JP2001501801A

JP2001501801A - モノクローナル抗体ｂｒ１１０およびその使用

Info

Publication number: JP2001501801A
Application number: JP09515854A
Authority: JP
Inventors: エリックヘルストローム、カール; ヘルストローム、インゲゲルド; ガリゲス、ウルスラ; マッカンドルー、スティーヴン; マークァルド、ハンス
Original assignee: ブリストル−マイヤーズスクイッブカンパニー
Priority date: 1995-10-19
Filing date: 1996-10-07
Publication date: 2001-02-13
Also published as: NO321548B1; WO1997014796A1; NO981745D0; NO981745L; EP0856054A1; CA2235269A1; CA2235269C; AU7394296A; US5840854A; EP0856054B1; DE69632333T2; DE69632333D1; IL123294A0; ATE265532T1; ES2219699T3; MX9802129A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＢＲ１１０抗原を特異的に認識し結合するインターナライジングリガンド類（すなわちＢＲ１１０リガンド類）を提供する。抗原に結合した後、そのリガンドと抗原はコンプレックスを形成する。コンプレックスとして、その抗原は周知の開発されている方法並びに市販のシステムを用いて検出することができる。

Description

【発明の詳細な説明】モノクローナル抗体ＢＲ１１０およびその使用本願明細書中では、多数の文献が言及されている。本発明に関する技術の状況をより完全に説明するために、これらの文献の開示はその全てを参照して本願明細書の記載の一部とする。発明の背景癌は世界中で４人に１人がかかる広範囲にわたる各種疾患を包含している。明らかに、罹患患者数の上では、癌は重大な医学的関心を提示している。その問題の重大性およびその社会に与えるインパクトのために、癌に対する有効な治療薬および診断薬は貴重なものとして評価されている。ヒト腫瘍関連抗原に対する抗体は最近の技術的成果であり、或る種の癌に対する重要な治療薬および診断薬を約束するものである。ヒト腫瘍関連抗原に対する抗体は周知であり広く記述されている。このような腫瘍関連抗原の１つはＧＡ７３３−２抗原と名付けられている。ＧＡ７３３−２抗原は約３４ｋＤ−４０ｋＤの分子量をもち、ＧＡ７３３抗原群のメンバーである（ライネンバッハ（Linenbach）ら、ＰＮＡＳＵＳＡ８６巻、２７−３１ページ（１９８９））。ＧＡ７３３−２抗原の生物学的機能は知られていない（１９９３年４月２９日に公開された国際公開第ＷＯ９３／０８２９号）。ＧＡ７３３−２からのＤＮＡプローブを用いて、研究者らはゲノムライブラリーをスクリーニングし、ＧＡ７３３−１と命名された均質な配列を分離することができた。研究者らはＧＡ７３３−１遺伝子からその抗原を発現させることができた。しかしその抗原が腫瘍関連抗原であるかどうかを確認した者はいなかった。その遺伝子およびそれによってコード化されている抗原が一般的に正常細胞、腫瘍細胞またはその両方に見いだされるのかどうかが不確実であり、それらがしばしば見いだされるという事実に、ＧＡ７３３−１遺伝子がゲノムライブラリーから分離されたという事実がさらに加わった。ＧＡ７３３−１抗原の分子量および機能は未知である。ＧＡ７３３−１抗原は複数のエピトープを含み、ＧＡ−７３３−１をコードするＤＮＡのセグメントは公知である（米国特許第５，１８５，２５４号、同上）。ＧＡ７３３−２抗原はＭｏＡｂＧＡ７３３と命名されたモノクローナル抗体（ＧＡ７３３−２抗体としても知られる）によって識別される（ハーリン（Herl yn）ら、ハイブリドーマ（Hybridoma）、５巻、Ｓ３−Ｓ１０ページ（１９８６））。ＭｏＡｂＧＡ７３３はヒト胃腸腫瘍の診断および治療について評価されている。それは殺腫瘍細胞性特性をあらわす。ＧＡ７３３−１およびＧＡ７３３ −２がアミノ酸配列において４９％の相同性を与えるという事実にもかかわらず（米国特許第５，１８５，２５４号、１９９３年２月９日発行）、ＭｏＡｂＧＡ７３３はＧＡ７３３−２抗原には結合するが、ＧＡ７３３−１抗原には結合しない。ＭｏＡｂＧＡ７３３は正常上皮細胞には結合する。ＧＡ７３３に加えて、いくつかの独立的に誘導されるｍＡｂ、例えばＣＯ１７ −１Ａ、Ｍ７７、Ｍ７９、３２３／Ａ３はすべてＧＡ７３３−２抗原を識別し結合する（国際公開第ＷＯ９３／０８２９号、同上）。モノクローナル抗体ＣＯ１７−１Ａ（１７−１Ａ抗体としても知られている）はＧＡ７３３−２抗原には結合するが、ＧＡ７３３−１抗原は識別せず結合しない。現在、ＧＡ７３３−１抗原に向けられるモノクローナル抗体は知られていない。本発明のＢＲ１１０リガンド類はＧＡ７３３−１抗原を識別して結合し、そして抗原に結合後、細胞によってインターナライズされる（取り込まれる）。さらに、本発明のＢＲ１１０リガンド類は殺腫瘍細胞活性をあらわすようにみえる。インターナライジング抗体は稀である。現在、このような“インターナライジング”抗体、すなわちそれらが結合する腫瘍細胞によって容易に取り込まれる抗体を治療に応用することが必要とされている。このような抗体は例えば、細胞内に運搬されてはじめて有効となる生物学的および／または化学的薬剤に結合することができる。発明の概要本発明のＢＲ１１０リガンド類、例えばＢＲ１１０モノクローナル抗体は以上に述べた治療的および診断的要求を満足する。ＢＲ１１０リガンド類は共通の特徴を有する。例えば、各ＢＲ１１０リガンドはＢＲ１１０抗原を特異的に認識し結合し、そしてモノクローナル抗体ＢＲ１１０（ＡＴＣＣ番号１１６９８）が向かうエピトープの少なくとも１部分に向けられる。本発明の１実施態様において、ＢＲ１１０リガンドはモノクローナル抗体ＢＲ１１０（ＡＴＣＣ番号１１６９８）である。さらに、本発明のＢＲ１１０リガンドのもう一つの実施態様はヒト／ネズミ組換え抗体であり、その抗原結合領域は、ハイブリドーマＨＢ１１６９８によって産生したモノクローナル抗体ＢＲ１１０の、その標的抗原への免疫特異的結合を競合的に阻止する。その他に本発明は、本発明のＢＲ１１０リガンド類の使用を提供する。図面の簡単な説明図１は、プラスミドｐＳＥ７０．０の模式図である。発明の詳細な説明定義本願明細書に用いる下記の用語またはフレーズは以下に説明する意味を有する。ここに用いる“リガンド”とは、完全無傷抗体分子および少なくとも抗原結合領域またはその部分（すなわち抗体分子の可変部）を有する分子、例えば、ＢＲ１１０抗原を特異的に識別し結合する、Ｆｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）₂分子、二重特異性抗体、融合蛋白質、または遺伝子工学的分子などを包含する。ここに用いる“抗原結合領域”とは、標的抗原を識別する分子の部分を意味する。ここに用いる“競合的に阻止する”とは、モノクローナル抗体ＢＲ１１０が向かう決定部位を、従来の相互抗体競合分析試験を用いて識別し結合することができることを意味する。（ベランガー（Belanger L）、シルベスター（Sylvestre C）およびドゥフォール（ Dufour D）（1973）、“競合的およびサンドウィッチ法によるアルファフェトプロテインの酵素免疫測定法”Clinica Chimica Acta ４８巻、１５ページ）。ここに用いる“標的抗原”とは抗原ＧＡ７３３−１またはその部分である。ここに用いる“結合する（joined）”は２つ以上の一般的に分離している実体もしくはセグメントを共有結合もしくは非共有結合によって結合することを意味する。ここに用いる“機能的活性”とは、その標的を識別し、結合できる分子の部分を意味する。ここに用いる“生物学的または化学的活性分子”とは、細胞増殖を阻止または停止することができ、さもなければ細胞を障害するように作用することができる生物学的または化学的分子を意味する。ここに用いる“免疫結合体”とは、細胞毒、放射性試剤、酵素、トキシン、抗腫瘍薬または治療薬に化学的または生物学的に結合する抗体などの分子またはリガンドを意味する。抗体は、その標的に結合できる限り、細胞毒、放射性試剤、抗腫瘍薬または治療薬に、その分子のいかなる部位で結合してもよい。免疫結合体の例は抗体−毒素化学的結合体および抗体−毒素融合蛋白質を含む。ここに用いる“有効量”とは、標的細胞を殺しまたはその増殖を阻止する抗体、免疫結合体、または組換え分子の量である。ここに用いる“融合蛋白質”とは、抗原結合領域が生物学的活性分子、例えば毒素、酵素、または蛋白質薬に結合しているキメラ蛋白質を意味する。ここに記載する本発明をさらに詳しく理解できるように、次の説明を示す。Ａ．本発明のリガンド類本発明はＢＲ１１０抗原を特異的に識別し、結合するインターナライジングリガンド類（すなわちＢＲ１１０リガンド類）を提供する。本発明のリガンドは、それがハイブリドーマＨＢ１１６９８によって産生されたモノクローナル抗体ＢＲ１１０の、その標的抗原への免疫特異的結合を競合的に阻止する抗原−結合領域を有する限り、いかなる形のものでもよい。そこで、ＢＲ１１０抗体と同じ結合特異性を有する組換え蛋白質（例えば、抗体が第二の蛋白質、例えばリンホカインまたは腫瘍阻止増殖因子などと結合している融合蛋白質）はすべて本発明の範囲に入る。本発明の１実施態様において、リガンドはモノクローナル抗体ＢＲ１１０である。モノクローナル抗体ＢＲ１１０を産生するハイブリドーマは１９９４年８月１０日にブダペスト条約の規定に基づいてメリーランド州２０８５２ロックビルパークローンドライブ１２３０１のアメリカンタイプカルチャーコレクション（“ＡＴＣＣ”）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１６９８と決められた。その他の実施態様では、リガンドは、Ｆｖ分子（例えば１本鎖Ｆｖ分子）、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）２分子、融合蛋白質、二重特異性抗体、異種抗体、またはＢＲ１１０抗体の抗原結合領域を有するすべての組換え分子である。本発明のリガンドは、モノクローナル抗体ＢＲ１１０（ＡＴＣＣ番号１１６９８）が向けられるエピトープに向けられる。本発明の一実施態様において、前記本発明のリガンドはモノクローナル抗体ＢＲ１１０が向けられるエピトープに向けられ、その標的に少なくとも約２×１０⁸ リットル／モルの親和性を示し、または多価抗体の場合には、少なくとも抗原に対する親和性１０⁸リットル／モルの二価抗体の結合から起きるのと同じ程度のアビディティーを示す。種々の親和性が可能であり、本発明に包含される。本発明のリガンドは修飾することができる、すなわち分子内のアミノ酸修飾によって、誘導体分子を生成することができる。化学的修飾も可能である。誘導体分子はポリペプチドの機能的特性を保持する、すなわちそのような置換を有する分子はまだそのポリペプチドとＧＡ７３３−１抗原またはその部分とを結合させることができる。これらのアミノ酸置換は、当業者には“保存的”として知られているアミノ酸置換を含むが、ただしこれに制限されるものではない。例えば或る種のアミノ酸置換、“保存的アミノ酸置換”と言われるものは、１つの蛋白質においてその蛋白質のコンフォメーションまたは機能を変えることなくしばしば行われる、ということは十分確立された蛋白質化学の原理である。このような変化はイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）をこれら疎水性アミノ酸類の他のものの代わりに置換すること；グルタミン酸（Ｅ）に代えてアスパラギン酸（Ｄ）に、またはその逆に置換すること；アスパラギン（Ｎ）に代えてグルタミン（Ｑ）にする、またはその逆；そしてスレオニン（Ｔ）に代えてセリン（Ｓ）にする、またはその逆を含む。その他の置換も、特定のアミノ酸の環境および蛋白質の三次元構造におけるその役割によって、保存的と考えることもできる。例えばグリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は交換できることが多い、アラニンとバリン（Ｖ）もそうである。相対的に疎水性であるメチオニン（Ｍ）はロイシンおよびイソロイシンと交換可能なことが多い、そして時にはバリンと交換可能である。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の顕著な特徴がその荷電であり、これら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが有意でない位置においては、交換可能であることが多い。その他の変化も特定環境においては“保存的”と考えることができる。Ｂ．本発明のリガンド類の作成法本発明のリガンド類は、（１）モノクローナル抗体およびその断片、（２）少なくとも抗原結合領域またはその部分を有する組換え分子、例えばＦｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）₂分子、二重特異性抗体、融合蛋白質、または（３）ＢＲ１１０抗原を特異的に識別し結合するすべての遺伝子工学的分子、を含む。本発明のモノクローナル抗体本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、下記のコーラー（ Kohler）およびミルスタイン（Milstein）によって記述された一般的方法（（１９７５）“明らかな特異性をもつ抗体を分泌する融合細胞の連続培養”Nature、２５６巻、４９５−４９７ページ）とその改良法（イェー（M.Yeh）ら、“モノクローナル抗体によって確認されたヒトメラノーマの細胞表面抗原”、Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 、７６（６）巻：２９７−３１ページ（１９７９）；およびイェーら、“ガングリオシドフラクションに存在し、ヒトメラノーマに見いだされる細胞表面抗原 ”、Int.J.Cancer ．２９巻、２６９−７５（１９８２））にしたがって調製された。この方法では、体細胞ハイブリッド形成法を用いて、抗体産生細胞（典型的には予め免疫原で免疫したマウスの脾細胞）を不死腫瘍細胞系統からの細胞に融合することによってハイブリドーマが調製される。ここに記載される新規なモノクローナル抗体は、ノイラミニダーゼで前処理したＨ３９２２ヒト乳癌細胞でマウスを免疫することによって作られた。Ｈ３９２２ヒト乳癌細胞で免疫するために、動物の腹腔内に少なくとも１回当り、１０⁷ 細胞の免疫原を接種する。その後、動物に２回以上免疫原を追加投与する。最後の追加投与の数日後に脾臓を動物から収穫し、脾細胞懸濁液を作り、公知の融合技術を用いてネズミ骨髄腫細胞と融合する。融合プロセスから生成したハイブリドーマを増殖させる。その後、生成した上澄液をイムノアッセイ法を用いてスクリーニングし、特異的抗原に結合できるその上澄液中の抗体を検出する（ハーディー（Hardy RR（1986）、モノクローナル抗体の精製および特徴づけ。Ｉｎ：ウェア（Weir DM）およびヘルゼンベルグ（H erzenberg LA）（編）Handbook of Experimental Immunology、第４版、１巻、１３ページ。オックスフォード：ブラックウェル科学出版社；エングヴァル（En gvall E）およびパールマン（Perlmann P）（1971）固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）：免疫グロブリンＧの定量法。Immunochemistry ８巻、８７１ページ）。本発明の組換え蛋白質ＢＲ１１０抗体と同じ抗原決定基に結合できる組換え蛋白質を作ることが日常的な手順である。同じ結合部位を認識する組換え蛋白質を確認するためには、標的を本発明の抗体と他の抗体とが競争する競合試験の実施が含まれる（ベランガー、シルベスターおよびドゥホール（１９７３）競合およびサンドウィッチ法によるアルファ−フェトプロテインの酵素免疫測定法。Clinica Chimica Acta ４８巻、１５）。競合試験は日常的なものであり、それらのプロトコルは十分確立されている（ハーロウ（E.Harlow）およびレーン（D.Lane）、編集、“抗体、実験室的マニュアル”１９８８、５６７−５７７ページ）。ＢＲ１１０抗体の抗原結合領域を有する本発明の抗体のクラス、アイソタイプおよびその他の変種は、本技術分野で公知の組換えクラス転換および融合技術を用いて作ることができる。（ウィンター（Winter G）およびミルスタイン（Mils tein C）（１９９１）人工抗体。Nature ３４９巻、２９３−２９９ページ。プラックサン（Pluckthun A）（１９９１）抗体エンジニアリング：大腸菌（Esher ichia coli ）発現系の使用による進歩。Bio/Technology ９巻、５４５−５５１ページ、ムーア（Moore GP）（１９８９）遺伝子工学による抗体。Clinical Che mistry ３５巻、１８４９−１８５３ページ）。本発明はＢＲ１１０融合蛋白質を提供する。融合蛋白質のための発現ベクターを作る一般的方法はよく確立されている（エルンストウィナッカー（Ernst Wi nnacker）“遺伝子からクローンへ：遺伝子工学の紹介”７章、１９８７、２３９−３１７ページ）。例えば融合蛋白質の合成を指向する発現ベクターの一般的作成法は次のようである。出発材料はｃＤＮＡクローンであってもよく、ここで関心とする遺伝子がベクターから除かれる。本技術分野で公知の方法を用いて、制限部位が開始コドンの近くに置かれる。次の段階は、ＤＮＡ断片を非対称的に切断する消化段階である。得られたＤＮＡ断片混合物をその後ベクターにクローン化する。もちろん、切断部位は選択したベクターのポリリンカー内に存在しなければならない。ベクターの広いスペクトラムが利用できるから、所望の切断部位を含む適したベクターを見つけるのは難しくないであろう。適切なクローンが確認されたならば、その切断部位を用いて、最初のｃＤＮＡクローンから得た関心とする遺伝子を挿入することができる。本発明はキメラＢＲ１１０蛋白質を提供する。ＢＲ１１０抗体と同じ抗原決定基に結合することができるキメラＢＲ１１０蛋白質を作ることは日常的である（モリソン（Morrison,S.L．）、ジョンソン（Johnson,M.J.）、ヘルツェンベルグ（Herzenberg,L.A．）およびオイ（Oi,V.T．）（１９８４）。キメラヒト抗体分子：ヒト不変領域ドメインを有するマウス抗原結合ドメイン。Proc.Natl.Acad .Sci.USA ８１巻６８５１−６８５５ページ、モリソン（１９８５）。トランスフェクトーマは新規なキメラ抗体を提供する。Science ２２９、１２０２−１２０７ページ）。遺伝子工学を用いて、（１）齧歯類可変重遺伝子セグメント（Ｖ_H）をヒト重鎖不変部遺伝子セグメントと組み合わせて重鎖遺伝子構築物を作ることによって、（２）齧歯類可変軽（Ｖ_L）遺伝子セグメントをヒト不変軽（Ｃ_L）エクソンに繋げて、軽鎖遺伝子構築物を作ることによって、および（３）重鎖および軽鎖遺伝子構築物の両方を骨髄腫細胞系統にトランスフェクトすることによって、キメラ免疫グロブリンを作り出すことができる（フェル（Fell）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６巻、８５０７−８５１１ページ（１９８９）；モリソン、ジョンソン、ヘルツェンベルグ、およびオイ（１９８４）。キメラヒト抗体分子：ヒト不変部ドメインを有するマウス抗原結合ドメイン。Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８１巻：６８５１−６８５５ページ）。原則として、いかなる齧歯類可変ドメインも、ヒト不変部アイソタイプと対にすることができ、その結果抗原特異性とエフェクター機能（例えば補体結合およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）など）との最適な組合わせを選択することができる（モリソン（１９８５）、トランスフェクトーマは新規なキメラ抗体を提供する。Science ２２９巻、１２０２−１２０７ページ）。必要により、可変部遺伝子セグメントに点突然変異を導入することによって（それはキメラ抗体のそのリガンドへの親和性を変え）、構築物の微同調（fine-t uning）が実現できる（クンケル（Kunkel,T.A．）１９８５、Proc.Natl.Acad ．S ci.USA 、３２巻；４８８−４９２ページ；クンケルら、１９８７、Methods Enzv mol. １５４巻：３６７−３８２ページ）。ＢＲ１１０リガンドのネズミの特徴を軽減または除去するためには、それの人間化した変形物を、分子操作およびトランスフェクトーマ技術を用いて作成することができる（コー（Co,M.S．）、デシャンプス（Deschamps,M）、ホワイトリー（Whitley,R.J.）、およびクイーン（Queen,C.）（１９９１）。抗ウィルス治療のための人間化した抗体。Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８８巻、２８６９−２８７３ページ）。所望の治療効果によって、種々のヒト重鎖アイソタイプを人間化抗体のために選択することができる。例えば、標的細胞の破壊が所望ならば、ヒトＩｇＧ１不変部を選択することができる、なぜならばそれはＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲII、およびＦｃｇＲIIIによって識別され、ＡＤＣＣを仲介するからである（アンダーソン（Anderson,C.L．）およびルーニー（Looney,R.J．）（１９８６）。ヒト白血球ＩｇＧＦｃ受容体。Immunol.Today ７巻、２６４−２６６ページ）。異なるエフェクター機能を有するキメラ抗体が、抗原結合領域をコード化する配列に異なる配列を結合することによって作られてきた。これらの異なる配列は、酵素（ノイバーガー（Neuberger）ら、Nature ３１２巻、６０４ページ（１９８４））、他の種からの免疫グロブリン不変部、およびその他の免疫グロブリン鎖の不変部を含む（シャロン（Sharon）ら、Nature ３０９巻３６４ページ（１９８４）；タン（Tan）ら、J.Immunol ．１３５巻：３５６５−３５６７ページ（１９８５））。その他の状況、例えば診断的画像化、抗体−受容体ブロッキング、または抗体依存性ドラッグデリバリーでは、Ｆｃ受容体にはほとんど（または全く）結合せずおよび／または補体仲介性溶解（complement-mediated lysis）には比較的効果のないアイソタイプ（例えばＩｇＧ２、ＩｇＧ４、またはＩｇＡ）が優れたアイソタイプとして挙げられる。分子操作およびトランスフェクトーマ技術は、関心とする特異性をもった齧歯類抗体を“人間化”する一般的手段である。これらの齧歯類−ヒトキメラ抗体は抗原性が低く、ヒト治療にはより有用であると予想される（コー、デシャンプス、ホワイトリー、クイーン（１９９１）。抗ウィルス治療のための人間化抗体。Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８８巻、２８６９−２８７３ページ）。一般的に、キメラ抗体を作成するために用いられる１方法の例は次の各段階を含む：ａ）抗体分子の抗原結合部分をコード化する正しい遺伝子セグメントを同定し、クローニングし；この遺伝子セグメント（重鎖のための可変（variable）、多様（diversity）および結合（joining）ＶＤＪ領域または軽鎖のための可変、結合ＶＪ領域または単にＶもしくは可変領域として知られている）はｃＤＮＡの形でもゲノムの形でもよい；ｂ）不変部またはそのうちの所望部分をコード化する遺伝子セグメントをクローンし；ｃ）完全なキメラ抗体が転写および翻訳可能な形でコード化されるように、可変部を不変部とつなぎ；ｄ）この構築物を、選択可能なマーカーと遺伝子コントロール領域、例えばプロモーター、エンハンサーおよびポリ（Ａ）付加シグナルなどを含むベクターに結合し；ｅ）この構築物を細菌中で増幅し；ｆ）このＤＮＡを真核細胞（大抵は哺乳動物のリンパ球）に導入し（トランスフェクション）；ｇ）選択可能なマーカーを発現する細胞を選択し；ｈ）所望のキメラ抗体を発現する細胞をスクリーニングし；そしてｋ）その抗体の適切な結合特異性およびエフェクター機能を試験する。キメラ抗体を作るためのその他の方法も当業者には周知である。ＢＲ１１０抗体の結合部位を識別するキメラ抗体の同定は日常的に、例えば競合試験によって行われる（ハーロウおよびレーン（編）、“抗体、実験室的マニュアル”１９８８、５６７−５７７ページ）。本発明のＢＲ１１０モノクローナル抗体は、ＢＲ１１０リガンドの可変領域とヒト不変領域とを化学的手段、例えば（２）ジスルフィド形成剤、例えば３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）など、（２）チオエーテル結合、（３）活性クロランブシル、（４）酸不安定、光分解性架橋剤、および（５）アビジンビオチン結合による結合などによって、化学的に結合させて作ることもできる（スチーヴンソン（Stevenson,F.K.）、ベル（Bell,A.J.）、クサク（C usack，R.）、ハンブリン（Hamblin,T.J.）、スレード（Slade,C.J.）、スペラベルグ（Spellerberg,M.B.）およびスチーヴンソン（Stevenson,G.T.）（１９９１）。ヒトメラノーマの治療のためにキメラ抗ＣＤ３８抗体を用いる免疫治療的アプローチの予備的研究。Blood ７７巻、１０７１−１０７９ページ；ウォング（S.Wong）“蛋白質の結合および架橋の化学”（１９９３）ＣＲＣPress，Inc. ）。本発明のリガンドを作成するためには他の方法も可能である（リウ（Liu,A.Y. ）、ロビンソン（Robinson,R.R．）、マレーJr.（Murray,E.D.Jr.）、レドベター（Ledbetter,J.A.）、ヘルストロム（ Hellstrom,I.）、およびヘルストロム（Hellstrom,K.E.）（１９８７ａ）。強いＦｃ−依存性生物学的活性を有する、ＣＤ２０に対するマウスーヒトキメラモノクローナル抗体の作成。J.Immunol.１３９巻、３５２１−３５２６ページ）。本発明は、二重特異性ＢＲ１１０モノクローナル抗体も提供する。ＢＲ１１０抗体と同じ抗原決定基に結合し得る二重特異性ＢＲ１１０モノクローナル抗体の作成は日常的である（ハーバー（Haber）ら、１９９０；ウェルズ（Wels,W．）、ハーワース（Harwerth,I.M．）、ツヴィクル（Zwickl.M．）、ハードマン（Ha rdman,N.）、グロナー（Groner B．）、ハイネス（Hynes,N.E.）（１９９２）“ ヒトＥＲＢＢ−２受容体を標的とする二重特異性１本鎖抗体ホスフェート融合蛋白質の構造、細菌発現および特徴づけ”Biotechnology １０巻：１１２８−１１３２ページ；トラウネッカー（A.Traunecker）ら（１９９１）EMBO Journal １０巻（１２）：３６５５−３６５９ページ）。本発明のＢＲ１１０抗体断片ＢＲ１１０抗体断片はＦｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）₂ 分子を含む。ネズミＢＲ１１０リガンドＡＴＣＣ番号１１６９８はネズミ腹水からアフィニティークロマトグラフィーによって精製できる。Ｆ（ａｂ’）₂断片は、精製されたＢＲ１１０モノクローナル抗体をラモイの方法によってペプシンで消化することによって作ることができる（ラモイ、“種々のサブクラスのマウスＩｇＧからＦ（ａｂ’）₂断片の作成”、Meth.Enzvmol ．１２１巻：６５２−６６３ページ（１９８６））。或いはＦ（ａｂ’）₂断片は遺伝子工学的手段によって日常的方法を用いて作ることができる（メイフォース（Mayforth R.D．）、クィンタンス（Quintans,J ．）（１９９０）“現在の概念：設計者と触媒的抗体”New Eng．J.Med．３２３巻１７３−１７８ページ；ワルドマン（Waldmann,T.A．）（１９９１）“診断および治療におけるモノクローナル抗体”Science ２５２巻、１６５７−１６６２ページ；ウィンター（Winter,G．）、ミルスタイン（Milstein,C．）（１９９１）“人工抗体”Nature ３４９巻２９３−２９９ページ；モリソン（Morrison,S .L．）（１９９２）“In Vitro 抗体：製造および応用のための戦略”Ann.Rev. Immunol．１０巻２３９−２６６ページ；ハーバーら（１９９０）；ウェルズ、ハーワース、ツヴィクル、ハードマン、グロナー、ハイネス（１９９２）“ヒトＥＲＢＢ−２受容体を標的とする二重特異性１本鎖抗体ホスフェート融合蛋白質の構造、細菌発現および特徴づけ”Biotechnology １０巻：１１２８−１１３２ページ；トラウネッカーら（１９９１）ＥＭＢＯ Journal １０巻（１２）：３６５５−３６５９ページ）。全ＢＲ１１０リガンドの結合と、Ｆ（ａｂ’）₂断片の結合とを区別するには、全抗体には結合するがＦ（ａｂ’）₂断片には結合しないホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合プロテインＡを用いる。ＢＲ１１０Ｆａｂ断片は、例えばパパインなどを用いて完全無傷ＢＲ１１０抗体を蛋白分解的に切断することによって作ることができる（パーハム（Parham,P ．）１９８６、マウスモノクローナル抗体から活性断片の作成および精製。”実験免疫学ハンドブック”４巻中、第１巻“免疫化学”（ワイアー（D.W.Weir）ら、編）１４．１−１４．２３ページ、Blackwell Scientific Publishers、オックスフォード）、パーハム（１９８６）、マウスモノクローナル抗体から活性断片の作成および精製。ワイアーおよびヘルツェンベルガー（編）Handbook of Experimental Immunology 第４版、１巻、１４ページ、オックスフォード：Blackwell Scientific Publicati ons）。或いは、Ｆａｂ断片は日常的技術を用いる遺伝子工学的手段によって作ることができる（ヒューズ（Huse）ら、１９８９、“ファージラムダにおけるイムノグロブリン受容体の広域結合ライブラリーの形成”Science ２４６巻、１２７５ −１２８１ページ）。ＢＲ１１０リガンド結合体および融合蛋白質の作成および精製のためのプロトコル本発明は生物学的または化学的活性分子の少なくとも１部に結合したＢＲ１１０リガンドを含むＢＲ１１０免疫結合体を提供する（バトラ（Batra）ら、Proc. Natl.Acad.Sci.USA ８６巻、８５４５−８５４９ページ（１９８９）；コンドー（Kondo）ら、J.Biol.Chem.２６３巻、９４７０−９４７５ページ（１９８８）；およびバトラら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６巻、８５４５−８５４９ページ（１９８９））。生物学的または化学的活性分子、例えば細胞傷害性試剤は細胞増殖を阻止または停止でき、さもなくば細胞を損傷するように作用する。本発明の実施にしたがうと、生物学的または化学的活性分子は酵素、リンホカイン、毒素、常磁性同位元素、ビオチン、フルオロフォア、クロモフォア、重金属、放射性同位元素、または化学療法剤を含むが、ただしこれらに制限されるものではない。毒素の適切な例はシュードモナス（Pseudomonas）外毒素、リシン、ブリオジン、およびジフテリア毒素を含むが、これらに制限するものではない。その他の例はブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ミトマイシン、シスプラチン、およびプロカルバジンを含む。ここに記載するような本技術分野で公知の遺伝子工学技術を用いて、ＢＲ１１０の抗原結合領域をコード化するＤＮＡ配列と生物学的または化学的活性分子をコード化するＤＮＡ配列とをＤＮＡレベルで結合し、そして、形質変換されたホスト細胞において細胞傷害性分子を組換え蛋白質として発現させることによって、組換え免疫毒素を生産することができる。組換え免疫毒素は、毒素の細胞傷害性ポテンシャルと共にＢＲ１１０抗体の細胞結合部の特異性を保持する均質分子である（コンドーら、J.Biol.Chem.２６３巻：９４７０−９４７５（１９８８）；シーガル（Sirgall）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８５巻、９７３８−９７４２ページ（１９８８）、パスタン（Pastan,I）およびフィッツゲラルド（Fitz Gerald,D）（１９９１）。癌治療のための組換え毒素。Science ２５４巻、１１７３−１１７７ページ。パスタン、ウィリンガムおよびフィッツゲラルド（１９８６）。免疫毒素。Cell ４７巻、６４１−６４８ページ）。組換え免疫結合体、特に１本鎖免疫結合体には薬剤／抗体結合体よりも利点があり、なぜならば前者は後者より容易に作られ、均質分子の集団、すなわち同一のアミノ酸残基からなる単一ポリペプチドを生成するからである（トレイル（Trail,P.A.）ら、異種移植ヒト癌のＢＲ９６−ドキソルビシン免疫結合体による治癒、Science、２６１巻、２１２−２１５ページ、１９９３）。生物学的または化学的活性分子が毒素または薬剤であるとき、その結合体は結合していない相手よりも強力である。Ｄ．本発明のリガンド類の使用本発明は対象からの組織切片中のＢＲ１１０抗原を検出する方法を提供する。本発明の実施にしたがうと、対象はヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ネズミ、イヌ、ネコ、またはトリとすることができる。その他の温血動物も含まれる。この方法は組織切片を本発明のモノクローナル抗体と接触させることを含んでなる。組織切片を本発明のモノクローナル抗体と接触させる条件は、コンプレックスが形成されるような結合をおこすことである。コンプレックス形成後、周知の開発された方法および市販のシステムを用いて抗原を検出することができる（ギャター（Gatter KC）、ファリニ（Falini B）およびメイソン（Mason DY）（１９８４）“組織病理学的診断におけるモノクローナル抗体の使用”Recent Adv ances in Histopathology １２巻、３５ページ；ボイクマン（Boekmann E．）、バウム（Baum RO）、シュルデス（Schuldes H）、クラマー（Kramer W．）、ハーテル（Hertel A）、ボー-クリストウ（Baew-Christow T）、ハンク（Hanle P ）、ジョナ −標識モノクローナル抗ＣＥＡ抗体ＢＷ４３１／２６による膀胱癌およびその転移の腫瘍画像化”British Journal of Cancer ６２巻（付録）８１ページ）。本発明の１実施態様において、組織切片は前胸部組織であり、悪性腫瘍組織は乳癌である。或いは、組織が結腸組織で、悪性腫瘍組織は腺癌である。さらに、組織が肺組織で、悪性腫瘍組織が肺癌である。また他の実施態様では、組織は卵巣組織で、悪性腫瘍組織は卵巣癌である。一般に組織切片とは、正常組織では低濃度のＢＲ１１０抗原が存在しないという特徴があり、悪性腫瘍組織では高濃度のＢＲ１１０抗原が存在するという特徴があるという組織の切片である。本発明の実施にしたがうと、組織切片に結合したモノクローナル抗体はその抗体に付着結合した標識マーカーを用いて直接検出することができる。或いは、組織切片に結合したモノクローナル抗体を、そのモノクローナル抗体を第２の抗体と接触させることによって検出することができる。第２の抗体は検出可能なマーカーで標識することができる。接触後、組織切片に結合したそのモノクローナル抗体は第２の抗体とコンプレックスを形成する。そのコンプレックスはこうして結合した第２の抗体を検出することによって検出される。本発明はその他に、試験される悪性腫瘍からの組織切片中のＢＲ１１０抗原の分布量の差を、正常組織からの組織切片のＢＲ１１０抗原の量および分布に対して測定する方法を提供する。この方法は、試験される組織および正常な組織の両方を本発明のモノクローナル抗体と接触させ、上記のように検出を行うことを含む。検出を行った後にＢＲ１１０抗原の量および分布の差を求めることができる。この測定は定量的測定である、すなわちこのようにして検出された抗原の数を数えたり、またはどのサンプルがより暗いかより明るいか、もしくは特定の色をもつかなどを調べる目視による測定である。本発明はさらに対象における悪性腫瘍状態を診断する方法を提供する。１実施態様において、この方法は対象から組織サンプルを採取することを含む。その後、その組織サンプルと本発明の抗体とを接触させ、そのような組織切片にＢＲ１１０抗原が存在する場合は抗体と抗原との間にコンプレックスを形成させる。コンプレックスの存在を検出する。もしも正常組織におけるよりもサンプル中により高濃度のコンプレックスが検出されるならば、その濃度は悪性腫瘍状態を示唆し、さらにその後の試験が正当化される。或いは、腫瘍の検出を生物学的液体サンプルを用いて行い、対象のヒト癌を検出することができる。血清学的診断法は、癌にかかっていると思われる患者の血清またはその他の生物学的液体に分泌または“流れ出る”腫瘍関連抗原の検出および定量を含む。このような抗原は、本技術分野で公知の方法、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）など―この場合には“流れ出る”抗原と反応する抗体を用いて液体サンプル中の抗原の存在を検出する―を用いて体液中に検出することができる（ウオティラ（Uotila）ら“ ヒトＡＦＰに対するモノクローナル抗体を用いる二部位サンドウィッチＥＬＩＳＡ”、J.Immunol.Methods ４２巻１１ページ（１９８１）、およびアラム（Allu m）ら、同上、４８−５１ページ）。前記説明から明らかなように、本発明のＢＲ１１０抗体を抗原抗体反応を含む大部分のアッセイに用いることができる。これらのアッセイは、標準ＲＩＡ法、液および固相の両方、並びにＥＬＩＳＡアッセイ、免疫蛍光法、およびその他の免疫細胞化学アッセイなどを含むが、これらに制限されるものではない（シコラ（Sikora）ら（編集）、モノクローナル抗体、３２−５２ページ（Blackwell Sc ientific Publications）１９８４）。ＢＲ１１０リガンド類の動物への投与ＢＲ１１０リガンド類を、標的細胞の増殖を鈍化させるかまたはそれらを完全に殺すのに十分な量、動物に投与することができる。ＢＲ１１０リガンド類を投与する最適スケジュールが対象、対象の身長および体重、疾患の重症度によって種々変わることは当業者に明らかであろう（グッドマン（G.Goodman）ら、J.Cli n.Oncol. ８巻、１０８３ページ（１９９０）。ネーデルマン（Nedelman,MA）、シェアリー（Shealy DJ）、ボウリン（Boulin R）、ブラント（Brunt E）、シーショルツ（Seasholtz,JI）、アレン（Allen E）、マッカートニー（McCartney J E）、ワレン（Warren FD）、オッパーマン（Oppermann H）、パング（Pang RHL ）、バーガー（Berger HJ）およびワイスマン（Weisman HF）（１９９３）テクネチウム−９９ｍ−標識抗ミオシン組換え１本鎖Ｆｖによる迅速な初期画像化：急性心筋梗塞のイヌモデルにおける評価。Journal of Nuclear Medicine ３４巻、２３４ページ。カータニー-ラック（Courtenary-Luck,N.S.）およびエペネトス（Epenetos,A.A．）（１９９０）。モノクローナル抗体の腫瘍に対する標的化。Curr.Opinion Immunol ．２巻、８８０−８８３ページ）。究極的には使用および投与のスケジュールは治療医が決める。量の範囲を決め、計画を立てる臨床的プロトコルは標準的なものである。本発明の抗体を含む組成物本発明は、生物学的または化学的に活性な試剤に結合する本発明のモノクローナル抗体を含んでなる組成物を提供する。１実施態様において、生物学的または化学的活性試剤は毒素である。毒素は、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス、外毒素−Ａ、アブリン、サポリン、およびゲロニンを含む群から選択されるが、これらに制限されるものではない。或いは、生物学的および化学的試剤は酵素、薬剤、またはＤＮＡ断片を含む（ネーデルマン、シェアリー、ボウリン、ブラント、シーショルツ、アレン、マッカートニ、ワレン、オッパーマン、パング、バーガー、およびワイスマン（１９９３）、テクネチウム−９９ｍ−標識抗ミオシン組換え１本鎖Ｆｖによる迅速な初期画像化：急性心筋梗塞のイヌモデルにおける評価。Journal of Nuclear M edicine ３４巻、２３４ページ）。酵素、薬剤またはＤＮＡ断片のモノクローナル抗体への付着結合は良く知られている（ポラードーナイト（Pollard-Knight D）、ホーキンス（Hawkins E）、ユング（Yeung D）、パッシュビー（Pashby DP）、シンプソン（Simpson M）、マクドガル（Mcdougall A）、バックル（Buckle P）およびチャールズ（Charles SA）（１９９０）表面プラスモン共鳴に基づくバイオセンサーによるイムノアッセイおよび核酸検出。Annales de Biologie Clinioue ４８巻、６４２ページ；クロニク（Kronick MJ）およびリトル（Little WA）（１９７４）内反射スペクトロスコピーによる蛍光励起に基づく新しいイムノアッセイ。Proceedings o f the National Academy of Sciences USA ７１巻、４５５３ページ）本発明の利点。本発明の抗体は、ヒト腫瘍関連抗原を識別する他の抗体のように、疾患と闘うための診断および治療薬の兵器庫の付加的メンバーである。ＢＲ１１０リガンドが有用なのは、それが腫瘍特異的抗体であるばかりでなく、それがインターナライジング抗体だからでもある。この種の抗体は、抗体−薬剤または抗体−毒素結合体（“免疫毒素”）を用いて選択的に細胞を殺す治療法に有用である；ここで、治療的抗腫瘍剤は化学的または生物学的に抗体または増殖因子に結合し、腫瘍に供給され、この場合抗体はこれと反応する腫瘍関連抗原または受容体に結合し、その抗腫瘍剤を腫瘍細胞内部に“運搬する ”（エンブルトン（Embleton）ら、“抗癌剤の抗体標的化”、Monoclonal Antib odies For Cancer Detection and Therapy ３１７−４４ページ（Academic Pres s）１９８５））。ここに記載した本発明をより良く理解するために次の例を示す。これらの例は例示の目的のためのものにすぎず、決して本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきものではないと理解すべきである。例１ＢＲ１１０モノクローナル抗体の作成本発明のＢＲ１１０モノクローナル抗体を、以前にイエー（M.Yeh）らが記載したハイブリドーマ融合技術を用いて作成した（Proc.Natl.Acad.Sci.USA ．（１９７９）、同上およびイエーら、Int.J.Cancer（１９８２）、同上）。つまりＢＡＬＢ／ｃマウスをノイラミニダーゼで前処理したＨ３９２２ヒト乳癌細胞（１０⁷個の細胞）を用いて免疫した。マウスは多重免疫（×６）を受けた。初回にはマウスはＲＩＢＩアジュバントを用いて腹腔内注射を受けた。２回目から６回目までは、マウスにＲＩＢＩアジュバントを用いずに腹腔内注射を１回行った。各回に注射した細胞の総数は約１０⁷細胞であった。最後の免疫後４日目に脾臓を摘出し、脾細胞をＲＰＭＩ培養培地に懸濁した。その後脾細胞をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下でＰ２×６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞と融合させ、その細胞懸濁液をミクロタイターウェル中で、選択的ＨＡＴ培地でイエーらが（同上）記載したように増殖させた［コーラーおよびミルスタイン、Nature ２５６巻、４９５−９７（１９７５）およびEur.J.Immunol ．６巻、５１１−１９ページ（１９７６）も参照されたい］。その混合物を播種し、単一の融合細胞またはクローンを起源とする低密度培養物を生成した。その後これらのハイブリドーマ培養物からの上澄液を、ガン細胞系、Ｈ３９２２、に対する直接的結合活性について、ダイラード（Douillard）らが記載したものと類似のＥＬＩＳＡ法を用いてスクリーニングした（ダイラードら“酵素標識第２抗体を用いるモノクローナル抗体産生をスクリーニングするための固相酵素免疫測定法”、Meth.Enzymol．９２巻、１６８−７４ページ（１９８３））。このアッセイによると、抗原（この抗原とスクリーニングされる抗体とは反応する）をミクロタイタープレート上に固定し、それからハイブリドーマ上澄液とインキュベートする。もしも上澄液が所望の抗体を含むならば、その抗体は固定抗原に結合し、抗免疫グロブリン抗体−酵素結合体、および光学密度の測定可能な変化をもたらす酵素のための基質の添加によって検出される。本研究において乳癌細胞系Ｈ３９２２およびヒト線維芽細胞は９６ウェル組織培養プレート（Costar Cambridge,MA）に配られ、湿式３７℃インキュベーター中で、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。細胞をその後調製したばかりの２％パラホルムアルデヒド１００μｌで固定し、１５分間室温でインキュベートし、その後試料希釈液（Genetic Systems,Seat tle,WA）で室温で１時間ブロックしたが、これが全アッセイのインキュベーション条件であった。Ｐ／ＢＳで洗浄後、ハイブリドーマ上澄液または精製抗体を加え、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗い、第２段階で培養培地（ＩＭＤＭ、Gibco、ＮＹ１０％ＦＢＳ）で希釈したＭＡｂ（ヤギ抗マウスＩｇＧ／Ｍ、Tango Burlingname,CA）を加え、１時間インキュベートした。洗浄段階後、緩衝化基質（Genetic Systems）を加え、１５分間のインキュベーション後、停止試薬（Genetic Systems）で反応を停止させた。吸光度をＯＤ４５０／６３０ｎｍで読んだ（Dynatech Microelisa Autoreader）。その後ハイブリドーマ培養物からの上澄液を１００ｍｌ／ウェル量加え、それらのウェルを室温で１時間インキュベートし、細胞をＰＢＳで３回洗った。次に、０．１％ＢＳＡおよびＰＢＳで希釈したヤギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ（Zymed,CA）を１００ｍｌ／ウェルの濃度に加えた。反応混合物を室温で１時間かまたは３７℃で３０分間インキュベートし、細胞をその後ＰＢＳで３回洗った。それからｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を１００ｍｌ／ウェルの量加え、プレートを暗所で室温で５−４５分間インキュベートした。細胞に結合した抗体を１０−２０分以内におきるウェルの色変化によって検出した。１００ｍｌ／ウェルのＨ₂ＳＯ₄の添加によって反応を停止し、吸光度をDy natech（Alexandria,VA）Microel isa Autoreader（登録商標）によって４９０ｎｍで読んだ。この分析試験は、培養した付着性細胞（生きているかもしくは固定されている）、懸濁液中で生きているかもしくは固定されている細胞、精製された可溶性抗原、および固定抗原のような細胞性抽出物を用いて行うことができる。こうして、癌細胞系Ｈ３９２２には結合反応性をもつがヒト線維芽細胞には結合反応性をもたない抗体を産生したハイブリドーマを選択し、クローニングし、サブクローンの特異性を確認した。ハイブリドーマ培養物をその後、抗体産生のためにin vitroで増殖させた。上に開示したようにＢＲ１１０抗体をハイブリドーマ上澄液から固定プロテインＡ（Rep1iGen，Cambridge,MA）上のアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。最終的配合緩衝液はＰＢＳで、抗体は無菌濾過し、冷蔵庫で貯蔵するかまたは−７０℃で凍らせた。ＰＢＬｓと反応しなかったハイブリドーマをクローニングし、in vitroで増殖させ、さらに抗体特異性を試験した。ヒト乳癌と反応する抗体を産生するハイブリドーマを再クローニングし、増殖させ、プリスタン注入（pristane-primed）齢３カ月ＢＡＬＢ／ｃマウスに注入したが、そこでそれらは腹水腫瘍として増殖した。この方法にしたがい、ハイブリドーマ細胞系ＢＲ１１０を得て、これをクローンニングし、マウスに注入し、腹水腫瘍として増殖させた。上に開示したように、ＢＲ１１０ハイブリドーマはＡＴＣＣに寄託されている。モノクローナルＢＲ１１０抗体を、固定組換えプロテインＡ（Repligen，Camb ridge,MA）上のアフィニティークロマトグラフィーによって腹水から精製した。澄明にした腹水を等量の結合緩衝液（１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ８）で希釈し、結合緩衝液であらかじめ平衡化したプロテインＡカラムに入れた。カラムを結合緩衝液でよく洗い、その後抗体を５０ｍＭリン酸、ｐＨ３で溶出した。精製抗体フラクションを１Ｍトリス、ｐＨ９、で中和し、それからホスフェート緩衝食塩水に対して透析した。精製ＢＲ１１０リガンドは最後に滅菌濾過し、冷蔵庫で保存するか、または凍らせて保存した。例２ＢＲ１１０モノクローナル抗体の特徴づけアイソタイプの決定ＢＲ１１０ハイブリドーマによって産生する免疫グロブリンのクラスを決定するために、次のようなＥＬＩＳＡ法を用いた：ダイナテクイムロン（Dynatech I mmulon）９６ウェルプレートをヤギ抗マウスＩｇＧサブクラス抗体（Southern Biotech,Birmingham,AＬ）、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ濃度、でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。この方法に基づき、ＢＲ１１０モノクローナル抗体がガンマ２ａアイソタイプであることが確認された。免疫組織学免疫組織学的研究には、Immunochemistry、１０４−６９ページ（John Wiley & Sons）ニューヨーク、１９７９）に記載され、ギャリグス（H.J.Garrigues）らが改良した（“原発性ヒトメラノーマの組織切片におけるヒトメラノーマ関連抗原、ｐ９７、の検出 ”、Int.J.Cancer ２９巻、５１１−１５ページ（１９８２））スターンバーガー（L.A.Sternberger）のペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）法を用いた。これらの試験の標的組織は手術の際に得られ、液体窒素で予備冷却したイソペンタンを用いて切除４時間以内に凍結した。組織をそれから液体窒素中に、または−７０℃で、使用時まで保存した。凍結切片を作り、空気乾燥し、アセトン処理をし、再び乾燥した［ギャリグスら、同上］。組織学的評価のために用いる切片をヘマトキシリンで染色した。非特異的バックグラウンドを減らすために、切片をＰＢＳで１／５に希釈した正常ヒト血清と共にあらかじめインキュベートした（ギャリグスら、“原発性ヒトメラノーマの組織切片におけるヒトメラノーマ関連抗原、ｐ９７、の検出”、Int.J.Cancer ２９巻、５１１−１５ページ（１９８２））。マウス抗体、ウサギ抗−マウスＩｇＧ、およびマウスＰＡＰを１０％正常ヒト血清と３％ウサギ血清の溶液で希釈した。ウサギ抗マウスＩｇＧ（Sternberger−Meyer Immunochemi cals,Inc.，Jarettsville，ＭＤ）を１／５０の希釈で用いた。特に精製したＰＡＰを２ｍｇ／ｍｌ含むマウスＰＡＰコンプレックス（Sternberger−Meyer Imm unocemicals,Inc．）を、１／８０の希釈で用いた。染色法は、連続切片を特異的抗体、すなわちＢＲ１１０、または対照抗体のどちらかで２．５時間処理し、それら切片を１／５０に希釈したウサギ抗マウスＩｇＧで室温で３０分間インキュベートし、その後それら切片を１／８０に希釈したマウスＰＡＰコンプレックスに室温で３０分間さらすことからなるものであった。各抗体での処理後、スライドをＰＢＳで２回洗った。調製したばかりの０．５％３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（Sigma Ch emical Co.,St.Louis,MO）および０．０１％Ｈ₂Ｏ₂の０．０５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ７．６、溶液を８分間加えることによって免疫組織化学反応を行った（Hell stromら、J.Immunol.,１２７：１５７−６０（１９８１））。さらに蒸留水中１％ＯｓＯ４溶液に２０分間さらすことによって染色を強化した。それら切片を水ですすぎ、アルコール中で脱水し、キシレンで清浄にし、スライドに載せた。平行切片をヘマトキシリンで染色した。スライドを各々コード（符号）下で評価し、コードをつけたサンプルを関係のない研究者がチェックした。典型的スライドを微分干渉コントラスト光学系（di fferential interference contrast optics）（Zeiss-Nomarski）を用いて写真にとった。抗体染色度は０（反応性なし）、＋（弱く陽性反応を示す細胞が少数ある）、＋＋（細胞の少なくとも１／３が陽性）、＋＋＋（大部分の細胞が陽性）、＋＋＋＋（ほとんど全細胞が強く陽性を示す）として評価した。＋と０との染色の差は、＋と＋＋の染色の差よりはっきりしなかったから、＋＋またはそれ以上に段階づけられた染色を“陽性”とした。悪性腫瘍および基質細胞の両方が腫瘍サンプル中に認められた。記録した染色は腫瘍細胞のものであり、なぜならば基質細胞は全然染色されないか、腫瘍細胞よりはるかに弱い程度にしか染色されなかったからである。下記の表１は種々の腫瘍および正常組織標本のＢＲ１１０モノクローナル抗体を用いる免疫組織学的染色を示す。以下の各表が明らかに示すように、ＢＲ１１０抗体は広範囲のヒト癌腫サンプルと反応する。結合アッセイ：ＢＲ１１０ＭＡｂによる細胞表面抗原の識別を種々の癌細胞系で免疫蛍光法によりCoulter Epics ＣＦＡＣＳを用いて確認した。単一細胞懸濁液を培養培地（ＩＭＤＭ Gibco，ＮＹ，１０％ＦＢＳ）で５×１０⁵〜１×１０⁶細胞の濃度に等分した。ＦＩＴＣ結合ＢＲ１１０ＭＡｂを培養培地で希釈して１０μｇ／ｍｌ濃度にして再懸濁細胞ペレットに加え、氷上で１時間インキュベーションした。細胞を培養培地で洗った後、そのサンプルの平均蛍光強度を分析した。結合比は、直線蛍光等量（linear fluorescence equivalent ）（ＬＦＥ）を陰性対照のＬＦＥで割ることによって計算した。結果を表４に示す。細胞の抗原結合部位の決定細胞系Ｈ３６１９およびＨ２９８７を用いて、ＦＩＴＣ結合ＢＲ１１０ＭＡｂで細胞結合試験を行い、その後ＦＡＣＳ分析を行った。平均蛍光強度は抗体５０〜０．３８ｍｇ／ｍｌの２倍希釈で染色して測定した。サイズおよび強度既知の蛍光ビーズにより標準曲線が作成され、それは抗体結合による蛍光等量の計算に含まれた。結合部位数は両細胞系で８×１０⁴部位／細胞と確認された。例３ＢＲ１１０のインターナリゼーションＢＲ１１０が抗原陽性癌細胞によってインターナライズされ得るかどうかを確認するために、リシンＡ鎖結合抗体を用いる間接的阻止アッセイを用いた。このアッセイでは、細胞ＤＮＡへのＨ３-チミジン取り込みの阻止が、所定の結合体の細胞傷害効果の尺度であり、リシンＡ鎖の癌細胞へのインターナリゼーションを反映する。癌細胞を９６ウェルミクロタイタープレートに、５×１０Ｅ３細胞／ウェルの量を載せ、３７℃で５％ＣＯ₂中で一晩インキュベートした。ハイブリドーマ上澄液（生、および１０倍希釈）をその培養器に加え、氷上で１時間インキュベートした。培養培地で洗浄後、ヤギ抗マウスＩｇＧリシンＡ鎖抗体（Inland Lab oratories,Austin，ＴＸ）、５ｍｇ／ｍｌ濃度、を加えて４２時間３７℃でインキュベートし、その後３Ｈ−チミジン５０μｌを１ｍＣｉ／ウェルの割合で加え、プレートをさらに６時間３７℃でインキュベートした。アッセイプレートをその後数時間−７０℃で凍結し、融解し、細胞収穫器（Wallac，ＬＫＢ）を用いて細胞をガラス繊維フィルター（Wallac，フィンランド）上に収穫した。シンチレーションカウンティング液を加えた後、フィルターマットを液体シンチレーションカウンター（Wallac，ＬＫＢ）で計数した。結果は、実験群対未処理対照の、Ｈ３−チミジン取り込みの阻止パーセントとしてあらわされ、ＭＡｂＢＲ１１０で処理後、癌細胞系Ｈ３９２２は９０％、Ｈ３３９６は６０％の増殖阻止を示し、その抗体はインターナライゼーションすることが証明される。ＢＲ１１０のインターナライゼーションを研究するもうひとつのアプローチとして、癌細胞を共焦顕微鏡（ライカ(Leica)共焦レーザー走査顕微鏡）によって分析した。ＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳに培養した癌細胞（Ｈ３６１９、Ｈ３３９６、Ｈ３９２２）をガラススライド（ＮＵＮＣチェンバーカバースリップ）上に４８時間付着させた。細胞を１５分間４℃に保った。ＦＩＴＣ結合抗体ＢＲ１１０、または対照としてのＦＩＴＣ結合抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ（Tago,Burlingname,CA）を、１０μｇ／ｍｌ濃度で４℃で１時間加えた。冷−培養培地でよく洗って未結合抗体を除去した。表面染色を検出するために、細胞を冷ＰＢＳで洗い、２％パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定し、その後抗退色試薬ジチオエリトリトール（シグマ社）で処理した。ＢＲ１１０のインターナライゼーションを研究するために、３７℃の培養培地を加え、細胞を個々の時間（０−３時間）インキュベートした。時間的経過を冷ＰＢＳおよび後固定によって停止した。共焦顕微鏡検査の画像は、細胞が先ず４ ℃でＢＲ１１０にさらされた後、ＭＡｂが細胞表面に広く結合することを示した。温度を３７℃に変え、細胞をその温度で１５分間保持すると、細胞形質の染色が認められた。その時のＢＲ１１０の結合は細胞形質コンパートメント内に不均一に分布し、細胞表面からはほとんどなくなっていた。細胞表面も細胞形質も対照ＭＡｂでは染色されなかった。データはＢＲ１１０が癌細胞にインターナライズされたことを示している。我々はＭＡｂＧＡ７３３の、癌細胞系Ｈ３３９６およびＳＷ９４８へのインターナライゼーションを試験した。抗体は４℃で専ら細胞表面に結合し、３７℃ で試験したときには極めて弱いインターナライゼーションを示すかまたは全く示さなかった。ＢＲ１１０の抗体依存性および補体依存性細胞傷害性ＡＤＣＣおよびＣＤＣ試験を行った；標的細胞（Ｈ３３９６、Ｈ３９２２）を⁵¹ Ｃｒで標識し、それらを補体およびＢＲ１１０の給源としてのヒトリンパ球またはヒト血清に４時間さらした。標的細胞からの⁵¹Ｃｒの放出を腫瘍細胞溶解（細胞傷害性）の証拠として測定した。ＢＲ１１０はＡＤＣＣおよびＣＤＣに関しては陰性であることがわかった、それはＩｇＧ２ａアイソタイプに帰せられるかも知れない。ＥＬＩＳＡ競合ＧＡ７３３遺伝子の関連性を考慮して、競合試験を行い、ＭＡｂＢＲ１１０とＧＡ７３３との特異性の差を確立した。ＦＡＣＳ分析は両蛋白質（ＧＡ７３３ −１およびＧＡ７３３−２）が細胞系Ｈ３３９６に存在することを示した。パラホルムアルデヒド固定細胞での結合研究は、これらの抗体が交差ブロックせず、したがって異なるエピトープに結合することを示した。アビジティーまたは親和力の測定スキャッチャード分析を行い、付着性非固定細胞への結合に対する放射性標識ＢＲ１１０ＭＡｂのアビジティーを測定した。データは、細胞系Ｈ３６１９およびＨ３３９６で試験した場合、ＢＲ１１０が約５×１０^-8ｍｏｌ／リットルの結合常数（Ｋａ）をもつことを示した。ＢＲ１１０抗原の特徴づけＢＲ１１０抗原は抗原陽性癌細胞系Ｈ２９８７から分離された。それら細胞は１％トリトンＸ−１００に可溶性であり、その抗原−抗体コンプレックスは非還元条件下でプロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーおよびＳＤＳ−Ｐａｇｅによって精製し、電気溶出またはエレクトロブロッティングによって回収した。Ｍｒ＝６６，０００の蛋白質がアミノ末端でブロックされた。残基２０の単一のアミノ末端配列がＭｒ＝５５，０００蛋白質で得られ、腫瘍関連抗原ＧＡ７３３−１、残基８８−１０７と完全に一致することを示した。Ｍｒ＝６６，０００ＢＲ１１０抗原の臭化シアン開裂は１つの主要断片を生成した。その断片をＳＤＳ−Ｐａｇｅによって精製し、配列によって回収すると、メチオニン残基が先に立つ残基６３で始まるＧＡ７３３−１の配列に一致した。これらのデータは、ＢＲ１１０抗原はアミノ末端でブロックされており、配列情報を得るためには断片化が必要であったことを確認するものである。その上、データはＭＲ＝５５，０００糖蛋白質が、まだＭＡｂＢＲ１１０に結合できる、ＭＲ＝６６，０００蛋白質の天然分解産物であることをも示唆する。ＧＡ７３３−２抗原をヒト結腸直腸癌細胞系ＳＷ９４８から精製し、その部分的アミノ酸配列を決定した（リネンバッハ（Linnenbach,A.J．）ら、ＰＮＡＳ８６、２７−３１、１９８９）。２つの組換え体を総ヒトゲノムライブラリーから分離し、ＧＡ７３３−１およびＧＡ７３３−２遺伝子の完全ＤＮＡ配列を決定した。ＭＡｂＢＲ１１０によって識別されるＧＡ７３３−１抗原は、ＭＡｂｓＧＡ７３３およびＣＯ１７−１Ａによって識別されるＧＡ７３３−２抗原に酷似している（すなわち部分的アミノ酸配列［４５ａ．ａ．］の比較は良い相同性を示す）。したがって、ＢＲ１１０ＭＡｂは、チログロブリン１型反復単位のエクソン８、ＨＬＡ−ＤＲ関連不変鎖、およびＩＬ−２増殖因子受容体のサブユニットと相同性を分かち合う遺伝子によってコード化される、関連してはいるが特異的な抗原に対して特異性をもつことがわかる。表１マウスＭａｂｓ免疫組織学（陽性数／試験数）（１）遠位尿細管のみ；（２）上皮の弱い染色；（３）上皮が弱く染色され、島細胞は染色されず；（４）上皮染色；（５）弱い拡散した染色。表２免疫組織学（陽性数／試験数）表３マウスモノクローナル抗体の免疫組織学染色時の腫瘍の均質および不均質抗原発現表４ＭＡｂＢＲ１１０による表面抗原識別（直接染色法）表５ＭＡＢＢＲ１１０およびＭＡＢ７３３による表面抗原識別（間接的染色法）例４癌細胞内へのＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０のインターナライゼーション物質および方法試薬、および対照として用いる細胞培養物−精製ＢＲ９６ｓＦｖ−ＰＥ４０免疫毒素は前に述べたものである（フリードマン（Friedman）ら、１９９３）。ウサギポリクローナルＢＲ１１０抗イデオタイプ血清（Bristol Myers Squibb）またはＥＸＡ２−１Ｈ８、マウス抗ＰＥモノクローナル抗体（Sigma Chemical C o.（St.Louis,MO））を用いて膜結合型ＥＬＩＳＡ法を行った。試料希釈剤および結合体希釈剤はGenetic Systems社（シアトル、WA）から提供された。ヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）特異的ＨＲＰ結合体はSouthern Biotechnology社（バーミンガム、ＡＬ）から購入した。多孔性ＨＱ樹脂（登録商標）はPerceptive Biosy stens（Framingham,ＭＡ）から購入した。制限酵素およびＤＮＡ改質酵素はNew England Biolabsから、そして［³Ｈ］−ロイシンはNew England Nuclear社（ボストン、MA）から購入した。プロテアーゼ阻止剤およびグルタチオンを含むその他の化学物質および試薬はSigma Chemical Ｃｏ．（St.Louis,MO）から購入した。Ｈ３６１９結腸腺癌、Ｈ３７５４肺癌およびＨ３９０７卵巣癌を、１０％ウシ胎児血清を添加したイスコヴス（Iscoves）改良ダルベッコ培地（ＩＤＭＥＭ）中に培養した。ＭＣＦ−７乳癌細胞系はＡＴＣＣから入手し、上記のように培養した。ＢＲ１１０モノクローナル抗体（ｍＡＢ）は、確立されている方法によって、ヒト乳癌細胞系Ｈ３９２２でマウスを免疫することによって発現させた。アミノ末端配列決定 −連続ハイブリドーマ細胞培養物から精製したｍｕＢＲ１１０ＩｇＧ約１０ナノモルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、重鎖および軽鎖を単離し、アプライドバイオシステムス４７７プロテインシーケンサー（登録商標）およびアプライドバイオシステムス１２０ＰＴＨアナライザー（登録商標）（ヘウィック（Hewick）ら、１９８１；マツダイラ（Matsudaira,P．）１９８７）を用いてＮＨ₂−末端配列分析をした。エドマン分解を２５サイクル行った。しかしアミノ末端配列は軽鎖でのみ得られたが、重鎖はＮ−末端がブロックされていると考えられた。ＲＮＡ分離、ｃＤＮＡ合成、および増幅 − ＲＮＡは前記のように（コメジンスキー（P.Chomezynski）およびサッチ（Sacchi）、１９８７）５×１０⁷ｍｕＢＲ１１０ハイブリドーマ細胞から作成した。ｃＤＮＡは、メーカーのインストラクションに従って、総ＲＮＡおよび熱安定性rth ポリメラーゼ（ｒ^TH−ＲＴ− ＲＮＡ−ＰＣＲキット（登録商標）、Perkin Elmer Cetus）を用いて得た。重鎖Ｆｖ遺伝子の増幅のために、我々はプライマー対、ＭＨＶＰ９（ＭＨＶ＝マウス重可変領域； 5-ACTACACGGTACCCGGGATCCATGG^c/_ATTGGA^A/_CCTGCTATTCCTG-3'）（ジョーンズ（Jon es）およびベンディグ（Bendig）１９９１）および３’Ｖ_H不変プライマー（5-N 6GAATTCA^T/_CC-TCCACACACAGG^A/_G ^A/_GCCAGTGGATAGAC-3'）（ラリック（Larrick）ら、１９９１）を用いた。可変軽鎖遺伝子のための５’プライマーは、エドマン分解、および他の関連マウス軽鎖遺伝子へのデータベースアラインメントから誘導されたＮ−末端アミノ酸配列によって設計した。５’プライマーは（5'CGATCCGAATTCGACATTGTGATGACCCAGTCTCA 3'）であり、一方３’Ｖ_L不変プライマーはmck-３（5'-N4GATTCCAAGAAGCACACGACTGAGGCA-3'）であった（ギランド（Gilland）ら、１９９１）。ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列には下線が引いてある。増幅ｃＤＮＡのクローニング ― 重−および軽鎖Ｆｖをコード化するＤＮＡ断片の増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって確認し、見かけ上の分子サイズ４７５および３７５塩基対で丁寧に移動させた。それらの５’および３’末端にはＰＣＲ産物をp BuescriptＳＫ（＋）にクローニングするための制限エンドヌクレアーゼ認識部位ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩがある（Stratagene,La Jolla,CA ）。ヌクレオチド配列を決定し、２本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型として用い、シクエナーゼ（Sequenase）２．０リエージェントキット（登録商標）（United St ates Biochemical、クリーヴランド、ＯＨ）をＴ７およびＴ３シーケンシングプライマー（Pharmacia,Piscataway,NJ）と共に用いて、ＢＲ１１０重-および軽鎖遺伝子セグメントのマルチプルクローニングを行った。ＢＲ１１０ｓＦｖ×ＰＥ４０発現プラスミド構築 ― 大腸菌（E.coli）においてＢＲ１１０ｓＦｖ×ＰＥ４０を産生するために用いる発現プラスミドはバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを利用する（スタディル（Studier）およびモファット（Moffat）、１９８６）。ＢＲ１１０Ｖ領域をＰＣＲで増幅し、ＮｄｅＩ制限部位（下線部分）をコード化している５’Ｖ_H ＰＣＲプライマー（5'-GCA ATG CATATGCAG ATC CAG TTG GTG CAG TCT GGA C-3' ）を用いてそれらの末端制限部位を改質した。上記５’Ｖ_HＰＣＲプライマーはＡＴＧ翻訳開始コード（太字）およびＶ_H遺伝子の最初の８コドンを含む。３’Ｖ_L ＰＣＲプライマー（5'-CCA TGG ATG CAT CCG TTT CAG CTC CAG CGT GGT CCC AGC -3'）、それはＮｓｉＩ制限部位（下線）をコード化、Ｖ１遺伝子の最後の９コドンをコード化している。我々は、また、ＢａｍＨＩ制限部位（下線）リンカーの最初の半分（太字）およびＶ_H遺伝子の最後の８コドンをもつように設計された３’Ｖ^HＰＣＲプライマー（5'-CCG GCC GGA TCC GCC TCC GCC TGA TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC T-3'）を合成することにより、フレキシブルリンカー、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃を２つのＶドメインの間に挿入した（ヒューストンら、１９８８：チャウダリーら、１９８９）。５’Ｖ_LＰＣＲプライマー（5-CCG GCC GGA TCC GGC GGT GGC GGT TCT GGCGGT GGC GGT TCT GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAC-3'）はＢａｍＨＩ制限部位（下線）リンカーの第２半分（太字）およびＶ_L遺伝子の最初の８コドンをコード化する。ＢａｍＨＩ制限部位を用いて２つのＰＣＲ産物を互いに連結し、それから５’Ｖ_Hおよび３’Ｖ_Lプライマーを用いるＰＣＲによって再増幅した（サムブルック（Sambrook）ら、１９８９）。それからＮｄｅＩ＋ＮｓｉＩ消化、およびその後の結合によって、ｐＢＷ７．０、ｐＭＳ８（＋）ベースベクターにおいて、ＢＲ９６ｓＦｖをＢＲ１１０ｓＦｖに置換した（マックアンドリュー、１９９５）。生成した発現プラスミドは融合蛋白質ｐＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０を細胞形質に向け、そしてＤＮＡ配列分析によって確認された。ＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０の発現および精製 − １本鎖免疫毒素融合蛋白質ＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０を上記のように大腸菌において発現させた。大腸菌ＢＬ２１（ＩＤＥ３）細胞（スタディル（Studier）&モファット（ Moffat）、１９８６）を発現プラスミドｐＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０で形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む“テリフィク（Terrific）−ブロス ”培地（Gobco-BRL、Gaithersburg,MD）で３７℃で増殖させ、１ｍＭＩＰＴＧで１．０のＯＤ６５０の対数相で誘導した。９０分後に細胞を収穫した。分析的分析のために、１ｍｌサンプルを遠心分離によって収穫し、冷Ｈ₂Ｏ中で１０分間、浸透性ショックを与えた。再度細胞を遠心分離し、細胞ペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４に再懸濁した。約１０⁸スフェロプラストから調製したアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、染色するか（レムリ、１９７０）、またはウサギ抗ＢＲ１１０イデオタイプポリクローナル血清を用いる免疫ブロット分析にかけた。６Ｌシェイクフラスコから作った大きい細菌細胞ペレットを上記のように処理し、混在物を前述のようにして分離した（フリードマンら、１９９３）。その後よく洗った混在物を７Ｍグアニジン中で変性させた。抗原クローニング、発現および精製 − ＢＲ１１０抗原（ＧＡ７３３−１）をＨ２９８７細胞から分離し、２０残基のアミノ末端配列を得た。その残基は腫瘍関連抗原ＧＡ７３３−１の８８−１０７残基に相補的であった。ＧＡ７３３−１はＧＡ７３３−２との相同性に基づいて分離された遺伝子配列であり、ＧＡ７３３−２はＭａｂｓＧＡ７３．３およびＣＯ１７−１Ａによって識別される胃腸関連抗原をコード化している。ＧＡ７３３−１はＧＡ７３３−２抗原に対して５０％相同である。ＦＡＣＳ分析によりＢＲ１１０抗原ＧＡ７３３−１を発現することが判明した３種類の癌細胞系、Ｈ３９０７卵巣癌、Ｈ３６１９結腸腺癌およびＨ３７５４肺癌についてノザーン分析を行った。各々の２０００万−３０００万細胞から、コムチンスキーおよびサッチの方法を用いてＲＮＡを分離した（コムチンスキー（ Chomczynski）およびサッチ（Sacchi）、１９８７（Anal.Biochem １６２巻１５６−１５９ページ））。オリゴヌクレオチドプローブをＧＡ７３３−１の公知のヌクレオチド配列に基づいて作った。ノザーン分析をMantianisに記載されているように行ったこの抗原のｃＤＮＡを配列特異的プライマー、総ＲＮＡおよび逆転写ポリメラーゼ（ＲＴ−ＲＮＡＰＣＲ、Perkin Elmer Cetus、を用いてメーカーの使用説明書にしたがって分離したが、ただし１０％ＤＭＳＯの添加は除いた；なぜならば抗原ＧＡ７３３−１は５０％以上ＧＣに富むからである。使用した特異的ＲＴプライマーは１１０−ＦＰ（5'GCC AAG CTT GTC CGG TCC GCG TTC CTC CGC CCC ACC 3'）、１１０−ＲＰ（5'CGG TCT AGA CTC GAG GCC GGG TAC CTA CAA GCT CGG TTC 3'）、１１０−ＲＰ１（5'GCG GGG ATC CGT GAG GCG CTT CAT GGA GAA CTT CGG 3'）であった。各プライマーの制限部位は下線が引かれ、それぞれＨｉｎｄIII、ＸｈｏＩ、およびＢａｍＨＩである。キットに用意されているランダムヘキサヌクレオチドか、または３’１１０−ＲＰ１プライマーのどちらかで逆転写した後、３２ＰＣＲサイクルを行い、適したサイズの産物を回収した。ｐＣＤ４０ＴｈｒＲｇ１に連結する前に、１．１５ｋＢ遺伝子断片をＨｉｎｄ IIIおよびＢａｍＨＩで消化した（ＣＤＭ７バックグラウンド中）、一方０．８６ｋＢ遺伝子断片をＨｉｎｄ III−ＸｈｏＩ断片としてｐＣＤＭ８に連結した。適したサイズの挿入物を含むプラスミドＤＮＡを決め、ＤＮＡ配列分析にかけた。細胞外ドメインをコード化しているＤＮＡ断片をヒトＦｃ領域の上流にサブクローニングし、一過性にＣＯＳ細胞に発現させた。生成した融合蛋白質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。細胞膜ＥＬＩＳＡ ― Ｈ３６１９結腸腺癌細胞から膜を作った（スピラ（Spir a）ら、“サブセレクションおよびＥＬＩＳＡアッセイよるモノクローナルクラス転換変種の同定”、J.Immunol.Meth．、７４巻３０７−１５ページ（１９８４）、ウォテイラ（Uotila）ら、“ヒトＡＦＰに対するモノクローナル抗体による二部位サンドウィッチＥＬＩＳＡ”、J ．Immunol.Methods．４２巻１１ページ（１９８１）、シコラ（Sikora）ら（編集）、Monoclonal Antibodies ．３２ −５２ページ（Blackwell Scientific Publications１９８４））。膜を、０．５Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９．６中、１０μ ｇ／ｍｌ蛋白質で、イムロンII ９６（登録商標）ウェルプレート（Dynatech Labs,Chantilly,ＶＡ）の表面にコーティングし、その後４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗い、試料の１：１０希釈液（Genetic Syst ems,Seattle,ＷＡ）で室温で１時間ブロックした。プレートをＰＢＳで３回洗い、その後結合体希釈液（Genetic Systems,Seattle,ＷＡ）中で最初の抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。プレートをその後ＰＢＳで３回洗い、第２の抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ特異的ＨＲＰまたはポリクローナルウサギＢＲ１１０抗イディオタイプ抗体のどちらかを、２．５μｇ/ｍｌになるように結合体希釈液に加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、それからＰＢＳで３回洗った。プレートをＰＢＳで３回洗い、それから室温でヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃ特異的ＨＲＰ（結合体希釈液中１：１０００）と共に室温で１時間インキュベートするか、またはさらに２回洗いその後反応をテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で室温で１５分間発現させ、１．３ＭＨ₂ＳＯ₄ で停止した。インキュベーション後、そのポリクローナル血清プレートもＰＢＳで５回洗い、上記のように処理した。吸光度を２波長４５０／６３０ｎｍで、Bi o-tekミクロプレートリーダー（Winooski,VT）を用いて測定した。細胞傷害性の分析。細胞を３７℃でＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０と共に２４時間インキュベートした。それからウェルをホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗い、２００μｌ／ウェルの１．５μＭカルセイン−ＡＭ（Molecular Probes ,Inc.,Eugene，ＯＲ）を加え、プレートを室温で４０分間インキュベートした。カルセイン−ＡＭは膜透過性で、非蛍光性である。細胞内エステラーゼによって加水分解がおきるとき、強く蛍光を発する生成物カルセインが形成される。インキュベーションの終わりに、蛍光濃度分析器（登録商標）（Bazter Heathcare C orp.，Mundelein，ＩＬ）を用いて励起/放射波長４８５／５３０ｎｍで蛍光を測定した。例５ＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０免疫毒素の構築（ｐＳＥ７０．０）オリジナルＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０構築物をカナマイシン耐性遺伝子を含むベクターにサブクローニングし、第２のｌａｃリプレッサーを発現ベクター中に組み込んだ。これは、ｐＥＴ２９ｃ（Novagen Inc）をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、同様に消化したＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０を２つの部位の間に挿入することによって行われた。生成した構築物はｐＳＥ７０．０（図１）と命名され、Ｔ７プロモーターのコントロール下にあった。ＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０発現、再生、および精製一本鎖免疫毒素融合蛋白質ＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０を混在物として大腸菌に発現させた。発現したＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０融合蛋白質を含む出発培地１リットルからの細胞ペーストを５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．０＋１ｍＭＥＤＴＡに再懸濁した。サンプルを８Ｋで１５分間遠心分離し、上澄液を傾瀉した。ペレットを４０ｍｌＨ₂Ｏに再懸濁し、４℃に１０分間保持し、８Ｋで１５分間遠心分離した。ペレットを５０ｍｌトリス−ＨＣｌｐＨ８．０＋１ｍＭＥＤＴＡに再懸濁した。０．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームを最終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌになるように加えた。サンプルを氷上に３０分間保持した。その後デタージェントテルギトール（Tergitol）をサンプルに加え、最終濃度４％とした。サンプルを氷上に６０分間保ち、１８Ｋで３０分間遠心分離した。サンプルを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ＋１ｍＭＥＤＴＡで３回洗った。ペレットをグアニジン溶液（７Ｍグアニジン−ＨＣＬ、０．１Ｍトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、５ｍＭＥＤＴＡ）３ｍｌ中で超音波処理し、４℃で４８時間放置した。サンプルをその後３０Ｋで３０分間遠心分離し、上澄液を集めた。サンプルをその後１００μｇ／ｍｌで、再生緩衝液（０．１Ｍトリス−ＨＣｌｐＨ８．０、５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＧＳＳＨ、１μＭＧＳＨ、１Ｍ尿素）をゆっくり添加して再生した。再生蛋白質を４℃で４８時間保持し、伝導性が５ｍＳ／ｃｍを下まわるまで４０ｍＭＨＣｌｐＨ８．０に対して透析を行った。サンプルをＤＥＡＥアニオン交換カラム上に注ぎ、４０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．０＋１ＭＮａＣｌの直線勾配で溶出した。非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより６７ｋＤａＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０融合蛋白質に相当するフラクションを集め、４０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．０２５０ｍｌで希釈し、ＤＥＡＥカラムの場合と同じＮａＣｌ勾配で、Ｍｏｎｏ−Ｑアニオン交換カラムに再びかけた。モノマーＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０に相当するサンプルが集められ、クーマシー−プラス試験（Pierce Chem Co．）によって定量した。ＢＲ１１０−ＢＤ１免疫毒素の構築および精製ＢＲ１１０ｍＡｂを０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ中で３倍モル過剰の２−イミノチオランの添加によって３７℃で１時間チオレート化した。ＢＤ１を、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ中で３倍モル過剰のＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン）で、室温で、６０分間誘導体化した。ＢＲ１１０−ＢＤ１をサイズ排除カラム（ＴＳＫ− ３０００）にかけ、遊離毒素から分離した。免疫毒素（１８０ｋＤａ）および遊離抗体（１５０ｋＤＡ）は一緒に溶出し、ブルー−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製した。０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．０（洗浄緩衝液）中のＢＲ１１０−ＢＤ１を４℃で１６時間、ブルー−セファロース（５ｍｌ樹脂／５ｍｇ結合体）に吸収させた。混合物を５ｍｌエコノカラム（Econocolumn）（Bio -Rad,Richmond，ＣＡ）に充填し、１ｍｌフラクションを、洗浄緩衝液中で漸増ＮａＣｌ濃度の２段階勾配（４００ｍＭＮａＣｌ、段階１；８００ｍＭＮａＣｌ、段階２）で溶出した。免疫毒素結合体をＯＤ₂₈₀（１．４＝１ｍｇ／ｍｌ）で定量し、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＢＲ１１０−免疫毒素の細胞傷害性分析増殖培地中の腫瘍細胞（１０⁵細胞／ｍｌ）を９６ウェル平底組織培養プレート（０．１ｍｌ／ウェル）に加え、３７℃で１６時間インキュベートした。ＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０またはＢＲ１１０−ＢＤ１をロイシンー遊離ＲＰＭＩ（アッセイ培地）で希釈し、０．１ｍｌを各ウェルに３７℃で２０時間（ＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０の場合）または２０および４４時間（ＢＲ１１０−ＢＤ１の場合）加えた。細胞に［³Ｈ］−ロイシン（１μＣｉ／ウェル）を３７℃でさらに４時間パルスした。細胞を凍結融解法によって溶解し、トムテック（Tomtec）細胞収穫器（Orange，ＣＴ）を用いて収穫した。細胞蛋白質への［³Ｈ］−ロイシンの組み込みをＬＫＢベータープレート液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。過剰のＢＲ１１０ＩｇＧ（５０μｇ／ｍｌ）を４８時間ＢＲ１１０−ＢＤ１細胞傷害性研究に加え、アッセイでＢＲ１１０特異性を証明した。ＢＲ１１０ＩｇＧの添加を除いて、アッセイは正確に上記のように行われた。表６選択した細胞系に対するＢＲ１１０ｓＦｖ−ＰＥ４０の２４時間細胞傷害性およびＦＡＣＳ分析表７種々の癌細胞系に対するＢＲ１１０ＩｇＧ-ＳＭＰＴ−ＢＤ１結合体の活性。２４および４８時間インキュベーション。 nd= 試験せず

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 ＬＣ０７Ｋ 16/30 Ｃ０７Ｋ 16/30 16/46 16/46 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 15/09 33/577 ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＧ０１Ｎ 33/574 5/00 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ヘルストローム、インゲゲルドアメリカ合衆国 98105 ワシントン州シアトルサーバードライヴ 3925 ノースイースト (72)発明者ガリゲス、ウルスラアメリカ合衆国 98110 ワシントン州ベインブリッジアイランドグロトルロード 15380 (72)発明者マッカンドルー、スティーヴンアメリカ合衆国 18940 ペンシルヴァニア州ニュートンクリーヴデンドライヴ 29 (72)発明者マークァルド、ハンスアメリカ合衆国 98040 ワシントン州マーサーアイランドフォーティーシックススストリート 922 サウスイースト

Claims

【特許請求の範囲】１．ＧＡ７３３−１抗原を特異的に認識し結合するがＧＡ７３３−２抗原は認識せず結合もしないリガンド。２．リガンドが腫瘍原性組織を特異的に認識し結合するが、正常組織は認識せず結合もしない請求項１記載のリガンド。３．ＡＴＣＣ番号ＨＢ１１６９８と命名されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体ＢＲ１１０。４．リガンドがＧＡ７３３−１抗原とコンプレックスを形成し、ＧＡ７３３−１抗原が細胞表面にある場合、前記リガンドが細胞内にインターナライズされる請求項１記載のリガンド。５．ＢＲ１１０と命名されたモノクローナル抗体である請求項１記載のリガンド。６．ＢＲ１１０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。７．少なくとも１つの機能的活性セグメントを含む部分である、細胞傷害剤の少なくとも１部分に結合された請求項１のリガンドを含んでなる結合体。８．細胞傷害剤が酵素、リンフォカイン、オンコスタチンまたは毒素である請求項７記載の結合体。９．検出可能なマーカーで標識された請求項２記載のモノクローナル抗体。１０．検出可能なマーカーが酵素、常磁性同位元素、ビオチン、フルオロフォア、クロモフォア、重金属または放射性同位元素である請求項９記載のモノクローナル抗体。１１．請求項２のモノクローナル抗体の抗原結合部位を有するＦｖ分子。１２．ｓＦｖ分子である請求項１１のＦｖ分子。１３．請求項２のモノクローナル抗体の抗原結合部位を有するＦａｂ分子。１４．請求項２のモノクローナル抗体の抗原結合部位を有するＦａｂ’分子。１５．請求項２のモノクローナル抗体の抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）₂分子。１６．２種類の異なる抗原に結合特異性を有する二重特異性抗体であって、抗原の１つは請求項２のモノクローナル抗体が結合する抗原である二重特異性抗体。１７．抗原結合領域が、ハイブリドーマＨＢ１１６９８によって産生されるモノクローナル抗体ＢＲ１１０の、その標的抗原への免疫特異的結合を競合的に阻止するヒト／ネズミ組み換え抗体。１８．対象からの組織切片中のＢＲ１１０抗原を検出する方法であって、組織切片と請求項２のモノクローナル抗体とを、前記抗体が前記組織切片に結合する条件下で接触させ、前記組織切片に結合した抗体を検出し、それによって組織切片中のＢＲ１１０を検出する各段階を含む方法。１９．組織切片が、正常組織の特徴がＢＲ１１０抗原が存在しないことであり、悪性腫瘍組織の特徴がＢＲ１１０抗原が存在することであるような組織の切片である請求項１８記載の方法。２０．悪性腫瘍組織が腺癌である請求項１９記載の方法。２１．組織切片が胃腸組織である請求項１９記載の方法。２２．組織切片が胸部組織である請求項１９記載の方法。２３．組織切片が結腸組織である請求項１９記載の方法。２４．組織切片が肺組織である請求項１９記載の方法。２５．組織切片に結合したモノクローナル抗体と、検出可能なマーカーで標識した第２の抗体とを、第２の抗体がモノクローナル抗体と結合する条件下で接触させ、このように結合した第２の抗体を検出することによって、組織切片に結合したモノクローナル抗体を検出する請求項１９記載の方法。２６．試験すべき悪性腫瘍からの組織切片のＢＲ１１０抗原の分布量の差を、正常組織からの組織切片のＢＲ１１０抗原の量および分布に対して測定する方法であって、試験すべき組織と正常組織の両方を請求項２のモノクローナル抗体と接触させ、それによってＢＲ１１０抗原の量および分布の差を検出する各段階を含む方法。２７．対象から組織サンプルを採取し、このような組織切片中のＢＲ１１０抗原を請求項２６の方法を用いて検出し、それによってそのような悪性腫瘍疾患を診断する各段階を含む対象の悪性腫瘍疾患診断法。２８．検出可能な試剤が付着結合している請求項２のモノクローナル抗体を含む組成物。２９．検出可能な試剤がリシン、ジフテリア毒素、ブリオジン、シュードモナス、エキソトキシン−Ａ、アブリン、サポリン、およびゲロニンからなる群から選択される毒素を含んでなる請求項２８記載の組成物。３０．検出可能な試剤が酵素、薬剤、またはＤＮＡ断片を含む請求項２８記載の組成物。３１．請求項１のリガンドをコード化する核酸分子。３２．請求項３１の核酸分子を含むプラスミド。３３．適切なホスト細胞中の請求項３２のプラスミドを含んでなるホストベクター系。３４．請求項３３のホストベクター系を増殖させてホストに蛋白質を産生させ、このようにして産生した蛋白質を回収する各段階を含む蛋白質の製造方法。