DE69632333T2

DE69632333T2 - Monoklonaler antikörper br110 und dessen anwendung

Info

Publication number: DE69632333T2
Application number: DE69632333T
Authority: DE
Inventors: Erik Karl HELLSTROM; Ingegerd Hellstrom; Ursula Garrigues; Stephen Mcandrew; Hans Marquardt
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1995-10-19
Filing date: 1996-10-07
Publication date: 2004-12-30
Anticipated expiration: 2016-10-08
Also published as: MX9802129A; NO321548B1; NO981745D0; CA2235269C; JP2001501801A; IL123294A0; EP0856054B1; WO1997014796A1; US5840854A; DE69632333D1; ES2219699T3; NO981745L; EP0856054A1; CA2235269A1; ATE265532T1; AU7394296A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Krebs umfasst einen weiten Bereich von Krankheiten, die weltweit eine von vier Personen betreffen. Was die Zahl der betroffenen Personen betrifft, stellt Krebs eindeutig ein ernstes medizinisches Problem dar. Angesichts der Ernsts des Problems und dessen Auswirkung auf die Gesellschaft wird hoher Wert auf gegen Krebs gerichtete wirksame therapeutische und diagnostische Agenzien gelegt. Antikörper gegen menschliche Tumor-assoziierte Antigene sind neuere technologische Errungenschaften, die versprechen, wichtige therapeutische und diagnostische Agenzien gegen gewisse Krebsarten zu werden.
Antikörper gegen menschliche Tumor-assoziierte Antigene sind allgemein bekannt und gut beschrieben. Ein solches Tumor-assoziiertes Antigen wird als das GA733-2 Antigen bezeichnet. Das GA733-2 Antigen hat ein Molekulargewicht von ungefähr 34 kD–40 kD und gehört zur Familie der GA733 Antigene (Linenbach et al. PNAS USA 86: 27–31 (1989)). Die biologische Funktion des GA733-2 Antigens ist unbekannt (internationale Offenlegungsschrift Nr. WO93/0829, offengelegt am 29. April 1993).
Unter Verwendung der DNA-Sonde von GA733-2 waren Wissenschaftler in der Lage, eine genomische Bibliothek zu screenen und eine als GA733-1 bezeichnete homologe Sequenz zu isolieren. Die Wissenschaftler konnten das Antigen aus dem GA733-1 Gen exprimieren. Jedoch ermittelte niemand, ob das Antigen ein Tumor-assoziiertes Antigen war.
Die Tatsache, dass das GA733-1 Gen aus einer genomischen Bibliothek isoliert worden war, trug weiterhin zur Unsicherheit bei, ob das Gen und das davon kodierte Antigen allgemein bei normalen Zellen, Tumorzellen oder beiden auftraten und mit welcher Frequenz diese auttraten. Das Molekulargewicht und die Funktion des GA733-1 Antigens sind unbekannt. Das GA733-1 Antigen enthält mehrere Epitope, und ein Segment der DNA, die für GA733-1 kodiert, ist bekannt (US-Patent Nr. 5,185,254, supra).
Das GA733-2 Antigen wird von einem monoklonalen Antikörper mit der Bezeichnung MoAb GA733 (auch als GA733-2 Antikörper bekannt) erkannt (Herlyn, et al. Hybridoma, 5: S3–S10 (1986)). MoAb GA733 wurde hinsichtlich der Diagnose und Therapie menschlicher gastrointestinaler Tumore bewertet. Er zeigt tumorizide Eigenschaften. Trotz der Tatsache, dass GA733-1 und GA733-2 49% Homologie in ihren Aminosäuresequenzen aufweisen (US-Patent Nr. 5,185,254, erteilt am 09. Februar 1993), bindet MoAB GA733 an das GA733-2 Antigen, aber nicht an das GA733-1 Antigen. MoAb GA733 bindet an normale Epitelzellen.
Zusätzlich zu GA733 erkennen mehrere unabhängig erhaltene mAbs, wie beispielsweise CO17-1A, M77, M79, 323/A3, alle das GA733-2 Antigen und binden daran (internationale Offenlegungsschrift Nr. WO93/0829, supra). Der monoklonale Antikörper CO17-1A (auch bekannt als der 17-1A Antikörper) bindet an das GA733-2 Antigen, erkennt aber nicht das GA733-1 Antigen und bindet auch nicht daran.
Gegenwärtig sind keine monoklonalen Antikörper gegen das GA733-1 Antigen bekannt. Die erfindungsgemäßen BR110 Liganden erkennen und binden an das GA733-1 Antigen und werden nach der Bindung an das Antigen von Zellen internalisiert. Die erfindungsgemäßen BR110 Liganden scheinen weiterhin einer tumorizide Aktivität aufzuweisen.
Internalisierende Antikörper kommen selten vor. Bei therapeutischen Anwendungen besteht gegenwärtig ein Bedarf für solche „internalisierenden" Antikörper, d. h. Antikörper, die von der Tumorzelle, an die sie binden, leicht aufgenommen werden. Solche Antikörper können zum Beispiel an biologische und/oder chemische Agenzien gebunden werden, die nur wirksam sind, wenn sie in die Zelle transportiert werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die erfindungsgemäßen BR110 Liganden, z. B. monoklonale Antikörper BR110, erfüllen die vorstehend besprochenen therapeutischen und diagnostischen Bedürfnisse.
BR110 Liganden weisen gemeinsame Eigenschaften auf. Beispielsweise erkennt jeder BR110 Ligand spezifisch das BR110 Antigen und bindet daran, und ist mindestens gegen einen Teil des Epitops gerichtet, gegen das der monoklonale Antikörper BR110 (ATCC Nr. 11698) gerichtet ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist der BR110 Ligand der monoklonale Antikörper BR110 (ATCC Nr. 11698). Weiterhin stellt ein rekombinanter Mensch/Maus Antikörper eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen BR110 Liganden dar, dessen Antigen-bindende Region kompetitiv die immunspezifische Bindung des vom Hybridom HB 11698 produzierten monoklonalen Antikörpers BR110 an dessen Zielantigen inhibiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine graphische Darstellung des Plasmids pSE 70.0.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
DEFINITIONEN
In dieser Anmeldung sollen die nachfolgenden Worte oder Ausdrücke die hier angegebenen Bedeutungen besitzen.
„Ligand" umfasst hierin ein intaktes Antikörper-Molekül und jedes Molekül, das mindestens eine Antigen-bindende Region oder einen Teil davon (d. h. den variablen Teil eines Antikörper-Moleküls) aufweist, z. B. ein Fv-Molekül, Fab-Molekül, Fab'-Molekül, F(ab')₂-Molekül, einen bispezifischen Antikörper, ein Fusionsprotein oder jedes genetisch erzeugte Molekül, welches das BR110 Antigen spezifisch erkennt und daran bindet.
„Antigen-bindende Region" bedeutet hierin einen Teil des Moleküls, der das Ziel-Antigen erkennt.
Hierein bedeutet „inhibiert kompetitiv" in der Lage zu sein, eine Determinante, gegen die der monoklonale Antikörper BR110 gerichtet ist, unter Verwendung herkömmlicher reziproker Antikörper-Kompetitions-Assays zu erkennen und daran zu binden. (Belanger L, Sylvestre C und Dufour D (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15).
„Ziel-Antigen" bedeutet hierin das GA733-1 Antigen oder Teile davon.
„Verknüpft" bedeutet hierin das Verbinden von zwei oder mehr im Allgemeinen getrennten Einheiten oder Segmenten durch eine kovalente Bindung oder eine nicht-kovalente Bindung.
„Funktional aktiv" bedeutet hierin den Teil des Moleküls, der in der Lage ist, sein Ziel zu erkennen und zu binden.
„Biologisch oder chemisch aktives Molekül" bedeutet hierin jedes biologische oder chemische Molekül, welches das Zellwachstum inhibieren oder stoppen oder anderweitig zum Nachteil der Zelle wirken kann.
„Immunkonjugat" bedeutet hierin jedes Molekül oder jeden Liganden wie beispielsweise einen Antikörper, der chemisch oder biologisch mit einem Zytotoxin, einem radioaktiven Agens, einem Enzym, einem Toxin, einem Anti-Tumor-Wirkstoff oder einem therapeutischen Agens verbunden ist. Der Antikörper kann mit dem Zytotoxin, dem radioaktiven Agens, dem Anti-Tumor-Wirkstoff oder dem therapeutischen Agens an jeder Position entlang des Moleküls verbunden sein, solange er dazu in der Lage ist, an sein Ziel zu binden. Beispiele für Immunkonjugate umfassen chemische Konjugate aus Antikörper und Toxin und Fusionsproteine aus Antikörper und Toxin.
„Wirksame Menge" bedeutet hierin eine Menge des Antikörpers, Immunkonjugats, oder rekombinanten Moleküls, die zur Tötung von Zielzellen oder der Inhibition von deren Proliferation führt.
„Fusionsprotein" bedeutet hierin jedes chimäre Protein, worin eine Antigen-bindende Region mit einem biologisch aktiven Molekül verbunden ist, z. B. einem Toxin, Enzym oder einem Proteinwirkstoff.
Die nachfolgende Beschreibung dient einem vollständigeren Verständnis der hierin beschriebenen Erfindung.
A. ERFINDUNGSGEMÄSSE LIGANDEN
Die vorliegende Erfindung stellt internalisierende Liganden (d. h. BR110 Liganden) bereit, die das BR110 Antigen spezifisch erkennen und binden.
Der erfindungsgemäße Ligand kann in jeder Form vorliegen, solange er eine Antigen-bindende Region aufweist, die kompetitiv die immunospezifische Bindung des vom Hybridom HB 11698 produzierten Antikörpers BR110 an dessen Zielantigen inhibiert. Somit fallen alle rekombinanten Proteine (z. B. Fusionsproteine, bei denen der Antikörper mit einem zweiten Protein wie beispielsweise einem Lymphokin oder einem Tumor-inhibierenden Wachstumsfaktor verbunden ist), welche die gleiche Bindungsspezifität wie der Antikörper BR110 aufweisen, in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Ligand ein monoklonaler Antikörper BR110. Das den monoklonalen Antikörper BR110 produzierende Hybridom wurde gemäß den Erfordernissen des Budapester Vertrags am 10. August 1994 bei der American Type Culture Collection („ATCC") 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, hinterlegt und mit der ATCC-Zugangsnr.: HB 11698 bezeichnet.
In anderen Ausführungsformen ist der Ligand ein Fv-Molekül (wie beispielsweise ein single chain Fv-Molekül), ein Fab-Molekül, ein Fab'-Molekül, ein F(ab')₂-Molekül, ein Fusionsprotein, ein bispezifischer Antikörper, ein Heteroantikörper oder jedes rekombinante Molekül, das die Antikörper-bindende Region des BR110 Antikörpers aufweist. Der erfindungsgemäße Ligand ist gegen das Epitop gerichtet, gegen das der monoklonale Antikörper BR110 (ATCC-Nr. 11698) gerichtet ist.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Ligand gegen das Epitop gerichtet, gegen das der monoklonale Antikörper BR110 gerichtet ist, und weist eine Affinität von mindestens 2 × 10⁸ Liter/Mol für sein Ziel auf, oder, im Fall multivalenter Antikörper, eine Avidität, die mindestens so groß ist wie die Avidität, die aus der Bindung eines bivalenten Antikörpers mit einer Affinität von 10⁸ Liter/Mol an ein Antigen resultieren würde. Unterschiedliche Affinitäten sind möglich und werden von der Erfindung umfasst.
Der erfindungsgemäße Ligand kann modifiziert sein, d. h. durch Aminosäuremodifikationen innerhalb des Moleküls, so dass Derivat-Moleküle produziert werden. Chemische Modifikationen sind ebenfalls möglich.
Derivat-Moleküle würden die funktionale Eigenschaft des Polypeptids beibehalten, denn das Molekül mit solchen Substitutionen wird weiterhin die Bindung des Polypeptids an das GA733-1 Antigen oder Teile davon erlauben.
Diese Aminosäuresubstitutionen umfassen Aminosäuresubstitutionen, die dem Fachmann als „konservativ" bekannt sind, sind aber nicht notwendigerweise darauf beschränkt.
Es ist beispielsweise ein allgemein bekanntes Prinzip in der Proteinchemie, dass bestimmte Aminosäure-Substitutionen, die „konservative Aminosäure-Substitutionen" genannt werden, häufig in einem Protein vorgenommen werden können, ohne entweder die Konformation oder die Funktion des Proteins zu verändern.
Solche Austausche umfassen die Substitution jeder aus Isoleucin (I), Valin (V) und Leucin (L) ausgewählten Aminosäure durch jede andere dieser hydrophoben Aminosäuren; Asparaginsäure (D) durch Glutaminsäure (E) und umgekehrt; Glutamin (Q) durch Asparagin (N) und umgekehrt; und Serin (S) durch Threonin (T) und umgekehrt.
In Abhängigkeit von der Umgebung der speziellen Aminosäure und deren Rolle in der dreidimensionalen Struktur des Proteins können auch andere Substitutionen als konservativ aufgefasst werden. Glyzin (G) und Alanin (A) können beispielsweise oft gegeneinander ausgetauscht werden, ebenso wie Alanin und Valin (V).
Methionin (M), welches relativ hydrophob ist, kann häufig mit Leucin und Isoleucin, und manchmal mit Valin ausgetauscht werden. Lysin (K) und Arginin (R) sind häufig in Positionen gegenseitig austauschbar, bei denen die wesentliche Eigenschaft des Aminosäurerests dessen Ladung ist und wobei die unterschiedlichen pK's dieser zwei Aminosäurereste nicht wichtig sind. In speziellen Umgebungen können noch weitere Austausche als „konservativ" betrachtet werden.
B. VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN LIGANDEN
Erfindungsgemäße Liganden umfassen (1) monoklonale Antikörper und Fragmente davon, (2) rekombinante Moleküle mit mindestens einer Antigen-bindenden Region oder einem Teil davon, z. B. ein Fv-Molekül, Fab-Molekül, Fab'-Molekül, F(ab')₂-Molekül, einen bispezifischen Antikörper, ein Fusionsprotein, oder (3) jedes genetisch veränderte Molekül, die alle das BR110 Antigen spezifisch erkennen und binden.
Erfindungsgemäße monoklonale Antikörper
Hybridome, welche die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren, werden nach den allgemeinen Verfahren hergestellt, die von Köhler und Milstein beschrieben wurden ((1975) Continous culture of fused cells secreting antibody of defined specificity. Nature 256, 495–497), wobei einige Modifikationen vorgenommen wurden (M. Yeh et al., „Cell Suface Antigens Of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibody", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76(6): 297–31 (1979); und Yeh et al., „A Cell-Surface Antigen Which is Present In the Ganglioside Fraction And Shared By Human Melanomas", Int. J Cancer, 29: 269–75 (1982)). Bei diesem Verfahren werden Hybridome durch Fusionieren von Antikörper-produzierenden Zellen (typischerweise Milzzellen von Mäusen, die zuvor mit einem Immunogen immunisiert wurden) mit Zellen einer unsterblichen Tumorzelllinie unter Verwendung somatischer Zellhybridisierungs-Verfahren hergestellt.
Die neuen, hierin beschriebenen monoklonalen Antikörper wurden hergestellt durch Immunisierung von Mäusen mit menschlichen H3922 Brustkarzinomzellen, die mit Neuraminidase vorbehandelt waren. Für die Immunisierung mit menschlichen H3922 Brustkarzinomzellen werden die Tiere wenigstens einmal mit 10⁷ Zellen des Immunogens intraperitoneal inokuliert. Die Tiere werden dann zwei oder mehrere Male mit dem Immunogen geboostet. Mehrere Tage nach dem letzten Boost werden die Milzen der Tiere geerntet, und eine Suspension von Milzzellen wird für die Fusion mit Maus-Myelomzellen unter Verwendung bekannter Fusionstechniken hergestellt.
Man lässt die aus dem Fusionsprozess resultierenden Hybridome wachsen. Danach werden die resultierenden Überstände unter Verwendung von Immunoassay-Verfahren gescreent, um im Überstand vorliegende Antikörper zu detektieren, die in der Lage sind, an das spezifische Antigen zu binden (Hardy RR (1986) Purification and characterization of monoclonal antibodies. In: Weir DM und Herzenberg LA (Hrsg.) Handbook of Experimental Immunology, 4. Aufl., Bd. 1, S. 13. Oxford: Blackwell Scientific Publications; Engvall E und Perlmann P (1971) Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8, 871).
Erfindungsgemäße rekombinante Proteine
Es sollte Routine sein, rekombinante Proteine herzustellen, die an dieselbe antigene Determinante wie der BR110 Antikörper zu binden vermögen. Die Identifizierung rekombinanter Proteine, welche dieselbe Bindungsstelle erkennen, beinhaltet lediglich das Erstellen von Kompetitionsassays, bei denen die erfindungsgemäßen Antikörper mit einem anderen Antikörper um das Ziel konkurrieren (Belanger L, Sylvestre C und Dufour D (1973) Enzyme linked immunassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15). Kompetitionsassays stellen Routine dar und deren Protokolle sind allgemein bekannt (E. Harlow und D. Lane, Hrsg., „Antibodies a laboratory manual" 1988, Seiten 567–577).
Klassen, Isotypen und andere Varianten des erfindungsgemäßen Antikörpers, welche die Antigen-bindende Region des BR110 Antikörpers aufweisen, können unter Verwendung rekombinanter Class-Switching und Fusionstechniken, welche dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden (Winter G und Milstein C (1991) Man-made antibodies. Nature 349, 293–299. Pluckthun A (1991) Antibody engineering: advances from the use of Escherichia coli expression systmes. Bio/Technology 9, 545–551. Moore GP (1989) Genetically engineered antibodies. Clinical Chemistry 35, 1849–1853).
Die vorliegende Erfindung stellt BR110 Fusionsproteine bereit. Allgemeine Verfahren zur Konstruktion von Expressionsvektoren für Fusionsproteine sind allgemein bekannt (Ernst Winnacker, „From Genes to Clones: Introduction to Gene Technology" Kapitel 7, 1987 auf den Seiten 239–317). Ein allgemeiner Ansatz für die Konstruktion von Expressionsvektoren, welche die Synthese von Fusionsproteinen steueren, sieht beispielsweise folgendermaßen aus.
Das Ausgangsmaterial kann ein cDNA-Klon sein, bei dem das Gen von Interesse aus einem Vektor entfernt wurde. Unter Verwendung von Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, wird eine Restriktionsschnittstelle in die Nähe eines Starkcodons positioniert. Der nächste Schritt ist ein Verdauungsschritt, der DNA-Fragmente asymmetrisch schneidet. Das erhaltene Gemisch aus DNA-Fragmenten wird dann in einen Vektor kloniert. Selbstverständlich muss eine Schnittstelle innerhalb des Polylinkers des gewählten Vektors vorhanden sein. Da ein weites Spektrum von Vektoren verfügbar ist, sollte es nicht schwierig sein, einen geeigneten Vektor zu finden, der die gewünschten Schnittstelle enthält. Sobald ein geeigneter Klon identifiziert ist, kann die Schnittstelle für die Insertion des Gens von Interesse verwendet werden, welches aus dem ursprünglichen cDNA-Klon erhalten werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt chimäre BR110 Proteine bereit. Die Herstellung eines chimären BR110 Proteins, welches an dieselbe antigene Determinante wie der BR110 Antikörper zu binden vermag, stellt Routine dar (Morrison, S. L. Johnson, M. J., Herzenberg, L. A., and Oi, V. T. (1984). Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855, Morrison, S. L. (1985). Transfectomas provide novel chimeric antibodies. Science 229, 1202–1207).
Genmanipulation kann verwendet werden, um chimäre Immunglobuline zu erzeugen durch (1) Verbinden des variablen schweren Gensegments (V_H) aus dem Nagetier mit den menschlichen Gensegmenten für die konstante Region der schweren Kette, um ein Genkonstrukt der schweren Kette zu erzeugen, (2) Verbinden des variablen leichten (V_L) Gensegments aus dem Nagetier mit einem menschlichen konstanten leichten (C_L) Exon, um das Genkonstrukt der leichten Kette zu erzeugen, und (3) Transfektion der Genkonstrukte sowohl der schweren als auch der leichten Kette in eine Myelomazelllinie (Fell et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8507–8511 (1989); Morrison, S. L., Johnson, M. J. Herzenberg, L. A., and Oi, VT. (1984). Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with humans constant region domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851–6855).
Im Prinzip kann jede variable Domäne aus dem Nagetier mit jedem menschlichen Isotyp der konstanten Region zusammengebracht werden, so dass die optimale Kombination von Antigenspezifität und Effektorfunktionen (beispielsweise Komplementfixierung und ADCC (Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität) selektiert werden kann (Morrison, S. L. (1985). Transfectomas provide novel chimeric antibodies. Science 229, 1202–1207).
Falls erforderlich, kann eine Feinabstimmung der Konstrukte durch Einführung von Punktmutationen in die Gensegmente für die variablen Regionen erreicht werden, welche die Affinität des chimären Antikörpers für seinen Liganden verändern (Kunkel, T. A., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 32; 488–492; Kunkel, T. A., et al., 1987, Methods Enzymol. 154: 367–382).
Um alle Maus-Eigenschaften des BR110 Liganden zu verringern oder zu beseitigen, können unter Verwendung molekularer Manipulationen und von Transfektomtechologie humanisierte Versionen hergestellt werden (Co, M. S., Deschamps, M., Whitley, R. J., und Queen, C. (1991). Humanized antibodies for antiviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869–2873).
In Abhängigkeit vom gewünschten therapeutischen Effekt können verschiedene Isotypen der menschlichen schweren Kette für den humanisierten Antikörper gewählt werden. Wenn beispielsweise die Zerstörung der Zielzelle gewünscht ist, kann die menschliche konstante IgG1 Region ausgewählt werden, da sie von FcgR I, FcgR II und FcgR III erkannt wird und ADCC vermittelt (Anderson, C. L., and Looney, R. J. (1986). Human leukocyte IgG Fc receptors. Immunol. Today 7, 264–266).
Chimäre Antikörper mit unterschiedlichen Effektorfunktionen wurden durch Verbinden verschiedener Sequenzen mit solchen, welche die Antigen-bindende Region kodieren, hergestellt. Diese unterschiedliche Sequenzen umfassen Enzyme (Neuberger et al., Nature 312: 604 (1984)), konstante Regionen von Immunglobulinen anderer Arten und konstante Regionen anderer Immunglobulinketten (Sharon et al., Nature 309: 364 (1984); Tan et al., J. Immunol. 135: 3565–3567 (1985)).
In anderen Situationen wie beispielsweise bei diagnostischen Bildgebungsverfahren, Antikörper-Rezeptor-Blockierung oder Antikörper-vermitteltem Wirkstofftransport, können Isotypen, die Fc-Rezeptoren schlecht (oder gar nicht) binden und/oder bezüglich Komplement-vermittelter Lyse relativ ineffektiv sind (wie beispielsweise IgG2, IgG4 oder IgA), die Isotypen der Wahl sein.
Molekulare Manipulationen und Transfektomtechnologie sind beliebte Verfahren, um Nagetier-Antikörper mit interessanten Spezifitäten zu "humanisieren". Diese chimären Nagetier-Mensch Antikörper sollen weniger antigen und brauchbarer für die menschliche Therapie sein (Co, M. S., Deschamps, M., Whitley, R. J., und Queen, C. (1991). Humanized antibodies for antiviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869–2873).
Im Allgemeinen umfasst ein Beispiel für ein Verfahren, welches zur Herstellung chimärer Antikörper verwendet werden kann, die folgenden Schritte:

a) Identifizierung und Klonierung des korrekten Gensegments, das für den Antigen-bindenden Teil des Antikörpers kodiert; dieses Gensegment (bekannt als die VDJ, d. h. variable, Diversitäts- und verbindende Regionen für schwere Ketten oder VJ-, d. h. variable, verbindende Regionen für leichte Ketten oder einfach als die V oder variable Region) kann entweder in der cDNA- oder der genomischen Form vorliegen;
b) Klonierung des Gensegments, das die konstante Region oder den gewünschten Teil davon kodiert;
c) Ligation der variablen Region mit der konstanten Region, so dass der vollständige chimäre Antikörper in einer transkribierbaren und translatierbaren Form kodiert ist;
d) Ligation dieses Konstrukts in einen Vektor, der einen selektierbaren Marker und Gensteuerungsregionen wie beispielsweise Promotoren, Enhancer und Poly(A)Additionssignale enthält;
e) Amplifikation dieses Konstrukts in Bakterien;
f) Einführen dieser DNA in eukaryotische Zellen (Transfektion), meistens in Lymphozyten von Säugetieren;
g) Selektion auf Zellen, die den selektierbaren Marker exprimieren;
h) Screening auf Zellen, die den gewünschten chimären Antikörper exprimieren;
k) Testen des Antikörpers auf geeignete Bindungsspezifität und Effektorfunktionen.

Andere Verfahren zur Herstellung chimärer Antikörper sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Die Identifizierung chimärer Antikörper, welche die Bindungstelle des BR110 Antikörpers erkennen, stellt Routine dar, und kann z. B. über Kompetitionsassays erfolgen (E. Harlow and D. Lane, Hrsg., "Antibodies a laboratory manual" 1988, Seiten 567–577).
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper BR110 kann auch hergestellt werden, indem die variablen Regionen des BR110 Liganden und eine menschliche konstante Region mit chemischen Mittel chemisch konjugiert werden, z. B. Konjugation mit (2) Disulfiderzeugenden Agentien wie beispielsweise 3-(2-Pyridyldithio)propionat (SPDP), (2) Thioether-Bindungen, (3) aktiviertes Chlorambucil, (4) säurelabilen und durch Licht spaltbaren Quervernetzern, und (5) Avidin-Biotin-Bindungen (Stevenson, F. K., Bell, A. J., Cusack, R., Hamblin, T. J., Slade, C. J., Spellerberg, M. B., und Stevenson, G. T. (1991). Preliminary studies for an immunotherapeutic approach to the treatment of human myeloma using chimeric anti-CD38 antibody. Blood 77, 1071–1079; S. Wong "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking" (1993) CRC Press, Inc.).
Andere Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Liganden sind möglich (Liu, A. Y., Robinson, R. R., Murray, E. D. Jr., Ledbetter, J. A., Hellstrom, I., und Hellstrom, K. E. (1987a). Production of a mouse-human chimeric monoclonal antibody to CD20 with potent Fc-dependent biologic activity. J. Immunol. 139, 3521–3526).
Die vorliegende Erfindung stellt auch bispezifische BR110 monoklonale Antikörper bereit. Die Herstellung bispezifischer BR110 monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, dieselbe antigene Determinante wie der BR110 Antikörper zu binden, stellt Routine dar (Haber et al., 1990; Wels, W., Harwerth, I. M., Zwickl, M., Hardman, N., Groner B., Hynes, N. E. (1992) Construction, bacterial expression and characterization of a bifunctional single-chain antibody phosphatase fusion protein targeted to the human ERBB-2 receptor. Biotechnology 10: 1128–1132; A. Traunecker et al. (1991) EMBO Journal 10(12): 3655–3659).
Erfindungsgemäße BR110 Antikörperfragmente
BR110 Antikörperfragmente umfassen Fv-Moleküle, Fab-Moleküle, Fab'-Moleküle, F(ab')₂-Moleküle.
Der BR110 Ligand aus der Maus mit der ATCC Nr. 11698 kann über Affinitätschromatographie aus Aszitesflüssigkeit der Maus aufgereinigt werden. F(ab')₂-Fragmente können durch Verdauen von aufgereinigtem BR110 monoklonalen Antikörper mit Pepsin nach Lamoyi, "Preparation of F(ab')₂ Fragments from Mouse IgG of Various Subclasses", Meth. Enzymol. 121: 652–663 (1986) erzeugt werden.
Alternativ können F(ab')₂-Fragmente durch Mittel der Genmanipulation unter Verwendung von Routineverfahren hergestellt werden (Mayforth R. D., Quintans, J. (1990) Current Concepts: Designer and catalytic antibodies. New Engl. J. Med. 323: 173–178; Waldmann, T. A. (1991) Monoclonal antibodies in diagnosis and therapy. Science 252: 1657–1662; Winter, G., Milstein, C. (1991) Man-made Antibodies. Nature 349: 293–299; Morrison, S. L. (1992) In Vitro antibodies: strategies for production and application. Ann. Rev. Immunol. 10: 239–266; Haber et al. 1990; Wels, W., Harwerth, I. M., Zwickl, M., Hardman, N., Groner B., Hynes, N. E. (1992) Construction, bacterial expression and characterization of a bifunctional single-chain antibody phosphatase fusion protein targeted to the human ERBB-2 receptor. Biotechnology 10: 1128–1132; A. Traunecker et al. (1991) EMBO Journal 10(12) 3655–3659).
Die Bindung des ganzen BR110 Liganden kann von der Bindung von F(ab')₂-Fragmenten durch Verwendung von Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Protein A unterschieden werden, welches an den ganzen Antikörper bindet, aber nicht an die F(ab')₂-Fragmente.
BR110 Fab-Fragmente können durch proteolytische Spaltung des intakten BR110 Antikörpers beispielsweise unter Verwendung von Papain hergestellt werden (Parham, P., 1986 Preparation and purification of active fragments from mouse monoclonal antibodies. In "Handbook of experimental immunology. In four volumes" Volume 1 "Immunochemistry" (Hrsg. D. W. Weir et al.) Seiten 14.1–14.23, Blackwell Scientific Publishers, Oxford.) Parham P (1986) Preparation and purification of active fragments from mouse monoclonal antibodies. In: Weir DM and Herzenberg LA (Hrsg.) Handbook of Experimental Immunology, 4 Aufl. Bd. 1, S. 14. Oxford: Blackwell Scientific Publications).
Alternativ können Fab-Fragmente durch Mittel der Genmanipulation unter Verwendung von Routineverfahren hergestellt werden (Huse et al. 1989 "Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin receptor in phage lambda" Science 246: 1275–1281).
PROTOKOLL FÜR DIE KONSTRUKTION UND AUFREINIGUNG VON BR110 LIGANDENKONJUGATEN UND FUSIONSPROTEINEN
Die Erfindung stellt BR110 Immunkonjugate bereit, die einen BR110 Liganden umfassen, der mindestens mit einem Teil eines biologisch oder chemisch aktiven Moleküls verknüpft ist (Batra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8545–8549 (1989); Kondo et al., J. Biol. Chem. 263: 9470–9475 (1988); and Batra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8545–8549 (1989). Das biologisch oder chemisch aktive Molekül, beispielsweise ein zytotoxisches Agens, kann das Zellwachstum inhibieren oder stoppen oder anderweitig zum Nachteil der Zelle wirken.
In Übereinstimmung mit der Ausführung der Erfindung umfassen biologisch oder chemisch aktive Moleküle, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Enzym, Lymphokin, ein Toxin, ein paramagnetisches Isotop, Biotin, ein Fluorophor, ein Chromophor, ein Schwermetall, ein Radioisotop oder ein chemotherapeutisches Agens. Geeignete Beispiele für Toxine umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Pseudomonas Exotoxin, Ricin, Bryodin und Diphtherie-Toxin. Zusätzliche Beispiele umfassen Bleomycin, Daktinomycin, Daunorubicin, Doxorubincin, Mitroxantron, Mitomycin, Cisplatin und Procarbazin.
Dem Fachmann bekannte Verfahren der Genmanipulation können wie hierin beschrieben verwendet werden, um rekombinante Immunotoxine herzustellen, die durch Ligation einer die Antigen-bindende Region von BR110 kodierenden DNA-Sequenz mit einer DNA-Sequenz, die ein biologisch oder chemisch aktives Molekül kodiert, auf DNA-Ebene und Exprimieren des zytotoxischen Moleküls als rekombinantes Protein in einer tranformierten Wirtszelle produziert werden. Rekombinante Immunotoxine sind homogene Moleküle, welche die Spezifität des zellbindenden Teils des BR110 Antikörpers zusammen mit dem zytotoxischen Potential des Toxins beibehalten (Kondo et al, J. Biol. Chem. 263: 9470–9475 (1988); Siegall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9738–9742 (1988) Pastan, I., und FitzGerald, D. (1991). Recombinant toxins for cancer treatment. Science 254., 1173–1177. Pastan, I., Willingham, M. C., und FitzGerald, D. J. (1986). Immunotoxins. Cell 47, 641–648).
Rekombinante Immunkonjugate, insbesondere Single-Chain-Immunkonjugate haben insofern einen Vorteil gegenüber Wirkstoff/Antikörper-Konjugaten, als dass sie einfacher als diese Konjugate hergestellt werden können und eine Population homogener Moleküle erzeugen, d. h. einzelne Polypeptide, die aus den gleichen Aminosäureresten zusammengesetzt sind (Trail, P. A., et al. Cure of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubicin immunoconjugates. Science. 261: 212–215, 1993). Wenn das biologisch oder chemisch aktive Molekül ein Toxin oder Wirkstoff ist, ist das Konjugat wirksamer als sein nicht-konjugiertes Gegenstück.
D. VERWENDUNGEN DER ERFINDUNGSGEMÄßEN LIGANDEN
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion von BR110 Antigen in Gewebeschnitten eines Individuums bereit. Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung kann das Individuum ein Mensch, Pferd, Schwein, Rind, eine Maus, ein Hund, eine Katze oder ein Vogel sein. Andere warmblütige Tiere sind ebenfalls einbezogen.
Dieses Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen der Gewebeschnitte mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper. Die Bedingungen, unter denen die Gewebeschnitte mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht werden, sind dergestalt, dass Bindung unter Komplexbildung erfolgt. Nach der Bildung des Komplexes kann das Antigen unter Verwendung allgemein bekannter und entwickelter Methoden und kommerzieller Systeme detektiert werden. (Gatter KC, Falini B and Mason DY (1984) The use of monoclonal antibodies in histopathological diagnosis. Recent Advances in Histopathology 12, 35; Boeckmann E, Baum RO, Schuldes H, Kramer W, Hertel A, Baew-Christow T, Hanke P, Jonas D and Hör G (1990) Tumour imaging of bladder carcinomas and their metastases with ¹¹¹In-labelled monoclonal anti-CEA antibody BW 431/26. British Journal of Cancer 62 (Suppl.), 81).
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform stammt der Gewebeschnitt aus Brustgewebe, und das neoplastische Gewebe ist ein Brustkarzinom. Alternativ ist das Gewebe Kolongewebe, und das neoplastische Gewebe ist ein Adenokarzinom. Das Gewebe ist weiterhin Lungengewebe, und das neoplastische Gewebe ist ein Lungenkarzinom. In einer weiteren Ausführungsform ist das Gewebe auch Eierstock-Gewebe, und das neoplastische Gewebe ein Eierstock-Karzinom.
Im Allgemeinen bestehen die Gewebeschnitte aus einem Gewebe, bei dem normales Gewebe durch das Fehlen oder durch niedrige Konzentrationen des BR110 Antigens und, neoplastisches Gewebe durch das Vorhandensein hoher Konzentrationen des BR110 Antigens charakterisiert ist.
Bei der Ausführung der Erfindung kann der an die Gewebeschnitte gebundene monoklonale Antikörper unter Verwendung eines an den Antikörper angefügten markierten Markers direkt detektiert werden. Alternativ kann der an die Gewebeschnitte gebundene monoklonale Antikörper durch In-Konakt-Bringen des monoklonalen Antikörpers mit einem zweiten Antikörper detektiert werden. Der zweite Antikörper kann mit einem detektierbaren Marker markiert sein. Nach dem Kontakt bildet der an die Gewebeschnitte gebundene monoklonale Antikörper einen Komplex mit dem zweiten Antikörper. Der Komplex wird über Detektion des zweiten derart gebundenen Antikörpers detektiert.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung des Unterschieds des Grads der Verteilung von BR110 Antigen in Gewebeschnitten aus zu testendem neoplastischem Gewebe relativ zur Menge und Verteilung von BR110 Antigen in Gewebeschnitten aus normalen Gewebe bereit. Dieses Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen sowohl des zu testenden Gewebes als auch des normalen Gewebes mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, so dass die Detektion wie vorstehend beschrieben durchgeführt werden kann. Nachdem die Detektion durchgeführt wurde, kann eine Bestimmung des Unterschieds der Menge und Verteilung von BR110 Antigen vorgenommen werden. Diese Bestimmung ist eine quantitative Bestimmung, d. h. eine Zählung der Anzahl der so detektierten Antigene oder eine visuelle Bestimmung, d. h. eine Bestimmung, welche Probe dunkler oder heller ist, oder eine bestimmte Farbe aufweist, usw.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Diagnostizieren eines neoplastischen Zustands in einem Individuum bereit. In einer Ausführungsform umfasst dieses Verfahren die Bereitstellung einer Gewebeprobe des Individuums. Die Gewebeprobe wird dann mit dem erfindungsgemäßen Antikörper in Kontakt gebracht, so dass das Vorhandensein des BR110 Antigens in solchen Gewebeschnitten die Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und dem Antigen bewirken wird. Das Vorhandensein des Komplexes wird detektiert. Wenn in der Probe eine höhere Konzentration des Komplexes detektiert wird als in normalem Gewebe, dann zeigt diese Konzentration einen neoplastischen Zustand an, und kann weitere Tests rechtfertigen.
Alternativ kann die Detektion eines Tumors durch Verwendung einer biologischen Flüssigkeitsprobe erreicht werden, um menschlichen Krebs in einem Individuum zu detektieren. Verfahren der serologischen Diagnostik beinhalten die Detektion und Quantifizierung Tumor-assoziierter Antigene, die in das Serum oder andere biologische Flüssigkeiten von Patienten sekretiert oder "ausgeschieden" wurden, von denen man annimmt, dass sie an einem Karzinom leiden. Solche Antigene können in den Körperflüssigkeiten unter Verwendung von Verfahren wie beispielsweise Radioimmunassays (RIA) oder enzymgebundenen Immunsorbentassays (ELISA), die dem Fachmann bekannt sind, detektiert werden, bei denen ein mit dem "abgeschiedenen" Antigen reaktiver Antikörper verwendet wird, um das Vorhandensein des Antigens in der Flüssigkeitsprobe zu detektieren (Uotila et al., "Two-Site Sandwich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP", J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981) and Allum et al., supra Seiten 24–51).
Aus dem vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, dass die erfindungsgemäßen BR110 Antikörper in den meisten Assays verwendet werden können, die Antigen-Antikörper-Reaktionen beinhalten. Diese Assays umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Standard-RIA-Verfahren, sowohl in flüssiger als auch fester Phase, ebenso wie ELISA-Assays, Immunfluoreszenzverfahren und andere immunzytochemische Assays (Sikora et al. (Hrsg.), Monoclonal Antibodies, Seiten 32–52 (Blackwell Scientific Publications 1984).
VERABREICHUNG VON BR110 LIGANDEN AN LEBEWESEN
Die BR110 Liganden können in einer Menge an Lebewesen verabreicht werden, die ausreicht, um die Proliferation der Zielzellen zu verlangsamen oder sie völlig abzutöten. Dem Fachmann ist klar, dass ein optimales Schema für die Verabreichung von BR110 Liganden in Abhängigkeit vom Individuum, der Größe und dem Gewicht des Individuums und der Schwere der Krankheit variiert (G. Goodman, et al., J. Clin. Oncol., 8, 1083 (1990). (Nedelman, MA, Shealy DJ, Boulin R, Brunt E, Seasholtz JI, Allen E, McCartney JE, Warren FD, Oppermann H, Pang RHL, Berger HJ and Weisman HF (1993) Rapid infant imaging with a Technetium-99m-labelled anti-myosin recombinant single-chain Fv: evaluation in a canine model of acute myocardial infarction. Journal of Nuclear Medicine 34, 234. Courtnay-Luck, N. S., and Epenetos, A. A. (1990). Targeting of monoclonal antibodies to tumors. Curr. Opinion Immunol. 2, 880–883). Letztendlich wird die Verwendung und das Schema der Verabreichung vom behandelnden Arzt bestimmt werden. Klinische Protokolle zur Bestimmung von Dosierungsbereichen und Schemata sind Standard.
ERFINDUNGSGEMÄßE ANTIKÖRPER UMFASSENDE ZUSAMMENSETZUNGEN
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper umfassen, an den ein biologisch oder chemisch aktives Agens angefügt ist.
In einer Ausführungsform ist das biologisch oder chemisch aktive Agens ein Toxin. Das Toxin ist ausgewählt aus der Gruppe, die, ohne darauf beschränkt zu sein, Ricin, Diphtherie-Toxin, Pseudomonas Exotoxin-A, Abrin, Supporin und Gelonin umfasst.
Alternativ umfasst das biologisch oder chemisch aktive Agens ein Enyzm, einen Wirkstoff oder ein DNA-Fragment (Nedelman, MA, Shealy DJ, Boulin R, Brunt E, Seasholtz JI, Allen E, McCartney JE, Warren FD, Oppermann H, Pang RHL, Berger HJ and Weisman HF (1993) Rapid infant imaging with a Technetium-99m-labelled anti-myosin recombinant single-chain Fv: evaluation in a canine model of acute myocardial infarction. Journal of Nuclear Medicine 34, 234).
Das Anfügen des Enzyms, des Wirkstoffs oder DNA-Fragments an monoklonale Antikörper ist allgemein bekannt (Pollard-Knight D, Hawkins E, Yeung D, Pashby DP, Simpson M, McDougall A, Buckle P and Charles SA (1990) Immunoassays and nucleic acid detection with a biosensor based on surface plasmon resonance. Annales de Biologie Clinique 48, 642; Kronick MJ and Little WA (1974) A new immunosassay based on fluorescent excitation by internal reflection spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 71, 4553).
VORTEILE DER ERFINDUNG
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind wie andere Antikörper, die menschliche Tumor-assoziierte Antigene erkennen, zusätzliche Elemente im Arsenal der diagnostischen und therapeutischen Agenzien im Kampf gegen die Krankheit.
Der BR110 Ligand ist nicht nur deswegen brauchbar, weil er ein Tumor-spezifischer Antikörper ist, sondern auch, weil er ein internalisierender Antikörper ist. Antikörper dieses Typs finden Anwendung bei therapeutischen Verfahren zum selektiven Töten von Zellen unter Verwendung von Antikörper-Wirkstoff- oder Antikörper-Toxin-Konjugaten ("Immuntoxine"), bei denen ein therapeutisches Antitumor-Agens zum Transport zum Tumor chemisch oder biologisch mit einem Antikörper oder Wachstumsfaktor verbunden ist, wobei der Antikörper an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Rezeptor, gegen den es reaktiv ist, bindet und das Antitumor-Agens innerhalb der Tumorzellen "abliefert" (Embleton et al., "Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Seiten 317–44 (Academic Press, 1985)).
Zum vollständigeren Verständnis der hierin beschriebenen Erfindung werden die nachfolgenden Beispiele angeführt. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung, ohne in irgendeiner Weise den Schutzumfang zu beschränken.
BEISPIEL 1
Herstellung des monoklonalen Antikörpers BR110
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper BR110 wurde unter Verwendung von Verfahren der Hybridom-Fusion hergestellt, wie sie zuvor von M. Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1979), supra und Yeh et al., Int. J. Cancer (1982), supra, beschrieben wurden.
Um es kurz zusammenzufassen, wurden BALB/c Mäuse unter Verwendung von Neuramindase-vorbehandelten menschlichen H3922 Brustkarzinomzellen (10⁷ Zellen) immunisiert. Die Mäuse erhielten mehrfache Immunisierungen (x6). Beim ersten Mal erhielten die Mäuse eine intraperitoneale Injektion unter Verwendung von RIBI Adjuvans. Beim zweiten bis zum sechsten Mal erhielten die Mäuse eine intraperitoneale Injektion ohne RIBI Adjuvans.
Die jedes Mal injizierte Gesamtzahl von Zellen betrug ungefähr 10⁷ Zellen. Vier Tage nach der letzten Immunisierungen wurden die Milzen entnommen und Milzzellen in RPMI-Kulturmedium suspendiert. Die Milzzellen wurden dann in Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG) mit P2x63-Ag8.653 Mausmyelomzellen fusioniert und die Zellsuspension in Mikrotiter-Wells wie von Yeh et al., supra (siehe auch Kohler und Milstein, Nature 256: 495–97 (1975) und Eur. J. Immunol., 6: 511–19 (1976)] beschrieben selektiv in HAT-Medium kultiviert. Das Gemisch wurde zur Bildung von Kulturen niedriger Dichte ausgesät, die von einzelnen fusionierten Zellen oder Klonen abstammten.
Die Überstände dieser Hybridom-Kulturen wurden dann auf direkte Bindungsaktivität auf der Krebszelllinie, H3922, unter Verwendung eines ELISA-Assays gescreent, der dem von Douillard et al., "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay For Screening Monoclonal Antibody Production Using Enzyme-Labeled Second Antibody", Meth. Enzymol., 92: 168–74 (1983) ähnlich war.
Gemäß diesem Assay wird Antigen (mit dem der Antikörper, auf den gescreent wird, reaktiv ist) auf Miktrotiterplatten immobilisiert und dann mit Hybridomüberständen inkubiert. Wenn ein Überstand den gewünschten Antikörper enthält, bindet der Antikörper an das immobilisierte Antigen und wird durch Zugabe eines Anti-Immunglobulin-Antikörper-Enzymkonjugats und eines zu einer messbaren Änderung der optischen Dichte führenden Substrats für das Enzym detektiert.
In den vorliegenden Untersuchungen wurden die Brustkrebszelllinie H3922 und menschliche Fibroblasten in eine 96-Well-Zellkulturplatte (Costar Cambridge, MA) gegeben und über Nacht in einem feuchten Inkubator bei 37°C, 5% CO₂, inkubiert.
Die Zellen wurden dann mit 100 μl frisch angesetztem 2% Paraformaldehyd fixiert, 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit Probenverdünner (Genetic Systems, Seattle, WA) 1 h bei Raumtemperatur blockiert, wobei dies die Inkubationsbedingung für den gesamten Assay war. Nach Waschen mit PBS wurden dann Hybridomüberstände oder aufgereinigter Antikörper zugegeben und 1 h inkubiert. Die Platten wurden mit PBS gewaschen und ein in Kulturmedium (IMDM, Gibco, NY 10% FBS) verdünnter MAb (Ziege-Anti-Maus IgG/M, Tango Burlingname, CA) für den zweiten Schritt wurde zugegeben und 1 h inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde gepuffertes Substrat (Genetic Systems) zugegeben und die Reaktion mit Stoppreagenz (Genetic Systems) nach einer Inkubationsdauer von 15 min gestoppt. Die Extinktion wurde bei OD 450/630 nm (Dynatech Microelisa Autoreader) abgelesen.
Die Überstände aus den Hybridomkulturen wurden dann mit 100 μl/Well zugegeben, die Wells 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. In einem nächsten Schritt wurde in 0,1% BSA und PBS verdünnte Ziege-Anti-Maus-Meerrettichperoxidase (Zymed, CA) bis auf eine Konzentration von 100 μl/Well zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde entweder 1 h bei Raumtemperatur oder 30 min bei 37°C inkubiert und die Zellen dann dreimal mit PBS gewaschen. o-Phenylendiamin (OPD) wurde dann mit 100 μl/Well zugegeben und die Platten im Dunklen 5–45 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Antikörperbindung an die Zellen wurde über eine Farbänderung in den Wells detektiert, die innerhalb von 10–20 min auftrat. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl/Well H₂SO₄ gestoppt und die Extinktion in einem Dynatech (Alexandria, VA) Microelisa autoreader^® bei 490 nm gemessen.
Dieser Assay kann unter Verwendung von kultivierten adhärenten lebenden oder fixierten Zellen, lebenden oder fixierten Zellen in Suspension, aufgereinigtem löslichem Antigen und Zellextrakten als dem immobilisierten Antigen durchgeführt werden.
Hybridome, die Antikörper mit einer Bindungsreaktivität gegen die Krebszelllinie H3922, aber nicht gegen menschliche Fibroblasten hervorbrachten, wurden somit selektiert, kloniert und die Spezifität der Subklone wurde bestätigt. Die Hybridom-Kultur wurde dann in vitro zur Antikörperproduktion vermehrt. Wie vorstehend offenbart, wurde der Antikörper BR110 über Affinitätschromatographie auf immobilisiertem Protein A (RepliGen, Cambridge, MA) vom Hybridom-Überstand aufgereinigt. Der endgültige Formulierungspuffer war PBS, und der Antikörper wurde steril filtriert und gekühlt oder eingefroren bei –70°C gelagert.
Gegen PBLs nicht reaktive Hybridome wurden kloniert, in vitro vermehrt und weiter auf ihre Antikörperspezifität hin getestet. Diejenigen Hybridome, die gegen menschlichen Brustkrebs reaktive Antikörper produzierten, wurden erneut kloniert, vermehrt und in 3-Monate alte, mit Pristan geprimte BALB/C Mäuse injiziert, wo sie zu Aszites-Tumoren heranwuchsen.
Gemäß diesem Verfahren wurde die Hybridomzelllinie BR110 erhalten, kloniert und in Mäuse injiziert, um sich dort als Aszites-Tumor zu entwickeln. Wie vorstehend offenbart, wurde das BR110 Hybridom bei der ATCC hinterlegt.
Monoklonaler BR110 Antikörper wurde über Affinitätschromatographie auf immobilisiertem rekombinantem Protein A (Repligen, Cambridge, MA) aus Aszites aufgereinigt. Geklärter Aszites wurde mit einem gleichen Volumen Bindungspuffer (1 M Kaliumphosphat, pH 8) verdünnt und auf eine zuvor mit Bindungspuffer äquilibrierte Protein A-Säule aufgetragen.
Die Säule wurde ausgiebig mit Bindungspuffer gewaschen und der Antikörper dann mit 50 mM Phosphorsäure, pH 3, eluiert. Die aufgereinigte Antikörperfraktion wurde mit 1 M Tris, pH 9, neutralisiert und dann gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert.
Aufgereinigter BR110 Ligand wurde schließlich steril filtriert und gekühlt oder eingefroren gelagert.
BEISPIEL 2
Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers BR110
Bestimmung des Isotyps
Zur Bestimmung der vom Hybridom BR110 produzierten Klasse von Immunglobulin wurde das folgende ELISA-Verfahren verwendet: Dynatech Immulon 96-Well-Platten wurden mit Ziege-Anti-Maus-Antikörpern der Subklasse IgG (Southern Biotech, Birmingham, AL) bei einer Konzentration von 1 mg/ml in PBS beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert.
Auf der Grundlage dieses Verfahrens wurde bestimmt, dass der monoklonale Antikörper BR110 den Isotyp Gamma 2a aufweist.
Immunhistologie
Das Peroxidase-Antiperoxidase (PAP)-Verfahren nach L. A. Sternberger wie in Immunochemistry, S. 104–69 (John Wiley & Sons, New York, 1979) beschrieben und wie von H. J. Garrigues et al., "Detection Of A Human Melanoma-Associated Antigen, S. 97, In Histological Sections Of Primary Human Melanomas". Int. J. Cancer, 29: 511–15 (1982) modifiziert, wurde für die immunhistologischen Untersuchungen verwendet. Die Zielgewebe für diese Tests wurden durch Chirurgie erhalten und innerhalb von 4 h nach der Entnahme unter Verwendung von in flüssigem Stickstoff vorgekühltem Isopentan eingefroren.
Die Gewebe wurden dann bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff oder bei –70°C gelagert. Gefrorene Schnitte wurden hergestellt, luftgetrocknet, mit Aceton behandelt und erneut getrocknet siehe [Garrigues et al., supra]. Schnitte für die histologische Untersuchung wurden mit Hämatoxylin gefärbt.
Um nicht-spezifischen Hintergrund zu verringern, wurden die Schnitte mit normalem menschlichem Serum präinkubiert, das 1/5 in PBS verdünnt war (H. J. Garrigues et al., "Detection Of A Human Melanoma-Associated Anigen, S. 97, In Histological Sections of Primary Human Melanomas", Int. J. Cancer, 29: 511–15 (1982)). Maus-Antikörper, Kaninchen-Anti-Maus IgG und Maus PAP wurden in einer Lösung von 10% normalem menschlichem Serum und 3% Kaninchenserum verdünnt. Kaninchen-Anti-Maus IgG (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) wurde bei einer Verdünnung von 1/50 verwendet. Maus-PAP-Komplexe (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.), die 2 mg/ml spezifisch aufgereinigtes PAP enthielten, wurden bei einer Verdünnung von 1/80 verwendet.
Das Färbeverfahren bestand aus der Behandlung serieller Schnitte für 2,5 h mit entweder spezifischem Antikörper, d. h. BR110, oder einem Kontrollantikörper, 30-minütiger Inkubation der Schnitte bei Raumtemperatur mit 1/50 verdünntem Kaninchen-Anti-Maus IgG, worauf man die Schnitte 30 min bei Raumtemperatur 1/80 verdünnten Maus-PAP-Komplexen aussetzte. Nach jeder Behandlung mit Antikörper wurden die Objektträger zweimal in PBS gewaschen.
Die immunhistochemische Reaktion wurde durch Zugabe von frisch angesetztem 0,5% 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 0,01% H₂O₂ in 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,6, 8 min entwickelt (Hellstrom et al., J. Immunol. 127: 157–60 (1981)). Die Färbung wurde intensiviert, indem man das Präparat 20 min einer 1% OsO₄-Lösung in destilliertem Wasser aussetzte. Die Schnitte wurden mit Wasser gespült, in Alkohol dehydratisiert, in Xylol geklärt und auf Objetkräger aufgetragen. Parallele Schnitte wurden mit Hämatoxylin gefärbt.
Die Objektträger wurden kodiert bewertet und die kodierten Proben durch einen unabhängigen Wissenschaftler überprüft. Repräsentative Objektträger wurden unter Verwendung von Optik für differentiellen Interferenzkontrast (Zeiss-Nomarski) fotografiert. Der Grad der Antikörpertärbung wurde bewertet mit 0 (keine Reaktivität), + (einige schwach positive Zellen), ++ (mindestens ein Drittel der Zellen positiv), +++ (die meisten Zellen positiv), ++++ (annähernd alle Zellen stark positiv). Da die Unterschiede zwischen Färbungen mit der Stärke + und 0 weniger deutlich waren als die Unterschiede zwischen Färbungen mit der Stärke + und ++, wurde eine mit ++ oder mehr bewertete Färbung als „positiv" erachtet. In Tumorproben wurden sowohl neoplastische als auch Stromazellen beobachtet. Die wiedergegebene Färbung ist die der Tumorzellen, da Stromazellen überhaupt nicht oder viel schwächer als die Tumorzellen gefärbt wurden.
Tabelle 1 zeigt die immunhistologische Färbung verschiedener Tumorproben und Normalgewebeproben unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers BR110. Wie die Tabellen deutlich zeigen, reagiert der Antikörper BR110 mit einer großen Auswahl menschlicher Karzinomproben.
Bindungsassays
Die Erkennung von Zelloberflächenantigenen durch den MAb BR110 wurde über Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Coulter Epics C FACS für eine Vielzahl von Karzinomzelllinien festgestellt.
Einzelzellsuspensionen wurden in Kulturmedium (IMDM Gibco, NY, 10% FBS) bei einer Konzentration von 5 × 10⁵ bis 1 × 10⁶ Zellen in Aliquots aufgeteilt. FITC-konjugierter Mab BR110 wurde den resuspendierten Zellpellets bei einer Konzentration von 10 μg/ml, verdünnt in Kulturmedium, zugegeben, worauf sich eine einstündige Inkubation auf Eis anschloss. Nach Waschen der Zellen in Kulturmedium wurden die Proben auf durchschnittliche Fluoreszenzintensität analysiert. Bindungsverhältnisse wurden berechnet, indem das lineare Fluoreszenzäquivalent (LFE) durch das LFE der Negativkontrolle geteilt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Bestimmung der Antigenbindungsstellen pro Zelle
Zellbindungsassays wurden mit FITC-konjugiertem MAb BR110 unter Verwendung der Zelllinien H3619 und H2987 durchgeführt, worauf sich eine FACS-Analyse anschloss. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität wurde nach Färbung mit zweifachen Verdünnungen des Antikörpers 50 auf 0,38 mg/ml ermittelt. Fluoreszierende Beads mit bekannter Größe und Intensität ergaben eine Standardkurve, die in die Berechnung der Fluoreszenzäquivalente durch Antikörperbindung einbezogen wurde. Für beide Zelllinien wurde die Anzahl der Bindungsstellen mit 8 × 10⁴ Stellen/Zelle bestimmt.
BEISPIEL 3
Internalisierung von BR110
Um zu bestimmen, ob BR110 durch Antigen-positive Karzinomzellen internalisiert werden konnte, wurde ein indirekter Inhibitionsassay unter Verwendung eines Ricin-A-Kettekonjugierten Antikörpers verwendet.
Nach diesem Assay ist die Inhibierung das H3-Thymidineinbaus in zelluläre DNA ein Maß für die zytotoxische Wirkung des verabreichten Konjugats und gibt die Internalisierung der Ricin-A-Kette durch die Karzinomzellen wieder.
Karzinomzellen wurden in einer Mikrotiterplatte mit 96 Wells mit 5 × 10³ Zellen/Well ausplattiert und anschließend bei 37°C, 5% CO₂ über Nacht inkubiert. Hybridom-Überstand (unverdünnt und in zehnfacher Verdünnung) wurde der Kultur zugegeben und 1 Stunde auf Eis inkubiert. Nach Waschen mit Kulturmedium wurde ein Ziege-Anti-Maus-IgG-Ricin-A-Kette-Antikörper (Inland Laboratories, Austin, TX) bei einer Konzentration vom 5 mg/ml für eine Inkubationsdauer von 42 h bei 37°C zugegeben, woraufhin 50 μl 3H-Thymidin mit 1 mCi/Well zugegeben wurden und die Platte weitere 6 h bei 37°C inkubiert wurde. Die Assay-Platten wurden dann mehrere Stunden bei –70°C eingefroren, aufgetaut und die Zellen unter Verwendung eines Zellernters (Wallac, LKB) auf Glasfaserfilter (Wallac, Finnland) geerntet. Nach Zugabe von Szintillationsflüssigkeit wurden die Filtermatten in einem Flüssig-Szintillationszähler (Wallac, LKB) ausgezählt.
Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Inhibierung des H3-Thymidineinbaus bei der experimentellen Gruppe gegenüber einer unbehandelten Kontrolle ausgedrückt. Nach Behandlung mit MAb BR110 zeigt die Karzinomzelllinie H3922 eine Wachstumsinhibition von 90% und die Karzinomzelllinie H3396 eine Wachstumsinhibition von 60%, es gibt somit einen Beweis für die Internalisierung des Antikörpers.
In einem weiteren Ansatz zur Untersuchung der Internalisierung von BR110 wurden Karzinomzellen über confokale Mikroskopie (Leica Confocal Laser Scanning Mikroskop) analysiert.
Man ließ in IMDM/10% FBS kultivierte Karzinomzellen (H3619, H3396, H3922) 48 h an Glasobjektträger adhärieren. Die Zellen wurden 15 min bei 4°C gehalten. FITC-konjugierter Antikörper BR110 oder FITC-konjugierter Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper (Tago, Burlingname, CA) als Kontrolle wurden in einer Konzentration von 10 μg/ml 1 Stunde bei 4°C zugegeben. Nicht-gebundener Antikörper wurde durch ausgiebiges Waschen mit kaltem Kulturmedium entfernt. Um Oberflächenfärbung zu detektieren, wurden die Zellen mit kaltem PBS gewaschen und 15 min mit 2% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert, worauf sich eine Behandlung mit dem Anti-Fading-Reagens Dithioerythritol (Sigma) anschloss.
Um die Internalisierung von BR110 zu untersuchen, wurde Kulturmedium bei 37°C zugegeben und die Zellen für individuelle Zeiträume inkubiert (0–3 h). Das Zeitverfolgungsexperiment wurde mit kaltem PBS und nachträglicher Fixierung beendet. Die vom confokalen Mikroskop erhaltenen Bilder zeigten, dass der MAb ausschließlich an die Zelloberfläche band, wenn die Zellen zuerst bei 4°C BR110 ausgesetzt wurden. Wenn die Temperatur auf 37°C verschoben wurde und die Zellen 15 min bei dieser Temperatur gehalten wurden, wurde zytoplasmatische Färbung beobachtet. Zu diesem Zeitpunkt war die Bindung von BR110 in den zytoplasmatischen Kompartimenten ungleich verteilt und fehlte im Wesentlichen an der Zelloberfläche. Weder die Zelloberfläche noch das Zytoplasma wurden durch den Kontroll-MAb gefärbt. Diese Daten zeigen, dass BR110 in die Karzinomzellen internalisiert wurde.
Wir testeten MAb GA733 auf Internalisierung mit den Karzinomzelllinien H3396 und SW948. Der Antikörper band bei 4°C ausschließlich an die Zelloberfläche und wies extrem schwache oder keine Internalisierung bei 37°C auf.
Antikörper-abhängige und Komplement-abhängige Zytotoxicität von BR110
ADCC- und CDC-Tests wurden durchgeführt, wobei die Zielzellen (H3396, H3922) mit ⁵¹Cr markiert und 4 h menschlichen Lymphozyten oder menschlichem Serum als Quelle von Komplement sowie BR110 ausgesetzt wurden.
Die Freisetzung von ⁵¹Cr aus den Zielzellen wurde als Nachweis der Tumorzelllyse (Zytotoxizität) gemessen.
BR110 erwies sich als negativ für ADCC und CDC, was auf dessen IgG2a-Isotyp zurückzuführen sein kann.
ELISA-Kompetition
Angesichts der Verwandtschaft der GA733-Gene wurde ein Kompetitionsassay durchgeführt, um die Spezifitätsunterschiede zwischen den MAbs BR110 und GA733 zu bestimmen. Durch FACS-Analyse wurde nachgewiesen, dass beide Proteine (GA733-1 und GA733-2) auf der Zelllinie H3396 vorhanden sind. Bindungsstudien auf Paraformaldehyd-fixierten Zellen zeigten, dass diese Antikörper sich nicht gegenseitig blockieren und folglich an unterschiedliche Epitope binden.
Bestimmung der Avidität oder Affinität
Eine Scatchard-Analyse wurde durchgeführt, um die Avidität von radiomarkiertem BR110 MAb bei Bindung an adhärente nicht-fixierte Zellen zu bestimmen. Die Daten zeigen, dass BR110 bei Tests auf den Zelllinien H3619 und H3396 eine ungefähre Assoziationskonstante (Ka) von 5 × 10^–8 mol/Liter aufweist.
Charakterisierung des BR110-Antigens
Das BR110-Antigen wurde aus der Antigen-positiven Karzinomzelllinie H2987 isoliert. Die Zellen wurden in 1% Triton X-100 solubilisiert und die Antigen-Antikörper-Komplexe über Protein A-Sepharose-Chromatographie und SDS-Page unter nicht-reduzierenden Bedingungen aufgereinigt und über Elektroelution oder Elektroblotting isoliert.
Das Protein mit einem Mr = 66.000 war aminoterminal blockiert. Für das Protein mit Mr = 55.000 Protein wurde eine einzelne aminoterminale Sequenz von 20 Resten erhalten, die vollständige Identität mit dem Tumor-assoziierten Antigen GA733-1 in den Resten 88–107 zeigte.
Eine Spaltung des BR110-Antigens mit Mr = 66.000 durch Bromcyan erzeugte ein Hauptfragment, das über SDS-Page aufgereinigt wurde, isoliert wurde und in seiner Sequenz identisch war mit der bei Rest 63 beginnenden Sequenz von GA733-1, wobei ein Methioninrest vorausging. Diese Daten bestätigen, dass das BR110-Antigen aminoterminal blockiert ist. Fragmentierung war nötig, um Sequenzinformation zu erhalten. Darüber hinaus legen die Daten nahe, dass das Glycoprotein mit Mr = 55.000 ein natürliches Spaltprodukt des Proteins mit Mr = 66.000 ist, welches noch in der Lage ist, an MAb BR110 zu binden.
Das GA733-2 Antigen wurde aus der menschlichen kolorektalen Karzinomzelllinie SW948 aufgereinigt und seine Aminosäuresequenz wurde teilweise bestimmt (Linnenbach, A. J. et al., PNAS 86, 27–31, 1989). Zwei Rekombinanten wurden aus einer Bibliothek mit gesamtem menschlichem Genom isoliert und die vollständige DNA-Sequenz des GA733-1 und GA733-2 Gens wurde bestimmt.
Das GA733-1 Antigen, das von MAb BR110 erkannt wird, ist nahe mit dem GA733-2 Antigen verwandt (d. h. ein Vergleich von Teilaminosequenzen [45 Aminosäuren] weist eine gute Homologie auf), das von den MAbs GA733 und CO17-1A erkannt wird.
Folglich scheint der BR110 MAb eine Spezifität für ein verwandtes, aber einzigartiges Antigen aufzuweisen, das von einem Gen kodiert wird, welches eine Homologie mit Exon 8 der Repeat-Einheit vom Thyroglobulin-Typ 1, der HLA-DR-assoziierten invarianten Kette und der a-Untereinheit des IL-2-Wachstumsfaktorrezeptors aufweist.
TABELLE 1
TABELLE 2
TABELLE 3 Immunohistologie mit monoklonalen Maus-Antikörpern Homogene und heterogene Antigenexpression im Tumor nach Färbung Anzahl positiv/Anzahl getestet Anzahl Homogen Anzahl Heterogen
TABELLE 4 ERKENNUNG VON OBERFLÄCHENANTIGEN DURCH MAb BR110 (DIREKTE FÄRBEMETHODE)
TABELLE 5 ERKENNUNG VON OBERFLÄCHENANTIGEN DURCH MAB BR110 UND MAB733 (INDIREKTE FÄRBEMETHODE)
BEISPIEL 4
Internalisierung von BR110 sFv-PE40 in Karzinomzellen
Materialien und Methoden
Reagenzien und Zellkultur – Aufgereinigtes BR96 sFv-PE40 Immunotoxin, das als Kontrolle verwendet wurde, wurde früher beschrieben (Friedman et al., 1993). Membranbindungs-ELISAs wurden entweder unter Verwendung von polyklonalem BR110-Anti-Idiotyp-Kaninchenserum (Bristol-Myers Squibb) oder von EXA2-1H8, einem monoklonalen Anti-PE-Antikörper der Maus (Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)) durchgeführt. Probenverdünnungsmittel und Konjugatverdünnungsmittel wurden von Genetic Systems (Seattle, WA) geliefert. Ziege-Anti-Maus Ig (H + L)-spezifisches HRP-Konjugat wurde von Southern Biotechnology (Birmingham. AL) bezogen. Poröses HQ-Harz^® wurde von Perceptive Biosystems (Framingham, MA) bezogen. Restriktions- und DNA-modifizierende Enzyme wurden von New England Biolabs und [³H]-Leucin wurde von New England Nuclear (Boston, MA) bezogen. Andere Chemikalien und Reagenzien, einschließlich Protease-Inhibitoren und Glutathion, wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. H3619 Kolonadenokarzinomzellen, H3745 Lungenkarzinomzellen und H3907 Eierstockkarzinomzellen wurden in Iscoves Modifiziertem Dulbecco's Medium (IDMEM) mit 10% fötalem Kälberserum kultiviert. Die MCV-7 Brustkarzinomzelllinie wurde von ATCC bezogen und wie vorstehend beschrieben kultiviert. Der monoklonale Antikörper (mAb) BR110 wurde durch Immunisierung von Mäusen mit der menschlichen Brustkarzinomzelllinie H3922 nach etablierten Verfahren erzeugt.
Aminoterminale Sequenzierung – Ungefähr 10 nMol muBR110 IgG, die aus kontinuierlicher Hybridomzellkultur aufgereinigt worden waren, wurden über 15% SDS-PAGE aufgetrennt und die schweren und leichten Ketten für NH₂-terminale Sequenzanalyse unter Verwendung eines Applied Biosystems 477 Protein Sequencer^® und eines Applied Biosystems 120 PTH Analyzer^® (Hewick et al., 1981; Matsudaira, P. 1987) isoliert. Es wurden 25 Zyklen des Edman-Abbaus durchgeführt. Man erhielt jedoch nur eine aminoterminale Sequenz für die leichte Kette, da anzunehmen war, dass die schwere Kette N-terminal blockiert war.
RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und Amplifizierung – RNA wurde aus 5 × 10⁷ muBR110 Hybridomzellen wie früher beschrieben hergestellt (P. Chomezynski und N. Sacchi, 1987). cDNA wurde unter Verwendung von Gesamt-RNA und der thermostabilen rth Polymerase (r^TH-RT-RNA-PCR Kit^®, Perkin Elmer Cetus) nach den Anweisungen des Herstellers erhalten. Für die Amplifikation des F_v-Gens der schweren Kette verwendeten wir das Primerpaar MHV P9 (MHV = Maus schwere variable Region; 5'-ACTACACGGTACCCGGGATCCATGG^C/_ATTGGA^A/_CCTGCTATTCCTG-3') (Jones und Bendig 1991) und den 3' V_H konstanten Primer (5'-N6GAATTCA^T/_CC-TCCACACACAGG^A/_G ^A/_GCCAGTGGATAGAC-3') (Larrick, et al., 1991). Der 5'-Primer für das Gen der variablen leichten Kette wurde auf der Grundlage der N-terminalen Aminosäuresequenz aus dem Edman-Abbau und einem Datenbank-Alignment mit anderen verwandten Genen leichter Ketten der Maus entworfen. Der 5'-Primer war (5'-CGATCCGAATTCGACATTGTGATGACCCAGTCTCA-3'), während der 3'-V_L-konstante Primer mck-3 (5'N4GAATTCCAAGAAGCACACGACTGAGGCA-3') (Gilland et al., 1991) war. Die Erkennungssequenzen für KpnI und EcoRI sind unterstrichen.
Klonierung amplifizierter cDNA – Die Amplifikationsprodukte von DNA-Fragmenten, die Fv der schweren und leichten Kette kodieren, wurden über Agarosegelelektrophorese identifiziert und wanderten mit einer scheinbaren molekularen Größe von 475 bzw. 375 Basenpaaren. An ihren 5'- und 3'-Enden befinden sich Erkennungsstellen für die Restriktionsendonukleasen KpnI und EcoRI zur Klonierung der PCR-Produkte in pBluescript SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA). Die Nukleotidsequenz wurde für mehrere Klone von Segmenten der Gene schwerer und leichter Ketten von BR110 unter Verwendung doppelsträngiger Plasmid-DNA als Template und des Sequenase 2.0 Reagent Kit^® (United States Biochemical, Cleveland, OH) mit T7 und T3 Sequenzierungsprimern (Pharmacia, Piscataway, NJ) bestimmt.
Konstruktion des BR110 sFv xPE40 Expressionsplasmids – Das für die Herstellung von BR110 sFv x PE40 in E. coli verwendete Expressionsplasmid benutzt den RNA-Polymerase-Promotor des Bakteriophagen T7 (Studier und Moffat, 1986). Die BR110 V-Regionen wurden über PCR amplifiziert, um ihre endständigen Restriktionsschnittstellen unter Verwendung eines 5' V_H PCR-Primers (5'-GCA ATG CATATGCAG ATC CAG TTG GTG CAG TCT GGA C-3'), der die NdeI Restriktionsstelle (unterstrichen) kodiert, und ein ATG-Translationsinitiations-Kodon (fett) und die ersten acht Kodons des V_H-Gens umfasst, zu modifizieren. Der 3' V_L PCR-Primer war (5'-CCA TGG ATG CAT CCG TTT CAG CTC CAG CGT GGT CCC AGC-3'), der die NsiI Restriktionsschnittstelle (unterstrichen) und die letzten neun Kodons des V₁-Gens kodiert. Durch Synthese des 3' V_H PCR-Primers (5'-CCG GCC GGA TCC GCC TCC GCC TGA TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC T3'), der so entworfen war, dass er die Bam HI-Restriktionsschnittstelle (unterstrichen), die erste Hälfte des Linkers (fett) und die letzten acht Kodons des V_H-Gens aufwies, inserierten wir auch einen flexiblen Linker, (Gly₄Ser)₃, zwischen den beiden V-Domänen (Huston et al., 1988; Chaudhary et al., 1989). Der 5' V_L PCR-Primer (5'-CCG GCC GGA TCC GGC GGT GGC GGT TCT GGC GGT GGC GGT TCT GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAC-3') kodiert die BamHI-Restriktionsschnittstelle (unterstrichen), die zweite Hälfte des Linkers (fett) und die ersten acht Kodons des V_L-Gens. Die BamHI-Restriktionsschnittstelle wurde verwendet, um die beiden PCR-Produkte zu ligieren, woraufhin Reamplifizierung über PCR unter Verwendung der 5'- V_H- und V_L-Primer erfolgte (Sambrook et al., 1989). In pBW7.0, einem Vektor auf der Basis von pMS8 (+), wurde dann über NdeI + NsiI-Verdau und anschließender Ligation BR96 sFv (McAndrew, 1995) durch BR110 sFv ersetzt. Das resultierende Expressionsplasmid schickt das Fusionsprotein pBR110sFv-PE40 ins Zytoplasma und wurde durch DNA-Sequenzanalyse verifiziert.
Expression und Aufreinigung von BR110 sFv-PE40 – Das single-chain Immunotoxin-Fusionsprotein BR110 sFv-PE40 wurde in E. coli wie vorstehend beschrieben exprimiert. E. coli BL21 (IDE3)-Zellen (Studier & Moffat, 1986) wurden mit dem Expressionsplasmid pBR110sFv-PE40 transformiert, in 100 μg/ml Ampicillin enthaltendem „Terrific-Broth"-Medium (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) bei 37°C kultiviert und in der logarithmischen Phase bei einer OD650 von 1.0 mit 1 mM IPTG induziert. Die Zellen wurden 90 Minuten später geerntet. Für analytische Untersuchung wurden Proben von 1 ml durch Zentrifugation geerntet und in kaltem H₂O 10 min osmotischem Schock ausgesetzt. Die Zellen wurden erneut zentrifugiert und die Zellpellets in 10 mM Tris-HCL, pH 7,4, resuspendiert. Aus ungefähr 10⁸ Sphäroplasten hergestellte Aliquots wurden SDS-PAGE unterzogen und gefärbt (Laemmli, 1970) oder einer Immunoblot-Analyse unter Verwendung von Kaninchen-Anti-BR110-idiotypischen polyklonalen Seren unterzogen. Ein Pellet der in einem 6L-Schüttelkolben hergestellten Bakterienhauptmasse wurde wie vorstehend beschrieben verarbeitet, und Einschlusskörper wurden wie früher beschrieben isoliert (Friedman et al., 1993). Ausgiebig gewaschene Einschlusskörper wurden dann in 7M Guanidin denaturiert.
Klonierung Expression und Aufreinigung des Antigens – Man isolierte das BR110 Antigen (GA733-1) aus H2987-Zellen und erhielt eine aminoterminale Sequenz von 20 Resten. Die Reste waren komplementär zu den Resten 88–107 des Tumor-assoziierten Antigens GA733-1. GA733-1 ist eine aufgrund ihrer Homologie zu GA733-2 isolierte Gensequenz, wobei letztere das von den MAbs GA73.3 und CO17-1A erkannte gastrointestinal-assoziierte Antigen kodiert. GA733-1 ist 50% homolog zum GA733-2 Antigen.
Eine Northern-Analyse wurde mit drei Karzinomzelllinien, H3907 Eierstockkarzinom, H3619 Kolonadenokarzinom und H3754 Lungenkarzinom, durchgeführt, für die über FACS-Analyse eine Expression des BR110 Antigens GA733-1 gezeigt worden war. RNA wurde aus 20–30 Millionen Zellen jeder Zelllinie unter Verwendung des Verfahrens von Chomczynski und Sacchi (Chomczynski und Sacchi, 1987 (Anal. Biochem 162: 156–159)) isoliert. Auf der Basis der bekannten Nukleotidsequenz von GA733-1 wurde eine Oligonukleotid-Sonde hergestellt. Die Northern-Analyse wurde wie in Maniatis beschrieben durchgeführt.
Die cDNA des Antigens wurde nach den Anleitungen des Herstellers mit sequenzspezifischen Primern, Gesamt-RNA und reverse Transkriptase-Polymerase (RT-RNA PCR, Perkin Elmer Cetus) isoliert, wobei jedoch 10% DMSO zugegeben wurden, weil das Antigen GA733-1 einen GC-Gehalt von mehr als 50% aufweist. Die verwendeten spezifischen RT-Primer waren 110-FP (5' GCC AAG CTT GTC CGG TCC GCG TTC CTC CGC CCC ACC 3'), 110-RP (5' CGG TCT AGA CTC GAG GCC GGG TAC CTA CAA GCT CGG TTC 3'), 110-RP1 (5' GCG GGG ATC CGT GAG GCG CTT CAT GGA GAA CTT CGG 3'). Die Restriktionsschnittstellen für jeden Primer sind unterstrichen und sind HindIII, XhoI bzw. BamHI. Nach reverser Transkription entweder mit Random Hexanucleotides, die mit dem Kit bereitgestellt wurden, oder dem 3' 110-RP1-Primer wurden 32 PCR-Zyklen durchgeführt und Produkte mit zutreffender Größe isoliert. Die 1,15 kB-Gen-Fragmente wurden vor der Ligation in pCD40ThrRg1 (in einem CDM7-Hintergrund) mit HindIII und BamHI verdaut, während die 0,86 kB Gen-Fragmente als HindIII-XhoI-Fragmente in pCDM8 ligiert wurden. Inserts der zutreffenden Größe enthaltende Plasmid-DNAs wurden identifiziert und einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen. Das für die extrazelluläre Domäne kodierende DNA-Fragment wurde stromaufwärts von der menschlichen Fc-Region subkloniert und transient in COS-Zellen exprimiert. Das resultierende Fusionsprotein wurde über Protein-A-Affinitätschromatographie aufgereinigt.
Zellmembran-ELISA – Von H3619 Kolonadenokarzinomzellen wurden Membranen hergestellt (Spira et al., „The Identification Of Monoclonal Class with Variants By Subselection And ELISA Assay" J. Immunol. Meth. 74: 307–15 (1984), Uotila et al., „Two-Site Sandwich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP", J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981), Sikora et al., (Hrsg.), Monoclonal Antibodies, S. 32–52 (Blackwell Scientific Publications 1984)).
Die Membranen wurden auf die Oberfläche von Immulon II 96^® Well-Platten (Dynatech Labs, Chantilly, VA) bei 10 μg/ml Protein in 0,5 M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat, pH 9,6, beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit Probenverdünnungsmittel bei einer Verdünnung von 1 : 10 (Genetic Systems, Seattle, WA) 1 h bei RT blockiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen und dann mit primärem Antikörper in Konjugat-Verdünnungsmittel (Genetic Systems, Seattle, WA) bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und anschließend wurde sekundärer Antikörper, entweder Ziege-Anti-Maus-IgG-spezifische HRP oder polyklonale Kaninchen-BR110 anti-idiotypische Antikörper, bei einer Konzentration von 2,5 μg/ml in Konjugatverdünnungsmittel zugegeben. Die Platten wurden 1 h bei RT inkubiert und dann dreimal mit PBS gewaschen. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen, dann entweder 1 h bei RT mit Ziege-Anti-Kaninchen IgG Fc-spezifischer HRP in einer Verdünnung von 1 : 1000 in Konjugatverdünnungsmittel inkubiert oder zweimal zusätzlich gewaschen, wonach die Reaktion mit Tetramethylbenzidin (TMB) 15 Minuten bei RT durchgeführt und mit 1,3 M H₂SO₄ gestoppt wurde. Nach der Inkubation wurden die Platten mit polyklonalen Seren ebenfalls fünfmal mit PBS gewaschen und dann wie vorstehend beschrieben behandelt. Die Extinktion wurde bei zwei Wellenlängen, 450/630 nm, unter Verwendung eines Bio-tek-Mikroplattenlesegeräts (Winooski, VT) bestimmt.
Zytotoxizitätsanalyse. Zellen wurden mit BR110 sFv-PE40 24 h bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, 200 μl/Well 1,5 μM Calcein-AM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) wurden zugegeben und die Platten 40 min bei RT inkubiert. Calcein-AM kann die Membran passieren und ist nicht-fluoreszent. Wenn Hydrolyse durch intrazelluläre Esterasen erfolgt, wird das intensiv fluoreszierende Produkt Calcein gebildet. Nach dem Ende der Inkubation wird die Fluoreszenz unter Verwendung eines Fluorescence Concentration Analyzer^® (Baxter Healthcare Corp., Mundelein, IL) bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 485/530 nm gemessen.
BEISPIEL 5
Konstruktion des BR110sFv-PE40-Immunotoxins (pSE 70.0)
Das ursprüngliche BR110sFv-PE40-Konstrukt wurde in einen Vektor subkloniert, bei dem der Expressionsvektor das Kanamycin-Resistenzgen und einen zweiten Lac-Repressor enthält. Dies wurde durchgeführt, indem pET29c (Novagen Inc.) mit EcoRI und XbaI verdaut und auf ähnliche Weise verdautes BR110 sFv-PE40 zwischen die beiden Stellen inseriert wurde. Das resultierende Konstrukt wurde als pSE 70.0 (1) bezeichnet und stand unter Kontrolle des T7-Promotors.
Expression, Umfalten und Aufreinigung von BR110 sFv-PE40
Das single-chain Immuntoxin-Fusionsprotein BR110 sFv-PE40 wurde in E. coli als Einschlusskörper exprimiert. Zellmasse aus 1 Liter Ausgangskultur, die das exprimierte BR110 sFv-PE40 Fusionsprotein enthielt, wurde in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 + 1 mM EDTA resuspendiert. Die Probe wurde 15 min mit 8K zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Das Pellet wurde in 40 ml H₂O resuspendiert, 10 min bei 4°C gehalten und 15 min bei 8K zentrifugiert. Das Pellet wurde in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 + 1 mM EDTA resuspendiert. 0,5 mg/ml Lysozym wurde auf eine Endkonzentration von 0,25 mg/ml zugegeben. Die Probe wurde 30 min auf Eis gestellt.
Das Detergenz Tergitol wurde dann der Probe auf eine Endkonzentration von 4% zugegeben. Die Probe wurde 60 min auf Eis gestellt und dann 30 min mit 18K zentrifugiert. Die Probe wurde dreimal mit 50 mM Tris-HCl + 1 mM EDTA gewaschen. Das Pellet wurde in 3 ml Guanidinlösung (7M Guanidin-HCl, 0.1 M Tris-HCl pH 7,4, 5 mM EDTA) sonifiziert, worauf man es 48 h bei 4°C stehen ließ. Die Probe wurde dann 30 min mit 30K zentrifugiert und der Überstand gesammelt.
Die Probe wurde dann bei einer Konzentration von 100 μg/ml durch langsame Zugabe zu Umfaltungspuffer (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 1 mM GSSH, 1 μM GSH, 1 M Harnstoff) umgefaltet. Das umgefaltete Protein wurde 48 h bei 4°C gehalten und gegen 40 mM HCl pH 8,0 dialysiert, bis die Leitfähigkeit unter 5 mS/cm lag. Die Probe wurde auf eine DEAE-Anionenaustauschsäule geladen und mit einem linearen Gradienten von 40 mM Tris- HCl pH 8,0 + 1 M NaCl eluiert. Die gemäß nicht-reduzierender SDS-PAGE dem 67 kDa BR110 sFv-PE40-Fusionsprotein entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, in 250 ml 40 mM Tris-HCl pH 8,0 verdünnt und erneut auf eine Mono Q Anionenaustauschsäule aufgetragen, wobei der NaCl-Gradienten der gleiche war wie für die DEAE-Säule. Die dem monomeren BR110 sFv-PE40 entsprechenden Proben wurden gesammelt und über den Coomassie-Plus Assay (Pierce Chem Co.) quantifiziert.
Konstruktion und Aufreinigung des Immunotoxins BR110-BD1
BR110 mAb wurde durch Zugabe eines 3-fachen molaren Überschusses von 2-Iminothiolan in 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 8,0), 1 mM EDTA 1 h bei 37°C thioliert. BD1 wurde mit einem 3-fachen molaren Überschuss von SMPT (2-Succinimidyloxycarbonyl-a-methyl-a-(2-pyridyldithio)-toluol) in 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 8,0), 1 mM EDTA 60 min bei Raumtemperatur derivatisiert. BR110-BD1 wurde auf eine Größenausschluss-Säule (TSK-3000) aufgetragen und von freiem Toxin abgetrennt. Das Immunotoxin (180 kDa) und der freie Antikörper (150 kDa) eluierten zusammen und wurden durch Blue-Sepharose-Affinitätschromatographie weiter aufgereinigt. BR110-BD1 in 0,1 M Natriumphosphat pH 7,0 (Waschpuffer) wurde an Blue-Sepharose (5 ml Harz/5 mg Konjugat) 16 h bei 4°C absorbiert. Das Gemisch wurde in eine 5 ml Econocolumn (Bio-Rad, Richmond, CA) gepackt und 1 ml-Fraktionen mit einem zweistufigen Gradienten ansteigender NaCl-Konzentrationen in Waschpuffer (400 mM NaCl, Schritt 1; 800 mM NaCl, Schritt 2) eluiert. Das Immunotoxin-Konjugat wurde bei OD₂₈₀ (1,4 = 1 ml/ml) quantifiziert und über nicht-reduzierende SDS-PAGE analysiert.
Zytotoxizitätsanalyse von BR110-Immunotoxinen
Tumorzellen (10⁵ Zellen/ml) in Wachstumsmedium wurden in 96-Well-Flachboden-Gewebekulturplatten (0,1 ml/Well) gegeben und 16 h bei 37°C inkubiert. In Leucin-freiem RPMI (Assay-Medium) wurden Verdünnungen von BR110 sFv-PE40 oder BR110-BD1 hergestellt und jedem Well 0,1 ml 20 h bei 37°C (für BR110 sFv-PE40) oder 20 und 44 h (für BR110-BD1) zugegeben. Bei den Zellen wurde für zusätzliche 4 h bei 37°C ein Puls mit [³H]-Leucin (1 μCi/Well) durchgeführt. Die Zellen wurden durch Einfrieren-Auftauen lysiert und unter Verwendung eines Tomtec-Zellernters (Orange, CT) geerntet. Der Einbau von [³H]-Leucin in zelluläres Protein wurde unter Verwendung eines LKB Beta-Plate-Flüssigszintillationszählgeräts bestimmt.
Bei der 48-Stunden BR110-BD1-Zytotoxizitätsuntersuchung wurde überschüssiges BR110 IgG (50 μg/ml) zugegeben, um die BR110-Spezifität in dem Assay zu zeigen. Mit Ausnahme der Zugabe von BR110 IgG wurde der Assay exakt wie vorstehend angegeben durchgeführt. TABELLE 6 24 h-Zytotoxizität und FACS-Analyse von BR110 sFv-PE40 auf ausgewählten Zelllinien
TABELLE 7 Konjugataktivität von BR110 IgG-SMPT-BD1 auf verschiedenen Karzinomzelllinien 24-Stunden- und 48-Stunden-Inkubation

nd: nicht durchgeführt

Claims

Monoklonaler Antikörper, der das GA733-1 Antigen bindet, wobei der Antikörper eine Antigenbindungsstelle aufweist, welche die Bindung des monoklonalen Antikörpers BR110, der von einem Hybridom mit der Bezeichnung ATCC Nr. HB 11698 produziert wird, an das GA733-1 Antigen kompetitiv inhibiert.
Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper vorzugsweise tumorigenes Gewebe einer Zelllinie, nicht jedoch normales Gewebe der gleichen Linie bindet.
Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper einen Komplex mit dem GA733-1 Antigen bildet und in eine Zelle internalisiert wird, wenn das GA733-1 Antigen auf der Zelloberfläche lokalisiert ist.
Antikörper nach Anspruch 1, worin der Antikörper Kolonkarzinom-Gewebe bindet, nicht jedoch normales intestinales Gewebe bindet.
Antikörper nach Anspruch 1, worin der Antikörper Brustkarzinomgewebe bindet, nicht jedoch normales Brustgewebe bindet.
Antikörper nach Anspruch 1, worin der Antikörper kein normales Leber-, Brust- oder Thyroid-Gewebe bindet.
Hybridom, welches den monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 produziert.
Hybridom mit der Bezeichnung ATCC Nr. HB 11698.
Konjugat, umfassend den Antikörper nach Anspruch 1, verknüpft mit wenigstens einem Teil eines zytotoxischen Agens, wobei dieser Teil wenigstens ein funktional aktives Segment umfasst.
Konjugat nach Anspruch 9, wobei das zytotoxische Agens ein Enzym, Lymphokin, Onkostatin oder Toxin ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, markiert mit einem detektierbaren Marker.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 11, wobei der detektierbare Marker ein Enzym, ein paramagnetisches Isotop, Biotin, ein Fluorophor, ein Chromophor, ein Schwermetall oder ein Radioisotop ist.
Fv-Molekül, das die Antigen-Bindungsstelle des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1 aufweist.
Fv-Molekül nach Anspruch 13 in Form eines sFv-Moleküls.
Fab-Molekül, welches die Antigen-Bindungsstelle des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1 aufweist.
Fab'-Molekül, welches die Antigen-Bindungsstelle des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1 aufweist.
F(ab')₂-Molekül, welches die Antigen-Bindungsstelle des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1 aufweist.
Bispezifischer Antikörper mit einer Bindungsspezifität für zwei verschiedene Antigene, wobei eine der Antigen-Bindungsstellen davon das gleiche Epitop wie der monoklonale Antikörper nach Anspruch 1 bindet.
Rekombinanter Mensch/Maus-Antikörper, dessen Antigen-bindende Region die immunspezifische Bindung des monoklonalen Antikörpers BR110, produziert vom Hybridom ATCC Nr. HB 11698 an dessen Zielantigen kompetitiv inhibiert.
Verfahren zum Nachweis des von BR110 erkannten Antigens in einem Gewebeschnitt aus einem Individuum, wobei man den Gewebeschnitt mit dem monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 unter solchen Bedingungen in Kontakt bringt, dass der Antikörper an den Gewebeschnitt bindet; und man den an den Gewebeschnitt gebundenen Antikörper detektiert und dadurch das Antigen, welches von BR110 in dem Gewebeschnitt erkannt wird, detektiert.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Gewebeschnitt von einem Gewebe stammt, in dem normales Gewebe durch das Fehlen des von BR110 erkannten Antigens charakterisiert ist und neoplastisches Gewebe durch das Vorhandensein des von BR110 erkannten Antigens charakterisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Gewebe ein Adenokarzinom, ein gastrointestinales Gewebe, Brustgewebe, Kolongewebe oder Lungengewebe ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Detektion das Inkontaktbringen des monoklonalen Antikörpers mit einem zweiten Antikörper umfasst, welcher mit einem detektierbaren Marker markiert ist.
Verfahren zur Bestimmung einer Differenz in der Menge und Verteilung eines von BR110 erkannten Antigens in Gewebeschnitten aus zu untersuchendem neoplastischem Gewebe, im Vergleich zur Menge und Verteilung des von BR110 erkannten Antigens in Gewebeschnitten von normalem Gewebe, wobei man bei diesem Verfahren wenigstens einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 verwendet.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 10 und 11 in einem Verfahren zur Diagnostizierung eines neoplastischen Zustands in einem Individuum.
Zusammensetzung, umfassend einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6, an welchen ein detektierbares Agens angefügt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das detektierbare Agens ein Toxin, ausgewählt unter Rizin, Diphterieatoxin, Bryodin, Pseudomonas Exotoxin A, Abrin, Supporin und Gelonin, umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das detektierbare Agens ein Enzym, einen Wirkstoff oder ein DNA-Fragment umfasst.
Nukleinsäure-Molekül, kodierend für den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Plasmid, welches das Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 29 umfasst.
Wirt/Vektor-System, umfassend ein Plasmid nach Anspruch 30 in einer geeigneten Wirtszelle.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, wobei man das Wirt/Vektor-System nach Anspruch 31 vermehrt, so dass das Protein in dem Wirt produziert wird und man das so produzierte Protein isoliert.