugado.

D. Usos de los ligandos de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para detectar antígeno BR110 en secciones tisulares de un sujeto. De acuerdo con la práctica de esta invención, el sujeto puede ser un sujeto humano, equino, porcino, bovino, canino, felino o un ave. También se incluyen otros animales de sangre calientes.

Este procedimiento comprende poner en contacto las secciones tisulares con el anticuerpo monoclonal de la invención. Las condiciones en las que las secciones tisulares se ponen en contacto con el anticuerpo monoclonal de la invención son tales que la unión se produzca de forma que se forme un complejo. Tras la formación del complejo, el antígeno puede detectarse usando técnicas y sistemas comerciales bien conocidos y desarrollados (Gatter KC, Falini B y Mason DY (1984) The use of monoclonal antibodies in histopathological diagnosis. Recent Advances in Histopathology 12, 35; Boekmann E, Baum RO, Schuldes H, Kramer W, Hertel A, Baew-Christow T, Hanke P, Jonas D y Hör G (1990) Tumour imaging of bladder carcinomas and their metastases with ^{111}In-labelled monoclonal anto-CEA antibody BW 431/26. British Journal of Cancer 62 (Suppl), 81).

En una forma de realización de la invención, la sección de tejido es tejido mamario y el tejido neoplásico es un carcinoma de mama. Por otro lado, el tejido es tejido de colon y el tejido neoplásico es adenocarcinoma. Además, el tejido es tejido pulmonar y el tejido neoplásico es carcinoma de pulmón. Asimismo, en otra forma de realización, el tejido es tejido ovárico y el tejido neoplásico es carcinoma de ovarios. Generalmente, las secciones de tejido son de un tejido en el que el tejido normal se caracteriza por la ausencia de niveles bajos de antígeno BR110 y el tejido neoplásico se caracteriza por la presencia de niveles elevados de antígeno BR110.

De acuerdo con la práctica de la invención, el anticuerpo monoclonal unido a las secciones de tejido se pueden detectar directamente usando un indicador marcado unido al anticuerpo. Por otro lado, el anticuerpo monoclonal unido a las secciones de tejido se puede detectar poniendo en contacto el anticuerpo monoclonal con un segundo anticuerpo. El segundo anticuerpo puede marcarse con un marcador detectable. Tras el contacto, el anticuerpo monoclonal unido a las secciones de tejido forma un complejo con el segundo anticuerpo. El complejo se detecta mediante la detección del segundo anticuerpo unido de este modo.

Además, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar una diferencia en la cantidad de distribución de antígeno BR110 en secciones de tejido de un tejido neoplásico para probarse en relación con la cantidad y distribución de antígeno BR110 en secciones tisulares de un tejido normal. Este procedimiento comprende poner en contacto el tejido que se va a probar y el tejido normal con el anticuerpo monoclonal de la invención, de forma que la detección se puede efectuar como se ha descrito anteriormente. Tras realizar la detección, se puede efectuar una determinación de la diferencia en la cantidad y distribución de antígeno BR110. Esta determinación es una determinación cuantitativa, es decir, determinar qué muestra es más oscura o más clara, o tiene un determinado color etc.

La invención también proporciona un procedimiento de diagnóstico de un trastorno neoplásico en un sujeto. Después, la muestra de tejido se pone en contacto con el anticuerpo de la invención de forma que la presencia del antígeno BR110 en tales secciones de tejido dará lugar a la formación de un complejo entre el anticuerpo y el antígeno. Se detecta la presencia del complejo. Si en la muestra se detecta un nivel superior de complejo que en el tejido normal, ese nivel es indicativo de un trastorno neoplásico y deben realizarse más pruebas.

Por otro lado, se puede detectar un tumor usando una muestra de fluido biológico para detectar un carcinoma humano en un sujeto. Las técnicas diagnósticas serológicas implican la detección y cuantificación de antígenos asociados a tumores que se han secretado o "eliminado" al suero o a otros fluidos biológicos de pacientes de los que se cree que tienen un carcinoma. Tales antígenos pueden detectarse en los fluidos corporales usando técnicas conocidas en la materia, tales como radioinmunoensayos (RIA) o ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), en las que se usa un anticuerpo reactivo con el antígeno "eliminado" para detectar la presencia del antígeno en una muestra de fluido (Uotila y col., "Two-Site Sandwich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP", J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981) y Allum y col., supra en las páginas 48-51).

De lo anterior se hace evidente que los anticuerpos BR110 de la invención se pueden usar en la mayoría de los ensayos que implican reacciones antígeno-anticuerpo. Estos ensayos incluyen, pero no se limita a ellos, técnicas RIA estándar, tanto de fase líquida como de fase sólida, así como ensayos ELISA, técnicas de inmunofluorescencia y otros ensayos inmunocitoquímicos (Sikora y col. (eds), Monoclonal Antibodies, páginas 32-52 (Blackwell Scientific Publications 1984).

Administración a animales de ligandos BR110

Los ligandos BR110 se pueden administrar a animales en una cantidad suficiente como para enlentecer la proliferación de las células objetivo o para matarlas por completo. Para aquellos expertos en la técnica debe estar claro que el programa óptimo para administrar ligandos BR110 variará en función del sujeto, la altura y el peso del sujeto, la gravedad de la enfermedad (G. Goodman, y col., J. Clin. Oncol., 8, 1083 (1990). (Nedelman, MA, Shealy DJ, Boulin R, Brunt E, Seasholtz JI, Allen E, McCartney JE, Warren FD, Oppermann H, Pang RHL, Berger HJ y Weisman HF (1993) Rapid infant imaging with a Technetium-99m-labelled anti-myosin recombinant single-chain Fv: evaluation in a canine model of acute myocardial infarction. Journal of Nuclear Medicine 34, 234. Courtenay-Luck, N. S., y Epenetos, A. A. (1990). Targeting of monoclonal antibodies to tumors. Curr. Opinion Immunol. 2, 880-883). En último término, los médicos que están tratando al paciente decidirán el uso y el programa de administración. Los protocolos clínicos para determinar el intervalo y el programa de dosis son estándar.

Composiciones que incluyen los anticuerpos de la invención

La presente invención proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo monoclonal de la invención al que está unido un agente biológica y químicamente activo.

En una forma de realización, el agente biológica o químicamente activo es una toxina. La toxina se selecciona de un grupo que incluye, pero no se limita a ellas, ricino, toxina diftérica, pseudomonas, exotoxina A, abrina, suporina y gelonina.

Por otro lado, el agente biológica y químicamente activo comprende una enzima, un fármaco o un fragmento de ADN (Nedelman, MA, Shealy DJ, Boulin R, Brunt E, Seasholtz JI, Allen E, McCartney JE, Warren FD, Oppermann H, Pang RHL, Berger HJ y Weisman HF (1993) Rapid infant imaging with a Technetium-99m-labelled anti-myosin recombinant single-chain Fv: evaluation in a canine model of acute myocardial infarction. Journal of Nuclear Medicine 34, 234.

La unión de la enzima, el fármaco o el fragmento de ADN a los anticuerpos monoclonales se conoce bien (Pollard-Knight D, Hawkins E, Yeung D, Pashby DP, Simpson M, McDougall A, Buckle P y Charles SA (1990) Immunoassays and nucleic acid detection with a biosensor based on surface plasmon resonance. Annales de Biologie Clinique 48, 642; Kronick MJ y Little WA (1974) A new immunoassay based on fluorescent excitation by internal reflection spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 71, 4553).

Ventajas de la invención

Los anticuerpos de la presente invención, como otros anticuerpos que reconocen antígenos asociados a tumores humanos, son miembros adicionales del arsenal de agentes diagnósticos y terapéuticos para la guerra contra las enfermedades.

El ligando BR110 es útil, no solo porque es un anticuerpo específico de tumor sino también porque es un anticuerpo que se internaliza. Los anticuerpos de este tipo encuentran uso en procedimientos terapéuticos para matar células de forma selectiva usando conjugados anticuerpo-fármaco o anticuerpo-toxina ("inmunotoxinas"), en los que un agente antitumoral terapéutico está química o biológicamente unido a un anticuerpo o a un factor de crecimiento para liberar en el tumor, donde el anticuerpo se une al antígeno asociado a tumor o al receptor con el que es reactivo y "libera" el agente antitumoral en el interior de las células tumorales (Embleton y col., "Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, páginas 317-44 (Academic Press, 1985).

Para que la invención descrita en la presente memoria descriptiva pueda entenderse de modo más completo, se exponen los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos son sólo para propósitos ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance de este invención de ninguna manera.

Ejemplo 1 Preparación del anticuerpo monoclonal BR110

El anticuerpo monoclonal BR110 de la invención se produjo usando técnicas de fusión de hibridomas como han descrito anteriormente M. Yeh y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979), supra y Yeh y col., Int. J. Cancer (1982), supra.

Brevemente, se inmunizaron ratones BALB/c usando células de carcinoma de mama humano H3922 previamente tratadas con neuraminidasa (10^{7} células). Los ratones recibieron diversas inmunizaciones (x6). La primera vez, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal usando adyuvante RIBI. De la segunda a la sexta vez, se administró a los ratones una inyección intraperitoneal sin usar adyuvante RIBI.

El número total de células inyectadas en cada ocasión fue de aproximadamente 10^{7} células. Cuatro días después de la última inmunización se retiró el bazo y las células del bazo se suspendieron en medio de cultivo RPMI. Después, las células del bazo se condensaron con células de mieloma de ratón P2x63-Ag8.653 en presencia de polietilenglicol (PEG) y se induce el crecimiento de la suspensión celular en pocillos de microtitulación en medio HAT selectivo, como describen Yeh y col., supra [véase también Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975) y Eur. J. Immunol., 6: 511-19 (1976)]. La mezcla se sembró para formar cultivos de baja densidad que se originan de células sencillas condensadas o de clones.

Los sobrenadantes de estos cultivos de hibridoma se sometieron a detección selectiva para determinar la actividad de unión directa en la línea de células de cáncer, H3922, usando un ensayo ELISA similar al descrito por Douillard y col., "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay For Screening Monoclonal Antibody Production Using Enzyme-Labeled Second Antibody", Meth. Enzymol., 92: 168-74 (1983).

De acuerdo con este ensayo, el antígeno (con el que el anticuerpo que se está buscando reacciona) se inmoviliza en placas de microtitulación y después se incuba con los sobrenadantes de hibridoma. Si un sobrenadante contiene en anticuerpo deseado, el anticuerpo se unirá al antígeno inmovilizado y se detecta mediante la adición de un conjugado anticuerpo antiinmunoglobulina-enzima y un sustrato para la enzima, que conduce a un cambio mensurable con densidad óptica.

En los estudios actuales, se introdujeron la línea de células de cáncer de mama H3922 y fibroblastos humanos en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos (Costar Cambridge, MA) y se incubaron durante toda la noche en una estufa con humedad a 37ºC y un 5% de CO_{2}.

A continuación, se fijaron las células con 100 \mul de paraformaldehído al 2% preparado recientemente, se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido por el bloqueo con diluyente de muestra (Genetic Systems, Seattle, WA) durante 1 hora a temperatura ambiente, siendo ésta la condición de incubación para todo el ensayo. Después de lavar con PBS, se añadieron sobrenadantes de hibridoma o anticuerpo purificado y se incubaron durante 1 hora. Las placas se lavaron con PBS y, en una segunda etapa, se añadió un AcM (IgG/M antiratón de cabra, Tango Burlingname, CA) diluido en medio de cultivo (IMDM, Gibco, NY SBF al 10%) y se incubó durante 1 hora. Después de la etapa de lavado se añadió sustrato tamponado (Genetic Systems) y se detuvo la reacción con reactivo de interrupción (Genetic Systems) tras 15 minutos de tiempo de incubación. La absorbancia se leyó a una DO de 450/630 nm (Dynatech Microelisa Autoreader).

A continuación se añadieron los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma a 100 ml/pocillo, los pocillos se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y las células se lavaron tres veces con PBS. Después, se añadió peroxidasa de rábano antiratón de cabra (Zymed, CA) diluida en BSA al 0,1% y PBS hasta alcanzar una concentración de 100 ml/pocillo. La mezcla de reacción se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente o durante 30 minutos a 37ºC y, después, las células se lavaron tres veces con PBS; a continuación se añadió o-fenilendiamina (OPD) a 100 ml/pocillo y las placas se incubaron en oscuridad a temperatura ambiente durante 5-45 minutos.

La unión del anticuerpo a las células se detectó por un cambio de color en los pocillos que se produjo en 10-20 minutos. La reacción se detuvo añadiendo 100 ml/pocillo de H_{2}SO_{4} y la absorbancia se leyó en un Dynatech (Alexandria, VA) Microelisa autoreader® a 490 nm.

Este ensayo se puede llevar a cabo usando células adherentes cultivadas, vivas o con fijación, células en suspensión vivas o fijas, extractos de antígeno soluble purificado y celulares como antígeno inmovilizado.

De este modo se seleccionaron los hibridomas que producían anticuerpos con la reactividad de unión a la línea de células cancerosas H3922 y no a fibroblastos humanos, se clonaron y se confirmó la especificidad de los subclones. Después se expandió in vitro el cultivo de hibridoma para la producción de anticuerpo. Como se ha descrito antes, el anticuerpo BR110 se purificó a partir de sobrenadante de hibridoma mediante cromatografía de afinidad o proteína A inmovilizada (RepliGen, Cambridge, MA). El tampón de formulación final fue PBS y el anticuerpo se filtró en esterilidad y se almacenó refrigerado o congelado a -70ºC.

Los hibridomas que no reaccionaron con los PBL se clonaron, se expandieron in vitro y se sometieron a pruebas para determinar la especificidad del anticuerpo. Los hibridomas que produjeron anticuerpos reactivos con cáncer de mama humano se volvieron a clonar, a expandir y se inyectaron en ratones BALB/c alimentados con pristane de 3 meses de edad, donde crecieron como tumores ascíticos.

Siguiendo este procedimiento, se obtuvo la línea de células de hibridoma BR110, se clonó y se inyectó a ratones para que desarrollaran un tumor ascítico. Como se ha descrito anteriormente, el hibridoma BR110 se ha depositado con un número de la ATCC.

El anticuerpo monoclonal BR110 se purificó a partir de la ascitis mediante cromatografía de afinidad en proteína A recombinante inmovilizada (RepliGen, Cambridge, MA). La ascitis clara se diluyó con un volumen igual de tampón de unión (fosfato potásico 1M, pH 8) y se aplicó a una columna con proteína A previamente equilibrada con tampón de unión.

La columna se lavó de forma extensa con tampón de unión y después el anticuerpo se eluyó con ácido fosfórico 50 mM, pH 3. La fracción de anticuerpo purificado se neutralizó con Tris 1M a pH 9 y después de dializó frente a suero salino tamponado con fosfato. Por último, el ligando BR110 purificado se filtró en condiciones de esterilidad y se guardó refrigerado o congelado.

Ejemplo 2 Caracterización del anticuerpo monoclonal BR110 Determinación del isotipo

Para determinar la clase de inmunoglobulina producida por el hibridoma BR110 se usó la siguiente técnica de ELISA: Placas de 96 pocillos Dynatech Immulon se revistieron con anticuerpos de la subclase de IgG antiratón de cabra (Southern Biotech, Birmingham, AL) a una concentración de 1 mg/ml en PBS y se incubaron durante toda la noche a 4ºC.

Mediante este procedimiento se determinó que el anticuerpo monoclonal BR110 es del isotipo gamma 2a.

Inmunohistología

La técnica de la peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) de L. A. Sternberger, como se describe en Immunochemistry, páginas 104-69 (John Wiley & Sons, Nueva York, 1979) y como modificaron H. J. Garrigues y col., "Detection Of a Human Melanoma-associated Antigen, página 97, En Histological Sections Of Primary Human Melanomas" Int. J. Cancer, 29: 511-15 (1982), se usó para los estudios inmunohistológicos. Los tejidos objetivo de estas pruebas se obtuvieron mediante cirugía y se congelaron dentro de las 4 horas posteriores a su retirada usando isopentano previamente enfriado en nitrógeno líquido.

A continuación, los tejidos se almacenaron en nitrógeno líquido o a -70ºC hasta su uso. La secciones congeladas se prepararon, se secaron con aire, se trataron con acetona y se secaron de nuevo [véase Garrigues y col., supra]. Las secciones que se iban a usar para la evaluación histológica se tiñeron con hematoxilina.

Para disminuir los entornos inespecíficos, las secciones se incubaron previamente con suero humano normal diluido 1/5 en PBS (H. J. Garrigues y col., "Detection Of A Human Melanoma-Associated Antigen, pág. 97. En Histological Sections Of Primary Human Melanomas", Int. J. Cancer, 29: 511-15 (1982)). Los anticuerpos de ratón, la IgG de conejo antirratón y la PAP de ratón se diluyeron en una solución del 10% de suero humano normal y 3% de suero de conejo. La IgG de conejo antiratón (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) se usó a una dilución de 1/50. Los complejos PAP de ratón (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) que contenían 2 mg/ml de PAP purificado de forma específica se usaron a una dilución de 1/80.

El procedimiento de tinción consistió en tratar secciones seriadas con anticuerpo específico, es decir BR110, o con un anticuerpo control durante 2,5 horas, incubando las secciones durante 30 minutos a temperatura ambiente con IgG antiratón de conejo diluida a 1/50 y, después, exponiendo las secciones a complejos PAP de ratón diluidos a 1/80 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de cada tratamiento con anticuerpo, los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS.

La reacción inmunihistoquímica se desarrolló añadiendo 0,5% de tecracloruro de 3,3'-diaminobencidina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) t 0,01% de H_{2}O_{2} en tampón Tris 0,05 M, pH 7,6, para 8 minutos (Hellstrom y col., J. Inmunol., 127: 157-60 (1981)). Una exposoción adicional a una disolución de OsO_{4} al 1% en agua destilada durante 20 minutos intensificó la tinción. Las secciones se aclararon en agua, se deshidrataron en alcohol, se aclararon en xileno, y se montaron sobre portaobjetos. Las secciones paralelas se tiñeron con hematoxilina.

Cada uno de los portaobjetos se evaluó con un código y un investigador independiente comprobó las muestras codificadas. Los portaobjetos típicos se fotografiaron usando óptica de contraste de interferencia diferencial (Zeiss-Nomarski). EL grado de tinción del anticuerpo se evaluó como 0 (sin reactividad), + (algunas células débilmente positivas), ++ (al menos un tercio de las células es positivo), +++ (la mayoría de las células es positiva), ++++ (aproximadamente todas las células son fuertemente positivas). Dado que las diferencias existentes entre la tinción + y 0 eran menos claras que las que existen entre las tinciones + y ++, un grado de tinción ++ o mayor se consideró "positivo". En las muestras de tumor se encontraron tanto células neoplásicas como estromales. La tinción registrada fue la de las células tumorales porque las células estromales no se tiñeron nada o se tiñeron mucho más débilmente que las células tumorales.

La tabla 1, a continuación, demuestra la tinción inmunohistológica de muestras de varios tumores y de tejido normal usando el anticuerpo monoclonal BR110. Como la tabla demuestra claramente, el anticuerpo BR110 reacciona con un amplio abanico de muestras de carcinoma humano.

Ensayos de unión

El reconocimiento de los antígenos de superficie celular por el AcM BR110 se identificó en una variedad de líneas de células de carcinoma mediante inmunofluorescencia, usando un Coulter Epics C FACS.

Las suspensiones celulares se alicuotaron en medio de cultivo (IMDM Gibco, NY, SBF al 10%) a una concentración de 5 x 10^{5} células. A los sedimentos celulares resuspendidos se añadió AcM BR110 conjugado con FITC a una concentración de 10 \mug/ml diluidas en medio de cultivo, seguido por una incubación de 1 hora en hielo. Después de lavar las células con medio de cultivo, se analizaron las muestras para determinar la intensidad media de fluorescencia. Las proporciones de unión se calcularon dividiendo el equivalente de fluorescencia lineal (EFL) por el EFL del control negativo. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Determinación de los sitios de unión al antígeno por célula

Los ensayos de unión celular se realizaron con AcM BR110 conjugado con FITC usando líneas celulares H3619 y H2987, seguido por análisis con FACS. La intensidad media de fluorescencia se determinó tras la tinción con diluciones del doble de anticuerpo de 50 a 0,38 mg/ml). Las perlas fluoradas de tamaño e intensidad conocidos produjeron una curva estándar que se incluyó en el cómputo de equivalentes de fluorescencia a través de la unión al anticuerpo. Se determinó que el número de sitios de unión en ambas líneas celulares era de 8 x 10^{4} sitios/célula.

Ejemplo 3 Internalización de BR110

Para determinar si el BR110 podría internalizarse en las células de carcinoma positivas para el antígeno se aplicó un ensayo de inhibición indirecta usando un anticuerpo conjugado con la cadena A de ricino.

De acuerdo con este ensayo, la inhibición de la incorporación de timidina-3H en el ADN celular es una medida del efecto citotóxico del conjugado dado y refleja la internalización de la cadena A de ricino en las células de carcinoma.

Las células de carcinoma se sembraron en una placa de microtitulación de 96 pocillos a 5 x 10^{3} células/pocillo, seguido por una incubación durante toda la noche a 37ºC y CO_{2} al 5%. Al cultivo se añadió sobrenadante de hibridoma (neto y a una dilución de 10 veces) y se incubó durante 1 hora en hielo. Después de lavar con medio de cultivo se añadió un anticuerpo de la cadena A de ricino de IgG antiratón de cabra (Inland Laboratories, Austin, TX) a una concentración de 5 mg/ml durante un tiempo de incubación de 42 horas a 37ºC, después del cual se añadieron 50 \mul de timidina-3H a 1 mCi/pocillo y la placa se incubó durante otras 6 horas a 37ºC. A continuación, las placas se congelaron a -70ºC durante varias horas, se descongelaron y se recogieron las células en filtros de fibra de vidrio (Wallac, Finlandia) usando un cosechador de células (Wallac, LKB). Después de añadir líquido de centelleo para el contaje, los residuos que quedaron en el filtro se contaron con un contador de centelleo líquido (Wallac, LKB).

Los resultados se expresan como el porcentaje de inhibición de la incorporación de timidina-3H en el grupo experimental frente al control sin tratar de la línea de células de carcinoma, la línea H3922 muestra un 90% y la H3396 un 60% de inhibición del crecimiento tras el tratamiento con AcM Br110, el anticuerpo exhibe signos de internalización.

Como otro enfoque para estudiar la internalización del BR110, las células de carcinoma se analizaron mediante microscopia confocal (microscopia de barrido láser confocal Leica).

Se permitió la adhesión de las células de carcinoma (H3619, H3396, H3922) cultivadas en IMDM/SBF al 10% a portas de cristal (cubres de cámara NUNC) durante 48 horas. Las células se colocaron a 4ºC durante 15 minutos. Se añadieron anticuerpo BR110 conjugado con FITC o anticuerpo IgG antiratón de cabra conjugado con FITC (Tago, Burlingname, CA) como control a una concentración de 10 \mug/ml durante 1 hora a 4ºC. El anticuerpo sin unir se eliminó mediante lavado extenso con medio de cultivo frío. Para detectar la tinción de superficie, las células se lavaron con PBS frío y se fijaron con paraformaldehído al 2% durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido por un tratamiento con reactivo antidecoloración Ditioeritritol (Sigma).

Para investigar la internalización del BR110, se añadió medio de cultivo a 37ºC y las células se incubaron a puntos de tiempo individuales (tiempo 0-3 horas). El curso del tiempo se detuvo con PBS frío y posterior fijación. Las imágenes de microscopia confocal demostraron que cuando las células se expusieron primero a BR110 a 4ºC, el AcM se unió exclusivamente a la superficie de la célula. Cuando la temperatura se cambió a 37ºC y las células se guardaron a esa temperatura durante 15 minutos, se observó tinción citoplásmica: La unión de BR110 en ese momento se distribuyó de forma no homogénea en compartimentos citoplásmicos y no existía en la superficie de la célula. Ni la superficie de la célula ni el citoplasma se tiñó con el AcM control. Los datos demuestran que el BR110 se internalizó en las células de carcinoma.

Hemos realizado pruebas con el AcM GA733 para determinar la internalización en las líneas de células de carcinoma H3396 y SW948. Cuando las pruebas se realizaron a 37ºC, el anticuerpo se unió exclusivamente a la superficie de la célula a 4ºC con una internalización extremadamente débil o sin ella.

Citotoxicidad de BR110 dependiente de anticuerpo y dependiente de complemento

Se llevaron a cabo pruebas ADCC y CDC, marcando las células objetivo (H3396, H3922) con ^{51}Cr y exponiéndolas durante 4 horas a linfocitos humanos o a suero humano como fuente de complemento y de BR110.

Se midió la liberación de ^{51}Cr desde las células objetivo como signo de la lisis de las células tumorales (citotoxicidad).

Se encontró que el BR110 era negativo para ADCC y CDC, lo que puede atribuirse a su isotipo IgG2a.

Competición por ELISA

Teniendo en cuenta la relación de los genes de GA733, se llevó a cabo un ensayo de competición para establecer las diferencias de especificidad entre los AcM BR110 y GA733. El análisis con FACS ha mostrado que las dos proteínas (GA733-1 y GA733-2) están presentes den la línea celular H3396. Los estudios de unión en células fijadas con paraformaldehído demostraron que estos anticuerpos no experimentaban bloqueos cruzados y, por tanto, se unen a epítopos diferentes.

Determinación de la avidez o afinidad

Se llevó a cabo un análisis de Scatchard para determinar la avidez del AcM BR110 marcado radiactivamente tras la unión a células adherentes no fijadas. Los datos indican que el BR110 tiene un constante de asociación (Ka) aproximada de 5 x 10^{-8} moles/litro determinada en las líneas celulares H3619 y H33696.

Caracterización del antígeno BR110

El antígeno BR110 se aisló de la línea de células de carcinoma positivas para el antígeno H2987. Las células se solubilizaron en Tritón X-100 al 1% y los complejos antígeno-anticuerpo se purificaron mediante cromatografía proteica en Sefarosa-A y SDS-Page en condiciones no reductoras y se recuperaron por electroelución o electrotransferencia.

La proteína Mr = 66.000 se bloqueó en su extremo amino. Para la proteína Mr = 55.000 se obtuvo una única secuencia en el extremo amino de 20 residuos, lo que muestra una completa identidad con el antígeno asociado a tumor GA 733-1, residuos 88-107.

La escisión con bromuro de cianógeno del antígeno BR110 Mr = 66.000 generó un fragmento principal que se purificó mediante SDS-Page, se recuperó por la secuencia que era idéntica a la secuencia del GA-733-1 comenzando en el residuo 63, precedido por un residuo de metionina. Estos datos confirman que el antígeno BR110 está bloqueado en su extremo amino, para obtener la información de la secuencia se requirió fragmentación. Además, los datos sugieren que la glucoproteína MR= 55.000 es un producto de fragmentación natural de la proteína MR= 66.000 que todavía es capaz de unirse al AcM BR110.

El antígeno GA 733-2 se purificó de la línea de células de carcinoma colorrectal humano SW948 y se determinó su secuencia parcial de aminoácidos (Linnenbach, A. J. Y col., PNAS 86, 27-31, 1989). De una genoteca humana total se aislaron dos recombinantes y se determinó la secuencia completa de ADN de los genes de GA 733-1 y GA 733-2.

El antígeno GA733-1 que es reconocido por el AcM BR110 está muy relacionado con el antígeno GA 733-2 (es decir, al comparación de la secuencia parcial de aminoácidos [45 aa] muestra una buena homología), que es reconocido por los AcM GA 733 y CO17-1A.

En consecuencia, parece que el AcM BR110 tiene especificidad por un antígeno relacionado, aunque único, que está codificado en un gen que comparte homología con el exón 8 de la unidad repetitiva de tiroglobulina tipo 1, la cadena invariante asociada a HLA-DR y la subunidad a del receptor del factor de crecimiento de IL-2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Inmunohistología de los AcM de ratón (número de positivos/número de pruebas)

1

TABLA 2 Inmunohistología (número de positivos/número de pruebas)

3

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TABLA 3

Anticuerpos monoclonales de ratón Inmunohistología Expresión antigénica homogénea y heterogénea en el tumor tras la tinción

Número de positivos/número de pruebas Número de homogéneos Número de heterogéneos

4

TABLA 4 Reconocimiento del antígeno de superficie por el AcM BR110 (método de tinción directa)

5

TABLA 5 Reconocimiento del antígeno de superficie por el AcM BR110 y el AcM 733 (método de tinción directa)

Líneas celulares	BR110	GA 733
	Proporciones de unión
Ca. Pulmón H2987	35	24
Ca. Mama H3922	45	26
Ca. Mama H3396	20	52
Ca. Colorrectal SW948	1	86

Ejemplo 4 Internalización del BR110 sFv-PE40 en las células de carcinoma Materiales y procedimientos

Anteriormente se han descrito los reactivos y el cultivo celular-inmunotoxina BR96 sFv-PE40 purificada, usada como control (Friedman y col., 1993). Los ensayos de ELISA de unión a la membrana se llevaron a cabo usando suero de conejo policlonal BR110 antiidiotípico (Bristol Myers Squibb) o EXA2-1H8, un anticuerpo monoclonal antiPE de ratón (Signa Chemical Co. (St. Louis, MO). Genetic Systems (Seattle, WA) proporcionó el diluyente de la muestra y el diluyente del conjugado. Southern Biotechnology (Birmingham, AL) suministró el conjugado Ig (H + L) antiratón de cabra-HRP específico. Perceptive Biosystems (Framingham, MA) suministró la resina porosa HQ®. Las enzimas de restricción y de modificación del ADN procedían de New England Biolabs y la leucina- [^{3}H] se consiguió de New England Nuclear (Boston, MA). Otros productos químicos y reactivos, incluidos los inhibidores de proteasa y el glutatión, se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Adenocarcinoma de colon H3619, carcinoma de pulmón H3754 y carcinomas ováricos H3907 se cultivaron en medio Dulbecco modificado con Iscoves (IDMEM) con suero bovino fetal al 10%. La línea de células de carcinoma de mama MCF-7 se obtuvo del ATCC y se cultivó como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo monoclonal BR110 (AcM) se desarrolló por inmunización de ratones con la línea de células de carcinoma de mama humano H3922 según los procedimientos establecidos.

Secuenciación del extremo amino: Aproximadamente 10 nmoles de muBR110 IgG, purificada del cultivo continuo de células de hibridomas, se purificó mediante SDS-PAGE al 15% y las cadenas pesada y ligera se aislaron para realizar el análisis de la secuencia en el NH_{2} terminal usando un secuenciador Applied Biosystems 477 Protein Sequencer® y un analizador Applied Biosystems 120 PTH Analyzer® (Hewick y col., 1981; Matsudaira, P., 1987). Se llevaron a cabo veinticinco ciclos de degradación de Edman. Sin embargo, sólo se obtuvo la secuencia del extremo amino de la cadena ligera, ya que se pensó que la cadena pesada estaba bloqueada en el extremo N.

Aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y amplificación: Se preparó ARN de 5 x 10^{7} células de hibridoma muBR110 como se ha descrito anteriormente (P. Chomezynski y N. Sacchi, 1987). El ADNc se obtuvo usando ARN total y la polimerasa rth termoestable (r^{TH}-RT-RNA-PCR Kit®, Perkin Elmer Cetus) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la amplificación de del gen Fv de la cadena pesada usamos el par cebador, MHV P9 (MHV= Región variable de la cadena pesada de ratón; 5'-ACTACACGGTACCCGGGATCCATGG^{C}/_{A} TTGGA^{A}/_{C} CTGCTATTCCTG-3') (Jones y Bending 1991) y el cebador constante 3' V_{H} (5'-N6GAATTCA^{T}/_{C}C-TCCACACACAGG^{A}/_{G} ^{A}/_{G}CCAGTGGATAGAC-3') (Larrick y col., 1991). El cebador 5' para el gen de la región variable de la cadena ligera se diseñó según la secuencia aminoacídica del extremo N derivada de la degradación de Edman la alineación de la base de datos a otros genes relacionado de la cadena ligera de ratón. El cebador 5' fue (5'CGATCCGAATTCGACATTGTGATGACCCAGTCTCA 3') mientras que el cebador constante 3' V_{L} fue mck-3 (5'-N4GAATTCCAAGAAGCACACGACTGAGGCA-3')
(Gilland y col., 1991). Las secuencias de reconocimiento para Kpn I y EcoRI están subrayadas.

Clonación del ADNc amplificado: Los productos de la amplificación de los fragmentos de ADN que codifican la región Fv de las cadenas pesada y ligera se identificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y su migración indicó un aparente tamaño molecular de 475 y 375 pares de bases, respectivamente. En sus extremos 5' y 3' existen sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción KpnI y EcorRI para clonar los productos de la PCR en pBluescript SK(+) (Stratagen, La Jolla, CA). Se determinó la secuencia nucleotídica para varios clones de los segmentos génicos de las cadenas ligera y pesada de BR110 usando como molde ADN plasmídico de doble cadena y el kit Sequenase 2.0 reagent kit® (United States Biochemical, Cleveland, OH) con los cebadores de secuenciación T7 y T3 (Pharmacia, Piscataway, NJ).

Construcción del plásmido de expresión de BR110 sFv X PE40: El plásmido de expresión usado para la producción de BR110sFv X PE40 en E. coli usa el promotor de la polimerasa de ARN del bacteriófago T7 (Studier y Moffat, 1986). Las regiones V de BR110 se amplificaron mediante PCR para modificar sus sitios de restricción terminales usando un cebador de PCR 5' V_{H} (5'-GCA ATG CATATGCAG ATC CAG TTG GTG CAG TCT GGA C-3'), que codificaba el sitio de restricción NdeI, subrayado, que incluye un codón ATG de iniciación de la traducción (negrita) y los primeros ocho codones del gen V_{H}. El cebador de PCR de la región 3'V_{L} (5'-CCA TGG ATG CAT CCG TTT CAG CTC CAG CGT GGT CCC AGC-3'), que codificaba el sitio de restricción Nsi I (subrayado) y los últimos nueve codones del gen de V_{1}. También insertamos un ligador flexible, (Gly_{4}Ser)_{3}, entre los dos dominios V (Huston y col, 1988; Chaudhary y col., 1989) mediante la síntesis de cebador de PVR de 3' V_{H} (5'-CCG GCC GGA TCC GCC TCC GCC TGA TGA GGA AGC GGT GAC CGT GGT CCC T-3'), que se diseñó para que tuviera el sitio de restricción Bam H I (subrayado), la primera mitad del agente de unión (negrita) y los últimos ocho codones del gen de V_{H}. El cebador de PCR para 5' V_{L} (5'-CCG GCC GGA TCC GGC GGT GGC GGT TCT GGC GGT GGC GGT TCT GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAC-3') codifica el sitio de restricción Bam HI (subrayado), la segunda mitad del ligador (negrita) y los primeros ocho codones del gen de V_{L}. El sitio de restricción Bam HI se usó para ligar los dos productos de la PCR y, después, se volvió a amplificar con PCR usando los cebadores 5'V_{H} y 3'V_{L} (Sambrook y col., 1989). A continuación se sustituyó el BR110sFv por el BR96 sFv (McAndrew, 1995) en pBW7,0, un vector basado en pMS8 (+), mediante digestión con NdeI + Nsi I seguida por ligación. El plásmido de expresión resultante dirige la proteína de fusión pBR110sFv-PE40 al citoplasma, y se confirmó mediante análisis de la secuencia de ADN.

Expresión y purificación de BR110 sFv-PE40: La proteína de fusión de inmunotoxina de cadena sencilla BR110 sFv-PE40 se expresó en E. coli como se ha descrito anteriormente en este documento. Las células de E. coli BL21 (IDE3) (Studier y Moffat, 1986) se transformaron con el plásmido de expresión pBR110sFv-PE40, cultivado en medio "Terrific-Broth" (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) con 100 \mug/ml de ampicilina a 37ºC y se indujeron con IPTG 1 mM en la fase logarítmica a una DO de 650 de 1,0. Las células re recogieron noventa minutos después. Para el análisis analítico, se recogió, mediante centrifugación, 1 ml de las muestras y se indujo un shock osmótico en H_{2}O fría durante 10 minutos. Las células se centrifugaron de nuevo y los precipitados celulares se resuspendieron en Tris-HCl 10 mM, pH 7,4. Las alícuotas preparadas de aproximadamente 10^{8} esferoplastos se sometieron a SDS-PAGE y se marcaron (Laemmli, 1970) o sometieron a análisis de inmunotransferencia usando el suero policlonal idiotípico de ratón antiBR110. Una gran cantidad de precipitado de células bacterianas preparado de un matraz de agitación de 6 l se procesó como se ha descrito anteriormente y los cuerpos de inclusión se aislaron como se ha descrito antes (Friedman y col., 1993). Los cuerpos de inclusión lavados extensamente se desnaturalizaron a continuación en guanidina 7M.

Expresión, clonación y purificación del antígeno: El antígeno BR110 (GA 733-1) se aisló a partir de las células H2987 y se obtuvo la secuencia de 20 residuos del extremo amino. Los residuos eran complementarios a los residuos 88-107 del antígeno asociado a tumor GA 733-1. La GA 733-1 es una secuencia génica aislada en función de su homología con GA 733-2, que codifica el antígeno asociado al tracto gastrointestinal reconocido por los AcM GA 73.3 y CO17-1A. El GA 733-1 tiene un 50% de homología con el antígeno GA 733-2.

Se llevó a cabo un análisis Northern en las tres líneas de células de carcinoma, carcinoma ovárico H3907, adenocarcinoma de colon H3619 y carcinoma de pulmón H3754, de los que se había mostrado que expresaban el antígeno de BR110 GA 733-1 mediante análisis con FACS. Se aisló ARN de 20-30 millones de células de cada uno usando el método de Chomczynski y Sacchi (Chomczynski y Sacchi, 1987 (Anal. Biochem 162: 156-159)). Se preparó una sonda oligonucleotídica basada en la secuencia de nucleótidos conocida de GA 733-1. El análisis Northern se llevó a cabo como se describe en Mantianis.

El ADNc del antígeno se aisló usando cebadores específicos de secuencia, ARN total y polimerasa transcriptasa inversa (RT-RNA PCR, Perkin Elmer Cetus) según las instrucciones del fabricante excepto por la adición de 10% de DMSO, usado porque el antígeno GA733-1 tiene más del 50% de GC. Los cebadores RT específicos usados fueron 110-FP (5' GCC AAG CTT GTC CGG TCC GCG TTC CTC CGC CCC ACC 3'), 110-RP (5' CGG TCT AGA CTC GAG GCC GGG TAC CTA CAA GCT CGG TTC 3'), 110-RP1 (5' GCG GGG ATC CGT GAG GCG CTT CAT GGA GAA CTT CGG 3'). El sitio de restricción para cada cebador está subrayado y son Hind III, Xho I y Bam HI, respectivamente. Tras la transcripción inversa con cualquiera de los hexanucleótidos aleatorios proporcionados con el kit o el cebador 3''110-RP1, se llevaron a cabo 32 ciclos de PCR con recuperación de los productos de tamaño adecuado. Los fragmentos génicos de 1,15 kB se digirieron con HindIII y Bam HI antes de su inserción en pCD40ThrRg1 (en un entorno CDM7), mientras que los fragmentos génicos de 0,86 kB se ligaron como fragmentos HindIII-XhoI en pCDM8. Los ADN plasmídicos que contenían los insertos del tamaño adecuado se identificaron y se sometieron a análisis de la secuencia de ADN. EL fragmento de ADN que codificaba el dominio extracelular se subclonó en dirección 5' de la región Fc humana y se expresó de forma transitoria en células COS. La proteína de fusión resultante se purificó mediante cromatografía de afinidad de Proteína A.

ELISA de membrana celular: Se prepararon membranas de células de adenocarcinoma de colon H3619 (Spira y col., "The Identification Of Monoclonal Class Switch Variants By Subselection And ELISA Assay", J. Immunol. Meth., 74: 307-15 (1984), Uotila y col., "Two-Site Sandwich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP", J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981), Sikora y col. (eds), Monoclonal Antibodies, pág. 32-52 (Blackwell Scientific Publications 1984)).

Las membranas se colocaron revistiendo la superficie de placas de 96 pocillos Immulon II 96® (Dynatech Labs, Chantilly, VA) a 10 \mug/ml de proteína en carbonato sódico/bicarbonato sódico 0,5M, pH 9,6 y se incubaron durante toda la noche a 4ºC. Las placas se lavaron tres veces con PBS, se bloquearon con diluyente de muestra a 1:10
(Genetic Systems, Seattle, WA) durante 1 hora a TA. Las placas se lavaron tres veces con PBS y después se incubaron con anticuerpo primario durante toda la noche a 4ºC en diluyente de conjugado (Genetic Systems, Seattle, WA). A continuación se lavaron las placas tres veces con PBS seguido por la adición de anticuerpo secundario, bien HRP específico de IgG antiratón de cabra o anticuerpos policlonales antiidiotípicos BR110 de conejo, a 2,5 \mug(ml en diluyente de conjugado. Las placas se incubaron durante 1 hora a TA y después se lavaron tres veces con PBS. Las placas se lavaron tres veces con PBS y después se incubaron durante 1 hora a TA con HRP específico de la región Fc de IgG anticonejo de cabra a 1:1000 en diluyente de conjugado o se lavaron dos veces más, tras lo cual se desarrolló la reacción con bencidina de tetrametilo (TMB) durante 15 minutos a TA y se detuvo con H_{2}SO_{4} 1,3M. Después de ña incubación, las placas con suero policlonal también se lavaron cinco veces con PBS y se trataron como se ha indicado anteriormente. La absorbencia se cuantificó a doble longitud de onda 450/630 nm, usando un lector de microplacas Bio-tek (Winooski, VT).

Análisis de citotoxicidad: Las células se incubaron con BR110 sFv-PE40 durante 24 horas a 37ºC. Después, los pocillos se lavaron dos veces con suero salino tamponado con fosfato (PBS), se añadieron 200 \mul/pocillo de calceína-AM 1,5 \muM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) y las placas se incubaron durante 40 minutos a TA. La calceína-AM puede atravesar la membrana y no es fluorescente. Cuando se produce la hidrólisis por la acción de esterasas intracelulares se forma el producto de calceína intensamente fluorescente. Al final de la incubación, se mide al fluorescencia usando un analizador Fluorescence Concentration Analyzer® (Baxter Healthcare Corp., Mundelein, IL) a longitudes de onda de excitación/emisión de 485/530 nm.

Ejemplo 5 Construcción de inmunotoxina BR110 sFv-PE40 (pSE 70.0)

El constructo original BR110 sFv-PE40 se subclonó en un vector que contiene el gen de la resistencia a kanamicina y un segundo represor lac construido en el vector de expresión. Esto se realizó digiriendo el pET29c (Novagen Inc) con EcoRI y XbaI e insertando entre los dos sitios un BR110 sFv- PE40 digerido de forma similar. El constructo resultante se denominó pSE 70.0 (figura 1) y estaba bajo el control del promotor T7.

Expresión, replegamiento y purificación de BR110 sFv-PE40

La proteína de fusión inmunotoxina de cadena sencilla BR110 sFv-PE40 se expresó en E. coli en forma de cuerpos de inclusión. La pasta celular de 1 litro de cultivo de partida que contenía la proteína de fusión BR110 sFv-PE40 expresada se resuspendió en Tris-HCl 50 mM a pH de 8,0 + EDTA 1 mM. La muestra se centrifugó a 8K durante 15 minutos y se decantó el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en 40 ml de H_{2}O, se guardó a 4ºC durante 10 minutos y se centrifugó a 8K durante 15 minutos. El precipitado se resuspendió en Tris-HCl 50 mM a pH 8,0 + EDTA 1 mM. Se añadieron 0,5 mg/ml de lisozima hasta alcanzar una concentración final de 0,25 mg/ml. La muestra se mantuvo en hielo durante 30 minutos.

A continuación, a la muestra se añadió detergente Tergitol hasta alcanzar una concentración final del 4%. La muestra se mantuvo en hielo durante 60 minutos y se centrifugó a 18K durante 30 minutos. La muestra se lavó tres veces con Tris-HCl 50 mM + EDTA 1 mM. El precipitado se sometió a ultrasonidos en 3 ml de solución de guanidina (guanidina-HCl 7M, Tris HCl 0,1M, pH 7,4, EDTA 5 mM) y se dejó a 4ºC durante 48 horas. Después, la muestra se centrifugó a 30K durante 30 minutos y se recogió el sobrenadante.

Después, la muestra se volvió a plegar a 100 \mug/ml mediante la adición lenta a tampón de replegamiento (Tris-HCl 0,1M, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, GSSH 1 mM, GSH 1 \muM, urea 1M). La proteína nuevamente plegada se mantuvo a 4ºC durante 48 horas y se dializó frente a HCl 40 mM a pH 8,0 hasta que la conductividad estaba por debajo de 5 mS/cm. La muestra se cargó en una columna de intercambio aniónico DEAE y se eluyó con un gradiente lineal de Tris- HCl 40 mM a pH 8,0 + NaCl 1M. Se recogieron las fracciones correspondientes a una proteína de fusión BR110 sFv-PE40 de 67 kDa mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras, se diluyeron en 250 ml de Tris-HCl 40 mM a pH 8,0 y se volvieron a aplicar a una columna de intercambio aniónico Mono-Q con el mismo gradiente de NaCl que para la columna DEAE. Las muestras correspondientes al monómero BR110 sFv-PE40 se recogieron y cuantificaron mediante ensayo con Coomassie-Plus (Pierce Chem Co.)

Construcción y purificación de inmunotoxina BR110-BD1

Se produjo la tiolación del AcM BR110 mediante adición de 2-iminotiolano en un exceso molar del triple en tampón fosfato sódico 0,2 M (pH 8,0), EDTA 1 mM durante 1 hora a 37ºC. Se derivó BD1 con SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)-tolueno) en un exceso molar del triple en tampón fosfato sódico 0,2 M (pH 8,0), EDTA 1 mM a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se aplicó BR110-BD1 a una columna de exclusión por tamaño (TSK-3000) y se separó de la toxina libre. La inmunotoxina (180 kDa) y el anticuerpo libre (150 kDa) eluyeron juntos y se purificaron posteriormente mediante cromatografía de afinidad en Blue-Sefarosa. El BR110-BD1, en fosfato sódico 0,1 M a pH 7,0 (tampón de lavado), se absorbió en la Blue-Sefarosa (5 ml de resina/5 mg de conjugado) durante 16 horas a 4ºC. La mezcla se empaquetó en una Econocolumn (Bio-Rad, Richmond, CA) y eluyeron fracciones de 1 ml con un gradiente de 2 etapas de concentraciones crecientes de NaCl en tampón de lavado (NaCl 400 mM, etapa 1; NaCl 800 mM, etapa 2). El conjugado de inmunotoxina se cuantificó a DO_{280} (1,4 = 1 mg/ml) y se analizó en SDS-PAGE en condiciones no reductoras.

Análisis de citotoxicidad de las inmunotoxinas-BR110

Se añadieron células tumorales (10^{5} células/ml) en medio de crecimiento a placas de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano (0,1 ml/pocillo) y se incubaron a 37ºC durante 16 horas. Se prepararon diluciones de BR110 sFv-PE40 o BR110-BD1 en RPMI sin leucina (medio de ensayo) y a cada pocillo se añadieron 0,1 ml durante 20 horas a 37ºC (para BR110 sFv-PE40) o durante 20 y 44 horas (para BR110-BD1). A las células se añadió leucina-[^{3}H] en pulsos (1 \muCi/pocillo) durante otras 4 horas a 37ºC. Las células se lisaron mediante congelación-descongelación y se recogieron usando un cosechador celular Tomtec (Orange, CT). La incorporación de leucina-[^{3}H] en la proteína celular se determinó usando un contador de centelleo líquido LKB Beta-Plaque.

Al estudio de citotoxicidad de BR110-BD1 de 48 horas se añadió un exceso de IgG de BR110 (50 \mug/ml), para demostrar la especificidad BR110 en el ensayo. A excepción de la adición de la IgG de BR110, el ensayo se realizó exactamente como se ha indicado anteriormente.

TABLA 6 Citotoxicidad a 24 horas de BR110 sFv-PE40 y análisis con FACS de las líneas celulares seleccionadas

Línea celular	CE_{50} de BR110 sFv-PE40	Proporción de unión de
		BR110 por FACS
H2987	0,7 ng/ml	18,28
MCF-7	2,85 ng/ml	13,17
H3396	9 ng/ml	17,1
H2981	> 1 \mug/ml	1

TABLA 7 Actividad del conjugado IgG de BR110-SMPT-BD1 sobre varias líneas de células de carcinoma. Incubación de 24 y 48 horas

Línea celular	FACS	24 h	48 h	48 h + BR110
	(BR110)	CE_{50} (\mug/ml)	CE_{50} (\mug/ml)	(50 \mug/ml)
H3619	33	0,07	0,06	2
H2987	20	0,1	0,001	4
MCF-7	15	5	0,05	>5
H3396	12	nr	0,09	>5
H2981	1	> 5	> 5	>5
nr= no realizado

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7

8

Claims (32)

1. Un anticuerpo monoclonal que se une al antígeno GA733-1, teniendo dicho anticuerpo un sitio de combinación de antígeno que inhibe de forma competitiva la unión del anticuerpo monoclonal BR110 producido por un hibridoma designado con el nº ATCC HB11698 al antígeno GA733-1.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo preferentemente se une a tejido tumorigénico de un linaje celular pero no se une a tejido normal del mismo linaje.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo forma un complejo con el antígeno GA733-1 y se internaliza en una célula cuando el antígeno GA733-1 se localiza en la superficie celular.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une a tejido de carcinoma de colon pero no se une a tejido intestinal normal.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une a tejido de carcinoma de mama pero no se une a tejido mamario normal.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo no se une a tejido normal hepático, mamario o de tiroides.

7. Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un hibridoma designado con el nº ATCC HB11698.

9. Un conjugado que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 unido a al menos una porción de un agente citotóxico, incluyendo la porción al menos un segmento funcionalmente activo.

10. El conjugado de la reivindicación 9, en el que el agente citotóxico es una enzima, una linfoquina, una oncostatina o una toxina.

11. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 marcado con un indicador seleccionable.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11, en el que el indicador seleccionable es una enzima, un isótopo paramagnético, biotina, un fluoróforo, un cromóforo, un metal pesado o un radioisótopo.

13. Una molécula Fv que tiene el sitio de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1.

14. La molécula Fv de la reivindicación 13, que es una molécula sFv.

15. Una molécula Fab que tiene el sitio de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1.

16. Una molécula Fab' que tiene el sitio de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1.

17. Una molécula F(ab')_{2} que tiene el sitio de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1.

18. Un anticuerpo biespecífico con una especificidad de unión para dos antígenos diferentes, uno de los sitios de combinación antigénica de los cuales se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1.

19. Un anticuerpo recombinante humano/murino, cuya región de unión al antígeno inhibe de forma competitiva la unión inmunoespecífica del anticuerpo monoclonal BR110 producido por hibridoma nº ATCC HB 11698 a su antígeno objetivo.

20. Un procedimiento para detectar el antígeno reconocido por BR110 en una sección de tejido de un sujeto, que comprende poner en contacto la sección de tejido con el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 en condiciones tales que el anticuerpo se una a la sección de tejido y que se detecte el anticuerpo unido a la sección de tejido y, por tanto, que se detecte el antígeno reconocido por BR110 en la sección de tejido.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que la sección de tejido es de un tejido en el que el tejido normal se caracteriza por la ausencia del antígeno reconocido por BR110 y el tejido neoplásico se caracteriza por la presencia del antígeno reconocido por BR110.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el tejido es un adenocarcinoma, un tejido gastrointestinal, un tejido mamario, un tejido de colon o un tejido de pulmón.

23. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la detección comprende poner en contacto el anticuerpo monoclonal con un segundo anticuerpo que está marcado con un indicador detectable.

24. Un procedimiento para determinar una diferencia en la cantidad y la distribución del antígeno reconocido por BR110 en secciones de tejido procedentes de un tejido neoplásico que se va a someter a pruebas respecto de la cantidad y distribución del antígeno reconocido por BR110 en secciones de tejido procedentes de un tejido normal, procedimiento en el cual se aplica al menos un anticuerpo de la reivindicación 1 a 6.

25. Uso de un anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 10-11 en un procedimiento de diagnóstico de un trastorno neoplásico en un sujeto.

26. Una composición que comprende un anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, a la cual se une un agente detectable.

27. La composición de la reivindicación 26, en la que el agente detectable comprende una toxina seleccionada de un grupo formado por ricino, toxina diftérica, briodina, exotoxina A de pseudomonas, abrina, suporina y gelonina.

28. La composición de la reivindicación 26, en la que el agente detectable comprende una enzima, un fármaco o un fragmento de ADN.

29. Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

30. Un plásmido que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 29.

31. Un sistema de vector huésped que comprende un plásmido de la reivindicación 30 en una célula huésped adecuada.

32. Un procedimiento para producir una proteína que comprende hacer crecer el sistema de vector huésped de la reivindicación 31 para producir la proteína en el huésped y recuperar la proteína producida de este modo.