NO321548B1 - Monoklonalt antistoff som binder seg til GA733-1-antigen, hybridom, konjugat, humant/muse-rekombinant antistoff, nukleinsyremolekyl, plasmid, vertsvektorsystem samt fremgangsmate for fremstilling av et protein. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omfatter monoklonalt antistoff som binder seg til GA733-1-antigen, hybridom, konjugat, humant/muse-rekombinant antistoff, nukleinsyremolekyl, plasmid, vertsvektorsystem samt fremgangsmåte for fremstilling av et protein.

Oppfinnelsens bakgrunn

Cancer inkluderer et bredt område av sykdommer som rammer 1 av 4 mennesker i hele verden. Uttrykt ved antall rammede mennesker utgjør cancer et alvorlig medisinsk problem. På grunn av problemets alvorlighet og dets innvirkning på samfunnet verdsettes terapeutiske og diagnostiske midler rettet mot cancer meget høyt. Antistoffer mot humane tumorassosierte antigener er nye teknologiske landevinninger som er lovende som viktige terapeutiske og diagnostiske midler mot visse cancere.

Antistoffer mot humane tumorassosierte antigener er velkjente og grundig beskrevet. Et slikt tumorassosiert antigen er betegnet GA733-2-antigen. GA733-2-antigenet har en molekylvekt på ca. 34-40 kD og er et medlem av en familie av GA733-antigener (Linenbach et al., PNAS USA 86:27-31 (1989)). Den biologiske funksjon til GA733-2-antigenet er ukjent (internasjonal publikasjon nr. WO 93/0829, publisert 29. april 1993) .

Ved anvendelse av DNA-proben fra GA733-2, var forskere i stand til å screene et genomisk bibliotek og iso-lere en homolog sekvens betegnet GA33-1. Fra GA733-l-genet var forskere i stand til å uttrykket antigenet. Ingen hadde imidlertid bestemt hvorvidt antigenet var et tumorassosiert antigen.

Det faktum at GA733-1-genet ble isolert fra et genomisk bibliotek ga ytterligere usikkerhet om hvorvidt genet og det kodede antigen vanligvis befant seg på normale celler, tumorceller eller begge, og hvor ofte de ble funnet. Molekyl-vekten og funksjonen av GA733-1-antigenet er ukjent. GA733-1-antigenet inneholder multiple epitoper, og et segment av DNA som koder for GA733-1 er kjent (US patent nr. 5 185 254,

supra).

GA733-2-antigenet gjenkjennes av et monoklonalt antistoff betegnet MoAb GA733 (også kjent som GA733-2-antistoff)

(Herlyn, et al., Hybridoma, 5:S3-S10 (1986)). MoAb GA733 er blitt evaluert for diagnose og terapi av humane gastro-intestinaltumorer. Det oppviser tumoricidale karakteristika. Til tross for det faktum at GA733-1 og GA733-2 deler 49 % homologi i aminosyresekvens (US patent nr. 5 185 254, bevilget 9. februar 1993), binder MoAb GA733 GA733-2-antigenet, men binder ikke GA733-1-antigenet. MoAb GA733 binder normale epitelceller.

Flere uavhengig avledede monoklonale antistoffer, i tillegg til GA733, slik som C017-1A, M77, M79, 323/A3, gjenkjenner og binder alle GA733-2-antigenet (internasjonal publikasjon nr. WO 93/0829, supra). Monoklonalt antistoff C017-1A (også kjent som 17-lA-antistoff) bindes til GA733-2-antigen, men gj enkj enner og binder ikke GA733 -1-antigenet.

INT. J. CANCER, vol. 55,- 1993, s. 938-946, Stein R. et al., "Specificity and properties of Mab RS7-3G11 and the antigen defined by this pancarcinoma monoclonal antibody" beskriver en metode for å bestemme forskjeller i GA733-1-distribusjon mellom normalt og neoplastisk vev. Videre beskrives antistoffer RS7 som binder antigen tilsvarende BR110 i foreliggende søknad. INT. J. CANCER: Supplement, vol. 8, - 1994, s. 60-63, De Leij. L. et al., "SCLC-cluster-2 antibodies detect the pancarcinoma/epithelial glycoprotein EGP-2" omhandler SCLC-gruppe-2-antistoffer med spesifisitet for antigenet GA733-2. Videre omtales også SCLC-gruppe-13-antistoffer med GA733-l-spesifisitet. INT. J. CANCER: Supplement, vol. 8. - 1994, s. 98-102, Stein R., et al., "Characterization of cluster 13: The epithelial/carcinoma antigen recognized by Mab RS7" beskriver også antistoffet RS7 som binder antigen tilsvarende BR110, men med spesifisitet for det nærliggende antigenet, GA733-2 til GA733-1. EP 0 376 746 A2 omhandler DNA-sekvens som koder for GA733-1-antigenet.

Det finnes i dag ingen kjente monoklonale antistoffer rettet mot GA733-1-antigenet. BR110-ligandene ifølge foreliggende oppfinnelse gjenkjenner og binder GA733-1-antigenet og opptas i cellers indre etter binding til antigen. BR110-ligandene ifølge foreliggende oppfinnelse synes dessuten å oppvise tumoricidal aktivitet.

Antistoffer som opptas i cellers indre er sjeldne. Det foreligger i dag et behov ved terapeutiske anvendelser for slike antistoffer som "opptas i cellers indre", dvs. antistoffer som lett opptas av tumorceller som de bindes til. Slike antistoffer kan f.eks. kobles til biologiske og/eller kjemiske midler som kun er effektive når de transporteres inn i cellen.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter monoklonalt antistoff som binder seg til GA733-1-antigen, kjennetegnet ved at antistoffet inneholder et antigenbindingssete som kompetitivt inhiberer bindingen av monoklonalt antistoff BR110 produsert et hybridom betegnet ATCC nr. HB11698, til GA733-1-antigenet.

Også omfattet av oppfinnelsen er hybridom, kjennetegnet ved at den produserer det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter oppfinnelsen konjugat, kjennetegnet ved at det omfatter antistoffet ifølge oppfinnelsen bundet til minst en del av et cytotoksisk middel, idet delen inkluderer minst ett funksjonelt aktivt segment.

Oppfinnelsen omfatter videre humant/muse-rekombinant antistoff, kjennetegnet ved at dets antigen-bindingsområde kompetitivt inhiberer den immunspesifikke binding av monoklonalt antistoff BR110 produsert av hybridom med ATCC nr. HB11698 til dets målantigen.

Også omfattet av oppfinnelsen er nukleinsyremolekyl, kjennetegnet ved at det koder for antistoffet ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter oppfinnelsen plasmid, kjennetegnet ved at det omfatter nukleinsyremolekylet ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen omfatter også vertsvektorsystem, kjennetegnet ved at det omfatter et plasmid ifølge oppfinnelsen i en egnet vertscelle.

Endelig omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et protein, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av vertsvektorsystemet ifølge oppfinnelsen for å produsere proteinet i verten og gjenvinning av det således produserte protein.

BR110-ligandene, f.eks. BR110-monoklonale antistoffer, tilfredsstiller de terapeutiske og diagnostiske behov diskutert ovenfor.

BR110-ligander har felles karakteristika. Hver BR110-ligand vil f.eks. spesifikt gjenkjenne og finne BRllO-antigene.t og er rettet mot minst en del av epitopen som det monoklonale antistoff BR110 (ATCC nr. 11698) er rettet mot.

I en utførelsesform av oppfinnelsen er BR110-liganden det monoklonale antistoff BR110 (ATCC nr. 11698). En annen utførelsesform av BR110-liganden er dessuten humant/muse-rekombinant antistoff, hvis antigenbindende område kompetitivt inhiberer den immunspesifikke binding av monoklonalt antistoff BR110 produsert av hybridom HB 11698, til dets målantigen.

Kort beskrivelse av figuren

Figur 1 er en grafisk fremstilling av plasmid pSE 70.0.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Definisjoner

Som anvendt i foreliggende søknad har de følgende ord eller uttrykk de angitte betydninger.

Som anvendt heri inkluderer "ligand" et intakt antistoffmolekyl og ethvert molekyl som inneholder minst ett antigenbindende område eller en del derav (dvs. den variable del av et antistoffmolekyl), f.eks. et Fv-molekyl, Fab-molekyl, Fab'-molekyl, F (ab') 2-molekyl, et bispesifikt antistoff, et fusjonsprotein eller ethvert genetisk konstruert molekyl som spesifikt gjenkjenner og binder BR110-antigenet.

Som anvendt heri betegner "antigenbindingsområde" en del av molekylet som gjenkjenner målantigenet.

Som anvendt heri betegner "kompetitivt inhiberer" å være i stand til å gjenkjenne og binde et determinantsete som det monoklonale antistoff BR110 er rettet mot ved anvendelse av konvensjonelle resiproke antistoffkonkurranseanalyser.

(Belanger L., Sylvestre C og Dufour D (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15).

Som anvendt heri er "målantigenet" antigenet GA733-1 eller deler derav.

Som anvendt heri betegner "forbundet" å binde to eller flere vanligvis separate enheter eller segmenter via en kovalent binding eller en ikke-kovalent binding.

Som anvendt heri betegner "funksjonelt aktivt" den del av molekylet som er i stand til å gjenkjenne og binde sitt mål.

Som anvendt heri betegner "biologisk eller kjemisk aktivt molekyl" ethvert biologisk eller kjemisk molekyl som kan inhibere eller stanse cellevekst, eller ellers virke til skade for cellen.

Som anvendt heri betegner et "immunkonjugat" ethvert molekyl eller ligand, slik som et antistoff som er kjemisk eller biologisk bundet til et cytokin, et radioaktivt middel, enzym, toksin, et antitumor-legemiddel eller et terapeutisk middel. Antistoffet kan være bundet til cytotoksinet, det radioaktive middel, antitumor-legemidlet eller det terapeutiske middel på ethvert sted langs molekylet, så lenge som det er i stand til å binde sitt mål. Eksempler på immunkonjugater inkluderer kjemiske antistoff-toksin-konjugater og antistoff-toksin-fusj onsproteiner.

Som anvendt heri er en "effektiv mengde" en mengde av antistoffet, immunkonjugatet eller det rekombinante molekyl som dreper målceller eller inhiberer proliferasjonen av disse.

Som anvendt heri betegner et "fusjonsprotein" ethvert kimært protein hvori et antigenbindingsområde er bundet til et biologisk aktivt molekyl, f.eks. toksin, enzym eller protein-legemiddel.

Den etterfølgende beskrivelse bidrar til en mer fullstendig forståelse av foreliggende oppfinnelse.

A. Ligandene ifølge oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ligander som opptas i det indre av celler (dvs. BR110-ligander) som spesifikt gjenkjenner og binder BR110-antigenet.

Liganden kan foreligge i enhver form, så lenge som det inneholder et antigenbindingsområde som kompetitivt inhiberer den immunspesifikke binding av monoklonalt antistoff BR110 produsert av hybridom HB11698 til sitt målantigen. Ethvert rekombinant protein (f.eks. fusjonsproteiner hvori antistoffet er kombinert med det andre protein, slik som et lymfokin eller en tumorinhiberende vekstfaktor) som har den samme bindingsspesifisitet som BRllO-antistoffet, faller således innenfor rammen for foreliggende oppfinnelse.

I en utførelsesform av oppfinnelsen er liganden et monoklonalt antistoff BR110. Hybridomen som produserer det monoklonale antistoff BR110 er blitt deponert under bestem-melsene i Budapestavtalen den 10. august 1994, hos the American Type Culture Collection ("ATCC"), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, og er blitt identifisert med ATCC aksesjonsnummer: HB 11698.

Liganden kan modifiseres, dvs. ved hjelp av aminosyremodifikasjoner innen molekylet, for å produsere derivatmolekyler. Kjemisk modifikasjon kan også være mulig.

Derivatmolekyler vil bibeholde polypeptidets funksjonelle egenskap, nemlig at molekylet med slike substitusjoner fremdeles vil tillate binding av polypeptidet til GA733-1-antigenet eller deler derav.

Disse aminosyresubstitusjoner inkluderer, men er ikke nødvendigvis begrenset til, aminosyresubstitusjoner kjent i teknikken som "konservative".

Det er f.eks. et veletablert prinsipp i protein-kjemien at visse aminosyresubstitusjoner, betegnet "konservative aminosyresubstitusjoner", ofte kan utføres i et protein uten å endre verken konformasjonen eller funksjonen av proteinet.

Slike endringer inkluderer substitusjon av enhver av isoleucin (I), valin (V) og leucin (L) med enhver annen av disse hydrofobe aminosyrer; asparaginsyre (D) med glutaminsyre

(E) og vice versa; glutamin (Q) med asparagin (N) og vice versa; og serin (S) med treonin (T) og vice versa. Andre substitusjoner kan også betraktes som konservative, avhengig av omgivelsene til den spesielle aminosyre og dens rolle i den tredimensjonale struktur av proteinet. Glysin (G) og alanin (A) kan f.eks. ofte utbyttes med hverandre, på samme måte som alanin og valin (V).

Metionin (M), som er forholdsvis hydrofob, kan ofte utbyttes med leucin og isoleucin, og noen ganger med valin. Lysin (K) og arginin (R) kan ofte utbyttes med hverandre på steder hvor aminosyrerestens signifikante trekk er dens ladning, og de forskjellige pK-verdier av disse to aminosyrerester ikke er signifikant. Ytterligere andre endringer kan betraktes som "konservative" i spesielle omgivelser.

B. Fremgangsmåter for fremstilling av ligandene

Ligander inkluderer (1) monoklonale antistoffer og fragmenter derav, (2) rekombinante molekyler som inneholder minst ett antigenbindingsområde eller en del derav, f.eks. et Fv-molekyl, Fab-molekyl, Fab<1->molekyl, F (ab' )2-molekyl, et bispesifikt antistoff, et fusjonsprotein eller (3) ethvert genetisk konstruert molekyl som alle spesifikt gjenkjenner og binder BRU0-antigenet.

Monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen

Hybridomer som produserer de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen produseres ved å følge generelle prosedyrer beskrevet av Kohler og Milstein ( (1975) "Continuous culture of fused cells secreting antibody of defined specificity." Nature 256, 495-497) med noen modifikasjoner (M. Yeh et al., "Cell Surface Antigens of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibody", Proe. Nati. Acad. Sei. (USA, 76(6):297-31 (1979); og Yeh et al., "A Cell-surface Antigen Which is Present In the Ganglioside Fraction And Shared By Human Melanomas", Int. J. Cancer, 29:269-75 (1982)). Ved denne prosedyre fremstilles hybridomer ved å fusjonere antistoff-produserende celler (typisk miltceller fra mus som tidligere er immunisert med et immunogen) til celler fra en udødelig

■tumorcellelinje ved anvendelse av somatisk celle-hybridiser-ingsprosedyrer.

De nye monoklonale antistoffer beskrevet heri ble dannet ved å immunisere mus med neuraminidaseforbehandlede H3922-humane brystkarsinomcelier. For immunisering med H3922-humane brystkarsinomceller inokuleres dyrene intraperitonealt minst én gang med IO<1> celler av immunogenet. Dyrene forsterk-ningsinjiseres deretter to eller flere ganger med immunogen. Miltene uttas fra dyrene flere dager etter den siste forsterk-nings injeksjon og en miltcellesuspensjon prepareres for fusjon, ved anvendelse av kjente fusjonsteknikker, med muse-myelomceller.

Hybridomene fra fusjonsprosessen tillates å vokse. De resulterende supernatanter screenes deretter ved anvendelse av immunanalyseprosedyrer for å påvise antistoffer i supernatantene som er i stand til å binde det spesifikke antigen (Hardy RR (1986) Purification and characterization of monoclonal antibodies. I: Weir DM og Herzenberg LA (red.) Handbook of Experimental Immunology, 4. utg., vol. 1, s. 13, Oxford: Blackwell Scientific Publications; Engvall E og Perlmann P

(1971) Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8, 871) .

Rekombinante proteiner

Det er rutinemessig å fremstille rekombinante proteiner som er i stand til å bindes til den samme antigene determinant som BRllO-antistoffet. Identifikasjon av rekombinante proteiner som gjenkjenner det samme bindingssete involverer kun oppstilling av kompetitive analyser hvori antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse konkurrerer med et annet antistoff for målet (Belanger L, Sylvestre C og Dufour D (1973) Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15). Kompetitiv analyser er rutinemessige og deres protokoller er veletablerte (E. Harlow og D. Lane, red., "Antibodies a laboratory manual" 1988, s. 567-577).

Klasse, isotype og andre varianter av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse som inneholder antigenbindingsområdet til BR110-antistoffet, kan konstrueres ved anvendelse av rekombinante klasseskiftings- og fusjonsteknikker som er kjent i teknikken. (Winter G og Milstein C (1991) Man-made antibodies. Nature 349, 293-299. Pluckthun A (1991) Antibody engineering: advancees from the use of Escherichia coli expression systems. Bio/Technology 9, 545-551. Moore GP (1989) Genetically engineered antibodies Clinical Chemistry 35, 1849-1853) .

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer BR110-fusjonsproteiner. Generelle teknikker for konstruksjon av ekspresjonsvektorer for fusjonsproteiner er veletablerte (Ernst Winnacker, "From Genes to Clones: Introduction to Gene Technology", kapittel 7, 1987, s. 239-317). En generell metode for konstruksjon av ekspresjonsvektorer som dirigerer syntesen av fusjonsproteiner er f.eks. som følger.

Startmaterialet kan være en cDNA-klon hvori genet av interesse er blitt fjernet fra en vektor. Ved anvendelse av kjente metoder i teknikken plasseres et restriksjonssete i nærheten av et startkodon. Det neste trinn er et spaltings-trinn som vil spalte DNA-fragmenter asymmetrisk. Den oppnådde blanding av DNA-fragmenter blir deretter klonet i en vektor. Et spaltingssete må selvsagt være til stede i polylinkeren til den valgte vektor. Fordi et bredt spektrum av vektorer er til-gjengelige vil det ikke være vanskelig å finne en egnet vektor som inneholder det ønskede spaltingssete. Når en egnet klon er identifisert kan spaltingssetet anvendes for innføyelse av genet av interesse som kan erholdes fra den opprinnelige cDNA-klon.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer kimære BR110-proteiner. Fremstilling av kimært BRllO-protein som er i stand til binding til den samme antigendeterminant som BRllO-antistoffet, er rutinemessig (Morrison, S. L., Johnson, M. J. Herzenberg, L. A., og Oi, V. T. (1984). Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 6851-6855, Morrison, S. L. (1985) . Transfektomer tilveiebringer nye kimære antistoffer (Science 229, 1202-1207).

Genteknikk kan anvendes for å danne kimære immun-globuliner ved (1) kombinasjon av det variable tunge gensegment (VH) fra gnager med humane tung-kjede konstant område-gensegmenter for å fremstille tung-kjede-genkonstruksjonen, (2) binding av det variable lette (VL) gensegment fra gnager til et humant konstant lett (Cj ekson, for å danne lett-kjede-genkonstruksjonen, og (3) transfeksjon av både tung- og lett-kjede-genkonstruksjonene i en myelomcellelinje (Fell et al., i Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:8507-8511 (1989); Morrison, S. L., Johnson, M. J., Herzenberg, L. A. og Oi, V. T. (1984). Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:6851-6855).

I prinsipp kan ethvert variabelt domene fra gnager pares enhver human konstant område-isotype, slik at den optimale kombinasjon av antigenspesifisitet og effektorfunksjoner (slik som komplementfiksering og ADCC (antistoff-avhengig cellemediert cytotoksisitet) kan utvelges (Morrison, S. L. (1985) . Transfectomas provide novel chimeric antibodies. Sicence 229, 1202-1207).

Hvis nødvendig kan finavstemming av konstruksjonene oppnås ved å innføres punktmutasjoner i de variable område-gensegmenter som endrer affiniteten av det kimære antistoff for dets ligand (Kunkel, T. A., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 32;488-492; Kunkel, T. A., et al., 1987, Methods Enzymol. 154:367-382).

For å redusere eller eliminere alle musekjennetegn hos BR110-liganden, kan det produseres humaniserte versjoner ved anvendelse av molekylære manipulasjoner og transfektomteknologi (Co, M. S., Deschamps, M. Whitley, R. J. og Queen, C. (1991). Humanized antibodies for antiviral therapy. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88, 2869-2873).

Forskjellige humane tung kjede-isotyper kan utvelges for det humaniserte antistoff, avhengig av den ønskede terapeutiske effekt, når f.eks. destruksjon av målcellen er ønsket kan det humane IgGl-konstante område utvelges, fordi det gjenkjennes av FcgR I, FcgR II og FcgR III, og formidler ADCC (Anderson, C. L. og Looney, R. J. (1986). Human leukocyte

IgG Fe receptors. Immunol. Today 7, 264-266).

Kimære antistoffer med forskjellige effektorfunksjoner er blitt produsert ved å binde forskjellige sekvenser til de som koder for antigenbindingsområdet. Disse forskjellige sekvenser inkluderer enzymer (Neuberger et al., Nature 312:604 (1984)), immunglobulin-konstante områder fra andre arter og konstante områder av en annen immunglobulin-kjede (Sheron et al., Nature 309:364 (1984); Tan et al., J. Immunol. 135:3565-3567 (1985)).

I andre situasjoner, slik som ved diagnostisk av-bildning, antistoff-reseptorblokkering eller antistofformidlet legemiddelutlevering, kan isotyper som binder Fc-reseptorer dårlig (eller ikke i det hele tatt) og/eller er forholdsvis ineffektive ved komplementmediert lysis (slik som IgG2, IgG4 eller IgA), kan være de valgte isotyper.

Molekylære manipulasjoner og transfektomteknologi er populære midler for å "humanisere" gnagerantistoffer med interessante spesifisiteter. Disse gnager-humane-kimære antistoffer er forventet å være mindre antigene og mer anvendelige i human terapi (Co, M. S., Deschamps, M., Whitley, R. J. og Queen, C. (1991). Humanized antibodies for antiviral therapy. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88, 2869-2873).

Et generelt eksempel på en prosedyre som kan anvendes for å produsere kimære antistoffer involverer de følgende trinn: a) identifikasjon og kloning av det korrekte gensegment som koder for antigenbindingsdelen av antistoff-molekylet; dette gensegment (kjent som VDJ, variable, mangfoldighets- og bindingsområder for tunge kjeder eller VJ, variable, bindingsområder- for lette kjeder eller ganske enkelt som V eller det variable område) kan foreligge i enten cDNA- eller genomisk form; b) kloning av gensegmentene som koder for det konstante område eller en ønsket del derav; c) ligering av det variable område til et konstant område, slik at det komplette kimære antistoff kodes for i en form som kan transkriberes og translateres; d) ligering av denne konstruksjon i en vektor som inneholder en utvelgbar markør og genkontro11områder, slik som promotorer, enhancere og poly(A)addisjons-signaler; e) ampiifikasjon av denne konstruksjon i bakterier; f) innføring av dette DNA i eukaryote celler (transfeksjon), oftest pattedyrlymfocytter; g) utvelgelse med hensyn til celler som uttrykker den utvelgbare markør; h) screening for celler som uttrykker det ønskede kimære antistoff; og

k) testing av antistoffet for korrekt bindingsspesifisitet og effektorfunksjoner.

Andre prosedyrer for fremstilling av kimære antistoffer er velkjente i teknikken.

Identifikasjon av kimære antistoffer som gjenkjenner bindingssetet for BR110-antistoffet er rutinemessig, f.eks, ved hjelp av kompetitive analyser (E. Harlow og D. Lane, red., "Antibodies a laboatory manual" 1988, s. 567-577.

Det BR110-monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan også fremstilles ved kjemisk konjugasjon av de variable områder av BR110-liganden og et humant konstant område ved hjelp a kjemiske metoder, f.eks. konjugasjon med (2) disulfiddannende midler som 3-(2-pyridylditio)propionat (SPDP), (2) tioeterbindinger, (3) aktivert klorabucil, (4) syrelabile og fotospaltbare krysslinkere, og (5) avidin-bio-tinbinding {Stevenson, F. K., Bell, A. J., Cusack, R., Hamblin, T. J.f Slade, C. J., Spellberg, M. B., og Stevenson, G. T. (1991) . Preliminære undersøkelser for en immunterapeut-isk metode for behandling av humant myelom ved anvendelse av kimært anti-CD38-antistoff er beskrevet i Blood 77, 1071-1079; S. Wong "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking"

(1993) CRC Press, Inc.).

Andre fremgangsmåter for fremstilling av liganden ifølge foreliggende oppfinnelse er mulige (Liu, A. Y., Robinson, R. R., Murray, E. D. Jr., Ledbetter, J. A., Hellstrom, I., og Hellstrom, K. E. (1987a). Produksjon av et mus-humant kimært monoklonalt antistoff mono CD20 med potent Fc-avhengig biologisk aktivitet er beskrevet i (J. Immunol.

139, 3521-3526).

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer også bispesi-fikke BR110 monoklonale antistoffer. Fremstilling av bispesi-fikke BR110 monoklonale antistoffer som er i stand til å bindes til den samme antigene determinant som BR110-antistoffer er rutinemessig (Haber et al., 1990; Wels, W., Harwerth, I. M., Zwickl, M., Hardmann, N., Groner B., Hynes, N. E. (1992), konstruksjon, bakteriell ekspresjon og karakterisering av et bifunksjonelt enkeltkjedet antistoff-fosfatase-fusjonsprotein målrettet mot den humane ERBB-2-reseptor er beskrevet i Biotechnology 10:1128-1132; A. Traunecker et al.

(1991) EMBO Journal 10(12):3655-3659).

BR110 antistoffragmenter

BR110 antistoffragmenter inkluderer Fv-molekyl, Fab-molekyl, Fab1 -molekyl og F (ab1) 2-molekyl.

Muse-BRllO-ligand ATCC nr. 11698 kan renses ved affinitetskromatografi fra en muse-ascitesvæske. F (ab') 2-f rag-menter kan dannes ved spalting av renset BR110 monoklonalt antistoff med pepsin i overensstemmelse med Lamoyi, "Preparation of F(ab')2 Fragments from Mouse IgG of Various Subclasses", Meth. Enzymol. 121:652-663 (1986).

F (ab *) 3-fragmenter kan alternativt produseres ved hjelp av genteknologi ved anvendelse av rutinemetodikker (Mayforth R. S., Quintans, J. (1990) Current Concepts: Designer and catalytic antibodies. New Eng. J. Med. 323:173-178; Waldmann, T. A. (1991) Man-made Antibodies. Nature 349:293-299; Morrison, S. L. (1992) In Vitro antibodies: strategies for production and application. Ann. Rev. Immunol. 10:239-266; Haber et al., 1990; Wels, W., Harwerth, I. M., Zwickl, M., Hardman, N., Groner B., Hynes, N. E. (1992) Construction, bacterial expression and characterization of a bifunctional single-chain antibody phosphatase fusion protein targeted to the human ERBB-2 receptor. Biotechnology 10:1128-1132; A. Traunecker et al. (1991) EMBO Journal 10(12):3655-3659). ;Binding av hel BRllO-ligand kan skjelnes fra binding av F (ab1) 2-fragmenter ved anvendelse av pepperrotperoksidase ;(HRP)-konjugert protein A som bindes til hele antistoffet, men ikke til F (ab1)2-fragmentene. ;BR110 Fab-fragmenter kan produseres ved proteolytisk spaltning av det intakte BRllO-antistoff ved anvendelse av f.eks. papain (Parham, P., 1986 Preparation and purification of active fragments from mouse monoclonal antibodies. I "Handbook of experimental immunology. In four volumes" Volume 1 "Immunochemistry" (Red. D. W. Weir et al.) s. 14.1-14.23, Blackwell Scientific Publishers, Oxford). Parham P (1986) Preparation and purification of active fragments from mouse monoclonal antibodies. I: Weir DM og Herzenberg LA (red) Handbook of Experimental Immunology, 4. utgave, vol. 1, s. 14. Oxford: Blackwell Scientific Publications). ;Alternativt kan Fab-fragmenter produseres ved hjelp av genteknologi ved anvendelse av rutineteknikker (Huse et al. 1989 "Generation of a large combinatorial libary of the immunoglobulin receptor in phage lambda" Science 246:1275-1281) . ;Protokoll for konstruksjon og rensing av BRllO- ligand-konjugater og fusjonsproteiner ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer BR110-immun-kon jugater som omfatter en BR110-ligand forbundet med minst en del av et biologisk eller kjemisk aktivt molekyl (Batra et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:8545-8549 (1989); Kondo et al., J. Biol. Chem. 263:9470-9475 (1988); og Batra et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:8545-8549 (1989). Det biologisk eller kjemisk aktive molekyl, slik som et cytotoksisk middel, kan inhibere eller stanse cellevekst eller på annen måte virke skadelig for cellen. ;I overensstemmelse med utøvelse av foreliggende oppfinnelse inkluderer biologisk eller kjemisk aktive molekyler, men er ikke begrenset til, et enzym, lymfokin, et toksin, en paramagnetisk isotop, biotin, en fluorofor, en kromofor, et tungmetall, en radioisotop eller et kjemoterapeutisk middel. Egnede eksempler på toksiner inkluderer, men er ikke begrenset til, Pseudomonas eksotoksin, ricin, bryodin og difteritoksin. Ytterligere eksempler inkluderer bleomycin, daktinomycin, daunorubicin, doksorubicin, mitoksantron, mitomycin, cisplatin og prokarbazin. ;Kjente genteknologiske teknikker kan anvendes som beskrevet heri for å fremstille rekombinante immuntoksiner produsert ved ligering av en DNA-sekvens som koder for et antigenbindingsområde av BR110 med en DNA-sekvens som koder for et biologisk eller kjemisk aktivt molekyl på DNA-nivået, og ekspresjon av det cytotoksiske molekyl som et rekombinant protein i en transformert vertscelle. Rekombinante immuntoksiner er homogene molekyler som bibeholder spesifisiteten til cellebindingsdelen av BR110-antistoffet med toksinets cytotoksiske potensial (Kondo et al., J. Biol. Chem. 263:9470-9475 (1988); Siegall et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:9738-9742 (1988) Pastan, I., og FitzGerald, D. (1991). Recombinant toxins for cancer treatment. Science 245, 1173-1177. Pastan, I., Willingham, M. C. og FitzGerald, D. J. ;(1986). Immunotoxins. Cell 47, 641-648). ;Rekombinante immunkonjugater, spesielt enkeltkjedete immunkonjugater, har en fordel i forhold til legemiddel/anti-stoffkonjugater ved at de fremstilles lettere enn disse konjugater og danner en populasjon av homogene molekyler, dvs. enkle polypeptider sammensatt av de samme aminosyrerester (Trail, P. A. et al., Cure of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubicin immunoconjugates. Science, 261:212-215, 1993). Når det biologisk eller kjemisk aktive molekyl er toksin eller legemiddel er konjugatet mer potent enn dets ikke-konjugerte motpart. ;D. Anvendelser av ligandene ;Foreliggende beskrivelse tilveiebringer en fremgangsmåte for påvisning av BRllO-antigen i vevssnitt fra et individ. Individet kan være et menneske, en hest, gris, storfe, mus, hund, katt eller en fugl. Andre varmblodige dyr er også inkludert. ;Fremgangsmåten omfatter at vevssnittene bringes i kontakt med et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen. Betingelsene for kontakt mellom vevssnittene og det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen er slike at bindingen foregår slik at det dannes et kompleks. Etter dannelsen av komplekset kan antigenet påvises ved anvendelse av velkjente og utviklede metoder og kommersielle systemer (Gåtter KC, Falini B og Mason DY (1984) The use of monoclonal antibodies in histopathological diagnosis. Recent Advances in Histo-pathology 12, 35; Boekmann E, Baum RO, Schuldes H, Kramer W, Hertel A, Baew-Christow T, Hanke P. Jonas D og Hor G (1990) Tumor imaging of bladder carcinomas and their metastases with <ul>In-labelled monoclonal anti-CEA antibody BW 431/26. British Journal of Cancer 62 (Suppl.), 81). ;I én utførelsesform er vevssnittet brystvev og det neoplastiske vev er en brystkarsinom. Alternativt er vevet tykktarmsvev og det neoplastiske vev er adenokarsinom. Vevet kan dessuten være lungevev og det neoplastiske vev lungekarsinom. I en annen utførelsesform er dessuten vevet ovarievev og det neoplastiske vev er ovariekarsinom. ;Vevssnittene er generelt fra et vev hvor det normale vev er kjennetegnet ved fravær av lave nivåer av BRllO-antigen og det neoplastiske vev er kjennetegnet ved tilstedeværelse av høye nivåer av BRllO-antigen. ;I overensstemmelse med en utøvelse kan det monoklonale antistoff bundet til vevssnittene påvises direkte ved anvendelse av en markør bundet til antistoffet. Alternativt kan det monoklonale antistoff bundet til vevssnittene påvises ved å bringe det monoklonale antistoff i kontakt med andre antistoff. Det andre antistoff kan være merket med en påvisbar markør. Etter kontakten danner det monoklonale antistoff bundet til vevssnittene et kompleks med det andre antistoff. Komplekset påvises ved å påvise det således bundne andre antistoff. ;Foreliggende beskrivelse tilveiebringer dessuten en fremgangsmåte for bestemmelse av en forskjell i mengden av fordeling av BRllO-antigen i vevssnitt fra et neoplastisk testvev i forhold til mengden og fordelingen av BRllO-antigen i vevssnitt fra et normal vev. Denne fremgangsmåte omfatter at både testvevet og det normale vev bringes i kontakt med det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen, slik at påvisningen kan utføres som beskrevet ovenfor. Etter at påvisningen er utført kan det utføres en bestemmelse av forskjellen i mengden og fordelingen av BRllO-antigen. Denne bestemmelse er en kvantitativ bestemmelse, dvs. telling av antallet påviste antigener, eller en visuell bestemmelse, dvs. bestemmelse av hvilken prøve er mørkere eller lysere eller har en spesiell farge etc. ;Foreliggende beskrivelse tilveiebringer dessuten en fremgangsmåte for diagnostisering av en neoplastisk tilstand hos et individ. I en utførelsesform omfatter denne fremgangsmåte uttak av en vevsprøve fra individet. Vevsprøven bringes deretter i kontakt med antistoffet, slik at tilstedeværelsen av BR110-antigenet i slike vevssnitt vil forårsake dannelse av et kompleks mellom antistoffet og antigenet. Tilstedeværelsen av et kompleks påvises. Dersom det påvises et høyere nivå av komplekset i prøven enn i normalt vev, så er dette nivå en indikasjon på en neoplastisk tilstand og ytterligere tester kan anvises. ;Påvisning av tumor kan alternativt oppnås ved anvendelse av en biologisk væskeprøve for å påvise humant karsinom hos et individ. Serologiske diagnostiske teknikker involverer påvisning og kvantifisering av tumorassosierte antigener som er blitt utskilt eller "utspredt" i serum eller andre biologiske væsker hos pasienter som antas å lide av karsinom. Slike antigener kan påvises i kroppsvæskene ved anvendelse av kjente ;teknikker som radioimmunanalyser (RIA) eller enzymbundne immunsorbentanalyser (ELISA), hvori et antistoff som er reaktivt med det "utspredte" antigen anvendes for å påvise tilstedeværelsen av antigenet i en væskeprøve (Uotila et al., "Two-Site Sandwich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP", J. Immunol. Methods, 42:11 (1981) og Allum et al., supra, s. 48-51). ;Det fremgår fra det foregående at BRllO-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i de fleste analyser som involverer antigen-antistoffreaksjoner. Disse analyser inkluderer, men er ikke begrenset til, standard RIA-teknikker, både flytende og fast fase, så vel som ELISA-analyser, immunfluorescensteknikker og andre immuncytokjemiske analyser (Sikora et al. (red.), Monoclonal Antibodies, s. 32- ;52 (Blackwell Scientific Publications 1984). ;Administrering av BR110- ligander til dyr ;BR110-ligandene kan administreres til dyr i en mengde tilstrekkelig til å redusere proliferasjonen av målceller eller drepe dem fullstendig. Det vil fremgå for fagfolk på området at den optimale plan for administrering av BR110-ligander vil variere basert på individer, individets høyde og vekt og alvorligheten av sykdommen (G. Goodman, et al., J. Clin. Oncol., 8, 1083 (1990). (Nedelman, MA, Shealy DJ, Boulin R, Brunt E, Seasholtz JI, Allen E, McCartney JE, Warren FD, Oppermann H, Pang RHL, Berger HJ og Weisman HF (1993) Rapid infant imaging with a Technetium-99m-labelled anti-myosin recombinant single-chain Fv: evaluation in a canine model of acute myocardial infaretion. Journal of Nuclear Medcine 34, 234. Courtenay-Luck, N. S. og Epenetos, A. A. (1990). Targeting of monoclonal antibodies to tumors. Curr. Opinion Immunol. 2, 880-883). Anvendelsen og administreringsplanen vil til sist avgjøres av den behandlende lege. Kliniske protokoller for bestemmelse av doseringsområde og planlegging er standard. ;Fordeler ved oppfinnelsen ;Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, slik som andre antistoffer som gjenkjenner humane tumorassosierte antigener, er ytterligere medlemmer av arsenalet av diagnostiske og terapeutiske midler for krigen mot sykdom. ;BR110-ligand er ikke kun anvendelig fordi det er et tumorspesifikt antistoff, men også fordi det er et antistoff som kan trenge inn i det indre av celler. Antistoffer av denne type finner anvendelse ved terapeutiske metoder for selektiv celledreping ved anvendelse av antistoff-legemiddel- eller antistoff-toksinkonjugater ("immuntoksiner") hvori et terapeutisk antitumormiddel er kjemisk eller biologisk bundet til et antistoff eller en vekstfaktor for utlevering til tumoren, hvor antistoffet bindes til det tumorassosierte antigen eller reseptor som det er reaktivt med, og "leverer" antitumormidlet inne i tumorcellen (Embleton et al., "Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents", i Monoclonal Antibodies For Cancer ;Detection and Therapy, s. 317-44 (Academic Press, 1985)). ;Eksempel 1 ;Fremstilling av BR110 monoklonalt antistoff ;Det BR110 monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse ble fremstilt ved anvendelse av hybridomfusjons-teknikker, som tidligere beskrevet av M. Yeh et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, (1979), supra og Yeh et al., Int. J. Cancer (1982), supra. ;Kort beskrevet ble BALB/c-immunisert ved anvendelse av H3922 humane brystkarsinomceller (IO<7> celler) som var for-håndsbehandlet med neuraminidase. Musen mottok flere immuni-seringer (6 ganger). Den første gang mottok musene intraperitoneal injeksjon ved anvendelse av RIBI-adjuvans. Den andre til og med den sjette gang ble musene gitt en intraperitoneal injeksjon uten anvendelse av FIBI-adjuvans. ;Det totale antall celler injisert hver gang var ca. IO<7> celler. Fire dager etter den siste immunisering ble milten fjernet og miltceller ble suspendert i RPMI-kulturmedium. Miltcellene ble deretter fusjonert med P2x63-Ag8.653-muse-myelomceller i nærvær av polyetylenglykol (PEG) og celle-suspensjonen ble dyrket i mikrotiterbrønner i selektiv HAT-medium, som beskrevet av Yeh et al., supra [se også Kohler og Milstein, Nature, 256:495-97 (1975), og Eur. J. Immunol., 6:511-19 (1976)] . Blandingen ble sådd for å danne lavdensi-tetskulturer med opprinnelse fra enkle fusjonerte celler eller kloner. ;Supernatantene fra disse hybridomkulturer ble deretter screenet for direkte bindingsaktivitet på cancercelle-1injen H3922 ved anvendelse av en ELISA-analyse som var lignende analysen beskrevet av Douilard et al., "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay For Screening Monoclonal Antibody Production Using Enzyme-Labeled Second Antibody", Meth. Enzymol., 92:168-74 (1983). ;I overensstemmelse med denne analyse immobiliseres antigenet (som antistoffet det screenes for er reaktivt med) på mikrotiterplater, og inkuberes deretter med hybridomsupernatanter. Hvis en supernatant inneholder et ønskede antall stoff vil antistoffet bindes til det immobiliserte antigen og påvises ved tilsetning av et antiimmunglobulin-antistoff-enzymkonjugat og et substrat for enzymet, hvilket fører til en målbar endring av optisk tetthet. ;Ved de foreliggende undersøkelser ble brystcancer-cellelinje H3922 og human fibroblast tilsatt til en 96 brønners vevskulturplate (Costar Camebridge, MA) og inkubert over natten ved 37 °C i en fuktig inkubator, 5 % C02. ;Cellene ble deretter fiksert med 100 ul nypreparert ;2 % paraformaldehyd, inkubert i 15 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av blokkering med prøvefortynningsmiddel (Genetic Systems, Seattle, WA) i én time ved romtemperatur, idet dette er inkubasjonsbetingelsen for hele analysen. Etter vask med PBS ble hybridomsupernatanter eller renset antistoff deretter tilsatt og inkubert i én time. Platene ble vasket med PBS og et andre trinns monoklonalt antistoff (geit-anti-mus IgG/M, Tango Burlingname, CA) fortynnet i kulturmedium (IMDM, Gibco, NY, 10 % FBS) ble tilsatt og inkubert i én time. Etter et vasketrinn ble bufret substrat (Genetic Systems) tilsatt og reaksjonen ble stoppet med stoppreagens (Genetic Systems) etter en inkubasjonstid på 15 minutter. Absorbansen ble avlest ved OD 450/630 nm (Dynatech Microelisa Autoreader). ;Supernatantene fra hybridomkulturene ble deretter tilsatt i en mengde av 100 ml/brønn, brønnene ble inkubert i én time ved romtemperatur og cellene ble vasket tre ganger med PBS. Geit-anti-mus-pepperrotperoksidase (Zymed, CA) fortynnet i 0,1 % BSA og PBS ble deretter tilsatt til en konsentrasjon på 100 ml/brønn. Reaksjonsblåndingen ble inkubert i enten én time ved romtemperatur eller i 30 minutter ved 37 °C, og cellene ble deretter vasket tre ganger med PBS. o-fenylen-diamin (OPD) ble deretter tilsatt i en mengde på 100 ml/brønn og platene ble inkubert i mørke ved romtemperatur i 5- ;45 minutter. ;Antistoffbinding til cellene ble påvist ved en farge-endring i brønnene som inntraff innen 10-20 minutter. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 100 ml/brønn H2S04 og absorbansen ble avlest i en Dynatech (Alexandria, VA) Microelisa autoreader ved 490 nm. ;Denne analyse kan utføres ved anvendelse av dyrkede adherente celler, levende eller fikserte, celler i suspensjon, levende eller fikserte, renset oppløselig antigen og celle-ekstrakter, som det immobiliserte antigen. ;Hybridomer som produserte antistoffer med bindings-reaktivitet til cancercellelinjen H3922 og ikke til humane fibroblaster, ble således utvalgt, klonet og spesifisiteten av subklonene ble bekreftet. Hybridomkulturen ble deretter ekspandert in vi tro for antistoffproduksjon. Som beskrevet ovenfor ble BR110-antistoffet renset fra hybridomsupernatant ved affinitetskromatografi på immobilisert protein A (RepliGen, Cambridge, MA). Den siste formuleringsbuffer var PBS og antistoffet ble sterilfiltrert og lagret nedkjølt eller nedfrosset ved -70 °C. ;Hybridomer som ikke reagerte med PBL ble klonet, ekspandert in vitro og videre testet for antistoffspesi-fisitet. De hybridomer som produserer antistoff som reagerer med human brystcancer ble reklonet, ekspandert og injisert til pristan-primede 3 måneder gamle BALB/c-mus, hvor de vokste som ascitestumorer. ;Ved å følge denne prosedyre ble hybridomcellelinje BR110 erholdt, klonet og injisert i mus for å utvikles som en ascitestumor. Som beskrevet ovenfor er BRllO-hybridomen deponert hos ATCC. ;Monoklonalt BR110-antistoff ble renset fra ascites ved affinitetskromatografi på immobilisert rekombinant protein A (RepliGen, Cambridge, MA). Klaret ascites ble fortynnet med et like stort volum bindingsbuffer (1 M kaliumfosfat, pH 8) og applisert på en protein A-kolonne som tidligere var ekvili-brert med bindingsbuffer. ;Kolonnen ble grundig vasket med bindingsbuffer og antistoffet ble deretter eluert med 50 mM fosforsyre, pH 3. Den rensede antistoffraksjon ble nøytralisert med 1 M tris, pH 9, og deretter dialysert mot fosfatbufret saltvann. Renset BRllO-ligand ble til slutt sterilfiltrert og lagret nedkjølt eller nedfrosset. ;Eksempel 2 ;Karakterisering av BR110- monoklonalt antistoff Isotypebestemmelse ;For å bestemme klassen av immunglobulin produsert av BR110-hybridom ble det benyttet den følgende ELISA-teknikk: Dynatech Immulon 96 brønners plater ble belagt med geit-anti-mus-IgG-underklasse-antistoffer (Southern Biotech, Birmingham, AL) i en konsentrasjon på 1 mg/ml i PBS, og inkubert over natten ved 4 °C. ;Basert på denne prosedyre ble det bestemt at BR110-monoklonalt antistoff er av gamma 2a-isotypen. ;Immunhistologi ;Peroksidase-antiperoksidase (PAP)-teknikken ifølge L. A. Sternberger, som beskrevet i Immunochemistry, s. 104-69 (John Wiley & Sons, New York, 1979) og som modifisert av H. J. Garrigues et al., "Detection Of a Human Melanoma-Associated Antigen, p97, In Histological Sections Of Primary Human Melanomas", Int. J. Cancer, 29:511-15 (1982), ble anvendt for de immunhistologiske undersøkelser. Målvevene for disse tester ble fremskaffet ved operasjon og nedfrosset innen 4 timer etter fjerning ved anvendelse av isopentan som var forhånds-avkjølt i flytende nitrogen. ;Vevene ble deretter lagret i flytende nitrogen, eller ved -70 °C, inntil de ble anvendt. Frysesnitt ble preparert, lufttørket, behandlet med aceton og tørket på nytt [se Garrigues et al., supra]. Snitt som skulle anvendes for histo-logisk evaluering ble farget med hematoksylin. ;For å redusere uspesifikke bakgrunner ble snittene preinkubert med normalt humant serum fortynnet 1/5 i PBS (H. J. Garrigues et al., "Detection Of a Human Melanoma-Associated Antigen, p97, In Histological Sections Of Primary Human Melanomas", Int. J. Cancer, 29:511-15 (1982)). Museanti-stoffer, kanin-anti-mus-IgG og muse-PAP ble fortynnet i en oppløsning av 10 % normalt humant serum og 3 % kaninserum. Kanin-anti-mus-IgG (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD), ble anvendt ved en fortynning på 1/50. Muse-PAP-komplekser (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) inneholdende 2 mg/ml spesifikt renset PAP ble anvendt ved en fortynning på 1/80. ;Fargingsprosedyren består av behandling av seriesnitt med enten spesifikt antistoff, dvs. BR110, eller et kontroll-antistoff, i 2,5 time, inkubasjon av snittene i 30 minutter ved romtemperatur med kanin-anti-mus-IgG fortynnet 1/50, etterfulgt av behandling av snittene med muse-PAP-komplekser fortynnet 1/80 i 30 minutter ved romtemperatur. Etter hver behandling med antistoff ble snittene vasket to ganger i PBS. ;Den immunhistokjemiske reaksjon ble fremkalt ved tilsetning av nypreparert 0,5 % 3,3'-diaminobenzidintetrahydro-klorid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) og 0,01 % H202 i 0,05 M tris buffer, pH 7,6, i 8 minutter (Hellstrom et al., J. Immunol., 127:157-60 (1987)). Ytterligere behandling med en 1 % Os04-oppløsning i destillert vann i 20 minutter intensifi-serte fargen. Snittene ble skyllet med vann, dehydrert i alkohol, klaret i xylen og montert på preparatglass. Parallelle snitt ble farget med hematoxylin. ;Preparatglassene ble alle evaluert under kode og kodete prøver ble kontrollert av en uavhengig forsker. Typiske preparatglass ble fotografert ved anvendelse av differensiell interferenskontrastoptik (Zeiss-Nomarski). Graden av antistof-farging ble evaluert som 0 (ingen reaktivitet), + (noen få svakt positive celler), ++ (1/3 av cellene er positive), +++ ;(de fleste celler er positive), ++++ (hovedsakelig alle celle er sterkt positive). Fordi forskjellene mellom + og 0 farging var mindre fremtredende enn mellom + og ++ farging, ble en farging gradert som ++ eller høyere betraktet som "positiv". Både neoplastiske og stromaceller ble observert i tumorprøver. Den registrerte farging er farging av tumorcellene fordi stromacellene ikke ble farge i det hele tatt, eller de ble farget mye svakere enn tumorcellene. ;Tabell 1 nedenfor viser den immunhistologiske farging av forskjellige tumor- og normale vevsprøver ved anvendelse av BRllO-monoklonalt antistoff. Som det fremgår tydelig fra tabellene reagerer BR110-antistoffet med mange forskjellige humane karsinomprøver. ;Bindinqsanalyser: ;Gjenkjennelse av celleoverflateantigener med det BR110 monoklonale antistoff ble identifisert på forskjellige karsinomcellelinjer ved hjelp av immunfluorescens ved anvendelse av en Coulter Epics C FACS. ;Aliquoter av enkeltcellesuspensjoner ble tilsatt til kulturmedium (IMDM Gibco, NY, 10 % FBS) i en konsentrasjon på 5 x IO<5> til 1 x IO<6> celler. FITC-konjugert BR110 monoklonalt antistoff ble tilsatt til de resuspenderte cellepelleter med en konsentrasjon på 10 ug/ml fortynnet i kulturmedium, etterfulgt av inkubasjon i én time på is. Etter vask av cellene med kulturmedium ble prøvene analysert for gjennomsnittlig fluorescensintensitet. Bindingsforhold ble beregnet ved å dividere den lineære fluorescensekvivalent (LFE) med LFE til den negative kontroll. Resultatene er vist i tabell 4. ;Bestemmelse av antigenbindingssete pr. celle ;Cellebindingsanalyser ble utført med FITC-konjugert BR110 monoklonalt antistoff ved anvendelse av cellelinjer H3619 og H2987, etterfulgt av FACS-analyse. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet ble bestemt ved farging med to gangers fortynninger av antistoff (50 til 0,38 mg/ml). Fluorescerende perler med kjent størrelse og intensitet produserte en standardkurve som ble inkludert i beregningen av fluorescens-ekvivalenter gjennom antistoffbinding. Antallet bindingsseter ble bestemt for begge cellelinjer til 8 x 10<*> seter/celler.

Eksempel 3

Internalisering av BR110

For å bestemme hvorvidt BR110 kunne internaliseres av antigenpositive karsinomceller ble det anvendt indirekte inhiberingsanalyse ved anvendelse av et ricin A-kjede-konjugert antistoff.

Ifølge denne analyse er inhibering av <3>H-tymidin-inkorporering i cellulært DNA et mål på den cytotoksiske effekt av det gitte konjugat og avspeiler internaliseringen av ricin A-kjeden av karsinomcellene.

Karsinomceller ble utspredt i en 96 brønners mikro-titerplate i en mengde av 5 x 10 E3-celler/brønn, etterfulgt av inkubasjon over natten ved 37 °C, 5 % C02. Hybridomsupernatant (ren og 10 gangers fortynning) ble tilsatt til kulturen og inkubert i én time på is. Etter vask med kulturmedium ble et geit-anti-mus-IgG-ricin A-kjede-antistoff (Inland Laboratories, Austin, TX) i en konsentrasjon på 5 mg/ml tilsatt i en inkubasjonstid på 42 timer ved 37 °C, hvoretter 50 ul <3>H-tymidin ble tilsatt i en mengde på 1 mCi/brønn og platen ble inkubert i ytterligere 6 timer ved 37 °C. Analyse-platene ble deretter nedfrosset til -70 °C i flere timer, tinet, og cellene ble oppsamlet på glassfiberfiltere (Wallac, Finland) ved anvendelse av et celleoppsamlingsapparat (Wallac, LKB). Etter tilsetning av scintillasjonstellingsvæske ble filtermassene tellet med en væskescintillasjonsteller (Wallac,

LKB) .

Resultatene er uttrykt som prosent inhibering av <3>H-tymidininkorporering i eksperimentgruppen i forhold til en ubehandlet kontroll, karsinomcellelinje, der H3922 viser 90 % og foreliggende H3396 60 % vekstinhibering etter behandling med monoklonalt antistoff BR110, antistoffet gir bevis på internalisering.

Som en annen metode for å undersøke internalisering av BR110, ble karsinomceller analysert ved konfokal mikroskopi (Leica konfokal laserskanningsmikroskop).

Karsinomceller (H3619, H3396, H3922) dyrket i IMDM/10 % FBS, ble tillatt å adherere til preparatglass (NUNC kammerdekkglass) i 48 timer. Cellene ble plassert ved 4 °C i 15 minutter. FITC-konjugert antistoff BR110 eller FITC-konjugert antistoff geit-anti-mus-IgG (Tago, Burlingname, CA) som en kontroll, ble tilsatt i en konsentrasjon på 10 ug/ml i

én time ved 4 °C. Ubundet antistoff ble fjernet ved omfattende vask med kaldt kulturmedium. For å påvise overflatefarging ble cellene vasket med kald PBS og fiksert med 2 % paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av behandling med antifalmereagens ditioerytritol (Sigma).

For å undersøke internalisering av BR110 ble kulturmedium ved 37 °C tilsatt, og cellene ble inkubert i individu-elle tidsrom (0-3 timer). Inkubasjon ble stanset med kald PBS og etter fiksering. Avbildninger fra det konfokale mikroskop viste at når cellene først ble utsatt for BR110 ved 4 °C ble det monoklonale antistoff utelukkende bundet til celleoverflaten. Når temperaturen ble endret til 37 °C og cellene ble oppbevart ved denne temperatur i 15 minutter, ble det observert cytoplasmatisk farging. Bindingen av BR110 ved dette tidspunkt var ujevnt fordelt i cytoplasmatiske områder og var stort sett fraværende fra celleoverflaten. Verken celleoverflaten eller cytoplasmaet ble farget med den monoklonale antistof f kontroll . Dataene viser at BR110 ble internalisert i karsinomceller.

Monoklonalt antistoff GA733 ble testet for internalisering på karsinomcellelinjer H3396 og SW948. Antistoffet ble utelukkende bundet til celleoverflaten ved 4 °C med ytterst svakt eller ingen internalisering ved 37 °C.

Antistof f avhengig og komplementavhenqig cytotoksisitet av BR110

Det ble utført ADCC-og CDC-test ved merking av målceller (H3396, H3922) med "Cr og behandling av cellene i 4 timer med humane lymfocytter eller humant serum som en kilde for komplement og BR110.

Frigivelsen av <sl>Cr fra målcellene ble målt som bevis på tumorcellelyse (cytotoksisitet).

BR110 ble funnet å være negativ for ADCC og CDC, hvilket kan tilskrives dets IgG2a-isotype.

ELI SA- kompet i tiv analyse

Med hensyn til slektskapet mellom GA733-genene ble det utført en kompetitiv analyse for å etablere spesifisitets-forskjellene mellom de monoklonale antistoffer BR110 og GA733. FACS-analyse har vist at begge proteiner (GA733-1 og GA733-2) er til stede på cellelinjen H3396. Bindingsundersøkelser på paraformaldehydfikserte celler viste at disse antistoffer ikke kryssblokkerer og derfor bindes til forskjellige epitoper.

Bestemmelse av aviditet eller affinitet

Scatchard analyse ble utført for å bestemme avidi-teten av radiomerket BR110 monoklonalt antistoff ved binding til adherente ikke-fikserte celler. Dataene indikerer at BR110 har en tilnærmet assosiasjonskonstant (Ka) på 5 x 10"B mol/l testet på cellelinje H3619 og H3396.

Karakterisering av BR110- antigenet

BRllO-antigen ble isolert fra den antigenpositive karsinomcellelinje H2987. Cellene ble oppløst i 1 % Triton X-100 og antigen-antistoffkompleksene ble renset ved protein A-sepharosekromatografi og SDS-Page under ikke-reduserende be-tingelser, og isolert ved elektroeluering eller elektroblot-ting.

Mr = 66 000 proteinet ble blokkert aminoterminalt. En enkel aminoterminalsekvens på 20 rester ble erholdt for Mr = 55 000 proteinet, hvilket viser fullstendig identitet med det tumorassosierte antigen GA733-1, rester 88-107.

Cyanogenbromidspalting av Mr = 66 000 BR110-antigenet frembrakte et hovedfragment som ble renset ved hjelp av SDS-Page, sekvensen var identisk til sekvensen av GA733-1 med start med rest 63, med en metioninrest foran. Disse data bekrefter at BR110-antigenet er aminoterminalt blokkert, fragmentering var nødvendig for å oppnå sekvensinformasjon. Dataene antyder dessuten at Mr = 55 000 glykoproteinet er et naturlig spaltingsprodukt av Mr = 66 000 proteinet som fremdeles er i stand til å bindes til monoklonalt antistoff BR110.

GA733-2-antigenet ble renset fra den humane kolo-rektalkarsinomcellelinje SW948 og den partielle aminosyresekvens ble bestemt (Linnenbach, A. J. et al., PNAS 86, 27-31, 1989). To rekombinanter ble isolert fra et totalt humant genomisk bibliotek og den komplette DNA-sekvens av GA733-1- og GA733-2-genet ble bestemt.

GA733-l-antigenet som gjenkjennes av monoklonalt antistoff BR110 er nært beslektet med GA733-2-antigenet (dvs. at sammenligning mellom partiell aminosyresekvens [45 aminosyrer] viser god homologi) som gjenkjennes av monoklonale antistoffer GA733 og C017-1A.

Det synes derfor som om det BR110 monoklonale antistoff har spesifisitet for et beslektet, men unikt, antigen som kodes for av et gen som deler homologi med ekson 8 av den tyroglobulin type 1-gjentakelsesenhet, den HLA-DR-assosierte invariantkjede og a-subenheten av IL-2-vekstfaktorreseptoren.

Eksempel 4

Internalisering av BR110 sFv- PE40 i karsinomceller Materialer og metoder

Reagenser og cellekultur-renset BR96 sFv-PE40 immuntoksin anvendt som en kontroll er beskrevet tidligere (Friedman et al., 1993). Membranbindings ELISA ble utført ved anvendelse av enten kanin-polyklonalt BR110 anti-idiotypisk serum (Bristol Myers Squibb) eller EXA2-1H8, et muse-anti-PE-monoklonalt antistoff (Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)). Prøvefortynningsmiddel og konjugatfortynningsmiddel ble levert av Genetic Systems (Seattle, WA). Geit-anti-mus-Ig (H + L) - spesifikt HRP-konjugat ble innkjøpt fra Southern Biotechnology (Birmingham, AL). Porøs HQ-resin ble innkjøpt fra Perceptive Biosystems (Framingham, MA). Restriksjonsenzymer og DNA-modi-fiserende enzymer var fra New England Biolabs og [<3>H]-leucin ble innkjøpt fra New England Nuclear (Boston, MA). Andre kjemikalier og reagenser, inkludert proteaseinhibitorer og glutation, ble innkjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). H3619 kolonadenokarsinom, H3754 lungekarsinom og H3907 ovariekarsinomer ble dyrket i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IDMEM) med 10 % kalvefosterserum. MCF-7 brystkarsinom-cellelinjen ble anskaffet fra ATCC og dyrket som beskrevet ovenfor. Det BR110-monoklonale antistoff (mAb) ble utviklet ved immunisering av mus med den humane brystkarsinomcellelinje

H3922 i overensstemmelse med etablerte prosedyrer.

Aminoterminal sekvensering

Ca. 10 nmol muBRHO IgG, renset fra en kontinuerlig hybridomcellekultur, ble separert ved hjelp av 15 % SDS-PAGE og de tunge og lette kjeder ble isolert for NH2-terminal sekvensanalyse ved anvendelse av et Applied Biosystems 477 proteinsekvenseringsapparat og en Applied Biosystems 120 PTH-analysator (Hewick et al., 1981; Matsudaira, P., 1987). 25 sykluser med Edman-nedbrytning ble utført. Aminoterminalsekvens ble imidlertid kun oppnådd for den lette kjede, fordi den tunge kjede ble antatt å være N-terminalt blokkert.

RNA- isolering, cDNA- syntese og amplifikasjon

RNA ble fremstilt fra 5 x IO<7> muBRHO hybridomceller som beskrevet tidligere (P. Chomezynski og N. Sacchi, 1987). cDNA ble erholdt ved anvendelse av totalt RNA og den termo-stabile rth-polymerase ("r™-RT-RNA-PCR Kit", Perkin Eimer Cetus) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner. For amplif ikasjon av tungkjede-Fv-genet ble det anvendt primer-parene MHV P9 (MHV = muse-tung-variabelt område; 5'-ACTACAC GGTACCCGGGATCCATGGc/ATTGGAA/cCTGCTATTCCTG-3 ') (Jones og Bending 1991) og den 3' V„-konstante primer (5'-N6 GAATTCAT/CC-TCCACACACAGGVgVgCCAGTGGATAGAC-3 1) (Larrick, et al., 1991). 5'-. primeren for det variable lettkjede-gen ble utformet i overensstemmelse med den N-terminale aminosyresekvens avledet fra Edman-nedbrytning og databaseoppstilling i forhold til andre beslektede lettkjede-musegener. 5'-primeren var (5• CGATCC GAATTCGACATTGTGATGACCCAGTCTCA 3') mens den 3' VL-konstante primer var mek-3 (5'-N4 GAATtCCAAGAAGCACACGACTGAGGCA-3') (Gilland et al., 1991). Gjenkjennelsessekvensene for Kpn I og EcoR I er understreket.

Kloning av amplifisert cDNA

Produktene fra amplifikasjonen av DNA-fragmenter som koder for tung- og lett-kjede Fv ble identifisert ved agarose-gelelektroforese og vandret med en tilsynelatende molekyl-størrelse på hhv. 475 og 375 basepar. Ved deres 5'- og 3'-ender ligger restriksjonsendonukleasegjenkjennelsesseter Kpnl og EcoRI for kloning av PCR-produktene i pBluescript SK(+)

(Stratagene, La Jolla, CA). Nukleotidsekvensen ble bestemt for multiple kloner av BR110 tung- og lett-kjede gensegmenter ved anvendelse av dobbelttrådet plasmid-DNA som templat og Sequenase 2.0 reagenssett (United States Biochemical, Cleveland, OH) med T7- og T3-sekvenseringsprimere (Pharmacia, Piscataway, NJ).

BR110 sFv x PE40 ekspresjonsplasmidkonstruksjon

Ekspresjonsplasmidet anvendt for produksjon av BRllOsFv x PE40 i E. coli benytter bakteriofag-T7 RNA-polymer-asepromoteren (Studier og Moffat, 1986) . BR110 V-områdene ble PCR-amplifisert for å modifisere deres terminale restriksjonsseter ved anvendelse av en 5<1> VH PCR-primer (5'-GCA ATG CATATGCAG ATC CAG TTG GTG CAG TCT GGA C-3<1>) som kodet for Nde I-restriksjonssetet, understreket, som inkluderer en ATG-translasjonsinitieringskode (fet skrift) og de første 8 kodoner av V„-genet. 3' VL PCR-primeren (5'-CCA TGG ATG CAT CCG TTT CAG CTC CAG CGT GGT CCC AGC-3') koder for Nsi I-restriksjonssetet (understreket) og de siste 9 kodoner av Vx-genet. Det ble også innføyet en fleksibel linker, (Gly4Ser)3, mellom de to V-domener (Huston et al., 1988; Chaudhary et al., 1989) ved å syntetisere 3' VH PCR-primeren (5'-CCG GCC GGA TCC GCC TCC GCC TGA TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC T-3') som ble utformet for å inneholde Barn H I-restriksjonssetet (understreket) , den første halvpart av linkeren (fet skrift) og de siste 8 kodoner av V„-genet. Det 5' VL PCR-primeren (5'-CCG GCC

GGA TCC GGC GGT GGC GGT TCT GGC GGT GGC GGT TCT GAC ATT GTG

ATG ACC CAG TCT CAC-3') koder for Barn H I-restriksjonsseter (understreket), den siste halvpart av linkeren (fet skrift) og de første 8 kodoner av VL-genet. Barn H I-restriksjonssetet ble anvendt for å ligere de to PCR-produkter sammen og ble deretter reamplifisert via PCR ved anvendelse av 5' VH- og 3' VL-primerne (Sambrook et al., 1989). BR110 sFv ble deretter substituert for BR96 sFv (McAndrew, 1995), i pBW7.0, en pMS8 (+) basert vektor, ved Ndel + Nsi I-spaltning etterfulgt av ligering. Det resulterende ekspresjonsplasmid dirigerer fusjonsproteinet pBR110sFv-PE40 til cytoplasma og ble be-

kreftet ved DNA sekvensanalyse.

Ekspresjon og rensing av BR110 sFv- PE40

Det enkeltkjedete immuntoksinfusjonsprotein BR110 sFv-PE40 ble uttrykt i E. coli som beskrevet ovenfor. E. coli BL21 (IDE3)-celler (Studier & Moffat, 1986) ble transformert med ekspresjonsplasmid pBR110sFv-PE40, dyrket i "Terrific-Broth" medium (Gibico-BRL, Gaithersburg, MD) inneholdende

100 ug/ml ampicillin ved 37 °C, og indusert med 1 mM IPTG i den logaritmiske fase ved en OD650 på 1,0. Cellene ble inn-høstet 90 minutter senere. For analytisk analyse ble 1 ml prøver innhøstet ved sentrifugering og sjokkbehandlet osmotisk i kald H20 i 10 minutter. Cellene ble sentrifugert på nytt og cellepelletene ble resuspendert i 10 nm tris-HCl, pH 7,4. Aliquoter preparert fra ca. IO<8> sfaeroplaster ble underkastet SDS-PAGE og farget (Laemmli, 1970) , eller underkastet immun-blotanalyse ved anvendelse av kanin-anti-BRllO-idiotypisk polyklonalt serum. En samlet bakteriecellepellet preparert fra 6 liter ristekultur ble bearbeidet som beskrevet ovenfor og inklusjonslegemer ble isolert som beskrevet tidligere (Friedman et al., 1993). Grundig vaskede inklusjonslegemer ble deretter denaturert i 7 M guanidin.

Antigenkloninq, ekspresjon og rensing

BR110-antigener (GA733-1) ble isolert fra H2987-celler og den aminoterminale sekvens av 20 rester ble erholdt. Restene var komplementære til de 88-107 rester av det tumorassosierte antigen GA733-1. GA733-1 er en gensekvens som er isolert basert på dens homologi med GA733-2, som koder for det gastrointestinalassosierte antigen som gjenkjennes av monoklonale antistoffer GA73.3 og C017-1A. GA733-1 er 50 % homolog med GA733-2-antigenet.

Northern analyse ble utført på tre karsinomcellelinjer, H3907 ovariekarsinom, H3619 kolonadenokarsinom og H3754 lungekarsinom, som var blitt vist å uttrykke BRllO-antigenet GA733-1 via FACS-analyse. RNA ble isolert fra 20-30 millioner celler fra hver cellelinje ved anvendelse av metoden ifølge Chomczynski og Sacchi (Chomczynksi og Sacchi, 1987 (Anal. Biochem 162:156-159)). En oligonukleotidprobe ble fremstilt basert på den kjente nukleotidsekvens av GA733-1. Northern analyse ble utført som beskrevet i Mantianis.

cDNA for antigenet ble isolert ved anvendelse av sekvensspesifikke primere, totalt RNA og revers transkriptase-polymerase (RT-RNA-PCR, Perkin Eimer Cetus) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner, med unntak av tilsetningen av 10 % DMSO som ble anvendt fordi antigenet GA733-1 har et inn-hold av GC høyere enn 50 %. De spesifikke RT-primere som ble anvendt var 110-FP (5' GCC AAG CTT GTC CGG TCC GCG TTC CTC CGC

CCC ACC 3'), 110-RP (5' CGG TCT AGA CTC GAG GCC GGG TAC CTA CAA GCT CGG TCC 3'), 110-RP1 (5' GCG GGG ATC CGT GAG GCG CTT

CAT GGA GAA CTT CGG 3'). Restriksjonssetet for hver primer er understreket og er hhv. Hind III, Xho I, og Barn HI. Etter revers transskripsjon med vilkårlige heksanukleotider levert med settet er 3' 110-RP1-primeren, ble det utført 32 PCR-sykluser og det ble isolert produkter med hensiktsmessig størrelse. 1,15 kB genfragmentene ble spaltet med Hind III og Barn HI før ligering i pCD40ThrRgl (i en CDM7-bakgrunn), mens 0,86 kB genfragmenter ble ligert i form av Hind III-XhOI-fragmenter i pCDM8. Plasmid DNA inneholdende innføyelsene med passende størrelse ble identifisert og underkastet DNA-sekvensanalyse. DNA-fragmentet som koder for det ekstracellu-lære domene ble subklonet oppstrøms for det humane Fc-område og kortvarig uttrykt i COS-celler. Det resulterende fusjonsprotein ble renset ved protein A-affinitetskromatografi.

Cellemembran- ELISA

Membraner fra H3619 kolonadenokarsinomceller ble preparert (Spira et al., "The Identification of Monoclonal Class Switch Variants By Subselection And ELISA Assay", J. Immunol. Meth., 74:307-15 (1984), Uotila et al., "Two-site Sandwich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP", J. Immunol. Methods, 42:11 (1981), Sikora et al. (red.), Monoclonal Antibodies, s. 32-52 (Blackwell Scientific Publications 1984)).

Membraner ble belagt på overflaten av Immulon II 96 brønners plater (Dynatech Labs., Chantilly, VA) ved 10 ug/ml protein i 0,5 M natriumkarbonat/natriumbikarbonat, pH 9,6, og inkubert over natten ved 4 °C. Platene ble vasket tre ganger med PBS, blokkert med prøvefortynningsmiddel ved 1:10 (Genetic Systems, Seattle, WA) i én time ved romtemperatur. Platene ble vasket tre ganger med PBS og deretter inkubert med primært antistoff over natten ved 4 °C i konjugatfortynningsmiddel (Genetic Systems, Seattle, WA). Platene ble deretter vasket tre ganger med PBS, etterfulgt av tilsetning av sekundært antistoff, enten geit-anti-mus-IgG-spesifikk HRP eller polyklonale kanin-BRllO-anti-idiotypiske-antistoffer, ved 2,5 ug/ml i konjugatfortynningsmiddel. Platene ble inkubert i én time ved romtemperatur og deretter vasket tre ganger med PBS. Platene ble vasket tre ganger med PBS og deretter enten inkubert i én time ved romtemperatur med geit-anti-kanin-IgG Fc-spesifikt HRP ved 1:1000 i konjugatfortynningsmiddel, eller vasket ytterligere to ganger, hvoretter reaksjonen ble utviklet med tetrametylbenzidin (TMB) i 15 minutter ved romtemperatur og stanset med 1,3 M H2S04. Etter inkubasjonen ble også platene med de polyklonale sera vasket fem ganger i PBS og behandlet som angitt ovenfor. Absorbansen ble kvantifisert ved to bølgelengder 450/630 nm ved anvendelse av en Bio-tek mikroplateavleser (Winooski, VT).

Cytotoksisitetsanalyse

Celler ble inkubert med BR110 sFv-PE40 i 24 timer ved 37 °C. Brønnene ble deretter vasket to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS), 200 ul/brønn med 1,5 uM kalsein-AM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) ble tilsatt og platene ble inkubert i 40 minutter ved romtemperatur. Kalsein-AM er membranperme-abel og ikke-fluorescerende. Når hydrolyse foregår ved hjelp av intracellulære esteraser dannes det intenst fluorescerende produkt kalsein. Ved slutten av inkubasjonen ble fluorescensen målt ved anvendelse av en fluorescenskonsentrasjonsanalysator (Baxter Healtcare Corp., Mundelein, IL) ved eksitasjon/emi-sjonsbølgelengder på 485/530 nm.

Eksempel 5

Konstruksjon av BR110 sFv- PE40- immuntoksin ( pSE 70. 0)

Den opprinnelige BR110 sFv-PE40-konstruksjon ble subklonet i en vektor som inneholder kanamycinresistensgenet og en andre lac-repressor bygget inn i ekspresjonsvektoren. Dette ble utført ved en spaltning av pET29c (Novagen Inc) med EcoRI og Xbal og innføyelse av en lignende spalte BR110 sFv-PE40 mellom de to seter. Den resulterende konstruksjon ble betegnet pSE 70.0 (figur 1) og var under kontroll av T7-promotoren.

BR110 sFv- PE40 ekspresjon, refolding og rensing

Det enkeltkjedete immunotoksinfusjonsprotein BR110 sFv-PE40 ble uttrykt i E. coli som inklusjonslegemer. Celle-pasta fra 1 liter startkultur inneholdende uttrykt BR110 sFv-PE40-fusjonsprotein ble resuspendert i 50 mM tris-HCl, pH 8,0, pluss 1 mM EDTA. Prøven ble sentrifugert ved 8 K i 15 minutter og supernatanten ble dekantert. Pelleten ble resuspendert i 40 ml HjO, oppbevart ved 4 °C i 10 minutter og sentrifugert ved 8 K i 15 minutter. Pelleten ble resuspendert i 50 mM tris-HCl, pH 8,0, pluss 1 mM EDTA. 0,5 mg/ml lysozym ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,25 mg/ml. Prøven ble oppbevart på i 30 minutter.

Detergenten Tergitol ble deretter tilsatt til prøven til en sluttkonsentrasjon på 4 %. Prøven ble oppbevart på is i 60 minutter og sentrifugert ved 18 K i 30 minutter. Prøven ble vasket tre ganger med 50 mM tris-HCl + 1 mM EDTA. Pelleten ble sonikert i 3 ml guanidinløsning (7 M guanidin-HCl, 0,1 M tris-HCl pH 7,4, 5 mM EDTA) og oppbevart ved 4 °C i 48 timer. Prøven ble deretter sentrifugert ved 30 K i 30 minutter og supernatanten ble oppsamlet.

Prøven deretter refoldet ved 100 ug/ml ved langsom tilsetning til refoldingsbuffer (0,1 M tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 1 mM GSSH, 1 uM GSH, 1 M urea). Det refoldede protein ble oppbevart ved 4 °C i 48 timer og dialysert mot 40 mM HC1, pH 8,0, inntil ledningsevnen var lavere enn 5 mS/cm. Prøven ble applisert på en DEAE-anionbytterkolonne og eluert med en lineær gradient av 40 mM tris-HCl, pH 8,0, pluss 1 M NaCl. Fraksjonene som tilsvarte et 67 kDa BR110 sFv-PE40-fusjonsprotein, ved hjelp av ikke-reduserende SDA-PAGE, ble oppsamlet, fortynnet i 50 ml 40 mM tris-HCl, pH 8,0, og applisert på nytt en Mono-Q anionbytterkolonne med den samme NaCl-gradient som for DEAE-kolonnen. Prøvene som tilsvarte monomer BR110 sFv-PE40 ble oppsamlet og kvantifisert ved hjelp av coomassie-pluss-analysen (Pierce Chem Co.).

BRllO- BDl- immuntoksinkonstruksjon og rensing

BR110 monoklonalt antistoff ble tiolert ved tilsetning av et tre gangers molart overskudd av 2-iminotiolan i 0,2 M natriumfosfatbuffer (pH 8,0), 1 mM EDTA, i én time ved 37 °C. BD1 ble derivatisert med et tre gangers molart overskudd av SMPT (4-sukksinimidyloksykarbonyl-a-metyl-a-(2-pyridylditio)-toluen) i 0,2 M natriumfosfatbuffer (pH 8,0), 1 mM EDTA, ved romtemperatur i 60 minutter. BR110-BD1 ble applisert på en størrelseseksklusjonskolonne (TSK-3000) og separert fra fritt toksin. Immuntoksinet (180 kDa) og fritt antistoff (150 kDa) eluerte sammen og ble ytterligere renset ved Blue-Sepharose affinitetskromatografi. BR110-BD1 i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,0 (vaskebuffer), ble absorbert på Blue-Sepharose (5 ml resin/5 ml konjugat) i 16 timer ved 20 °C. Blandingen ble pakket i en 5 ml ekonokolonne (Bio-Rad, Richmond, CA), og 1 ml fraksjoner ble eluert med en to-trinns gradient av økende NaCl-konsentrasjoner i vaskebuffer (400 mM NaCl, trinn 1; 800 mM NaCl, trinn 2). Immuntoksinkonjugatet ble kvantifisert ved OD2eo (1,4 = 1 mg/ml) og analysert ved ikke-reduserende SDS-PAGE.

Cytotoksisitetsanalyse av BR110- immuntoksiner

Tumorceller (IO<5> celler/ml) i vekstmedium ble tilsatt til 96 brønners flatbunnede vevskulturplater (0,1 ml/brønn) og inkubert ved 37 °C i 16 timer. Fortynninger av BR110 sFv-PE40 eller BR110-BD1 ble tillaget i leucinfritt RPMI (analyse-medium) og 0,1 ml ble tilsatt til hver brønn i 20 timer ved 37 °C (for BR110 sFv-PE40) eller i 20 og 44 timer (for BR110-BD1). Cellene ble pulset med [<3>H]-leucin (1 uCi/brønn) i ytterligere 4 timer ved 37 °C. Cellene ble lysert ved frysing-tining og innhøstet ved anvendelse av Tomtec celleinnhøstings-apparat (Orange, CT). Inkorporering av [<3>H]-leucin i cellulært protein ble bestemt ved anvendelse av en LKB p-palte-væskescintillasjonsteller.

Overskudd av BR110 IgG (50 ug/ml) ble tilsatt etter 48 timer av BR110-BDl-cytotoksisitetsundersøkelsen for å demonstrere BRllO-spesifisitet i analysen. Med unntak av tilsetningen av BR110 IgG ble analysen utført nøyaktig som angitt ovenfor.

nd = ikke utført

Claims (10)

1. Monoklonalt antistoff som binder seg til GA733-1-antigen, karakterisert ved at antistoffet inneholder et antigenbindingssete som kompetitivt inhiberer bindingen av monoklonalt antistoff BR110 produsert et hybridom betegnet ATCC nr. HB11698, til GA733-1-antigenet.

2. Hybridom, karakterisert ved at den produserer det monoklonale antistoff ifølge krav 1.

3. Hybridom, karakterisert ved at den har betegnelsen ATCC nr. HB11698.

4. Konj ugat, karakterisert ved at det omfatter antistoffet ifølge krav 1 bundet til minst en del av et cytotoksisk middel, idet delen inkluderer minst ett funksjonelt aktivt segment.

5. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er merket med en påvisbar markør.

6. Humant/muse-rekombinant antistoff, karakterisert ved at dets antigenbindingsområde kompetitivt inhiberer den immunspesifikke binding av monoklonalt antistoff BR110 produsert av hybridom med ATCC nr. HB11698 til dets målantigen.

7. Nukleinsyremolekyl, karakterisert ved at det koder for antistoffet ifølge krav 1.

8. Plasmid, karakterisert ved at det omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 7.

9. Vertsvektorsystem, karakterisert ved at det omfatter et plasmid ifølge krav 8 i en egnet vertscelle.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein, karakterisert ved at den omfatter dyrking av vertsvektorsystemet ifølge krav 9 for å produsere proteinet i verten og gjenvinning av det således produserte protein.